TW202317769A - 來自腺相關病毒血清型９（ａａｖ９）的分離的修飾衣殼蛋白ｖｐ１、基於其的衣殼和載體 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及基因療法和分子生物學領域。更具體地，本發明涉及來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的分離的修飾衣殼蛋白VP1、基於上述VP1的衣殼和載體以及其用途，所述分離的修飾衣殼蛋白VP1與野生型AAV9衣殼蛋白VP1相比，包含一個或多個胺基酸取代，這些取代提高了基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體的產生(組裝)效率。

Description

來自腺相關病毒血清型９（ＡＡＶ９）的分離的修飾衣殼蛋白ＶＰ１、基於其的衣殼和載體
本申請涉及基因療法和分子生物學領域。更具體地，本發明涉及來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的分離的修飾衣殼蛋白VP1、基於上述VP1的衣殼和載體以及其用途，所述分離的修飾衣殼蛋白VP1與野生型AAV9衣殼蛋白VP1相比，包含一個或多個胺基酸取代，這些取代提高了基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體的產生(組裝)效率。
腺相關病毒(AAV)是一種小的(25 nm)、自主複製缺陷的無包膜病毒。已經在人和靈長類中描述了許多不同的AAV血清型。腺相關病毒基因組由長度約為4,700個核苷酸的(+或-)單鏈DNA (ssDNA)構成。在基因組DNA分子的末端容納有反向末端重複(ITR)。基因組包含兩個開放閱讀框(ORF)：Rep和Cap，其包含編碼各種蛋白產物的幾個替代閱讀框。rep產物對於AAV複製至關重要，而三種衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)以及其他替代產物由Cap基因編碼。VP1、VP2和VP3蛋白以1:1:10的比例存在，以形成二十面體衣殼(Xie Q.等人The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410)。在重組AAV (rAAV)載體產生期間，將側翼有ITR的表現盒包裝到AAV衣殼中。AAV複製所需的基因不包括在盒中。重組AAV被認為是用於體內基因轉移的最安全和最廣泛使用的病毒載體之一。載體可以感染多種組織類型的細胞，以提供強且持續的轉殖基因表現。它們也是非致病性的，並且具有低免疫原性概況(High KA等人, "rAAV human trial experience" Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57)。 在開發有效的基因療法領域中研究的緊迫目的之一是優化載體以改善給定載體的某些特性。 各種AAV血清型的特徵是對不同宿主細胞表面受體的親和力，它們對這些受體具有向性。因此，AAV2的主要已知受體是硫酸乙醯肝素蛋白多糖，共受體是整合素異二聚體aVβ5、成纖維細胞生長因子受體1型和肝細胞生長因子受體c-Met。AAV12與硫酸乙醯肝素蛋白多糖和唾液酸結合。AAV4和AAV5分別與N-和O-連接的唾液酸結合。AAV5啟動血小板源性生長因子受體。此外，已經在AAV衣殼蛋白的胺基酸序列與其組裝過程、基因組的包殼化、對宿主細胞表面上所展示的不同類型受體的親和力之間建立了關係(Govindasamy L.等人. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct;87(20):11187-99)。 國際申請WO2012145601描述了具有變體衣殼蛋白的腺相關病毒(AAV)病毒粒子，其中與野生型AAV相比，當通過玻璃體內注射施用時，所述AAV病毒粒子表現出更大的視網膜細胞感染性。 國際申請WO2013158879描述了用於向受試者遞送異源核酸序列的腺相關病毒(AAV)載體，所述載體包含含有一個或多個離氨酸取代的衣殼蛋白VP1，其中一個離氨酸取代為K137R，其中所述離氨酸取代對抑制所述衣殼蛋白的泛素化有效，從而提高了所述AVV載體在靶標細胞中的轉導效率。 迄今為止，需要高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，即需要有效產生包含轉殖基因的基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的病毒載體(包殼異源核酸)。
本發明的作者出乎意料地發現，當與基於野生型rAAV9 (無下述突變)的包殼病毒載體的組裝相比，野生型AAV9衣殼蛋白VP1中一個或多個胺基酸取代的存在引起基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體的高效產生(組裝)，所述胺基酸取代選自： F422W， F422W和Y446F， I601M， 即當與基於野生型rAAV9 (無上述突變)的包殼病毒載體的組裝相比，在AAV9衣殼中包含上述修飾的基於rAAV9的包殼病毒載體的組裝導致含有轉殖基因的基於rAAV9的病毒載體(包殼異源核酸)的產生顯著更為頻繁。 發明的簡要描述在一個方面，本發明涉及一種來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的分離的修飾衣殼蛋白VP1，其用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，所述分離的修飾衣殼蛋白VP1包含由 Cap基因編碼的野生型AAV9衣殼蛋白VP1的胺基酸序列，所述胺基酸序列具有一個或多個選自以下的取代： F422W， F422W和Y446F， I601M， 其中野生型AAV9衣殼蛋白VP1胺基酸序列具有由SEQ ID NO: 1表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含在F422W位的取代。 在一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有由SEQ ID NO: 2表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含取代F422W和Y446F。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有由SEQ ID NO: 3表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含取代I601M。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有由SEQ ID NO: 4表示的胺基酸序列。 在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種，所述修飾衣殼蛋白VP1用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F422W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 6的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F422W和Y446F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 7的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代I601M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 8的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 在一個方面，本發明涉及一種分離的衣殼，其用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，所述分離的衣殼包含上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種、AAV9衣殼蛋白VP2或其修飾變體以及AAV9衣殼蛋白VP3或其修飾變體。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括野生型AAV9衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括具有由SEQ ID NO: 9表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W並且具有由SEQ ID NO: 10表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W和Y309F。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W和Y309F並且具有由SEQ ID NO: 11表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代I464M。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代I464M並且具有由SEQ ID NO: 12表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括野生型AAV9衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括具有由SEQ ID NO: 17表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W並且具有由SEQ ID NO: 18表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W和Y244F。