CN115087462A - 降体脂剂及具有降体脂作用的物质的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供降体脂剂及具有降体脂作用的物质的筛选方法，所述降体脂剂以Regnase‑1抑制剂为有效成分，所述筛选方法包含选择抑制Regnase‑1的表达的物质或抑制Regnase‑1的功能的物质的步骤。本发明的降体脂剂对改善代谢综合征、预防和/或治疗包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的脂肪性肝病是有用的。通过本发明的筛选方法，能够得到具有降体脂作用的有用物质。

Description

降体脂剂及具有降体脂作用的物质的筛选方法
技术领域
本发明涉及降体脂剂及具有降体脂作用的物质的筛选方法。
背景技术
现今，随着饮食习惯的变化，肥胖、糖尿病等所谓的代谢综合征不断增加，作为代谢综合征在肝脏中的表型的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease：NAFLD)也在不断增加。将在肝脏内堆积有中性脂肪的状态称为脂肪肝，将在几乎不饮酒的人群中发生的脂肪肝称为NAFLD。NAFLD中存在不会发展的经历良性过程的单纯性脂肪肝、及可能会发展成肝硬化或肝癌的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis：NASH)。作为NAFLD的原因，可列举出肥胖(内脏脂肪堆积)、糖尿病、血脂异常、高血压、急剧的体重减少或急性饥饿状态等。
虽然最近开发出了对病毒性肝炎有效的治疗方法，但尚未确定NAFLD及NASH的有效的治疗方法。考虑到患者数量的急剧增大，期望尽快开发出一种治疗方法。
Regnase-1(作为ZC3H12A及MCPIP1而为人所知)是CCCH型的锌指蛋白。Regnase-1在其中央区域具有核糖核酸酶结构域，通过IL-6及IL-12的p40亚单位等靶mRNA的降解，将由Toll样受体(TLR)及IL-1受体介导的免疫应答调节为负(非专利文献1～4)。小鼠中的Regnase-1的缺失会引起重度的自身免疫疾患，导致T细胞的过度活化。在非免疫细胞中，Regnase-1在十二指肠上皮中维持铁稳态(非专利文献5)。此外，肠上皮细胞特异性Regnase-1缺失小鼠对实验性结肠炎具有耐性(非专利文献6)。然而，肝脏中的Regnase-1的作用尚不明确。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Matsushita K,et al.(2009)Zc3h12a is an RNase essentialfor controlling immune responses by regulating mRNA decay.Nature 458(7242):1185-1190.
非专利文献2：Iwasaki H,et al.(2011)The IkappaB kinase complexregulates the stability of cytokine-encoding mRNA induced by TLR-IL-1R bycontrolling degradation of regnase-1.Nat Immunol 12(12):1167-1175.
非专利文献3：Uehata T,et al.(2013)Malt1-induced cleavage of regnase-1in CD4(+)helper T cells regulates immune activation.Cell 153(5):1036-1049.
非专利文献4：Mino T,et al.(2015)Regnase-1and Roquin Regulate a CommonElement in Inflammatory mRNAs by Spatiotemporally Distinct Mechanisms.Cell161(5):1058-1073.
非专利文献5：Yoshinaga M,et al.(2017)Regnase-1Maintains IronHomeostasis via the Degradation of Transferrin Receptor 1and Prolyl-Hydroxylase-Domain-Containing Protein 3mRNAs.Cell Rep 19(8):1614-1630.
非专利文献6：Nagayama Y,et al.(2018)Regnase-1controls colon epithelialregeneration via regulation of mTOR and purine metabolism.Proc Natl Acad SciUSA.115(43):11036-11041.
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的技术问题在于阐明肝脏中的Regnase-1的作用，提供Regnase-1抑制剂的新型用途。
解决技术问题的技术手段
为了解决上述技术问题，本发明包括以下的各个发明。
[1]一种降体脂剂，其以Regnase-1抑制剂为有效成分。
[2]根据所述[1]所述的降体脂剂，其用于改善代谢综合征。
[3]根据所述[1]所述的降体脂剂，其用于预防和/或治疗脂肪性肝病。
[4]根据所述[3]所述的降体脂剂，其中，脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为抑制Regnase-1的表达的核酸。
[6]根据所述[1]～[4]中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为以Regnase-1基因为靶标的基因治疗药物。
[7]根据所述[1]～[4]中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为与Regnase-1特异性结合的抗体或肽。
[8]一种具有降体脂作用的物质的筛选方法，其包括选择抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质的步骤。
