WO2024024565A1

WO2024024565A1 - ニューロトリミンの機能阻害剤

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Publication number: WO2024024565A1
Application number: PCT/JP2023/026213
Authority: WO
Inventors: 徹秋山; 祐己鴨志田; 寛敦林; 祐介山角; 健昭小田; 弥磨鹿内
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2023-07-18
Publication date: 2024-02-01

Abstract

本発明は、細胞の老化を抑制する剤、および細胞老化によって惹起される疾患等の予防または治療薬の提供を課題とする。より具体的には、本発明は、NTM（Neurotrimin）の機能阻害剤を有効成分として含有する、細胞老化抑制剤、および当該細胞老化抑制剤を含有する医薬等である。また、本発明は、老化を抑制する抗体である。さらに、本発明は、細胞の老化を抑制する物質のスクリーニング方法である。

Description

ニューロトリミンの機能阻害剤

　本発明は、ニューロトリミンの機能阻害剤に関する。さらに、本発明は、ニューロトリミンの機能阻害剤を含む、細胞老化の抑制剤、個体老化および肥満の改善薬、ならびに細胞老化によって誘導される諸疾患の治療薬に関する。

　超高齢を迎えた現代社会にとって、健康寿命の延長は現代科学の解決すべき最重要課題の一つである。健康寿命の延長には、医療システムの改革や生活習慣病、食習慣等の改善が有効な手段であることは明白である。しかし、健康寿命に対する抜本的な対応には、老化制御機構の俯瞰的理解と、老化に伴う加齢性疾病や、臓器・組織の機能低下を予防する技術の開発が必要不可欠である。

　細胞の老化は、細胞増殖が不可逆的に停止した状態を指し、個体レベルの老化や老化に関連した疾患の発症においても、重要な役割を果たしていると考えられている。例えば、Bakerらは、早老性モデルマウスを用いた遺伝学的解析から、老齢個体から人工的に老化細胞を除去すると、動脈硬化や腎障害などの老年病の発症が有意に遅れ、さらには寿命そのものも延長することを報告した（非特許文献１）。さらに、非早老性マウスにおいて、老化細胞が健康寿命に及ぼす影響を調べたところ、老化細胞のバイオマーカーの１つであるp16陽性細胞が体内に蓄積すると寿命が短くなる傾向にあること、p16陽性細胞を除去すると個体の健康寿命が伸びる可能性があることなどが示唆された（非特許文献２）。従って、生体内に存在する老化細胞を選択的に除去するか、または細胞の老化を抑制もしくは停止することができれば、健康寿命の延長や加齢に伴う疾患（動脈硬化症や骨粗鬆症）の治療における新たな方法論の確立につながると考えられる。

　細胞老化は、慢性的な炎症状態と考えられている。この慢性的な炎症状態が、がん化やがんの悪性化などの原因となることが報告されている（非特許文献３）。細胞老化は、かつては細胞増殖を止め、がん抑制的に働くと考えられていたが、近年では細胞の老化状態は、がんに対して二面性を有し、がん細胞の増殖を促進する場合もあることが示されている（非特許文献４）。
　また、肥満状態は、細胞老化と同様に慢性的な炎症状態であり、肥満状態下では細胞老化状態も進行していることが報告されている（非特許文献５）。肥満状態において、特に炎症や細胞老化が誘導されているのが脂肪組織で（非特許文献６）、この脂肪組織における細胞老化が肥満に伴うインスリン抵抗性の獲得の要因となっている（非特許文献７）。

　老化した細胞（老化細胞）は、その細胞内においてp16（CDKN2A）、p15（CDKN2B）およびp21（CDKN1A）などの細胞老化マーカーの発現が上昇するとともに、炎症系サイトカイン（例えば、IL-6、IL-8など）、ケモカイン、マトリクスメタロプロテイナーゼおよび成長因子などを分泌することが報告されている。この分泌現象は、老化関連分泌表現型（senescence-associated secretory phenotype；SASP）と称され、老化関連疾患の発症に関連していることが示唆されている（非特許文献８～非特許文献１０）。例えば、炎症系サイトカインの一つであるIL-6は、様々ながんに対して大きく寄与することが広く報告されている（非特許文献１１）。また、SASP関連因子は、パラクライン的に作用し、老化細胞の周辺に存在する組織に対して炎症や発がんなどを促進する好ましくない微小環境を提供する因子として機能する可能性も示唆されている（非特許文献１２）。

　ニューロトリミン（Neurotrimin； NTM）は、脳の発生段階において、発現する膜タンパク質として同定された（非特許文献１３）。NTMは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）により細胞膜にアンカーされるGPIアンカータンパク質の一種で、N末側に細胞外に分泌されるために必要なシグナルペプチド配列、C末側にはGPI付加に必要なシグナルペプチド配列が存在し、さらに分子中央には３つのIgG-likeドメインが存在する（非特許文献１４）。最も発現が高い組織は脳であるが、脂肪組織などを中心としてその他の組織においても発現が認められる。これまでNTMに対する研究はほとんどが脳・神経系について行われており、神経細胞の伸長・重合などに関わっているとされている（非特許文献１５）。

　NTM欠損マウスを用いた研究から、NTMを欠損すると恐怖行動などの脳の高次機能に変化が生じることが示されている（非特許文献１６）。その他の組織における機能については、不明な点が多いが、がんとの関連を示唆する報告がある。例えば、NTMはがん組織に特異的に多く発現しており、がん細胞表面上に固定されているNTMを標的とした抗体が、ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）またはCDC（complement-dependent cytotoxicity）を介してがん細胞を殺傷することが報告されている（特許文献１）。

特開2010-133705号公報

Bakerら, Nature 479:232-236 2011. Bakerら, Nature 530:184-189 2016. Furmanら, Nat. Med. 25:1822-1832 2019. Siebenら, Trends Cell Biol. 9:723-737 2018. Ferrucciら, Nat. Rev. Cardiol. 15:505-522 2018. Liuら, Clin. Sci. 134:315-330 2020. Minaminoら, Nat. Med. 15:1082-1087 2009. Birchら, Genes Dev. 34:1565-1576 2020. Sharplessら, Nat. Rev. Cancer 15:397-408 2015. van Deursen, Nature 509:439-446 2014. Johnsonら, Nat. Rev. Clin. Oncol. 15:234-248 2018. Coppeら, PLoS Biol. 6:2853-2868 2008. Struykら, J. Neurosci. 15:2141-2156 1995. Lodgeら, Mol Cell Neurosci.17:746-760 2001. Gilら, J Neurosci. Nov 18:9312-9325. 1998. Mazitovら, Behav Brain Res. 15:317:311-318 2017.

　上記事情に鑑み、本発明は、細胞老化の抑制剤（細胞老化を抑制または停止させる物質）の提供を目的とする。さらに、本発明は、細胞老化の抑制剤を有効成分として含有する医薬であって、老化細胞によって惹起される状態（例えば、個体老化、肥満など）の改善薬、あるいは、老化細胞によって惹起される疾患（例えば、炎症性疾患、がん、糖尿病など）の治療のための医薬等の提供を目的とする。

　本発明者らは、ヒト正常2倍体細胞IMR-90にRasを発現して老化を誘導する系に、siRNAライブラリを導入することにより、老化に関わる遺伝子群を検索した。検索した遺伝子群の中から、抗体医薬の標的となりうる分泌タンパク質をコードする遺伝子として、ニューロトリミン（Neurotrimin； NTM）遺伝子を同定した。NTM遺伝子をノックダウンすると細胞老化が抑制され、細胞内における細胞老化マーカーのp15とp16および炎症マーカーのIL-6の発現が低下した。さらに、NTMノックアウトマウスの解析、インスリン感受性、高脂肪食負荷試験の結果等からNTMは、老化、代謝、炎症、がん化に関与することが予想された。
　以上のように、本発明者らはNTMが細胞老化に関与することを初めて明らかにした。

　さらに、本発明者らは、NTMに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製し、その中から、老化を誘導した細胞内におけるp15（細胞老化マーカー）の発現およびIL-6（炎症系サイトカイン）の発現を抑制する抗体を産生するクローンを複数取得することに成功した。
　本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。