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W和Y244F並且具有由SEQ ID NO: 19表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代I399M。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代I399M並且具有由SEQ ID NO: 20表示的胺基酸序列。 在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述衣殼的任一種，所述衣殼用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體。 在一個方面，本發明涉及一種用於向受試者遞送異源核酸序列的基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含： 1) 上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種或上述衣殼的任一種，和 2) 異源核酸序列，其包含在靶標細胞中促進由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列。 在本發明的一些實施方案中，rAAV9載體包括包含提供產物表現的調節序列的異源核酸序列，其中異源核酸序列的表現產物是治療性多肽或報告多肽。 在一個方面，本發明涉及一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的藥物組合物，其包含： a) 上述rAAV9載體的任一種；和 b) 藥學上可接受的賦形劑。 在一個方面，本發明涉及一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的方法，其包含向受試者施用上述rAAV9載體的任一種或上述藥物組合物。 在一個方面，本發明涉及上述rAAV9載體的任一種或上述藥物組合物用於治療有需要的受試者的疾病的用途。 在所述用途的一些實施方案中，疾病選自：血液疾病、中樞神經系統疾病、代謝疾病、肌肉疾病、遺傳疾病。 在一個方面，本發明涉及一種用於產生上述rAAV9載體的任一種的方法，其包含分別用以下轉染生產細胞：上述包含編碼來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的序列的核酸的任一種或上述編碼衣殼的核酸。
定義和一般方法除非本文另有定義，與本發明有關的所有技術和科學術語將具有與本領域技術人員通常所理解的相同的含義。 此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數術語，並且複數術語應包括單數術語。典型地，本文所述的細胞培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、有機合成化學、醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸的雜交和化學的現有分類和方法是技術人員所熟知並且在本領域廣泛使用的。如本領域中常見的，或如本文所述，酶反應和純化方法根據製造商的指南進行。 "分離的"意為自天然狀態改變或去除。例如，天然存在於活生物體中的核酸或肽不是"分離的"，但與其天然狀態的共存材料部分或完全分離的相同核酸或肽是"分離的"。分離的核酸或蛋白可以基本上以純化的形式存在，或者可以存在於非天然環境中，諸如例如遺傳修飾細胞。 術語"天然存在的"、"天然的"或"野生型"用於描述可以在自然界中找到的與人工產生的不同的物件。例如，可以從自然界的來源中分離出來並且未經實驗室人員有意修改的存在於生物體(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列是天然存在的。 術語"基因組"是指生物體的完整遺傳物質。 除非上下文另有規定，如在本描述和隨後的申請專利範圍中使用的，詞語"包括"和"包含"或其變體(諸如"具有"、"包括(includes)"、"包括(including)"、"包含(comprises)"或"包含(comprising)")將理解為含有指定的整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組的意思。 蛋白 ( 肽 )如在本描述中使用的，術語"肽"、"多肽"和"蛋白"可互換使用，並且它們是指由通過肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可以構成蛋白序列或肽序列的胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括包含通過肽鍵相互連接的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白。如本描述中所使用的，該術語是指短鏈(其在本領域中通常也被稱為例如肽、寡肽和寡聚物)和較長鏈(其在本領域中一般被稱為蛋白，其有許多類型)兩者。"多肽"尤其包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。 核酸分子在本描述中可互換使用的術語"核酸"、"核酸序列(nucleic sequence)"、"核酸序列(nucleic acid sequence)"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核苷酸序列"意為修飾或未修飾的核苷酸精確序列，其決定核酸的片段或區域、含有或不含非天然核苷酸以及是雙鏈DNA或RNA、單鏈DNA或RNA或所述DNA的轉錄產物。 如本描述中使用的，作為非限制性實例，多核苷酸包括通過本領域可用的任何手段獲得的所有核酸序列，作為非限制性實例，所述手段包括重組手段，即使用普通的選殖技術和PCR等，從重組文庫或細胞基因組中選殖核酸序列，以及通過合成手段。 此處還應包括，本發明不涉及在其天然染色體環境中(即在天然狀態中)的核苷酸序列。本發明的序列已經經過分離和/或純化，即它們通過例如複製被直接或間接地取樣，它們的環境已經被至少部分地修改。因此，這裡還應提及通過重組遺傳學例如通過宿主細胞獲得，或通過化學合成獲得的分離的核酸。 除非另有指示，術語核苷酸序列包括其互補物。因此，具有特定序列的核酸應理解為包括具有其互補序列的其互補鏈的核酸。 腺相關病毒 (AAV)細小病毒科(Parvoviridae family)的病毒是小的含有DNA的動物病毒。細小病毒科可以分為兩個亞科：細小病毒亞科(Parvovirinae)(其成員感染脊椎動物)和濃核病毒亞科(Densovirinae)(其成員感染昆蟲)。到2006年，已有11種腺相關病毒的血清型被描述(Mori, S.等人, 2004, "Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein", Virology, Т. 330 (2): 375-83)。所有已知的血清型都可以感染來自多種組織類型的細胞。組織特異性由衣殼蛋白血清型決定，因此，通過分配所期望的血清型來構建基於腺相關病毒的載體。細小病毒和細小病毒科的其他成員進一步的資訊在文獻(Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication»,病毒學領域(Fields Virology)中的第69章(1996年第三版))中描述。 所有已知AAV血清型的基因組組織非常相似。AAV的基因組是長度小於約5000個核苷酸(nt)的線性、單鏈DNA分子。反向末端重複(ITR)在對病毒生命週期至關重要的蛋白(Rep)的獨特編碼核苷酸序列以及重疊衣殼蛋白(Cap)的序列的側翼。Cap基因編碼形成衣殼的VP蛋白(VP1、VP2和VP3)以及AAP (啟動腺相關病毒 (AAV)組裝的蛋白)(Sonntag F, Köther K, Schmidt K, 等人 The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2011;85(23):12686-12697. doi:10.1128/JVI.05359-11)和MAAP (膜相關輔助蛋白)(Ogden PJ, Kelsic ED, Sinai S, Church GM. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 2019;366(6469):1139-1143. doi:10.1126/science.aaw2900)。長度為145個核苷酸的AAV基因組側翼序列是自身互補的，並且其被組織以使得可以形成能量穩定的分子內雙鏈體，該雙鏈體形成T形髮夾。這類髮夾結構起病毒DNA複製起點的功能，充當細胞DNA聚合酶複合物的引子。哺乳動物細胞中野生型AAV (wtAAV)感染後，Rep基因(例如Rep78和Rep52)分別使用P5啟動子和P19啟動子表現，並且兩種Rep蛋白在病毒基因組的複製中均具有一定的功能。Rep開放閱讀框(Rep ORF)中的剪接事件導致實際上四種Rep蛋白(例如Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表現。然而，已經證明編碼Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以在哺乳動物細胞中產生AAV載體。 基於重組腺相關病毒 (rAAV) 的載體如本文使用的術語"載體"意為能夠轉運與其連接的另一核酸的核酸分子。此外，本文中術語"載體"是指能夠轉運核酸的病毒顆粒。 如本描述中使用的，術語"表現"定義為由其啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄和/或轉譯。 