ES2550229T3 - Células modificadas genéticamente para comprender glucoquinasa de islote pancreático y usos de éstas - Google Patents

Abstract

Un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina o fragmento funcional de ésta, comprendiendo dicho hepatocito una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano o fragmento funcional de ésta.

Description

Células modificadas genéticamente para comprender glucoquinasa de islote pancreático y usos de éstas

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina o fragmento funcional de ésta, comprendiendo dicho hepatocito una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano o fragmento funcional de ésta. Las células de la presente invención son útiles en una amplia variedad de aplicaciones, en particular en el contexto de regímenes terapéuticos y profilácticos dirigidos al tratamiento de la diabetes y/o la mejora de los síntomas asociados con la diabetes, tomando como base el trasplante de las células de la presente invención a mamíferos que requieren tratamiento. También se facilita el diseño de sistemas de cribado con base in vitro para ensayar la eficacia terapéutica y/o la toxicidad de regímenes de tratamiento adyuvantes potenciales.

Antecedentes de la invención

Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por autor en esta especificación se recogen alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación, no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento

o cualquier forma de sugerencia de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en Australia.

La diabetes mellitus se caracteriza por una anormalidad en el metabolismo de carbohidratos que resulta en niveles de glucosa elevados tanto en sangre como en orina. El fracaso del cuerpo humano para metabolizar apropiadamente la glucosa está causado por defectos en la secreción de la insulina o uso de la insulina. La insulina es producida por las células β en los islotes del páncreas y permite al cuerpo utilizar la glucosa como una fuente de energía. Cuando este proceso no puede ocurrir, el cuerpo lo compensa utilizando fuentes alternativas de energía tal como grasas almacenadas. Sin embargo, esto da lugar a niveles de glucosa que se incrementan rápidamente y la acumulación de cetonas en la corriente sanguínea debido a la aparición de metabolismo graso extenso.

La diabetes se clasifica en términos generales en dos grupos denominados diabetes de Tipo 1 y diabetes de Tipo 2. La diabetes de Tipo 1 (referida frecuentemente como diabetes de inicio juvenil debido a su aparición en la infancia o adolescencia temprana) es una afección autoinmune debilitante causada por la destrucción selectiva de las células β productoras de insulina en los islotes del páncreas. Su inicio es abrupto y se produce típicamente antes de la edad de 20 años. Actualmente, sin embargo, la diabetes de Tipo 1 se está presentando de manera creciente en adultos. Esta enfermedad se caracteriza por la ausencia de función de las células β y la ausencia de producción de insulina, y, por lo tanto, se requiere terapia con insulina. La diabetes de Tipo 2, sin embargo, se caracteriza por resistencia a insulina, una afección en la que el cuerpo no usa apropiadamente la insulina, lo que está acompañado frecuentemente por obesidad y otros trastornos metabólicos. Frecuentemente, no se observan síntomas marcados. Los defectos de secreción de insulina son evidentes muy pronto en la enfermedad tanto en diabetes de Tipo 1 como Tipo 2, a pesar de su diferente etiología.

En ausencia de tratamiento, la diabetes puede ser mortal mientras que la diabetes mal controlada da lugar a la aparición de complicaciones tales como glomeruloesclerosis diabética, en la que los riñones se dañan irreversiblemente dando lugar a fallo renal. El tratamiento de la diabetes de tipo 1 y también de los síntomas graves de la diabetes de tipo 2 es generalmente por inyección diaria de insulina para reemplazar la insulina que las células P dañadas ya no son capaces de producir. Sin embargo, incluso en el caso de un régimen de tratamiento optimizado de este tipo, las complicaciones y efectos secundarios son comunes. Por ejemplo, las complicaciones vasculares diabéticas, que afectan tanto a microvasos como macrovasos sanguíneos, representan causas principales de discapacidad y muerte en los pacientes con diabetes de tipo 1 y tipo 2. De hecho, ahora se reconoce a la diabetes como un factor de riesgo potente e independiente para el desarrollo de enfermedad aterosclerótica coronaria, cerebrovascular y periférica (Beckman et al., 2002, JAMA 287:2570-2581).

El tratamiento de la diabetes también puede realizarse mediante el trasplante de tejido secretor de insulina. Sin embargo, como esta última estrategia se basa en el uso de tejido humano escaso como una fuente, parece improbable que vaya a haber un número suficiente de órganos disponibles para ayudar a más que a un número seleccionado de diabéticos dependientes de insulina. Además, estos pacientes tendrían que someterse a un régimen a largo plazo de fármacos inmunosupresores.

De acuerdo con esto, existe una necesidad continua de desarrollar métodos alternativos y más efectivos para regular los niveles de glucosa en los pacientes diabéticos. En el trabajo que da lugar a la presente invención, se ha generadouna población de célulasquesintetizan,almacenanysecretan insulina en respuesta alaestimulación con glucosa. Sin embargo, mientras las líneas celulares existentes de este tipo han secretado insulina de una manera altamente sensible, y por lo tanto en respuesta incluso a niveles muy bajos de glucosa, la modificación genética introducida en las células de la presente invención ha refinado su capacidad de respuesta a la glucosa de manera que la insulina se produce sólo en respuesta a niveles fisiológicamente relevantes de glucosa, esto es, niveles iguales a o mayores que los niveles mínimos de glucosa que resultarían en la producción de insulina por las células β pancreáticas en individuos normales.

Resumen de la invención

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "derivado de" debe entenderse que indica que un número entero o grupo de números enteros particulares se ha originado de la especie especificada, pero no se ha obtenido necesariamente directamente de la fuente especificada. Además, tal y como se usa en la presente memoria, las formas singulares de "un", "y" y "el" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa.

La presente especificación contiene información de secuencia de nucleótidos preparada usando el programa PatentIn Versión 3.1,presentadoenlapresente memoria despuésdelabibliografía.Cadasecuencia de nucleótidos se identifica en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <210>1, <210>2, etc). La longitud, tipo de secuencia (ADN, etc) y organismo fuente para cada secuencia de nucleótidos se indica por información proporcionada en los campos de indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos referidas en la especificación se identifican por el indicador SEQ ID NO: seguido del identificador de la secuencia (por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, etc.). El identificador de la secuencia referido en la especificación se correlaciona con la información proporcionada en el campo delindicadornumérico <400>en el listadodesecuencias, queestá seguido delidentificador de la secuencia (por ejemplo, <400>1, <400>2, etc). Esto es, SEQ ID NO:1 como se detalla en la especificación se correlaciona con la secuencia indicada como <400>1 en el listado de secuencias.

Un aspecto de la presente invención está dirigido a un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina o fragmento funcional de ésta, comprendiendo dicho hepatocito una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano o fragmento funcional de ésta.

En otro aspecto se proporciona un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente según el primer aspecto de la invención, hepatocito que es capaz de secretar insulina debido a su transfección con una molécula de ácido nucleico que codifica insulina o fragmento funcional u homólogo de ésta.

Los aspectos adicionales de la presente invención son como se proporcionan en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de pIRESpuro3. El ADNc de la glucoquinasa de islote humano se cortó del vector pBluescriptSK enelsitio EcoRIyposteriormente se clonóenelsitio EcoRIdelsitio de multiclonación de los vectores pIRESpuro3.

La Figura 2 es una representación esquemática de la secuencia del vector pIRESpuro3 del vector pIRESpuro3 (secuencia de 5157 pares de bases SEQ ID NO:1) con el inserto de ADNc de glucoquinasa de islote humano (2733 pares de bases SEQ ID NO:2) resaltado en el texto agrandado. Los nucleótidos en texto en negrita representan los nucleótidos remanentes del vector de clonación pBluescriptSK. La SEQ ID NO:3 representa la secuencia del vector que incorpora la secuencia de ADNc de glucoquinasa de islote.

La Figura 3 es una imagen de la expresión por RT/PCR de glucoquinasa de islote humano, producto 200 pb. Marcador de ADN (carril 1), clon 6 de células Melligen (carril 2), células Huh7ins sólo con vector pIRESpuro3 (carril 3), células Huh7ins (carril 4).

La Figura 4 es una imagen de un análisis por transferencia Western para glucoquinasa humana en Huh7ins (carril 1), células Huh7ins sólo con vector pIRESpuro3 (carril 2), células Melligen (carril 3).

La Figura 5 es una representación gráfica de actividad Glucoquinasa de (1) Huh7, (2) Huh7ins (3) Huh7ins (vector vacío)y(4)células Melligen en presenciade(a)20mMglucosa,y(b)20 mMglucosa más10 mMglucosa-6-fosfato. Medias ± SEM, n=6.

La Figura 6 es una representación gráfica de la secreción de insulina de (a) Huh7ins y (b) células Melligen en respuesta a concentraciones crecientes de glucosa: 15-20 mM. Los valores se expresan como medias ± S.E. (n=3).

La Figura 7 es una representación gráfica de la secreción de insulina de células Melligen en respuesta a concentraciones crecientes de glucosa: 3,75-5,0 mM. Los valoresse expresan como medias ± S.E. (n=6).

La Figura 8 es un micrografía electrónica de transmisión de células Melligen que muestra vesículas secretoras con gránulos densos (sg) rodeados de un halo claro (barra = 1 μM). (b) Micrografías inmuno-electrónicas que muestran la localización de insulina en células Melligen (barra = 460 nm).

La Figura 9 es una representación gráfica de células MIN-6 incubadas con las citoquinas pro-inflamatorias IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL) en combinación e individualmente a) durante 6 días reemplazando las citoquinas y medio una vez cada 2 días y b) durante 8 días con las citoquinas y el medio cambiados diariamente. Las células control se incubaron en medio solo. Los resultados se expresan como media ±

S.E. (n=4; los SE se encontraron en los puntos de datos).

La Figura 10 es una representación gráfica del tratamiento de células MIN-6 con concentraciones de citoquinas tituladas durante 8 días a) al doble (IFN-γ(768 ng/mL),TNF-α (20 ng/mL) e IL-1β (4.000 pg/mL)) y b) a la mitad (IFNγ (192 ng/mL), TNF-α (5 ng/mL) e IL-1β (1.000 pg/mL)) de las concentraciones iniciales usadas. Los resultados se expresan como media ± S.E. (n=4; los SEse encontraron en los puntos de datos).

La Figura 11 es una representación gráfica de las cinéticas de crecimiento de células MIN 6 y las tres líneas celulares hepáticas usadas. Las células se sembraron inicialmente a una densidad de 1x104 células/mL, para las líneas celulares hepáticas, y 2x104 células/mL, para las células MIN-6, en placas de seis pocillos. Los recuentos celularesse obtuvieron usando un hemocitómetro cadasegundo díaalolargo delperiodo estudiado a)células MIN6 b) Huh7 c) Huh7ins y d) Melligen. Los resultados se expresan como media ± SE, (n=3) (En algunos puntos de tiempo, los SE se encuentran en el punto de datos).

La Figura 12 es una representación gráfica de un ensayo de viabilidad MTT en células Huh7ins realizado para asegurar que el crecimiento exponencial se detectaba por el ensayo durante 8 días. Los resultados se expresan como media ± SE (n=6; los SE se encontraron en los puntos de datos).

La Figura 13 es una representación gráfica de un ensayo de viabilidad MTT en células MIN-6 incubadas con las citoquinas IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL). El medio se cambió diariamente. La viabilidad celular se determinó a varios puntos de tiempo a lo largo del periodo de 10 días. Las concentraciones de citoquinas usadas fueron a) 1 vez b) 2 veces más que y c) 5 veces más que las concentraciones iniciales. Los resultados se expresan como media ± SE (n=6; los SE se encontraron en los puntos de datos).

La Figura 14 es una representación gráfica de un ensayo de viabilidad MTT en células a) MIN-6 b) Huh7 c) Huh7ins d) Melligen incubadas con las citoquinas IFN-γ (384 ng/mL),TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL). Las citoquinas se cambiaron diariamente durante un periodo de 10 días. Los resultados se expresan como media ± SE, (n=5) (En algunos puntos de tiempo, los SEse encuentran en el punto de datos *P<0,01,**P<0,001).

La Figura 15 es una imagen de tinción con Anexina/PI de Huh7ins tanto a 24h como 48h que muestra ausencia de muerte celular apoptótica temprana o tardía. Sólo se detectó una población necrótica y la diferencia entre las células control y tratadas no fue significativa p>0,05. Estas figuras son representativas de cuatro experimentos independientes.

La Figura 16 es una imagen que muestra que tanto a 24h como 48h, las células Melligen mostraron ausencia de muerte celular apoptótica temprana o tardía. Sólo se detectó una población necrótica y la diferencia entre las células control y tratadas no fue significativa p>0,05. Estas figuras son representativas de cuatro experimentos independientes.

La Figura 17 esunaimagendetinción única con PIde Huh7ins que muestraque no había pico sub-G1 evidente en células tratadas y control a 24h y 48h.Estas figurasson representativas de cuatro experimentos independientes.

La Figura 18 es una imagen de tinción única con PI de células Melligen que muestra que no había pico sub-G1 evidente en células tratadas y control a 24h y 48h. Estas figuras son representativas de cuatro experimentos independientes.

La Figura 19 es una imagen de la morfología celular de células MIN-6 no tratadas después de a) 1 día, b) 6 días, y c) 12 días de incubación sin citoquinas. La morfología celular de las células MIN-6 después de tratamiento con citoquinas con IFN-γ, TNF-α e IL-1β puede verse en d) 1 día, e) 6 días y f) 12 días. (Aumento 100x).

La Figura 20 es una imagen de la morfología celular de células Huh7ins no tratadas después de a) 1 día, b) 6 días, y c) 12 días. La morfología celular de las células Huh7ins incubadas con las citoquinas IFN-γ, TNF-α e IL-1β después de los mismos puntos de tiempo d) 1 día, e) 6 días, y f) 12 días. (Aumento 100x). La morfología de las células Melligen fue la misma que las células Huh7ins.

La Figura 21 es una imagen que muestrala RT-PCRrealizada usando cebadoresparalosreceptoresde citoquinas IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2, TNFR1 y TNFR2. Los carriles contienen ADNc para: 1-Células de islote Pancreático (control positivo) 2-Células Huh7 3-Células Huh7ins 4-Células TAO 5-Control negativo. Los resultados muestran bandas para IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2 y TNFR1 pero no para el receptor de citoquina TNFR2. El receptor de citoquina TNFR2 no se detectó a nivel molecular en las líneas celulares hepáticas.

La Figura 22 es una imagen de RT-PCR realizada usando cebadores para IκBα, IκBβ e IκBε. Los carriles contienen ADNc para: células de islote pancreático control y tratadas (control positivo), células Huh7 control y tratadas, células Huh7ins control y tratadas, y células Melligen control y tratadas. Los resultados muestran bandas para IκBα, IκBβ, IκBε e iNOS pero no MCP-1.

La Figura 23 es una representación gráfica de resultados de PCR en tiempo real que muestran que los inhibidores de NFκB están regulados a la baja en las células Melligen. La molécula efectora aguas abajo, Fas, también está regulada a la baja. Estas tendencias en la expresión génica también se observaron en células Huh7 y Huh7ins.

La Figura 24 esuna representación gráfica quemuestra lasconcentraciones de NOencélulasa)Min6,b)Huh7,c) Huh7ins y d) Melligen. No se detectaron concentraciones incrementadas de NO en líneas celulares hepáticas después de un tratamiento con citoquinas de 48h, usando la reacción de Greiss modificada. Los resultados se expresan como media ± SE (n=6).

La Figura 25 es una representación gráfica que muestra la secreción crónica total de insulina después de incubación con y sin la mezcla de citoquinas IFN-γ, TNF-α e IL-1β durante 1,2, 3, 5, 8 y 10 días a) células MIN -6 b) células Huh7ins y c) células Melligen.Los resultadosse expresan como media ± SE (n=6).

