KR20190053236A - 헌팅톤병의 aav 치료 - Google Patents
헌팅톤병의 aav 치료 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190053236A KR20190053236A KR1020197010964A KR20197010964A KR20190053236A KR 20190053236 A KR20190053236 A KR 20190053236A KR 1020197010964 A KR1020197010964 A KR 1020197010964A KR 20197010964 A KR20197010964 A KR 20197010964A KR 20190053236 A KR20190053236 A KR 20190053236A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- htt
- nucleic acid
- promoter
- mirna
- Prior art date
Links
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 title claims abstract description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 28
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 183
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 156
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 107
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 94
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 94
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 94
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 77
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 67
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 37
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 32
- 101001030705 Homo sapiens Huntingtin Proteins 0.000 claims description 31
- 102000054185 human HTT Human genes 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 14
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 6
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 5
- 108091056862 miR-64 stem-loop Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 41
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 82
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 69
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 66
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 59
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 54
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 50
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 49
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 32
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 23
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 21
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 13
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 101100520968 Homo sapiens PPP1R1B gene Proteins 0.000 description 12
- 102100024556 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 1B Human genes 0.000 description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 12
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 11
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 11
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 11
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 11
- 101150043003 Htt gene Proteins 0.000 description 11
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 101150053137 AIF1 gene Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 8
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- -1 for example Chemical class 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 108091024449 let-7e stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 108091044227 let-7e-1 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 108091071181 let-7e-2 stem-loop Proteins 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 4
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000012749 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Human genes 0.000 description 4
- 108010090047 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Proteins 0.000 description 4
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 4
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 210000001159 caudate nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 3
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 3
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011771 FVB mouse Methods 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 3
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 3
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 2
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 2
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008164 Cerebrospinal fluid leakage Diseases 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 2
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 102100032459 Microprocessor complex subunit DGCR8 Human genes 0.000 description 2
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 2
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 2
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- NMCBVGFGWSIGSB-NUTKFTJISA-N Trp-Ala-Leu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N NMCBVGFGWSIGSB-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CBOQJANXLMLOSS-UHFFFAOYSA-N ethyl vanillin Chemical compound CCOC1=CC(C=O)=CC=C1O CBOQJANXLMLOSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108091084679 miR-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091033354 miR-3-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091058771 miR-3-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 210000001009 nucleus accumben Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 2
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000009899 Agrostemma githago Nutrition 0.000 description 1
- 240000007241 Agrostis stolonifera Species 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IKKVASZHTMKJIR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LGFCAXJBAZESCF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- CZPAHAKGPDUIPJ-CIUDSAMLSA-N Ala-Gln-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CZPAHAKGPDUIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N Ala-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FEGOCLZUJUFCHP-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FEGOCLZUJUFCHP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NHWYNIZWLJYZAG-XVYDVKMFSA-N Ala-Ser-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N NHWYNIZWLJYZAG-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N Ala-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N Ala-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102100040121 Allograft inflammatory factor 1 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N Arg-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- UHFUZWSZQKMDSX-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UHFUZWSZQKMDSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N Arg-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MNBHKGYCLBUIBC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N Asn-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FTCGGKNCJZOPNB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MOHUTCNYQLMARY-GUBZILKMSA-N Asn-His-Gln Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MOHUTCNYQLMARY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N Asn-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FHETWELNCBMRMG-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BKZFBJYIVSBXCO-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-His Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(O)=O BKZFBJYIVSBXCO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(N)=O PLTGTJAZQRGMPP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N Asn-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O GKKUBLFXKRDMFC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DAYDURRBMDCCFL-AAEUAGOBSA-N Asn-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DAYDURRBMDCCFL-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- BEHQTVDBCLSCBY-CFMVVWHZSA-N Asn-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BEHQTVDBCLSCBY-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XEDQMTWEYFBOIK-ACZMJKKPSA-N Asp-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XEDQMTWEYFBOIK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N Asp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- RDRMWJBLOSRRAW-BYULHYEWSA-N Asp-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O RDRMWJBLOSRRAW-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- PGUYEUCYVNZGGV-QWRGUYRKSA-N Asp-Gly-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PGUYEUCYVNZGGV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IDDMGSKZQDEDGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 BKOIIURTQAJHAT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZVGRHIRJLWBWGJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZVGRHIRJLWBWGJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OYSYWMMZGJSQRB-AVGNSLFASA-N Asp-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O OYSYWMMZGJSQRB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150051353 Canx gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241000702141 Corynephage beta Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N Gln-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- QYTKAVBFRUGYAU-ACZMJKKPSA-N Gln-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QYTKAVBFRUGYAU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GPISLLFQNHELLK-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N GPISLLFQNHELLK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KVXVVDFOZNYYKZ-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KVXVVDFOZNYYKZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NPTGGVQJYRSMCM-GLLZPBPUSA-N Gln-Gln-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NPTGGVQJYRSMCM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N Gln-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N Gln-Gly-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IKFZXRLDMYWNBU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GNMQDOGFWYWPNM-LAEOZQHASA-N Gln-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(O)=O GNMQDOGFWYWPNM-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- NSORZJXKUQFEKL-JGVFFNPUSA-N Gln-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O NSORZJXKUQFEKL-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- OREPWMPAUWIIAM-ZPFDUUQYSA-N Gln-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OREPWMPAUWIIAM-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- SYZZMPFLOLSMHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O SYZZMPFLOLSMHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- JKDBRTNMYXYLHO-JYJNAYRXSA-N Gln-Tyr-Leu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JKDBRTNMYXYLHO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UBRQJXFDVZNYJP-AVGNSLFASA-N Gln-Tyr-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O UBRQJXFDVZNYJP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MKRDNSWGJWTBKZ-GVXVVHGQSA-N Gln-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MKRDNSWGJWTBKZ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- ZMXZGYLINVNTKH-DZKIICNBSA-N Gln-Val-Phe Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZMXZGYLINVNTKH-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- WVYJNPCWJYBHJG-YVNDNENWSA-N Glu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WVYJNPCWJYBHJG-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- VGUYMZGLJUJRBV-YVNDNENWSA-N Glu-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VGUYMZGLJUJRBV-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N Glu-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N Glu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DMYACXMQUABZIQ-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- XUDLUKYPXQDCRX-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XUDLUKYPXQDCRX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BULIVUZUDBHKKZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N Gly-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PNUFMLXHOLFRLD-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 PNUFMLXHOLFRLD-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N Gly-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N His-Asp-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BDHUXUFYNUOUIT-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HYWZHNUGAYVEEW-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N HYWZHNUGAYVEEW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000890626 Homo sapiens Allograft inflammatory factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000869796 Homo sapiens Microprocessor complex subunit DGCR8 Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N Ile-Gly-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N Ile-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N Ile-Phe-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N 0.000 description 1
- JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- JTBFQNHKNRZJDS-SYWGBEHUSA-N Ile-Trp-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N JTBFQNHKNRZJDS-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 102000016921 Integrin-Binding Sialoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010028750 Integrin-Binding Sialoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N Leu-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LLBQJYDYOLIQAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- USLNHQZCDQJBOV-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O USLNHQZCDQJBOV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N Leu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KOSWSHVQIVTVQF-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N Leu-Lys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QNTJIDXQHWUBKC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNNPKXBBRZVIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VSRXPEHZMHSFKU-IUCAKERBSA-N Lys-Gln-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VSRXPEHZMHSFKU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Glu Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC([O-])=O LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GNLJXWBNLAIPEP-MELADBBJSA-N Lys-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O GNLJXWBNLAIPEP-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N Lys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IZJGPPIGYTVXLB-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N Lys-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- VWJFOUBDZIUXGA-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N VWJFOUBDZIUXGA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DTICLBJHRYSJLH-GUBZILKMSA-N Met-Ala-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DTICLBJHRYSJLH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N Met-Asn-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- OTKQHDPECKUDSB-SZMVWBNQSA-N Met-Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 OTKQHDPECKUDSB-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 description 1
- 101001030698 Mus musculus Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029955 Nervous System Heredodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- BRDYYVQTEJVRQT-HRCADAONSA-N Phe-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O BRDYYVQTEJVRQT-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- UNLYPPYNDXHGDG-IHRRRGAJSA-N Phe-Gln-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 UNLYPPYNDXHGDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GDBOREPXIRKSEQ-FHWLQOOXSA-N Phe-Gln-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GDBOREPXIRKSEQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- FMMIYCMOVGXZIP-AVGNSLFASA-N Phe-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMMIYCMOVGXZIP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YYKZDTVQHTUKDW-RYUDHWBXSA-N Phe-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N YYKZDTVQHTUKDW-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- VJLLEKDQJSMHRU-STQMWFEESA-N Phe-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VJLLEKDQJSMHRU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- HQCSLJFGZYOXHW-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N HQCSLJFGZYOXHW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QRUOLOPKCOEZKU-HJWJTTGWSA-N Phe-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N QRUOLOPKCOEZKU-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Cys Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N Pro-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- KTFZQPLSPLWLKN-KKUMJFAQSA-N Pro-Gln-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KTFZQPLSPLWLKN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UUHXBJHVTVGSKM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FYKUEXMZYFIZKA-DCAQKATOSA-N Pro-Pro-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FYKUEXMZYFIZKA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NAIPAPCKKRCMBL-JYJNAYRXSA-N Pro-Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 NAIPAPCKKRCMBL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N Pro-Tyr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FIDNSJUXESUDOV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N Pro-Val-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IMNVAOPEMFDAQD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N Pro-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079005 RDV peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UBRXAVQWXOWRSJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N UBRXAVQWXOWRSJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XXNYYSXNXCJYKX-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O XXNYYSXNXCJYKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NNFMANHDYSVNIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N Ser-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KZPRPBLHYMZIMH-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- VLMIUSLQONKLDV-HEIBUPTGSA-N Ser-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VLMIUSLQONKLDV-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BDMWLJLPPUCLNV-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N Ser-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYBRQMLZDDJBSW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000252794 Sphinx Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N Thr-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KEGBFULVYKYJRD-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- QGXCWPNQVCYJEL-NUMRIWBASA-N Thr-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QGXCWPNQVCYJEL-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N Thr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KCRQEJSKXAIULJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- VYEHBMMAJFVTOI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VYEHBMMAJFVTOI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N Thr-Gly-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O YSXYEJWDHBCTDJ-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 1
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N Thr-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N Thr-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IWAVRIPRTCJAQO-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- QNTBGBCOEYNAPV-CWRNSKLLSA-N Trp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O QNTBGBCOEYNAPV-CWRNSKLLSA-N 0.000 description 1
- XZLHHHYSWIYXHD-XIRDDKMYSA-N Trp-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XZLHHHYSWIYXHD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- YXONONCLMLHWJX-SZMVWBNQSA-N Trp-Glu-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YXONONCLMLHWJX-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- YRSOERSDNRSCBC-XIRDDKMYSA-N Trp-His-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YRSOERSDNRSCBC-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 VPRHDRKAPYZMHL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- WMIUTJPFHMMUGY-ZFWWWQNUSA-N Trp-Pro-Gly Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)NCC(=O)O WMIUTJPFHMMUGY-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- SDNVRAKIJVKAGS-LKTVYLICSA-N Tyr-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N SDNVRAKIJVKAGS-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- HKIUVWMZYFBIHG-KKUMJFAQSA-N Tyr-Arg-Gln Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O HKIUVWMZYFBIHG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CYDVHRFXDMDMGX-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asn-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O CYDVHRFXDMDMGX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JWGXUKHIKXZWNG-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gly-Gln Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O JWGXUKHIKXZWNG-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N Tyr-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PRONOHBTMLNXCZ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BYAKMYBZADCNMN-JYJNAYRXSA-N Tyr-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O BYAKMYBZADCNMN-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- QFXVAFIHVWXXBJ-AVGNSLFASA-N Tyr-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QFXVAFIHVWXXBJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101150004676 VGF gene Proteins 0.000 description 1
- 244000178320 Vaccaria pyramidata Species 0.000 description 1
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N Val-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- QPZMOUMNTGTEFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N QPZMOUMNTGTEFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- OUUBKKIJQIAPRI-LAEOZQHASA-N Val-Gln-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OUUBKKIJQIAPRI-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- SZTTYWIUCGSURQ-AUTRQRHGSA-N Val-Glu-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SZTTYWIUCGSURQ-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- FOADDSDHGRFUOC-DZKIICNBSA-N Val-Glu-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N FOADDSDHGRFUOC-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LAYSXAOGWHKNED-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N Val-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- UZFNHAXYMICTBU-DZKIICNBSA-N Val-Phe-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N UZFNHAXYMICTBU-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- UQMPYVLTQCGRSK-IFFSRLJSSA-N Val-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UQMPYVLTQCGRSK-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- JXWGBRRVTRAZQA-ULQDDVLXSA-N Val-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N JXWGBRRVTRAZQA-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012637 allosteric effector Substances 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 208000012601 choreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003703 cisterna magna Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000003952 cochlear nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940073505 ethyl vanillin Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010059898 glycyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004713 immature microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000004283 incisor Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000030309 inherited neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000009592 kidney function test Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 1
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047926 leucyl-lysyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000002197 limbic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000021165 maintenance of RNA location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091007426 microRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229940090668 parachlorophenol Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000771 poly (alkylcyanoacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002637 putamen Anatomy 0.000 description 1
- 229940022416 quickflex Drugs 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 208000012802 recumbency Diseases 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 210000005250 spinal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940044609 sulfur dioxide Drugs 0.000 description 1
- 235000010269 sulphur dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010045269 tryptophyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 239000011882 ultra-fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000005172 vertebrate brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 개시내용의 측면들은 헌팅톤병을 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 헌팅틴 유전자 (HTT)를 표적으로 하는 간섭 핵산 (예컨대 인공 miRNA), 및 그를 사용한 헌팅톤병의 치료 방법을 제공한다.
Description
[관련 출원]
본 출원은 발명의 명칭이 "AAV TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISEASE"인 2016년 9월 22일자 U.S. 가출원 제62/398,487호의 출원일에 대한 35 U.S.C. 119(e)하의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
[연방 후원 연구]
본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 교부되는 NS038194하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권리를 가진다.
헌팅톤병(Huntington's disease) (HD)은 헌팅틴(huntingtin) 유전자 엑손 1 CAG 반복 영역의 확장에 의해 야기되는 파괴적인 유전성 신경변성 질환이다. 헌팅틴 단백질 (HTT)이 신체 전체에 걸쳐 발현되기는 하지만, 폴리글루타민 확장 단백질은 선조체의 중간 가시 뉴런(medium spiny neuron) 및 그의 피질 연결에 대하여 특히 독성이다. 환자들은 우울 및 불안을 포함한 정서적 증상 및 특징적인 운동 교란 및 무도병으로 고생한다. 현재 헌팅톤병에 대한 치유법은 존재하지 않으며; 치료 선택사항은 질환 증상을 개선하는 것에 제한된다.
[발명의 개요]
본 개시내용의 측면들은 헌팅톤병 (HD)을 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서는, 인간 헌팅틴 (HTT)과 특이적으로 혼성화되어 그의 발현을 억제하는 억제성 핵산 (예컨대 인공 miRNA와 같은 miRNA)이 제공된다.
이에 따라, 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2-10 또는 21-22 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 헌팅틴은 서열식별번호: 1에 제시되어 있는 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1의 적어도 2개 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 연속되는 염기에 대하여 상보성인 핵산 (예컨대 miRNA)을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다: 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체(inverted terminal repeat) (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역. 일부 실시양태에서, 각 miRNA를 코딩하는 서열은 miRNA 백본 서열을 코딩하는 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 상기 트랜스진은 추가적으로 프로모터를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 추가적으로 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 치료용 단백질 (예컨대 비-돌연변이 헌팅틴) 또는 리포터 단백질 (예를 들면 형광 단백질 예컨대 GFP)이다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 트랜스진의 비번역 부분에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 비번역 부분은 인트론이다. 일부 실시양태에서, 비번역 부분은 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 최종 코돈과 폴리-A 테일 서열 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 비번역 부분은 프로모터 서열의 최종 핵산 염기와 폴리-A 테일 서열의 첫 번째 염기 사이에 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 단리된 핵산은 추가적으로 제2 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제3 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위(terminal resolution site) (TRS)가 결핍되어 있으며, 임의적으로 이 경우 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 인간 헌팅틴과 혼성화되어 그의 발현을 억제한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 플라스미드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 제공한다: 캡시드 단백질; 및 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산.
일부 실시양태에서, 상기 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 rAAV는 자가-상보성(self-complementary) AAV (scAAV)이다.
일부 실시양태에서, rAAV는 중추신경계 (CNS)에의 전달용으로 제제화된다.
본 개시내용의 측면들은 병원성 헌팅틴의 발현을 감소시킬 수 (예컨대 억제할 수) 있으며, 그에 따라 헌팅톤병의 치료에 유용할 수 있는 단리된 핵산에 관한 것이다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서의 헌팅톤병의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 헌팅톤병에 걸려 있거나 그것이 발병할 위험이 있는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대상체는 36개를 초과하는 CAG 반복체, 40개를 초과하는 반복체 또는 100개를 초과하는 반복체를 가지는 헌팅틴 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연령 20세 미만이거나, 또는 청소년 HD에 걸린 것으로 진단되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 투여는 대상체의 중추신경계 (CNS)에 대한 상기 단리된 핵산 또는 rAAV의 전달을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 투여는 주사, 임의적으로는 정맥내 주사 또는 선조체내 주사를 통한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진의 각 miRNA 백본 서열은 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 서열식별번호: 21 또는 22에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR) 또는 그의 변이체가 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, ITR 변이체에는 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, TRS가 결핍되어 있는 ITR 변이체는 ΔTRS ITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 캡시드 단백질; 및 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)를 제공하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 서열이 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 및 ΔTRS ITR이 플랭킹되어 있다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 그를 필요로 하는 대상체에서의 헌팅톤병의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 헌팅톤병에 걸려 있거나 그것이 발병할 위험이 있는 대상체에게 본원에서 기술되는 바와 같은 rAAV (예컨대 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV)의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 miRNA를 코딩하는 트랜스진의 서열은 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 7 또는 8에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 서열이 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스진에는 전체-길이 AAV ITR 및 ΔTRS ITR이 플랭킹되어 있다.
일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 36개를 초과하는 CAG 반복체, 40개를 초과하는 반복체 또는 100개를 초과하는 반복체를 가지는 헌팅틴 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연령 20세 미만이다.
일부 실시양태에서, 투여는 주사를 통한다. 일부 실시양태에서, 주사는 정맥내 주사 또는 선조체내 주사이다.
도 1은 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 mir-HTT-6433을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 헬라(HeLa) 세포를 나타낸다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수확하고, 정량 RT-PCR (qRT-PCR)용으로 RNA를 추출하였다. 결과는 mir-HTT-6433이 50 %까지 만큼 내생 인간 헌팅틴을 감소시킨다는 것을 표시한다.
도 2는 AAV9 벡터에 패키지화되어 돌연변이 인간 헌팅틴을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (Yac128 마우스)의 선조체에 직접 주사되는 mir-HTT-6433을 나타낸다. 주사 1개월-후, qRT-PCR에 의해 인간 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 하나의 동물 세트 (n=5)에서는, 주사된 측면에서 인간 헌팅틴의 수준을 비-주사 측면에서의 수준과 비교하였다. 주사된 측면에서 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0017) 감소가 관찰되었다. 두 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 비히클 단독 주사를 투여받은 동물과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴의 상당한 감소 (p=0.0004)가 관찰되었다. 세 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 AAV9-GFP가 주사된 것들과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0064) 감소가 존재하였다. 종합하면, 데이터는 mir-HTT-6433이 생체 내의 뇌에서 헌팅틴 mRNA를 50 %까지 감소시킨다는 것을 표시한다.
도 3은 AAV9-mir-HTT-6433 또는 PBS를 사용한 편측으로의 돌연변이 헌팅틴 (인간)을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 주사를 나타낸다. 주사 6개월-후, 평균대에서 마우스를 시험하였다. 데이터는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스가 PBS로 처리된 HD 마우스에 비해 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량의 감소를 나타낸다는 것을 표시한다.
도 4a-4c는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA가 세포 배양물 및 생체 내에서 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 4a는 인간 헌팅틴 mRNA상 표적 부위들의 위치를 나타낸다. 도 4b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 헬라 세포를 나타내는데; 48시간 후 qPCR에 의해 헌팅틴 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 발현은 세포 수에 있어서의 웰별 변이를 반영하기 위하여 HPRT에 대하여 정규화하고, 미처리/나이브 대조에 대비하여 나타내었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4c는 세포 배양물에서의 결과를 바탕으로 하여 생체내 시험용으로 선택된 후보 miRNA들을 나타낸다. 마우스의 선조체에 편측으로 주사하였다. 주사 1개월-후, 선조체를 수확하고, GFP 양성 조직을 절제 분리하였다. 데이터는 HPRT에 대하여 정규화하고, GFP-단독 대조에 대비하여 나타내었다.
도 5a-5c는 U6 프로모터로부터 인공 miRNA를 발현시키는 것이 마우스 선조체에서의 헌팅틴의 침묵화를 향상시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 5a는 CBA (polII) 및 U6 프로모터로부터 miRNA를 발현하는 AAV9 구성체에 관한 데이터를 나타낸다. CBA-프로모터 추진 miRNA는 GFP 유전자의 3'-UTR에 위치하는 반면, U6 프로모터 추진 인공 miRNA를 포함하는 구성체는 별도의 프로모터로부터 GFP를 공동-발현한다. 도 5b는 부위 5155 (좌측) 및 6433 (우측)을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 인공 miRNA의 주사 후 주사된 선조체에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 비-주사 측면에 대비하여 나타내었다. 도 5c는 부위 6433을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 miRNA가 편측으로 주사된 마우스에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 GFP-발현 대조 벡터가 주사된 마우스의 군에 대비하여 나타내었다.
도 6a-6b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 선조체 발현이 행동 이상을 야기한다는 것을 보여준다. 도 6a는 주사 6개월-후, U6-프로모터 추진 mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 보금자리를 트는 데에 실패하였음을 보여준다. 사진은 케이지에 새로운 네슬렛(nestlet)을 위치시키고 24시간 후에 촬영되었다. 도 6b는 PBS, CBA-mir-HTT-6433 또는 U6-mir-HTT-6433으로 처리된 Yac128 마우스의 케이지 모니터링을 나타낸다. 24-27시간 동안, 케이지 주변으로 움직이면서 소요되는 시간량을 기록하였다. 시간 당 평균 시간은 총 시간량을 기록 시간 수로 나누는 것에 의해 계산하였다.