用途"基因療法"是將基因插入到受試者的細胞和/或組織中以治療疾病(典型地為遺傳疾病)，其中用功能等位基因替換有缺陷的突變等位基因。 "治療(treat)"、"治療(treating)"和"治療(treatment)"是指減輕或消除生物學病症和/或至少一種其伴隨症狀的方法。此外，本文中提及"治療"包括提及治癒性、姑息性和預防性治療。 在一個方面，治療的受試者或患者是哺乳動物，優選人受試者。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 術語"病症"意為將受益於根據本發明的治療的任何狀況。 "疾病"是受試者的健康狀態，其中受試者不能維持體內平衡，並且其中如果疾病沒有得到改善，則受試者的健康繼續惡化。 術語"受試者"、"患者"、"個體"等在本描述中可互換使用，並且它們是指適用本描述中所述方法的任何動物。在某些非限制性實施方案中，受試者、患者或個體是人。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 來自腺相關病毒血清型 9 (AAV9) 的分離的修飾衣殼蛋白 VP1在一個方面，本發明涉及一種來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的分離的修飾衣殼蛋白VP1，其用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，所述分離的修飾衣殼蛋白VP1包含由 Cap基因編碼的野生型AAV9衣殼蛋白VP1的胺基酸序列，所述胺基酸序列具有一個或多個選自以下的取代： F422W， F422W和Y446F， I601M， 其中野生型AAV9衣殼蛋白VP1胺基酸序列具有胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 1)。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含在F422W位的取代。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 2)。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含取代F422W和Y446F。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 3)。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1包含取代I601M。 在本發明的一些實施方案中，分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1具有胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGMLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 4)。 來自腺相關病毒血清型 9 (AAV9) 的分離的修飾衣殼蛋白 VP2 和 VP3腺相關病毒基因組DNA的(+)-鏈的"右側"包含編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的重疊序列。這些基因的轉錄從單一啟動子p40開始。相應蛋白的分子量分別為87 kDa、72 kDa和62 kDa。所有這三種蛋白都轉譯自單一的mRNA。轉錄後，前mRNA可以以兩種不同的方式剪接，其中較長或較短的內含子被切除以形成長度為2300個或2600個核苷酸的mRNA。 因此，將突變引入到 Cap基因中將不僅影響AAV9衣殼蛋白VP1，還影響AAV9衣殼蛋白VP2和VP3。 圖7是顯示AAV9衣殼的結構蛋白在AAV Cap基因序列中的位置的圖示： 1-737 aa - VP1， 138-737 aa - VP2， 203-737 aa - VP3。 考慮到重疊序列編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，VP1中的胺基酸取代F422W將對應於： VP2中在F285W位的胺基酸取代； VP3中在F220W位的胺基酸取代。 考慮到重疊序列編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，VP1中的胺基酸取代Y446F將對應於： VP2中在Y309F位的胺基酸取代； VP3中在Y244F位的胺基酸取代。 考慮到重疊序列編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，胺基酸取代I601M將對應於： VP2中在I464M位的胺基酸取代； VP3中在I399M位的胺基酸取代。 此外，申請人認為通過指示VP1/VP2/VP3中包括所述突變的短胺基酸序列來指定已發現的突變的環境是適當的： 對於VP1中的F422W (VP2中的F285W/VP3中的F220W)：NVP WHSS； 對於VP1中的Y446F (VP2中的Y309F/VP3中的Y244F)：YLY FLSK； 對於VP1中的I601M (VP2中的I464M/VP3中的I399M)：NQG MLPG。 在一些實施方案中，野生型AAV9衣殼蛋白VP2的胺基酸序列具有由以下表示的胺基酸序列： TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 9)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W並且具有由以下表示的胺基酸序列： TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 10)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W和Y309F。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W和Y309F並且具有由以下表示的胺基酸序列： TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 11)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代I464M。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代I464M並且具有由以下表示的胺基酸序列： TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGMLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 12)。 在本發明的一些實施方案中，野生型AAV9衣殼蛋白VP3具有由以下表示的胺基酸序列： MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 17)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W並且具有由以下表示的胺基酸序列： MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 18)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W和Y244F。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W和Y244F並且具有由以下表示的胺基酸序列： MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPWHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 19)。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代I399M。 在本發明的一些實施方案中，修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代I399M並且具有由以下表示的胺基酸序列： MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGMLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO: 20)。 衣殼在一個方面，本發明涉及一種分離的衣殼，其用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，所述分離的衣殼包含上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種、AAV9衣殼蛋白VP2或其修飾變體以及AAV9衣殼蛋白VP3或其修飾變體。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括野生型AAV9衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括具有由SEQ ID NO: 9表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W並且具有由SEQ ID NO: 10表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W和Y309F。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代F285W和Y309F並且具有由SEQ ID NO: 11表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代I464M。