JP2017506521A - アデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、（ａ）野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の４５７、４９２、４９９および５３３位に存在する少なくとも４つのアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質、ならびに（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えＡＡＶベクターがここで開示される。

Description

本発明は、組換えウイルスベクターの分野に関する。特に、本発明は、治療用遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達するのに適切な組換えウイルスベクターに関する。
今日に至るまで、アデノ随伴ウイルスは、治療用遺伝子の送達のための最も有望なベクターの１つであり続けている。相当数の前臨床試験および臨床試験により、このアプローチが、販売承認を得ることができる遺伝子ベースの薬物の開発に適切であることがしっかり確立されている。
１９８０年代に遺伝子療法のためのベクターとしてＡＡＶ２の開発が始まって以来、多様な適用例および標的組織のためのこのプラットフォームの最適化において、大きな進展が見られている。そうした開発の中でも、最も重大な点は恐らく多種多様な血清型が発見されたこととであり、それらのうちの１０〜１２種の血清型について現在広く探索が行われている。これら種々の血清型の最も顕著な特徴のなかでも、それらのそれぞれに相対的な組織指向性、場合によっては神経細胞の逆行輸送が可能であることが挙げられる。これらの血清型のうち、ＡＡＶ１〜１０が、前臨床および臨床の目的で広く使用されている。
患者中の特異的な組織および細胞のサブタイプの標的化および脱標的化を可能にするプロセスが関与する、より新しいプラットフォームが開発されている。これらのアプローチの中核技術は、現存するＡＡＶバリアント（血清型）の試行錯誤による評価、およびランダムに導入が生じたＡＡＶキャプシド突然変異体のｉｎ ｖｉｖｏにおける選択に基づく。これら２つの有望なアプローチは共に、異なる形質導入の挙動を有する可能性のある、数百個ではないとしても、数十個のベクターをもたらす。
ＡＡＶの血清型の最も興味深い態様は、それらにより、動物モデルおよびヒト中での特定の組織の効率的な形質導入が可能になることである。現時点では、組織指向性についての、根底にある機構の包括的な分子レベルの理解はまだ提示されておらず、したがって、各血清型が利用することが可能な、組織に特異的な受容体が、種々の血清型による効率的な形質導入における中心的役割を果たすと一般に推測されている。
したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける導入遺伝子の発現および組織特異性に関して改善された特性を有する追加のＡＡＶベクターが依然として必要である。特に、そのようなベクターには、ヒト中で種々の標的組織に遺伝子を送達するのに大幅に増強された利益をもたらす可能性がある。
一態様では、本発明は、（ａ）野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の４５７、４９２、４９９および５３３位に存在する少なくとも４つのアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質、ならびに（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
一実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号２の配列、またはその配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１の配列を含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３を含む。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９ＤおよびＦ５３３Ｙを含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２および２０５位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２およびＳ２０５の１つまたは複数を含む。別の好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２ＳおよびＴ２０５Ｓを含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の５８５および５８８位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｓ５８５およびＴ５８８の１つまたは複数を含む。より好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｒ５８５ＳおよびＲ５８８Ｔを含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の５４６、５４８および５９３位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｄ５４６、Ｇ５４８およびＳ５９３の１つまたは複数を含む。より好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８ＧおよびＡ５９３Ｓを含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、残基Ｎ３１２を含み、すなわち、その残基は、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中の３１２位に存在する。この実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列と比較して、３１２位において突然変異していない。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の３１５位にアミノ酸置換を含むバリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質、および（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
一実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６の配列を含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１５Ｎを含む。好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列が、１２５、１５１、１６３、２０６、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：（ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｔ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｎ５４９Ｄ、Ａ５５１Ｇ、Ｑ５８８Ｓおよび／もしくはＧ５９６Ｓ、ならびに／または（ｂ）Ｔ５９１Ｒを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質配列中の３１２位にアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質、および（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質が、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１１の配列を含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１２Ｎを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１２の定義に従うＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質配列と比べて、３１２位にアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質、および（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質が、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位の１つまたは複数に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／もしくは５９３位の１つもしくは複数において、または代替のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の１つもしくは複数の対応する位置に存在する。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号２の配列、もしくはその配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１の配列を含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｓ３１２、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９、Ｙ５３３、Ｄ５４６、Ｇ５４８、Ｓ５８５、Ｔ５８８および／またはＳ５９３を含む。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２Ｓ、Ｔ２０５Ｓ、Ｎ３１２Ｓ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔおよび／またはＡ５９３Ｓを含む。
さらなる実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０に由来する。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号３の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／またはＴ５８９Ｒを含む。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列中の１２４、１５０、１５３、１９５、３０３、４４４、４７９、４８６、５２０、５３３、５３７、５７５、５７８および／または５８３位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２４Ｉ、Ｋ１５０Ａ、Ｋ１５３Ｓ、Ａ１９５Ｓ、Ｒ３０３Ｓ、Ｔ４４４Ｍ、Ｓ４７９Ａ、Ｖ４８６Ｄ、Ｔ５２０Ｙ、Ｐ５３３Ｄおよび／またはＧ５８３Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｇ５３７Ｅ、Ｓ５７５Ｒおよび／またはＴ５７８Ｒを含む。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ６に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号５の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／またはＴ５８９Ｒを含む。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ８に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｔ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｎ５４９Ｄ、Ａ５５１Ｇ、Ｑ５８８Ｓおよび／またはＧ５９６Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｓ３１５Ｎおよび／またはＴ５９１Ｒを含む。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１４、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｌ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｎ３１４Ｓ、Ｑ４５８Ｍ、Ｖ４９３Ａ、Ｅ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｇ５４７Ｄ、Ａ５８９Ｔおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｓ１６２Ａ、Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅおよび／またはＳ５８６Ｒを含む。
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質を含む。別の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１０に由来する。別の実施形態では、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号８の配列を含む。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｎ３１５Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｌ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｇ５４９Ｄ、Ｑ５８８Ｓ、Ａ５９１Ｔおよび／またはＧ５９６Ｓを含む。代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質と比べて、以下のアミノ酸置換：Ｇ５５１Ｅを含む。
一実施形態では、組換えＡＡＶベクターが、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターと比較して、神経細胞組織または網膜組織の形質導入の増加を示す。
別の実施形態では、組換えＡＡＶベクターが、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、肝臓組織の形質導入の増加を示す。
一実施形態では、遺伝子産物が、干渉ＲＮＡまたはアプタマーを含む。別の実施形態では、遺伝子産物がポリペプチドを含む。好ましくは、遺伝子産物が、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または神経細胞もしくは網膜細胞の機能を増強するポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、遺伝子産物が、グリア由来の神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、脳由来の神経栄養因子、ロドプシン、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、またはペリフェリンを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）上記の定義に従う組換えＡＡＶベクター、および（ｂ）薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、遺伝子産物を対象中の組織に送達するための方法であって、上記の定義に従う組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組織が、血液、骨髄、筋肉組織、神経細胞組織、網膜組織、膵臓組織、肝臓組織、腎臓組織、肺組織、腸組織または心臓組織から選択される。好ましくは、組織が、神経細胞組織、網膜組織または肝臓組織である。
別の態様では、本発明は、対象中の障害を治療するための方法であって、上記の定義に従う組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害が、神経学的障害、眼障害または肝臓障害である。
別の態様では、本発明は、対象中の障害を治療する際に使用するための、上記の定義に従う組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、障害が、神経学的障害、眼障害または肝臓障害である。好ましくは、神経学的障害が神経変性疾患である。代替の実施形態では、眼障害が、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症または糖尿病性網膜症である。
別の態様では、本発明は、単離バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／もしくは５９３位の１つもしくは複数において、または代替のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の１つもしくは複数の対応する位置に存在する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、単離バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の定義に従うバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の定義に従う核酸を含む単離宿主細胞を提供する。
野生型アデノ随伴ウイルス２キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１４０１）を示す図である。残基：Ｖ１２５、Ｖ１５１、Ａ１６２、Ｔ２０５、Ｎ３１２、Ｑ４５７、Ｓ４９２、Ｅ４９９、Ｆ５３３、Ｇ５４６、Ｅ５４８、Ｒ５８５、Ｒ５８８およびＡ５９３が強調されている。 真性型アデノ随伴ウイルス２（ｔｔＡＡＶ２）キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｓ３１２、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９、Ｙ５３３、Ｄ５４６、Ｇ５４８、Ｓ５８５、Ｔ５８８、Ｓ５９３が、野生型ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）と比較して異なり、強調されている。 野生型アデノ随伴ウイルス１キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号３；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２０７７）を示す図である。強調されている残基：Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２（配列番号２）中のＳ２０５と整列される）−Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）−Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）−Ｔ５８９（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）。 野生型アデノ随伴ウイルス５キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号４；ＮＣＢＩ参照配列：ＡＦ０８５７１６）を示す図である。強調されている残基：Ｇ５３７（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）−Ｓ５７５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）−Ｔ５７８（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）。 野生型アデノ随伴ウイルス６キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号５；ＮＣＢＩ参照配列：ＡＦ０２８７０４）を示す図である。強調されている残基：Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ２０５と整列される）−Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）−Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）−Ｔ５８９（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）。 野生型アデノ随伴ウイルス８キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号６；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００６２６１）を示す図である。強調されている残基：Ｓ３１５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ３１２と整列される）−Ｔ５９１（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）。 野生型アデノ随伴ウイルス９キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号７；ＮＣＢＩ参照配列：ＡＹ５３０５７９）を示す図である。強調されている残基：Ｓ１６２（ｔｔＡＡＶ２中のＳ１６２と整列される）−Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ２０５と整列される）−Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）−Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）。 野生型アデノ随伴ウイルス１０キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。強調されている残基：Ｇ５５１（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）。 ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列の整列を示す図である。 ＡＡＶ２ベクターを生成するために使用したプラスミドは、パッケージングプラスミドｐＤＧであったことを示す図である。上：野生型ＡＡＶ２遺伝子を有するｐＤＧ。下：真性型ＡＡＶ２遺伝子を有するｐＤＧ−ｔｔＡＡＶ２；５８５および５８８位における、ヘパランに結合するドメイン中の２つの主要な突然変異が強調されている。ＭＭＴＶ：ＡＡＶ ｒｅｐの発現を推進するプロモーター；Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡは、アデノウイルスのヘルパー因子を発現する遺伝子である。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける注射についての、ｒＡＡＶ２真性型（ＴＴ）および野生型（ＷＴ）のウイルスタイターの定量化を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質のＫｒｙｐｔｏｎ染色を、赤外蛍光スキャナー（Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してスキャンした図である。１０μｌのＡＡＶ２ウイルス粒子および６２．５ｎｇ〜５００ｎｇのＢＳＡを、ＳＤＳを含有する１２％の分離ゲル上で分離し、Ｋｒｙｐｔｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎを用いて染色した。画像を、グレースケールに変換した。キャプシド遺伝子のタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３を、左に記入してある。 ｉｎ ｖｉｖｏにおける注射についての、ｒＡＡＶ２真性型（ＴＴ）および野生型（ＷＴ）のウイルスタイターの定量化を示す図である。ｑＰＣＲから得られたタイター（ベクターのゲノム［ｖｇ／ｍｌ］）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られたタイター（キャプシドのタイター［キャプシド／ｍｌ］）を示す表である。 ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色したラット脳の切片の代表的な例を示す図である。