도 7a-7b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 선조체 수축을 야기한다는 것을 보여준다. 도 7a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 DARPP-32 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7b는 주사 6개월-후의 DARPP-32 양성 면적의 정량을 나타낸다.
도 8a-8d는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 소교세포의 지속적인 활성화를 야기한다는 것을 보여준다. 도 8a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 Iba1 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 이미지는 주사 측면에서 촬영되었다. 주사 6개월 후의 총 (도 8b), 활성화 (도 8c) 및 휴지 (도 8d) 소교세포의 정량을 나타내었다.
도 9a-9c는 U6 프로모터로부터의 mir155 기반 인공 miRNA의 발현이 헌팅틴 표적화 가이드 가닥 및 다른 서열의 과발현을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 9a는 판독의 개시 위치가 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 헤어핀 (mir-155 백본)에 맵핑된다는 것을 보여준다. 위치는 성숙한 가닥에 대비하여 기록하였으며, 각 샘플에서 맵핑되는 내생 miRNA의 총 수에 대하여 판독치를 정규화하였다. 수평선은 대조 샘플에서 발견되는 인공 miRNA의 바탕 수준을 나타낸다. 도 9b는 정량 RT-PCR에 의한 성숙한 miR-HTT (mir-155 백본으로부터의 것)의 상대적 정량을 나타낸다. 도 9c는 판독의 개시 부분이 mir-30 백본에 삽입되어 U6 프로모터로부터 발현되는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA에 맵핑된다는 것을 보여준다.
도 10a-10b는 mir-HTT-6433의 발현이 표적 부위를 가지는 mRNA를 우선적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 10a는 mRNA가 인공 miRNA 부위들 (범례)에 일치하는 정준(canonical) miRNA 결합을 포함하는 것들 및 없는 것들로 분할되었다는 것을 보여준다. AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스 군에서는, 그와 같은 부위가 있고 없는 mRNA들 사이에 차이가 없었다. 반면, 도 10b는 AAV-U6-mir-HTT-6433 군에서 완전한 8량체 부위를 가지는 mRNA의 발현쪽으로 이동이 있었음을 보여준다.
도 11a-11c는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 마우스 선조체에서의 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 11a는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스 선조체에서의 GFP 염색을 보여준다. GFP 양성인 선조체의 %를 측정하기 위하여, 이미지J가 사용되었다. 도 11b는 Yac128 마우스의 선조체에서 인간 헌팅틴 mRNA를 측정하는 정량 RT-PCR을 나타낸다. 도 11c는 3종의 서로 다른 투여량으로 헌팅틴 표적화 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스의 대표적인 사진을 나타낸다. 데이터는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 표시한다.
도 12a-12b는 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후, Yac128 마우스가 평균대를 건너는 능력의 감소를 나타낸다는 것을 표시하는 데이터를 나타낸다. 도 12a는 2-3개월에 주사된 마우스가 평균대를 건너는 시간의 분명한 증가를 나타내며, 그 중 일부는 완전히 건너는 데에 실패한다는 것을 보여준다. 도 12b는 7개월령에 PBS 또는 CBA-mir-HTT-6433 중 어느 하나가 주사된 Yac128 마우스가 평균대에서의 행동에 있어서 연령-관련 감소를 나타낸다는 것을 보여준다. U6-mir-HTT-6433 (적색 점)을 사용한 주사는 이와 같은 감소를 가속한다.
도 13a-13b는 C57BL/6 마우스가 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후 평균대에서 최초의 행동 악화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 13a는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스의 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량을 보여준다. 도 13b는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 DARPP-32 양성 선조체 면적의 정량을 나타낸다.
도 14a-14b는 내생 miRNA의 분포가 mir-HTT-6433을 사용한 주사 후 거의 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 도 14a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 보여주는데; mir-HTT-6433 가이드 및 패신저 가닥의 수준은 녹색으로 나타내었으며, 적색으로 나타낸 것은 모두 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서 상당한 변화를 나타내는 내생 miRNA 종들이다. 도 14b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 나타낸다.
도 15a-15c는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여준다. 도 15a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 mRNA 발현에 있어서 거의 변화를 나타내지 않는다는 것을 보여주는데; 녹색으로 나타낸 것은 모두 상당한 p-값을 나타내는 유전자이며, 청색으로 나타낸 것은 다중 비교를 위한 조정 후 유의성 있게 유지되는 것들이다. 도 15b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 CBA에 비해 mRNA 발현에 있어서 더 많은 변화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 15c는 mir-HTT-6433로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여주는데; 7종의 RNA가 U6 및 CbA 처리 군 사이에서 상당히 차별적으로 발현되었다.
도 16은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵(middle caudate)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신(calnexin)에 대하여 정규화하였다. 주의: CBA 및 U6 구성체 각각에는 mir155 백본을 사용하였음.
도 17은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵(middle putamen)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 18은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 19는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 20은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 21은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 22는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 23은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 24는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 전방 선조체에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 25a-25b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25a는 mir-155-6433 (서열식별번호: 23)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25b는 mir-30-6433 (서열식별번호: 24)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다.
도 26a-26b는 양 뇌로의 AAV 벡터의 전달을 보여준다. 도 26a는 전체 선조체가 4, 6 mm 블록 내에 포함되도록 관상면에서 절제된 양 뇌의 개략적인 개관을 보여준다 (상단). 전방 블록은 속섬유막에 의해 분할되지 않은 선조체의 전방 부분을 포함한다 (중단). 주사가 표적으로 하는 내측 블록은 한정된 조가비핵을 포함하며, 미상핵은 하단에 나타내었다. 도 26b는 대조 (AAV9) 및 처리 (AAV9miRHTT) 처리된 동물에서의 AAV 벡터 게놈을 나타낸다. 벡터 게놈은 참조 유전자로서 게놈 HPRT를 사용하는 디지털 액적 PCR에 의해 측정하였다. 값들은 log 척도로 플로팅하였다.
도 27은 인공 miRNA 가이드 가닥이 디지털 액적 PCR에 의해 정량되었음을 보여준다. let-7e*에 대하여 정규화함으로써 상대적인 miRNA 수준을 계산하고, 그와 같은 값을 log 척도로 플로팅하였다. RQN < 5인 샘플은 배제하였다. 기록되는 수는 이와 같은 품질 임계치를 통과하여 miRNA 분석에 사용된 샘플의 총 수이다. P 값은 다중 시험을 위한 튜키(tukey) 보정을 포함하는 2-원 아노바(ANOVA)를 사용하여 계산하였다.
도 28은 scAAV9-항-HTT-6433이 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 나타낸 데이터는 양 칼넥신에 대하여 정규화된 HTT mRNA의 신호이다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p,0.03 이하에서의 처리 군들 (AAV9 또는 AAV9miRHTT) 사이의 상당한 평균 차이를 표시한다. U6-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵 및 조가비핵에서, 그리고 주사 6개월-후에는 조가비핵에서 인간 돌연변이 HTT mRNA를 상당히 낮추었다. CBA-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서, 주사 6개월-후에는 미상핵 및 조가비핵에서 HTT mRNA를 낮추었다. 분석에서는 미상핵의 내측 영역, 외측 조가비핵 및 전방 선조체를 조사하였다.
도 29a-29b는 AAV9 및 AAV9miRHTT 처리된 양에서의 내생 양 htt mRNA 및 단백질의 수준을 나타낸다. 도 29a는 양 htt mRNA 수준이 방법에서 기술된 바와 같이 측정되었으며 양 칼넥신 (Canx)에 대비하여 표현되었음을 보여준다. 나타낸 것은 연구 2의 결과이다. AAV9와 AAV9miRHTT 처리 군 사이에 내생 양 htt mRNA 수준의 차이는 존재하지 않았다. 도 29b는 연구 2의 주사 6개월-후 조가비핵에서 항-htt1-17 항체 (Ab1)를 사용하여 검출된 내생 양 헌팅틴 및 인간 mHTT 단백질의 수준을 나타낸다. 샘플 웨스턴 블럿은 AAV9miRHTT가 일 측면상에 주사된 4 마리의 서로 다른 양에서의 뇌의 주사 및 비-주사 측면의 wt htt (화살표) 및 인간 돌연변이 htt (화살촉)의 신호를 보여준다. 그래프는 % 주사된 측면 대 비-주사 측면으로서 농도측정에 의해 측정된 평균 wt 양 htt 및 인간 mHTT 신호를 나타낸다. AAV9miRHTT를 사용한 처리가 내생 양 헌팅틴 단백질의 수준에는 영향을 주지 않았으나, 인간 mHTT의 수준은 상당히 감소시켰음에 유의한다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p=0.005를 표시한다.
도 30은 AAV9-miRHTT가 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 감소시킨다는 것을 보여준다. 연구 1 및 2로부터의 조가비핵의 샘플 웨스턴 블럿은 항체 3B5H10를 사용하여 검출되는 돌연변이 HTT 및 적재 대조로서의 액틴을 보여준다 (상단). 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다 (하단). 나타낸 것은 연구 1 및 2, 그리고 주사 1 및 6개월-후의 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에서의 결과이다. 연구 2에서는, 주사 6개월-후 각 영역에서 2개의 영역 (영역 1 및 2)을 조사하였다. 별표는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 31은 연구 1 (U6 프로모터) 및 연구 2 (CBA 프로모터)에서의 주사 1 및 6개월-후의 MSD 검정에 의해 검출되는 인간 돌연변이 HTT 수준을 나타낸다. 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다. 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에 대하여 결과를 나타내었다. 별표 *는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 32a-32b는 miRHTT 주사된 양 선조체의 같은쪽 피질 및 반대쪽 미상핵 조가비핵에서 mHTT 수준이 변화되지 않는다는 것을 보여준다. 도 32a는 miRHTT 주사된 선조체의 같은쪽 피질에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 평균 수준을 표시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다. 도 32b는 miRHTT-주사된 선조체의 반대쪽 미상핵 및 조가비핵에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 수준을 표시하는 막대 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다.
도 2는 AAV9 벡터에 패키지화되어 돌연변이 인간 헌팅틴을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (Yac128 마우스)의 선조체에 직접 주사되는 mir-HTT-6433을 나타낸다. 주사 1개월-후, qRT-PCR에 의해 인간 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 하나의 동물 세트 (n=5)에서는, 주사된 측면에서 인간 헌팅틴의 수준을 비-주사 측면에서의 수준과 비교하였다. 주사된 측면에서 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0017) 감소가 관찰되었다. 두 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 비히클 단독 주사를 투여받은 동물과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴의 상당한 감소 (p=0.0004)가 관찰되었다. 세 번째 동물 세트 (n=5/군)에서는, mir-HTT-6433이 주사된 동물에서 헌팅틴 mRNA의 수준을 AAV9-GFP가 주사된 것들과 비교하였다. 이러한 동물에서도 역시 헌팅틴 mRNA의 상당한 (p=0.0064) 감소가 존재하였다. 종합하면, 데이터는 mir-HTT-6433이 생체 내의 뇌에서 헌팅틴 mRNA를 50 %까지 감소시킨다는 것을 표시한다.
도 3은 AAV9-mir-HTT-6433 또는 PBS를 사용한 편측으로의 돌연변이 헌팅틴 (인간)을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 주사를 나타낸다. 주사 6개월-후, 평균대에서 마우스를 시험하였다. 데이터는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스가 PBS로 처리된 HD 마우스에 비해 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량의 감소를 나타낸다는 것을 표시한다.
도 4a-4c는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA가 세포 배양물 및 생체 내에서 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 4a는 인간 헌팅틴 mRNA상 표적 부위들의 위치를 나타낸다. 도 4b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 헬라 세포를 나타내는데; 48시간 후 qPCR에 의해 헌팅틴 mRNA 수준을 측정하였다. 헌팅틴 발현은 세포 수에 있어서의 웰별 변이를 반영하기 위하여 HPRT에 대하여 정규화하고, 미처리/나이브 대조에 대비하여 나타내었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. 도 4c는 세포 배양물에서의 결과를 바탕으로 하여 생체내 시험용으로 선택된 후보 miRNA들을 나타낸다. 마우스의 선조체에 편측으로 주사하였다. 주사 1개월-후, 선조체를 수확하고, GFP 양성 조직을 절제 분리하였다. 데이터는 HPRT에 대하여 정규화하고, GFP-단독 대조에 대비하여 나타내었다.
도 5a-5c는 U6 프로모터로부터 인공 miRNA를 발현시키는 것이 마우스 선조체에서의 헌팅틴의 침묵화를 향상시키지 않는다는 것을 보여준다. 도 5a는 CBA (polII) 및 U6 프로모터로부터 miRNA를 발현하는 AAV9 구성체에 관한 데이터를 나타낸다. CBA-프로모터 추진 miRNA는 GFP 유전자의 3'-UTR에 위치하는 반면, U6 프로모터 추진 인공 miRNA를 포함하는 구성체는 별도의 프로모터로부터 GFP를 공동-발현한다. 도 5b는 부위 5155 (좌측) 및 6433 (우측)을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 인공 miRNA의 주사 후 주사된 선조체에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 비-주사 측면에 대비하여 나타내었다. 도 5c는 부위 6433을 표적으로 하는 U6 및 CBA-프로모터 추진 miRNA가 편측으로 주사된 마우스에서의 헌팅틴 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 데이터는 GFP-발현 대조 벡터가 주사된 마우스의 군에 대비하여 나타내었다.
도 6a-6b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 선조체 발현이 행동 이상을 야기한다는 것을 보여준다. 도 6a는 주사 6개월-후, U6-프로모터 추진 mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 보금자리를 트는 데에 실패하였음을 보여준다. 사진은 케이지에 새로운 네슬렛(nestlet)을 위치시키고 24시간 후에 촬영되었다. 도 6b는 PBS, CBA-mir-HTT-6433 또는 U6-mir-HTT-6433으로 처리된 Yac128 마우스의 케이지 모니터링을 나타낸다. 24-27시간 동안, 케이지 주변으로 움직이면서 소요되는 시간량을 기록하였다. 시간 당 평균 시간은 총 시간량을 기록 시간 수로 나누는 것에 의해 계산하였다.
도 7a-7b는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 선조체 수축을 야기한다는 것을 보여준다. 도 7a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 DARPP-32 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7b는 주사 6개월-후의 DARPP-32 양성 면적의 정량을 나타낸다.
도 8a-8d는 U6 프로모터로부터의 mir-HTT-6433의 장기 발현이 소교세포의 지속적인 활성화를 야기한다는 것을 보여준다. 도 8a는 주사 1개월 (상단) 및 6개월 (하단)-후의 Yac128 마우스의 주사된 측면에서의 Iba1 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 이미지는 주사 측면에서 촬영되었다. 주사 6개월 후의 총 (도 8b), 활성화 (도 8c) 및 휴지 (도 8d) 소교세포의 정량을 나타내었다.
도 9a-9c는 U6 프로모터로부터의 mir155 기반 인공 miRNA의 발현이 헌팅틴 표적화 가이드 가닥 및 다른 서열의 과발현을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 9a는 판독의 개시 위치가 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 헤어핀 (mir-155 백본)에 맵핑된다는 것을 보여준다. 위치는 성숙한 가닥에 대비하여 기록하였으며, 각 샘플에서 맵핑되는 내생 miRNA의 총 수에 대하여 판독치를 정규화하였다. 수평선은 대조 샘플에서 발견되는 인공 miRNA의 바탕 수준을 나타낸다. 도 9b는 정량 RT-PCR에 의한 성숙한 miR-HTT (mir-155 백본으로부터의 것)의 상대적 정량을 나타낸다. 도 9c는 판독의 개시 부분이 mir-30 백본에 삽입되어 U6 프로모터로부터 발현되는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA에 맵핑된다는 것을 보여준다.
도 10a-10b는 mir-HTT-6433의 발현이 표적 부위를 가지는 mRNA를 우선적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 10a는 mRNA가 인공 miRNA 부위들 (범례)에 일치하는 정준(canonical) miRNA 결합을 포함하는 것들 및 없는 것들로 분할되었다는 것을 보여준다. AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스 군에서는, 그와 같은 부위가 있고 없는 mRNA들 사이에 차이가 없었다. 반면, 도 10b는 AAV-U6-mir-HTT-6433 군에서 완전한 8량체 부위를 가지는 mRNA의 발현쪽으로 이동이 있었음을 보여준다.
도 11a-11c는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 마우스 선조체에서의 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 11a는 헌팅틴 표적화 인공 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스 선조체에서의 GFP 염색을 보여준다. GFP 양성인 선조체의 %를 측정하기 위하여, 이미지J가 사용되었다. 도 11b는 Yac128 마우스의 선조체에서 인간 헌팅틴 mRNA를 측정하는 정량 RT-PCR을 나타낸다. 도 11c는 3종의 서로 다른 투여량으로 헌팅틴 표적화 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스의 대표적인 사진을 나타낸다. 데이터는 벡터 투여량을 감소시키는 것이 감소된 확산 및 녹다운을 발생시킨다는 것을 표시한다.
도 12a-12b는 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후, Yac128 마우스가 평균대를 건너는 능력의 감소를 나타낸다는 것을 표시하는 데이터를 나타낸다. 도 12a는 2-3개월에 주사된 마우스가 평균대를 건너는 시간의 분명한 증가를 나타내며, 그 중 일부는 완전히 건너는 데에 실패한다는 것을 보여준다. 도 12b는 7개월령에 PBS 또는 CBA-mir-HTT-6433 중 어느 하나가 주사된 Yac128 마우스가 평균대에서의 행동에 있어서 연령-관련 감소를 나타낸다는 것을 보여준다. U6-mir-HTT-6433 (적색 점)을 사용한 주사는 이와 같은 감소를 가속한다.
도 13a-13b는 C57BL/6 마우스가 U6-프로모터 추진 헌팅틴 표적화 인공 miRNA의 주사 후 평균대에서 최초의 행동 악화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 13a는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스의 평균대를 건너는 데에 걸리는 시간량을 보여준다. 도 13b는 대조 (나이브) 마우스, 및 AAV-U6-mir-HTT-6433 및 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 DARPP-32 양성 선조체 면적의 정량을 나타낸다.
도 14a-14b는 내생 miRNA의 분포가 mir-HTT-6433을 사용한 주사 후 거의 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. 도 14a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 보여주는데; mir-HTT-6433 가이드 및 패신저 가닥의 수준은 녹색으로 나타내었으며, 적색으로 나타낸 것은 모두 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서 상당한 변화를 나타내는 내생 miRNA 종들이다. 도 14b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스에서의 분포를 나타낸다.
도 15a-15c는 mir-HTT-6433으로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여준다. 도 15a는 AAV-CbA-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 mRNA 발현에 있어서 거의 변화를 나타내지 않는다는 것을 보여주는데; 녹색으로 나타낸 것은 모두 상당한 p-값을 나타내는 유전자이며, 청색으로 나타낸 것은 다중 비교를 위한 조정 후 유의성 있게 유지되는 것들이다. 도 15b는 AAV-U6-mir-HTT-6433이 주사된 마우스가 CBA에 비해 mRNA 발현에 있어서 더 많은 변화를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 15c는 mir-HTT-6433로 처리된 마우스에서의 mRNA 프로파일을 보여주는데; 7종의 RNA가 U6 및 CbA 처리 군 사이에서 상당히 차별적으로 발현되었다.
도 16은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵(middle caudate)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신(calnexin)에 대하여 정규화하였다. 주의: CBA 및 U6 구성체 각각에는 mir155 백본을 사용하였음.
도 17은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 1개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵(middle putamen)에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 18은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 19는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 20은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 미상핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 21은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 외측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 22는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵의 내측 측면에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 측면 및 주사된 측면에서의 발현 수준에 대한 데이터를 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 23은 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 중간 조가비핵에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 24는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 전방 선조체에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다. 비-주사 대조 양에서의 htt 발현 수준에 대한 데이터도 나타내었다. 상대적인 htt 발현 수준은 양 칼넥신에 대하여 정규화하였다.
도 25a-25b는 인간 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25a는 mir-155-6433 (서열식별번호: 23)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다. 도 25b는 mir-30-6433 (서열식별번호: 24)의 예상 헤어핀 구조를 나타낸다.
도 26a-26b는 양 뇌로의 AAV 벡터의 전달을 보여준다. 도 26a는 전체 선조체가 4, 6 mm 블록 내에 포함되도록 관상면에서 절제된 양 뇌의 개략적인 개관을 보여준다 (상단). 전방 블록은 속섬유막에 의해 분할되지 않은 선조체의 전방 부분을 포함한다 (중단). 주사가 표적으로 하는 내측 블록은 한정된 조가비핵을 포함하며, 미상핵은 하단에 나타내었다. 도 26b는 대조 (AAV9) 및 처리 (AAV9miRHTT) 처리된 동물에서의 AAV 벡터 게놈을 나타낸다. 벡터 게놈은 참조 유전자로서 게놈 HPRT를 사용하는 디지털 액적 PCR에 의해 측정하였다. 값들은 log 척도로 플로팅하였다.
도 27은 인공 miRNA 가이드 가닥이 디지털 액적 PCR에 의해 정량되었음을 보여준다. let-7e*에 대하여 정규화함으로써 상대적인 miRNA 수준을 계산하고, 그와 같은 값을 log 척도로 플로팅하였다. RQN < 5인 샘플은 배제하였다. 기록되는 수는 이와 같은 품질 임계치를 통과하여 miRNA 분석에 사용된 샘플의 총 수이다. P 값은 다중 시험을 위한 튜키(tukey) 보정을 포함하는 2-원 아노바(ANOVA)를 사용하여 계산하였다.
도 28은 scAAV9-항-HTT-6433이 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 보여준다. 나타낸 데이터는 양 칼넥신에 대하여 정규화된 HTT mRNA의 신호이다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p,0.03 이하에서의 처리 군들 (AAV9 또는 AAV9miRHTT) 사이의 상당한 평균 차이를 표시한다. U6-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵 및 조가비핵에서, 그리고 주사 6개월-후에는 조가비핵에서 인간 돌연변이 HTT mRNA를 상당히 낮추었다. CBA-프로모터 추진 인공 miRNA는 주사 1개월-후에 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서, 주사 6개월-후에는 미상핵 및 조가비핵에서 HTT mRNA를 낮추었다. 분석에서는 미상핵의 내측 영역, 외측 조가비핵 및 전방 선조체를 조사하였다.