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP2，其包含取代I464M並且具有由SEQ ID NO: 12表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括野生型AAV9衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括具有由SEQ ID NO: 17表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W並且具有由SEQ ID NO: 18表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W和Y244F。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代F220W和Y244F並且具有由SEQ ID NO: 19表示的胺基酸序列。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代I399M。 在本發明的一些實施方案中，分離的衣殼包括修飾AAV9衣殼蛋白VP3，其包含取代I399M並且具有由SEQ ID NO: 20表示的胺基酸序列。 分離的核酸在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種，所述修飾衣殼蛋白VP1用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F422W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 6的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F422W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 6的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F422W和Y446F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 7的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F422W和Y446F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 7的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代I601M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1，並且由具有SEQ ID NO: 8的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代I601M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 8的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在一個方面，本發明涉及一種分離的衣殼，其用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，所述分離的衣殼包含上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種。 在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F285W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2，並且由具有SEQ ID NO: 14的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F285W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 14的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F285W和Y309F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2，並且由具有SEQ ID NO: 15的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F285W和Y309F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 15的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代I464M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2，並且由具有SEQ ID NO: 16的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代I464M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP2的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 16的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 12的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F220W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3，並且由具有SEQ ID NO: 22的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F220W的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 22的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 18的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代F220W和Y244F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3，並且由具有SEQ ID NO: 23的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代F220W和Y244F的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 23的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 19的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在本發明的一些實施方案中，分離的核酸編碼具有胺基酸取代I399M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3，並且由具有SEQ ID NO: 24的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。 "編碼具有胺基酸取代I399M的來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP3的相應胺基酸序列的其他序列"意為可替代具有SEQ ID NO: 24的核酸序列的核酸序列，因為由於遺傳密碼的簡併性，所以許多不同的DNA序列可以編碼本文公開的如SEQ ID NO: 20的胺基酸序列。產生這些編碼相同胺基酸序列的替代DNA序列完全在本領域受過訓練的人員技術範圍內。這類變體DNA序列在本發明的範圍內。 在一個方面，本發明涉及一種分離的核酸，其編碼上述衣殼的任一種，所述衣殼用於高效產生(組裝)基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體。 在一些實施方案中，編碼上述衣殼的分離的核酸包括上述核酸序列的任一種。 重組腺相關病毒血清型 9 (rAAV9) 載體在一個方面，本發明涉及一種用於向受試者遞送異源核酸序列的基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含： 1) 上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種或上述衣殼的任一種，和 2) 異源核酸序列，其包含在靶標細胞中促進由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列。 在一個方面，本發明涉及一種用於向受試者遞送異源核酸序列的基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含： 1) 上述來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的任一種，和 2) 異源核酸序列，其包含在靶標細胞中促進由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列。 在一個方面，本發明涉及一種用於向受試者遞送異源核酸序列的基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含： 1) 上述衣殼的任一種，和 2) 異源核酸序列，其包含在靶標細胞中促進由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列。 