ベクターを、矢印が示すように、線条体内に注射した。 黒質中への注射の代表的な例を示す図である。 ｔｔＡＡＶ２およびｗｔＡＡＶ２を使用する眼のＧＦＰ形質導入を示す図である。ｔｔＡＡＶ２ベクター（上）およびｗｔＡＡＶ２ベクター（下）を投与した後の横断面における網膜を示す。 ｔｔＡＡＶ２およびｗｔＡＡＶ２を使用する眼のＧＦＰ形質導入を示す図である。図Ａ中の破線で示すボックスの拡大図である。 新生仔中にベクターを注射した後の、マウス脳の形質導入を示す図である。ｉ．ｖ．：静脈内ベクター投与；ｉ．ｃ．：頭蓋内注射；ＡＡＶ−２：ｗｔＡＡＶ２；ＡＡＶ−ＴＴ：ｔｔＡＡＶ２。 ＡＡＶ２キャプシドを三次元で示す図である。強調されている残基は、ｔｔＡＡＶ２粒子と野生型粒子との間のアミノ酸変化に対応し、それらの位置に応じて色分けされている。 ＡＡＶ２キャプシド上の３回フォールドされたスパイクを示す図である。強調されている残基は、真性型粒子と野生型粒子との間のアミノ酸変化に対応する。ヘパリン結合性部位の残基が、緑色で強調されている。 ＡＡＶ２キャプシドの内側を示す図である。薄青色で強調されている残基は、キャプシドの内側上に位置するｔｔＡＡＶ２中の単一のアミノ酸変化に対応する。 ＡＡＶ２キャプシド上の３回フォールドされたスパイクを示す図である。ベージュ色で強調されている残基は、真性型ベクター中の２つのアミノ酸変化に対応し、これらのアミノ酸変化は、空間的に近く、ＡＡＶキャプシド上の３回フォールドされた近接する２つのピークの間の溝中に位置する。 ＡＡＶ２キャプシド上の３回フォールドされたスパイクを示す図である。茶色で強調されている残基は、真性型ベクター中の単一の孤立したアミノ酸変化（Ｓ５９３）に対応し、このアミノ酸変化は、３回フォールドされた近接するピークの間の溝中に位置する。 ＡＡＶ２キャプシド上の３回フォールドされたスパイクを示す図である。ピンク色で強調されている４つのアミノ酸が、受容体結合に関与し、３回フォールドされたスパイク上で密接な位置関係にある。 ＡＡＶ２に由来するＶＰ１キャプシド単量体（薄青色）とＡＡＶ１に由来するＶＰ１単量体（橙色）との間の整列を三次元で示す図である。図の中央左にある強調されている残基は、ＡＡＶ１中のＧ５４９（橙色の球体）およびＡＡＶ２中のＥ５４８（青緑色の球体）に対応する。図の右上にある強調されている残基は、ＡＡＶ１中のＳ５８６およびＴ５８９（橙色の球体）ならびにＡＡＶ２中のＲ５８５およびＲ５８８（青緑色の球体）に対応する。 ＡＡＶ２に由来するＶＰ１キャプシド単量体（薄青色）とＡＡＶ５に由来するＶＰ１単量体（紫色）との間の整列を三次元で示す図である。図の中央にある強調されている残基は、ＡＡＶ５中のＧ５３７（紫色の球体）およびＡＡＶ２中のＥ５４８（青緑色の球体）に対応する。図の右上にある強調されている残基は、ＡＡＶ５中のＳ５７５およびＴ５７８（紫色の球体）ならびにＡＡＶ２中のＲ５８５およびＲ５８８（青緑色の球体）に対応する。 ＡＡＶ２に由来するＶＰ１キャプシド単量体（薄青色）とＡＡＶ６に由来するＶＰ１単量体（黄色）との間の整列を三次元で示す図である。図の下方にある強調されている残基は、ＡＡＶ６中のＧ５４９（橙色の球体）およびＡＡＶ２中のＥ５４８（青緑色の球体）に対応する。図の右上にある強調されている残基は、ＡＡＶ６中のＳ５８６およびＴ５８９（橙色の球体）ならびにＡＡＶ２中のＲ５８５およびＲ５８８（青緑色の球体）に対応する。 ＡＡＶ２に由来するＶＰ１キャプシド単量体（薄青色）とＡＡＶ８に由来するＶＰ１単量体（ピンク色）との間の整列を三次元で示す図である。図の左上にある強調されている残基は、ＡＡＶ８中のＳ３１５（赤色の球体）およびＡＡＶ２中のＮ３１２（青緑色の球体）に対応する。図の右下にある強調されている残基は、ＡＡＶ８中のＴ５９１（赤色の球体）およびＡＡＶ２中のＲ５８８（青緑色の球体）に対応する。 ＡＡＶ２に由来するＶＰ１キャプシド単量体（薄青色）とＡＡＶ９に由来するＶＰ１単量体（緑色）との間の整列を三次元で示す図である。図の中央にある強調されている残基は、ＡＡＶ９中のＧ５４９（黄色の球体）およびＡＡＶ２中のＥ５４８（青緑色の球体）に対応する。図の左下にある強調されている残基は、ＡＡＶ９中のＳ５８６（黄色の球体）およびＡＡＶ２中のＲ５８５（青緑色の球体）に対応する。 ラット脳中の線条体への注射の後の、束傍核中のｒＡＡＶ２ＴＴおよびＷＴ発現の分析を示す図である。ラット脳の切片の代表的な画像であり、左に吻側面を、右に尾側面を示す。線条体中の注射部位を示す；図２６ＢおよびＣにおいて観察される視床下部中の投影領域を示す（束傍核：ｐｆ）。 ラット脳中の線条体への注射の後の、束傍核中のｒＡＡＶ２ＴＴ発現およびＷＴ発現の分析を示す図である。ｒＡＡＶ２ＷＴの線条体への注射の後に束傍核（ｐｆ）中で検出されたＧＦＰ発現の高倍率の画像である。 ラット脳中の線条体への注射の後の、束傍核中のｒＡＡＶ２ＴＴ発現およびＷＴ発現の分析を示す図である。ＴＴの線条体への注射の後に束傍核（ｐｆ）中で検出されたＧＦＰ発現の高倍率の画像である。 ｒＡＡＶ２ＴＴおよびＷＴの、新生仔マウス中への頭蓋内注射の概観を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片の代表的な例を示す。５×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ（上）またはｒＡＡＶ２ＷＴ（中央）を、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。新生仔マウスから得られた、注射されていない脳を、同時に染色し、陰性対照として示す（ＮＴ、形質導入なし）。 ｒＡＡＶ２ＴＴまたはＷＴの頭蓋内注射の後の、新生仔マウス脳の切片の高倍率の写真を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片を示す。５×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ（左のパネル）またはｒＡＡＶ２ＷＴ（右のパネル）を、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。Ｓ１ＢＦ：バレル野一次体性感覚皮質。 ｒＡＡＶ２ＴＴおよびＷＴの新生仔マウス中への全身注射の後の、脳の形質導入の概観を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片の代表的な例を示す。２×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ（上）またはｒＡＡＶ２ＷＴ（下）を、新生仔マウスの頚静脈中に注射した。 ｒＡＡＶ２ＴＴまたはＷＴの全身注射の後の、新生仔マウス脳の切片の高倍率の写真を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片を示す。２×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ（左のパネル）またはｒＡＡＶ２ＷＴ（右のパネル）を、新生仔マウスの頚静脈中に注射した。Ｓ１ＢＦ：バレル野一次体性感覚皮質。 ｒＡＡＶ２ＴＴまたはＷＴの全身注射の後の、新生仔マウス組織切片の高倍率の写真を示す図である。２×１０１１ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴまたはｒＡＡＶ２ＷＴを、新生仔マウスの頚静脈中に注射した。注射されていないマウス臓器を、陰性対照として使用した。 ｒＡＡＶ２ＴＴ、ＷＴおよびＨＢｎｕｌｌの線条体への注射の後の、成体ラット脳の切片の高倍率の画像を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色したラット脳の切片の代表的な例を示す。３．５×１０９ｖｇのｒＡＡＶ２ＷＴ（左）、ＴＴ（右）またはＡＡＶ２−ＨＢｎｕｌｌ（中央）を、成体ラット脳の線条体中に注射し、代表的な写真を、視床または黒質（ＳＮ）中で撮影した。 新生仔マウス中で、種々のＴＴ突然変異体と比較した完全なＡＡＶ−ＴＴの頭蓋内注射の概観を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片の代表的な例を示す。５×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＴＴ−Ｓ５９３ＡまたはＴＴ−Ｄ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅ（ＴＴ−ＤＧ）を、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。新生仔マウスから得られた、注射されていない脳を、同時に染色し、陰性対照（ＮＴ）として示す。 種々のＴＴ突然変異ベクターの頭蓋内注射の後の、新生仔マウス脳の切片の高倍率の写真を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片を示す。５×１０１０ｖｇのベクターを、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。ＴＴ−ＤＧ：ＴＴ−Ｄ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅ。 ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ突然変異体および１０個の突然変異を含有する最終となる可能性があるＴＴベクターと比較した、完全なＡＡＶ−ＴＴの新生仔マウスの頭蓋内注射の概観を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片の代表的な例を示す。５×１００９ｖｇのｒＡＡＶ２ＴＴ、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＴＴまたはＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−Ｄ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅ−Ｓ５９３Ａ（ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−ＤＧ−Ｓ５９３Ａ）を、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。新生仔マウスから得られた、注射されていない脳を、同時に染色し、陰性対照（ＮＴ）として示す。 種々のＴＴ突然変異ベクターの頭蓋内注射の後の、新生仔マウス脳の切片の高倍率の写真を示す図である。ＧＦＰ特異的抗体を用いて染色した新生仔脳の切片を示す。５×１００９ｖｇのベクターを、新生仔マウス脳の側脳室中に注射した。 完全なＡＡＶ−ＴＴ、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ突然変異体またはＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−ＤＧ−Ｓ５９３Ａを注射した新生仔マウス脳中のＧＦＰタンパク質のＥＬＩＳＡ定量化を示す図である。５×１００９ｖｇのベクターを、新生仔マウス脳の側脳室中に注射し、収集した脳全体から、タンパク質の全量を抽出した。ＧＦＰ特異的抗体を使用して、各脳試料中のＧＦＰの発現を検出し、標準ＧＦＰタンパク質を、定量化のために使用した。１つの条件当たり、Ｎ＝５匹の動物。エラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。 ＡＡＶ３ＢのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。強調されている残基は、ＡＡＶ−ｔｔ中の残基と、対応する位置において同一である残基を示す。３１２位における内部セリン残基に下線を付す。 ＡＡＶ−ＬＫ０３のＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
一態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。ｒＡＡＶベクターは典型的には、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して異なるバリアントキャプシドタンパク質を含む。好都合なことに、バリアントキャプシドタンパク質は、脳および／または眼中のベクターの感染性を増強させることができ、遺伝子療法による治療剤をこれらの組織内へ送達するのに、ベクターを特に適切なものにする。
組換えＡＡＶベクター
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスを示す略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、全てのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を、別段の必要性がある場合以外は網羅する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えアデノ随伴ウイルスはまた、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。用語「ＡＡＶ」は、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶｒｈ１０を含めた、ＡＡＶ−１０）、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ−１２）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶおよびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ科哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、等である。
種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブの末端リピート（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびキャプシドサブユニットの配列が、当技術分野で公知である。そのような配列を、文献、または公共データベース、例として、ＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ−００２０７７（ＡＡＶ−１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ−１）、ＮＣ−００１４０１（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ−２）、ＮＣ−００１７２９（ＡＡＶ−３）、ＮＣ−００１８２９（ＡＡＶ−４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ−４）、ＮＣ−００６１５２（ＡＡＶ−５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ−８）、およびＮＣ−００６２６１（ＡＡＶ−８）を参照されたい；これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：９３９；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５８：９２１；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３：３７５〜３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい。
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）の配列、典型的には、細胞に遺伝子の形質転換を行うための、目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、時には、２つのＡＡＶの逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接し得る。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全て）およびキャプシドで包まれたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例として、哺乳動物細胞に送達しようとする導入遺伝子）を含む場合には、この粒子は、典型的には「ｒＡＡＶベクター粒子」、または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶ粒子の生成は必然的に、ｒＡＡＶベクターの生成を含み、したがって、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子の内部に含有される。
「組換え」は、本明細書で使用する場合、ベクター、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞が、クローニング、制限もしくはライゲーションのステップ（例えば、その中に含まれるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに関係するステップ）、および／または自然界において見出される産物とは明確に異なる構築物をもたらすその他の手順を種々に組み合わせて得られる産物であることを意味する。組換えウイルスまたは組換えベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語はそれぞれ、元々のポリヌクレオチド構築物の複製物および元々のウイルス構築物の子孫の複製物を含む。
バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質
本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。「バリアント」により、ＡＡＶキャプシドタンパク質が、同じ血清型の対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と異なることを意味する。例えば、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。この文脈では、「対応する」は、同じ血清型のキャプシドタンパク質を指し、換言すると、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むこと、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むこと等を指す。
バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、例えば、１〜５０、１〜３０、１〜２０または１〜１５個のアミノ酸置換を含むことができる。好ましくは、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を保持する。
本発明の実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位の１つまたは複数に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。この文脈では、「対応する」は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中の上記の位置の１つに対応する、任意のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中（例えば、ＡＡＶ２タンパク質配列またはＡＡＶ２以外のキャプシドタンパク質配列中）の位置を指す。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／もしくは５９３位の１つもしくは複数において、または代替のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の１つもしくは複数の対応する位置に存在する。
一般に、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１を含む。
核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに配列同一性
用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含めた、任意の長さの、ヌクレオチドの重合体の形態を指す。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例として、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことができ、ヌクレオチド以外の構成成分を介在させることができる。ヌクレオチド構造への改変は、存在させる場合には、重合体の集合の前または後にもたらすことができる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用する場合、二本鎖および一本鎖の分子を交換可能に指す。別段の特定または必要性がない限り、本明細書に記載する本発明のいずれの実施形態においても、ポリヌクレオチドは、二本鎖形態も、二本鎖形態を構成することが公知であるまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれも包含する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に使用して、任意の長さの、アミノ酸の重合体を指す。この用語はまた、改変されているアミノ酸の重合体も包含する；改変には、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションがある。ポリペプチド、例として、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチド等は、遺伝子産物の哺乳動物の対象への送達およびそのための組成物の文脈で論述する場合には、それぞれの未変化ポリペプチド、または未変化タンパク質の所望の生化学的機能を保持する、その任意の断片もしくは遺伝子工学的に作製した誘導体を指す。同様に、遺伝子産物を哺乳動物の対象に送達する際に使用するための抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、およびその他のそのような核酸（これらを、レシピエント細胞に送達しようとする「導入遺伝子」と呼ぶことができる）について言及する場合にも、所望の生化学的機能を保有する未変化ポリペプチドまたは任意の断片もしくは遺伝子工学的に作製する誘導体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセントの「配列同一性」を有し、このことは、整列させて、２つの配列を比較する場合に、塩基またはアミノ酸がそうしたパーセントで同じであることを意味する。配列類似性を、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において利用可能なＢＬＡＳＴを含めた、方法およびコンピュータプログラムを使用して、配列を整列させることができる。別の整列アルゴリズムが、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）のパッケージ中で利用可能なＦＡＳＴＡであり、ＧＣＧは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全子会社である。整列のためのその他の技法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡの一事業部）に記載されている。特に興味深いのが、配列中のギャップを許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列を整列させる際にギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７０：１７３〜１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの整列方法を使用するＧＡＰプログラムを利用しても、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照されたい。
興味深いのが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１））を使用して、配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティーは、一般に１〜５、通常２〜４の範囲に及び、多くの実施形態では３である。ギャップ伸長ペナルティーは、一般に約０．０１〜０．２０の範囲に及び、多くの場合は０．１０である。このプログラムは、インプットして比較しようとする配列により決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、プログラムにより決定されるデフォルトパラメータを使用して、配列同一性を決定する。このプログラムもまた、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）のパッケージから利用可能である。