　すなわち、本発明は以下の（１）～（１５）である。
（１）NTM（Neurotrimin）の機能阻害剤を有効成分として含有する、細胞老化抑制剤。
（２）前記NTMの機能阻害剤が抗体、ペプチドアプタマー、特殊ペプチド、核酸または低分子化合物である、上記（１）に記載の細胞老化抑制剤。
（３）上記（１）または（２）に記載の細胞老化抑制剤を含有する、個体老化の改善剤。
（４）上記（１）または（２）に記載の細胞老化抑制剤を含有する、肥満の改善剤。
（５）上記（１）または（２）に記載の細胞老化抑制剤を含有する、細胞老化によって惹起される疾患の予防または治療のための医薬組成物。
（６）前記疾患が、がん、糖尿病、高血圧症、脂質異常症、動脈硬化、脳梗塞、心臓病（心筋梗塞、心筋症、心肥大）、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝疾患（肝硬変、肝炎、脂肪肝）、認知症（アルツハイマー病）、パーキンソン病、フレイル、サルコペニア、羸痩、変形性関節症、変形性脊椎症、皮膚疾患、老人性脱毛症、白内障、ドライアイ、緑内障、加齢黄斑変性、老眼、その他の慢性炎症性疾患、その他の代謝性疾患および／または感染症である、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）上記（１）または（２）に記載の細胞老化抑制剤を含有する、飲食品組成物または化粧品組成物。
（８）アンチエイジング用、ダイエット用または血糖値低下用である、上記（７）に記載の飲食品組成物または化粧品組成物。
（９）CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｃ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｄ）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｅ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（１０）NTMの機能を抑制または阻害する抗体であって、上記（９）に記載の抗体とNTMとの結合を競合阻害する抗体またはその抗原結合断片。
（１１）Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、一本鎖抗体、scFv、scFv二量体またはdsFvであることを特徴とする上記（９）または（１０）に記載の抗原結合断片。
（１２）以下の（ａ）および（ｂ）を含む、細胞老化を抑制する物質のスクリーニング方法。
（ａ）細胞にNTMおよび候補物質を接触させる工程、および
（ｂ）NTMおよび候補物質を接触させた細胞の細胞老化の程度を評価する工程
（１３）前記細胞老化の程度を、細胞老化マーカーの発現量、またはSASP（senescence-associated secretory phenotype；SASP）関連因子の発現量を指標にして評価する、上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記細胞老化マーカーが、p16、p15またはp21である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）前記SASP関連因子が、IL-6またはIL-8遺伝子である、上記（１３）に記載の方法。
　なお、本明細書において「～」の符号は、その左右の値を含む数値範囲を示す。

　本発明にかかる剤、医薬等を用いることにより、細胞老化を阻害または抑制することができる。その結果、老化細胞によって惹起される状態（例えば、個体老化、肥満など）の改善、あるいは、老化細胞によって惹起される疾患（例えば、炎症性疾患、がん、糖尿病など）の治療が可能となる。

図１は、新規老化遺伝子を同定法するため方法の概要と、同定したNTMの構造を示す。Ａは新規の老化遺伝子のスクリーニング方法の概要を示す。ＢはNTMの構造、およびNTMが細胞膜上にアンカーされている状態を模式的に描いた図を示す。図２は、siRNAによるNTM遺伝子ノックダウンの結果を示す。siRNA によりNTMをノックダウンしたIMR90細胞におけるNTM（Ａ）、p15（Ｂ）およびIL-6（Ｃ）の遺伝子発現量を、Rasによる老化の誘導条件下または非誘導下において測定した。図３は、細胞内にNTMを強制発現させた結果を示す。NTMを発現させたIMR90細胞における、p15（Ａ）およびIL-6（Ｂ）の遺伝子発現量を、Rasによる老化の誘導条件下または非誘導下において測定した。図４は、分泌型NTMの機能解析の結果を示す。Ａは、NTMを分泌するHeLa細胞とIMR90細胞の共培養の状態を模式的に示した図である。Ｂは、IMR90細胞におけるp15 mRNAの発現量を測定した結果を示す。図５は、リコンビナントNTMの老化誘導作用を確認した結果を示す。Rasにより老化誘導したIMR90細胞（Ras）または老化誘導していないIMR90細胞（mock）における、NTM（Ａ）、p15（Ｂ）およびIL-6（Ｃ）の遺伝子発現量を測定した。図６は、マウスMEFにおけるNTMの老化における役割を検討した結果（１）である。同腹の野生型マウス（WT）およびNTM欠損マウス（NTM KO）由来のMEFの継代操作を繰り返し、継代毎に細胞の増殖率を調べた結果を示す。図７は、マウスMEFにおけるNTMの老化における役割を検討した結果（２）である。同腹の野生型マウス（WT）およびNTM欠損マウス（NTM KO）由来のMEFの継代操作を繰り返し、継代毎にp15（Ａ）、p16（Ｂ）、IL-6（Ｃ）およびNTM（Ｄ）の発現量を調べた結果を示す。図８は、肥満におけるNTMの役割の検討結果である。過食型肥満モデルであるdb/dbマウスの脂肪組織におけるNTM（Ｄ）、マクロファージマーカーのF4/80（Ｅ）、老化関連因子であるp15（Ａ）、IL-6（Ｂ）およびp16（Ｃ）の遺伝子発現量を測定した。Control；野生型マウス、db/db；肥満モデルマウス。図９は、カロリー制限を行ったマウスの体重変化の測定結果である。Fed ad libitum；自由摂食マウス群、Calory restriction；カロリー制限マウス群。図１０は、NTMおよび老化関連因子の発現に対するカロリー制限の影響を調べた結果である。自由摂食マウス（lib）およびカロリー制限マウス（CR）の代謝制御臓器におけるp15（Ａ）、IL-6（Ｂ）、p16（Ｃ）、NTM（Ｄ）、炎症系サイトカインのTNFα（Ｅ）およびF4/80（Ｆ）の遺伝子発現量を測定した。epi；内臓脂肪組織（epididymal fat）、sub；皮下脂肪組織（subcutaneous fat）、liver；肝臓、mus；筋肉、lib；自由摂食マウス群、CR；カロリー制限マウス群。図１１は、高脂肪食負荷NTM欠損マウスの解析結果（１）を示す。高脂肪食負荷NTM欠損マウス（NTM KO）と野生型マウス（WT）の体重変化（Ａ）およびITT（Insulin tolerance test）の結果（Ｂ）を示す。図１２は、高脂肪食負荷NTM欠損マウスの解析結果（２）を示す。高脂肪食負荷NTM欠損マウス（NTM KO）と野生型マウス（WT）の空腹時血糖値（Ａ）およびHbA1c値（Ｂ）を測定した結果を示す。図１３は、高脂肪食負荷NTM欠損マウスの解析結果（３）を示す。高脂肪食負荷NTM欠損マウス（NTM KO）と野生型マウス（WT）の代謝制御臓器におけるNTM（Ａ）、p16（Ｂ）、p15（Ｃ）およびp21（Ｄ）の遺伝子発現量を測定した。epi；内臓脂肪組織、sub；皮下脂肪組織、liver；肝臓、mus；筋肉。図１４は、高脂肪食負荷NTM欠損マウスの解析結果（４）を示す。高脂肪食負荷NTM欠損マウス（NTM KO）と野生型マウス（WT）の代謝制御臓器におけるIL6（Ａ）、TNFα（Ｂ）、F4/80（Ｃ）の遺伝子発現量を測定した。epi；内臓脂肪組織、sub；皮下脂肪組織、liver；肝臓、mus；筋肉。図１５は、NTMの機能阻害による細胞老化の抑制効果を調べた結果である。NTMに対する完全ヒト抗体をRasにより老化誘導したIMR90細胞に添加し、当該細胞内におけるp15（Ａ）およびIL-6（Ｂ）の遺伝子発現量を測定した。図１６は、若いマウスと老齢マウスの筋力を比較した結果である。左図は、野生型の若い雄マウス（Young）と老齢雄マウス（Old）の筋力を比較した結果で、右図は、野生型の若い雌マウス（Young）と老齢雌マウス（Old）の筋力を比較した結果である。図１７は、NTMの欠損が老化による筋力の低下に及ぼす影響を調べた結果である。左図は、野生型老齢雄マウス（WT）とNTM欠損老齢雄マウス（NTM KO）の筋力を比較した結果で、右図は、野生型老齢雌マウス（WT）とNTM欠損老齢雌マウス（NTM KO）の筋力を比較した結果である。図１８は、若いマウスと老齢マウスの筋持久力を比較した結果である。野生型の若い雌マウス（Young）と老齢雌マウス（Old）のHanging Timeを比較した結果（左図）と、Hanging Score（右図）を比較した結果を示す。図１９は、NTMの欠損が老化による筋持久力の低下に及ぼす影響を調べた結果（１）である。野生型老齢雄マウス（WT）とNTM欠損老齢雄マウス（NTM KO）のHnging Timeを比較した結果（左図）と、Hanging Score（右図）を比較した結果を示す。図２０は、NTMの欠損が老化による筋持久力の低下に及ぼす影響を調べた結果（２）である。野生型老齢雌マウス（WT）とNTM欠損老齢雌マウス（NTM KO）のHnging Timeを比較した結果（左図）と、Hanging Score（右図）を比較した結果を示す。図２１は、Frailty scoreの測定項目を示す。図２２は、NTMの欠損が老化によるフレイルに及ぼす影響を調べた結果を示す。野生型老齢雄マウス（WT）とNTM欠損老齢雄マウス（NTM KO）のFrailty scoreを比較した結果を示す。