La Figura 26 es una representación gráfica que muestra el almacenamiento de insulina en a) células MIN-6 b) célulasHuh7insyc)célulasMelligen después deincubación con ysin la mezcla de citoquinasIFN-γ, TNF-α e IL-1β durante 1, 2, 3, 5, 8 y 10 días. Los resultados se expresan como media ± SE (n=5).

La Figura 27 es una representación gráfica que muestra la capacidad de respuesta a glucosa usando un estímulo de 20 mM glucosa a) células MIN-6 con y sin tratamiento b) células Huh7ins y c) células Melligen después de 10 días de incubación con las citoquinas IFN-γ(384 ng/mL),TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL).Los resultados se expresan como media ± SE (n=6). Célulassin tratar (malva), células tratadas (ciruela).

La Figura 28 es una representación gráfica que muestra que un tratamiento con citoquinas de 10 días no afectó la capacidad de respuesta de las células (a) Huh7ins y (b) Melligen a glucosa en el intervalo milimolar. Las células Melligen secretan insulina en respuesta a 4,25 mM glucosa (el intervalo fisiológico) y las células Huh7ins a 2,5 mM glucosa.

La Figura 29 es una imagen de factores de transcripción de células β, hormonas pancreáticas, convertasa proinsulina, y factores del aparato sensor de glucosa expresados en líneas celulares hepáticas transfectadas. Análisis por RT-PCR para los factores de transcripción de células β [PDX-1, NEUROG3, NEUROD1, NKX2-2, NKX61, Pax6]; hormonas pancreáticas [glucagón, somatostatina (SST) y polipéptido pancreático (PP)]; GLUT2 y Glucoquinasa (GK) [forma de islote y hepática]; convertasas proinsulina [PC1/3 y PC2] en células Huh7 (carril 1),

células Huh7ins (carril 2), células Melligen (carril 3), islote humano (carril 4, el control positivo), y agua (carril 5, el control negativo).

La Figura 30 es una imagen de análisis por PCR en tiempo real de (a) glucoquinasa de islote humano en el carril 2 células de islote humano, carril 3 células Melligen, carril 4 Huh7ins sólo con vector, carril 5 Huh7ins, carril 6 células Huh7, carril 7 dH2O y (b) glucoquinasa de hígado humano en el carril 2: células de islote humano, carril 3: células Melligen, carril 4: Huh7ins sólo con vector, carril 5: dH2O. Carril 1: marcador de ADN en ambos casos.

La Figura 31 es una representación gráfica de expresión por PCR en tiempo real de GK hepática en a) células Melligen y Huh7ins con vector vacío, y b) células Huh7ins y células Huh7ins con vector vacío. El nivel de expresión génica se expresó como el valor medio Ct corregido ± SE de líneas celulares individuales (n=8).

La Figura 32 es una representación gráfica de expresión por PCR en tiempo real del factor de transcripción de células β, PDX-1: células Melligen y células Huh7ins. El nivel de expresión génica se expresó como el valormedio Ct corregido ± SE de líneas celulares individuales (n=8).

La Figura 33 es una representación gráfica de expresión por PCR en tiempo real del factor de transcripción de células β, NEUROD1: en células Melligen y células Huh7ins. El nivel de expresión génica se expresó como el valor medio Ct corregido ± SE de líneas celulares individuales (n=8).

La Figura 34 es una representación gráfica de expresión por PCR en tiempo real del transportador de glucosa GLUT2: en a) células Melligen y células Huh7, y b) células Melligen y células Huh7ins. El nivel de expresión génica se expresó como el valor medio Ct corregido ± SE de líneas celulares individuales (n=8).

La Figura 35 es una imagen de análisis por transferencia western cualitativo para la expresión de PDX-1 en: Huh7 (carril 1), Huh7ins (carril 2), Melligen (carril 3), y el control positivo, células de islote humano (carril 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se fundamenta, en parte, en la determinación de que la secreción de insulina en respuesta a glucosa por células modificadas por ingeniería genética que no son células β pancreáticas puede diseñarse más apropiadamente para mimetizar los eventos fisiológicos normales mediante la modificación por ingeniería de la célula para expresar glucoquinasa de islote pancreático, a diferencia de otras formas de glucoquinasa. Se ha determinado que en ausencia de la producción de esta enzima, puede ocurrir una capacidad de respuesta hipersensible a niveles de glucosa extracelulares, dando lugar a la inducción de un estado hipoglucémico en individuos tratados con dichas células, debido al hecho de que la producción de insulina está regulada al alza incluso cuando los niveles de glucosa sistémicos están por debajo del umbral fisiológico más bajo requerido para estimular la producción de inulina por células β pancreáticas normales. Esta determinación, y la generación de células tomando como base ésta, ha facilitado ahora la mejora de los regímenes de tratamiento terapéutico y profiláctico dirigidos a tratar la diabetes y/o los síntomas asociados con la diabetes.

De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención está dirigido a un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, que es capaz de secretar insulina, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicha célula con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano.

La referencia a una "célula capaz de secretar insulina" debe entenderse como una referencia a una célula que produce o tiene la capacidad de producir insulina. La referencia a "produce" es una referencia a la expresión (ya sea transcripción o traducción) de una molécula de ácido nucleico que codifica insulina y la secreción de la insulina expresada porésta.Sin limitarla presente invención a ninguna teoría omodo deacción,la capacidad de una célula β pancreática normal para producir insulina en respuesta a glucosa de una manera fisiológicamente relevante se debe tanto a su capacidad para expresar el gen de la insulina como a la funcionalidad de un "sistema sensor de glucosa" que regula la liberación de insulina en respuesta a pequeños cambios de nutrientes externos. El sistema sensor de glucosa comprende esencialmente un transportador de glucosa de alta capacidad, tal como GLUT 2, y una enzima de fosforilación de glucosa, tal como glucoquinasa. La última molécula, que es el objeto de la modificación genética de la presente invención, proporciona el atributo funcional celular crucial que asegura que la expresión del gen de la insulina ocurra sólo en respuesta a niveles de glucosa extracelulares que se encuentran en un intervalo mM específico. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, la insulina se libera en el entorno extracelular bien mediante la secreción de insulina soluble por la célula o mediante el anclaje de las moléculas de insulina a moléculas de la superficie celular. Debe entenderse que después de la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica la insulina, la insulina que se produce puede almacenarse intracelularmente durante un periodo de tiempo antes de su liberación. Por ejemplo, la célula puede almacenar insulina intracelularmente donde, después de la estimulación con glucosa, la insulina almacenada se libera y/o la expresión de la insulina se regula al alza. Esta célula puede por lo tanto expresar constitutivamente la insulina pero efectúa su secreción sólo después de recibir un estímulo apropiado.

En términos de convertir a la célula capaz de producir y secretar insulina como se ha detallado anteriormente, se apreciará que esto puede haber ocurrido en un punto de tiempo anterior a la generación de las células de la presente invención o puede ocurrir simultáneamente con la modificación genética de la presente invención, siendo la transfección de las células con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático.

Las células objeto pueden haberse aislado recientemente de un individuo (tal como un individuo que puede ser el sujeto de tratamiento) o pueden haberse obtenido de una fuente no fresca, tal como de un cultivo (por ejemplo, en el que se expande el número de células) o de una preparación madre congelada de células (por ejemplo, una línea celular madre establecida tal como la línea celular Huh7ins), que se han aislado en algún punto de tiempo anterior de un individuo o de otra fuente. También debe entenderse que las células objeto, antes de experimentar la manipulación genética de la presente invención, pueden haber experimentado alguna otra forma de tratamiento o manipulación, tal como pero no limitado a enriquecimiento o purificación, modificación del estado del ciclo celular o la formación de una línea celular. De acuerdo con esto, la célula objeto puede ser una célula primaria o una célula secundaria. Una célula primaria es una que se ha aislado de un individuo. Una célula secundaria es una que, después de su aislamiento, ha experimentado alguna forma de manipulación in vitro antes de la manipulación genética de la presente invención.

La célula objeto es un hepatocito. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, se sabe que los hepatocitos juegan un papel crucial en el metabolismo intermedio, síntesis y almacenamiento de proteínas en el hígado. Aún más, las células hepáticas expresan de manera inherente el transportador de glucosa de alta capacidad GLUT2, siendo éste uno de los elementos clave del sistema sensor de glucosa que regula la liberación de insulina de las células β pancreáticas en respuesta a pequeños cambios de nutrientes externos. De acuerdo con esto, cuando se usan hepatocitos, en lugar de introducir la modificación genética de la presente invención (que es la incorporación de un gen que expresa glucoquinasa de islote pancreático) generalmente sólo es necesario manipularlos de otra manera para introducir la capacidad de expresar el gen de la insulina.

La presente invención proporciona por lo tanto un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicho hepatocito con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano.

Como se ha detallado anteriormente en la presente memoria, se ha determinado que la expresión de una glucoquinasa, per se, aunque permite la capacidad de respuesta celular a la glucosa, puede no resultar necesariamente en la capacidad de respuesta a la glucosa que mimetiza los eventos fisiológicos asociaos con el funcionamiento pancreático normal. Por ejemplo, la enzima glucoquinasa que se expresa endógenamente por los hepatocitos, aunque puede considerarse aceptable en el contexto del funcionamiento hepático normal, no es ideal en el contexto del funcionamiento pancreático ya que es efectivamente "hiper-responsiva" ya que dichas células, si se transfectan con un gen que codifica insulina, se estimularán para expresar y secretar insulina a concentraciones de glucosa extracelulares que están por debajo de aquellas a las que las células β de islote pancreático normales producirán insulina. En el contexto de los seres humanos, por ejemplo, las células β de islotes pancreáticos normales producirán insulina en respuesta a concentraciones de glucosa extracelulares del orden de 4-5 mM mientras algunos hepatocitos, si se modifican por ingeniería genética para producir insulina, son capaces de responder a niveles de glucosa muy por debajo de 4 mM, presentando de esta manera el potencial de inducir hipoglucemia si no se gestionan apropiadamente.

Para este fin, la referencia a una célula modificada genéticamente que es responsiva a la glucosa de una "manera fisiológicamente relevante" debe entenderse como una referencia a una célula que produce insulina en respuesta a sustancialmente el mismo intervalo de concentración de glucosa al que normalmente responderían las células β de islote pancreático del mamífero en cuestión. Esto es, la capacidad de respuesta a glucosa objeto no es tal que se induzca un estado fisiológicamente inaceptable de hipoglucemia. Debe apreciarse, por lo tanto, que este intervalo de concentración puede variar de un mamífero a otro. En el contexto de los seres humanos, el intervalo de concentración de glucosa relevante es aproximadamente 4-5 mM de glucosa. En términos de superar este problema, se ha determinado además que cuando se quiere generar una célula secretora de insulina responsiva a glucosa, el problema asociado con capacidad aumentada de respuesta a glucosa puede superarse diseñando la célula para expresar glucoquinasa de islote pancreático. Se ha encontrado que las células que se han transfectado con el gen que codifica esta forma particular de glucoquinasa consiguen una capacidad de respuesta fisiológica a los niveles de glucosa extracelulares que mimetiza la observada por las células β de islote pancreático normales.

La presente invención está dirigida a un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicho hepatocito con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático y en el que dicha célula responde a la glucosa de una manera fisiológicamente relevante.

La referencia a "glucoquinasa de islote pancreático" debe entenderse como una referencia a una forma de glucoquinasa que se expresa por células de islote pancreático. Para este fin, la referencia a las proteínas que se expresan por las células de la presente invención, tales como "insulina", "transportador de glucosa", "GLUT 2", "glucoquinasa" y "glucoquinasa de islote pancreático" debe entenderse como una referencia a todas las formas de estas proteínas y a derivados funcionales y homólogos de éstas. Esto incluye, por ejemplo, todas las isoformas que surgen de corte y empalme alternativo del ARNm que codifica estas moléculas o mutantes funcionales o variantes polimórficas de estas proteínas. Por ejemplo, la referencia a "insulina" debe entenderse como una referencia a todas las formas de insulina incluyendo, pero no limitado a, formas precursoras (por ejemplo, proinsulina), productos divididos o proinsulina parcialmente escindida (por ejemplo, des 32,33 insulina y des 64,65 insulina), insulina madura (por ejemplo, el producto obtenido después de escisión de proinsulina) la cadena α o β de la insulina en el aislamiento o varias isoformas de insulina debidas a la traducción de variantes de corte y empalme del ARNm. Por ejemplo, la línea celular Huh7ins produce proinsulina como el producto bioactivo ya que las células hepáticas no expresan naturalmente las enzimas PC2 o PC3 que escinden proinsulina a insulina. En otro ejemplo, la glucoquinasa de islote pancreático es la forma humana de esta molécula y, aún más preferiblemente, la forma codificada por SEQ ID NO:2.

La referencia a "mamífero" debe entenderse que incluye referencia a un mamífero tal como pero no limitado a ser humano, primate, ganado (animal (por ejemplo, oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de compañía (por ejemplo, perro, gato), animal de ensayo de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, cobaya, hámster), animal salvaje cautivo (por ejemplo, zorro, ciervo). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano o primate. Lo más preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un hepatocito humano modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicho hepatocito con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano.

Preferiblemente, dicha glucoquinasa de islote pancreático es glucoquinasa de islote pancreático humano codificada por SEQ ID NO:2.

Los "derivados" de las moléculas descritas en la presente memoria (por ejemplo, insulina, GLUT 2, transportadores de glucosa en general, glucoquinasa y semejantes) incluyen fragmentos, partes, porciones o variantes funcionales. Los derivados puedenderivarde la inserción, deleción o sustitución de aminoácidos.Losderivados insercionales de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxílico terminales así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples aminoácidos.Lasvariantesdesecuencia de aminoácidos insercionalesson aquellas en lasqueuno omás residuos de aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en la proteína aunque la inserción aleatoria también es posible con un cribado adecuado de la funcionalidad del producto resultante. Las variantes delecionales se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia.

Las variantes de aminoácidos sustitucionales son aquellas en las que al menos un residuo en una secuencia se ha eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las adiciones a secuencias de aminoácidos incluyen fusiones con otros péptidos, polipéptidos o proteínas, como se ha detallado anteriormente.

Los derivados también incluyen fragmentos que tienen regiones particulares de la proteína completa fusionados a péptidos, polipéptidos u otras moléculas proteináceas o no proteináceas. Por ejemplo, la insulina o derivado de ésta puede fusionarse con otra molécula con el fin de tener un efecto agonista de su actividad. En otro ejemplo, puede ser deseable facilitar la co-expresión tanto de proinsulina como una enzima de escisión. Los derivados de secuencias de ácido nucleico que pueden utilizarse según el método de la presente invención pueden derivar de manera similar de sustituciones, deleciones y/o adiciones de un único o múltiples nucleótidos incluyendo la fusión con otras moléculas de ácido nucleico. Los derivados de secuencias de ácido nucleico también incluyen variantes degeneradas.

Una "variante"debe entendersequesignificauna moléculaque presentaalmenos parte de la actividad funcionalde la forma de la molécula de la que es una variante. Una variación puede tener cualquier forma y puede ser natural o no natural. Por "homólogo" se quiere decir que la molécula deriva de una especie distinta de la que se está tratando según el método de los aspectos de tratamiento de la presente invención. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se determina que una especie distinta de la que se está tratando produce una forma de la molécula objeto que presenta una funcionalidad adecuada. En el contexto de la insulina, por ejemplo, se podía utilizar el gen de la insulina de un mamífero no humano, incluso cuando se propone utilizar las células de la invención en un contexto humano.