如本描述中使用的術語"基於重組腺相關病毒血清型9的載體"、"基於AAV9的重組病毒"、"基於AAV9的病毒樣顆粒"、"重組病毒AAV9株"、"重組AAV9載體"或"基於rAAV9的載體"具有相同的含義。 在本發明的一些實施方案中，rAAV9包括包含提供產物表現的調節序列的異源核酸序列，其中異源核酸序列的表現產物是治療性多肽或報告多肽。 根據本發明的rAAV載體不包含編碼對病毒生命週期至關重要的蛋白(Rep)序列以及重疊衣殼蛋白(Cap)序列的基因的核苷酸序列。 在本描述的上述部分中詳細地表徵了衣殼。 如本發明使用的，"在靶標細胞中提供由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列"意為影響選殖有它們的編碼序列的表現和加工所必需的多核苷酸序列。表現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列、有效的RNA加工信號(諸如剪接)和多聚腺苷酸化信號、穩定細胞質mRNA的序列、增加轉譯效率的序列(即Kozak共有序列)、增加蛋白穩定性的序列以及當需要時，增加蛋白分泌的序列。這類控制序列的性質取決於宿主生物體而不同，在原核生物中，這類控制序列一般包括核糖體結合位點的啟動子和轉錄終止序列，在真核生物中，這類控制序列典型地包括啟動子和轉錄終止序列。術語"調節序列"至少包括其存在對於表現和加工至關重要的所有組分，並且還可以包括其存在是有利的另外的組分，例如前導肽序列。 如在本描述中使用的，術語"啟動子"是指控制一個或多個編碼序列的轉錄的核酸片段，並且其在結構上通過DNA依賴性RNA聚合酶的結合位點、轉錄起始位點和任何其他DNA序列(包括但不限於轉錄因子結合位點、阻遏蛋白結合位點和啟動蛋白結合位點以及本領域技術人員已知的直接或間接地與所述啟動子一起調節轉錄水準的任何其他核苷酸序列)的存在來鑒定。"組成型"啟動子是在典型的生理和發育條件下在大多數組織中有活性的啟動子。"誘導型"啟動子是受到生理或發育調節(例如在化學誘導劑的影響下)的啟動子。"組織特異性"啟動子僅在特定類型的組織或細胞中是有活性的。 用於在真核細胞中，並且特別是在哺乳動物細胞中高水準產生多肽的啟動子應該是強的，並且優選在各式各樣的細胞類型中有活性。能夠在許多細胞類型中驅動表現的強組成型啟動子在本領域中是眾所周知的，並且因此本文中沒有必要對其進行詳細描述。根據本發明的思想，優選使用巨細胞病毒(CMV)啟動子。源自人巨細胞病毒(hCMV)的即刻早期(IE)區域的啟動子或啟動子/增強子特別適合作為本發明的rAAV9載體的啟動子。例如，人巨細胞病毒(hCMV)即刻早期(IE)區域以及源自其的功能表現誘導片段和/或功能表現增強片段已經在ЕР0173177和ЕР0323997中公開，並且在本領域中是眾所周知的。因此，可以將hCMV即刻早期(IE)區域的幾個片段用作啟動子和/或啟動子/增強子。 如本文使用的"增強子(enhancers)"或"增強子(enhancer)"可以指與編碼重組產物的DNA序列相鄰定位的DNA序列。增強子元件典型地位於啟動子元件的5'方向，或者可以在編碼DNA序列(例如轉錄或轉譯為重組產物的DNA序列)的下游或內部定位。因此，增強子元件可以在編碼重組產物的DNA序列的上游或所述序列的下游的100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多鹼基對處定位。增強子元件可以提高表現自DNA序列的重組產物的量至高於與單個啟動子元件相關的表現水準。本領域的普通技術人員容易得到多種增強子元件。 在本發明的一些實施方案中，包含在靶標細胞中提供由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列的異源核酸序列可以在5'-末端至3'-末端方向包括以下元件： 左側(第一) ITR (反向末端重複)； CMV (巨細胞病毒)增強子； CMV (巨細胞病毒)啟動子； hBG1基因(血紅蛋白γ1亞基基因)的內含子； 編碼產物的核酸； hGH1多聚腺苷酸化信號(人生長激素基因多聚腺苷酸化信號)； 右側(第二) ITR。 在一些實施方案中，編碼產物的核酸(轉殖基因)為至少一種編碼蛋白的基因。在一些實施方案中，轉殖基因編碼至少一種小的抑制性核酸。在一些實施方案中，轉殖基因編碼至少一種報告分子。在一些實施方案中，小的抑制性核酸是miRNA。在一些實施方案中，小的抑制性核酸是海綿miRNA或TuD-RNA，其抑制動物中至少一種miRNA的活性。在一些實施方案中，miRNA在靶標組織的細胞中表現。在一些實施方案中，靶標組織是肝、中樞神經系統(CNS)、眼、胃腸道、呼吸道、乳房、胰腺、泌尿道的組織或子宮組織。 在一些實施方案中，rAAV9載體具有異源核酸序列的表現產物，其為治療多肽或報告多肽。 在一些實施方案中，rAAV9載體包含編碼產物治療性多肽的異源核酸序列，其中治療性多肽是選自因子VIII (Factor VIII)、因子IX (Factor IX)或其功能變體的凝血因子。 在一些實施方案中，rAAV9載體包含編碼產物因子VIII或其功能變體的異源核酸序列。 在一些實施方案中，rAAV9載體包含編碼產物因子IX或其功能變體的異源核酸序列。 在一些實施方案中，rAAV9載體包含編碼產物SMN1蛋白(運動神經元存活蛋白)的異源核酸序列。 在一些實施方案中，rAAV9載體包含編碼產物SARS-cov2 (嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2)的RBD-S多肽(S糖蛋白的重組受體結合結構域)的異源核酸序列。 藥物組合物在一個方面，本發明涉及一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的藥物組合物，其包含： a) 上述rAAV9載體的任一種；和 b) 藥學上可接受的賦形劑。 在一些實施方案中，藥物組合物用於向有需要的人遞送基因產物。 在特定的實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含在藥學上可接受的載體或其他藥用劑(medicinal agent)、藥劑(pharmaceutical agent)、載體、佐劑、稀釋劑等中的本發明的rAAV9病毒顆粒。對於注射，載體將典型地為液體載體。對於其他給藥方法，載體可以是固體或液體，諸如無菌無熱原水或無菌無熱原磷酸鹽緩衝鹽水溶液。對於吸入給藥，載體是可吸入的，並且優選以固體或液體顆粒形式。作為注射介質，優選使用含有注射溶液常用的添加劑(諸如穩定劑、鹽或鹽水和/或緩衝液)的水。 在其他實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含在藥學上可接受的載體或其他藥用劑、藥劑、載體、佐劑、稀釋劑等中的細胞，其中rAAV9載體整合到基因組中。 "藥物組合物"意為包含本發明的上述rAAV9載體和至少一種選自以下的組分的組合物：藥學上可接受的以及藥理學相容的賦形劑，諸如填充劑、溶劑、稀釋劑、載體、助劑、分佈劑、遞送劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、助懸劑、增稠劑、延長遞送控制劑，其選擇和比例取決於給藥的類型和路徑以及劑量。本發明的藥物組合物及其製備方法對本領域的技術人員而言將無疑是顯而易見的。藥物組合物應優選按照GMP (藥品生產品質管制規範(Good Manufacturing Practice))要求製造。組合物可以包含緩衝液組合物、張力劑、穩定劑和增溶劑。 "藥學上可接受的"意為不具有生物學或其他負面副作用的材料，例如可以施用給受試者而不引起任何不期望的生物學作用的材料。因此，這類藥物組合物可以用於例如離體轉染細胞或將病毒顆粒或細胞體內直接施用給受試者。 本文使用術語"賦形劑"來描述除了本發明的上述成分之外的任何成分。這些成分是無機或有機性質的物質，其在藥物生產/製造中使用以給予藥物產品必要的理化特性。 "穩定劑"是指提供活性劑的物理和/或化學穩定性的賦形劑或兩種或更多種賦形劑的混合物。 術語"緩衝液"、"緩衝液組合物"、"緩衝劑"是指能夠通過其酸鹼共軛組分的作用抵抗pH的變化的溶液，其使rAAV9載體產物能夠抵抗pH的變化。一般而言，藥物組合物優選具有在4.0至8.0的範圍中的pH。所使用的緩衝液的實例包括但不限於乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽等緩衝液溶液。 如果活性劑在例如2-8℃的貯存溫度下在指定的保存期限期間保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性，則藥物組合物是"穩定的"。優選地，活性劑保持物理和化學穩定性兩者以及生物學活性。貯存期基於在加速或自然老化條件下的穩定性測試的結果進行調整。 根據本發明的藥物組合物可以以現成製劑的形式以單一單位劑量或多個單一單位劑量的形式製造、包裝或廣泛銷售。如本文使用的術語"單一單位劑量"是指含有預定量的活性成分的離散量的藥物組合物。活性成分的量典型地等於待在受試者中施用的活性成分的劑量或該劑量的方便部分，例如該劑量的一半或三分之一。 用於遞送基因產物的方法在一個方面，本發明涉及一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的方法，其包含向受試者施用上述rAAV9載體的任一種或上述藥物組合物。 受試者是指任何適用本描述中提供的技術的活生物體。在某些非限制性實施方案中，受試者是人。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 本領域公認的用於施用rAAV9載體的任何方法均可適用於本發明的上述rAAV9載體。 示例性的給藥方式包括局部應用、鼻內、吸入、經黏膜、經皮、腸內(例如口服、直腸)、腸胃外(例如靜脈內、皮下、皮內、肌內)給藥，以及直接組織或器官注射。 