　以下、本発明の実施形態について説明する。
　第１の実施形態は、NTM（Neurotrimin）の機能阻害剤を有効成分として含有する細胞老化抑制剤（以下「本実施形態にかかる細胞老化抑制剤」とも記載する）である。ここで、「細胞老化抑制（細胞老化の抑制）」とは、細胞が老化することを阻止もしくは阻害すること、または、細胞老化を改善することを意味する。
　「細胞老化」の指標は、多くの先行研究によって報告されており、古くはテロメア長の短縮があり、それ以外によく用いられるものとして、p15（CDKN2B）もしくはp15遺伝子の発現上昇、p16（CDKN2A）もしくはp16遺伝子の発現上昇、p21もしくはp21（CDKN1A）もしくはp21遺伝子の発現上昇、p19（CDKN2D）もしくはp19遺伝子の発現上昇、細胞老化特異的β-ガラクトシダーゼ（senescence-associated β-galactosidase：SA-β-gal）の活性化、Lamin B1の消失、細胞老化特異的ヘテロクロマチン形成（Senescence-associated heterochromatic foci：SAHF）、DNA損傷応答（DDR）および老化関連分泌表現型（senescence-associated secretory phenotype：SASP）関連因子（例えば、IL-6、IL-8、TGF-βなど）の発現上昇または分泌上昇などを挙げることができる。その他にも細胞のサイズ、粒度の増加やミトコンドリアのサイズ・数の増加とそれに伴うROS産生の増加などの形態学変化の他、レトロトランスポゾンであるLINE1の活性化や、ヒストンアセチル化酵素KAT7の増加などが報告されている（細胞老化に関する、詳細については、例えば、Gasekら, Nature aging 1:870-879, 2021などを参照のこと）。

　本実施形態におけるNTMとは、例えば、ヒトNTMタンパク質（NCBIアクセッション番号；NM_001144058；NP_001137530）の他、他の動物由来のホモログも含まれる。さらに、ヒトNTMタンパク質のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性、好ましくは、90%以上の配列同一性（例えば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上の配列同一性）を有するタンパク質であって、細胞の老化を誘導または促進するタンパク質（すなわち、当該タンパク質を細胞に接触させた場合、当該細胞が老化する（細胞老化の特徴を呈する）ようなタンパク質）であってもよい。なお、分泌されるNTMタンパク質は、NCBIアクセッション番号；NP_001137530に示されるアミノ酸配列からシグナルペプチド領域を除いたタンパク質または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。本実施形態にかかるNTMには、配列番号２で表される80%以上の配列同一性、好ましくは、90%以上の配列同一性（例えば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上の配列同一性）を有するタンパク質であって、細胞の老化を誘導または促進するタンパク質（すなわち、当該タンパク質を細胞に接触させた場合、当該細胞が老化する（細胞老化の特徴を呈する）ようなタンパク質）も含まれる。

　本実施形態において、「NTMの機能阻害剤（以下「本実施形態にかかるNTM機能阻害剤」とも記載する）」とは、NTMの機能（または活性）、特に、細胞に作用した場合に、当該細胞に細胞老化を誘導する機能（または活性）を阻害または抑制する物質のことである。NTMの機能を阻害または抑制する物質として、特に限定はしないが、例えば、NTMの機能を阻害または抑制する抗体、ペプチドアプタマー、特殊ペプチド（D-アミノ酸やN-メチルアミノ酸等を含むペプチドまたは大環状骨格を有するペプチドなど、Caryら, J. Synth. Org. Chem. Jpn., 75:1171-1177 2017）もしくは低分子化合物など、または、NTMを分解するもしくは分解を誘導する物質、NTMの発現を阻害もしくは抑制する物質（例えば、siRNA、miRNAなど）などが挙げられる。「NTMの機能阻害剤」は、第６の実施形態にかかるスクリーニング方法を用いることで、当業者であれば、容易に取得することができる。

　第２の実施形態は、NTMの機能を阻害または抑制する抗体（以下「本実施形態にかかる抗NTM抗体」とも記載する）である。
　本明細書における「抗体」は、その調製方法およびその構造は特に限定されるものではなく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはナノ抗体など、所望の抗原と所望の特性で結合する「抗体」の全てが含まれる。
　本実施形態にかかる抗NTM抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、免疫動物（限定はしないが、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、マウス、ラットまたはブタなど）に対して、抗原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、抗原および／またはアジュバントを免疫動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントとして、限定はしないが、例えば、完全フロイントおよびモノホスホリル脂質A合成－トレハロースジコリノミコレート（MPL-TMD）が含まれる。抗原の免疫後、免疫動物由来の血清から、定法により（例えば、ProteinAを保持したセファロースなどを用いる方法など）抗NTM抗体を精製することができる。

　また、本実施形態にかかる抗NTM抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、以下のようにして作製することができる。なお、本明細書において「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団（抗体を構成する重鎖、軽鎖のアミノ酸配列が同一である抗体集団）から得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法（例えば、ハイブリドーマ法など）により作製されるものとして限定的に解釈されるものではない。
　モノクローナル抗体の作製方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（KohlerおよびMilstein, Nature 256 495-497 1975）、または、組換え法（米国特許第4,816,567号）などを挙げることができる。あるいは、本実施形態にかかる抗NTM抗体は、ファージ抗体ライブラリ（例えば、Clacksonら, Nature 352 624-628 1991；Marksら, J.Mol.Biol. 222 581-597 1991など）などから単離してもよい。より具体的に説明すると、ハイブリドーマ法を用いて調製する場合、その調製方法には、例えば、以下に示す４つの工程が含まれる：（i）抗原を免疫動物に免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどが選択可能である。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤や電気融合法を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、アミノプテリンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
　このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。

　ナノ抗体とは、抗体重鎖の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）からなるポリペプチドのことである。通常ヒトなどの抗体は重鎖と軽鎖から構成されているが、ラマ、アルパカおよびラクダなどのラクダ科の動物では、重鎖のみからなる1本鎖抗体（重鎖抗体）を産生する。重鎖抗体は、通常の重鎖および軽鎖からなる抗体と同様に、標的抗原を認識し、抗原に結合することができる。重鎖抗体の可変領域は、抗原への結合親和性を有する最小単位であり、この可変領域断片は「ナノ抗体」と呼ばれている。ナノ抗体は、高耐熱性、消化耐性、常温安定性があり、遺伝子工学的手法により容易に大量に調製することが可能である。
　ナノ抗体は、例えば、以下のようにして作製することができる。ラクダ科の動物に抗原を免疫し、採取した血清から目的の抗体の有無を検出し、所望の抗体価が検出された免疫動物の末梢血リンパ球由来のRNAからcDNAを作製する。得られたcDNAからVHHをコードするDNA断片を増幅して、これを、ファージミドに挿入して、VHHファージミドライブラリを調製する。作製したVHHファージミドライブラリから数回のスクリーニングを経て、所望のナノ抗体を作製することができる。

本実施形態にかかる抗NTM抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、ヒト化抗体およびヒト抗体とのキメラ抗体などが挙げられる。キメラ抗体とは、例えば、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体（例えば、ラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に結合させた抗体）などのことで（例えば、Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855 1984.など）、遺伝子組換え技術によって容易に構築することができる。

　ヒト化抗体は、フレームワーク領域（FR）にヒト由来の配列を持ち、相補性決定領域（CDR）が他の動物種（例えば、マウスなど）由来の配列からなる抗体である。ヒト化抗体は、まず、他の動物種、ここではマウスで説明するが、マウス由来の抗体の可変領域からそのCDRをヒト抗体可変領域に移植し、重鎖および軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト化された再構成ヒト抗体可変領域をヒト抗体定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Queenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 1989.など）。

　本実施形態にかかる抗NTM抗体の抗原結合断片とは、本実施形態にかかる抗NTM抗体の一部分の領域であって、NTMに結合する抗体断片のことであり、断片としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’）₂、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびナノ抗体等）、scFv（single chain Fv）、diabody（scFv二量体）、dsFv（disulfide-stabilized Fv）、ならびに、本実施形態にかかる抗NTM抗体のCDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。

　Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。

　F（ab’）₂は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。F（ab’）₂は、抗体分子をペプシンで処理して断片を取得する他、Fabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。

　Fab’は、上記F（ab’）₂のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。

　scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH-リンカー-VLないしはVL-リンカー-VHポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。

　diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、2価の抗原結合活性を有する抗体断片である。2価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、または、一方が異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvをコードするcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。

　dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。

　CDRを含むペプチドは、重鎖または軽鎖のCDR（CDR1～3）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。

　ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（Hypervariable region）、V領域のその他の部分および定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（例えば、Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722-727 2000.など）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（例えば、Siriwardenaら, Opthalmology, 109, 427-431 2002.等を参照）により取得することができる。

　本実施形態にかかる抗NTM抗体の抗原結合断片を用いて、多重特異性抗体を構成することができる。多重特異性とは２つ以上の抗原に対して結合特異性を有することを意味し、例えば、２つ以上の抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体または抗原結合断片を含むタンパク質の形態が挙げられる。これは既知の技術によって当業者によって実施される。多重特異性を構築する方法としては、異なる２種類の抗体重鎖分子がヘテロ二量体を形成するようにタンパク工学的操作を施した非対称IgGの構築技術、抗体から得た低分子量の抗原結合断片同士を連結する、または別の抗体分子と連結する技術、などに分類される手法が複数開発されている。具体的な構築法の例はたとえば以下の文献を参考にすることができる。Kontermannら, Drug Discovery Today, 20, 838-847 2015.