[9]根据所述[8]所述的方法，其包括：使受试物质与表达Regnase-1的细胞接触的工序；测定所述细胞的Regnase-1的表达水平的工序；及比较该表达水平和未与受试物质接触的所述细胞中的Regnase-1的表达水平，选择使Regnase-1的表达水平降低的受试物质的工序。
[10]根据所述[8]所述的方法，其包括：使Regnase-1、基质RNA及受试物质接触的工序；测定基质RNA的降解水平的工序；及比较该降解水平与未添加受试物质而使Regnase-1与基质RNA接触时的基质RNA的降解水平，选择使基质RNA的降解水平降低的受试物质的工序。
发明效果
根据本发明，能够提供一种以Regnase-1抑制剂为有效成分的降体脂剂。本发明的降体脂剂对改善代谢综合征、预防和/或治疗脂肪性肝病而言是有用的。此外，本发明提供一种具有降体脂作用的物质的筛选方法。根据本发明的筛选方法，能够得到具有降体脂作用的有用物质。
附图说明
图1为示出对野生型小鼠或Regnase-1fl/fl小鼠给予AAV.TBG.Cre(AddGene公司，#107787)，并用蛋白质印迹法(western blotting)检测第0、2、4、8天肝脏中的Regnase-1的结果的图；其中，Regnase-1fl/fl小鼠的Regnase-1基因的外显子4～6的区域被替换为用loxP序列夹持Regnase-1基因的外显子4～6的区域而得到的改造基因(Reg-1flox/flox)。
图2为示出使用给予病毒3周后(8周龄)的肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠(Reg-1LKO小鼠)及对照小鼠(Reg-1 WT小鼠)的血清，测定(A)丙氨酸氨基转移酶(Alaninetransaminase)(ALT)、(B)谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase)(AST)、(C)甘油三酯、(D)总胆固醇、(E)酯化胆固醇及(F)葡萄糖而得到的结果的图。
图3中的(A)为示出肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠(Reg-1 LKO小鼠)及对照小鼠(Reg-1 WT小鼠)的3周龄～43周龄的体重的推移的图，(B)为16～18周龄的两种小鼠的附睾脂肪组织的代表性照片，(C)为示出两种小鼠的附睾脂肪组织重量相对于体重的重量比(eWAT指数(eWAT index))的图，(D)为两种小鼠的肝脏重量相对于体重的重量比(肝指数(Liver index))。
图4为示出从对肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠(Reg-1 LKO小鼠)及对照小鼠(Reg-1 WT小鼠)给予病毒后第2周开始，摄取NASH饮食或对照饮食6周这一期间内的体重的推移的图。
图5为示出开始NASH饮食6周后的各组小鼠的肝脏重量相对于体重的比的图。
图6为示出使用开始NASH饮食6周后的各组小鼠的血清测定(A)丙氨酸氨基转移酶(ALT)、(B)谷草转氨酶(AST)、(C)乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase)(LDH)而得到的结果的图。
图7为示出在开始NASH饮食6周后，从各组小鼠中取出肝脏并供于组织学检查的结果的图，第一行为进行肉眼观察的结果，第二行为苏木精-伊红染色的结果，第三行为利用抗F4/80抗体的免疫染色的结果，第四行为天狼星红染色的结果。
图8为示出在使肝脏的Regnase-1并不缺失的Regnase-1fl/fl小鼠摄取NASH饮食并呈现出NASH的病状后给予AAV.TBG.Cre从而使肝脏的Regnase-1缺失的实验中，每经过一段时间从各组小鼠中取出肝脏并供于组织学检查的结果的图，第一行为苏木精-伊红染色的结果，第二行为利用抗F4/80抗体的免疫染色的结果，第三行为天狼星红染色的结果。
图9为示出在使肝脏的Regnase-1并不缺失的Regnase-1fl/fl小鼠摄取NASH饮食并呈现出NASH的病状后给予AAV.TBG.Cre从而使肝脏的Regnase-1缺失的实验中，使用从给予AAV.TBG.Cre起第3周的各组小鼠的血清测定(A)丙氨酸氨基转移酶(ALT)、(B)乳酸脱氢酶(LDH)、(C)亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase)(LAP)及(D)甘油三酯而得到的结果的图。
图10为示出使C57/Bl6J小鼠摄取NASH饮食或对照饮食6周后，使其感染表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒，并在感染后第3周从各组小鼠中取出的肝脏的肉眼观察结果的图。
图11为示出各组小鼠的肝脏重量相对于体重的比的图，其中，使C57/Bl6J小鼠摄取NASH饮食或对照饮食6周后，使其感染表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒，测定感染后第3周从各组小鼠中取出的肝脏的重量。
图12为示出使C57/Bl6J小鼠摄取NASH饮食或对照饮食6周后，使其感染表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒，将感染后第3周从各组小鼠中取出的肝脏供于组织学检查而得到的结果的图，第一行为苏木精-伊红染色的结果，第二行为天狼星红染色的结果，第三行为利用抗F4/80抗体的免疫染色的结果。
图13为示出使C57/Bl6J小鼠摄取NASH饮食或对照饮食6周后，使其感染表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒，由感染后第3周从各组小鼠中取出的肝脏制作天狼星红染色标本，通过图像解析对各组小鼠肝脏的天狼星红阳性区域进行定量化而得到的结果的图。
图14为示出使C57/Bl6J小鼠摄取NASH饮食或对照饮食6周后，使其感染表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒，由感染后第3周从各组小鼠中取出的肝脏制作利用抗F4/80抗体的免疫染色标本，通过图像解析对抗F4/80抗体阳性区域进行定量化而得到的结果的图。
