KR102051393B1 - 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터 및 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터를 동시 형질주입하여, 암세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는 AAV 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다. 상기 재조합 벡터 시스템은 암질환 치료용 표적 유전자를 이용하여 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물{A recombinant vector for adeno-associated virus based gene delivery and a composition for preventing or treating cancer using the same}
본 발명은 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재 통계청 자료에 따르면, 한국인의 사망 원인 중 암으로 인한 사망이 1위를 차지하고 있다. 암이란 일반적으로 인체 조직을 이루고 있는 세포 주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고 세포분열을 계속하는 질환으로, 개시(initiation), 촉진(promotion) 및 진행(progression)의 세 단계를 거쳐 발생한다. 암의 원인은 환경이나 음식물 속에 포함된 발암 물질에 의해 정상적인 세포의 유전자나 암 억제 유전자에 돌연변이가 일어나고 이러한 세포들이 발암 물질의 계속적인 자극을 받으면서 비 정상적으로 증식하여 암 조직을 형성하는 것으로 알려져 있으나, 암의 발생 원인에 대해서는 아직도 명확하게 밝혀진 바가 없다.
암은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)로 구분되어지는데, 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되어지는 전이(metastasis)가 되지 않는 것에 반해 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르는 아주 중요한 원인이 된다.
암질환 중 폐암은 19세기까지만 해도 매우 드문 질환이었으나 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 발병률이 급격하게 증가하고 있다. 2002년 한국중앙암등록본부 연례 보고서에 의하면 전체 암 발생은 99,025건으로 이중 기관지 및 폐에서의 암은 11,741명으로 2위(11.9%)를 차지한 바 있다. 연령별로는 60대가 38.6%로 가장 많고, 70대가 27.9%, 50대가 18.9%의 순이며, 성별로는 남성이 8,876명, 여성이 2,865명으로 남성이 여성보다 3배 이상 높게 발병하는 것으로 보고된 바 있다.
암의 치료를 위해서는 수술 요법, 방사선 치료 요법 및 화학요법 등이 사용되고 있으나 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그에 따른 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하더라도 미세하게 전이된 암 세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 다양한 항암제의 개발에도 불구하고 항암제를 이용한 암 치료 시, 항암제에 대한 암세포 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 항암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증식하기 때문이다.
최근 화학요법으로 일부 유전자를 타겟으로 하는 항체 치료제 및 특이적 저분자 화합물이 사용되고 있다. 그러나 유전자 치료제의 문제점으로는 유전자가 전달된 표적 세포의 암화 가능성, 숙주(인체)의 면역반응을 유도함으로써 야기되는 의도치 않은 이상반응, 유전자 발현량이나 발현기간 조절 문제로 인한 치료 효과 저하 등을 들 수 있다. 따라서 암질환 치료를 위한 유전자 치료제 개발 시, 야기되는 문제점들을 해결하고 치료 효과를 향상시킬 수 있는 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제 10-2016-0130996호 (2016.11.15 공개)
본 발명의 목적은 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 및 이를 이용한 암질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며, 암세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 아데노부속바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노부속바이러스를 포함하는 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터 및 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터를 동시 형질주입하여, 암세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는 AAV 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다. 상기 재조합 벡터 시스템은 암질환 치료용 표적 유전자를 이용하여 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)의 역가를 확인한 것이다.
도 2는 다양한 세포주[정상세포(293A), 정상폐세포(L132), 비소세포성폐암세포(H1299), 세기관지암(H358), 섬유육종(HT1080)]에서 Galectin-1의 mRNA 발현량을 확인한 것이다.
도 3은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-Gal1-Cre)의 역가를 확인한 것이다.
도 4는 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)로 정상세포주(293A) 및 암세포주(HT1080)를 감염시킨 후, 세포사멸 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 5는 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)로 폐암세포주(H358, H1299)를 감염시킨 후, 세포사멸 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이다.
도 6은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)로 암세포주(HT1080)를 감염시킨 후, 세포사멸 효과를 TUNEL 분석으로 확인한 것이다.
도 7은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)로 폐암세포주(H358)를 감염시킨 후, 세포사멸 효과를 TUNEL 분석으로 확인한 것이다.
