CN117025677A - 亨廷顿病的aav治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开的方面涉及用于治疗亨廷顿病的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开提供了靶向亨廷顿蛋白基因(HTT)的干扰核酸(例如，人工miRNA)和使用其治疗亨廷顿病的方法。

Description

亨廷顿病的AAV治疗
本申请为申请号为201780072293.6，申请日为2017年9月22日，发明名称为“亨廷顿病的AAV治疗”的分案申请。
相关申请
本申请要求35U.S.C.119(e)的于2016年9月22日提交的题为“AAV TREATMENT OFHUNTINGTON'SDISEASE”的美国临时申请序列号62/398,487的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。
联邦政府资助的研究
本发明是在国立卫生研究院授予的NS038194的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
亨廷顿病(HD)是一种破坏性的遗传性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白基因外显子1中CAG重复区的扩增引起。虽然亨廷顿蛋白(HTT)在全身表达，但聚谷氨酰胺扩展的蛋白特别对纹状体中的中间多棘神经元及其皮质连接有毒。患者患有包括抑郁和焦虑在内的情绪症状，以及特征性的运动障碍和舞蹈病。亨廷顿病目前无法治愈；治疗选择仅限于改善疾失调状。
发明内容
本公开的多个方面涉及用于治疗亨廷顿病(HD)的组合物和方法。在一些实施方案中，提供了抑制性核酸(例如，miRNA，例如人工miRNA)，其特异性地杂交并抑制人类亨廷顿蛋白(HTT)的表达。
因此，在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含或编码在SEQ ID NO：2-10或21-22任一个中记载的序列。在一些实施方案中，人类亨廷顿基因包含SEQ ID NO：1所示的序列。在一些实施方案中，本公开提供与SEQ ID NO：1的至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)连续碱基互补的核酸(例如，miRNA)。
在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含：包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体的第一区域；和，包含编码一个或多个miRNA的转基因的第二区域。在一些实施方案中，编码各miRNA的序列包含侧接编码miRNA骨架序列的序列的如SEQID NO：2-10任一项所述的序列。
在一些实施方案中，每个miRNA骨架序列是mir-155骨架序列，mir-30骨架序列或mir-64骨架序列。
在一些实施方案中，转基因还包含编码启动子的核酸序列。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或U6启动子。
在一些实施方案中，转基因还包含编码蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，蛋白是治疗性蛋白(例如，非突变的亨廷顿蛋白)或报告蛋白(例如，荧光蛋白，例如GFP)。
在一些实施方案中，一个或多个miRNA位于转基因的非翻译部分。在一些实施方案中，非翻译部分是内含子。在一些实施方案中，非翻译部分位于编码蛋白的核酸序列的最后一个密码子和poly-A尾序列之间。在一些实施方案中，非翻译部分位于启动子序列的最后一个核酸碱基和poly-A尾序列的第一个碱基之间。
在一些实施方案中，分离的核酸还包含第三区域，其包含第二腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体。
在一些实施方案中，第一或第二ITR变体缺乏功能性末端解析位点(terminalresolution site，TRS)，任选地其中ITR变体是ΔTRS ITR。
在一些实施方案中，至少一个miRNA与人类亨廷顿基因杂交并抑制其表达。
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒。
在一些方面，本公开提供了宿主细胞，其包含如本公开所述的分离的核酸或载体。
在一些方面，本公开提供了重组AAV(rAAV)，其包含：衣壳蛋白；和，如本公开所述的分离的核酸。
在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO：20所示的序列。
在一些实施方案中，rAAV是自身互补的AAV(scAAV)。
在一些实施方案中，配制rAAV用于递送至中枢神经系统(CNS)。
本公开的多个方面涉及能够减少(例如，抑制)致病性亨廷顿基因表达并因此可用于治疗亨廷顿病的分离的核酸。因此，在一些方面，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗亨廷顿病的方法，该方法包括向患有亨廷顿病或有发展亨廷顿病风险的受试者施用治疗有效量的如本公开所述的分离的核酸或rAAV。
在一些实施方案中，受试者包含具有超过36个CAG重复、超过40个重复或超过100个重复的亨廷顿基因。在一些实施方案中，受试者小于20岁，或被诊断为患有青少年HD。
在一些实施方案中，施用导致分离的核酸或rAAV递送至受试者的中枢神经系统(CNS)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选静脉内注射或纹状体内(intrastriatal)注射。
在一些方面，本公开提供了包含编码一个或多个miRNA的转基因的分离的核酸，其中编码每个miRNA的转基因的序列包含SEQ ID NO：7或8所示的侧接miRNA骨架序列的序列。
在一些实施方案中，每个miRNA骨架序列是mir-155骨架序列、mir-30骨架序列或mir-64骨架序列。
在一些实施方案中，转基因包含启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或U6启动子。
在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO：21或22所示的序列。
在一些实施方案中，转基因侧接腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体。在一些实施方案中，ITR变体缺乏功能性末端解析位点(terminal resolution site,TRS)。在一些实施方案中，缺乏TRS的ITR变体是ΔTRS ITR。
在一些方面，本公开提供一种包含含有编码一个或多个miRNA的转基因的分离的核酸的载体，其中编码每个miRNA的转基因的序列包含SEQ ID NO：7或8所示的侧接miRNA骨架序列的序列。在一些实施方案中，载体是质粒。。
在一些实施方案中，转基因的每个miRNA骨架序列均是mir-155骨架序列、mir-30骨架序列或mir-64骨架序列。
在一些实施方案中，转基因包含启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或U6启动子。
在一些实施方案中，转基因包含SEQ ID NO：21或22所示的序列。
在一些实施方案中，转基因侧接腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体。在一些实施方案中，ITR变体缺乏功能性末端解析位点(TRS)。在一些实施方案中，缺乏TRS的ITR变体是ΔTRS ITR。
在一些方面，本公开提供一种重组AAV(rAAV)，其包含衣壳蛋白和包含编码一个或多个miRNA的转基因的分离的核酸，其中编码每个miRNA的转基因的序列包含SEQ ID NO：7或8所示的侧接miRNA骨架序列的序列。
在一些实施方案中，转基因侧接全长AAV ITR序列。在一些实施方案中，转基因侧接全长AAV ITR和ΔTRS ITR。
在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含SEQ ID NO：20所示的序列。
在一些方面，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗亨廷顿病的方法，该方法包括向患有亨廷顿病或有发展亨廷顿病风险的受试者施用治疗有效量的如本文所述的rAAV(例如，包含编码一个或多个miRNA的转基因的rAAV，其中编码每个miRNA的转基因的序列包含SEQ ID NO：7或8所示的侧接miRNA骨架序列的序列)。
在一些实施方案中，分离的核酸的转基因侧接全长AAV ITR序列。在一些实施方案中，转基因侧接全长AAV ITR和ΔTRS ITR。
在一些实施方案中，rAAV包含AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，受试者包含具有超过36个CAG重复、超过40个重复或超过100个重复的亨廷顿基因(huntingin gene)。在一些实施方案中，受试者小于20岁。
在一些实施方案中，施用是通过注射。在一些实施方案中，注射是静脉内注射或纹状体内注射。
附图简述
图1显示了用表达靶向人亨廷顿基因的mir-HTT-6433的质粒转染的HeLa细胞。转染后48小时，收获细胞并提取RNA用于定量RT-PCR(qRT-PCR)。结果表明mir-HTT-6433使内源性人类亨廷顿蛋白降低了多达50％。
图2显示包装到AAV9载体并直接注射到表达突变型人类亨廷顿基因的转基因小鼠(Yac128小鼠)的纹状体中的mir-HTT-6433。注射后一个月，通过qRT-PCR测量人类亨廷顿基因mRNA的水平。在一组动物(n＝5)中，比较注射侧人类亨廷顿基因的水平与未注射侧的水平。在注射侧观察到亨廷顿mRNA的显著(p＝0.0017)减少。在第二组动物(n＝5/组)中，将注射mir-HTT-6433的动物的亨廷顿mRNA水平与仅接受载体注射的动物进行比较。在这些动物中也观察到亨廷顿蛋白的显著减少(p＝0.0004)。在第三组动物(n＝5/组)中，比较注射mir-HTT-6433的动物与注射AAV9-GFP的动物中亨廷顿mRNA的水平。这些动物中也存在亨廷顿mRNA的显著降低(p＝0.0064)。总之，数据表明mir-HTT-6433使在体内脑中的亨廷顿mRNA减少50％。
图3显示用AAV9-mir-HTT-6433或PBS单侧注射表达突变体亨廷顿基因(人)的转基因小鼠。注射后6个月，在平衡木上测试小鼠。数据表明，与用PBS处理的HD小鼠相比，用mir-HTT-6433处理的小鼠显示穿过平衡木所花费时间减少。
图4A-4C显示靶向人亨廷顿基因的人工miRNA减少细胞培养物和体内的亨廷顿mRNA。图4A显示了人亨廷顿mRNA上的靶位点的位置。图4B显示用表达靶向人亨廷顿基因的人工miRNA的质粒转染的HeLa细胞；通过qPCR在48小时后测量亨廷顿蛋白mRNA水平。将亨廷顿基因表达相对HPRT归一化以解释孔之间细胞数目的差异并且表述为相对于未处理的/原初的对照。误差线表示标准误差。图4C显示了基于细胞培养结果选择用于体内测试的候选miRNA。在纹状体中单侧注射将小鼠。注射后一个月，收获纹状体并解剖出GFP阳性组织。将数据相对HPRT归一化并表示为相对于仅GFP对照。
图5A-5C显示自U6启动子表达人工miRNA未改善小鼠纹状体中亨廷顿基因的沉默。图5A显示了与自CBA(polII)和U6启动子表达miRNA的AAV9构建物有关的数据。CBA启动子驱动的miRNA位于GFP基因的3'-UTR，而含有U6启动子驱动的人工miRNA的构建物自单独的启动子共表达GFP。图5B显示注射靶向位点5155(左)和6433(右)的U6和CBA启动子驱动的人工miRNA后，注射的纹状体中亨廷顿mRNA的相对量。数据表示为相对于非注入侧。图5C显示了用靶向位点6433的U6和CBA启动子驱动的miRNA单侧注射的小鼠中，亨廷顿mRNA的相对量。数据表示为相对于注射表达GFP的对照载体的小鼠组。
图6A-6B显示自U6启动子的mir-HTT-6433的长期纹状体表达导致行为异常。图6A显示注射后6个月，注射U6-启动子驱动的mir-HTT-6433的小鼠未能搭巢。在将新的小巢放入笼中后24小时拍摄照片。图6B显示用PBS、CBA-mir-HTT-6433或U6-mir-HTT-6433处理的Yac128小鼠的笼监测。24-27小时内记录在笼子周围移动所花费的时间。通过将总时间量除以记录小时数来计算每小时的平均时间。
图7A-7B显示自U6启动子的mir-HTT-6433的长期表达引起纹状体收缩。图7A显示注射后1个月(顶部)和6个月(底部)，Yac128小鼠注射侧的DARPP-32染色的代表性图像。图7B显示注射后6个月DARPP-32阳性区域的定量。
图8A-8D显示自U6启动子的mir-HTT-6433的长期表达引起小胶质细胞的持续活化。图8A显示注射后1个月(顶部)和6个月(底部)Yac128小鼠注射侧的Iba1染色的代表性图像。拍摄注射部位图像。显示了注射后6个月的总体(图8B)、活化的(图8C)和静息的(图8D)小胶质细胞的定量。
图9A-9C显示自U6启动子的基于mir155的人工miRNA的表达导致靶向引导链和其他序列的亨廷顿蛋白过表达。图9A显示了定位至靶向亨廷顿基因的人工miRNA发夹(mir-155骨架)的读数的起始位置。报告了相对于成熟链的位置，并将读数相对每个样品中定位的内源miRNA的总数归一化。水平线代表在对照样品中发现的人工miRNA的背景水平。图9B显示通过定量RT-PCR对成熟miR-HTT(来自mir-155骨架)的相对定量。图9C显示了定位至靶向亨廷顿基因的人工miRNA的读数的起始部分，所述人工miRNA植入在mir-30骨架中并自U6启动子表达。
图10A-10B显示mir-HTT-6433的表达优先降低了具有靶位点的mRNA。图10A显示mRNA被分成含有与人工miRNA位点(图例)匹配的经典miRNA结合的那些和没有的那些。在注射AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠组中，有和没有这些位点的mRNA之间没有差异。相比之下，图10B显示，在AAV-U6-mir-HTT-6433组中，存在向具有完美8聚体位点的mRNA的抑制的转变。
图11A-11C显示减少载体剂量导致小鼠纹状体中的扩散和敲降的减少。图11A显示用编码靶向亨廷顿基因的人工miRNA和EGFP的载体注射的小鼠纹状体中的GFP染色。ImageJ用于测量GFP阳性的纹状体的百分比。图11B显示了测量Yac128小鼠纹状体中人亨廷顿mRNA的定量RT-PCR。图11C显示以三种不同剂量注射编码靶向亨廷顿基因的miRNA和EGFP的载体的小鼠的代表性照片。数据表明减少载体剂量导致扩散和敲降的减少。
图12A-12B显示了表明在注射U6启动子驱动的靶向亨廷顿基因的人工miRNA后，Yac128小鼠显示穿过平衡木的能力下降的数据。图12A显示在2-3个月注射的小鼠显示穿过平衡木的时间明显增加，并且其中一些完全不能穿过。图12B显示在7个月龄时注射PBS或CBA-mir-HTT-6433的Yac128小鼠显示出与年龄相关的平衡木行为下降。注射U6-mir-HTT-6433(红点)加速这种下降。
图13A-13B显示在注射U6启动子驱动的靶向亨廷顿基因的人工miRNA后，C57BL/6小鼠显示在平衡木上的行为的初始恶化。图13A显示了对照(原初的)小鼠和注射AAV-U6-mir-HTT-6433和AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠穿过平衡木所花费的时间量。图13B显示对照(原初的)小鼠和注射AAV-U6-mir-HTT-6433和AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠中DARPP-32阳性纹状体区域的定量。
