CN106062200B

CN106062200B - 腺相关病毒载体

Info

Publication number: CN106062200B
Application number: CN201580008760.XA
Authority: CN
Inventors: R·M·林登
Original assignee: Kings College London; Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Current assignee: Kings College London; Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2035-02-17
Also published as: AU2021202538B2; PT3108000T; AU2021202538A1; JP6602788B2; IL247332A0; IL279154B; EP3597760A3; JP6942166B2; US20240124894A1; PL3108000T3; JP2023126885A; WO2015121501A1; US11802293B2; SG11201606365TA; ES2749235T3; JP2017506521A; BR112016018598A2; US20180135076A1; CA2939612C; HUE045801T2

Abstract

本文公开了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV2衣壳蛋白，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含至少4个氨基酸取代；其中，所述至少4个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上：457，492，499和533；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

Description

腺相关病毒载体

发明领域

本发明涉及重组病毒载体的领域。具体地，本发明涉及适合用于治疗基因的体内递送的重组病毒载体。

发明背景

迄今为止，腺相关病毒仍是用于治疗基因的递送的最有前景的载体之一。显著数量的临床前和临床研究已经牢固确立，这种方法适合用于开发可达到市场认可的基于基因的药物。

自20世纪80年代开始开发AAV2用作用于基因治疗的载体以来，在优化该平台用于多种应用和靶组织上已取得了很多进展。在这些发展中，可能最重要的是发现了广泛多样的血清型，其中10至12种现在已被普遍研究。这些不同血清型的最突出的特征之一是它们各自的相对组织嗜性和(在某些情况下)神经元逆向运输的能力。在这些血清型中，AAV1-10被广泛用于临床前和临床目的。

已开发了涉及允许靶向和脱靶向患者的特定组织和细胞亚型的过程的较新的平台。这些方法的核心技术是基于现有的AAV变体(血清型)的试错评估和随机引入的AAV衣壳突变体的体内选择。这两个有前景的方法一起提供了数十种(如果不是数百种)具有不同转导行为的潜在载体。

AAV血清型的最吸引人的方面是它们有效地转导动物模型和人中的特定组织的能力。迄今，对于组织嗜性的基本机制的全面分子认识尚待提出并且因此一般认为针对每个血清型的可用的组织特异性受体在各种血清型的有效转导中发挥中心作用。

因此仍然需要额外的AAV载体，其具有在体内转基因表达和组织特异性方面的改善的特性。特别地，这样的载体具有提供用于基因递送至人中的各种靶组织的极大增强的益处的潜力。

发明概述

在一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV2衣壳蛋白，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含至少4个氨基酸取代；其中，所述至少4个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上：457，492，499和533；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列，或与其具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1的序列。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：M457，A492，D499和Y533。在优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：Q457M，S492A，E499D和F533Y。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白还在AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：125，151，162和205。在优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：I125，A151，S162和S205。在另一个优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I，V151A，A162S和T205S。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白还在AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：585和588。优选地，变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：S585和T588。更优选地，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：R585S和R588T。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白还在AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：546，548和593。优选地，变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：D546，G548，和S593。更优选地，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：G546D，E548G和A593S。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含残基N312，即存在于野生型AAV2衣壳蛋白中的位置312上的残基。在此实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相较于野生型AAV2衣壳蛋白序列在位置312上不是突变的。

在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV8衣壳蛋白，其中所述变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白在AAV8衣壳蛋白序列的位置315上包含氨基酸取代；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：6的序列。

在一个实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含氨基酸取代S315N。优选地，AAV8衣壳蛋白序列包含存在于一个或多个下列位置上的一个或多个氨基酸取代：125，151，163，206，460，495，502，536，549，551，588，591和/或596。

在优选的实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：(a)V125I,Q151A,K163S,A206S,T460M,T495A,N502D,F536Y,N549D,A551G,Q588S和/或G596S；和/或(b)T591R。

在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV3B衣壳蛋白，其中所述变体AAV3B衣壳蛋白相对于野生型AAV3B衣壳蛋白在AAV3B衣壳蛋白序列的位置312上包含氨基酸取代；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，变体AAV3B衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：11具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：11的序列。

在一个实施方案中，变体AAV3B衣壳蛋白相对于野生型AAV3B衣壳蛋白包含氨基酸取代S312N。

在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV-LK03衣壳蛋白，其中所述变体AAV-LK03衣壳蛋白相对于如SEQ ID NO：12定义的AAV-LK03衣壳蛋白序列在位置312上包含氨基酸取代；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，变体AAV-LK03衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性的序列。

在另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白在相应于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置的位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；和(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；或者存在于替代的AAV衣壳蛋白序列的一个或多个相应的位置上。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV2衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列，或与其具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV2。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1的序列。

在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：I125,A151,S162,S205,S312,M457,A492,D499,Y533,D546,G548,S585,T588和/或S593。在优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,V151A,A162S,T205S,N312S,Q457M,S492A,E499D,F533Y,G546D,E548G,R585S,R588T和/或A593S。

在其它实施方案中，变体AAV衣壳蛋白来自AAV1，AAV5，AAV6，AAV8，AAV9或AAV10。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV1衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV1。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：3的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV1衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。在优选的实施方案中，变体AAV1衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S。在替代实施方案中，变体AAV1衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代的：S205T，G549E，S586R和/或T589R。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV5衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：4具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV5。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：4的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV5衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：124,150,153,195,303,444,479,486,520,533,537,575,578和/或583。在优选的实施方案中，变体AAV5衣壳蛋白相对于野生型AAV5衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V124I,K150A,K153S,A195S,R303S,T444M,S479A,V486D,T520Y,P533D和/或G583S。在替代实施方案中，变体AAV5衣壳蛋白相对于野生型AAV5衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：G537E，S575R和/或T578R。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV6衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：5具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV6。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：5的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV6衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。在优选的实施方案中，变体AAV6衣壳蛋白相对于野生型AAV6衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S。在替代实施方案中，变体AAV6衣壳蛋白相对于野生型AAV6的衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：S205T，G549E，S586R和/或T589R。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV8衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV8。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：6的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV8衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。在优选的实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,K163S,A206S,T460M,T495A,N502D,F536Y,N549D,A551G,Q588S和/或G596S。在替代实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：S315N和/或T591R。

在一个实施方案中，载体包含AAV9衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：7具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV9。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：7的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV9衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,314,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。在优选的实施方案中，变体AAV9衣壳蛋白相对于野生型AAV9衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：L125I,Q151A,N314S,Q458M,V493A,E500D,F534Y,G547D,A589T和/或G594S。在替代实施方案中，变体AAV9衣壳蛋白相对于野生型AAV9衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：S162A，S205T，G549E和/或S586R。

在一个实施方案中，载体包含变体AAV10衣壳蛋白。在另一个实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：8具有至少95％的序列同一性的序列。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白来自AAV10。在另一个实施方案中，野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：8的序列。

在一个实施方案中，至少一个氨基酸取代存在于AAV10衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。在优选的实施方案中，变体AAV10衣壳蛋白相对于野生型AAV10衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,K163S,A206S,N315S,T460M,L495A,N502D,F536Y,G549D,Q588S,A591T和/或G596S。在替代实施方案中，变体AAV10衣壳蛋白相对于野生型AAV10衣壳蛋白包含下列氨基酸取代：G551E。

在一个实施方案中，重组AAV载体相较于包含相应的野生型AAV衣壳蛋白的AAV载体表现出神经元或视网膜组织的增加的转导。

在另一个实施方案中，重组AAV载体相较于相应的野生型AAV衣壳蛋白表现出肝脏组织的增加的转导。

在一个实施方案中，基因产物包括干扰RNA或适体。在另一个实施方案中，基因产物包括多肽。优选地，基因产物包括神经保护多肽，抗血管生成多肽，或增强神经元或视网膜细胞的功能的多肽。在优选的实施方案中，基因产物包括胶质源性神经营养因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，脑源性神经营养因子，视紫红质，retinoschisin，RPE65或外周蛋白。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含：(a)根据前述任一权利要求的重组AAV载体；和(b)药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本发明提供了用于将基因产物递送至受试者的组织的方法，所述方法包括向受试者施用如上文定义的重组AAV载体或药物组合物。

在一些实施方案中，组织选自血液，骨髓，肌肉组织，神经元组织，视网膜组织，胰腺组织，肝脏组织，肾组织，肺组织，肠组织或心脏组织。优选地，组织是神经元、视网膜或肝脏组织。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的病症的方法，所述方法包括向受试者施用如上文定义的重组AAV载体或药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是神经、眼部或肝脏病症。

在另一个方面，本发明提供了如上文定义的重组AAV载体或药物组合物，其用于治疗受试者的病症。在一些实施方案中，所述病症是神经、眼部或肝脏病症。优选地，神经病症是神经变性疾病。在替代实施方案中，眼部病症是青光眼，色素性视网膜炎，黄斑变性，视网膜劈裂或糖尿病性视网膜病。

在另一个方面，本发明提供了分离的变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白相对于野生型的AAV衣壳蛋白包含至少一个氨基酸取代；其中所述至少一个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；或者存在于替代的AAV衣壳蛋白序列的一个或多个相应的位置上。

在另一个方面，本发明提供了分离的核酸，其包含编码如上文定义的变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了分离的宿主细胞，其包含如上文定义的核酸。

附图简述

图1显示了野生型腺相关病毒2衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1；NCBI参考序列：NC_001401)。残基V125,V151,A162,T205,N312,Q457,S492,E499,F533,G546,E548,R585,R588和A593被突出显示。

图2显示了真实型腺相关病毒2(ttAAV2)衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。残基I125,A151,S162,S205,S312,M457,A492,D499,Y533,D546,G548,S585,T588,S593相比野生型AAV2VP1(SEQ ID NO：l)不同并被突出显示。

图3显示了野生型腺相关病毒1衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：3；NCBI参考序列：NC_002077)。突出显示的残基：S205(与ttAAV2(SEQ ID NO：2)中的S205对齐)-G549(与ttAAV2中的G548对齐)-S586(与ttAAV2中的S585对齐)-T589(与ttAAV2中的T588对齐)。

图4显示了野生型腺相关病毒5衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：4；NCBI参考序列：AF085716)。突出显示的残基：G537(与ttAAV2中的G548对齐)-S575(与ttAAV2中的S585对齐)-T578(与ttAAV2中的T588对齐)。

图5显示了野生型腺相关病毒6衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：5；NCBI参考序列：AF028704)。突出显示的残基：S205(与ttAAV2中的S205对齐)-G549(与ttAAV2中的G548对齐)-S586(与ttAAV2中的S585对齐)-T589(与ttAAV2中的T588对齐)。

图6显示了野生型腺相关病毒8衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：6；NCBI参考序列：NC_006261)。突出显示的残基：S315(与ttAAV2中的S312对齐)-T591(与ttAAV2中的T588对齐)。

图7显示了野生型腺相关病毒9衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7；NCBI参考序列：AY530579)。突出显示的残基：S162(与ttAAV2中的S1621)-S205(与ttAAV2中的S205对齐)-G549(与ttAAV2中的G548对齐)-S586(与ttAAV2中的S585对齐)。

图8显示了野生型腺相关病毒10衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。突出显示的残基：G551(与ttAAV2中的G548对齐)。

图9显示了AAV衣壳蛋白VP1氨基酸序列的比对。

图10：用于产生AAV2载体的质粒是包装质粒pDG。上图：具有野生型AAV2基因的pDG。下图：具有真实型AAV2基因的pDG-ttAAV2，突出显示的是位置585和588上的乙酰肝素结合结构域中的两个关键突变。MMTV：驱动AAV rep表达的启动子，E2a、E4ORF6和VA是表达腺病毒辅助因子的基因。

图11：用于体内注射的rAAV2真实型(TT)和野生型(WT)的病毒滴度通过显示针对分离的蛋白的氪染色的SDS-PAGE定量，并用红外线-荧光扫描仪(Odyssey Imagingsystems)扫描。A：10μl的AAV2病毒颗粒和62.5ng-500ng的BSA在含SDS的12％分离胶上分离并用氪蛋白染料染色。将图像转换为灰度图。衣壳基因蛋白VP1、VP2、VP3标注在左侧。B：显示来自qPCR(载体基因组[vg/ml])和SDS-Page(衣壳滴度[衣壳/ml])的滴度的表。

图12 A：显示了用GFP特异性抗体染色的大鼠脑切片的代表性例子。将载体注射入如箭头所示的纹状体中。B：显示了至黑质中的注射的代表性例子。

图13：显示了使用ttAAV2和wtAAV2的眼睛的GFP转导。A：显示了ttAAV2(上图)和wtAAV2(下图)载体施用后的横切面中的视网膜。B：显示了A中的虚线框的放大图。