可以以常規形式，作為液體溶液或懸浮液、適合用於在注射前在液體中製備溶液或懸浮液的固體形式或作為乳劑製備注射劑。備選地，可以以局部而不是全身的方式(例如以儲庫(depot)製劑或緩釋製劑)施用本發明的上述基於AAV9的重組病毒。 將基於AAV9的重組病毒以有效量引入到生物體中。優選將基於AAV9的重組病毒以生物有效量引入到生物體中。重組病毒的"生物有效"量是足以引起感染(或轉導)以及細胞中核酸序列的表現的量。如果在體內將病毒施用給細胞(例如，如下所述，將病毒施用給受試者)，那麼病毒載體的"生物有效"量是足以引起轉導和靶標細胞中核酸序列的表現的量。 施用本發明的上述基於AAV9的重組病毒的細胞可以是任何類型的細胞，包括但不限於運動神經元或神經系統的其他組織、上皮細胞(例如皮膚、呼吸道和腸道上皮細胞)、肝細胞、肌肉細胞、胰腺細胞(包括胰島細胞)、肝細胞、脾細胞、成纖維細胞、內皮細胞等。 本發明的上述基於AAV9的重組病毒不用於修飾人生殖系細胞的遺傳完整性。 用途在一個方面，本發明涉及上述rAAV9載體的任一種或上述藥物組合物用於治療有需要的受試者的疾病的用途。 在該用途的一些實施方案中，疾病選自：血液疾病、中樞神經系統疾病、代謝疾病、肌肉疾病、遺傳疾病。 受試者是指適用本描述中提供的技術的任何動物。在某些非限制性實施方案中，受試者是人。所述受試者可以是任何年齡的雄性或雌性。 可以通過本領域已知的用於施用病毒載體的任何手段向有需要的人受試者或動物施用本發明的rAAV9載體。 示例性的給藥方式包括局部應用、鼻內、吸入、經黏膜、經皮、腸內(例如口服、直腸)、腸胃外(例如靜脈內、皮下、皮內、肌內)給藥，以及直接組織或器官注射。 可以以常規形式，作為液體溶液或懸浮液、適合用於在注射前在液體中製備溶液或懸浮液的固體形式或作為乳劑製備注射劑。備選地，可以以局部而不是全身的方式(例如以儲庫製劑或緩釋製劑)施用本發明的上述基於AAV9的重組病毒。 在該用途的一些實施方案中，疾病選自：血液疾病、中樞神經系統疾病、代謝疾病、肌肉疾病、遺傳疾病。 在該用途的一些實施方案中，疾病是血液疾病。 在該用途的一些實施方案中，疾病是肌肉疾病。 在該用途的一些實施方案中，疾病是遺傳疾病。 在該用途的一些實施方案中，異源核酸序列的表現產物是因子IX或其功能變體。 在該用途的一些實施方案中，異源核酸序列的表現產物是因子VIII或其功能變體。 在該用途的一些實施方案中，異源核酸序列的表現產物是SMN1蛋白(運動神經元存活蛋白)。 在該用途的一些實施方案中，異源核酸序列的表現產物是SARS-cov2 (嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2)的RBD-S多肽(S糖蛋白的重組受體結合結構域)。 在該用途的一些實施方案中，上述rAAV9載體的任一種或上述藥物組合物以治療有效量使用。 "治療有效量"理解為意為足以減輕(例如緩和、降低、減少)與疾病狀態相關的症狀的至少一種的量。或者說，"治療有效"量是足以對受試者的狀況提供一些改善的量。 本發明的上述基於AAV9的重組病毒的劑量將取決於給藥方式、特定的病毒載體，並且它們可以以常規的方式來確定。用於達到治療作用的示例性劑量為每公斤至少約10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14、10 15、10 16個轉導單位或更多，優選約10 9至10 15個轉導單位，更優選10 14個轉導單位的病毒力價。 因此，本發明的基於AAV9的重組病毒、試劑和方法可用於將核酸引導至分裂或非分裂細胞，並在其中穩定表現異源核酸。使用該載體系統，現在可以在體內條件下將編碼影響細胞生理的蛋白的基因引入到細胞中。因此本發明的載體可用於疾病狀態的基因療法。 一般而言，本發明可用於遞送具有生物學作用的任何外源核酸以治療或改善與任何基因表現相關的病症有關的症狀。示例性的疾病狀態包括但不限於：囊性纖維化(和其他肺部疾病)、血友病A、血友病B、地中海貧血、貧血和其他凝血障礙、AIDs、阿滋海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化症、癲癇和其他神經系統障礙、糖尿病、肌營養不良(例如Duchenne、Becker、脊髓性肌萎縮症(SMA))、高雪氏病(Gaucher disease)、胡爾勒氏病(Hurler's disease)、腺苷脫胺酶缺乏症、糖原沉積病和其他代謝缺陷、實體器官(例如腦、肝、腎、心臟)疾病等。 基因轉移在理解疾病狀態和提供疾病狀態的治療方面具有實質的潛在用途。有許多遺傳疾病，其缺陷基因是已知的並且已被選殖。在某些情況下，這些選殖的基因的功能是已知的。一般來說，上述疾病狀態分為兩類：缺乏狀態，典型地為酶缺乏，其一般以隱性方式遺傳，以及不平衡狀態，有時至少涉及調節蛋白或結構蛋白，其以顯性方式遺傳。對於缺乏狀態的疾病，基因轉移可用於將正常基因帶入受影響的組織用於替代療法。對於不平衡疾病狀態，基因轉移可用於在模型系統中產生疾病狀態，其然後可用於嘗試消解疾病狀態。因此，本發明的方法允許治療遺傳疾病。根據本發明，疾病狀態通過部分或全部補救引起疾病或使其更嚴重的缺乏或失衡來治療。也可以使用核酸序列的位點特異性整合來誘導突變或糾正缺乏。 用於產生 rAAV9 載體的方法在一個方面，本發明涉及一種用於產生上述rAAV9載體的任一種的方法，其包含分別用以下轉染生產細胞：上述包含編碼來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的修飾衣殼蛋白VP1的序列的核酸的任一種或上述編碼衣殼的核酸。 衣殼蛋白可以表現自穩定整合了主題修飾AAV衣殼的基因或編碼序列的重組病毒、表現載體或細胞系。此外，本發明提供在體外由AAV衣殼蛋白產生具有所述突變的AAV衣殼以及在體外構建包裝的衣殼。本發明進一步提供修飾AAV衣殼的產生，該修飾AAV衣殼已經過遺傳工程化以表現臨床上顯著的抗原的異源表位以引發免疫反應。 用於產生rAAV9載體的方法已在實施例部分詳細描述。 轉殖基因動物根據本公開的一些方面，所提供的是用於產生體細胞轉殖基因動物模型的方法。在一些實施方案中，該方法包含向非人動物施用上述rAAV的任一種，其中rAAV包含至少一種轉殖基因，並且其中rAAV感染非人動物靶標組織的細胞。 在一些實施方案中，可以使用主題衣殼變體來產生體細胞轉殖基因動物模型，其包含向非人動物施用上述rAAV的任一種，其中rAAV包含至少一種轉殖基因。在一些實施方案中，轉殖基因是至少一種編碼蛋白的基因。在一些實施方案中，轉殖基因編碼至少一種小的抑制性核酸。在一些實施方案中，轉殖基因編碼至少一種報告分子。 體細胞轉殖基因動物模型可以是哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬、非人靈長類。 在一些實施方案中，可以將推定的治療劑施用給體細胞轉殖基因動物模型以確定推定的治療劑對動物疾病狀態的影響。 實施例為了更好地理解本發明，提供以下實施例。這些實施例僅用於說明的目的，並且不應解釋為以任何方式限制本發明的範圍。 本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均通過引用併入本文。儘管為了清楚理解的目的，已經通過說明和實例對前述發明進行了一些詳細的描述，但是根據本發明的教式，可以在不背離所附實施方案的精神或範圍的情況下對其做出某些改變和修改，這對於本領域的普通技術人員而言將是顯而易見的。 材料和一般方法 重組 DNA 技術如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012中所述，使用標準方法操作DNA。根據製造商的方案使用分子生物學試劑。 基因合成所需的基因段製備自由化學合成製造的寡核苷酸。長度為300 bp-4,000 bp的基因段側翼有單個限制性位點，其通過寡核苷酸的退火和連接(包括PCR擴增)組裝，並隨後通過特定的限制性位點進行選殖。通過DNA測序確認次選殖基因片段的DNA序列。 DNA 序列確定通過Sanger測序確定DNA序列。 DNA 和蛋白序列分析以及序列資料處理SnapGene套裝軟體版本5.1.4.1用於序列創建、圖譜繪製(mapping)、分析、注釋和說明。 統計資料分析結果指示為平均值±標準差(SD)，方差分析(ANOVA)用於比較測試和對照結果並確定它們是統計學上顯著的。 實施例 1. rAAV9 衣殼變體文庫的產生rAAV9衣殼變體文庫是通過Cap基因序列的隨機誘變(Davidsson M.等人, 2016)產生的。簡而言之，從頭組裝血清型9的Cap基因的野生型序列(GenBank ID AY530579.1)，其後使用尿嘧啶-DNA糖基化酶將合成的野生型AAV9衣殼核苷酸序列片段化，使用不具有校對活性的DNA聚合酶將所得片段組裝成全長Cap基因(作為結果，序列中出現隨機突變)。將全長突變變體選殖到載體質體pAAV-linker (圖1)中的AscI/EcoRI限制性位點處，與綠色螢光蛋白(GFP)處於共同閱讀框中，從而產生多樣化的隨機rAAV9衣殼文庫，其後使用該文庫來選擇具有提高的組裝效率和/或轉導活性的衣殼變體。 在U-87 MG細胞上對表現出提高的組裝效率的病毒顆粒進行體外陽性選擇。此外，對於轉導，我們使用了在碘克沙醇梯度中使用超速離心純化的顆粒。48小時後，收穫細胞並分離基因組DNA用於隨後擴增能夠有效轉導的病毒基因組序列。其後將所得序列重新選殖並重新生產用於隨後的選擇反覆運算，以用具有最高組裝效率的變體充實文庫。5輪選擇後，對100個選殖的衣殼基因進行測序，以確定最成功的突變及其組合。根據測序結果，主要的突變組合是AAV9 VP1中的Y446F和F422W (約占選殖的10%)以及包含AAV9 VP1中的單突變F422W或I601M的選殖株。將這些衣殼變體選殖到用於產生病毒顆粒的載體中，並進一步用於視覺化和比較相對於野生型AAV9的rAAV顆粒生成效率/轉導概況。 實施例 2. 