도 8은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP)로 폐암세포주(H358) 및 암세포주(HT1080)를 감염시킨 후, 세포사멸 효과를 DNA 분절(fragmentation)로 확인한 것이다.
도 9는 ICR 마우스에 AAV 재조합 바이러스(GT513)을 단회 투여 후, 폐 조직의 독성을 조직병리학으로 확인한 것이다.
도 10은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 11은 AAV 재조합 바이러스(pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 12는 AAV 재조합 바이러스(pAAV-Gal1-Cre) 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 Cre/LoxP 시스템을 이용하여 암세포에 특이적인 Gal1 프로모터를 가지며 Cre를 발현하는 pAAV-Gal1-Cre 벡터를 클로닝하고, Cre 단백질에 반응하여 GFP를 발현하는 pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 벡터를 클로닝한 후, pAAV-Gal1-Cre와 pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 바이러스를 동시 형질주입한 결과, Gal1 특이적인 암세포에서 BAK 또는 Bmal1을 장기간 발현하는 것을 확인하며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며, 암세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 시스템을 제공한다.
상기 제 1 재조합 발현 벡터는 도 10 또는 도 11의 개열지도를 가질 수 있으며, 상기 제 2 재조합 발현 벡터는 도 12의 개열지도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 발현 목적 유전자는 암질환 치료용 표적 유전자일 수 있으며, 상기 표적 유전자는 BAK 또는 Bmal1 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 발현 목적 유전자를 포함하고, 상기 발현 목적 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및 AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 암세포에 특이적으로 상기 발현 목적 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 아데노부속바이러스를 제공한다.
상기 재조합 아데노부속바이러스는 암세포에 특이적으로 발현 목적 유전자를 장기 발현할 수 있다.
상기 발현 목적 유전자는 암질환 치료용 표적 유전자일 수 있으며, 상기 표적 유전자는 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 BAK 또는 Bmal1 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노부속바이러스를 유효성분으로 포함하는 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암질환은 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 세기관지암, 섬유육종, 간암, 위암, 대장암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노부속바이러스를 유효성분으로 포함하는 암질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 암세포에 특이적인 치료용 유전자의 탐색 및 발굴
1-1. 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 기반 벡터 및 재조합 바이러스 제조
(1) pAAV-CMV-Cre 벡터 제작
Cre 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 서열분석(sequencing)을 통해 Cre 유전자의 염기서열을 확인한 후, pAAV-CMV 벡터에 삽입하여 pAAV-CMV-Cre 벡터를 클로닝하였다.
(2) 바이러스 패키징
pAAV-CMV-Cre 벡터와 AAV 패키징 구조물(packaging construct) (Grimm, D. et al. (2008). J. Virol. 82: 5887-5911.)을 함께 293 세포에 형질주입(transfection)하여 Cre를 발현하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
1-2. pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 및 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 재조합 바이러스 제조
(1) pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 및 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 벡터 제작
유전자의 장기 발현을 유도하는 것으로 알려진 EF1a 프로모터에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 서열분석을 통해 EF1a의 염기서열을 확인한 후, pAAV 벡터에 삽입하여 pAAV-EF1a-MCS 벡터를 클로닝하였다.
또한, 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것으로 알려진 BAK1 및 Bmal1 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이전 연구에서 사용한 df 시스템(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb. 2007, p. 1126-1135.)에 유전자를 삽입하여 pAAV-dfBAK-IRES-GFP 및 pAAV-dfBmal1-IRES-GFP를 클로닝하였다. dfBAK-IRES-GFP 및 dfBmal1-IRES-GFP 유전자에 대한 프라이머로 PCR을 수행하여 서열을 얻은 후 제한효소를 이용하여 pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 및 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 벡터를 제작하였다.
(2) 바이러스 패키징
pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 벡터 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 벡터와 AAV 패키징 구조물을 함께 293 세포에 형질주입하여 두 가지 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
(3) AAV 재조합 바이러스의 적정 시험
AAV 재조합 바이러스의 적정(titration)을 측정하기 위해, 본 발명의 재조합 바이러스가 가지는 EF1a 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 수행하였다.