图14：新生小鼠载体注射后的小鼠脑的转导。i.v.：静脉内载体施用；i.c.：颅内注射；AAV-2，wtAAV2；AAV-TT，ttAAV2。

图15：AAV2衣壳的三维图示。突出显示的残基相应于ttAAV2和野生型颗粒之间的氨基酸变化，根据它们的位置通过颜色进行分组。

图16：AAV2衣壳上的三倍峰的图示。突出显示的残基相应于真实型和野生型颗粒之间的氨基酸变化。肝素结合位点残基突出显示为绿色。

图17：AAV2衣壳的内侧的图示。淡蓝色的突出显示的残基相应于ttAAV2中的位于衣壳的内侧上的单氨基酸改变。

图18：AAV2衣壳上的三倍峰的图示。浅褐色的突出显示的残基相应于真实型载体中空间上紧密的并且位于AAV衣壳上的两个三倍-近端峰之间的沟中的两个氨基酸改变。

图19：AAV2衣壳上的三倍峰的图示。棕色的突出显示的残基相应于真实型载体中位于三倍-近端峰之间的沟中的单个分离的氨基酸改变(S593)。

图20：AAV2衣壳上的三倍峰的图示。以粉色突出显示的四个氨基酸参与受体结合并且紧密地位于三倍峰上。

图21：来自AAV2的VP1衣壳单体(浅蓝色)和来自AAV1的VP1单体(橙色)之间的比对的三维图示。在图的中央偏左处突出显示的残基相应于AAV1中的G549(橙色球体)和AAV2中的E548(青色球体)。在图的右上方处突出显示的残基相应于AAV1中的S586和T589(橙色球体)和AAV2中的R585和R588(青色球体)。

图22：来自AAV2的VP1衣壳单体(浅蓝色)和来自AAV5的VP1单体(紫色)之间的比对的三维图示。在图的中间突出显示的残基相应于AAV5中的G537(紫色球体)和AAV2中的E548(青色球体)。在图的右上方处突出显示的残基相应于AAV5中的S575和T578(紫色球体)和AAV2中的R585和R588(青色球体)。

图23：来自AAV2的VP1衣壳单体(浅蓝色)和来自AAV6的VP1单体(黄色)之间的比对的三维图示。在图的底部突出显示的残基相应于AAV6中的G549(橙色球体)和AAV2中的E548(青色球体)。在图的右上方处突出显示的残基相应于AAV6中的S586和T589(橙色球体)和AAV2中的R585和R588(青色球体)。

图24：来自AAV2的VP1衣壳单体(浅蓝色)和来自AAV8的VP1单体(粉红色)之间的比对的三维图示。在图的左上方突出显示的残基相应于AAV8中的S315(红色球体)和AAV2中的N312(青色球体)。在图的右下方突出显示的残基相应于AAV8中的T591(红色球体)和AAV2中的R588(青色球体)。

图25：来自AAV2的VP1衣壳单体(浅蓝色)和来自AAV9的VP1单体(绿色)之间的比对的三维图示。在图的中间突出显示的残基相应于AAV9中的G549(黄色球体)和AAV2中的E548(青色球体)。在图的左下方突出显示的残基相应于AAV9中的S586(黄色球体)和AAV2中的R585(青色球体)。

图26：在大鼠脑纹状体注射后束旁核中rAAV2TT和WT表达的分析。A：显示左侧的吻端和右侧的尾端的大鼠脑切片的代表性图像。指示了纹状体中注射的部位，并且显示了在B和C中观察到的下丘脑中的突出物区域(束旁核，pf)。B和C：在rAAV2WT(B)或TT(C)的纹状体注射后束旁核(pf)中检测到的GFP表达的高倍率图像。

图27：新生小鼠中rAAV2TT和WT的颅内注射的概览。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片的代表性例子。5x10¹⁰vg的rAAV2TT(上图)或rAAV2WT(中图)被注射入新生小鼠大脑的侧脑室。同时染色的来自新生小鼠的未注射的脑被表示为阴性对照(N T，非转导的)。

图28：在rAAV2TT或WT的颅内注射后新生小鼠脑切片的高倍率照片。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片。5x10¹⁰vg的rAAV2TT(左图)或rAAV2WT(右图)被注射入新生小鼠大脑的侧脑室。S1BF：桶状区初级体感皮层。

图29：新生小鼠的rAAV2TT和WT在全身注射后的大脑传导的概览。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片的代表性例子。2x10¹¹vg的rAAV2TT(上图)或rAAV2WT(下图)被注射入新生小鼠的颈静脉。

图30：在rAAV2TT或WT的全身注射后新生小鼠脑切片的高倍率照片。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片。2x10¹¹vg的rAAV2TT(左图)或rAAV2WT(右图)被注射入新生小鼠的颈静脉。S1BF：桶状区初级体感皮层。

图31：在rAAV2TT或WT的全身注射后新生小鼠组织切片的高倍率照片。2x10¹¹vg的rAAV2TT或rAAV2WT被注射入新生小鼠的颈静脉。未注射的小鼠器官用作为阴性对照。

图32：在rAAV2TT、WT和HBnull的纹状体注射后成年大鼠脑切片的高倍率图像。显示了用GFP特异性抗体染色的大鼠脑切片的代表性例子。3.5x10⁹vg的rAAV2WT(左图)、TT(右图)或AAV2-HBnull(中图)被注射入成年大鼠脑的纹状体中并获取丘脑或黑质(SN)中的代表性照片。

图33：新生小鼠中完全AAV-TT的颅内注射相较于各种TT突变体的概览。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片的代表性例子。5x10¹⁰vg的rAAV2TT、TT-S312N、TT-S593A或TT-D546G/G548E(TT-DG)被注射入新生小鼠脑的侧脑室。同时染色的来自新生小鼠的未注射的脑被表示为阴性对照(NT)。

图34：在各种TT突变载体的颅内注射后新生小鼠脑切片的高倍率照片。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片。5x10¹⁰vg的载体被注射入新生小鼠脑的侧脑室。TT-DG：TT-D546G/G548E。

图35：完全AAV-TT的新生小鼠颅内注射相较于TT-S312N突变体和含10个突变的潜在最终TT载体的概览。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片的代表性例子。5x10⁰⁹vg的rAAV2TT、TT-S312N、TT或TT-S312N-D546G/G548E-S593A(TT-S312N-DG-S593A)被注射入新生小鼠脑的侧脑室。同时染色的来自新生小鼠的未注射的脑被表示为阴性对照(NT)。

图36：在各种TT突变载体的颅内注射后新生小鼠脑切片的高倍率照片。显示了用GFP特异性抗体染色的新生小鼠脑切片。5x10⁰⁹vg的载体被注射入新生小鼠脑的侧脑室。

图37：用完全AAV-TT、TT-S312N突变体或TT-S312N-DG-S593A注射的新生小鼠大脑中的GFP蛋白的ELISA定量。5x10⁰⁹vg的载体被注射入新生小鼠脑的侧脑室并从整个收获的脑中提取总蛋白。GFP特异性抗体被用来检测各脑样品中的GFP表达，并将标准GFP蛋白用于定量。N＝5只动物/条件。误差棒代表平均值±SEM。

图38：AAV3B的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列。突出显示的残基表示与AAV-tt中相应位置上的残基相同的残基。位置312上的内部丝氨酸残基加以下划线。

图39：AAV-LK03的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列。

序列列表

SEQ ID NO：l是野生型腺相关病毒2衣壳蛋白VP 1的氨基酸序列(参见图1)。

SEQ ID NO：2是真实型腺相关病毒2(ttAAV2)衣壳蛋白的氨基酸序列(参见图2)。

SEQ ID NO：3是野生型腺相关病毒1衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图3)。

SEQ ID NO：4是野生型腺相关病毒5衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图4)。

SEQ ID NO：5是野生型腺相关病毒6衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图5)。

SEQ ID NO：6是野生型腺相关病毒8衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图6)。

SEQ ID NO：7是野生型腺相关病毒9衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图7)。

SEQ ID NO：8是野生型腺相关病毒10Upenn衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图8)。

SEQ ID NO：9是野生型腺相关病毒10日本衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图9)。

SEQ ID NO：10是图9中所示的腺相关病毒的共有氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是野生型腺相关病毒3B衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图38)。

SEQ ID NO：12是腺相关病毒LK-03衣壳蛋白VP1的氨基酸序列(参见图39)。

发明详述

在一个方面，本发明涉及重组腺相关病毒(AAV)载体。rAAV载体通常包含相较于野生型AAV衣壳蛋白不同的变体衣壳蛋白。变体衣壳蛋白可有利地赋予脑和/或眼中增强的载体感染性，使得该载体特别适合于通过基因疗法递送治疗剂至这些组织中。

重组AAV载体

本公开内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)载体。“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可以用来指病毒本身或其衍生物。该术语涵盖所有亚型和天然存在的和重组的形式，除非另有要求。缩写“rAAV”指的是重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括，例如，AAV 1型(AAV-1)，AAV 2型(AAV-2)，AAV 3型(AAV-3)，AAV 4型(AAV-4)，AAV 5型(AAV-5)，AAV6型(AAV-6)，AAV 7型(AAV-7)，AAV 8型(AAV-8)，AAV 9型(AAV-9)，AAV10型(AAV-10，包括AAVrh10)，AAV 12型(AAV-12)，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV，灵长类动物AAV，非灵长类动物AAV和羊AAV。“灵长类动物AAV”指的是感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”指的是感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指的是感染牛哺乳动物的AAV，等等。

AAV的各种血清型的基因组序列以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域中是公知的。这样的序列可以在文献中或在公共数据库如GenBank中找到。参见，例如，GenBank登录号NC-002077(AAV-1),AF063497(AAV-1),NC-001401(AAV-2),AF043303(AAV-2),NC-001729(AAV-3),NC-001829(AAV-4),U89790(AAV-4),NC-006152(AAV-5),AF513851(AAV-7),AF513852(AAV-8),和NC-006261(AAV-8)；其公开内容通过引用并入本文。也参见，例如，Srivistava等人(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology 221:208；Shade等人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人(2004)Virology 33:375-383；国际专利申请WO 00/28061,WO 99/61601,WO 98/11244；和美国专利号6,156,303。

如本文所使用的“rAAV载体”是指包含不是AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，通常是用于细胞的遗传转化的目标序列。在一些实施方案中，异源多核苷酸可侧接至少一个和一些时候两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。rAAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”指的是包含至少一个AAV衣壳蛋白(通常野生型AAV的所有衣壳蛋白)和壳体化的多核苷酸rAAV载体的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送到哺乳动物细胞中的转基因)，它通常被称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV颗粒的产生必然包括rAAV载体的产生，因为这样的载体包含在rAAV颗粒内。

如本文所用的“重组”是指载体、多核苷酸、多肽或细胞是克隆、限制性酶切或连接步骤(例如涉及包含在其中的多核苷酸或多肽)的产物和/或导致与自然界中发现的产物不同的构建体的其它程序的各种组合的产物。重组病毒或载体是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的重复物和原始病毒构建体的后代。

变体AAV衣壳蛋白

本文所描述的rAAV载体包含变体AAV衣壳蛋白。“变体”是指AAV衣壳蛋白与相同血清型的相应的野生型AAV衣壳蛋白不同。例如，变体AAV衣壳蛋白相对于相应的野生型AAV衣壳蛋白可以包含一个或多个氨基酸取代。在此上下文中，“相应”是指相同血清型的衣壳蛋白，即变体AAV1衣壳蛋白相对于相应野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，变体AAV2衣壳蛋白相对于相应野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，等等。

变体AAV衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白可以包含，例如1至50，1至30，1至20或1至15个氨基酸取代。优选地，变体AAV衣壳蛋白相对于相应的野生型AAV衣壳蛋白包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14个氨基酸取代。在优选的实施方案中，变体AAV衣壳蛋白保留与野生型衣壳蛋白的至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

在本发明的实施方案中，变体AAV衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白在相应于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置的位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593。在此上下文中，“相应”是指任何AAV衣壳蛋白序列中(例如，在AAV2蛋白质序列或非AAV2衣壳蛋白序列中)的位置，其相应于AAV2衣壳蛋白的上述位置之一。在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；或者在替代的AAV衣壳蛋白序列的一个或多个相应的位置上。

通常地，AAV衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3。在优选的实施方案中，衣壳蛋白包括AAV衣壳蛋白VP1。

核酸和氨基酸序列和序列同一性

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以通过非核苷酸组分中断。如果存在的话，核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后赋予。如本文所用的术语多核苷酸可互换地是指双链和单链分子。除非另有指出或要求，否则本文描述的其为多核苷酸的本发明的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式的每一个。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，其指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成，糖基化，脂质化，磷酸化，或与标记组分缀合。多肽，例如抗血管生成多肽，神经保护多肽等，当在递送基因产物至哺乳动物受试者的上下文中讨论时，和因此组合物，指的是各自完整多肽，或者其任何片段或遗传工程衍生物，其保留了完整蛋白的所需的生化功能。类似地，对编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护多肽的核酸以及用于递送基因产物至哺乳动物受试者的其它这样的核酸(其可被称为待递送至受体细胞的“转基因”)的提及包括编码完整多肽或具有所需生化功能的任何片段或基因工程衍生物的多核苷酸。

多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比“序列同一性”，意思是，当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基或氨基酸是相同的。序列相似性可以以许多不同的方式来测定。为了测定序列同一性，序列可以使用方法和计算机程序包括BLAST(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上获得)来对齐。另一种比对算法是FASTA，可在来自Madison,Wisconsin,USA，Oxford Molecular Group,Inc的全资子公司的GeneticsComputing Group(GCG)程序包中获得。用于比对的其它技术在Methods in Enzymology,vol.266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.Doolittle,Academic Press,Inc.(Harcourt Brace&Co.,San Diego,California,USA的一个部门)中描述。特别感兴趣的是允许序列中的缺口的比对程序。Smith-Waterman是允许序列比对中的缺口的一种类型的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。