生成序列文庫後從所得序列文庫中選擇重組病毒顆粒為了產生序列文庫並隨後從所得序列文庫中選擇重組病毒顆粒，開發了如下一系列質體：載體質體、包含Rep基因序列的質體以及包含病毒顆粒複製所需的腺病毒基因的構建體。 載體質體pAAV-linker (圖1)旨在用於將AAV血清型9衣殼基因的隨機變體文庫選殖到一個帶有報告蛋白的閱讀框中，其通過在HindIII/EcoRI位點處使用限制酶-連接酶選殖方法，將原始構建體pAAV-GFP (圖2)中的修飾綠色螢光蛋白的序列替換為從5'末端添加了EcoRI限制性位點以及從3'末端添加了HindIII限制性位點的從頭合成的序列T2A-GFP而產生。 包含Rep基因序列的質體pAAV-Rep (圖3)通過將在5'末端添加了PciI限制性位點以及在3'末端添加了PsiI限制性位點的合成的AAV血清型2 Rep基因序列(GenBank ID AF043303.1)從頭選殖到質體pGEM-T Easy (其也用PciI/PsiI限制酶處理)中而產生。 用於產生重組病毒顆粒的腺病毒基因來源於構建體pHelper (圖4)，其包含：AmpR -提供對胺苄青黴素的抗性的β-內醯胺酶基因，Ori -細菌的複製起點，Adeno E2A -參與病毒DNA複製的輔助腺病毒基因序列，Adeno E4 -參與病毒DNA複製的輔助腺病毒基因序列，Adeno VARNA -負責轉譯早期病毒基因和晚期病毒基因兩者的輔助腺病毒基因序列。 實施例 3. 基於修飾腺相關病毒血清型 9 (rAAV9) 的載體的生成效率為了產生具有修飾血清型9衣殼的rAAV顆粒，使用聚乙烯亞胺同時用如下3個質體轉染HEK293生產細胞： 1) 包含編碼組裝rAAV顆粒所需的蛋白和RNA的腺病毒核苷酸序列的質體(輔助質體)； 2) 包含腺相關病毒的Rep基因的天然核苷酸序列以及修飾的Cap基因序列的質體，所述修飾的Cap基因序列選自：SEQ ID NO: 6、7或8的核苷酸序列或編碼以下的任何其他核苷酸序列：具有SEQ ID NO: 2、3或4的胺基酸序列的VP1蛋白，以及來自所使用的核苷酸序列的替代閱讀框的VP2和VP3蛋白，其中 VP2可以具有SEQ ID NO: 9、10、11或12的胺基酸序列的任一種； 以及VP3可以具有SEQ ID NO: 17、18、19或20的胺基酸序列的任一種； 3) 包含編碼旨在用於遞送到患者細胞中的靶標基因的異源rAAV顆粒基因組的質體。 這組基因在72小時內提供rAAV病毒顆粒的組裝和其中靶標基因組的包殼化。轉染後72小時，對生產細胞進行裂解以釋放rAAV顆粒，所得載體在37℃下用DNAase I處理2小時，並然後在56℃下用蛋白酶K再處理2小時。使用由正向引子5'-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3'、反向引子5'-TCAGCTCGATGCGGTTCAC-3'和對GFP序列特異的探針5'-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1-3'組成的寡核苷酸組，通過定量PCR確定所得rAAV顆粒的力價。 本發明的作者出乎意料地發現，野生型AAV9衣殼蛋白VP1中選自F422W或I601M的單個取代的存在，或者突變Y446F和F422W的同時存在導致具有上述突變的基於rAAV9的包殼病毒顆粒的產量提高。例如，定量PCR顯示編碼靶標GFP基因的包裝的異源rAAV顆粒基因組的拷貝數發生變化(圖5)。 在存在突變F422W的情況下(AAV9-01Mut-GFP)，當與具有野生型衣殼蛋白VP1的對照AAV9 (AAV9-NullMut-GFP)相比，包裝的病毒基因組的數量從1.82E+09 vg/ml增加到3.12E+09 vg/ml，增加到1.71倍。 在存在突變I601M的情況下(AAV9-02Mut-GFP)，當與具有野生型衣殼蛋白VP1的對照AAV9 (AAV9-NullMut-GFP)相比，包裝的病毒基因組的數量從1.82E+09 vg/ml增加到3.76E+09 vg/ml，增加到2.1倍。 在同時存在突變Y446F和F422W的情況下(AAV9-03Mut-GFP)，當與具有野生型衣殼蛋白VP1的對照AAV9 (AAV9-NullMut-GFP)相比，包裝的病毒基因組的數量從1.82E+09 vg/ml增加到3.42E+09 vg/ml，增加到1.88倍。 實施例 4. 評估用在野生型 AAV9 衣殼蛋白 VP1 中包含點突變的基於 rAAV9 的產物轉導細胞的效率將U-87 MG細胞接種到24孔板的孔中。將細胞鋪板到補充有穀胺醯胺、10%牛血清的EMEM生長培養基中。細胞接種密度為10,000個細胞/cm 2。在轉導運行期間，預先製備的細胞以400,000 vg/細胞的MOI進行轉導。所有樣品一式三份運行。將完整細胞用作陰性對照。 使用Guava EasyCyte流式細胞儀和GuavaSoft軟體，通過GFP報告蛋白信號的強度測量轉導效率。 本發明的作者發現，野生型AAV9衣殼蛋白VP1中單突變F422W或I601M的存在以及突變Y446F和F422W的同時存在不會導致通過具有上述突變的rAAV載體的轉殖基因遞送效率的顯著降低。例如，流式細胞術顯示在用具有野生型AAV9衣殼蛋白VP1或包含單突變F422W或I601M的野生型AAV9衣殼蛋白VP1以及在野生型AAV9衣殼蛋白VP1中同時包含突變Y446F和F422W的衣殼變體的基於rAAV的產物轉導U-87 MG細胞系後48小時，GFP陽性細胞的數量發生變化(圖6)。 對於具有野生型衣殼蛋白VP1的對照rAAV9產物(AAV9-NullMut-GFP)，表現GFP的細胞的數量為95.58%。 在存在突變F422W的情況下(AAV9-01Mut-GFP)，表現GFP的細胞的數量為96.15%。 在存在突變I601M的情況下(AAV9-02Mut-GFP)，表現GFP的細胞的數量為93.75%。 在同時存在突變Y446F和F422W的情況下(AAV9-03Mut-GFP)
[圖1]是旨在用於選殖AAV血清型9衣殼基因的隨機變體文庫的質體pAAV-linker的環狀示意圖。 GFP是編碼綠色螢光蛋白的序列， 多聚A (PolyA)是多聚腺苷酸化信號， ITR是腺相關病毒的反向末端重複， T2A是編碼使靶標蛋白和報告蛋白能夠共表現的2A自切割肽的序列， HBG內含子是人β-珠蛋白內含子， CMV啟動子是人巨細胞病毒啟動子， AmpR是β-內醯胺酶基因的序列，其提供大腸桿菌(E.coli)對胺苄青黴素的抗性， pUC起點是高拷貝細菌複製起點。 [圖2]是質體pAAV-GFP的環狀圖。 EGFP是編碼修飾綠色螢光蛋白的序列， 多聚A是多聚腺苷酸化信號， ITR是腺相關病毒的反向末端重複， HBG內含子是人β-珠蛋白內含子， CMV啟動子是人巨細胞病毒啟動子， AmpR是β-內醯胺酶基因的序列，其提供大腸桿菌對胺苄青黴素的抗性， pUC起點是高拷貝細菌複製起點。 [圖3]是旨在用於從隨機變體文庫中產生野生型AAV血清型9的重組病毒產物的質體pAAV-Rep的環狀示意圖。 AmpR是β-內醯胺酶基因的序列，其提供大腸桿菌對胺苄青黴素的抗性， pUC起點是高拷貝細菌複製起點， AAV Rep基因是編碼病毒生命週期所需的Rep蛋白的序列。 [圖4]是旨在用於從隨機變體文庫中產生野生型AAV血清型9的重組病毒產物的質體pHelper的環狀示意圖。 AmpR是β-內醯胺酶基因，其提供對胺苄青黴素的抗性， Ori是細菌的複製起點， Adeno E2A是參與病毒DNA複製的輔助腺病毒基因序列， Adeno E4是參與病毒DNA複製的輔助腺病毒基因序列， Adeno VARNA是負責轉譯早期病毒基因和晚期病毒基因兩者的輔助腺病毒基因序列。 [圖5]是顯示包含修飾AAV9衣殼蛋白VP1的基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體生成效率的圖。 AAV9-01Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變F422W的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-02Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變I601M的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-03Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變Y446F和F422W的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-NullMut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含野生型AAV9衣殼蛋白VP1。 Vg/ml cf是指每毫升培養液的病毒基因組計數。 [圖6]是顯示評估用在野生型AAV9衣殼蛋白VP1中包含一個或多個點突變的基於rAAV9的產物轉導細胞的效率的圖。 AAV9-01Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變F422W的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-02Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變I601M的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-03Mut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含具有突變Y446F和F422W的修飾AAV9衣殼蛋白VP1。 AAV9-NullMut-GFP是指基於修飾腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的載體，其包含野生型AAV9衣殼蛋白VP1。 [圖7]是顯示AAV9衣殼的結構蛋白在編碼AAV9衣殼的序列中的位置的示意圖。 1-737 aa - VP1， 138-737 aa - VP2， 203-737 aa - VP3。