Como se ha detallado anteriormente en la presente memoria, las células de la presente invención están modificadas genéticamente. Esta modificación genética puede ocurrir en uno o ambos de dos contextos. En primer lugar, la célula puede haberse modificado genéticamente con el fin de convertirla en "capaz de secretar insulina". En segundo lugar, la célula objeto también se transfecta con una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático. De acuerdo con esto, por "modificada genéticamente" se quiere decir que la célula objeto ha experimentado alguna forma de manipulación molecular respecto a la que se observa en el contexto de la mayoría de una población no modificada correspondiente. Dichas modificaciones incluyen pero no están limitadas a:

(i)

La introducción de material de ácido nucleico homólogo o heterólogo en la célula. Por ejemplo, la célula se convierte en transgénica mediante la introducción de todo o parte de uno o más genes. Esto ocurre claramente en el contexto de la transfección de una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático pero también puede ocurrir hasta el grado de que la célula debe convertirse en "capaz de secretar insulina". Los genes que se introducen pueden codificar un producto proteico, tal como insulina, glucoquinasa o un transportador de glucosa. Alternativamente, el gen objeto puede corresponder a una molécula reguladora tal como un promotor, por ejemplo cuando sólo se busca modular la transcripción de un gen existente. Preferiblemente, la célula se transfecta con una molécula de ácido nucleico que codifica insulina o un derivado u homólogo de ésta. Aún más preferiblemente, la célula se transfecta de manera permanente con ADNc o ADN genómico que codifica insulina y/o glucoquinasa de islote pancreático o un derivado u homólogo de éstas. Sin embargo, pueden generarse células que expresen de manera transitoria una molécula de ácidonucleico que codificaestasmoléculas.Esto puede serútilen determinadas circunstancias en las que, por ejemplo, un individuo sólo presentará de manera temporal síntomas de diabetes debido a la regulación a la baja temporal de la actividad desus células β.Esto puedeserútil,porejemplo, en el tratamiento de afecciones transitorias tales como diabetes gestacional. En otro ejemplo, en lugar de transfectar una molécula de ácido nucleico que codifica estasmoléculas en la célula,se activa un gen genómico endógeno pero no expresado, esto es, se induce o incluso se regula al alza la expresión del gen en el que el gen bien no se expresa

o no se expresa en niveles lo suficientemente altos. Además de la modificación de las células de la presente invención para producir proteínas que son directamente relevantes para la producción de insulina, otros genes relevantes para optimizar la generación de las células objeto, y que también pueden introducirse, incluyen genes que codifican proteínas marcadoras tales como EGFP. Los marcadores deselección, tales como genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, gen de resistencia G418 que permite la selección de células de mamífero usando el análogo de neomicina G418 o gen de resistencia a puromicina), proporcionan un medio conveniente para seleccionar transformantes exitosos mientras la incorporación de un gen suicida, tal como el gen de timidina quinasa pMC-1, facilita la eliminación in vivo de las células introducidas modificadas genéticamente posteriormente a la finalización del régimen de tratamiento. Aunque no es probable que esto se requiera en el contexto del tratamiento de la diabetes de Tipo I, puede ser relevante cuando se requiere un régimen de tratamiento transitorio tal como en el contexto de la diabetes gestacional o algunas formas suaves de diabetes de Tipo II.

(ii)

La modulación de la expresión de un gen, por ejemplo, mediante la inducción de la regulación al alza de la expresión de un gen que de otra manera no se expresaría, o la mutación de ADN endógeno, por ejemplo, para regular a la baja o convertir en no funcional un gen no deseado, tal como el gen de glucoquinasa hepática endógena.

La referencia a un "ácido nucleico" debe entenderse como una referencia tanto a ácido desoxirribonucleico como ácido ribonucleico de éste. La molécula de ácido nucleico objeto puede ser cualquier forma adecuada de molécula de ácido nucleico incluyendo, por ejemplo, una molécula genómica, de ADNc o de ácido ribonucleico. Para este fin, el término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de ADN o traducción de ARN que resulta en la síntesis de un péptido, polipéptido o proteína. Una construcción de ADN, por ejemplo, corresponde a la construcción que se puede buscar para transfectarla en una célula para la expresión posterior mientras un ejemplo de una construcción de ARN es la molécula de ARN transcrita a partir de la construcción de ADN, construcción de ARN que sólo requiere la traducción para generar la proteína de interés. La referencia a "producto de expresión" es una referencia al producto producido a partir de la transcripción y traducción de una molécula de ácido nucleico.

El término "proteína" debe entenderse que engloba péptidos, polipéptidos y proteínas. También debe entenderse que estos términos se usan indistintamente en la presente memoria. La proteína puede estar glicosilada o no glicosilada y/o puede contener un rango de otras moléculas fusionadas, ligadas, unidas o asociadas de otra manera a la proteína tales como lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas (tal como ocurriría cuando la proteína de interés se produce como una proteína de fusión con otra molécula, por ejemplo GST o EGFP). La referencia de aquí en adelante en la presente memoria a una "proteína" incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos así como una proteína asociada con otras moléculas tales como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas.

El experto en la técnica apreciará que el mecanismo por el que se introducen estas modificaciones genéticas puede tener cualquier forma adecuada que será muy conocida y entendida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el material genético generalmente se introduce convenientemente en las células mediante el uso de una construcción de expresión. Alternativamente, se puede buscar usar, como la población celular de partida, un tipo celular que bien naturalmente ocomo un resultado demanipulación genética bien aleatoria o dirigida anteriorse caracteriza poruna

o más de las modificaciones genéticas de interés (por ejemplo, se puede buscar introducir la modificación de la glucoquinasa de islote pancreático en una célula que se ha modificado previamente en términos de convertirla en "capaz de secretar insulina". La modificación de una línea celular tal como Huh7ins, como se discute con mayor detalle posteriormente en la presente memoria, que es una línea celular hepática transfectada con ADN que codifica insulina es uno de dichos ejemplos).

Lo más preferiblemente,dicha modificación genética esla transfección de una célula capazde secretarinsulina con una construcción de expresión que comprende una o más regiones de ADN que comprenden un promotor unido de manera operativa a una secuencia que codifica una glucoquinasa de islote pancreático y, opcionalmente, una segunda región de ADN que codifica un marcador seleccionable y, opcionalmente, una tercera región de ADN que codifica una proteína suicida. En otra realización preferida, la construcción también puede comprender ADN que codifica insulina y/o un transportador de glucosa en el que la célula objeto no se ha convertido previamente en "capaz de secretar insulina".

El promotor objeto puede ser constitutivo o inducible. Cuando la construcción objeto expresa más de una proteína de interés, éstas pueden estar bajo el control de promotores separados o pueden estar bajo el control de un único promotor, tal como ocurre en el contexto de un vector bicistrónico que usa una secuencia IRES para facilitar la traducción de más de un producto proteico, en una forma no fusionada, a partir de un único transcrito de ARN. La construcción objeto puede diseñarse adicionalmente para facilitar el uso del sistema de expresión génica inducible porcorte y empalme mediado por la recombinasa Cre.

La referencia a una "construcción de expresión" de ácido nucleico debe entenderse como una referencia a una molécula de ácido nucleico que es transmisible a una célula y diseñada para experimentar transcripción. La molécula de ARN se transcribe a partir de ésta. En general, las construcciones de expresión también se refieren por varios términos alternativos, términos que se utilizan ampliamente indistintamente, incluyendo "casete de expresión" y "vector".

La construcción de expresión de la presente invención puede generarse por cualquier método adecuado incluyendo técnicas recombinantes o sintéticas. Para este fin, la construcción objeto puede construirse desde el principio, como ocurriría cuando se utiliza una estrategia completamente sintética, o puede construirse modificando apropiadamente un vector existente. Cuando se adopta la última estrategia, el intervalo de vectores que se podrían utilizar como punto de partida es extenso e incluye, pero no está limitado a:

(i) Plásmidos

Los plásmidos son pequeñas partes que se replican independientemente de ADN citoplásmico, que generalmente se encuentran en células procariotas, que son capaces de replicación autónoma. Los plásmidos se usan comúnmente en el contexto de la clonación molecular debido a su capacidad de ser transferidos de un organismo a otro. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, los plásmidos pueden permanecer episomales o pueden incorporarse en el genoma de un huésped. Los ejemplos de plásmidos que se podrían utilizar incluyen los derivados de bacterias pBR322 y pUC.

(ii) Bacteriófago

Los bacteriófagos son virus que infectan y se replican en bacterias. Consisten generalmente en un núcleo de ácido nucleico encerrado en una recubierta proteica (denominada la cápside). Dependiendo del tipo de fago, el ácido nucleico puede ser bien ADN (mono o bicatenario) o ARN (monocatenario) y pueden ser bien lineales o circulares. Los fagos pueden ser filamentosos, poliédricos o poliédricos y con cola, las colas tubulares a las que están unidas una o más fibras de cola tubulares. Los fagos pueden acomodar generalmente fragmentos más grandes de ADN extraño que, por ejemplo, los plásmidos. Los ejemplos de fagos incluyen, pero no están limitados a, los fagos lambda de E. coli, bacteriófago P1 y los fagos T-even (por ejemplo, T4).

(II) Baculovirus

Éstos son cualquiera de un grupo de virus con ADN que sólo se multiplican en invertebrados y generalmente se clasifican en la familia Baculoviridae. Su genoma consiste en ADN circular bicatenario.

(iv) Cromosomas Artificiales

Cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales de levadura o cromosomas artificiales bacterianos.

(v) Vectores híbridos tales como cósmidos, fagémidos y plásmidos

Los cósmidos derivan generalmente de plásmidos pero también comprenden sitios cos para fago lambda mientras los fagémidos representan un vector quimérico fago-plásmido. Los fásmidos generalmente también representan una quimera plásmido-fago pero se definen gracias al hecho de que contienen orígenes funcionales de replicación de ambos. Los fásmidos pueden propagarse por lo tanto bien como un plásmido o un fago en una cepa huésped apropiada.

(vI) Vectores disponibles comercialmente que en sí mismos se generan completamente sintéticamente o son versiones modificadas de vectores naturales, tal como el vector bicistrónico pIRESpuro3.

El experto en la técnicaentenderá quela selección de unvectorapropiado parala modificación, hasta elgrado en el que se elige hacer esto en lugar de generar sintéticamente una construcción, dependerá de varios factores incluyendo eluso último en el que se aplicará la célulamodificadagenéticamente.Porejemplo,cuando la célula se va a administrar in vivo en un serhumano,puedesermenos deseableutilizardeterminados tiposde vectores,tales como vectores virales. Además, es necesario considerar la cantidad de ADN que se piensa introducir en la construcción. Se entiende generalmente que determinados vectores se transfectan más fácilmente en determinados tipos celulares. Por ejemplo, el rango de tipos celulares que pueden actuar como huésped para un plásmido dado puede variardeun tipo de plásmido a otro.En aún otro ejemplo,cuandomás grande sea elinserto de ADN que se requiere insertar, más limitada es la elección del vector a partir del que se genera la construcción de expresión de la presente invención. Para este fin, el tamaño del ADN insertado puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño de la secuencia de ADN quecodifica la proteínadeinterés, el número de proteínasque se piensa expresar, el número de marcadores de selección que se utilizan y la incorporación de características tales como regiones de policonector de linearización y semejantes.

La construcción de expresión que se usa en la presente invención puede ser de cualquier forma incluyendo circular

o lineal. En este contexto, una secuencia de nucleótidos "circular" debe entenderse como una referencia a la parte de secuencia de nucleótidos circulardecualquiermoléculadenucleótidos.Porejemplo,lasecuenciadenucleótidos puede ser completamente circular, tal como un plásmido, o puede ser parcialmente circular, tal como la parte circular de una molécula de nucleótidos generada durante replicación en círculo rodante (esto puede ser relevante, por ejemplo, cuando una construcción se replica inicialmente, antes de su introducción en una población celular, por este tipo de método en lugar de mediante un sistema de clonación basado en células). En este contexto, la secuencia de nucleótidos "circular" corresponde a la parte circular de esta molécula. Una secuencia de nucleótidos "lineal" debe entenderse como una referencia a cualquiersecuencia de nucleótidos que esencialmente está en forma lineal. La secuencia lineal puede ser una molécula de nucleótidos lineal o puede ser una parte lineal de una molécula de nucleótidos que también comprende una parte no lineal tal como una parte circular. Un ejemplos de una secuencia de nucleótidos lineal incluye, pero no está limitada a, una construcción derivada de plásmido que se ha linearizado conelfindefacilitarsuintegraciónenlos cromosomasdeuna célulahuéspedouna construcción quese ha generado sintéticamente en forma lineal. Para este fin, debe entenderse que la configuración de la construcción de la presente invención puede o no permanecer constante. Por ejemplo, una construcción derivada de plásmido circular puede transfectarse en una célula donde permanece como un episoma circular estable que experimenta replicación ytranscripción en esta forma. Sin embargo, en otro ejemplo, la construcción objeto puede ser una que se transfecta en una célula en forma circular pero experimenta linearización intracelular antes de la integración cromosómica. Ésta no es necesariamente una situación ideal ya que dicha linearización puede ocurrir de una manera aleatoria y escinde potencialmente la construcción en una región crucial convirtiéndola de esta manera en inefectiva.

Las moléculas de ácido nucleico que se utilizan en el método de la presente invención pueden derivar de cualquier fuente humana o no humana. Las fuentes no humanas contempladas por la presente invención incluyen primates, animales de granja (por ejemplo, ovejas, cerdos, vacas, cabras, caballos, burros), animal de ensayo de laboratorio (por ejemplo, ratones, hámsteres, conejos, ratas, cobayas), animales de compañía domésticos (por ejemplo, perros, gatos), pájaros (por ejemplo, pollo, ganso, patos y otras aves de corral, aves de caza, emus, avestruces), animales salvajes cautivos o domesticados (por ejemplo, zorros, canguros, dingos), reptiles, peces, insectos, organismos procariotas o ácidos nucleicos sintéticos.

Debe entenderse que las construcciones de la presente invención pueden comprender material de ácido nucleico de más de una fuente. Por ejemplo, mientras la construcción puede originarse de un plásmido bacteriano, al modificar ese plásmido para introducir las características definidas en la presente memoria puede introducirse material de ácido nucleico de fuentes no bacterianas. Estas fuentes pueden incluir, por ejemplo, ADN viral (por ejemplo, ADN IRES), ADN de mamíferos (por ejemplo, el ADN que codifica la glucoquinasa de islote pancreático) o ADN sintético (porejemplo,para introducirsitiosespecíficosde endonucleasa de restricción).Aún más,eltipocelularen el que se propone expresar la construcción objeto puede ser diferente de nuevo respecto a que no corresponde al mismo organismo que todo o parte del material de ácido nucleico de la construcción. Por ejemplo, una construcción que consiste en ADN derivado esencialmente de bacterias o virus puede expresarse no obstante en las células madre de mamíferos contempladas en la presente memoria.

Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, la presente invención se ejemplifica en el contexto de un vector bicistrónico que expresa glucoquinasa de islote pancreático que se transfecta en células que ya son "capaces de secretar insulina" en el contexto de la definición anterior. Específicamente, el ADNc que codifica glucoquinasa de islote pancreático se transfecta en el sitio de multiclonación de pIRESpuro3. Aún sin limitar la invención de ninguna manera, el vector bicistrónico pIRESpuro3 ejemplificado en la presente memoria contiene el sitio de entrada de ribosoma interno del virus de la encefalomiocarditis, que permite la traducción de dos marcos de lectura abiertos a partir de un ARN mensajero (Jackson et al., 1990, Trends Biochem. Sci. 15: 477-483; Jang et al., 1988,J.Virol.62:2636-2643;Rees etal.,1996,BioTechniques 20:102-104).Después de selección con puromicina, es probable que la mayor parte de las colonias supervivientes exprese de manera estable la glucoquinasa de islote pancreático, disminuyendo así la necesidad de cribar grandes números de colonias para encontrar clones funcionales (siendo ésta una ventaja particular de los vectores bicistrónicos). Para seleccionar las células que expresan altos niveles de glucoquinasa de islote pancreático, se incrementa la presión selectiva para resistencia a antibiótico debido al posicionamiento del gen de resistencia a puromicina en 3' en una posición menos óptima para la traducción según dirige por la secuencia IRES (Rees et al., 1996, supra). Mediante la disminución del nivel de expresión del marcador de resistencia a antibiótico, se incrementa la presión selectiva en el casete de expresión completo, lo que resulta en la selección de células que expresan el transcrito completo, incluyendo la glucoquinasa de islote pancreático, a niveles altos. El casete de expresión de pIRESpuro3 contiene el promotor/potenciador inmediato temprano principal del citomegalovirus humano seguido de un sitio de clonación múltiple que precede a los codonesdeparada en los tresmarcos de lectura,unintrón sintético que sesabe que aumenta la estabilidad del ARNm (Huang y Gorman, 1990, Nucleic Acids Res. 18: 937-947), el IRES ECMV seguido del gen que codifica resistencia a puromicina (puromicin-N-acetil-transferasa; de la Luna et al., 1988, Gene 62: 121-128), y la señal de poliadenilación de SV40. Los ribosomas pueden entrar en el ARNm bicistrónico en el extremo 5' para traducir el gen de interés y en IRES ECMV para traducir el marcador de resistencia a antibiótico. Debe entenderse que el vector de expresión ejemplificado en la presente memoria sólo se proporciona como ejemplo y no se pretende que limite de ninguna manera el rango y diseño de vectores que podrían usarse para conseguir el objeto de la presente invención.

La presente invención proporciona por lo tanto un hepatocito humano modificado genéticamente, hepatocito que es capaz de secretar insulina, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicha célula con un vector, vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la glucoquinasa de islote pancreático.

Preferiblemente, dicho vector es un vector bicistrónico y dicha glucoquinasa de islote pancreático está en la forma codificada por SEQ ID NO:2.

Aún más preferiblemente, dicho vector bicistrónico es pIRESpuro3 y lo más preferiblemente definido por SEQ IQ NO:3.

Todavía más preferiblemente, dicha célula modificada genéticamente es capaz de responder a glucosa de una manera fisiológicamente relevante y, lo más preferiblemente, a niveles de glucosa extracelulares en el intervalo de 38 mM, preferiblemente 3,5-7 mM, más preferiblemente 4-6 mMy lo más preferiblemente 4-5 mM.

Como apreciará el experto en la técnica, la generación de las células de la presente invención puede requerir la aplicación de una etapa de cribado y selección para identificar y aislar las células que han incorporado con éxito la modificación genética de interés. Los métodos de identificación serán muy conocidos para el experto en la técnica e incluyen, pero no están limitados a:

(i) Detección de proteínas celulares específicas.

La detección de proteínas específicas, tales como proteínas de la superficie celular o proteínas intracelulares (por ejemplo, insulina, GLUT 2, glucoquinasa etc.), puede efectuarse convenientemente mediante marcaje de afinidad de fluorescencia y microscopía de fluorescencia, por ejemplo. Brevemente, se incuban anticuerpos marcados fluorescentemente en células fijadas para detectar marcadores cardiacos específicos. Alternativamente, pueden emplearse técnicas tales como inmunotransferencia Western o micro matrices de hibridación ("chips de proteína"). A este respecto, este método puede utilizarse para identificar tipos celulares bien mediante una etapa de selección positiva o negativa tomando como base la expresión de una cualquiera o más moléculas.

(ii) Detección de ARN o ADN celular específico.

Este método se efectúa preferiblemente usando RT-PCR o en tiempo real (qRT-PCR). Alternativamente, otros métodos que pueden usarse incluyen micromatriz de hibridación ("chip de ARN") o transferencia Northern o transferencia Southern. Puede usarse RT-PCR para detectar ARN específicos que codifican esencialmente cualquier proteína, tal como las proteínas detalladas en el punto (ii) anterior, o proteínas que se secretan o que de otra forma no son detectables convenientemente mediante la metodología detallada en el punto (ii).

(iii) Detección de actividad funcional celular específica.

Aunque el análisis de una población celular en términos de su funcionamiento se considera generalmente como un método menos conveniente que los métodos de cribado de los puntos (i)-(ii), en algunos casos éste puede no ser el caso. Por ejemplo, en la medida en que se busca establecer la existencia de un sistema sensor de glucosa funcional, puede evaluarse la producción de insulina de una célula de la invención en presencia de niveles variados de glucosa extracelular.

(iv) Pueden llevarse a cabo otros medios de cribado para la integración estable y el mantenimiento de la modificación (por ejemplo, en el contexto de la generación de una línea celular y por lo tanto cultivo celular a largo plazo) que incluyen el cribado para la expresión de un marcador de selección, tal como EGFP, que proporciona un medio más conveniente para establecer la integración de una modificación genética, en particular cuando la expresión del marcador está ligada inextricablemente a la modificación de interés, tal como mediante el uso de un vector bicistrónico.

Debe entenderse que en términos de caracterizar la población de células generada en el contexto de la presente invención, puede utilizarse una cualquiera o más de las técnicas detalladas anteriormente.

Como se ha detallado anteriormente en la presente memoria, la célula modificada de la presente invención es un hepatocito, siendo éste un tipo celularque podría decirse que requiere menos modificación para convertirlo en capaz de secretar insulina que otros tipos celulares debido al hecho de que expresa de manera inherente el transportador de glucosa de alta capacidad, GLUT 2. Sin embargo, aunque los hepatocitos también expresan de manera inherente glucoquinasa, en el contexto de la capacidad de respuesta de la insulina,se podría decir que esta molécula funciona de una manera hipersensible ya que resulta en la expresión de un gen de insulina transfectado a niveles de glucosa extracelulares de tan poco como 2,5 mM, estando éste por debajo del intervalo fisiológico en el que las células de islote pancreático producen generalmente insulina en el ser humano. De acuerdo con esto, los desarrollos de la presente invención son una etapa significativa hacia adelante ya que superan este problema.

Según esta realización preferida, el hepatocito objeto puede recogerse en freso o puede derivar de una línea celular. Aún más, puede ser uno para el que se requiera convertirlo en capaz de secretar insulina mediante la transfección del ADN que codifica insulina (ocurriendo esto bien separadamente a o simultáneamente con la modificación genética de la glucoquinasa de islote pancreático descrita en la presente memoria) o puede haberse convertido ya. Preferiblemente, dicho hepatocito es una célula Huh7ins, siendo ésta una línea celular que se ha modificado para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica insulina. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, Huh7ins es una línea celular hepática modificada por ingeniería genética que almacena y secreta insulina en respuesta a glucosa. Sin embargo, estas células son hiper-responsivas en el sentido fisiológico ya que pueden comenzar a secretar insulina a niveles sub-fisiológicos de glucosa (por ejemplo, 2,5 mM), comparado con entre 4-5 mM de glucosa para el funcionamiento de células β pancreáticas humanas normales, dando lugar potencialmente de esta manera al inicio de hipoglucemia.Se piensa queestas células presentan un desequilibrio en la proporción glucoquinasa:hexoquinasa a favor de las hexoquinasas lo que resulta en un flujo glicolítico aumentado a niveles bajos de glucosa y consecuentemente sensibilidad incrementada de la respuesta de secreción de insulina estimulada por glucosa. Para este fin, se ha determinado inesperadamente que aunque existe un gen de glucoquinasa endógeno funcional en los hepatocitos tales como Huh7ins, la introducción del gen de glucoquinasa pancreática actúa no obstante para superar el problema asociado con la actividad del gen de glucoquinasa de hepatocito endógena.

La presente invención proporciona por lo tanto lo más preferiblemente una célula Huh7ins modificada genéticamente, comprendiendo dicha modificación genética la transfección de dicha célula Huh7ins con un vector, vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático.

Preferiblemente, dicho vector es un vector bicistrónico y dicha glucoquinasa de islote pancreático es la forma codificada por SEQ ID NO:2.

Aún más preferiblemente, dicho vector bicistrónico es pIRESpuro3 y lo más preferiblemente es SEQ ID NO:3.

Todavía más preferiblemente, dicha célula Huh7ins modificada genéticamente es una célula Melligen.

El desarrollo de la presente invención ha facilitado ahora el desarrollo de medios para tratar terapéuticamente o profilácticamente afecciones patológicas caracterizadas por la producción aberrante, preferiblemente insuficiente o inadecuada, de insulina funcional. Este problema puede deberse a una cualquiera de varias causas incluyendo, pero no limitado a, destrucción de células β pancreáticas, el funcionamiento aberrante del sistema sensor de glucosa de las células β, defectos en la expresión del gen de la insulina o defectos en la funcionalidad del producto de expresión de la insulina en sí mismo. De acuerdo con esto, la referencia a una afección patológica "caracterizada por la producción aberrante de insulina funcional" debe entenderse como una referencia a cualquier afección, un síntoma o causa de la cual es niveles insuficientes o inadecuados de insulina funcionalmente efectiva. De acuerdo con esto, como se ha detallado anteriormente, esto puede deberse a defectos en la célula β en sí misma, el sistema sensor de glucosa o los niveles de expresión o funcionalidad del producto de expresión de la insulina.

De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención está dirigido a células modificadas genéticamente como se ha definido anteriormente en la presente memoria, para uso en el tratamiento de una afección en un mamífero, afección que se caracteriza por la producción aberrante de insulina funcional.

Preferiblemente, dicha afección es diabetes.

La referencia a "diabetes" debe entenderse como una referencia a una afección en la que se producen niveles insuficientes de insulina para mantener niveles de glucosa biológicamente normales. Esto puede deberse a defectos congénitos en las células de los islotes pancreáticos, el inicio de una respuesta autoinmune dirigida a las células P pancreáticas (por ejemplo diabetes de tipo 1/IDDM, diabetes gestacional o IDDM lentamente progresiva que también se refiere como diabetes autoinmune latente en adultos), defectos en el funcionamiento de las células de los islotes pancreáticos causados por factores medioambientales tales como dieta o estrés (por ejemplo, diabetes de tipo 2/diabetes de inicio adulto), daño en las células de los islotes pancreáticos tal como, pero no limitado a, causado por lesión física, la degeneración de las células de los islotes pancreáticos debido a afecciones no autoinmunes o como un efecto secundario debido al inicio o tratamiento de una afección patológica no relacionada.

En un aspecto relacionado de la presente invención, el sujeto sometido a tratamiento o profilaxis puede ser cualquier ser humano o animal que necesita el tratamiento terapéutico o profiláctico. A este respecto, la referencia en la presente memoria a "tratamiento" y "profilaxis" debe considerarse en su contexto más amplio. El término "tratamiento" no implica necesariamente que un mamífero se trate hasta la recuperación total. De manera similar, "profilaxis" no significa necesariamente que el sujeto con contraerá eventualmente una afección patológica. De acuerdo con esto, tratamiento y profilaxis incluyen la mejora de los síntomas de una afección particular o prevenir o reducir de otra forma el riesgo de desarrollar una afección particular. El término "profilaxis" puede considerarse como reducir la gravedad del inicio de una afección particular. El "tratamiento" también puede reducir la gravedad de una afección existente.

La presente invención debe entenderse por lo tanto que engloba prevenir, reducir o mejorar de otra forma la diabetes en un mamífero. Esto debe entenderse como una referencia a la prevención, reducción o mejora de uno cualquiera o más síntomas de la diabetes mediante la producción de insulina. Los síntomas de la diabetes incluyen, pero no están limitados a, niveles de glucosa o regulación del nivel de glucosa anormales, niveles de insulina anormales, sed, micción frecuente, pérdida de peso, visión borrosa, dolor de cabeza y dolor abdominal. Debe entenderse que la presente invención puede reducir la gravedad de uno cualquiera o más síntomas o eliminar la existencia de uno cualquiera o más síntomas. Por ejemplo, el método de la presente invención puede normalizar bien completamente o parcialmente los niveles de glucosa en un individuo diabético. Aunque lo más deseable es la normalización completa, la normalización parcial es útil no obstante, por ejemplo, para reducir el riesgo de que un individuo diabético de tipo 1sucumba auncomadiabético.La presente invenciónse extiende aprevenirelinicio de uno cualquiera o más síntomas de la diabetes. Por ejemplo, en individuos que están predispuestos al desarrollo de la diabetes, cuyas células de los islotes pancreáticos se están degenerando gradualmente o que han padecido un daño agudo e irreparable en las células de los islotes pancreáticos, la presente invención puede emplearse para restaurar la producción de insulina antes de la aparición de uno cualquiera o más de los síntomas de la diabetes.

Según este aspecto de la invención, las células objeto son preferiblemente células autólogas que se aíslan y modifican genéticamente ex vivo y se trasplantan de nuevo en el individuo del que se recogieron originalmente. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención se extiende no obstante al uso de células derivadas de cualquier otra fuente adecuada en el que las células objeto presentan el mismo perfil de histocompatibilidad mayor que el individuo que es elsujeto de tratamiento. De acuerdo con esto, dichas células son efectivamente autólogas ya que no resultarían en los problemas de histocompatibilidad que están asociados normalmente con el trasplante de células que presentan un perfil MHC extraño. Dichas células debe entenderse que se encuentran en la definición de "autólogas". Por ejemplo, en determinadas circunstancias puede ser deseable, necesario o de significancia práctica que las células objeto se aíslen de un gemelo genéticamente idéntico, o de un embrión generado usando gametos derivados del individuo objeto o clonados del individuo objeto (en este caso, las células probablemente correspondan a células madre que han experimentado diferenciación dirigida hasta un tipo celular somático apropiado). Las células también pueden haberse modificado por ingeniería para presentar el perfil de histocompatibilidad mayor deseado. El uso de dichas células supera las dificultades que se encuentran de manera inherente en el contexto de trasplantes de tejido u órgano.

Sin embargo, cuando no es posible o factible aislar o generar células autólogas, puede ser necesario utilizar células alogénicas.Células"alogénicas" son aquellas que se aíslan de la misma especieque elsujeto que seestá tratando pero que presentan un perfil MHC diferente. Aunque el uso de dichas células en el contexto de terapéuticos necesitará probablemente el uso de tratamiento de inmunosupresión, este problema puede minimizarse sin embargo por el uso de células que presentan un perfil MHC que presenta similitud con el del sujeto que se está tratando, tal como una población celular que se ha aislado/generado de un pariente tal como un hermano, padre o hijo. También se contempla en la presente memoria el uso de líneas celulares establecidas tales como Huh7ins o las células Melligen que se han derivado de ellas. La presente invención también debe entenderse para extenderse al trasplante xenogénico. Estos es, las células que se modifican genéticamente según la invención y se introducen en un paciente se aíslan de una especie distinta de la especie delsujeto que se está tratando.

La referencia a un "número efectivo" significa el número de células necesario para al menos conseguir parcialmente el efecto deseado, o retrasar el inicio de, inhibir la progresión de, o parar conjuntamente el inicio o la progresión de la afección particular que se está tratando. Dichas cantidades dependerán, porsupuesto, de la afección particular que se está tratando, la gravedad de la afección y parámetros del paciente individual incluyendo edad, condiciones físicas, tamaño, peso, estado fisiológico, tratamiento concurrente, historial médico y parámetros relacionados con el trastorno en cuestión. Un experto en la técnica será capaz de determinar el número de células de la presente invención que constituirá una dosis efectiva, y el modo óptimo de administración de éstas sin experimentación innecesaria, discutiéndose este último aspecto adicionalmente más adelante en la presente memoria. Estos factores son muy conocidos para los expertos en la técnica y pueden abordarse con no más que experimentación rutinaria. Se prefiere generalmente usar un número máximo de células, esto es, el número más alto seguro según el criterio médico sensato. Los expertos en la técnica entenderán, sin embargo, que un número de células más bajo puede administrarse por razones médicas, razones psicológicas o por cualquier otra razón.