興味深い別のプログラムが、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７〜１４９頁、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。ＦａｓｔＤＢにより、以下のパラメータ：
ミスマッチペナルティー：１．００、
ギャップペナルティー：１．００、
ギャップサイズペナルティー：０．３３、および
連結ペナルティー：３０．０
に基づいて、パーセント配列同一性を計算する。
バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位の１つまたは複数において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図１（配列番号１）に示す。また、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列は、データベースの受託番号：ＮＣ−００１４０１；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３１３５；ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿６８０４２６．１；ＧｅｎＢａｎｋｋ：ＡＡＣ０３７８０．１からも入手可能である。
好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号１に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号２の配列、またはその配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｓ３１２、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９、Ｙ５３３、Ｄ５４６、Ｇ５４８、Ｓ５８５、Ｔ５８８および／またはＳ５９３を含む。好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２Ｓ、Ｔ２０５Ｓ、Ｎ３１２Ｓ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔおよび／またはＡ５９３Ｓを含む。
ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中の突然変異の組合せ
バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のアミノ酸置換の任意の組合せを含むことができる。したがって、特定の実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記のリストから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記に開示した１４個のアミノ酸置換の全てを含み、例えば、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、配列番号２の配列（すなわち、本明細書でｔｔＡＡＶ２またはＡＡＶ２−ＴＴと呼ぶ配列）を含む。
さらなる実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記の１４個の突然変異のサブセットを含むことができる。理論により拘束されるわけではないが、個々の実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、下記の機能別の群に分けられる以下の残基を含むことができる：
１）Ｓ５８５および／またはＴ５８８；これらの残基は、ヘパリン結合の減少、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンに富む脳組織中のウイルスの伝播の増加と関連がある場合がある；
２）Ｓ３１２；この内部セリン残基は、キャプシド−ＤＮＡ間の相互作用において役割を果たす場合がある；
３）Ｄ５４６および／またはＧ５４８；これらの残基は、抗体を中和する相互作用に関与し、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける形質導入の特性に寄与する場合がある；
４）Ｓ５９３；この残基は、３回フォールドされた近接するスパイクの間の溝中に位置する；
５）Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９および／またはＹ５３３；これら４つのアミノ酸は、受容体結合に関与する場合があり、３回フォールドされたスパイク上で密接な位置関係にある；
６）Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２および／またはＳ２０５；これらの残基は、ＰＬＡ２活性および／または侵入するウイルスの輸送と関連がある場合がある。
本明細書ではまた、さらなるＡＡＶの血清型中の対応する位置において、上記の残基に対応する突然変異が存在する場合には、そうした突然変異を含む、対応するサブグループも企図することを理解されたい（下記を参照されたい）。
好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、受容体結合と関連がある場合がある、上記で言及した位置における４つの突然変異、すなわち、残基：４５７、４９２、４９９および５３３、またはそれ以上の突然変異を含む。したがって、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、以下の残基：Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３を含むことが特に好ましい。
いくつかの好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、３１２位において突然変異しておらず、例えば、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、（野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中に存在する）残基Ｎ３１２を含む。したがって、いくつかの実施形態では、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、上記で言及した特定の突然変異の１〜１３個を含むことができるが、突然変異Ｎ３１２Ｓは含まない。
その他の血清型に由来するバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質
さらなる実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、代替のＡＡＶの血清型、すなわち、ＡＡＶ２以外のＡＡＶの血清型に由来する。例えば、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０（例えば、ＡＡＶｒｈ１０）のキャプシドタンパク質に由来し得る。
これらの実施形態では、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に関して上記に記載した位置に対応する１つまたは複数の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。換言すると、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位に対応する、代替（すなわち、ＡＡＶ２以外）のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
種々のＡＡＶの血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位に対応する、代替のＡＡＶの血清型に由来するキャプシドタンパク質中の位置を同定する方法は、当業者には理解されるものと予想される。特に、当技術分野で公知であり、本明細書に記載する配列の整列により、そのような位置を容易に同定することができる。例えば、１つのそのような配列の整列を、図９に提供する。
この文脈で特に妥当なのは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位に三次元空間において対応する、代替のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の位置である。タンパク質構造の三次元におけるモデル化および整列のための方法は当技術分野で周知であり、それらを使用して、そのような対応する位置を、ＡＡＶ２以外のキャプシドタンパク質配列中で同定することができる。ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列の、代替のＡＡＶの血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）のキャプシドタンパク質配列との例示的な３Ｄにおける整列を、図２１〜２５に示し、下記に論述する。当業者であれば、さらなる血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１２に由来するキャプシドタンパク質との類似の３Ｄにおける整列を行い、ＡＡＶ２中の上記で定義した位置に対応する、そのような配列中の位置を同定することができる。
バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図３（配列番号３）に示す。また、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質の配列は、データベースの受託番号：ＮＣ−００２０７７からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、配列番号３に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ２０５と整列される）；Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）；Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）；およびＴ５８９（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の以下の置換：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／またはＴ５８９Ｒを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列中の１２４、１５０、１５３、１９５、３０３、４４４、４７９、４８６、５２０、５３３、５３７、５７５、５７８および／または５８３位の１つまたは複数に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ５キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図４（配列番号４）に示す。また、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質の配列は、データベースの受託番号：ＡＦ０８５７１６からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、配列番号４に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｇ５３７（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）；Ｓ５７５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）；Ｔ５７８（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２４Ｉ、Ｋ１５０Ａ、Ｋ１５３Ｓ、Ａ１９５Ｓ、Ｒ３０３Ｓ、Ｔ４４４Ｍ、Ｓ４７９Ａ、Ｖ４８６Ｄ、Ｔ５２０Ｙ、Ｐ５３３Ｄおよび／またはＧ５８３Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の以下の置換：Ｇ５３７Ｅ、Ｓ５７５Ｒおよび／またはＴ５７８Ｒを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図５（配列番号５）に示す。また、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質の配列は、データベースの受託番号：ＡＦ０２８７０４からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、配列番号５に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ２０５と整列される）；Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）；Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）；Ｔ５８９（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の以下の置換：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／またはＴ５８９Ｒを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図６（配列番号６）に示す。また、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質の配列は、データベースの受託番号：ＮＣ＿００６２６１からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、配列番号６に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｓ３１５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ３１２と整列される）；Ｔ５９１（ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｔ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｎ５４９Ｄ、Ａ５５１Ｇ、Ｑ５８８Ｓおよび／またはＧ５９６Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の以下の置換：Ｓ３１５Ｎおよび／またはＴ５９１Ｒを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
一実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の３１５位にアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、残基Ｎ３１５を含むことができる。したがって、一実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１５Ｎを含む。
バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１４、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図７（配列番号７）に示す。また、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質の配列は、データベースの受託番号：ＡＹ５３０５７９からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、配列番号７に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｓ１６２（ｔｔＡＡＶ２中のＳ１６２と整列される）；Ｓ２０５（ｔｔＡＡＶ２中のＳ２０５と整列される）；Ｇ５４９（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）；Ｓ５８６（ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｌ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｎ３１４Ｓ、Ｑ４５８Ｍ、Ｖ４９３Ａ、Ｅ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｇ５４７Ｄ、Ａ５８９Ｔおよび／またはＧ５９４Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の以下の置換：Ｓ１６２Ａ、Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅおよび／またはＳ５８６Ｒを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ１０」には、ＡＡＶｒｈ１０が含まれる。この実施形態では、バリアントＡＡＶ１０（例えば、ＡＡＶｒｈ１０）キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質ＶＰ１中のこれらの位置は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する。
野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図８（配列番号８）に示す。好ましくは、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質は、配列番号８に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質ＶＰ１は、以下の残基を、野生型ＡＡＶ２（配列番号１）中には存在しないが、上記に開示したバリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）中に存在するアミノ酸残基に対応する位置：Ｇ５５１（ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８と整列される）においてすでに含有する。したがって、好ましい実施形態では、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｎ３１５Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｌ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｇ５４９Ｄ、Ｑ５８８Ｓ、Ａ５９１Ｔおよび／またはＧ５９６Ｓを含む。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号２、ｔｔＡＡＶ２）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を増加させることができる。
代替の実施形態では、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質が、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異を野生型ＡＡＶ２配列に戻す復帰に対応するアミノ酸置換を含む。例えば、バリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質は、以下の置換：Ｇ５５１Ｅを含むことができる。典型的には、そのようなバリアントＡＡＶ１０キャプシドタンパク質は、１つまたは複数の機能特性を、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質（配列番号１）と共有し得、例えば、野生型ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質と比較して、神経細胞組織または網膜組織の感染性および／または形質導入を低下させることができる。
バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質と比べて、３１２位にアミノ酸置換を含むことができる。例えば、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質は、残基Ｎ３１２を含むことができる。したがって、一実施形態では、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１２Ｎを含む。さらなる実施形態では、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する位置に１つまたは複数の追加の突然変異を含むことができる。
野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図３８（配列番号１１）に示す。また、野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベースの受託番号：ＡＦ０２８７０５からも入手可能である。好ましくは、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質は、配列番号１１に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質
一実施形態では、ベクターが、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質を含む。この実施形態では、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質は、配列番号１２の定義に従うＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質配列と比べて、３１２位にアミノ酸置換を含むことができる。例えば、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質は、残基Ｎ３１２を含むことができる。したがって、一実施形態では、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質は、配列番号１２の定義に従うＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質配列と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１２Ｎを含む。さらなる実施形態では、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に関して上記に開示した位置に対応する位置に１つまたは複数の追加の突然変異を含むことができる。
野生型ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列は、公知であり、図３９（配列番号１２）に示す。また、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質配列は、ＷＯ２０１３／０２９０３０に、その中では配列番号３１として開示されている。好ましくは、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質は、配列番号１２に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
遺伝子産物
一実施形態では、ｒＡＡＶは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸をさらに含む。「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能である、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現の結果得られる分子である。遺伝子産物として、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。