Standard는 AAV 구조 DNA를 복제(copy) 수로 환산하여 109에서 105까지 CT 값을 통해 표준곡선(p=0.9991)을 구한 후, AAV로부터 gDNA를 추출하여 AAV 재조합 바이러스의 적정을 측정하였다.
그 결과, 도 1을 참조하여 보면, mL 당 2.5 X 1012 및 2.6 X 1012의 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 암세포 치료용 표적 지향성 AAV 기반 재조합 바이러스의 제조
Cre/LoxP 시스템(대한내분비학회지: 제21권 제5호 2006)을 이용하여 암세포 특이적인 Galectin-1 프로모터를 가지며 Cre를 발현하는 pAAV-Gal1-Cre 벡터를 클로닝하였다. 상기 바이러스가 형질주입되는 경우, Gal-1 특이적인 암세포에서 Cre를 발현하는 특성을 가지게 된다.
2-1. 폐암 특이적 과발현 유전자 발굴
(1) 정상세포주 및 암세포주에서 Galectin-1 발현 분석
Gal-1이 암세포에서 특이적으로 발현하는지 여부를 확인하기 위해, 다양한 세포주[정상세포(293A), 정상폐세포(L132), 비소세포성폐암세포(H1299), 세기관지암(H358), 섬유육종(HT1080)]에서 Gal-1 mRNA 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 2를 참조하여 보면, 정상세포에 비해 암세포에서 Gal-1이 약 5배 내지 20배 높게 발현되는 것을 확인하였다.
(2) pAAV-Gal1-Cre 벡터 제작
상기 실험으로부터 Gal-1이 암세포에 특이적으로 발현되는 것을 확인하고, 이를 통해 암세포에 특이적인 프로모터로 Gal-1을 선택하였다. Gal-1 프로모터에 대한 프라이머로 PCR을 수행하여 서열을 확보한 후, 이를 CMV 프로모터가 제거된 pAAV-CMV-Cre 벡터에 삽입하여 pAAV-Gal1-Cre 벡터를 클로닝하였다.
(3) 바이러스 패키징
pAAV-Gal1-Cre 벡터와 AAV 패키징 구조물을 293 세포에 형질주입하여 pAAV-Gal1-Cre 재조합 바이러스를 제조하였다. 이후 Sucrose gradient 방법으로 바이러스를 정제하여 고농도의 재조합 바이러스를 획득하였다.
(4) AAV 재조합 바이러스의 적정 시험
AAV 재조합 바이러스의 적정을 측정하기 위해, AAV가 가지는 역 말단 반복부위(inverted terminal repeats; ITR)에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
Standard는 AAV 구조 DNA를 복제수로 환산하여 109에서 105까지 CT 값을 통해 표준곡선(p=0.9954)을 구한 후, AAV로부터 gDNA를 추출하여 AAV 재조합 바이러스의 적정을 측정하였다.
그 결과, 도 3을 참조하여 보면, mL 당 2.4 X 1012의 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
(5) 세포 내 실험을 통한 표적 지향성 유전자 치료용 바이러스의 효력 검증
정상세포주(293A)와 암세포주(HT1080, H365, H1299)를 pAAV-Gal1-Cre 벡터와 pAAV-EF1a-dfBAK 벡터 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1 벡터로 동시 감염시킨 후, 6일째에 MTT 분석을 수행하여 세포사멸 효력을 비교하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5를 참조하여 보면, 폐암세포를 포함한 모든 암세포에서 pAAV-Gal1-Cre 벡터와 pAAV-EF1a-GFP 벡터를 동시 감염시킨 대조군과 비교하였을 때, pAAV-Gal1-Cre 벡터와 pAAV-EF1a-dfBmal1 벡터를 동시 감염시킨 경우 통계적으로 유의한 세포사멸 효력을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 정상세포인 293A 세포에서는 차이를 보이지 않았다. 또한, pAAV-Gal1-Cre 벡터와 pAAV-EF1a-dfBAK 벡터를 동시 감염시킨 경우, 폐암세포인 H358 세포에서 약간의 세포사멸 효력을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았고, 다른 폐암세포와 암세포 그리고 정상세포에서 세포사멸 효력의 차이를 나타내지 않았다.