Como se ha discutido anteriormente en la presentememoria,debeentenderse que aunquelapresente invenciónse fundamenta en la introducción de células modificadas genéticamente en un individuo que padece una afección como se define en la presente memoria, puede no ser necesariamente el caso que cada célula de la población introducida en el individuo haya adquirido o mantendrá la modificación objeto. Por ejemplo, cuando una población de células transfectada y expandida se administra en total (es decir, las células modificadas con éxito no están enriquecidas), puede existir una proporción de células que no han adquirido o retenido la modificación genética. La presente invención se consigue por lo tanto siempre que la parte relevante de las células introducidas de esta manera constituya el "número efectivo" comose ha definido anteriormente. Sin embargo, en una realización particularmente preferida, la población de células que han experimentado diferenciación se someterán a la identificación de células modificadas con éxito, su aislamiento (por ejemplo, por separación FACS basada en EGFP o selección GST) y ensayo para una modificación genética funcional e introducción en el individuo objeto. Esto proporciona un medio para seleccionar una subpoblación de células específica para administración, tal como células que expresan niveles apropiados de la insulina y moléculassensoras de glucosa en cuestión.

En el contexto de este aspecto de la presente invención, las células objeto requieren la introducción en el individuo objeto. Para este fin, las células pueden introducirse por cualquier método adecuado. Por ejemplo, pueden introducirse suspensiones celulares por inyeccióndirecta o en un coágulo sanguíneo mediantelocuallascélulas se inmovilizan en el coágulo facilitando de esta manera el trasplante. Las células también pueden encapsularse antes del trasplante. La encapsulación es una técnica que es útil para prevenir la diseminación de las células que pueden continuar proliferando (es decir, presenta características de inmortalidad), aunque no se espera que esto sea un problema significativo cuando se administra una población pura de células diferenciadas de forma terminal (pero puede ser un problema si la población de células deriva de una línea celular inmortalizada) o para minimizar problemas de rechazo por la incompatibilidad de tejido.

Las célulastambién pueden introducirseporimplante quirúrgico.Estopuedesernecesario,porejemplo,cuando las células existen en la forma de un injerto de tejido o cuando las células se encapsulan antes del trasplante. El sitio del trasplante puede ser cualquier sitio adecuado, por ejemplo, subcutáneamente o, cuando las células donantes son células hepáticas,bajo lacápsularenal.Sin limitarla presente invenciónaninguna teoría omodo de acción,cuando las células se administran como una suspensión celular encapsulada, las células coalescerán en una masa. Debe entenderse que las células pueden continuar dividiéndose después del trasplante.

Las células que se administran al paciente pueden administrarse como dosis únicas o múltiples por cualquier ruta adecuada. Preferiblemente, y cuando sea posible, se utiliza una única administración. La administración mediante inyección puede estar dirigida a varias regiones de un tejido u órgano, dependiendo del tipo de tratamiento requerido.

Otras moléculas proteináceas o no proteináceas pueden coadministrarse bien con la introducción de las células productoras de insulina o durante la producción de insulina por las células trasplantadas. Por "coadministradas" se quiere decir administración simultánea en la misma formulación o en diferentes formulaciones a través de la misma o rutasdiferenteso administraciónsecuenciala travésde la misma o rutasdiferentes.Poradministración "secuencial" se quiere decir una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o días entre el trasplante de estas células y la administración de las moléculas proteináceas o no proteináceas o el inicio de la producción de insulina y la administración de la molécula proteinácea o no proteinácea. Por ejemplo, puede ser necesario co-administrar la enzima PC2 o PC3 para facilitar la escisión de proinsulina a insulina. Otros ejemplos de circunstancias en las que puede requerirse dicha co-administración incluyen, pero no están limitadas a:

(i)

Cuando se administran células o tejidos no singénicos a un sujeto, habitualmente ocurre rechazo inmune de dichas células o tejidos por el sujeto. En esta situación, será necesario tratar también al paciente con un régimen inmunosupresor, que comienza preferiblemente antes de dicha administración, de manera que se minimiza dicho rechazo. Los protocolos de inmunosupresión para inhibir rechazo de injerto alogénico, por ejemplo, mediante la administración de ciclosporina A, anticuerpos inmunosupresores, y semejantes son una práctica extendida y estándar.

(ii)

Dependiendo de la naturaleza de la afección que se está tratando, puede ser necesario mantener al paciente en un curso de medicación para aliviar los síntomas de la afección hasta que el momento en el que las células trasplantadas se integren y sean completamente funcionales (por ejemplo, la administración de insulina). Alternativamente, en el momento en el que se trata la afección, puede ser necesario comenzar el uso a largo plazo de medicación para prevenir la re-aparición del daño. Por ejemplo, cuando el daño objeto se causó por una afección autoinmune, el uso en curso de los fármacos inmunosupresores puede requerirse incluso cuando se han usado células singénicas. Esto dependerá, sin embargo, de la naturaleza de las células que se han modificado genéticamente yde sise corresponderán o no con una diana autoinmune.

Debe entenderse que la presente invención puede realizarse aisladamente para tratar la afección en cuestión o puede realizarse junto con una o más técnicas adicionales diseñadas para facilitar o aumentar el tratamiento objeto. Estas técnicas adicionales pueden tener la forma de la co-administración de otras moléculas proteináceas o no proteináceas, como se ha detallado anteriormente en la presente memoria.

Aunque la presente invención es particularmente adecuada para el tratamiento o profilaxis de la diabetes, no debe entenderse que está limitada al tratamiento de esta afección. En lugar de esto, la presente invención puede utilizarse para tratar cualquier afección caracterizada por la actividad funcional o niveles aberrantes, no deseados o inapropiadosdeotra forma,deuna molécula quepuedemodularse directamente oindirectamente porla insulina,tal como pero no limitado a, los niveles de glucosa y/o insulina o derivado o equivalente de ésta. La referencia a actividad funcional o niveles "aberrantes, no deseados o inapropiados de otra forma" de dicha molécula (por ejemplo, glucosa y/o insulina) debe entenderse como una referencia a niveles o actividades anormales bien de forma permanente o transitoria de estas moléculas o a niveles o actividades fisiológicamente normales de una o ambas de estasmoléculas, niveles o actividades que son no obstante no deseados o inapropiados de otra forma.

Debe entenderse que una molécula que puede modularse "directamente" por la insulina es una con la que la insulina objeto se asocia o interacciona de otra manera para regular al alza, regular a la baja o modular de otra forma su actividad funcional o niveles o para alterar de cualquier manera sus características estructurales u otras fenotípicas, moleculares u otras características físicas. El incremento de los niveles de insulina, per se, debe entenderse que se encuentra dentro del contexto de esta definición. Una molécula que puede modularse "indirectamente" por la insulina es una que se modula (en el contexto descrito anteriormente) por una molécula proteinácea o no proteinácea distinta de la insulina, molécula proteinácea o no proteinácea distinta que está modulada directamente o indirectamente por dicha insulina. De acuerdo con esto, la presente invención se extiende a la modulación de la actividad funcional o niveles de una molécula dada mediante una cascada inducida por la insulina de etapas reguladoras.

Otro aspecto de la presente invención contempla células modificadas genéticamente como se ha definido anteriormente en la presente memoria para uso en la reducción de los niveles de glucosa en un mamífero.

Aún otro aspecto de la presente invención está dirigido a células modificadas genéticamente como se ha definido anteriormente en la presente memoria para uso en el tratamiento de una afección en un mamífero, afección que está caracterizada por la producción aberrante de insulina funcional.

Preferiblemente, dicha afección es diabetes.

El desarrollo de las células de la presente invención ha facilitado ahora el desarrollo de sistemas de cribado con base in vitro para ensayar la eficacia y toxicidad de regímenes de tratamiento o cultivo existentes o potenciales.

Así, se proporciona un método para evaluar el efecto de un régimen de tratamiento o cultivo en el estado fenotípico de las células modificadas genéticamente como se ha definido anteriormente en la presente memoria, comprendiendo dicho método someter a dichas células a dicho régimen de tratamiento y cribado para un estado fenotípico alterado.

Por "alterado" se quiere decir que uno o más de los parámetros fenotípicos o funcionales que son el objeto del análisis están cambiados respecto a las células no tratadas. Éste puede ser un resultado deseable cuando el régimen de tratamiento en cuestión se diseña para mejorar o ayudar al funcionamiento celular. Sin embargo, cuando el régimen de tratamiento está asociado con un resultado perjudicial, esto puede ser indicativo de toxicidad y por lo tanto lo inadecuado de usar el régimen de tratamiento. Ahora es muy conocido que las diferencias que se observan en términos de la capacidad de respuesta de un individuo a un fármaco particular están ligadas frecuentemente a la composición genética única de ese individuo. De acuerdo con esto, dichas técnicas proporcionan un medio valioso para ensayar bien un régimen de tratamiento existente o uno nuevo que puede usarse concurrentemente con la administración de las células de la invención. Esto proporciona un medio único para evaluar la eficacia probable de un fármaco, tal como un fármaco que se propone para ser co-administrado con las células de la invención, antes de administrar el fármaco y las células in vivo.Cuandounpacienteestá extremadamentemal, el estrés psicológico que puede causar un régimen de tratamiento que causa un resultado no deseado puede evitarse o al menos minimizarse.

Por lo tanto, las técnicas anteriores pueden usarse para cribar y/o ensayar fármacos, otros regímenes de tratamiento

o condiciones de cultivo. En el contexto de la evaluación de los cambios fenotípicos o funcionales, esta estrategia puede utilizarse para monitorizar cambios en los perfiles de la expresión génica de las células y tejidos objeto. Así, estos métodos pueden usarse para determinar, por ejemplo, los cambios en el patrón de la expresión génica en respuesta a un régimen de tratamiento concomitante propuesto, tal como un régimen de tratamiento que se requiere mantener con el fin de tratar una afección no relacionada que también padece el paciente.

Preferiblemente,eltratamientoal queestánsometidaslas célulaso tejidos de la presente invencióneslaexposición a un compuesto. Preferiblemente, el compuesto es un fármaco o un ión fisiológico. Alternativamente, el compuesto puede ser un factor de crecimiento o un factor de diferenciación. Para este fin, es altamente deseable tener un método disponible que sea capaz de predecir dichos efectos secundarios en las células de la invención antes de su exposición al fármaco.

La presente invención se define adicionalmente por los Ejemplos siguientes no limitativos.

Ejemplo 1 Generación y ensayo de células Melligen Materiales y Métodos

Construcción del plásmido

El ADNc de glucoquinasa de islote humano contenido en el vector comercial pBluescript, fue un regalo del Dr M. Alan Permutt, Universidad de Washington (St Louis EEUU). El ADNc de glucoquinasa de islote humano se cortó del pBrescript SK+ por la enzima de restricción ECOR I. El fragmento de 2733 pares de bases que contiene el ADNc de glucoquinasa de islote humano se insertó en el vector de expresión pIERSpuro3 (Clontech, EEUU) en el sitio ECORI en el sitio de multiclonación (971-972 pb) (Fig.1).

Cultivo celular

LascélulasHuh7insse cultivaron comomonocapas en Medio deEagle con Modificación de Dulbecco que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS) en 5% CO2 en aire más 0,55 mg/ml G418 como se describe (Tuch et al., 2003, Gene Therapy10:490-503).

Transfección del plásmido con ADNc de glucoquinasa de islote humano

Las células Huh7ins se transfectaron con la construcción pIRESpuro3-glucoquinasa o el vector pIRESpuro3 solo usando reactivo de transfección Effectenen (Qiagen, Alemania). Veinticuatro horas después de la transfección, se añadió el antibiótico selectivo de eucariotas puromicina (1,1 μg/ml) a los cultivos. El medio más los fármacos se cambiaron cada 2-3 días. Después de 14 días de selección, las colonias se seleccionaron y se expandieron en cultivos en masa. Las células que contenían la construcción pIRESpuro3-glucoquinasa se referirán de aquí en adelante en la presente memoria como células Melligen.

Identificación de los ADNc de glucoquinasa de islote humano

Se aisló el ARN total de líneas celulares clonales usando el método Triazol™ según las instrucciones del fabricante (Gibco-BRL). La muestra de ARN se trató con ADNasa en 20 m Tris-HCl (pH 8,4), 2 mM MgCl2, y 50 mM KCl para eliminar cualquier traza de ADN genómico contaminante. El ADNc se sintetizó usando un kit de transcripción (Qiagen, Alemania). La RT-PCR se realizó en un volumen de 30 μl de tampón que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 3,5 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0,4 μMde los cebadores y0,5 μg ADNc.

Los cebadores diseñados para el ADNc de glucoquinasa de islote humano fueron como sigue:

5'-CTGAGTGGCTTGTGATTCTG-3' (SEQ ID NO:4);

5'-AATCTTAGGTTGGGCATGG-3' (SEQ ID NO:5), que rinde un producto de 220 pb (2461-2681 pares de bases).

La amplificación se realizó durante 35 ciclos a temperatura desnaturalizante 950C durante 45 segundos, temperatura de hibridación 560C durante 30 segundos y temperatura de extensión 720C durante 35 segundos. El producto de PCR se separó en un gel de agarosa al 2% con tampón TBE (Fig. 3).

Análisis por transferencia Western

Las células Melligen, Huh7ins con vector vacío y células Huh7ins se tripsinizaron y se retiraron de los matraces de tejido. Las células suspendidas se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se aspiró. Los sedimentos celulares se suspendieron con tampón I (Tris 10 mM, NaH2PO4 20mM, EDTA 1,0 mM, PMSF 0,1 mM, pepstatina 10 μg/ml, leupeptina 10 μl/ml a pH= 7,8) y se aplicó el ciclo congelación (-700C, 10 minutos) descongelación (370C, 10 minutos) tres veces, y se incubó durante 20 minutos a 40C. Los sobrenadantes se prepararon por centrifugación a 11.000 rpm en una microfuga refrigerada durante 30 minutos y la concentración de proteína en el sobrenadante se determinó posteriormente usando el Kit de Reactivo de Ensayo de proteína MIcro BCA (PIERCE).

Las muestras de proteína de tres tipos celulares diferentes (15 μg/30μl) se corrieron en geles de poliacrilamida al 30% para análisis por transferencia Western a 100v y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Millipore Corporation, EEUU). La membrana de nitrocelulosa se bloqueó en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) con 5% de leche desnatada toda la noche a 40C para evitar la unión no específica. Después de lavar tres veces (10 min) con PBS que contenía 0,05% Tween20 la membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpo primario anticuerpo antiglucoquinasa humana de conejo (dilución 1/1.000) (Santa Cruz Biot EEUU) durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavó de nuevo tres veces con PBS (0,05% Tween20), la membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpo secundario -un conjugado anti-IgG de conejo policlonal (burro) con peroxidasa de rábano (dilución 1/800) (Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBS (0,05% Tween20), la expresión de la proteína glucoquinasa en la membrana de nitrocelulosa se detectó usando 3,3'-Diaminobencidina (sustrato de la peroxidasa) (Sigma). El primario glucoquinasa humana se produjo en conejos frente a una proteína recombinante correspondiente a los aminoácidos 318-405 que se localizan cerca del extremo carboxi de la glucoquinasa de origen humano,conjugado con un anticuerpo monoclonal anti-IgG de conejo y detecta una proteína de 52 kD (Figura 4).

Eenzima glucoquinasa y hexoquinasa, actividad

La fosforilación de la glucosa se midió en homogenados celulares siguiendo la conversión de [U-14C] glucosa a [U14C] glucosa-6-fosfato como se describe (Kuwajima et al., 1996, J Biol. Chem. 261: 8849-53). Las actividades glucoquinasa y hexoquinasa se discriminaron realizando el ensayo en presencia o ausencia de 10 mmoles/L de glucosa-6-fosfato, un inhibidor de la actividad hexoquinasa de baja Km (Wilson, 1984, Regulation of carbohydrate metabolism, p. 45-85).