도 29a-29b는 AAV9 및 AAV9miRHTT 처리된 양에서의 내생 양 htt mRNA 및 단백질의 수준을 나타낸다. 도 29a는 양 htt mRNA 수준이 방법에서 기술된 바와 같이 측정되었으며 양 칼넥신 (Canx)에 대비하여 표현되었음을 보여준다. 나타낸 것은 연구 2의 결과이다. AAV9와 AAV9miRHTT 처리 군 사이에 내생 양 htt mRNA 수준의 차이는 존재하지 않았다. 도 29b는 연구 2의 주사 6개월-후 조가비핵에서 항-htt1-17 항체 (Ab1)를 사용하여 검출된 내생 양 헌팅틴 및 인간 mHTT 단백질의 수준을 나타낸다. 샘플 웨스턴 블럿은 AAV9miRHTT가 일 측면상에 주사된 4 마리의 서로 다른 양에서의 뇌의 주사 및 비-주사 측면의 wt htt (화살표) 및 인간 돌연변이 htt (화살촉)의 신호를 보여준다. 그래프는 % 주사된 측면 대 비-주사 측면으로서 농도측정에 의해 측정된 평균 wt 양 htt 및 인간 mHTT 신호를 나타낸다. AAV9miRHTT를 사용한 처리가 내생 양 헌팅틴 단백질의 수준에는 영향을 주지 않았으나, 인간 mHTT의 수준은 상당히 감소시켰음에 유의한다. 별표는 비쌍형 t-검정을 사용한 p=0.005를 표시한다.
도 30은 AAV9-miRHTT가 선조체에서 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 감소시킨다는 것을 보여준다. 연구 1 및 2로부터의 조가비핵의 샘플 웨스턴 블럿은 항체 3B5H10를 사용하여 검출되는 돌연변이 HTT 및 적재 대조로서의 액틴을 보여준다 (상단). 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다 (하단). 나타낸 것은 연구 1 및 2, 그리고 주사 1 및 6개월-후의 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에서의 결과이다. 연구 2에서는, 주사 6개월-후 각 영역에서 2개의 영역 (영역 1 및 2)을 조사하였다. 별표는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 31은 연구 1 (U6 프로모터) 및 연구 2 (CBA 프로모터)에서의 주사 1 및 6개월-후의 MSD 검정에 의해 검출되는 인간 돌연변이 HTT 수준을 나타낸다. 그래프는 AAV9 (대조) 또는 AAV9-miRHTT 중 어느 하나로 처리된 양에서의 개별 값 및 평균 (수평 막대)의 분포를 나타낸다. 서로 다른 선조체 영역 (미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체)에 대하여 결과를 나타내었다. 별표 *는 비쌍형 t-검정을 기준으로 한 p<0.05 이하에서의 주사된 측면상에서의 AAV9과 AAV9-miRHTT 사이의 상당한 차이를 표시한다.
도 32a-32b는 miRHTT 주사된 양 선조체의 같은쪽 피질 및 반대쪽 미상핵 조가비핵에서 mHTT 수준이 변화되지 않는다는 것을 보여준다. 도 32a는 miRHTT 주사된 선조체의 같은쪽 피질에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 평균 수준을 표시하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다. 도 32b는 miRHTT-주사된 선조체의 반대쪽 미상핵 및 조가비핵에서의 액틴에 대하여 정규화된 mHTT의 수준을 표시하는 막대 그래프를 나타낸다. 데이터는 연구 1에서의 비쌍형 t-검정을 기반으로 한 주사 1 및 6개월-후 NS의 것이다.
본 발명의 측면들은 대상체에게 전달되었을 때 대상체에서의 병원성 헌팅틴 단백질 (HTT)의 발현을 감소시키는 데에 효과적인 특정 간섭 RNA(interfering RNA) (예컨대 인공 miRNA와 같은 miRNA)에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술되는 방법 및 조성물은 헌팅톤병의 치료에 유용하다.
헌팅톤병의
치료 방법
본 개시내용에 의해, 대상체에게 트랜스진 (예컨대 miRNA와 같은 억제성 RNA)을 전달하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 헌팅틴 (htt) 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 간섭 RNA를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 헌팅틴 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 억제성 RNA를 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 rAAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 헌팅틴 (예컨대 서열식별번호: 1)의 적어도 2개 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상)의 연속되는 염기에 특이적으로 결합하는 (예컨대 그와 혼성화되는) 억제성 miRNA를 제공한다. 본원에서 사용될 때, "연속되는 염기"는 (예컨대 핵산 분자의 일부로서) 서로 공유 결합되어 있는 (예컨대 하나 이상의 포스포디에스테르 결합 등에 의함) 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 miRNA는 서열식별번호: 1의 2개 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상)의 연속되는 뉴클레오티드 염기와 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 99 % 또는 약 100 % 동일하다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩되는 miRNA이다.
본원에서 사용될 때, "헌팅톤병" 또는 "HD"는 병원성 돌연변이 헌팅틴 단백질 (HTT 또는 mHTT)의 생성을 초래하는 HTT 유전자에서의 3-뉴클레오티드 반복체 확장 (예컨대 CAG, 폴리-글루타민 또는 폴리Q, 트랙트(tract)로 번역됨)에 의해 야기되는 점진적으로 악화되는 운동, 인지 및 행동 변화를 특징으로 하는 신경변성 질환을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 헌팅틴 단백질은 뇌의 특정 영역에서의 뉴런 세포 사멸 속도를 가속한다. 일반적으로, HD의 중증도는 대상체에서의 3-뉴클레오티드 반복체 확장의 크기와 상관된다. 예를 들어, 36 내지 39개 사이의 반복체를 포함하는 CAG 반복체 영역을 가지는 대상체는 "발현성 감퇴(reduced penetrance)" HD를 가지는 것을 특징으로 하는 반면, 40개를 초과하는 반복체를 가지는 대상체는 "완전 발현성" HD를 가지는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, HD에 걸려 있거나 그것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 약 36 내지 약 39개 사이의 CAG 반복체 (예컨대, 36, 37, 38 또는 39개의 반복체)를 포함하는 HTT 유전자를 가진다. 일부 실시양태에서, HD에 걸려 있거나 그것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 40개를 초과하는 (예컨대, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200개 또는 그 이상인) CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가진다. 일부 실시양태에서, 100개를 초과하는 CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가지는 대상체는 100개 미만의 CAG 반복체를 가지는 대상체에 비해 더 일찍 HD를 발병한다. 일부 실시양태에서, 100개를 초과하는 CAG 반복체를 포함하는 HTT 유전자를 가지는 대상체는 약 20세의 연령 전에 HD 증상들을 발병할 수 있는데, 청소년 HD (무동-경직성 HD 또는 웨스트팔(Westphal) 변이 HD로도 지칭됨)에 걸린 것으로 지칭된다. 대상체 HTT 유전자 대립유전자(allele)에서의 CAG 반복체의 수는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 양식에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 대상체의 생물학적 샘플 (예컨대 혈액)로부터 핵산 (예컨대 DNA)이 단리될 수 있으며, PCR 또는 핵산 서열분석 (예컨대 일루미나(Illumina) 서열분석, 생거(Sanger) 서열분석, SMRT 서열분석 등)과 같은 혼성화-기반 방법에 의해 HTT 대립유전자의 CAG 반복체 수가 측정될 수 있다.
물질의 "유효량"은 원하는 효과를 산출하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 유효량은 대상체 표적 조직의 충분한 수의 표적 세포를 형질감염 (또는 rAAV 매개 전달 맥락에서의 감염)시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 표적 조직은 중추신경계 (CNS) 조직 (예컨대 뇌 조직, 척수 조직, 뇌척수액 (CSF) 등)이다. 일부 실시양태에서, (예컨대 rAAV를 통하여 전달될 수 있는) 단리된 핵산의 유효량은 대상체에서 치료적 이익을 가지기에, 예를 들면 병원성 유전자 또는 단백질 (예컨대 HTT)의 발현을 감소시키기에, 대상체의 수명을 연장하기에, 대상체에서 질환의 하나 이상의 증상 (예컨대 헌팅톤병의 증상)을 개선하기에 충분한 양일 수 있는 등이다. 유효량은 예를 들면 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 및 표적화될 조직과 같은 다양한 인자들에 따라 달라지게 되며, 그에 따라 본 개시내용의 다른 어딘가에서 기술되는 바와 같이 대상체 및 조직간에 가변적일 수 있다.
단리된
핵산
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 헌팅틴 (HTT)의 발현을 감소시키는 (예컨대 억제하는) 데에 유용한 단리된 핵산을 제공한다. "핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 및 핵산은 단리된다. 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 인공적으로 산출되는 것을 의미한다. 핵산과 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 하기를 의미한다: (i) 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 시험관 내에서 증폭되는 것; (ii) 클로닝에 의해 재조합으로 제조되는 것; (iii) 절단 및 겔 분리에 의한 것과 같이 정제되는 것; 또는 (iv) 예를 들면 화학적 합성에 의해 합성되는 것. 단리된 핵산은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 조작가능한 핵산이다. 따라서, 5' 및 3' 제한 부위가 알려져 있거나 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 벡터에 포함되어 있는 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되나, 그의 자연 숙주 내에서 그의 고유 상태로 존재하는 핵산 서열은 그렇지 않다. 단리된 핵산이 실질적으로 정제될 수도 있으나, 그럴 필요가 있는 것은 아니다. 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내에서 단리되는 핵산은 그것이 존재하는 세포내 물질을 미미한 백분율이지만 그것이 포함할 수 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 본원에서 용어가 사용될 때 그와 같은 핵산은 단리된 것인데, 그것이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 표준 기술에 의해 용이하게 조작가능하기 때문이다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 그의 자연 환경으로부터 단리되거나 인공적으로 제조된 (예컨대 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 등에 의함) 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.
숙련 기술자라면, 캡시드 단백질의 기능적으로 등가인 변이체 또는 동종체를 제공하기 위하여 보존성 아미노산 치환이 이루어질 수 있다는 것도 알고 있을 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 보존성 아미노산 치환을 발생시키는 서열 대안을 포괄한다. 본원에서 사용될 때, 보존성 아미노산 치환은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적인 전하 또는 크기 특징을 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 해당 방법들을 열거하고 있는 참고문헌 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에 나와 있는 것들과 같이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 폴리펩티드 서열 변경 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존성 치환에는 하기 군 내의 아미노산들 사이에서 이루어지는 치환이 포함된다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 이에 따라, 본원에서 개시되는 단백질 및 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 보존성 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산은 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (rAAV 벡터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술되는 바와 같은 단리된 핵산은 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 영역 (예컨대 제1 영역)을 포함한다. 단리된 핵산 (예컨대 재조합 AAV 벡터)은 캡시드 단백질에 패키지화되어 대상체에게 투여되고/거나 선택된 표적 세포로 전달될 수 있다. "재조합 AAV (rAAV) 벡터"는 통상적으로 최소한 트랜스진 및 그의 조절 서열, 그리고 5' 및 3' AAV 역전 말단 반복체 (ITR)로 구성된다. 트랜스진은 본원의 다른 어딘가에서 개시되는 바와 같이 대상체의 내생 mRNA를 표적으로 하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA)를 코딩하는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 다른 어딘가에서 기술되는 바와 같이, 트랜스진은 또한 예를 들면 단백질 및/또는 발현 조절 서열 (예컨대 폴리-A 테일)을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
일반적으로, ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 이러한 서열의 어느 정도의 사소한 변형은 허용가능하지만, 바람직하게는 실질적으로 전체인 ITR 코딩 서열이 분자에 사용된다. 이러한 ITR 서열을 변형시키는 능력은 관련 기술분야의 기술에 속한다 (예컨대 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]과 같은 교재; 및 문헌 [K. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)] 참조). 본 발명에 사용되는 그와 같은 분자의 예는 선택된 트랜스진 서열 및 연관 조절 요소들이 5' 및 3' AAV ITR 서열에 의해 플랭킹되어 있는, 트랜스진을 포함하는 "시스-작용(cis-acting)" 플라스미드이다. AAV ITR 서열은 현재 확인되어 있는 포유동물 AAV 유형들을 포함하여, 어떠한 알려져 있는 AAV로부터도 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예컨대 rAAV 벡터)은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 이들의 변이체에서 선택되는 혈청형을 가지는 적어도 하나의 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 AAV2 ITR을 코딩하는 영역 (예컨대 제1 영역)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 추가적으로 제2 AAV ITR을 포함하는 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 이들의 변이체에서 선택되는 혈청형을 가진다. 일부 실시양태에서, 제2 ITR은 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있는 돌연변이 ITR이다. "말단 분해 부위가 결핍되어 있는"이라는 용어는 ITR의 말단 분해 부위 (TRS)의 기능을 무효화하는 돌연변이 (예컨대 센스(sense) 돌연변이 예컨대 비-동의 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이)를 포함하는 AAV ITR, 또는 기능성인 TRS를 코딩하는 핵산 서열이 결핍되어 있는 감축된 AAV ITR (예컨대 ΔTRS ITR)을 지칭할 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 기능성인 TRS가 결핍되어 있는 ITR을 포함하는 rAAV 벡터는 예를 들면 문헌 [McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656]에 기술되어 있는 바와 같이 자가-상보성인 rAAV 벡터를 산출한다.
재조합 AAV 벡터에 대하여 상기에서 밝힌 주요 요소들 이외에, 벡터는 또한 본 발명에 의제 제조되는 벡터에 의해 형질감염되거나 바이러스에 의해 감염된 세포에서의 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 가능하게 하는 방식으로 트랜스진의 요소들과 작용가능하게 연결된 통상적인 조절 요소들을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "작용가능하게 연결된" 서열에는 해당 유전자와 연속되는 발현 조절 서열, 및 트랜스로 작용하거나 원거리에서 작용하여 해당 유전자를 조절하는 발현 조절 서열 둘 다가 포함된다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉 코자크(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 원할 경우 코딩된 생성물의 분비를 강화하는 서열이 포함된다. 고유성, 상시성, 유도성 및/또는 조직-특이성인 프로모터를 포함한 수많은 발현 조절 서열들이 관련 기술분야에 알려져 있으며, 활용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 핵산 서열 (예컨대 코딩 서열)과 조절 서열은 핵산 서열의 발현 또는 전사를 조절 서열의 영향 또는 조절하에 위치시키도록 하는 방식으로 그들이 공유 연결되는 경우, 작용가능하게 연결된 것으로 지칭된다. 핵산 서열이 기능성인 단백질로 번역되는 것을 원하는 경우, 2개의 DNA 서열은 5' 조절 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 발생시키는 경우, 그리고 2개 DNA 서열들 사이 연결의 특성이 (1) 프레임-쉬프트(frame-shift) 돌연변이의 도입을 발생시키지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 유도하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 해당 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우에 작용가능하게 연결된 것으로 지칭된다. 따라서, 생성되는 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 프로모터 영역이 해당 DNA 서열의 전사에 영향을 줄 수 있었던 경우, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작용가능하게 연결되는 것이다. 마찬가지로, 2개 이상의 코딩 영역들은 공통 프로모터로부터의 그들의 전사가 2개 이상 단백질의 발현이 인 프레임(in frame)으로 번역되도록 하는 것을 발생시키는 방식으로 그들이 연결되는 경우, 작용가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서는, 작용가능하게 연결된 코딩 서열들이 융합 단백질을 산출한다. 일부 실시양태에서, 작용가능하게 연결된 코딩 서열들은 기능성 RNA (예컨대 miRNA)를 산출한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 트랜스진을 포함하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 트랜스진은 하나 이상의 마이크로RNA(microRNA) (예컨대 miRNA)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 전사 또는 전사-후 유전자 침묵화(silencing)를 매개할 수 있는 소형 비-코딩 RNA 분자이다. 통상적으로, miRNA는 효소적으로 프레(pre)-miRNA로 프로세싱되는 (예컨대 드로샤(Drosha), DGCR8, 파샤(Pasha) 등에 의함) 일차 miRNA (프리(pri)-miRNA)로 지칭되는 헤어핀 또는 스템-루프 (예컨대 자가-상보성, 단일-가닥 백본을 가짐) 이중체 구조로 전사된다. 프리-miRNA의 길이는 가변적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프리-miRNA는 길이가 약 100 내지 약 5000개 염기쌍 (예컨대 약 100, 약 200, 약 500, 약 1000, 약 1200, 약 1500, 약 1800 또는 약 2000개 염기쌍) 범위이다. 일부 실시양태에서, 프리-miRNA는 길이가 200개 염기쌍을 초과한다 (예컨대 2500, 5000, 7000, 9000개 또는 그 이상 염기쌍의 길이).
역시 헤어핀 또는 스템-루프 이중체 구조를 특징으로 하는 프레-miRNA도 길이가 가변적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 40개 염기쌍 길이 내지 약 500개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 50 내지 100개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 프레-miRNA는 크기가 약 50 내지 약 90개 염기쌍 길이 (예컨대 약 50, 약 52, 약 54, 약 56, 약 58, 약 60, 약 62, 약 64, 약 66, 약 68, 약 70, 약 72, 약 74, 약 76, 약 78, 약 80, 약 82, 약 84, 약 86, 약 88 또는 약 90개 염기쌍 길이) 범위이다.
일반적으로, 프레-miRNA는 세포질로 외수송되어 다이서(Dicer)에 의해 효소적으로 프로세싱됨으로써, 먼저 불완전한 miRNA/miRNA* 이중체를, 그리고 다음에는 단일-가닥의 성숙한 miRNA 분자를 산출하며, 이는 이후 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)에 적재된다. 통상적으로, 성숙한 miRNA 분자는 크기가 약 19 내지 약 30개 염기쌍 길이 범위이다. 일부 실시양태에서, 성숙한 miRNA 분자는 길이가 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 30개 염기쌍이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 핵산은 서열식별번호: 2-10 또는 21-22 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하는 프리-miRNA, 프레-miRNA 또는 성숙한 miRNA를 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서는 단리된 핵산 또는 벡터 (예컨대 rAAV 벡터)가 하나를 초과하는 (예컨대 2, 3, 4, 5, 10개 또는 그 이상과 같은 다수의) miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다는 것을 알아야 한다. 일부 실시양태에서, 상기 하나를 초과하는 miRNA 각각은 동일한 표적 유전자를 표적으로 한다 (예컨대 그와 혼성화되거나 거기에 특이적으로 결합함) (예를 들면 각 miRNA가 HTT 유전자를 표적으로 하는 3종의 독자적인 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산). 일부 실시양태에서, 하나를 초과하는 miRNA 각각은 서로 다른 표적 유전자를 표적으로 한다 (예컨대 그와 혼성화되거나 거기에 특이적으로 결합함).
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 인공 miRNA를 코딩하는 단리된 핵산 및 벡터 (예컨대 rAAV 벡터)를 제공한다. 본원에서 사용될 때, "인공 miRNA" 또는 "amiRNA"는 예를 들면 문헌 [Eamens et al. (2014), Methods Mol . Biol . 1062:211-224]에 기술되어 있는 바와 같이 miRNA 및 miRNA* (예컨대 miRNA 이중체의 패신저(passenger) 가닥) 서열이 표적 유전자의 고도로 효율적인 RNA 침묵화를 유도하는 상응하는 amiRNA/amiRNA* 서열로 대체되어 있는 내생 프리-miRNA 또는 프레-miRNA (예컨대 기능성인 성숙한 miRNA를 생성시킬 수 있는 전구체 miRNA인 miRNA 백본)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인공 miRNA는 내생 miR-155 성숙 miRNA-코딩 서열 대신 성숙한 HTT-특이적 miRNA를 코딩하는 서열 (예컨대 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나)이 삽입되어 있는 miR-155 프리-miRNA 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 기술되는 바와 같은 miRNA (예컨대 인공 miRNA)는 miR-155 백본 서열, miR-30 백본 서열, miR-64 백본 서열 또는 miR-122 백본 서열을 포함한다.
트랜스진을 포함하는 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)은 단리된 핵산의 어떠한 적합한 위치에도 배치될 수 있다. 상기 영역은 예를 들면 인트론, 5' 또는 3' 비번역 영역 등을 포함하여 핵산의 어떠한 비번역 부분에도 배치될 수 있다.
일부 경우에는, 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예컨대 단백질 코딩 서열) 첫 번째 코돈의 상류에 상기 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 배치시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 단백질 코딩 서열의 첫 번째 코돈과 첫 번째 코돈의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다.
일부 경우 (예컨대 트랜스진에 단백질 코딩 서열이 결핍되어 있는 경우)에는, 트랜스진의 폴리-A 테일의 상류에 상기 영역 (예컨대 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역 등)을 배치하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 2000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 1000개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 500개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 250개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 150개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 100개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 50개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 첫 번째 염기와 첫 번째 염기의 20개 뉴클레오티드 상류 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 영역은 프로모터 서열의 마지막 뉴클레오티드 염기와 폴리-A 테일 서열의 첫 번째 뉴클레오티드 염기 사이에 배치된다.
일부 경우에서, 상기 영역은 트랜스진 폴리-A 테일의 마지막 염기의 하류에 배치될 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 2000개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 1000개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 500개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 250개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다. 상기 영역은 폴리-A 테일의 마지막 염기와 마지막 염기의 150개 뉴클레오티드 하류 위치 사이에 존재할 수 있다.
트랜스진이 하나를 초과하는 miRNA를 코딩하는 경우, 각 miRNA는 트랜스진 내의 어떠한 적합한 위치에도 배치될 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들면, 제1 miRNA를 코딩하는 핵산은 트랜스진의 인트론에 배치될 수 있으며, 제2 miRNA를 코딩하는 핵산 서열은 또 다른 비번역 영역 (예컨대 트랜스진의 단백질 코딩 서열 마지막 코돈과 폴리-A 테일 첫 번째 염기 사이)에 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 추가적으로 하나 이상의 발현 조절 서열 (예컨대 프로모터 등)을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 발현 조절 서열에는 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉 코자크 공통 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 원할 경우 코딩된 생성물의 분비를 강화하는 서열이 포함된다. 고유성, 상시성, 유도성 및/또는 조직-특이성인 프로모터를 포함한 대단히 많은 수의 발현 조절 서열들이 관련 기술분야에 알려져 있으며, 활용될 수 있다.