图14A-14B显示注射mir-HTT-6433后，内源性miRNA的分布基本不受影响。图14A显示注射AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠中的分布；mir-HTT-6433引导链和过客链的水平以绿色显示，红色是显示注射AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠中显示出显著变化的所有内源性miRNA种类。图14B显示用AAV-U6-mir-HTT-6433注射的小鼠中的分布。
图15A-15C显示用mir-HTT-6433处理的小鼠中的mRNA谱。图15A显示注射AAV-CbA-mir-HTT-6433的小鼠显示mRNA表达的少量变化；绿色是显示显著p值的所有基因，蓝色是那些在针对多重比较调整后仍然显著的基因。图15B显示与CBA相比，注射AAV-U6-mir-HTT-6433的小鼠显示出更多的mRNA表达变化。图15C显示用mir-HTT-6433处理的小鼠中的mRNA谱；7种RNA在U6和CbA处理组之间显著差异表达。
图16显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体一个月后，与亨廷顿病绵羊模型的中尾状体(middle caudate)中人类亨廷顿(人类htt)RNA的相对表达相关的数据。还显示了未注射的对照绵羊中的htt表达水平的数据。将相对htt表达水平对绵羊钙联接蛋白进行归一化。注意：在每个CBA和U6构建物中均使用mir155骨架。
图17显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体一个月后，与亨廷顿病绵羊模型的中壳核(middle putamen)中人亨廷顿(人类htt)RNA的相对表达有关的数据。还显示了未注射的对照绵羊中表达水平的数据。将相对htt表达水对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图18显示在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，与亨廷顿病绵羊模型中尾状体内侧的人类亨廷顿(人类htt)RNA相对表达相关的数据。显示了非注射侧和注射侧的表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图19显示在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，与亨廷顿病绵羊模型中尾状体外侧的人类亨廷顿(人类htt)RNA相对表达相关的数据。显示了非注射侧和注射侧的表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图20显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，与亨廷顿病绵羊模型的中尾状体中人亨廷顿(人类htt)RNA的相对表达相关的数据。还显示了未注射的对照绵羊中的htt表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图21显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)或空scAAV9对照载体后6个月，与亨廷顿病绵羊模型的中壳核侧面的人类亨廷顿(人类htt)RNA相对表达相关的数据。显示了非注射侧和注射侧的表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图22显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)或空scAAV9对照载体后6个月，与亨廷顿病绵羊模型的中壳核内侧的人类亨廷顿蛋白(人类htt)RNA相对表达相关的数据。显示了非注射侧和注射侧的表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图23显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，与亨廷顿病绵羊模型的中壳核中人亨廷顿(人类htt)RNA相对表达相关的数据。还显示了未注射的对照绵羊中htt表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图24显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，与亨廷顿病绵羊模型的前纹状体中人亨廷顿(人类htt)RNA相对表达相关的数据。还显示了未注射的对照绵羊中的htt表达水平的数据。将相对htt表达水平相对绵羊钙联接蛋白进行归一化。
图25A-25B显示了靶向人类亨廷顿基因的人工miRNA的预测的发夹结构。图25A显示mir-155-6433的预测的发夹结构(SEQ ID NO：23)。图25B显示了mir-30-6433的预测的发夹结构(SEQ ID NO：24)。
图26A-26B显示AAV载体向绵羊脑的递送。图26A显示在冠状面(顶部)切开的绵羊脑的图解概述，使得整个纹状体包含在4个6毫米块内。前块包含纹状体的前部，其未被内囊(中间)分开。注射针对的内侧块具有定义的壳核和尾状物，显示在底部。图26B显示对照(AAV9)和处理的(AAV9miRHTT)动物中的AAV载体基因组。使用基因组HPRT作为参考基因，通过数字液滴PCR测量载体基因组。这些值以对数标度绘图。
图27显示通过数字液滴PCR定量人工miRNA引导链。通过对let-7e*进行归一化计算相对miRNA水平，并将该值以对数标度绘图。排除RQN<5的样品。报告的数字是满足该质量阈值的并用于miRNA分析的样品总数。使用具有用于多检验的Tukey校正的双因素ANOVA计算P值。
图28所示scAAV9-抗-HTT-6433减少纹状体中人突变体亨廷顿mRNA。显示的数据是针对绵羊钙联接蛋白归一化的HTT mRNA的信号。星号表示用非配对t检验测得的p为0.03或更低的处理组(AAV9或AAV9miRHTT)之间的()平均值显著差异。U6启动子驱动的人工miRNA在注射后1个月的尾状体和壳核中和注射后6个月的壳核中显著降低人突变体HTT mRNA。CBA启动子驱动的人工miRNA在注射后1个月的尾状体、壳核和前纹状体中和注射后6个月的的尾状体和壳核中降低HTT mRNA。在分析中检查尾状体、外侧壳核和前纹状体的内侧区域。
图29A-29B显示在AAV9和AAV9miRHTT处理的绵羊中内源性绵羊HTT mRNA和蛋白的水平。图29A显示如方法中所述测定绵羊htt mRNA水平，并且表示为相对于绵羊钙联接蛋白(Canx)。显示的是研究2的结果。AAV9和AAV9miRHTT处理组之间的内源绵羊htt mRNA水平没有差异。图29B显示了注射后6个月，来自研究2的壳核中用抗-htt1-17抗体(Ab1)检测的内源绵羊亨廷顿蛋白和人mHTT蛋白的水平。样品Western印迹显示，一侧注射AAV9miRHTT的4只不同绵羊中脑的注射和未注射侧的wt htt(箭)和人突变体htt(箭头)的信号。图表显示了从密度测定法确定的平均wt绵羊htt和人mHTT信号，表示为注射侧相对于非注射侧的百分比。注意，用AAV9miRHTT处理不影响内源绵羊亨廷顿蛋白的水平，但显著降低人mHTT的水平。星号表示以未配对t检验测得的p＝0.005。
图30显示AAV9-miRHTT减少纹状体中人类突变体亨廷顿蛋白。来自研究1和2的壳核的样品Western印迹显示，用抗体3B5H10和作为上样对照(顶部)的肌动蛋白检测到的突变体Htt。图表显示了用AAV9(对照)或AAV9-miRHTT(底部)处理的绵羊的单独值和平均值(水平条)的分布。显示了注射后1和6个月的研究1和2中不同纹状体区域(尾状体、壳核和前纹状体)的结果。在研究2中，注射后6个月，在每个区域检查两个区(区1和区2)。星号表示基于非配对t检验AAV9和AAV9-miRHTT之间注射侧的显著差异，p<0.05或更低。
图31显示在研究1(U6启动子)和研究2(CBA启动子)中注射后1和6个月通过MSD测定检测的人突变体HTT水平。图表显示用AAV9(对照)或AAV9-miRHTT处理的绵羊的单独值和平均值(水平条)的分布。显示了不同纹状体区域(尾状体、壳核和前纹状体)的结果。星号*表示基于非配对t检验，AAV9和AAV9-miRHTT之间注射侧的显著差异，p<0.05或更低。
图32A-32B显示miRHTT注射的绵羊纹状体的同侧皮质和对侧尾状壳核中的mHTT水平未改变。图32A显示指示miRHTT注射的纹状体同侧的皮质中相对肌动蛋白归一化的mHTT的平均水平。数据来自研究1注射后第1个月和第6个月，NS，基于非配对t检验。图32B显示指明注射miRHTT的纹状体对侧的尾状体和壳核中相对肌动蛋白归一化的mHTT水平的棒图。数据来自研究1注射后第1个月和第6个月，NS，基于非配对t检验。
具体实施方式
本发明的多个方面涉及某些干扰RNA(例如，miRNA，例如人工miRNA)，其在递送至受试者时有效降低受试者中致病性亨廷顿蛋白(HTT)的表达。因此，在一些实施方案中，本公开描述的方法和组合物用于治疗亨廷顿病。
治疗亨廷顿病的方法
本公开提供了向受试者递送转基因(例如，抑制性RNA，例如miRNA)的方法。该方法通常包括给受试者施用有效量的编码能够降低亨廷顿(htt)蛋白表达的干扰RNA的分离核酸，或包含用于表达能够降低亨廷顿蛋白表达的抑制性RNA的核酸的rAAV。
在一些方面，本公开提供了特异性结合(例如，杂交)人亨廷顿基因(例如，SEQ IDNO：1)的至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或更多)连续碱基的抑制性miRNA。如本文所用，“连续碱基”是指两个或更多个彼此共价结合(例如，通过一个或多个磷酸二酯键等)的核苷酸碱基(例如作为核酸分子的一部分)。在一些实施方案中，至少一个miRNA与SEQ ID NO：1的至少两个或更多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或更多个)连续核苷酸碱基约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或约100％同一。在一些实施方案中，抑制性RNA是miRNA，其包括在SEQ ID NO：2-10中任一个所记载的序列或由其编码。
如本文所用，“亨廷顿病”或“HD”是指神经退行性疾病，其特征在于由HTT基因中三核苷酸重复扩增(例如，CAG，其被翻译成聚谷氨酰胺或polyQ，段)引起的不断恶化的运动、认知和行为变化，所述三核苷酸重复扩增导致产生致病性突变体亨廷顿蛋白(HTT，或mHTT)。在一些实施方案中，突变体亨廷顿蛋白加速脑的某些区域中神经元细胞死亡的速率。一般来说，HD的严重程度与受试者中三核苷酸重复扩增的大小相关。例如，具有包含36至39个重复的CAG重复区域的受试者的特征在于“外显率降低”的HD，而具有多于40个重复的受试者的特征在于“完全外显率”的HD。因此，在一些实施方案中，患有HD或具有患HD风险的受试者具有包含约36至约39个CAG重复(例如，36、37、38或39个重复)的HTT基因。在一些实施方案中，患有HD或具有患HD风险的受试者具有包含40或更多(例如，40、45、50、60、70、80、90、100、200或更多)CAG重复的HTT基因。在一些实施方案中，具有包含超过100个CAG重复的HTT基因的受试者比具有少于100个CAG重复的受试者更早地发展HD。在一些实施方案中，具有包含超过100个CAG重复的HTT基因的受试者可在约20岁之前发展HD症状，并且被称为具有青少年HD(也称为运动不能-强直HD(akinetic-rigid HD)或Westphal变体HD)。受试者的HTT基因等位基因中的CAG重复数可以通过本领域已知的任何合适的方式确定。例如，可以从受试者的生物样品(例如，血液)中分离核酸(例如，DNA)，并且可以通过基于杂交的方法(例如PCR或核酸测序(例如，Illumina测序，Sanger测序，SMRT测序等))确定HTT等位基因的CAG重复数。
物质的“有效量”是足以产生所需效果的量。在一些实施方案中，分离的核酸的有效量是足以转染(或在rAAV介导的递送的背景下感染)足够数量的受试者靶组织的靶细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是中枢神经系统(CNS)组织(例如，脑组织、脊髓组织、脑脊髓液(CSF)等)。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸的(例如，其可以经由rAAV递送)可以是下述量：足以在受试者中产生治疗益处，例如，减少致病基因或蛋白的表达(例如，HTT)、延长受试者的寿命、改善受试者的一个或多个疾病症状(例如，亨廷顿病的症状)等。有效量将取决于多种因素，诸如例如，受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织，并且因此可以如本公开中其他地方所述随受试者和组织而改变。
分离的核酸
在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其用于减少(例如，抑制)人类亨廷顿基因(HTT)的表达。“核酸”序列是指DNA或RNA序列。在一些实施方案中，分离本公开的蛋白和核酸。如本文所用，术语“分离的”是指人工产生的。如本文关于核酸所用，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)通过裂解和凝胶分离纯化；或(iv)合成，通过例如化学合成。分离的核酸是易于通过本领域熟知的重组DNA技术操作的核酸。因此，认为载体中包含的核苷酸序列(已知该载体中的5'和3'限制性位点或已公开用于该载体聚合酶链反应(PCR)引物序列)是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必需的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为它可以包含其所在细胞中的仅微小百分比的物质。然而，当该术语在本文中使用时，这种核酸是分离的，因为它易于通过本领域普通技术人员已知的标准技术操作。如本文关于蛋白或肽所用，术语“分离的”是指已从其天然环境中分离或人工产生的(例如，通过化学合成，通过重组DNA技术等)蛋白或肽。
技术人员还将认识到，可以进行保守氨基酸取代以提供功能等同的变体或衣壳蛋白的同源物。在一些方面，本公开包括导致保守氨基酸取代的序列改变。如本文所用，保守氨基酸取代是指不改变其中进行氨基酸取代的蛋白的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。变体可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法制备，例如在汇编这些方法的参考文献中发现的，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in Molecular Biology，FM Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，New York。氨基酸的保守取代包括在下列组中的氨基酸之间取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。因此，可以对本文公开的蛋白和多肽的氨基酸序列进行保守氨基酸取代。
本发明的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV载体)。在一些实施方案中，如本公开所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组AAV载体)包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组AAV(rAAV)载体”通常至少包含转基因及其调控序列和5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)。如本文其他地方所公开的，转基因可以包含编码一个或多个抑制性RNA(例如，miRNA)的一个或多个区域，所述抑制性RNA包含靶向受试者的内源mRNA的核酸。转基因还可以包含编码例如蛋白/或表达控制序列(例如，poly-A尾)的区域，如本公开中其他地方所述。