具体实施方式
[降体脂剂]
本发明提供一种以Regnase-1抑制剂为有效成分的降体脂剂。本发明的降体脂剂可适宜地用于改善代谢综合征。此外，本发明的降体脂剂可适宜地用于预防和/或治疗脂肪性肝病。脂肪性肝病为在肝脏中堆积有中性脂肪的状态的疾病，也被称为脂肪肝。脂肪性肝病可以为酒精性脂肪性肝病，也可以为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。NAFLD中的10～20％为可发展为肝硬化或肝癌的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。本发明的降体脂剂由于能够用于预防和/或治疗NASH，因此非常有用。
本发明的降体脂剂可以以药品的形态摄取。以药品的形态摄取本发明的降体脂剂时，可以以Regnase-1抑制剂为有效成分，并按照常规方法进行制剂。例如，作为用于口服给药的制剂，可列举出固体或液体的剂型，具体而言，可列举出片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。这些制剂可利用公知的方法制备，其包含制剂领域中常用的载体、稀释剂或赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，可使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。作为用于非口服给药的制剂，例如可使用注射剂、栓剂等，注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌内注射剂、静脉滴注剂、关节腔内注射剂等剂型。这样的注射剂可按照公知的方法制备，例如通过将上述有效成分溶解、混悬或乳化至通常用于注射剂的无菌的水性或油性液体中而制备。作为注射用的水性液体，例如可使用生理盐水、葡萄糖或包含其他辅料的等渗溶液等，也可同时使用适当的助溶剂，例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、HCO-50等)等。作为油性液体，例如可使用芝麻油、大豆油等，也可同时使用作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等。用于直肠给药的栓剂可通过将上述有效成分混合至通常的栓剂用基质中而制备。以此方式得到的制剂安全且为低毒性，因此例如可对人或哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、羊、猪、牛、猫、狗、猴子等)进行口服或非口服给药。
本发明的降体脂剂可以以饮食品的形态摄取。饮食品中包括保健食品、功能性食品、特定保健用食品、患者用食品、营养强化食品、补剂等。饮食品的形态没有特别限定。例如可列举出片剂、颗粒剂、散剂、保健饮料等形态；茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果实饮料、乳酸饮料等饮料；糖、糖果、口香糖、巧克力、零食点心、饼干、果冻、果酱、奶油、烘焙点心、面包等点心及面包类；鱼糕、火腿、香肠等水产及畜产加工食品；加工乳、发酵乳等乳制品；色拉油、天妇罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、掼奶油、调味料等油脂及油脂加工食品；沙司、调料汁等调味料；咖喱、炖菜、盖饭、粥、杂烩粥等蒸煮袋食品；冰淇淋、果子露(sherbet)、刨冰等冷冻点心等。
本发明的降体脂剂的有效成分可以为抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质。抑制Regnase-1的表达的物质可以为抑制Regnase-1的表达的核酸。作为抑制Regnase-1的表达的核酸，可列举出Regnase-1基因的siRNA(小干扰RNA(shortinterfering RNA))、shRNA(短发夹RNA(short hairpin RNA))、反义寡核苷酸等。给予对象动物的Regnase-1基因的碱基序列可容易地从公知的数据库(DDBJ/GenBank/EMBL等)中获得，可通过公知的方法设计抑制Regnase-1的表达的核酸。例如，人、小鼠、大鼠的碱基序列及氨基酸序列的登录号(accession number)如下所述。
人：NM_001323550(碱基序列)、NP_001310479(氨基酸序列)
NM_001323551(碱基序列)、NP_001310480(氨基酸序列)
小鼠：NM_153159(碱基序列)、NP_694799(氨基酸序列)
大鼠：NM_001077671(碱基序列)、NP_001071139(氨基酸序列)
siRNA为长度约为20个碱基(例如约21～23个碱基)或长度小于20个碱基的双链RNA，通过使这种siRNA在细胞中表达，可抑制作为该siRNA的靶标的基因(在本发明中为Regnase-1基因)的表达。由于shRNA包含为单链RNA且部分为回文状的碱基序列，因此在分子内形成双链结构，shRNA是指由在3’末端具有突出部的短发夹结构构成的约20个碱基对以上的分子。这种shRNA可在导入至细胞内后，在细胞内降解为约20个碱基(代表性而言，例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，与siRNA一样能够抑制作为靶标的基因(在本发明中为Regnase-1基因)的表达。siRNA及shRNA只要能够抑制Regnase-1的表达，则可以为任意的形态。siRNA或shRNA能够基于靶基因的碱基序列、通过公知的方法进行设计。siRNA或shRNA可人工化学合成。此外，例如可使用T7RNA聚合酶及T7启动子，由模板DNA在体外合成反义RNA及正义RNA。反义寡核苷酸只要为与Regnase-1基因的DNA序列中的连续的5～100个碱基序列互补或杂交的核苷酸，则可以是DNA或RNA中的任意一者。此外，只要对功能没有阻碍，则也可以为经修饰的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可通过常规方法合成，例如可利用市售的DNA合成装置容易地合成。