「異種」は、実体の遺伝子型が比較の対象である、その実体の残りの部分の遺伝子型とは明確に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学的技法により、異なる種に由来するプラスミドまたはベクター内へ導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。ネイティブのコード配列から取り出されたプロモーターであって、こうしたプロモーターとの連結が天然には見出されないコード配列に作動可能に連結されているプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種の遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶ中には通例含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種の遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶにより通例コードされない遺伝子産物である。
いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。
干渉ＲＮＡ
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適切なＲＮＡｉには、細胞中のアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを減少させるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞中のアポトーシスを誘発または促進する遺伝子産物のレベルを低下させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。本明細書では、遺伝子産物がアポトーシスを誘発または促進する遺伝子を、「アポトーシス促進性の遺伝子」と呼び、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ；タンパク質）を、「アポトーシス促進性の遺伝子産物」と呼ぶ。アポトーシス促進性の遺伝子産物として、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、ＢａｋおよびＢａｄ遺伝子産物が挙げられる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。
また、干渉ＲＮＡは、血管新生性の産物に対するものであってもよく、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ｃａｎｄ５；例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号；米国特許公開第２００８／０１８８４３７号；およびＲｅｉｃｈら（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．、９：２１０を参照されたい）、ＶＥＧＦＲ１（例えば、Ｓｉｒｎａ−０２７；例えば、Ｋａｉｓｅｒら（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、１５０：３３；およびＳｈｅｎら（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１３：２２５を参照されたい）、またはＶＥＧＦＲ２（Ｋｏｕら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４４：１５０６４）が挙げられる。また、米国特許第６，６４９，５９６号、第６，３９９，５８６号、第５，６６１，１３５号、第５，６３９，８７２号および第５，６３９，７３６号；ならびに米国特許第７，９４７，６５９号および第７，９１９，４７３号も参照されたい。
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡもしくはｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」、またはｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子（「標的遺伝子」）に向けて放たれるＲＮＡ二重鎖のヌクレオチドである。「ＲＮＡ二重鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域の間の相補的な対形成により形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡの二重鎖の部分のヌクレオチド配列が、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補性を示すことから、ｓｉＲＮＡは、遺伝子に向けて「放たれる」。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二重鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖の部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖の部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含有することができる。ループの長さは変化し得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチド長である。また、ヘアピン構造は、３’または５’のオーバーハング部分も含有することができる。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、０、１、２、３、４または５ヌクレオチド長の３’または５’のオーバーハングである。
「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」またはｓｈＲＮＡは、干渉ＲＮＡ、例として、ｓｉＲＮＡを発現するように作製することができるポリヌクレオチド構築物である。
アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、例示的な、目的のアプタマーとして、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ｎｇら（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、５：１２３；およびＬｅｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：１８９０２を参照されたい。また、ＰＤＧＦに特異的なアプタマー、例えば、Ｅ１００３０も、使用するのに適している；例えば、ＮｉおよびＨｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ、２２３：４０１；ならびにＡｋｉｙａｍａら（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０７：４０７）を参照されたい。
ポリペプチド
一実施形態では、遺伝子産物は、治療用タンパク質である。「治療用」のペプチドまたはタンパク質は、細胞または対象中のタンパク質の不在または不足の結果生じる症状を軽減するまたは低下させることができるペプチドまたはタンパク質である。代わって、「治療用」のペプチドまたはタンパク質は、これ以外の利益、例えば、抗変性効果を対象に付与するものである。
遺伝子産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは一般に、細胞、例えば、神経細胞組織、網膜組織または肝臓組織中に存在する細胞、例えば、肝細胞、ニューロン、グリア細胞、桿体光受容器細胞もしくは錐体光受容器細胞、網膜神経節細胞、ミューラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を増強するポリペプチドである。
例示的なポリペプチドとして、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦおよびＮＴＮ）；抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体；ＶＥＧＦ結合性抗体；ＶＥＧＦ結合性抗体断片（例えば、単鎖抗ＶＥＧＦ抗体）；エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；可溶性Ｆｉｔポリペプチド（Ｌａｉら（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）；可溶性Ｆｉｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎら（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照されたい）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；可溶性Ｔｉｅ−２受容体等；メタロプロテイナーゼ−３組織阻害物質（ＴＩＭＰ−３）；光応答性オプシン、例えば、ロドプシン；抗アポトーシス性ポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ）；等が挙げられる。適切なポリペプチドには、これらに限定されないが、グリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；線維芽細胞増殖因子２；ニュールツリン（ＮＴＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；神経増殖因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）；脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；上皮増殖因子；ロドプシン；アポトーシスのＸ連鎖性阻害物質；およびソニックヘッジホッグが含まれる。適切なポリペプチドが、例えば、ＷＯ２０１２／１４５６０１に開示されている。
遺伝子を肝臓に送達するための例示的なポリペプチドとして、例えば、ＰＢＧＤ（ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ）、ＩＤＵＡ（イズロニダーゼ）、Ｆａｈ（フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ）、Ａ１ＡＴ（アルファ（１）−アンチトリプシン）、１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）（ウリジン二リン酸グルクロニルトランスフェラーゼ）、ＨＣＣＳ１（肝細胞癌抑制因子１）、ＣＤ（シトシンデアミナーゼ）、ＳＯＣＳ３（サイトカインシグナル伝達抑制因子３）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、チミジンキナーゼ、ＩＬ−２４（インターロイキン−２４）、ＩＬ−１２（インターロイキン−１２）、およびＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド）が挙げられる。
調節配列
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、構成性プロモーターに作動可能に連結する。その他の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、誘導性プロモーターに作動可能に連結する。場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、組織に特異的または細胞型に特異的な調節エレメントに作動可能に連結する。
例えば、場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、肝細胞に特異的、ニューロンに特異的または光受容器に特異的な調節エレメント（例えば、光受容器に特異的なプロモーター）、例えば、ニューロンまたは光受容器細胞中で作動可能に連結している遺伝子を選択的に発現させる調節エレメントに作動可能に連結する。適切な、光受容器に特異的な調節エレメントとして、例えば、ロドプシンのプロモーター；ロドプシンキナーゼのプロモーター（Ｙｏｕｎｇら（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．、４４：４０７６）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．、９：１０１５）；網膜色素変性症遺伝子のプロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）前掲）；光受容器間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子のエンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）前掲）；ＩＲＢＰ遺伝子のプロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．、５５：２２５）が挙げられる。適切な、神経細胞に特異的なプロモーターとして、とりわけ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）のプロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３〜１５（１９９３）；神経細繊維軽鎖遺伝子のプロモーター、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１ １〜５（１９９１）；およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子のプロモーター、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３〜８４（１９９５）が挙げられる。適切な、肝細胞に特異的なプロモーターとして、アルブミンのプロモーター（Ｈｅａｒｄら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９８７；７：２４２５）、またはアルファ１−アンチトリプシンのプロモーター（Ｈａｆｅｎｒｉｃｈｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１９９４；８４、３３９４〜４０４）が挙げられる。
「調節エレメント」または「調節配列」は、ポリヌクレオチドの複製、２倍化、転写、スプライシング、翻訳または分解を含めた、ポリヌクレオチドの機能の調節に寄与する、分子の相互作用に関わるヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、スピードまたは特異性に影響を及ぼすことができ、本質的に増強性または阻害性であり得る。当技術分野で公知の調節エレメントとして、例えば、転写調節配列、例として、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。プロモーターは、特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモーターから下流（３’方向）に通常位置するコード領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。
「作動可能に連結する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄまたはｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、遺伝子エレメントを、それらが予想される様式で作動することができるように関係付けて並置させることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を支援するならば、プロモーターは、コード領域に作動可能に連結されている。こうした機能的な関係が保たれる限り、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことができる。プロモーターは、好ましくは、隣接するＤＮＡ配列に作動可能に連結する。プロモーターは典型的には、ＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を、プロモーターが存在しない場合に発現する組換え産物の量と比較して、増加させる。１つの生物に由来するプロモーターを利用して、別の生物を起源とするＤＮＡ配列からの組換え産物の発現を増強させることができる。例えば、脊椎動物のプロモーターを、脊椎動物中でクラゲＧＦＰを発現させるために使用することができる。さらに、１つのプロモーターエレメントが、並行につなげた複数のＤＮＡ配列に発現させる組換え産物の量を増加させることもできる。したがって、１つのプロモーターエレメントが、１つまたは複数の組換え産物の発現を増強させることができる。複数のプロモーターエレメントが、当業者には周知である。
用語「エンハンサー」は、本明細書で使用する場合、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するか、またはコードＤＮＡ配列（例えば、１つもしくは複数の組換え産物に転写もしくは翻訳されるＤＮＡ配列）の下流もしくは内部に位置する場合がある。したがって、エンハンサーエレメントは、組換え産物をコードするＤＮＡ配列から１００塩基対、２００塩基対または３００塩基対以上上流または下流に位置し得る。エンハンサーエレメントは、ＤＮＡ配列から発現する組換え産物の量を、プロモーターエレメントがもたらす発現の増加に加えて、さらに増加させることができる。当業者であれば、複数のエンハンサーエレメントを容易に利用することができる。
医薬組成物
本開示は、ａ）上記に記載したｒＡＡＶベクター、およびｂ）薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤または緩衝剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤または緩衝剤は、ヒトにおいて使用するのに適切である。
そのような賦形剤、担体、希釈剤および緩衝剤は、過度の毒性を示すことなく投与することができる任意の医薬品を含む。薬学的に許容できる賦形剤として、これらに限定されないが、液体、例として、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられる。
賦形剤中に、薬学的に許容できる塩、例えば、鉱物酸の塩、例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；および有機酸の塩、例として、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等を含めることができる。さらに、補助物質、例として、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等も、そのようなビヒクル中に存在し得る。多種多様な薬学的に許容できる賦形剤が、当技術分野で公知であり、本明細書で詳細に論述する必要はない。例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら編、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら編、第３版、Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．を含めた、多様な刊行物に、薬学的に許容できる賦形剤は十分に記載されている。
特定の実施形態では、本発明は、上記に記載したｒＡＡＶベクターを、薬学的に許容できる担体またはその他の薬用物質、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤等中に含む医薬組成物を提供する。注射用では、担体は典型的には液体である。その他の投与方法の場合には、担体は、固体、または液体、例として、無菌の、発熱性物質を含有しない水、もしくは無菌の、発熱性物質を含有しないリン酸緩衝溶液のいずれであってもよい。吸入投与の場合には、担体は、呼吸に適しており、好ましくは、固体または液体の粒子の形態をとる。注射剤の媒体として、注射用液剤のために通常用いる添加剤、例として、安定化剤、塩を含有する水、もしくは生理食塩水、および／または緩衝液を使用するのが好ましい。
「薬学的に許容できる」により、生物学的にかつその他の面で望ましい物質を意味し、例えば、そうした物質は、いずれの望ましくない生物学的作用も引き起こすことなく、対象に投与することができる。したがって、そのような医薬組成物は、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞のトランスフェクションにおいて、またはウイルス粒子もしくは細胞を対象に直接投与する際に使用することができる。
遺伝子産物を組織または細胞（例えば、肝臓、神経または網膜の組織または細胞）に送達する方法、および治療方法
本発明の方法は、異種核酸配列を、宿主の組織または分裂細胞および非分裂細胞の両方を含めた細胞内に送達するための手段を提供する。加えて、本発明のベクターおよびその他の試薬、方法ならびに医薬製剤は、治療方法としてまたはそれ以外の目的で、タンパク質またはペプチドを、それを必要とする対象に投与する方法においても有用である。したがって、この様式では、タンパク質またはペプチドを、対象中でｉｎ ｖｉｖｏで生成させることができる。対象には、タンパク質もしくはペプチドの欠損があるという理由で、または対象中でのタンパク質もしくはペプチドの生成により、治療方法としてもしくはそれ以外の目的で、何らかの治療効果をもたらすことができるという理由で、対象が、タンパク質またはペプチドを必要とする場合があり、これらについて、下記にさらに説明する。
本明細書で使用する場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等は、所望の薬理学的および／生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防するという意味で予防的である場合があり、かつ／または疾患および／もしくはその疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という意味で治療的である場合がある。「治療」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特に、ヒト中の疾患の治療をいずれも網羅し、（ａ）疾患を有するとはまだ診断されていないが、疾患の素因がある恐れがあるまたは疾患が発症するリスクがある恐れがある対象中で疾患が発症するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、その進行を停止させること、および（ｃ）疾患を緩和させる、すなわち、疾患を後退させることを含む。
一般に、本発明を利用し、生物学的作用を有する任意の外来核酸を送達して、任意の臓器、組織または細胞中の遺伝子発現に関連する任意の障害と関連がある症状、とりわけ、例えば、肝臓、脳または眼と関連がある症状を治療または改善することができる。例示的な疾患状態として、これらに限定されないが、リソソーム貯蔵疾患、急性間欠性ポルフィリン症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、アルファ（１）−アンチトリプシン欠損、急性肝不全、ポンペ病、チロシン血症、クリグラー−ナジャー症候群、肝炎、硬変、肝細胞癌、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、ならびにその他の神経学的障害、癌（例えば、脳腫瘍）、網膜変性疾患およびその他の眼疾患が挙げられる。
遺伝子移入は、疾患状態について理解し、それに対する療法を提供するのに有用である可能性がかなり高い。欠陥遺伝子が、公知であり、クローニングされているいくつかの遺伝性疾患がある。場合によっては、これらクローニングされている遺伝子の機能が公知である。一般に、上記の疾患状態は、２つのクラスに分類される：一般に劣性に遺伝する、酵素が通常欠損する状態、および優性に遺伝する、調節タンパク質または構造タンパク質が少なくとも一時的に関与する不均衡な状態。欠損状態の疾患の場合、遺伝子移入を使用して、正常遺伝子を罹患組織内に提供し、補充療法を行うこと、および疾患についての動物モデルを、アンチセンス突然変異を使用して作り出すことができると予想される。不均衡な疾患状態の場合、遺伝子移入を使用して、モデル系において疾患状態を作り出すことができ、次いで、これを使用して、疾患状態の是正を試みることができると予想される。したがって、本発明の方法により、遺伝性疾患の治療が可能になる。本明細書で使用する場合、疾患を引き起こすまたは疾患をより重度にする欠損または不均衡を部分的または全体的に矯正することによって、疾患状態を治療する。また、核酸配列の部位に特異的な組込みを使用して、突然変異を引き起こすこと、または欠陥を矯正することも可能である。