通常，ITR序列的长度约为145bp。优选地，基本上编码ITR的整条序列用于分子中，尽管这些序列的某种程度的微小修饰是允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域的技术范围内。(参见，例如教科书，如Sambrook等，"Molecular Cloning.A Laboratory Manual"，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等，J Virol.,70:520 532(1996))。用于本发明的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选择的转基因序列和相关的调节元件侧接5'和3'AAV ITR序列。AAV ITR序列可以从任何已知的AAV获得，包括目前鉴定的哺乳动物AAV类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，rAAV载体)包括具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型的至少一个ITR。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码AAV2ITR的区域(例如，第一区域)。
在一些实施方案中，分离的核酸还包含含有第二AAVITR的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施例中，第二AAV ITR具有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体的血清型。在一些实施方案中，第二ITR是缺乏功能性末端解析位点(TRS)的突变体ITR。术语“缺乏末端解析位点”可以指AAV ITR，其包括消除ITR的末端解析位点(TRS)功能的突变(例如，有义突变，如非同义突变，或错义突变)，或指缺乏编码功能性TRS(例如，ΔTRS ITR)的核酸序列的截短的AAV ITR。不希望受任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性TRS的ITR的rAAV载体产生自身互补的rAAV载体，例如如McCarthy(2008)Molecular Therapy 16(10)：1648-1656所述的。
除了上文鉴定的重组AAV载体的主要元件外，载体还包括常规的控制元件，其以允许转基因在用载体转染的或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因的元件有效地连接。如本文所用，“有效连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制目的基因表达的表达控制序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、可诱导的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。
如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调控序列以使得核酸序列的表达或转录处于受调控序列影响或控制下的方式共价连接时，称其有效地连接。如果希望核酸序列被翻译成功能性蛋白，则如果5'调控序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录以及如果两条DNA序列间的连锁的性质不会(1)导致移框突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰将相应的RNA转录物翻译成蛋白的能力，则认为两条DNA序列有效地连接。因此，如果启动子区能够实现该DNA序列的转录，使得所得的转录物可以翻译成所需的蛋白或多肽，则启动子区域将与核酸序列有效地连接。类似地，两个或更多个编码区在它们以这样的方式连接，使得它们从共同启动子的转录导致两个或更多个已经框内翻译的蛋白的表达时，它们被有效地连接。在一些实施方案中，有效地连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，有效地连接的编码序列产生功能性RNA(例如，miRNA)。
在一些方面，本公开提供了分离的核酸，其包含转基因，其中所述转基因包括编码一个或多个微RNA(例如，miRNA)的核酸序列。“微RNA”或“miRNA”是能够介导转录或翻译后基因沉默的小的非编码RNA分子。通常，miRNA被转录为发夹或茎环(例如，具有自身互补性，单链骨架)双链体结构，称为初级miRNA(pri-miRNA)，其被酶促加工(例如，被Drosha、DGCR8、Pasha等)成pre-miRNA。pri-miRNA的长度可以变化。在一些实施方案中，pri-miRNA的长度范围为约100至约5000个碱基对(例如，约100、约200、约500、约1000、约1200、约1500、约1800、或约2000个碱基对)。在一些实施方案中，pri-miRNA的长度大于200个碱基对(例如，长度为2500、5000、7000、9000或更多碱基对)。
Pre-miRNA，其特征还在于发夹或茎环双链体结构，其长度也可以变化。在一些实施方案中，pre-miRNA的大小范围为长度约40个碱基对至长度约500个碱基对。在一些实施方案中，pre-miRNA的大小范围为长度约50至100个碱基对。在一些实施方案中，pre-miRNA的大小范围为长度约50至约90个碱基对(例如，长度约50、约52、约54、约56、约58、约60、约62、约64、约66、约68、约70、约72、约74、约76、约78、约80、约82、约84、约86、约88或约90个碱基对)。
通常，pre-miRNA被输出到细胞质中，并由Dicer酶促处理以首先产生不完美的miRNA/miRNA*双链体，并且随后产生单链成熟miRNA分子，其随后被加载到RNA诱导的沉默复合物中(RISC)。通常，成熟miRNA分子大小范围为长度约19至约30个碱基对。在一些实施方案中，成熟miRNA分子的长度为约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或30个碱基对。在一些实施方案中，本公开的分离的核酸包含编码pri-miRNA、pre-miRNA或包含在SEQ ID NO：2-10或21-22任一个所记载的序列的成熟miRNA的序列。
应当理解，在一些实施方案中，分离的核酸或载体(例如，rAAV载体)包含编码一个以上(例如，多个，例如2、3、4、5、10或更多个)miRNA的核酸序列。在一些实施方案中，一个以上miRNA中的每一个均靶向(例如，特异性地杂交或结合)相同的靶基因(例如，编码三个独特miRNA的分离的核酸，其中每个miRNA均靶向HTT基因)。在一些实施方案中，一个以上miRNA中的每一个均靶向(例如，特异性杂交或结合)不同的靶基因。
在一些方面，本公开提供了编码一个或多个人工miRNA的分离的核酸和载体(例如，rAAV载体)。如本文所用，“人工miRNA”或“amiRNA”是指内源pri-miRNA或pre-miRNA(例如，miRNA骨架，其是能够产生功能性成熟miRNA的前体miRNA)，其中miRNA和miRNA*(例如，miRNA双链体的过客链)序列已用相应的指导目标基因高效RNA沉默的amiRNA/amiRNA*序列替换，例如如Eamens等，(2014),Methods Mol.Biol.1062:211-224所述。例如，在一些实施方案中，人工miRNA包含miR-155pri-miRNA骨架，编码成熟HTT特异性miRNA的序列(例如，SEQ ID NO：2-10中的任一项)已插入其中以代替内源的miR-155成熟miRNA编码序列。在一些实施方案中，如本公开所述的miRNA(例如，人工miRNA)包含miR-155骨架序列、miR-30骨架序列、mir-64骨架序列或miR-122骨架序列。
可以将包含转基因的区域(例如，第二区域，第三区域，第四区域等)置于分离的核酸的任何合适位置。该区域可位于核酸的任何非翻译部分，包括例如内含子、5'或3'非翻译区等。
在某些情况下，期望将所述区域(例如，第二区域，第三区域，第四区域等)置于编码蛋白的核酸序列(例如，蛋白编码序列)的第一个密码子的上游。例如，该区域可位于蛋白编码序列的第一个密码子和第一个密码子上游的2000个核苷酸之间。该区域可位于蛋白编码序列的第一个密码子和第一个密码子上游的1000个核苷酸之间。该区域可位于蛋白编码序列的第一个密码子和第一个密码子上游的500个核苷酸之间。该区域可位于蛋白编码序列的第一个密码子和第一个密码子上游的250个核苷酸之间。该区域可位于蛋白编码序列的第一个密码子和第一个密码子上游的150个核苷酸之间。
在一些情况下(例如，当转基因缺乏蛋白编码序列时)，可能需要将该区域(例如，第二区域，第三区域，第四区域等)置于转基因的poly-A尾上游。例如，该区域可以位于poly-A尾的的一个碱基和第一个碱基上游2000个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游1000个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游500个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游250个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游150个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游100个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游50个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的第一个碱基和第一个碱基上游20个核苷酸间。在一些实施方案中，该区域位于启动子序列的最后一个核苷酸碱基和poly-A尾序列的第一个核苷酸碱基之间。
在一些情况下，该区域可以位于转基因poly-A尾最后一个基基下游。该区域可以位于poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基下游2000个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基下游1000个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基下游500个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基下游250个核苷酸间。该区域可以位于poly-A尾的最后一个碱基和最后一个碱基下游150个核苷酸间。
应当理解，在转基因编码多于一个miRNA的情况下，每个miRNA均可以位于转基因内的任何合适位置。例如，编码第一miRNA的核酸可以位于转基因的内含子中，并且编码第二miRNA的核酸序列可以位于另一个非翻译区域(例如，在蛋白编码序列的最后一个密码子和转基因poly-A尾的第一个碱基间)。
在一些实施方案中，转基因还包含编码一个或多个表达控制序列(例如，启动子等)的核酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及需要时，增强编码产物分泌的序列。大量表达控制序列，包括天然的、组成型的、可诱导的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。
“启动子”是指由启动基因特异性转录所需的细胞合成机制或引入的合成机器机制识别的DNA序列。短语“有效定位地”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和表达基因。
对于编码蛋白的核酸，通常在转基因序列之后和3'AAV ITR序列之前插入多腺苷酸化序列。可用于本公开的rAAV构建物还可含有内含子，理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列源自SV-40，并且被称为SV-40T内含子序列。可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单个基因转录物产生多于一个多肽。IRES序列用于产生含有多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见，例如，Sambrook等，以及其中引用的参考文献，例如，在第3.18 3.26和16.17 16.27以及Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989]。在一些实施方案中，口蹄疫病毒2A序列包含在多蛋白中；这是一种小肽(长度约为18个氨基酸)，已被证明可介导多蛋白的切割(Ryan，MD等，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，NM等，J Virology，1996年11月；p.8124-8127页；Furler，S等，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C等，The Plant Journal，1999；4：453-459)。先前已在包括质粒和基因治疗载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中证明了2A序列的切割活性(Ryan，MD等，EMBO，1994；4：928-933；Mattion，NM等，J Virology，1996年11月；p.8124-8127；Furler，S等，Gene Therapy，2001；8：864-873；和Halpin，C等，The Plant Journal，1999；4：453-459；de Felipe，P等，Gene Therapy，1999；6：198-208；deFelipe，P等，Human Gene Therapy，2000；11：1921-1931；和Klump，H等，Gene Therapy，2001；8：811-817)。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子[Invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是U6启动子。
诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素(例如温度)或特定生理状态的存在(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮素昆虫启动子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素抑制系统(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(Gossen等，Science，268：1766-1769(1995)，也参见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486诱导型系统(Wang等，Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari等,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。在该上下文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态调节的启动子，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。