세포죽음이 세포사멸에 의한 현상인지 여부를 확인하기 위해, 암세포주(HT1080, H358)를 pAAV-Gal1-Cre 벡터와 pAAV-EF1a-dfBAK-IRES-GFP 벡터 또는 pAAV-EF1a-dfBmal1-IRES-GFP 벡터로 동시 감염시킨 후, 6일째에 TUNEL 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7을 참조하여 보면, 대조군과 비교하였을 때 폐암세포인 HT1080 세포와 H358 세포 모두에서 BAK 및 Bmal1에 의한 세포사멸 현상인 형광 세포가 다수 관찰되었다.
세포사멸에 의한 현상을 추가적으로 확인하기 위해, 상기 시료를 이용하여 DNA 분절(fragmentation)을 측정한 결과, 도 8을 참조하여 보면, HT1080 세포와 H358 세포 모두에서 BAK 및 Bmal1에 의한 세포사멸 현상인 DNA 분절이 관찰되었다.
상기 결과를 통해 BAK 및 Bmal1이 세포사멸에 의한 세포죽음을 초래하고, 상기와 같은 작용이 폐암세포 뿐만아니라 다른 암세포에서도 효력을 보일 수 있음을 확인하였다. 또한, 암 특이적 프로모터를 이용하여 세포사멸 효력을 암세포 특이적으로 조절할 수 있음을 증명하였다.
실시예 3 : 마우스 모델에서 표적 지향성 유전자 치료용 AAV 기반 재조합 바이러스의 안전성 검증 시험
다음으로 시험물질인 AAV-EF1a-dfBmal1(GT513)의 예상되는 치료 용량을 ICR 마우스에 단회 정맥 투여하였을 때 나타나는 독성을 검사하여 안전성 여부를 파악하고, 최대 내성용량( maximal tolerated dose; MTD)을 확보하고자 동물실험을 수행하였다.
3-1. 시험군에 대한 정보
시험군에 대한 정보는 하기 표 1과 같다.
투여기간 군 구성
 용량
(genome copies)		 투여액량
(μL/head)		 투여경로 동물수
수컷
단회투여
 G1 PBS 0 125 미정맥
 5
G2 AAV(GT513) 5 X 1011 125 5
3-2. 시험방법 및 평가항목
(1) 체중측정
모든 동물에 대하여 투여 전(군 분리 시), 투여 개시 이후 4일차, 7일차, 10일차, 14일차에 체중을 측정하고, 부검일(15일차)에는 12시간 절식시킨 후 체중을 측정하였다.
그 결과, 총 14일의 시험기간 동안 모든 군에서 체중 변화는 관찰되지 않았고, AAV(GT513)군은 대조군과 비슷한 양상으로 정상적인 체중 증가를 보이며 유의적 차이를 나타내지 않았다.
(2) 일반증상 관찰
모든 동물에 대하여 투여 및 관찰기간 동안 사망 여부, 일반증상의 종류, 발현일, 증상의 정도를 1일 1회 이상 관찰하였다. 투여 개시일은 1일로 설정하고, 투여기간 중 빈사 또는 사망 동물 발견 시, 즉시 부검을 실시하여 내부 장기를 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 총 14일의 시험기간 동안 시험물질 투여로 인한 사망 개체는 관찰되지 않았고, 관찰기간 동안 시험물질 처치군인 AAV(GT513)군과 대조군에서 유의할 만한 이상증상도 관찰되지 않았다.
(3) 사료 섭취량 측정
모든 동물에 대하여 사료 섭취량은 투여 개시일인 1일차, 투여 개시 이후 4일차, 7일차, 10일차에 공급량을 측정하고, 익일에 공급과 동일한 시간대에 잔량을 측정하여 일일 섭취량을 산출하였다.
그 결과, 투여 개시일, 투여 후 4일차, 7일차, 10일차의 일일 사료 섭취량을 비교해 보면, AAV(GT513)군은 대조군 대비 약간 낮은 섭취량을 보였고, 투여 7일차에 AAV(GT513)군은 일시적으로 유의한 감소를 나타내긴 하였으나, 시험기간 동안 체중감소를 동반하지 않았으며, 발생 빈도 또한 단발성으로 확인되어 시험물질 투여와는 연관성이 없는 것으로 판단하였다.