当本发明的降体脂剂的有效成分为抑制Regnase-1的表达的核酸时，可以以非病毒载体或病毒载体的形态给予。以非病毒载体的形态给予时，可利用使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、HVJ-脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法(Lipofection)、利用脂质体转染试剂(Lipofectamine)的方法等)、显微注射法、利用基因枪(Gene Gun)将核酸分子与载体(金属颗粒)一起移入细胞的方法等。使用病毒载体给予生物体siRNA或shRNA时，可利用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。在经无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒、仙台病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中导入表达siRNA或shRNA的DNA，并使细胞或组织感染该重组病毒，由此能够在细胞或组织内导入基因。
虽然期望siRNA与靶序列相同，但只要能够诱导RNA干涉，则也可以是不完全相同的序列。具体而言，只要siRNA的反义链序列与靶序列杂交，则可以有1个～多个(例如2、3、4个)错配。即，siRNA可以为相较于靶序列，1个～多个碱基发生了替代、增加或缺失且能够诱导RNA干涉的siRNA。此外，siRNA可以为与靶序列具有85％以上、90％以上、95％以上、98％以上的序列同一性且能够诱导RNA干涉的siRNA。
只要能够诱导RNA干涉，则siRNA可以将正义链或反义链中的任一者的核苷酸全部变换为DNA(杂交型)，也可以将正义链和/或反义链的一部分核苷酸变换为DNA(嵌合体型)。作为杂交型，可列举出将正义链的核苷酸变换为DNA的siRNA。作为嵌合体型，可列举出将下游侧(正义链的3’末端侧、反义链的5’末端侧)的一部分核苷酸变换为DNA的siRNA。具体而言，可列举出将正义链的3’末端侧及反义链的5’末端侧的核苷酸均变换为DNA的siRNA、将正义链的3’末端侧或反义链的5’末端侧中的任一侧的核苷酸变换为DNA的siRNA。此外，所变换的核苷酸长度可以为直至相当于RNA分子的1/2的核苷酸为止的任意长度。
只要能够诱导RNA干涉，则siRNA可以为其核苷酸(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸)的糖、碱基和/或磷酸盐经化学修饰的核苷酸类似物。作为碱基被修饰的核苷酸类似物，例如可列举出5位修饰尿苷或胞苷(例如，5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、5-甲氧基尿苷等)；8位修饰腺苷或鸟苷(例如，8-溴鸟苷等)；脱氮核苷酸(例如，7-脱氮-腺苷等)；O-烷基化核苷酸及N-烷基化核苷酸(例如，N6-甲基腺苷等)等。此外，作为糖被修饰的核苷酸类似物，例如可列举出核糖核苷酸的2’-OH被H、OR、R、卤原子、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN(此处，R表示碳原子数为1-6的烷基、烯基或炔基)等取代的2’位糖修饰、5’末端被单磷酸化的5’末端磷酸化修饰。作为磷酸盐被修饰的核苷酸类似物，可列举出键合于相邻的核糖核苷酸的磷酸酯基被硫代磷酸酯基取代的核苷酸类似物。
抑制Regnase-1的表达的物质可以为以Regnase-1基因为靶标的基因治疗药物。作为这种基因治疗药物，例如可列举出具备以Regnase-1基因为靶标的基因组编辑手段的病毒载体。作为病毒载体，可列举出慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。基因组编辑手段可以为CRISPER/Cas9。CRISPER/Cas9由Cas9蛋白与向导RNA构成，向导RNA可使用包含与Regnase-1基因互补的核苷酸区域及与Cas9蛋白相互作用的区域的RNA。优选为包含表达CRISPER/Cas9的多核苷酸且该CRISPER/Cas9将可操作地连接于肝脏特异性的启动子序列的Regnase-1基因作为靶标的腺相关病毒载体。使细胞或组织感染具备以Regnase-1基因为靶标的基因组编辑手段的病毒载体，并将Regnase-1基因破坏、替代等，由此能够抑制Regnase-1的表达。
本发明的降体脂剂的有效成分可以为与Regnase-1特异性结合的抗体或肽。通过使抗体或肽与Regnase-1结合，能够抑制Regnase-1与基质RNA的结合。与Regnase-1特异性结合的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。此外，可以为完整的抗体分子，也可以为可与Regnase-1特异性结合的抗体片段(例如，Fab、F(Ab’)2、Fab’、Fv、scFv等)。抗体可以为人嵌合抗体或人源化抗体。抗体及肽均可通过公知的方法制备。当本发明的药品的有效成分为肽或抗体时，优选将其制成与药学上可接受的载体一起进行制剂的注射剂或输液而通过非口服给予途径给予，例如给予至静脉内、肌肉内、皮肤内、腹腔内、皮下或局部。
本发明的降体脂剂的有效成分可以为抑制Regnase-1的表达或功能的低分子化合物。
本发明的降体脂剂可含有0.001～50质量％、优选含有0.01～10质量％、进一步优选含有0.1～1质量％的有效成分。本发明的药品的给药量可考虑目的、疾病的种类、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、病史、有效成分的种类等适当设定。以具有约65～70kg的体重的普通人为对象时，优选每天的给药量为0.02mg～4000mg左右，更优选为0.1mg～200mg左右。每天的总给药量可以为单次给药量，也可以为分次给药量。
[筛选方法]
本发明提供一种具有降体脂作用的物质的筛选方法。本发明的筛选方法使用Regnase-1即可。本发明的筛选方法中使用的Regnase-1可以为蛋白质，也可以为基因。此外，Regnase-1为蛋白质时，可以为全长蛋白质，也可以为包含核糖核酸酶结构域的活性片段。