在另一个实施方案中，使用转基因的天然启动子。当希望转基因的表达应该模拟天然表达时，天然启动子可能是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或响应特定转录刺激而受调控时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调控序列(例如，启动子、增强子等)是本领域熟知的。示例性组织特异性调控序列包括但不限于以下组织特异性启动子：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、胰高血糖素启动子、生长抑素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。其他示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等，Gene Ther.，3：1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)启动子，Arbuthnot等，Hum.Gene Ther.，7：1503-14(1996))，骨骨钙素启动子(Stein等，Mol.Biol.Rep.，24：185-96(1997))；骨唾液蛋白启动子(Chen等，J.Bone Miner.Res.，11：654-64(1996))，CD2启动子(Hansal等，J.Immunol.，161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α-链启动子，神经元如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))，神经细丝轻链基因启动子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5(1991))，和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等，Neuron，15：373-84(1995))，以及对技术人员来说是显而易见的那些。
本公开的多个方面涉及包含多于一个启动子(例如，2、3、4、5或更多种启动子)的分离的核酸。例如，在具有转基因的构建物的背景下，所述转基因包含编码蛋白的第一区域和编码抑制性RNA(例如，miRNA)的第二区域，可能需要使用第一启动子序列驱动蛋白编码区域的表达(例如，与蛋白编码区有效连接的第一启动子序列)，并用第二启动子序列(例如，与抑制性RNA编码区有效连接的第二启动子序列)驱动抑制性RNA编码区的表达。通常，第一启动子序列和第二启动子序列可以是相同的启动子序列或不同的启动子序列。在一些实施方案中，第一启动子序列(例如，驱动蛋白编码区表达的启动子)是RNA聚合酶III(polIII)启动子序列。polIII启动子序列的非限制性实例包括U6和H1启动子序列。在一些实施方案中，第二启动子序列(例如，驱动抑制性RNA表达的启动子序列)是RNA聚合酶II(polII)启动子序列。polII启动子序列的非限制性实例包括T7、T3、SP6、RSV和巨细胞病毒启动子序列。在一些实施方案中，polIII启动子序列驱动抑制性RNA(例如，miRNA)编码区的表达。在一些实施方案中，polII启动子序列驱动蛋白编码区的表达。
在一些实施方案中，核酸包含编码蛋白的转基因。蛋白可以是治疗性蛋白(例如，用于治疗或预防哺乳动物受试者的疾病状态的肽、蛋白或多肽)或报告蛋白。在一些实施方案中，治疗性蛋白用于治疗或预防亨廷顿病，例如聚谷氨酰胺结合肽1(QBP1)、PTD-QBP1、ED11、C4胞内抗体、VL12.3胞内抗体、MW7胞内抗体、Happ1抗体、Happ3抗体、mEM48胞内抗体、某些单克隆抗体(例如，1C2)和肽P42及其变体，如Marelli等，(2016)Orphanet Journal ofRare Disease 11:24；doi：10.1186/s13023-016-0405-3所述。在一些实施方案中，治疗性蛋白是野生型亨廷顿蛋白(例如，具有包含少于36个重复的PolyQ重复区域的亨廷顿蛋白)。
不希望受任何特定理论的束缚，与非等位基因特异性沉默(例如，野生型和突变Htt等位基因二者的沉默)相比，突变亨廷顿基因(HTT)的等位基因特异性沉默可以在受试者中提供改善的安全性特征，因为野生型HTT的表达和功能在细胞中得以保留。本发明的多个方面涉及发明人的认识和认识，即以非等位基因特异性方式引入靶向HTT基因的一个或多个抑制性RNA(例如，miRNA)序列同时驱动明确的(hardened)野生型HTT基因(未被miRNA靶向的野生型HTT基因)的表达的分离的核酸和载体能够实现伴随的突变体HTT敲降，例如在CNS组织中，并具有增加的野生型HTT的表达。通常，编码内源野生型和突变体HTT mRNA的核酸序列以及编码“明确的”野生型HTT mRNA的转基因的核酸是充分不同的，使得“明确的”野生型HTT转基因mRNA不被一个或多个抑制性RNA(例如，miRNA)靶向。例如，这可以通过在HTT转基因序列中引入一个或多个沉默突变以使其编码与内源野生型HTT基因相同的蛋白但具有不同的核酸序列来实现。在这种情况下，外源mRNA可以称为“明确的”。或者，抑制性RNA(例如，miRNA)可以靶向内源野生型HTT mRNA的5'和/或3'非翻译区。然后可以在转基因mRNA中除去或替换这些5'和/或3'区域，使得转基因mRNA不被一个或多个抑制性RNA靶向。
可以在转基因中提供的报道序列(例如，编码报告蛋白的核酸序列)包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和本领域熟知的其他物质的DNA序列。当与驱动其表达的调节元件相连时，报告序列提供可通过常规手段检测的信号，包括酶、射线照相、比色、荧光或其他光谱学测定，荧光激活细胞分选测定和免疫测定(包括酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射免疫分析(RIA)和免疫组化。例如，在标记序列是LacZ基因的情况下，通过β-半乳糖苷酶活性的测定来检测携带该信号的载体的存在。在转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶的情况下，携带信号的载体可以通过在发光计中的颜色或光产生目测测量。例如，此类报道分子可用于验证核酸的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调控活性。
重组腺相关病毒(rAAV)
在一些方面，本公开提供了分离的AAV。如本文关于AAV所用，术语“分离的”是指人工产生或获得的AAV。可以使用重组方法产生分离的AAV。此类AAV在本文中称为“重组AAV”。重组AAV(rAAV)优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的核酸酶和/或转基因被特异性递送至一个或多个预定组织。AAV衣壳是决定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可以选择具有适合于被靶向组织的衣壳的rAAV。
获得具有所需衣壳蛋白的重组AAV的方法是本领域熟知的。(参见，例如，US2003/0138772)，其内容通过引用整体并入本文。通常，该方法涉及培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因的重组AAV载体；和足够的辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由AAV的cap基因编码的结构蛋白。AAV包含三种衣壳蛋白，病毒体蛋白1至3(命名为VP1、VP2和VP3)，所有这些都通过可变剪接从单个cap基因转录而来。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3的分子量分别为约87kDa、约72kDa和约62kDa。在一些实施方案中，在翻译时，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。
在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有选自AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白具有衍生自非人类灵长类动物的血清型，例如AAVrh8血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白是AAV9血清型。在一些实施方案中，AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO：20中所示的序列。
在宿主细胞中培养以将rAAV载体包装在AAV衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一个或多个所需组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞使用本领域技术人员已知的方法工程化以含有一个或多个所需组分。最合适的是，这种稳定的宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的所需组分。但是，所需的组分可处于组成型启动子的控制之下。在适合与转基因一起使用的调控元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选定的稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的选定组分，以及在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择的组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员可以产生其他稳定的宿主细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码蛋白的编码序列(例如，野生型亨廷顿蛋白，任选地“明确的”野生型亨廷顿蛋白)。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。
可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开的rAAV所需的重组AAV载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人，J.Virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法产生重组AAV(在美国专利号6,001,650中详细描述)。通常，通过用待包装成AAV颗粒的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体(accessory function vector)转染宿主细胞来产生重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，其对生产性的AAV复制和衣壳化而言以反式起作用。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(即，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。适用于本公开的载体的非限制性实例包括pHLP19，描述于美国专利号6,001,650中，和pRep6cap6载体，描述于美国专利号6,156,303，其全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码非AAV起源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于其复制(即“附属功能”)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。
在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞对外来DNA的摄取，并且当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞已经被“转染”。大量转染技术在本领域是通常已知的。参见，例如，Graham等，(1973)Virology,52:456,，Sambrook等，(1989)MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York，Davis等，(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier，和Chu等，(1981)Gene 13：197。此类技术可用于将一个或多个外源核酸(例如核苷酸整合载体和其他核酸分子)引入合适的宿主细胞中。
“宿主细胞”是指携带或能够携带目标物质的任何细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作AAV辅助构建物、AAV小基因质粒、附属功能载体或与重组AAV产生相关的其他转移DNA的接受者。该术语包括已经转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态或基因组或总DNA补充物(DNA complement)上可能不必与原始亲本完全相同。
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延续生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群。本领域进一步已知，在这类克隆群体的储存或转移期间，核型中可发生自发或诱导的变化。因此，源自所提及的细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不精确相同，并且所述细胞系包括这些变化。
如本文所用，术语“重组细胞”是指已引入外源DNA区段(例如导致生物活性多肽转录或产生生物活性核酸(例如RNA)的DNA区段)的细胞。
如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，当与适当的控制元件结合时其能够复制，并且其可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达运载体(vehicles)，以及病毒载体(vectors)。在一些实施方案中，预期有用的载体是其中待转录的核酸区段位于启动子转录控制下的那些载体。“启动子”是指由启动基因特异性转录所需的细胞合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。短语“有效定位的”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和基因的表达。术语“表达载体或构建物”意指含有核酸的任何类型的遗传构建物，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如，以从转录的基因产生生物活性多肽产物或功能性RNA(例如，指导RNA)。用于将重组载体包装在期望的AAV衣壳中以产生本公开的rAAV的前述方法不意味着限制，并且其他合适的方法对于技术人员是明显的。
在一些实施方案中，本文提供的序列(包括序列表中提供的序列)中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸或尿苷(U)核苷酸可以用适合具有腺苷核苷酸的碱基配对的任何其他核苷酸替换(例如，通过Watson-Crick碱基对)。例如，在一些实施方案中，本文提供的序列(包括序列表中提供的序列)中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸可以适当地用尿苷(U)核苷酸替换，反之亦然。
施用方式
可以根据本领域已知的任何适当方法将本公开的组合物中的rAAV递送至受试者。例如，rAAV，优选悬浮在生理学上相容的运载物(即，在组合物中)中的rAAV，可以施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。
