KR102300949B1 - 암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 ltbp1의 용도 - Google Patents

암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 ltbp1의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102300949B1
KR102300949B1 KR1020190162860A KR20190162860A KR102300949B1 KR 102300949 B1 KR102300949 B1 KR 102300949B1 KR 1020190162860 A KR1020190162860 A KR 1020190162860A KR 20190162860 A KR20190162860 A KR 20190162860A KR 102300949 B1 KR102300949 B1 KR 102300949B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
ltbp1
protein
gene
expression level
Prior art date
Application number
KR1020190162860A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200070143A (ko
Inventor
오세옥
한명은
김윤학
김지영
김가현
박시영
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Publication of KR20200070143A publication Critical patent/KR20200070143A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102300949B1 publication Critical patent/KR102300949B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

본 발명은 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 LTBP1의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 LTBP1을 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단, 예후 예측 또는 예후 예측용 마커로 이용하는 경우, 높은 진단 감도 및 특이도를 가지고 위암, 췌장암 또는 뇌암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 예후를 예측할 수 있어 위암, 췌장암 또는 뇌암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있으며, 나아가 본 발명의 LTBP1의 발현을 억제할 수 있는 제제를 이용하여 위암의 예방 및 치료에 응용할 수 있다.

Description

암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 LTBP1의 용도{Uses of LTBP1 for Diagnosing, Predicting Prognosis or Treating of Cancer}
본 발명은 암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 LTBP1의 용도에 관한 것이다.
종래에는 임상적, 형태학적 특징에 따라 특정 암을 분류하였기 때문에, 유전학적 수준에서 다르게 분류될 수 있는 환자들도 동일한 진단을 받을 수 밖에 없었다. 따라서, 종래의 분류에 따른 암의 치료방법 및 치료제를 적용하였을 때, 해당 암이 치료되지 않는 경우가 많았다. 따라서, 한 집단에서 나타날 수 있는 모든 종류의 암에 대해 각각의 분류에 따라 효과적으로 적용할 수 있는 약물들의 개발이 요구되고 있다.
이를 위해서는, 암 치료를 위한 표적 유전자를 선정하는 것이 무엇보다도 중요하다. 즉, 암의 단계에 따라 암의 분화 정도, 침입특성, 유전자들의 발현 형태 및 발현량이 달라진다. 따라서, 암의 분류에 따라 적절하게 투여할 수 있는 약물을 개발하기 위해서는, 각 단계마다 합당한 표적 유전자를 선택하고, 표적 유전자의 기능을 조절할 수 있는 물질을 찾는 것이 중요하다.
한편, 최근에는 특정 암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 암을 진단하려는 연구가 이루어지고 있으나, 암 환자의 예후를 예측하기 위한 유전자 마커에 대한 연구는 상대적으로 덜 이루어지고 있다. 예컨대, 같은 병기로 진단된 위암이라도 그 예후는 환자마다 차이가 있으므로 위암의 효과적인 치료를 위해서는 위암의 조기발견 뿐만 아니라, 위암의 예후를 정확하게 예측하는 것이 무엇보다 중요하다.
따라서, 특정 암 환자의 진단 뿐만 아니라 예후를 정확하게 예측할 수 있다면, 예후에 따라 수술 또는 항암화학요법 등의 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 암환자의 생존에 크게 기여할 수 있으므로, 암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있는 기술이 요구된다.
이 중 LTBP1 유전자는 latent TGF-beta binding proteins의 구성요소 중 하나로, TGF-β의 분비와 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 특정 암에서의 역할은 알려져 있지 않다.
따라서, LTBP1 유전자를 타겟으로 하는 경우 유전학적 수준에서 객관적으로 암을 진단하고, 암 환자의 예후를 정확하게 예측하며, 종래 항암제 개발 방법에 적용할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 정확하고 신속한 특정 암의 진단, 예후 예측 방법 및 치료 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, LTBP1이 과발현된 위암, 췌장암 및 뇌암 환자에서의 예후가 좋지 않음을 발견하여 진단적 가치를 확인하였고, LTBP1 유전자가 암세포의 증식(proliferation), 세포이동(cell migration) 및 세포침윤(cell invasion)을 조절할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 이용한 체외에서 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 이용한 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 LTBP1(Latent Transforming Growth Factor Beta Binding Protein 1) 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 위암, 췌장암 또는 뇌암 개체에서 LTBP1 유전자의 발현 수준; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정한 경우 LTBP1 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 과발현되었다.
