JP2006502716A - 移植可能な細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子スイッチ分子の制御下にある、少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含有する、ヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。本発明はまた、移植のため、移植片拒絶を阻害するため、および移植片から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療のための、該細胞の製造および使用に関する。
Description
本発明は、活性物質の添加により調節可能な遺伝子スイッチ分子の制御下にある少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含有する、ヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。本発明はまた、移植のための、移植片拒絶を阻害するための、ならびに移植片から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療のための、該細胞の調製および使用にも関する。
ヒト疾患の多様性は、特定の細胞、組織または臓器の死または機能不全に基づいており、医薬では十分に処置することができないことが多い。慣用的な治療は従来、損傷を受けた組織または臓器を、健常ヒトドナーから得られた、例えば心臓、肺、腎臓、膵臓、または該臓器からの細胞または組織のごとき、健常細胞、組織または臓器を移植することにより置き換えることから成っている。しかしながら、現在のところ臓器ドナーが不足しているため、ドナー組織に対する要求を十分に満たすことができない。該不足は、特別に繁殖させたヒト以外のドナー動物からの組織または細胞を移植することによりなくすことができる。あるいは、交換細胞は細胞株から得ることもできる。これらの細胞は同様に、ヒト起源であっても、またはヒト以外の起源であってもよい。
しかしながら、ヒト生物体へのヒト以外の細胞、組織または臓器の移植(異種移植)も、ヒトレシピエントへの遺伝子的に同一でないヒトのドナー細胞、ドナー組織またはドナー臓器の移植(同種移植)も、免疫仲介移植片拒絶の問題を有している。該拒絶は外来性タンパク質であると認識されているドナー細胞上に存在する組織適合性抗原に基づいており、それにより移植片に対して向けられた免疫応答を起こしている。同種間および異種間の細胞、組織または臓器に対する免疫応答は、免疫系の異なった細胞(例えばB細胞、T細胞、抗原提示細胞)間の、多数の複雑な相互作用に基づいており、そして最終的には、移植された細胞、組織または臓器の拒絶を結果として生じることができる。したがって、該免疫応答を抑制するため、レシピエントは、免疫系を抑制し、または移植片に対して該レシピエントに耐性をもたらしてそのような拒絶を防止する、「免疫モジュレータ」として知られている医薬で処置しなければならない。
使用される免疫モジュレータの例は、ステロイド(プレドノソロンおよび誘導体)、カルシニューリン阻害剤(シクロスポリンA、タクロニムス)、ラパマイシン(シロリムス)、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、アザチオプリン(イムラン)、リンパ球抗血清(ALG−抗白血球グロブリン、ATG−抗胸腺細胞グロブリン)またはモノクローナル抗体(抗CD25:ゼナパックス、シムレクト)である。
抗体療法は、移植後の最初の数週および数ヶ月に支持療法として行われ(導入療法)、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、そしてしばしばMMFおよびイムランは通常、移植時から、患者が移植片を伴っている全期間、即ち、時に全生涯にわたって投与される。しかしながら、現在使用されている免疫変調物質のタイプ、作用様式および組み合わせとは無関係に、医薬品は通常、静脈内または経口で投与され、それ故、患者の全身に分布する。従って、それらはその作用部位、即ち移植された臓器または組織、または移植された細胞が置かれた部位のみでなく、生物体の他の組織または臓器すべてにも到達する。このことは、移植片に限定されない、一般的な免疫防御の抑制を生じる。非標的組織および臓器においてそれらは免疫系の機能を害し、従って、多くの臓器の生理学的機能遂行を妨げ、多数の副作用を生じるであろう。
通常の免疫変調治療の最も重大な副作用は、これに関連する高血圧、腎臓および肝臓に対する損傷、日和見感染発生の増加、そして、例えばがんおよびリンパ球増殖性障害のごとき多様な悪性化の割合の増加である。従って、例えば、普通はわずかな症状のみを伴って進行するサイトメガロウイルス感染が、免疫抑制された患者においては肝炎、肺炎および髄膜炎を発症し得るため、それが移植片受容者の死亡率を増加させる主たる原因となっている(移植臨床管理、第5巻、2000 Medscape社、Web MD Health Network、ニューヨーク、USA)。他の研究では、免疫抑制された同種移植片レシピエントは、通常の処置後、がんの危険性が3倍〜4倍高く、特定の型のがんでは20〜500倍も増加し得ることを確認している(Penn I.、Clin.Transpl.147−158、1998)。加えて、特に免疫抑制性の免疫モジュレータは、免疫系に対するそれらの作用とは無関係に、一般に毒性を有するかもしれない。従って、カルシニューリン阻害剤はしばしば腎不全、高血圧、高脂血症および糖尿病を発症している。医薬品による定期的な処置はさらに生活の質を非常に損なっており、従って、医学的に必要とされる程度まで患者が実行しないことが多い。
さらに不利なことは、全身循環による分布後に、移植部位で治療的に活性な濃度を依然として達成するためには、比較的高用量の該医薬品が投与される必要があるということである。このことはさらに、該副作用の発生を促進または増加させる。
こうした事実を打ち消すため、多数の新規免疫治療剤および付随する診断アプローチが近年開発されている。
免疫変調の副作用を減少させる臨床的に試験されたアプローチは、例えば、新規に開発された免疫応答性医薬品を低濃度で組み合わせ、標準療法剤(例えばステロイド、シクロスポリンA)をそれらと取り替えることから成る。このことは、例えば、ダクリズマブ、シロリムスおよび低用量タクロリムスの組み合わせを使用してグリココルチコイドの糖尿病誘発性作用が回避された、糖尿病処置のための同種間膵島細胞の移植で首尾よく実施された(Shapiro J.、The New England Journal of Medicine、Vol 343、N.4、230−238、2000)。しかしながら、この処置でさえ、例えば白血球レベルの減少、口腔潰瘍および消化障害の発生のごとき、該組み合わせの中の個々の免疫モジュレータの副作用を避けることが不可能であった。
免疫変調の副作用を減少させる臨床的に試験されたアプローチは、例えば、新規に開発された免疫応答性医薬品を低濃度で組み合わせ、標準療法剤(例えばステロイド、シクロスポリンA)をそれらと取り替えることから成る。このことは、例えば、ダクリズマブ、シロリムスおよび低用量タクロリムスの組み合わせを使用してグリココルチコイドの糖尿病誘発性作用が回避された、糖尿病処置のための同種間膵島細胞の移植で首尾よく実施された(Shapiro J.、The New England Journal of Medicine、Vol 343、N.4、230−238、2000)。しかしながら、この処置でさえ、例えば白血球レベルの減少、口腔潰瘍および消化障害の発生のごとき、該組み合わせの中の個々の免疫モジュレータの副作用を避けることが不可能であった。
別の可能な治療的アプローチは、新規免疫変調物質を投与することにより、患者における外来組織への免疫学的許容性を達成させることである。これに関連して、許容性とは、継続的な免疫抑制を伴わない、移植片への免疫応答または拒絶の不在として特徴付けられる。この種の免疫変調物質は、当業者には公知の通常の方法に従って投与される(例えば、WO00/12138;WO97/41232;WO96/26274;WO01/87330;Ferrari−Lacrazら、The Journal of Immunology、2001、Vol167、pp.3478−3485;Kimら、The Journal of Immunology、1998、160:5742−5748;Penn、Transplant Proc、1991、23:1101;Beveridgeら、Lancet、1984、1:788を参照されたい)。
慣用的治療アプローチの1つの不都合な点は、許容性誘導免疫モジュレータもまた通常全身投与される(例えば静脈内)ということである。別の不都合な点は、免疫モジュレータは、患者にその後外部から投与するため、天然資源から治療用生成物として単離するか、または組換え分子として生物工学的に調製しなければならないことである。しかしながら、調製による側面は、免疫モジュレータが、十分な量でまたは十分活性で、天然型または組換え分子として単離しまたは調製することができない結果を生じるかもしれない。加えて、免疫モジュレータのex vivo調製は、患者に対してさらなる健康危害をもたらし得る物質(例えば動物生物体から単離されたため、潜在的に動物由来感染症を移し得る物質)の添加を必要とするかもしれない。この結果として、全ての患者に対して適切な様式で免疫モジュレータにより処置することは不可能であり、または処置にはさらなる健康危害が付随するかもしれない。
本発明の範囲内の目的は、上記の不利益を回避しまたは軽減する免疫療法を開発することであり、それは特に、まさに免疫応答が活性化されまたは活性化し得る生物中で、即ち移植された細胞または臓器の場所で、その免疫変調作用、特に免疫抑制作用を示し、それと同時に、その時期と量が調節できる免疫変調作用を可能にする。
本発明によれば、調節可能な遺伝子発現システムの助けにより、細胞中での免疫モジュレータの発現を調節することが可能であった。
調節可能な遺伝子発現システムの助けにより、免疫モジュレータを局所的に(例えば、細胞移植片中で)および適用量で産生することが可能である。こうした免疫モジュレータの調節可能な産生はこれまで示されていない。従って、一過性細胞培養実験において免疫モジュレータMutIL−15/mFcの調節可能な産生を得たという発見は、ことさら驚くべきことであった(実施例1およびKimら、I.Immunology 1998、160、5742−5748を参照されたい)。
調節可能な遺伝子発現システムの助けにより、免疫モジュレータを局所的に(例えば、細胞移植片中で)および適用量で産生することが可能である。こうした免疫モジュレータの調節可能な産生はこれまで示されていない。従って、一過性細胞培養実験において免疫モジュレータMutIL−15/mFcの調節可能な産生を得たという発見は、ことさら驚くべきことであった(実施例1およびKimら、I.Immunology 1998、160、5742−5748を参照されたい)。
調節可能な発現システムは、免疫モジュレータを、連続的かつ全身に、または低濃度でも、もはや投与する必要がないことを可能にする。
本発明の別の考慮すべき利点は、移植の場所でさえ、医学的観点から必要とされない場合は免疫応答の連続的抑制が生ずる必要はないが、必要な時にのみ抑制が活性化されることである。このことは、身体に対する、特に移植領域に対する副作用、そして負担を軽減する。それはまた、患者が免疫モジュレータ、特に免疫抑制剤の投与に継続的に頼る必要がないため、患者に対する肉体的および精神的的救済も意味する。本明細書における免疫抑制剤とは、生物中の移植片、特に細胞、組織および/または臓器により引き起こされる免疫応答を完全にもしくは部分的に阻害する物質を意味している。
本発明の別の考慮すべき利点は、移植の場所でさえ、医学的観点から必要とされない場合は免疫応答の連続的抑制が生ずる必要はないが、必要な時にのみ抑制が活性化されることである。このことは、身体に対する、特に移植領域に対する副作用、そして負担を軽減する。それはまた、患者が免疫モジュレータ、特に免疫抑制剤の投与に継続的に頼る必要がないため、患者に対する肉体的および精神的的救済も意味する。本明細書における免疫抑制剤とは、生物中の移植片、特に細胞、組織および/または臓器により引き起こされる免疫応答を完全にもしくは部分的に阻害する物質を意味している。
加えて、本発明は、免疫モジュレータをもはや天然資源から単離する必要がなく、または組換え的に産生し精製する必要がないという利点を提供する。免疫モジュレータは、レシピエントの生体中でおよび/またはin vivoにおける作用部位で、治療的に活性な量および形で産生され、従って、その完全な天然の活性を保持している。
したがって、本発明の1つの側面は、活性物質を添加することにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含む移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞に関する。
本発明の核酸とは、RNAまたはDNA、特にゲノムDNA、組換え的に産生されたDNA、cDNA、または、例えばホスホラミデート化のレベルで合成された合成DNAを意味している。同様に含まれるのは、該核酸のヌクレオチドの組み合わせおよび/または修飾である。この用語はさらに、1本鎖および2本鎖の核酸も含む。
また、1以上の免疫モジュレータをコードする機能的に連結された成分、例えば1以上の遺伝子またはその活性部分、およびその活性化の状態が活性化物質を加えることにより調節される少なくとも1つの調節可能な遺伝子発現システム、および例えばプロモーターおよび調節的ヌクレオチド配列のごとき調節可能な要素、およびポリアデニル化シグナル、例えばSV40ポリアデニル化シグナル、を含む核酸も含まれる。該成分は、含有されている遺伝子配列が転写調節の影響下で転写されるような様式で接続されている場合は、機能的に連結されている。
本発明の用語、免疫モジュレータは、免疫変調作用、特に免疫抑制作用を有する任意の型の分子、例えばタンパク質、融合タンパク質および可溶性リガンドを本質的に含み、ここで、融合タンパク質は2以上の遺伝子または遺伝子断片の連結により産生された融合遺伝子の発現産物を意味している。
生物、細胞および/または組織の免疫応答が、例えば改変されたまたは抑制されたレセプター結合のため本質的に阻害される場合は、免疫変調作用が存在している。免疫変調作用は、移植された細胞、組織または臓器に対する免疫寛容が引き起こされる場合は、同様に存在している。
免疫モジュレータの作用は、例えば、以下の活性の1以上を含む:
・ T細胞により仲介される抗原認識の阻害、
・ T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
・ T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
・ T細胞の増殖の阻害、
・ T細胞の生存を支援する分子の阻害、
・ T細胞のエフェクター分子(TNF−α、IFN−γなど)の阻害、
・ T細胞の接着の阻害、
・ T細胞同時刺激性相互作用の阻害(リンパ球の活性化は2つのシグナルを経て起こる:第1に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第2にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する;この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる)、
・ 例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および/またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
・ 例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
・ 補体系成分の阻害、
・ 外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および/または
・ 炎症反応の阻害。
・ T細胞により仲介される抗原認識の阻害、
・ T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
・ T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
・ T細胞の増殖の阻害、
・ T細胞の生存を支援する分子の阻害、
・ T細胞のエフェクター分子(TNF−α、IFN−γなど)の阻害、
・ T細胞の接着の阻害、
・ T細胞同時刺激性相互作用の阻害(リンパ球の活性化は2つのシグナルを経て起こる:第1に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第2にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する;この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる)、
・ 例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および/またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
・ 例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
・ 補体系成分の阻害、
・ 外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および/または
・ 炎症反応の阻害。
適した免疫モジュレータの例は抗体である。IL−15、IL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−12、IL−17、IL−18、IL−21、インターフェロンγ、TNF−α、CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD80、CD86若しくはCD154、またはこれらのレセプターに対する抗体が特に好ましい。
免疫モジュレータFasL、PD−L1またはPD−L2が同様に好ましい。
さらに好ましい免疫モジュレータは、IL−15、IL−10、IL−4、IL−2、インターフェロンγまたはTGF−βであり、特に融合タンパク質の形が好ましい。融合タンパク質は、特に好ましくは、第1に、野生型IL−15、野生型IL−10、野生型IL−4、野生型インターフェロンγまたは野生型TGF−β、そして第2に、Fcフラグメントを含む。さらに、第1に変異IL−15、好ましくは101位および108位の「Q」が「D」で置換されているもの、または変異IL−2、第2に、例えばヒンジ領域を経て変異IL−15分子のC末端へ融合されたFcフラグメント(例えば、WO97/41232;Kimら、J.Immunol.(1998)、160(12):5742−5748;WO01/87330を参照されたい)を含む融合タンパク質が特に好ましい。
さらに好ましい免疫モジュレータは、IL−15、IL−10、IL−4、IL−2、インターフェロンγまたはTGF−βであり、特に融合タンパク質の形が好ましい。融合タンパク質は、特に好ましくは、第1に、野生型IL−15、野生型IL−10、野生型IL−4、野生型インターフェロンγまたは野生型TGF−β、そして第2に、Fcフラグメントを含む。さらに、第1に変異IL−15、好ましくは101位および108位の「Q」が「D」で置換されているもの、または変異IL−2、第2に、例えばヒンジ領域を経て変異IL−15分子のC末端へ融合されたFcフラグメント(例えば、WO97/41232;Kimら、J.Immunol.(1998)、160(12):5742−5748;WO01/87330を参照されたい)を含む融合タンパク質が特に好ましい。
さらに好ましい免疫モジュレータは、第1にTNF−α レセプター(タイプ1または2)、ICOS、CTLA−4、PSGL−1、ICAM−1またはVCAM−1、第2に、例えばEP417,563に開示されているTNFレセプター融合タンパク質の場合のごときFcフラグメントの融合タンパク質である。
さらに好ましい免疫モジュレータは、例えば膜貫通ドメインおよび細胞質尾部のない変異体としての、好ましくはFcフラグメントを含有する融合タンパク質としての、例えばIL−15Rα、IL−6、IL−7、IL−12、IL−17、IL−18レセプターのごときサイトカインレセプターまたは増殖因子レセプターの分泌された変異体である。
融合タンパク質は好ましくはキメラ融合タンパク質である。適した融合タンパク質の例は、IL−15または変異IL−15、および異種Fcフラグメントを含む、IL−15誘導体である。