"프로모터"는 특정 유전자 전사를 개시하는 데에 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. "작용가능하게 배치된", "조절하에 있는" 또는 "전사 조절하에 있는"이라는 구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 조절하는 데에 있어서 핵산과 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 의미한다.
단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 후 및 3' AAV ITR 서열 전에 삽입된다. 본 개시내용에 유용한 rAAV 구조체는 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 포함할 수도 있다. 한 가지 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래하며, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나를 초과하는 폴리펩티드를 생성시키는 데에 사용된다. IRES 서열은 하나를 초과하는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질을 생성시키는 데에 사용되게 된다. 이러한 공통적인 벡터 요소들 및 다른 것들의 선택은 통상적인 것으로써, 많은 그와 같은 서열들이 구입가능하다 (예컨대 문헌 [Sambrook et al.] 및 예를 들면 그안의 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27에 인용되어 있는 참고문헌, 그리고 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조). 일부 실시양태에서는, 발입병 바이러스 2A 서열이 다중단백질(polyprotein)에 포함되는데; 이는 다중단백질의 절단을 매개하는 것으로 나타나 있는 소형 펩티드 (대략 18개 아미노산 길이)이다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 치료법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 포함한 인공 시스템에서 이미 입증되어 있다 (문헌 [Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933]; [Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127]; [Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873]; 및 [Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459]; [de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208]; [de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.]; 및 [Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817]).
상시성 프로모터의 예에는 비제한적으로 레트로바이러스 로우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의적으로 RSV 인핸서 포함), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의적으로 CMV 인핸서 포함) (예컨대 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터 [인비트로겐(Invitrogen) 사]가 포함된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 강화된 닭 β-액틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 U6 프로모터이다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인성으로 공급되는 화합물, 온도와 같은 환경 인자, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들면 세포 또는 복제중인 세포에서만의 급성인 단계, 특정 분화 상태에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 비제한적으로 인비트로겐 사, 클론테크(Clontech) 사 및 아리아드(Ariad) 사를 포함한 다양한 시중의 공급원으로부터 구입가능하다. 많은 다른 시스템들이 기술된 바 있으며, 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 공급되는 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예에는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 포유동물 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088호); 엑디손 곤충 프로모터 (문헌 [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]); 테트라사이클린-억제성 시스템 (문헌 [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]); 테트라사이클린-유도성 시스템 (문헌 [Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 문헌 [Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)]도 참조); RU486-유도성 시스템 (문헌 [Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신-유도성 시스템 (문헌 [Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)])이 포함된다. 이와 같은 맥락에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들면 온도, 세포 또는 복제중인 세포에서만의 급성 단계, 특정 분화 상태에 의해 조절되는 것들이다.
또 다른 실시양태에서는, 트랜스진의 고유 프로모터가 사용되게 된다. 고유 프로모터는 트랜스진의 발현이 고유 발현을 모방하기를 원하는 경우에 바람직할 수 있다. 고유 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발생에 따라, 또는 조직-특이적인 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 고유 발현을 모방하기 위하여 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코자크 공통 서열과 같은 다른 고유 발현 조절 요소들이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직-특이적인 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에서, 조직-특이적인 조절 서열은 조직 특이적인 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적인 전사 인자에 결합한다. 그와 같은 조직-특이적 조절 서열 (예컨대 프로모터, 인핸서 등)에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 조직-특이적 조절 서열에는 하기의 조직 특이적 프로모터들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 간-특이적 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드 (PPY) 프로모터, 시냅신-1 (Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 포유동물 데스민 (DES) 프로모터, α-미오신 중쇄 (a-MHC) 프로모터 또는 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터. 다른 대표적인 프로모터로는 숙련 기술자라면 알고 있을 여러 가지 중에서도 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (문헌 [Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)]); 알파-페토단백질 (AFP) 프로모터 (문헌 [Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]), 골 오스테오칼신 프로모너 (문헌 [Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]); 골 시알로단백질 프로모터 (문헌 [Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)]), CD2 프로모터 (문헌 [Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)]); 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-사슬 프로모터, 뉴런성 예컨대 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (문헌 [Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]), 뉴로필라멘트 경-쇄 유전자 프로모터 (문헌 [Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)]) 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터 (문헌 [Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)])가 포함된다.
본 개시내용의 측면들은 하나를 초과하는 프로모터 (예컨대 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 프로모터)를 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 제1 영역 및 억제성 RNA (예컨대 miRNA)를 코딩하는 제2 영역을 포함하는 트랜스진을 가지는 구성체의 맥락에서는, 제1 프로모터 서열 (예컨대 단백질 코딩 영역에 작용가능하게 연결된 제1 프로모터 서열)을 사용하여 단백질 코딩 영역의 발현을 추진하고, 제2 프로모터 서열 (예컨대 억제성 RNA 코딩 영역에 작용가능하게 연결된 제2 프로모터 서열)을 사용하여 억제성 RNA 코딩 영역의 발현을 추진하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 상기 제1 프로모터 서열 및 제2 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열 또는 서로 다른 프로모터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 프로모터 서열 (예컨대 단백질 코딩 영역의 발현을 추진하는 프로모터)은 RNA 폴리머라제 III (polIII) 프로모터 서열이다. polIII 프로모터 서열의 비-제한적인 예에는 U6 및 H1 프로모터 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 프로모터 서열 (예컨대 억제성 RNA의 발현을 추진하는 프로모터 서열)은 RNA 폴리머라제 II (polII) 프로모터 서열이다. polII 프로모터 서열의 비-제한적인 예에는 T7, T3, SP6, RSV 및 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열이 포함된다. 일부 실시양태에서는, polIII 프로모터 서열이 억제성 RNA (예컨대 miRNA) 코딩 영역의 발현을 추진한다. 일부 실시양태에서는, polII 프로모터 서열이 단백질 코딩 영역의 발현을 추진한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 상기 단백질은 치료용 단백질 (예컨대 포유동물 대상체에서의 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드) 또는 리포터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 치료용 단백질은 헌팅톤병의 치료 또는 예방에 유용한 것, 예를 들면 문헌 [Marelli et al. (2016) Orphanet Journal of Rare Disease 11:24; doi:10.1186/s13023-016-0405-3]에 기술되어 있는 바와 같은 폴리글루타민 결합 펩티드 1 (QBP1), PTD-QBP1, ED11, C4 내부체(intrabody), VL12.3 내부체, MW7 내부체, Happ1 항체, Happ3 항체, mEM48 내부체, 특정 단일클론 항체 (예컨대 1C2) 및 펩티드 P42, 그리고 이들의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 야생형 헌팅틴 단백질 (예컨대 36개 미만의 반복체를 포함하는 폴리Q 반복 영역을 가지는 헌팅틴 단백질)이다.
어떠한 특정 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 야생형 HTT 발현 및 기능이 세포에서 보존되기 때문에, 돌연변이 헌팅틴 (HTT)의 대립유전자-특이적 침묵화는 비-대립유전자 특이적 침묵화 (예컨대 야생형 및 돌연변이 HTT 대립유전자 둘 다의 침묵화)에 비해 대상체에서 향상된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다. 본 발명의 측면들은 비-대립유전자-특이적인 방식으로 HTT 유전자를 표적으로 하면서도 경화된(hardened) 야생형 HTT 유전자 (miRNA에 의해 표적화되지 않는 야생형 HTT 유전자)의 발현을 추진하는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA) 서열을 포함하는 단리된 핵산 및 벡터가 예를 들면 CNS 조직에서 야생형 HTT의 증가된 발현에 의해 동시적인 돌연변이 HTT 녹다운(knockdown)을 달성할 수 있다는 발명자들의 인지 및 인식과 관련된다. 일반적으로, 내생 야생형 및 돌연변이 HTT mRNA를 코딩하는 핵산과 "경화된" 야생형 HTT mRNA를 코딩하는 트랜스진 핵산의 서열은 충분히 서로 달라서, "경화된" 야생형 HTT 트랜스진 mRNA는 하나 이상의 억제성 RNA (예컨대 miRNA)에 의해 표적화되지 않는다. 이는 예를 들면 HTT 트랜스진 서열에 하나 이상의 침묵 돌연변이를 도입함으로써 그것이 내생 야생형 HTT 유전자와 동일한 단백질을 코딩하나 상이한 핵산 서열을 가지도록 하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이와 같은 경우, 외인성 mRNA는 "경화된" 것으로 지칭될 수 있다. 대안적으로, 억제성 RNA (예컨대 miRNA)는 내생 야생형 HTT mRNA의 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 표적으로 할 수 있다. 다음에, 이러한 5' 및/또는 3' 영역은 트랜스진 mRNA가 하나 이상의 억제성 RNA에 의해 표적화되지 않도록 트랜스진 mRNA에서는 제거되거나 대체될 수 있다.
트랜스진에 제공될 수 있는 리포터 유전자 (예컨대 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 서열)에는 비제한적으로 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로르암페니콜 아세틸프랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 것들을 코딩하는 DNA 서열이 포함된다. 그의 발현을 추진하는 조절 요소들과 결합될 경우, 리포터 서열은 효소, 방사선사진, 색상측정, 형광 또는 기타 분광사진 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정, 그리고 효소 연관 면역흡착제 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA) 및 면역조직화학을 포함한 면역학적 검정을 포함한 통상적인 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 보유하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 트랜스진이 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 보유하는 벡터는 발광측정기에서 색상 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다. 이와 같은 리포터들은 예를 들면 핵산의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는 데에 유용할 수 있다.
재조합
아데노
-연관 바이러스 (
rAAV
)
일부 측면에서, 본 개시내용은 단리된 AAV를 제공한다. AAV와 관련하여 본원에서 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 인공적으로 제조되거나 수득된 AAV를 지칭한다. 단리된 AAV는 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그와 같은 AAV는 본원에서 "재조합 AAV"로 지칭된다. 재조합 AAV (rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가지고 있어서, rAAV의 뉴클레아제 및/또는 트랜스진이 하나 이상의 예정된 조직(들)으로 특이적으로 전달되게 된다. AAV 캡시드는 이러한 조직-특이적 표적화 능력을 결정하는 데에 있어서 중요한 요소이다. 이에 따라, 조직이 표적화되는 데에 적절한 캡시드를 가지는 rAAV가 선택될 수 있다.
원하는 캡시드 단백질을 가지는 재조합 AAV를 수득하기 위한 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들면 그 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함되는 US 2003/0138772호 참조). 통상적으로, 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질; 기능성인 rep 유전자; AAV 역전 말단 반복체 (ITR) 및 트랜스진으로 구성되는 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질에의 재조합 AAV 벡터의 패키지화를 가능하게 하기에 충분한 헬퍼(helper) 기능성들을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV의 cap 유전자에 의해 코딩되는 구조 단백질이다. AAV는 모두 대안적인 스플라이싱을 통하여 단일 cap 유전자로부터 전사되는 3종의 캡시드 단백질인 비리온 단백질 1 내지 3 (VP1, VP2 및 VP3으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3의 분자량은 각각 약 87 kDa, 약 72 kDa 및 약 62 kDa이다. 일부 실시양태에서, 번역시, 캡시드 단백질은 바이러스 게놈 주변으로 구형의 60-량체 단백질 쉘(shell)을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질의 기능은 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 전달하며, 숙주와 상호작용하는 것이다. 일부 측면에서, 캡시드 단백질은 조직 특이적인 방식으로 숙주로 바이러스 게놈을 전달한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAVrh8, AAV9 및 AAV10으로 구성되는 군에서 선택되는 AAV 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 비-인간 영장류로부터 유래하는 혈청형, 예를 들면 AAVrh8 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함한다.
AAV 캡시드에 rAAV 벡터를 패키지화하기 위하여 숙주 세포에서 배양될 구성요소들은 트랜스로(in trans) 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 구성요소들 중 임의의 하나 이상 (예컨대 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능성)은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 필요한 구성요소 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 안정한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 그와 같은 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 조절하에 필요한 구성요소(들)를 함유하게 된다. 그러나, 필요한 구성요소(들)는 상시성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 적합한 유도성 및 상시성 프로모터의 예는 본원의 트랜스진과 함께 사용하기에 적합한 조절 요소들에 대한 논의에서 제공된다. 또 다른 대안에서, 선택되는 안정한 숙주 세포는 상시성 프로모터의 조절하에 있는 선택된 구성요소(들)를, 그리고 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절하에 있는 다른 선택된 구성요소(들)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 293 세포 (상시성 프로모터의 조절하에 E1 헬퍼 기능성을 포함함)로부터 유래하나 유도성 프로모터의 조절하에 rep 및/또는 cap 단백질을 함유하는 안정한 숙주 세포가 생성될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 또 다른 안정한 숙주 세포가 생성될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 (예컨대 야생형 헌팅틴 단백질, 임의적으로 "경화된" 야생형 헌팅틴 단백질)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기한 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포를 포함하는 상기 조성물은 추가적으로 냉동보존제를 포함한다.
본 개시내용의 rAAV를 제조하는 데에 필요한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능성은 어떠한 적절한 유전자 요소 (벡터)를 사용하여서도 패키지화용 숙주 세포로 전달될 수 있다. 선택되는 유전자 요소는 본원에서 기술되는 것들을 포함한 어떠한 적합한 방법에 의해서도 전달될 수 있다. 본 개시내용의 임의 실시양태를 구성하는 데에 사용되는 방법은 핵산 조작 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기술이 포함된다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조한다. 마찬가지로, rAAV 비리온을 생성시키는 방법이 잘 알려져 있으며, 적합한 방법의 선택이 본 개시내용에 있어서 제한이 되는 것은 아니다. 예를 들면, 문헌 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 U.S. 특허 제5,478,745호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염법 (U.S. 특허 제6,001,650호에 상세하게 기술되어 있음)을 사용하여 제조될 수 있다. 통상적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자로 패키지화될 재조합 AAV 벡터 (트랜스진을 포함하는 것), AAV 헬퍼 기능성 벡터 및 액세서리 기능성 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질감염시키는 것에 의해 제조된다. AAV 헬퍼 기능성 벡터는 증식성 AAV 복제 및 캡시드화(encapsidation)에 트랜스로 기능하는 "AAV 헬퍼 기능성" 서열 (즉 rep 및 cap)을 코딩한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능성 벡터는 조금의 검출가능한 야생형 AAV 비리온 (즉 기능성인 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)도 생성시키지 않는 효율적인 AAV 벡터 제조를 뒷받침한다. 본 개시내용과 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비-제한적인 예에는 U.S. 특허 제6,001,650호에 기술되어 있는 pHLP19 및 U.S. 특허 제6,156,303호에 기술되어 있는 pRep6cap6 벡터가 포함되며, 둘 다 전체적으로 본원에 참조로 포함된다. 액세서리 기능성 벡터는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 AAV가 복제를 위하여 의존하는 세포 기능성 (즉 "액세서리 기능성")을 위한 뉴클레오티드 서열들을 코딩한다. 액세서리 기능성에는 비제한적으로 AAV 유전자 전사 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 조립에 연관되어 있는 부분들을 포함한 AAV 복제에 필요한 기능성들이 포함된다. 바이러스-기반 액세서리 기능성은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (헤르페스 심플렉스 바이러스 유형-1이 아닌 다른 것) 및 박시니아 바이러스와 같은 알려져 있는 헬퍼 바이러스들 중 어느 것으로부터 유래할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. "형질감염"이라는 용어는 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는 데에 사용되는 것으로써, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우에 세포는 "형질감염된" 것이다. 수많은 형질감염 기술들이 관련 기술분야에 일반적으로 알려져 있다. 예를 들면 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456], [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York], [Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier] 및 [Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 그와 같은 기술들은 뉴클레오티드 통합 벡터 및 기타 핵산 분자와 같은 하나 이상의 외인성 핵산을 적합한 숙주 세포로 도입하는 데에 사용될 수 있다.
"숙주 세포"는 해당 물질을 함유하거나 함유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 구성체, AAV 미니유전자 플라스미드, 액세서리 기능성 벡터, 또는 재조합 AAV의 제조와 연관되어 있는 다른 이전 DNA의 수용자로 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 기원 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용될 때의 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열에 의해 형질감염된 바 있는 세포를 지칭할 수 있다. 자연적이거나, 우연하거나 또는 고의적인 돌연변이로 인하여, 단일 모체 세포의 자손들이 형태구조 또는 게놈 또는 총 DNA 보체에 있어서 원래의 모체와 반드시 완전히 동일할 필요는 없을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용될 때, "세포주"라는 용어는 시험관 내에서 연속적이거나 장기간인 성장 및 분할을 할 수 있는 세포 군집을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 선조 세포로부터 유래하는 클론 군집이다. 그와 같은 클론 군집의 저장 또는 이전 동안 핵형에 있어서 자발적이거나 유도된 변화가 발생할 수 있다는 것 또한 관련 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 언급되는 세포주로부터 유래하는 세포들은 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지는 않을 수 있는데, 언급되는 세포주는 그와 같은 변이체들을 포괄한다.
본원에서 사용될 때, "재조합 세포"라는 용어는 생물학적으로-활성인 폴리펩티드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산 예컨대 RNA의 생성으로 이어지는 DNA 분절과 같은 외인성 DNA 분절이 도입되어 있는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "벡터"라는 용어에는 적정한 조절 요소와 결합될 경우 복제를 할 수 있으며 세포들 사이에서 유전자 서열을 이전할 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등이 포함된다. 따라서, 상기 용어에는 클로닝 및 발현 비히클은 물론, 바이러스 벡터도 포함된다. 일부 실시양태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 분절이 프로모터의 전사 조절하에 배치되는 벡터인 것으로 생각된다. "프로모터"는 유전자의 특이적인 전사를 개시하는 데에 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. "작용가능하게 배치된", "조절하에 있는" 또는 "전사 조절하에 있는"이라는 구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 조절하는 핵산과 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 존재한다는 것을 의미한다. "발현 벡터 또는 구성체"라는 용어는 서열을 코딩하는 핵산의 일부 또는 전체가 전사될 수 있는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 구성체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 발현에는 예를 들면 전사되는 유전자로부터 생물학적으로-활성인 폴리펩티드 생성물 또는 기능성 RNA (예컨대 가이드 RNA)를 생성시키기 위한 핵산의 전사가 포함된다. 본 개시내용의 rAAV를 제조하기 위한 원하는 AAV 캡시드에의 재조합 벡터의 전기한 패키지화 방법이 제한되는 것을 의미하는 것은 아니며, 숙련 기술자라면 다른 적합한 방법이 떠오르게 될 것이다.
일부 실시양태에서는, 서열 목록에서 제공되는 서열을 포함한 본원에서 제공되는 서열 중 임의의 하나 이상 티미딘 (T) 뉴클레오티드 또는 우리딘 (U) 뉴클레오티드가 아데노신 뉴클레오티드와의 염기 쌍형성 (예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 통함)에 적합한 임의의 다른 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 서열 목록에서 제공되는 서열을 포함한 본원에서 제공되는 서열 중 임의의 하나 이상 티미딘 (T) 뉴클레오티드는 우리딘 (U) 뉴클레오티드로 적합하게 대체될 수 있거나, 또는 그 반대이다.
투여 양식
본 개시내용의 rAAV는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 적절한 방법에 따라 조성물 중에서 대상체에게 전달될 수 있다. 예를 들면, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 담체에 현탁된 (즉 조성물 중의) rAAV가 대상체, 즉 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니 피그, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비-인간 영장류 (예컨대 마카크)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 숙주 동물에 인간이 포함되지 않는다.
포유동물 대상체에의 rAAV의 전달은 예를 들면 근육내 주사에 의하거나, 또는 포유동물 대상체 혈류로의 투여에 의할 수 있다. 혈류로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관에의 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 수술 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 기술인 격리된 사지 관류(isolated limb perfusion)에 의해 혈류로 투여되는데, 상기 방법은 본질적으로 통상의 기술자가 rAAV 비리온의 투여 전에 전신 순환으로부터 사지를 격리하는 것을 가능하게 한다. U.S. 특허 제6,177,403호에 기술되어 있는 격리된 사지 관류 기술의 변형 역시 근육 세포 또는 조직으로의 형질도입을 잠재적으로 강화하기 위하여 격리된 사지의 혈관구조에 비리온을 투여하는 데에 숙련 기술자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 어떤 경우에는, 대상체의 CNS로 비리온을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "CNS"는 척추동물 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 상기 용어에는 뉴런 세포, 신경아교세포, 별아교세포, 뇌척수액 (CSF), 간질 공간, 골, 연골 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 재조합 AAV는 예컨대 뇌실 영역에의 주사에 의해 직접 CNS 또는 뇌로는 물론, 정위 주사에 의하는 것과 같이 관련 기술분야에 알려져 있는 신경외과적 기술을 사용하여 바늘, 카테터 또는 관련 장치에 의해 선조체 (예컨대 선조체의 미상핵 또는 조가비핵), 척수 및 신경근 이음부 또는 소뇌 소엽으로 전달될 수 있다 (예컨대 문헌 [Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999]; [Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000]; [Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993]; 및 [Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조). 일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 기술되는 바와 같은 rAAV는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 뇌내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 수막강내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 선조체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 두개내 주사에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 대조(cisterna magna) 주사에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 뇌 외측 뇌실 주사에 의해 전달된다.
본 개시내용의 측면들은 캡시드 단백질 및 트랜스진을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것으로써, 여기서 상기 트랜스진은 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 miRNA는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 rAAV는 서열식별번호: 16-19 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열 또는 그의 일부로 표시되는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 추가적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 단독, 또는 하나 이상의 다른 바이러스 (예컨대 하나 이상의 다른 트랜스진을 코딩하여 보유하는 제2의 rAAV)와의 조합으로써 rAAV를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 각각 하나 이상의 서로 다른 트랜스진을 가지는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 이상의 서로 다른 rAAV를 포함한다.
적합한 담체는 rAAV가 가이드되는 지시의 관점에서 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 적합한 담체로는 다양한 완충 용액과 배합될 수 있는 식염수가 포함된다 (예컨대 포스페이트 완충 식염수). 다른 대표적인 담체에는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 덱스트란, 아가, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일 및 물이 포함된다. 담체의 선택이 본 개시내용의 제한이 되는 것은 아니다.