令人感兴趣的是使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))的局部同源性算法来测定序列同一性的BestFit程序。缺口产生罚分一般将在1至5的范围内，通常在2至4的范围内，并且在许多实施方案中将是3。缺口延伸罚分一般将在约0.01至0.20的范围内，并且在许多情况下将是0.10。该程序具有由输入以进行比较的序列确定的默认参数。优选地，序列同一性使用由程序确定的默认参数来测定。该程序也可获自来自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing Group(GCG)程序包。

另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB在Current Methods in SequenceComparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,SelectedMethods and Applications,pp.127-149,1988,Alan R.Liss,Inc中描述。百分比序列同一性通过基于下列参数的FastDB计算：

错配罚分：1.00；

缺口罚分：1.00；

缺口大小罚分：0.33；和

加入处罚：30.0。

变体AAV2衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV2衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白在AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593。

野生型AAV2衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图1中显示(SEQ ID NO：1)。野生型AAV2衣壳蛋白的序列也可获自数据库登录号：NC-001401；UniProt P03135；NCBI参考序列：YP_680426.1；GenBank：AAC03780.1。

优选地，变体AAV2衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。在优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列，或与其具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的序列。

AAV2衣壳蛋白中的突变的组合

变体AAV2衣壳蛋白可以包含上述氨基酸取代的任意组合。因此，在具体的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含选自上述列表的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14个氨基酸取代。在一个实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含上文公开的所有14个氨基酸取代，例如变体AAV2衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列(即如本文所提及的ttAAV2或AAV2-TT)。

在其它实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白可以包含上述14突变的子集。不受理论的束缚，在个别实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白可以包含下列残基(其在下文分为功能组)：

1)S585和/或T588；这些残基可与降低的肝素结合和富含硫酸肝素蛋白聚糖的脑组织中增加的病毒传播相关；

2)S312；此内部丝氨酸残基可能在衣壳-DNA相互作用中起作用；

3)D546和/或G548；这些残基可能牵涉与中和抗体的相互作用，从而有助于体内的转导特性；

4)S593；该残基位于三倍近端峰之间的沟中；

5)M457，A492，D499和/或Y533；这四个氨基酸可能参与受体结合并且紧密地位于三倍峰上；

6)I125,A151,S162和/或S205中；这些残基可能与PLA 2活性和/或侵入的病毒的运输相关。

应当理解本文中还考虑了包含当存在于其它AAV血清型(见下文)中的相应位置上时相应于上述残基的突变的相应子集。

在优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白包含可与受体结合相关的上述位置上的四个或多个突变，即残基457，492，499和533。因此，特别优选的是变体AAV2衣壳蛋白包含下列残基：M457，A492，D499和Y533。

在一些优选的实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白在位置312上不是突变的，例如变体AAV2衣壳蛋白包含残基N312(其存在于野生型AAV2衣壳蛋白中)。因此，在一些实施方案中，变体AAV2衣壳蛋白可包含上述特定突变的1至13个，但不包含突变N312S。

来自其它血清型的变体AAV衣壳蛋白

在其它实施方案中，变体AAV衣壳蛋白来自替代的AAV血清型，即除AAV2以外的AAV血清型。例如，变体AAV衣壳蛋白可以来源于AAV1,AAV3B,AAV-LK03,AAV5,AAV6,AAV8,AAV9或AAV10(例如AAVrh10)衣壳蛋白。

在这些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白在相应于上文关于AAV2描述的位置的一个或多个位置上包含至少一个氨基酸取代。换句话说，变体AAV衣壳蛋白在替代的(即非AAV2)AAV衣壳蛋白序列中相应于AAV2衣壳蛋白序列的位置125、151、162、205、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593的位置上包含至少一个氨基酸取代。

基于各种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较，本领域技术人员会知道如何鉴定来自替代的AAV血清型的衣壳蛋白中相应于AAV2衣壳蛋白的位置125、151、162、205、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593的位置。特别地，这样的位置可以通过本领域中已知的和本文中所描述的序列比对来容易地鉴定。例如，一个这样的序列比对在图9中提供。

在此上下文中特别相关的是替代的AAV衣壳蛋白序列中在三维空间中相应于AAV2衣壳蛋白的位置125、151、162、205、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593的位置。用于三维建模和蛋白质结构的比对的方法在本领域中是众所周知的，并且可以用于鉴定非AAV2衣壳蛋白序列中的这样的相应的位置。AAV2衣壳蛋白序列与替代的AAV血清型(例如AAV1，AAV5，AAV6，AAV8和AAV9)的衣壳蛋白序列的示例性3D比对显示于图21至25中并在下文进行讨论。本领域技术人员可以进行与来自其它血清型(例如AAV2，AAV3，AAV7，AAV10和AAV 12)的衣壳蛋白的类似3D比对，并鉴定这样的序列中相应于AAV2中上文定义的位置的位置。

变体AAV1衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV1衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV1衣壳蛋白在AAV1衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。AAV1衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV1衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图3中示出(SEQ ID NO：3)。野生型AAV1衣壳蛋白序列还可获自数据库登录号：NC-002077。优选地，变体AAV1衣壳蛋白与SEQID NO：3具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV1衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：S205(与ttAAV2中的S205对齐)；G549(与ttAAV2中的G548对齐)；S586(与ttAAV2中的S585对齐)；和T589(与ttAAV2中的T588对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV1衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S。通常地，这样的变体AAV1衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV1衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV1衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV1衣壳蛋白可以包含一个或多个下列取代：S205T，G549E，S586R和/或T589R。通常地，这样的变体AAV1衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV1衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

变体AAV5衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV5衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV5衣壳蛋白在AAV5衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：124,150,153,195,303,444,479,486,520,533,537,575,578和/或583。AAV5衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV5衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图4中示出(SEQ ID NO：4)。野生型AAV5衣壳蛋白序列还可获自数据库登录号：AF085716。优选地，变体AAV5衣壳蛋白与SEQ IDNO：4具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV5衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：G537(与ttAAV2中的G548对齐)；S575(与ttAAV2中的S585对齐)；T578(与ttAAV2中的T588对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV5衣壳蛋白相对于野生型AAV5衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V124I,K150A,K153S,A195S,R303S,T444M,S479A,V486D,T520Y,P533D和/或G583S。通常地，这样的变体AAV5衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV5衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV5衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV5衣壳蛋白可以包含一个或多个下列取代：G537E,S575R和/或T578R。通常地，这样的变体AAV5衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV5衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

变体AAV6衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV6衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV6衣壳蛋白在AAV6衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。AAV6衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV6衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图5中示出(SEQ ID NO：5)。野生型AAV6衣壳蛋白序列还可获自数据库登录号：AF028704。优选地，变体AAV6衣壳蛋白与SEQ IDNO：5具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV6衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：S205(与ttAAV2中的S205对齐)；G549(与ttAAV2中的G548对齐)；S586(与ttAAV2中的S585对齐)；T589(与ttAAV2中的T588对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV6衣壳蛋白相对于野生型AAV6衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S。通常地，这样的变体AAV6衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV6衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV6衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV6衣壳蛋白可以包含一个或多个下列取代：S205T，G549E，S586R和/或T589R。通常地，这样的变体AAV6衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV6衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

变体AAV8衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV8衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白在AAV8衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。AAV8衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV8衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图6中示出(SEQ ID NO：6)。野生型AAV8衣壳蛋白序列还可获自数据库登录号：NC_006261。优选地，变体AAV8衣壳蛋白与SEQID NO：6具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV8衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：S315(与ttAAV2中的S312对齐)；T591(与ttAAV2中的T588对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,K163S,A206S,T460M,T495A,N502D,F536Y,N549D,A551G,Q588S和/或G596S。通常地，这样的变体AAV8衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV8衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV8衣壳蛋白可以包含一个或多个下列取代：S315N和/或T591R。通常地，这样的变体AAV8衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV8衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在一个实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白在AAV8衣壳蛋白序列的位置315上包含氨基酸取代。例如，变体AAV8衣壳蛋白可包含残基N315。因此，在一个实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含氨基酸取代S315N。

变体AAV9衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV9衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV9衣壳蛋白在AAV9衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,162,205,314,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。AAV9衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV9衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图7中示出(SEQ ID NO：7)。野生型AAV9衣壳蛋白序列还可获自数据库登录号：AY530579。优选地，变体AAV9衣壳蛋白与SEQ IDNO：7具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV9衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：S162(与ttAAV2中的S162对齐)；S205(与ttAAV2中的S205对齐)；G549(与ttAAV2中的G548对齐)；S586(与ttAAV2中的S585对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV9衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：L125I,Q151A,N314S,Q458M,V493A,E500D,F534Y,G547D,A589T和/或G594S。通常地，这样的变体AAV9衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV9衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV9衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV9衣壳蛋白可以包含一个或多个下列取代：S162A,S205T,G549E和/或T589R。通常地，这样的变体AAV9衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV9衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

变体AAV10衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV10衣壳蛋白。如本文所使用，“AAV10”包括AAVrh10。在此实施方案中，变体AAV10(例如AAVrh10)衣壳蛋白在AAV10衣壳蛋白序列中的一个或多个下列位置上包含至少一个氨基酸取代：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。AAV10衣壳蛋白VP1中的这些位置相应于上文关于AAV2所公开的那些。

野生型AAV10衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图8中示出(SEQ ID NO：8)。优选地，变体AAV10衣壳蛋白与SEQ ID NO：8具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

野生型AAV10衣壳蛋白VP1已在相应于存在于上文公开的变体AAV2衣壳蛋白(SEQID NO：2，ttAAV2)中而非野生型AAV2(SEQ ID NO：1)中的氨基酸残基的位置上包含下列残基：G551(与ttAAV2中的G548对齐)。因此，在优选的实施方案中，变体AAV10衣壳蛋白相对于野生型AAV10衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,Q151A,K163S,A206S,N315S,T460M,L495A,N502D,F536Y,G549D,Q588S,A591T和/或G596S。通常地，这样的变体AAV10衣壳蛋白可与变体AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：2，ttAAV2)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV10衣壳蛋白增加的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

在替代实施方案中，变体AAV10衣壳蛋白包含相应于存在于ttAAV2中的突变转换回野生型AAV2序列的一个或多个氨基酸取代。例如，变体AAV10衣壳蛋白可以包含下列取代：G551E。通常地，这样的变体AAV10衣壳蛋白可与野生型AAV2衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)共享一个或多个功能特性，例如可赋予相较于野生型AAV10衣壳蛋白降低的神经元的或视网膜组织的感染性和/或转导。

变体AAV3B衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV3B衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV3B衣壳蛋白相对于野生型AAV3B衣壳蛋白可在位置312上包含氨基酸取代。例如，变体AAV3B衣壳蛋白可包含残基N312。因此，在一个实施方案中，变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含氨基酸取代S312N。在其它实施方案中，变体AAV3B衣壳蛋白可在相应于上文关于AAV2所公开的那些的位置上包含一个或多个额外的突变。

野生型AAV3B衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图38中示出(SEQ ID NO：11)。野生型AAV3B衣壳蛋白序列还可获自NCBI数据库登录号：AF028705。优选地，变体AAV3B衣壳蛋白与SEQ ID NO：11具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

变体AAV-LK03衣壳蛋白

在一个实施方案中，载体包含变体AAV-LK03衣壳蛋白。在此实施方案中，变体AAV-LK03衣壳蛋白相对于如SEQ ID NO:12定义的AAV-LK03衣壳蛋白序列可在位置312上包含氨基酸取代。例如，变体AAV-LK03衣壳蛋白可包含残基N312。因此，在一个实施方案中，变体AAV-LK03衣壳蛋白相对于如SEQ ID NO:12定义的AAV-LK03衣壳蛋白序列包含氨基酸取代S312N。在其它实施方案中，变体AAV-LK03衣壳蛋白可在相应于上文关于AAV2所公开的那些的位置上包含一个或多个额外的突变。

野生型AAV-LK03衣壳蛋白VP1的序列是已知的，并在图39中示出(SEQ ID NO：12)。野生型AAV-LK03衣壳蛋白序列还在WO 2013/029030中公开为其中的序列号31。优选地，变体AAV-LK03衣壳蛋白与SEQ ID NO：12具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

基因产物

在一个实施方案中，rAAV还包含异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框能够在转录和翻译后编码特定蛋白质。“基因产物”是特定基因的表达产生的分子。基因产物包括，例如，多肽、适体、干扰RNA、mRNA等。

“异源”意指来源于与进行比较的实体的其余部分基因型不同的实体。例如，通过遗传工程技术引入至来自不同物种的质粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中移除和可操作地连接至与其不是天然发现连接的编码序列的启动子是异源启动子。因此，例如，包含编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是包含通常不包括在天然存在的野生型AAV中的核酸的rAAV，并且所编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型AAV编码的基因产物。

在一些实施方案中，基因产物是干扰RNA。在一些实施方案中，基因产物是适体。在一些实施方案中，基因产物是多肽。

干扰RNA

当基因产物是干扰RNA(RNAi)时，合适的RNAi包括降低细胞中的凋亡或血管生成因子的水平的RNAi。例如，RNAi可以是减少诱导或促进细胞中的凋亡的基因产物的水平的shRNA或siRNA。其基因产物诱导或促进凋亡的基因在本文中称为“促凋亡基因”并且这些基因的产物(mRNA；蛋白质)被称为“促凋亡基因产物”。促凋亡基因产物包括，例如，Bax,Bid,Bak和Bad基因产物。参见，例如，美国专利号7,846,730。

干扰RNA还可以针对血管生成产物，例如VEGF(例如，Cand5；参见，例如，美国专利公开号2011/0143400；美国专利公开号2008/0188437；和Reich等人(2003)Mol.Vis.9:210)，VEGFR1(例如，Sirna-027；参见，例如，Kaiser等人(2010)Am.J.Ophthalmol.150:33；和Shen等人(2006)Gene Ther.13:225)，或VEGFR2(Kou等人(2005)Biochem.44:15064))。还参见，美国专利号6,649,596,6,399,586,5,661,135,5,639,872和5,639,736；和美国专利号7,947,659和7,919,473。

“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向至目标基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA是“靶向”至基因的，因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA的双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分外，发夹结构还可包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为5，6，7，8，9，10，11，12或13个核苷酸。发夹结构还可以包含3'或5'突出部分。在一些实施方案中，突出端是长度为0、1、2、3、4或5的3'或5'突出核苷酸。

“短发夹RNA”或shRNA是可以被产生以表达干扰RNA诸如siRNA的多核苷酸构建体。

适体

当基因产物是适体时，示例性目标适体包括针对血管内皮细胞生长因子(VEGF)的适体。参见，例如，Ng等人(2006)Nat.Rev.Drug Discovery 5:123；和Lee等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:18902。还适合使用的是PDGF特异性适体，例如，E10030；参见，例如，Ni and Hui(2009)Ophthalmologica 223:401；和Akiyama等人(2006)J.CellPhysiol.207:407)。

多肽

在一个实施方案中，基因产物是治疗性蛋白质。“治疗性”肽或蛋白是可减轻或减少细胞或受试者中由蛋白的缺失或缺陷造成的症状的肽或蛋白质。或者，“治疗性”肽或蛋白质是在其它方面赋予受试者益处例如抗退化作用的肽或蛋白质。

当基因产物是多肽时，多肽通常是增强细胞的功能的多肽，所述细胞例如为存在于神经元、视网膜或肝脏组织中的细胞，例如肝细胞，神经元，神经胶质细胞，视杆或视锥感光细胞，视网膜神经节细胞，米勒细胞，双极细胞，无长突细胞，水平细胞或视网膜色素上皮细胞。

示例性多肽包括神经保护多肽(例如，GDNF，CNTF，NT4，NGF，以及NTN)；抗血管生成多肽(例如，可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体；VEGF结合抗体；VEGF结合抗体片段(例如，单链抗VEGF抗体)；内皮抑素；肿瘤抑素；血管抑素；可溶性Fit多肽(Lai等人(2005)Mol.Ther.12:659)；包含可溶性Fit多肽的Fc融合蛋白(参见，例如，Pechan等人(2009)GeneTher.16:10)；色素上皮源性因子(PEDF)；可溶性Tie-2受体；等等)；金属蛋白酶-3的组织抑制剂(TIMP-3)；光响应视蛋白，例如视紫红质；抗细胞凋亡多肽(例如，Bcl-2,Bcl-Xl)；等等。合适的多肽包括但不限于胶质源性神经营养因子(GDNF)；成纤维细胞生长因子2；神经生长因子(neurturin)(NTN)；睫状神经营养因子(CNTF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-4(NT4)；脑源性神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子；视紫红质；X连锁的凋亡抑制剂；和音猬因子(Sonic hedgehog)。合适的多肽公开于例如WO 2012/145601中。

用于基因递送至肝脏的示例性多肽包括例如，PBGD(胆色素原脱氨酶)IDUA(艾杜糖醛酸酶)Fah(延胡索酰乙酰乙酸水解酶)A1AT(α(1)-抗胰蛋白酶)，1A1(hUGT1A1)(尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶)，HCCS1(肝细胞癌抑制蛋白1)，CD(胞嘧啶脱氨酶)，SOCS3(细胞因子信号传导抑制蛋白3)，TNF(肿瘤坏死因子)，胸苷激酶，IL-24(白细胞介素24)，IL-12(白细胞介素-12)，和TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)。

调控序列

在一些实施方案中，编码目标基因产物的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在其它实施方案中，编码目标基因产物的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。在一些情况下，编码目标基因产物的核苷酸序列可操作地连接至组织特异性或细胞类型特异性调节元件。

例如，在一些情况下，编码目标基因产物的核苷酸序列可操作地连接至肝细胞特异性、神经元特异性或光感受器特异性的调控元件(例如，光感受器特异性启动子)，例如，在神经元或光感受器细胞中赋予可操作地连接的基因的选择性表达的调控元件。合适的光感受器特异性调控元件包括，例如，视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子(Young等人(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)；β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等人(2007)J.Gene Med.9:1015)；色素性视网膜炎基因启动子(Nicoud等人(2007)同上)；光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)基因增强子(Nicoud等人(2007)同上)；IRBP基因启动子(Yokoyama等人(1992)Exp Eye Res.55:225)。合适的神经元特异性启动子包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)；神经丝轻链基因启动子，Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:561 1-5(1991)；和神经元特异性vgf基因启动子，Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995)；等等。合适的肝细胞特异性启动子包括白蛋白启动子(Heard等人,Mol Cell Biol 1987；7:2425)或α1-抗胰蛋白酶启动子(Hafenrichter等人Blood 1994；84,3394-404)。

“控制元件”或“控制序列”是参与有助于多核苷酸的功能调节(包括多核苷酸的复制，倍增，转录，剪接，翻译，或降解)的分子的相互作用的核苷酸序列。调节可影响过程的频率、速度或特异性，并且在自然界中可以是增强性或抑制性的。本领域中已知的控制元件包括例如，转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于下游(3'方向)的编码区从该启动子的转录的DNA区域。

“可操作地连接”或“有效连接”指的是遗传元件的并置，其中所述元件处于允许它们以预期的方式操作的关系。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接至编码区。在启动子和编码区之间可存在插入残基，只要该功能关系得到维持。

如本文所用的术语“启动子”可以指位于编码重组产物的DNA序列的相邻位置的DNA序列。启动子优选地可操作地连接至相邻的DNA序列。相较于在没有启动子存在时表达的重组产物的量，启动子通常增加从DNA序列表达的重组产物的量。来自一种生物体的启动子可被用来增强源自另一种生物体的DNA序列的重组产物表达。例如，脊椎动物启动子可以用于水母GFP在脊椎动物中的表达。此外，一个启动子元件可以增加串联的多个DNA序列表达的重组产物的量。因此，一个启动子元件可增加一个或多个重组产物的表达。多种启动子元件是本领域普通技术人员所公知的。

如本文所用的术语“增强子”可以指位于编码重组产物的DNA序列的相邻位置的DNA序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游或可以位于编码DNA序列(例如，转录或翻译成重组产物的DNA序列)的下游或编码DNA序列之中。因此，增强子元件可以位于编码重组产物的DNA序列的上游或下游100个碱基对、200个碱基对、或300或多个碱基对。增强子元件可以增加从上述由启动子元件增加了表达的DNA序列表达的重组产物的量。多种增强子元件对于本领域普通技术人员而言是容易获得的。

药物组合物

本公开内容提供了药物组合物：a)如上文所述的rAAV载体；和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液。在一些实施方案中，药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液适用于人类使用。

这样的赋形剂、载体、稀释剂和缓冲液包括可以被施用而没有不适当的毒性的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。

药学上可接受的盐可以包含在其中，例如，无机酸盐如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，等；和有机酸的盐如乙酸盐，丙酸盐，丙二酸盐，苯甲酸盐，等。此外，辅助性物质可以存在于这样的媒介物中，所述辅助性物质为例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质，等。广泛多样的药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的并且不需要在这里详细地讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中充分描述，包括，例如，A.Gennaro(2000)"Remington:The Science and Practice of Pharmacy,"20th edition,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人,eds.,7(th)ed.,Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbook of PharmaceuticalExcipients(2000)A.H.Kibbe等人,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc。

在具体的实施方案中，本发明提供了包含在药学上可接受的载体或其它药剂、药物、载体、佐剂、稀释剂等中的如上文所述的rAAV载体的药物组合物。对于注射，载体通常将是液体。对于其它施用方法，载体可以是固体或液体，例如无菌无热原的水或无菌无热原的磷酸缓冲盐水溶液。对于吸入施用，载体将是可吸入的，并且将优选为固体或液体颗粒的形式。作为注射介质，优选使用包含通常用于注射溶液的添加剂例如稳定剂、盐或盐水和/或缓冲液的水。

“药学上可接受的”是指不是生物学上或其它方面不期望的，例如，该材料可施用至受试者而不引起任何不期望的生物效应。因此，这样的药物组合物可以例如用于细胞的离体转染或用于直接施用病毒颗粒或细胞至受试者。

递送基因产物至组织或细胞(例如肝脏、神经元或视网膜组织或细胞)的方法和治疗方法

本发明的方法提供了用于递送异源核酸序列至宿主组织或细胞(包括分裂和非分裂细胞)中的手段。本发明的载体和其它试剂、方法和药物制剂另外地可用于施用蛋白质或肽至有此需要的受试者的方法，作为治疗或其它的方法。以这种方式，蛋白质或肽可因此在受试者中体内产生。受试者可能需要该蛋白质或肽，因为受试者具有该蛋白质或肽的缺陷，或因为在受试者中蛋白质或肽的产生可赋予一定的治疗效应，从而作为治疗或其它的方法，并且如在下文进一步解释。

如本文所用，术语“治疗”、“医治”等是指获得所需的药理学和/或生理学效应。该效应在完全或部分防止疾病或其症状方面可以是预防性的和/或在疾病和/或可归因于该疾病的不利影响的部分或完全治愈方面可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物特别是人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病或处于发生该疾病的风险中但还没有被诊断为患有其的受试者中发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；和(c)缓解疾病，即，导致疾病的消退。

在一般情况下，本发明可以用于递送具有生物效应的任何外来核酸以治疗或改善与任何器官、组织或细胞中的基因表达相关的任何病症相关联的症状，特别是与例如肝脏、脑或眼相关联的那些症状。示例性疾病状态包括，但不限于：溶酶体贮积症，急性间歇性卟啉，鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，α(1)-抗胰蛋白酶缺乏症，急性肝脏功能衰竭，庞皮病，酪氨酸血症，克里格勒－纳贾尔综合征，肝炎，肝硬化，肝细胞癌，AIDS，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化症，癫痫症，和其它神经病症，癌症(例如脑癌)，视网膜变性疾病和其它眼部疾病。

基因转移在理解和提供用于疾病状态的治疗中具有实质性的潜在用途。存在许多其中有缺陷的基因是已知的并已被克隆的遗传性疾病。在某些情况下，这些克隆的基因的功能是已知的。在一般情况下，上述的疾病状态分为两类：缺陷性状态，通常为酶的，其通常以隐性方式遗传，和不平衡状态，至少有时涉及调节或结构蛋白，其以显性方式遗传。对于缺陷性状态疾病，基因转移可用于将正常基因引入受影响的组织用于替代疗法，以及用于使用反义突变创建疾病的动物模型。对于不平衡疾病状态，基因转移可用于创建模型系统中的疾病状态，其可随后尝试用于消除疾病状态。因此本发明的方法允许遗传性疾病的治疗。如本文所使用的，疾病状态通过部分或全部地补救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡来治疗。使用核酸序列的位点特异性整合以引起突变或纠正缺陷也是可能的。

在一个方面，本发明提供了递送基因产物至受试者的组织或细胞(例如，肝脏、神经元或视网膜组织或细胞)的方法，该方法包括给受试者施用如上所述的rAAV载体。基因产物可以是多肽或干扰RNA(例如，shRNA，siRNA等)，或适体，例如如上文所述的。细胞可以是例如血细胞，干细胞，骨髓(例如造血)细胞，肝细胞，癌细胞，血管细胞，胰腺细胞，神经细胞，神经胶质细胞，眼或视网膜细胞，上皮或内皮细胞，树突细胞，成纤维细胞，肺细胞，肌细胞，心肌细胞，肠细胞或肾细胞。类似地，组织可以例如选自血液，骨髓，肌肉组织(例如骨骼肌，心肌或平滑肌包括血管平滑肌)，中枢或外周神经系统组织(例如，脑、神经元组织或视网膜组织)，胰腺组织，肝脏组织，肾组织，肺组织，肠组织或心脏组织。

递送基因产物至视网膜细胞可以提供视网膜疾病的治疗。视网膜细胞可以是光感受器，视网膜神经节细胞，米勒细胞，双极细胞，无长突细胞，水平细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些情况下，视网膜细胞为感光细胞，例如，视杆或视锥细胞。类似地，递送基因产物至神经元组织或细胞可以提供神经障碍的治疗。基因产物可被传递至存在于神经元组织中的各种细胞类型，例如神经元或神经胶质细胞(例如星形胶质细胞，少突胶质细胞等等)。递送基因产物至肝脏可以提供肝脏病症的治疗。基因产物可被递送至例如肝细胞。

本公开内容提供了治疗疾病(例如，肝脏、神经或眼部疾病)的方法，该方法包括对有需要的个体施用有效量的如上所述的rAAV载体。受试者rAAV载体可以通过颅内注射，脑内注射，眼内注射，通过玻璃体内注射，视网膜注射，视网膜下注射，静脉注射或通过任何其它方便的施用模式或途径施用。

施用的其它示例性模式包括口服、直肠、经粘膜、局部、透皮、吸入、肠胃外(例如，静脉内，皮下，皮内，肌内，和关节内)施用等，以及直接的组织或器官注射，可替代地，鞘内，直接肌内，心室内，静脉内，腹膜内，鼻内或眼内注射。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或作为乳液。或者，可以以局部而非全身方式例如在贮库或缓释制剂中施用病毒。

重组病毒载体优选以足以导致受试者的细胞(例如肝脏，神经或视网膜细胞)中异源核酸序列的感染(或转导)和表达的量的施用至受试者。优选地，靶细胞是肝细胞，神经细胞(包括中枢和外周神经系统的细胞，特别是脑细胞)或视网膜细胞。在一些情况下，视网膜细胞为感光细胞(例如，视杆和/或视锥细胞)。在其它情况下，视网膜细胞是RGC细胞。在其它情况下，视网膜细胞是RPE细胞。在其它情况下，视网膜细胞可以包括无长突细胞，双极细胞，和水平细胞。

优选地，载体以治疗有效量施用。如本文所使用的“治疗有效”量是足以减轻(例如，缓解，降低，减少)与疾病状态相关的至少一个症状的量。可替代地陈述地，“治疗有效”量是足以提供受试者的病况的一定改善的量。“治疗有效量”将落入可以通过实验和/或临床试验确定的相对宽的范围内。例如，对于体内注射，治疗有效剂量将为约10⁶至约10¹⁵的rAAV病毒体，例如约10⁸至10¹²的rAAV病毒体的量级。对于体外转导，待递送至细胞的有效量的rAAV病毒体将为约10⁸至约10¹³的rAAV病毒体的量级。其它有效剂量可以由本领域普通技术人员通过常规试验建立剂量响应曲线来容易地建立。

在一些实施方案中，可以采用多于一次施用(例如，两次，三次，四次或更多次施用)以在一段不同的时间间隔上(例如，每天，每周，每月，每年等)实现期望水平的基因表达。

可以治疗的神经性疾病包括与脑或CNS相关的任何疾病，包括精神疾病。脑的疾病分为两个一般种类：(a)病理过程诸如感染、创伤和肿瘤；和(b)神经系统所特有的疾病，其包括髓鞘疾病和神经元变性疾病。任何一类的疾病可以进行治疗。例如，神经性疾病可以选自神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，脊髓性肌萎缩和小脑变性；精神分裂症；癫痫；缺血相关疾病和中风；脱髓鞘疾病例如多发性硬化，静脉周脑炎，脑白质营养不良例如因芳基硫酸酯酶A的缺乏引起的异染性脑白质营养不良，因半乳糖脑苷脂β-半乳糖苷酶的缺乏引起的克拉伯病，肾上腺脑白质营养不良和肾上腺髓质神经病；病毒后疾病，例如进行性多灶性白质脑病，急性播散性脑脊髓炎，急性坏死性出血性白质脑炎；线粒体脑肌病；神经癌，例如原发性脑肿瘤，包括神经胶质瘤，脑膜瘤，神经鞘瘤，垂体腺瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，血管瘤，表皮样瘤，肉瘤和从其它肿瘤来源的颅内转移；神经性感染或神经炎症性疾病。

可利用本发明方法治疗的眼部疾病包括，但不限于，急性黄斑视神经视网膜病变；白塞氏病；脉络膜新生血管化；糖尿病性葡萄膜炎；组织胞浆菌病；黄斑变性，例如急性黄斑变性，非渗出性年龄相关的黄斑变性和渗出性年龄相关的黄斑变性；水肿，例如黄斑水肿，囊样黄斑水肿和糖尿病性黄斑水肿；多灶性脉络膜炎；影响后部眼位点或位置的眼外伤；眼部肿瘤；视网膜疾病，例如视网膜中央静脉阻塞，糖尿病视网膜病变(包括增生性糖尿病视网膜病变)，增生性玻璃体视网膜病变(PVR)，视网膜动脉阻塞性疾病，视网膜脱离，葡萄膜炎视网膜疾病；交感性眼炎；伏格特-小柳(VKH)综合征；葡萄膜扩散；由眼激光治疗引起的或影响的后部眼病症；由光动力治疗引起的或影响的后部眼病症；光凝固，辐射性视网膜病变；视网膜前膜病症；视网膜分支静脉阻塞；前部缺血性视神经病变；非视网膜病变糖尿病视网膜功能障碍；视网膜劈裂；视网膜色素变性；青光眼；乌谢尔综合征，视锥-视杆营养不良；斯特格疾病(眼底黄色斑点症)；遗传性黄斑变性；脉络膜视网膜变性；利伯先天性黑矇；先天性静止性夜盲；无脉络膜；巴比二氏综合征；黄斑毛细血管扩张；利伯遗传性视神经病变；早产儿视网膜病；和色觉的病症，包括全色盲，红色盲，绿色盲，和蓝色盲。

可被治疗的肝脏疾病包括，例如，溶酶体贮积病，例如急性间歇性卟啉，鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，威尔逊氏病，粘多糖病(例如MPS I型或MPS VI型)，斯莱综合征，庞皮病，酪氨酸血症，α(1)抗胰蛋白酶缺乏症，克里格勒－纳贾尔综合征；A、B或C型肝炎；肝硬化；肝癌，例如肝细胞癌；或急性肝功能衰竭。

本发明发现了在兽医和医疗应用两者中的用途。合适的受试者包括禽类和哺乳动物，其中哺乳动物是优选的。如本文所用的术语“禽”包括，但不限于，鸡，鸭，鹅，鹌鹑，火鸡和雉。如本文所用的术语“哺乳动物”包括，但不限于，人，牛，绵羊，山羊，马科动物，猫科动物，犬科动物，兔类动物等。人受试者是最优选的。人受试者包括胎儿，新生小鼠，婴儿，青少年和成年受试者。

组织(例如肝脏、神经元或视网膜组织)的转导

在一些实施方案中，本文所公开的rAAV载体表现出组织(例如肝脏，神经元和/或视网膜组织)的增加的转导，例如相比于包含野生型AAV衣壳蛋白的相应AAV载体(来自相同血清型)。例如，rAAV载体相较于包含相应的野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体的感染性可以表现出至少10％，50％，100％，500％或1000％增加的感染性。

在其它实施方案中，本文所公开的rAAV载体可以选择性或特异性感染组织(例如肝脏，神经元或视网膜组织)，例如相较于其它类型的细胞类型，显示出肝脏、神经元或视网膜细胞的增加的转导。例如，相较于另一种细胞类型(如非肝脏，非神经元和/或非视网膜细胞)，rAAV载体可以表现出特定细胞类型(如肝脏，神经元或视网膜细胞)的至少10％，50％，100％，500％或1000％增加的感染性。例如，相较于肝脏、脑和/或眼外的细胞，rAAV载体可以选择性地感染肝细胞、神经元和/或感光细胞。

当重组AAV载体表现出神经元或视网膜组织的增加的转导时，例如当使用载体用于治疗神经性或眼部病症时，载体优选包含变体AAV2衣壳蛋白。

当重组AAV载体表现出肝脏组织的增加的转导时，例如当使用载体用于治疗肝脏疾病时，载体优选包含变体AAV3B、AAV-LK03或AAV 8衣壳蛋白。

核酸和宿主细胞

本公开内容提供了分离的核酸，其包含编码如上所述的变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列。分离的核酸可以包含在AAV载体，例如重组AAV载体中。

包含这样的变体AAV衣壳蛋白编码序列的重组AAV载体可被用于产生重组AAV病毒体(即重组AAV载体颗粒)。因此，本公开内容提供了重组AAV载体，当引入到合适的细胞中时，其可以提供重组AAV病毒体的产生。

本发明还提供了宿主细胞，例如分离的(遗传修饰)的宿主细胞，其包含目标核酸。主题宿主细胞可以是分离的细胞，例如，在体外培养的细胞。主题宿主细胞可用于产生主题rAAV病毒体，如下文所描述的。当主题宿主细胞用于产生主题rAAV病毒体时，它被称为“包装细胞”。在一些实施方案中，主题宿主细胞用主题核酸稳定地遗传修饰。在其它实施方案中，主题宿主细胞用主题核酸瞬时遗传修饰。

主题核酸使用已建立的技术稳定或瞬时引入宿主细胞，包括，但不限于，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体介导的转染等。对于稳定转化，主题核酸通常将还包括选择标记，例如，几种公知的选择标记的任一种，例如新霉素抗性等。

通过引入主题核酸至任何的各种细胞产生主题宿主细胞，所述各种细胞为例如哺乳动物细胞，包括，例如，鼠细胞，灵长类动物细胞(例如，人细胞)。合适的哺乳动物细胞包括但不限于，原代细胞和细胞系，其中合适的细胞系包括，但不限于，293细胞，COS细胞，HeLa细胞，Vero细胞，3T3小鼠成纤维细胞，C3H10T1/2成纤维细胞，CHO细胞等。合适的宿主细胞的非限制性实例包括，例如，HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)，CHO细胞(例如ATCC号CRL9618，CCL61，CRL9096)，293细胞(例如ATCC号CRL-1573)，Vero细胞，NIH 3T3细胞(例如，ATCC号CRL-1658)，Huh-7细胞，BHK细胞(例如，ATCC号CCL10)，PC12细胞(ATCC号CRL1721)，COS细胞，COS-7细胞(ATCC号CRL1651)，RATI细胞，小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)，人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)，HLHepG2细胞，等。主题宿主细胞还可以使用杆状病毒感染昆虫细胞例如Sf9细胞(其产生AAV)来制备(参见，例如，美国专利号7,271,002；美国专利申请12/297,958)。

在一些实施方案中，除了包含编码如上所述的变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸以外，遗传修饰的主题宿主细胞还包括包含编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它实施方案中，主题宿主细胞还包含rAAV载体。可使用主题宿主细胞产生rAAV病毒体。产生rAAV病毒体的方法描述于，例如，美国专利公开号2005/0053922和美国专利公开号2009/0202490中。

如本文所用，“包装”是指一系列导致AAV颗粒的组装和衣壳化的细胞内事件。AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。组装相关蛋白(AAP)是cap基因内的开放阅读框的产物，并且可能还需要进行包装。

AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)进行复制并被哺乳动物细胞包装的AAV。用于AAV的多种这样的辅助病毒在本领域是已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒例如牛痘。腺病毒包括许多不同的亚组，尽管腺病毒亚群C的5型是最常用的。人、非人哺乳动物和禽来源的大量的腺病毒是已知的并且可得自保藏机构例如ATCC。疱疹家族的病毒包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；其也可得自保藏机构例如ATCC。

“辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的允许AAV复制和包装(与本文中所描述的复制和包装的其它要求结合)的功能。如本文所述，“辅助病毒功能”可以以多种方式提供，包括通过提供辅助病毒或提供例如编码所需的功能的多核苷酸序列至生产者细胞。例如，将包含编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列的质粒或其它表达载体与rAAV载体一起转染到生产者细胞中。

“感染性”病毒或病毒颗粒是包含被适当地组装的病毒衣壳且能够递送多核苷酸组分至其中病毒物种是向性的细胞的病毒或病毒颗粒。该术语并不一定意味着该病毒的任何复制能力。用于计数感染性病毒颗粒的测定法在本公开内容和本领域中其它地方描述。病毒感染性可以表示为感染性病毒颗粒与总病毒颗粒的比率。测定感染性病毒颗粒与总病毒颗粒的比率的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337(描述了TCID50感染滴度测定)；和Zolotukhin等人(1999)Gene Ther.6:973。

“复制能力”病毒(例如复制能力的AAV)是指具有感染性并且还能够在被感染的细胞(即在辅助病毒或辅助病毒功能的存在下)进行复制的表型上野生型的病毒。在AAV的情况下，复制能力通常需要功能性AAV包装基因的存在。在一般情况下，如本文所述的rAAV载体在哺乳动物细胞中(特别是在人细胞中)由于缺少一种或多种AAV包装基因而是复制无能的。通常，这样的rAAV载体缺乏任何AAV包装基因序列以最小化复制能力的AAV通过AAV包装基因和传入的rAAV载体之间的重组产生的可能性。在许多实施方案中，如本文所述的rAAV载体制剂是含有很少(如果有的话)的复制能力的AAV(rcAAV，也被称为RCA)(例如，少于约1rcAAV/10²rAAV颗粒，少于约1rcAAV/10⁴rAAV颗粒，少于约1rcAAV/10⁸rAAV颗粒，少于约1rcAAV/10¹²rAAV颗粒，或没有rcAAV)的rAAV载体制剂。

“分离的”核酸、载体、病毒、病毒颗粒、宿主细胞或其它物质是指不含至少一些其它组分的物质的制剂，所述其它组分在所述物质或类似物质天然存在或最初从其制备时也可以存在。因此，例如，分离的物质可以通过使用纯化技术以从源混合物富集来制备。富集可以在绝对基础上测量，例如每溶液体积的重量，或它可以相对于存在于源混合物中的第二潜在的干扰物质来测量。本公开内容的实施方案的递增富集是递增地更加分离的。分离的核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质在一些实施方案中是纯化的，例如，约80％至约90％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，至少约98％纯，或至少约99％纯或更纯。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域中普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料也可以在实践或测试本发明中使用，但现描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。

应理解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简明起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合具体地涵盖在本发明中并且公开在本文中如同每一个组合单独地和明确的公开。此外，各种实施方案及其元件的所有子组合物也具体地涵盖在本发明中并且公开在本文中如同每一个组合单独地和明确的公开。

下面的实施例被提供来举例说明本发明的某些实施方案。它并非旨在以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1

在本实施例中，本发明人设计并构建命名为ttAAV2(如在真实型中)的新型AAV2载体。此外，该新型载体在许多动物模型(大鼠，小鼠和新生小鼠)中测试以评估ttAAV2相较于组织培养适应的(野生型)AAV2是否表现出不同。本发明人证明了ttAAV2相对于AAV2具有用于基因递送的优点，并且特别地可用于使用异源序列的脑或眼睛组织的体内转导。

方法

1.克隆：wtAAV2的衣壳基因获自我们的生产者质粒pDG(图10)。该质粒含有wtAAV2rep和cap基因。衣壳基因的子片段(分别地pDG核苷酸A：3257-3759，B：4025-4555，C：4797-5287和D：5149-5425)被亚克隆到pBS中用于后续突变。四个突变通过定向诱变引入片段A中从而导致编码氨基酸(AA)改变V125I、V151A、A162S和T205S的构建体。片段B被突变为编码单个AA改变N312S。片段C被突变为编码AA改变Q457M,S492A,E499D,F533Y,G546D,E548G,R585S,R588T和A593S。在成功诱变的确认后，片段A-C被重新克隆到pDG中，产生生产者质粒(pDG-ttAAV2)，其将支持产生由ttAAV2衣壳衣壳化的重组病毒。

2.ttAAV2-GFP病毒载体产生的纯化和滴定。

载体产生按照采用rAAV质粒与pDG(其提供Ad辅助功能以及AAV rep和cap基因)的共转染的标准方案来建立。各种rAAV质粒被用来产生重组质粒。

pTR-UF11(CAG-GFP)用作rAAV质粒。每细胞工厂(CF10)接种8x10⁸个293细胞。14-18小时后，将细胞用pDG或pDG-rrAAV2和prAAV(例如PTR-UF11)使用CaPO₄共沉淀方法转染。72小时后收获细胞，并重悬浮于裂解缓冲液(20mMTris-HCl,pH8,150mM NaCl,0.5％脱氧胆酸盐)中。细胞沉淀通过四个冻融循环裂解以释放病毒，其中每个循环由-80℃30分钟随后37℃30分钟组成。在最后的解冻后，将裂解物用50U/ml浓度的benzonase处理，并在37℃下温育30分钟。重组病毒使用重力流柱纯化。

纯化。作为第一步骤，将粗裂解物通过在4000g离心15分钟来澄清，并施加至预成型的碘克沙醇不连续梯度。然后收集病毒级分并重新缓冲到乳酸林格氏液中以及使用Amicon离心过滤器进行浓缩。

接着，病毒制剂的纯度通过SDS聚丙烯酰胺电泳评估，并使用实时PCR法滴定。粗提取物含有4.5x10¹²个颗粒；收集的病毒组分包含1.5x10¹²个颗粒。此时，纯化方法回收存在于粗提取物中的病毒的约33％。

3.rAAV载体生产和纯化(替代方法)

在上述第2点的替代实施方案中，rAAV2载体如下产生。为了产生rAAV2病毒体，每细胞工厂(CF10)接种5x10⁸个293T细胞。14-18小时后，将细胞用含GFP的载体PD10-pST2-CMV-GFP和pDG或pDG衣壳突变体(pDG-ttAAV2)双重转染以分别产生AAV2-CMV-GFP野生型或真实型载体。双重转染使用来自Polysciences的PEI-max在3,5ml PEI/mg DNA的比率实现。在37℃温育72小时后通过以2200rpm在4℃下离心培养基和细胞10分钟来收获细胞。移去上清液并保留用于进一步处理，将细胞沉淀重悬浮于裂解缓冲液(0.15M NaCl,50mM Tris-HCl[pH 8.8])中。

随后细胞沉淀通过四个冻融循环裂解以释放病毒，其中每个循环由-80℃30分钟随后37℃30分钟组成。在最后的解冻后，将裂解物用150U/ml浓度的benzonase处理，并在37℃下温育30分钟。然后将裂解物在2000rpm离心20分钟以澄清裂解物。使用0.22μm乙酸纤维素滤器过滤上清，使用

色谱系统(GE Healthcare)和AVB琼脂糖亲和柱(bfr.A:PBS,pH 8；bfr B:0.5M甘氨酸,pH2.7)通过FPLC纯化重组AAV2病毒制剂。将收集的级分针对PBS透析过夜，然后将病毒制备物通过SDS聚丙烯酰胺电泳和实时PCR方法滴定。

结果

ttAAV2的体内传导和扩散

在体内测试ttAAV2载体以评估经修饰的病毒在这样的背景下的生物活性。制备AAV2-CMV-GFP WT和TT病毒的样品用于注射至许多体内模型。为了这个目的，我们浓缩病毒，因为只有有限体积的载体可在体内注射。然后我们进行了qPCR和SDS-PAGE以评估浓缩的载体的新滴度(图11)。

在qPCR和蛋白凝胶分析后，我们获得了下列的新滴度：1.33x10¹²病毒基因组/ml的AAV2-CMV-GFP TT和1.25x10¹²病毒基因组/ml的AAV2-CMV-GFP WT。衣壳滴度如下：8.89x10¹²衣壳/ml的AAV2-CMV-GFP TT和7.83x10¹²衣壳/ml的AAV2-CMV-GFP WT。滴度在基因组拷贝和衣壳拷贝之间不同，因为SDS-PAGE还显示了空衣壳，其通常在重组AAV载体产生期间产生，因此衣壳滴度比从qPCR获得的病毒基因组滴度高。

大鼠脑组织中的转导。

rAAV2TT和WT病毒在野生型大鼠的黑质或纹状体中注射，每个条件注射3只大鼠，剂量为每次注射2x10⁹vg或3.5x10⁹vg。28天后，解剖脑并制备组织切片用于免疫荧光分析。主要数据显示于图12和图26中。

rAAV2TT和WT病毒均能够转导每个注射部位的神经元和神经胶质细胞，尽管效率不同。通过比较，我们观察到相比于WT载体，TT载体更有效地转导脑组织并且从注射位点扩散得更多。此外，我们观察到在rAAV2TT的纹状体注射后，转导的神经元在束旁核(下丘脑的区域)中的存在。这表明了TT载体能够从注射部位的转导细胞体通过主动运输沿着神经元突起转移到下丘脑，表明逆向运输的强能力。这种逆向运输能力已在组织培养适应的WTrAAV2载体中丢失，因为未转导的细胞可以在相同的区域中观察到(参见图26)。

综合起来，在大鼠脑中的这些结果表明相比于滴度匹配的wtAAV2，ttAAV2的显著增加的扩散和转导效率。此外，AAV2TT展现非常好的逆向运输能力的证据，这已在AAV2WT病毒中丢失。

小鼠眼模型中的转导。

来自用于我们的大鼠脑研究的同一批的ttAAV2和wt-AAV2在以每眼2x10⁹vg的剂量注射入成年小鼠眼中。为了避免动物间差异性，每个小鼠在一只眼睛接受rAAV2TT的注射且在对侧眼接受rAAV2WT的注射。分析了眼内注射的三种不同的途径：前房内，玻璃体内和视网膜下。收获动物并6周后通过免疫荧光评估GFP表达。结果示于图13中。综合起来，这些数据表明在视网膜下注射后ttAAV2对感光细胞的转导的显著增强(在转导的感光细胞的水平和数量上)，如果与wtAAV2(其在成功的RPE65临床试验中使用)相比较。

新生小鼠模型中的转导。

概括而言，将ttAAV2和wtAAV2GFP载体注射到新生小鼠中。测试了注射的两种途径，静脉内注射和颅内注射。4周后，将动物处死并且从所有小鼠采集所有组织。我们已分析了脑，其在收获后通过在荧光显微镜上器官的直接荧光来可视化。结果示于图14中。颅内和全身注射的结果在下文更详细地讨论。

颅内注射

5x10¹⁰vg任一载体注射在P1新生小鼠的侧脑室。注射后4周将动物处死并对脑进行解剖、切片和使用抗GFP抗体染色。结果示于图27中。

如在成年大鼠脑中观察到的，这些数据表明，AAV2TT在颅内注射后相较于AAV2WT载体显示小鼠脑组织的增强的转导和更高的扩散。当在更高倍率下观察染色切片时，这两个载体之间的转导效率的差异被进一步突出：TT载体在表达水平和转导的细胞的数目方面均表现较好。AAV2TT和WT似乎具有相同的细胞类型亲和力，各自展现神经元以及神经胶质细胞的转导，表明所观察到的差异是在效率而不是在细胞类型特异性上的差异(图28)。综合起来，这些数据表明，ttAAV2相较于基于wtAAV2的载体在颅内注射后显示小鼠脑组织的更多增强的转导。另外，当使用ttAAV2载体时一些证据暗示衬砌心室的室管膜细胞层的转导。这种现象对于wtAAV2载体是不可见的。

全身注射

在P1新生小鼠中完成2x10¹¹vg任一载体的颈静脉内注射。注射后4周将动物处死并收获各种器官和通过使用抗GFP抗体的免疫组化评估GFP转导(脑，肝脏，心脏，肌肉，肺，脾和肾)。脑染色的结果示于图29中并且高倍率的照片显示在图30中。

我们在观察到在AAV2TT的全身注射后CNS中良好的转基因表达。AAV2WT载体相比之下表现较差，只观察到少数转导的神经元。

为了评估AAV2TT载体的总体生物分布，我们评估了在全身注射后不同组织中获得的转导水平。将收获的器官固定、石蜡包埋、切片和针对GFP表达染色(图31)。

这些数据表明，AAV-TT载体似乎不具有针对其它器官的强亲和力，而是显示主要针对神经元组织的特异性。此观察可证实通过AAV的静脉内注射治疗神经元遗传疾病的益处，因为它确保了通过此注射途径载体不会转导非靶外周器官而主要地仅转导脑。

总之，我们的体内数据表明，ttAAV2在眼和脑组织中具有非凡的转导特性，显示了几乎专一的针对神经元组织的特异性。

实施例2

其它考虑

不受理论的束缚，相信相较于wtAAV2，ttAAV2中存在的突变包括下列功能组：

1)位于AAV2衣壳三倍峰上的肝素结合残基(S585和T588)；相信，这些残基负责wtAAV2衣壳的肝素结合。在ttAAV2中这些被替换并且我们假设此替换支持病毒在富含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的脑组织中的扩散。

2)位于衣壳内侧上的ttAAV2中的单氨基酸改变(S312)；此内部丝氨酸残基可能在衣壳-DNA相互作用中起作用，从而潜在地促进感染过程中的病毒稳定性、基因组包装或基因组释放。

3)位于AAV衣壳结构的三倍近端峰之间的沟中的两个空间上紧密的氨基酸(D546和G548)；这些残基可能参与与中和抗体的相互作用，从而有助于体内的转导特性。

4)位于三倍近端峰之间的沟中的单个孤立的氨基酸改变(S593)；

5)被认为参与受体结合并且紧密地位于三倍峰上的四个氨基酸(M457，A492，D499和Y533)；

6)位于VP1/VP2一级序列中的其余四个氨基酸改变(I125，A151，S162和S205)；这些残基在不是VP3的一部分的衣壳区域内。已知病毒衣壳内的VP1/VP2特定区域含有可能参与传入病毒的运输的PLA2活性。已显示该区域中的改变影响病毒感染性。

AAV2衣壳蛋白中的这些突变的三维位置是已知的并在图15至20中示出。相应位置可以在来自其它血清型的AAV衣壳蛋白中鉴定(见下文)。为了进一步表征ttAAV2和负责改善的ttAAV2表型的个体氨基酸改变的作用，ttAAV2衣壳可以被突变以将所选择的氨基酸(或氨基酸组，例如基于上文讨论的组1至6)逆转为它们在野生型AAV2衣壳中的相应序列。每个突变载体随后可以使用如上述实施例中描述的方法来进行分析。

例如，表达GFP的各种突变载体可通过颅内(IC)注射到CD1新生小鼠中来提交到动物模型中的第一筛选。在注射的脑中获得的来自每个突变体载体的GFP信号随后通过荧光显微镜观察并与从原始的表达GFP的wtAAV2和ttAAV2载体获得的信号相比较。在鉴定新的表型后(即，当突变特定氨基酸组后，ttAAV2-特异性强GFP表达的消失)，注射的脑随后进一步切片并通过免疫组织化学进行分析。

同时，将这些选择的突变载体通过成年大鼠颅内注射提交到第二筛选。此外，相关的突变组合通过静脉内(IV)注射到新生小鼠以评估载体的生物分布来进行分析。选择的器官(心脏，肺，肝脏，脾，肾，肌肉)随后进行处理用于免疫组织化学和GFP表达的评估。

各TT特异性残基对载体的效率和生物分布的贡献的分析

为了进一步表征AAV2TT和查明负责改善的TT表型的氨基酸改变，将AAV2TT衣壳逐步突变以将所选择的氨基酸逆转为它们在野生型AAV2衣壳中的相应序列。这种策略使我们能够更具体地辨别14个氨基酸突变中的每一个针对AAV2TT的表型的贡献，并限定最小真实型载体，其仅包含必要的突变。

如上所讨论的，我们将14个TT特异性残基根据它们在AAV衣壳上的位置和它们对转导特征的相关潜在贡献进行分组。各种AAV-TT突变体通过在新生小鼠脑或在成年大鼠脑中颅内注射进行筛选以观察是否一些TT特异性残基至野生型等效物的逆转与表型的丢失相关联，由此鉴定14个TT残基中重要的氨基酸改变。

肝素结合位点(HBS)

已显示残基585和588负责AAV2WT衣壳的肝素结合。在AAV-TT中这些被替换并且我们假定该替换支持病毒在富含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的脑组织中的扩散。这两个残基都位于AAV2衣壳结构的三倍近端峰上(参见图16)。

我们通过工程改造WT衣壳上的改变R585S和R588T消除了AAV2WT肝素结合能力(AAV2-HBnull)，即将残基突变为真实型等效物。进行此第一分析以确定AAV-TT不仅仅是没有肝素结合位点的能更多地扩散的AAV2，而是一些其它12个氨基酸改变也在改善AAV-TT转导特征中起作用。

成年大鼠中的颅内注射

将滴度匹配的AAV2-TT、AAV2-WT和AAV2-HBnull载体以每次注射3.5x10⁹vg的剂量注射在野生型大鼠的黑质或纹状体中。28天后解剖脑并制备组织切片用于GFP表达的免疫荧光分析(图32)。

我们在AAV-TT病毒的纹状体注射后在丘脑和黑质中观察到强GFP表达，表明载体的强逆向运输能力。相比之下，AAV2-HBnull和AAV2WT显示比AAV-TT少得多(如果有的话)的逆向运输，因为极少数细胞体在纹状体注射后在这些区域中转导。此观察表明，AAV2-HBnull与AAV-TT不同并且AAV2衣壳上肝素结合能力的不存在有助于脑中真实型载体的良好扩散。然而，这不足以解释其改善的转导特征。

残基S312、D546-G548和S593

S312残基是位于AAV2衣壳的内侧上的唯一TT特异性改变。我们的假设是该内部残基可能在衣壳-DNA相互作用中起作用，从而潜在地促进感染过程中的病毒稳定性、基因组包装和基因组释放。

分别在位置546和548上的D和G残基位于近端3倍峰之间的沟中。

单个孤立的丝氨酸S593位于三倍近端峰之间的沟中。

这些TT特异性残基在AAV2衣壳的三维结构上的位置在图17至19中显示。考虑到它们在结构中不太突出的位置，我们假设，这些残基可能不促成ttAAV2转导表型。

新生小鼠颅内注射

突变S312N在AAV2-TT衣壳上工程改造以创建TT-S312N突变体。突变D546G和G548E在AAV2-TT衣壳上工程改造以产生AAV-TT-DG突变体。突变S593A在AAV2-TT衣壳上工程改造以创建AAV-TT-S593A突变体。

通过将这些选择的TT氨基酸逆转为它们在野生型AAV2衣壳中的相应序列，我们旨在确定这些残基对改善的AAV-TT表型的贡献。

将5x10¹⁰vg的各突变载体注射在P1新生小鼠的侧脑室。注射后4周将动物处死并对脑进行解剖、切片和使用抗GFP抗体染色。结果示于图33中。

有趣的是，这些数据表明，AAV TT-S312N相较于完全AAV2TT载体显示小鼠脑组织的增强的转导。另一方面，氨基酸改变S593A或D546E/G548D似乎没有影响TT表型，因为类似的传导特征可以在整个大脑中观察到。当在较高放大倍率下观察染色切片时，转导效率的差异进一步突出(图34)。

从高倍率照片，我们可以观察到，AAV TT-S312似乎以比原始的具有14个氨基酸改变的AAV-TT更高的效率转导神经元组织。特别地，我们可以看到在TT-S312N载体注射后在脑的吻侧(皮层，纹状体，海马)中更强的转基因表达，无论是在转导的细胞的水平还是数目上。尽管由于与靶向注射部位相关的困难造成在注射的新生小鼠脑中的高变异性，这个观察在分析的所有动物中被证实。在另一方面，逆转S593A或D546E/G548D似乎对TT载体传导表型没有太大的影响。

实施例3

AAV2真实型衣壳上靶向的氨基酸突变，选自用实施例2中的突变体组合获得的结果

根据来自完全AAV TT衣壳上的氨基酸组突变的结果，我们可以确定突变S312N似乎对于TT表型是有利的，进一步提高了它在脑中的转导效率。此外，我们观察到逆转S593A和D546G/G548E似乎不影响AAV-TT的神经元表型。因此，我们假设，TT特异性残基S593、D546和G548可以从真实型衣壳序列排除，在这些位置上留下AAV2WT残基以获得仅具有10个氨基酸改变的最终TT载体。

为了验证这些假设，我们工程改造了TT-S312N-D546G-G548D-S593A载体并通过新生小鼠脑注射测试了它的转导效率。因为最后的新生小鼠颅内注射似乎导致检测到GFP表达的饱和信号，我们决定还与这个“最终前”TT一起注射TT和TT-S312N载体，使用比以前使用的低10倍的剂量。通过使用这个较低剂量我们旨在避免在转导的脑中达到GFP染色的饱和水平，并避免在不同的突变体之间的转导效率比较的困难。

将5x10⁰⁹vg的各突变载体注射在P1新生小鼠的侧脑室。注射后4周将动物处死并对脑进行解剖、切片和使用抗GFP抗体染色。结果示于图35中。

如先前观察到的，这些数据表明，AAV TT-S312N相较于完全AAV2TT载体显示小鼠脑组织的增强的转导。另一方面，最小TT-S312N-D546G/G548E-S593A载体似乎没有达到这些更高水平的转导，尽管它也包含内部S312N突变。这表明，一个或多个氨基酸改变在TT表型中起着一些作用。通过将这些残基逆转回AAV2WT等效物，我们失去了一些增加的传导能力。当在更高倍率观察染色切片时，这些观察结果得到证实(图36)。

我们决定通过对全脑蛋白提取物的酶联免疫吸附试验(ELISA)定量注射的脑中获得的总GFP表达来进一步研究由这些载体的每一个获得的转导效率。简言之，在注射5x10⁰⁹vg载体4周后，将动物处死，收获整个脑并裂解，提取总脑蛋白。通过使用GFP蛋白质标准，我们随后可以定量每一个注射脑中表达的GFP蛋白的量(图37)。

我们可以确认，TT-S312N内部突变体以比完全TT载体更高的效率转导小鼠脑，因为它在所有注射的脑中导致更多的GFP表达。另一方面，最小TT载体TT-S312N-D546G/G548E-S593A似乎导致较低水平的转导：尽管每脑中表达的GFP的平均量在此图中似乎更高，但这是由于在一个脑中测量的极端的GFP值，如通过此条件的高误差棒所示的。使用此最小TT载体，动物之间的变异性非常高的，只有五个中的一个动物比用TT-S312N转导的动物表现更好。这种高变异性促使我们谨慎考虑此临时最小TT载体，特别是因为免疫组化分析也显示，TT-S312N变体比TT-S312N-DG-S593A表现更好。

因此，我们选择了TT-S312N变体作为我们最优选的AAV TT载体，它相较于野生型AAV2包含下列13个氨基酸突变：V125I,V151A,A162S,T205S,Q457M,S492A,E499D,F533Y,G546D,E548G,R585S,R588T和A593S。

尽管上述研究表明了TT-S312N作为最优选的AAV-TT载体，但这些研究示出了许多TT特异性残基的个体功能和贡献。特别地，紧密位于衣壳的三倍峰上的四个氨基酸很可能参与受体结合。在一些实施方案中，这些残基在AAV-TT中逆转回AAV2WT相应残基。例如，突变M457Q、A492S、D499E和Y533F可以在AAV-TT衣壳上工程化并如前所述分析此突变载体以显示这些残基的作用。在其它实施方案中，位于VP1/VP2一级序列上的四个氨基酸有可能牵涉病毒的运输，并且可以在AAV-TT中逆转回AAV2WT相应残基(I125V,A151V,S162A,S205T)并类似地进行分析。

实施例4

其它血清型中变体AAV载体的构建

还可以测定在其它非AAV2血清型的背景下ttAAV2特异性氨基酸改变的功能。

主要腺相关病毒(AAV)(即AAV1，5，6，8，9和rh10)的衣壳氨基酸序列可与来自ttAAV2的氨基酸序列比对(例如如图9中所示的)。这使得能够鉴定哪个ttAAV2特异性氨基酸已存在于其它血清型中的相同位置上。然后将各种血清型中的相关残基突变为wtAAV2中的相应残基。这些改变证明了ttAAV2特异性残基对于每种血清型的效率和生物分布的重要性。

如上所讨论的，表达GFP的各种突变载体可通过颅内(IC)注射到CD1新生小鼠中来提交到第一筛选。在注射的脑中获得的GFP信号随后与从合适的表达GFP的血清型对照获得的信号相比较。在将鉴定的氨基酸突变成其相应的AAV2残基时GFP表达的减少或增加证实在这些特定的位置上这些特定残基的重要性。在适用时，随后将注射的脑进一步切片并通过免疫组织化学进行分析。此外，所选择的突变血清型通过静脉内(IV)注射到新生小鼠中进行分析以评估载体的生物分布并将其与原始的未突变的对应物进行比较。

在其它实施方案中，在ttAAV2中鉴定的相关氨基酸被插入作为在相关位置上引入其它主要血清型的关键突变。ttAAV2特异性残基在其它AAV亚型中的插入使我们能够改善各血清型的转导和生物分布特征。

实施例5

在其它AAV血清型中保守的ttAAV2特异性残基至相应的AAV2残基的修饰。

现有的腺相关血清型的衣壳氨基酸序列与ttAAV2的衣壳氨基酸序列的比较分析首先使我们能够鉴定在其它血清型中保守的ttAAV2特异性残基(见图9)。这些残基由S162，S205，S312，G548，S585和T588组成。每个非AAV2血清型在其序列的相应氨基酸位置上包含一个这些残基或几个这些残基的组合。

在具体的实施方案中，各种血清型中这些残基的每一个被转换成相应的野生型AAV2氨基酸并测试这些新突变体的转导效率。

1)AAV1血清型的修饰

AAV1包含相应于ttAAV2中的残基S205、G548、S585和T588的残基S205、G549、S586和T589。当来自AAV1的VP1单体与来自AAV2的VP1进行三维对齐时，我们可以验证wtAAV2中相应的残基(即T205、E548、R585和R588)处于3D结构上完美匹配的位置(图21)。因此，我们的结论是，重要的是将AAV1中的每个ttAAV2特异性残基转换成相应的野生型AAV2对应物而不影响蛋白质的三维结构。在具体的实施方案中，在AAV1衣壳序列中进行下列突变：S205T，G549E，S586R，T589R。

2)AAV5血清型的修饰

AAV5包含相应于ttAAV2中的残基G548、S585和T588的残基G537、S575和T578。AAV2中的R585和R588残基处于3D结构上与AAV5中的S575和T578完美匹配的位置。虽然根据三维结构AAV2中的E548并没有与AAV5中的残基G537完美匹配(图22)，我们还是决定将其纳入研究，因为两个残基是空间上相对紧密的。因此在具体的实施方案中，在AAV5衣壳序列中进行下列突变：G537E,S575R,T578R。

3)AAV6血清型的修饰

AAV6包含相应于ttAAV2中的残基S205、G548、S585和T588的残基S205、G549、S586和T589。wtAAV2中相应的残基(即T205、E548、R585和R588)(图23)处于VP1 3D结构上完美匹配的位置。因此，在具体的实施方案中，在AAV6衣壳序列中进行下列突变：S205T，G549E，S586R，T589R。

4)AAV8血清型的修饰

AAV8包含相应于ttAAV2中的残基S312和T588的残基S315和T591。wtAAV2中相应的残基(即N312和R588)处于VP1 3D结构上完美匹配的位置(图24)。因此，在具体的实施方案中，在AAV8衣壳序列中进行下列突变：S315N，T591R。

在一个实施方案中，通过在TT AAV2中的S312N突变赋予改善的转导效率可以通过应用氨基酸改变S315N来转移至AAV8血清型。

我们通过定点诱变突变AAV8衣壳序列，并由此产生AAV8-S315N载体质粒。该质粒用于产生通过293T细胞的双转染表达含有ITR的CMV-GFP转基因的重组AAV8-S315N载体。该载体随后从细胞裂解物并从收获的培养上清液通过FPLC亲和层析使用AVB琼脂糖树脂纯化。衣壳滴度和载体基因组滴度通过SDS-PAGE和qPCR分别评估。

表达GFP的突变AAV8-S315N载体通过CD1新生小鼠中的全身注射筛选。滴度匹配的AAV8载体用作对照。在2x10¹¹vg的颈静脉内注射后在各器官中获得的GFP表达随后进行分析，主要集中在其中AAV8先前已显示出一些强转导效率的肝脏。

5)AAV9血清型的修饰

AAV9包含相应于ttAAV2中的残基S162、S205、G548和S585的残基S162、S205、G549和S586。AAV2中相应的残基(即A162、T205、E548和R585)处于VP1 3D结构上完美匹配的位置(图25)。因此，在具体的实施方案中，在AAV9衣壳序列中进行下列突变：S162A，S205T，G549E和S586R。

6)AAVrh10血清型的修饰

AAVrh10包含相应于ttAAV2中的残基G548的残基G551。考虑到该残基和位置在各种血清型中所表现的保守程度，我们假定AAVrh10中的G551将与wtAAV2中的E548在三维上对齐。因此，在一个实施方案中，在AAVrh10衣壳序列中进行下列突变：G551E。

7)AAV3B和AAV-LK03血清型的修饰

类似于AAV8血清型，在将衣壳蛋白VP1序列与AAV-TT的序列比对后，我们观察到AAV3B血清型也在位置312上包含内部丝氨酸(见图38中的AAV3B衣壳序列)。

新描述的LK03AAV载体(包含由M.A.Kay通过DNA改组工程改造的五个不同亲本的AAV衣壳的嵌合衣壳)也在衣壳的内侧包含残基S312(见Lisowski等人,Selection andevaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model,Nature 506,382–386(2014))。AAV-LK03的衣壳序列公开于WO2013/029030中并显示于图39中。

因此，在其它实施方案中，AAV3B和AAV-LK03载体通过在两个载体中施加氨基酸改变S312N来进行突变。这些新突变体及其相应的AAV对照血清型也通过在新生小鼠中的颈静脉内注射进行测试。然后分析在各收获器官中获得的GFP表达。

实施例6

在AAV血清型之间可转移的ttAAV2特异性氨基酸的鉴定

在其它实施方案中，在ttAAV2表征过程中鉴定的关键氨基酸在相关位置上插入到其它主要血清型中。然后使用合适的非突变血清型作为对照测试新工程改造的载体。这独立于血清型而验证了AAV衣壳的特定位置上个体氨基酸的重要性。

1)残基S585，T588，S312，D546，G548和S593

AAV1、AAV5和AAV6在其衣壳蛋白序列中在相应于ttAAV2中的G548、S585和T588的位置上天然含有相同的氨基酸残基。因此，在其它实施方案中，这些血清型的衣壳蛋白在匹配的位置上进行突变以包含存在于ttAAV2中的其它残基S312、D546和S593。类似地，已在相应于ttAAV2中的S312和T588的位置上包含与ttAAV2相同的氨基酸残基的AAV8被进一步突变以含有相应于ttAAV2中的S585、D546、G548和S593的残基。已包含与ttAAV2中的G548和S585相应的残基的AAV9被突变以包含相应于ttAAV2中的T588、S312、D546和S593的残基。最后，已包含相应于G548的残基的AAV10被进一步修饰以还含有相应于S585、T588、S312、G548和S593的残基。

2)残基I125，A151，S162，S205，M457，A492，D499和Y533

AAV1和AAV6已天然含有残基S205。因此，在其它实施方案中，这些血清型在相应于ttAAV2中的残基I125、A151、S162、M457、A492、D499和Y533的位置上进行突变。类似地，已包含残基S162和S205的AAV9被进一步突变以包含相应于ttAAV2中的I125、A151、M457、A492、D499和Y533的残基。最后，AAV5、8和10被修饰以显示相应于ttAAV2中的I125、A151、S162、S205、M457、A492、D499和Y533残基。

存在于ttAAV2中的突变和存在于其它AAV血清型的野生型衣壳蛋白VP1序列中的相应残基的位置示于下表1中。在一般情况下，变体非AAV2载体可通过突变表1中对于这些血清型所示的任何残基来构建。以斜体示出的残基是已在相应位置上存在于ttAAV2中的残基。在优选的实施方案中，非AAV2血清型在以非斜体字示出的一个或多个残基上进行突变。以此方式，通过ttAAV2显示的有利性质可以被转移到替代AAV血清型中。

表1

ttAAV2

AAV1

AAV5

AAV6

AAV8

AAV9

AAV10

I125

V125

V124

V125

L125

V125

A151

Q151

K150

Q151

S162

T162

K153

T162

K163

S162

K163

S205

A195

S205

A206

S205

A206

S312

N313

R303

N313

S315

N314

N315

M457

N458

T444

N458

T460

Q458

T460

A492

K493

S479

K493

T495

V493

L495

D499

N500

V486

N500

N502

E500

N502

Y533

F534

T520

F534

F536

F534

F536

D546

S547

P533

S547

N549

G547

G549

G548

G549

G537

G549

A551

G549

G551

S585

S586

S575

S586

Q588

S586

Q588

T588

T589

T578

T589

T591

A589

A591

S593

G594

G583

G594

G596

G594

G596

本发明的其它实施方案

本发明还涉及另外的方面，如在下面的总结性段落中定义：

1.一种重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：

(a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白包含至少1个氨基酸取代；其中，所述至少1个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；和

(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

2.根据段落1的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV2衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列，或与其具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV2；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1的序列。

3.根据段落2的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列残基：I125,A151,S162,S205,S312,M457,A492,D499,Y533,D546,G548,S585,T588和/或S593。

4.根据段落2或段落3的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于野生型AAV2衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I,V151A,A162S,T205S,N312S,Q457M,S492A,E499D,F533Y,G546D,E548G,R585S,R588T和/或A593S。

5.根据段落1至3的任一项的重组AAV载体，其中变体AAV衣壳蛋白来自AAV1,AAV5,AAV6,AAV8,AAV9或AAV10。

6.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV1衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV1；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：3的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV1衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。

7.根据段落6的重组AAV载体，其中所述变体AAV1衣壳蛋白相对于野生型AAV1衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S；和/或

(b)S205T,G549E,S586R和/或T589R。

8.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV5衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：4具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV5；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：4的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV5衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：124,150,153,195,303,444,479,486,520,533,537,575,578和/或583。

9.根据段落8的重组AAV载体，其中所述变体AAV5衣壳蛋白相对于野生型AAV5衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)V124I,K150A,K153S,A195S,R303S,T444M,S479A,V486D,T520Y,P533D和/或G583S；和/或

(b)G537E,S575R和/或T578R。

10.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV6衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：5具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV6；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：5的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV6衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,313,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。

11.根据段落10的重组AAV载体，其中所述变体AAV6衣壳蛋白相对于野生型AAV6衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)V125I,Q151A,T162S,N313S,N458M,K493A,N500D,F534Y,S547D和/或G594S；和/或

(b)S205T,G549E,S586R和/或T589R。

12.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV8衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV8；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：6的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV8衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。

13.根据段落12的重组AAV载体，其中所述变体AAV8衣壳蛋白相对于野生型AAV8衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)V125I,Q151A,K163S,A206S,T460M,T495A,N502D,F536Y,N549D,A551G,Q588S和/或G596S；和/或

(b)S315N和/或T591R。

14.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAV9衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：7具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAV9；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：7的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV9衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,314,458,493,500,534,547,549,586,589和/或594。

15.根据段落14的重组AAV载体，其中所述变体AAV9衣壳蛋白相对于野生型AAV9衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)L125I,Q151A,N314S,Q458M,V493A,E500D,F534Y,G547D,A589T和/或G594S；和/或

(b)S162A,S205T,G549E和/或S586R。

16.根据段落5的重组AAV载体，其中(i)所述载体包含变体AAVrh10衣壳蛋白；(ii)所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：8具有至少95％的序列同一性的序列；(iii)野生型AAV衣壳蛋白来自AAVrh10；和/或(iv)野生型AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：8的序列；

并且其中至少1个氨基酸取代存在于AAV10衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,163,206,315,460,495,502,536,549,551,588,591和/或596。

17.根据段落16的重组AAV载体，其中所述变体AAVrh10衣壳蛋白相对于野生型AAVrh10衣壳蛋白包含一个或多个下列氨基酸取代：

(a)V125I,Q151A,K163S,A206S,N315S,T460M,L495A,N502D,F536Y,G549D,Q588S,A591T和/或G596S；和/或

(b)G551E。

18.根据任何前述段落的重组AAV载体，其中所述重组AAV载体相较于包含相应的野生型AAV衣壳蛋白的AAV载体表现出神经元或视网膜组织的增加的转导。

19.根据任何前述段落的重组AAV载体，其中所述基因产物包括干扰RNA或适体。

20.根据段落1至18的任一项的重组AAV载体，其中所述基因产物包括多肽。

21.根据段落20的重组AAV载体，其中所述基因产物包括神经保护多肽，抗血管生成多肽，或增强神经元或视网膜细胞的功能的多肽。

22.根据段落21的重组AAV载体，其中所述基因产物包括胶质源性神经营养因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，脑源性神经营养因子，视紫红质，retinoschisin，RPE65或外周蛋白。

23.一种药物组合物，其包含：

(a)根据任何前述段落的重组AAV载体；和

(b)药学上可接受的赋形剂。

24.一种用于将基因产物递送至受试者的神经元或视网膜组织的方法，所述方法包括向受试者施用根据任何前述段落的重组AAV载体或药物组合物。

25.一种用于治疗受试者的神经或眼部病症的方法，所述方法包括向受试者施用根据任何前述段落的重组AAV载体或药物组合物。

26.根据段落1至23的任一项的重组AAV载体或药物组合物，其用于治疗神经或眼部病症。

27.根据段落24至26的任一项使用的方法、重组AAV载体或药物组合物，其中所述神经病症是神经变性疾病。

28.根据段落24至26的任一项使用的方法、重组AAV载体或药物组合物，其中所述眼部病症是青光眼，色素性视网膜炎，黄斑变性，视网膜劈裂或糖尿病性视网膜病。

29.一种分离的变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白相对于野生型AAV衣壳蛋白包含至少一个氨基酸取代；其中所述至少一个氨基酸取代存在于AAV2衣壳蛋白序列的一个或多个下列位置上：125,151,162,205,312,457,492,499,533,546,548,585,588和/或593；或者存在于替代的AAV衣壳蛋白序列的一个或多个相应的位置上。

30.一种分离的核酸，其包含编码如段落29定义的变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。

31.一种分离的宿主细胞，其包含如段落30中定义的核酸。

Claims

1.一种重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：

(a)变体AAV2衣壳蛋白，

其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白包含至少4个氨基酸取代；

其中所述至少4个氨基酸取代是：Q457M、S492A、E499D和F533Y；且

其中所述变体AAV2衣壳蛋白还包含残基N312；和

(b)异源核酸，其包含编码基因产物的核苷酸序列。

2.根据权利要求1的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白包含SEQ ID NO：2的序列。

3.根据权利要求1的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还在该AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：125、151、162和205。

4.根据权利要求3的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I、V151A、A162S和T205S。

5.根据权利要求1的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还在该AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：585和588。

6.根据权利要求5的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还包含一个或多个下列氨基酸取代：R585S和R588T。

7.根据权利要求1的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还在该AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：546，548和593。

8.根据权利要求7的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还包含一个或多个下列氨基酸取代：G546D、E548G和A593S。

9.根据权利要求1的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还在该AAV2衣壳蛋白序列的下列位置上包含一个或多个氨基酸取代：125、151、162、205、585、588、546、548和593。

10.根据权利要求9的重组AAV载体，其中所述变体AAV2衣壳蛋白相对于SEQ ID NO：1的野生型AAV2衣壳蛋白还包含一个或多个下列氨基酸取代：V125I、V151A、A162S、T205S、R585S、R588T、G546D、E548G和A593S。

11.根据权利要求1～10之任一项的重组AAV载体，其中所述重组AAV载体相较于包含相应的野生型AAV衣壳蛋白的AAV载体表现出神经元或视网膜组织的增加的转导。

12.根据权利要求1～10之任一项的重组AAV载体，其中所述基因产物包括干扰RNA或适体。

13.根据权利要求1～10之任一项的重组AAV载体，其中所述基因产物包括多肽。

14.根据权利要求13的重组AAV载体，其中所述基因产物包括神经保护多肽、抗血管生成多肽、或增强神经元或视网膜细胞的功能的多肽。

15.根据权利要求14的重组AAV载体，其中所述基因产物包括胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、视紫红质、retinoschisin、RPE65或外周蛋白。

16.一种药物组合物，其包含：

(a)根据权利要求1～15之任一项的重组AAV载体；和

(b)药学上可接受的赋形剂。

17.根据权利要求1～15之任一项的重组AAV载体或权利要求16的药物组合物在制备用于将基因产物递送至受试者的组织的药物中的用途。

18.根据权利要求17的用途，其中所述组织选自血液、骨髓、肌肉组织、神经元组织、视网膜组织、胰腺组织、肝脏组织、肾组织、肺组织、肠组织或心脏组织。

19.根据权利要求18的用途，其中所述组织是神经元、视网膜或肝脏组织。

20.根据权利要求1～15之任一项的重组AAV载体或权利要求16的药物组合物在制备用于治疗受试者的病症的药物中的用途。

21.根据权利要求20的用途，其中所述病症是神经、眼部或肝脏病症。

22.根据权利要求21的用途，其中所述神经病症是神经变性疾病。

23.根据权利要求21的用途，其中所述眼部病症是青光眼、色素性视网膜炎、黄斑变性、视网膜劈裂或糖尿病性视网膜病。