(4) 혈액학적검사(CBC) 및 혈액생화학검사(serum biochemistry)
혈액학적검사 및 혈액생화학적검사를 위해, 동물을 부검 전에 12시간 동안 절식시키고, 부검일에 개복 후 복대정맥에서 채혈을 실시하였다.
검사항목 혈액량 튜브
혈액학적검사 약 0.2 mL EDTA-2K CBC bottle
혈액생화학적검사 약 0.4 mL 이상 1.5 mL eppendorf tube
- 혈액학적검사: 채혈한 혈액 중 약 0.2 mL을 항응고제인 EDTA-2K가 들어있는 CBC bottle(Vacutainer 1.5 mL, BD, USA)에 주입한 후, 자동혈액분석기(ADVIA 2120, SIEMENS, USA)를 이용하여 적혈구수(RBC), 백혈구수(WBC), 혈색소량(HGB), 헤마토크리트치(HCT), RBC indices로서 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC), 혈소판수(PLT)를 측정하였다.
- 혈액생화학검사: 채혈한 혈액의 일부를 1.5 mL eppendorf tube(INSEPACK, SEKISUI, JAPAN)에 주입하고 15-20분간 실온에 방치하여 응고시킨 후, 10분간 원심분리(3,000 rpm, 1,630 RCF, MF300, Hanil, Korea)하여 얻은 혈청으로 혈액생화학분석기(Accute TBA-40FR, Toshiba Medical System Co., Japan)를 이용하여 urea nitrogen(BUN), creatinine(CREA), AST(GOT, Glutamate Oxaloacetate Transaminase), ALT(GPT, Glutamate Pyruvate Transaminase)를 측정하였다.
혈액학적검사 결과, 대조군과 비교하였을 때 AAV(GT513)군에서 백혈구수에 한하여 유의적인 감소를 보였으나, 이 외 지표인 적혈구수, 헤모글로빈치, 헤마토크리트치, 적혈구지수, 혈소판 수치에서는 통계적 유의성이 관찰되지 않았다.
혈액생화학검사 결과, AAV(GT513)군은 신장 손상 지표인 BUN과 creatine에서 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았고, 간세포 손상의 지표인 GOT와 GPT에서 약간 낮은 경향을 보였으나 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다. 선행연구 결과, ICR 마우스에서 백혈구 정상수치 범위는 5.0~13.7(X 103 세포/μL)로 보고된 바 있고, 5~7주령의 ICR 마우스에서 백혈구 정상수치 범위가 2.11~3.60으로 보고된 바 있어, AAV(GT513)군의 백혈구 수치는 대조군과 유의적 차이를 보였으나 정상 생리활성수준의 변화로 판단하였다. 또한, GOT와 GPT의 정상수치 범위는 각각 55~251 U/L, 28~184 U/L로 보고된 바 있어, AAV(GT513)군에 확인된 GOT, GPT 수치는 정상 범위 내에서 큰 차이를 보이지 않는 변동 수준에 해당되고, 대조군 대비 통계적 유의성 또한 확인되지 않기에 시험물질에 의한 특이적 영향이 없는 것으로 판단하였다.
(6) 부검 및 장기중량 측정
부검 전날 절식한 계획부검 동물에 대하여 부검 당일에 복대정맥에서 혈액검사를 위한 채혈을 실시한 후, 복대정맥과 동맥을 절단하는 방법으로 방혈하여 안락사시켰다. 각 개체별로 내부 주요 장기에 대해 부검 소견을 관찰하고 간, 비장, 신장(좌, 우), 폐, 고환(좌, 우), 심장, 흉선, 위, 폐조직 총 9개의 장기들을 적출하여 전자저울(BP3100S, SartoriusAG, Germany)로 습중량을 측정하고, 체중에 대한 상대 장기중량을 산출하였다.