一態様では、本発明は、遺伝子産物を、対象中の組織または細胞（例えば、肝臓、神経または網膜の組織または細胞）に送達する方法であって、上記に記載したｒＡＡＶベクターを対象に投与するステップを含む方法を提供する。遺伝子産物は、例えば、上記に記載した、ポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、またはアプタマーであり得る。細胞は、例えば、血液細胞、幹細胞、骨髄（例えば、造血）細胞、肝細胞、癌性細胞、血管細胞、膵臓細胞、神経細胞、グリア細胞、眼もしくは網膜の細胞、上皮もしくは内皮の細胞、樹状細胞、線維芽細胞、肺細胞、筋肉細胞、心臓細胞、腸細胞、または腎臓細胞である場合がある。同様に、組織も、例えば、血液、骨髄、筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋、もしくは血管平滑筋を含めた平滑筋）、中枢もしくは末梢の神経系組織（例えば、脳、神経細胞組織もしくは網膜組織）、膵臓組織、肝臓組織、腎臓組織、肺組織、腸組織、または心臓組織から選択することができる。
遺伝子産物を網膜細胞に送達すれば、網膜疾患の治療を行うことができる。網膜細胞は、光受容器、網膜神経節細胞、ミューラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞であり得る。場合によっては、網膜細胞は、光受容器細胞、例えば、桿体細胞または錐体細胞である。同様に、遺伝子産物を神経の組織または細胞に送達すれば、神経学的障害の治療も行うことができる。遺伝子産物を、神経細胞組織中に存在する種々の細胞型、例えば、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）に送達することができる。遺伝子産物を肝臓に送達すれば、肝臓障害の治療を行うことができる。遺伝子産物を、例えば、肝細胞に送達することができる。
本開示は、疾患（例えば、肝臓疾患、神経学的疾患または眼疾患）を治療する方法であって、それを必要とする個体に、有効量の上記に記載したｒＡＡＶベクターを投与するステップを含む方法を提供する。主題のｒＡＡＶベクターを、頭蓋内注射、脳内注射、硝子体内注射、網膜注射、網膜下注射による眼内注射、静脈内注射、または任意のその他の好都合な投与の様式もしくは経路により投与することができる。
さらなる例示的な投与の様式として、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、局所投与、経皮投与、吸入投与、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内および関節内）投与等、ならびに組織または臓器へ直接注射すること、代わって、くも膜下腔内注射、直接的な筋肉内注射、脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射が挙げられる。注射剤を、従来の剤型に、液状の溶液もしくは懸濁液、注射に先立って溶液となすもしくは液体中に懸濁させるのに適切な固体の剤型、または乳剤のいずれかとして調製することができる。代わって、ウイルスを、全身性ではなく局所性に、例えば、デポーまたは持続放出性に形成して投与することもできる。
組換えウイルスベクターは、好ましくは、対象の細胞（例えば、肝臓、神経または網膜の細胞）中での異種核酸配列の感染（または形質導入）および発現をもたらすのに十分な量で、対象に投与する。好ましくは、標的細胞は、肝細胞、（中枢および末梢の神経系の細胞、特に、脳細胞を含めた）神経細胞、または網膜細胞である。場合によっては、網膜細胞は、光受容器細胞（例えば、桿体および／または錐体）である。その他の事例では、網膜細胞は、ＲＧＣ細胞である。その他の事例では、網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である。その他の事例では、網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞および水平細胞を含むことができる。
好ましくは、ベクターを、治療有効量で投与する。「治療的有効」量は、本明細書で使用する場合、疾患状態と関連がある症状の少なくとも１つを軽減（例えば、緩和、減少、低下）させるのに十分な量である。換言すると、「治療的有効」量は、対象の状態の何らか改善をもたらすのに十分な量である。「治療有効量」は、比較的広い範囲に及び、実験および／または臨床治験により決定することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける注射の場合、治療有効用量はおよそ、約１０６〜約１０１５個のｒＡＡＶウイルス粒子、例えば、約１０８〜１０１２個のｒＡＡＶウイルス粒子である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける形質導入の場合、ｒＡＡＶウイルス粒子の、細胞に送達するのに有効な量はおよそ、約１０８〜約１０１３個のｒＡＡＶウイルス粒子である。当業者であれば、用量応答曲線を確立する日常的な試行により、その他の有効投与量を容易に確立することができる。
いくつかの実施形態では、例えば、毎日、週１回、月１回、年１回等、種々の長さの間隔を置いて、２回以上の投与（例えば、２、３または４回以上の投与）を行って、所望のレベルの遺伝子発現を得ることができる。
治療することができる神経学的疾患には、精神病を含めた、脳またはＣＮＳと関連がある任意の疾患が含まれる。脳の疾患は、２つの一般的なカテゴリー：（ａ）病理学的なプロセス、例として、感染、外傷および新生物、ならびに（ｂ）ミエリンの疾患およびニューロンの変性を含む、神経系に特有の疾患に分類される。いずれのカテゴリーに属する疾患も、治療することができる。例えば、神経学的疾患は、神経変性疾患、例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症および小脳変性；統合失調症；てんかん；虚血に関連する疾患および脳卒中；脱髄疾患、例として、多発性硬化症、静脈周囲脳炎、アリールスルファターゼＡの欠損に起因する異染色性白質ジストロフィー、ガラクトセレブロシドベータ−ガラクトシダーゼの欠損に起因するクラッベ病、副腎白質ジストロフィーおよび副腎脊髄ニューロパチー等の白質ジストロフィー；ウイルス感染後疾患、例として、進行性多巣性白質脳症、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎；ミトコンドリア脳筋症；神経学的な癌、例として、神経膠腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腺腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、血管腫、類表皮、肉腫を含めた、原発性脳腫瘍、およびその他の腫瘍源からの頭蓋内転移；神経学的感染、または神経学的な炎症性の状態から選択することができる。
主題の方法を使用して治療することができる眼疾患として、これらに限定されないが、急性黄斑神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ブドウ膜炎；ヒストプラスマ症；黄斑変性、例として、急性黄斑変性、非滲出型加齢黄斑変性および滲出型加齢黄斑変性；浮腫、例として、黄斑浮腫、嚢胞状黄斑浮腫および糖尿病性黄斑浮腫；多巣性脈絡膜炎；眼の後側の部位または場所に影響を及ぼす眼の外傷；眼腫瘍；網膜障害、例として、網膜中心静脈閉塞、（増殖性糖尿病性網膜症を含めた）糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜の動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜網膜疾患；交感神経性眼炎；フォークト−小柳−原田（ＶＫＨ）症候群；ブドウ膜浸出；眼のレーザー治療またはその影響により引き起こされた眼の後側の状態；光線力学的療法またはその影響により引き起こされた眼の後側の状態；光凝固、放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞；前部虚血性視神経症；網膜症以外の糖尿病性網膜機能不全；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性；脈絡網膜変性；レーバー先天黒内障；先天性停止夜盲症；脈絡膜欠如；バルデ−ビードル症候群；黄斑毛細血管拡張；レーバー遺伝性視神経萎縮症；未熟児網膜症；ならびに１色覚、１型２色覚、２型２色覚および３型２色覚を含めた、色覚障害が挙げられる。
治療することができる肝臓疾患として、例えば、リソソーム貯蔵疾患、例えば、急性間欠性ポルフィリン症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、ウィルソン病、ムコ多糖症（例えば、Ｉ型ＭＰＳもしくはＶＩ型ＭＰＳ）、スライ症候群、ポンペ病、チロシン血症、アルファ（１）−アンチトリプシン欠損、クリグラー−ナジャー症候群；Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎；肝硬変；肝臓癌、例えば、肝細胞癌；または急性肝不全が挙げられる。
本発明は、獣医学的適用例および医学的適用例の両方において有用である。適切な対象には、鳥類および哺乳動物の両方が含まれるが、哺乳動物が好ましい。用語「鳥類」には、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウおよびキジが含まれる。用語「哺乳動物」には、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が含まれる。ヒト対象が、最も好ましい。ヒト対象には、胎児、新生児、乳児、青少年および成人の対象が含まれる。
組織（例えば、肝臓組織、神経細胞組織または網膜組織）の形質導入
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するｒＡＡＶベクターは、例えば、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、対応する（同じ血清型に由来する）ＡＡＶベクターと比較すると、組織（例えば、肝臓組織、神経細胞組織および／または網膜組織）の形質導入の増加を示す。例えば、ｒＡＡＶベクターは、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルス粒子による感染性と比較すると、感染性の少なくとも１０％、５０％、１００％、５００％または１０００％の増加を示すことができる。
さらなる実施形態では、本明細書に開示するｒＡＡＶベクターは、組織（例えば、肝臓組織、神経細胞組織または網膜組織）に選択的または特異的に感染することができ、例えば、その他の細胞型と比較すると、肝細胞、神経細胞または網膜細胞の形質導入の増加を示す。例えば、ｒＡＡＶベクターは、別の細胞型（例えば、肝臓以外、神経以外および／または網膜以外の細胞）と比較すると、特定の細胞型（例えば、肝細胞、神経細胞または網膜細胞）の感染性の少なくとも１０％、５０％、１００％、５００％または１０００％の増加を示すことができる。例えば、ｒＡＡＶベクターは、肝臓、脳および／または眼以外の細胞と比較すると、肝細胞、ニューロンおよび／または光受容器細胞に選択的に感染することができる。
組換えＡＡＶベクターが、神経細胞組織または網膜組織の形質導入の増加を示す場合、例えば、ベクターを使用して、神経学的障害または眼障害を治療するとき、ベクターは、好ましくは、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む。
組換えＡＡＶベクターが、肝臓組織の形質導入の増加を示す場合、例えば、ベクターを使用して、肝臓障害を治療するとき、ベクターは、好ましくは、バリアントＡＡＶ３Ｂ、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３またはバリアントＡＡＶ８のキャプシドタンパク質を含む。
核酸および宿主細胞
本開示は、上記に記載したバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。単離核酸を、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクター中に含めることができる。
そのようなバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質コード配列を含む組換えＡＡＶベクターを使用して、組換えＡＡＶウイルス粒子（すなわち、組換えＡＡＶベクター粒子）を生成することができる。したがって、本開示は、適切な細胞中に導入された場合、組換えＡＡＶウイルス粒子の生成を行うことができる組換えＡＡＶベクターを提供する。
本発明は、主題の核酸を含む、宿主細胞、例えば、単離（遺伝子改変）宿主細胞をさらに提供する。主題の宿主細胞は、単離細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞であり得る。下記に記載するように、主題の宿主細胞は、主題のｒＡＡＶウイルス粒子を生成するのに有用である。主題の宿主細胞を使用して、主題のｒＡＡＶウイルス粒子を生成する場合、この宿主細胞は、「パッケージング細胞」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、主題の宿主細胞は、主題の核酸を用いて、安定に遺伝子改変が行われている。その他の実施形態では、主題の宿主細胞は、主題の核酸を用いて、一過性に遺伝子改変が行われている。
これらに限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介型トランスフェクション等を含めた、確立されている技法を使用して、主題の核酸を、宿主細胞内に安定または一過性に導入する。安定な形質転換のために、主題の核酸は一般に、選択マーカー、例えば、いくつかの周知の選択マーカーのいずれか、例として、ネオマイシン抵抗性マーカー等をさらに含む。
主題の核酸を多様な細胞のいずれか、例えば、哺乳動物細胞内に導入することによって、主題の宿主細胞を生成する；哺乳動物細胞として、例えば、マウス細胞および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞には、これらに限定されないが、初代細胞および細胞株が含まれ、適切な細胞株として、これらに限定されないが、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベロ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。適切な宿主細胞の非限定的な例として、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴＩ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が挙げられる。また、バキュロウイルスを使用して、ＡＡＶを生成する昆虫細胞、例として、Ｓｆ９細胞に感染させて、主題の宿主細胞を作製することもできる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号；米国特許出願１２／２９７，９５８を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、主題の遺伝子改変宿主細胞は、上記に記載した、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つまたは複数のＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。その他の実施形態では、主題の宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。主題の宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶウイルス粒子を生成することができる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成する方法は、例えば、米国特許公開第２００５／００５３９２２号、および米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
本明細書で使用する場合、「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の集合およびキャプシド化が生じる一連の細胞内事象を指す。ＡＡＶ「ｒｅｐ」遺伝子およびＡＡＶ「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製タンパク質およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。本明細書では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐを、ＡＡＶの「パッケージング遺伝子」と呼ぶ。集合関連タンパク質（ＡＡＰ）は、ｃａｐ遺伝子内のオープンリーディングフレームの産物であり、また、パッケージングに必要な場合もある。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が、哺乳動物細胞により複製およびパッケージングされるのを可能にするウイルスを指す。多様な、ＡＡＶのためのそのようなヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニア等のポックスウイルスを含めて、当技術分野で公知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が、最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類を起源とする多数のアデノウイルスが、公知であり、ＡＴＣＣ等の受託機関から入手可能である。ヘルペスの科のウイルスとして、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもまた、ＡＴＣＣ等の受託機関から入手可能である。
「ヘルパーウイルスの機能」は、（本明細書に記載する複製およびパッケージングに必要なその他の機能と共同して）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスのゲノム中にコードされている機能を指す。本明細書に記載するように、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をプロデューサー細胞にトランスに提供することを含めて、いくつかの方法で、「ヘルパーウイルスの機能」を提供することができる。例えば、１つまたは複数のアデノウイルスのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはその他の発現ベクターを、プロデューサー細胞内に、ｒＡＡＶベクターと共にトランスフェクトする。
「感染性」のウイルスまたはウイルス粒子は、能力を有するように集合させたウイルスキャプシドを含み、ある細胞内へのポリヌクレオチド構成成分の送達が可能であるウイルスまたはウイルス粒子であり、この細胞に対して、そのウイルスの種は指向性がある。この用語は、ウイルスの何らかの複製能力を必ずしも暗示しない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイが、本開示の他の箇所に記載されており、当技術分野にも記載されている。ウイルスの感染性を、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比として表すことができる。全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比を決定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒら（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０の感染性タイターのアッセイの記載）；およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６：９７３を参照されたい。
「複製可能な」ウイルス（例えば、複製可能なＡＡＶ）は、感染性であり、また、感染細胞中（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルスの機能の存在下）で複製されることも可能である、表現型が野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能には一般に、機能性の、ＡＡＶのパッケージング遺伝子の存在が必要である。一般に、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如に起因して、哺乳動物細胞（とりわけ、ヒト細胞）中では複製可能ではない。典型的には、ＡＡＶのパッケージング遺伝子と侵入するｒＡＡＶベクターとの組換えにより、複製可能なＡＡＶが生成される可能性を最小限に留めるために、そのようなｒＡＡＶベクターは、いずれかのＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠く。多くの実施形態では、本明細書に記載するｒＡＡＶベクター調製物は、いずれかの複製可能なＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、また、ＲＣＡとも呼ぶ）を含有するにしても、わずかしか含有しない調製物である（例えば、１０２個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０４個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０８個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、１０１２個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶを含有しない）。
「単離された」核酸、ベクター、ウイルス、ウイルス粒子、宿主細胞またはその他の物質は、物質の調製物であって、その物質または類似の物質が天然に存在するかまたは最初に調製されたときにも存在する可能性があるその他の成分の少なくとも一部を除いた物質の調製物を指す。したがって、例えば、精製の技法を使用して、供給源の混合物から物質を濃縮することによって、単離物質を調製することができる。濃縮は、溶液の容量当たりの重量等の絶対値として測定してもよく、または第２の、供給源の混合物中に存在する干渉する可能性がある物質に対する相対値として測定してもよい。本開示の実施形態の濃縮の程度の増加により、単離の程度がますます高まる。単離された核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞またはその他の物質を、いくつかの実施形態では、例えば、約８０％〜約９０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、または少なくとも約９９％以上の純度で精製する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する技術に関わる当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似するまたはそれらと均等である任意の方法および材料もまた、本発明の実行または試験において使用することができるが、好ましい方法および物質が、ここに記載されている。方法および／または材料を開示し、記載するために、本明細書で言及する全ての刊行物が、参照により本明細書に組み込まれており、そうした方法および／または材料と関連する刊行物が引用されている。
明示するために、別個の実施形態の文脈で記載されている本発明の特定の特徴はまた、組み合わせて、単一の実施形態としても提供することができることが理解される。反対に、簡潔に記載するために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の種々の特徴もまた、別個にまたはそれらの一部を任意に適切に組み合わせて提供することができる。本発明に関する実施形態の全ての組合せが、本発明により具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組合せが個々かつ明確に開示されているかのごとく、本明細書に開示されている。さらに、種々の実施形態およびそれらの要素の部分的な組合せの全てもまた、本発明により具体的に包含され、あたかもありとあらゆるそのような部分的な組合せが個々かつ明確に本明細書に開示されているかのごとく、本明細書に開示されている。