用于本发明的筛选方法的Regnase-1可以为源自任意生物的Regnase-1，没有特别限定。用于本发明的筛选方法的Regnase-1可以为哺乳动物的Regnase-1。作为哺乳动物，可列举出人、黑猩猩、猴子、狗、牛、小鼠、大鼠、豚鼠等，优选为人。编码各种动物的Regnase-1的基因的碱基序列及氨基酸序列的信息可从公知的数据库(DDBJ/GenBank/EMBL等)中获得。例如，人、小鼠、大鼠的碱基序列及氨基酸序列的登录号如下所述。
人：NM_001323550(碱基序列)、NP_001310479(氨基酸序列)
NM_001323551(碱基序列)、NP_001310480(氨基酸序列)
小鼠：NM_153159(碱基序列)、NP_694799(氨基酸序列)
大鼠：NM_001077671(碱基序列)、NP_001071139(氨基酸序列)
受试物质没有特别限定，例如可以为核酸、肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、细胞培养上清、植物提取液、哺乳动物的组织提取液、血浆等。受试物质可以为新型的物质，也可以为公知的物质。受试物质可以形成盐。受试物质的盐可以为与生理学上可接受的酸或碱基的盐。
本发明的筛选方法可以为选择抑制Regnase-1的表达的物质的方法。通过本发明的筛选方法选择抑制Regnase-1的表达的物质时，例如可使用包括下述工序的筛选方法：使受试物质与表达Regnase-1的细胞接触的工序；测定所述细胞的Regnase-1的表达水平的工序；及比较该表达水平和未与受试物质接触的所述细胞中的Regnase-1的表达水平，选择使Regnase-1的表达水平降低的受试物质的工序。
表达Regnase-1的细胞可以为生物体内的细胞，也可以为培养细胞。培养细胞可以为初代培养细胞，也可以为确立细胞系。表达Regnase-1的细胞可以为内源性的表达Regnase-1的细胞，也可以为外源性的表达Regnase-1的细胞。作为内源性的表达Regnase-1的细胞，例如可列举出HeLa细胞、HEK293细胞、Jurkat细胞、Caco-2细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、EL-4细胞等。外源性的表达Regnase-1的细胞可通过向适当的宿主细胞中导入包含编码Regnase-1的DNA的重组表达载体(Regnase-1表达载体)来制备。作为宿主细胞，例如可使用源自Regnase-1缺失小鼠的MEF细胞及初代培养细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、Jurkat细胞、Caco-2细胞、EL-4细胞等。
使受试物质与细胞接触的方法没有特别限定。例如，使用培养细胞时，可列举出向培养基中添加受试物质的方法等。例如，在非人类动物的生物体中使受试物质与细胞接触时，可列举出口服给予、静脉内给予、腹腔内给予等全身给予、对目标脏器或目标组织的局部给予等。此外，优选设置未接触受试物质的对照组。
关于Regnase-1的表达水平的测定，可测定Regnase-1的蛋白质量，也可测定Regnase-1的mRNA量。测定蛋白质量时，可通过公知的方法从细胞中提取蛋白质，也可使用公知的蛋白质量测定方法进行定量。作为公知的蛋白质量测定方法，例如可列举出蛋白质印迹法、EIA法、ELISA法、RIA法、使用蛋白质测定试剂的方法等。测定mRNA量时，可通过公知的方法从细胞中提取RNA，并使用公知的mRNA量测定方法进行定量。作为公知的mRNA量测定方法，可列举出RNA印迹法(northern blotting)、RT-PCR法、定量RT-PCR法、RNA酶保护试验等。
若与未接触受试物质的对照组中的Regnase-1的蛋白质量或mRNA量相比，接触了受试物质时Regnase-1的蛋白质量或mRNA量有所减少，则能够将该受试物质选作目标物质。受试物质使Regnase-1的蛋白质量或mRNA量减少的程度没有特别限定，例如，可以选择与未接触受试物质的细胞的蛋白质量或mRNA量相比减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下或10％以下的受试物质。
本发明的筛选方法也可以为选择抑制Regnase-1的功能的物质的方法。Regnase-1的功能可以为核糖核酸内切酶活性。选择抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质时，例如可以使用包括下述工序的筛选方法：使Regnase-1、基质RNA及受试物质接触的工序；测定基质RNA的降解水平的工序；及比较该降解水平与未添加受试物质而使Regnase-1与基质RNA接触时的基质RNA的降解水平，选择使基质RNA的降解水平降低的受试物质的工序。
包括选择抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质的步骤的筛选方法可在使用表达Regnase-1的细胞的体系及不使用表达Regnase-1的细胞的体系中的任意一种体系中实施。不使用表达Regnase-1的细胞时，向适当的反应液(例如，“20mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,5mM MgCl2及1mM DTT”等含镁的Tris盐酸缓冲液)中添加Regnase-1、基质RNA及受试物质，于30～37℃反应30～120分钟，测定基质RNA的降解(切断)水平。受试物质抑制核糖核酸内切酶活性时，基质RNA的切断得到抑制，降解水平降低。
作为该体系中使用的Regnase-1，优选重组Regnase-1蛋白。重组Regnase-1蛋白可以为全长蛋白质，也可以为包含核糖核酸酶结构域的活性片段。基质RNA可使用包含公知的可利用Regnase-1切断的序列的RNA。基质RNA也可以为合成RNA。