　本実施形態にかかる抗NTM抗体およびその抗原結合断片として、例えば、CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体およびその抗原結合断片を挙げることができる。
（Ａ）重鎖CDR1アミノ酸配列が、GYSFTSYW（配列番３）、
重鎖CDR2アミノ酸配列が、IYPGDSDTR（配列番号４）、
重鎖CDR3アミノ酸配列が、ARQRFGEFAYYYYGLDV（配列番号５）、
軽鎖CDR1アミノ酸配列が、TGAVTTSNY（配列番号６）
軽鎖CDR2アミノ酸配列が、GTS（配列番号７）、および
軽鎖CDR3アミノ酸配列が、ALWYSTHYV（配列番号８）を有する。
（Ｂ）重鎖CDR1アミノ酸配列が、GYTLTELS（配列番号９）、
重鎖CDR2アミノ酸配列が、FDPEDGETI（配列番号１０）、
重鎖CDR3アミノ酸配列が、ATYSSGWYALDY（配列番号１１）、
軽鎖CDR1アミノ酸配列が、QSVSIY（配列番号１２）
軽鎖CDR2アミノ酸配列が、DAS（配列番号１３）、および
軽鎖CDR3アミノ酸配列が、QQRIKWPFT（配列番号１４）を有する。
（Ｃ）重鎖CDR1アミノ酸配列が、GFTFSDYY（配列番号１５）、
重鎖CDR2アミノ酸配列が、ISNDGSTIY（配列番号１６）、
重鎖CDR3アミノ酸配列が、ARDYYGSGSFYPKPHY YYYYGMDV（配列番号１７）、
軽鎖CDR1アミノ酸配列が、QSVLYSSNNKNY（配列番号１８）
軽鎖CDR2アミノ酸配列が、WAS（配列番号１９）、および
軽鎖CDR3アミノ酸配列が、QQYYSPPFT（配列番号２０）を有する。
（Ｄ）重鎖CDR1アミノ酸配列が、GFSLSTSGVG（配列番号２１）、
重鎖CDR2アミノ酸配列が、IYWDDDKR（配列番号２２）、
重鎖CDR3アミノ酸配列が、AHSAYYDILTGYALDAFDI（配列番号２３）、
軽鎖CDR1アミノ酸配列が、QSVSSY（配列番号２４）
軽鎖CDR2アミノ酸配列が、DAS（配列番号２５）、および
軽鎖CDR3アミノ酸配列が、RQRSNWPWT（配列番号２６）を有する。
（Ｅ）重鎖CDR1アミノ酸配列が、GFSLSTSGVG（配列番号２７）、
重鎖CDR2アミノ酸配列が、IYWDDDKR（配列番号２８）、
重鎖CDR3アミノ酸配列が、AHSAYYDILTGYALDAFDI（配列番号２９）、
軽鎖CDR1アミノ酸配列が、QSVLYSSNNKIY（配列番号３０）
軽鎖CDR2アミノ酸配列が、WAS（配列番号３１）、および
軽鎖CDR3アミノ酸配列が、QQYYSPPFT（配列番号３２）を有する。

　さらに、本実施形態にかかる抗NTM抗体には、CDR1～3のアミノ酸配列が上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体とNTMとの結合を競合阻害し、かつ、NTMの機能を阻害または抑制する抗体（以下「本実施形態にかかる競合抗体」とも記載する）も含まれる。本実施形態にかかる競合抗体は、当業者において周知である競合実験などにより、調製および取得することができる。具体的には、第１の抗NTM抗体（本実施形態にかかる抗NTM抗体）とNTMとの結合が、第２の抗NTM抗体によって競合阻害を受けるとき、第１の抗NTM抗体と第２の抗NTM抗体は実質的に同一、または極近傍の抗原部位に結合していると判断される。当該第２の抗NTM抗体がNTMの機能を阻害または抑制する場合には、当該第２の抗NTM抗体は本実施形態にかかる競合抗体であり、本実施形態にかかる抗NTM抗体に含まれる。なお、上記競合実験の方法として、例えば、Fab断片等を用いる方法が当該技術分野おいて、通常行われている。例えば、WO95/11317、 WO94/07922、WO2003/064473、WO2008/118356およびWO2004/046733などを参照のこと。また、NTMの機能を阻害または抑制するかどうかは、実施例に開示される方法、例えば、細胞内における細胞老化マーカー（p15、p16またはp21など）の発現を低下させるかどうか、または細胞からのSASP関連因子の分泌を抑制するかどうかなどを調べることにより容易に確認することができる。

　第３の実施形態は、本実施形態にかかる細胞老化抑制剤（すなわち、NTMの機能阻害剤を有効成分として含有する細胞老化抑制剤）を含有する、医薬、または組成物（例えば、医薬組成物、飲食品組成物、化粧品組成物など）（以下「本実施形態にかかる医薬および組成物等」とも記載する）である。あるいは、第３の実施形態は、NTMの機能阻害剤を有効成分として含有する、医薬または組成物である。
　前述の通り、細胞老化を抑制または阻害すると、個体老化の進行が抑制される。実際に、本発明者らは、NTMの機能阻害により、加齢に伴う筋力および筋持久力の低下が抑制されることを確認した（実施例を参照のこと）。さらに、NTMの機能阻害により、加齢に伴うフレイル（frailty syndrome）の進行を抑制することができること（実施例におけるノックアウトマウスを用いた実験の結果を参照のこと）も確認した。従って、本実施形態にかかる細胞老化抑制剤の使用により、個体老化の進行を抑えることができると考えられる。
　また、NTMの機能を阻害することは、加齢に伴う疾患（動脈硬化症や骨粗鬆症など）の治療を行う上で有効であると考えられる。老化した細胞が存在する組織では、慢性的な炎症状態が進行しており、この慢性的な炎症状態が、がんや慢性炎症疾患などの原因になると考えられている。さらに、肥満も慢性的な炎症状態と考えられており、肥満状態下の生体組織においては、炎症や細胞老化が誘導され、このような炎症状態または細胞老化が、例えば、脂肪組織における細胞老化が肥満に伴うインスリン抵抗性の獲得の要因となることも報告されている。
　従って、第３の実施形態にかかる医薬および組成物等は、個体老化もしくは肥満の改善剤、細胞老化によって惹起される各種疾患の予防薬もしくは治療薬などとして使用することができる。細胞老化によって惹起される各種疾患としては、特に限定はしないが、例えば、加齢、肥満、慢性的炎症によって発症する各種疾患および代謝性疾患など、より具体的には、例えば、がん、糖尿病、高血圧症、脂質異常症、動脈硬化、脳梗塞、心臓病（心筋梗塞、心筋症、心肥大）、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝疾患（肝硬変、肝炎、脂肪肝）、認知症（アルツハイマー病）、パーキンソン病、フレイル、サルコペニア、羸痩、変形性関節症、変形性脊椎症、皮膚疾患、老人性脱毛症、白内障、ドライアイ、緑内障、加齢黄斑変性、老眼、その他の慢性炎症性疾患、および／またはその他の代謝性疾患などを挙げることができる。さらに、最近の報告によると、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）による感染症では、その重症化に細胞老化が重要な役割を果たしていること、新型コロナウイルスが細胞老化を誘導する機能を持つことが明らかとなっており（Leeら, Nat. 599:283-289 2021）、第３の実施形態にかかる医薬および組成物等は、感染症の治療用途にも使用することが可能である。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等は、有効成分（例えば、NTMの機能阻害剤自体、またはNTMの機能阻害剤を含有する細胞老化抑制剤など）自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である１または複数の物質の他、１または２以上の製剤用添加物を含む組成物の形態で投与することが望ましい。本実施形態にかかる医薬および組成物等の有効成分としては、異なる複数の本実施形態にかかる細胞老化抑制剤を含んでもよい。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤、点眼剤などが挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、有効成分を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

　経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤もしくは液剤等の形態の経口投与用医薬等、静脈内投与用、筋肉内投与用もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤、点眼剤、軟膏、クリーム剤などの形態の非経口投与用医薬等として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合および製造方法などは、当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して1重量％から90重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。

　経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠してもよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

　非経口投与用製剤のうち、注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのpH調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。

　点眼剤は、水性の溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に有効成分を懸濁または溶解させた液剤の形態として製造してもよい。

　軟膏、クリーム剤については、有効成分と基剤および添加剤を練り合わせ、混合することで製造することができる。油脂性軟膏剤は、例えば、油脂類、ろう類、パラフィンなどの炭化水素類などの油脂性基剤を加温して融解し、有効成分を添加し、混和して溶解または分散させ、全体が均質になるまで混ぜて練り合わせることにより製造することができる。水溶性軟膏剤は、例えば、マクロゴールなどの水溶性基剤を加温して融解し、有効成分を添加し、全体が均質になるまで混ぜて練り合わせることにより製造することができる。
　クリーム剤は、例えば、ワセリン、高級アルコールなどをそのまま、もしくは乳化剤などの添加剤を加えた油相、または、精製水をそのまま、もしくは乳化剤などの添加剤を加えた水相のいずれかに有効成分を添加し、それぞれ加温し、油相および水相を合わせて全体が均質になるまでかき混ぜて乳化することにより製造することができる。

　非経口直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基剤と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等の投与量および投与回数は特に限定されず、改善すべき状態もしくは治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
　一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01～1000mg（有効成分重量）程度であり、一日１回または数回に分けて、あるいは、数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001～100mg（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等は、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として調製してもよい。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。

　本実施形態にかかる医薬および組成物等は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる薬剤は、当該治療薬等の構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。また、キットに添付される使用説明書は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROM、DVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよく、あるいは、インターネットなどにより入手可能な電子ファイルであってもよい。