임의적으로, 본 개시내용의 조성물은 rAAV 및 담체(들) 이외에 다른 통상적인 제약용 성분들, 예컨대 보존제 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 대표적인 보존제에는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화 황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 포함된다. 적합한 화학적 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다.
rAAV는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키기에, 그리고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 제약상 허용되는 투여 경로에는 선택된 기관으로의 직접 전달 (예컨대 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 기타 비경구 투여 경로가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 원할 경우, 투여 경로들이 조합될 수도 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는 데에 필요한 rAAV 비리온의 투여량, 예를 들면 체중 킬로그램 당/게놈 카피수 (GC/kg)로 나타낸 투여량 단위는 비제한적으로 하기를 포함한 몇 가지 인자들을 기준으로 가변적이게 된다: rAAV 비리온 투여의 경로, 치료 효과를 달성하는 데에 필요한 유전자 또는 RNA 발현의 수준, 치료되는 구체적인 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 생성물의 안정성. 관련 기술분야 통상의 기술자라면 상기언급된 인자들은 물론 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 인자들을 기준으로 특정 질환 또는 장애를 가지고 있는 환자들을 치료하기 위한 rAAV 비리온 투여량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
rAAV의 유효량은 원하는 조직을 표적으로 하여 동물을 표적 감염시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, rAAV의 유효량은 안정한 체세포 트랜스제닉 동물 모델을 생성시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일차적으로 대상체의 종, 연령, 체중, 건강, 그리고 표적화될 조직과 같은 인자들에 따라 달라지게 되며, 그에 따라 동물 및 조직간에 가변적일 수 있다. 예를 들면, rAAV의 유효량은 일반적으로 약 109 내지 1016개의 게놈 카피를 함유하는 용액 약 1 ml 내지 약 100 ml의 범위이다. 일부 경우에는, 약 1011 내지 1013개 사이 rAAV 게놈 카피의 투약량이 적절하다. 특정 실시양태에서는, 1012 또는 1013개의 rAAV 게놈 카피가 CNS 조직을 표적화하는 데에 효과적이다. 일부 경우에, 안정한 트랜스제닉 동물은 다수의 rAAV 투여에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 역일(calendar day) (예컨대 24-시간 기간) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 역일 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV의 투여분은 역주(calendar week) (예컨대 7 역일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 격주 (예컨대 2 역주 기간에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 역월 (calendar month) 당 1회 (예컨대 30 역일에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 6 역월 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV 투여분은 역년(calendar year) (예컨대 365일 또는 윤년의 경우 366일) 당 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 특히 고농도의 rAAV가 존재하는 경우 (예컨대 ~1013 GC/ml 또는 그 이상) 조성물 중 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 배합된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는데, 예를 들면 계면활성제의 첨가, pH 조정, 염 농도 조정 등이 포함된다 (예컨대 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178] 참조).
제약상-허용되는 부형제 및 담체 용액의 배합에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는데, 다양한 치료 요법에서의 본원에서 기술되는 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발도 그러하다.
통상적으로, 이러한 배합물은 적어도 약 0.1 % 또는 그 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 상기 백분율은 당연히 가변적일 수 있으며, 편리하게도 총 배합물 중량 또는 부피의 약 1 또는 2 % 내지 약 70 % 또는 80 % 또는 그 초과 사이일 수 있다. 물론, 각 치료상-유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 어떠한 주어진 화합물의 단위 투여분에서도 적합한 투약량이 수득되게 되는 방식으로 준비될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그와 같은 제약용 배합물을 제조함에 있어서 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자들은 물론, 다른 약학적 고려사항들을 고려하게 될 것이므로, 말 그대로 다양한 투약량 및 치료 요법들이 바람직할 수 있다.
소정의 상황에서는, 본원에서 개시되는 적합하게 배합된 제약용 조성물 중 rAAV-기반 치료용 구성체를 피하, 췌장내, 비내, 비경구, 정맥내, 근육내, 수막강내 또는 경구, 복강내 중 어느 하나로, 또는 흡입에 의해 전달하는 것이 바람직하게 된다. 일부 실시양태에서는, U.S. 특허 제5,543,158호; 5,641,515호 및 5,399,363호 (각각 그 전체가 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 바와 같은 투여 양태들이 rAAV를 전달하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 양식은 문맥 주사에 의한 것이다.
주사가능 용도에 적합한 제약용 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액, 그리고 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서, 그리고 오일 중에서 제조될 수도 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 조제물들은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 많은 경우에서, 상기 형태는 멸균되며, 용이한 주사성(syringability)이 존재하는 정도까지 유동성이다. 그것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적정한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균 및 항진균 작용제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들면 당 또는 나트륨 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직하게 된다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 중 사용에 의해 달성될 수 있다.
주사가능 수용액 투여의 경우, 예를 들면 용액은 필요에 따라 적합하게 완충된 것, 및 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장화된 액체 희석제일 수 있다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여서는, 사용될 수 있는 멸균 수성 매체가 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들면, 1 투약량이 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해된 후, 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나, 또는 제안된 주입 부위에 주사되는 것 중 어느 하나일 수 있다 (예를 들면 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 숙주의 조건에 따라 약간의 투약량 변동은 반드시 발생하게 된다. 어떠한 경우에도, 투여를 담당하는 사람이 개별 숙주를 위한 적절한 투여량을 결정하게 된다.
멸균 주사가능 용액은 필요에 따라 본원에서 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 활성 rAAV를 필요한 양으로 적절한 용매에 혼입한 후, 이어서 여과 멸균하는 것에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기에서 열거된 것들에 속하는 기본 분산 매체 및 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입하는 것에 의해 제조된다. 멸균 주사가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 그들의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 더하기 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공-건조 및 냉동-건조 기술이다.
본원에서 개시되는 rAAV 조성물은 중성 또는 염 형태로 배합될 수도 있다. 제약상-허용되는 염에는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)이 포함되는데, 예를 들면 염산 또는 인산과 같은 무기 산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기 산과 형성된다. 유리 카르복실 기를 사용하여 형성되는 염은 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 히드록시드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 배합시, 용액은 투약 배합물과 상용성인 방식으로, 그리고 치료적으로 유효한 만큼의 양으로 투여되게 된다. 배합물은 주사가능 용액, 약물-방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용될 때, "담체"에는 임의의 모든 용매, 분산 매체, 비히클, 코팅, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 제약 활성 물질용으로의 그와 같은 매체 및 작용제들의 사용에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 조성물에 혼입될 수도 있다. "제약상-허용되는"이라는 구는 숙주에게 투여되었을 때 알레르기 반응 또는 유사한 원치 않는 반응을 야기하지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다.
적합한 숙주 세포에의 본 개시내용 조성물의 도입을 위하여, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미세구체, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 비히클이 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달 트랜스진은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등 중 어느 하나에의 캡슐화된 전달용으로 제제화될 수 있다.
그와 같은 제제는 본원에서 개시되는 핵산 또는 rAAV 구성체의 제약상 허용되는 배합물의 도입에 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 일반적으로 알려져 있다. 최근에는, 향상된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가지는 리포좀이 개발되었다 (U.S. 특허 제5,741,516호). 또한, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 조제물의 다양한 방법들이 기술되어 있다 (U.S. 특허 제5,567,434호; 5,552,157호; 5,565,213호; 5,738,868호 및 5,795,587호).
리포좀은 다른 절차에 의한 형질감염에 대해서는 보통 내성인 수많은 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀에는 바이러스-기반 전달 시스템에서 통상적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 다양한 배양 세포주 및 동물에 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테리형 이펙터(allosteric effector)를 도입하는 데에 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀-매개 약물 전달의 효과성을 조사하는 몇 가지 성공적인 임상 시험들이 완료된 바 있다.
리포좀은 수성 매체 중에 분산되어 자발적으로 다층상 동심 이중층 소포 (다층상 소포 (MLV)로도 지칭됨)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 직경을 가진다. MLV의 초음파처리는 200 내지 500 Å 범위의 직경을 가지며 코어에 수용액을 함유하는 소형 단층상 소포 (SUV)의 형성을 발생시킨다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제제가 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 방지하기 위하여, 그와 같은 초미세 입자 (0.1 ㎛ 가량의 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용 고려된다.
상기한 전달 방법들에 더하여, 하기하는 기술들도 숙주에의 rAAV 조성물의 대안적인 전달 방법으로 고려된다. 초음파영동(sonophoresis) (즉 초음파)이 사용된 바 있는데, 순환 시스템으로의, 그리고 그를 통한 약물 투과의 속도 및 효능을 강화하기 위한 장치로서 U.S. 특허 제5,656,016호에 기술되어 있다. 고려되는 다른 약물 전달 대안으로는 골내 주사 (U.S. 특허 제5,779,708호), 마이크로칩 장치 (U.S. 특허 제5,797,898호), 안구 제제 (문헌 [Bourlais et al., 1998]), 경피 매트릭스 (U.S. 특허 제5,770,219호 및 5,783,208호) 및 피드백(feedback)-조절 전달 (U.S. 특허 제5,697,899호)이 있다.
키트
및 관련 조성물
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 작용제는 치료, 진단 또는 연구 적용분야에서의 그의 사용을 용이하게 하기 위한 제약용 또는 진단용 또는 연구용 키트로 조립될 수 있다. 키트는 본 개시내용의 구성요소들 및 사용 지침을 수용하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 구체적으로, 그와 같은 키트는 해당 작용제의 예정된 적용분야 및 적정한 사용에 대해 기술하는 지침과 함께 본원에서 기술되는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트 내의 작용제는 특정 적용분야 및 작용제의 투여 방법에 적합한 제약용 제제 및 투약분으로 존재할 수 있다. 연구 목적의 키트는 다양한 실험을 전개하는 데에 적절한 농도 또는 양으로 구성요소들을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 rAAV를 생성시키기 위한 키트에 관한 것으로써, 상기 키트는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩되는 miRNA를 포함하는 단리된 핵산을 수용하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 AAV 캡시드 단백질, 예를 들면 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 수용하는 용기를 포함한다.
키트는 연구자들에 의한 본원에서 기술되는 방법의 사용을 용이하게 하도록 설계될 수 있으며, 많은 형태를 취할 수 있다. 키트 중 조성물 각각은 해당될 경우 액체 형태로 (예컨대 용액 중으로), 또는 고체 형태 (예컨대 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에는, 조성물 중 일부가 예를 들면 키트와 함께 제공될 수 있거나 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예컨대 물 또는 세포 배양 배지)의 첨가에 의해 (예컨대 활성인 형태로) 구성가능하거나 달리 가공가능할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "지침"은 지침 및/또는 홍보물의 구성요소로 정의될 수 있는데, 통상적으로 본 개시내용의 패키지화에 대한 것이거나 그와 연관된 기재된 지침을 포함한다. 지침에는 지침이 키트와 연관되어 있는 것임을 사용자가 분명하게 인식하게 되도록 하는 소정의 방식으로 제공되는 임의의 구두 또는 전자 지침, 예를 들면 시청각 (예컨대 비디오테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 웹-기반 통신 등도 포함될 수 있다. 기재된 지침은 제약용 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 부처에 의해 규정된 형태로 존재할 수 있는데, 상기 지침은 동물 투여용 제조, 사용 또는 판매 부처에 의한 승인을 반영할 수도 있다.
키트는 하나 이상의 용기 내에 본원에서 기술되는 구성요소들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 예로서, 일 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 키트 구성요소들을 혼합하는 것, 및/또는 샘플을 단리하고 혼합하는 것, 및 대상체에게 적용하는 것에 대한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 본원에서 기술되는 작용제를 수용하는 용기를 포함할 수 있다. 상기 작용제는 액체, 젤 또는 고체 (분말)의 형태로 존재할 수 있다. 작용제는 멸균 제조되어, 주사기 내에 포장된 후, 냉동 출하될 수 있다. 대안적으로, 그것은 바이알 또는 다른 저장 용기에 수용될 수 있다. 제2의 용기가 멸균 제조된 다른 작용제를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 키트는 사전혼합되어 주사기, 바이알, 튜브 또는 다른 용기 내로 출하되는 활성 작용제를 포함할 수 있다.
하기 실시예에 의해, 본 발명의 대표적인 실시양태들이 더욱 상세하게 기술될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명을 대표하는 것으로써, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 대표적인 실시양태로 제한되는 것은 아님을 알고 있을 것이다.
[
실시예
]
실시예
1: 재료 및 방법
세포 배양 및 스크리닝 검정
DMEM, 10 % 열 불활성화된 FBS를 사용한 고도 글루코스 및 1 % 페니실린 스트렙토마이신 (써모피셔(ThermoFisher) 사) 중에서 헬라 세포를 유지하였다. 형질감염 24-시간 전에, 세포를 6-웰 플레이트상에 0.8-1.0x106 세포/웰로 시딩하였다. 형질감염 일자에, 성장 배지를 1.6 ml의 옵티(Opti)-MEM (써모피셔 사)으로 대체하였다. 2 μl/웰의 다르마펙트 듀오(DharmaFECT Duo) (다르마콘(Dharmacon) 사)를 사용하여 플라스미드를 형질감염시켰다. 각 웰은 0.6 ㎍의 플라스미드 DNA를 수용하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 수확하고, 미르바나(MirVana) RNA 단리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 RNA/올리고-dT 및 수퍼스크립트(Superscript) III (인비트로겐 사)를 사용하는 반응을 사용하여 cDNA를 생성시켰다. 타크만(TaqMan) 검정 (써모피셔 사)을 사용하여 헌팅틴 mRNA를 측정하였다. 하우키핑 유전자(housekeeping gene)로서 인간 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)를 사용하는 ΔΔC(T)법을 사용하여 상대적인 헌팅틴 mRNA 수준을 계산하였다.
마우스 수용, 주사 및 유지
YAC128 및 야생형 FVB 마우스를 입수하였다. 야생형 수컷 마우스를 YAC128 암컷과 교배시키는 것에 의해 마우스를 FVB 배경에서 사육하였다. 생성되는 이형접합 YAC128 및 야생형 마우스를 12:12 광 일정으로 유지하면서, 임의의 먹이 및 물에 대한 접근권을 주었다. 꼬리 단편 또는 귀 천공물로부터 추출된 DNA의 PCR에 의해 유전형을 검증하였다. UMPC3 또는 UMPC4 미세주사기 (월드 프레시젼 인스트루먼츠(World Precision Instruments) 사, 플로리다 사라소타 소재)의 도움으로 소형 동물 스테레오택스(stereotax) SAS-4100 (ASI 인스트루먼츠(Instruments) 사, 미시간 와렌 소재)에 의해 마우스의 선조체에 직접 선택된 AAV를 주사하였다. 284 mg/kg의 트리브로모에탄올을 사용하여 마우스를 마취한 후, 스테레오택스에 위치시켰다. 정수리점을 0점으로 사용하여 수술을 수행하고, 전방 1.0 mm, 측면 2.0 mm를 측정한 후, 33 게이지 바늘을 선조체로 3.0 mm 내렸다. 125 nl/분의 속도로 3.0 μl를 전달하도록 펌프를 설정하였다. 주사 후, 가온 패드상에서 마우스를 회복시킨 다음, 다시 수용 영역의 해당 케이지에 위치시켰다.
조직 추출
적절한 시점에, 마우스를 희생시키고, RNA 분석 또는 면역조직화학용으로 조직을 추출하였다. RNA 추출의 경우, 마우스를 마취한 후, 경부 탈구에 의해 사망시켰다. 뇌를 제거하고, 선조체를 절제 분리하였다. 가용할 경우, GFP 발현을 사용하여 절제를 가이드함으로써, GFP 양성 조직만을 분석하였다. 조직을 즉시 RNA레이터(RNALater) (암비온(Ambion) 사)에 위치시켰다. 이어서, 그것을 -80 ℃에서 냉동 저장하였다. 실험 종료 시에는, 면역조직화학용으로 예정된 마우스를 깊게 마취하고, 식염수 후 이어서 4 % 파라포름알데히드를 심장내로 관류하였다. 샘플을 저온 2 % 파라포름알데히드에 밤새 후고정한 다음, 4 ℃로 포스페이트 완충 식염수 중에 저장하였다. 레이카(Leica) VT1000s 비브라톰(vibratome)에서 40 마이크로미터 절편을 슬라이싱함으로써, 관상 절편을 제조하였다.
마우스 행동
평균대 보행: (평균대 크기) 평균대를 건너도록 마우스를 훈련시켰다. 훈련 후, 그것이 평균대의 하나의 단부로부터 다른 단부로 건널 때, 마우스를 기록하였다. 마우스 당 3회의 시도를 기록하였다. 기록을 바탕으로, 마우스가 평균대의 하나의 단부상 표시로부터 다른 단부로 건너는 데에 걸리는 시간량을 측정하였다.
거주 케이지 활성: 마우스를 26시간 동안 단독으로 자동화된 거주 케이지 페노타이핑 스캐닝 시스템(phenotyping scanning system) (클레버(Clever) Sys, Inc. 사, 버지니아 레스턴 소재)에 위치시켰다. 시간 당 평균 활성 시간을 계산하기 위하여, 마우스가 새로운 환경에 적응하는 첫 번째 데이터 시간을 삭제한 다음; 총 보행 기록 시간 빼기 1시간으로 나눈 보행에 소요된 총 시간을 계산하였다.
면역조직화학 및 정량
3 % 수소 퍼옥시드를 사용하여 3분 동안 고정된 조직 슬라이스를 블로킹한 다음, 0.5 % 트리톤(triton) x를 사용하여 20분 동안 인큐베이션하였다. 토끼 또는 마우스 유래 항체용 벡터 라보래토리즈 엘리트(Vector Laboratories Elite) ABC 키트 시약을 사용하여 DARPP32 (아브캄(Abcam) 사 ab40801; 1:10,000 희석), Iba1 (와코(Wako) 사 019-19741; 1:1,000 희석), GFP (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사 G10362; 1:1000 희석) 및 NeuN (EMD 밀리포어(Millipore) 사 MAB377; 1:1000 희석)에 대하여 면역조직화학을 수행하였다. 금속 강화 DAB 기재 키트 (피어스(Pierce) 사)를 사용하여 디아미노벤지딘으로 2분 동안 절편을 염색하였다.
소형 RNA 라이브러리
클로닝
및 분석
미르바나 RNA 단리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 15 % 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 5 ㎍의 총 RNA를 사용하여 18-30개 뉴클레오티드 RNA의 크기 선택을 수행하였다. 크기 선택 후, 소형 RNA는 에탄올 침전시키고, 아데닐레이트화-전 3'-어댑터 (5'-rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3'; 서열식별번호: 11)에 결찰시켰다. 결찰 생성물을 RT 프라이머 (5'-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열식별번호: 12)에 어닐링하고, 5'-어댑터 (RNA: 5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3'; 서열식별번호: 13)에 결찰시켰다. AMV 역전사 혼합물 (NEB 사)을 사용하여 역전사를 수행하고, 하나의 범용 프라이머 (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'; 서열식별번호: 14) 및 하나의 바코드화된 프라이머 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열식별번호: 15)와 함께 아큐프라임(AccuPrime) Pfx DNA 폴리머라제 (인비트로겐 사)를 사용하여, PCR 증폭하였다. 라이브러리를 서열분석하고, mm9 게놈 및 AAV 게놈에 대하여 맵핑하였다. miRNA 헤어핀상에서의 5'-말단 맵핑의 위치를 기반으로 miRNA 종을 분류하였는데, 이에 따라 각 종은 공유된 시드 서열을 가지는 모든 소형 RNA로 구성되었다. 종 할당에서 3'-말단은 고려되지 않았다. 엣지(edge)R 패키지를 사용하여 차별적인 내생 miRNA의 발현을 분석하였다.
mRNA
라이브러리
클로닝
및 분석
상기와 같이 RNA를 추출하였다. 표준 방법에 의해 라이브러리를 구축하였다. 탑햇(topHat)2를 사용하여 판독치를 맵핑하고, 데세크(deseq)2 패키지를 사용하여 차등 발현을 계산하였다.
양 실험
헌팅톤병의 트랜스제닉 양 모델 (예컨대 병원성 인간 헌팅틴 단백질을 발현하는 트랜스제닉 양)에 scAAV9-CBA-mir-HTT (mir-155 백본에 miRNA 6433을 포함함), scAAV-U6-mir-HTT (mir-155 백본에 miRNA 6433을 포함함) 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나를 주사하였다. 주사 1개월 후 또는 6개월 후 중 어느 하나에 양을 희생시켰다. 조직 및 핵산 샘플을 제조하고, 정량 PCR 및 면역조직화학에 의해 분석하였다.
실시예
2: 마우스
생체내
실험
헌팅틴
표적화
인공
miRNA의
설계 및 선택
인간 헌팅틴 mRNA를 표적으로 하는 9종의 서열 (표 1, 도 1)을 시험하였다. 9개의 표적으로 하는 서열 위치의 개략적인 도시를 도 4a에 나타내었다. 인공 miRNA의 2개 카피를 동시에 내생 miRNA-155 또는 miR-30을 기반으로 하는 백본에 클로닝하고, 전체 인공 miRNA를 EGFP의 3'-UTR에 삽입하였다 (도 5a, 상단). mir-155-기반 및 mir-30-기반 항-HTT amiRNA의 예상 헤어핀 구조를 각각 도 25a-25b에 나타내었다. 생성되는 플라스미드를 헬라 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 수확하고, 정량 RT-PCR (qRT-PCR)에 의해 내생 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 9종의 인공 miRNA 중 3종이 50 % 초과만큼 헌팅틴을 감소시켰다 (도 1-2 및 4b-4c).
최초 스크린으로부터 3종의 서열이 생체내 실험용으로 선택되었다. 공지의 siRNA (E1.4)를 기반으로 하는 인공 miRNA도 시험하였다. 후보 서열들을 자가-상보성 AAV9 벡터에 패키지화한 후, 대략 128개의 폴리글루타민 코딩 반복체의 연장체를 가지는 인간 헌팅틴을 발현하는 트랜스제닉 마우스 (Yac128 마우스)의 선조체에 직접 그것을 주사하였다. 1개월 후, 3종의 상이한 투여량에서 AAV9의 분포 및 GFP 리포터의 발현을 평가하였다. 최고 투여량에서, 선조체 전체에 걸쳐 GFP 염색이 존재하였으며 (도 11a), AAV9-CβA-항-HTT-6433 (p=0.006) 또는 AAV9-CβA-항-HTT-5155 (p=0.013, 도 4c; mir-155 백본을 사용하였음) 중 어느 하나로 처리된 마우스에서 인간 헌팅틴 mRNA가 상당히 감소되었다. 벡터의 투여량을 감소시키는 것은 감소된 GFP 발현 (도 11a)을 발생시켰으며, 1:10 희석에서는 인간 헌팅틴 mRNA의 상당한 감소가 달성되지 않았다 (도 11b). 도 11c는 3종의 상이한 투여량으로 헌팅틴 표적화 miRNA 및 EGFP 양자를 코딩하는 벡터가 주사된 마우스의 대표적인 사진을 제공한다.