그 결과, 부검 후 AAV(GT513)군은 심장, 폐, 흉선, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 대장, 맹장 등의 내부 장기 상에서 시험물질에 의한 영향으로 판단되는 이상소견이 관찰되지 않았다. 절대 장기중량 결과에서 AAV(GT513)군은 대조군과 비교했을 때, 심장, 폐조직의 중량이 약간 감소하였으며, 흉선, 위, 간, 비장, 신장, 고환은 동등하거나 약간 증가하였으나, 이러한 차이는 경미한 수준에 해당되었고, 시험군에서 특이적인 경향성이 확인되지 않았으며, 대조군 대비 유의한 차이 또한 확인되지 않았다. 상대 장기중량 결과에서도 AAV(GT315)군은 대조군과 비교했을 때, 심장, 폐, 위, 간조직의 중량이 약간 감소하였으나, 모든 장기 수치에서 뚜렷한 증가 또는 감소 소견을 보이지 않았고, 대조군 대비 유의한 차이 또한 확인되지 않았기에 시험물질 투여와 관련된 영향은 없는 것으로 판단하였다.
(7) 폐조직 염색
조직 염색용 폐조직은 10% 포르말린 용액을 이용하여 고정시켰다. 충분한 고정 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하고 조직절편기(microtome)를 이용하여 4 μm 두께로 박절한 다음 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색을 수행한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다.
그 결과, 도 9를 참조하여 보면, 폐조직의 병리조직학적 소견에서도 바이러스혈증(viremia) 시, 관찰되는 폐렴 등의 특이적인 병변이 관찰되지 않았다.
독성은 실험물질에 의한 독성학적 변화로서 인정될 수 있는 평가항목들의 다양한 변화들이 수반되어야 하는데 본 발명에서 시험물질인 AAV(GT513)는 체중변화, 사료 섭취량, 임상증상에서 시험물질 투여와 관련된 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 부검 후 실시한 혈액학적검사와 각종 장기의 장해지표가 되는 혈액생화학검사 결과에서 백혈구 수치에 한하여 유의적 감소를 보이긴 하였으나, 다른 측정지표간 뚜렷한 변화를 보이지 않았으며, 모두 정상생리범위 내에서 변동수준에 해당되는 것으로 확인되었다. 장기 중량결과에서도 신장과 간을 포함한 모든 측정 장기에서 대조군 대비 절대·상대중량의 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 확인되어 본 실험에서 사용된 모든 지표 상에서 시험물질 AAV(GT315)는 의미있는 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여 볼 때, 본 시험조건 하에서 ICR 마우스의 시험물질 AAV(GT513)의 최대내성용량(MTD)은 5 X 1011 genome copies/head를 상회하는 것으로 판단하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 Bmal1 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및
    AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 비소세포성 폐암, 세기관지암 및 섬유육종으로 이루어진 군에서 선택된 암세포에 특이적으로 상기 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;를 포함하며,
    상기 암세포에 특이적으로 상기 유전자를 장기 발현하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 재조합 발현 벡터는 도 11의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 재조합 발현 벡터는 도 12의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 Bmal1 유전자는 암질환 치료용 표적 유전자인 것을 특징으로 하는, 아데노부속바이러스 기반 유전자 전달용 재조합 벡터 조성물.
  5. 삭제
  6. 아데노부속바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터에 EF1a 프로모터 및 Bmal1 유전자를 포함하고, 상기 유전자의 장기 발현을 유도하는 제 1 재조합 발현 벡터; 및
    AAV 벡터에 Gal1 프로모터를 포함하고, 비소세포성 폐암, 세기관지암 및 섬유육종으로 이루어진 군에서 선택된 암세포에 특이적으로 상기 유전자의 발현을 유도하는 제 2 재조합 발현 벡터;로 공동 형질감염시켜 생산된 재조합 아데노부속바이러스.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 재조합 아데노부속바이러스는 암세포에 특이적으로 Bmal1 유전자를 장기 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노부속바이러스.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 Bmal1 유전자는 암질환 치료용 표적 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노부속바이러스.
  9. 삭제
  10. 제 6항에 있어서, 상기 Bmal1 유전자는 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노부속바이러스.
  11. 제 6항의 재조합 아데노부속바이러스를 유효성분으로 포함하는 비소세포성 폐암, 세기관지암 및 섬유육종으로 이루어진 군에서 선택된 암질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 6항의 재조합 아데노부속바이러스를 유효성분으로 포함하는 비소세포성 폐암, 세기관지암 및 섬유육종으로 이루어진 군에서 선택된 암질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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