　本実施形態にかかる組成物が、飲食品組成物として提供される場合、その形態は特に制限されず、例えば、清涼飲料、栄養飲料等の飲料、キャンディー、ガム、ゼリー、クリーム、アイスクリームなどの菓子類、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、バター等の乳製品、その他サプリメント（栄養補助食品）などであってもよい。本実施形態にかかる飲食品組成物として、特に限定はしないが、例えば、個体老化の予防または防止を目的としたアンチエイジング（抗加齢）用のサプリメント、ダイエット（体重の減少）用サプリメント、血糖値の低下のためのサプリメント、筋力の維持または増強のためのサプリメントなどを挙げることができる。

　第４の実施形態は、インビトロまたはインビボにおいて細胞老化を抑制または阻害する方法であって、NTMの機能（または活性）を抑制または阻害することを含む、前記方法である。ここで、NTMの機能（または活性）とは、前述のように、細胞に作用して、当該細胞に細胞老化を誘導する機能（または活性）のことである。例えば、生体内における細胞老化を抑制する場合には、NTM阻害剤（例えば、第２の実施形態にかかる抗体の他、NTMの機能を阻害する低分子化合物など）を薬学的に許容される担体等と共に生体に投与してもよい。
　また、第４の実施形態には、インビトロまたはインビボにおいて細胞老化を抑制または阻害するための、NTM阻害剤の使用も含まれる。
　なお、第４の実施形態においては、インビボにおいて細胞老化を抑制する場合その行為の中から医療行為は除外される。また、インビボでNTM阻害剤を使用する場合において、医療行為としての使用は除外される。従って、第４の実施形態には、例えば、個体老化の予防または防止を目的としたアンチエイジングのために、NTM阻害剤を含む飲食品組成物または化粧品組成物などを生体に投与（例えば、経口投与（例えば、サプリメントの服用）また経皮投与（例えば、化粧品組成物の皮膚等への塗布）など）する工程が含まれていてもよい。
　ただし、第５の実施形態にかかる予防方法および治療方法に、NTM阻害剤の医療行為としての使用が含まれることは言うまでもない。

　第５の実施形態は、本実施形態にかかる医薬等（すなわち、本実施形態にかかる細胞老化抑制剤を含有する医薬または医薬組成物）を、対象者（疾患の予防または治療の対象者）に投与することを含む、個体老化の改善方法、肥満の改善方法、または細胞老化によって惹起される疾患の予防方法もしくは治療方法である。
　ここで、「改善」とは、ある時点における身体的状態をより好ましい状態にすることで、個体老化の改善には、例えば、加齢に伴う身体能力の衰えを阻止または衰えの速さを低減させることなどが含まれ、肥満の改善には、例えば、体重の減量の他、メタボリックシンドロームの改善なども含まれるが、これらの概念に限定されるものではない。
　「治療」とは、治療対象のほ乳動物において引き起こされる病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味する。また、「予防」とは、疾患を発症するおそれがあるほ乳動物において、その発症を予め阻止することを意味する。
　本実施形態にかかる医薬等を投与する対象者は、ほ乳類に分類される任意の動物であればよく、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、霊長類に属する動物など、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい投与対象者は、ヒトである。

　第６の実施形態は、NTMの機能阻害剤を探索することを含む、細胞老化を抑制する物質のスクリーニング方法である。より具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）を含む、細胞老化を抑制する物質のスクリーニング方法である。
（ａ）細胞にNTMおよび候補物質を接触させる工程、および
（ｂ）NTMおよび候補物質を接触させた細胞の細胞老化の程度を評価する工程
　NTMは、他の細胞または、NTMを発現する細胞自身に作用し、その細胞の老化を誘導することが考えられる。従って、NTMの機能を阻害する物質は、細胞老化を抑制すると考えられる。実際、NTMに対する抗体（中和抗体）が、老化誘導された細胞内における細胞老化マーカー（例えば、p15など）の発現を抑制し、細胞からのSASP関連因子（例えば、IL-6など）の分泌を抑制することが本発明によって明らかにされている（詳細は、実施例を参照のこと）。

　工程（ａ）は、NTMと細胞老化を抑制する候補物質を、細胞老化を誘導した細胞に接触させる工程である。具体的には、例えば、細胞を培養している培地に、NTM（例えば、分泌型NTM）と候補物質を適量添加し、適当な温度下にて培養することで、工程（ａ）を実施することができる。場合によっては、予め細胞老化を誘導した細胞を用いてもよい。この場合、細胞老化の誘導は、特に限定はしないが、例えば、Rasタンパク質を細胞内で発現させることなどにより誘導することができる。
　NTMと細胞老化を抑制する候補物質を細胞に接触させる順序は、いずれが先であっても、または同時であってもよい、あるいは、予め、NTMと候補物質を混合したのち混合物を細胞に接触させてもよい。

　工程（ｂ）は、NTMによる細胞老化の誘導を候補物質が抑制するかどうかを調べる工程である。ここで、細胞が老化したかどうかは、上述したように、テロメア長の短縮、p15、p16、p21、p19、SA-β-galなどの細胞老化マーカーの発現上昇もしくは活性化、Lamin B1の消失、SAHF、DDRまたはSIL-6、IL-8、TGF-βなどのSASP関連因子の分泌の増加などを指標に評価できる。これらの指標により、候補物質を接触させない細胞と比較して、候補物質を接触させ細胞における細胞老化の特徴量が減少している場合、当該候補物質は、細胞老化を抑制するまたは細胞老化を抑制する可能性があると判断することができる。

　本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。また、本明細書において、「約」とは±10%の数値範囲を意味する。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

１．材料と方法
１－１．細胞培養試薬
　粉末MEM（Minimum essential medium）、粉末DMEM（Dulbecco’s modified eagle’s medium）、粉末RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）培地は日水製薬株式会社から購入した。ペニシリンおよびストレプトマイシン（P/St）は、株式会社明治製菓から購入した。ウシ胎児血清（fetal bovine serum; FBS）は、Equitech-BioもしくはGIBCOより購入した。トリプシン粉末は、GIBCOから購入した。RNAi library、ヒトNeurotrimin（NTM）に対するsiRNAおよびそのコントロールとなるsiRNAはThermo Fisher Scientificより購入した。その他、特に指定のない実験試薬類は、Wako、ナカライテスクもしくはSIGMAの特級、または生化学実験用のものを用いた。

１－２．細胞培養試薬の調製
PBS(-) 溶液
　137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.76 mM KH₂PO₄となるように各試薬をMilliQ水で溶解し、オートクレーブした後、常温で保存した。
200 mM L-Glutamine
200 mMになるようにMillQで溶解させた、フィルター滅菌を行った後。4℃で保存した。
10 % NaHCO ₃
MilliQ水に溶解させ、オートクレーブした後、4℃で保存した。
DMEM（High Glucose）
　4.75 gの粉末のDMEMを500 mLのmilliQに溶解し、30分間撹拌後にオートクレーブした。そこに200 mM L-Glutamineを10 mL、20 % Glucoseを8.75 mLを加えた。さらに10 % NaHCO₃溶液を培地が赤色に変化するまで適量加えたものをDMEM（High Glucose）として用いた。
MEM
　4.7 gの粉末のMEMを500 mLのmilliQに溶解し、30分間撹拌後にオートクレーブした。そこに200 mM L-Glutamineを5 mLを加えた。さらに10 % NaHCO₃溶液を培地が赤色に変化するまで適量加えたものをMEMとして用いた。
RPMI 1640
　5.1 gの粉末のRPMI 1640を500 mLのmilliQに溶解し、30分間撹拌後にオートクレーブした。そこに200 mM L-Glutamineを5 mL加えた。さらに10 % NaHCO₃溶液を培地が赤色に変化するまで適量加えたものをRPMI 1640として用いた。

ウシ胎児血清（FBS）
　-20℃で凍結した血清の入った容器を37℃の温浴中で溶解した後、56℃で30分間インキュベートし、補体成分の非働化を行った。
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（P/St）
　500 μLずつ分注し、-20℃で保存した。使用時に、培地に1/1000量（終濃度100 units / mL ペニシリン、100 μg / mL ストレプトマイシン）加えた。
ポリブレン（hexadimethrine bromide）
　milliQ水で10 mg/mlに調整し、0.20 μmフィルターでろ過滅菌を行った（用事調整）
4-OH Tamoxifen
エタノールで1 mMとなるように調整し、-20℃で保存した。使用時に、培地に1/5000量（終濃度200 nM）加えた。

１－３．プラスミド
pCMV-Flag-NTM、pBabe-Flag-NTM(Puro)、pET38a-His-NTMは、常法により調製し、保存したものを使用した。Rasタンパク質を発現させるためのプラスミドとして、pLNCX2 ER:RasをAddgeneより購入した。

１－４．リコンビナントNTMタンパク質の作製
　分泌型NTMを保持するプラスミドは、分泌型NTMのcDNA配列（配列番号１）をpET38aベクターに組み込み、N末端にHisタグを付加した。調製したプラスミドで、大腸菌株BL21を形質転換し、得られた形質転換体を大量培養した。培養後の菌体から、Hisビーズを用いて、目的の分泌型NTMタンパク質を濃縮および精製した。得られたタンパク質は、ニトロセルロース膜を用いてPBS(-)で一晩透析した後、BCA法にてタンパク質濃度の測定を行った。