Fcフラグメント(結晶可能フラグメント)とは、例えば、すべての定常ドメインまたは例えばヒンジ領域を含むもののような第1の定常(部分的または完全)ドメインを除いたすべての定常ドメイン、重鎖の第2(CH2)および第3(CH3)の定常ドメインを含むフラグメントのような抗原に結合しない抗体のフラグメントを意味している。Fcフラグメントは天然資源に由来しても、組換え的に調製しおよび/または合成してもよい。対応する方法は当業者には公知である。これに関連して、Fcフラグメントは、例えば、融合タンパク質を構築するために適した切断部位を含むもののように、天然配列と比較して、1以上の突然変異を有することができる(Kimら、上記文献を参照されたい)。
本発明のさらなる態様において、Fcフラグメントは免疫グロブリン(Ig)Gの1つ、特に、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4および/または類似の哺乳動物IgG、および/またはIgM、特に、ヒトIgMまたは類似の哺乳動物IgM、および/またはマウスIgG2aである。
免疫モジュレータは野生型配列を有していても他の変異配列を有していてもよい。免疫モジュレータは、機能的に活性な形態、例えば、機能的に活性な可溶型または機能的に活性なウイルス型ですでに存在していることが好ましい。可溶型とは、例えば可溶性レセプター分子のごとく、細胞膜に結合しない分子を意味している。ウイルス型とは、例えばウイルスIL−10のごとく、ウイルスゲノムにより内因的にコードされているタンパク質アイソフォームを意味している。
本発明の変異配列とは、例えば、1以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換により野生型配列からの逸脱を含むが、免疫変調作用を完全には失っていないヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味している。
したがって、本発明の変異した免疫モジュレータは、好ましくは少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、特に好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約99%の野生型配列との配列相同性を有している分子である。
本発明の配列相同性とは、2つの配列の類似度の程度(%陽性)を意味しており、それはポリヌクレオチドの場合においては、例えばフィルターセットを「オフ」にし、BLOSUM=62にしたBLASTN 2.0.14によって決定される(Altschulら、1997、Nucl.Acids Res.、25:3389−3402)。配列相同性は、例えば、インターネット上、http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/での共通の配列相同性プログラムを使用して確認することができる。
本発明の用語、調節可能な遺伝子発現システムとは、遺伝子スイッチ分子をコードする配列と遺伝子スイッチ結合配列との組み合わせを意味しており、該遺伝子スイッチ結合配列への該遺伝子スイッチ分子の結合は、活性物質の添加により調節され、それにより標的遺伝子の発現を制御しており、この場合、標的遺伝子は免疫モジュレータをコードしている(Burcinら、1998、Frontiers in Bioscience 3:cl−7も参照されたい)。
一般に、遺伝子スイッチ分子は、適した遺伝子スイッチ結合配列へ結合させることにより、標的遺伝子の転写を活性化または阻害することが可能である。活性化は遺伝子スイッチ分子に基づくことができ、例えば、関与するRNAポリメラーゼおよび/または転写因子の接触部位を提供している。阻害は、転写複合体に必要とされるDNA結合部位を、DNAへのその結合によりブロッキングする遺伝子スイッチ分子により起こすことができ、それにより、該結合部位を、例えば、関与するRNAポリメラーゼおよび/または転写因子へ到達できないようにする。
活性物質の添加は、標的遺伝子の転写に正(活性化)にも負(阻害)にも影響することができる。例えば、標的遺伝子は活性物質の非存在下では発現されない。活性物質の添加後、後者は遺伝子スイッチ分子へ結合し、それにより活性化および遺伝子スイッチ結合配列への該遺伝子スイッチ分子の結合が起こり、続いて標的遺伝子の転写が開始される。別の例は、活性物質非存在下でDNAへ結合し、そして転写を活性化する遺伝子スイッチ分子である。活性物質の添加および結合後、遺伝子スイッチ分子は不活性化され、標的遺伝子の転写が停止される。
用語、遺伝子スイッチ分子とは、活性物質のための結合部位および転写活性化ドメインを含有する分子、好ましくはタンパク質、特に融合タンパク質を意味しており、その分子は活性物質の結合後にその活性化の状態を変化させる。
本発明の用語、遺伝子スイッチ結合配列とは、好ましくは、免疫モジュレータをコードする遺伝子またはその活性部分の翻訳開始(+1)の5’上流に位置している核酸配列を意味しており、その核酸配列は、標的遺伝子の転写、特に転写速度および/または組織特異性を制御するか、あるいは翻訳を制御する。プロモーター活性を有し、好ましくは同様にエンハンサー活性を有している調節核酸配列が、該遺伝子スイッチ結合配列に間接的にまたは直接的に結合されている。
本発明の調節可能遺伝子発現システムの機能は、例えば以下のように説明することができる:
遺伝子スイッチ結合配列に遺伝子スイッチ分子が結合しない場合は、共役標的遺伝子は発現されず、この場合、免疫モジュレータは産生されない。
遺伝子スイッチ結合配列に遺伝子スイッチ分子が結合しない場合は、共役標的遺伝子は発現されず、この場合、免疫モジュレータは産生されない。
活性物質が添加される場合、後者は、例えば、遺伝子スイッチ分子の2量体化ドメインへ結合する。この結合は2量体化ドメインにコンホメーション変化を生じ、2つの遺伝子スイッチ分子の2量体化、続いて遺伝子スイッチ結合配列への結合を起こす。この結合は、遺伝子スイッチ分子の活性化ドメインを最小TATAプロモーターの近傍へ近づけ、従って、免疫モジュレータをコードする共役標的遺伝子の転写を開始させる。活性物質が加えられてしまった後は、遺伝子スイッチ結合配列への遺伝子スイッチ分子の結合が解除され、従って標的遺伝子の発現が停止する。
従って、本発明の遺伝子スイッチ分子は、活性物質を加え、次に遺伝子スイッチ結合部位へ結合させることにより、調節し、例えば阻害または活性化し、好ましくは活性化することが可能である。
好ましい活性物質とは、例えば、ミフェプリストーン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンまたはラパマイシンのような遺伝子スイッチを経て、遺伝子または多数の遺伝子の直接的または間接的に調節された発現を起こす、薬理的適合性物質を意味している。
本発明の調節された遺伝子発現システムは、特にプロゲステロン遺伝子発現システムであり、それは、GAL4−DNA結合ドメイン(Gal4−DBD)、切断型リガンド結合部位を有する変異プロゲステロンレセプター由来の2量体化ドメイン(hPR−LBD)、およびヒトNF−κBタンパク質のp65サブユニットの活性化ドメイン(p65−AD)から成る、人工的に組み立てられた転写因子を意味する遺伝子スイッチを含む。遺伝子スイッチ結合配列は、例えば、対応する標的遺伝子が共役されている最小TATAプロモーターが後に続く17ヌクレオチドGAL4結合配列から成るヌクレオチド配列である。言及した遺伝子スイッチ成分Gal4−DBD/hPR−LBD/p65−ADを有するこの種の調節可能遺伝子発現システムは、例えば、Wangら、1994、PNAS 91:8180−8184またはWangら、1997、Gene Therapy 4:432−441に説明されている。このシステムに適した活性物質の例は、哺乳動物には存在せず、遺伝子スイッチ分子の2量体化ドメインへ特異的に結合し、それにより引き起こされる2量体化により該分子を活性化する人工ホルモン様分子、ミフェプリストーンである。
本発明のさらなる調節可能遺伝子発現システムは、テトラサイクリン(Tet)または誘導体ドキシサイクリン(Dox)により誘導可能なシステムを意味するテトラサイクリン遺伝子発現システムであり、そのシステムにおいては、遺伝子スイッチ分子はTetトランス活性化因子タンパク質から成る。該トランス活性化因子(tTA)は、VP16活性化ドメインと大腸菌のTetリプレッサー(TetR)との融合タンパク質である。テトラサイクリン非存在下、tTAはその遺伝子スイッチ結合部位、Tet−応答性要素(TRE)に対して高親和性を有しており、標的遺伝子の発現を活性化する。活性物質テトラサイクリンの添加はDNA結合、従って標的遺伝子活性化を阻害する。この調節可能な遺伝子発現システムは、例えば、Gossen、1995、Science 268:1766−1769;Fruh、1995、Nature 375:415−418;Chaoら、1998、Mol.Cell.Biol.18(8):4883−4898;Halappnavarら、1999、J.Biol.Chem.274(52):37097−37104;またはvan der Vlagら、2000、J.Biol.Chem.275(1):697−704に記載されている。
この調節Tetシステムの変形は逆トランス活性化因子(rtTA)である。このシステムにおいては、例えば、Gossen、1995、Science 268:1766−1769;Gossenら、1992、PNAS 89:5547−5551;Linstedtら、1997、Mol.Biol.Cell 8:1073−1087;Mehlenら、1998、Nature 395:801−804;またはJoosseら、2000、Hum.Mol.Genet.9:3075−3082に記載されているように、野生型TetRは変異TetR(rTetR)に置換されており、その結果、融合タンパク質は、ドキシサイクリン存在下でのみDNAの遺伝子スイッチ結合部位を結合させ、従って共役標的遺伝子を誘導する。
本発明のさらなる調節可能遺伝子発現システムは、ラパマイシン遺伝子発現システムである。このシステムは、活性物質ラパマイシンにより仲介される、タンパク質FKBP12およびFRAPの誘導可能2量体化を含む。これら2つのタンパク質の2量体化は、FRAPに結合した活性化ドメインのDNA結合を起こし、従って共役標的遺伝子のスイッチを入れる。この種の調節可能遺伝子発現システムは、例えば、Riveraら、1996、Nature Med 2:1028−1032に記載されている。
活性物質は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、眼窩内、嚢内、脊髄内、経皮、局所的、経口、または粘膜、例えば鼻腔または口腔を経て、当業者にはよく知られている方法により投与することができる。投与の方法のさらなる例は、全身的または局所的な注射、潅流、またはカテーテルに基づいた投与である。適した経口剤形の例は、錠剤またはカプセル剤である。経肺投与は、例えば、スプレーにより、および皮下に埋め込まれた配置物(dispository)を経て実施する。経皮吸収治療システム(TTS)は、例えば、EP0 944 398−A1、EP0 916 336−A1、EP0 889 723−A1またはEP0 852 493−A1に開示されている。
細胞は移植可能であることが好ましい。本発明の移植可能とは、生細胞が同一生体の異なった部位へ、または異なった(レシピエント)生体へ移植できることを意味しており、該細胞は非腫瘍原性細胞であることが好ましく、または細胞が腫瘍細胞に由来する場合は、該細胞はその増殖を阻害するために移植に先立って適切に処理される(例えば有糸分裂不活性化により)(例えば、WO00/64459およびUS5,175,103;Pleasureら(1992)The Journal of Neuroscience、12(5):1802−1815を参照されたい)。
本発明の移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞は、特にヒト細胞を含めた哺乳動物細胞であり、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルから、好ましくはヒトから誘導される。
本発明の細胞の例は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、心臓細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、神経細胞、骨髄細胞、骨細胞、軟骨細胞、血液細胞、結合組織細胞、および膵臓、腎臓、眼または肺の細胞である。
非全能細胞とは、完全な生体へ独立して発育することが不可能な細胞を意味している。
さらなる態様において、細胞は幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞である。好ましくは、多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。限定されるものではないが成人組織に由来する特に好ましい幹細胞は、神経幹細胞、骨髄幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、ならびに消化管、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤および膵管の幹細胞を含む。
さらなる態様において、細胞は幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞である。好ましくは、多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。限定されるものではないが成人組織に由来する特に好ましい幹細胞は、神経幹細胞、骨髄幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、ならびに消化管、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤および膵管の幹細胞を含む。
本発明の細胞は、本発明の上記のものを含有し、ヒトまたは動物の生体の組織または臓器が同一のまたは異なったヒトまたは動物の生体内へ移植される前および/または後で、該組織または臓器内へ導入する細胞も含む。
好ましい態様は、細胞株の形態の本発明の細胞に関する。
本発明の細胞株は、例えば、当業者によく知られている方法、例えば遺伝子導入、形質転換または感染により、本発明の上記核酸で細胞株を形質転換するかまたは感染させることによって調製することができる。
本発明の細胞株は、例えば、当業者によく知られている方法、例えば遺伝子導入、形質転換または感染により、本発明の上記核酸で細胞株を形質転換するかまたは感染させることによって調製することができる。
本発明のさらなる態様において、核酸は追加として、選択カセット、特に適した遺伝子導入マーカー遺伝子および/または分化マーカー遺伝子をコードしている。
本発明の選択カセットは、特定の細胞、例えば遺伝子導入された細胞または分化した細胞の特異的選択を与える少なくとも1つの遺伝子をコードする核酸配列である。
本発明の選択カセットは、特定の細胞、例えば遺伝子導入された細胞または分化した細胞の特異的選択を与える少なくとも1つの遺伝子をコードする核酸配列である。
この種の選択のため、例えば、分化マーカー遺伝子、遺伝子導入マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子を使用することが可能である。このように使用される遺伝子は、主として、特定の毒性物質、例えば抗生物質への耐性を仲介する遺伝子である。これに関連して最も頻繁に使用される抗生物質は、ネオマイシン、ハイグロマイシン(hph)、ゼオシン(Sh ble)およびピューロマイシン(pacA)である。特に幹細胞を選択するための、この種の遺伝子の他の例は、例えば、蛍光マーカー、例えばGFPの発現を調節する遺伝子であり、その助けにより、選択すべき細胞を蛍光表示式細胞分取器(FACS)で精製することができる。選択マーカーの他の例は、表面分子、例えば増殖因子レセプターであり、その助けにより、細胞を磁気免疫ビーズで濃縮することができる(Bonini C.、Science Vol.276、1719−1724、1997)。他の例は酵素活性(例えばチミジンキナーゼ)をコードする遺伝子であり、それは毒性物質の前駆体、「プロドラッグ」(例えばガンシクロビル)を毒性物質へ変換する。この場合ネガティブ選択が起こり、即ち、遺伝子の上流のプロモーターを発現しない細胞のみが生存する。
本発明の選択カセットのさらに可能な遺伝子は、lacZ(β−ラクタマーゼをコードする)、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アデノシン デアミナーゼ(ADA)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、およびキサンチングアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ(XGPRT)である。当業者は、必要に応じて、該遺伝子、例えば追加の核酸配列の機能を確実にするためまたは増加させるために使用することができる試薬に熟知している。
好ましい態様において、核酸はさらにNK細胞および/またはキラー細胞、好ましくはヒトMHCクラスI分子、キメラMHCクラスI分子またはウイルスMHCクラスI相同体を阻害する分子をコードしている。
キラー細胞は、自発性または後天の性細胞毒性の可能性を有する単核細胞の不均一な集団として当業者に公知である。NK細胞(ナチュラルキラー細胞)とは、天然に存在する、即ち、免疫応答の結果ではなく、従って抗原特異的に誘導されないキラー細胞を意味する。
本発明はさらに、本明細書においてすでに詳細に説明したように、少なくとも1つの免疫モジュレータ、および活性物質の添加により調節できる少なくとも1つの遺伝子発現システムをコードする核酸に関する。
核酸は同様に、遺伝子発現を調節する少なくとも1つの要素をコードしていることが好ましい。これらの要素とは、例えばプロモーターまたは調節核酸配列を意味している。これらおよび発現ベクター(以下により詳細に例示されている)は、核酸を発現するために適した条件を作り出すことができる。発現ベクターは一般に、特定の細胞に、または各々の場合に転写されるべき遺伝子に適したプロモーターを含む。
真核生物における構成的発現を可能にする調節可能な要素の例は、RNAポリメラーゼIIIにより認識されるプロモーターである。全ての細胞および組織型における構成的発現のためのこの種のプロモーターは、例えばpGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、TK(チミジンキナーゼ)プロモーター、EF1α(伸長因子1−α)プロモーター、SV40(サルウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーターおよびpUB(ユビキチン)プロモーターである。
真核生物において細胞または組織特異的発現を可能にする調節可能な要素の例は、特定の細胞型においてのみ発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、またはプロモーターもしくはエンハンサーの活性化配列である。こうしたプロモーターの例は、膵β細胞のインスリンプロモーター、神経細胞のSox−2プロモーター、筋肉細胞のミオシン重鎖プロモーター、内皮細胞のVE−カドヘリンプロモーターおよび上皮細胞のケラチンプロモーターである。
真核生物における調節可能な発現を可能にする調節可能な要素のさらなる例は、対応するリプレッサーと組み合わされたテトラサイクリンオペレーターである(Gossen M.ら(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5、516−20)。
発現は同様に、量に関しておよび/または時間の関数として発現に影響する調節ヌクレオチド配列を経て調節することができる。これらには、例えば、エンハンサー配列、リーダー配列、ポリアデニル化配列、IRES配列、イントロン、インスレーター配列およびリプレッサー配列が含まれる。
本発明の核酸は、1以上の核酸分子上に位置することができる。しかしながら、多数の核酸分子の場合、これらは本発明に従って機能的に協力しなければならない。例えば、本発明に従って、(i)遺伝子スイッチ分子の配列、(ii)遺伝子スイッチ結合部位の調節下にある免疫モジュレータの配列、および(iii)選択マーカーの配列は、3つの異なった核酸分子上に位置することが可能である。核内での遺伝子スイッチ分子の転写のため、翻訳後に細胞質中で産生される遺伝子スイッチタンパク質は、順に、核内で免疫モジュレータ配列の遺伝子スイッチ結合部位へ結合し、それらの発現を調節することができる。