El análisis western cualitativo mostró la presencia de glucoquinasa humana en todas las líneas celulares ensayadas, pero parecía haber una regulación al alza de la proteína en las células Melligen (Fig. 4). Las células Huh7, Huh7ins y Huh7ins con vector vacío contienen 16 ± 1,2, 24,2 ± 2,3, 25,4 ± 2,6 U/g de proteína de actividad fosforilante de glucosa, respectivamente cuando se ensayaron a 20 mM glucosa en ausencia de glucosa-6-fosfato, pero esta actividad se reduce a 3,0 ± 0,5, 4,8 ± 0,4 y 4,7 ± 0,5 U/g de proteína respectivamente cuando el ensayo se realiza en presencia de 10 mmoles/l de glucosa-6-fosfato (Fig. 5). Esto indica que la mayor parte de la actividad glucosa-6fosfato se debe a la contribución de las hexoquinasas sensibles a glucosa-6-fosfato de baja Km en las líneas celulares Huh7. En comparación, las células Melligen tienen un nivel significativamente mayor (P<0,01) de capacidad fosforilante de glucosa comparado con las demás líneas celulares cuando se mide en ausencia de glucosa-6-fosfato de 34,6 ± 3,4 U/g de proteína, lo que se correlaciona con la concentración incrementada de proteína en la transferencia western. Sin embargo, en presencia de glucosa-6-fosfato, las células Melligen presentan un aumento de 3 veces en la actividad: 20,6 ± 2,7 U/g, sobre las células Huh7ins, por lo tanto en las células Melligen la actividad hexoquinasa representa 42% de la capacidad fosforilante de glucosa total, atribuyéndose el resto a glucoquinasas insensibles a glucosa-6-fosfato.

Estimulación aguda de la secreción de insulina

Antes de la estimulación, se sembraron en placas 5x106 células (Huh7, Huh7ins con vector solo y células Melligen) en cada pocillo de una placa de seis pocillos toda la noche, las placas de cultivo tisular se lavaron concienzudamente con medio basal (PBS que contenía 1 mM CaCl2 y suplementado con 20 mM HEPES y 2 mg/ml BSA,1,25 mMglucosa)para eliminarmediode cultivo yFCS.Se incubaronmonocapas enelmedio basala pH 7,4 durante dos periodos consecutivos de 1 hora para estabilizar la secreción basal de insulina. Las monocapas se expusieron a estímulo durante 1 hora. La glucosa 1,25-20 mM se disolvió en medio basal. El medio basal solo se usó como un control. En respuesta a concentraciones crecientes de glucosa de 1-20 mM, se generó una curva dosis-respuesta para la secreción de insulina para varios clones de células Melligen y se comparó con la de las células Huh7ins parentales. Puede observarse en la Fig. 6 que mientras la capacidad de respuesta a la glucosa comenzó a 2,5 mMen células Huh7ins,comenzó en el intervalo fisiológico entre 4-5mMen las células Melligen.El nivel real de insulina secretada para glucosa en el intervalo fisiológico también fue el doble que el de las células Huh7ins parentales en células del clon 6, que se usaron en todos los experimentos posteriores. En ensayo de células Huh7ins con vector solo no fue significativamente diferente del de las células Huh7ins (resultados no mostrados). Experimentos adicionales determinaron que la concentración exacta de glucosa a la que las células Huh7ins-GK comenzaron la secreción de insulina en respuesta a glucosa era 4,25 mM (Fig. 7).

Secreción y almacenamiento de insulina

Se lavaron células Huh7ins con el vector solo y Melligen con PBS, se tripsinizaron y retiraron de los matraces de cultivo tisular.Las célulassuspendidasse centrifugarona 1.000 rpm durante5 minutos yelsobrenadantese aspiró.

Las células se resuspendieron en el volumen deseado de medio fresco, se realizó un recuento de células y las célulassedistribuyeron en tubos de 1,5mla una densidad de 5x106célulasportubo.Los tubosse centrifugaron a

1.800 rpmdurante 5minutosyelsobrenadante se desechó.Las célulasse resuspendieron en 300 μl de 0,18N HCl en etanol al 70% durante 48 horas a 40C, para permitir un tiempo suficiente para la lisis de las células y liberación de la insulina almacenada. Para la medida del contenido de insulina, las muestras se diluyeron 1:10 antes de ponerlas en el radioinmunoensayo (RIA).

Ensayo de secreción de insulina (ensayo RIA)

Los niveles de insulina humana se midieron por un RIA específico para este péptido y sus productos de división como se ha descrito previamente (Tuch et al., 2003, Gene Therapy 10: 490-503). La especificidad se estableció mostrando <0,05% de reactividad cruzada con insulina. El RIA de insulina se realizó usando anticuerpo de insulina de cobaya (Wellcome, Inglaterra) e insulina marcada con 125I preparada por el método de la cloramina T. La reactividad cruzada con proinsulina humana fue 73%. Se usaron estándares de insulina humana para ensayar el producto de células hepáticas.

Microscopía electrónica de transmisión e inmune

Para el análisis morfológico por microscopía electrónica, las células Melligen se fijaron (2% glutaraldehído/1% paraformaldehído) y se procesaron según técnicas convencionales usando tinción con bloque de acetato de uranilo y contratinción con citrato de plomo de Reynold de secciones ultrafinas (80 nm). Las secciones teñidas se examinaron a 80 kV en un microscopio electrónico de transmisión Phillips CM 10. El tamaño de los gránulos se midió directamente a partir de las imágenes después de calibrar con réplicas (Figura 8a).

Para microscopía inmunoelectrónica, se usó un procedimiento de post-inclusión en inmuno-oro para confirmar la localización de la insulina intracelular. Se analizaron suspensiones de células únicas de células Melligen y MIN-6 (línea celular de insulinoma de ratón, usado como un control positivo). Brevemente, las secciones se incubaron en metaperyodato de sodio al 50% a 500C durante 3,5 minutos seguido de 0,01 M tampón citrato de sodio pH 6,0 a 950C durante 10 minutos y un periodo de enfriamiento de 15 minutos. La unión no específica se bloqueó usando suero de cabra al 1% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una sonda de oro anti cobaya de cabra 10 nm

(1:50) (Aurion, Wageningen, Holanda) incubada durante 2 horas a temperatura ambiente se dirigió frente a un anticuerpo primario policlonal anti insulina humana de cobaya (1:20) (Zymed, San Francisco EEUU) incubado toda la noche a 40C. El anticuerpo primario se reemplazó por PBS para evaluar el nivel de unión no específica de la sonda de oro. Las secciones se contratiñeron con citrato de plomo de Reynold antes del examen (Figura 8b).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como medias ± S.E. Las medias de muestras emparejadas se compararon con el ensayo de la t de Student.

Resultados

La Figura 2 muestra la secuencia del vector pIERSpuro3 (secuencia de 5157 pares de bases) con el inserto de

ADNc de glucoquinasa de islote humano (2733 pares de bases) que se clonó en el vector en el sitio 972 pb. Ambas

uniones del vector e inserto se han secuenciado (resultados no mostrados).

Ejemplo 2

Las células Melligen pueden corregir la diabetes reteniendo la capacidad de respuesta secretora de insulina a la estimulación con glucosa in vivo

La capacidad de respuesta a la glucosa in vivo en el intervalo de concentración milimolar es el distintivo de una célula β artificial para la terapia de reemplazo de insulina en la diabetes de Tipo 1. Cuando esto puede conseguirse, dichas células β artificiales ofrecen una estrategia potencial para superar la disponibilidad limitada de tejido pancreático humano donante. Se ha demostrado la supervivencia de células Huh7ins encapsuladas en un modelo de ratón diabético inmunodeficiente.

Para ensayar la factibilidad de las células Melligen de corregir el estado diabético sin inducir hipoglucemia, las células Melligen (107 células) se trasplantan subcapsularmente en ratones diabéticos no autoinmunes no obesos con inmunodeficiencia severa combinada (NOD.scid). Se requieren grupos de ocho animales para estos experimentos. La diabetes(nivelesde glucosa sanguínea que superan 14 mMen dos ocasiones separadas yconcentración sérica de insulina por debajo de 0,15 ng/mL) se induce por una única dosis alta de STZ (250 mg/kg de peso corporal). Después del trasplante, se monitoriza el peso corporal y la glucosa sanguínea tres veces cada semana y después diariamente si las concentraciones de glucosa sanguíneas disminuyen por debajo de 4 mM. El trasplante se considera exitoso si la concentración de glucosa sanguínea no en ayunas vuelve a normal (menos de 8,4 mM) en los 5 días posteriores a la cirugía. Los animales se mantienen en insulina exógena inmediatamente después del trasplante si es necesario. Los trasplantes se consideran no exitosos si la concentración de glucosa sanguínea se incrementa hasta más de 20 mM en más de dos ocasiones. Después del trasplante y cuando los niveles de glucosa sanguínea están entre 5 y 10 mM, se realizan ensayos de tolerancia a la glucosa y se ensayan los niveles de glucosa sanguínea e insulina sérica. Si los niveles de glucosa sanguínea bajan hasta menos de 2 mM durante más de 24h, el animal se sacrifica y el trasplante se retira. Si se retiene el estado normoglicémico, los explantes se recogerán a las 2, 6 y 12 semanas después del trasplante de una cohorte para verificar que la hiperglucemia vuelve posteriormente. A las 2, 6 y 12 semanas, el páncreas se prepara para inmunohistoquímica de insulina. Después de la resección, el injerto se pesa y se cuantifican las características proliferativas de las células Melligen por un ensayo MTT durante un periodo de 72h. Se mide el contenido de insulina del injerto. Los explantes también se examinan para expresión génica (de glucoquinasa, transportador de glucosa GLUT2, e insulina por PCR), histológicamente (para integridad celular, gránulos secretores de insulina, y vascularización) e inmunohistoquímicamente (para insulina).

Ejemplo 3

Microencapsulación de células Melligen para proporcionar un medio de producción y secreción ectópica de insulina tanto (A) in vitro como (B) in vivo evitando la destrucción autoinmune.

(a) Experimentos in vitro usando células Melligen encapsuladas

Las células Melligen se microencapsulan y se cultivan in vitro durante hasta 6 semanas. La viabilidad y capacidad de respuesta a la glucosa de las células Melligen encapsuladas se determinan después de 1, 2, 4 y 6 semanas de cultivo antes de comenzar cualquier estudio in vivo usando las células microencapsuladas. Se estableció una curva de respuesta a la dosis para la secreción de insulina en respuesta a glucosa desde niveles de glucosa basales a altos de las células encapsuladas. Se determina la liberación crónica y aguda de insulina por las células encapsuladas. Para medir la liberación aguda de insulina, se llevan a cabo incubaciones estáticas con estímulos tradicionales (glucosa, teofilina, y 8-Br-AMPc [que incrementa el AMPc intracelular]). También se examina el almacenamiento de insulina después de sonicación y extracción toda la noche en etanol ácido. El almacenamiento y secreción de insulina se miden por RIA de insulina como se ha descrito previamente (Tuch, et al., 2003, Gene Therapy10:490-503; Permutt et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 8688-8692). El porcentaje de células vivas y muertas se identifica observando fluorescencia de calceína y yoduro de propidio, respectivamente, usando un microscopio confocal. Entre los factores citotóxicos que son responsables de la supervivencia limitada de los injertos encapsulados, se piensa que los más importantes son las citoquinas. Para determinar la destrucción de las células Melligen inducida por citoquinas, se co-cultivan células no encapsuladas y microencapsuladas con citoquinas proinflamatorias. Las células Melligen encapsuladas están con líneas celulares de macrófagos humanos activados y se determinaron posteriormente la viabilidad y secreción de insulina.

(b) Experimentos in vivo usando células Melligen encapsuladas

(i)

Evaluación de biocompatibilidad de las microcápsulas

Para que esta terapia sea clínicamente viable, las microcápsulas no deben provocar un sobrecremiento celular excesivo, que limitaría la capacidad de difusión y la vida del trasplante. Por lo tanto, se trasplantan microcápsulas vacías subcapsularmente en ratones diabéticos no obesos (NOD) de 6 semanas de edad que no han desarrollado todavía diabetes espontánea. A las 2, 6 y 12 semanas después del trasplante, las microcápsulas se retiran y se determina el grado de sobrecrecimiento capsular.

(ii)

Trasplante de células Melligen encapsuladas

Las células Melligen encapsuladas se analizan para determinar si pueden revertir la diabetes autoinmune sin el desarrollo posterior de hipoglucemia. Los ratones NOD diabéticos espontáneamente se usan para estos experimentos. La corrección de la diabetes se establece por el mismo escenario que para las células Melligen no encapsuladas y se realizan ensayos de tolerancia a la glucosa. Las cápsulas se retiran 2, 6, y 12 semanas después del trasplante y se examinan para sobrecrecimiento capsular y las cápsulas explantadas también se evalúan para secreción de insulina en respuesta a glucosa, contenido de insulina, y viabilidad (ensayo MTT) y examen inmunohistológico.

(iii) Inmunoreactividad de células Melligen encapsuladas

Los resultados indican que a diferencia de las células β pancreáticas, las células hepáticas que expresan insulina pueden no ser susceptibles a destrucción autoinmune. Sin embargo, pueden generarse reacciones inflamatorias si los productos antigénicos de las células que mueren encapsuladas difunden a través de la microcápsula. Por lo tanto, se realizó un análisis para determinar si las microcápsulas evitan la comunicación entre las células Melligen y las células inmunes que podría causar activación de linfocitos. Esto se consigue usando un sistema de co-cultivo de esplenocitos convencional. También se evalúa la deposición de IgG en las microcápsulas y las células Melligen contenidas en las microcápsulas (después de incubación de las microcápsulas con anticuerpo anti-IgG de ratón marcadoconFITC)a las 6 y12 semanas después deltrasplante,para determinar si los anticuerpos se inducenbien por antígenos liberados de la superficie celular, proteínas secretadas por las células vivas, o liberados después de la muerte celular que pueden difundir a través de la cápsula.

Ejemplo 4

Resistencia de línea celular hepática que secreta insulina a citoquinas pro-inflamatorias implicadas en la muerte de células beta

Resultados

Se realizaron experimentos preliminares para determinar las diluciones apropiadas de las citoquinas, IFN-γ, TNF-α e IL-1β, que reducirían la viabilidad en la línea de células β control, MIN-6. Las citoquinas tambiénse ensayaron para eficacia tanto individualmente como en combinación según el diseño experimental de Tabiin et al. (2001). El ensayo MTT para viabilidad celular se empleó para determinar el efecto citotóxico de las citoquinas en las células Huh7ins, células Melligen, y la línea celular parental, Huh7. La tinción con anexinaV/PI permitió la detección de poblaciones necróticas y apoptóticas en las células tratadas con citoquinas y no tratadas.

Caracterización del crecimiento celular

Para establecer las cinéticas de crecimiento de cada una de las líneas celulares (MIN-6, Huh7, Huh7ins y Melligen) usadas en este estudio, se cuantificaron los números de células durante periodos de tiempo variados. Se usó una densidad de siembra inicial de 1x104 células/mL en placas de 6 pocillos, tomando como base experimentos previos, y se generaron curvas de crecimiento. Cada una de las líneas celulares alcanzó una fase estacionaria a diferentes velocidades (Figura 9). LascélulasHuh7,Huh7ins yMelligen se acercaron al crecimiento exponencialsobre el día8 cuando la concentración celular fue aproximadamente 1x106 células/pocillo. Por el contrario, las células MIN-6 sólo alcanzaron una concentración celular de 5x105 células/mL, en el mismo punto de tiempo (Figura 9). También se encontróque elnúmero de célulasmás alto registrado para lascélulasMIN-6 (1x106células/mL) sólo sealcanzó en el día 10. Como las células MIN-6 y Huh7 son de origen pancreático murino y hepático humano, respectivamente, cada línea celular presentó diferentes cinéticas de crecimiento. Estas características de crecimiento celular se usaron para determinar el curso de tiempo para experimentos en los que las citoquinas se co-incubaron con las líneas celulares. Como las células MIN-6 alcanzaron la fase de crecimiento logarítmica en un punto de tiempo posterior, esta línea celular se sembró en placas a densidades de siembra superiores cuando se corrieron en experimentos paralelos con Huh7 y Huh7ins para asegurar que las células estaban en fase logarítmica cuando se usaron en los experimentos de toxicidad de citoquinas.