以下の実施例を提供して、本発明の特定の実施形態を例証する。いかなる場合であっても、実施例には本発明を制限する意図はない。
（実施例１）
本実施例では、発明者らは、（真性型という意味で）ｔｔＡＡＶ２と名付けた、新規のＡＡＶ２ベクターを設計し、構築した。さらに、ｔｔＡＡＶ２が、組織培養適応（野生型）ＡＡＶ２と比較して、異なる挙動を示すかどうかを評価するために、新規のベクターを、いくつかの動物（ラット、マウスおよび新生仔マウス）モデル中で試験した。ｔｔＡＡＶ２は、遺伝子送達について、ＡＡＶ２を上回る利点を有し、脳組織または眼組織の、異種配列によるｉｎ ｖｉｖｏ形質導入に特に有用であることを、発明者らは実証した。
方法
１．クローニング
ｗｔＡＡＶ２のキャプシド遺伝子を、我々のプロデューサープラスミドｐＤＧから得た（図１０）。このプラスミドは、ｗｔＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有する。キャプシド遺伝子のサブ断片（それぞれ、ｐＤＧヌクレオチドＡ：３２５７〜３７５９、Ｂ：４０２５〜４５５５、Ｃ：４７９７〜５２８７およびＤ：５１４９〜５４２５）を、ｐＢＳ内にサブクローニングし、続いて、突然変異誘発を行った。４つの突然変異を、部位特異的変異誘発により、断片Ａ内に導入し、その結果、アミノ酸（ＡＡ）変化：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２ＳおよびＴ２０５Ｓをコードする構築物を得た。断片Ｂを、単一のＡＡ変化：Ｎ３１２Ｓをコードするように突然変異させた。断片Ｃを、ＡＡ交換：Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８ＴおよびＡ５９３Ｓをコードするように突然変異させた。良好な突然変異誘発を確認して、断片Ａ〜Ｃを、ｐＤＧ内に再クローニングし、その結果、ｔｔＡＡＶ２キャプシドで包まれる組換えウイルスの生成を支援するプロデューサープラスミド（ｐＤＧ−ｔｔＡＡＶ２）を得た。
２．ｔｔＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスベクターの生成、精製およびタイターの決定
ベクターの生成を、ｒＡＡＶプラスミドのｐＤＧとのコトランスフェクションを利用する標準的なプロトコールに従って確立した；ｐＤＧにより、Ａｄのヘルパー機能ならびにＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の両方が提供される。多様なｒＡＡＶプラスミドを使用して、組換えプラスミドを生成した。
ｐＴＲ−ＵＦ１１（ＣＡＧ−ＧＦＰ）を、ｒＡＡＶプラスミドとして使用した。１つのセルファクトリー（ＣＦ１０）当たり、８×１０８個の２９３細胞を播種した。１４〜１８時間後、細胞を、ｐＤＧまたはｐＤＧ−ｒｒＡＡＶ２、およびｐｒＡＡＶ（例えば、ｐＴＲ−ＵＦ１１）で、ＣａＰＯ４共沈殿法を使用してトランスフェクトした。７２時間後、細胞を、収集し、溶解用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸）中に再懸濁した。細胞のペレットを、４サイクルの凍結および解凍により溶解させて、ウイルスを放出させ、各サイクルが、−８０℃の３０分間、それに続く、３７℃の３０分間からなった。最後の解凍の後、溶解液を、ベンゾナーゼを５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いて処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。組換えウイルスを、自然落下式カラムを使用して精製した。
精製。最初のステップとして、未精製の溶解液を、４０００ｇにおける１５分間の遠心分離により清澄化し、これに、あらかじめ形成したイオジキサノールの段階的勾配を適用した。次いで、ウイルス画分を、収集し、乳酸リンゲル液中で再緩衝し、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離用フィルターを使用して濃縮した。
続いて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により、ウイルス調製物の純度を評価し、リアルタイムＰＣＲ法を使用して、タイターを決定した。未精製の抽出物は、４．５×１０１２個の粒子を含有し、収集したウイルス画分は、１．５×１０１２個の粒子を含有した。この時点で、この精製方法により、未精製の抽出物中に存在するウイルスの約３３％を回収した。
３．ｒＡＡＶベクターの生成および精製（代替方法）
上記の２の時点における代替の実施形態では、ｒＡＡＶ２ベクターを、以下に従って生成する。ｒＡＡＶ２ウイルス粒子を生成するために、１つのセルファクトリー（ＣＦ１０）当たり、５×１０８個の２９３Ｔ細胞を播種した。１４〜１８時間後、細胞を、ＧＦＰ含有ベクターＰＤ１０−ｐＳＴ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ、およびｐＤＧまたはｐＤＧキャプシド突然変異体（ｐＤＧ−ｔｔＡＡＶ２）のいずれかで二重にトランスフェクトして、それぞれ、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰの野生型または真性型のベクターを生成した。二重のトランスフェクションは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＰＥＩ−ｍａｘを１ｍｇのＤＮＡ当たり３．５ｍｌのＰＥＩの比で使用して実現した。７２時間の３７℃におけるインキュベーションの後に、培地および細胞を４℃において２２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、細胞を収集した。上清を、取り出し、さらなる処理のために残し、細胞のペレットを、溶解用緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．８］）中に再懸濁した。
次いで、細胞のペレットを、４サイクルの凍結および解凍により溶解させて、ウイルスを放出させ、各サイクルが、−８０℃の３０分間、それに続く、３７℃の３０分間からなった。最後の解凍の後、溶解液を、ベンゾナーゼを１５０Ｕ／ｍｌの濃度で用いて処理し、３７°で３０分間インキュベートした。次いで、溶解液を２０００ｒｐｍで２０分間スピンして、溶解液を清澄化した。上清を、０．２２μｍのセルロースアセテート製フィルターを使用してろ過し、組換えＡＡＶ２ウイルス調製物を、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＡＶＢセファロース親和性カラム（ｂｆｒ．Ａ：ＰＢＳ、ｐＨ８；ｂｆｒ Ｂ：０．５Ｍのグリシン、ｐＨ２．７）を使用するＦＰＬＣにより精製した。収集した画分を、ＰＢＳに対して一晩透析し、次いで、ウイルス調製物のタイターを、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびリアルタイムＰＣＲ法により決定した。
結果
ｔｔＡＡＶ２のｉｎ ｖｉｖｏにおける形質導入および伝播
ｔｔＡＡＶ２ベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、そのような状況における改変ウイルスの生理活性を評価するために試験した。いくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデル内への注射のために、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＷＴウイルスおよびＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＴＴウイルスの試料を調製した。このためには、ｉｎ ｖｉｖｏではベクターのわずかな容量しか注射することができないので、ウイルスを濃縮した。次いで、ｑＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、濃縮したベクターの新たなタイターを評価した（図１１）。
ｑＰＣＲおよびタンパク質ゲル分析の後、以下の新たなタイター：ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＴＴ：１．３３×１０１２個のウイルスゲノム／ｍｌ、およびＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＷＴ：１．２５×１０１２個のウイルスゲノム／ｍｌを得た。キャプシドのタイターは、以下の通りであった：ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＴＴ：８．８９×１０１２個のキャプシド／ｍｌ、およびＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＧＦＰ ＷＴ：７．８３×１０１２個のキャプシド／ｍｌ。タイターは、ゲノムのコピー数とキャプシドのコピー数の間で異なり、また同時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからは、組換えＡＡＶベクターを生成する間に通例生成する、空のキャプシドがあることも示され、したがって、キャプシドのタイターは、ｑＰＣＲから得られるウイルスゲノムのタイターよりも高い。
ラット脳中への形質導入
ｒＡＡＶ２のＴＴウイルスおよびＷＴウイルスを、野生型ラットの黒質または線条体中に注射し、１つの条件当たり、３匹のラットに、１回の注射当たり、２×１０９ｖｇまたは３．５×１０９ｖｇの用量で注射した。２８日後に、脳を解体し、組織切片を調製して、免疫蛍光法による分析を行った。一次データを、図１２および図２６に示す。
ｒＡＡＶ２のＴＴウイルスおよびＷＴウイルスの両方により、効率は異なるが、それぞれの注射部位から、神経細胞およびグリア細胞に形質導入することが可能であった。比較すると、ＴＴベクターは、ＷＴベクターよりも、脳組織に効率的に形質導入し、注射部位からの伝播が向上していることが観察された。さらに、ｒＡＡＶ２ＴＴの線条体への注射の後に、視床下部の１つの領域である束傍核中に形質導入ニューロンが存在することも観察された。このことは、ＴＴベクターが、注射部位で形質導入された細胞体から、能動輸送により、ニューロンの突起に沿って視床下部へ移動することが可能であったことを示しており、逆行輸送についての強力な能力が明らかになった。この逆行輸送の能力は、組織培養適応ＷＴ ｒＡＡＶ２ベクターにおいては失われている；その理由は、形質導入細胞を、同じ領域中に観察することができなかったからである（図２６を参照されたい）。
総合すると、ラット脳中では、これらの結果は、タイターを一致させたｗｔＡＡＶ２と比較して、ｔｔＡＡＶ２による伝播および形質導入効率が顕著に増加したことを示している。さらに、ＡＡＶ２ＴＴは、非常に良好な逆行輸送の能力についての証拠も提示しており、この能力は、ＡＡＶ２ＷＴウイルス中では失われている。
マウス眼モデル中への形質導入
ラット脳試験のために使用したのと同じバッチから得られたｔｔＡＡＶ２およびｗｔ−ＡＡＶ２を、成体マウスの眼内に、１眼当たり２×１０９ｖｇの用量で注射した。動物間の変動を回避するために、各マウスの一方の眼には、ｒＡＡＶ２ＴＴを注射し、反対側の眼には、ｒＡＡＶ２ＷＴを注射した。眼内注射の３つの異なる経路：前房内、硝子体内および網膜下を分析した。６週間後に、動物を収集し、ＧＦＰの発現を免疫蛍光法により評価した。結果を図１３に示す。総合すると、これらのデータは、（良好なＲＰＥ６５臨床治験において使用された）ｗｔＡＡＶ２と比較する場合、網膜下注射の後のｔｔＡＡＶ２による光受容器細胞の形質導入が、形質導入された光受容器細胞のレベルおよび数の両方に関して著しく増強されることを示している。
新生仔マウスモデル中への形質導入
要約すると、ｔｔＡＡＶ２ＧＦＰベクターおよびｗｔＡＡＶ２ＧＦＰベクターの両方を、マウス新生仔中に注射した。２つの注射経路：静脈内注射および頭蓋内注射を試験した。４週間後、動物を屠殺し、全てのマウスから全ての組織を収集した。脳を、収集してから、蛍光顕微鏡上での臓器の直接的な蛍光により可視化して、脳を分析した。結果を図１４に示す。下記に、頭蓋内注射および全身注射の結果を、より詳細に論述する。
頭蓋内注射
いずれかのベクターの５×１０１０ｖｇを、Ｐ１新生仔の側脳室中に注射した。注射の４週間後に、動物を屠殺し、脳を、解体し、切片化し、抗ＧＦＰ抗体を使用して染色した。結果を図２７に示す。
成体ラット脳において観察されたのと同様に、これらのデータは、ＡＡＶ２ＴＴが、頭蓋内注射の後に、ＡＡＶ２ＷＴベクターと比較して、マウス脳組織の形質導入の増強およびより高い伝播を示すことを示している。染色切片をより高い倍率で観察すると、両方のベクターの間の形質導入効率の差がさらに明らかになった：ＴＴベクターは、形質導入された細胞の数および発現レベルの両方に関してより良好に機能した。ＡＡＶ２ＴＴおよびＡＡＶ２ＷＴは、それぞれが神経細胞およびグリア細胞の形質導入を示し、同じ細胞型親和性を有するようであり、このことは、観察された差が、細胞型特異性の差ではなく、効率の差であることを示唆している（図２８）。総合すると、これらのデータは、ｔｔＡＡＶ２が、ｉ．ｃ．注射の後に、ｗｔＡＡＶ２に基づくベクターと比較して、マウス脳組織の形質導入の大幅な増強を示すことを示している。さらに、いくつかの証拠から、ｔｔＡＡＶ２ベクターを使用する場合には、脳室の壁を構成する脳室上皮細胞の層の形質導入が生じることも示唆されている。この現象は、ｗｔＡＡＶ２ベクターでは認められない。
全身注射
いずれかのベクターの２×１０１１ｖｇを、Ｐ１新生仔中の頚静脈内に注射した。注射の４週間後に、動物を屠殺し、種々の臓器（脳、肝臓、心臓、筋肉、肺、脾臓および腎臓）を、収集し、ＧＦＰの形質導入について、抗ＧＦＰ抗体を使用する免疫組織化学的検査により評価した。脳の染色の結果を図２９に示し、高倍率の写真を図３０に示す。
ＡＡＶ２ＴＴの全身注射の後のＣＮＳ中の良好な導入遺伝子の発現が観察された。ＡＡＶ２ＷＴベクターは、比較すると、わずか数個の形質導入ニューロンが観察されたに過ぎず、その機能は劣っていた。
ＡＡＶ２ＴＴベクターの全体的な体内分布を評価するために、全身注射の後に種々の組織中で得られた形質導入のレベルを評価した。収集した臓器を、固定し、パラフィン包埋し、切片化し、ＧＦＰの発現について染色した（図３１）。
これらのデータは、ＡＡＶ−ＴＴベクターが、その他の臓器に対しては強力な親和性を有さないようであるが、代わりに、主として神経細胞組織に対しては特異性を示すことを示している。この観察結果から、ＡＡＶの静脈内注射が神経細胞の遺伝学的障害の治療に有益であることが証明され得ると予想される。というのは、ベクターが、この注射経路を介して、非標的末梢臓器ではなく、主として脳のみに形質導入をもたらすことが確保されるからである。
総合すると、我々のｉｎ ｖｉｖｏにおけるデータからは、ｔｔＡＡＶ２が、眼組織および脳組織中では並外れた形質導入特性を有し、ほとんどもっぱら神経細胞組織に対して特異性を示すことが示唆される。
（実施例２）
追加の検討事項
理論により拘束されるわけではないが、ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異は、ｗｔＡＡＶ２と比較して、以下の機能別の群を含むと考えられる：
１）ＡＡＶ２キャプシドの３回フォールドされたスパイク上に位置するヘパリン結合性の残基（Ｓ５８５およびＴ５８８）；これらの残基は、ｗｔＡＡＶ２キャプシドのヘパリン結合に関与すると考えられる。ｔｔＡＡＶ２中では、これらが交換されており、この交換により、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに富む脳組織中のウイルスの伝播が支援されることが推測される。
２）キャプシドの内側上に位置するｔｔＡＡＶ２中の単一のアミノ酸変化（Ｓ３１２）；この内部セリン残基は、キャプシド−ＤＮＡ間の相互作用において役割を果たす場合があり、それにより、ウイルスの安定性、ゲノムのパッケージングまたは感染時のゲノムの放出のいずれかに寄与する可能性があると予想される。
３）ＡＡＶキャプシド構造上の３回フォールドされた近接するスパイクの間の溝中に位置する２つの空間的に近いアミノ酸（Ｄ５４６およびＧ５４８）；これらの残基は、抗体を中和する相互作用に関与し、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける形質導入特性に寄与する場合があると予想される。
４）３回フォールドされた近接するスパイクの間の溝中に位置する単一の孤立したアミノ酸変化（Ｓ５９３）；
５）受容体結合に関与すると考えられ、３回フォールドされたスパイク上で密接な位置関係にある４つのアミノ酸（Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３）；
６）ＶＰ１／ＶＰ２の一次配列中に存在する４つの残りのアミノ酸変化（Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２およびＳ２０５）；これらの残基は、ＶＰ３の一部ではないキャプシド領域の内部にある。ウイルスのキャプシドの内部の、ＶＰ１／ＶＰ２に特異的な領域は、侵入するウイルスの輸送に関与する場合があると予想されるＰＬＡ２活性を含有することが公知である。この領域の変化が、ウイルスの感染性に影響を及ぼすことが示されている。
ＡＡＶ２キャプシドタンパク質中のこれらの突然変異の三次元の位置は、公知であり、図１５〜２０に示す。対応する位置を、その他の血清型に由来するＡＡＶキャプシドタンパク質中で同定することができる（下記を参照されたい）。ｔｔＡＡＶ２、および改善されたｔｔＡＡＶ２の表現型に関与する個々のアミノ酸変化の役割をさらに特徴付ける目的で、個々の選ばれたアミノ酸（または、例えば、上記で論述した１〜６の群に基づく一連のアミノ酸）を、野生型ＡＡＶ２キャプシド中のそれらの対応する配列に逆戻りさせるために、ｔｔＡＡＶ２キャプシドを突然変異させることができる。次いで、それぞれの突然変異ベクターを、上記の実施例に記載した方法を使用して分析することができる。
例えば、ＧＦＰを発現する、種々の突然変異したベクターを、動物モデル中での、ＣＤ１新生仔マウス中への頭蓋内（ＩＣ）注射による第１のスクリーニングに供することができる。次いで、注射した脳中の、それぞれの突然変異ベクターから得られるＧＦＰのシグナルを、蛍光顕微鏡法により観察し、ＧＦＰを発現する元々のｗｔＡＡＶ２ベクターおよびｔｔＡＡＶ２ベクターから得られるシグナルと比較する。新たな表現型（すなわち、ｔｔＡＡＶ２に特異的な、強力なＧＦＰの発現の、特定のアミノ酸の基を突然変異させた場合の無効化）を同定したら、次いでさらに、注射した脳を切片化し、免疫組織化学的検査により分析する。
平行して、これらの選択した突然変異ベクターを、成体ラットの頭蓋内注射による第２のスクリーニングに供する。加えて、ベクターの体内分布を評価するために、関連の突然変異の組合せも、新生仔マウス内への静脈内（ＩＶ）注射により分析する。次いで、選択された臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉）を処理して、免疫組織化学的検査およびＧＦＰの発現の評価を行う。
ＴＴに特異的なそれぞれの残基の、ベクターの効率および体内分布に対する寄与の分析
ＡＡＶ２ＴＴをさらに特徴付け、改善されたＴＴの表現型に関与するアミノ酸変化を特定する目的で、選ばれたアミノ酸を、野生型ＡＡＶ２キャプシド中のそれらの対応する配列に逆戻りさせるために、ＡＡＶ２ＴＴキャプシドを、段階的に突然変異させた。この戦略により、我々は、１４個のアミノ酸の突然変異のそれぞれの、ＡＡＶ２ＴＴの表現型に対する寄与をより具体的に識別し、必要な突然変異のみを含有する最低限の真性型ベクターを定義することができた。
上記で論述したように、ＴＴに特異的な１４個の残基を、ＡＡＶキャプシド上のそれらの位置と、形質導入プロファイルに関連してそれらが寄与する可能性とに基づき群に分けた。ＴＴに特異的ないくつかの残基の、ＷＴ等価物への復帰が表現型の喪失と関連があるかどうかを観察し、それにより、ＴＴの１４個の残基のうちの重要なアミノ酸変化を同定するために、新生仔マウス脳または成体ラット脳中への頭蓋内注射により、種々のＡＡＶ−ＴＴの突然変異をスクリーニングした。
ヘパリン結合性部位（ＨＢＳ）
残基：５８５および５８８は、ＡＡＶ２ＷＴキャプシドのヘパリン結合に関与することが示されている。ＡＡＶ−ＴＴ中では、これらが交換されており、この交換により、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに富む脳組織中のウイルスの伝播が支援されることが推測された。これら２つの残基は、ＡＡＶ２キャプシド構造の３回フォールドされた近接するスパイク上に存在する（図１６を参照されたい）。
ＷＴキャプシド上にＲ５８５ＳおよびＲ５８８Ｔの変化を工学的に作製すること（ＡＡＶ２−ＨＢｎｕｌｌ）、すなわち、残基を突然変異させて、真性型等価物を得ることによって、ＡＡＶ２ＷＴのヘパリン結合能力を無効にした。ＡＡＶ−ＴＴは単に、ヘパリン結合性部位を有さない、より広く伝播することが可能であるＡＡＶ２ではなく、しかし、その他の１２個のアミノ酸変化のいくつかもまた、ＡＡＶ−ＴＴの形質導入プロファイルの改善において役割を果たすことを確認するために、この第１の分析を実施した。
成体ラット中への頭蓋内注射
タイターをマッチさせたＡＡＶ２−ＴＴベクター、ＡＡＶ２−ＷＴベクターおよびＡＡＶ２−ＨＢｎｕｌｌベクターを、野生型ラットの黒質または線条体中に、１回の注射当たり３．５×１０９ｖｇの用量で注射した。２８日後に、脳を解体し、組織切片を調製して、ＧＦＰの発現の免疫組織化学的検査による分析を行った（図３２）。
ＡＡＶ−ＴＴウイルスの線条体への注射の後に、視床および黒質中の強力なＧＦＰの発現が観察され、ベクターの強力な逆行輸送の能力が明らかになった。一方、ＡＡＶ２−ＨＢｎｕｌｌおよびＡＡＶ２ＷＴは、ＡＡＶ−ＴＴよりも、存在するにしても、はるかに低い逆行輸送を示した；というのは、線条体への注射の後、これらの領域中では、非常にわずかな細胞体にしか形質導入が生じなかったからである。この観察結果から、ＡＡＶ２−ＨＢｎｕｌｌはＡＡＶ−ＴＴとは異なること、およびＡＡＶ２キャプシド上にヘパリン結合能力が存在しないことによって脳中での真性型ベクターの良好な伝播がもたらされることが示された。しかし、このことは、ＡＡＶ−ＴＴの改善された形質導入プロファイルを説明するには十分でない。
残基：Ｓ３１２、Ｄ５４６−Ｇ５４８、およびＳ５９３
Ｓ３１２残基は、ＴＴに特異的な変化であり、この変化だけが、ＡＡＶ２キャプシドの内側上に位置する。この内部残基は、キャプシド−ＤＮＡ間の相互作用において役割を果たす場合があり、それにより、ウイルスの安定性、ゲノムのパッケージングまたは感染時のゲノムの放出のいずれかに寄与する可能性があると予想されることが想定された。
５４６および５４８位におけるＤ残基およびＧ残基はそれぞれ、近接する３回フォールドされたピークの間の溝中に位置する。
単一の孤立したセリンであるＳ５９３は、３回フォールドされた近接するスパイクの間の溝中に存在する。
これらＴＴに特異的な残基の、ＡＡＶ２キャプシドの三次元構造上の位置を、図１７〜１９に示す。我々は、これらの残基の位置の構造中の突出度があまり高くないことを考慮して、これらの残基は、ｔｔＡＡＶ２の形質導入の表現型に寄与し得ないと仮定した。
新生仔マウスの頭蓋内注射
突然変異Ｓ３１２Ｎを、ＡＡＶ２−ＴＴキャプシドに工学的に作製して、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ突然変異体を作り出した。突然変異Ｄ５４６ＧおよびＧ５４８Ｅを、ＡＡＶ２−ＴＴキャプシドに工学的に作製して、ＡＡＶ−ＴＴ−ＤＧ突然変異体を生成した。突然変異Ｓ５９３Ａを、ＡＡＶ２−ＴＴキャプシドに工学的に作製して、ＡＡＶ−ＴＴ−Ｓ５９３Ａ突然変異体を作り出した。
これらの選ばれたＴＴアミノ酸を、野生型ＡＡＶ２キャプシド中のそれらの対応する配列に復帰させることによって、これらの残基の、改善されたＡＡＶ−ＴＴの表現型に対する寄与を決定することを狙った。
それぞれの突然変異ベクターの５×１０１０ｖｇを、Ｐ１新生仔の側脳室中に注射した。注射の４週間後に、動物を屠殺し、脳を、解体し、切片化し、抗ＧＦＰ抗体を使用して染色した。結果を図３３に示す。
興味深いことに、これらのデータは、ＡＡＶ ＴＴ−Ｓ３１２Ｎが、完全なＡＡＶ２ＴＴベクターと比較して、マウス脳組織の形質導入の増強を示すことを示唆している。他方、アミノ酸変化Ｓ５９３ＡおよびＤ５４６Ｅ／Ｇ５４８Ｄは、ＴＴの表現型に影響を及ぼさないようであった；というのは、類似の形質導入プロファイルを、脳全体を通して観察し得たからである。染色切片をより高い倍率で観察すると、形質導入効率の差が、さらに明らかになった（図３４）。