したがって、本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の核酸を含むベクターにも関する。
本発明の可能なベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現ベクターおよび遺伝子治療において活性なベクターである。
本発明の可能なベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現ベクターおよび遺伝子治療において活性なベクターである。
本発明の発現ベクターは、少なくとも1つの本発明の核酸、少なくとも1つの翻訳開始シグナル、1つの翻訳終結シグナルおよび/または真核生物における発現のための1つのポリアデニル化シグナルを含む。
特に哺乳動物細胞における発現のための、この種の発現ベクターは、なかでも市販されている例えばpIRES(クローンテック、ハイデルベルグ、ドイツ)、pCI−neoベクター(プロメガ、マンハイム、ドイツ)、pCMV−Script(ストラタジーン、ラ・ホーヤ、USA)およびpcDNA3ベクター(インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ)であり、または個々の要素から個々に組み立てることができる。
遺伝子治療において活性な本発明のベクターの例は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはRNAウイルスのレプリコンに基づいたベクターである(例えばLindemannら、1997、Mol.Med.3:466−76;Springerら、1998、Mol.Cell.2:549−58;Khromykh、2000、Curr.Opin.Mol.Ther.2:555−69を参照されたい)。
遺伝子治療において活性なベクターは、本発明の核酸フラグメントとリポソームを複合体形成させることによって得ることもできる。レポフェクションは、リポソーム懸濁液を超音波処理することによる、カチオン性脂質からの小さな単層小胞の調製を包含する。DNAは、リポソーム表面へイオン的に、そして総正電荷が保持され、100%のプラスミドDNAがリポソームと複合体形成するような比で結合されている。脂質混合物DOTMA(1,2−ジオレイルオキシプロピル−3−トリメチルアンモニウムブロミド)およびDOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)に加え、多数の新規脂質製剤がその間に合成され、多様な細胞株において遺伝子導入効率が試験された(Behrら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6982−6986;GaoおよびHuang、1991、Biochem.Biophys.Acta 1189、195−203;Felgnerら、1994、J.Biol.Chem.269、2550−2561)。該新規脂質製剤の例は、DOTAP(N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムエチルサルフェート)およびDOGS(TRANSFECTAM;ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン)である。細胞内への核酸の輸送を増加させる賦形剤の可能な例は、核酸の核内への輸送を可能にする、DNAに結合したタンパク質もしくはペプチド、または合成ペプチドDNA分子である(Schwartzら、1999、Gene Therapy 6:282;Brandenら、1999、Nature Biotechs.17:784)。賦形剤は、核酸の細胞質内への放出を可能にする分子(Planckら、1994、J.Biol.Chem.269、12918;Kichlerら、1997、Bioconj.Chem.8、213)、または、例えばリポソーム(UhlmannおよびPeimann、1990、Chem.Rev.90、544)も含む。本発明の細胞は、異種遺伝子を発現するために使用することもできる。
遺伝子治療ベクターは、遺伝子導入(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降)または感染により細胞内へ導入することができる。
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の細胞、ならびに適した賦形剤および/または添加剤を含む、医薬品に関する。
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の細胞、ならびに適した賦形剤および/または添加剤を含む、医薬品に関する。
本発明の医薬品は、例えば以下の疾患、
(a)リウマチ性障害、例えば関節リウマチ、シェ−グレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群またはベーチェット病、
(b)I型糖尿病またはLADA、
(c)甲状腺の自己免疫疾患、例えばグレーブス病、
(d)中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、
(f)皮膚疾患、例えば乾癬または神経皮膚炎、
(g)炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病、
(h)免疫障害、
(i)血管疾患、および
(j)移植により生ずる疾患、例えば移植片拒絶、
の予防および/または治療のために使用することができる。
(a)リウマチ性障害、例えば関節リウマチ、シェ−グレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群またはベーチェット病、
(b)I型糖尿病またはLADA、
(c)甲状腺の自己免疫疾患、例えばグレーブス病、
(d)中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、
(f)皮膚疾患、例えば乾癬または神経皮膚炎、
(g)炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病、
(h)免疫障害、
(i)血管疾患、および
(j)移植により生ずる疾患、例えば移植片拒絶、
の予防および/または治療のために使用することができる。
例えば医薬品を安定化させおよび/または保存するために働く、適した賦形剤および添加剤は、一般的に当業者によく知られている。これらには、例えば、生理的食塩水、デキストロースリンゲル液、乳酸リンゲル液、ウィスコンシン大学液/ViaSpan(登録商標)(Belzer UW)、ユーロコリンズ液、DMSO、エチレングリコール、スクロース、トレハロース、フィコール、ペルフルオロカーボン、脱塩水、安定化剤、抗酸化剤、錯化剤、抗菌化合物、プロテイナーゼ阻害剤および/または不活性ガスが含まれる。
本発明の医薬品は、それらが投与されるべき特定の型の細胞、組織または臓器に適した方法に従って投与される。この種の方法は当業者によく知られている。それらによれば、本医薬品は、例えば以下のように投与することができる:
・ 肝細胞に対しては静脈内、
・ 心筋細胞に対しては筋肉内または他のカテーテルに基づいた投与、そして
・ β細胞に対しては皮下、静脈内、腹腔内、カプセル化もしくは筋肉内。
・ 肝細胞に対しては静脈内、
・ 心筋細胞に対しては筋肉内または他のカテーテルに基づいた投与、そして
・ β細胞に対しては皮下、静脈内、腹腔内、カプセル化もしくは筋肉内。
医薬品は、細胞を患者から取り出し、例えばDNA遺伝子導入により遺伝子組換えされ、そして患者へ再導入するex vivoアプローチにより、あるいは遺伝子治療において活性な本発明のベクターを、裸のDNAの形で、または本発明のウイルスもしくは非ウイルスベクターまたは本発明の細胞を使用することにより、患者の体内へ導入するin vivoアプローチにより、生体内へ導入することができる。
医薬品の投与量は、例えば体重、一般的健康状態、体表面のサイズ、患者の年齢および他の医薬品との相互作用のような多数の因子に依存することが知られている。投与量は同様に、投与の型にも依存する。したがって、投与量は各々の患者に対し、当業者により個々のケースで決定されなければならない。医薬品は、1日当たり1回または数回、そして数日にわたって投与することができる;このこともまた当業者が決定することができる。
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の細胞を含む、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/またはヒトもしくは哺乳動物の臓器に関する。
本発明の用語、臓器特異的組織および哺乳動物の臓器は、例えば哺乳動物の臓器である心臓、皮膚、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、神経、眼、肺、骨髄、軟骨、骨、血管、結合組織、および該臓器の各々の組織を含む。
本発明の用語、臓器特異的組織および哺乳動物の臓器は、例えば哺乳動物の臓器である心臓、皮膚、膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、神経、眼、肺、骨髄、軟骨、骨、血管、結合組織、および該臓器の各々の組織を含む。
本発明はまた、少なくとも1つの本発明の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物にも関する。
トランスジェニック動物は通常、組織特異的に増加した核酸の発現を示し、従って、例えば免疫応答を分析するのに非常に適している。トランスジェニックマウスを使用することが好ましい。
トランスジェニック動物は通常、組織特異的に増加した核酸の発現を示し、従って、例えば免疫応答を分析するのに非常に適している。トランスジェニックマウスを使用することが好ましい。
本発明のヒト以外の哺乳動物の例は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルである。
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物へ移植するための使用に関する。本発明の移植は、好ましくは自家移植、同種移植または異種移植である。
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物へ移植するための使用に関する。本発明の移植は、好ましくは自家移植、同種移植または異種移植である。
移植とは、例えば細胞、組織および臓器のような生体物質を、同一生体の異なった部位へ(自家移植)、または1つの生体(ドナー)から別の生体(レシピエント)へ移すことあるいは移植することとして当業者に理解されている。異なった生体への移植の場合、区別は以下のようになされている:
・ ドナーとレシピエントが同一種に属し、遺伝的に完全にまたは実質的に同一である同系移植(synotransplantation)、
・ ドナーとレシピエントが同一種に属するが、免疫学的に異なる同種移植、そして
・ ドナーとレシピエントが同一種に属さず、その結果として免疫学的に完全に異なる異種移植。
・ ドナーとレシピエントが同一種に属し、遺伝的に完全にまたは実質的に同一である同系移植(synotransplantation)、
・ ドナーとレシピエントが同一種に属するが、免疫学的に異なる同種移植、そして
・ ドナーとレシピエントが同一種に属さず、その結果として免疫学的に完全に異なる異種移植。
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、哺乳動物またはヒトにおける移植片拒絶を阻害するための使用に関する。
本発明の哺乳動物とは、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコまたはサルを意味している。
移植片拒絶とは、移植された材料、例えば細胞、組織または臓器がレシピエントの生体により拒絶されるプロセスとして当業者に理解されている。拒絶は細胞性免疫および体液性免疫により起こる。拒絶の原因は、移植された材料とレシピエントのあいだのタンパク質構造の相違である。移植された組織のタンパク質構造は、レシピエントの免疫系により免疫原性であると認識され、それにより免疫応答が誘発される。
移植片拒絶とは、移植された材料、例えば細胞、組織または臓器がレシピエントの生体により拒絶されるプロセスとして当業者に理解されている。拒絶は細胞性免疫および体液性免疫により起こる。拒絶の原因は、移植された材料とレシピエントのあいだのタンパク質構造の相違である。移植された組織のタンパク質構造は、レシピエントの免疫系により免疫原性であると認識され、それにより免疫応答が誘発される。
本発明はさらに、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、移植から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療のための使用に関する。こうした疾患の例は、本発明の医薬品の応用分野に関連してすでに前に記述されている。
移植片拒絶を阻害するための、そして移植から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療のための、本発明の使用は、例えば本発明の細胞、組織および/または臓器をヒトまたは哺乳動物へ導入することにより行うことができる。本発明の免疫モジュレータの発現は、本発明の調節可能遺伝子発現システムを経て調節される。調節は、本発明の活性物質を投与することにより、または投与を中断することにより実施され、それにより遺伝子スイッチ分子を活性化または不活性化する。活性化の場合、遺伝子スイッチは、免疫モジュレータをコードする標的遺伝子の転写を活性化する。結果として発現された該免疫モジュレータは、移植された細胞、組織または臓器に対する免疫系の防御的応答を、特にヒトまたは哺乳動物の生体の移植領域において本質的に阻害する。
細胞の使用に基づいた処置は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、非全能性胚性幹細胞または非全能性胚性生殖細胞または成人組織に由来する幹細胞の誘導体から本発明の細胞を選択することにより達成することができる。成人組織に由来する好ましい幹細胞は、ヒトまたは哺乳動物内へ導入された神経幹細胞、骨髄の幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、ならびに消化管、皮膚、脂肪組織、腸、胎盤および膵管の幹細胞を含む。
本発明はまた、本発明の細胞を調製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む:
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
b. 遺伝子スイッチ分子を調節するための少なくとも1つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること。
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
b. 遺伝子スイッチ分子を調節するための少なくとも1つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること。
本発明の核酸、ベクター、分化マーカー遺伝子または遺伝子導入マーカー遺伝子、または細胞を細胞内へ導入するため、当業者によく知られている遺伝子導入、形質転換、電気穿孔または注入の標準法を使用する。
核酸の発現を引き起こすかまたは促進するのに適した条件は、本明細書において上にすでに説明されている。これらには、例えば発現ベクター、プロモーター、および調節可能核酸配列、例えばエンハンサー、ポリアデニル化配列が含まれる。
本発明はまた、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器を調製するためのin vitro方法に関するものであり、以下の工程を含む:
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入すること、
b. 工程aの細胞を分化させること、
c. 工程bの分化細胞を選択すること、および
d. 工程cの選択された細胞を、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織内および/またはヒトもしくは哺乳動物の臓器へ導入すること。
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入すること、
b. 工程aの細胞を分化させること、
c. 工程bの分化細胞を選択すること、および
d. 工程cの選択された細胞を、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織内および/またはヒトもしくは哺乳動物の臓器へ導入すること。
さらなる態様において、本発明のin vitro方法における工程aの後、前または同時に、非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカーを導入することが好ましく、そして工程aの後に、工程aの遺伝子導入された細胞を選択することが好ましい。
本発明の核酸を含有する細胞の分化は、例えば胚様体形成により、好ましくは細胞を溶液中で培養することにより、細胞を高密度で培養することにより、細胞凝集により、分化阻害物質(例えばLIFまたはフィーダー細胞により条件付けされた培地)を除去しながらフィーダー細胞上での培養を解除することにより、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ビタミン(例えばニコチンアミド)、レチノイン酸、酪酸ナトリウムまたはDMSOを培養細胞に加えることにより、または分化を開始させることが知られている他の物質を加えることにより、誘導することができる。
細胞を選択するための多数の方法が知られている。
分化した胚性幹細胞から細胞を選択するための方法は、例えば、Klugら(J.Clin.Invest.1996 Jul 1;98(1):216−24)およびSoriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62)に記載されている。
分化した胚性幹細胞から細胞を選択するための方法は、例えば、Klugら(J.Clin.Invest.1996 Jul 1;98(1):216−24)およびSoriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62)に記載されている。
1つの好ましい選択の方法において、本発明の選択カセットは、抗生物質耐性遺伝子であるマーカー遺伝子を含む。細胞は、分化工程の間にまたは後に適した抗生物質を加えた後、分化細胞を濃縮することにより選択または単離される。マーカー遺伝子を発現する分化細胞のみが、抗生物質に対して耐性である。未分化細胞は死滅する。遺伝子導入細胞の選択も同一の方法により実施することができる。
本発明の抗生物質とは、本発明の選択カセットとして使用された抗生物質耐性遺伝子により耐性が生ずる抗生物質を意味している。培養幹細胞への抗生物質の添加後、本質的に、レポーター遺伝子発現ベクターを含有する幹細胞のみが生き残りそして分化する。
本発明の選択カセットの遺伝子がルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質および/または黄色蛍光タンパク質をコードする選択方法を適用することも可能である。選択されるべき細胞は、蛍光表示式細胞分取器(FACS)を使って単離するか、またはアフィニティー精製により選択する。
さらに表面分子、例えば磁気免疫ビーズを使った増殖因子レセプターによって細胞を濃縮することも可能である(Bonini C.、Science Vol.276、1719−1724、1997)。
第2マーカー遺伝子を細胞へ導入できることが好ましく、それにより、本発明のin vitro方法の工程aに従った核酸および/またはベクターがうまく導入された細胞の選択を実施することを可能にする。この2重選択は、所望の細胞の約90%、好ましくは約95〜100%純粋な集団を得ることを可能にする。
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む:
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも1つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞へ導入すること、
b. 工程aの遺伝子導入細胞を選択すること、
c. 工程bに従って選択された細胞を、少なくとも1つのヒト以外の哺乳動物胚盤胞へ導入すること、
d. 工程cの胚盤胞または工程dの胚をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
e. 該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも1つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞へ導入すること、
b. 工程aの遺伝子導入細胞を選択すること、
c. 工程bに従って選択された細胞を、少なくとも1つのヒト以外の哺乳動物胚盤胞へ導入すること、
d. 工程cの胚盤胞または工程dの胚をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
e. 該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
好ましい態様において、幹細胞は多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む:
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の2つの前核のいずれかに導入すること、
b. 工程aの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
c. 該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法に関するものであり、以下の工程を含む:
a. 少なくとも1つの本発明の核酸および/または少なくとも1つの本発明のベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の2つの前核のいずれかに導入すること、
b. 工程aの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
c. 該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること。
精管切断したオスと交尾することにより偽妊娠させたヒト以外の哺乳動物養母が好ましい。
養母へ未分化胚芽細胞および/または卵母細胞を導入するための方法は、当業者に知られている。導入は、例えばファロピー管または子宮内への注入により実施することができる(例えばHogan,B.、Beddington,R.、Constantini,F.およびLacy,E.、実験室マニュアル(1994)、コールドスプリングハーバー研究所出版、173−181頁を参照されたい)。
養母へ未分化胚芽細胞および/または卵母細胞を導入するための方法は、当業者に知られている。導入は、例えばファロピー管または子宮内への注入により実施することができる(例えばHogan,B.、Beddington,R.、Constantini,F.およびLacy,E.、実験室マニュアル(1994)、コールドスプリングハーバー研究所出版、173−181頁を参照されたい)。
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、例えば、該ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物から、例えばマウスの尾からゲノムDNAを抽出することにより同定することができる。続くPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)解析において、本発明の核酸に対する導入遺伝子を特異的に認識するプライマーを使用する。ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは、このようにして検出することができる。
また、サザンブロットにより同定を実施することも可能である。この場合、ゲノムDNAを膜に転写し、DNAプローブ、例えば、探している導入遺伝子に特異的な放射性標識DNAプローブにより検出する。
ヒト以外の幹細胞、卵母細胞、前駆細胞または不死化細胞を再生してヒト以外のトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを得ることによる、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法は、例えばDE196 25 049号およびUS4,736,866号;US5,625,122号;US5,698,765号;US5,583,278号およびUS5,750,825号から当業者に公知であり、そして、例えば、本発明の発現ベクターを胚もしくは精母細胞へ直接注入することにより、または発現ベクターの胚性幹細胞への遺伝子導入を経ることにより作製できるトランスジェニック動物を含む(例えば、Pinkert、1994:トランスジェニック動物技術:実験室ハンドブック、アカデミックプレス、ロンドン、UKの中のPolitesおよびPinkert:DNAマイクロインジェクション及びトランスジェニック動物の作製、15−68頁;Houdebine 1997、Harwood Academic Publishers、アムステルダム、オランダ;Pinkert、1994、上記文献中のDoetschman:胚性幹細胞への遺伝子移入、115−146頁;Pinkert、1994、上記文献中のWood:レトロウイルス介在遺伝子移入、147−176頁;Pinkert、1994、上記文献中のMonastersky:遺伝子移入技術:代替技術及び応用、177−220頁を参照されたい)。
トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを作製するための多数の方法は、なかでもWO98/36052号、WO01/32855号、DE196 25 049号、US4,736,866号、US5,625,122号、US5,698,765号、US5,583,278号およびUS5,750,825号から、同様に当業者には公知であり、そして、例えば、本発明のベクターを胚もしくは精母細胞へ直接注入することにより、またはベクターもしくは核酸を胚性幹細胞へ遺伝子導入をすることにより作製できるトランスジェニック動物を含む(Pinkert、1994:トランスジェニック動物技術:実験室ハンドブック、アカデミックプレス、ロンドン、UKの中のPolitesおよびPinkert、15−68頁:Pinkert、1994、上記文献中の115−146頁、Doetschmanも参照されたい)。
さらなる態様において、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器を調製するための本発明のin vitro方法、および本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法で使用される幹細胞は、多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞である。
本発明は同様に、本発明の前述の方法により作製されたヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、および該哺乳動物の子孫に関する。
本発明はさらに、同種移植および/または異種移植のためにヒトもしくは動物の細胞、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/またはヒトもしくは哺乳動物の臓器を得るための、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の使用に関する。
本発明はさらに、同種移植および/または異種移植のためにヒトもしくは動物の細胞、ヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/またはヒトもしくは哺乳動物の臓器を得るための、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の使用に関する。
細胞移植は、例えば、体内移植方法によって、または血管壁を通したカテーテル注入法によって実施することができる。
本発明に従って得ることとは、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の生体から、細胞、組織および/または臓器を取り出すことを意味する。こうした取り出し方法はよく知られている。
本発明に従って得ることとは、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の生体から、細胞、組織および/または臓器を取り出すことを意味する。こうした取り出し方法はよく知られている。
本発明はさらに、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、本発明の細胞、本発明のヒトもしくは動物の臓器特異的組織および/または本発明のヒトもしくは哺乳動物の臓器の、薬理的に活性な成分を発見するため、および/または毒性物質を同定するための使用に関する。
この種の方法は、例えば、本発明の細胞を、例えば96ウェルマイクロタイタープレートにまき、続いて、研究されるべき薬理学的に活性なまたは毒性の物質を加え、次に、該物質が死細胞数を増加させたかどうかを細胞計数によって分析することから成るであろう。
本発明の用語、薬理学的に活性な成分および毒性物質とは、適した条件下、哺乳動物またはヒトの個々の細胞、個々の組織、個々の臓器、または全生体に対して薬理学的または毒性の影響を発揮するすべての分子、化合物および/または組成物および物質混合物を意味している。
可能な薬理学的に活性な成分および毒性物質は、単純な化学(有機または無機)分子または化合物、核酸または核酸類似体、核酸のアンチセンス配列、ペプチド、タンパク質または複合体および抗体であることができる。例は、物質ライブラリーに由来し、その薬理活性または毒性活性が研究されている有機分子である。
薬理学的に活性な成分とは、例えば以下に影響する成分である:
・ 細胞が分割および/または生き残るための能力、
・ タンパク質の分泌、例えば膵β細胞からのインスリン、神経細胞からのドーパミン、
・ 筋肉細胞の収縮、
・ 細胞の遊走行動、
・ 細胞の代謝活性、
・ 細胞の電気生理学的活性、
・ 細胞生成物の酵素活性、
・ 細胞分化、
・ 組織または臓器への細胞の組織化。
・ 細胞が分割および/または生き残るための能力、
・ タンパク質の分泌、例えば膵β細胞からのインスリン、神経細胞からのドーパミン、
・ 筋肉細胞の収縮、
・ 細胞の遊走行動、
・ 細胞の代謝活性、
・ 細胞の電気生理学的活性、
・ 細胞生成物の酵素活性、
・ 細胞分化、
・ 組織または臓器への細胞の組織化。
哺乳動物またはヒトの全生体へ適用されたとは、例えば以下に対する影響を意味している:
・ 心臓血管系、
・ 内分泌系、
・ 胃腸系、
・ 神経系、および
・ 代謝活性。
・ 心臓血管系、
・ 内分泌系、
・ 胃腸系、
・ 神経系、および
・ 代謝活性。
毒性物質の例は、以下のような活性成分である:
・ 特定のシグナル、例えばストレスに続いて、アポトーシスを起こすように細胞を刺激する、
・ 心臓血管系に影響する、
・ 神経系に影響する、および/または
・ 代謝活性に影響する。
・ 特定のシグナル、例えばストレスに続いて、アポトーシスを起こすように細胞を刺激する、
・ 心臓血管系に影響する、
・ 神経系に影響する、および/または
・ 代謝活性に影響する。
同定された薬理学的に活性な成分および毒性物質は、適切な場合、本明細書において前に例として述べたように、移植片から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療のための、診断薬または医薬を製造するのに適した添加剤および/または賦形剤と組み合わせまたは一緒に使用することができる。
本発明はまた以下の項にも関する:
(i) ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含む、前記細胞。
(ii) 幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞であることを特徴とする、(i)に記載の細胞。
(iii) 多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(i)または(ii)に記載の細胞。
(iv) 細胞株の形態の、(i)〜(iii)の少なくとも1項に記載の細胞。
(v) 調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび/またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、(i)〜(iv)の少なくとも1項に記載の細胞。
(vi) 免疫モジュレータが以下の機能的特質の少なくとも1つを有することを特徴とする、(i)〜(v)の少なくとも1項に記載の細胞:
a. T細胞により仲介される抗原認識の阻害、
b. T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
c. T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
d. T細胞の増殖の阻害、
e. T細胞の生存を支援する分子の阻害、
f. T細胞のエフェクター分子(TNF−α、IFN−γなど)の阻害、
g. T細胞の接着の阻害、
h. T細胞同時刺激性相互作用の阻害(リンパ球の活性化は2つのシグナルを経て起こる:第1に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第2にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する;この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる)、
i. 例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および/またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
j. 例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
k. 補体系成分の阻害、
l. 外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および/または
m. 炎症反応の阻害。
(vii) 免疫モジュレータが抗体であることを特徴とする、(i)〜(vi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(viii) 免疫モジュレータが
a. レセプター、
b. 可溶性分泌型レセプター、
c. 分泌されたタンパク質またはペプチド、
であることを特徴とする、(i)〜(vi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(ix) 免疫モジュレータが、変異IL−15およびFcフラグメントの融合タンパク質であり、該Fcフラグメントは変異IL−15分子のC末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、(viii)に記載の細胞。
(x) 抗体のFcフラグメントが、IgG、特に、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4若しくは類似の哺乳動物IgGまたはIgM、特に、ヒトIgM若しくは類似の哺乳動物IgMのFcフラグメントであることを特徴とする、(ix)に記載の細胞。
(xi) 核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および/または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、(i)〜(x)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xii) 核酸が追加として、NK細胞および/またはキラー細胞を阻害する分子をコードすることを特徴とする、(i)〜(xi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xiii) 核酸が追加として、
a. 樹状細胞、
b. 単球および/またはマクロファージ、
c. B細胞、
d. 多形核細胞、例えば好中性顆粒球、
を阻害する分子をコードする、(i)〜(xi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xiv) 該阻害性分子が、ヒトMHCクラスI分子、キメラMHCクラスI分子またはウイルスMHCクラスI相同体であること特徴とする、(xiii)に記載の細胞。
(xv) 少なくとも1つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも1つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
(xvi) (xv)に記載の少なくとも1つの核酸を含むベクター。
(xvii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞、および適した賦形剤および/または添加剤を含む医薬。
(xviii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器。
(xix) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xx) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、および/または(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物への移植のための使用。
(xxi) 同種移植、自家移植または異種移植であることを特徴とする、(xx)に記載の使用。
(xxii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、(xv)に記載の核酸、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、適当な場合には少なくとも1つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
(xxiii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、(xv)に記載の核酸、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療用の医薬を製造するための使用。
(xxiv) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程:
c. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
d. 遺伝子スイッチを調節するための少なくとも1つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。
(xxv) (xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのin vitro方法であって、以下の工程:
e. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入すること、
f. 工程aの細胞を分化させること、
g. 工程bの分化細胞を選択すること、および
h. 工程cの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。
(xxvi) 工程aの後、前または同時に、少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカーを、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入し、工程aの後に、工程aの遺伝子導入された細胞を優先的に選択することを特徴とする、(xxv)に記載の方法。
(xxvii) 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(xxv)または(xxvi)に記載の方法。
(xxviii) (xviii)に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
f. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも1つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞へ導入すること、
g. 工程aの遺伝子導入細胞を選択すること、
h. 工程bに従って選択された細胞を、少なくとも1つのヒト以外の哺乳動物の胚盤胞へ導入すること、
i. 工程cの胚盤胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
j. 該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
(xxix) 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(xxviii)に記載の方法。
(xxx) (xix)に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
d. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の2つの前核のいずれかに導入すること、
e. 工程aの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
f. 該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
(xxxi) (xxviii)または(xxix)に記載の方法により作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xxxii) (xxx)に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xxxiii) (xix)、(xxx)および(xxxi)のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、同種移植および/または異種移植用のヒト以外の細胞、ヒト以外の臓器特異的組織、および/またはヒト以外の哺乳動物の臓器を得るための使用。
(xxxiv) (xix)、(xxx)および(xxxi)のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理学的に活性な成分を発見するため、および/または毒性物質を同定するための使用。
(i) ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含む、前記細胞。
(ii) 幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞であることを特徴とする、(i)に記載の細胞。
(iii) 多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(i)または(ii)に記載の細胞。
(iv) 細胞株の形態の、(i)〜(iii)の少なくとも1項に記載の細胞。
(v) 調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび/またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、(i)〜(iv)の少なくとも1項に記載の細胞。
(vi) 免疫モジュレータが以下の機能的特質の少なくとも1つを有することを特徴とする、(i)〜(v)の少なくとも1項に記載の細胞:
a. T細胞により仲介される抗原認識の阻害、
b. T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
c. T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
d. T細胞の増殖の阻害、
e. T細胞の生存を支援する分子の阻害、
f. T細胞のエフェクター分子(TNF−α、IFN−γなど)の阻害、
g. T細胞の接着の阻害、
h. T細胞同時刺激性相互作用の阻害(リンパ球の活性化は2つのシグナルを経て起こる:第1に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第2にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する;この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる)、
i. 例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および/またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
j. 例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
k. 補体系成分の阻害、
l. 外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および/または
m. 炎症反応の阻害。
(vii) 免疫モジュレータが抗体であることを特徴とする、(i)〜(vi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(viii) 免疫モジュレータが
a. レセプター、
b. 可溶性分泌型レセプター、
c. 分泌されたタンパク質またはペプチド、
であることを特徴とする、(i)〜(vi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(ix) 免疫モジュレータが、変異IL−15およびFcフラグメントの融合タンパク質であり、該Fcフラグメントは変異IL−15分子のC末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、(viii)に記載の細胞。
(x) 抗体のFcフラグメントが、IgG、特に、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4若しくは類似の哺乳動物IgGまたはIgM、特に、ヒトIgM若しくは類似の哺乳動物IgMのFcフラグメントであることを特徴とする、(ix)に記載の細胞。
(xi) 核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および/または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、(i)〜(x)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xii) 核酸が追加として、NK細胞および/またはキラー細胞を阻害する分子をコードすることを特徴とする、(i)〜(xi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xiii) 核酸が追加として、
a. 樹状細胞、
b. 単球および/またはマクロファージ、
c. B細胞、
d. 多形核細胞、例えば好中性顆粒球、
を阻害する分子をコードする、(i)〜(xi)の少なくとも1項に記載の細胞。
(xiv) 該阻害性分子が、ヒトMHCクラスI分子、キメラMHCクラスI分子またはウイルスMHCクラスI相同体であること特徴とする、(xiii)に記載の細胞。
(xv) 少なくとも1つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも1つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
(xvi) (xv)に記載の少なくとも1つの核酸を含むベクター。
(xvii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞、および適した賦形剤および/または添加剤を含む医薬。
(xviii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器。
(xix) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xx) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、および/または(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物への移植のための使用。
(xxi) 同種移植、自家移植または異種移植であることを特徴とする、(xx)に記載の使用。
(xxii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、(xv)に記載の核酸、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、適当な場合には少なくとも1つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
(xxiii) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞、(xv)に記載の核酸、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療用の医薬を製造するための使用。
(xxiv) (i)〜(xiv)のいずれか1項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程:
c. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
d. 遺伝子スイッチを調節するための少なくとも1つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。
(xxv) (xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのin vitro方法であって、以下の工程:
e. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入すること、
f. 工程aの細胞を分化させること、
g. 工程bの分化細胞を選択すること、および
h. 工程cの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。
(xxvi) 工程aの後、前または同時に、少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカーを、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入し、工程aの後に、工程aの遺伝子導入された細胞を優先的に選択することを特徴とする、(xxv)に記載の方法。
(xxvii) 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(xxv)または(xxvi)に記載の方法。
(xxviii) (xviii)に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
f. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも1つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞へ導入すること、
g. 工程aの遺伝子導入細胞を選択すること、
h. 工程bに従って選択された細胞を、少なくとも1つのヒト以外の哺乳動物の胚盤胞へ導入すること、
i. 工程cの胚盤胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
j. 該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
(xxix) 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、(xxviii)に記載の方法。
(xxx) (xix)に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
d. (xv)に記載の少なくとも1つの核酸および/または(xvi)に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の2つの前核のいずれかに導入すること、
e. 工程aの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
f. 該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。
(xxxi) (xxviii)または(xxix)に記載の方法により作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xxxii) (xxx)に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
(xxxiii) (xix)、(xxx)および(xxxi)のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、同種移植および/または異種移植用のヒト以外の細胞、ヒト以外の臓器特異的組織、および/またはヒト以外の哺乳動物の臓器を得るための使用。
(xxxiv) (xix)、(xxx)および(xxxi)のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、(xviii)に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理学的に活性な成分を発見するため、および/または毒性物質を同定するための使用。
以下の図面および実施例は、本発明を例示することを意図するものであり、本発明を限定するものではない。
本発明の遺伝子スイッチは、以下の3つの機能単位から成るキメラタンパク質である:
i )遺伝子スイッチ結合ドメインUASを認識するGal4 DNA結合ドメイン(Gal−DBD)。本発明のUAS配列は、17ヌクレオチドの配列モチーフの4つのコピーを含み、そのモチーフの各々は、2つのGal4−DBD分子のための結合部位として働くことができる。
ii) 遺伝子スイッチへの活性物質ミフェプリストーンの結合を仲介し、そして遺伝子スイッチタンパク質の2量体化による活性コンホメーションへの変換を起こす、ヒトプロゲステロンレセプターの切断型リガンド結合ドメイン(PR−LBD)。
iii) 遺伝子スイッチによって標的遺伝子の転写を活性化する、p65活性化ドメイン(P65−AD)。
本発明の遺伝子スイッチは、以下の3つの機能単位から成るキメラタンパク質である:
i )遺伝子スイッチ結合ドメインUASを認識するGal4 DNA結合ドメイン(Gal−DBD)。本発明のUAS配列は、17ヌクレオチドの配列モチーフの4つのコピーを含み、そのモチーフの各々は、2つのGal4−DBD分子のための結合部位として働くことができる。
ii) 遺伝子スイッチへの活性物質ミフェプリストーンの結合を仲介し、そして遺伝子スイッチタンパク質の2量体化による活性コンホメーションへの変換を起こす、ヒトプロゲステロンレセプターの切断型リガンド結合ドメイン(PR−LBD)。
iii) 遺伝子スイッチによって標的遺伝子の転写を活性化する、p65活性化ドメイン(P65−AD)。
ミフェプリストーン非存在下では、上流に偏在性の弱い基礎最小チミジンキナーゼプロモーター(pTK)を経て、少量の遺伝子スイッチが転写される。しかしながら、これらの遺伝子スイッチ分子は、単量体として存在し、それ故、DNA領域と結合できず、また転写を開始することができない。活性物質ミフェプリストーンの添加後、遺伝子スイッチシステムが活性化される。リガンド−結合遺伝子スイッチホモ2量体は、UAS配列を含有するDNA領域(例えばMutIL15−mFcのためのTATAプロモーター調節遺伝子の上流の調節領域など)へ結合し、従って、免疫変調タンパク質の転写を活性化する。加えて、UAS配列を有するDNA領域は、遺伝子スイッチタンパク質遺伝子のTKプロモーターの上流に位置しているので、該遺伝子スイッチタンパク質それ自身の転写が、自己調節フィードバック機構で同時に活性化され、従って、活性遺伝子スイッチの量を増加させる。
細胞株から調製された、本発明の移植可能細胞は、例えば、抗生物質ネオマイシン(Neo−R)およびハイグロマイシン(Hygro−R)に耐性のマーカー遺伝子をさらに含むことができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(pGK)のごとき、偏在性プロモーターにより調節されるマーカー遺伝子は、DNA構築物の取り込みで細胞を選択するために役に立つ。例えば、ラットインスリンプロモーター(RIP)のごとき、細胞型特異的プロモーターにより調節されるマーカー遺伝子は、特異的細胞型のトランスジェニック細胞を選択するために役に立つ。
本発明のトランスジェニック動物を作製するため、細胞は少なくとも要素1および2を含んでいなければならない。細胞株からトランスジェニック細胞を調製するためには、細胞は追加として要素3も含むことができる。
実施例
免疫変調タンパク質MutIL−15/mFcの調節された発現の作用様式を研究し、示すため、2つの実験モデルを開発した。
a)移植のためのトランスジェニック細胞株
このモデルにおいて、幹細胞を、MutIL−15/mFc免疫モジュレータの調節可能発現のための要素に加えて、特定の細胞型(例えばインスリン産生細胞)の調製を可能にする選択カセット(US5,733,727号参照)を含んでいるベクター構築物で遺伝子導入した。この方法において、未分化トランスジェニック幹細胞から、特定の細胞型の分化細胞を調製し、単離することが可能である。これらのトランスジェニック分化細胞は、適したレシピエントマウス(例えば糖尿病マウス)へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植細胞はそれら自身でMutIL−15/mFcを産生し、従って、それら自身の拒絶を防止する。
b)トランスジェニックマウスモデル
ミフェプリストーンの添加を経たMutIL−15/mFcの調節された発現を起こす構築物をゲノムに含む、トランスジェニックマウスを作製した。MutIL−15/mFc発現は、偏在性プロモーターにより調節されているので、マウスは、ミフェプリストーンの添加により刺激された場合にMutIL−15/mFcを産生した。臓器(例えば心臓、腎臓)または細胞(島細胞、神経細胞)をトランスジェニック動物から取り出すことができ、別の、非トランスジェニックマウス内へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植臓器/細胞はそれ自身、MutIL−15/mFcを産生し、従って、それ自身の拒絶を防止する。
実施例
免疫変調タンパク質MutIL−15/mFcの調節された発現の作用様式を研究し、示すため、2つの実験モデルを開発した。
a)移植のためのトランスジェニック細胞株
このモデルにおいて、幹細胞を、MutIL−15/mFc免疫モジュレータの調節可能発現のための要素に加えて、特定の細胞型(例えばインスリン産生細胞)の調製を可能にする選択カセット(US5,733,727号参照)を含んでいるベクター構築物で遺伝子導入した。この方法において、未分化トランスジェニック幹細胞から、特定の細胞型の分化細胞を調製し、単離することが可能である。これらのトランスジェニック分化細胞は、適したレシピエントマウス(例えば糖尿病マウス)へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植細胞はそれら自身でMutIL−15/mFcを産生し、従って、それら自身の拒絶を防止する。
b)トランスジェニックマウスモデル
ミフェプリストーンの添加を経たMutIL−15/mFcの調節された発現を起こす構築物をゲノムに含む、トランスジェニックマウスを作製した。MutIL−15/mFc発現は、偏在性プロモーターにより調節されているので、マウスは、ミフェプリストーンの添加により刺激された場合にMutIL−15/mFcを産生した。臓器(例えば心臓、腎臓)または細胞(島細胞、神経細胞)をトランスジェニック動物から取り出すことができ、別の、非トランスジェニックマウス内へ移植することができる。移植された動物がミフェプリストーンで処置された場合、移植臓器/細胞はそれ自身、MutIL−15/mFcを産生し、従って、それ自身の拒絶を防止する。
トランスジェニックマウスモデルのためのベクタークローニング