일 실시예를 통해, 본 발명의 LTBP1 유전자가 위암, 췌장암 및 뇌암에 있어서 발현이 증가할 뿐만 아니라, 고발현일수록 해당 암 환자의 예후가 나쁘다는 사실을 본 발명에서 최초로 규명하였다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 해당 암의 발병 여부를 확인하는 것으로 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 LTBP1 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예후"란 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명의 목적상, 예후란 위암, 췌장암 및 뇌암의 치료 후 해당 개체에서 치료 성공 여부, 생존, 재발, 전이, 약물반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 즉, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적 상 위암, 췌장암 및 뇌암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 LTBP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 LTBP1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로브 (probe) 또는 안티센스 (anti-sense) 뉴클레오티드이며, 상기 LTBP1 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 LTBP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명의 LTBP1이 과다 발현된 암을 표현하기 위해 사용된 용어 "과발현(overexpression)"은 적합한 발현 분석법을 통해 LTBP1의 발현 수준을 측정한 경우에 있어서, 비교 대상 세포의 LTBP1 발현 수준에 비하여 2 배 이상인 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "마커(marker)"란 해당 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 대상 암 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 대조 세포에 비하여 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.
본 발명의 목적상, 본 발명의 위암, 췌장암 및 뇌암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 해당 암세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내며; 본 발명의 해당 암 예후 예측 마커는 암 발병 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 높거나 동일한 수준의 발현을 나타낸다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 위암, 췌장암 및 뇌암을 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 위암, 췌장암 및 뇌암을 진단 또는 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 LTBP1 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 LTBP1 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)이며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 LTBP1 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암, 췌장암 또는 뇌암을 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 하여 적절하게 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브 (probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 (labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서는, 본 발명의 LTBP1 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암, 췌장암 또는 뇌암 질환의 발병 여부를 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 하이브리드화 방법은 본 발명의 LTBP1 폴리뉴클레오티드에 상기 프라이머 또는 프로브를 노출 또는 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 이들 서열은, 비특이적 결합을 최소화 하도록 적절히 조절된 조건에서 혼성화 되며, 예를 들면 약 80% 내지 90%의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은, 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 42℃에서 밤새 (overnight) 혼성화시키고, 0.1 Υ SSC, 0.1% SDS 내, 55℃에서 최종 세척하는 것을 포함한다. 또한 약 90% 이상의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 0.1 Υ SSC, 0.1% SDS 내, 60℃에서 최종 세척하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 LTBP1 단백질(이하 'LTBP1 폴리펩티드'와 혼용) 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 LTBP1 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게 는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 LTBP1 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체를 포함한다.
본 발명의 위암, 췌장암 및 뇌암 진단 또는 예후 예측 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 용어 "위암"이란 위에서 발생하는 암종(악성 종양)을 총칭하는 의미이고, 용어 "췌장암"이란 췌장에서 발생하는 암종(악성 종양)을 총칭하는 의미이며, 용어 "뇌암"이란 뇌에서 발생하는 암종(악성 종양)을 총칭하는 의미이다.
본 발명에서는 종래 번거롭고 복잡한 진단 방법을 사용하지 않고 위암, 췌장암 및 뇌암 마커인 LTBP1의 양을 측정함으로써 용이하게 진단 또는 예후를 예측할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 위암, 췌장암 또는 뇌암 진단 또는 예후 예측 마커인 LTBP1 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 정량 검출을 위한 진단 또는 예후 예측용 키트는 LTBP1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, LTBP1의 뉴클레오티드 또는 일부 서열에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 발현 수준을 측정하기 위해 상기 "mRNA 발현 수준 측정"과 관련하여 기술된 분석 방법을 이용한 키트를 이용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 키트는 위암, 췌장암 및 뇌암을 대상으로 하며 LTBP1 단백질의 수준을 측정하는 위암, 췌장암 및 뇌암 진단 또는 예후 예측용 키트이고, 본 발명의 LTBP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 단백질 수준을 측정하는 키트는 "단백질 발현 수준 측정"을 위해 사용되는 상기 기술된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 ELISA 키트 또는 단백질칩 키트일 수 있다.