U6 프로모터로부터 인공
miRNA를
발현시키는 것은
헌팅틴의
침묵화를
향상시키지 않는다
가장 강력한 miRNA (HTT-6433)의 단일 카피를 U6 프로모터의 조절하에 AAV9 벡터로 클로닝하였다 (도 5a, 하단). 마우스에 편측으로 원래의 2개 카피 AAV9-CBA-항-HTT-6433 (서열식별번호: XX 포함), AAV9-CBA-항-HTT-5155, AAV9-U6-항-HTT-6433 (서열식별번호: XX 포함) 또는 AAV9-U6-항-HTT-5155 중 어느 하나를 주사하였다. 1개월 후, 선조체를 수확하고, GFP 발현을 확인한 후, qRT-PCR에 의해 헌팅틴 mRNA의 수준을 측정하였다. 인공 miRNA의 서열에 관계없이, AAV9-U6-항-HTT 및 AAV9-CBA-항-HTT로 처리된 마우스 사이에 상당한 녹다운 차이는 관찰되지 않았다. AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433로 처리된 마우스 둘 다에서, 주사된 측면에서의 헌팅틴 mRNA의 양이 비-주사 측면에서의 것의 대략 50 %였다 (도 5b). 각 동물의 대조로서 반대쪽 (비-주사) 측면을 사용하는 것이 동물 대 동물 가변성을 감소시킨다는 것에 유의한다. 편측으로 AAV9-GFP가 주사된 마우스에서는, 반대쪽 측면에서 종종 적은 수의 GFP 양성 뉴런이 관찰됨으로써, 일부 바이러스가 비-주사 측면으로 확산된다는 것을 표시하였다. 따라서, 반대쪽 측면을 대조로 사용하는 것은 녹다운을 저평가할 수 있다. 대조로서 반대쪽 측면을 사용하는 것의 잠재적인 교란 효과를 제거하기 위하여, 대조로서 PBS만이 주사된 동물 군을 사용하여 실험을 반복하였다. 데이터는 AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-mir-HTT-6433 둘 다가 대략 50 %까지 헌팅틴 mRNA를 감소시킨다는 것을 표시하였다 (도 5c).
U6 프로모터로부터의
mir
-
HTT
-6433의 장기
선조체
발현은 마우스에서
독성이다
AAV9-U6-항-HTT-6433 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433을 Yac128 마우스의 선조체에 직접 편측으로 주사하였다. 주사 6개월 후, AAV9-U6-항-HTT-6433이 주사된 마우스가 보금자리를 틀지 않고 일부가 과다활성 표현형을 나타낸다는 것이 관찰되었다. 이러한 이상을 기록하기 위하여, 각 케이지의 네슬렛(nestlet)을 교체하였다. 24-시간 후, AAV9-U6-항-HTT-6433의 새로운 네슬렛은 사용되지 않은 반면, PBS 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433 주사된 마우스는 예상대로 보금자리를 틀었다 (도 6a). 거주-케이지 모니터링 시스템을 사용하여, 마우스를 24시간 동안 기록하였다. AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스는 PBS 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에 비해 상당히 더 많은 시간을 그의 거주 케이지 주변으로 움직이면서 소요하였다 (도 6b). 마우스가 평균대를 건너는 데에 걸리는 평균 시간도 측정하였다. 이와 같은 시험에서, 마우스는 평균대 건너기를 3회 완료할 것을 요구받았다. 평균적으로, AAV9-CBA-항-HTT-6433 처리된 마우스는 PBS 주사만을 투여받은 마우스에 비해 더 빠르게 건너는 경향이 있었다 (도 3 및 12a). AAV9-U6-항-HTT-6433 군의 나머지 4마리의 마우스 중, 2마리는 평균대에서 뛰거나 떨어지는 것 중 어느 하나로써, 성공적으로 건널 수 없었다 (도 12a). 더 고령인 Yac128 마우스 (7개월령)에서 수행된 두 번째 실험에서는, 평균대를 건너는 시간의 연령 관련 증가가 관찰되었다. 이와 같은 증가는 나이브 마우스 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433으로 처리된 마우스 양자에서 존재하였으며, AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에서 가속되었다 (도 12b).
신경병리학적 발견들이 상기한 행동 결과와 상관된다. 주사된 측면에서, AAV9-U6-항-HTT-6433 마우스는 뇌실의 확장, DARPP-32 양성 뉴런의 상실 및 선조체 수축을 나타내었다 (도 7a-7b). 나머지 선조체에서, 그들은 증가된 Iba1 염색 (도 8a, 하단), 총 및 활성화 소교세포의 증가, 및 휴지 소교세포 수의 감소 (도 8b-8d)를 나타내었다. 야생형 C57Bl/6 마우스 및 FVB 마우스에 동일한 벡터를 주사하고, 독성이 그와 같은 맥락에서의 돌연변이 헌팅톤의 존재에 대하여 의존성인지를 확인하기 위하여, U6 추진 miR의 결과를 평가하였다. FVB 마우스에서는, 평균대에서의 빠른 퇴행 및 심각하게 확장된 뇌실을 가지는 Yac128 마우스에서의 것과 효과가 유사하였다. 그러나, C57BL6 마우스에서는, 효과가 존재하기는 하였으나, 덜 현저하였다. U6 군에서 평균대를 건너는 시간에 있어서의 최초의 증가가 존재하기는 하였지만, 연구 종료 시에는 군들 사이에 상당한 차이가 존재하지 않았다 (도 13a). 선조체 수축 역시 C57BL6 마우스에서는 덜 심각하였다 (도 13b).
U6 프로모터로부터의
헌팅틴을
표적으로 하는 인공
miRNA의
발현은
헌팅틴
표적화
소형 RNA의 과발현을 발생시킨다
마우스 군에 편측으로 U6 및 CβA 프로모터로부터 인공 miRNA 6433을 발현하는 scAAV9 벡터를 주사하였다. 주사 2주-후에 생성되는 소형 RNA를 클로닝하고, 서열분석하였다. 양 군에서, AAV 게놈에 맵핑되는 서열 중 96 %가 예상 소형 RNA 생성물에 맵핑되었으며, 적은 백분율만이 부정확한 다이서 또는 드로샤 절단을 나타내었다. U6 프로모터 추진 인공 miRNA가 주사된 군에서는, 서열분석 결과 헌팅틴 표적화 서열이 우세해서, 모든 맵핑가능한 서열의 절반 (50 %)에 달했던 반면, CBA 벡터가 주사된 마우스에서는 서열 중 5 %만이 벡터가 코딩하고 있는 소형 RNA와 일치하였다 (도 9a). 이에 따라, 잠재적으로, 센스 가닥 및 미끄러짐(slippage) 생성물을 포함한 대안적인 시드 서열을 가지는 소형 RNA가 기능성인 내생 miRNA의 것과 유사한 수준으로 존재할 수 있다 (도 9a). qPCR에 의해 헌팅틴 표적화 소형 RNA의 상대적인 양을 측정함으로써, 헌팅틴 표적화 서열의 과발현을 확인하였다. U6 프로모터 추진 구성체가 주사된 마우스에서 소형 RNA의 발현이 150 내지 250배 더 높은 것으로 관찰되었다 (도 9b).
내생 miRNA 30 서열은 보통 인공 miRNA용 스캐폴드(scaffold)로 사용된다. 이와 같은 스캐폴드로부터 유래하는 이성질체(isomir) 프로파일이 더 바람직한지를 확인하기 위하여, miR-30 백본에 항-HTT-6433 서열을 삽입한 후, 10주령 Yac128 마우스에 주사하였다 (도 9c). mir-30 스캐폴드는 CβA 프로모터에 의해 산출되는 것과 유사한 성숙한 인공 miRNA의 수준을 산출하였으며 (도 9a), 50 % 가까이까지 인간 헌팅틴을 감소시켰다. mir-155 스캐폴드와 달리, mir-30 스캐폴드는 안티센스 (가이드) 가닥과 유사한 수준으로 성숙한 센스 (패신저) 가닥을 생성시킨다. CβA 프로모터의 mir-155 백본과의 조합은 바탕을 초과하도록 예정된 안티센스 가닥만을 생성시킨다 (도 9a).
샘플 중 판독분의 절반이 넘게 AAV-코딩된 인공 miRNA에 맵핑될 수 있기는 하였지만, 헌팅틴을 표적으로 하는 인공 miRNA의 과발현은 내생 miRNA의 분포에는 최소한의 효과를 가졌다 (도 14a-14b). 사실상, 주사된 군을 비-주사 (반대쪽) 측면과 비교하였을 때 가장 큰 차이가 관찰됨으로써, 주사 자체가 miRNA 프로파일의 국소적인 변화를 생성시킨다는 것을 암시하였다. 이는 시간이 지나면서 해결될 수 있는 손상에 대한 국소적 염증 반응을 반영할 수 있다.
U6 프로모터로부터의
헌팅틴을
표적으로 하는 인공
miRNA의
발현은 다중
mRNA의
발현을
와해한다
헌팅틴 표적화 miRNA 과발현의 결과를 조사하기 위하여, AAV9-U6-항-HTT-6433 또는 AAV9-CBA-항-HTT-6433 중 어느 하나로 처리된 마우스 선조체의 RNAseq 분석을 수행하였다. 주사 2주-후, 주사 및 비-주사 측면에서의 선조체 mRNA 프로파일을 비교하였다. 데이터는 CBA-mirHTT-6433로 처리된 마우스에 상당한 차이가 거의 존재하지 않는다는 것을 표시하였다 (도 14a). AAV9-U6-항-HTT-6433으로 처리된 마우스에서는, 처리에 반응하여 증가된 mRNA 및 감소된 것들 모두가 관찰되었다 (도 14b). 2주에 AAV9-U6-항-HTT-6433 및 AAV9-CBA-항-HTT-6433의 프로파일을 비교하였을 때, 8종의 mRNA만이 이러한 2개 군 사이에서 상당히 차별적으로 발현되는 것으로 관찰되었다. 인공 miRNA의 예정된 표적 부위의 존재 또는 부재에 따라 RNA를 분류하고, 표적 부위가 존재하거나 부재하는 mRNA에서의 변화의 누적 분포를 플로팅하였다. AAV-U6-6433이 주사된 마우스에서는, 가장 풍부한 AAV-유래 소형 RNA 종과 일치하는 완전한 8량체 표적 부위를 그의 3'-UTR에 포함하는 유전자의 약간의 하향조절로의 이동이 관찰되었다 (도 10b). AAV-CBA-6433 (도 10a)은 물론, 다른 AAV-유래 소형 RNA 종들 중 어느 것 (도 15a-15c)이 주사된 마우스에서도 이와 같은 이동이 분명하지 않았다.
실시예
3: 양
생체내
실험
본 실시예에서는, 인간 헌팅톤병의 양 모델을 사용하였다. 간단하게 말하자면, 인간 헌팅틴 (인간 htt) 단백질을 발현하는 트랜스제닉 양을 생성시켰다. scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나를 선조체내로 양에 주사하였다. 각 구성체는 각각 CBA 프로모터 또는 U6 프로모터와 β-글로불린 폴리아데닐화 서열 사이에 존재하는 인트론 내에 위치하는 mir-155 백본에 삽입된 항-헌팅턴 mir-6433 서열 (서열식별번호: 7)의 단일 카피를 포함하였다. 본 실험에서 투여된 rAAV를 제조하는 데에 사용된 구성체를 서열식별번호: 18 (scAAV9 CBA-mir-HTT) 및 19 (scAAV9 U6-mir-HTT)에 제시하였다.
주사 1개월 또는 6개월-후 중 어느 하나에 양을 희생시켰다. 조직 및 핵산 샘플을 제조하고, 정량 PCR 및 면역조직화학에 의해 분석하였다.
데이터는 1개월 시점에 U6 프로모터하에 발현되는 mir-HTT의 주사가 비-주사 및 빈-scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 양의 중간 미상핵 및 중간 조가비핵 모두에서 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다. 도 16은 scAAV9 U6-mir-HTT 주사 1개월-후의 양의 중간 미상핵에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 도 17은 scAAV9 U6-mir-HTT 주사 1개월-후의 양 모델의 중간 조가비핵에서의 인간 헌팅틴 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 이전 실시예에서 기술된 마우스 모델과 달리, U6 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 헌팅톤병의 양 모델에서는 독성이 아니었다는 것에 유의한다.
데이터는 6개월 시점에 CBA 프로모터하에 발현되는 mir-HTT의 주사가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 양의 중간 미상핵 및 중간 조가비핵 모두에서 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다.
도 18 및 19는 양 중간 미상핵의 내측 (도 18) 및 외측 (도 19) 측면에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 데이터는 CBA 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 뇌의 비-주사 측면 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 뇌의 주사된 측면에서 인간 htt 발현의 감소를 야기한다는 것을 표시하였다. 주사 6개월-후, 중간 미상핵에서의 htt 침묵화에 대한 CBA 및 U6 프로모터로부터의 mir-HTT 발현의 효과도 비교하였다. 데이터는 U6 프로모터 또는 CBA 프로모터 중 어느 하나로부터 발현되는 mir-HTT가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 동물과 비교하였을 때 중간 미상핵에서의 인간 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다 (도 20).
도 21 및 22는 주사 6개월-후의 양 중간 조가비핵의 외측 (도 21) 및 내측 (도 22) 측면에서의 인간 htt 발현의 감소와 관련된 데이터를 나타낸다. 데이터는 CBA 프로모터로부터 발현되는 mir-HTT가 뇌의 비-주사 측면 및 빈 scAAV9-주사 대조 마우스와 비교하였을 때 뇌의 주사된 측면에서 인간 htt 발현의 감소를 야기한다는 것을 표시하였다. 주사 6개월-후, 중간 미상핵에서의 htt 침묵화에 대한 CBA 및 U6 프로모터로부터의 mir-HTT 발현의 효과도 비교하였다. 데이터는 U6 프로모터 또는 CBA 프로모터 중 어느 하나로부터 발현되는 mir-HTT가 비-주사 및 빈 scAAV9-주사 대조 동물과 비교하였을 때 중간 조가비핵에서의 인간 htt 발현의 감소를 발생시킨다는 것을 표시하였다 (도 23).
도 24는 scAAV9 CBA-mir-HTT ("CBA 프로모터"), scAAV9 U6-mir-HTT ("U6 프로모터") 또는 빈 scAAV9 대조 벡터 중 어느 하나의 선조체내 주사 6개월 후의 헌팅톤병 양 모델의 전방 선조체에서의 인간 헌팅틴 (인간 htt) RNA의 상대적인 발현과 관련된 데이터를 나타낸다.
실시예
4:
헌팅톤병의
트랜스제닉 양 모델에서 인공
miRNA는
선조체
전체에 걸쳐 인간 돌연변이
헌팅틴을
감소시킨다
동물 및 동물 절차
본 실시예에서는 메리노(merino) 양을 사용하였다. 마취제의 투여 전에, 대략 8시간 동안 밤새 동물들을 굶겼다. 동물들에게 심장 박동수, 호흡수, 온도 및 체중을 포함한 수술-전 신체검사를 제공하였다. 혈청 (5 ml) 및 CSF의 기준선 샘플을 수집하였다.
2개의 서로 다른 양의 군을 사용하여 2개 부분으로 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구의 경우, 대략 8개월령인 41 마리의 트랜스제닉 동물 (21 마리의 거세 숫양, 20 마리의 암양)에게 총 3x1012개의 게놈 카피를 위한 1x1013 gc/ml의 역가로 300 μl의 자가-상보성 AAV9 (scAAV9) 벡터를 편측으로 주사하였다. 두 번째 연구의 경우, 14개월령의 14 마리의 동물에게는 이와 같은 벡터를, 그리고 14 마리에게는 대조 벡터를 주사하였다. 주사 확산의 수술-후 영상화를 가능하게 하기 위하여, 벡터 제제에 가돌리늄을 첨가하였다. 동물들을 수술실로 이동시키고, 수술 준비를 하였다. 그들을 사지를 접거나 사지를 결박하여 발포 쿠션상에서 스핑크스 자세로 휴지시켰다. 정위 프레임 (코프(Kopf) 사, 대형 동물)을 사용하여 동물의 두부를 제자리에 고정하였다. 19 게이지 요추 천자 캐뉼러를 사용한 요추 천자를 통하여 뇌척수액을 수집하였다. 속섬유막을 표적으로 하여 선조체에 직접 rAAV를 전달하였다. 동물의 두부를 면도하고, 베타딘으로 준비한 후, 투명한 플라스틱으로 감쌌다. #15 스캘펄(scalpel)을 사용하여 곡선 절개를 수행함으로써, 정수리점을 노출시켰다. 일단 정수리점을 확인하고 나서, 전기 드릴을 사용하여 정수리점의 앞쪽(rostral) 10 mm 및 중심선의 외측 11 mm에 3-4 mm의 천두공(burr hole)을 위치시켰다. 통상적인 강화 전달 (CED) 캐뉼러 (MRI 인터벤션스(MRI Interventions) 사, 캘리포니아 어빈 소재)를 조작장치에 고정하고, 주사될 작용제로 프라이밍하여 라인으로부터 공기를 제거하였다. #11 스캘펄을 사용한 1.5 mm 절개에 의해 경질막을 개방하고, 경질막 표면으로부터 표적 깊이까지 CED 캐뉼러를 25 mm 전진시켰다. 외부 캐뉼러 (1.65 mm)는 경질막 절개부를 밀봉하여 주입 동안의 CSF 누출을 방지한다. 팁 주변의 조직이 안정화되도록 하기 위하여, 주입은 캐뉼러 삽입 5분 후에 개시하였다. 주입 속도는 300 μl의 총 부피가 주사될 때까지 3.33 μl/분으로 설정하였다. 주입이 완료되고 10분 후, 캐뉼러를 천천히 회수하고, 골 왁스 플러그(bone wax plug)를 사용하여 두개골을 복구함으로써 CSF 누출을 방지하였다. 식염수를 사용하여 상처를 세척한 후, 3.0 비크릴 봉합사를 사용하여 폐쇄하였다. 표준 마취 풀림 및 회복 절차에 따랐다. 수술-후 MRI를 수행하여 가돌리늄의 확산을 확인하였다. 첫 번째 연구에서 한 마리의 동물이 수술 후 배제되었는데, 영상화시 가돌리늄이 가시적이지 않았기 때문이었으며, 두 번째 연구에서 두 번째 동물이 배제되며, 가돌리늄이 주로 뇌실에 존재하는 것으로 나타났기 때문이다. 수술 후, 동물들을 3일 동안 관찰하에 유지하였으며, 5일 동안 실내에서 수용하였다. 다음에, 그들을 실외로 옮기고, 나머지 연구 동안 실외 방목지에 수용하였다. 연구 전체에 걸쳐 고충의 징후 및 행동의 변화에 대하여 동물들을 시각적으로 모니터링하였다. 두 마리의 동물이 수술 합병증에 걸림으로써, 부분적인 사지 마비를 초래하였다. 이는 마취하에서의 동물의 배치에 기인하는 것으로 여겨졌다. 한 마리는 조기에 마취되었으며, 한 마리는 6개월 군으로부터 1개월 군으로 이동시켰다. 주사-후 기간 전체에 걸쳐 주기적으로 동물들을 칭량하고, 뇌척수액, 혈액 및 혈청의 샘플을 채취하여, 추가 분석용으로 저장하였다.
세포 계수 및 감별을 위하여, 목정맥 정맥천자를 통해 칼륨 EDTA 혈액 수집 튜브 (라벤더 탑(Lavender top); LT)에 혈액을 수집하고, 감별 (CBE 감별)에 의한 완전 혈액 조사를 수행하였다. 임상 화학용으로, 목정맥 정맥천자를 통해 혈청 수집 튜브 (레드 탑(red top); RT)에 혈액을 수집하였다. 샘플을 다중 생화학 분석(MBA)용으로 제출하였다.
주사 1개월 및 6개월-후, 동물들을 수확한 후, 조직학 또는 생화학 분석 중 어느 하나에 동물들을 사용하였다. 동물들을 수술 테이블로 수송하고, 대략 6 mL의 CSF를 수집하는 동안 배쪽 횡와(ventral recumbency)로 위치시켰다. 동물들을 등쪽 횡와로 재위치시켰다. 목동맥을 노출시키고, 캐뉼러 팁으로부터 4 cm의 깊이로 캐뉼러삽입하였다. 목정맥을 노출시키고, 200-500 U 헤파린/kg을 목정맥에 주사하였다. 헤파린 투여 5분 후, 1 ml/체중2kg의 레타바브(Lethabarb) (325 mg 펜타바르비톤 나트륨/ml) 정맥내 주사에 의해 양을 안락사시켰다. 저온 9 % NaCl을 사용하여 주입 펌프를 프라이밍하고, 목동맥 캐뉼러에 연결하였다. 500 mmHg의 압력으로 대략 8 L의 저온 9 % NaCl을 사용하여 동물들을 관류하였다. 조직학용으로는, 500 mmHg 압력의 8 L 4 % 파라포름알데히드로 주입을 전환하였다. 뇌 및 간을 추출하였다. 조직을 4 ℃에서 24시간 동안 4 % 파라포름알데히드에 후-고정하고, 4 ℃에서 최소 14일 동안 1X 포스페이트 완충된 식염수 중 30 % 수크로스로 옮겼다.
RNA, 단백질 및 DNA 검정용으로는, 상기한 바와 같은 저온 9 % NaCl을 사용하여 양을 관류하였다. 하기의 순서로 말초 조직의 수집을 수행하였다: 간, 부신, 난소 (해당될 경우), 근육 및 심장. 서로 다른 기기의 사용, 그리고 10 % 표백제 및 70 % 에탄올을 사용하여 검시 표면을 세척하는 것에 의해 교차 오염을 방지하였다. 신체로부터 기관을 제거하고, 3 mm 생검 펀치를 사용하여 샘플을 수집하였다. 각 기관으로부터 총 10개의 샘플을 수집하였는데; 2개의 샘플은 액체질소 중에서 급속-냉동하였으며, 8개의 샘플은 4 ℃에서 24시간 동안 RNA 레이터(later) 중에 저장하였다 (간, 근육 및 심장 샘플용으로 300 μl의 RNA 레이터, 부신 및 난소 샘플용으로 500 μl의 RNA 레이터).