17×4/pGL3 Basicベクター(TATAボックスおよび遺伝子スイッチ結合部位として17オリゴマーの4コピーを有する、プロメガから入手した修飾pGL3Basicベクター)中のルシフェラーゼ遺伝子を、追加としてCD5リーダー配列(Jones H.、Nature 323(6086)、346−349、1986)を含む、変異IL−15タンパク質およびマウスFc部分のための遺伝子(本明細書において以後、MutIL−15/mFcと称する:Kimら、The Journal of Immunology、1998、160:5742−5748)で置換した。CD5−MutIL−15/mFc遺伝子は、SV40ポリA配列で終結している(ベクター名:17×4/IL15)。続いて、SbfIおよびPmeI切断部位を含有するオリゴヌクレオチドを17オリゴマーの上流に導入した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ)。該切断部位は、pswitchベクター(インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ)から単離された、上流調節領域(Gal4UAS−PTK−IVS8)を含んでいる、遺伝子スイッチ分子のための遺伝子(GS=Gal4−DBD/hPR−LBD/p65−AD)を導入するために役に立つ(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/GS)。あるいは、および追加として、IVS8イントロン(同様にpswitchから)がTATAボックスおよびCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS)。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定により点検した。
17×4/pGL3 Basicベクター(TATAボックスおよび遺伝子スイッチ結合部位として17オリゴマーの4コピーを有する、プロメガから入手した修飾pGL3Basicベクター)中のルシフェラーゼ遺伝子を、追加としてCD5リーダー配列(Jones H.、Nature 323(6086)、346−349、1986)を含む、変異IL−15タンパク質およびマウスFc部分のための遺伝子(本明細書において以後、MutIL−15/mFcと称する:Kimら、The Journal of Immunology、1998、160:5742−5748)で置換した。CD5−MutIL−15/mFc遺伝子は、SV40ポリA配列で終結している(ベクター名:17×4/IL15)。続いて、SbfIおよびPmeI切断部位を含有するオリゴヌクレオチドを17オリゴマーの上流に導入した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ)。該切断部位は、pswitchベクター(インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ)から単離された、上流調節領域(Gal4UAS−PTK−IVS8)を含んでいる、遺伝子スイッチ分子のための遺伝子(GS=Gal4−DBD/hPR−LBD/p65−AD)を導入するために役に立つ(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/GS)。あるいは、および追加として、IVS8イントロン(同様にpswitchから)がTATAボックスおよびCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS)。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定により点検した。
インスリン産生細胞からのトランスジェニックin vitro移植片のためのベクタークローニング
これらのベクターは、トランスジェニックマウスモデルのためのベクターと類似して調製された。しかしながら、これらのプラスミドは追加として、ラットインスリンプロモーター(RIP)により調節されているネオマイシン耐性遺伝子(neo)、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(pGK)により調節されているハイグロマイシン耐性遺伝子(hygro)を含む、フラグメントも含んでいる。これらの要素はCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の5’より下流に挿入され、あるいは2つの転写方向でクローン化される(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/GS)。あるいは、および追加として、IVS8イントロン(同様にpswitchから)がTATAボックスおよびCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/IVS8/GS)。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定によりチェックした。
これらのベクターは、トランスジェニックマウスモデルのためのベクターと類似して調製された。しかしながら、これらのプラスミドは追加として、ラットインスリンプロモーター(RIP)により調節されているネオマイシン耐性遺伝子(neo)、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(pGK)により調節されているハイグロマイシン耐性遺伝子(hygro)を含む、フラグメントも含んでいる。これらの要素はCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の5’より下流に挿入され、あるいは2つの転写方向でクローン化される(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/GS)。あるいは、および追加として、IVS8イントロン(同様にpswitchから)がTATAボックスおよびCD5−MutIL−15/mFc遺伝子の開始コドン間に挿入されたベクターを調製した(ベクター名:17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/IVS8/GS)。すべてのクローニング生成物のセグメント間の移行は配列決定によりチェックした。
実施例1および2で述べたベクター中のCD5−MutIL−15/mFcの調節された発現および分泌のチェック
cos−7細胞(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)およびA293細胞(Quantum、モントリオール、カナダ)の一時的遺伝子導入を実施した。この目的のため、遺伝子導入1日前に、5〜7.5×105細胞/ウェルを6ウェルプレートにまいた。1〜2μgDNA/ウェルによる遺伝子導入を、各々の場合に10ng/mlの濃度での10〜20μlのDNAと、各々の場合に250μlのOptiMEM−I培地(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、ドイツ)を混合することにより実施した。平行した実験において、各々の場合に2μlのリポフェクタミン2000(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、#11668−019)/μgのDNAと、250μlのOptiMEM−I培地(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、#31985−062)を混合した。両方の混合物の等量を混合し、室温で20分放置した。その間、50〜70%コンフルエントである細胞を含有する6ウェルプレートをPBSで1回洗浄し、次に各々の場合に、1.5mlの増殖培地/ウェル(DMEM+10%FCS)を加えた。各々の場合に、ウェル当たり500μlのDNA/リポフェクタミン混合物を該細胞に滴加した。追加としてミフェプリストーン刺激された細胞に、各々の場合に2μlのミフェプリストーン(シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ;最終濃度10−8M)の10−5M 80%エタノール溶液(インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ)を与えた。次の日、培地を除去し、そして2mlの新鮮培地(DMEM+10%FCS)を加えた。ミフェプリストーン刺激細胞は、再び追加として各々の場合に、2μlのミフェプリストーンを受けた。遺伝子導入3日後、培地を細胞から除去し、細胞残渣を除くために遠心分離し、続いて保存のため−80℃で凍結した。細胞をPBSで1回洗浄し、PBS中に掻き出し、1.5mlのエッペンドルフ容器へ移し、各々の場合に、50μlのRIPA緩衝液(1%IGEPAL/シグマ、ダイゼンホーフェン、I−3021、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0、1%SDS、4mM EDTAおよび完全EDTA−フリー プロテアーゼインヒビターカクテル/ロシュ、マンハイム、ドイツ、#1873580、を含んでいるPBS)を用い、4℃で30〜60分溶解させた。遠心分離した溶解物は、液体窒素で急速凍結し、−80℃で保存した。
cos−7細胞(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)およびA293細胞(Quantum、モントリオール、カナダ)の一時的遺伝子導入を実施した。この目的のため、遺伝子導入1日前に、5〜7.5×105細胞/ウェルを6ウェルプレートにまいた。1〜2μgDNA/ウェルによる遺伝子導入を、各々の場合に10ng/mlの濃度での10〜20μlのDNAと、各々の場合に250μlのOptiMEM−I培地(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、ドイツ)を混合することにより実施した。平行した実験において、各々の場合に2μlのリポフェクタミン2000(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、#11668−019)/μgのDNAと、250μlのOptiMEM−I培地(ライフ・テクノロジーズ、カールスルーエ、#31985−062)を混合した。両方の混合物の等量を混合し、室温で20分放置した。その間、50〜70%コンフルエントである細胞を含有する6ウェルプレートをPBSで1回洗浄し、次に各々の場合に、1.5mlの増殖培地/ウェル(DMEM+10%FCS)を加えた。各々の場合に、ウェル当たり500μlのDNA/リポフェクタミン混合物を該細胞に滴加した。追加としてミフェプリストーン刺激された細胞に、各々の場合に2μlのミフェプリストーン(シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ;最終濃度10−8M)の10−5M 80%エタノール溶液(インビトロジェン、カールスルーエ、ドイツ)を与えた。次の日、培地を除去し、そして2mlの新鮮培地(DMEM+10%FCS)を加えた。ミフェプリストーン刺激細胞は、再び追加として各々の場合に、2μlのミフェプリストーンを受けた。遺伝子導入3日後、培地を細胞から除去し、細胞残渣を除くために遠心分離し、続いて保存のため−80℃で凍結した。細胞をPBSで1回洗浄し、PBS中に掻き出し、1.5mlのエッペンドルフ容器へ移し、各々の場合に、50μlのRIPA緩衝液(1%IGEPAL/シグマ、ダイゼンホーフェン、I−3021、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0、1%SDS、4mM EDTAおよび完全EDTA−フリー プロテアーゼインヒビターカクテル/ロシュ、マンハイム、ドイツ、#1873580、を含んでいるPBS)を用い、4℃で30〜60分溶解させた。遠心分離した溶解物は、液体窒素で急速凍結し、−80℃で保存した。
CD5−mutIL15−mFc分泌は、融合タンパク質のマウスFc部分を認識するELISAにより分析した。この目的のため、96ウェルプレート(ヌンク、ヴィースバーデン、ドイツ、#439454)を各々の場合に、100μlの抗マウスIgG2a抗体(クローンR11−89、BDファーミンジェン、ハイデルベルグ、ドイツ、#02251D−553446)を用い、37℃で1時間コーティングした。プレートは続いてPBSで3回洗浄し、非特異的結合部位を飽和させるため、37℃で1時間、DMEM+10%FCSとインキュベートした。各々の場合に、100μlの非希釈培地を、コーティングされたプレートへ加え、次に室温で1時間インキュベートし、続いて、各々の場合に、200μlのPBS/0.1%Tween20で5回、および各々の場合に、200μlのPBSで1回洗浄した。マウスFc部分を検出するため、酵素−結合HRP抗マウスIgG2a抗体、クローンR19−15(BDファーミンジェン、ハイデルベルグ、#02017E−553391)を同様に室温で1時間プレートとインキュベートし、そしてプレートは次に上述のように再び洗浄した。結合された融合タンパク質の量は、OPD含有基質溶液(25mlの0.1Mクエン酸、25mlの0.1Mリン酸水素2カリウム、H2Oで100mlとし、+1錠のOPD(シグマ、ダイゼンホーフェン、#P8412)+40μlのH2O2、30%)添加後の着色反応により可視化し、3M HClを加えることによって反応を停止させた後、490nmにて、ELISAリーダー(μQuant、BIO−TEK Instruments Inc.)中で測定した。
さらに、非希釈培地上清は免疫ブロッティングにより分析した。この目的のためには、培地上清をレムリ(Lammli)試料緩衝液と混合し、92℃に5分間加熱し、次に12.5%強度ポリアクリルアミドゲルへ応用し、そして150Vで電気泳動的に分画した。タンパク質は続いてニトロセルロース膜(Schleicher u.Schuell、ダーセル、ドイツ、CD0564−1)へ移した。非特異的結合部位を飽和させるため、膜を5%粉乳/PBS/0.1%Tween20で処理した。それは次に、1:500希釈のマウス抗ヒトIL15抗体(ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、#554712)と、4℃で16時間インキュベートし、PBS/0.1%Tween20でよく洗浄し、次に、1:3000希釈のペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗体(アマシャム、フライブルグ、ドイツ Freiburg&num;NA9310)で、室温で1時間処理した。よく洗浄した後、膜を界面活性剤(NEN;バッドホンブルグ、ドイツ、#NE103E)を用い、室温で5分処理し、そして着色反応をX線フィルムを応用することにより検出した。
ミフェプリストーンを添加してまたは添加せずに遺伝子導入された細胞の培地上清の分析は、以下の結果を明らかにした:
以下の遺伝子導入を実施した:
1. mCD5.6(MutIL−15/mFc分泌に対する陽性対照、ベクターはCMVプロモーター制御下のCD5−MutIL−15/mFcを含んでいる)
2. 17×4/IL15/オリゴ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチを有しない陰性対照)
3. 17×4/IL15/オリゴ+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン
4. 17×4/IL15/オリゴ/GS±ミフェプリストーン
5. 17×4/IL15/オリゴ/GS+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン
6. 17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS±ミフェプリストーン
7. 17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン。
以下の遺伝子導入を実施した:
1. mCD5.6(MutIL−15/mFc分泌に対する陽性対照、ベクターはCMVプロモーター制御下のCD5−MutIL−15/mFcを含んでいる)
2. 17×4/IL15/オリゴ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチを有しない陰性対照)
3. 17×4/IL15/オリゴ+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン
4. 17×4/IL15/オリゴ/GS±ミフェプリストーン
5. 17×4/IL15/オリゴ/GS+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン
6. 17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS±ミフェプリストーン
7. 17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS+pcDNA3スイッチ±ミフェプリストーン。
遺伝子スイッチ分子を有しない対照ベクター(2.)で遺伝子導入された細胞、およびミフェプリストーンで刺激されなかった細胞においては、MutIL−15/mFcの有意な発現は観察されなかった。単に自己調節遺伝子スイッチ分子(4.+6.)を含む構築物での遺伝子導入後は、ミフェプリストーン刺激後にMutIL−15/mFc分泌のわずかな増加が、ELISAの助けにより検出された。このことは多分、一過的遺伝子導入の過程での自己調節遺伝子活性化による、活性遺伝子スイッチ分子の不十分な形成によるものである。それ故、遺伝子スイッチの量を、一貫して高遺伝子スイッチ産生をもたらすpcDNA3スイッチ(CMVプロモーター制御下の遺伝子スイッチ)との同時遺伝子導入により外部的に増加させた。これらの同時遺伝子導入において、遺伝子スイッチ−フリー(3.)および遺伝子スイッチ含有(5.+7.)構築物の両方で遺伝子導入した細胞の培地上清では、ミフェプリストーン処理後、ELISAにより検出されたMutIL−15/mFcの量が増加していた。
遺伝子導入3.の培地上清の免疫ブロット分析(図1)から、同様に、非刺激細胞(レーン2)と比較して、ミフェプリストーン刺激後(レーン1)、MutIL−15/mFc(50kDaバンド)量の産生が増加したことを確認した。
これらの結果は、MutIL−15/mFc融合タンパク質の転写および分泌が、上述のベクター(例えば、17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS)で遺伝子導入された細胞においてミフェプリストーンの添加により誘導できることを立証している。このことは、調節されたMutIL−15/mFc発現の機能性を立証している。
実施例1および2で述べたベクター中の遺伝子スイッチタンパク質(Gal4UAS−PTK−IVS8−Gal4−DBD/hPR−LBD/p65−AD)の調節された発現および機能性のチェック
前述のように、自己調節遺伝子スイッチのみを産生する、一過的に遺伝子導入された細胞(17×4/IL15/オリゴ/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GSでの遺伝子導入)中の、活性遺伝子スイッチ分子の数は少なかった。
前述のように、自己調節遺伝子スイッチのみを産生する、一過的に遺伝子導入された細胞(17×4/IL15/オリゴ/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GSでの遺伝子導入)中の、活性遺伝子スイッチ分子の数は少なかった。
単一細胞レベルでのMutIL−15/mFcの発現を検出するためには、ELISAの感度は十分ではないので、pGene/V5−His/lacZ(インビトロジェン、カールスルーエ)との同時遺伝子導入を実施した。このベクターは、その転写が同様に遺伝子スイッチ結合部位により調節されるlacZ遺伝子を含んでおり、ミフェプリストーン刺激に基づき、活性遺伝子スイッチを同時に含む細胞でのみ、β−ガラクトシダーゼが産生されることを意味している。該遺伝子スイッチは第2のベクターにより提供した(この場合、自己調節遺伝子スイッチを有する構築物)。β−ガラクトシダーゼは、基質反応によって、個々の細胞内の青い沈殿として検出した。それにより、実質的により高い感度でベクター構築物の機能を検出することが可能である。
実施例3に記載したように、A293細胞を以下の構築物で遺伝子導入し、次に一部、ミフェプリストーンで刺激した:
1. pCMVβ(lacZのための陽性対照、CMVプロモーター制御下のlacZ遺伝子を含んでいるベクター)、