항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 LTBP1 단백질 및 그의 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 위암, 췌장암 또는 뇌암의 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생체외에서 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 시료 내 상기 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 각 대조군과 비교하는 단계로서,
(b-1) 상기 시료 내 상기 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 위암, 췌장암 또는 뇌암인 것으로 진단하며; 또는
(b-2) 상기 시료 내 상기 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 예후가 알려진 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자의 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교해 동일하거나 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 나쁜 예후를 가질 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 유전자 또는 단백질의 발현이 검출될 수 있는 대상 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 방법은, 대조군(정상 대조군)에서의 유전자 발현 수준을 위암, 췌장암 및 뇌암 의심 개체의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 위암, 췌장암 및 뇌암 의심 개체의 실제 암 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 즉, 위암, 췌장암 또는 뇌암으로 추정되는 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 시료의 것보다 해당 암으로 추정되는 시료 유래에서 더 높은 수준으로 발현되면 해당 암으로 추정되는 시료를 해당 암으로 예측할 수 있는 것이다.
바람직하게 상기 방법은, 본 발명의 LTBP1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 마커로 이용하는 경우, 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 생물학적 시료에 LTBP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 처리하는 단계; 상기 제제와 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 결합을 검출하는 단계; 및 검출된 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 LTBP1 폴리펩티드 마커를 이용하는 경우, 생물학적 시료를 제공하는 단계; 상기 생물학적 시료에 LTBP1 단백질에 대한 항체를 처리하는 단계; 항체-항원 복합체를 검출하는 단계; 및 검출된 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 방법을 이용하여 본 발명의 LTBP1 단백질을 검출할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 방법은 대조군(예컨대, 예후가 알려진 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자)에서의 유전자 발현 수준을 대상 암 개체의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 대상 암 개체의 실제 위암, 췌장암 또는 뇌암 예후를 예측할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예후가 알려진 암 환자"는 암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 3 년 안에 재발하여 음성적 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 완치되어 긍정적 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
상기 예후가 알려진 암 환자는 암 치료를 받은 환자로서, 상기 암치료는 방사선 치료, 화학치료, 화학방사선 치료, 보조항암화합요법(adjuvant chemotherapy), 위 절제술, 위 절제술 후 화학치료 또는 화학방사선치료, 및 보조항암화합요법 또는 수술 후 방사선 치료 없는 위 절제술로 이루어진 군으로부터 선택된다.
즉, 예후가 알려진 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자의 시료로부터 측정한 암 마커 유전자의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 암 마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 암의 예후를 예측할 수 있다. 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 양성적 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 양성적 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 반대로 음성적 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 음성적 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 추출물 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이다. 보다 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA) 또는 화합물이며, 가장 바람직하게는 siRNA(small interference RNA), 또는 화합물이다.
본 발명에 있어서, 상기 억제제는 LTBP1의 뉴클레오티드의 발현 또는 LTBP1 단백질의 활성을 억제하는 것을 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, LTBP1의 뉴클레오티드의 발현을 억제하는 억제제는, LTBP1의 mRNA에 대한 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "siRNA (small interfering RNA)"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서 (Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 eIF3m 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 상기 siRNA는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 핵산서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "shRNA (short hairpin RNA)"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)를 의미한다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 작은 사이즈를 가지는 올리고머 분자이다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.
본 발명의 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 LTBP1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머이다.