１－５．抗NTMヒトモノクローナル抗体の作製
　抗NTMヒトモノクローナル抗体の作製は、株式会社Trans Chromosomicsに委託し、完全ヒト抗体産生マウスTC-mABTMを用いて行った。抗原には、全長のNTMを強制発現させたCHO細胞、またはNTMを強制発現させたExpi293F細胞の培養上清からHisビーズを用いて精製した分泌型のリコンビナントNTMタンパク質を用いた。作製した抗体がNTMタンパク質を認識していることは、NTMを強制発現させたHeLa細胞もしくはCHO細胞を用いて、各細胞が生細胞状態で細胞膜上が染色されることを指標にして確認した。

１－６．細胞を用いた解析
１－６－１．細胞培養
IMR90細胞
　IMR90細胞は、MEM、10% FBS、1×MEM Non-Essential Amino Acids Solution、1 mM Sodium Pyruvateを用い、37℃、5% CO₂、3% O₂の低酸素インキュベーター内で培養し、1×10⁶ cells/dishで継代を行った。
HeLa細胞
　HeLa細胞は、MEM、10% FBSを用い、37℃、5% CO₂のインキュベーター内で培養し、1×10⁶ cells/dishの割合で継代を行った。
Plat A細胞
　Plat A細胞はDMEM（High Glucose）、10% FBSを用い、37℃、5% CO₂のインキュベーター内で培養し、1×10⁶cells/dishの割合で継代を行った。
MEF
　MEFはDMEM（High Glucose）、10% FBS、P/Stを用い、37℃、5% CO₂,のインキュベーター内で培養し、1×10⁶ cells/dishの割合で継代を行った。
ハイブリドーマ
　株式会社Trans Chromosomicsにて作製されたハイブリドーマは、PRMI1630、10% FBS、P/St、HT培地サプリメントHybri-Max^TM、5 % Bricloneを用い、37℃、5% CO₂、のインキュベーター内で培養した。

１－６－２．Real-time PCR
　SYBR Green（Roche）を用いて各遺伝子のmRNA発現量を定量した。基本的な反応液の組成を以下に記す。
Power SYBR Green PCR Master Mix: 5 μL
5 μM forward primer: 1 μL
5 μM reverse primer: 1 μL
Template cDNA：3 μL
　Light Cycler 480 Multiple plate 96、white（Roche）中で上記の反応液を混合し、スピンダウンを行った後、Light Cycler 480（Roche）を用いて反応および定量を行った。定量にはΔCT法を用いた。それぞれの遺伝子のmRNA量は、HPRT1またはs17のmRNA量で除することで補正した。また1回の試行につき3連のサンプルを用い、平均値と標準偏差を算出した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。

１－６－３．PEI（plyethylenimine）を用いた遺伝子導入
　PEIによる遺伝子導入はPlat A細胞を用いた場合に行った。以下に10 cm dishを用いた場合の遺伝子導入法を示す。
　20 μgのプラスミドDNAをOpti-MEM（GIBCO)：1000 μLに加えてゆるやかに混和し、DNA Mixを調製した。一方で60 μLのPEIを1000 μLのOpti-MEMに加えてゆるやかに混和し、PEI Mixを調製した。5分後、DNA MixとPEI Mixを混和し、20分間室温でインキュベートした。得られたDNA complexの溶液500 μLを培地10 mLで培養している細胞に均一に行き渡るように加えた。37℃、5% CO₂のインキュベーターで培養し、12時間後、基本培地に培地交換した。

１－６－４．レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　トランスフェクションの前日、HEK293-T細胞由来のウイルスパッケージング細胞であるPlat A細胞を、100 mm dishに2×10⁶ cells/dishとなるように播種した。翌日、レトロウイルスベクターをそれぞれ30 μgずつ、PEIを用いて遺伝子導入した。以下、遺伝子導入後からIMR90細胞へのインフェクションまでの操作はP2レベルで行った。
　遺伝子導入から12時間後にMEM培地（10% FBS、1×NEAA、 1 mM Sodium Pyruvate）で培地交換（10 mL/dish）を行い、さらに24～36時間後に培養上清を回収した。得られた培養上清を0.45 μmフィルター（Advantec）を通すことで濾過滅菌し、レトロウイルスストック液とした（-80℃保存）。得られたレトロウイルス液に、用事調製した10 mg/mLポリブレン溶液を終濃度10 μg/mLとなるように加え、レトロウイルス溶液とした。
　インフェクションする前日、IMR90細胞を6 well plateに2×10⁵ cells/wellとなるように播種した。翌日、レトロウイルス溶液を2 mL/wellとなるように加え、1,370×g（PlateSpin II（Kubota）で3,500 rpm）、室温で90分間遠心した。37℃、5% CO₂のインキュベーター内で8時間培養後、培地を通常のIMR90細胞用の培地に交換した。
　インフェクションを行った2日後、ネオマイシンまたはピューロマイシンを含む培地で継代操作を2回挟んで培養することで、感染細胞のセレクションを行った。

１－６－５．Lipofectamin RNAi MAXを用いたノックダウン法
　Lipofectamin RNAi MAX（Invitrogen）による特定遺伝子のノックダウンはIMR90細胞を用いて行った。以下に12 well plateを用いた場合のRNAi導入法を示す。
　10 pmolのsiRNA（Thermo Fisher）をOpti-MEM（GIBCO)：100 μLに加えてゆるやかに混和し、RNA Mixを調製した。一方で3 μLのLipofectamin RNAi MAXを100 μLのOpti-MEMに加えてゆるやかに混和し、Lipofectamin Mixを調製した。5分後、RNA MixとLipofectamin Mixを混和し、20分間室温でインキュベートした。得られたRNA complexの溶液200 μLをP/Stを除いた培地2 mLで培養している細胞に均一に行き渡るように加えた。37℃、5% CO₂のインキュベーターで培養し、12時間後、基本培地に培地交換した。

１－６－６．Ras誘導型IMR90細胞を用いた細胞老化誘導実験
　Plat A細胞にpLNCX2 ER:Rasを導入することにより、レトロウイルスを産生させた。作製したレトロウイルスをIMR90細胞に感染させた後、ネオマイシン存在下で感染細胞の選択を行い、得られた細胞をIMR90 ER-Rasとして用いた。
　Ras誘導に伴う細胞老化は、IMR90 ER-Ras細胞に200 nMの4-OH tamoxifenを4～6日間作用させることにより誘導した。

１－７．マウスを用いた解析
１－７－１．野生型およびNTM欠損マウスの飼育
　NTM欠損マウスは、凍結胚をMutant Mouse Resource and Research Center（MMRRC）より入手し、C57B6マウスとの十分な戻し交配を行った後に飼育および繁殖を行った。マウスは12時間毎の明暗サイクルの照明下でSPF条件下において飼育され、固形飼料CE-2（CLEA）と水（オートクレーブした蒸留水）は自由摂取とした。床敷は乾熱滅菌されたソフトチップを使用し、ケージは夏目製作所、飲水ボトルは日本クレアよりそれぞれ購入したものを用いた。全ての実験はNTMヘテロ欠損マウス雌雄のかけ合わせから得られた同腹子を用いて行った。また、全ての動物実験は東京大学動物実験実施規則に基づいて行った。

１－７－２．Genotyping
　個体標識には耳パンチ法を用いた。手術用はさみを用いて4週齢程度のマウスより尻尾を約2 mm切り取り、1.5 mLチューブに採取した。600 μLの50 mM NaOHを加え、90 ℃のヒートブロックで30分間処理した。熱処理後、10秒間ボルテックスを行い、溶液を十分に攪拌した後、1 M Tris-HCI（pH8.0）を50 μL加え、再びよくボルテックスした。その後、15,000 rpm、4℃で10分間遠心を行ったものの上清を、以下のPCR反応におけるTemplate genome DNA solutionとして用いた。野生型、NTM KOのそれぞれのアリルを特異的に認識するプライマーを以下に示す。
[NTM (wild-type allele)]
Sense: 5’- CTGAACTGCTACGGGGAAGAG -3’（配列番号３３）
[knockout allele]
Sense: 5’- GCAGCGCATCGCCTTCTATC -3’ （配列番号３４）
[common allele (Reverse)]
Antisense: 5’- CTCGGGAAAAGGCAGTAGCAG -3’ （配列番号３５）

１－７－３．マウス胚性幹細胞（mouse embryonic fibroblast：MEF）の調製
　トリプシン溶液は、トリプシン粉末（GIBCO）を0.25%（w/v）となるようにPBS (-) に溶かし、0.45 μmフィルター（Advantec）に通して濾過滅菌した（用事調整）。
　NTMヘテロ欠損マウスの雌雄を交配させた日から13.5日後、NTMヘテロ欠損雌マウスの全身を70%エタノールでアルコール消毒し、開腹後に胎児の入った子宮を取り出した。臍帯の付け根をはさみで切断後、子宮から胎児を一匹ずつ取り出してPBS (-) に浸した。胎児から頭、内臓、手足、尻尾を除いた後、氷冷したトリプシン溶液1 mLに移し、鋭利なはさみを用いて2～3 mmにミンスした。15 mLチューブに移し、トリプシン溶液で液量を胎児1匹あたり5 mLに合わせ、37℃で60～100 cycle/minで消化具合を見ながら10分間振盪した。トリプシンの反応を止めるため、FBSを1 mL加えてよく懸濁し、さらに細胞塊を除くためこれを100 μm セルストレーナー（Falcon）のメッシュを用いて濾過した。濾過された細胞懸濁液を遠心（280×g、5分間、4℃）後、上清を除き、得られた沈殿を基本培地（DMEM (High Glucose)、10% FBS、P/St）で懸濁して100 mm dishに胎児1匹当たり1 wellの割合で播いた。翌日、培地交換を行い、トリプシン処理により播き直して実験に用いた。