2. 17×4/IL15/オリゴ+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチなしの陰性対照)、
3. 17×4/IL15/オリゴ/GS+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン、
4. 17×/IL15/オリゴ/IVS8/GS+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン
5. pcDNA3スイッチ+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(構成的に高い遺伝子スイッチを有する陽性対照)
6. pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチを有しない陰性対照)。
1. pCMVβ(lacZのための陽性対照、CMVプロモーター制御下のlacZ遺伝子を含んでいるベクター)、
2. 17×4/IL15/オリゴ+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチなしの陰性対照)、
3. 17×4/IL15/オリゴ/GS+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン、
4. 17×/IL15/オリゴ/IVS8/GS+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン
5. pcDNA3スイッチ+pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(構成的に高い遺伝子スイッチを有する陽性対照)
6. pGene/V5−His/lacZ±ミフェプリストーン(遺伝子スイッチを有しない陰性対照)。
遺伝子導入3日後、−20℃で10分、細胞を氷冷メタノールで固定し、PBSで3回洗浄し、次に、lacZ染色溶液(60μlの400mMフェリシカン化カリウム、60μlの400mMフェロシカン化カリウム、60μlの200mM MgCl2、300μlの20mg/ml X−Gal、5.52mlのPBS)を用い、37℃で2.5時間処理した。
遺伝子導入された細胞の光学顕微鏡による評価は、以下の結果を与えた(表2):
細胞の有意な青色染色は、遺伝子スイッチなしでは観察されなかった(2.)。自己調節遺伝子スイッチで遺伝子導入細胞において(3.+4.)、ミフェプリストーンによる刺激は、細胞の3〜5%で明瞭な青色染色を起こした。
この低い数の細胞は非常に少量のMutIL−15/mFcのみしか産生しないので、該量はELISAの検出限界以下である。しかしながら、lacZ染色では、個々の細胞でも遺伝子スイッチ活性を記録および検出することが可能である。
これらの実験は、ミフェプリストーン刺激後に、17×4/IL15/オリゴ/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GS構築物により提供される、lacZの転写をもたらす、活性化された遺伝子スイッチの能力を立証している。これらのデータは従って、前述の構築物の、自己調節遺伝子スイッチの機能性を立証している。
トランスジェニックマウスの作製および特徴付け
構築物17×4/IL15/オリゴ/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GSの50μgのDNAを制限酵素Eco47IIIおよびNotIで切断し、そして各々、所望の4800bpおよび4924bpフラグメントを精製した。該フラグメントは次に、C3HeB/FeJマウスの前核内へ注入し、そして胚は続いて偽妊娠メス内へ移植した。得られたマウスからDNAを抽出し、PCR分析の助けを借りて、導入遺伝子の組み込みを試験した。該PCRにおいて、以下のプライマーを使用した:GS−IL15FW.2(5’−TAT GGC TTC TGA GGC GGA AAG AAC CAG C−3’)およびGS−L15RV.3(5’−G CAG AGA CCC CAT GGG CAT GGT GGC TAG−3’)。従って、得られたPCR生成物は、各々、211bp(イントロンなし)および335bp(IVS8イントロンあり)の長さである。
構築物17×4/IL15/オリゴ/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8/GSの50μgのDNAを制限酵素Eco47IIIおよびNotIで切断し、そして各々、所望の4800bpおよび4924bpフラグメントを精製した。該フラグメントは次に、C3HeB/FeJマウスの前核内へ注入し、そして胚は続いて偽妊娠メス内へ移植した。得られたマウスからDNAを抽出し、PCR分析の助けを借りて、導入遺伝子の組み込みを試験した。該PCRにおいて、以下のプライマーを使用した:GS−IL15FW.2(5’−TAT GGC TTC TGA GGC GGA AAG AAC CAG C−3’)およびGS−L15RV.3(5’−G CAG AGA CCC CAT GGG CAT GGT GGC TAG−3’)。従って、得られたPCR生成物は、各々、211bp(イントロンなし)および335bp(IVS8イントロンあり)の長さである。
17×4/IL15/オリゴ/GS構築物の卵母細胞注入から得られた、44匹のマウスの内、16匹の動物(36%)がトランスジェニックであった。
創立動物(F0世代)を野生型DBA/2マウスと交尾させ、そして得られたf1子孫は再び、導入遺伝子のゲノムでの存在を試験した。トランスジェニックF1動物は続いて、MutIL−15/mFcの調節された発現を試験した。約8〜16週の年齢で、動物にゴマ油に溶解した250μg/kgのミフェプリストーン(シグマ、ダイゼンホーフェン、M9046)を1日おきに、総計で3回、腹腔内へ注射した。最後の注射から1日後に動物を殺し、そしてRNAおよびタンパク質を組織から抽出した。次に、ELISAおよびウェスタンブロットの助けを借りて、組織中の遺伝子スイッチタンパク質および免疫モジュレータ発現を分析した。転写された遺伝子スイッチおよび免疫モジュレータの量を決定するため、定量的逆転写PCR(RT−PCR)によって、RNAの量を決定した。
創立動物(F0世代)を野生型DBA/2マウスと交尾させ、そして得られたf1子孫は再び、導入遺伝子のゲノムでの存在を試験した。トランスジェニックF1動物は続いて、MutIL−15/mFcの調節された発現を試験した。約8〜16週の年齢で、動物にゴマ油に溶解した250μg/kgのミフェプリストーン(シグマ、ダイゼンホーフェン、M9046)を1日おきに、総計で3回、腹腔内へ注射した。最後の注射から1日後に動物を殺し、そしてRNAおよびタンパク質を組織から抽出した。次に、ELISAおよびウェスタンブロットの助けを借りて、組織中の遺伝子スイッチタンパク質および免疫モジュレータ発現を分析した。転写された遺伝子スイッチおよび免疫モジュレータの量を決定するため、定量的逆転写PCR(RT−PCR)によって、RNAの量を決定した。
各々の場合、製造者の指示書に従い、1μgのRNAをExpand Reverse Transcriptase(ロシュ、マンハイム)の助けを借りて、cDNAへ転写した。これに続いて、Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green Kits(ロシュ、マンハイム)の助けを借りて遺伝子スイッチおよび免疫モジュレータMutIL−15/mFcの発現を調べた。免疫モジュレータを検出するためのPCR条件は以下の通りである:
変性:95℃、600秒
サイクル:95℃ 15秒、60℃ 5秒、72℃ 10秒
プライマーCD5.6−FW:5’−CCTGCTGGGGATGCTGGTC
プライマーCD5.6−RV:5’−TTTTCCTCCAGTTCCTCACATTC
MgCl2:3mM。
遺伝子スイッチを検出するためのPCR条件は以下の通りである:
変性:95℃、600秒
サイクル:95℃ 15秒、53℃ 5秒、72℃ 10秒
プライマーGS−FW:5’−GACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAG
プライマーGS−RV:5’−TATATCCTGTAAAGAATCCAT
MgCl2:3mM。
変性:95℃、600秒
サイクル:95℃ 15秒、60℃ 5秒、72℃ 10秒
プライマーCD5.6−FW:5’−CCTGCTGGGGATGCTGGTC
プライマーCD5.6−RV:5’−TTTTCCTCCAGTTCCTCACATTC
MgCl2:3mM。
遺伝子スイッチを検出するためのPCR条件は以下の通りである:
変性:95℃、600秒
サイクル:95℃ 15秒、53℃ 5秒、72℃ 10秒
プライマーGS−FW:5’−GACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAG
プライマーGS−RV:5’−TATATCCTGTAAAGAATCCAT
MgCl2:3mM。
さらに、ミフェプリストーン処理前および後に、一定間隔で動物から採血し、その中に含まれているMutIL−15/mFcの量を、ELISAで決定した。
同一年齢の、および以前にミフェプリストーンで処理されていない同一トランスジェニック系統のマウスを比較のために使用した。
同一年齢の、および以前にミフェプリストーンで処理されていない同一トランスジェニック系統のマウスを比較のために使用した。
もしくは、トランスジェニックマウスを2工程方法で作製した。第1に、遺伝子スイッチ分子のみ(系統「A」)かまたは遺伝子スイッチ結合部位により調節された免疫モジュレータのみ(系統「B」)を発現する、トランスジェニックマウスの2つの異なった系統を発生させる。得られたA系統のトランスジェニックマウスの内、適した量の遺伝子スイッチ分子を発現する動物を選択し、第2の工程において、B系統のトランスジェニックマウスと交尾させた。得られた子孫は次に、2つの導入遺伝子の同時発現を試験する。この方法において、2重トランスジェニック系統「A/B」が得られ、それは遺伝子スイッチ分子により調節される免疫モジュレータを発現する。
構築物pswitch(系統「A」に対して)または17×4/IL15/オリゴおよび17×4/IL15/オリゴ/IVS8(系統「B」に対して)の50μgのDNAを、適した制限酵素で切断し、そして所望のフラグメントを精製する。該フラグメントは次に、C3HeB/FeJマウスの前核内へ注入し、そして胚は続いて偽妊娠メス内へ移植する。得られたマウスからDNAを抽出し、PCR分析の助けを借りて、導入遺伝子の組み込みを試験する。
トランスジェニックマウスのドナー臓器からの膵島の移植
膵島移植は、マウスの膵臓から単離された膵島を、糖尿病マウスの腎被嚢下に注入することを含んでいる(Ferrari−Lacrazら、The Journal of Immunology、2001、Vol.167、pp.3478−3485)。ドナー膵島は、遺伝子スイッチの制御下でMutIL−15/mFcを発現するDBA/2J系統のトランスジェニックマウスから単離される。臓器除去の日に、検出可能にMutIL−15/mFcを産生するように、ドナーマウスをミフェプリストーンで前処理(250μg/kg)する。膵島を調製するため、ドナー膵臓を原位置でタイプIVコラゲナーゼ(2mg/ml;Worthington Biochemical Corp.)で潅流する。37℃で30分の消化の後、膵島を不連続フィコール濃度勾配で精製し、続いて5.6mMのグルコースを含んでいるRPMI1640培地(ギブコ、カールスルーエ)で培養する。300〜400の膵島を、レシピエントの腎被嚢下で移植する。
膵島移植は、マウスの膵臓から単離された膵島を、糖尿病マウスの腎被嚢下に注入することを含んでいる(Ferrari−Lacrazら、The Journal of Immunology、2001、Vol.167、pp.3478−3485)。ドナー膵島は、遺伝子スイッチの制御下でMutIL−15/mFcを発現するDBA/2J系統のトランスジェニックマウスから単離される。臓器除去の日に、検出可能にMutIL−15/mFcを産生するように、ドナーマウスをミフェプリストーンで前処理(250μg/kg)する。膵島を調製するため、ドナー膵臓を原位置でタイプIVコラゲナーゼ(2mg/ml;Worthington Biochemical Corp.)で潅流する。37℃で30分の消化の後、膵島を不連続フィコール濃度勾配で精製し、続いて5.6mMのグルコースを含んでいるRPMI1640培地(ギブコ、カールスルーエ)で培養する。300〜400の膵島を、レシピエントの腎被嚢下で移植する。
レシピエントは6〜10週齢の、β細胞毒素ストレプトゾトシン(225mg/kg;シグマ、ダイゼンホーフェン)を腹腔内へ注射することにより糖尿病が誘導されている、非トランスジェニックB6AF1マウスである。同系膵島(即ち、B6AF1マウスの膵島)を対照として糖尿病マウスへ移植する。
膵島は左腎被嚢下、無菌的に移植する。この目的のため、マウスを麻酔し、肋骨弓下で切断を実行する。左腎臓を腹腔から移動させ、腎被嚢の下極を短く切開する。鈍無菌カニューレを使用し、腎被嚢下にポケットを形成させる。次に、滅菌ピペットチップにより、膵島をこの空洞内へ注入する。続いて、腎臓を腹腔内へ戻し、そして腹部を閉じる。移植の日以後、連続的にMutIL−15/mFcを産生するように、1日おきにミフェプリストーン(250μg/kg)でレシピエント動物を処理する。
同種移植片機能は、定期的なグルコース測定によりモニターする(Accu−Check III;ベーリンガー・マンハイム、マンハイム、ドイツ)。糖尿病の誘導前および後、そして膵島移植後に、一定の間隔で動物の尾静脈または延髄後静脈叢から血液を採り、そして血糖レベルを決定する。追加の管理を、尿試験紙を使用して、血液採取の間に実施する。初期移植片機能は、移植3〜5日後に、11.1ミリモル/l(200mg/dl)以下の血糖含量として定義される。初期移植片機能が観察された後、少なくとも2日連続して、もし、血糖レベルが500mg/dlより高くまで増加したら、移植片は拒絶されたとみなされる。
対照として、ミフェプリストーンが投与されず、そして従って遺伝子スイッチ調節MutIL−15/mFcを発現しない動物で、またはMutIL−15/mFcの外的添加で処置された動物で、膵島移植を実施する。
記述したような様式で処置された動物は、トランスジェニックドナーマウスから得られた膵島細胞の移植後、より良好に血糖レベルを調節することができ、そしてミフェプリストーン処置後、細胞移植片の拒絶が減少する。
異所性心臓移植
異所性心臓移植は、ドナー心臓とレシピエントの腹部中の大血管を連結することを含んでいる(Onoら、J.Cardiovasc.Surg.1969、Corryら、Transplantation 1973)。ドナー心臓を、遺伝子スイッチ制御下でMutIL−15/mFcを発現する、DBA/2J系統のトランスジェニックマウスから単離する。ドナーマウスは、臓器除去の日に、検出可能にMutIL−15/mFcを産生するように、ミフェプリストーンで前処理する(250μg/kg)。麻酔マウスの大静脈を分離し、そして全循環系に分布するようにヘパリン(400U/kg)を注入する。動物は続いて腹部血管を切断することにより出血させ、そして胸骨正中切開の助けにより心臓を露出させる。大動脈および肺血管を分離しおよび切断し、そして肺血管および大静脈を4−10Tevdek(Deknatal、クイーンズビレッジ)でひとまとめにして結索する。心臓は、その除去直後に、生理学的食塩水(Physiolosol、アボット・ラボラトリーズ、イリノイ、USA)中、4℃で保存する。レシピエント(6〜8週齢の非トランスジェニックB6AF1マウス)の下位大静脈および腹部大動脈を露出させ、そして血管にゆるく固定した血管クランプをつける。ドナー大動脈の末端を、8−0プロレン縫合糸によりレシピエント腹部大動脈の側面と結びつける。ドナーの肺動脈を、同一様式でレシピエントの大静脈へ融合させる。血管クランプを取り除き、そして、心臓収縮が再び自発的に開始するように、ドナー心臓を37℃の乳酸リンゲル液で加熱する。移植の日以後、連続的にMutIL−15/mFcを産生するように、1日おきにミフェプリストーン(250μg/kg)でレシピエント動物を処理する。腹部壁を通して拍動している心臓を触診することにより、1日おきに移植片生存をチェックし、そしてパルスの強度および速度に基づいて、1+〜4+のスケールで評価する。心筋収縮がもはや触診不能である場合、心臓が拒絶されたとみなされる。ドナー心臓が、非処置対照動物よりも長い期間にわたって拍動する場合は、拒絶が防止されている。対照として、ミフェプリストーンが投与されず、そして従って遺伝子スイッチ調節MutIL−15/mFcを発現しない動物で、またはMutIL−15/mFcの外的添加で処置された動物で、心臓移植を実施する。
異所性心臓移植は、ドナー心臓とレシピエントの腹部中の大血管を連結することを含んでいる(Onoら、J.Cardiovasc.Surg.1969、Corryら、Transplantation 1973)。ドナー心臓を、遺伝子スイッチ制御下でMutIL−15/mFcを発現する、DBA/2J系統のトランスジェニックマウスから単離する。ドナーマウスは、臓器除去の日に、検出可能にMutIL−15/mFcを産生するように、ミフェプリストーンで前処理する(250μg/kg)。麻酔マウスの大静脈を分離し、そして全循環系に分布するようにヘパリン(400U/kg)を注入する。動物は続いて腹部血管を切断することにより出血させ、そして胸骨正中切開の助けにより心臓を露出させる。大動脈および肺血管を分離しおよび切断し、そして肺血管および大静脈を4−10Tevdek(Deknatal、クイーンズビレッジ)でひとまとめにして結索する。心臓は、その除去直後に、生理学的食塩水(Physiolosol、アボット・ラボラトリーズ、イリノイ、USA)中、4℃で保存する。レシピエント(6〜8週齢の非トランスジェニックB6AF1マウス)の下位大静脈および腹部大動脈を露出させ、そして血管にゆるく固定した血管クランプをつける。ドナー大動脈の末端を、8−0プロレン縫合糸によりレシピエント腹部大動脈の側面と結びつける。ドナーの肺動脈を、同一様式でレシピエントの大静脈へ融合させる。血管クランプを取り除き、そして、心臓収縮が再び自発的に開始するように、ドナー心臓を37℃の乳酸リンゲル液で加熱する。移植の日以後、連続的にMutIL−15/mFcを産生するように、1日おきにミフェプリストーン(250μg/kg)でレシピエント動物を処理する。腹部壁を通して拍動している心臓を触診することにより、1日おきに移植片生存をチェックし、そしてパルスの強度および速度に基づいて、1+〜4+のスケールで評価する。心筋収縮がもはや触診不能である場合、心臓が拒絶されたとみなされる。ドナー心臓が、非処置対照動物よりも長い期間にわたって拍動する場合は、拒絶が防止されている。対照として、ミフェプリストーンが投与されず、そして従って遺伝子スイッチ調節MutIL−15/mFcを発現しない動物で、またはMutIL−15/mFcの外的添加で処置された動物で、心臓移植を実施する。
この実施例は、非処置動物と比較して、ミフェプリストーンで処置された動物においてはより長い時間、異所性心臓移植片が機能的に生き残っていることを示している。
トランスジェニックES細胞株の調製
構築物17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/GS、17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GS、17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/IVS8/GSの100μgのDNAを、制限酵素Eco47IIIおよびNotIで切断し、フラグメントを精製し、そして少なくとも100μlの滅菌PBSに再懸濁した。構築物17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSを次に、エレクトロポレーションにより、SVJ129またはR1系統のマウスES細胞内へ導入した。この目的のため、指数的に増殖しているマウスES細胞をトリプシン処理し、分離しそして計数した。約3×107の細胞を、5〜10mlの冷PBSで2回洗浄し、そして細胞ペレットは次に、DNAを含んだ最終容量が800μlになるように、冷PBSに集めた。続いて消化されたDNAを細胞へ加え、溶液を混合し、そして氷上で少なくとも10分間、インキュベートした。滅菌作業台上で、細胞/DNA混合物を、0.4cm電極スリットを有する、前もって冷却したエレクトロポレーションキュベット(バイオラッド、ミュンヘン、ドイツ)に充填した。エレクトロポレーションはGenepulser2装置(バイオラッド、ミュンヘン)を使用して、0.8kVおよび3μFで実施した。細胞を次にES細胞培地(20mM Hepes、15%熱不活性化FCS、50U/mlペニシリン、50pg/mlストレプトマイシン、0.1mM非必須アミノ酸、0.1mMメルカプトエタノール、103U/ml白血病抑制因子を含んでいるDMEM)と混合し、そして0.1%ゼラチンでコーティングした10枚の10cm細胞培養ディッシュに均等に分布させた。次の日、ES細胞培地に溶解した200μg/mlのハイグロマイシン(シグマ、ダイゼンホーフェン、H3274)を加えることにより選択を開始した。細胞を、約5〜9日の構築物の取り込みで選択し、そして個々のトランスジェニッククローンを滅菌作業台上、手作業で単離し、そして96ウェルプレートへ移した。細胞はコンフルエントに到達する前に継代し、そして連続的に、48ウェルプレート、24ウェルプレート、6ウェルプレートおよび10cmディッシュへ再プレートした。