基质RNA的降解水平的测定方法没有特别限定，例如可列举出PCR、电泳等。使用PCR时，例如可列举出合成在基质RNA的5’侧及3’侧连接有DNA的嵌合寡核苷酸并将其作为基质RNA的方法。该方法中，使用与连接于基质嵌合寡核苷酸的5’侧及3’侧的DNA序列互补的引物进行定量PCR。若基质嵌合寡核苷酸被切断，则PCR扩增效率降低，若基质嵌合寡核苷酸未被切断，则PCR扩增效率提高。即，若受试物质为抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质，则与未添加受试物质的体系(基质嵌合寡核苷酸被Regnase-1切断)相比，PCR扩增效率提高，可将这种受试物质选作使基质RNA的降解水平降低的受试物质。在该体系中，可选择添加受试物质时的PCR扩增水平增加至未添加受试物质时的PCR扩增水平的1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2倍以上的受试物质。
使用电泳时，例如可使用上述基质嵌合寡核苷酸的末端(两端或一端)被标记的基质RNA。标记物质只要能够对电泳后的条带的浓度进行定量则没有特别限定，例如可列举出荧光标记、RI标记、生物素标记等。使用对两端进行了荧光标记的基质嵌合寡核苷酸时，若在反应后回收基质嵌合寡核苷酸并进行电泳，则未被切断的基质嵌合寡核苷酸显现出两端被荧光标记的一条全长条带。另一方面，基质嵌合寡核苷酸被切断时，则至少显现出较短的二条条带、或者被进一步降解的片段。即，若受试物质为抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质，则与未添加受试物质的体系(基质嵌合寡核苷酸被Regnase-1切断)相比，优先显现出一条全长条带，因此可将这种受试物质选作使基质RNA的降解水平降低的受试物质。
在包括选择抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质的步骤的筛选方法中，使用表达Regnase-1的细胞时，作为表达Regnase-1的细胞，可以为内源性的表达Regnase-1的细胞，也可以为外源性的表达Regnase-1的细胞。外源性的表达Regnase-1的细胞可使用将Regnase-1表达载体导入宿主细胞而制备的Regnase-1表达细胞。作为基质RNA，可使用包含公知的可利用Regnase-1切断的序列的RNA。例如，可列举出IL-6基因的3’-UTR的转录物。
在该体系中，可将向适当的宿主细胞中导入了Regnase-1表达载体与包含在荧光素酶基因的下游连接有IL-6基因的3’-UTR的DNA的载体的细胞用作表达Regnase-1的细胞。将受试物质添加至培养基，培养1～3天左右(优选2天时间)，然后使细胞裂解并使用公知的方法测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。使用该细胞时，若荧光素酶基因的mRNA的3’-UTR部分被Regnase-1切断，则荧光素酶活性降低，若Regnase-1的核糖核酸内切酶活性被抑制，则荧光素酶基因的mRNA的3’-UTR部分不会被切断，荧光素酶活性得以维持。
即，若受试物质为抑制Regnase-1的核糖核酸内切酶活性的物质，则与未添加受试物质的体系(基质嵌合寡核苷酸被Regnase-1切断)相比，可获得较高的发光强度，因此可将这种受试物质选作使基质RNA的降解水平降低的受试物质。在该体系中，可选择使添加了受试物质时的发光强度增加至未添加受试物质时的发光强度的1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2倍以上的受试物质。
本发明包括以下的各个发明。
(A1)一种使体脂降低的方法，其特征在于，其包含给予有效剂量的抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质的工序。
(A2)一种代谢综合征的改善方法，其特征在于，其包含给予有效剂量的抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质的工序。
(A3)一种脂肪性肝病的预防和/或治疗方法，其特征在于，其包含给予有效剂量的抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质的工序。
(B1)抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质在降低体脂中的应用。
(B2)一种抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质，其用于改善代谢综合征。
(B3)一种抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质，其用于预防和/或治疗脂肪性肝病。
(C1)抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质在制备降体脂剂中的应用。
(C2)抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质在制备代谢综合征改善剂中的应用。
(C3)抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质在制备用于预防和/或治疗脂肪性肝病的药品中的应用。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于此。
以下所有的实验均使用C57/Bl6背景的小鼠。Regnase-1基因的外显子4～6的区域被替换为用loxP序列夹持Regnase-1基因的外显子4～6的区域而得到的改造基因(Reg-1flox/flox)的小鼠(Regnase-1fl/fl小鼠)记载于Uehata等人的(Uehata T,et al.(2013)Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4(+)helper T cells regulates immuneactivation.Cell 153(5):1036-1049)中。
[实施例1：肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠的肝脏的评价]
(1)肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠的制作
从尾静脉对5周龄的Regnase-1fl/fl小鼠给予0.625×1012个/100μL PBS的AAV.TBG.Cre(AddGene公司，#107787)，制作肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠(以下称为“Reg-1 LKO小鼠”)。对照小鼠(以下称为“Reg-1 WT小鼠”)则是从尾静脉给予AAV8病毒颗粒。Reg-1 LKO小鼠的Regnase-1基因在2天内完全缺失(图1)。
(2)生化检查
为了调查肝脏中的Regnase-1缺失的影响，在给予病毒3周后(8周龄)，对Reg-1LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠进行采血，并将血清供于生化检查。将结果示于图2。Reg-1 LKO小鼠的丙氨酸氨基转移酶(ALT)值及谷草转氨酶(AST)值与Reg-1 WT小鼠同等，体现出未因Regnase-1缺失诱发肝损伤。Reg-1 LKO小鼠的血清甘油三酯(Triglycerides)、总胆固醇(T-CHOL)、酯化胆固醇(E-CHOL)的各值相较于Reg-1 WT小鼠有所降低，体现出肝脏的Regnase-1与脂肪代谢调节相关。另外，Reg-1 LKO小鼠的血清葡萄糖(Glucose)值相较于Reg-1 WT小鼠也有所降低，体现出肝脏的Regnase-1也与糖代谢相关。
(3)体重的推移
在3周龄～43周龄测定Reg-1 LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠的体重，并将其推移示于图3的(A)。观察到与Reg-1 WT小鼠相比，Reg-1 LKO小鼠在第9周以后的体重增加受到抑制。认为体重增加受到抑制的主要原因在于体脂降低。图3的(B)为16～18周龄的Reg-1 LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠的附睾脂肪组织的代表性照片。明显可知Reg-1 LKO小鼠的脂肪组织量较少。图3的(C)为16～18周龄的Reg-1 LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠的附睾脂肪组织重量相对于体重的重量比(eWAT指数)，图3的(D)为16～18周龄的Reg-1 LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠的肝脏重量相对于体重的重量比(肝指数)。由图3的(C)、(D)可知，Reg-1 LKO小鼠的eWAT指数相较于Reg-1 WT小鼠显著减少，但二者的肝指数之间没有差别。
(4)总结
根据上述结果可知，肝脏中的Regnase-1的缺失会使体脂及血糖值降低而不会引发特别重度的病状，因此认为通过抑制肝脏的Regnase-1，能够改善代谢综合征。
[实施例2：肝脏特异性Regnase-1缺失小鼠针对NASH饮食所产生的影响]
使Reg-1 LKO小鼠及Reg-1 WT小鼠从给予病毒后的第2周开始摄取NASH饮食(Oriental Yeast Co.,ltd.；NASH-1)或对照饮食。在摄取了6周的NASH饮食或对照饮食后，从各小鼠中回收样品。
(1)体重的推移
开始NASH饮食后每隔1周测定体重。将结果示于图4。对于Reg-1WT小鼠，观察到对照饮食组、NASH饮食组的体重均增加，但NASH饮食组的体重增加比对照饮食轻微。另一方面，Reg-1 LKO小鼠的NASH饮食组显示出与Reg-1 WT小鼠的对照饮食组相同程度的体重增加。
(2)肝脏重量
开始NASH饮食6周后从各小鼠中取出肝脏并测定重量，并调查其相对于体重的比(肝脏炎症的指标)。将结果示于图5。与其他组(Reg-1 WT小鼠的对照饮食组、Reg-1 LKO小鼠的NASH饮食组及对照饮食组)相比，Reg-1 WT小鼠的NASH饮食组的肝脏/体重比为高值。该结果显示：肝脏的Regnase-1未缺失的小鼠(Reg-1 WT小鼠)因摄取NASH饮食而在肝脏引发了炎症，但Reg-1 LKO小鼠即使摄取NASH饮食也未在肝脏发生炎症。
(3)生化检查
使用从各组小鼠中采集的血清，测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)值、谷草转氨酶(AST)值及乳酸脱氢酶(LDH)值。将结果示于图6。丙氨酸氨基转移酶(ALT)值、谷草转氨酶(AST)值及乳酸脱氢酶(LDH)值在Reg-1 WT小鼠的NASH饮食组均显示高值，但在Reg-1 LKO小鼠的NASH饮食组中显著降低。
(4)组织学检查
从各组小鼠中取出肝脏，并进行肉眼观察后，制作组织标本，进行苏木精-伊红(H&E)染色、利用抗F4/80抗体的免疫染色、天狼星红(Sirious Red)染色。将结果示于图7。Reg-1 WT小鼠的NASH饮食组中，门静脉(pv)周围的脂肪变性(参照H&E)、巨噬细胞的聚集(F4/80阳性细胞)及通过天狼星红染色而观察到的纤维化均增加，但在Reg-1 LKO小鼠的NASH饮食组中，门静脉周围的脂肪变性、巨噬细胞的聚集及纤维化的程度均显著减弱。
(5)总结
上述结果体现出在饮食诱导NASH小鼠模型中，肝脏的Regnase-1缺失会带来炎症与肝损伤的减弱，因此认为通过抑制肝脏的Regnase-1，能够预防NASH的发病。
[实施例3：对呈现出NASH的病状后使肝脏特异性缺失Regnase-1而带来的病状改善的研究]
使6～7周龄的Regnase-1fl/fl雄性小鼠摄取NASH饮食(Oriental Yeast Co.,ltd.；NASH-1)5周，然后以与实施例1相同的方式从尾静脉给予AAV.TBG.Cre或。使6～7周龄的Regnase-1fl/fl小鼠摄取NASH饮食或对照饮食周，给予AAV8病毒颗粒以代替AAV.TBG.Cre，将得到的小鼠(Reg-1WT小鼠的NASH饮食组及Reg-1 WT小鼠的对照饮食组)分别作为阳性对照及阴性对照(参照图8)。
(1)组织学检查