１－７－４．マウス血清の調製および血清成分の測定
　マウスの血液は、麻酔下にてシリンジと23G注射針を用いて下大静脈から採血した。採血後、血液は1.5 mLチューブに移し、転倒攪拌を行った後に常温で1時間静置した。静置後、4℃、3000 rpmで30分間遠心し、上清画分を回収することで血清を得た。ヘモグロビンA1cの測定には、マウス血液30 μLを10 mMのEDTA 5 μLと混合したものを用いた。マウスの血液成分の測定は長浜ライフサイエンスラボラトリーに委託した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。

１－７－５．インスリン負荷実験（Insulin Tolerance Test；ITT）
　単独飼育条件下で4時間絶食した野生型およびNTM欠損マウスに、1 IU（International Unit）/kgとなるように、PBSで希釈したHuman recombinant insulin（Invitrogen）を腹腔内投与した。その後、0、30、60、90、120分と経時的に尾静脈から採血し、血糖値を、アセンシアブリーズ2（バイエル薬品株式会社）を用いて測定した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。

１－７－６．db/dbマウスの飼育・解剖
　肥満モデルマウスであるdb/dbマウス（BKS Cg. db/db）は日本クレアより購入した。対照群として、db/dbマウスのコントロールマウス（BKS Cg. m+/m+）を同じく日本クレアから購入し、実験に用いた。それぞれのマウスは単独飼育条件下で15週齢まで飼育し、6時間絶食した後に屠殺し、各臓器を回収した。

１－７－７．マウスへの摂取カロリー制限実験
　日本クレアより購入したC57BL6Jの雄マウスを体重が均等になるように2群に群分けし、単独飼育した。自由摂食群は、十分量の餌を与えた状態で自由に食餌させ、週当たりの摂食量を記録した。摂取カロリー制限群には、自由摂食群が摂食した60%の重量の餌になるように週3回に分けて給餌した。両群ともに経時的に体重を計測し、210日間飼育した。屠殺前に2時間絶食して臓器を回収した。

１－７－８．マウスへの高脂肪食負荷実験
　4‐6週齢雄の野生型マウスおよびNTM欠損マウス8-12匹を単独飼育し、高脂肪食（60 kcal%Fat, High Fat Diet:HFD）（Research diets）を給餌し、9週間にわたって体重と摂食量を測定した。9週間の高脂肪食給餌後、6時間絶食後屠殺した。

１－７－９．老齢マウスの筋力の測定
　600日齢の野生型およびNTM欠損老齢マウスの筋力（握力）をGrip strength Testにより測定した。Grip strength Testは、スマート型ラット・マウス用握力測定装置MK-380Si（室町機械）を用いて実施した。マウス1匹につき3回の測定を行い、その平均値を各マウスの握力値とした。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。

１－７－１０．老齢マウスの筋持久力測定
　600日齢の野生型およびNTM欠損老齢マウスの筋持久力を4-limb Hanging Test（Hanging test）により測定した。試験はワイヤーハンギング実験箱（小原医科産業株式会社）を用いて行い、マウスが全ての手足で金網を握っている条件下で金網をマウスと共に上下反転し、落下するまでに耐えた時間を耐久時間（Hanging time）とした。さらに、この耐久時間と各々のマウスの体重をかけあわせたものをHanging scoreとして評価した。有意差検定にはスチューデントのt検定を用いた。

１－７－１１．Frailty scoreの算出
　960日齢の野生型およびNTM欠損雄マウスのFrailty scoreを算出した。Frailty scoreの指標は先行論文（Whiteheadら, J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-32 2014）に一部改訂を加えたものを使用した。1匹のマウスにつき各項目について、0, 0.5, 1の3段階で評価し、合計23項目の合計値を各々のマウスのFrailty scoreとして算出した。Frailty scoreの測定項目は図２１に示す。

２．結果
２－１．老化遺伝子のスクリーニング
　細胞老化を制御する新規因子を探索・同定する目的で、スクリーニング系の構築を行った。ヒト正常線維芽細胞であるIMR90に細胞増殖因子Rasタンパク質の発現を薬剤依存的に増加させることで老化を誘導する系（Innesら, Methods Mol Biol. 1896: 83-92 2019）を作製し、その細胞に対してsiRNAライブラリを用いて網羅的に遺伝子のノックダウンを行った。その時、細胞老化の変化を細胞老化マーカーp15 mRNAの発現量の変動により評価し、ノックダウンにより細胞老化が変化する遺伝子の絞り込みを行った。絞り込まれた因子の中で、コードするタンパク質が分泌タンパク質でありSASP因子様に働くことが期待されるタンパク質である、ニューロトリミン（Neurotrimin；NTM）に注目した。
　NTMは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）により細胞膜にアンカーされるGPIアンカータンパク質の一種で、N末側に細胞外に分泌されるために必要なシグナルペプチド配列、C末側にはGPI付加に必要なシグナルペプチド配列が存在し、さらに分子中央には３つのIgG-likeドメインが存在する（図１Ｂ参照）。

２－２．siRNAによるNTM遺伝子のノックダウン
　ヒト正常線維芽細胞のIMR90細胞のNTMをsiRNAによりノックダウンすると（図２Ａ）、Rasによって誘導されるp15およびIL-6の発現量の増加が抑制された（図２ＢおよびＣ）。従って、NTMは、細胞老化を誘導および／または促進する機能を有すると考えられた。

２－３．NTMの強制発現
　IMR90細胞にレトロウイルスを用いてNTMを強制発現させた。その結果、Rasによって誘導されるp15およびIL-6の発現量の増大が、NTMの発現により促進された（図３ＡおよびＢ）。この結果も、NTMが、細胞老化を誘導および／または促進する機能を有することを示唆している。

２－４．NTMの機能解析
　以上の結果から、細胞から分泌されたNTMは、周囲の細胞に作用し、老化を誘導することが予想された。そこで、NTMを強制発現したHeLa細胞とRasにより老化を誘導したIMR90細胞をtranswellで共培養した（図４Ａ参照）。分泌されたNTMが細胞に作用して老化を誘導するならば、HeLa細胞から分泌されたNTMはメンブレンを通過して、IMR90細胞に作用し、老化を誘導することが予想される。NTMを強制発現したHeLa細胞と共培養したIMR90細胞の老化マーカーであるp15の発現量を調べたところ、発現の増加が確認された（図４Ｂ）。従って、HeLa細胞から分泌されたNTMがIMR90細胞の老化を誘導したものと考えられる。

２－５．リコンビナントNTMによる老化の誘導
　次に、大腸菌を用いてリコンビナントNTM蛋白質（rNTM）を作製し、Rasで老化を誘導したIMR90細胞に作用させた。その結果、rNTM（40 ng/mL）を培地に加えるとp15およびIL-6の発現が誘導されることが明らかになった（図５ＢおよびＣ）。また、NTM遺伝の発現も誘導された（図５Ａ）

２－６．マウスMEFにおけるNTMの老化における役割
　次に、NTM欠損マウスの胎児から調製したMEF（Mouse embryonic fibroblast）を用いた解析を行った。MEFは継代操作を繰り返すことにより、細胞老化が生じ、細胞増殖が段々と低下することが分かっている。そこで、同腹の野生型マウスおよびNTM欠損マウス由来のMEFの継代操作を繰り返し、増殖の変化を検討した。その結果、NTMの欠損により、継代数の増加に伴う細胞増殖の低下が抑制されていることが明らかになった（図６ＡおよびＢ）。さらに、NTMの欠損により継代数の増加に伴うp15、p16およびIL-6の発現誘導が抑制されていることが明らかになった（図７Ａ、ＢおよびＣ）。
　以上の結果より、マウスのMEFにおいてもNTMは老化を誘導する機能を有することが示された。

２－７．肥満におけるNTMの役割
　NTMがマウス個体における老化に関わっているかを検討した。マウス個体において老化を誘導する方法の1つが肥満である。肥満においては脂肪組織を中心に慢性的な炎症状態に陥っており、老化が惹起されていることが知られている。そこで、過食型肥満モデルとして用いられているdb/dbマウス（満腹ホルモンレプチンの受容体が欠損している）の脂肪組織におけるNTMならびに老化関連因子の発現変動を検討した。その結果、肥満により、脂肪組織においてp15、p16およびIL-6の発現誘導が確認され、その時、NTMの発現も増加傾向を示していることが明らかとなった（図８）。