또한, 본 발명에 있어서, LTBP1 단백질의 발현을 억제하는 억제제는, LTBP1에 대한 항체, 앱타머, LTBP1의 단백질에 직접적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 화합물 및 천연 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 목적으로 하는 항암 효과를 얻을 수 있는 한, siRNA를 다양하게 조합하여 이용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 2의 염기서열로 표시되는 LTBP1 siRNA를 이용하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 유효성분인 상기 억제제는 암세포 생존율, 암세포의 이동능 및 침윤능을 감소 또는 억제시킴으로써 항암 효과를 나타낸다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 LTBP1가 과발현된 위암, 췌장암 또는 뇌암의 치료 효과는 해당 암세포 생존 억제에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 일반적으로 암과 같은 악성 종양은 성장속도가 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 더욱 악화될 수 있는데, 본원발명의 LTBP1 발현 및 활성 억제용 조성물은 세포의 세포증식능, 이동능 및 침윤능을 감소시켜서, 궁극적으로 위암, 췌장암 또는 뇌암을 치료할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 해당 암의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명에서, "건강기능식품"이란, 암의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야한다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 세포에 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 세포에서 LTBP1(Latent-Transforming Growth Factor Beta-Binding Protein 1) 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 세포에서의 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 해당 암 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 경우 해당 암 치료제로 판단하는 단계.
본 발명의 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제 스크리닝 방법은 후보 물질의 처리에 의해 LTBP1 발현이 증가되는 경우, 상기 후보 물질을 해당 암 질환을 촉진시키는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보 물질에 의해 LTBP1 발현이 감소하는 경우, 처리된 후보 물질이 해당 암 치료제로 사용될 수 있을 것으로 판단할 수 있게 된다. 이러한 스크리닝 방법에 있어서, 그 활성 측정은 LTBP1 발현 수준에 따라 용이하게 판단될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 LTBP1 유전자의 발현 수준을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 LTBP1을 위암, 췌장암 또는 뇌암 진단 또는 예후 예측용 마커로 이용하는 경우, 높은 진단 감도 및 특이도를 가지고 해당 암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 예후를 예측할 수 있어 위암, 췌장암 또는 뇌암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있으며, 나아가 본 발명의 LTBP1의 발현을 억제할 수 있는 제제를 이용하여 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 및 치료에 응용할 수 있다.
도 1은 다양한 환자 및 이의 정상 대조군에서의 LTBP1 mRNA 발현 분석 결과 위암환자, 췌장암환자, 뇌암환자에서만 LTBP1이 과발현되어 있음을 보여준다.
도 2는 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자에서의 LTBP1의 과발현에 따른 예후를 보여준다.
도 3은 LTBP1 억제시 위암 세포, 췌장암 세포 및 뇌암 세포 증식에 대한 효과를 세포생존율로 측정한 결과를 보여준다.
도 4a, 4b 및 4d는 LTBP1 억제시 위암, 췌장암 또는 뇌암 세포주에서의 세포 이동에 대한 결과를 보여준다. 도 4c 및 4e는 LTBP1 억제시 위암, 췌장암 또는 뇌암 세포주에서의 세포 침윤에 대한 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 특정 암에서 LTBP1 발현 증가 확인
본 발명자들은 LTBP1 유전자(Latent-Transforming Growth Factor Beta-Binding Protein 1, HGNC: 6714)가 암의 진단을 위한 타겟이 될 수 있는지 평가하기 위하여, 다양한 암 환자 및 이의 정상 대조군에서의 LTBP1 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
각 암 조직과 정상 조직의 발현량을 U133 Plus2 microarray 방법으로 비교한 자료들을 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상인 조직 및 다른 암 조직인 지방종 (도 1d), 간암(도 1e) 및 구강암(도 1f)에 비해, 위암 환자(도 1a), 췌장암 환자(도 1b) 및 뇌암 환자(도 1c)에서 LTBP1이 과발현되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 특정 암 환자의 LTBP1 발현 수준에 따른 예후 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1의 결과를 기반으로 하여 LTBP1 유전자가 위암, 췌장암 및 뇌암 환자의 예후 예측 및 치료를 위한 타겟이 될 수 있는지 평가하기 위하여, 각 암 환자로부터 분리된 암세포에서 LTBP1의 과발현 수준을 확인한 후, Kaplan Meier 분석 방법을 이용하여 예후를 분석하였다.
본 분석에 사용한 위암(Stomach Adenocarcinoma) 조직은 위암 수술을 받은 총 340명의 위암 환자로부터 획득하였다. 환자들 중 생존 정보가 없는 경우는 분석에서 제외하였다.
본 분석에 사용한 췌장암(Pancreatic Adenocarcinoma) 조직은 췌장암 수술을 받은 총 166명의 췌장암 환자로부터 획득하였다. 환자들 중 생존 정보가 없는 경우는 분석에서 제외하였다.