将rAAV递送至哺乳动物受试者可以通过例如肌内注射或通过施用至哺乳动物受试者的血流中。可以通过注射到静脉、动脉或任何其他血管中来施用到血流中。在一些实施方案中，通过分离的肢体灌注将rAAV施用到血流中，所述分离的肢体灌注是外科领域中公知的技术，该方法基本上使技术人员能够在施用rAAV病毒体之前将肢体与体循环分离。本领域技术人员还可以使用分离的肢体灌注技术的变体(描述于美国专利号6,177,403中)将病毒体施用到分离的肢体的脉管系统中以潜在地增强对肌肉细胞或组织的转导。此外，在某些情况下，可能需要将病毒体递送至受试者的CNS。“CNS”是指脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊髓液(CSF)、间质空间、骨、软骨等。使用针、导管或相关装置并使用本领域已知的神经外科技术，例如通过立体定向注射(参见，例如，Stein等，J Virol 73：3424-3429,1999；Davidson等，PNAS 97：3428-3432,2000；Davidson等，Nat.Genet.3：219-223,1993；和Alisky和Davidson，Hum.Gene Ther.11：2315-2329，2000)，重组AAV可以通过注射到例如心室区域以及纹状体(例如，纹状体的尾状体核或壳核)、脊髓和神经肌肉连接或小脑小叶，直接递送至CNS或脑。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用本公开中描述的rAAV。在一些实施方案中，通过脑内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过纹状内注射施用rAAV。在一些实施方案中，通过颅内注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过小脑延髓池注射递送rAAV。在一些实施方案中，通过脑侧脑室注射递送rAAV。
本公开的多个方面涉及包含重组AAV的组合物，所述重组AAV包含衣壳蛋白和编码转基因的核酸，其中所述转基因包含编码一个或多个miRNA的核酸序列。在一些实施方案中，每个miRNA均包含在SEQ ID NO：2-10任一项所述的序列。在一些实施方案中，核酸还包含AAV ITR。在一些实施方案中，rAAV包含由SEQ ID NO：16-19中任一个所示序列或其部分表示的rAAV载体。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的运载物。
本公开的组合物可包含单独的rAAV，或其与一个或多个其他病毒(例如，具有一个或多个不同转基因的第二rAAV)的组合。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的rAAV，每个rAAV均具有一个或多个不同的转基因。
考虑到rAAV所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载物。例如，一种合适的运载物包括盐水，其可以用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其他示例性运载物包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载物的选择不是对本公开的限制。
任选地，除了rAAV和运载物之外，本公开的组合物还可以含有其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
rAAV被以足够的量施用以转染所需组织的细胞，并提供足够水平的基因转移和表达而没有不适当的不良影响。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所选器官(例如，门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其他胃肠外(parental)施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
实现特定“治疗效果”所需的rAAV病毒体的剂量，例如基因组拷贝/每千克体重(GC/kg)的剂量单位，将基于若干因素而变化，包括但不限于：rAAV病毒体施用途径，达到治疗效果所需的基因或RNA表达水平，所治疗的特定疾病或病症，以及基因或RNA产物的稳定性。基于上述因素以及本领域熟知的其他因素，本领域技术人员可以容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV病毒体剂量范围。
有效量的rAAV是足以靶向感染动物、靶向期望组织的量。在一些实施方案中，有效量的rAAV是足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量主要取决于诸如受试者的物种，年龄，体重，健康状况和待靶向的组织等因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，rAAV的有效量通常在约1ml至约100ml含有约109至1016基因组拷贝的溶液的范围内。在一些情况下，约1011至1013rAAV基因组拷贝之间的剂量是合适的。在某些实施方案中，1012或1013rAAV基因组拷贝对靶向CNS组织是有效的。在一些情况下，通过多个剂量的rAAV产生稳定的转基因动物。
在一些实施方案中，以每个日历日(例如，24小时)不超过一次将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以每个日历周不超过一次(例如，7个日历日)将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以不超过每两周一次(例如，在两个日历周时间内一次)将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以每个日历月不超过一次(例如，在30个日历日中一次)将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以每六个日历月不超过一次将rAAV剂量施用于受试者。在一些实施方案中，以每个日历年不超过一次(例如，365天或闰年时366天)将rAAV剂量施用于受试者。
在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高浓度rAAV的情况下(例如，～1013GC/ml或更高)。减少rAAV聚集的方法是本领域公知的，并且包括例如添加表面活性剂、pH调节、盐浓度调节等。(参见，例如，Wright FR等，Molecular Therapy(2005)12,171-178，其内容通过引用并入本文。)
药学上可接受的赋形剂和运载物溶液的配制对于本领域技术人员来说是公知的，也可以开发合适的剂量和治疗方案用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物。
通常，这些制剂可含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化，并且可以方便地在总制剂重量或体积的约1或2％至约70％之间或80％或更多之间。当然，可以制备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量，使得在任何给定单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备此类药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品架存期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因此，各种剂量和治疗方案可能是可取的。
在某些情况下，希望通过皮下、胰腺内(intraopancreatically)、鼻内、肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入递送本文公开的适当配制的药物组合物中的基于rAAV的治疗构建物。在一些实施方案中，可使用如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用整体并入本文)中所述的施用方递送rAAV。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过门静脉注射。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或用于临时制备无菌注射溶液或分散液的分散液和无菌粉末。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的并且是易于注射程度的流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。运载物可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000ml的皮下输液流体中或者在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的状况，剂量的一些变化必然发生。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体宿主的适当剂量。
通过将所需量的活性rAAV根据需要与本文列举的各种其他成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌运载体中来制备分散液，所述无菌运载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
本文公开的rAAV组合物还可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)并且其与无机酸形成，诸如例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。
如本文所用，“运载物”包括任何和所有溶剂、分散介质、运载体、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、运载物溶液、悬浮液、胶体等。这类用于药物活性物质的介质和药剂的使用是本领域熟知的。补充性活性成分也可以被掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。
递送运载体如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，可以配制递送转基因的rAAV载体以用于递送，或将其包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。
此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或rAAV构建物的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。最近，开发出具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物运载物的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
脂质体已经成功地与许多细胞类型一起使用，这些细胞类型通常对其他程序的转染具有抗性。此外，脂质体没有DNA长度限制，而这对于基于病毒的递送系统是常见的。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成个多个检查脂质体介导的药物递送的有效性的成功的临床实验。
脂质体由磷脂形成，磷脂分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV通常具有25nm至4μm的直径。MLV的超声处理导致小单层囊泡(SUV)的形成，其直径在200至的范围内，含有在核心中的水性介质。
或者，可以使用rAAV的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定且可重现的方式捕获物质。为了避免由于细胞内聚合物过载引起的副作用，应该使用能够在体内降解的聚合物设计这类超细颗粒(大小约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。
除了上述递送方法之外，还考虑以下技术作为将rAAV组合物递送至宿主的替代方法。已经使用超声导入(即，超声)并在美国专利号5,656,016中有描述，作为增强药物渗透进入和通过循环系统的速率和功效的装置。考虑到的其他药物递送替代方式是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼科制剂(Bourlais等，1998)、透皮基质(美国专利号5,770,219和5,783,208)和反馈控制的递送(美国专利号5,697,899)。
试剂盒和相关组合物
在一些实施方案中，本文所述的药剂可以组装成药物试剂盒或诊断试剂盒或研究试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的用途。试剂盒可包括容纳本公开的成分和使用说明的一个或多个容器。具体地，此类试剂盒可包括本文所述的一个或多个药剂，以及描述预期应用和这些药剂的正确使用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以处于适合于特定应用和药剂施用方法的药物制剂和剂量中。用于研究目的的试剂盒可包含用于进行各种实验的适当浓度或量的组分。
在一些实施方案中，本公开涉及一种试剂盒，其用于生产rAAV，所述试剂盒包括容纳分离的核酸的容器，所述分离的核酸包含含有SEQ ID NO：2-10任一项所述的序列的miRNA或由SEQ ID NO：2-10任一项所述的序列编码的miRNA。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含容纳分离的核酸的容器，所述分离的核酸编码AAV衣壳蛋白，例如AAV9衣壳蛋白。
可以设计该试剂盒以便于研究人员使用本文所述的方法，并且可以采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物都可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的(constitutable)或可加工的(例如，至活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或细胞培养基)，其可以与或可以不与该试剂盒一块提供。如本文所使用的，“说明书”可以定义指导和/或倡议的内容，并且通常涉及对本公开的包装方面的或与本公开的包装相关的书面说明。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，使得用户将清楚地认识到说明书与该试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的通信等。书面说明书可以采用管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书也可反映制造、使用或销售动物管理机构的批准。
试剂盒可以在一个或多个容器中包含本文所述的任何一个或多个组分。作为实例，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一个或多个组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。试剂盒可包括容纳本文所述药剂的容器。药剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。可无菌制备药剂，包装在注射器中并冷藏运输。或者，它可以容纳在小瓶或其他容器中用于储存。第二容器可以具有无菌制备的其他药剂。或者，试剂盒可包括预混合的并在注射器、小瓶、管或其他容器中运输的活性剂。