２－８．カロリー制限によるNTMの発現抑制
　肥満とは逆の実験としてマウスを用いて摂取カロリーの制限実験を行った。カロリー制限は、最も有名な寿命延長法の1つであり、マウスを始めとしてサルなどの高等生物においても摂取カロリーの制限により老化が抑制され、寿命が延長することが報告されている（Colmanら, Science 325:201-204 2009）。そこで、マウスに対し、40％の摂取カロリー制限（Calory restriction；CR）を30週間課し、代謝制御臓器におけるNTMおよび老化関連因子の発現変動を自由摂食群（Fed ad libitum；lib）と比較した。
　カロリー制限によりマウスの体重は減少した（図９）。そして、カロリー制限により、内臓脂肪組織（epididymal fat；epi）および皮下脂肪組織（subcutaneous fat；sub）において、老化関連因子であるp15（図１０Ａ）、IL-6（図１０Ｂ）およびp16（図１０Ｃ）の発現が低下し、明らかに老化の抑制が確認された。この時、NTMの発現は脂肪組織を中心として顕著に低下していることが確認された（図１０Ｄ）。

２－９．高脂肪食負荷NTM欠損マウスの解析
　通常飼育条件下において、NTM欠損マウスは、若齢時には雌雄ともに野生型マウスと比較して体重およびインスリン感受性に差は認められなかった。そこで生理的に老化を誘導するため、高脂肪食負荷を行って肥満状態とし、この時生じた体重変化ならびにインスリン感受性の変化をITT（Insulin tolerance test）にて検討した。ITTは、マウスにインスリンを投与し、経時的に血糖値の変化をモニタリングする実験で、インスリン感受性の高いマウスはインスリン投与後速やかに血糖値の減少が認められるが、肥満などでインスリン抵抗性を獲得した個体ではインスリン投与による血糖値の減少が緩慢になる。
　その結果、NTM欠損マウスに高脂肪食を与えた個体では、体重は有意な差とは認められなかったものの減少傾向を示し（図１１Ａ）、インスリン感受性が有意に改善した（図１１Ｂ）。また、空腹時血糖値が減少傾向にあること（図１２Ａ）、糖尿病マーカーHbA1cの値が有意に低下していること（図１２Ｂ）も明らかとなった。さらに、脂肪組織を中心とした代謝制御臓器において、p15、p16およびp21などの細胞老化マーカー（図１３）および炎症マーカー（図１４）の発現が低下していることが明らかとなった。

２－１０．NTMの機能阻害抗体を用いた解析
　これまでの結果より、NTMは、１）細胞外に分泌されて他細胞の老化を誘導すること、あるいは、膜結合型NTMが当該NTMを発現する細胞または隣接する他の細胞の老化を誘導すること、２）肥満により脂肪組織において発現誘導を受けること、３）NTMを欠損すると肥満におけるインスリン抵抗性の獲得が阻害されることが明らかとなった。これらの事実より、NTMに対する中和抗体（機能を阻害する抗体）は細胞老化、個体老化、炎症、肥満/糖尿病、がんなど多様な疾患に対する治療薬になりうると考えられる。そこで、完全ヒト抗体産生マウス（染色体導入によりヒト抗体遺伝子全長を安定に保持するマウス）を用いてNTMに対する中和抗体の作製を試みた（Trans Chromosomicsに委託）。NTMを強制発現させた細胞またはリコンビナントNTMタンパク質をマウスに免疫し、NTMに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立した。得られたクローンの中で、NTM中和活性を有するもの、すなわち老化の誘導を阻害する機能を有するクローンを、p15遺伝子およびIL6遺伝子の発現抑制を指標にして選別した。その結果、Rasにより老化を誘導したIMR90細胞におけるp15、IL-6の発現を抑制できる抗体の取得に成功した（前述の抗体（Ａ）～（Ｅ））。
　具体的には、得られた抗NTMヒトモノクローナル抗体（前述の抗体（Ａ））を、100 ng/mLまたは1,000 ng/mLとなるようにIMR90細胞の培養液に添加し、4日間培養した後、IMR90細胞におけるp15およびIL-6遺伝子の発現量を測定した。その結果、IMR90細胞におけるp15およびIL-6の遺伝子発現量は、抗体の添加により、抑制させることが明らかになった（図１５）。

２－１１．NTMが老化による筋力の低下に及ぼす影響の検討
２－１１－１．老化による筋力の低下
　老化が筋力に及ぼす影響について検討するために、Grip Strength Testを実施した。180日齢の若いマウス（雄および雌）と690日齢の老齢マウスの筋力を測定し、比較したところ、雄および雌共に、老化によって、筋力が低下することが確認された（図１６、雄：左図、雌：右図）。
２－１１－２．老化による筋力の低下に及ぼすNTMの効果
　600日齢の老化した野生型マウスとNTM欠損マウスの筋力を比較するためにGrip strength Testを実施した。その結果、雌雄ともにNTMの欠損により老齢マウスにおける筋力の低下が有意に抑制されていることを見出した（図１７、雄：左図、雌：右図）。
　以上の結果から、NTMの欠損は老齢マウスにおいて、筋力の低下を抑制する効果があると考えられた。

２－１２．NTMが老化による筋持久力の低下に及ぼす影響の検討
２－１２－１．老化による筋持久力の低下
　老化が筋持久力に及ぼす影響について検討するために、Hanging Testを実施した。180日齢の若い雌マウスと690日齢の老齢雌マウスの筋持久力を測定し、比較したところ、Hanging TimeおよびHanging score共に、老齢マウスの値が低く、老化によって筋持久力が低下することが確認された（図１８、Hanging Time：左図、Hanging score：右図）。
２－１２－２．老化による筋持久力の低下に及ぼすNTMの効果
　600日齢の老化した野生型マウスとNTM欠損マウスの筋持久力を比較するためにHanging Testを実施した。その結果、雌雄ともにNTMの欠損により老齢マウスにおける筋持久力の低下が有意に抑制されていることを見出した（図１９：雄マウスの結果、図２０：雌マウスの結果）。
　以上の結果から、NTMの欠損は老齢マウスにおいて、筋持久力の低下を抑制する効果があると考えられた。

２－１３．老齢NTM欠損マウスのFrailty scoreの算出および解析
　NTMがマウス個体の老化に与える影響を、より総合的な指標を用いて老化の表現型で評価するために、960日齢の老化した野生型雄マウスおよびNTM欠損雄マウスのFrailty scoreを算出した。その結果、NTMの欠損により老化マウスにおけるフレイルの進行が抑制される傾向にあることを見出した（図２２）。
　この結果から、NTMの欠損は、筋力や筋持久力の低下を抑制する他、マウス個体の老化を抑制することが考えられた。

　以上の実験結果からは、NTMを阻害することにより、細胞老化が阻害または抑制されこと、ならびに、個体老化の抑制、および加齢により発症する疾患の予防と治療が可能であることが示唆された。

　本発明は、老化および肥満の改善、加齢に伴い発症する疾患等の予防または治療に有用な医薬等を提供する。従って、本発明は、医療分野における利用が期待される。

Claims

　NTM（Neurotrimin）の機能阻害剤を有効成分として含有する、細胞老化抑制剤。
　前記NTMの機能阻害剤が抗体、ペプチドアプタマー、特殊ペプチド、核酸または低分子化合物である、請求項１に記載の細胞老化抑制剤。
　請求項１または２に記載の細胞老化抑制剤を含有する、個体老化の改善剤。
　請求項１または２に記載の細胞老化抑制剤を含有する、肥満の改善剤。
　請求項１または２に記載の細胞老化抑制剤を含有する、細胞老化によって惹起される疾患の予防または治療のための医薬組成物。
　前記疾患が、がん、糖尿病、高血圧症、脂質異常症、動脈硬化、脳梗塞、心臓病（心筋梗塞、心筋症、心肥大）、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎臓病、慢性肝疾患（肝硬変、肝炎、脂肪肝）、認知症（アルツハイマー病）、パーキンソン病、フレイル、サルコペニア、羸痩、変形性関節症、変形性脊椎症、皮膚疾患、老人性脱毛症、白内障、ドライアイ、緑内障、加齢黄斑変性、老眼、その他の慢性炎症性疾患、その他の代謝性疾患および／または感染症である、請求項５に記載の医薬組成物。
　請求項１または２に記載の細胞老化抑制剤を含有する、飲食品組成物または化粧品組成物。
　アンチエイジング用、ダイエット用または血糖値低下用である、請求項７に記載の飲食品組成物または化粧品組成物。
　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）または（Ｅ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
（Ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｃ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｄ）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｅ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
　NTMの機能を抑制または阻害する抗体であって、請求項９に記載の抗体とNTMとの結合を競合阻害する抗体またはその抗原結合断片。
　Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、一本鎖抗体、scFv、scFv二量体またはdsFvであることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の抗原結合断片。
　以下の（ａ）および（ｂ）を含む、細胞老化を抑制する物質のスクリーニング方法。
（ａ）細胞にNTMおよび候補物質を接触させる工程、および
（ｂ）NTMおよび候補物質を接触させた細胞の細胞老化の程度を評価する工程
　前記細胞老化の程度を、細胞老化マーカーの発現量、またはSASP（senescence-associated secretory phenotype；SASP）関連因子の発現量を指標にして評価する、請求項１２に記載の方法。
　前記細胞老化マーカーが、p16、p15またはp21である、請求項１３に記載の方法。
　前記SASP関連因子が、IL-6またはIL-8遺伝子である、請求項１３に記載の方法。