본 분석에 사용한 뇌암(Glioblastoma Multiforme) 조직은 뇌암 수술을 받은 총 145명의 뇌암 환자로부터 획득하였다. 환자들 중 생존 정보가 없는 경우는 분석에서 제외하였다.
각 암 환자들을 LTBP1 발현량을 기준으로 두 그룹으로 나눌 때, 5배 교차검증 (5 Fold Cross Validation) 기법을 이용하여 LTBP1 기준값을 정하였다. 생존 시간의 차이는 생존 분석에서 사용하는 척도 중의 하나인 C-index 값을 이용하여 계산하였다. 기준 LTBP1 발현량보다 적은 환자들을 저위험군 (위암 111명, 췌장암 158명, 뇌암 38명명), 높은 환자들을 고위험군 (위암 229명, 췌장암 8명, 뇌암 107명)으로 분류하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 위암, 췌장암 및 뇌암 환자들 중에서도 LTBP1이 특히 과발현된 경우 그 예후가 좋지 않음을 확인하였다.
실시예 3. LTBP1 넉다운이 세포 증식, 이동 및 침윤에 미치는 영향 확인
3-1. LTBP1 넉다운이 세포 증식에 미치는 영향
본 발명자들은 LTBP1 유전자가 위암 세포, 췌장암 세포, 뇌암 세포의 세포 분열(증식, 생존율)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, LTBP1 siRNA를 각 세포주에 처리한 후 siRNA의 효율을 real-time PCR 법으로 검증하고(도 3a, 3b, 3c), 세포 분열을 Ex-Cytox 어세이 방법으로 측정하였다(도 3d, 3e, 3f).
먼저, LTBP1 siRNA를 각 암세포주에 처리한 경우, LTBP1의 mRNA가 감소함을 real time PCR로 확인하였다.
LTBP1 유전자의 발현을 감소시키기 위해 유전자 녹다운 (gene knockdown)을 실시하였다. LTBP1 유전자의 siRNA를 제작하여 [LTBP1; 5`-AGU UUC CAG GUA UAG UGA U(dTdT)-3`(서열번호 1); 5'-GUG CUU UGA UAU GGA UGA A(dTdT)-3' 및 5`-CGU CCA GAU ACA UCA GGU U (dTdT)-3'(서열번호 2)] (바이오니어, 한국), [scrambled (SCR) siRNA; 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A(dTdT)-3'(서열번호 3)] (Dhamacon, USA), 위암세포 (SNU1, SNU16, SNU216, SNU1, SNU620, SNU16, 및 NCI-N87)에 형질주입 (transfection)을 실시하였고, 2-5일 후 10ml의 EZ-cytox cell viability assay reagent (DoGen, Korea)를 첨가한 후, 1 내지 2 시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 후, ELISA reader (TECAN, Switzerland)를 이용하여, 세포증식을 측정하였다. 이때, SCR(scrambled) siRNA를 대조군으로 이용하였다.
그 결과, 도 3a 및 3d에 나타낸 바와 같이, LTBP1 siRNA를 처리하였을 때 위암세포주(SNU216, SNU1, SNU620, SNU16, NCI-N87)의 세포증식이 현저히 감소하였다.
또한, 도 3b 및 3e에 나타낸 바와 같이, LTBP1 siRNA를 처리하였을 때 췌장암세포주(MIA-PACA2, CAPAN1, ASPC1, PANC1)의 세포증식이 현저히 감소하였다.
또한, 도 3c 및 3f에 나타낸 바와 같이, LTBP1 siRNA를 처리하였을 때 뇌암세포주(U373MG, U87MG, GBM05)의 세포증식이 현저히 감소하였다.
따라서, 위암, 췌장암 및 뇌암 세포주에서 siLTBP1에 의한 LTBP1 억제가 각 암 세포의 증식을 억제시켰다는 것을 알 수 있다.
3-2. LTBP1 넉다운이 세포 이동에 미치는 영향
본 발명자들은 LTBP1 siRNA를 암 세포주에 처리한 후 상처 치유 분석(wound healing assay)(도 4a, SNU216)로 측정하거나, 보이든 챔버 분석(Boyden chamber assay)(도 4b, 4d)으로 세포 이동을 확인하였다.