高倍率の写真からは、ＡＡＶ ＴＴ−Ｓ３１２が、１４個のアミノ酸変化を有する元々のＡＡＶ−ＴＴよりも高い効率で、神経細胞組織に形質導入するようであることを観察することができた。特に、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎベクターの注射の後に、脳の頭側（皮質、線条体、海馬）において、形質導入された細胞のレベルおよび数の両方に関して、より強力な、導入遺伝子の発現を認めることができた。この注射部位が標的であることに関連する困難に起因して、注射した新生仔脳に高い変動性が生じるにもかかわらず、この観察結果は、分析した動物の全てにおいて確認された。他方、復帰させたＳ５９３ＡおよびＤ５４６Ｅ／Ｇ５４８Ｄの、ＴＴベクターによる形質導入の表現型に及ぼす影響は多くはないようであった。
（実施例３）
実施例２の突然変異の組合せを用いて得られた結果から選択される、ＡＡＶ２真性型キャプシド上におけるアミノ酸突然変異の標的
我々は、完全なＡＡＶ ＴＴキャプシド上のアミノ酸の基の突然変異から得られた結果に基づいて、突然変異Ｓ３１２Ｎが、ＴＴの表現型にとって有益であり、脳中へのその形質導入効率をさらに増加させるようであると決定することができた。さらに、復帰させたＳ５９３ＡおよびＤ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅが、神経細胞のＡＡＶ−ＴＴの表現型には影響を及ぼさないようであることも観察された。したがって、我々は、ＴＴに特異的な残基：Ｓ５９３、Ｄ５４６およびＧ５４８を真性型キャプシド配列から排除し、代わりに、これらの位置におけるＡＡＶ２ＷＴの残基を残して、１０個のアミノ酸変化のみを有する最終的なＴＴベクターを得ることができると仮定した。
これらの仮定を確認するために、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−Ｄ５４６Ｇ−Ｇ５４８Ｄ−Ｓ５９３Ａベクターを工学的に作製し、その形質導入効率を、新生仔マウス脳への注射により試験した。最後に行った新生仔頭蓋内注射は、ＧＦＰ発現の検出シグナルを飽和させてしまうようであったことから、我々はまた、この「最終決定前の」ＴＴと平行して、ＴＴベクターおよびＴＴ−Ｓ３１２Ｎベクターも、前回使用した用量の１／１０の用量を使用して注射することを決めた。このより低い用量を使用することによって、形質導入された脳中のＧＦＰの染色レベルが飽和に達するのを回避すること、および異なる突然変異体間で形質導入効率を比較するのが困難になるのを回避することを狙った。
それぞれの突然変異ベクターの５×１００９ｖｇを、Ｐ１新生仔の側脳室中に注射した。注射の４週間後に、動物を屠殺し、脳を、解体し、切片化し、抗ＧＦＰ抗体を使用して染色した。結果を図３５に示す。
以前にも観察されたように、これらのデータも、ＡＡＶ ＴＴ−Ｓ３１２Ｎが、完全なＡＡＶ２ＴＴベクターと比較して、マウス脳組織の形質導入の増強を示すことを示唆している。他方、最低限のＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−Ｄ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅ−Ｓ５９３Ａベクターは、これもまたＳ３１２Ｎ内部突然変異を含有するにもかかわらず、形質導入のこうしたより高いレベルには達しないようであった。このことから、アミノ酸変化のうちの１つまたは複数が、ＴＴの表現型において何らかの役割を果たすことが示唆される。これらの残基を復帰させてＡＡＶ２ＷＴ等価物に戻すことによって、増加した形質導入能力の一部が失われた。染色切片をより高い倍率で観察すると、これらの観察結果が確認された（図３６）。
我々は、注射した脳中に得られるＧＦＰ発現の総量を、全脳からのタンパク質抽出物に対する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量化することによって、これらのベクターのそれぞれによって得られる形質導入効率をさらに検討することを決めた。手短に述べると、５×１００９ｖｇのベクターを注射した４週間後に、動物を屠殺し、脳全体を収集し、溶解させ、脳タンパク質の全量を抽出した。次いで、ＧＦＰタンパク質標準物質を使用して、注射したそれぞれの脳中に発現したＧＦＰタンパク質の量を定量化することができた（図３７）。
ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ内部突然変異体は、完全なＴＴベクターよりも高い効率で、マウス脳に形質導入することを確認することができた；というのは、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎが、全ての注射した脳において全般的に、より高いＧＦＰの発現をもたらしたからである。他方、最低限のＴＴベクターであるＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−Ｄ５４６Ｇ／Ｇ５４８Ｅ−Ｓ５９３Ａは、より低いレベルの形質導入をもたらすようであった：このグラフ上では、脳１つ当たりのＧＦＰの発現量の平均はより高いようであるが、このことは、１つの脳において測定されたＧＦＰの極値に起因した；これは、この状態についての高いエラーバーにより示されている。この最低限のＴＴベクターに関しては、動物間の変動性が非常に高く、５匹の動物のうち１匹だけが、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎにより形質導入された動物よりも良好な機能を示した。この高い変動性に起因して、我々は、この暫定的な最低限のＴＴベクターの検討には慎重になった；とりわけ、免疫組織化学的検査による分析からもまた、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎバリアントが、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ−ＤＧ−Ｓ５９３Ａよりも良好に機能することが示されたからである。
したがって、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎバリアントが、最も好ましいＡＡＶ ＴＴベクターとして選択され、これは、野生型ＡＡＶ２と比較すると、以下の１３個のアミノ酸の突然変異：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２Ｓ、Ｔ２０５Ｓ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８ＴおよびＡ５９３Ｓで構成される。
上記の試験から、ＴＴ−Ｓ３１２Ｎが最も好ましいＡＡＶ−ＴＴベクターであることが示唆されるが、これらの試験は、いくつかのＴＴに特異的な残基が個々に、機能を有し、寄与することを示している。特に、キャプシドの３回フォールドされたスパイク上で密接な位置関係にある４つのアミノ酸は、受容体結合に関与する可能性が高い。いくつかの実施形態では、これらの残基を、ＡＡＶ−ＴＴ中で復帰させて、ＡＡＶ２ＷＴの対応する残基に戻す。例えば、突然変異Ｍ４５７Ｑ、Ａ４９２Ｓ、Ｄ４９９ＥおよびＹ５３３Ｆを、ＡＡＶ−ＴＴキャプシド上で工学的に作製し、これらの残基の役割を示すために、この突然変異したベクターを、これまでの記載に従って分析することができる。さらなる実施形態では、ウイルスの輸送に関与する可能性が高い、ＶＰ１／ＶＰ２の一次配列中に存在する４つのアミノ酸を、ＡＡＶ−ＴＴ中で復帰させて、ＡＡＶ２ＷＴの対応する残基（Ｉ１２５Ｖ、Ａ１５１Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ２０５Ｔ）に戻し、同様に分析することができる。
（実施例４）
その他の血清型におけるバリアントＡＡＶベクターの構築
また、ＡＡＶ２以外のその他の血清型の状況における、ｔｔＡＡＶ２に特異的なアミノ酸変化の機能も決定することができる。
主要なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０のキャプシドのアミノ酸配列を、例えば、図９に示すように、ｔｔＡＡＶ２に由来する配列と整列させることができる。これにより、どのｔｔＡＡＶ２に特異的なアミノ酸が、その他の血清型中で同じ位置においてすでに存在するかを同定するのが可能になる。次いで、種々の血清型中の関連する残基を、ｗｔＡＡＶ２中の対応する残基に突然変異させる。これらの変化は、それぞれの血清型の効率および体内分布について、ｔｔＡＡＶ２に特異的な残基の重要性を示す。
上記で論述したように、次いで、ＧＦＰを発現する、種々の突然変異したベクターを、ＣＤ１新生仔マウス中への頭蓋内（ＩＣ）注射による第１のスクリーニングに供する。次いで、注射した脳中で得られるＧＦＰのシグナルを、適切なＧＦＰ発現血清型対照から得られるシグナルと比較する。同定したアミノ酸をそれらの対応するＡＡＶ２残基に突然変異させた場合のＧＦＰの発現の減少または増加により、これらの特定の位置におけるこれらの特定の残基の重要性が示される。適切な場合には、次いでさらに、注射した脳を、切片化し、免疫組織化学的検査により分析する。加えて、ベクターの体内分布を評価し、それを元々の突然変異していない対応物と比較するために、選ばれた突然変異血清型に対しては、新生仔マウス内への静脈内（ＩＶ）注射による分析も行う。
さらなる実施形態では、ｔｔＡＡＶ２中で同定した、関連するアミノ酸を、主要な突然変異として、その他の主たる血清型中に、関連する位置に挿入する。ｔｔＡＡＶ２に特異的な残基をその他のＡＡＶのサブタイプ中に挿入することによって、各血清型の形質導入および体内分布のプロファイルを改善することが可能になる。
（実施例５）
その他のＡＡＶの血清型中で保存されているｔｔＡＡＶ２に特異的な残基の、対応するＡＡＶ２残基への改変
最初に、現存するアデノ随伴血清型のキャプシドのアミノ酸配列を、ｔｔＡＡＶ２に由来する配列と比較分析することにより、その他の血清型中で保存されているｔｔＡＡＶ２に特異的な残基を同定することができた（図９を参照されたい）。これらの残基は、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｓ３１２、Ｇ５４８、Ｓ５８５およびＴ５８８からなる。ＡＡＶ２以外の血清型のそれぞれが、これらの残基のうちの１つ、またはいくつかからなる組合せを、その配列中の対応するアミノ酸の位置に含有する。
特定の実施形態では、種々の血清型中のこれらの残基のそれぞれを、対応する、野生型ＡＡＶ２のアミノ酸に変換し、これらの新たな突然変異体の形質導入効率を試験する。
１）ＡＡＶ１血清型の改変
ＡＡＶ１は、残基：Ｓ２０５、Ｇ５４９、Ｓ５８６およびＴ５８９を含有し、これらは、ｔｔＡＡＶ２中では、以下の残基：Ｓ２０５、Ｇ５４８、Ｓ５８５およびＴ５８８に対応する。ＡＡＶ１に由来するＶＰ１単量体を、ＡＡＶ２に由来するＶＰ１と三次元で整列させると、ｗｔＡＡＶ２中の対応する残基、すなわち、Ｔ２０５、Ｅ５４８、Ｒ５８５およびＲ５８８が、３Ｄ構造上の完全に一致する位置にあることを確認することができた（図２１）。したがって、我々は、ＡＡＶ１中のｔｔＡＡＶ２に特異的な残基のそれぞれを、対応する野生型ＡＡＶ２対応物に変換しても、タンパク質の三次元構造には影響が及ばないことは意義深いと結論付けた。特定の実施形態では、以下の突然変異：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒ、Ｔ５８９Ｒを、ＡＡＶ１のキャプシド配列中に作製する。
２）ＡＡＶ５血清型の改変
ＡＡＶ５は、残基：Ｇ５３７、Ｓ５７５およびＴ５７８を含有し、これらは、ｔｔＡＡＶ２中では、以下の残基：Ｇ５４８、Ｓ５８５およびＴ５８８に対応する。ＡＡＶ２中の残基：Ｒ５８５およびＲ５８８は、３Ｄ構造上でＡＡＶ５中のＳ５７５およびＴ５７８と一致する位置にある。三次元構造によると、ＡＡＶ２中の残基Ｅ５４８は、ＡＡＶ５中の残基Ｇ５３７と完全には一致しなかった（図２２）が、それでも我々は、両方の残基が空間的に比較的近いので、研究にそれを含めることを決めた。したがって、特定の実施形態では、以下の突然変異：Ｇ５３７Ｅ、Ｓ５７５Ｒ、Ｔ５７８Ｒを、ＡＡＶ５のキャプシド配列中に作製する。
３）ＡＡＶ６血清型の改変
ＡＡＶ６は、残基：Ｓ２０５、Ｇ５４９、Ｓ５８６およびＴ５８９を含有し、これらは、ｔｔＡＡＶ２中では、以下の残基：Ｓ２０５、Ｇ５４８、Ｓ５８５およびＴ５８８に対応する。ｗｔＡＡＶ２中の対応する残基、すなわち、Ｔ２０５、Ｅ５４８、Ｒ５８５およびＲ５８８は、ＶＰ１の３Ｄ構造上の完全に一致する位置にある（図２３）。したがって、特定の実施形態では、以下の突然変異：Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒ、Ｔ５８９Ｒを、ＡＡＶ６のキャプシド配列中に作製する。
４）ＡＡＶ８血清型の改変
ＡＡＶ８は、残基：Ｓ３１５およびＴ５９１を含有し、これらは、ｔｔＡＡＶ２中では、以下の残基：Ｓ３１２およびＴ５８８に対応する。ｗｔＡＡＶ２中の対応する残基、すなわち、Ｎ３１２およびＲ５８８は、ＶＰ１の３Ｄ構造上の完全に一致する位置にある（図２４）。したがって、特定の実施形態では、以下の突然変異：Ｓ３１５Ｎ、Ｔ５９１Ｒを、ＡＡＶ８のキャプシド配列中に作製する。
一実施形態では、ＴＴ ＡＡＶ２中のＳ３１２Ｎの突然変異がもたらす形質導入効率の改善を、アミノ酸変化Ｓ３１５Ｎを適用することによって、ＡＡＶ８血清型に移入することができる。
ＡＡＶ８のキャプシド配列を、部位特異的変異誘発により突然変異させ、それにより、ＡＡＶ８−Ｓ３１５Ｎベクタープラスミドを作り出した。このプラスミドを使用して、ＩＴＲ含有ＣＭＶ−ＧＦＰ導入遺伝子を発現する組換えＡＡＶ８−Ｓ３１５Ｎベクターを、２９３Ｔ細胞の二重トランスフェクションにより生成した。次いで、ベクターを、細胞溶解液および収集した培養物の上清から、ＡＶＢセファロース樹脂を使用するＦＰＬＣ親和性クロマトグラフィーにより精製した。キャプシドのタイターおよびベクターのゲノムのタイターをそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｑＰＣＲにより評価した。
ＧＦＰを発現する、突然変異ＡＡＶ８−Ｓ３１５Ｎベクターを、ＣＤ１新生仔マウス中への全身注射によりスクリーニングする。タイターをマッチさせたＡＡＶ８ベクターを、対照として使用する。次いで、２×１０１１ｖｇの頚静脈内注射の後に種々の臓器中に得られるＧＦＰの発現を、主として、ＡＡＶ８がある程度強力な形質導入効率をすでに示している肝臓に焦点を当てて分析する。
５）ＡＡＶ９血清型の改変
ＡＡＶ９は、残基：Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｇ５４９およびＳ５８６を含有し、これらは、ｔｔＡＡＶ２中では、以下の残基：Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｇ５４８およびＳ５８５に対応する。ＡＡＶ２中の対応する残基、すなわち、Ａ１６２、Ｔ２０５、Ｅ５４８およびＲ５８５、は、ＶＰ１の３Ｄ構造上の完全に一致する位置にある（図２５）。したがって、特定の実施形態では、以下の突然変異：Ｓ１６２Ａ、Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９ＥおよびＳ５８６Ｒを、ＡＡＶ８のキャプシド配列中に作製する。
６）ＡＡＶｒｈ１０血清型の改変
ＡＡＶｒｈ１０は、残基Ｇ５５１を含有し、これは、ｔｔＡＡＶ２ではＧ５４８に対応する。この残基および位置が種々の血清型の間で保存されているように見える状況を考慮すると、ＡＡＶｒｈ１０中のＧ５５１は、三次元的にはｗｔＡＡＶ２中のＥ５４８と整列されることが推測される。したがって、一実施形態では、以下の突然変異：Ｇ５５１Ｅを、ＡＡＶｒｈ１０のキャプシド配列中に作製する。
７）ＡＡＶ３Ｂ血清型およびＡＡＶ−ＬＫ０３血清型の改変
ＡＡＶ８血清型と同様に、ＡＡＶ３Ｂ血清型もまた、キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列を、ＡＡＶ−ＴＴに由来する配列と整列させると、内部セリンを３１２位に含有することが観察された（図３８のＡＡＶ３Ｂキャプシドの配列を参照されたい）。
新たに記載されているＬＫ０３ＡＡＶベクターは、Ｍ．Ａ．ＫａｙがＤＮＡシャフリングにより工学的に作製した、５つの異なる親ＡＡＶキャプシドから構成されるキメラのキャプシドであり、これもまた、残基Ｓ３１２をキャプシドの内側に含有する（Ｌｉｓｏｗｓｋｉら、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｌｉｖｅｒ ｍｏｄｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ、５０６、３８２〜３８６（２０１４）を参照されたい）。ＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドの配列は、ＷＯ２０１３／０２９０３０に開示されており、図３９に示す。
したがって、さらなる実施形態では、ＡＡＶ３ＢベクターおよびＡＡＶ−ＬＫ０３ベクターを、両方のベクター中にアミノ酸変化Ｓ３１２Ｎを適用することによって突然変異させる。これらの新たな突然変異体およびそれらの対応するＡＡＶの対照の血清型もまた、新生仔マウス中への頚静脈内注射により試験する。次いで、種々の収集臓器中で得られるＧＦＰの発現を分析する。
（実施例６）
ＡＡＶの血清型間で移入可能であるｔｔＡＡＶ２に特異的なアミノ酸の同定
さらなる実施形態では、ｔｔＡＡＶ２の特徴付けの間に同定した主要なアミノ酸を、その他の主たる血清型中に、関連する位置に挿入する。次いで、新たに工学的に作製したベクターを、突然変異していない適切な血清型を対照として使用して試験する。これにより、血清型とは独立に、個々のアミノ酸の、ＡＡＶキャプシド上の特定の位置における重要性についての妥当性が確認される。
１）残基：Ｓ５８５、Ｔ５８８、Ｓ３１２、Ｄ５４６、Ｇ５４８およびＳ５９３
ＡＡＶ１、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６は、ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８、Ｓ５８５およびＴ５８８に対応する同じアミノ酸残基を、それらのキャプシドタンパク質配列中の位置に天然に含有する。したがって、さらなる実施形態では、ｔｔＡＡＶ２中に存在するその他の残基：Ｓ３１２、Ｄ５４６およびＳ５９３を含めるために、これらの血清型中のキャプシドタンパク質を、一致する位置において突然変異させる。同様に、ＡＡＶ８は、ｔｔＡＡＶ２中のものと同じアミノ酸残基をすでに含有し、これらの位置は、ｔｔＡＡＶ２中ではＳ３１２およびＴ５８８に対応する；ＡＡＶ８もさらに突然変異させて、ｔｔＡＡＶ２中のＳ５８５、Ｄ５４６、Ｇ５４８およびＳ５９３に対応する残基を含有させる。ＡＡＶ９は、ｔｔＡＡＶ２中のＧ５４８およびＳ５８５に対応する残基をすでに含有する；ＡＡＶ９を突然変異させて、ｔｔＡＡＶ２中のＴ５８８、Ｓ３１２、Ｄ５４６およびＳ５９３に対応する残基を含める。最後に、ＡＡＶ１０は、Ｇ５４８に対応する残基をすでに含有する；ＡＡＶ１０もさらに改変してまた、Ｓ５８５、Ｔ５８８、Ｓ３１２、Ｇ５４８およびＳ５９３に対応する残基を含有させる。
２）残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３
ＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、残基Ｓ２０５をすでに天然に含有する。したがって、さらなる実施形態では、これらの血清型を、ｔｔＡＡＶ２中の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３に対応する位置において突然変異させる。同様に、ＡＡＶ９は、残基：Ｓ１６２およびＳ２０５をすでに含有する；ＡＡＶ９もさらに突然変異させて、ｔｔＡＡＶ２中のＩ１２５、Ａ１５１、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３に対応する残基を含有させる。最後に、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびＡＡＶ１０を改変して、ｔｔＡＡＶ２中のＩ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３に対応する残基をもたせる。
ｔｔＡＡＶ２中に存在する突然変異の位置、およびその他のＡＡＶの血清型の野生型キャプシドタンパク質ＶＰ１の配列中に存在する対応する残基を、下記の表１に示す。一般に、これらの血清型について表１に示す残基のうちのいずれかを突然変異させることによって、ＡＡＶ２以外のバリアントのベクターを構築することができる。斜体で示す残基は、ｔｔＡＡＶ２中に、対応する位置にすでに存在する残基である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２以外の血清型を、斜体でない字体で示す１つまたは複数の残基において突然変異させる。このようにして、ｔｔＡＡＶ２が示す好都合な特性を、代替のＡＡＶの血清型中に移入することができる
本発明のさらなる実施形態
本発明はまた、以下に要約する項に定義する追加の態様にも関する。
１．組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
（ａ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３位の１つまたは複数に対応する位置に存在する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質；ならびに
（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、組換えＡＡＶベクター。
２．（ｉ）バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号２の配列、もしくはその配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１の配列を含む、第１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
３．バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２、Ｓ２０５、Ｓ３１２、Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９、Ｙ５３３、Ｄ５４６、Ｇ５４８、Ｓ５８５、Ｔ５８８および／またはＳ５９３を含む、第２項に記載の組換えＡＡＶベクター。
４．バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２Ｓ、Ｔ２０５Ｓ、Ｎ３１２Ｓ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔおよび／またはＡ５９３Ｓを含む、第２項または第３項に記載の組換えＡＡＶベクター。
５．バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０に由来する、第１項から第３項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６．（ｉ）バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ１に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号３の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
７．バリアントＡＡＶ１キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ１キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／もしくはＧ５９４Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／もしくはＴ５８９Ｒ
を含む、第６項に記載の組換えＡＡＶベクター。
８．（ｉ）バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ５に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列中の１２４、１５０、１５３、１９５、３０３、４４４、４７９、４８６、５２０、５３３、５３７、５７５、５７８および／または５８３位の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