원형 톱 및 골 겸자를 사용하여 두개골로부터 뇌를 제거하였다. 추출 후, 뇌를 칭량하고, 맞춤제작 플렉시글라스 뇌 매트릭스에 배측으로 위치시켰다. 4 6 mm 블록에 선조체를 완전히 포함하도록 뇌에 9개의 절단부(cut)를 형성시켰다. 제1 절단부는 후각 망울 부착부의 전방에 형성시켰으며 (매트릭스의 시작으로부터 대략 18 mm), 이어서 6 mm 간격으로 4개의 절단부를 형성시켰다. 선조체를 후방으로부터 전방으로 4개의 6 mm 블록으로 분할하였다: 2p (후방), 2m1 (내측 1), 2m2 (내측 2) 및 2a (전방). 하기의 순서로 선조체 절제를 수행하였다: 2p, 2m1, 2a. 우측 (비-주사) 반구의 선조체를 모든 블록에서 먼저 절제하였는데, 반구들 사이에서는 스캘펄 날을 교체하였다. 절제는 드라이 아이스상의 페트리 접시에서 수행하였는데, 가능한 한 많은 백색질을 선조체 조직으로부터 제거하기 위하여 주의를 기울였다. 일단 절제 분리되고 나서는, 선조체 단편 (미상핵 및 조가비핵)을 절반으로 분할한 후; 내측 단편 (블록의 중심선에 가장 가까움)은 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하고, 외측 단편은 액체 질소 중에서 급속 냉동하였다. CBA 연구에서의 6개월 군의 선조체 절제는 미상핵 및 조가비핵 양자로부터 4개의 선조체 샘플을 생성시키는 방식으로 수행하였다. 등쪽 절편 (내측 및 외측 모두)은 액체 질소 중에서 급속 냉동하였으며, 배쪽 절편 (내측 및 외측 모두)은 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하였다. 24시간 후에 RNA 레이터를 제거하고, 샘플을 -80 ℃에서 저장하였다.
2m2 블록은 OCT를 사용하여 충분하게 덮은 후, 2-메틸부탄 및 드라이 아이스 조에서 냉동시켰다. 2a, 2m1 및 2p 블록 중 나머지는 동일한 방식으로 냉동시켰다. 등쪽 대 배쪽 방식으로 각 블록으로부터 10개의 피질 샘플을 채취하였는데: 2개는 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰으며, 8개는 4 ℃에서 1 ml의 RNA 레이터에 저장하였다.
조직학적 분석용 조직의 절개
조직학적 분석을 위한 조직 절개 전에, 뇌로부터 선조체를 단리하여, OCT에 의해 충분히 덮고, -20 ℃에서 24시간 동안 저장하였다. 전체 선조체를 관통하여 슬라이딩 마이크로톰(sliding microtome) (라이체르트-정 테트란더(Reichert-Jung Tetrander) 슬라이딩 마이크로톰)으로 40 ㎛ 두께로 측정되는 관상 절편을 절단하였다. 절편을 4 ℃에서 1X 포스페이트 완충된 식염수 중 0.01 % 나트륨 아지드에 저장하였다.
벡터
클로닝
및
rAAV9
제조
첫 번째 연구의 경우, 시험 벡터는 내생 mir155 백본을 기반으로 하는 인공 miRNA를 추진하는 U6 프로모터를 포함하였다 (AAV9-U6-miRHTT). 인공 miRNA는 인간은 표적으로 하나, 양 헌팅틴은 표적으로 하지 않는다. AAV 패키지화를 향상시키기 위하여, 키메라 인트론을 추진하는 키메라 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴 (CBA) 프로모터가 포함되었다. 대조 벡터 (AAV9)는 빈 CBA 프로모터 및 인트론만을 포함하였다. 두 번째 연구의 경우, 시험 벡터는 CMV 인핸서 및 CBA 프로모터, 인트론 및 miRNA-155 기반 인공 miRNA를 포함하였다 (AAV9-CBA-miRHTT).
패키지화를 위하여, rAAV 벡터 플라스미드, 패키지화 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 HEK 293 세포에 공동-형질감염시켰다. 패키지화 플라스미드는 rAAV 벡터 플라스미드로부터 AAV 비리온으로의 재조합 게놈의 절제, 복제 및 패키지화로 이어지는 조절 및 AAV9 캡시드 단백질을 발현하였다. 재조합 바이러스는 표준 CsCl 구배 침강 및 투석에 의한 탈염에 의해 정제하였다.
헌팅틴
mRNA
수준의 분석
분지 DNA 검정 (bDNA)을 사용하여 RNA 레이터 보존 샘플 중 RNA 농도를 분석하였다. RNA 레이터 (어피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix eBioscience) 사, 퀀티진(Quantigene)® 샘플 처리 키트)에 저장된 조직으로부터의 조직 균질물의 제조에 대한 제조자의 지침에 따라 샘플을 처리하였다. bDNA 검정 (퀀티진® 2.0 시약 시스템)에 대한 제조자의 지침에 따라 균질화된 샘플을 분석하였다. 인간 헌팅틴 (인간 HD, 퀀티진의 SA-50339), 양 헌팅틴 (양 헌팅틴, 퀀티진의 SF-10586) 및 하우키핑 유전자로서의 양 칼넥신 (양 칼넥신, 퀀티진의 SF-10622)을 검출하기 위하여, 프로브를 사용하여 샘플을 분석하였다. 검정 결과는 테칸 인피니트(Tecan Infinite) M1000 프로(PRO) 발광측정기를 사용하여 측정하였다 (노출 시간(integration time)은 200 ms로 설정).
miR
-
Htt
수준의 분석
냉동된 블록에서, 외측 미상핵 및 내측 조가비핵으로부터 생검 펀치 (2 mm)를 샘플링하였다. 일부 변형을 가한 트리졸(TRIzol) 제조자의 지침 (암비온(Ambion) 사)을 사용하여 RNA 추출을 수행하였다. 트리졸 추출에서의 상 분리 후, 수성 상을 RNA 클린 앤 콘센트레이터(Clean & Concentrator) (자이모(Zymo) 사) 컬럼으로 옮기고, 그의 프로토콜에 따랐다. 분석시까지 RNA를 -80 ℃로 저장하였다. 단편 분석기 (어드밴스드 애널리티칼 테크놀로지스(Advanced Analytical Technologies) Inc. 사)에서 RNA 품질 및 농도를 확인하였다. 분석 직전에, RNA를 20 ng/μl로 희석하였다. 타크만(TaqMan) 마이크로RNA 역전사 키트 (Cat# 4366596, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사), 2 μl의 RNA 및 가이드 가닥 특이적 스템-루프 프라이머 (UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCU (서열식별번호: 25)를 표적으로 하는 써모피셔 사 맞춤 검정, 또는 검정 id 002407, let7e*)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 인공 miRNA 가이드 가닥을 역-전사하였다. 다중화를 가능하게 하기 위하여, 5 μl의 RT 생성물, 1x 농도의 miR-Htt 검정 및 0.3x 농도의 let-7e* 검정을 사용하여 ddPCR 반응을 구성하였다. QX200 액적 생성기 (Cat# 1864002, 바이오래드(Biorad) 사)를 사용하여 액적을 생성시키고, 종료점 PCR 증폭 (40 주기) 후 양성 신호에 대하여 모니터링하였다. miRHTT 및 let-7e* 사이의 절대 농도 비를 계산하는 것에 의해 miRHTT의 상대적인 발현을 확인하였다.
벡터 게놈 분포
젠트라 퓨어진(Gentra Puregene) 조직 키트 (키아젠(Qiagen) 사)를 사용하여, 액체 질소에 급속 냉동시켰던 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 나노드롭 원(NanoDrop ONE)c 분광광도계를 사용하여 게놈 DNA 농도를 측정하였다. 투입분으로서의 50 ng의 DNA, 그리고 벡터-특이적 CB 및 U6 프로모터 및 HPRT 참조 유전자를 검출하는 타크만 검정을 사용하여, 제조자의 권장사항에 따라 액적 디지털 PCR (ddPCR, 바이오래드 사)을 수행하였다. 결과를 이배체 게놈 당 벡터 게놈 (vg/dg)로 나타내었다.
헌팅틴
단백질 수준의 분석 --
mHTT에
대한 중간규모 검출 검정 (
MSD
)
선조체 샘플을 10 mM HEPES, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제 (로체(Roche) 사)로 구성되는 완충제 중에서 균질화하고, 10 % 진폭으로 10초 초음파처리하였다. 브래드포드(Bradford) 검정을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 96-웰 퀵플렉스(QuicPlex) 표준 플레이트 (MSD 사)를 PBS 중 토끼 단일클론 항-HTT 프롤린 1220 영역 항체 (D7F7, 세포 신호전달, 1:250)로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. PBST (PBS + 0.05 % 트윈(Tween)20)를 사용하여 3x 10분 동안 플레이트를 세척하고, PBS 중 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 RT에서 2시간 동안 블로킹하였다. PBST로 3x 10분 동안 세척한 후, 25 μL의 균질화 완충제 중에 20 ㎍의 단백질을 포함하는 샘플의 기술적 2반복물, 또는 바탕물 (균질화 완충제)을 플레이트에 분배하고, 궤도 진탕기에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 중에서 3x 10분 세척하고, 하기와 같이 이차/검출 항체 혼합물 중에서 인큐베이션하였다: mHTT의 검출을 위하여, 마우스 단일클론 항-폴리Q 항체 MW1 (DSHB)을 PBS 중 1 % BSA 중에 각 항체 1 ㎍/mL로 항-마우스 술포태그(SulfoTag) 검출 항체 (MSD 사)와 혼합하였다. 웰 당 30 μL의 검출 항체 혼합물을 적용하고, 궤도 진탕기에서 RT로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST 중에서 3x 10분 세척하고, 퀵플렉스 SQ120 (MSD 사)에서의 판독 직전에 웰 당 150 μL의 2x 판독 완충제 (MSD 사)를 적용하였다.
웨스턴
블러팅
냉동된 블록으로부터 소형 조직 단편을 제거하고, 얼음상에서 200 μl의 10 mM HEPES pH 7.2, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA + 프로테아제 억제제 정제 (미니, 완전, 무-EDTA 로체 사 #11836170001) 중에 균질화하였다. 10초 동안 샘플을 초음파처리한 후, 브래드포드법 (바이오래드 사 #500-0006)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 3-8 % 트리스(Tris)-아세테이트 겔 (라이프 테크놀로지스 사 #EA03785BOX) 상에서의 SDS-PAGE에 의해 동일 농도의 단백질 (25 ㎍)을 분리하고, 트랜스블럿 터보(TransBlot Turbo) (바이오래드 사)를 사용하여 니트로셀룰로스로 옮겼다. 트리스-완충 식염수 + 0.1 % 트윈-20 (TBST) 중 5 % 무-지방 분유 중에서 1시간 동안 블럿을 블로킹하고, 블로킹 용액에 희석된 일차 항체 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 사용된 일차 항체는 하기였다: 항-폴리-Q (MW1, 코리엘(Coriell) 사, 1:500 또는 3B5H10, 시그마(Sigma) 사, 1:1000), 항-헌팅틴 (MAB2166, EMD 밀리포어 사, 1:1000 또는 Ab1, 문헌 [DiFiglia et al., 1995], 1:1000), 항-DARPP32 (#ab40801, 아브캄(Abcam) 사, 1:10,000), 항-액틴 (A4700, 시그마 사, 1:1000) 및 항-스펙트린 (MAB1622, EMD 밀리포어 사, 1:4000). TBST 중에서 블럿을 세척하고, 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액 중에 1:5000 희석된 퍼옥시다제 표지 이차 항체 중에서 인큐베이션한 후, TBST 중에서 세척하고, 수퍼시그날 웨스트 피코(SuperSignal West Pico) 화학발광 기질 (피어스(Pierce) 사 #34080) 중에서 인큐베이션하였다. CCD 영상화 시스템 (알파 이노테크(Alpha Innotech) 사) 및 하이퍼필름(Hyperfilm) ECL (GE 헬스케어(Healthcare) 사)을 사용하여 이미지를 수득하였다. 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 디지털 이미지상에서 농도측정을 수행하였다. 비쌍형 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하고, 결과를 주사된 측면에 대한 평균 값으로 나타내었다.
DARPP32
,
NeuN
및
Iba1에
대한 면역조직화학
DARPP32 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 3 % 수소 퍼옥시드 중에서 3분, 0.5 % 트리톤(Triton)-X-100 중에서 20분, 그리고 이어서 1X PBS 중 1.5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스(Vector Labs) 사, S-1000) 중에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1.5 % 표준 염소 혈청 중 항-DARPP32 (아브캄 사, ab40801, 1:1,000 희석) 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 다음에, 절편들을 1X PBS 중 바이오티닐화 염소 항-토끼 IgG 항체 (벡터 랩스 사, AP-1000, 1:200 희석) 중에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 벡타스타인 엘리트(Vectastain Elite) ABC 키트 (벡터 랩스 사, PK-6100)의 2 % 엘리트 A 및 2 % 엘리트 B 시약과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 금속 강화 DAB 키트 (써모피셔 사이언티픽 사, 34065)를 사용하여 DARPP32 양성 세포를 가시화하였다. 절편들을 안정한 퍼옥시드 완충제 중 1X 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 인큐베이션하였다.
NeuN 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 3 % 수소 퍼옥시드 중에서 3분, 0.5 % 트리톤-X-100 중에서 20분, 그리고 이어서 4 ℃로 밤새 1X PBS 중 1.5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000) 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편들을 1.5 % 표준 염소 혈청 중 항-NeuN (케미콘(Chemicon) 사, MAB377, 1:1,000 희석) 중에서 4 ℃로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음에, 절편들을 형광 AF594 염소 항-마우스 IgG (써모피셔 사이언티픽 사, A-11005, 1:2,000 희석) 중에서 40분 동안 인큐베이션함으로써, NeuN 양성 세포를 가시화하였다.
Iba1 양성 세포를 정량하기 위하여, 모든 20 번째 절편을 1X PBS 중 5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000), 1 % 소 혈청 알부민 (시그마 사, A-3059), 0.2 % 트리톤-X-100 및 0.03 % 수소 퍼옥시드의 용액 중에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 5 % 표준 염소 혈청 (벡터 랩스 사, S-1000) 중 항-Iba1 (와코 케미칼스(Wako Chemicals) 사, 019-19741, 1:1,000 희석) 및 1 % 소 혈청 알부민 (시그마 사, A-3059) 중에서 4 ℃로 밤새 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 바이오티닐화 염소 항-토끼 IgG 항체 (벡터 랩스 사, AP-1000, 1:200 희석) 중에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 절편들을 1X PBS 중 벡타스타인 엘리트 ABC 키트 (벡터 랩스 사, PK-6100)의 2 % 엘리트 A 및 2 % 엘리트 B 시약과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 금속 강화 DAB 키트 (써모피셔 사이언티픽 사, 34605)를 사용하여 안정한 퍼옥시드 완충제 중 1X 3,3'-디아미노벤지딘 중에서 절편을 인큐베이션하는 것에 의해 반응을 가시화하였다. 각 절편의 니콘 에클립스(Nikon Eclipse) E600 현미경을 사용한 이미지 (DARPP32의 경우 20X 및 Iba1의 경우 40X)를 촬영하는 것에 의해, 뇌의 좌측 및 우측 반구에서의 DARPP32 및 Iba1 양성 세포의 정량을 수행하였다. 서로 다른 절편들 사이에서 일관되게 이미지를 포착하기 위하여, 선조체의 내측 등쪽 가장자리에서 첫 번째 이미지를 포착하고, 스테이지를 배쪽 가장자리를 향하여 0.5 cm 이동하였다. 일단 배쪽 가장자리에 도달하고 나서, 10개의 이미지가 포착될 때까지 스테이지를 0.5 cm 외측 및 0.5 cm 등쪽으로 이동하였다. 각 이미지에는 무작위 번호를 할당함으로써, 세포를 정량할 때의 선입견을 제거하였다. 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 세포를 계수하였다.
치우 테크니칼 코포레이션(Chiu Technical Corporation) 사의 머큐리(Mercury) 100-W 램프가 구비된 니콘 에클립스 E600을 사용하여 60X로 NeuN 양성 세포의 정량을 수행하였다. DARPP32 및 Iba1 이미지를 포착하는 데에 사용된 입체학적 방법을 NeuN 양성 세포를 정량하는 데에도 사용하였다. 선조체 전체에 걸쳐 모든 20 번째 절편 (동물 측면 당 29-35개 절편)의 주사 및 비-주사 측면에서 이미지J 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 DARPP32 염색된 영역에 수동으로 원을 그림으로써, 각 절편에서의 선조체, 미상핵 및 조가비핵의 면적을 측정하였다. 관찰자는 조건에 대하여 맹검처리되었다. 면적에 절편 두께 (40 마이크로미터)를 곱하고 슬라이드들 사이의 절편 수 (20)를 곱한 후, 각 동물에 대하여 서로 더함으로써, 각 영역의 총 부피를 측정하였다. 통계 분석은 마이크로소프트 엑셀, 쌍형성 및 비쌍형 t-검정, 군 당 N = 3 또는 4 마리의 동물을 사용하여 수행하였다.
주사 후 벡터 게놈 및
miRNA
분포
HD의 녹-인(knock-in) 모델에서의 확장된 마우스 헌팅틴 및 HD의 트랜스제닉 마우스 모델에서의 인간 mHTT 트랜스진 mRNA의 침묵화를 관찰하였다. 이와 같은 실시예에서는, 2개 HD 양 군 (연구 1 및 연구 2)의 선조체에 편측으로 주사하였다. 연구 1에서는, 비-코딩 스터퍼(stuffer) 서열이 프로모터와 폴리-A 신호 사이에 삽입되어 있는 scAAV9-U6-miRHTT (AAV9miRHTT) 또는 scAAV9-CBA-빈것 (AAV9)을 8-9개월령의 양에 주사하였다. 연구 2에서는, scAAV9-CBA-miRHTT 또는 scAAV9-CBA-빈것 (AAV9)을 14개월령의 양에 주사하였다. AAV9-miRHTT 투여 1개월 및 6개월 후에, 뇌를 수확하였다.
액적 디지털 PCR (ddPCR, 도 26b)에 의해 영역 하위세트 (도 26a)에서 게놈 카피수를 측정하였다. 게놈 카피수는 비-주사 측면에 비해 주사된 측면의 미상핵 및 조가비핵에서 최고였으며, 주사 1 및 6개월 후 scAAV9-U6-miRHTT 처리 군에서 최고 수준이었다. 피질 및 간에 소량의 벡터 게놈이 존재하였으나, 부신에서는 검출가능하지 않았다 (도 26b).
RNA 품질 번호 (RQN)로 지칭되는 점수를 생성시키는 단편 분석기를 사용하여 RNA 품질을 측정하였다. RQN은 전기-영동도를 분석하고, 28S와 18S 리보좀 피크 선명도 및 기준선 사이의 비와 같은 RNA 완전성의 수많은 서로 다른 척도들을 통합하는 것에 의해 생성된다. 점수는 일반적으로 0 (완전히 분해됨) 내지 10의 범위이다. 5를 초과하는 점수를 가지는 샘플을 사용하여 인공 miRNA 가이드 가닥의 수준을 분석하였다. 낮은 RQN 점수로 인하여, 연구 1로부터 2 마리 및 연구 2로부터 2 마리의 동물을 분석에서 배제하였다. ddPCR을 사용하여 인공 miRNA 가이드 가닥의 수준을 측정하고, 내생 let7e*에 대하여 정규화하였다 (도 27). 인공 miR 안티센스 가닥의 상대적인 품질은 비-주사 측면에 비해 주사된 측면에서 3.5-1000배 더 높았으며, 주사 6개월-후에 비해 1개월-후에서 더 높았다. AAV9-miRHTT를 사용한 주사 반대쪽 측면에서는 miRNA 가이드 가닥이 낮은 수준으로 검출되었다.
scAAV9
-
miR
HTT
의
단일 투여가 미상핵 및
조가비핵에서
인간 돌연변이
헌팅틴
mRNA를
장기간
감소시킨다
인간 HTT mRNA는 특이적으로 인식하며 양 HTT mRNA는 그렇게 하지 않는 분지 DNA (bDNA) 검정을 사용하여, 전방 및 내측 선조체 중 HTT mRNA를 측정하였다. 이와 같은 검정은 RNA 단리를 필요로 하지 않기 때문에, 모든 샘플을 분석에 포함시켰다. 주사 1개월-후, 내측 블록의 주사에 가장 가까운 곳에서, scAAV9-U6-miRHTT (연구 1)가 미상핵 및 조가비핵 모두에서 50 % 초과까지 인간 HTT mRNA를 감소시켰다 (도 28). 주사 부위로부터 더 멀었던 전방 선조체에서는 상당한 침묵화가 검출되지 않았다 (도 28). 주사 6개월-후, mRNA 침묵화는 미상핵에서 현저하였다 (도 28). scAAV9-CβA-miRHTT 군 (연구 2)에서는, 주사 1개월-후에 내측 조가비핵, 내측 미상핵 및 전방 선조체에서 (도 28), 그리고 주사 6개월-후에 내측 미상핵 및 내측 조가비핵 일부에서 (도 28) HTT mRNA의 현저한 침묵화가 발생하였다. 전방 선조체는 6개월 후에서 상당한 저하를 나타내지 않았다. 내생 양 HTT mRNA의 상당한 침묵화는 존재하지 않았다 (도 29a).