간략하게, 상술한 바와 같이 LTBP1 siRNA를 위암세포(SNU216, NCI-N87), 췌장암세포(MIA-PACA2, PANC1) 및 뇌암세포(GBM05, U373MG)에 처리한 후, 단일층 (monolayer)을 형성할 수 있을 만큼의 적정량의 세포들을 48-웰 플레이트에 접종하였다. 다음 날 노란색 파이펫 팁을 이용하여 일정 간격으로 세포를 긁어낸 후 관찰하였으며, 세포분열이 세포 이동에 미치는 효과를 최소화하기 위해 mitomycin C(0.01 mg/ml)를 첨가하였으며, 광학현미경을 이용하여 시간대별로 관찰하였다. 이때, SCR(scrambled) siRNA를 대조군으로 이용하였다.
그 결과, 도 4a, 4b 및 4d에 나타낸 바와 같이, LTBP1 siRNA를 처리하였을 때 위암세포(SNU216, NCI-N87), 췌장암세포(MIA-PACA2, PANC1), 뇌암세포(GBM05, U373MG)의 세포이동능이 현저히 감소하였다.
따라서, 위암, 췌장암 및 뇌암 세포주에서 siLTBP1에 의한 LTBP1 억제가 위암, 췌장암 및 뇌암 세포의 이동을 억제시켰다는 것을 알 수 있다.
3-3. LTBP1 넉다운이 세포 침윤에 미치는 영향
본 발명자들은 LTBP1 siRNA를 위암세포(SNU216), 췌장암세포(MIA-PACA2) 및 뇌암세포(U373MG)에 처리한 후 보이든 챔버 분석(Boyden chamber assay)으로 세포 침윤을 확인하였다.
간략하게, 상술한 바와 같이 LTBP1 siRNA를 위암 세포주(SNU216)에 처리한 후, 2일째에 대략 5 x 104 세포/50 ml의 세포들을 무혈청 (serum free) RPMI1640에 준비한 후, 타입 I 콜라겐 멤브레인으로 코팅된 웰에 접종하였다. 세포분열이 세포 이동에 미치는 효과를 제거하기 위해, mitomycin C (0.01 mg/ml, Sigma, USA)을 첨가하였다. 37℃ 배양기에서 4-6시간 동안 반응 시킨 후, Diff-quik solution (sysmex, Japan)을 이용하여 세포들을 고정 및 염색하였다. 염색된 세포들은 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다. 이때, SCR(scrambled) siRNA를 대조군으로 이용하였다.
그 결과, 도 4c 및 4e에 나타낸 바와 같이, LTBP1 siRNA를 처리하였을 때 위암세포(SNU216), 췌장암세포(MIA-PACA2) 및 뇌암세포(U373MG)의 세포침윤능이 현저히 감소하였다.
따라서, 위암, 췌장암 및 뇌암 세포주에서 siLTBP1에 의한 LTBP1 억제가 위암, 췌장암 및 뇌암 세포의 침윤을 억제시켰다는 것을 알 수 있다.
결론적으로, 본 발명은 본 발명의 LTBP1은 특정 암-특이 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오 마커로서 진단적 가치가 있을 뿐만 아니라, LTBP1의 발현을 억제하는 억제제는 특정 암-특이 치료제로서 유용하게 응용할 수 있음을 밝혔다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Uses of LTBP1 for Diagnosing, Predicting Prognosis or Treating of Cancer <130> PNU-383p-1 <150> KR 10-2018-0157017 <151> 2018-12-07 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTBP1 siRNA <400> 1 aguuuccagg uauagugau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTBP1 siRNA <400> 2 gugcuuugau auggaugaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled siRNA <400> 3 cguccagaua caucagguu 19

Claims (10)

  1. LTBP1(Latent-Transforming Growth Factor Beta-Binding Protein 1) 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LTBP1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 LTBP1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로브 (probe) 또는 안티센스 (anti-sense) 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LTBP1 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 LTBP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측용 키트.