通过以下实施例更详细地描述本发明的示例性实施方案。这些实施例是本发明的示例，本领域技术人员将认识到，本发明不限于示例性实施例。
实施例
实施例1：材料和方法
细胞培养和筛选测定
将HeLa细胞维持在高葡萄糖DMEM(具有10％热灭活的FBS和1％青霉素链霉素)(ThermoFisher)中。转染前24小时，将细胞以0.8-1.0×106细胞/孔接种到6孔板上。在转染当天，用1.6ml Opti-MEM(ThermoFisher)代替生长培养基。使用2μl/孔的DharmaFECT Duo(Dharmacon)转染质粒。每孔接受0.6μg质粒DNA。转染后48小时，收获细胞并使用MirVanaRNA分离试剂盒提取总RNA。使用寡dT和Superscript III(Invitrogen)，使用1μg RNA/反应产生cDNA。使用TaqMan测定法(ThermoFisher)测量亨廷顿mRNA。使用ΔΔC(T)方法用人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)作为持家基因，计算亨廷顿mRNA的相对水平。
小鼠饲养、注射和维持
获得YAC128和野生型FVB小鼠。通过将野生型雄性小鼠与YAC128雌性交配，在FVB背景上繁殖小鼠。将得到的杂合YAC128和野生型小鼠维持在12:12光照时间表，并随意获得食物和水。通过从尾部剪下的组织或耳部打孔获得的组织提取的DNA的PCR，验证基因型。利用UMPC3或UMPC4显微注射器(World Precision Instruments，Sarasota，FL)辅助的小动物立体定位仪SAS-4100(ASI Instruments，Warren，MI)用选择的AAV直接注射到小鼠纹状体中。用284mg/kg三溴乙醇麻醉小鼠并置于立体定位仪中。使用前囟点作为零点，测量前部1.0mm、侧部2.0mm，并将33规格针头降低3.0mm至纹状体中，进行手术。设定泵为以125nl/分钟的速率输送3.0ul。在注射后，允许小鼠在加热垫上恢复，然后放回到饲养区域中的笼子中。
组织提取
在适当的时间点，处死小鼠并提取组织用于RNA分析或免疫组织化学。对于RNA提取，将小鼠麻醉并通过颈脱位法处死。取出脑并解剖出纹状体。可用时，GFP表达用于指导解剖，以便仅分析GFP阳性组织。将组织立即置于RNALater(Ambion)中。随后将它们在-80℃下冷冻保存。在实验结束时，将用于免疫细胞化学的小鼠深度麻醉并用盐水心内灌注，然后用4％多聚甲醛灌注。将样品在冷的2％多聚甲醛中固定过夜，然后在4℃下储存在磷酸盐缓冲盐水中。通过在Leica VT1000s振动切片机上切40微米切片制备冠状切片。
小鼠行为
平衡木行走：训练小鼠穿过(平衡木大小)平衡木。训练后，当小鼠从平衡木的一端穿过另一端时记录小鼠。每只小鼠记录三次试验。基于记录，测量小鼠从平衡木一端上的标记穿过另一端所花费的时间量。
居家笼活动：将小鼠单独置于自动家居笼表型分析扫描系统(Clever Sys，Inc.，Reston VA)中26小时。为了计算每小时的平均活动时间，删除小鼠适应新环境期间第一小时的数据；然后计算总记录时间减去一小时后行走所花费的总时间。
免疫组织化学和定量
将固定的组织切片用3％过氧化氢封闭3分钟，然后用0.5％triton x孵育20分钟。使用Vector Laboratories Elite ABC试剂盒，针对兔或小鼠来源的抗DARPP32(Abcamab40801；1：10,000稀释)、抗Iba1(Wako 019-19741；1：1,000稀释)、抗GFP(LifeTechnologies G10362；1：1000)和抗NeuN(EMD Millipore MAB377；1：1000稀释)抗体进行免疫细胞化学。使用Metal Enhanced DAB Substrate Kit(Pierce)，用二氨基联苯胺将切片染色2分钟。
小RNA文库克隆和分析
使用MirVana RNA分离试剂盒提取总RNA。在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上使用5μg总RNA进行18-30核苷酸RNA的大小选择。在大小选择后，将小RNA乙醇沉淀并连接到预腺苷酸化的3'-衔接子(5'-rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3'；SEQ ID NO：11)。将连接产物与RT引物(5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'；SEQ ID NO：12)退火并连接至5'-衔接子(RNA：5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3'；SEQ ID NO：13)。使用AMV逆转录酶混合物(NEB)进行逆转录并使用AccuPrime Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR扩增，使用一条通用引物(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA-3'；SEQ ID NO：14)和一条条码化引物(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'；SEQ ID NO：15)。对文库进行测序并将其定位于mm9基因组和AAV基因组。基于miRNA发夹上5'末端定位的位置对miRNA种类进行分类，因此每个种类均由具有共有种子序列的所有小RNA组成。种类分配中没有考虑3'末端。使用edgeR包分析内源miRNA的差异表达。
mRNA文库克隆和分析
如上所述提取RNA。通过标准方法构建文库。使用topHat2定位读数，并使用deseq2包计算差异表达。
绵羊实验
将亨廷顿病转基因绵羊模型(例如，表达致病性人类亨廷顿蛋白的转基因绵羊)注射scAAV9-CBA-mir-HTT(包含mir-155骨架中的mi-6433)、scAAV-U6-mir-HTT(包含mir-155骨架中的mi-6433)或空scAAV9对照载体。在注射后一个月或六个月处死绵羊。制备组织和核酸样品并通过定量PCR和免疫组织化学进行分析。
实施例2：小鼠体内实验
靶向亨廷顿基因的人工miRNA的设计和选择
测试了靶向人类亨廷顿蛋白mRNA的9种序列(表1，图1)。图4A中提供了描绘九种靶向序列的位置的示意图。将两个拷贝的人工miRNA串联克隆到基于内源miRNA-155或miR-30的骨架中，并将整条人工miRNA插入EGFP的3'-UTR中(图5A，顶部)。基于mir-155和基于mir-30的抗HTT amiRNA的预测的发夹结构分别显示在图25A-25B中。将得到的质粒转染到Hela细胞中。48小时后，收获细胞并通过定量RT-PCR(qRT-PCR)测量内源性亨廷顿mRNA的水平。9种人工miRNA中的三种使亨廷顿蛋白减少超过50％(图1-2和4B-4C)。
表1：亨廷顿基因mir目标
选择来自初始筛选的三个序列用于体内实验。还测试了基于已知siRNA(E1.4)的人工miRNA。将候选序列包装到自身互补的AAV9载体中，并将其直接注射到表达具有约128个聚谷氨酰胺编码重复片段的人类亨廷顿基因的转基因小鼠的纹状体中(Yac128小鼠)。一个月后，以三种不同剂量评估AAV9的分布和GFP报告基因的表达。在最高剂量，GFP染色存在于整个纹状体中(图11A)并且在用AAV9-CβA-抗-HTT-6433(P＝0.006)或AAV9-CβA-抗-HTT-5155(p＝0.013，图4C；使用mir-155骨架)处理的小鼠中人亨廷顿蛋白mRNA显著减少。减少载体的剂量导致GFP表达降低(图11A)，并且在1:10稀释度下，未实现人类亨廷顿mRNA的显著降低(图11B)。图11C提供了以三种不同剂量注射编码靶向亨廷顿基因的miRNA和EGFP两者的载体的小鼠的代表性照片。
自U6启动子表达的人工miRNA未改善亨廷顿基因的沉默
将最有效的miRNA(HTT-6433)的单拷贝克隆到AAV9载体中，处于U6启动子控制下(图5A，底部)。用原始的两拷贝AAV9-CBA-抗-HTT-6433(包含SEQ ID NO：XX)、AAV9-CBA-抗-HTT-5155、AAV9-U6-抗-HTT-6433(包含SEQID NO：XX)或AAV9-U6-抗-HTT-5155单侧注射小鼠。一个月后，收获纹状体并确认GFP表达，并通过qRT-PCR测量亨廷顿mRNA的水平。无论人工miRNA的序列如何，用AAV9-U6-抗-HTT和AAV9-CBA-抗-HTT处理的小鼠之间的敲降没有显著差异。在用AAV9-U6-抗-HTT-6433和AAV9-CBA-抗-HTT-6433处理的小鼠中，注射侧的亨廷顿mRNA的量约为未注射侧的量的50％(图5B)。注意，针对每只动物，使用对侧(未注射)作为对照减少了动物间的变异性。在单侧注射AAV9-GFP的小鼠中，偶尔会观察到对侧的少量GFP阳性神经元，表明一些病毒扩散到未注射的一侧。因此，使用对侧作为对照可能低估敲降。为了消除使用对侧作为对照的潜在混杂效应，使用仅注射PBS的一组动物作为对照重复实验。数据表明AAV9-U6-抗-HTT-6433和AAV9-CBA-mir-HTT-6433均使亨廷顿mRNA减少约50％(图5C)。
自U6启动子的mir-HTT-6433的长期纹状体表达在小鼠中是有毒的
将AAV9-U6-抗-HTT-6433或AAV9-CBA-抗-HTT-6433直接单侧注射到Yac128小鼠的纹状体中。注射后6个月，观察到注射AAV9-U6-抗-HTT-6433的小鼠没有搭巢，并且一些表现出过度活跃的表型。为了记录这些异常情况，更换了每个笼子中的小巢。24小时后，AAV9-U6-抗-HTT-6433的新小巢未被使用，而注射PBS和AAV9-CBA-抗-HTT-6433的小鼠如预期的那样搭了巢(图6A)。使用居家笼监测系统，记录小鼠24小时。与用PBS或用AAV9-CBA-抗-HTT-6433处理的小鼠相比，用AAV9-U6-抗-HTT-6433处理的小鼠在其居家笼周围移动花费的时间显著更多(图6B)。还测量了小鼠穿过平衡木所花费的平均时间。对于该测试，要求小鼠完成三次穿越。平均而言，AAV9-CBA-抗-HTT-6433处理的小鼠往往比仅接受PBS注射的小鼠更快地穿越(图3和12A)。在AAV9-U6-抗-HTT-6433组中剩余的四只小鼠中，两只不能成功穿越，无论是跳跃还是从平衡木上跌落(图12A)。在对较老的Yac128小鼠(7个月大)进行的第二个实验中，观察到与年龄相关的穿过平衡木的时间增加。这种增加存在于原初的小鼠和用AAV9-CBA-抗-HTT-6433处理的小鼠中，并且在用AAV9-U6-抗-HTT-6433处理的小鼠中加速(图12B)。
神经病理学发现与上述行为结果相关。在注射侧，AAV9-U6-抗-HTT-6433小鼠显示心室扩大、DARPP-32阳性神经元丧失和纹状体收缩(图7A-7B)。在剩余的纹状体中，它们表现出增加的Iba1染色(图8A，底部)、总体和活化的小胶质细胞的增加和静息小胶质细胞数量的减少(图8B-8D)。向野生型C57Bl/6小鼠和FVB小鼠注射相同的载体，并评估U6驱动的miR的结果，以确定毒性是否依赖于该背景下突变体亨廷顿基因的存在。在FVB小鼠中，效果类似于Yac128小鼠，其在平衡木上快速退化并具有严重扩大的心室。然而，在C57BL6小鼠中，存在效果但不太明显。虽然在U6群组中穿过平衡木的时间存在初始增加，但在研究终点处，组之间没有显著差异(图13A)。在C57BL6小鼠中纹状体收缩也不太严重(图13B)。
自U6启动子的靶向亨廷顿基因的人工miRNA的表达导致靶向亨廷顿基因的小RNA的过表达
小鼠各组单侧注射自U6和CβA启动子表达人工miRNA 6433的scAAV9载体。克隆并测序注射后两周产生的小RNA。在这两组中，96％的定位到AAV基因组的序列定位到预期的小RNA产物，只有一小百分比代表不精确的Dicer或Drosha切割。在注射U6启动子驱动的人工miRNA的组中，靶向亨廷顿基因的序列主导测序结果，占所有可定位序列的一半(50％)，而在注射CBA载体的小鼠中，只有5％的序列与载体编码的小RNA匹配(图9A)。因此，潜在地，具有替代种子序列(包括有义链和滑移产物(slippage product))的小RNA可以以与功能性内源miRNA的水平相当的水平存在(图9A)。通过qPCR测量靶向亨廷顿基因的小RNA的相对量，以确认靶向亨廷顿基因的序列的过表达。观察到在注射U6启动子驱动的构建物的小鼠中，小RNA的表达高150至250倍(图9B)。
内源miRNA30序列通常用作人工miRNA的支架。为了确定来自该支架的isomir谱是否更有利，我们将抗-HTT-6433序列包埋在miR-30骨架中并注射到10周龄的Yac128小鼠中(图9C)。mir-30支架产生成熟人工miRNA的水平与由CβA启动子产生的水平相当(图9A)，并且使人类亨廷顿蛋白减少接近50％。与mir-155支架不同，mir-30支架产生成熟有义(乘客)链的水平与反义(引导)链相当。CβA启动子与mir-155骨架的组合仅产生高于背景的预期反义链(图9A)。
尽管样品中超过一半的读数可以定位到AAV编码的人工miRNA，但是靶向亨廷顿基因的人工miRNA的过表达对内源miRNA的分布具有最小的影响(图14A-14B)。事实上，当注射组与非注射(对侧)侧进行比较时观察到最大的差异，这表明注射本身产生miRNA谱的局部变化。这可能反映了针对损伤的局部炎症反应，其可能随着时间的推移而消退(resolve)。
自U6启动子的靶向亨廷顿基因的人工miRNA的表达破坏了多种mRNA的表达
进行用AAV9-U6-抗-HTT-6433或AAV9-CBA-抗-HTT-6433处理的小鼠纹状体的RNAseq分析，以研究靶向亨廷顿基因的miRNA的过表达的后果。注射后两周，比较注射侧和未注射侧的纹状体mRNA谱。数据表明用CBA-mirHTT-6433处理的小鼠几乎没有显著差异(图14A)。在用AAV9-U6-抗-HTT-6433处理的小鼠中，观察到增加的mRNA和响应于处理而减少的mRNA二者(图14B)。当在两周比较AAV9-U6-抗-HTT-6433和AAV9-CBA-抗-HTT-6433的谱时，观察到在这两组之间仅有8个mRNA显著差异地表达。根据人工miRNA的预测靶位点的存在或不存在对RNA进行分选，并绘制靶位点存在或不存在的mRNA的变化的累积分布。在注射AAV-U6-6433的小鼠中，观察到朝向其3'-UTR中含有与最丰富的AAV起源的小RNA种类匹配的完美8mer靶位点的基因的下调的小移位(图10B)。在用AAV-CBA-6433注射的小鼠(图10A)和任何其他AAV起源的小RNA种类(图15A-15C)中，这种移位都不明显。
实施例3：绵羊体内实验
在该实施例中使用人类亨廷顿病绵羊模型。简而言之，产生了表达人类亨廷顿蛋白(人类htt)蛋白的转基因绵羊。用scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体纹状体内注射绵羊。每个构建物包含插入位于内含子内的mir-155骨架的抗亨廷顿蛋白mir-6433序列(SEQ ID NO：7)的单拷贝以及β-球蛋白多腺苷酸化序列，所述内含子分别位于CBA启动子或U6启动子之间。用于产生本实验中施用的rAAV的构建物在SEQ ID NO：18(scAAV9 CBA-mir-HTT)和19(scAAV9 U6-mir-HTT)中列出。
在注射后一个月或六个月处死绵羊。制备组织和核酸样品，并通过定量PCR和免疫组织化学进行分析。
数据表明，与未注射的和空scAAV9注射的对照小鼠相比时，在一个月的时间点，注射在U6启动子下表达的mir-HTT导致绵羊中尾状体和中壳核二者中的htt表达减少。图16显示与注射scAAV9 U6-mir-HTT一个月后绵羊中尾状体中人htt表达减少有关的数据。图17显示了与注射scAAV9U6-mir-HTT一个月后绵羊模型的中壳核中人亨廷顿蛋白表达减少有关的数据。注意，与前一实施例中描述的小鼠模型不同，由U6启动子表达的mir-HTT在亨廷顿病绵羊模型中是无毒的。
数据表明，与未注射的和注射空scAAV9的对照小鼠相比，在6个月的时间点，注射在CBA启动子下表达的mir-HTT导致绵羊中尾状体和中核壳中的htt表达减少。