構築物17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/GS、17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GS、17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPnh/IVS8/GSの100μgのDNAを、制限酵素Eco47IIIおよびNotIで切断し、フラグメントを精製し、そして少なくとも100μlの滅菌PBSに再懸濁した。構築物17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/GSおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8/GSを次に、エレクトロポレーションにより、SVJ129またはR1系統のマウスES細胞内へ導入した。この目的のため、指数的に増殖しているマウスES細胞をトリプシン処理し、分離しそして計数した。約3×107の細胞を、5〜10mlの冷PBSで2回洗浄し、そして細胞ペレットは次に、DNAを含んだ最終容量が800μlになるように、冷PBSに集めた。続いて消化されたDNAを細胞へ加え、溶液を混合し、そして氷上で少なくとも10分間、インキュベートした。滅菌作業台上で、細胞/DNA混合物を、0.4cm電極スリットを有する、前もって冷却したエレクトロポレーションキュベット(バイオラッド、ミュンヘン、ドイツ)に充填した。エレクトロポレーションはGenepulser2装置(バイオラッド、ミュンヘン)を使用して、0.8kVおよび3μFで実施した。細胞を次にES細胞培地(20mM Hepes、15%熱不活性化FCS、50U/mlペニシリン、50pg/mlストレプトマイシン、0.1mM非必須アミノ酸、0.1mMメルカプトエタノール、103U/ml白血病抑制因子を含んでいるDMEM)と混合し、そして0.1%ゼラチンでコーティングした10枚の10cm細胞培養ディッシュに均等に分布させた。次の日、ES細胞培地に溶解した200μg/mlのハイグロマイシン(シグマ、ダイゼンホーフェン、H3274)を加えることにより選択を開始した。細胞を、約5〜9日の構築物の取り込みで選択し、そして個々のトランスジェニッククローンを滅菌作業台上、手作業で単離し、そして96ウェルプレートへ移した。細胞はコンフルエントに到達する前に継代し、そして連続的に、48ウェルプレート、24ウェルプレート、6ウェルプレートおよび10cmディッシュへ再プレートした。
10nMミフェプリストーンの添加後、定量的RT−PCRによる遺伝子スイッチおよびMutIL−15/mFc、またはELISAおよびウェスタンブロットアッセイの助けを借りたMutIL−15/mFcの調節可能な発現で細胞クローンを試験した(上記実施例3および4で説明したように)。
あるいは、トランスジェニックES細胞を2工程方法で調製した。第1に、調節された様式で遺伝子スイッチ分子のみを発現するトランスジェニックES細胞を発生させる。得られたトランスジェニック細胞株のうち、適した量の遺伝子スイッチ分子を発現するクローンを選択する。第2の工程において、これらのクローンを、遺伝子スイッチ結合部位により調節される免疫モジュレータをコードしているDNA構築物でスーパー遺伝子導入する(supertransfect)。得られた2重トランスジェニック株は、実施例5に記載したように、2つの導入遺伝子の同時発現を、RT−PCRによって試験する。この様式において、遺伝子スイッチ分子調節免疫モジュレータを発現する、2重トランスジェニックES細胞を得る。遺伝子スイッチ構築物の100μgのDNAを適した制限酵素で切断し、所望のフラグメントを精製し、滅菌PBSに再懸濁し、そして前述のように、エレクトロポレーションによりES細胞内へ導入する。構築物は抗生物質ゼオシンに対する耐性を伝えられているので、該抗生物質での処理により、遺伝子導入がうまくいった細胞を選択することができる。トランスジェニッククローンを、得られた細胞から単離し、ミフェプリストーン添加の関係する遺伝子スイッチ分子の発現は、定量的RT−PCRにより調査する。適した量の遺伝子スイッチ分子を発現するクローンは、第2の工程において、構築物17×4/IL15/オリゴ/RIPhnおよび17×4/IL15/オリゴ/RIPhn/IVS8の精製Eco47III/NotIフラグメントとエレクトロポレーションによりスーパー遺伝子導入し、そしてハイグロマイシン処理により第2の導入遺伝子の取り込みで選択する。両方の導入遺伝子の同時取り込みは、ゲノムDNAのPCR分析によりチェックする。
得られた2重トランスジェニック細胞クローンは、上記実施例5ですでに説明したように、10nMミフェプリストーンの添加後、定量的RT−PCRによる遺伝子スイッチおよびMutIL−15/mFc、またはELISAおよびウェスタンブロットアッセイの助けを借りたMutIL−15/mFcの調節可能な発現を試験する。続いて、ミフェプリストーン添加後にのみ、十分量の免疫モジュレータMutIL−15/mFcを産生および分泌するクローンを、得られた細胞株から選択する。
トランスジェニックES細胞から調製されたインスリン産生細胞の移植
移植に先立って、遺伝子スイッチの制御下でMutIL−15/mFcを発現する、インスリン産生細胞を、未分化ハイグロマイシン耐性ES細胞クローンから調製する、Soriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62。
移植に先立って、遺伝子スイッチの制御下でMutIL−15/mFcを発現する、インスリン産生細胞を、未分化ハイグロマイシン耐性ES細胞クローンから調製する、Soriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62。
十分な量のMutIL−15/mFcを産生するように、インスリン産生細胞を移植前にミフェプリストーンで処理する。
続いて、百万のインスリン産生細胞を、腎被嚢下(実施例7で説明したように)かまたは脾臓内へ(Soriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62)、ストレプトゾトシン処理のために糖尿病であるC57BL/6マウス内へ注射する。移植の日以後、連続的にMutIL−15/mFcを産生するように、1日おきにミフェプリストーン(250μg/kg)でレシピエント動物を処理する。
続いて、百万のインスリン産生細胞を、腎被嚢下(実施例7で説明したように)かまたは脾臓内へ(Soriaら(Diabetes.2000 Feb.;49(2):157−62)、ストレプトゾトシン処理のために糖尿病であるC57BL/6マウス内へ注射する。移植の日以後、連続的にMutIL−15/mFcを産生するように、1日おきにミフェプリストーン(250μg/kg)でレシピエント動物を処理する。
同種移植片機能は、定期的なグルコース測定によりモニターする(Accu−Check III;ベーリンガー・マンハイム、マンハイム)。糖尿病の誘導前および後、そして膵島移植後に、一定の間隔で動物の尾静脈または延髄後静脈叢から血液を採り、そして血糖レベルを決定する。追加の管理を、尿試験紙を使用して、血液採取の間に実施する。初期移植片機能は、移植3〜5日後に、11.1ミリモル/l(200mg/dl)以下の血糖含量として定義される。前記のように、初期移植片機能が観察された後、少なくとも2日連続して、もし、血糖レベルが500mg/dlより高くまで増加したら、移植片は拒絶されたとみなされる。
対照として、同一の細胞クローンから調製されたが、しかしミフェプリストーンで前処理されていない、そして従って遺伝子スイッチ調節MutIL−15/mFcを発現しない、インスリン産生細胞をレシピエント動物内へ移植する。あるいは、MutIL−15/mFc構築物を含んでいるが、しかし遺伝子スイッチを含んでいないインスリン産生細胞を使用することも可能である。
幹細胞から誘導されたインスリン産生細胞を受けとった後に、MutIL−15/mFcの外部添加で処理された動物も、さらなる対照として働く。
幹細胞から調製され、インスリン産生細胞を受けとった動物の血糖レベルの研究は、ミフェプリストーンで処理された動物において、比較的長い時間、細胞移植片が機能的に活性であることを示している。
幹細胞から調製され、インスリン産生細胞を受けとった動物の血糖レベルの研究は、ミフェプリストーンで処理された動物において、比較的長い時間、細胞移植片が機能的に活性であることを示している。
Claims (34)
- ヒトまたは動物の非全能性細胞であって、活性物質を加えることにより調節できる遺伝子発現システムの制御下にある少なくとも1つの免疫モジュレータをコードする少なくとも1つの核酸を含む、前記細胞。
- 幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞。
- 多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項1または2に記載の細胞。
- 細胞株の形態の、請求項1〜3の少なくとも1項に記載の細胞。
- 調節できる遺伝子発現システムがプロゲステロン遺伝子発現システム、テトラサイクリン発現システムおよび/またはラパマイシン遺伝子発現システムであることを特徴とする、請求項1〜4の少なくとも1項に記載の細胞。
- 免疫モジュレータが以下の機能的特性の少なくとも1つを有することを特徴とする、請求項1〜5の少なくとも1項に記載の細胞:
a.T細胞により仲介される抗原認識の阻害、
b.T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの阻害、
c.T細胞上のレセプターを経て仲介されるシグナルの活性化、
d.T細胞の増殖の阻害、
e.T細胞の生存を支援する分子の阻害、
f.T細胞のエフェクター分子(TNF−α、IFN−γなど)の阻害、
g.T細胞の接着の阻害、
h.T細胞同時刺激性相互作用の阻害(リンパ球の活性化は2つのシグナルを経て起こる:第1に抗原レセプターを経た刺激が起こり、第2にインプリントされていないリンパ球のクローン増殖および分化のための別のシグナルが発生する;この同時刺激性相互作用は免疫モジュレータにより阻害することができる)、
i.例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与するさらなる細胞の活性化、増殖、生存、抗原提示、シグナル伝達および/またはエフェクター機能の阻害、例えば共通のおよび特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する異なった細胞の、表面レセプターを経た、または例えばサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子のごとき分泌された分子を経た、細胞相互作用の阻害、
j.例えば特別な抗原提示細胞、特に、例えば樹状細胞および単球/マクロファージ、T細胞、B細胞、好中性顆粒球およびNK細胞のごとき、免疫応答に関与する細胞の遊走の阻害、
k.補体系成分の阻害、
l.外来抗原または自己免疫抗原の提示に関連した、または抗原への抗体の結合による、貪食活性の阻害、および/または
m.炎症反応の阻害。 - 免疫モジュレータが抗体であることを特徴とする、請求項1〜6の少なくとも1項に記載の細胞。
- 免疫モジュレータが、
d.レセプター、
e.可溶性分泌型レセプター、
f.分泌されたタンパク質またはペプチド、
であることを特徴とする、請求項1〜6の少なくとも1項に記載の細胞。 - 免疫モジュレータが、変異IL−15およびFcフラグメントの融合タンパク質であり、該Fcフラグメントは変異IL−15分子のC末端へ、好ましくはヒンジ領域を経て融合されていることを特徴とする、請求項8に記載の細胞。
- 抗体のFcフラグメントが、IgG、特に、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4若しくは類似の哺乳動物IgGまたはIgM、特に、ヒトIgM若しくは類似の哺乳動物IgMのFcフラグメントであることを特徴とする、請求項9に記載の細胞。
- 核酸が追加として選択カセット、特に、適した遺伝子導入マーカー遺伝子および/または分化マーカー遺伝子をコードすることを特徴とする、請求項1〜10の少なくとも1項に記載の細胞。
- 核酸が追加として、NK細胞および/またはキラー細胞を阻害する分子をコードすることを特徴とする、請求項1〜11の少なくとも1項に記載の細胞。
- 核酸が追加として、
a.樹状細胞、
b.単球および/またはマクロファージ、
c.B細胞、
d.多形核細胞、例えば好中性顆粒球
を阻害する分子をコードすることを特徴とする、請求項1〜11の少なくとも1項に記載の細胞。 - 該阻害性分子が、ヒトMHCクラスI分子、キメラMHCクラスI分子またはウイルスMHCクラスI相同体であることを特徴とする、請求項13に記載の細胞。
- 少なくとも1つの免疫モジュレータ、および活性物質を加えることにより調節できる少なくとも1つの遺伝子発現システムをコードする核酸。
- 請求項15に記載の少なくとも1つの核酸を含む、ベクター。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞、および適した賦形剤および/または添加剤を含む、医薬。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つの細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の細胞、および/または請求項18に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒトまたは哺乳動物への移植のための使用。
- 同種移植、自家移植または異種移植であることを特徴とする、請求項20に記載の使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の細胞、請求項15に記載の核酸、請求項18に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、適当な場合には少なくとも1つの免疫モジュレータの存在下での、ヒトまたは哺乳動物における移植片拒絶を阻害する医薬を製造するための使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の細胞、請求項15に記載の核酸、請求項18に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植片から生ずる疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療用の医薬を製造するための使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の細胞を調製するための方法であって、以下の工程:
c.請求項15に記載の少なくとも1つの核酸および/または請求項16に記載の少なくとも1つのベクターを、移植可能なヒトまたは動物の非全能性細胞へ導入すること、および
d.遺伝子スイッチを調節するための少なくとも1つの適した活性物質の添加により該核酸を発現させること、
を含む、前記方法。 - 請求項18に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するためのin vitro方法であって、以下の工程:
e.請求項15に記載の少なくとも1つの核酸および/または請求項16に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの分化マーカー遺伝子を、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入すること、
f.工程aの細胞を分化させること、
g.工程bの分化細胞を選択すること、および
h.工程cの選択された細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む、前記方法。 - 工程aの後、前または同時に、少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカーを、少なくとも1つの非全能性幹細胞、非全能性前駆細胞および/または非全能性不死化細胞へ導入し、工程aの後に、工程aの遺伝子導入された細胞を優先的に選択することを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項25または26に記載の方法。
- 請求項18に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
f.請求項15に記載の少なくとも1つの核酸および/または請求項16に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも1つの卵母細胞、幹細胞、前駆細胞および/または不死化細胞へ導入すること、
g.工程aの遺伝子導入細胞を選択すること、
h.工程bに従って選択された細胞を、少なくとも1つのヒト以外の哺乳動物の胚盤胞へ導入すること、
i.工程cの胚盤胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
j.該胚盤胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。 - 幹細胞が多能性または多分化能の、胚性、胎性、新生児性または成人性幹細胞であることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 請求項19に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程:
d.請求項15に記載の少なくとも1つの核酸および/または請求項16に記載の少なくとも1つのベクター、ならびに少なくとも1つの適した遺伝子導入マーカー遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物受精卵母細胞の2つの前核のいずれかに導入すること、
e.工程aの哺乳動物卵母細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること、および
f.該哺乳動物卵母細胞から発育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を同定すること、
を含む、前記方法。 - 請求項28または29に記載の方法により作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
- 請求項30に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
- 請求項19、30および31のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、同種移植および/または異種移植用のヒト以外の細胞、ヒト以外の臓器特異的組織、および/またはヒト以外の哺乳動物臓器を得るための使用。
- 請求項19、30および31のいずれか1項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、請求項18に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的組織および/またはヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理学的に活性な成分を発見するため、および/または毒性物質を同定するための使用。
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