９．バリアントＡＡＶ５キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ５キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｖ１２４Ｉ、Ｋ１５０Ａ、Ｋ１５３Ｓ、Ａ１９５Ｓ、Ｒ３０３Ｓ、Ｔ４４４Ｍ、Ｓ４７９Ａ、Ｖ４８６Ｄ、Ｔ５２０Ｙ、Ｐ５３３Ｄおよび／もしくはＧ５８３Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｇ５３７Ｅ、Ｓ５７５Ｒおよび／もしくはＴ５７８Ｒ
を含む、第８項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１０．（ｉ）バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ６に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号５の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ６キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１３、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位置の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１１．バリアントＡＡＶ６キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ６キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｔ１６２Ｓ、Ｎ３１３Ｓ、Ｎ４５８Ｍ、Ｋ４９３Ａ、Ｎ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｓ５４７Ｄおよび／もしくはＧ５９４Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅ、Ｓ５８６Ｒおよび／もしくはＴ５８９Ｒ
を含む、第１０項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１２．（ｉ）バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ８に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１３．バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｔ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｎ５４９Ｄ、Ａ５５１Ｇ、Ｑ５８８Ｓおよび／もしくはＧ５９６Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｓ３１５Ｎおよび／もしくはＴ５９１Ｒ
を含む、 第１２項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１４．（ｉ）バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号７の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１４、４５８、４９３、５００、５３４、５４７、５４９、５８６、５８９および／または５９４位の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１５．バリアントＡＡＶ９キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｌ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｎ３１４Ｓ、Ｑ４５８Ｍ、Ｖ４９３Ａ、Ｅ５００Ｄ、Ｆ５３４Ｙ、Ｇ５４７Ｄ、Ａ５８９Ｔおよび／もしくはＧ５９４Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｓ１６２Ａ、Ｓ２０５Ｔ、Ｇ５４９Ｅおよび／もしくはＳ５８６Ｒ
を含む、第１４項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１６．（ｉ）バリアントＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質を含み、（ｉｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶｒｈ１０に由来し、かつ／または（ｉｖ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号８の配列を含み、
少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、３１５、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する、第５項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１７．バリアントＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶｒｈ１０キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
（ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｎ３１５Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｌ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｇ５４９Ｄ、Ｑ５８８Ｓ、Ａ５９１Ｔおよび／もしくはＧ５９６Ｓ、ならびに／または
（ｂ）Ｇ５５１Ｅ
を含む、第１６項に記載の組換えＡＡＶベクター。
１８．対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターと比較して、神経細胞組織または網膜組織の形質導入の増加を示す、第１項から第１７項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１９．遺伝子産物が、干渉ＲＮＡまたはアプタマーを含む、第１項から第１８項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２０．遺伝子産物がポリペプチドを含む、第１項から第１８項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２１．遺伝子産物が、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または神経細胞もしくは網膜細胞の機能を増強するポリペプチドを含む、第２０項に記載の組換えＡＡＶベクター。
２２．遺伝子産物が、グリア由来の神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、脳由来の神経栄養因子、ロドプシン、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、またはペリフェリンを含む、第２１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
２３．（ａ）第１項から第２２項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター、および
（ｂ）薬学的に許容できる賦形剤
を含む医薬組成物。
２４．遺伝子産物を対象中の神経細胞組織または網膜組織に送達するための方法であって、第１項から第２３項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
２５．神経学的障害または眼障害を治療するための方法であって、第１項から第２４項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
２６．神経学的障害または眼障害を治療する際に使用するための、第１項から第２３項のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
２７．神経学的障害が、神経変性疾患である、第２４項から第２６項のいずれかに従って使用するための方法、組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
２８．眼障害が、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症または糖尿病性網膜症である、第２４項から第２６項のいずれかに従って使用するための方法、組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
２９．単離バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２、２０５、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／もしくは５９３位の１つもしくは複数において、または代替のＡＡＶキャプシドタンパク質配列中の１つもしくは複数の対応する位置に存在する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、単離バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質。
３０．第２９項の定義に従うバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
３１．第３０項の定義に従う核酸を含む単離宿主細胞。
配列番号１は、野生型アデノ随伴ウイルス２キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図１を参照されたい）。
配列番号２は、真性型アデノ随伴ウイルス２（ｔｔＡＡＶ２）キャプシドタンパク質のアミノ酸配列である（図２を参照されたい）。
配列番号３は、野生型アデノ随伴ウイルス１キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図３を参照されたい）。
配列番号４は、野生型アデノ随伴ウイルス５キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図４を参照されたい）。
配列番号５は、野生型アデノ随伴ウイルス６キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図５を参照されたい）。
配列番号６は、野生型アデノ随伴ウイルス８キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図６を参照されたい）。
配列番号７は、野生型アデノ随伴ウイルス９キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図７を参照されたい）。
配列番号８は、野生型アデノ随伴ウイルス１０Ｕｐｅｎｎキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図８を参照されたい）。
配列番号９は、野生型アデノ随伴ウイルス１０ｊａｐａｎｅｓｅキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図９を参照されたい）。
配列番号１０は、図９に示す、アデノ随伴ウイルスについてのコンセンサスアミノ酸配列である。
配列番号１１は、野生型アデノ随伴ウイルス３Ｂキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図３８を参照されたい）。
配列番号１２は、アデノ随伴ウイルスＬＫ−０３キャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列である（図３９を参照されたい）。

Claims (39)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ａ）野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の４５７、４９２、４９９および５３３位に存在する少なくとも４つのアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質、ならびに
    （ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、組換えＡＡＶベクター。
  2. （ｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号２の配列、もしくはその配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または（ｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
  3. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｍ４５７、Ａ４９２、Ｄ４９９およびＹ５３３を含む、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
  4. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９ＤおよびＦ５３３Ｙを含む、請求項２または３に記載の組換えＡＡＶベクター。
  5. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６２および２０５位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  6. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｉ１２５、Ａ１５１、Ｓ１６２およびＳ２０５の１つまたは複数を含む、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
  7. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２ＳおよびＴ２０５Ｓを含む、請求項５または６に記載の組換えＡＡＶベクター。
  8. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の５８５および５８８位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  9. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｓ５８５およびＴ５８８の１つまたは複数を含む、請求項８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  10. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｒ５８５ＳおよびＲ５８８Ｔを含む、請求項８または９に記載の組換えＡＡＶベクター。
  11. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列中の５４６、５４８および５９３位に１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  12. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、１つまたは複数の以下の残基：Ｄ５４６、Ｇ５４８およびＳ５９３の１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の組換えＡＡＶベクター。
  13. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８ＧおよびＡ５９３Ｓを含む、請求項１１または１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
  14. バリアントＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、残基Ｎ３１２を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  15. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ａ）野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の３１５位にアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質、および
    （ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、組換えＡＡＶベクター。
  16. （ｉ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または（ｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号６の配列を含む、請求項１５に記載の組換えＡＡＶベクター。
  17. バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１５Ｎを含む、請求項１５または１６に記載の組換えＡＡＶベクター。
  18. ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列中の１２５、１５１、１６３、２０６、４６０、４９５、５０２、５３６、５４９、５５１、５８８、５９１および／または５９６位の１つまたは複数に存在する１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１５から１７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  19. バリアントＡＡＶ８キャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と比べて、１つまたは複数の以下のアミノ酸置換：
    （ａ）Ｖ１２５Ｉ、Ｑ１５１Ａ、Ｋ１６３Ｓ、Ａ２０６Ｓ、Ｔ４６０Ｍ、Ｔ４９５Ａ、Ｎ５０２Ｄ、Ｆ５３６Ｙ、Ｎ５４９Ｄ、Ａ５５１Ｇ、Ｑ５８８Ｓおよび／もしくはＧ５９６Ｓ；ならびに／または
    （ｂ）Ｔ５９１Ｒ
    を含む、請求項１８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  20. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ａ）野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質と比べて、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質配列中の３１２位にアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質、および
    （ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、組換えＡＡＶベクター。
  21. （ｉ）バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質が、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または（ｉｉ）野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号１１の配列を含む、請求項２０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  22. バリアントＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質と比べて、アミノ酸置換Ｓ３１２Ｎを含む、請求項２０または２１に記載の組換えＡＡＶベクター。
  23. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ａ）配列番号１２の定義に従うＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質配列と比べて、３１２位にアミノ酸置換を含む、バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質、および
    （ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、組換えＡＡＶベクター。
  24. バリアントＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドタンパク質が、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２３に記載の組換えＡＡＶベクター。
  25. 組換えＡＡＶベクターが、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターと比較して、神経細胞組織または網膜組織の形質導入の増加を示す、請求項１から１４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  26. 組換えＡＡＶベクターが、対応する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、肝臓組織の形質導入の増加を示す、請求項１５から２４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  27. 遺伝子産物が、干渉ＲＮＡまたはアプタマーを含む、請求項１から２６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  28. 遺伝子産物がポリペプチドを含む、請求項１から２７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  29. 遺伝子産物が、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または神経細胞もしくは網膜細胞の機能を増強するポリペプチドを含む、請求項２８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  30. 遺伝子産物が、グリア由来の神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、脳由来の神経栄養因子、ロドプシン、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、またはペリフェリンを含む、請求項２９に記載の組換えＡＡＶベクター。
  31. （ａ）請求項１から３０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター、および
    （ｂ）薬学的に許容できる賦形剤
    を含む医薬組成物。
  32. 遺伝子産物を対象中の組織に送達するための方法であって、請求項１から３１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
  33. 組織が、血液、骨髄、筋肉組織、神経細胞組織、網膜組織、膵臓組織、肝臓組織、腎臓組織、肺組織、腸組織または心臓組織から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 組織が、神経細胞組織、網膜組織または肝臓組織である、請求項３３に記載の方法。
  35. 対象中の障害を治療するための方法であって、請求項１から３１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
  36. 対象中の障害を治療する際に使用するための、請求項１から３１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
  37. 障害が、神経学的障害、眼障害または肝臓障害である、請求項３５または３６に記載の使用するための方法、組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
  38. 神経学的障害が、神経変性疾患である、請求項３７に記載の使用するための方法、組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
  39. 眼障害が、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症または糖尿病性網膜症である、請求項３７に記載の使用するための方法、組換えＡＡＶベクターまたは医薬組成物。
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