图18和19显示了与绵羊中尾状体的内侧(图18)和外侧(图19)的人类htt表达减少有关的数据。数据表明，与脑的未注射侧和空scAAV9注射的对照小鼠相比，由CBA启动子表达的mir-HTT导致脑注射侧中人htt表达的减少。还比较了注射后6个月，来自CBA和U6启动子的mir-HTT表达对中尾状体中htt沉默的影响。数据表明，与非注射和空scAAV9注射的对照动物相比，从U6启动子或CBA启动子表达的mir-HTT导致中尾状体中人htt表达的减少(图20)。
图21和22显示了与注射后6个月的绵羊中壳核的外侧(图21)和内侧(图22)的人类htt表达减少有关的数据。数据表明，与脑的未注射侧和空scAAV9注射的对照小鼠相比，由CBA启动子表达的mir-HTT导致脑注射侧中人htt表达的降低。还比较了注射后6个月，来自CBA和U6启动子的mir-HTT表达对中尾状体中htt沉默的影响。数据表明，与非注射和空scAAV9注射的对照动物相比，从U6启动子或CBA启动子表达的mir-HTT导致中壳核中人htt表达的减少(图23)。
图24显示了在纹状体内注射scAAV9 CBA-mir-HTT(“CBA启动子”)、scAAV9 U6-mir-HTT(“U6启动子”)或空scAAV9对照载体六个月后，亨廷顿病绵羊模型的前纹状体中人亨廷顿(人类htt)RNA相对表达有关的数据。
实施例4：人工miRNA在亨廷顿病转基因绵羊模型中减少整个纹状体中的人突变体亨廷顿蛋白
动物和动物程序
在该实施例中使用了美利奴绵羊。在施用麻醉剂之前，将动物过夜禁食约8小时。对动物进行术前体检，包括心率、呼吸频率、体温和体重。收集血清(5ml)和CSF的基线样品。
用两组不同的绵羊在两个部分中进行该研究。对于第一项研究，41只年龄约8个月的转基因动物(21只阉羊，20只母羊)单侧注射300μl自身互补的AAV9(scAAV9)载体，其滴度为对总共3x1012基因组拷贝而言的1×1013GC/ml。对于第二项研究，14只14个月的动物注射该载体，并且14只注射对照载体。将钆添加到载体制剂中以允许注射扩散的手术后成像。将动物移至手术室并准备手术。他们被放置在泡沫垫上的sphinx位置，折叠四肢或四肢悬垂。立体定向框架(Kopf，大型动物)用于将动物的头部固定到位。使用19号脊柱穿刺插管(tapcannula)通过腰椎穿刺收集脑脊髓液。将rAAV直接递送至纹状体，靶向内囊。将动物的头部剃毛，用聚维酮碘备皮，并用透明塑料覆盖。使用#15手术刀制作曲线切口以暴露前囟。一旦识别出前囟，就使用电钻将3-4mm的钻孔布置在前囟前端(rostral to bregma)10mm处和中线11mm侧。将对流增强递送(CED)插管(MRI Interventions，Irvine，CA)固定在操纵器中，并用待注射药剂注满以从线上除去空气。使用#11手术刀用1.5mm切口打开硬脑膜，并且将CED插管从硬脑膜表面推进至目标深度25mm。外插管(1.65mm)密封硬脑膜切口以防止输注期间CSF泄漏。在插管插入后5分钟开始输注，以使尖端周围的组织稳定。输注速率设定为3.33μl/分钟，直至注射总体积为300μl。输注完成10分钟后，缓慢抽出插管，并使用骨蜡塞修复颅骨并防止CSF泄漏。用盐水清洗伤口并使用3.0vicryl缝线封闭。遵循标准麻醉唤醒和恢复程序。手术后进行MRI以确定钆的扩散。第一项研究中的一只动物在手术后被排除，因为在成像时没有看到钆，并且排除了第二项研究的第二只动物，因为钆似乎主要在脑室中。手术后，将动物保持观察3天，然后在室内饲养5天。然后将它们转移到室外并在研究的剩余部分在围场中室外饲养。视觉监测动物在整个研究中的痛苦迹象和行为变化。两只动物患有手术并发症，导致部分肢体麻痹。这被认为是归因于动物在麻醉下的定位。一只早期麻醉，一只从六个月的群组移至一个月的群组中。在整个注射后期间定期称重动物，取出脑脊液、血液和血清样品并保存用于进一步分析。
为了细胞计数和区分，通过颈静脉静脉穿刺收集血液至钾EDTA血液收集管(淡紫色盖子；LT)并进行完整的分类血液检查(CBE分类)。为了进行临床化学，通过颈静脉静脉穿刺将血液收集到血清收集管(红色盖子；RT)中。提交样品用于多种生化分析(MBA)。
在注射后一个月和六个月收获动物，将动物用于组织学或生化分析。将动物运送到手术台并置于腹侧卧位，同时收集约6mL的CSF。动物重新置于背侧卧位。暴露颈动脉并在距离插管尖端4cm的深度插入插管。暴露颈静脉并将200-500U肝素/kg注入颈静脉。施用肝素5分钟后，通过静脉注射1ml/2kg体重的Lethabarb(325mg戊巴比妥钠/ml)使绵羊安乐死。输液泵用冷的9％NaCl注满并连接到颈动脉插管。在500mmHg的压力下用约8L冷的9％NaCl灌注动物。对于组织学，将输注换成8L 4％多聚甲醛，压力为500mmHg。提取脑和肝脏。将组织在4％多聚甲醛中在4℃下后固定24小时，并在4℃下转移至1X磷酸盐缓冲盐水中的30％蔗糖至少14天。
对于RNA、蛋白和DNA测定，如上所述用冷的9％NaCl灌注绵羊。外周组织的收集按以下顺序进行：肝脏、肾上腺、卵巢(如果适用)、肌肉和心脏。通过使用不同的仪器和用10％漂白剂和70％乙醇洗涤尸检表面来防止交叉污染。从尸体中取出器官，并使用3mm活检穿孔器收集样品。从每个器官收集总共10个样品；将两个样品在液氮中快速冷冻，并将8个样品在4℃下储存在RNA later中24小时(300μl RNA later用于肝脏、肌肉和心脏样品，500μlRNA later用于肾上腺和卵巢样品)。
使用圆锯和骨钳将脑从颅骨中取出。在取出后，将脑称重并腹侧放置在定制的有机玻璃脑基体中。切割脑9次，以在4 6mm块中完全容纳纹状体。第一次切割在嗅球附件后面(距离基体开始约18mm)，随后的4次切割以6mm间隔进行。纹状体从后到前分成4个6mm的块：2p(后)、2m1(内侧1)、2m2(内侧2)和2a(前侧)。纹状体解剖按以下顺序进行：2p、2m1、2a。首先在所有块中解剖右侧(未注射的)半球的纹状体，并在半球之间更换手术刀片。在干冰上的培养皿中进行解剖，并注意尽可能多地从纹状体组织中除去白质。一旦剖出，将纹状体块(尾状体和核壳)分成两半；将内侧块(最接近块的中线)在4℃下储存在1ml RNA later中，并将外侧块在液氮中快速冷冻。完成CBA研究中6个月的群组的纹状体解剖，方式为产生来自尾状体和壳核二者的四个纹状体样品。背部切片(内侧和外侧二者)在液氮中快速冷冻，并且腹侧切片(内侧和外侧二者)在4℃下储存在1ml RNA later中。二十四小时后去除RNAlater，并将样品保存在-80℃。
将2m2块用OCT充分覆盖并在2-甲基丁烷和干冰浴中冷冻。2a、2m1和2p块的剩余部分以相同方式冷冻。以从背部至腹部方式从每个块中取出10个皮质样品；两个在液氮中快速冷冻，8个在4℃下储存在1ml RNA later中。
用于组织学分析的组织切片
在用于组织学分析的组织切片之前，从脑中分离纹状体，用OCT充分覆盖，并在-20℃下储存24小时。用滑动切片机(Reichert-Jung Tetrander滑动切片机)通过整个纹状体切割厚度为40μm的冠状切片。将切片在4℃下储存于1X磷酸盐缓冲盐水中的0.01％叠氮化钠中。
载体克隆和rAAV9生产
对于第一项研究，测试载体含有U6启动子，其驱动基于内源mir155骨架的人工miRNA(AAV9-U6-miRHTT)。人工miRNA靶向人类但不是绵羊亨廷顿基因。包括驱动嵌合内含子的嵌合巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，以改善AAV包装。对照载体(AAV9)仅含有空的CBA启动子和内含子。对于第二项研究，测试载体含有CMV增强子和CBA启动子、内含子和基于miRNA-155的人工miRNA(AAV9-CBA-miRHTT)。
为了包装，将rAAV载体质粒、包装质粒和腺病毒辅助质粒共转染到HEK 293细胞中。包装质粒表达调节性和AAV9衣壳蛋白，导致来自rAAV载体质粒的重组基因组切除、复制和包装到AAV病毒体中。通过标准CsCl梯度沉降纯化重组病毒，并通过透析脱盐。
亨廷顿mRNA水平分析
使用分支DNA测定(bDNA)分析RNA later保存的样品中的RNA水平。根据制造商关于从存储在RNA later中的组织制备组织匀浆的指南(Affymetrix eBioscience，Sample Processing Kit)处理样品。根据制造商的关于bDNA测定的指南(2.0Reagent System)分析均质化的样品。用探针分析样品以检测人类亨廷顿基因(人HD，来自Quantigene的SA-50339)、绵羊亨廷顿基因(绵羊亨廷顿基因，来自Quantigene的SF-10586)和作为管家基因的绵羊钙联接基因(绵羊钙联接基因，来自QuantiGene的SF-10622)。用Tecan Infinite M1000 PRO光度计(积分时间设定为200ms)测量测定结果。
分析miR-Htt水平
从来自冷冻块的外侧尾状体和内侧壳核中采集活检打孔物(2mm)。使用TRIzol制造商的指南(Ambion)并进行一些修改来进行RNA提取。在TRIzol提取中进行相分离后，将水相转移至RNA Clean&Concentrator(Zymo)柱并遵循该方案。将RNA储存在-80℃直至分析。在Fragment Analyzer(Advanced Analytical Technologies Inc.)上测定RNA质量和浓度。在分析紧前，将RNA立即稀释至20ng/μl。根据制造商的说明，使用TaqMan MicroRNAReverse Transcription Kit(Cat#4366596，Thermo Scientific)，各2μl的RNA和引导链特异性茎环引物(靶向UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCU(SEQ ID NO：25)的ThermoFisher定制测定，或测定id 002407，let7e*)逆转录人工miRNA引导链。ddPCR反应使用下述进行设置：5μL RT产物，1×浓度的miR-HTT测定和0.3×浓度的let-7E*测定，以允许多路复用。用QX200Droplet Generator(Cat#1864002，Biorad)产生液滴，并在终点PCR扩增(40个循环)后监测阳性信号。通过计算miRHTT和let-7e*的绝对浓度之间的比率来确定miRHTT的相对表达。
载体基因组分布
使用Gentra Puregene Tissue试剂盒(Qiagen)从已在液氮中快速冷冻的样品中提取基因组DNA。使用NanoDrop ONEc分光光度计测量基因组DNA浓度。根据制造商的建议进行Droplet Digital PCR(ddPCR，Biorad)，使用50ng DNA作为输入，TaqMan测定检测载体特异性CB和U6启动子和HPRT参照基因。结果表示为每个二倍体基因组的载体基因组(vg/dg)。
亨廷顿蛋白水平的分析-mHTT的中尺度检测测定(MSD)
将纹状体样品在由10mM HEPES、250mM蔗糖、1mM EDTA和蛋白酶抑制剂(Roche)组成的缓冲液中匀浆，并以10％振幅超声处理10s。使用Bradford测定测量蛋白浓度。将96孔QuicPlex标准板(MSD)用PBS中的兔单克隆抗-HTT脯氨酸1220区抗体(D7F7，CellSignaling，1：250)4℃下过夜包被。将板用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，每次10分钟，并用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭2小时。用PBST洗涤3次，每次10分钟后，将在25μL匀浆缓冲液或空白(均质化缓冲液)中具有20μg蛋白的样品的技术副本分配到板中，并在定轨振荡器上于4℃孵育过夜。将板在PBST中洗涤3次，每次10分钟，并如下所述在二级/检测抗体混合物中孵育：为了检测mHTT，将小鼠单克隆抗polyQ抗体MW1(DSHB)与抗小鼠SulfoTag检测抗体(MSD)以PBS中1％BSA中1μg/mL每种抗体混合。每孔施加30μL检测抗体混合物并在定轨振荡器上在室温下孵育3小时。将板在PBST中洗涤3次，每次10分钟，并在QuickPlex SQ120(MSD)读数之前每孔施加150μL的2xRead Buffer(MSD)。
Western印记
将组织小块从冷冻块取出并在冰上于200μl 10mM HEPES pH7.2，250mm蔗糖，1mMEDTA+蛋白酶抑制剂片剂(迷你的完全的无EDTA的Roche#11836170001)匀浆。将样品超声处理10秒，并使用Bradford方法(BioRad#500-0006)测定蛋白浓度。通过3-8％Tris-乙酸盐凝胶上的SDS-PAGE(Life Technologies#EA03785BOX)分离等浓度的蛋白(25μg)，并使用TransBlot Turbo(BioRad)转移到硝酸纤维素。将印迹在Tris缓冲盐水+0.1％Tween-20(TBST)中的5％脱脂奶粉中封闭1小时，并在4℃于封闭溶液中稀释的一抗中孵育过夜。使用的一抗是：抗-poly-Q(MW1，Coriell，1：500或3B5H10，Sigma，1：1000)、抗亨廷顿蛋白(MAB2166，EMD Millipore，1：1000或Ab1，DiFiglia等，1995，1：1000)、抗DARPP32(#ab40801，Abcam，1：10,000)、抗肌动蛋白(A4700，Sigma，1：1000)和抗血影蛋白(MAB1622，EMD Milliopore，1：4000)。将印迹在TBST中洗涤，在室温下在封闭溶液中以1：5000稀释的过氧化物酶标记的第二抗体孵育1小时，在TBST中洗涤并在SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate(Pierce#34080)中孵育。用CCD成像系统(Alpha Innotech)和Hyperfilm ECL(GE Healthcare)获得图像。使用ImageJ软件(NIH)对数字图像进行光密度测定。使用非配对t检验进行统计学分析，并且结果表示为注射侧的平均值。
DARPP32、NeuN和Iba1的免疫组织化学
为了定量DARPP32阳性细胞，每第20个切片在1X PBS中的3％过氧化氢中孵育3分钟，在0.5％Triton-X-100中孵育20分钟，然后在1X PBS中的1.5％正常山羊血清(VectorLabs，S-1000)中孵育4小时。将切片在1.5％正常山羊血清中的抗-DARPP32(AbCam，ab40801，1：1,000稀释)中于4℃孵育过夜。然后将切片在1X PBS中的生物素化的山羊抗兔IgG抗体(Vector Labs，AP-1000，1：200稀释)中孵育10分钟。将切片与在1XPBS中的来自Vectastain EliteABC Kit(Vector Labs，PK-6100)的2％EliteA和2％Elite B试剂孵育5分钟。使用Metal Enhanced DAB试剂盒(ThermoFisher Scientific，34065)可视化DARPP32阳性细胞。将切片在稳定的过氧化物缓冲液中的1X 3,3'-二氨基联苯胺中孵育。
为了定量NeuN阳性细胞，每第20个切片在1X PBS中的3％过氧化氢中孵育3分钟，在0.5％Triton-X-100中孵育20分钟，然后在1X PBS中的1.5％正常山羊血清(VectorLabs，S)-1000)中于4℃过夜孵育。将切片在1.5％正常山羊血清中的抗NeuN(Chemicon，MAB377，1：1,000稀释)中于4℃孵育1小时。然后将切片在荧光AF594山羊抗小鼠IgG(ThermoFisher Scientific，A-11005，1：2,000稀释)中孵育40分钟以可视化NeuN阳性细胞。