Como el ensayo MTT era para usarse para determinar la viabilidad celular tanto en presencia como ausencia de citoquinas, se realizaron experimentos preliminares para determinar la viabilidad celular de células Huh7ins no tratadas. Las células Huh7ins se sembraron a una densidad inicial de 1x103 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 8 días. En el ensayo MTT, el MTT se metaboliza por la deshidrogenasa mitocondrial en las mitocondrias viables de una célula para producir un cristal de color violeta, formazán. Cuando se disuelve en DMSO la absorbancia de la disolución de formazán puede leerse a 570 nm. El ensayo MTT es un método rápido y reproducible para determinar la respuesta celular a agentes citotóxicos.

Los resultados obtenidos a partir de este experimento preliminar mostraron que la densidad de siembra elegida se acercaba a un valor de absorbancia de 1,0 nm durante el periodo de 8 días. La densidad de siembra inicial usada fue óptima ya que los experimentos posteriores para evaluar el efecto citotóxico de las citoquinas eran para realizarse durante entre seis ydoce días.Estosresultadostambiénmostraron que elcrecimiento exponencial de las células se reflejó por la actividad mitocondrial de las células. A partir de los resultados de la cinética de crecimiento (Figura 11)también se determinó quelascélulas MIN-6 se sembrarían enplacas al dobledeladensidad de siembra que las líneas celulares hepáticas.

Optimización del tratamiento con citoquinas en las células MIN-6 por el ensayo MTT

Los experimentos iniciales usaron diluciones seriadas de concentraciones de citoquinas únicas de IFN-γ, TNF-α e IL1β. Las DE50 (dosis efectiva requerida para destruir la mitad de la población celular) indicadas en la hoja de dato respectiva para cada citoquina constituyeron la concentración más diluida usada (Tabla 1). Estos experimentos iniciales de titulación fueron necesarios ya que cada valor DE50 proporcionado en la hoja de datos se aplica a una aplicación específica y una línea celular específica.

Adicionalmente, diferentes preparaciones de citoquinas presentan diferentes potencias.

Tabla 1 Optimización de las concentraciones de citoquinas únicas para células MIN-6

Los resultados del ensayo MTT revelaron que la co-incubación de células MIN-6 con las concentraciones de citoquinas únicas a las concentraciones listadas en la Tabla 1 no redujo la viabilidad de las células MIN-6 comparada con las células no tratadas incluso después de 14 días de co-incubación (datos no mostrados). Consecuentemente, las citoquinas se usaron en combinación y a concentraciones mayores de citoquinas. Las concentraciones empleadas fueron similares a las usadas por Tablin et al. (2001) en estudios que investigaron el tratamiento con citoquinas tanto de la línea celular de insulinoma de roedor, NIT-1, como la línea celular de hepatocitos humanos que secreta insulina, HEPG2 ins/g.

Los medios y las citoquinas IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL)únicamente o en combinación se cambiaron una vez cada dos días y las células se ensayaron para viabilidad durante un periodo de seis días. Sin embargo, a la densidad de siembra inicial usada (2x103 células/pocillo), aproximadamente 43 ± 2% de las células MIN-6 todavía eran viables en el día final del experimento (Figura 9a). El periodo de observación se incrementó por lo tanto hasta 8 días y el medio y las citoquinas se cambiaron diariamente. En estas condiciones, sobre el día 8, sólo el 22 ± 1% de las células MIN-6 eran viables comparado con el 100 ± 1% de las células no

tratadas (P=0,0045) (Figura 9b).

Como era preferible obtener el menor porcentaje de células viables sobre el día final del experimento y para determinar de manera precisa las cinéticas de la muerte inducida por las citoquinas, la concentración de la triple combinación de citoquinas se tituló adicionalmente añadiendo las citoquinas al doble IFN-γ(768 ng/mL), TNF-α (20 ng/mL) e IL-1β (4.000 pg/mL) y mitad IFN-γ (192 ng/mL), TNF-α (5 ng/mL) e IL-1β (1.000 pg/mL) de las concentraciones de la triple citoquina usadas previamente.

Después de cambiar las citoquinas diariamente a las concentraciones usadas en la Figura 10a y b, aproximadamente el 20 ± 2% de las células todavía permanecía viable comparado con el 100 ± 2% de viabilidad de las células control (P=0,0065). La aplicación de citoquinas únicas no produjo el mismo efecto tóxico que la combinación triple de citoquinas. Por lo tanto, el periodo de experimentación se prolongó hasta 10 días y las citoquinas se usaron a concentraciones dos veces y cinco veces mayores que las concentraciones usadas en la

Figura 9.

Sobre el día 10 sólo el 15 ± 2% de las células MIN-6 tratadas con citoquinas permaneció viable comparado con el 100 ± 1% de las células no tratadas (P=0,0011) incluso después de que las concentraciones se incrementaran hasta 5 veces las concentraciones iniciales (Figuras 13a y b). Estos experimentos indicaron que el incremento mayor de las concentraciones de citoquinas no redujo adicionalmente la viabilidad celular.

En resumen, después de titular las concentraciones de citoquinas en la línea celular MIN-6, se determinó que las concentraciones siguientes serían adecuadas para experimentos futuros durante 10 días porque fueron las más tóxicas para la línea de célulasβ pancreáticas cuando se reponían diariamente IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL).

Ensayo MTT

Después de establecer el tratamiento de citoquinas optimizado para reducir la viabilidad de las células MIN-6, estos parámetros experimentales se aplicaron a células Huh7 y Huh7ins. Esto se hizo para determinar si las citoquinas tendrían elmismo efecto en las líneas celulares de hepatoma con y sin el gen de la insulina.

Se observó una diferencia significativa en la susceptibilidad de las células MIN-6 y las células Huh7ins a toxicidad inducida por citoquinas desde el día 3 (P=0,018) (Figuras 14a y c). Sobre el día 3, las células MIN-6 y Huh7ins que se trataron con citoquinas tuvieron viabilidades de 72 ± 5%. Las células MIN-6 no tratadas permanecieron exponencialmente viables (100 ± 1%) durante los 10 días del experimento. El tratamiento de las células MIN6 con las triples citoquinas durante 10 días causó una disminución significativa en la viabilidad celular cuando se compara

con las células no tratadas (P=0,0039)(Figura 14a).

Cuando se expusieron a la combinación de citoquinas durante 10 días, las células Huh7, Huh7ins y Melligen no mostraron una disminución significativa en la viabilidad celular comparado con las células control no tratadas de cada línea celular (Figura 14 b-d).

La Apoptosis y parada del ciclo celular no son inducidas por la mezcla de citoquinas en células de hepatoma humano que secretan insulina

La translocación de la fosfotidilserina del lado interior de la membrana plasmática a su capa exterior es un evento temprano en la apoptosis. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípido dependiente de calcio con alta afinidad por la fosfatidilserina. El yoduro de propidio (PI) es una sonda de viabilidad citométrica estándar que es excluida por las células con la membrana intacta. La tinción con PI se realiza simultáneamente con la tinción con anexina V para diferenciar las células apoptóticas (sólo positivas para anexina V) de las células necróticas (doble positivas para anexina V-PI), ya que las células necróticas también exponen fosfatidilserina a anexina V debido a la pérdida de la integridad de la membrana (Vermes et al.,1995). Se usó elensayo de la tde Studentylos valoresde P menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

El análisis de la unión de anexina V se realizó a las 24 y 48h con y sin tratamiento con citoquina. La tinción de las células Melligen en el punto de tiempo de 24h mostró cerca del 0% de células positivas para anexina V solo (apoptóticas) y 0% de células doble positivas para anexina V y PI (apoptóticas tardías) y 20% de tinción sólo con PI (necróticas). A las 48h, el porcentaje de células necróticas en el grupo tratado con citoquinas no se diferenció

significativamente del registrado en las muestras no tratadas (19%).

Para elucidar el efecto de las citoquinas en la viabilidad de las células Huh7ins, Melligen y MIN-6 usando sólo tinción con PI, las células se incubaron con la mezcla de citoquinas durante 48h. El número de células viables no disminuyó en las células de hepatoma que secretan insulina por el tratamiento con la mezcla de citoquinas a 24h y 48h según el ensayo MTT (Figura 14). Para examinar si el tratamiento con la mezcla de citoquinas inducía apoptosis o parada del ciclo celular en las células Huh7ins y Melligen, se analizó el contenido de ADN en estas células usando citometría deflujo después de tinciónconyoduro de propidio.En ambascélulasdehepatomaquesecretan insulina, el tratamiento con citoquinas no afectó el número de células en la fase subG1 del ciclo celular, representando células apoptóticas (Figuras 17 y 18). Además, no hubo un incremento en el número de células en la fase S o fase G0/G1, sugiriendo que las citoquinas no reducen el número de células viables mediante la inducción de apoptosis y parada del ciclo celular en la fase G0/G1 en células de hepatoma que secretan insulina. Los resultados de las células MIN-6 no se muestran.

Morfología celular

En las Figuras 19a, 19b y 19c, las células MIN-6 no tratadas parecen tener las membranas celulares intactas y permanecieron unidas a la placa en colonias que crecían como monocapas. Sobre el día 12, las células MIN-6 eran confluentes. Por el contrario, las células MIN-6 tratadas con citoquinas empezaron a degenerar con membranas

rotas causando que las células se despegaran después de 6 días (Figura 19e). Se observó la degeneración completa con restos celulares dispersos entre las células remanentes en el día 12 (Figura 19f).

La co-incubación de células Huh7ins y Melligen con la mezcla de citoquinas pro-inflamatorias no indujo cambios morfológicos consistentes con muerte celular después del día 1 (Figura 20d) o día 6 (Figura 20e). En estos dos puntos de tiempo, las células Huh7ins y Melligen estaban unidas y con un tamaño uniforme. Sin embargo, sobre el día 10 las células Huh7ins tratadas con citoquinas (Figura 20f) aparecieron menos densas cuando se compara con las células no tratadas (Figura 20c). Las células tratadas remanentes aparecieron intactas, unidas y con ausencia de restos celulares como se observa para las células MIN-6 tratadas con citoquinas. La morfología tanto de las células MIN-6 y las líneas celulares hepáticas corrobora los resultados obtenidos del ensayo de viabilidad celular MTT, que indicó que las líneas celulares hepáticas eran más resistentes a los efectos tóxicos de las citoquinas proinflamatorias.

Receptores de citoquinas y cascadas de señalización celulares:

Para establecer si la resistencia observada de la línea celular hepática a la mezcla de citoquinas pro-inflamatorias se debe a la ausencia de los receptores de citoquinas, se realizó RT-PCR usando ADNc generado a partir de ARN aislado de células de islote primarias humanas (control positivo), Huh7 (línea celular parental), Huh7ins (Huh7 transfectada con el gen de la insulina) y Melligen (Huh7ins modificadas adicionalmente) con cebadores para IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2, TNFR1 y TNFR2. La expresión molecular de los receptores de citoquinas IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2 y TNFR1 se confirmó en todas las células (Fig. 21). Por lo tanto, la susceptibilidad reducida a muerte inducida por citoquinas presentada por las células Melligen no puede ser atribuida a la ausencia de receptores para las citoquinas.

Se realizó RT-PCR usando cebadores para los receptores de citoquinas IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2, TNFR1 y TNFR2. Los carriles contienen ADNc para: 1-Células de islote pancreático (control positivo) 2-Células Huh7 3-Células Huh7ins 4-Células Melligen 5-Control negativo. Los resultados muestran bandas para IFNR1, IFNR2, IL1R1, IL1R2 y TNFR1 pero no para el receptor de citoquinas TNFR2.

Aguas abajo de la proteína con dominio de muerte (TRADD) asociada al receptor TNF (TNFR) 1, proteína de interacción de receptor y factor asociado a receptor TNF (TRAF) 2 activan la ruta NF-κB. Se ha reportado que NF-κB inicia la expresión de varios genes asociados con anti-apoptosis, crecimiento celular, y respuesta inmune en células hepáticas. No se observó una diferencia significativa en la activación de NF-κB inducida por citoquinas entre las células tratadas Huh7, Huh7ins y Melligen (Figura 23). Estos resultados indican que la mezcla de citoquinas induce la activación de NF-κB independientemente de la presencia del gen de insulina, y el mecanismo anti-apoptótico en estas líneas celulares hepáticas parece ser independiente de la activación de NF-κB.

Expresión del gen i κB en célula de hepatoma humano que secreta insulina inducida por citoquinas

Para investigar los efectos aguas abajo de la inhibición de la señalización de NF-κB, se evaluó la expresión génica inducida por citoquinas en las células Huh7, Huh7ins y Melligen. La expresión génica de Fas e iNOS se inactivó después de la adición de citoquinas a las líneas celulares hepáticas (Fig. 22). Después de la exposición a citoquinas, la abundancia relativa de los ARNm de iNOS y Fas (densidad óptica corregida por abundancia de GAPDH) fue, respectivamente, aproximadamente 2 veces menor en las células control no tratadas con la mezcla de citoquinas. La expresión del gen endógeno GAPDH no se vio afectada por la exposición a citoquinas.

Determinación de óxido nítrico

La actividad enzimática iNOS se estimó por medidas de la acumulación de nitrito (un producto estable de la oxidación de óxido nítrico (NO)) en el medio por la reacción de Griess modificada durante una exposición de 48h a citoquinas, IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (2.000 pg/mL). En la reacción de Gri ess modificada, se midió la producción de óxido nítrico por las células MIN-6, Huh7, Huh7ins y Melligen como la acumulación de nitrito en el mediocondicionado y se determinó porlareaccióndeGriess modificada.Brevemente, se mezclaron 50 μL del medio sincélulas con un volumen igualde sulfanilamida al1% (Sigma,EEUU)en ácidofosfóricoal5%.La placase incubó durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Se añadió disolución NED (dihidrocloruro de N-1-naftiletilendiamina al 0,1% en agua) (Sigma, EEUU), 50 μL por pocillo, a todos los pocillos y la placa se incubó de nuevo durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. La concentración de nitrito se determinó en triplicado en un intervalo de concentración que correspondió a la parte lineal de la curva estándar. La absorbancia se midió a 540 nm en un lector de microplacas (BioTek, EEUU).

Usando la reacción de Griess modificada, se determinaron las cantidades de nitrito liberadas en el medio de cultivo de células MIN-6 tratadas con citoquinas y no tratadas a las 24h y 48h. Se detectaron concentraciones de NO significativamente mayores en las células MIN-6 tratadas con citoquinas tanto a 24h como 48h (P<0,01). Las células tratadas Huh7, Huh7ins y Melligen, por otra parte, no presentaron un incremento en la producción de NO comparado con las células no tratadas a los puntos de tiempo de 24h ó 48h (P>0,05). ((Fig. 24). Células no tratadas -barras verdes, células tratadas -barras moradas).

Efecto de citoquinas en la secreción, almacenamiento de insulina y capacidad de respuesta a la glucosa

Para que las células Melligen sean candidatos adecuados como célulasβ artificiales, deben continuar siendo responsivasa la glucosa yalmacenarysecretarinsulina en elmedio de citoquinaspro-inflamatorias.Por lo tanto, se determinaron los efectos de IFN-γ, TNF-α e IL-1β en la secreción, almacenamiento de insulina y capacidad de respuesta a la glucosa de las células Huh7ins y Melligen.