在开始NASH饮食前、开始NASH饮食后第5周、给予AAV.TBG.Cre后第3周，从各组小鼠中取出肝脏，并制作组织标本，进行苏木精-伊红(H&E)染色、利用抗F4/80抗体的免疫染色、天狼星红(Sirious Red)染色。将结果示于图8。摄取NASH饮食5周的小鼠(Reg-1 WT小鼠的NASH饮食组及Regnase-1fl/fl小鼠)呈现出作为NASH的病状表现的小泡性及大泡性脂肪变性(micro and macro vesicular steatosis)(参照H&E)、炎症表现(F4/80阳性细胞)、纤维化(天狼星红染色)。在给予AAV8病毒颗粒后进一步摄取NASH饮食3周的Reg-1 WT小鼠的NASH饮食组中，观察到了小泡性及大泡性脂肪变性的恶化。然而，给予AAV.TBG.Cre而使肝脏中的Regnase-1缺失的小鼠中，小泡性及大泡性脂肪变性、炎症及纤维化均显著减弱。
(2)生化检查
对给予AAV.TBG.Cre或AAV8病毒颗粒后第3周的小鼠进行采血，并将血清供于生化检查。将结果示于图9。对于给予AAV.TBG.Cre从而使肝脏中的Regnase-1缺失的小鼠(图中LKO)，观察到了作为肝损伤的标志的ALT、LDH、LAP的显著降低。另外，也几乎未观察到血清甘油三酯的上升。
(3)总结
根据上述结果，认为通过抑制肝脏的Regnase-1，能够改善作为NASH病状的指标的炎症、纤维化、脂肪代谢异常。因此，体现出肝脏的Regnase-1是治疗脂肪性肝病的优异的靶标。
[实施例4：对给予在肝脏特异性表达Regnase-1基因的siRNA的腺相关病毒(AAV)所带来的NASH模型小鼠的病状改善的研究]
将肝细胞特异性的甲状腺素结合球蛋白(Thyroxine-binding globulin)(TBG)作为启动子，制作表达Regnase-1基因的siRNA的腺相关病毒(AAV)。Regnase-1基因的siRNA的碱基序列与市售的以小鼠Regnase-1基因为靶标的siRNA(Thermo Fisher Scientific,siRNA ID:170484,Catalog#:AM16708)相同。作为对照病毒，使用表达GFP基因的AAV代替Regnase-1基因的siRNA。
使5周龄的C57/Bl6J小鼠食用NASH饮食或对照饮食6周后，从尾静脉给予表达Regnase-1基因的siRNA的AAV或对照病毒(1.8×1012个)，从而使其感染病毒。
(1)肝脏的肉眼观察与重量
在给予病毒3周后从各组小鼠中取出肝脏，进行肉眼观察，然后测定重量。将肉眼观察的结果示于图10，将肝脏重量相对于体重的重量比(肝脏炎症的指标)示于图11。感染了对照病毒的NASH饮食组小鼠的肝脏带有脂肪肝特征性的黄色，并且与对照饮食组小鼠的肝脏相比，大小增大。另一方面，感染了表达Regnase-1基因的siRNA的AAV的NASH饮食组小鼠的肝脏的颜色及大小均与对照饮食组小鼠的肝脏相同。
(2)组织学检查
测定重量后，制作肝脏的组织标本，进行苏木精-伊红(H&E)染色、天狼星红(Sirious Red)染色、利用抗F4/80抗体的免疫染色。将结果示于图12。此外，将利用图像解析对天狼星红染色标本的阳性区域(纤维化)进行定量化而得到的结果示于图13，将利用图像解析对利用抗F4/80抗体的免疫染色阳性区域(炎症)进行定量化而得到的结果示于图14。观察到与感染了对照病毒的NASH饮食组小鼠相比，感染了表达Regnase-1基因的siRNA的AAV的NASH饮食组小鼠中，作为NASH的病状表现的小泡性及大泡性脂肪变性(micro andmacro vesicular steatosis)显著减少。此外，由天狼星红染色结果及图13观察到，感染了表达Regnase-1基因的siRNA的AAV的NASH饮食组小鼠的纤维化受到抑制，由利用抗F4/80抗体的免疫染色结果及图14观察到了巨噬细胞的聚集(炎症)的减弱。
(3)总结
上述结果暗示了，使用Regnase-1基因的siRNA的基因治疗可成为NASH的治疗方法的可能性。
另外，本发明并不受上述的各个实施方案及实施例的限定，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同实施方案中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方案也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献均作为参考而援用于本说明书中。

Claims (10)

1.一种降体脂剂，其以Regnase-1抑制剂为有效成分。
2.根据权利要求1所述的降体脂剂，其用于改善代谢综合征。
3.根据权利要求1所述的降体脂剂，其用于预防和/或治疗脂肪性肝病。
4.根据权利要求3所述的降体脂剂，其中，脂肪性肝病为非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为抑制Regnase-1的表达的核酸。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为以Regnase-1基因为靶标的基因治疗药物。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的降体脂剂，其中，Regnase-1抑制剂为与Regnase-1特异性结合的抗体或肽。
8.一种具有降体脂作用的物质的筛选方法，其包括选择抑制Regnase-1的表达的物质或抑制Regnase-1的功能的物质的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括：使受试物质与表达Regnase-1的细胞接触的工序；测定所述细胞的Regnase-1的表达水平的工序；及比较该表达水平和未与受试物质接触的所述细胞中的Regnase-1的表达水平，选择使Regnase-1的表达水平降低的受试物质的工序。
10.根据权利要求8所述的方法，其包括：使Regnase-1、基质RNA及受试物质接触的工序；测定基质RNA的降解水平的工序；及比较该降解水平与未添加受试物质而使Regnase-1与基质RNA接触时的基质RNA的降解水平，选择使基质RNA的降解水平降低的受试物质的工序。
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