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Claims (39)

  1. 一種來自腺相關病毒血清型9 (AAV9)的分離的修飾衣殼蛋白VP1，其用於高效產生基於重組腺相關病毒血清型9 (rAAV9)的包殼病毒載體，該分離的修飾衣殼蛋白VP1包含由 Cap基因編碼的野生型AAV9衣殼蛋白VP1胺基酸序列，該胺基酸序列具有一個或多個選自以下的取代： F422W， F422W和Y446F， I601M， 其中該野生型AAV9衣殼蛋白VP1胺基酸序列具有由SEQ ID NO: 1表示的胺基酸序列。
  2. 根據請求項1所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其包含在F422W位的取代。
  3. 根據請求項2所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO: 2表示的胺基酸序列。
  4. 根據請求項1所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其包含取代F422W和Y446F。
  5. 根據請求項4所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO: 3表示的胺基酸序列。
  6. 根據請求項1所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其包含取代I601M。
  7. 根據請求項6所述的分離的修飾AAV9衣殼蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO: 4表示的胺基酸序列。
  8. 一種分離的核酸，其編碼根據請求項1至7中任一項所述的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1，該衣殼蛋白VP1用於高效產生基於重組腺相關病毒血清型9的包殼病毒載體。
  9. 根據請求項8所述的分離的核酸，其編碼具有胺基酸取代F422W的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1，該分離的核酸由具有SEQ ID NO: 6的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。
  10. 根據請求項8所述的分離的核酸，其編碼具有胺基酸取代F422W和Y446F的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1，該分離的核酸由具有SEQ ID NO: 7的核酸序列或編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。
  11. 根據請求項8所述的分離的核酸，其編碼具有胺基酸取代I601M的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1，該分離的核酸由具有SEQ ID NO: 8的核酸序列或由編碼相應胺基酸序列的任何其他序列表示。
  12. 一種分離的衣殼，其用於高效產生基於重組腺相關病毒血清型9的包殼病毒載體，該分離的衣殼包括根據請求項1至7中任一項所述的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1。
  13. 根據請求項12所述的分離的衣殼，其包含根據請求項1至7中任一項所述的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1、AAV9衣殼蛋白VP2或其修飾變體以及AAV9衣殼蛋白VP3或其修飾變體。
  14. 根據請求項13所述的分離的衣殼，其包含野生型AAV9衣殼蛋白VP2。
  15. 根據請求項14所述的分離的衣殼，其包含具有由SEQ ID NO: 9表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP2。
  16. 根據請求項13所述的分離的衣殼，其包含來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP2。
  17. 根據請求項16所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，所述修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W。
  18. 根據請求項17所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，該修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W並且具有由SEQ ID NO: 10表示的胺基酸序列。
  19. 根據請求項16所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，該修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W和Y309F。
  20. 根據請求項19所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，該修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代F285W和Y309F並且具有由SEQ ID NO: 11表示的胺基酸序列。
  21. 根據請求項16所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，該修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代I464M。
  22. 根據請求項21所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP2，該修飾AAV9衣殼蛋白VP2包含取代I464M並且具有由SEQ ID NO: 12表示的胺基酸序列。
  23. 根據請求項13所述的分離的衣殼，其包含野生型AAV9衣殼蛋白VP3。
  24. 根據請求項23所述的分離的衣殼，其包含具有由SEQ ID NO: 17表示的胺基酸序列的野生型AAV9衣殼蛋白VP3。
  25. 根據請求項13所述的分離的衣殼，其包含來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP3。
  26. 根據請求項25所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W。
  27. 根據請求項26所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W並且具有由SEQ ID NO: 18表示的胺基酸序列。
  28. 根據請求項25所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W和Y244F。
  29. 根據請求項28所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代F220W和Y244F並且具有由SEQ ID NO: 19表示的胺基酸序列。
  30. 根據請求項25所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代I399M。
  31. 根據請求項30所述的分離的衣殼，其包含修飾AAV9衣殼蛋白VP3，該修飾AAV9衣殼蛋白VP3包含取代I399M並且具有由SEQ ID NO: 20表示的胺基酸序列。
  32. 一種分離的核酸，其編碼根據請求項12至31中任一項所述的衣殼，該衣殼用於高效產生基於重組腺相關病毒血清型9的包殼病毒載體。
  33. 一種用於向受試者遞送異源核酸序列的基於重組腺相關病毒血清型9的載體，該載體包含： 1) 根據請求項1至7中任一項所述的來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1或根據請求項12至31中任一項所述的衣殼，和 2) 異源核酸序列，其包含在靶標細胞中促進由異源核酸序列編碼的產物表現的調節序列。
  34. 根據請求項33所述的rAAV9載體，其中所述異源核酸序列的表現產物是治療性多肽或報告多肽。
  35. 一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的藥物組合物，其包含： a) 根據請求項33至34中任一項所述的rAAV9載體；和 b) 藥學上可接受的賦形劑。
  36. 一種用於向有需要的受試者遞送基因產物的方法，其包含向該受試者施用根據請求項33至34中任一項所述的rAAV9載體或根據請求項35所述的藥物組合物。
  37. 一種根據請求項33至34中任一項所述的rAAV9載體或根據請求項35所述的藥物組合物用於治療有需要的受試者的疾病的用途。
  38. 根據請求項37所述的用途，其中該疾病選自：血液疾病、中樞神經系統疾病、代謝疾病、肌肉疾病、遺傳疾病。
  39. 一種用於產生根據請求項33至34中任一項所述的rAAV9載體的方法，其包含分別用以下轉染生產細胞：根據請求項8至11中任一項所述的包含編碼來自腺相關病毒血清型9的修飾衣殼蛋白VP1的序列的核酸或根據請求項32所述的編碼衣殼的核酸。
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