La línea de células β pancreáticas que secreta insulina responsivas a glucosa, MIN-6 (Miyazaki et al., 1990) se usó como un control positivo. Para determinar si el tratamiento con triple citoquina tenía un efecto en la secreción, almacenamiento de insulina y capacidad de respuesta a la glucosa crónicos, las células se expusieron a citoquinas [IFN-γ (384 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β(2.000 pg/mL)]. Elmedio ylas citoquinas se cambiaron diariamente durante el periodo de 10 días estudiado. Se usó un RIA de insulina para determinar la concentración de insulina en las muestras recogidas.

Secreción y almacenamiento de insulina crónicos

Las células MIN-6 tratadas con citoquinas secretaron significativamente menos insulina (14.005 ± 1.317 ng/pocillo) que las células MIN-6 no tratadas (21.408 ± 814 ng/pocillo) en el día 1 (P=0,012) y a lo largo del periodo completo estudiado (Figura 25a). Los niveles de insulina para las células MIN-6 tratadas con citoquinas en el día 10 representaron la cantidad total de insulina secretada durante los 10 días completos. Por el contrario, las células Huh7ins co-incubadas con citoquinas, secretaron cantidades de insulina que no fueron significativamente diferentes a las secretadas por células Huh7ins y Melligen no tratadas durante el periodo de 10 días (Figura 25b).

Efecto de las citoquinas en el almacenamiento de inulina

Las células MIN-6, Huh7ins y Melligen se trataron durante 10 días con mezcla de citoquinas IFN-γ, TNF-α eIL-1β. La insulina almacenada se extrajo usando el método de etanol ácido y las cantidades de insulina se determinaron por RIA en los días 1, 2, 3, 5, 8 y 10. Las células MIN-6 se vieron afectadas significativamente por el tratamiento con citoquinas en el día 2 (P<0,05) a diferencia de esto las células Huh7ins y Melligen retuvieron su capacidad de almacenar insulina durante los 10 días completos sin diferencia significativa entre las células tratadas y no tratadas (P>0,05).

A partir de la Figura 26a, puede observarse que el almacenamiento de insulina por pocillo se incrementó de manera constante en las células MIN-6 no tratadas durante los 10 días del experimento al proliferar las células. Después de la exposición de las células MIN-6 a la mezcla de citoquinas durante 10 días, el contenido de insulina disminuyó significativamente después del día 1 comparado con las células MIN-6 control (P=0,017). La diferencia entre las células MIN-6 tratadasyno tratadascontinuósiendosignificativa a lo largo del resto de díasdel experimento.Porel contrario, las células Huh7ins y Melligen tratadas con la combinación de citoquinas no mostraron una diferencia significativa en el almacenamiento de insulina comparado con las células Huh7ins y Melligen no tratadas, respectivamente.

Capacidad de respuesta a la glucosa

Después de 10 días de tratamiento con citoquinas de las células MIN-6, hubo una disminución significativa en la respuesta de insulina a un estímulo de glucosa cuando se compara con las células MIN-6 control (P=0,0009). La secreción de insulina de las células MIN-6 no tratadas en respuesta a 20 mM glucosa se incrementó más de 5 veces durante 1h cuando se compara con los niveles basales (692 ± 78 ng/pocillo/h) (P=0,0002) (Figura 27a). Las células MIN-6 tratadas no liberaron niveles significativamente mayores de insulina con el estímulo de glucosa comparado con los niveles basales (P=0,60) (Figura 27a). Esto fue porque las células presentaron una viabilidad reducida después de 10 días de co-incubación con las citoquinas, mientras las células control continuaron en crecimiento logarítmico. Por lo tanto, en el día 10, había más células control y por lo tanto un mayoralmacenamiento de insulina. Estos datos mostraron que las células control respondieron al estímulo de glucosa 20 mM, confirmando que las células MIN-6 constituían un modelo de células β apropiado.

El efecto de las citoquinas en la capacidad de respuesta a la glucosa también se determinó para las células Huh7ins y Melligen. Las células Huh7ins y Melligen no tratadas proporcionaron un incremento de 5 veces en la secreción de insulinacuandoseestimularon con 20 mMglucosa,convuelta a losnivelesbasalesdesecrecióndeinsulina(0,13± 0,014 pmoles/pocillo/h) después de la retirada del estímulo de glucosa (Figura 27b y c). Las células Huh7ins y Melligen incubadas con citoquinas durante 10 días mostraron un incremento de 4,5 veces en la secreción de insulina después del estímulo de glucosa 20 mM y una vuelta a niveles basales de secreción (0,06 ± 0,006 pmoles/pocillo/h) en 1h después de la estimulación (Figura 27b y c). La cantidad de insulina secretada por las células Huh7ins y Melligen tratadas durante el estímulo no fue significativamente diferente del resultado obtenido para las células Huh7ins y Melligen no tratadas, respectivamente. Esto indica que las células Huh7ins y Melligen retienen la capacidad de responder a un estímulo de glucosa incluso después de 10 días de tratamiento con citoquinas.

Las células Huh7ins y Melligen se cultivaron durante 10 días con y sin citoquinas. En el día 10, las células se estimularon con concentraciones crecientes de glucosa en medio basal. Las células Huh7ins secretaron cantidades incrementadas de insulina en respuesta a 2,5 mM glucosa y las células Melligen a 4,25 mM glucosa. En ambas líneas celulares, no se observó una diferencia significativa entre las células tratadas con citoquinas y las no tratadas a ninguna concentración de glucosa (P>0,05) (Fig. 28).

Ejemplo 5

Análisis de la expresión de factores de transcripción de las células β en células Melligen

En este estudio, se detectó el nivel de transdiferenciación pancreática que ha ocurrido en las células Huh7ins y Melligen. Se analizó la expresión de factores de transcripción de células βseleccionados, hormonas pancre áticas, y componentes del aparato sensor de la glucosa [(GLUT2 yglucoquinasa (GK)]de células pancreáticas en las células Huh7ins y Melligen junto con la línea parental Huh7 (Figura 29).

Métodos

RT-PCR

El ARN obtenido de las líneas celulares se usó para transcribir de forma inversa ADN complementario (ADNc) usando los reactivos de transcripción inversa (Promega, EEUU), que se prepararon hasta una mezcla de reacción de 40 μL, que contenía tampón RT, cebadores aleatorios, inhibidor de ARNasa, mezcla de dNTP, transcriptasa inversa, dH2O sin ARNasa. El volumen para cada reactivo se lista en la Tabla 2. Todos los reactivos se centrifugaron para mezclar yse incubaron a 370C durante 1 hora;esto se siguió por un choque con calor a 990C durante 1 minuto. Los tubosse transfirieron inmediatamente a hielo y estaban listos para usarse para amplificación adicional.

Tabla 2 Contenidos de la mezcla de transcripción inversa

Reactivos

Volumen (μL)

Tampón 5x AMP RT

8

Cebadores Aleatorios (500 μg/mL)

3

Inhibidor de ARNasa (40 unidades/μL de reacci ón)

1

Mezcla de dNTP (10 mM)

4

Transcriptasa Inversa (10 unidades)

1,5

ARN Molde

3

dH2O sin ARNasa

19,5

Volumen Total

40

La posibilidad de contaminación con ADNc en el ARN aislado total se excluyó, debido a la adición de 1,5 μL de ADNasa (1 unidad/μL)a 60 μL de preparación de ARNm.La muestra también se examinó después de electroforesis 5 en un gel de agarosa al 1,5%.

Las secuencias de cebador final específico se listan en la Tabla 3, incluyendo: PDX-1, NEUROG3, NEUROD1, NKX2-2, NKX6-1, PAX6, PC1/3, PC2, GK hepática, GK de islote, GLUT2, glucagón, somatostatina (SST), y polipéptido pancreático (PP). Estos cebadores se diluyeron hasta 1 μg/μL, y sediluyeron adicionalmente 1:8 para las reacciones de PCR.

10 Tabla 3 Lista de cebadores específicos de gen: las secuencias, los tamaños de productos, y temperatura de hibridación.

PCR en tiempo real

Se realizó PCR en tiempo real para determinar el nivel de expresión de algunos factores que se detectaron por RT-PCR en diferentes líneascelulares,yparaevaluarelefectodelasobreexpresión de GKdeislote humano en células Melligen (Figura 30).

Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa usando un Prism 7500 (ABI). Se usó el kit Platinum SYBR Green qPCR supermix-UDG (Invitrogen) como reactivos de amplificación. Los cebadores se listan en al Tabla 3.

Las condiciones de amplificación incluyeron inicio 500C durante 2 min y desnaturalización a 960C durante 10 min, seguido de 40 ciclos y cada ciclo incluyó desnaturalización a 960C 35 segundos, hibridación a 580C (para ADNc de glucoquinasa de islote humano) ó 66,50C (para el gen de glucoquinasa hepática) 35 segundos y extensión a 720C 35 segundos.

El análisis cuantitativo relativo se realizó según el valor CT comparativo usando la fórmula aritmética 2-(∆∆Ct). Los niveles de ADNc se normalizaron respecto al gen endógeno (GAPDH humano).

Transferencia Western

El análisis Western se realizó para PDX1 como se ha descrito previamente en células Huh7, Huh7ins y Melligen usando PDX1 humano(antihumanodeconejo,dilución 1:1.000,Chemicon)yanticuerposecundario frente a conejo (Upstate, EUU).

Resultados Genes de glucoquinasa en islote humano y hepático en diferentes tipos celulares.

Nivel de expresión de glucoquinasa hepática en células Melligen y Huh7ins

Como se ha encontrado que la GK hepática se expresa endógenamente en todas las líneas celulares derivadas de hígado por RT-PCR, la diferencia en el nivel de expresión se determinó adicionalmente por PCR en tiempo real entre las líneas celulares. Hubo una expresión significativamente mayor (p<0,0001) en células Melligen comparado con las células Huh7ins con vector vacío (sin GK de islote) (Figura 31a). No se observó una diferencia significativa (p=0,268) en la expresión de GK hepática en las células Huh7ins con vector vacío (que no portan GK de islote) comparado con las células Huh7ins (Figura 31). El análisis cuantitativo relativo realizado según el valor CT comparativo usando la fórmula aritmética 2-(∆∆Ct), mostró que la expresión de la glucoquinasa hepática en células Melligen era 5,133 veces mayor que la de las células Huh7ins sólo con vector.

Nivel de expresión para el factor de transcripción de células β, PDX1

Aunque la expresión de PDX-1 a nivel de ARNm se mostró en las células Huh7, Huh7ins y Melligen por RT-PCR, se realizó PCR en tiempo real para determinar si había alguna diferencia en el nivel de expresión entre las líneas celulares. El ensayo t emparejado mostró que había una diferencia significativa (p<0,0001) en la expresión de PDX-1 en células Melligen cuando se compara con las células Huh7ins. Las células Melligen tenían una expresión 2,908 veces mayor que las células Huh7ins según el valor CT (Figura 32).

El análisis por PCR en tiempo real indicó que no había diferencia significativa en la expresión de NEUROD, observada entre células Melligen y células Huh7ins (Figura 33).

Nivel de expresión para el transportador de glucosa, GLUT2

Para determinar si la sobreexpresión de insulina humana y GK de islote humano respectivamente en las células Huh7ins y Melligen tenía algún efecto en la expresión de GLUT2 a nivel del ARNm, se realizaron experimentos de PCR en tiempo real en los ADNc obtenidos de las células Huh7, Huh7ins y Melligen. La Figura 34 demuestra que el nivel de expresión para GLUT2 en células Melligen era significativamente (p<0,0001) mayor comparado con las células Huh7 y Huh7ins. No hubo una diferencia significativa (p=0,013) en la expresión de GLUT2 entre las células Huh7 y Huh7ins.

Análisis Western

La proteína PDX-1 específica se reveló por análisis de transferencia Western en células Huh7, Huh7ins y Melligen se detectó a 35 kDa (Figura 35).

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible a variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de dichas etapas o características.

REFERENCIAS

Listado de secuencias

<110> University of Technology, Sydney SIMPSON, Ann TAO, Chang 5 <120> Células modificadas genéticamente y usos de éstas

<130> 30570614/TDO

<150> 2007904310 <151> 2007-08-10 10

<160> 33

<170> PatentIn versión 3.4 15 <210> 1

<211> 5157

<212> ADN

<213> glucoquinasa de islote pancreático de mamíferos 20 <400> 1

<210> 2

<211> 2732

<212> ADN

<213> glucoquinasa de islote pancreático de mamíferos

<400> 2

<210> 3

<211> 7889

<212> ADN

<213> glucoquinasa de islote pancreático de mamíferos

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 4 <210> 5

<211> 19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 7

<210> 8

<211>19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> ADN

<213> cebador

<400> 11 <210> 12

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 12

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 15

<210> 16

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 17

<210> 18

<211> 24

<212> ADN

<213> cebador

<400> 18

<210> 19

<211> 25

<212> ADN

<213> cebador

<400> 19

<210> 20

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 25 <210> 26

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 27

<210> 28

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador

<400> 28

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 29

<210> 30

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 30

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> cebador

<400> 31

<210> 32

<211> 22

<212> ADN

<213> cebador <400> 32

5 <210> 33

<211> 18

<212> ADN

<213> cebador

10 <400> 33

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un hepatocito de mamíferos modificado genéticamente,hepatocito queescapazde secretarinsulina o fragmento funcional de ésta, comprendiendo dicho hepatocito una molécula de ácido nucleico que codifica glucoquinasa de islote pancreático humano o fragmento funcional de ésta.

2. 2.

   El hepatocito modificado genéticamente de la reivindicación 1, en el que dicho hepatocito es capaz de secretar insulina debido a su transfección con una molécula de ácido nucleico que codifica insulina o fragmento funcional u homólogo de ésta.

3. 3.

   El hepatocito modificado genéticamente de la reivindicación 1 ó 2 en el que dicho hepatocito expresa insulina en respuesta a una concentración de glucosa extracelularseleccionada del grupo que consiste en:

   (i)

   el intervalo de 3-8 mM;

   (ii)

   el intervalo de 3,5-7 mM;

   (iii) el intervalo de 4-6 mM; y

   (iv) el intervalo de 4-5 mM.

4. 4.

   El hepatocito modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que dicha glucoquinasa de islote pancreático es la forma codificada por SEQ ID NO:2 o es un fragmento funcional de ésta.

5. 5.

   El hepatocito modificado genéticamente de la reivindicación 4 en el que dicha modificación genética comprende la transfección de dicho hepatocito con un vector, vector que expresa SEQ ID NO:2 o un fragmento funcional de ésta.

6. 6.

   El hepatocito modificado genéticamente de la reivindicación 5 en el que dicho vector se selecciona de un grupo que consiste en:

   (i)

   un vector bicistrónico;

   (ii)

   pIRESpuro3; y

   (iii) un vector bicistrónico que corresponde sustancialmente a SEQ ID NO:3.

7. 7.

   El hepatocito modificado genéticamente de la reivindicación 4 ó 6 en el que dicho hepatocito es una célula Huh7ins.

8. 8.

   Células modificadas genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en el tratamiento de una afección en un mamífero, afección que se caracteriza por la producción aberrante de insulina funcional.

9. 9.

   Las células para uso según la reivindicación 8 en el que dicha producción aberrante de insulina funcional es una

   producción inadecuada de insulina funcional.
10. 10. Las células para uso según la reivindicación 9 en el que dicha producción inadecuada de insulina funcional es una producción inadecuada de insulina funcional en respuesta a una concentración de glucosa extracelular selecciona de un grupo que consiste en:

    (i)

    mayor de 3 mM;

    (ii)

    4-8 mM; y

    (iii) 4-6 mM.

11. 11.

    Las células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 en el que dicha afección es diabetes, diabetes tipo 1, IDDM, diabetes gestacional, IDDM progresiva lentamente, diabetes autoinmune latente o diabetes tipo 2.

12. 12.

    Células modificadas genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en la reducción de los niveles de glucosa en un mamífero.

13. 13.

    La célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o las células para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en el que dicho mamífero es un ser humano.