  5. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 위암, 췌장암 또는 뇌암의 진단 또는 예후 예측에 관한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 시료 내 측정된 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 각 대조군과 비교하는 단계로서,
    (b-1) 상기 시료 내 상기 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 위암, 췌장암 또는 뇌암인 것으로 진단하며; 또는
    (b-2) 상기 시료 내 측정된 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 예후가 나쁜 것으로 알려진 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자의 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교해 동일하거나 높은 것으로 확인된 경우, 그 대상은 나쁜 예후를 가질 것으로 예측하고;
    상기 예후가 나쁜 것으로 알려진 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자는, 해당 암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 나쁜 예후를 가지는 것으로 밝혀진 환자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (b-2)의 위암, 췌장암 또는 뇌암 환자는 암치료를 받은 환자로서, 상기 암치료는 방사선 치료, 화학치료, 화학방사선 치료, 보조항암화합요법(adjuvant chemotherapy) 및 위 절제술로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 삭제
  9. LTBP1 유전자의 발현 또는 이의 단백질의 활성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암, 췌장암 또는 뇌암의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 억제제는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 다음 단계를 포함하는 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 세포에 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 세포에서의 LTBP1 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 경우 위암, 췌장암 또는 뇌암 치료제로 판단하는 단계.
KR1020190162860A 2018-12-07 2019-12-09 암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 ltbp1의 용도 KR102300949B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180157017 2018-12-07
KR20180157017 2018-12-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200070143A KR20200070143A (ko) 2020-06-17
KR102300949B1 true KR102300949B1 (ko) 2021-09-10

Family

ID=71405885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190162860A KR102300949B1 (ko) 2018-12-07 2019-12-09 암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 ltbp1의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102300949B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029748A1 (en) 2008-08-04 2010-02-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Metastasis Promoting Genes and Proteins
US20180148793A1 (en) 2015-05-19 2018-05-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers and uses thereof for selecting pancreas cancer intervention

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029748A1 (en) 2008-08-04 2010-02-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Metastasis Promoting Genes and Proteins
US20180148793A1 (en) 2015-05-19 2018-05-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers and uses thereof for selecting pancreas cancer intervention

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200070143A (ko) 2020-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010040083A2 (en) Gene expression predictors of chemoresistance
KR20080005193A (ko) 유방암 관련 ｚｎｆｎ３ａ１ 유전자
CN108531596A (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
TW202018090A (zh) 癌促進因子表現抑制劑、其有效成分的篩選方法、對於該方法有用的表現匣、診斷藥及診斷方法
CN112867495A (zh) 包含syt11抑制剂作为活性成分的胃癌治疗组合物
KR101875935B1 (ko) Ｈｅｒ2 저해제 내성 바이오마커
KR101416147B1 (ko) 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도
KR102237463B1 (ko) 암 진단 또는 치료 표적으로서 lypd1의 용도
KR102300949B1 (ko) 암의 진단, 예후 예측 또는 치료를 위한 ltbp1의 용도
US20130295581A1 (en) Methods and Compositions for the Treatment and Diagnosis of Breast Cancer
JP6467580B2 (ja) 小細胞肺がんの診断薬及び治療薬
CN112462072B (zh) 一种tmub1蛋白在制备肿瘤免疫抑制分子检测剂中的应用
KR102324924B1 (ko) 항암제 선별방법
KR102141997B1 (ko) Pmvk를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물
KR102055350B1 (ko) 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도
KR20170052454A (ko) 소라페닙 민감성 예측용 바이오마커 조성물
KR102358385B1 (ko) 대장암 및 직장암의 예방, 진단 또는 치료를 위한 ｖｌｄｌｒ의 용도
KR20200009503A (ko) Pten 억제제에 대한 췌장암 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이의 용도
KR20230041128A (ko) 신규한 샤르코-마리-투스병 제1a형 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도
KR20200022187A (ko) Nono의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물
KR102328157B1 (ko) 제2형 당뇨병 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도
KR20190086131A (ko) 두경부암의 치료용 또는 예후 판단용 조성물
KR101150410B1 (ko) 간암 진단용 마커로서의 ｓ100ｐ의 용도
KR20140042577A (ko) 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도
CN117599078A (zh) 癌症标志物panx1及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant