KR20160130996A - 아데노-관련 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하되 상기 적어도 4개의 아미노산 치환이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치에 존재하는 변이형 AAV2 캡시드 단백질: 457, 492, 499 및 533; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 개시한다.

Description

아데노-관련 바이러스 벡터{ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR}
본 발명은 재조합 바이러스 벡터의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체내에서 치료 유전자의 전달에 적합한 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다.
지금까지, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 치료 유전자의 전달에 가장 유망한 벡터들 중 하나로 남아있다. 상당수의 전임상 및 임상 연구들은 상기 접근법이 시장의 승인에 도달할 수 있는 유전자-기반 약물의 개발에 적합함을 굳게 확립시켰다.
1980년대에 유전자 요법에 대한 벡터로서 AAV2의 개발이 시작된 이래로 다양한 용도 및 표적 조직에 대해 상기 플랫폼을 최적화함에 있어서 많은 진보가 이루어졌다. 상기 개발 중에서, 어쩌면 가장 중요한 것은 광범위하게 다양한 혈청형의 발견이었으며 이중 10 내지 12개가 현재 통상적으로 탐구되고 있다. 이들 다양한 혈청형의 가장 현저한 특징 중에는 그들 각각의 상대적인 조직 향성 및 일부의 경우, 뉴런 역행수송의 능력이 있다. 이러한 혈청형들 중에서, AAV1 내지 AAV10이 전-임상 및 임상 목적에 광범위하게 사용된다.
환자에서 특이적인 조직 및 세포 하위-유형의 표적화 및 탈-표적화를 허용하는 과정들을 수반하는 보다 신규의 플랫폼이 개발되었다. 이러한 접근법의 핵심 기술은 기존 AAV 변이체(혈청형)의 시행착오 평가 및 무작위로 도입된 AAV 캡시드 돌연변이체의 생체내 선택에 기반한다. 종합하면, 이러한 2가지 유망한 접근법은 수백 개는 아니지만, 수십 개의, 상이한 형질도입 양상을 갖는 잠재적인 벡터들을 제공한다.
AAV 혈청형의 가장 흥미를 자아내는 태양은 동물 모델 및 인간에서 특이적인 조직을 효율적으로 형질도입시키는 그의 능력이다. 지금까지, 조직 향성에 근원적인 기전의 포괄적인 분자적 이해가 여전히 요구되어야 하며 따라서 일반적으로 각각의 혈청형에 대해 이용 가능한 조직-특이적 수용체는 상기 다양한 혈청형에 의한 효율적인 형질도입에 중심적인 역할을 하는 것으로 생각된다.
따라서, 생체내 트랜스유전자 발현 및 조직 특이성에 관하여 개선된 성질을 갖는 추가적인 AAV 벡터가 여전히 필요하다. 특히, 상기와 같은 벡터는 인간에서 다양한 표적 조직으로의 유전자 전달에 크게 향상된 이점을 제공할 가능성을 갖는다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV)2 캡시드 단백질로, 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하되 상기 적어도 4개의 아미노산 치환이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치에 존재하는 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질: 457, 492, 499 및 533; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: M457, A492, D499 및 Y533. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: Q457M, S492A, E499D 및 F533Y.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: 125, 151, 162 및 205. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: I125, A151, S162 및 S205. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, V151A, A162S 및 T205S.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: 585 및 588. 바람직하게는 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: S585 및 T588. 보다 바람직하게 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: R585S 및 R588T.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: 546, 548 및 593. 바람직하게는 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: D546, G548 및 S593. 보다 바람직하게 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: G546D, E548G 및 A593S.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 잔기 N312, 즉 야생형 AAV2 캡시드 단백질 중 312번 위치에 존재하는 잔기를 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질 서열에 비해 312번 위치에서 돌연변이되지 않는다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV)8 캡시드 단백질로, 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 상기 AAV8 캡시드 단백질 서열 중 315번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S315N을 포함한다. 바람직하게, 상기 AAV8 캡시드 단백질 서열은 하기의 위치 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 163, 206, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596.
바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: (a) V125I, Q151A, K163S, A206S, T460M, T495A, N502D, F536Y, N549D, A551G, Q588S 및/또는 G596S; 및/또는 (b) T591R.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV)3B 캡시드 단백질로, 야생형 AAV3B 캡시드 단백질에 대해 상기 AAV3B 캡시드 단백질 서열 중 312번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 서열번호 11에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 11의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 야생형 AAV3B 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S312N을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV)-LK03 캡시드 단백질로, 서열번호 12에 정의된 바와 같은 AAV-LK03 캡시드 단백질 서열에 대해 312번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 서열번호 12에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로, 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 상응하는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 및 (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 하기의 위치 중 하나 이상: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 또는 또 다른 AAV 캡시드 단백질 서열 중 하나 이상의 상응하는 위치에 존재한다.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV2로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: I125, A151, S162, S205, S312, M457, A492, D499, Y533, D546, G548, S585, T588 및/또는 S593. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, V151A, A162S, T205S, N312S, Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T 및/또는 A593S.
추가의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 또는 AAV10으로부터의 것이다.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV1 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 3에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV1로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 3의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV1 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV5 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 4에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV5로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 4의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV5 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 124, 150, 153, 195, 303, 444, 479, 486, 520, 533, 537, 575, 578 및/또는 583. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V124I, K150A, K153S, A195S, R303S, T444M, S479A, V486D, T520Y, P533D, 및/또는 G583S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: G537E, S575R 및/또는 T578R.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV6 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 5에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV6으로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 5의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV6 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV8로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV8 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, K163S, A206S, T460M, T495A, N502D, F536Y, N549D, A551G, Q588S 및/또는 G596S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: S315N 및/또는 T591R.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 7에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV9로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 7의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV9 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 314, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: L125I, Q151A, N314S, Q458M, V493A, E500D, F534Y, G547D, A589T 및/또는 G594S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: S162A, S205T, G549E 및/또는 S586R.
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV10 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV10으로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8의 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 AAV10 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 야생형 AAV10 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, K163S, A206S, N315S, T460M, L495A, N502D, F536Y, G549D, Q588S, A591T 및/또는 G596S. 또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 야생형 AAV10 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환을 포함한다: G551E.
하나의 실시태양에서, 상기 재조합 AAV 벡터는 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터에 비해 뉴런 또는 망막 조직의 증가된 형질도입을 나타낸다.
또 다른 실시태양에서, 상기 재조합 AAV 벡터는 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 간 조직의 증가된 형질도입을 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 간섭 RNA 또는 앱타머를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게 상기 유전자 산물은 신경보호성 폴리펩타이드, 혈관형성 억제성 폴리펩타이드, 또는 뉴런 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 신경교 유래된 신경영양인자, 섬유아세포 성장인자, 신경성장인자, 뇌 유래된 신경영양인자, 로돕신, 레티노스키신, RPE65 또는 페리페린을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 (a) 상기에 정의된 바와 같은 재조합 AAV 벡터; 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 대상체에서 유전자 산물을 조직으로 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 조직은 혈액, 골수, 근육 조직, 뉴런 조직, 망막 조직, 췌장 조직, 간 조직, 신장 조직, 폐 조직, 장 조직 및 심장 조직 중에서 선택된다. 바람직하게 상기 조직은 뉴런, 신장 또는 간 조직이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 정의된 바와 같은 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 질환은 신경학적, 눈 또는 간 질환이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 질환은 신경학적, 눈 또는 간 질환이다. 바람직하게, 상기 신경학적 질환은 신경퇴행성 질병이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 눈 질환은 녹내장, 망막색소변성증, 황반변성, 망막분리 또는 당뇨성 망막병증이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 단리된 변이형 AAV 캡시드 단백질을 제공하며, 여기에서 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고; 여기에서 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 또는 또 다른 AAV 캡시드 단백질 서열에서 하나 이상의 상응하는 위치에 존재한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 변이형 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
도 1은 야생형 아데노-관련 바이러스 2 캡시드 단백질 VP1(서열번호 1; NCBI 참고번호: NC_001401)의 아미노산 서열을 나타낸다. 잔기 V125, V151, A162, T205, N312, Q457, S492, E499, F533, G546, E548, R585, R588 및 A593이 강조된다.
도 2는 트루-타입 아데노-관련 바이러스 2(ttAAV2) 캡시드 단백질 VP1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 나타낸다. 잔기 I125, A151, S162, S205, S312, M457, A492, D499, Y533, D546, G548, S585, T588, S593이 야생형 AAV2 VP1(서열번호 1)과 비교하여 상이하며 강조된다.
도 3은 야생형 아데노-관련 바이러스 1 캡시드 단백질 VP1(서열번호 3; NCBI 참고번호: NC_002077)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: S205(ttAAV2(서열번호 2)에서 S205에 맞게 정렬된다) - G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다) - S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다) - T589(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다).
도 4는 야생형 아데노-관련 바이러스 5 캡시드 단백질 VP1(서열번호 4; NCBI 참고번호: AF085716)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: G537(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다) - S575(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다) - S578(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다).
도 5는 야생형 아데노-관련 바이러스 6 캡시드 단백질 VP1(서열번호 5; NCBI 참고번호: AF028704)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: S205(ttAAV2에서 S205에 맞게 정렬된다) - G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다) - S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다) - T589(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다).
도 6은 야생형 아데노-관련 바이러스 8 캡시드 단백질 VP1(서열번호 6; NCBI 참고번호: NC_006261)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: S315(ttAAV2에서 S312에 맞게 정렬된다) - T591(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다).
도 7은 야생형 아데노-관련 바이러스 9 캡시드 단백질 VP1(서열번호 7; NCBI 참고번호: AY530579)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: S162(ttAAV2에서 S162에 맞게 정렬된다) - S205(ttAAV2에서 S205에 맞게 정렬된다) - G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다) - S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다).
도 8은 야생형 아데노-관련 바이러스 10 캡시드 단백질 VP1(서열번호 8)의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기: G551(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다).
도 9a 및 9b는 AAV 캡시드 단백질 VP1 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 10은 AAV2 벡터의 생성에 사용된 플라스미드가 패키징 플라스미드 pDG임을 나타낸다. 위: 야생형 AAV2 유전자를 갖는 pDG. 아래: 트루-타입 AAV2 유전자를 갖는 pDG-ttAAV2, 585 및 588번 위치에서 헤파란 결합 도메인 중 2개의 핵심 돌연변이가 강조된다. MMTV: AAV rep 발현을 구동하는 프로모터, E2a, E4ORF6 및 VA는 아데노바이러스 헬퍼 인자들을 발현하는 유전자들이다.
도 11은 분리된 단백질들에 대한 크립톤 염색을 나타내고 적외선-형광 스캐너(오디세이 이미징(Odyssey Imaging) 시스템)를 사용하여 스캐닝된, SDS-PAGE에 의한 생체내 주입에 대한 rAAV2 트루-타입(TT) 및 야생형(WT)의 바이러스 역가의 정량분석을 나타낸다. A: 10 ㎕의 AAV2 바이러스 입자, 및 62.5 ng 내지 500 ng의 BSA가 SDS를 함유하는 12% 분리 젤상에서 분리되었으며 크립톤 단백질 색소로 염색되었다. 상이 그레이스케일로 전환되었다. 캡시드 유전자 단백질 VP1, VP2, VP3을 좌측에 표지한다. B: qPCR(벡터 게놈[vg/㎖]) 및 SDS-Page(캡시드 역가[캡시드/㎖])로부터의 역가를 나타내는 표.
도 12. A. GFP-특이적 항체로 염색된 래트 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 벡터가 화살표에 의해 나타낸 바와 같이 선조체내로 주입되었다. B. 흑질내로의 주입의 전형적인 예를 나타낸다.
도 13은 ttAAV2 및 wtAAV2를 사용한 눈의 GFP 형질도입을 나타낸다. A. ttAAV2(상부) 및 wtAAV2(하부) 벡터 투여 후 망막 횡단면을 나타낸다. B. A의 점선 상자의 확대를 나타낸다.
도 14는 신생아 벡터 주입 후 마우스 뇌의 형질도입을 나타낸다. i.v., 정맥내 벡터 투여; i.c., 두개내 주입; AAV-2, wtAAV2; AAV-TT, ttAAV2.
도 15는 AAV2 캡시드의 3차원을 나타낸다. 강조된 잔기들은 그들의 위치에 따른 색상에 의해 분류된, ttAAV2와 야생형 입자간의 아미노산 변화에 상응한다.
도 16은 AAV2 캡시드상의 3중 스파이크를 나타낸다. 강조된 잔기는 트루-타입과 야생형 입자들간의 아미노산 변화에 상응한다. 헤파린 결합 부위 잔기는 녹색으로 강조된다.
도 17은 AAV2 캡시드의 내부를 나타낸다. 밝은 청색으로 강조된 잔기는 상기 캡시드의 내부에 위치한 ttAAV2에서의 단일 아미노산 변화에 상응한다.
도 18은 AAV2 캡시드상의 3중 스파이크를 나타낸다. 베이지 색으로 강조된 잔기는, 공간적으로 가깝고 상기 AAV 캡시드상의 2개의 3중-근위 피크 사이의 홈에 위치한 트루-타입 벡터의 2개의 아미노산 변화에 상응한다.
도 19는 AAV2 캡시드상의 3중 스파이크를 나타낸다. 갈색으로 강조된 잔기는 3중-근위 피크 사이의 홈에 위치한 트루-타입 벡터의 단일 단리된 아미노산 변화(S593)에 상응한다.
도 20은 AAV2 캡시드상의 3중 스파이크를 나타낸다. 분홍색으로 강조된 4개의 아미노산은 수용체 결합에 관련되며 상기 3중 스파이크상에 가깝게 위치한다.
도 21은 AAV2로부터의 VP1 캡시드 단량체(밝은 청색)와 AAV1로부터의 VP1 단량체(오렌지색)간의 정렬을 3차원으로 나타낸다. 그림의 중간-좌측에 강조된 잔기는 AAV1 중의 G549(오렌지색 구) 및 AAV2 중의 E548(청록색 구)에 상응한다. 그림의 상부-우측에 강조된 잔기는 AAV1 중의 S589 및 T589(오렌지색 구) 및 AAV2 중의 R585 및 R588(청록색 구)에 상응한다.
도 22는 AAV2로부터의 VP1 캡시드 단량체(밝은 청색)와 AAV5로부터의 VP1 단량체(자색)간의 정렬을 3차원으로 나타낸다. 그림의 중간에 강조된 잔기는 AAV5 중의 G537(자색 구) 및 AAV2 중의 E548(청록색 구)에 상응한다. 그림의 상부-우측에 강조된 잔기는 AAV5 중의 S575 및 T578(자색 구) 및 AAV2 중의 R585 및 R588(청록색 구)에 상응한다.
도 23은 AAV2로부터의 VP1 캡시드 단량체(밝은 청색)와 AAV6으로부터의 VP1 단량체(황색)간의 정렬을 3차원으로 나타낸다. 그림의 하부에 강조된 잔기는 AAV6 중의 G549(오렌지색 구) 및 AAV2 중의 E548(청록색 구)에 상응한다. 그림의 상부-우측에 강조된 잔기는 AAV6 중의 S586 및 T589(오렌지색 구) 및 AAV2 중의 R585 및 R588(청록색 구)에 상응한다.
도 24는 AAV2로부터의 VP1 캡시드 단량체(밝은 청색)와 AAV8로부터의 VP1 단량체(분홍색)간의 정렬을 3차원으로 나타낸다. 그림의 상부-좌측에 강조된 잔기는 AAV8 중의 S315(적색 구) 및 AAV2 중의 N312(청록색 구)에 상응한다. 그림의 하부-우측에 강조된 잔기는 AAV8 중의 T591(적색 구) 및 AAV2 중의 R588(청록색 구)에 상응한다.
도 25는 AAV2로부터의 VP1 캡시드 단량체(밝은 청색)와 AAV9로부터의 VP1 단량체(녹색)간의 정렬을 3차원으로 나타낸다. 그림의 중간에 강조된 잔기는 AAV9 중의 G549(황색 구) 및 AAV2 중의 E548(청록색 구)에 상응한다. 그림의 하부-좌측에 강조된 잔기는 AAV9 중의 S586(황색 구) 및 AAV2 중의 R585(청록색 구)에 상응한다.
도 26은 래트 뇌에 선조체 주입 후 속방핵 중 rAAV2 TT 및 WT 발현의 분석을 나타낸다. A: 좌측에 주둥이부 및 우측에 꼬리부를 나타내는 래트 뇌 섹션의 전형적인 상. 선조체의 주입 부위를 가리키며, B 및 C에서 관찰된 시상하부 중의 돌출 영역을 나타낸다(속방핵, pf). B 및 C: rAAV2 WT(B) 또는 TT(C)의 선조체 주입 후 속방핵(pf)에서 검출된 GFP 발현의 고배율 상.
도 27은 신생아 마우스에서 rAAV2 TT 및 WT의 두개내 주입의 전체상을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 5x1010 vg의 rAAV2 TT(상부) 또는 rAAV2 WT(중간)가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다. 동시에 염색된, 신생아 마우스로부터의 주입되지 않은 뇌를 음성 대조용(NT, 형질도입되지 않은)으로서 나타낸다.
도 28은 rAAV2 TT 또는 WT의 두개내 주입 후 신생아 마우스 뇌 섹션의 고배율 사진을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션을 나타낸다. 5x1010 vg의 rAAV2 TT(좌측 패널) 또는 rAAV2 WT(우측 패널)가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다. S1BF: 배럴 필드 1차 체감각 피질.
도 29는 신생아 마우스에서 rAAV2 TT 및 WT의 전신 주입 후 뇌 형질도입의 전체상을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 2x1011 vg의 rAAV2 TT(상부) 또는 rAAV2 WT(하부)가 신생아 마우스의 경정맥에 주입되었다.
도 30은 rAAV2 TT 또는 WT의 전신 주입 후 신생아 마우스 뇌 섹션의 고배율 사진을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션을 나타낸다. 2x1011 vg의 rAAV2 TT(좌측 패널) 또는 rAAV2 WT(우측 패널)가 신생아 마우스의 경정맥에 주입되었다. S1BF: 배럴 필드 1차 체감각 피질.
도 31은 rAAV2 TT 또는 WT의 전신 주입 후 신생아 마우스 조직 섹션의 고배율 사진을 나타낸다. 2x1011 vg의 rAAV2 TT 또는 rAAV2 WT가 신생아 마우스의 경정맥에 주입되었다. 주입되지 않은 마우스 기관이 음성 대조용으로서 사용되었다.
도 32는 rAAV2 TT, WT 및 HBnull의 선조체 주입 후 성체 래트 뇌 섹션의 고배율 상을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 래트 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 3.5x109 vg의 rAAV2 WT(좌측), TT(우측) 또는 AAV2-HBnull(중간)이 성체 래트 뇌의 선조체에 주입되었고 대표적인 사진이 시상 또는 흑질(SN)에서 촬영되었다.
도 33은 신생아 마우스에서 다양한 TT 돌연변이체와 비교된 전체 AAV-TT의 두개내 주입의 전체상을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 5x1010 vg의 rAAV2 TT, TT-S312N, TT-S593A 또는 TT-D546G/G548E(TT-DG)가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다. 동시에 염색된, 신생아 마우스로부터의 주입되지 않은 뇌를 음성 대조용(NT)으로서 나타낸다.
도 34는 다양한 TT 돌연변이체 벡터의 두개내 주입 후 신생아 마우스 뇌 섹션의 고배율 사진을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션을 나타낸다. 5x1010 vg의 벡터가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다. TT-DG: TT-D546G/G548E.
도 35는 TT-S312N 돌연변이체 및 10개의 돌연변이를 함유하는 잠재적인 최종 TT 벡터와 비교된 전체 AAV-TT의 신생아 마우스 두개내 주입의 전체상을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션의 전형적인 예를 나타낸다. 5x1009 vg의 rAAV2 TT, TT-S312N, TT 또는 TT-S312N-D546G/G548E-S593A(TT-S312N-DG-S593A)가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다. 동시에 염색된, 신생아 마우스로부터의 주입되지 않은 뇌를 음성 대조용(NT)으로서 나타낸다.
도 36은 다양한 TT 돌연변이체 벡터의 두개내 주입 후 신생아 마우스 뇌 섹션의 고배율 사진을 나타낸다. GFP-특이적 항체로 염색된 신생아 뇌 섹션을 나타낸다. 5x1009 vg의 벡터가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었다.
도 37은 전체 AAV-TT, TT-S312N 돌연변이체 또는 TT-S312N-DG-S593A가 주입된 신생아 마우스 뇌 중의 GFP 단백질의 ELISA 정량분석을 나타낸다. 5x1009 vg의 벡터가 신생아 마우스 뇌의 측뇌실에 주입되었고 수확된 전체 뇌로부터 전체 단백질이 절제되었다. GFP-특이적 항체가 각각의 뇌 샘플에서 GFP 발현을 검출하는데 사용되었고 표준 GFP 단백질이 정량분석에 사용되었다. N = 5마리 동물/조건. 오차 막대는 평균±SEM을 나타낸다.
도 38은 AAV3B의 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 강조된 잔기는 상응하는 위치들에서 AAV-tt 중의 잔기들과 동일한 잔기들을 나타낸다. 312번 위치의 내부 세린 잔기에 밑줄을 그었다.
도 39는 AAV-LK03의 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 목록
서열번호 1은 야생형 아데노-관련 바이러스 2 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 1 참조).
서열번호 2는 트루-타입 아데노-관련 바이러스 2(ttAAV2) 캡시드 단백질의 아미노산 서열이다(도 2 참조).
서열번호 3은 야생형 아데노-관련 바이러스 1 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 3 참조).
서열번호 4는 야생형 아데노-관련 바이러스 5 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 4 참조).
서열번호 5는 야생형 아데노-관련 바이러스 6 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 5 참조).
서열번호 6은 야생형 아데노-관련 바이러스 8 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 6 참조).
서열번호 7은 야생형 아데노-관련 바이러스 9 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 7 참조).
서열번호 8은 야생형 아데노-관련 바이러스 10 유팬(Upenn) 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 8 참조).
서열번호 9는 야생형 아데노-관련 바이러스 10 재패니즈 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 9a 및 9b 참조).
서열번호 10은 도 9a 및 9b에 도시된 아데노-관련 바이러스에 대한 공통 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 야생형 아데노-관련 바이러스 3B 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 38 참조).
서열번호 12는 아데노-관련 바이러스 LK-03 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 서열이다(도 39 참조).
하나의 태양에서, 본 발명은 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다. 상기 rAAV 벡터는 전형적으로 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 상이한 변이형 캡시드 단백질을 포함한다. 상기 변이형 캡시드 단백질은 유리하게는 뇌 및/또는 눈에서 상기 벡터의 증대된 감염성을 부여하여, 상기 벡터를, 조직 내로의 유전자 요법에 의한 치료제의 전달에 특히 적합하게 한다.
재조합 AAV 벡터
본원은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 제공한다. "AAV"는 아데노-관련 바이러스에 대한 약어이며 상기 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 하위유형 및 천연 및 재조합 형태를 모두 포함한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-관련 바이러스를 지칭하며, 또한 재조합 AAV 벡터(또는 "rAAV 벡터")로도 지칭된다. 용어 "AAV"는 예를 들어 1형 AAV(AAV-1), 2형 AAV(AAV-2), 3형 AAV(AAV-3), 4형 AAV(AAV-4), 5형 AAV(AAV-5), 6형 AAV(AAV-6), 7형 AAV(AAV-7), 8형 AAV(AAV-8), 9형 AAV(AAV-9), 10형 AAV(AAV-10, AAVrh10 포함), 12형 AAV(AAV-12), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하며, "소 AAV"는 소 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하는 등이다.
AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐만 아니라 고유 말단 반복부(TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열들은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 서열들을 문헌에서 또는 공개 데이터베이스, 예를 들어 진뱅크(GenBank)에서 찾을 수 있다. 예를 들어 진뱅크 수납 번호 NC-002077(AAV-1), AF063497(AAV-1), NC-001401(AAV-2), AF043303(AAV-2), NC-001729(AAV-3), NC-001829(AAV-4), U89790(AAV-4), NC-006152(AAV-5), AF513851(AAV-7), AF513852(AAV-8), 및 NC-006261(AAV-8)을 참조하고; 이들의 개시내용은 본 발명에 참고로 인용된다. 또한 예를 들어 문헌[Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555]; 문헌[Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823]; 문헌[Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309]; 문헌[Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939]; 문헌[Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994]; 문헌[Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208]; 문헌[Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921]; 문헌[Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854]; 문헌[Moris et al. (2004) Virology 33:375-383]; 국제 특허 공보 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국특허 제 6,156,303 호를 참조하시오.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오타이드 서열(즉, AAV에 이종인 폴리뉴클레오타이드), 전형적으로 세포의 유전자 형질전환에 중요한 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 이종 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나, 및 때때로 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)이 인접해 있을 수 있다. rAAV 벡터란 용어는 rAAV 벡터 입자 및 rAAV 벡터 플라스미드를 모두 포함한다. rAAV 벡터는 단일 가닥(ssAAV)이거나 또는 자기-상보성(scAAV)일 수 있다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(전형적으로 전부 야생형 AAV의 캡시드 단백질에 의해) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 상기 입자가 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 포유동물 세포로 전달되는 트랜스유전자)를 포함하는 경우, 상기를 전형적으로는 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"라 칭한다. 따라서, rAAV 입자의 생성은, rAAV 벡터가 rAAV 입자내에 함유되기 때문에, 반드시 rAAV 벡터의 생성을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합"은 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 세포가 클로닝, 제한 또는 연결(ligation) 단계(예를 들어 상기 중에 포함된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 관련된), 및/또는 자연에서 발견되는 생성물과 다른 구조물을 생성시키는 다른 과정의 다양한 조합의 산물임을 의미한다. 재조합 바이러스 또는 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자이다. 상기 용어는 각각 원래의 폴리뉴클레오타이드 구조물의 복제물 및 원래의 바이러스 구조물의 자손을 포함한다.
변이형 AAV 캡시드 단백질
본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 변이형 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. "변이형"은 상기 AAV 캡시드 단백질이 동일한 혈청형의 상응하는 야생형 AAV 캡시드와 상이함을 의미한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, "상응하는"은 동일한 혈청형의 캡시드 단백질을 지칭하는바, 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 상응하는 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상응하는 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 등이다.
상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 예를 들어 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 야생형 캡시드 단백질에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 유지한다.
본 발명의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 상응하는 위치에, 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593. 이와 관련하여, "상응하는"은 AAV2 캡시드 단백질에서 상기 위치들 중 하나에 상응하는 임의의 AAV 캡시드 단백질 서열 중의(예를 들어 AAV2 단백질 서열 또는 비-AAV2 캡시드 단백질 서열 중의) 위치를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 또는 또 다른 AAV 캡시드 단백질 서열에서 하나 이상의 상응하는 위치에 존재한다.
일반적으로, AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질 VP1을 포함한다.
핵산 및 아미노산 서열 및 서열 동일성
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 포함하여, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오타이드 성분들에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 상기 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형을 상기 중합체의 조립 전 또는 후에 제공할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 폴리뉴클레오타이드란 용어는 이중- 또는 단일-가닥 분자를 호환적으로 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 발명에 개시된 본 발명의 임의의 실시태양은 이중-가닥 형태 및 상기 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예견된 2개의 상보성 단일-가닥 형태 각각을 모두 포함한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 본 발명에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 변형된; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합이 수행된 아미노산 중합체를 포함한다. 폴리펩타이드, 예를 들어 혈관형성 억제성 폴리펩타이드, 신경보호성 폴리펩타이드 등(유전자 산물을 포유동물 대상체로 전달함과 관련하여 논의될 때) 및 그의 조성물은 각각의 완전한 폴리펩타이드, 또는 상기 완전한 단백질의 목적하는 생화학적 기능을 유지하는 그의 임의의 단편 또는 유전 공학 유도체를 지칭한다. 유사하게, 혈관형성 억제성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 신경보호성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 유전자 산물을 포유동물 대상체로 전달하는데 사용하기 위한 다른 상기와 같은 핵산(수용 세포로 전달되는 "트랜스유전자"로서 지칭될 수도 있다)에 대한 언급은 상기 완전한 폴리펩타이드, 또는 목적하는 생화학적 기능을 갖는 임의의 단편 또는 유전 공학 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 또 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 일정한 퍼센트의 "서열 동일성"을 가지며, 이는 정렬시, 2개의 서열을 비교할 때 염기 또는 아미노산의 비율이 동일함을 의미한다. 서열 유사성은 다수의 상이한 방식들로 측정될 수 있다. 서열 동일성을 측정하기 위해서, 서열들을 인터넷에서 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 입수할 수 있는 BLAST를 포함한 방법 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정렬시킬 수 있다. 또 다른 정렬 연산은 FASTA로, 옥스포드 몰레큘러 그룹 인코포레이티드(Oxford Molecular Group, Inc.)의 전액 출자된 자회사인, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(Genetics Computing Group: GCG) 패키지에서 입수할 수 있다. 다른 정렬 기법들이 문헌[Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA]에 개시되어 있다. 특히 중요한 것은 서열 중 중단(gap)을 허용하는 정렬 프로그램들이다. 스미스-워터맨(Smith-Waterman)은 서열 정렬에 중단을 허용하는 연산의 한 유형이다. 문헌[Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)]을 참조하시오. 또한, 니들맨과 분취(Needleman and Wunsch) 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 서열을 정렬시킬 수 있다. 문헌[J. Mol. Biol. 48: 443- 453 (1970)]을 참조하시오.
중요한 것은 서열 동일성을 측정하기 위해 스미스와 워터맨의 국소 상동성 연산을 사용하는 BestFit 프로그램이다(문헌[Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)]). 상기 중단 발생 벌점은 일반적으로 1 내지 5, 대개는 2 내지 4일 것이며, 다수의 실시태양에서 3일 것이다. 상기 중단 확장 벌점은 일반적으로 약 0.01 내지 0.20의 범위일 것이며, 다수의 경우에 0.10일 것이다. 상기 프로그램은 비교를 위해 입력된 서열들에 의해 측정된 디폴트 매개변수를 갖는다. 바람직하게, 상기 서열 동일성을 상기 프로그램에 의해 측정된 디폴트 매개변수를 사용하여 측정한다. 상기 프로그램을 또한 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(GCG) 패키지로부터 입수할 수 있다.
또 다른 중요한 프로그램은 FastDB 연산이다. FastDB는 문헌[Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc.]에 개시되어 있다. 서열 동일성 퍼센트는 하기의 매개변수를 기본으로 FastDB에 의해 계산된다:
불합치 벌점: 1.00;
중단 벌점: 1.00;
중단 크기 벌점: 0.33; 및
연결 벌점: 30.0.
변이형 AAV2 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 AAV2 캡시드 단백질 서열 중에 하기의 위치 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593.
야생형 AAV2 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 1에 나타낸다(서열번호 1). 야생형 AAV2 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: NC-001401; 유니프롯(UniProt) P03135; NCBI 참고 서열: YP_680426.1; 진뱅크: AAC03780.1로부터 입수할 수 있다.
바람직하게 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 서열번호 1에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 서열번호 2의 서열, 또는 상기에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: I125, A151, S162, S205, S312, M457, A492, D499, Y533, D546, G548, S585, T588 및/또는 S593. 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, V151A, A162S, T205S, N312S, Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T 및/또는 A593S.
AAV2 캡시드 단백질에서 돌연변이들의 조합
상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 아미노산 치환들 중 임의의 조합을 포함할 수 있다. 따라서 특정한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 목록 중에서 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 단백질은 상기 개시된 14개 아미노산 치환을 모두 포함하고, 예를 들어 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 서열번호 2의 서열을 포함한다(즉, 본 발명에서 지칭되는 바와 같은 ttAAV2 또는 AAV2-TT).
추가의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 14개 돌연변이의 부분집합을 포함할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 개별적인 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기들(이들은 하기에 기능성 군으로 나눠진다)을 포함할 수 있다:
1) S585 및/또는 T588; 이들 잔기는 감소된 헤파린 결합 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸-풍부 뇌 조직 중 상기 바이러스의 증가된 확산과 관련될 수 있다;
2) S312; 상기 내부 세린 잔기는 캡시드-DNA 상호작용에 한 역할을 할 수 있다.
3) D546 및/또는 G548; 이들 잔기는 중화 항체와의 상호작용에 관련될 수 있으며 따라서 생체내 형질도입 특징에 기여할 수 있다;
4) S593; 상기 잔기는 3중-근위 스파이크 사이의 홈에 위치한다;
5) M457, A492, D499 및/또는 Y533; 이들 4개의 아미노산은 수용체 결합에 관련될 수 있으며 상기 3중 스파이크상에 가깝게 위치한다;
6) I125, A151, S162 및/또는 S205; 이들 잔기는 PLA2 활성 및/또는 유입 바이러스의 수송에 관련될 수 있다.
추가의 AAV 혈청형들(하기 참조) 중의 상응하는 위치들에 존재할 때 상기 잔기들에 상응하는 돌연변이를 포함하는 상응하는 하위-군이 또한 본 발명에서 고려됨을 알 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 수용체 결합과 관련될 수 있는 상기 언급된 위치들, 즉, 잔기 457, 492, 499 및 533에 4개 이상의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 잔기 M457, A492, D499 및 Y533을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 312번 위치에서 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 돌연변이되지 않고, 예를 들어 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 잔기 N312(야생형 AAV2 캡시드 단백질 중에 존재한다)를 포함한다. 따라서 일부 실시태양에서, 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 상기 언급된 특정한 돌연변이들 중 1 내지 13개를 포함할 수 있으나, 돌연변이 N312S는 포함할 수 없다.
다른 혈청형들로부터의 변이형 AAV 캡시드 단백질들
추가의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 또 다른 AAV 혈청형, 즉, AAV2 이외의 AAV 혈청형으로부터의 것이다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV3B, AAV-LK03, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 또는 AAV10(예를 들어 AAVrh10)캡시드 단백질로부터 유래될 수 있다.
이들 실시태양에서, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 AAV2에 대해 상술한 것들에 상응하는 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 즉, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 또 다른(즉, 비-AAV2) AAV 캡시드 단백질 서열 중에, AAV2 캡시드 단백질 서열 중 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593번 위치에 상응하는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
당해 분야의 숙련가들은 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교를 근거로, AAV2 캡시드 단백질 중 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593번 위치에 상응하는 또 다른 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 중의 위치들을 확인하는 방법을 알 것이다. 특히, 상기와 같은 위치들은 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 바와 같은 서열 정렬에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 하나의 상기와 같은 서열 정렬을 도 9a 및 9b에 제공한다.
이와 관련하여 특히 적합한 것은 또 다른 AAV 캡시드 단백질 서열 중, AAV2 캡시드 단백질 중 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593번 위치에 3차원 공간에서 상응하는 위치들이다. 단백질 구조의 3차원 모델링 및 정렬 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며 이를 사용하여 비-AAV2 캡시드 단백질 서열 중의 상기와 같은 상응하는 위치들을 확인할 수 있다. 또 다른 AAV 혈청형(예를 들어 AAV1, AAV5, AAV6, AAV8 및 AAV9)의 캡시드 단백질 서열과 AAV2 캡시드 단백질 서열과의 예시적인 3D 정렬을 도 21 내지 25에 나타내며 하기에서 논의한다. 숙련가는 추가의 혈청형들, 예를 들어 AAV2, AAV3, AAV7, AAV10 및 AAV12로부터의 캡시드 단백질과의 유사한 3D 정렬을 수행할 수 있으며, AAV2 중의 상기 정의된 위치들에 상응하는 상기와 같은 서열 중의 위치를 확인할 수 있다.
변이형 AAV1 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV1 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 상기 AAV1 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. AAV1 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 3에 나타낸다(서열번호 3). 야생형 AAV1 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: NC-002077로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 서열번호 3에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV1 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기들을 함유한다: S205(ttAAV2에서 S205에 맞게 정렬된다); G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다); S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다); 및 T589(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
변이형 AAV5 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV5 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 상기 AAV5 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 124, 150, 153, 195, 303, 444, 479, 486, 520, 533, 537, 575, 578 및/또는 583. AAV5 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV5 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 4에 나타낸다(서열번호 4). 야생형 AAV5 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: AF085716으로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 서열번호 4에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV5 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기들을 함유한다: G537(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다); S575(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다); S578(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V124I, K150A, K153S, A195S, R303S, T444M, S479A, V486D, T520Y, P533D, 및/또는 G583S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: G537E, S575R 및/또는 T578R. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
변이형 AAV6 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV6 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 상기 AAV6 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. AAV6 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV6 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 5에 나타낸다(서열번호 5). 야생형 AAV6 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: AF028704로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 서열번호 5에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV6 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기들을 함유한다: S205(ttAAV2에서 S205에 맞게 정렬된다); G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다); S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다); T589(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
변이형 AAV 8 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 상기 AAV8 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596. AAV8 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV8 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 6에 나타낸다(서열번호 6). 야생형 AAV8 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: NC_006261로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 서열번호 6에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV8 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기들을 함유한다: S315(ttAAV2에서 S312에 맞게 정렬된다); T591(ttAAV2에서 T588에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, K163S, A206S, T460M, T495A, N502D, F536Y, N549D, A551G, Q588S 및/또는 G596S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: S315N 및/또는 T591R. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 AAV8 캡시드 단백질 서열 중 315번 위치에 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 잔기 N315를 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S315N을 포함한다.
변이형 AAV 9 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 상기 AAV9 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 162, 205, 314, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594. AAV9 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV9 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 7에 나타낸다(서열번호 7). 야생형 AAV9 캡시드 단백질 서열을 또한 데이터베이스 수납 번호: AY530579로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 서열번호 7에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV9 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기들을 함유한다: S162(ttAAV2에서 S162에 맞게 정렬된다); S205(ttAAV2에서 S205에 맞게 정렬된다); G549(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다); S586(ttAAV2에서 S585에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: L125I, Q151A, N314S, Q458M, V493A, E500D, F534Y, G547D, A589T 및/또는 G594S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: S162A, S205T, G549E 및/또는 S586R. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
변이형 AAV10 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV10 캡시드 단백질을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "AAV10"은 AAVrh10을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV10(예를 들어 AAVrh10) 캡시드 단백질은 상기 AAV10 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치들 중 하나 이상에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596. AAV10 캡시드 단백질 VP1 중의 이들 위치는 AAV2에 관하여 상기에 개시된 것들에 상응한다.
야생형 AAV10 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 8에 나타낸다(서열번호 8). 바람직하게 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 서열번호 8에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 AAV10 캡시드 단백질 VP1은 이미 상기 개시된 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2) 중에 존재하나 야생형 AAV2(서열번호 1)에는 존재하지 않는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하기의 잔기를 함유한다: G551(ttAAV2에서 G548에 맞게 정렬된다). 따라서, 바람직한 실시태양에서, 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 야생형 AAV10 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, Q151A, K163S, A206S, N315S, T460M, L495A, N502D, F536Y, G549D, Q588S, A591T 및/또는 G596S. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 상기 변이형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 2, ttAAV2)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV10 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 증가된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 서열에 대해 다시 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이의 복귀에 상응하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 상기 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 하기의 치환을 포함할 수 있다: G551E. 전형적으로 상기와 같은 변이형 AAV10 캡시드 단백질은 상기 야생형 AAV2 캡시드 단백질(서열번호 1)과 하나 이상의 기능 성질을 공유할 수 있고, 예를 들어 야생형 AAV10 캡시드 단백질에 비해 망막 조직의 뉴런의 감소된 감염성 및/또는 형질도입을 부여할 수 있다.
변이형 AAV 3B 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV3B 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 312번 위치에서 야생형 AAV3B 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 잔기 N312를 포함할 수 있다. 따라서 하나의 실시태양에서 상기 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S312N을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 AAV2와 관련하여 상기에 개시된 것들에 상응하는 위치에 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다.
야생형 AAV3B 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 38에 나타낸다(서열번호 11). 야생형 AAV3B 캡시드 단백질 서열을 또한 NCBI 데이터베이스 수납 번호: AF028705로부터 입수할 수 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV3B 캡시드 단백질은 서열번호 11에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질을 포함한다. 본 실시태양에서, 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 312번 위치에서 서열번호 12에 정의된 바와 같은 AAV-LK03 캡시드 단백질 서열에 대해 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 잔기 N312를 포함할 수 있다. 따라서 하나의 실시태양에서 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 서열번호 12에 정의된 바와 같은 AAV-LK03 캡시드 단백질 서열에 대해 아미노산 치환 S312N을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 AAV2와 관련하여 상기에 개시된 것들에 상응하는 위치에 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다.
야생형 AAV-LK03 캡시드 단백질 VP1의 서열은 공지되어 있으며, 도 39a 및 39b에 나타낸다(서열번호 12). AAV-LK03 캡시드 단백질 서열은 또한 WO 2013/029030에 서열번호 31로서 개시되어 있다. 바람직하게 상기 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질은 서열번호 12에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
유전자 산물
하나의 실시태양에서, 상기 rAAV는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산을 추가로 포함한다. "유전자"는 전사 및 번역 후 특정한 단백질을 암호화할 수 있는 적어도 하나의 개방 판독 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. "유전자 산물"은 특정한 유전자의 발현으로부터 생성되는 분자이다. 유전자 산물은 예를 들어 폴리펩타이드, 앱타머, 간섭 RNA, mRNA 등을 포함한다.
"이종"은 비교 중인 존재의 나머지와 유전자형으로 다른 존재로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어 유전 공학 기법에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터에 도입된 폴리뉴클레오타이드가 이종 폴리뉴클레오타이드이다. 고유의 암호화 서열로부터 제거되고 자연에서 연결되지 않는 것으로 밝혀진 암호화 서열에 작동적으로 연결된 프로모터가 이종 프로모터이다. 따라서, 예를 들어 이종 유전자 산물을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 rAAV는 천연의 야생형 AAV에 통상적으로 포함되지 않는 핵산을 포함하는 rAAV이며, 암호화된 이종 유전자 산물은 천연의 야생형 AAV에 의해 통상적으로 암호화되지 않는 유전자 산물이다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 간섭 RNA이다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 앱타머이다. 일부 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 폴리펩타이드이다.
간섭 RNA
유전자 산물이 간섭 RNA(RNAi)인 경우, 적합한 RNAi는 세포에서 세포사멸 또는 혈관형성 인자의 수준을 감소시키는 RNAi를 포함한다. 예를 들어, RNAi는 세포에서 세포사멸을 유도하거나 촉진하는 유전자 산물의 수준을 감소시키는 shRNA 또는 siRNA일 수 있다. 유전자 산물이 세포사멸을 유도하거나 촉진하는 유전자를 본 발명에서 "전구-세포사멸 유전자"로서 지칭하며 상기 유전자의 산물(mRNA; 단백질)을 "전구-세포사멸 유전자 산물"로서 지칭한다. 전구-세포사멸 유전자 산물은 예를 들어 Bax, Bid, Bak, 및 Bad 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어 미국특허 제 7,846,730 호를 참조하시오.
간섭 RNA는 또한 혈관형성 생성물, 예를 들어 VEGF(예를 들어, Cand5; 미국특허 공보 제 2011/0143400 호; 미국특허 공보 제 2008/0188437 호; 및 문헌[Reich et al. (2003) Mol. Vis. 9:210]을 참조하시오), VEGFR1(예를 들어, Sirna-027; 예를 들어 문헌[Kaiser et al. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33]; 및 문헌[Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225]을 참조하시오), 또는 VEGFR2(문헌[Kou et al. (2005) Biochem. 44: 15064])에 대한 것일 수 있다. 또한 미국특허 제 6,649,596 호, 미국특허 제 6,399,586 호, 미국특허 제 5,661,135 호, 미국특허 제 5,639,872 호, 및 미국특허 제 5,639,736 호; 및 미국특허 제 7,947,659 호 및 미국특허 제 7,919,473 호를 참조하시오.
"작은 간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 관심 유전자("표적 유전자")에 대해 표적화된 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 2개 영역간의 상보성 짝짓기에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 상기 siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 상보성이라는 점에서 상기 유전자에 "표적화된다". 일부 실시태양에서, 상기 siRNA의 듀플렉스의 길이는 30 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 듀플렉스는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 듀플렉스의 길이는 19 내지 25 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 상기 siRNA의 RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 부분일 수 있다. 상기 듀플렉스 부분외에, 상기 헤어핀 구조는 상기 듀플렉스를 형성하는 2개 서열 사이에 위치한 고리 부분을 함유할 수 있다. 상기 고리는 길이가 다양할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 고리는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 뉴클레오타이드 길이이다. 상기 헤어핀 구조는 또한 3' 또는 5' 돌출 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 돌출은 3' 또는 5' 돌출 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드 길이이다.
"짧은 헤어핀 RNA" 또는 shRNA는 간섭 RNA, 예를 들어 siRNA를 발현하도록 만들어질 수 있는 폴리뉴클레오타이드 구조물이다.
앱타머
상기 유전자 산물이 앱타머인 경우, 예시적인 관심 앱타머는 혈관내피 성장 인자(VEGF)에 대한 앱타머를 포함한다. 예를 들어 문헌[Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5: 123]; 및 문헌[Lee et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 18902]을 참조하시오. 또한 사용하기에 적합한 것은 PDGF-특이적 앱타머, 예를 들어 E10030이며; 예를 들어 문헌[Ni and Hui (2009) Ophthalmologica 223:401]; 및 문헌[Akiyama et al. (2006) J. Cell Physiol. 207:407)]을 참조하시오.
폴리펩타이드
하나의 실시태양에서, 상기 유전자 산물은 치료학적 단백질이다. "치료학적" 펩타이드 또는 단백질은 세포 또는 대상체에서 단백질의 부재 또는 결함으로부터 생성되는 증상을 경감시키거나 감소시킬 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 한편으로, "치료학적" 펩타이드 또는 단백질은 대상체에게 달리 이점, 예를 들어 퇴행 방지 효과를 부여하는 것이다.
상기 유전자 산물이 폴리펩타이드인 경우, 상기 폴리펩타이드는 일반적으로 세포, 예를 들어 뉴런, 망막 또는 간 조직, 예를 들어 간세포, 뉴런, 신경교 세포, 막대 또는 원추 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 뮬러 세포, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드이다.
예시적인 폴리펩타이드는 신경보호성 폴리펩타이드(예를 들어 GDNF, CNTF, NT4, NGF 및 NTN); 혈관형성 억제성 폴리펩타이드(예를 들어 용해성 혈관내피 성장 인자(VEGF) 수용체; VEGF-결합 항체; VEGF-결합 항체 단편(예를 들어 단쇄 항-VEGF 항체); 엔도스타틴; 튬스타틴; 안지오스타틴; 용해성 Fit 폴리펩타이드(문헌[Lai et al.(2005) Mol. Ther. 12:659]); 용해성 Fit 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 융합 단백질(예를 들어 문헌[Pechan et al.(2009) Gene Ther. 16:10]을 참조하시오); 색소 상피-유래된 인자(PEDF); 용해성 Tie-2 수용체 등); 메탈로프로테이나제-3의 조직 억제제(TIMP-3); 광-반응성 옵신, 예를 들어 로돕신; 세포사멸 방지성 폴리펩타이드(예를 들어 Bcl-2, Bcl-X1) 등을 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는 비제한적으로 신경교 유래된 신경영양 인자(GDNF); 섬유아세포 성장 인자 2; 뉴투린(NTN); 모양체 신경영양 인자(CNTF); 신경 성장 인자(NGF); 뉴로트로핀-4(NT4); 뇌 유래된 신경영양 인자(BDNF); 상피 성장 인자; 로돕신; 세포사멸의 X-연결된 억제제; 및 음파 헤지호그를 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는 예를 들어 WO 2012/145601에 개시되어 있다.
간으로의 유전자 전달을 위한 예시적인 폴리펩타이드는 예를 들어 PBGD(포르포빌리노젠 데아미나제) IDUA(이듀로니다제) Fah(퓨마릴아세토아세테이트 하이드롤리아제) A1AT(알파(1)-안티트립신), 1A1(hUGT1A1)(유리딘 다이포스페이트 글루쿠로닐트랜스퍼라제), HCCS1(간세포 암종 억제제 1), CD(사이토신 데아미나제), SOCS3(사이토킨 신호전달의 억제제 3), TNF(종양 괴사 인자), 티미딘 키나제, IL-24(인터류킨-24), IL-12(인터류킨-12), 및 TRAIL(종양 괴사 인자-관련된 세포사멸-유도 리간드)를 포함한다.
조절 서열
일부 실시태양에서, 관심 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 구성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 다른 실시태양에서, 관심 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 유도 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 예에서, 관심 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 조직 특이성 또는 세포 유형 특이성 조절 요소에 작동적으로 연결된다.
예를 들어, 일부 예에서, 관심 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 간세포-특이적, 뉴런-특이적 또는 광수용체-특이적 조절 요소(예를 들어 광수용체-특이적 프로모터), 예를 들어 뉴런 또는 광수용체 세포에서 작동적으로 연결된 유전자의 선택적인 발현을 부여하는 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 적합한 광수용체-특이적 조절 요소는 예를 들어 로돕신 프로모터; 로돕신 키나제 프로모터(문헌[Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076]); 베타 포스포다이에스테라제 유전자 프로모터(문헌[Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9: 1015]); 망막색소변성증 유전자 프로모터(상기 문헌[Nicoud et al. (2007)]); 광수용체간 레티노이드-결합 단백질(IRBP) 유전자 인헨서(상기 문헌[Nicoud et al. (2007)]; IRBP 유전자 프로모터(문헌[Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225])를 포함한다. 적합한 뉴런-특이적 프로모터는 특히 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터(문헌[Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (19930]); 신경섬유 경쇄 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:561 1-5 (1991)]); 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)])를 포함한다. 적합한 간세포-특이적 프로모터는 알부민 프로모터(문헌[Heard et al., Mol Cell Biol 1987; 7: 2425]) 또는 알파 1-안티트립신 프로모터(문헌[Hafenrichter et al. Blood 1994; 84, 3394-404])를 포함한다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 기능적 조절, 예를 들어 상기 폴리뉴클레오타이드의 복제, 중복, 전사, 이어맞추기, 번역 또는 분해에 기여하는 분자의 상호작용에 관련된 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 조절은 상기 과정의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있으며 실제로 증대성이거나 억제성일 수 있다. 당해 분야에 공지된 조절 요소는 예를 들어 전사 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 인헨서를 포함한다. 프로모터는, 특정 조건하에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 대개는 상기 프로모터로부터 하류(3' 방향으로)에 위치한 암호화 영역의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 영역이다.
"작용적으로 연결된" 또는 "작동적으로 연결된"은 유전자 요소들의 병렬을 지칭하며, 여기에서 상기 요소들은 이들을 예상된 방식으로 작동하게 하는 관계로 놓인다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 암호화 서열의 전사의 개시를 돕는 경우 상기 암호화 영역에 작동적으로 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 상기 프로모터와 암호화 영역 사이에는 중재 잔기가 존재할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "프로모터" 또는 "프로모터들"이란 용어는 재조합 생성물을 암호화하는 DNA 서열에 인접하여 위치하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 바람직하게는 인접한 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 프로모터는 전형적으로, 프로모터가 존재하지 않는 경우 발현된 재조합 생성물의 양에 비해 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 증가시킨다. 하나의 유기체로부터의 프로모터를 사용하여 또 다른 유기체로부터 기원하는 DNA 서열로부터의 재조합 생성물 발현을 증대시킬 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터를 척추동물에서 해파리 GFP의 발현에 사용할 수 있다. 또한, 하나의 프로모터 요소는 나란히 부착된 다수의 DNA 서열들에 대해 발현되는 재조합 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 프로모터 요소는 하나 이상의 재조합 생성물의 발현을 증대시킬 수 있다. 다수의 프로모터 요소들이 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 주지되어 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "인헨서" 또는 "인헨서들"이란 용어는 재조합 생성물을 암호화하는 DNA 서열에 인접하여 위치한 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 인헨서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하거나 또는 암호화 DNA 서열(예를 들어 재조합 생성물 또는 생성물들로 전사되거나 번역된 DNA 서열)의 하류 또는 상기 서열의 내부에 위치할 수 있다. 따라서, 인헨서 요소는 재조합 생성물을 암호화하는 DNA 서열의 100 염기쌍, 200 염기쌍, 또는 300 이상 염기쌍의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인헨서 요소는 프로모터 요소에 의해 제공된 증가된 발현 이상으로 DNA 서열로부터 발현된 재조합 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 다수의 인헨서 요소들이 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 쉽게 입수될 수 있다.
약학 조성물
본원은 a) 상술한 바와 같은 rAAV 벡터; 및 b) 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 완충제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 완충제는 인간에 사용하기에 적합하다.
상기와 같은 부형제, 담체, 희석제 및 완충제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 작용제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 비제한적으로 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 염은 상기 염 중에, 예를 들어 무기산염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 포함할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 상기와 같은 비히클 중에 존재할 수도 있다. 광범위하게 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제들이 당해 분야에 공지되어 있으며 이를 본 발명에서 상세히 논의할 필요는 없다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 다양한 간행물들, 예를 들어 문헌[A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins]; 문헌[Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7(th) ed., Lippincott, Williams, & Wilkins]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3 rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]에 상세히 개시되었다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 다른 약제, 약학적 작용제, 담체, 보조제, 희석제 등 중에 상술한 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 주입의 경우, 상기 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법들의 경우, 상기 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 멸균, 발열원-제거 수 또는 멸균 발열원-제거 포스페이트-완충 염수 용액일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 상기 담체는 호흡가능할 것이며, 바람직하게는 고체 또는 액체 미립자 형태일 것이다. 주입 매질로서, 주입 용액에 통상적인 첨가제, 예를 들어 안정화제, 염 또는 염수, 및/또는 완충제를 함유하는 물을 사용하는 것이 바람직하다.
"약학적으로 허용 가능한"은 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질을 의미하고, 예를 들어 상기 물질을 어떠한 바람직하지 못한 생물학적 효과도 일으키지 않으면서 대상체에게 투여할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 약학 조성물을 예를 들어 생체외에서 세포의 형질감염에 또는 바이러스 입자 또는 세포의 대상체에의 직접 투여에 사용할 수 있다.
유전자 산물의 조직 또는 세포(예를 들어 간 , 뉴런 또는 망막 조직 또는 세포)에의 전달 방법 및 치료 방법
본 발명의 방법은 이종 핵산 서열을 숙주 조직 또는 세포(분열 및 비-분열 세포 모두 포함)로 전달하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명의 벡터 및 다른 시약, 방법 및 약학 제형은 치료 방법으로서 또는 달리, 단백질 또는 펩타이드가 필요한 대상체에게 상기 단백질 또는 펩타이드를 투여하는 방법에 또한 유용하다. 따라서 이러한 방식으로, 상기 단백질 또는 펩타이드를 상기 대상체의 생체내에서 생성시킬 수도 있다. 상기 대상체는 상기 단백질 또는 펩타이드의 결핍을 갖거나 또는 상기 대상체에서의 상기 단백질 또는 펩타이드의 생성이 치료 방법으로서 또는 달리, 및 하기에 추가로 설명하는 바와 같이 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문에, 상기 단백질 또는 펩타이드가 필요할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하는" 등의 용어는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득함을 지칭한다. 상기 효과는 질병 또는 그의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방함에 의해 예방학적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 상기 질병의 원인인 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유에 의해 치료학적일 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질병의 임의의 치료를 포함하며, (a) 상기 질병의 소인이 있을 수 있거나 또는 상기 질병에 걸릴 위험이 있지만 아직 상기 질병이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 상기 질병이 발생하는 것을 예방하고; (b) 상기 질병을 억제하고, 즉 상기 질병의 발병을 정지시키고; (c) 상기 질병을 경감시킴, 즉 상기 질병의 역행을 일으킴을 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 임의의 기관, 조직 또는 세포에서의 유전자 발현과 관련된 임의의 질환, 특히 예를 들어 간, 뇌 또는 눈과 관련된 질환과 관련된 증상들을 치료하거나 개선시키기 위해 생물학적 효과를 갖는 임의의 외래 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질병 상태는 비제한적으로 리소솜 저장 질병, 급성 간헐성 포르피린증, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 알파(1)-안티트립신 결핍, 급성 간부전, 폼페병, 타이로신혈증, 크리글러-나자르 증후군, 간염, 경변증, 간세포 암종, AIDS, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 및 다른 신경학적 질환, 암(예를 들어 뇌암), 망막 퇴행성 질병 및 눈의 다른 질병을 포함한다.
유전자 전달은 질병 상태에 대한 이해 및 치료법의 제공에 상당한 잠재적인 용도를 갖는다. 결함 유전자가 공지되어 있고 클로닝된 다수의 유전병들이 존재한다. 일부의 경우에, 이들 클로닝된 유전자의 기능이 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 질병 상태는 2가지 부류, 즉 효소들이 대개 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 결핍 상태, 및 우성 방식으로 유전되는, 적어도 때때로 조절 또는 구조 단백질을 수반하는 불균형 상태로 나뉜다. 결핍 상태 질병의 경우, 유전자 전달은 정상 유전자를 대체 요법을 위해 병든 조직으로 가져갈 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 사용하여 상기 질병에 대한 동물 모델을 생성시키는데 사용될 수 있었다. 불균형 질병 상태의 경우, 유전자 전달은 모델 시스템에서 질병 상태를 생성시키는데 사용될 수 있었으며, 이어서 상기 시스템을 상기 질병 상태를 없애려는 노력으로 사용할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은 유전병의 치료를 허용한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 질병 상태를, 상기 질병을 유발하거나 상기 질병을 더 심하게 하는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 완전히 개선시킴으로써 치료한다. 돌연변이를 유발하거나 결함을 교정하기 위한 핵산 서열의 부위-특이적 통합의 용도가 또한 가능하다.
하나의 태양에서, 본 발명은 대상체에서 조직 또는 세포(예를 들어 간, 뉴런 또는 망막 조직 또는 세포)로 유전자 산물을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 상술한 바와 같은 rAAV 벡터를 투여함을 포함한다. 상기 유전자 산물은 예를 들어 상술한 바와 같은 폴리펩타이드 또는 간섭 RNA(예를 들어 shRNA, siRNA 등), 또는 앱타머일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어 혈액세포, 줄기세포, 골수(예를 들어 조혈) 세포, 간세포, 암세포, 맥관세포, 췌장세포, 신경세포, 신경교 세포, 눈 또는 망막 세포, 상피 또는 내피세포, 수지상 세포, 섬유아세포, 폐세포, 근육세포, 심장세포, 장세포 또는 신장세포일 수 있다. 유사하게 상기 조직은 예를 들어 혈액, 골수, 근육 조직(예를 들어 골격근, 심장근, 또는 맥관 평활근을 포함한 평활근), 중추 또는 말초 신경계 조직(예를 들어 뇌, 뉴런 조직 또는 망막 조직), 췌장 조직, 간 조직, 신장 조직, 폐 조직, 장 조직 또는 심장 조직 중에서 선택될 수 있다.
유전자 산물을 망막 세포로 전달하는 것을 망막 질병의 치료를 위해 제공할 수 있다. 상기 망막 세포는 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮬러세포, 양극 세포, 무축삭세포, 수평세포 또는 망막 색소 상피세포일 수 있다. 일부의 경우에, 상기 망막 세포는 광수용체 세포, 예를 들어 막대 또는 원추 세포이다. 유사하게, 유전자 산물을 뉴런 조직 또는 세포로 전달하는 것을 신경학적 질환의 치료를 위해 제공할 수 있다. 상기 유전자 산물을 뉴런 조직, 예를 들어 뉴런 또는 신경교 세포(예를 들어 성상세포, 희돌기교세포 등) 중에 존재하는 다양한 세포 유형들로 전달할 수 있다. 유전자 산물을 간으로 전달하는 것을 간 질환의 치료를 위해 제공할 수 있다. 상기 유전자 산물을 예를 들어 간세포로 전달할 수 있다.
본원은 질병(예를 들어 간, 신경학적 또는 눈 질병)의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 개인에게 유효량의 상술한 바와 같은 rAAV 벡터를 투여함을 포함한다. 대상 rAAV 벡터를 두개내 주입, 뇌내 주입, 안내 주입을 통해, 유리체내 주입, 망막 주입, 망막하 주입, 정맥내 주입에 의해서, 또는 임의의 다른 편리한 투여 방식 또는 경로에 의해 투여할 수 있다.
추가의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 점막통과, 국소, 경피, 흡입, 비경구(예를 들어 정맥내, 피하, 피내, 근육내, 및 관절내) 투여 등뿐만 아니라 직접적인 조직 또는 기관 주입, 한편으로, 척추강내, 직접적인 근육내, 심실내, 정맥내, 복강내, 비내 또는 안내 주입을 포함한다. 주입가능 물질을 통상적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액, 주입 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서 제조할 수 있다. 한편으로, 상기 바이러스를 전신 방식보다는 국소적으로, 예를 들어 데포 또는 서방성 형태로 투여할 수 있다.
재조합 바이러스 벡터를 바람직하게는 상기 대상체에게, 상기 대상체의 세포(예를 들어 간, 뉴런 또는 망막 세포) 중의 이종 핵산 서열의 감염(또는 형질도입) 및 발현을 생성시키기에 충분한 양으로 투여한다. 바람직하게, 상기 표적 세포는 간세포, 신경세포(중추 및 말초 신경계의 세포, 특히 뇌세포 포함) 또는 망막세포이다. 일부의 경우에, 상기 망막세포는 광수용체 세포(예를 들어 막대 및/또는 원추)이다. 다른 경우에, 상기 망막 세포는 RGC 세포이다. 다른 경우에, 상기 망막 세포는 RPE 세포이다. 다른 경우에, 망막 세포는 무축삭 세포, 양극세포 및 수평세포를 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 벡터를 치료 유효량으로 투여한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "치료 유효량"은 질병 상태와 관련된 증상들 중 적어도 하나를 경감(예를 들어 완화, 감소, 축소)시키기에 충분한 양이다. 달리 서술하자면, "치료 유효량"은 대상체의 상태에서 약간의 개선을 제공하기에 충분한 양이다. "치료 유효량"은 실험 및/또는 임상 시험을 통해 측정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 있을 것이다. 예를 들어, 생체내 주입의 경우, 치료 유효 용량은 약 106 내지 약 1015 rAAV 비리온, 예를 들어 약 108 내지 1012 rAAV 비리온의 정도일 것이다. 시험관내 형질도입의 경우, 세포로 전달되는 rAAV 비리온의 유효량은 약 108 내지 약 1013 rAAV 비리온의 정도일 것이다. 다른 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립시키는 통상적인 시험을 통해 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 쉽게 확립될 수 있다.
일부 실시태양에서, 1회 초과의 투여(예를 들어 2, 3, 4, 또는 그 이상의 투여)를 사용하여 다양한 간격의 기간에 걸쳐, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 성취할 수 있다.
치료될 수 있는 신경학적 질병은 정신병을 포함하여 뇌 또는 CNS와 관련된 임의의 질병을 포함한다. 뇌질병은 2개의 일반적인 범주내에 있다: (a) 병리학적 과정, 예를 들어 감염, 외상 및 신생물; 및 (b) 마이엘린의 질병 및 뉴런의 퇴화를 포함한 신경계 특유의 질병. 어느 범주로부터의 질병도 치료될 수 있다. 예를 들어, 상기 신경학적 질병은 신경퇴행성 질병, 예를 들어 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 척수성 근위축 및 소뇌 퇴화; 정신분열증; 간질; 허혈-관련된 질병 및 뇌졸중; 탈수초성 질병, 예를 들어 다발성 경화증, 정맥주변 뇌염, 백질이영양증, 예를 들어 아릴설파타제 A의 결핍으로 인한 이염성 백질이영양증, 갈락토세레브로사이드 베타-갈락토시다제의 결핍으로 인한 크라베병, 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증; 바이러스감염 후 질병, 예를 들어 진행성 다병소성 백질뇌증, 급성 산재성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈성 뇌백질염; 미토콘드리아 뇌척수증; 신경학적 암, 예를 들어 원발성 뇌종양, 예를 들어 신경교종, 뇌수막종, 신경초종, 뇌하수체 선종, 수모세포종, 두개인두종, 혈관종, 유피낭종, 육종 및 다른 종양원으로부터의 두개내 전이; 신경학적 감염 또는 신경학적 염증 상태 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 눈 질병은 비제한적으로 급성 황반 시신경망막병증; 베체트병; 맥락막 혈관신생; 당뇨병 포도막염; 히스토플라스마증; 황반 변성, 예를 들어 급성 황반 변성, 비-삼출성 나이 관련 황반 변성 및 삼출성 나이 관련 황반 변성; 부종, 예를 들어 황반 부종, 낭포 황반 부종 및 당뇨성 황반 부종; 다병소성 맥락막염; 후방 눈 부위 또는 위치에 영향을 미치는 녹내장; 눈 종양; 망막 질환, 예를 들어 망막 중심정맥 폐쇄, 당뇨성 망막병증(증식성 당뇨성 망막병증 포함), 증식성 유리체망막병증(PVR), 망막 동맥 폐쇄 질병, 망막 탈착, 포도막 망막 질병; 교감성 안염; 보그트 고야나기-하라다(VKH) 증후군; 포도막 확산; 눈 레이저 치료에 의해 유발되거나 영향을 받은 후방 눈 상태; 광역동 요법에 의해 유발되거나 영향을 받은 후방 눈 상태; 광응고, 방사선 망막병증; 망막전막 질환; 망막 분지정맥 폐쇄; 전방 허혈성 시신경병증; 비-망막병증 당뇨성 망막 기능장애; 망막분리; 망막색소변성증; 녹내장; 어셔 증후군, 원추-막대 이영양증; 스타르가르트병(노란점 안저); 유전성 황반 변성; 맥락망막 변성; 레베르 선천성 흑암시; 선천성 비진행성 야맹증; 맥락막 결손; 바데트-비들 증후군; 황반 모세혈관확장증; 레베르 유전성 시신경병증; 미숙아 망막병증; 및 색맹, 적색맹, 녹색맹 및 청색맹을 포함한 색각 질환을 포함한다.
치료될 수 있는 간 질병은 예를 들어 리소솜 저장 질병, 예를 들어 급성 간헐성 포르피린증, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 윌슨병, 점액다당류증(예를 들어 I형 MPS 또는 VI형 MPS), 슬라이 증후군, 폼페병, 타이로신혈증, 알파(1)-안티트립신 결핍, 크리글러-나자르 증후군; A, B 또는 C형 간염; 간경변증; 간암, 예를 들어 간세포 암종; 또는 급성 간부전을 포함한다.
본 발명은 수의학 및 의학 용도 모두에 사용된다. 적합한 대상체는 조류 및 포유동물 모두를 포함하며, 포유동물이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "조류"란 용어는 비제한적으로 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩을 포함한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "포유동물"이란 용어는 비제한적으로 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼 등을 포함한다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다.
조직(예를 들어 간 , 뉴런 또는 망막 조직)의 형질도입
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 예를 들어 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 상응하는 AAV 벡터(동일한 혈청형으로부터)에 비해, 조직(예를 들어 간, 뉴런 및/또는 망막 조직)의 증가된 형질도입을 나타낸다. 예를 들어 상기 rAAV 벡터는 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 감염성에 비해, 적어도 10%, 50%, 100%, 500% 또는 1000% 증가된 감염성을 나타낼 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 rAAV 벡터는 조직(예를 들어 간, 뉴런 또는 망막 조직)을 선택적으로 또는 특이적으로 감염시킬 수 있고, 예를 들어 다른 세포 유형에 비해 간, 뉴런 또는 망막 세포의 증가된 형질도입을 나타낸다. 예를 들어, 상기 rAAV 벡터는 또 다른 세포 유형(예를 들어 비-간, 비-뉴런 및/또는 비-망막 세포)에 비해, 특정한 세포 유형(예를 들어 간, 뉴런 또는 망막 세포)의 적어도 10%, 50%, 100%, 500% 또는 1000% 증가된 감염성을 나타낼 수 있다. 예를 들어 상기 rAAV 벡터는 상기 간, 뇌 및/또는 눈 밖의 세포에 비해 간세포, 뉴런 및/또는 광수용체 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있다.
상기 재조합 AAV 벡터가 신경 또는 망막 조직의 증가된 형질도입을 나타내는 경우, 예를 들어 상기 벡터가 신경학적 또는 눈 질환의 치료에 사용되는 경우, 상기 벡터는 바람직하게는 변이형 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다.
상기 재조합 AAV 벡터가 간 조직의 증가된 형질도입을 나타내는 경우, 예를 들어 상기 벡터가 간 질환의 치료에 사용되는 경우, 상기 벡터는 바람직하게는 변이형 AAV3B, AAV-LK03 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다.
핵산 및 숙주 세포
본원은 상술한 바와 같은 변이형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기 단리된 핵산은 AAV 벡터, 예를 들어 재조합 AAV 벡터 중에 포함될 수 있다.
상기와 같은 AAV 캡시드 단백질-암호화 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 사용하여 재조합 AAV 비리온(즉, 재조합 AAV 벡터 입자)을 생성시킬 수 있다. 따라서, 본원은, 적합한 세포내로 도입될 때 재조합 AAV 비리온의 생성을 제공할 수 있는 재조합 AAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 대상 핵산을 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 단리된(유전자 변형된) 숙주 세포를 추가로 제공한다. 대상 숙주 세포는 단리된 세포, 예를 들어 시험관내 배양 중의 세포일 수 있다. 대상 숙주 세포는 하기에 개시되는 바와 같이, 대상 rAAV 비리온의 생성에 유용하다. 대상 숙주 세포를 대상 rAAV 비리온의 생성에 사용하는 경우, 상기 세포를 "패키징 세포"라 칭한다. 일부 실시태양에서, 대상 숙주 세포는 대상 핵산에 의해 안정하게 유전자 변형된다. 다른 실시태양에서, 대상 숙주 세포는 대상 핵산에 의해 일시적으로 유전자 변형된다.
대상 핵산을 확립된 기법, 예를 들어 비제한적으로 전기영동, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜-매개된 형질감염 등을 사용하여 숙주 세포에 안정하게 또는 일시적으로 도입시킨다. 안정한 형질전환을 위해서, 대상 핵산은 일반적으로 선택성 마커, 예를 들어 다수의 주지된 선택성 마커, 예를 들어 네오마이신 내성 등 중 어느 하나를 추가로 포함할 것이다.
대상 숙주 세포는 대상 핵산을 다양한 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 쥐 세포 및 영장류 세포(예를 들어 인간 세포) 중 어느 하나에 도입시킴으로써 생성된다. 적합한 포유동물 세포는 비제한적으로 1차 세포 및 세포주를 포함하며, 이때 적합한 세포주는 비제한적으로 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, Vero 세포, 3T3 마우스 섬유아세포, C3H10T1/2 섬유아세포, CHO 세포 등을 포함한다. 적합한 숙주 세포의 비-제한적인 예는 예를 들어 HeLa 세포(예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC 번호 CCL10), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RATI 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함한다. 대상 숙주 세포를 또한 바큘로바이러스를 사용하여 제조하여 곤충 세포, 예를 들어 Sf9 세포(AAV를 생산한다)를 감염시킬 수 있다(예를 들어, 미국특허 제 7,271,002 호; 미국특허 출원 제 12/297,958 호를 참조하시오).
일부 실시태양에서, 유전자 변형된 대상 숙주 세포는 상술한 바와 같은 변이형 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 외에, 하나 이상의 AAV rep 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시태양에서, 대상 숙주 세포는 rAAV 벡터를 추가로 포함한다. rAAV 비리온을 대상 숙주 세포를 사용하여 생성시킬 수 있다. rAAV 비리온의 생성 방법은 예를 들어 미국특허 공보 제 2005/0053922 호 및 미국특허 공보 제 2009/0202490 호에 개시되어 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "패키징"은 AAV 입자의 조립 및 캡시드화를 생성시키는 일련의 세포내 사건들을 지칭한다. AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노-관련 바이러스의 복제 및 캡시드화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap를 본 발명에서 AAV "패키징 유전자"라 칭한다. 조립체 관련 단백질(AAP)은 상기 cap 유전자내 개방 판독 프레임의 생성물이며 패키징에 또한 필요할 수도 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(예를 들어 야생형 AAV)가 복제되게 하고 포유동물에 의해 패키징되게 하는 바이러스를 지칭한다. AAV에 대한 다양한 상기와 같은 헬퍼 바이러스들, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어 우두가 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 아데노바이러스는 다수의 상이한 하위군을 포함하지만, 하위군 C의 5형 아데노바이러스가 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 다수의 아데노바이러스가 공지되어 있으며 ATCC와 같은 기탁 기관으로부터 입수할 수 있다. 상기 헤르페스과의 바이러스로는 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)뿐만 아니라 거대세포바이러스(CMV) 및 가성광견병바이러스(PRV)가 있으며; 이들을 또한 ATCC와 같은 기탁 기관으로부터 입수할 수 있다.
"헬퍼 바이러스 기능(들)"은 AAV 복제 및 패키징(본 발명에 개시된 복제 및 패키징에 대한 다른 요건과 함께)을 허용하는 헬퍼 바이러스 게놈에서 암호화된 기능(들)을 지칭한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, "헬퍼 바이러스 기능"은 다수의 방식들로, 예를 들어 생산자 세포에게 트랜스로 헬퍼 바이러스를 제공하거나 또는 예를 들어 필수 기능(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공함으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 다른 발현 벡터를 rAAV 벡터와 함께 생산자 세포에 형질감염시킨다.
"감염성" 바이러스 또는 바이러스 입자는, 유능하게 조립된 바이러스 캡시드를 포함하고 상기 바이러스 종이 주성인 세포내로 폴리뉴클레오타이드 성분을 전달할 수 있는 것이다. 상기 용어는 상기 바이러스의 임의의 복제 능력을 반드시 의미하는 것은 아니다. 감염성 바이러스 입자를 카운트하기 위한 분석은 본 명세의 다른 어딘가 및 당해 분야에 개시되어 있다. 바이러스 감염성을 전체 바이러스 입자에 대한 감염성 바이러스 입자의 비로서 나타낼 수 있다. 감염성 바이러스 입자 대 전체 바이러스 입자의 비를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337](TCID50 감염 역가 분석을 개시한다) 및 문헌[Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973]을 참조하시오.
"복제-가능" 바이러스(예를 들어 복제-가능 AAV)는, 감염성이고 감염된 세포에서(즉, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재하에서) 또한 복제될 수 있는 표현형상 야생형 바이러스를 지칭한다. AAV의 경우에, 복제 능력은 일반적으로 기능성 AAV 패키징 유전자의 존재를 요한다. 일반적으로, 본 발명에 개시된 바와 같은 rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 패키징 유전자의 결여로 인해 포유동물 세포(특히 인간 세포)에서 복제-불능이다. 전형적으로, 상기와 같은 rAAV 벡터는 복제 가능 AAV가 AAV 패키징 유전자와 유입 rAAV 벡터간의 재조합에 의해 생성될 가능성을 최소화하기 위해서 임의의 AAV 패키징 유전자 서열이 없다. 다수의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 rAAV 벡터 제제는, 있다면 소수의 복제 가능 AAV(rcAAV, 또한 RCA라고도 칭함)(예를 들어 약 1 rcAAV/102 rAAV 입자 미만, 약 1 rcAAV/104 rAAV 입자 미만, 약 1 rcAAV/108 rAAV 입자 미만, 약 1 rcAAV/1012 rAAV 입자 미만, 또는 rcAAV가 없음)를 함유하는 것들이다.
"단리된" 핵산, 벡터, 바이러스, 비리온, 숙주 세포 또는 다른 물질은, 상기 물질 또는 유사한 물질이 자연적으로 존재하거나 또는 초기에 제조된 경우 또한 존재할 수 있는 다른 성분들 중 적어도 일부가 없는 물질의 제제를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 단리된 물질은 상기 물질을 원천 혼합물로부터 농축시키는 정제 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 농축은 절대 기준으로, 예를 들어 용액의 부피당 중량으로 측정되거나, 상기 원천 혼합물 중에 존재하는 제2의, 잠재적으로 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본원의 실시태양의 증가하는 농축물은 점점 더 많이 단리된다. 단리된 핵산, 벡터, 바이러스, 숙주 세포 또는 다른 물질은 일부 실시태양에서, 예를 들어 약 80% 내지 약 90% 순수하게, 적어도 약 90% 순수하게, 적어도 약 95% 순수하게, 적어도 약 98% 순수하게, 또는 적어도 약 99% 순수하게, 또는 더 이상 순수하게 정제된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 명시된 바와 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질을 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 이제 개시한다. 본 발명에서 언급된 모든 간행물들은 상기 방법 및/또는 물질을 상기 간행물들이 인용되는 것과 관련하여 개시하고 기술하기 위해 본 발명에 참고로 인용된다.
명확성을 위해, 별도의 실시태양들과 관련하여 개시되는 본 발명의 몇몇 특징들을 또한 단일 실시태양으로 함께 제공할 수도 있음을 알 것이다. 환언하면, 간략성을 위해, 단일 실시태양과 관련하여 개시되는 본 발명의 다양한 특징들을 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공할 수도 있다. 본 발명에 속하는 실시태양들의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 마치 모든 조합이 개별적이고 명백히 개시되는 바와 같이 본 발명에 개시된다. 또한, 상기 다양한 실시태양 및 그의 요소들의 모든 하위-조합들이 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 마치 모든 조합이 개별적이고 명백히 개시되는 바와 같이 본 발명에 개시된다.
하기의 실시예는 본 발명의 몇몇 실시태양들을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서, 발명자들은 ttAAV2(트루-타입에서와 같이)로 표시되는 신규의 AAV2 벡터를 설계하고 구축하였다. 또한, 상기 신규의 벡터를 ttAAV2가 조직 배양 적응(야생형) AAV2에 비해 상이하게 작용하는지를 평가하기 위해서 다수의 동물 모델(래트, 마우스 및 신생아 마우스)에서 시험하였다. 발명자들은 ttAAV2가 AAV2에 비해 유전자 전달에 유리하며 이종 서열을 갖는 뇌 또는 눈 조직의 생체내 형질도입에 특히 유용함을 입증하였다.
방법
1. 클로닝:
wtAAV2의 캡시드 유전자를 본 발명의 생산자 플라스미드 pDG(도 10)로부터 취하였다. 상기 플라스미드는 wtAAV2 rep 및 cap 유전자를 함유한다. 상기 캡시드 유전자의 하위단편들(각각 pDG 뉴클레오타이드 A:3257-3759, B:4025-4555, C:4797-5287 및 D:5149-5425)을 후속의 돌연변이유발을 위해 pBS내로 서브클로닝하였다. 4개의 돌연변이를 부위-지향된 돌연변이유발을 통해 단편 A내로 도입시켜 아미노산(AA) 변화 V125I, V151A, A162S 및 T205S를 암호화하는 구조물을 생성시켰다. 단편 B를 단일 AA 변화, N312S를 암호화하도록 돌연변이시켰다. 단편 C를 AA 교환 Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T, 및 A593S를 암호화하도록 돌연변이시켰다. 성공적인 돌연변이유발의 확인시 단편 A 내지 C를 pDG내로 재-클로닝시켜 생산자 플라스미드(pDG-ttAAV2)를 생성시켰으며, 이는 ttAAV2 캡시드에 의해 캡시드화되는 재조합 바이러스의 생산을 지지할 것이다.
2. ttAAV-2 GFP 바이러스 벡터 생산 정제 및 적정.
벡터 생산을 pDG(Ad 헬퍼 기능뿐만 아니라 AAV rep 및 cap 유전자를 모두 제공한다)에 의한 rAAV 플라스미드의 동시-형질감염을 사용하는 표준 프로토콜에 따라 확립시켰다. 다양한 rAAV 플라스미드를 사용하여 재조합 플라스미드들을 생성시켰다.
pTR-UF11(CAG-GFP)을 rAAV 플라스미드로서 사용하였다. 세포 공장(CF10)당 8x108 293 세포를 시딩하였다. 14 내지 18시간 후에, 상기 세포를 CaPO4 공-침전 방법을 사용하여 pDG 또는 pDG-rrAAV2 및 prAAV(예를 들어 pTR-UF11)로 형질감염시켰다. 72시간 후에 상기 세포를 수확하고 용해 완충제(20 mM 트리스-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 0.5% 데옥시콜레이트)에 재현탁시켰다. 세포 펠릿을 4회의 동결 해동 주기에 의해 용해시켜 바이러스를 방출시켰으며, 이때 각 주기는 -80 ℃에서 30분에 이어서 37 ℃에서 30분으로 이루어진다. 최종 해동 후에 용해물을 벤조나제로 50 U/㎖의 농도로 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 재조합 바이러스를 중력 흐름 컬럼을 사용하여 정제하였다.
정제
첫 번째 단계로서, 상기 조 용해물을 4000g에서 15분의 원심분리에 의해 등명화하고 예비-형성된 요오딕사놀 단계 구배에 적용시켰다. 이어서 상기 바이러스 분획을 수집하고 락테이트 링거액에 재-완충시킬뿐만 아니라 아미콘(Amicon) 원심분리 필터를 사용하여 농축시켰다.
후속으로, 상기 바이러스 제제의 순도를 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 평가하고 실시간 PCR 방법을 사용하여 적정하였다. 상기 조 추출물은 4.5x1012 입자를 함유하였으며; 상기 수집된 바이러스 분획은 1.5x1012 입자를 함유하였다. 이 시점에서 상기 정제 방법은 상기 조 추출물 중에 존재하는 바이러스의 약 33%를 회수하였다.
3. rAAV 벡터 생산 및 정제(또 다른 방법)
상기 2.에 대한 또 다른 실시태양에서, rAAV2 벡터를 하기와 같이 생성시킨다. rAAV2 비리온을 생성시키기 위해서, 세포 공장(CF10)당 5x108 293 세포를 시딩하였다. 14 내지 18시간 후에, 상기 세포를 GFP-함유 벡터 PD10-pST2-CMV-GFP, 및 pDG 또는 pDG 캡시드 돌연변이체(pDG-ttAAV2)로 이중 형질감염시켜 각각 AAV2-CMV-GFP 야생형 또는 트루-타입 벡터를 생성시켰다. 상기 이중 형질감염은 폴리사이언시즈(Polysciences)로부터 PEI-max를 DNA의 ㎎당 3.5 ㎖의 PEI의 비로 사용하여 실현시켰다. 상기 세포를, 상기 배지 및 세포를 4 ℃에서 10분 동안 2200 rpm으로 원심분리시킴으로써 37 ℃에서 72시간의 배양 후에 수확하였다. 상등액을 제거하고 추가의 처리를 위해 보관하였으며, 상기 세포 펠릿을 용해 완충제(0.15 M NaCl, 50 mM 트리스-HCl[pH 8.8])에 재현탁시켰다.
이어서 상기 세포 펠릿을 4회의 동결 해동 주기에 의해 용해시켜 바이러스를 방출시켰으며, 이때 각 주기는 -80 ℃에서 30분에 이어서 37 ℃에서 30분으로 이루어진다. 최종 해동 후에 용해물을 벤조나제로 150 U/㎖의 농도로 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서 상기 용해물을 2000 rpm에서 20분 동안 회전시켜 용해물을 등명화하였다. 상등액을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 사용하여 여과하고 상기 재조합 AAV2 바이러스 제제를 AKTA퓨리파이어(AKTApurifier) 크로마토그래피 시스템(지이헬쓰케어(GE Healthcare) 및 AVB 세파로스 친화성 컬럼(bfr. A: PBS, pH 8; bfr B: 0.5 M 글리신, pH 2.7)을 사용하여 FPLC에 의해 정제하였다. 상기 수집된 분획들을 PBS에 대해 밤새 투석시키고 이어서 바이러스 제제를 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 및 실시간 PCR 방법에 의해 적정하였다.
결과
ttAAV2의 생체내 형질도입 및 확산
상기 ttAAV2 벡터를 상기와 같은 상황에서 상기 변형된 바이러스의 생물활성을 평가하기 위해 생체내에서 시험하였다. AAV2-CMV-GFP WT 및 TT 바이러스의 샘플을 다수의 생체내 모델내로의 주입을 위해 제조하였다. 이를 위해서 상기 바이러스를, 오직 제한된 부피의 벡터만을 생체내로 주입할 수 있기 때문에 농축시켰다. 이어서 qPCR 및 SDS-PAGE를 수행하여 상기 농축된 벡터의 새로운 역가를 평가하였다(도 11).
qPCR 및 단백질 젤 분석 후에 하기의 새로운 역가를 획득하였다: 1.33x1012 바이러스 게놈/㎖의 AAV2-CMV-GFP TT 및 1.25x1012 바이러스 게놈/㎖의 AAV2-CMV-GFP WT. 상기 캡시드 역가는 하기와 같았다: 8.89x1012 캡시드/㎖의 AAV2-CMV-GFP TT 및 7.83x1012 캡시드/㎖의 AAV2-CMV-GFP WT. 상기 역가들은, 상기 SDS-PAGE가 또한 빈 캡시드(상기는 재조합 AAV 벡터 생산 중에 통상적으로 생성된다)를 나타내고 따라서 상기 캡시드 역가가 상기 qPCR로부터 획득된 바이러스 게놈 역가보다 더 높기 때문에, 게놈 사본과 캡시드 사본간에 상이하다.
래트 뇌에서의 형질도입
상기 rAAV2 TT 및 WT 바이러스를 야생형 래트의 흑질 또는 선조체에 주입하였으며, 이때 조건당 3마리의 래트에게 주입당 2x109 vg 또는 3.5x109 vg의 용량이 주입되었다. 28일 후에 뇌를 절제하고 조직 섹션을 면역형광 분석을 위해 준비하였다. 1차 데이터를 도 12 및 도 26에 나타낸다.
상기 rAAV2 TT 및 WT 바이러스 모두, 효율은 변하지만, 각각의 주입 부위로부터 뉴런 및 신경교 세포를 형질도입시킬 수 있었다. 비교에 의해, 상기 TT 벡터가 상기 WT 벡터보다 뇌 조직을 보다 효율적으로 형질도입시키고 주입 부위로부터 더 많이 확산됨을 관찰하였다. 더욱 또한, 상기 rAAV2 TT의 선조체 주입 후 시상하부 영역인 속방핵에서 형질도입된 뉴런의 존재를 관찰하였다. 이는 상기 TT 벡터가 주입 부위에서 형질도입된 세포체로부터 뉴런 돌기를 따라 능동 수송에 의해 시상하부로 이동할 수 있었음을 암시하며, 이는 강한 역행수송 능력을 강조한다. 이러한 역행수송 능력은, 형질도입되지 않은 세포를 동일한 영역에서 관찰할 수 없었으므로, 조직-배양 적응 WT rAAV2 벡터에서 상실되었다(도 26 참조).
종합하면, 래트 뇌에서 이러한 결과는 역가-합치된 wtAAV2에 비해 ttAAV2에 의한 현저하게 증가된 확산 및 형질도입 효율을 암시한다. 더욱 또한, AAV2 TT는, 상기 AAV2 WT 바이러스에서는 상실된 매우 양호한 역행수송 능력에 대한 증거를 나타낸다.
마우스 눈 모델에서 형질도입
본 발명의 래트 뇌 연구에 사용된 바와 동일한 배치로부터 ttAAV2 및 wt-AAV2를 성체 마우스 눈에 2x109 vg/눈의 용량으로 주입하였다. 동물간 변이성을 피하기 위해서, 각각의 마우스에게 한 쪽 눈에는 rAAV2 TT를 주입하고 반대쪽 눈에는 rAAV2 WT를 주입하였다. 3개의 상이한 안내 주입 경로, 즉, 전방내, 유리체내 및 망막하 주입을 분석하였다. 상기 동물들을 수확하고 GFP 발현을 6주 후에 면역형광에 의해 평가하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. 종합하면 이들 데이터는 wtAAV2(성공적인 RPE65 임상 시험에 사용되었다)에 비해, 형질도입된 광수용체 세포의 수준 및 수 모두에 관하여, 망막하 주입에 따른 ttAAV2에 의한 광수용체 세포의 형질도입의 현저한 증대를 암시한다.
신생아 마우스 모델에서 형질도입
요약하면, ttAAV2 및 wtAAV2 GFP 벡터를 마우스 신생아에 주입하였다. 2개의 주입 경로, 즉, 정맥내 주입 및 두개내 주입을 시험하였다. 4주 후에, 상기 동물들을 죽이고 모든 조직을 모든 마우스로부터 수확하였다. 상기 뇌를 분석하였으며, 이를 수확 후에 형광 현미경상에서 상기 기관의 직접 형광에 의해 가시화하였다. 결과를 도 14에 나타낸다. 상기 두개내 및 전신 주입의 결과를 하기에서 보다 상세히 논의한다.
두개내 주입
5x1010 vg의 어느 한 벡터를 P1 신생아의 측뇌실에 주입하였다. 상기 동물들을 주입-후 4주째에 죽이고 뇌를 절제하고, 분할하고 항-GFP 항체를 사용하여 염색하였다. 결과를 도 27에 나타낸다.
성체 래트 뇌에서 관찰된 바와 같이, 이들 데이터는 AAV2 TT가 상기 AAV2 WT 벡터에 비해 두개내 주입 후 증대된 마우스 뇌 조직의 형질도입 및 보다 높은 확산을 나타냄을 암시한다. 보다 높은 배율에서 상기 염색된 섹션의 관찰 시, 상기 두 벡터간의 형질도입 효율의 차이가 더욱 강조되었다: 상기 TT 벡터는 형질도입된 세포의 발현 수준 및 수 모두에 관하여 보다 양호하게 수행하였다. AAV2 TT 및 WT는 동일한 세포 유형 친화성을 갖는 듯하며, 이들은 각각 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포의 형질도입을 나타내고, 이는 상기 관찰된 차이가 세포유형 특이성에 있어서라기보다는 효율의 차이임을 암시한다(도 28). 종합하면, 이들 데이터는 ttAAV2가 wtAAV2-기반 벡터에 비해 i.c. 주입 후 마우스 뇌 조직의 훨씬 증대된 형질도입을 보임을 암시한다. 또한, 일부 증거는 ttAAV2 벡터 사용시 상기 뇌실 내층의 뇌실막세포층의 형질도입을 암시한다. 이러한 현상은 상기 wtAAV2 벡터의 경우 볼 수 없다.
전신 주입
2x1011 vg의 어느 한 벡터의 경정맥내 주입을 P1 신생아에서 수행하였다. 상기 동물을 주입-후 4주째에 죽이고 다양한 기관을 수확하고 항-GFP 항체를 사용하여 면역조직화학에 의해 GFP 형질도입에 대해 평가하였다(뇌, 간, 심장, 근육, 폐, 비장 및 신장). 상기 뇌 염색의 결과를 도 29에 나타내며 고배율 사진을 도 30에 나타낸다.
AAV2 TT의 전신 주입 후 CNS에서의 양호한 트랜스유전자 발현을 관찰하였다. 상기 AAV2 WT 벡터는 비교시 보다 나쁘게 수행하였으며, 단지 소수의 형질도입된 뉴런들만이 관찰되었다.
상기 AAV2 TT 벡터의 전체적인 생체분포를 평가하기 위해서, 전신 주입 후 다양한 조직들에서 획득된 형질도입 수준을 평가하였다. 상기 수확된 기관을 고정시키고, 파라핀 매몰하고, 분할하고 GFP 발현에 대해 염색하였다(도 31).
이들 데이터는 상기 AAV-TT 벡터가 다른 기관들에 대해 강한 친화성을 갖는 것으로 보이지는 않고 대신에 주로 뉴런 조직에 대해 특이성을 나타냄을 암시한다. 이러한 관찰은 상기 벡터가 비-표적 말초 기관을 형질도입시키지 않고 주로 상기 주입 경로를 통해 오직 뇌만을 확실히 형질도입시킬 것이기 때문에 AAV의 정맥내 주입에 의한 뉴런 유전 질환의 치료에 이로움을 입증할 수 있었다.
종합하면, 본 발명의 생체내 데이터는 ttAAV2가 눈 및 뇌 조직에서 대단한 형질도입 특성을 가지며, 이는 뉴런 조직에 거의 독점적으로 특이성을 나타냄을 암시한다.
실시예 2
추가적인 고려사항들
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, wtAAV2에 비해 ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이가 하기의 기능 군을 포함하는 것으로 여겨진다:
1) AAV2 캡시드 3중 스파이크상에 위치한 헤파린 결합 잔기들(S585 및 T588); 이들 잔기는 상기 wtAAV2 캡시드의 헤파린 결합에 기여하는 것으로 여겨진다. ttAAV2에서 이들은 치환되며 이러한 치환이 헤파란 설페이트 프로테오글리칸-풍부 뇌 조직에서의 상기 바이러스의 확산을 지지하는 것으로 추정한다.
2) 상기 캡시드의 내부상에 위치한 ttAAV2에서의 단일 아미노산 변화(S312); 상기 내부 세린 잔기는 캡시드-DNA 상호작용에 한 역할을 하며, 이에 의해 감염 동안 바이러스 안정성, 게놈 패키징 또는 게놈 방출에 잠재적으로 기여할 수도 있다.
3) AAV 캡시드 구조상의 3중-근위 스파이크 사이의 홈에 위치한 2개의 공간적으로 가까운 아미노산(D546 및 G548); 이들 잔기는 중화 항체와의 상호작용에 관련되며 따라서 생체내 형질도입 특성에 기여할 수도 있다.
4) 3중-근위 스파이크 사이의 홈에 위치한 단일의 단리된 아미노산 변화(S593);
5) 수용체 결합에 관련되고 상기 3중 스파이크상에 가깝게 위치하는 것으로 여겨지는 4개의 아미노산(M457, A492, D499 및 Y533);
6) VP1/VP2 1차 서열 중에 위치한 4개의 나머지 아미노산 변화(I125, A151, S162 및 S205); 이들 잔기는 VP3의 부분이 아닌 캡시드 영역내에 있다. 상기 바이러스 캡시드 내의 VP1/VP2 특이성 영역들은 유입 바이러스의 수송에 관련될 수도 있는 PLA2 활성을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 상기 영역에서의 변화는 바이러스 감염성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
상기 AAV2 캡시드 단백질 중의 이들 돌연변이의 3차원 위치는 공지되어 있으며 도 15 내지 20에 나타낸다. 상응하는 위치들을 다른 혈청형들로부터의 AAV 캡시드 단백질에서 확인할 수 있다(하기 참조). 상기 ttAAV2 및 개선된 ttAAV2 표현형에 원인인 개별적인 아미노산 변화의 역할을 추가로 특성화하기 위해서, 상기 ttAAV2 캡시드를, 개별적으로 선택된 아미노산(또는 아미노산들의 군, 예를 들어 상기에 논의된 군 1 내지 6을 기준으로 한)을 야생형 AAV2 캡시드 중의 그들의 상응하는 서열로 복귀시키기 위해서 돌연변이시킬 수 있다. 이어서 각각의 돌연변이체 벡터를 상기 실시예들에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
예를 들어 GFP를 발현하는 다양한 돌연변이체 벡터들을 동물 모델에서 CD1 신생아 마우스에서의 두개내(IC) 주입에 의해 1차 선별할 수 있다. 이어서 각각의 돌연변이체 벡터로부터 상기 주입된 뇌에서 획득된 GFP 신호가 형광 현미경검사에 의해 관찰되며 이를 원래의 GFP-발현 wtAAV2 및 ttAAV2 벡터로부터 획득된 것들과 비교한다. 새로운 표현형의 확인시(즉, 특정한 아미노산 군의 돌연변이시 ttAAV2-특이적의 강한 GFP 발현의 폐지), 이어서 상기 주입된 뇌를 추가로 분할하고 면역조직화학에 의해 분석한다.
동시에, 이들 선택된 돌연변이 벡터를 성체 래트 두개내 주입에 의해 2차 선별한다. 추가로, 관련된 돌연변이 조합들을 상기 벡터의 생체분포를 평가하기 위해서 신생아 마우스에의 정맥내(IV) 주입에 의해 분석한다. 이어서 선택된 기관(심장, 폐, 간, 비장, 신장, 근육)을 면역조직화학 및 GFP 발현의 평가를 위해 처리한다.
벡터의 효율 및 생체분포에의 각각의 TT-특이적 잔기의 기여의 분석
상기 AAV2 TT를 추가로 특성화하고 개선된 TT 표현형에 원인인 아미노산 변화를 정확히 지적하기 위해서, 상기 선택된 아미노산을 상기 야생형 AAV2 캡시드 중의 상응하는 서열로 복귀시키기 위해 상기 AAV2 TT 캡시드를 단계적으로 돌연변이시켰다. 이러한 전략은 상기 14개 아미노산 돌연변이들 각각의 AAV2 TT의 표현형에 대한 기여를 보다 구체적으로 식별할 수 있게 하고 오직 필요한 돌연변이들만을 함유하는 최소 트루-타입 벡터를 한정할 수 있게 하였다.
상기에 논의된 바와 같이, 상기 14개의 TT-특이적 잔기들을 그들의 AAV 캡시드상의 위치 및 형질도입 프로파일에의 그들의 관련된 잠재적인 기여를 기준으로 분류하였다. 상기 다양한 AAV-TT 돌연변이체를, 일부 TT-특이적 잔기의 WT 균등물로의 복귀가 표현형의 상실과 관련되었는지의 여부를 관찰하기 위해서 신생아 마우스 뇌 또는 성체 래트 뇌에서 두개내 주입에 의해 선별하였으며, 이에 의해 상기 14개 TT 잔기 중 중요한 아미노산 변화를 확인하였다.
헤파린 결합 부위(HBS)
잔기 585 및 588은 AAV2 WT 캡시드의 헤파린 결합을 맡고 있는 것으로 밝혀졌다. AAV-TT에서 이들은 치환되며 이러한 치환이 헤파린 설페이트 프로테오글리칸-풍부 뇌 조직에서의 상기 바이러스의 확산을 지지하는 것으로 추정하였다. 이들 2개의 잔기는 상기 AAV2 캡시드 구조의 3중 근위 스파이크상에 위치한다(도 16 참조).
상기 WT 캡시드(AAV2-HBnull)상의 변화 R585S 및 R588T를 조작함으로써, 즉, 상기 잔기들을 트루-타입 균등물로 돌연변이시킴으로써 상기 AAV2 WT 헤파린 결합 능력을 없앴다. 이러한 첫 번째 분석을, AAV-TT가 단지 헤파린 결합 부위가 없는 AAV2가 아니며, 보다 더 확산될 수 있지만 다른 12개 아미노산 변화 중 일부가 또한 상기 개선된 AAV-TT 형질도입 프로파일에 한 역할을 함을 확인하기 위해서 수행하였다.
성체 래트에서 두개내 주입
역가-합치된 AAV2-TT, AAV2-WT 및 AAV2-HBnull 벡터를 야생형 래트의 흑질 또는 선조체에 주입당 3.5x109 vg의 용량으로 주입하였다. 28일 후에 뇌를 절제하고 조직 섹션을 GFP 발현의 면역조직화학 분석을 위해 제조하였다(도 32).
AAV-TT 바이러스의 선조체 주입 후 시상 및 흑질에서의 강한 GFP 발현을 관찰하였으며, 이는 상기 벡터의 강한 역행수송 능력을 강조한다. 비교시, 매우 소수의 세포체들이 선조체 주입 후 상기 영역에 형질도입되었기 때문에, AAV2-HBnull 및 AAV2 WT는 AAV-TT보다, 존재한다면, 훨씬 적게 역행수송을 나타내었다. 이러한 관찰은 AAV2-HBnull이 AAV-AT와 상이하며 상기 AAV2 캡시드상의 헤파린 결합 능력의 부재가 뇌에서 트루-타입 벡터의 양호한 확산에 기여함을 입증하였다. 그러나, 이는 그의 개선된 형질도입 프로파일을 설명하기에 충분하지 않다.
잔기 S312, D546, G548 및 S593
S312 잔기는 상기 AAV2 캡시드의 내부상에 위치한 유일한 TT-특이적 변화이다. 본 발명의 가정은 상기 내부 잔기가 캡시드-DNA 상호작용에 한 역할을 하며, 이에 의해 감염 중 바이러스 안정성, 게놈 패키징 또는 게놈 방출에 잠재적으로 기여한다는 것이었다.
각각 546 및 548번 위치의 D 및 G 잔기는 상기 근위 3-중 피크 사이의 홈에 위치한다.
단일의 단리된 세린, S593은 3중-근위 스파이크 사이의 홈에 위치한다.
상기 AAV2 캡시드의 3차원 구조상의 이들 TT-특이적 잔기의 위치들을 도 17 내지 19에 나타낸다. 상기 구조에서 이들의 덜 현저한 위치가 제공된다면, 이들 잔기가 상기 ttAAV2 형질도입 표현형에 기여하지 않을 수도 있음을 가정하였다.
신생아 마우스 두개내 주입
돌연변이 S312N을 TT-S312N 돌연변이체를 생성시키기 위해서 상기 AAV2-TT 캡시드 상에서 조작하였다. 돌연변이 D546G 및 G548E를 AAV-TT-DG 돌연변이체를 생성시키기 위해서 상기 AAV2-TT 캡시드 상에서 조작하였다. 돌연변이 S593A를 AAV-TT-S593A 돌연변이체를 생성시키기 위해서 상기 AAV2-TT 캡시드 상에서 조작하였다.
이들 선택된 TT 아미노산을 야생형 AAV2 캡시드 중의 그들의 상응하는 서열로 복귀시킴으로써, 이들 잔기의 상기 개선된 AAV-TT 표현형에의 기여를 측정하기로 하였다.
5x1010 vg의 각각의 돌연변이체 벡터를 P1 신생아의 측뇌실에 주입하였다. 상기 동물들을 주입-후 4주째에 죽이고, 뇌를 절제하고, 분할하고 항-GFP 항체를 사용하여 염색하였다. 결과를 도 33에 나타낸다.
흥미롭게, 이들 데이터는 상기 AAV TT-S312N이 완전한 AAV2 TT 벡터에 비해 마우스 뇌 조직의 증대된 형질도입을 나타냄을 암시한다. 다른 한편으로, 아미노산 변화 S593A 또는 D546E/G548D는, 유사한 형질도입 프로파일이 상기 뇌 전체를 통해 관찰될 수 있었기 때문에 상기 TT 표현형에 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다. 보다 높은 배율에서 상기 염색된 섹션을 관찰할 때, 형질도입 효율의 차이가 더욱 강조되었다(도 34).
고배율 사진으로부터, 상기 AAV TT-S312가 14개의 아미노산 변화를 갖는 원래의 AAV-TT보다 더 높은 효율로 뉴런 조직을 형질도입시키는 듯함을 관찰할 수 있었다. 특히, 형질도입된 세포의 수준 및 수 모두에 관하여, TT-S312N 벡터 주입 후 상기 뇌(피질, 선조체, 해마)의 주둥이쪽에서 더 강한 트랜스유전자 발현을 볼 수 있었다. 상기 주입 부위의 표적화와 관련된 어려움으로 인한 주입된 신생아 뇌에서의 높은 변이성에도 불구하고, 이러한 관찰은 분석된 모든 동물들에서 확인되었다. 다른 한편으로, 복귀 S593A 또는 D546E/G548D는 TT 벡터 형질도입 표현형에 그다지 영향을 미치지 않는 듯하였다.
실시예 3
실시예 2에서 돌연변이체 조합들에 의해 획득된 결과 중에서 선택된, AAV2 트루-타입 캡시드상의 표적화된 아미노산 돌연변이
완전한 AAV TT 캡시드 상의 아미노산 기 돌연변이로부터의 결과를 근거로, 돌연변이 S312N이 TT 표현형에 이로운 것으로 보이고, 이는 뇌에서의 그의 형질도입 효율을 더욱 증가시킴을 결정할 수 있었다. 더욱 또한, 상기 복귀 S593A 및 D546G/G548E가 AAV-TT의 뉴런 표현형에 영향을 미치지 않는 듯함을 관찰하였다. 따라서 상기 TT-특이적 잔기 S593, D546 및 G548을 상기 트루-타입 캡시드 서열로부터 제외할 수 있으며, 대신에 이들 위치에 AAV2 WT 잔기가 남아 단지 10개의 아미노산 변화만을 갖는 최종 TT 벡터를 수득할 수 있음을 가정하였다.
이러한 가설을 확인하기 위해서, 상기 TT-S312N-D546G-G548D-S593A 벡터를 조작하고 신생아 마우스 뇌 주입에 의해 그의 형질도입 효율을 시험하였다. 최종 신생아 두개내 주입이 상기 검출된 GFP 발현에서 포화된 신호를 유도하는 것으로 생각되었기 때문에, 또한 상기 TT 및 TT-S312N 벡터를 상기 "최종-전" TT와 함께 앞서 사용된 것보다 10배 더 낮은 용량을 사용하여 주입할 것을 결정하였다. 이러한 보다 낮은 용량을 사용함으로써 상기 형질도입된 뇌에서 GFP 염색의 포화 수준에 도달하는 것을 피하고 상이한 돌연변이들 간의 형질도입 효율 비교의 어려움을 피하고자 하였다.
5x1009 vg의 각각의 돌연변이 벡터를 P1 신생아의 측뇌실에 주입하였다. 상기 동물을 주입-후 4주째에 죽이고 뇌를 절제하고, 분할하고 항-GFP 항체를 사용하여 염색하였다. 결과를 도 35에 나타낸다.
앞서 관찰된 바와 같이, 이들 데이터는 상기 AAV TT-S312N이 완전한 AAV2 TT 벡터에 비해 마우스 뇌 조직의 증대된 형질도입을 나타냄을 암시한다. 다른 한편으로, 상기 최소 TT-S312N-D546G/G548E-S593A 벡터는 상기 벡터가 내부 S312N 돌연변이를 함유하였다 하더라도 상기 보다 높은 형질도입 수준에 도달하지 못하는 것으로 생각되었다. 이는 상기 아미노산 변화 중 하나 이상이 상기 TT 표현형에서 일부 역할을 함을 암시한다. 이들 잔기를 다시 AAV2 WT 균등물로 복귀시킴으로써, 상기 증가된 형질도입 능력의 일부를 상실하였다. 보다 높은 배율로 상기 염색된 섹션을 관찰할 때, 이러한 관찰이 확인되었다(도 36).
주입된 뇌에서 획득된 전체 GFP 발현을 완전한 뇌 단백질 추출물 상에서 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 정량분석함으로써 이들 각각의 벡터에 의해 획득된 형질도입 효율을 추가로 조사하기로 하였다. 간단히, 5x1009 vg의 벡터 주입 후 4주째에, 상기 동물들을 죽이고, 전체 뇌를 수확하고 용해시켰으며, 전체 뇌 단백질을 추출하였다. 이어서 GFP 단백질 표준을 사용하여, 각각의 주입된 뇌에서 발현된 GFP 단백질의 양을 정량분석할 수 있었다(도 37).
상기 TT-S312N 내부 돌연변이체가 상기 주입된 뇌 모두에서 전체적으로 보다 많은 GFP 발현을 유도하기 때문에 상기 완전한 TT 벡터보다 마우스 뇌를 더 큰 효율로 형질도입시킴을 확인할 수 있었다. 다른 한편으로 상기 최소 TT 벡터, TT-S312N-D546G/G548E-S593A는 보다 낮운 수준의 형질도입을 유도하는 것으로 생각되었다: 뇌당 발현된 GFP의 평균량은 상기 그래프상에서 보다 높아 보이지만, 이는 상기 조건에 대해 높은 오차 막대에 의해 예시되는 바와 같이 상기 뇌 중 하나에서 측정된 극단의 GFP 값에 기인하였다. 상기 최소 TT 벡터에 의해, 동물들간의 변이성은 매우 높았으며, 5마리 중 오직 한 마리의 동물만이 TT-S312N으로 형질도입된 동물들보다 양호하게 수행하였다. 이러한 높은 변이성은, 특히 상기 면역조직화학 분석이 또한 상기 TT-S312N 변이체가 상기 TT-S312N-DG-S593A보다 더 양호하게 수행함을 보였기 때문에 상기 일시적인 최소 TT 벡터를 신중히 고려하게 하였다.
따라서 상기 TT-S312N 변이체를 본 발명의 가장 바람직한 AAV TT 벡터로 선택하였으며, 상기 벡터는 야생형 AAV2에 비해 하기 13개의 아미노산 돌연변이로 구성된다: V125I, V151A, A162S, T205S, Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T, 및 A593S.
상기 연구들은 상기 TT-S312N을 가장 바람직한 AAV-TT 벡터로서 제시하고 있지만, 이들 연구는 다수의 TT-특이적 잔기들의 개별적인 기능 및 기여를 예시한다. 특히, 상기 캡시드의 3중 스파이크상에 가깝게 위치한 4개의 아미노산이 수용체 결합에 관련되는 듯하다. 일부 실시태양에서, 이들 잔기는 상기 AAV-TT에서 상기 AAV2 WT 상응하는 잔기로 다시 복귀된다. 예를 들어, 돌연변이 M457Q, A492S, D499E 및 Y533F를, 이들 잔기의 역할을 예시하기 위해서 상기 AAV-TT 캡시드 및 앞서 개시된 바와 같이 분석된 상기 돌연변이 벡터상에서 조작할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이러스의 수송에 관련된 듯한 VP1/VP2 1차 서열 중에 위치한 4개의 아미노산은 상기 AAV-TT에서 AAV2 WT 상응하는 잔기(I125V, A151V, S162A, S205T)로 다시 복귀될 수 있으며 유사하게 분석될 수 있다.
실시예 4
다른 혈청형들에서 변이형 AAV 벡터의 구축
다른, 비-AAV2 혈청형과 관련하여 상기 ttAAV2-특이적 아미노산 변화의 기능을 또한 측정할 수 있다.
주 아데노-관련 바이러스(AAV), 즉, AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 및 AAVrh10의 캡시드 아미노산 서열을 예를 들어 도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이 ttAAV2로부터의 것과 함께 정렬할 수 있다. 이는 다른 혈청형들에서 동일한 위치에 이미 존재하는 ttAAV2-특이적 아미노산들을 확인할 수 있게 한다. 이어서 다양한 혈청형들 중의 관련 잔기들을 wtAAV2 중의 상응하는 잔기들로 돌연변이시킨다. 이러한 변화는 상기 혈청형 각각의 효율 및 생체분포에 대한 상기 ttAAV2-특이적 잔기의 중요성을 입증한다.
이어서, 상기에 논의된 바와 같이, GFP를 발현하는 다양한 돌연변이 벡터를 CD1 신생아 마우스에서 두개내(IC) 주입에 의해 1차 선별한다. 이어서 상기 주입된 뇌에서 획득된 GFP 신호를 적합한 GFP-발현 혈청형 대조용으로부터 획득된 것과 비교한다. 상기 확인된 아미노산의 그의 상응하는 AAV2 잔기로의 돌연변이시 GFP 발현의 감소 또는 증가는 이들 특정한 위치들에서 이들 특정한 잔기들의 중요성을 입증한다. 이어서, 적용 가능한 경우, 상기 주입된 뇌를 추가로 분할하고 면역조직화학에 의해 분석한다. 추가로, 선택된 돌연변이 혈청형을 상기 벡터의 생체분포를 평가하고 이를 원래의, 돌연변이되지 않은 대응물과 비교하기 위해서 신생아 마우스내로의 정맥내(IV) 주입에 의해 분석한다.
추가의 실시태양에서, 상기 ttAAV2에서 확인된 관련 아미노산들을 관련 위치에서 다른 현저한 혈청형내로 핵심 돌연변이로서 삽입한다. 다른 AAV 하위유형에서 ttAAV2-특이적 잔기의 삽입은 우리로 하여금 각 혈청형의 형질도입 및 생체분포 프로파일을 개선시킬 수 있게 한다.
실시예 5
다른 AAV 혈청형 중에 보존된 ttAAV2-특이적 잔기의 상응하는 AAV2 잔기로의 변형
기존 아데노-관련 혈청형의 캡시드 아미노산 서열과 ttAAV2로부터의 서열과의 비교 분석은 먼저 다른 혈청형들 중에 보존된 ttAAV2-특이적 잔기를 확인할 수 있게 하였다(도 9 참조). 이들 잔기는 S162, S205, S312, G548, S585 및 T588로 이루어진다. 각각의 비-AAV2 혈청형은 그의 서열 중 상응하는 아미노산 위치에 이들 잔기 중 하나 또는 다수의 조합을 함유한다.
특정한 실시태양에서, 다양한 혈청형 중의 각각의 이들 잔기를 상응하는 야생형 AAV2 아미노산(들)으로 전환시키고 이들 신규 돌연변이체의 형질도입 효율을 시험한다.
1) AAV1 혈청형의 변형
AAV1은 ttAAV2 중의 하기 잔기들에 상응하는 잔기 S205, G549, S586 및 T589를 함유한다: S205, G548, S585 및 T588. AAV1으로부터의 VP1 단량체를 AAV2로부터의 VP1과 3차원으로 정렬시킨 경우, wtAAV2 중의 상응하는 잔기들, 즉 T205, E548, R585 및 R588이 상기 3D 구조상에서 완벽하게 합치하는 위치들에 있음을 확인할 수 있었다(도 21). 따라서 AAV1 중의 각각의 ttAAV2-특이적 잔기(들)를 단백질의 3차원 구조에 영향을 미치지 않으면서 상응하는 야생형 AAV2 대응물로 전환시키는 것이 중요할 것이라는 결론을 내렸다. 특정한 실시태양에서 하기의 돌연변이들을 AAV1 캡시드 서열 중에서 수행한다: S205T, G549E, S586R, T589R.
2) AAV5 혈청형의 변형
AAV5는 ttAAV2 중의 하기 잔기들에 상응하는 잔기 G537, S575 및 T578을 함유한다: G548, S585 및 T588. AAV2 중의 R585 및 R588 잔기는 상기 3D 구조상에서 AAV5 중의 S575 및 T578과 합치하는 위치들에 있다. AAV2 중의 잔기 E548이 상기 3차원 구조에 따른 AAV5 중의 잔기 G537과 완벽하게 합치되지 않았지만(도 22), 여전히 상기 두 잔기가 모두 비교적 공간적으로 가깝기 때문에 연구에 포함시키기로 하였다. 따라서 특정한 실시태양에서 하기의 돌연변이들을 AAV5 캡시드 서열 중에서 수행한다: G537E, S575R, T578R.
3) AAV6 혈청형의 변형
AAV6은 ttAAV2 중의 하기 잔기들에 상응하는 잔기 S205, G549, S586 및 T589를 함유한다: S205, G548, S585 및 T588. wtAAV2 중의 상응하는 잔기들, 즉, T205, E548, R585 및 R588(도 23)은 상기 VP1 3D 구조상에서 완벽하게 합치하는 위치들에 있다. 따라서 특정한 실시태양에서 하기의 돌연변이들을 AAV6 캡시드 서열 중에서 수행한다: S205T, G549E, S586R, T589R.
4) AAV8 혈청형의 변형
AAV8은 ttAAV2 중의 하기 잔기들에 상응하는 잔기 S315 및 T591을 함유한다: S312 및 T588. wtAAV2 중의 상응하는 잔기들, 즉, N312 및 R588은 상기 VP1 3D 구조상에서 완벽하게 합치하는 위치들에 있다(도 24). 따라서 특정한 실시태양에서 하기의 돌연변이들을 AAV8 캡시드 서열 중에서 수행한다: S315N, T591R.
하나의 실시태양에서, TT AAV2 중의 S312N 돌연변이에 의해 부여된 개선된 형질도입 효율을 아미노산 변화 S315N을 적용함으로써 AAV8 혈청형으로 전달할 수 있다.
상기 AAV8 캡시드 서열을 부위-지향된 돌연변이유발에 의해 돌연변이시켰으며 이에 의해 AAV8-S315N 벡터 플라스미드를 생성시켰다. 상기 플라스미드를 사용하여, 293T 세포의 이중 형질감염에 의해 ITR-함유 CMV-GFP 트랜스유전자를 발현하는 재조합 AAV8-S315N 벡터를 생성시켰다. 이어서 상기 벡터를, 상기 세포 용해물 및 상기 수확된 배양 상등액으로부터 AVB 세파로스 수지를 사용하여 FPLC 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 캡시드 역가 및 벡터 게놈 역가를 각각 SDS-PAGE 및 qPCR에 의해 평가하였다.
GFP를 발현하는 돌연변이 AAV8-S315N 벡터를 CD1 신생아 마우스에서 전신 주입에 의해 선별한다. 역가-합치된 AAV8 벡터를 대조용으로서 사용한다. 이어서 2x1011 vg의 경정맥내 주입 후 다양한 기관에서 획득된 GFP 발현을 분석하며, 주로 AAV8이 앞서 강한 형질도입 효율로 입증된 간에 집중한다.
5) AAV9 혈청형의 변형
AAV9는 ttAAV2 중의 하기 잔기들에 상응하는 잔기 S162, S205, G549 및 S586을 함유한다: S162, S205, G548 및 S585. AAV2 중의 상응하는 잔기들, 즉 A162, T205, E548 및 R585는 상기 VP1 3D 구조상에서 완벽하게 합치하는 위치들에 있다(도 25). 따라서 특정한 실시태양에서 하기의 돌연변이들을 AAV8 캡시드 서열 중에서 수행한다: S162A, S205T, G549E 및 S586R.
6) AAVrh10 혈청형의 변형
AAVrh10은 ttAAV2의 G548에 상응하는 잔기 G551을 함유한다. 상기 잔기가 어떻게 보존되었고 위치가 다양한 혈청형들 중에 어떻게 존재하는 지를 고려하면서, AAVrh10 중의 G551이 wtAAV2 중의 E548과 3차원적으로 정렬될 것이라 추정한다. 따라서 하나의 실시태양에서 하기의 돌연변이를 AAVrh10 캡시드 서열 중에서 수행한다: G551E.
7) AAV3B 및 AAV-LK03 혈청형의 변형
상기 AAV8 혈청형과 유사하게, 상기 AAV3B 혈청형이 또한, 상기 캡시드 단백질 VP1 서열을 AAV-TT로부터의 서열과 정렬 후 312번 위치에서 내부 세린을 함유함을 관찰하였다(도 38에서 AAV3B 캡시드 서열을 참조하시오).
엠에이 케이(M.A. Kay)에 의해 DNA-셔플링에 의해 조작된 5개의 상이한 모 AAV 캡시드로 구성된 키메릭 캡시드인 상기 새로 개시된 LK03 AAV 벡터는 또한 상기 캡시드의 내부에 잔기 S312를 함유한다(문헌[Lisowski et al., Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model, Nature 506, 382-386 (2014)]을 참조하시오). 상기 AAV-LK03의 캡시드 서열은 WO2013/029030에 개시되어 있으며 도 39a 및 39b에 도시되어 있다.
따라서, 추가의 실시태양에서, 상기 AAV3B 및 AAV-LK03 벡터를 상기 두 벡터 모두에 아미노산 변화 S312N을 적용함으로써 돌연변이시킨다. 이들 신규의 돌연변이체 및 이들의 상응하는 AAV 대조용 혈청형을 또한 신생아 마우스에서 경정맥내 주입에 의해 시험한다. 이어서 다양한 수확된 기관에서 획득된 GFP 발현을 분석한다.
실시예 6
AAV 혈청형들 간에 이동 가능한 ttAAV2-특이적 아미노산의 확인
추가의 실시태양에서, 상기 ttAAV2 특성화 중 확인된 핵심 아미노산들을 관련 위치들에서 다른 현저한 혈청형들내로 삽입한다. 이어서 상기 새로 조작된 벡터들을 대조용으로서 적합한 돌연변이되지 않은 혈청형을 사용하여 시험한다. 이는 상기 혈청형과 별개로, AAV 캡시드상의 특정한 위치들에서의 개별적인 아미노산의 중요성을 확인시킨다.
1) 잔기 S585, T588, S312, D546, G548 및 S593
AAV1, AAV5 및 AAV6은 자연적으로 ttAAV2 중의 G548, S585 및 T588에 상응하는 그들의 캡시드 단백질 서열 중의 위치들에 동일한 아미노산 잔기를 함유한다. 따라서 추가의 실시태양에서, 이들 혈청형 중의 캡시드 단백질을 ttAAV2 중에 위치하는 다른 잔기들 S312, D546 및 S593을 포함하도록 합치하는 위치들에서 돌연변이시킨다. 유사하게, 이미 ttAAV2 중의 S312 및 T588에 상응하는 위치들에 ttAAV2에서와 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 AAV8을 ttAAV2 중의 S585, D546, G548 및 S593에 상응하는 잔기들을 함유하도록 추가로 돌연변이시킨다. 이미 ttAAV2 중의 G548 및 S585에 상응하는 잔기를 함유하는 AAV9를 ttAAV2 중의 T588, S312, D546 및 S593에 상응하는 잔기를 포함하도록 돌연변이시킨다. 최종적으로, 이미 G548에 상응하는 잔기를 함유하는 AAV10을 S585, T588, S312, G548 및 S593에 상응하는 잔기를 또한 함유하도록 추가로 변형시킨다.
2) 잔기 I125, A151, S162, M457, A492, D499 및 Y533
AAV1 및 AAV6은 이미 자연적으로 잔기 S205를 함유한다. 따라서 추가의 실시태양에서 이들 혈청형을 ttAAV2 중의 잔기 I125, A151, S162, M457, A492, D499 및 Y533에 상응하는 위치들에서 돌연변이시킨다. 유사하게, 이미 잔기 S162 및 S205를 함유하는 AAV9를 ttAAV2 중의 잔기 I125, A151, M457, A492, D499 및 Y533에 상응하는 잔기들을 함유하도록 추가로 돌연변이시킨다. 최종적으로, AAV5, 8 및 10을 ttAAV2 중의 잔기 I125, A151, S162, S205, M457, A492, D499 및 Y533에 상응하는 잔기들을 나타내도록 변형시킨다.
ttAAV2 중에 존재하는 돌연변이 및 다른 AAV 혈청형의 야생형 캡시드 단백질 VP1 서열 중에 존재하는 상응하는 잔기들의 위치를 하기 표 1에 나타낸다. 일반적으로, 변이형 비-AAV2 벡터들을, 상기 혈청형들에 대해 표 1에 나타낸 잔기들 중 어느 하나를 돌연변이시킴으로써 구축할 수 있다. 이탤릭체로 나타낸 잔기들은 상응하는 위치에서 ttAAV2 중에 이미 존재하는 잔기들이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 비-AAV2 혈청형들을 비-이탤릭체로 나타낸 잔기들 중 하나 이상에서 돌연변이시킨다. 이렇게 하여, ttAAV2에 의해 나타난 유리한 성질들을 또 다른 AAV 혈청형들로 이동시킬 수 있다.
ttAAV2 AAV1 AAV5 AAV6 AAV8 AAV9 AAV10
I125 V125 V124 V125 V125 L125 V125
A151 Q151 K150 Q151 Q151 Q151 Q151
S162 T162 K153 T162 K163 S162 K163
S205 S205 A195 S205 A206 S205 A206
S312 N313 R303 N313 S315 N314 N315
M457 N458 T444 N458 T460 Q458 T460
A492 K493 S479 K493 T495 V493 L495
D499 N500 V486 N500 N502 E500 N502
Y533 F534 T520 F534 F536 F534 F536
D546 S547 P533 S547 N549 G547 G549
G548 G549 G537 G549 A551 G549 G551
S585 S586 S575 S586 Q588 S586 Q588
T588 T589 T578 T589 T591 A589 A591
S593 G594 G583 G594 G596 G594 G596
본 발명의 추가의 실시태양들
본 발명은 또한 하기의 요약 단락들에 정의된 바와 같은 추가의 태양들에 관한 것이다:
1. (a) 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하되 상기 적어도 하나의 아미노산 치환이 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 상응하는 위치에 존재하는 변이형 AAV 캡시드 단백질: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 및
(b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산
을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
2. 1항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV2 캡시드 단백질을 포함하고; (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV2로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
3. 2항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 하기의 잔기 중 하나 이상을 포함한다: I125, A151, S162, S205, S312, M457, A492, D499, Y533, D546, G548, S585, T588 및/또는 S593.
4. 2항 또는 3항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV2 캡시드 단백질은 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: V125I, V151A, A162S, T205S, N312S, Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T 및/또는 A593S.
5. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 또는 AAV10으로부터의 것이다.
6. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV1 캡시드 단백질을 포함하고; (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 3에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV1로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 3의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV1 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594.
7. 6항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV1 캡시드 단백질은 야생형 AAV1 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S; 및/또는
(b) S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R.
8. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV5 캡시드 단백질을 포함하고; (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 4에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV5로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 4의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV5 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 124, 150, 153, 195, 303, 444, 479, 486, 520, 533, 537, 575, 578 및/또는 583.
9. 8항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV5 캡시드 단백질은 야생형 AAV5 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) V124I, K150A, K153S, A195S, R303S, T444M, S479A, V486D, T520Y, P533D, 및/또는 G583S; 및/또는
(b) G537E, S575R 및/또는 T578R.
10. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV6 캡시드 단백질을 포함하고; (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 5에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV6으로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 5의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV6 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 313, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594.
11. 10항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV6 캡시드 단백질은 야생형 AAV6 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) V125I, Q151A, T162S, N313S, N458M, K493A, N500D, F534Y, S547D, 및/또는 G594S; 및/또는
(b) S205T, G549E, S586R 및/또는 T589R.
12. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV8 캡시드 단백질을 포함하고, (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV8로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 6의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV8 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596.
13. 12항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV8 캡시드 단백질은 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) V125I, Q151A, K163S, A206S, T460M, T495A, N502D, F536Y, N549D, A551G, Q588S 및/또는 G596S; 및/또는
(b) S315N 및/또는 T591R.
14. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAV9 캡시드 단백질을 포함하고, (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 7에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAV9로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 7의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV9 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 162, 205, 314, 458, 493, 500, 534, 547, 549, 586, 589 및/또는 594.
15. 14항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAV9 캡시드 단백질은 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) L125I, Q151A, N314S, Q458M, V493A, E500D, F534Y, G547D, A589T 및/또는 G594S; 및/또는
(b) S162A, S205T, G549E 및/또는 S586R.
16. 5항에 따른 재조합 AAV 벡터에서,
(i) 상기 벡터는 변이형 AAVrh10 캡시드 단백질을 포함하고, (ii) 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; (iii) 야생형 AAV 캡시드 단백질은 AAVrh10으로부터의 것이고/이거나; (iv) 상기 야생형 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 8의 서열을 포함하고;
적어도 하나의 아미노산 치환이 상기 AAV10 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상에 존재한다: 125, 151, 163, 206, 315, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596.
17. 16항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 변이형 AAVrh10 캡시드 단백질은 야생형 AAVrh10 캡시드 단백질에 대해 하기의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다:
(a) V125I, Q151A, K163S, A206S, N315S, T460M, L495A, N502D, F536Y, G549D, Q588S, A591T 및/또는 G596S; 및/또는
(b) G551E.
18. 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 상기 재조합 AAV 벡터는 상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터에 비해 뉴런 또는 망막 조직의 증가된 형질도입을 나타낸다.
19. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 유전자 산물은 간섭 RNA 또는 앱타머를 포함한다.
20. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 유전자 산물은 폴리펩타이드를 포함한다.
21. 20항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 유전자 산물은 신경보호성 폴리펩타이드, 혈관형성 억제성 폴리펩타이드, 또는 뉴런 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드를 포함한다.
22. 21항에 따른 재조합 AAV 벡터에서, 유전자 산물은 신경교 유래된 신경영양인자, 섬유아세포 성장인자, 신경성장인자, 뇌 유래된 신경영양인자, 로돕신, 레티노스키신, RPE65 또는 페리페린을 포함한다.
23. (a) 1항 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터; 및
(b) 약학적으로 허용 가능한 부형제
를 포함하는 약학 조성물.
24. 대상체에서 유전자 산물을 뉴런 또는 망막 조직으로 전달하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체에게 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
25. 신경학적 또는 눈 질환을 치료하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대상체에게 1항 내지 24항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
26. 신경학적 또는 눈 질환의 치료에 사용하기 위한 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물.
27. 24항 내지 26항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방법, 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물에서, 상기 신경학적 질환은 신경퇴행성 질병이다.
28. 24항 내지 26항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방법, 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물에서, 상기 눈 질환은 녹내장, 망막색소변성증, 황반변성, 망막분리 또는 당뇨성 망막병증이다.
29. 단리된 변이형 AAV 캡시드 단백질로, 상기 변이형 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고; 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 AAV2 캡시드 단백질 서열에서 하기의 위치 중 하나 이상: 125, 151, 162, 205, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593; 또는 또 다른 AAV 캡시드 단백질 서열에서 하나 이상의 상응하는 위치에 존재한다.
30. 29항에 정의된 바와 같은 변이형 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
31. 30항에 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
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Ser Gln Gly 595 600 605 Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly 610 615 620 Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser 625 630 635 640 Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu 645 650 655 Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Ala 660 665 670 Ala Lys Xaa Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser 675 680 685 Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn 690 695 700 Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp 705 710 715 720 Phe Ala Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly 725 730 735 Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 740 <210> 11 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 3B <400> 11 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 12 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant sequence <400> 12 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735

Claims (39)

  1. (a) 야생형 아데노-관련 바이러스(AAV)2 캡시드 단백질에 대해 4개 이상의 아미노산 치환을 포함하되 상기 4개 이상의 아미노산 치환이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 457, 492, 499 및 533번 위치에 존재하는, 변이형 AAV2 캡시드 단백질; 및
    (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산
    을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (i) 변이형 AAV 캡시드 단백질이 서열번호 2의 서열, 또는 상기 서열에 95% 이상 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나
    (ii) 야생형 AAV 캡시드 단백질이 서열번호 1의 서열을 포함하는
    재조합 AAV 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 잔기 M457, A492, D499 및 Y533 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 Q457M, S492A, E499D 및 F533Y 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 125, 151, 162 및 205번 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 또한 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 잔기 I125, A151, S162 및 S205 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 V125I, V151A, A162S 및 T205S 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 585 및 588번 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 또한 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 잔기 S585 및 T588 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 R585S 및 R588T 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 AAV2 캡시드 단백질 서열 중 546, 548 및 593번 위치에서 야생형 AAV 캡시드 단백질에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 또한 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 잔기 D546, G548 및 S593 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 야생형 AAV2 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 G546D, E548G 및 A593S 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    변이형 AAV2 캡시드 단백질이 잔기 N312를 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  15. (a) 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 AAV8 캡시드 단백질 서열 중 315번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 변이형 AAV8 캡시드 단백질; 및
    (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산
    을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서,
    (i) 변이형 AAV 캡시드 단백질이 서열번호 6에 95% 이상 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나
    (ii) 야생형 AAV 캡시드 단백질이 서열번호 6의 서열을 포함하는
    재조합 AAV 벡터.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    변이형 AAV8 캡시드 단백질이 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S315N을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    AAV8 캡시드 단백질 서열에서 125, 151, 163, 206, 460, 495, 502, 536, 549, 551, 588, 591 및/또는 596번 위치 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 아미노산 치환을 또한 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서,
    변이형 AAV8 캡시드 단백질이 야생형 AAV8 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 (a) V125I, Q151A, K163S, A206S, T460M, T495A, N502D, F536Y, N549D, A551G, Q588S 및/또는 G596S; 및/또는 (b) T591R 중 하나 이상을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  20. (a) 야생형 AAV3B 캡시드 단백질에 대해 AAV3B 캡시드 단백질 서열 중 312번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 변이형 AAV3B 캡시드 단백질; 및
    (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산
    을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  21. 제 20 항에 있어서,
    (i) 변이형 AAV3B 캡시드 단백질이 서열번호 11에 95% 이상 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고/하거나
    (ii) 야생형 AAV 캡시드 단백질이 서열번호 11의 서열을 포함하는
    재조합 AAV 벡터.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    변이형 AAV3B 캡시드 단백질이 야생형 AAV3B 캡시드 단백질에 대해 아미노산 치환 S312N을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  23. (a) 서열번호 12에 정의된 AAV-LK03 캡시드 단백질 서열에 대해 312번 위치에 아미노산 치환을 포함하는 변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질; 및
    (b) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이종 핵산
    을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  24. 제 23 항에 있어서,
    변이형 AAV-LK03 캡시드 단백질이 서열번호 12에 95% 이상 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  25. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터에 비해 뉴런 또는 망막 조직의 증가된 형질도입을 나타내는 재조합 AAV 벡터.
  26. 제 15 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상응하는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 간 조직의 증가된 형질도입을 나타내는 재조합 AAV 벡터.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 산물이 간섭 RNA 또는 앱타머를 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 산물이 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  29. 제 28 항에 있어서,
    유전자 산물이 신경보호성 폴리펩타이드, 혈관형성 억제성 폴리펩타이드, 또는 뉴런 또는 망막 세포의 기능을 향상시키는 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  30. 제 29 항에 있어서,
    유전자 산물이 신경교 유래된 신경영양인자, 섬유아세포 성장인자, 신경성장인자, 뇌 유래된 신경영양인자, 로돕신, 레티노스키신, RPE65 또는 페리페린을 포함하는 재조합 AAV 벡터.
  31. (a) 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터; 및
    (b) 약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  32. 대상체에게 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 유전자 산물을 조직으로 전달하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    조직이 혈액, 골수, 근육 조직, 뉴런 조직, 망막 조직, 췌장 조직, 간 조직, 신장 조직, 폐 조직, 장 조직 및 심장 조직 중에서 선택되는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    조직이 뉴런, 신장 또는 간 조직인 방법.
  35. 대상체에게 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  36. 대상체에서 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    질환이 신경학적, 눈 또는 간 질환인, 방법, 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서,
    신경학적 질환이 신경퇴행성 질병인, 방법, 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물.
  39. 제 37 항에 있어서,
    눈 질환이 녹내장, 망막색소변성증, 황반변성, 망막분리 또는 당뇨성 망막병증인, 방법, 재조합 AAV 벡터 또는 약학 조성물.
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