为了定量Iba1阳性细胞，将每第20个切片1XPBS中的5％正常山羊血清(VectorLabs，S-1000)、1％牛血清白蛋白(Sigma，A-3059)、0.2％Triton-X-100和0.03％过氧化氢的溶液中孵育1小时。将切片在5％正常山羊血清(Vector Labs，S-1000)和1％牛血清白蛋白(Sigma，A-3059)中的抗Iba1(Wako Chemicals，019-19741，1：1,000稀释)中于4℃孵育过夜。将切片在1X PBS中的生物素化的山羊抗兔IgG抗体(Vector Labs，AP-1000，1：200稀释)孵育10分钟。将切片与在1X PBS中的来自Vectastain Elite ABC Kit(Vector Labs，PK-6100)的2％EliteA和2％EliteB试剂中孵育5分钟。使用Metal Enhanced DAB试剂盒(ThermoFisher Scientific，34605)，通过在稳定的过氧化物缓冲液中的1X 3',3-二氨基联苯胺中孵育切片来可视化反应。
通过用Nikon Eclipse E600显微镜拍摄每个切片的图像(DARPP32为20X，Iba1为40X)来完成脑左、右半球中DARPP32和Iba1阳性细胞的定量。为了一致地捕获不同切片之间的图像，第一幅图像在纹状体的内侧背侧边缘捕获，并且平台向腹侧边缘移动0.5cm。一旦到达腹侧边缘，将平台横向移动0.5cm并背侧移动0.5cm直至捕获10个图像。在定量细胞时，为每个图像分配随机数以消除偏差。使用ImageJ软件(NIH)计数细胞。
使用Nikon Eclipse E600和Chiu Technical Corporation Mercury 100-W灯以60X进行NeuN阳性细胞的定量。用于捕获DARPP32和Iba1图像的立体方法也用于定量NeuN阳性细胞。穿过纹状体在每第20个切片的注射和非注射侧上，通过使用ImageJ软件(NIH)手动环绕DARPP32染色区域，测量每个切片的纹状体、尾状体和壳核的面积(每只动物每侧29-35个切片)。观察者对条件不知情。通过将面积乘以切片厚度(40微米)乘以载玻片(20)之间的切片数并为每只动物加在一起来确定每个区域的总体积。使用Microsoft excel、配对和非配对t检验，每组N＝3或4只动物，进行统计分析。注射后的载体基因组和miRNA分布
观察了HD敲入模型中扩展的小鼠亨廷顿基因和HD转基因小鼠模型中人mHT转基因mRNA的沉默。在该实施例中，HD绵羊的两个群组(研究1和研究2)单侧注射纹状体。在研究1中，绵羊在8-9月龄时用scAAV9-U6-miRHTT(AAV9miRHTT)或scAAV9-CBA-空(AAV9)注射，其中非编码填充序列插入启动子和poly-A信号之间。在研究2中，在14月龄时用scAAV9-CBA-miRHTT或scAAV9-CBA-空(AAV9)注射绵羊。在AAV9-miRHTT施用后一个月和六个月收获脑。
通过液滴数字PCR(ddPCR，图26B)测定区域子集(图26A)的基因组拷贝。与非注射侧相比，注射侧的尾状体和壳核中的基因组拷贝最高，并且在注射后1和6个月时scAAV9-U6-miRHTT处理组中的水平最高。皮质和肝脏中存在少量载体基因组，但在肾上腺中检测不到(图26B)。
使用片段分析仪测量RNA质量，其产生得分，称为RNA质量数(RNA QualityNumber，RQN)。RQN是通过分析电色谱图(electro-pherogram)产生的，并整合了许多不同的RNA完整性测量指标，例如28S和18S核糖体峰值锐度与基线之间的比率。分数通常为0(完全降解)至10。分数大于5的样品用于分析人工miR引导链的水平。由于低RQN分数，研究1中的两只动物和研究2中的两只动物被排除在分析之外。使用ddPCR测量人工miRNA引导链的水平，并相对内源let7e*归一化(图27)。注射侧的人工miR反义链的相对量比未注射侧高3.5-1000倍，并且与注射后6个月相比在一个月时更高。在注射AAV9-miRHTT的对侧检测到低水平的miRNA引导链。
单次施用scAAV9-miRHTT长期减少尾状体和壳核中的人突变体亨廷顿mRNA
使用特异性识别人及非绵羊HTT mRNA的分支DNA(bDNA)测定测量前部和内侧纹状体中的HTT mRNA。该测定不需要RNA分离，并且所有样品都包括在分析中。在注射后一个月，最接近内侧块的注射，scAAV9-U6-miRHTT(研究1)在尾状体和壳核中使人HTT mRNA减少超过50％(图28)。在前部纹状体中没有检测到显著的沉默，其远离注射部位(图28)。在注射后6个月，mRNA沉默在尾状体中显著(图28)。在scAAV9-CβA-miRHTT群组(研究2)中，注射后一个月时HTT mRNA的显著沉默发生在内侧壳核、内侧尾状体和前纹状体(图28)，并且注射后6个月时，发生在内侧尾状体和部分内侧壳核中(图28)。前纹状体在6个月时没有显示出显著的降低。内源性绵羊HTT mRNA没有显著沉默(图29A)。
Western印迹测定和电化学发光(MSD测定)显示scAAV9-miRHTT减少尾状体和壳核中的人突变体亨廷顿蛋白
在相同的样品制备物中通过Western印迹(图30)和电化学发光(Meso ScaleDiscovery(MSD，图30))检测HTT蛋白。在研究1中，与野生型HTT相比优先检测mHTT(突变体HTT)的3BH510抗体用于通过Western印迹来检测mHTT蛋白(图30)。与缺乏miRHTT的AAV9处理相比，用scAAV9-U6-MIRHTT处理后一个月，在尾状体、壳核和前纹状体中存在mHTT蛋白的显著减少，并且在壳处理后6个月，在核壳中存在mHTT蛋白的显著减少。在研究2中(图30，下图)，注射后1个月scAAV9-CβA-miRHTT处理在壳核中显著沉默mHTT，注射后6个月在尾状体、壳核和前纹状体中显著沉默mHTT。
使用用于检测的MW1的MSD测定结果表明，scAAV9-U6-miRHTT处理(研究1)在处理后1个月和6个月显著降低了尾状体、壳核和前纹状体中的mHTT蛋白水平。在注射后一个月scAAV9-CBA-miRHTT显著沉默尾状体中的mHTT蛋白，并且在处理后6个月显著沉默尾状体、壳核和前纹状体中的mHTT蛋白(图31)。这些结果表明，MSD测定的结果(图31)和通过Western印迹测定获得的结果(图30)之间存在良好的一致性。
表2：在研究1和2中通过Western印迹和MSD测定突变体亨廷顿蛋白降低的平均百分比。通过Western印迹在研究1中用抗-htt golyQ抗体3B5H10和在研究2用抗体3B5H10、MAB2166(抗-HTT443-456，其不识别绵羊HTT(Reid等，2013))和抗-polyQ单克隆抗体MW1，测量人突变体亨廷顿蛋白。在MSD测定中，MW1用作检测抗体。该表报告了尾状体、壳核和前纹状体的平均mHTT百分比降低。通过将AAV9miRHTT处理的绵羊中注射侧的平均信号除以仅AAV9处理的动物中注射侧的平均信号来计算降低百分比。
由于检测mHTT的抗体可能具有不同的灵敏度，因此在研究2中包括通过Western印迹检测人mHTT蛋白的另外两种抗体MAB2166和MW1(表2)。在HD转基因绵羊中，MAB2166仅识别人类亨廷顿蛋白而不识别绵羊HTT。MW1优先识别HTT中扩增的聚谷氨酰胺区域，并且还用于在MSD测定中检测mHTT。表2比较了研究1和2中通过使用三种抗mHTT抗体(3B5H10、2166和MW1)的Western印迹以及通过使用MW1的MSD测定检测的mHTT的平均百分比降低。在研究2中，在多个新纹状体区域中Western印迹分析中的所有三种抗体均检测到显著的mHTT降低(49％至81％)。当在研究2中分析来自相同纹状体区域的两个样品时，MSD测定获得的mHTT降低结果是一致的。研究2中，Western印迹和使用MW1的MSD测定的结果的比较也是值得注意的。这两种不同的mHTT检测方法在mHTT降低程度上有很好的一致性。
通过Western印迹分析，与注射AAV9的皮质相比，覆盖注射AAV9-miRHTT的纹状体的皮质未显示mHTT蛋白水平的下降(图32A)。在相对于注射AAV9-MIRHTT的纹状体的对侧上的尾状体和壳核中检测到低水平的mRNA引导链。通过Western印迹分析，这些区域未显示降低水平的mHTT蛋白(图32B)。
为了研究用针对人类HD基因的AAV9-MIRHTT的处理是否影响内源性绵羊HTT的水平，通过利用人转基因mHTT与内源性绵羊HTT在SDS PAGE上的迁移差异的优势，利用Westernblot分析直接比较这两种蛋白的水平(图29B)。用识别htt1-17的Ab1抗体进行的Western印迹分析显示，与人mHTT不同，内源性绵羊HTT未被miRHTT处理降低(图29B)。
DARPP32标记的神经元和纹状体体积不受miRNA处理的影响
为了检查AAV载体注射的安全性，进行针对DARPP32(一种中间多棘神经元标记物)的免疫组化并且计数DARPP32阳性细胞的数目。AAV9-miRHTT处理组和AAV9处理组中细胞数之间没有显著差异(表3)，并且处理组之间在NeuN(一种神经元细胞标记物)染色的细胞数方面没有显著差异。使用DARPP32标记切片中纹状体的横截面积测量来确定纹状体体积，并且发现miRNA处理后与对照相比没有变化(表4)。
表3：DARPP32和NeuN阳性细胞的数量。通过配对t检验(注射至非注射侧)分析数据。仅在注射后六个月在用AAV9-CBA-miRHTT注射的WT绵羊的注射和未注射侧之间发现显著差异，1p＝0.002，通过配对t检验获得。
表4：纹状体体积。体积由每只动物每侧29-35个40μm切片的横截面积确定，每组N＝3只绵羊。1P＝0.01，2P＝0.03，3P＝0.02，使用配对t检验。
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在直接注射scAAV9后发生活化的小胶质细胞的短暂增加
研究了Iba1(一种定位于小胶质细胞并通过其激活上调的蛋白)免疫组织化学定位。基于形态学鉴定标记的细胞为静息或活化的小胶质细胞(表5)。注射scAAV9-U6-miRHTT或相应的对照载体在注射后一个月增加注射侧的活化小胶质细胞数量，但注射后6个月难以区分注射和未注射侧。在第二项研究中，仅在研究终点(6个月)检查小胶质细胞反应，在该时间点各组之间无显著差异。该发现表明，活化小胶质细胞的短暂增加与AAV负荷无关，并且可以用任何载体或单独手术发生。
表5：基于IBA1阳性细胞的形态的数量和分类。通过配对t检验(注射侧对非注射侧)进行统计学分析。6个月时，在注射AAV9-U6-miRHTT(1p＝0.01)的HD绵羊和注射AAV9(2p＝0.006)的WT绵羊中发现与非注射侧相比，注射侧活化小胶质细胞的显著增加。在注射AAV9(3p＝0.05)和AAV9-U6-miRHTT(4p＝0.04)的HD绵羊中，在一个月时发现静息小胶质细胞显著减少，并且在研究2中，六个月时在注射AAV9的HD绵羊中发现总小胶质细胞显著增加(4p＝0.04)。所有分析均通过配对t-检验比较注射与非注射侧完成。
scAAV9-miRHTT处理不影响血细胞计数、电解质或肝肾功能
在四个时间采集血液样品：基线(预处理)、处理后28天(或30天)、90天和180天。测量全血计数、电解质，并进行肝、肾功能检查(表6)。在AAV9-miRHTT注射的绵羊和对照之间未发现任何这些测量值的变化。此外，这些时间体重没有变化。
表6：所有绵羊的临床病理学和全血细胞计数。
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Claims (27)

1.一种分离的核酸，包含：
(i)包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的第一区域；和，
(ii)包含编码一个或多miRNA的转基因的第二区域，其中每个miRNA均包含与SEQ IDNO：1互补的种子序列。
2.一种分离的核酸，包含：
(i)包含第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的第一区域；和，
(ii)包含编码一个或多个miRNA的转基因的第二区域，其中每个miRNA均由包含SEQ IDNO：2-10中任一所示的且侧接miRNA骨架序列的序列的序列所编码。
3.一种分离的核酸，包含：
(i)编码第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体的第一区域；和，
(ii)包含编码一个或多个miRNA的转基因的第二区域，其中每个miRNA均包含与SEQ IDNO：1所示序列的至少2个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)连续碱基互补并侧接miRNA骨架序列的序列。
4.如权利要求2或3所述的分离的核酸，其中每个miRNA骨架序列均是mir-155骨架序列、mir-30骨架序列或mir-64骨架序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因包含启动子。
6.如权利要求5所述的分离的核酸，其中启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或U6启动子。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的核酸，其中所述转基因进一步编码蛋白。
8.如根据权利要求1至7中任一项所述的分离的核酸，其中所述一个或多个miRNA位于所述转基因的非翻译部分中。
9.如权利要求7所述的分离的核酸，其中非翻译部分是内含子。
10.如权利要求8所述的分离的核酸，其中非翻译部分位于编码蛋白的核酸序列的最后一个密码子和poly-A尾序列之间，或者位于启动子序列的最后一个核苷酸碱基和poly-A尾序列之间。
11.如权利要求1至10中任一项所述的分离的核酸，其进一步包含第三区域，所述第三区域包含第二腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)或其变体。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的核酸，其中所述ITR变体缺乏功能性末端解析位点(TRS)，任选地，其中ITR变体是ΔTRS ITR。
13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的核酸，其中至少一个miRNA与人类亨廷顿基因(例如，SEQ ID NO：1)杂交并抑制其表达。
14.一种包含权利要求1至13中任一项的分离的核酸的载体。
15.如权利要求14所述的载体，其中载体是质粒。
16.一种宿主细胞，其包含权利要求1至13任一项中所述的分离的核酸，或权利要求14或15所述的载体。
17.一种重组AAV(rAAV)，包含：
(i)衣壳蛋白；和，
(ii)权利要求1至13中任一项所述的分离的核酸。
18.如权利要求17上述的rAAV，其中衣壳蛋白是AAV9衣壳蛋白。
19.如权利要求17或18所述的rAAV，其中衣壳蛋白包含SEQ ID NO：20所示的序列。
20.如权利要求17至19中任一项所述的rAAV，其中rAAV是自身互补的AAV(scAAV)。
21.如权利要求17至20中任一项所述的rAAV，其中rAAV被配制用于递送至中枢神经系统(CNS)。
22.一种用于在有此需要的受试者中治疗亨廷顿病的方法，所述方法包括向患有亨廷顿病或处于发展亨廷顿病的风险的受试者施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的分离的核酸或权利要求17至21中任一项所述的rAAV。
23.如权利要求22所述的方法，其中受试者包含具有超过36个CAG重复、超过40个重复或超过100个重复的亨廷顿蛋白基因。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中受试者年龄小于20岁。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中施用导致分离的核酸或rAAV递送至受试者的中枢神经系统(CNS)。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中施用经由注射，任选静脉内注射或纹状体内注射。
27.一种分离的核酸，其编码SEQ ID NO：2-10或21-22中任一所示的序列。
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