웨스턴
블럿
검정 및 전기화학발광 (
MSD
검정)은
scAAV9
-
miR
HTT
가
미상핵 및
조가비핵에서
인간 돌연변이
헌팅틴
단백질을 감소시킨다는 것을
보여준다
동일한 샘플 조제물에서 웨스턴 블럿 (도 30) 및 전기화학발광 (중간 규모 발견(Meso Scale Discovery) (MSD) (도 30)에 의해 HTT 단백질을 검출하였다. 연구 1에서는, 웨스턴 블럿에 의해, 야생형 HTT에 비교하여 mHTT (돌연변이 HTT)를 우선적으로 검출하는 3BH510 항체를 사용하여 mHTT 단백질을 검출하였다 (도 30). scAAV9-U6-miRHTT를 사용한 처리 1개월 후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서, 그리고 처리 6개월-후에 조가비핵에서 miRHTT가 결핍되어 있는 AAV9를 사용한 처리에 비해 mHTT 단백질의 상당한 감소가 존재하였다. 연구 2 (도 30, 하단)에서, scAAV9-CβA-miRHTT 처리는 주사 1개월-후 조가비핵에서, 그리고 주사 6개월-후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT를 상당히 침묵화하였다.
검출에 MW1을 사용한 MSD 검정에 의한 결과는 scAAV9-U6-miRHTT 처리 (연구 1)가 처리 1 및 6개월-후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT 단백질 수준을 상당히 낮춘다는 것을 보여주었다. scAAV9-CBA-miRHTT는 주사 1개월-후에 미상핵에서, 그리고 처리 6개월 후 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서 mHTT 단백질을 현저하게 침묵화하였다 (도 31). 이러한 결과는 MSD 검정에 의한 결과 (도 31)와 웨스턴 블럿 검정에 의해 수득된 결과 (도 30) 사이에 충분한 일치성이 존재한다는 것을 표시하였다.
표 2: 연구 1 및 2에서의 웨스턴 블럿 및 MSD 검정에 의한 돌연변이 헌팅틴 단백질 저하의 평균 %. 연구 1에서는 항-htt 폴리Q 항체 3B5H10을, 연구 2에서는 항체 3B5H10, 양 HTT는 인식하지 않는 (문헌 [Reid et al., 2013]) MAB2166 (항-HTT443-456) 및 항-폴리Q 단일클론 항체 MW1을 사용한 웨스턴 블럿에 의해 인간 돌연변이 헌팅틴 단백질을 측정하였다. MSD 검정에서는 검출 항체로서 MW1을 사용하였다. 이와 같은 표는 미상핵, 조가비핵 및 전방 선조체에서의 평균 % mHTT 저하를 기록한다. % 저하는 AAV9miRHTT 처리된 양의 주사된 측면에서의 평균 신호를 AAV9 단독 처리된 동물의 주사된 측면에서의 평균 신호로 나누는 것에 의해 계산하였다.
mHTT를 검출하는 항체들은 서로 다른 민감성을 가질 수 있기 때문에, 웨스턴 블럿, MAB2166 및 MW1에 의해 인간 mHTT 단백질을 검출하는 2종의 다른 항체를 연구 2에 포함시켰다 (표 2). HD 트랜스제닉 양에서, MAB2166은 인간 헌팅틴만을 인식하며, 양 HTT는 인식하지 않는다. MW1은 HTT의 확장된 폴리글루타민 영역을 우선적으로 인식하므로, 역시 MSD 검정에서 mHTT의 검출에 사용하였다. 표 2는 연구 1 및 2에서 3종의 항-mHTT 항체 (3B5H10, 2166 및 MW1)를 사용한 웨스턴 블럿, 그리고 MW1을 사용한 MSD 검정에 의해 검출된 mHTT의 평균 % 저하를 비교한다. 연구 2에서는, 웨스턴 블럿 분석의 3종 전체 항체가 다중 신선조체 영역에서의 상당한 mHTT 저하를 검출하였다 (49 % 내지 81 %). MSD 검정에 의한 mHTT 저하의 결과는 연구 2에서 동일한 선조체 영역으로부터의 2개의 샘플이 분석된 경우, 일치하였다. 연구 2에서의 웨스턴 블럿 및 MW1을 사용한 MSD 검정에 의한 결과의 비교 역시 주목할 만하다. mHTT 저하 크기에 있어서의 이러한 2종의 서로 다른 mHTT 검출 방법 사이에는 충분한 일치가 존재하였다.
웨스턴 블럿 분석에 의하면, AAV9-miRHTT 주사된 선조체를 덮고 있는 피질은 AAV9 주사된 피질에 비해 mHTT 단백질 수준의 감소를 나타내지 않았다 (도 32a). AAV9-miRHTT 주사된 선조체의 반대쪽 측면상의 미상핵 및 조가비핵에서는, 낮은 mRNA 가이드 가닥 수준이 검출되었다. 이들 영역은 웨스턴 블럿 분석에서 감소된 mHTT 단백질 수준을 나타내지 않았다 (도 32b).
인간 HD 유전자에 대항하는 AAV9-miRHTT를 사용한 처리가 내생 양 HTT의 수준에 영향을 주는지를 조사하기 위하여, SDS PAGE에서의 2종 단백질의 이동에 있어서의 차이를 이용하는 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 인간 트랜스진 mHTT의 수준을 내생 양 HTT의 수준과 직접 비교하였다 (도 29b). htt1-17을 인식하는 Ab1 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석은 인간 mHTT와 달리, 내생 양 HTT가 miRHTT를 사용한 처리에 의해 저하되지 않는다는 것을 보여주었다 (도 29b).
DARPP32
표지된 뉴런 및
선조체
부피는
miRNA
처리에 의해 영향을 받지
않는다
AAV 벡터 주사의 안전성을 조사하기 위하여, 중간 가시 뉴런의 마커인 DARPP32에 대한 면역조직화학을 수행하고, DARPP32 양성 세포의 수를 계수하였다. AAV9-miRHTT 처리 및 AAV9 처리 군의 세포수 사이에, 상당한 차이는 존재하지 않았으며 (표 3), 뉴런 세포의 마커인 NeuN의 염색된 세포의 수에 있어서 처리 군들 사이에 상당한 차이는 존재하지 않았다. DARPP32 표지 절편에서의 선조체의 단면적 측정을 사용하여 선조체 부피를 측정하였는데, miRNA 처리 후의 대조에 비해 변화되지 않는다는 것이 발견되었다 (표 4).
표 3: DARPP32 및 NeuN 양성 세포의 수. 쌍형성 t-검정 (주사 대 비-주사 측면)에 의해 데이터를 분석하였다. AAV9-CBA-miRHTT가 주사된 WT 양에서만 주사 6개월 후 쌍형성 t-검정에서 1p=0.002로 주사 및 비-주사 측면 사이에 상당한 차이가 발견되었다.
표 4: 선조체 부피. 부피는 동물 당 측면 당 29-35개 40 ㎛ 절편의 단면적으로부터 측정하였다. 군 당 N=3 마리의 양, 1p=0.01, 2p=0.03, 3p=0.02, 쌍형성 t-검정 사용.
scAAV9를
사용한 직접
주사후에는
활성화된 소교세포의 일시적인 증가가
발생한다
소교세포에 국소화되어 그의 활성화시 상향조절되는 단백질인 Iba1의 면역-조직화학적 국소화를 조사하였다. 표지된 세포들을 형태구조를 기준으로 휴지 또는 활성화 소교세포로서 확인하였다 (표 5). scAAV9-U6-miRHTT 또는 상응하는 대조 벡터의 주사는 주사 1개월-후 주사된 측면에서의 활성화된 소교세포의 수를 증가시켰지만, 주사 6개월 후에는 주사 및 비-주사 측면이 구별불가능하였다. 두 번째 연구에서는, 연구 종료점 (6개월)에만 소교세포 반응을 조사하였는데, 그 시점에 군들 사이의 상당한 차이는 존재하지 않았다. 결과는 활성화된 소교세포의 일시적인 증가가 AAV 적재물과는 무관하며, 임의의 벡터 또는 수술 단독으로도 발생할 수 있다는 것을 암시한다.
표 5: IBA1 양성 세포의 형태구조를 기준으로 한 수 및 분류. 통계 분석은 쌍형성 t-검정 (주사된 측면 대 비-주사 측면)에 의해 수행하였다. 6개월에 AAV9-U6-miRHTT (1p=0.01)가 주사된 HD 양 및 AAV9 (2p=0.006)가 주사된 WT 양에서 비-주사 측면에 비교한 주사된 측면에서의 활성화된 소교세포의 상당한 증가가 발견되었다. 1개월에 AAV9 (3p=0.05) 및 AAV9-U6-miRHTT (4p=0.04) 양자가 주사된 HD 양에서 휴지 소교세포의 상당한 감소가 발견되었으며, 연구 2의 6개월에 AAV9가 주사된 HD 양에서 총 소교세포의 상당한 증가가 발견되었다 (4p=0.04). 모든 분석은 주사 대 비-주사 측면을 비교하는 쌍형성 t-검정에 의해 수행하였다.
scAAV9
-
miR
HTT
처리가 혈구 계수, 전해질, 또는 간 및 신장 기능에는 영향을 주지는 않는다
하기 4개 시점에 혈액 샘플을 채취하였다: 기준선 (처리전), 처리 후 28 (또는 30)일, 90일 및 180일. 전체 혈구 계수, 전해질을 측정하고, 간 및 신장 기능 시험을 수행하였다 (표 6). 이들 측정 중 어느 것에서도 AAV9-miRHTT 주사 양과 대조 사이에 변화는 발견되지 않았다. 또한, 이들 시점에 체중의 변화는 존재하지 않았다.
표 6. 모든 양들의 임상 병리 및 전체 혈구 계수.
[서열목록]
>서열식별번호: 1 헌팅틴 mRNA; NCBI 참조 서열 NM_002111.8)
>서열식별번호: 2
>서열식별번호: 3
>서열식별번호: 4
>서열식별번호: 5
>서열식별번호: 6
>서열식별번호: 7
>서열식별번호: 8
서열식별번호: 9
>서열식별번호: 10
>서열식별번호: 11
>서열식별번호: 12
>서열식별번호: 13
>서열식별번호: 14
>서열식별번호: 15
>서열식별번호: 16
좌위 dsCB-GFP-mir155- 5483 bp DNA 원형 SYN 11-OCT-2012
정의 dsCB-GFP-mirFlank-폴리A*에의 6433의 결찰
등재 dsCB-GFP-mir155-
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5483)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴(Central), 사이언티픽 앤 에듀케이셔널 소프트웨어(Scientific & Educational Software)에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: dsCB-GFP-mirFlank-폴리A*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5419
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 814..1093
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 870..899
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1100..1126
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1100..1369
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1168..1190)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1435..1465
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1435..1531
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
CDS 1605..2314
/유전자="GFP'"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 2341..2357
/유전자="'MCS"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2372..2395
/유전자="5'miR Flank'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2460..2504
/유전자="3'miR Flank"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2573..2699
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2788..2917)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3680..4537
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
>서열식별번호: 17
//좌위 pdsU6-Mir-htt-64 5686 bp DNA 원형 SYN 17-SEP-2013
정의 pU6-miRNAFlank-GFP*에의 6433의 결찰
등재 pdsU6-Mir-htt-64
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5686)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: pU6-miRNAFlank-GFP*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5622
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 777..1041
/유전자="U6 프로모터"
/SECDrawAs="영역"
misc_신호 1041..1041
/유전자="Pol III 개시"
/생성물="전사 개시 "
/SECDrawAs="표지"
CDS 1042..1065
/유전자="5' miR Flank'"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1130..1175
/유전자="miR 3' Flank"
/SECDrawAs="유전자"
misc_신호 1176..1181
/유전자="Pol III term"
/생성물="pol III 종료자"
/SECDrawAs="표지"
misc_특징 1199..1478
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1255..1284
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1754
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1511
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1553..1575)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1916
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1850
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
CDS 1990..2699
/유전자="GFP'"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 2726..2737
/유전자="'MCS'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2776..2902
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2991..3120)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3883..4740
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
>서열식별번호: 18
좌위 pCVscAsaq+-mir64 5155 bp DNA 원형 SYN 17-SEP-2013
정의 pCVscAsaq+-mirFlank*에의 6433의 결찰
등재 pCVscAsaq+-mir64
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5155)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: pCVscAsaq+-mirFlank*
단편 단부: BsmBI
단편 크기: 5090
삽입 분자: 6433
단편 단부:
단편 크기: 64
특징 위치/수식어
misc_특징 1..105
/유전자="ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 182..449
/유전자="CMV"
/생성물="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
CDS 448..753
/유전자="CB 프로모터"
/생성물="프로모터 진핵"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 754..1819
/유전자="인트론"
/생성물="인트론"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1820..1839
/유전자="MCS"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 1843..1847
/유전자=""MCS"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1862..1885
/유전자="5'miR Flank'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1950..1994
/유전자="3'miR Flank"
/SECDrawAs="영역"
CDS 2002..2128
/유전자="RBG pA"
/생성물="폴리A 신호"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 상보체 (2002..2128)
/유전자="RBG\pA"
/SECDrawAs="정보용"
misc_특징 2139..2281
/유전자="3'ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 2317..2509
/유전자="lacZ"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 2510..2965
/유전자="f1 ori"
/SECDrawAs="유전자"
misc_특징 3097..3957
/유전자="bla-AmpR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 4117..4731
/유전자="rep-pMB1"
/SECDrawAs="영역"
기원
>서열식별번호: 19
좌위 U6-mir6433-BGHpA 5223 bp DNA 원형 SYN 12-SEP-2013
정의 U6-MiRBA-6433-GFP**에의 dsAAV CB MCS**의 결찰
등재 U6-mir6433-BGHpA
키워드.
원천 미지.
생물체 미지
미분류.
참조 1 (염기 1 내지 5223)
저자 자체
잡지 미발표.
코멘트 SciEd 센트럴, 사이언티픽 & 에듀케이셔널 소프트웨어에 의해 생성된 SECID/파일
코멘트 SECNOTES|벡터 분자: U6-MiRBA-6433-GFP**
단편 단부: 둔단 및 EagI
단편 크기: 4954
삽입 분자: dsAAV CB MCS**
단편 단부: EagI 및 둔단
단편 크기: 269
특징 위치/수식어
misc_특징 662..767
/유전자="돌연변이 ITR"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 777..1041
/유전자="U6 프로모터"
/SECDrawAs="영역"
misc_신호 1041..1041
/유전자="Pol III 개시"
/생성물="전사 개시 "
/SECDrawAs="표지"
CDS 1042..1065
/유전자="5' miR Flank'"
/SECDrawAs="유전자"
CDS 1130..1175
/유전자="miR 3' Flank"
/SECDrawAs="유전자"
misc_신호 1176..1181
/유전자="Pol III term"
/생성물="pol III 종료자"
/SECDrawAs="표지"
misc_특징 1199..1478
/유전자="CMV 인핸서"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1255..1284
/유전자="잠정용"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1511
/유전자="프로브"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1485..1754
/유전자="B-액틴 프로모터"
/생성물="닭"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (1553..1575)
/유전자="rev"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1850
/유전자="SV40_late_19s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 1820..1916
/유전자="modSV40_late_16s_int"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2034..2230
/유전자="BGHpA"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2263..2274
/유전자="'MCS'"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 2313..2439
/유전자="폴리 A 신호"
/생성물="토끼 글로빈 폴리 A"
/SECDrawAs="영역"
misc_특징 상보체 (2528..2657)
/유전자="3' ITR"
/SECDrawAs="영역"
CDS 3420..4277
/유전자="Amp(R)"
/SECDrawAs="유전자"
기원
>서열식별번호: 20 AAV9 캡시드 단백질
>서열식별번호: 21
>서열식별번호: 22
SEQUENCE LISTING
<110> University of Massachusetts
<120> AAV TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISEASE
<130> U0120.70084WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> 2017-09-22
<150> US 62/398,487
<151> 2016-09-22
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13498
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gctgccggga cgggtccaag atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag 60
agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga 120
ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga 180
gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 240
gcagcagcag cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca 300
gcttcctcag ccgccgccgc aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc 360
gccgcccccg ccgccacccg gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccaaagaa 420
agaactttca gctaccaaga aagaccgtgt gaatcattgt ctgacaatat gtgaaaacat 480
agtggcacag tctgtcagaa attctccaga atttcagaaa cttctgggca tcgctatgga 540
actttttctg ctgtgcagtg atgacgcaga gtcagatgtc aggatggtgg ctgacgaatg 600
cctcaacaaa gttatcaaag ctttgatgga ttctaatctt ccaaggttac agctcgagct 660
ctataaggaa attaaaaaga atggtgcccc tcggagtttg cgtgctgccc tgtggaggtt 720
tgctgagctg gctcacctgg ttcggcctca gaaatgcagg ccttacctgg tgaaccttct 780
gccgtgcctg actcgaacaa gcaagagacc cgaagaatca gtccaggaga ccttggctgc 840
agctgttccc aaaattatgg cttcttttgg caattttgca aatgacaatg aaattaaggt 900
tttgttaaag gccttcatag cgaacctgaa gtcaagctcc cccaccattc ggcggacagc 960
ggctggatca gcagtgagca tctgccagca ctcaagaagg acacaatatt tctatagttg 1020
gctactaaat gtgctcttag gcttactcgt tcctgtcgag gatgaacact ccactctgct 1080
gattcttggc gtgctgctca ccctgaggta tttggtgccc ttgctgcagc agcaggtcaa 1140
ggacacaagc ctgaaaggca gcttcggagt gacaaggaaa gaaatggaag tctctccttc 1200
tgcagagcag cttgtccagg tttatgaact gacgttacat catacacagc accaagacca 1260
caatgttgtg accggagccc tggagctgtt gcagcagctc ttcagaacgc ctccacccga 1320
gcttctgcaa accctgaccg cagtcggggg cattgggcag ctcaccgctg ctaaggagga 1380
gtctggtggc cgaagccgta gtgggagtat tgtggaactt atagctggag ggggttcctc 1440
atgcagccct gtcctttcaa gaaaacaaaa aggcaaagtg ctcttaggag aagaagaagc 1500
cttggaggat gactctgaat cgagatcgga tgtcagcagc tctgccttaa cagcctcagt 1560
gaaggatgag atcagtggag agctggctgc ttcttcaggg gtttccactc cagggtcagc 1620
aggtcatgac atcatcacag aacagccacg gtcacagcac acactgcagg cggactcagt 1680
ggatctggcc agctgtgact tgacaagctc tgccactgat ggggatgagg aggatatctt 1740
gagccacagc tccagccagg tcagcgccgt cccatctgac cctgccatgg acctgaatga 1800
tgggacccag gcctcgtcgc ccatcagcga cagctcccag accaccaccg aagggcctga 1860
ttcagctgtt accccttcag acagttctga aattgtgtta gacggtaccg acaaccagta 1920
tttgggcctg cagattggac agccccagga tgaagatgag gaagccacag gtattcttcc 1980
tgatgaagcc tcggaggcct tcaggaactc ttccatggcc cttcaacagg cacatttatt 2040
gaaaaacatg agtcactgca ggcagccttc tgacagcagt gttgataaat ttgtgttgag 2100
agatgaagct actgaaccgg gtgatcaaga aaacaagcct tgccgcatca aaggtgacat 2160
tggacagtcc actgatgatg actctgcacc tcttgtccat tgtgtccgcc ttttatctgc 2220
ttcgtttttg ctaacagggg gaaaaaatgt gctggttccg gacagggatg tgagggtcag 2280
cgtgaaggcc ctggccctca gctgtgtggg agcagctgtg gccctccacc cggaatcttt 2340
cttcagcaaa ctctataaag ttcctcttga caccacggaa taccctgagg aacagtatgt 2400
ctcagacatc ttgaactaca tcgatcatgg agacccacag gttcgaggag ccactgccat 2460
tctctgtggg accctcatct gctccatcct cagcaggtcc cgcttccacg tgggagattg 2520
gatgggcacc attagaaccc tcacaggaaa tacattttct ttggcggatt gcattccttt 2580
gctgcggaaa acactgaagg atgagtcttc tgttacttgc aagttagctt gtacagctgt 2640
gaggaactgt gtcatgagtc tctgcagcag cagctacagt gagttaggac tgcagctgat 2700
catcgatgtg ctgactctga ggaacagttc ctattggctg gtgaggacag agcttctgga 2760
aacccttgca gagattgact tcaggctggt gagctttttg gaggcaaaag cagaaaactt 2820
acacagaggg gctcatcatt atacagggct tttaaaactg caagaacgag tgctcaataa 2880
tgttgtcatc catttgcttg gagatgaaga ccccagggtg cgacatgttg ccgcagcatc 2940
actaattagg cttgtcccaa agctgtttta taaatgtgac caaggacaag ctgatccagt 3000
agtggccgtg gcaagagatc aaagcagtgt ttacctgaaa cttctcatgc atgagacgca 3060
gcctccatct catttctccg tcagcacaat aaccagaata tatagaggct ataacctact 3120
accaagcata acagacgtca ctatggaaaa taacctttca agagttattg cagcagtttc 3180
tcatgaacta atcacatcaa ccaccagagc actcacattt ggatgctgtg aagctttgtg 3240
tcttctttcc actgccttcc cagtttgcat ttggagttta ggttggcact gtggagtgcc 3300
tccactgagt gcctcagatg agtctaggaa gagctgtacc gttgggatgg ccacaatgat 3360
tctgaccctg ctctcgtcag cttggttccc attggatctc tcagcccatc aagatgcttt 3420
gattttggcc ggaaacttgc ttgcagccag tgctcccaaa tctctgagaa gttcatgggc 3480
ctctgaagaa gaagccaacc cagcagccac caagcaagag gaggtctggc cagccctggg 3540
ggaccgggcc ctggtgccca tggtggagca gctcttctct cacctgctga aggtgattaa 3600
catttgtgcc cacgtcctgg atgacgtggc tcctggaccc gcaataaagg cagccttgcc 3660
ttctctaaca aacccccctt ctctaagtcc catccgacga aaggggaagg agaaagaacc 3720
aggagaacaa gcatctgtac cgttgagtcc caagaaaggc agtgaggcca gtgcagcttc 3780
tagacaatct gatacctcag gtcctgttac aacaagtaaa tcctcatcac tggggagttt 3840
ctatcatctt ccttcatacc tcaaactgca tgatgtcctg aaagctacac acgctaacta 3900
caaggtcacg ctggatcttc agaacagcac ggaaaagttt ggagggtttc tccgctcagc 3960
cttggatgtt ctttctcaga tactagagct ggccacactg caggacattg ggaagtgtgt 4020
tgaagagatc ctaggatacc tgaaatcctg ctttagtcga gaaccaatga tggcaactgt 4080
ttgtgttcaa caattgttga agactctctt tggcacaaac ttggcctccc agtttgatgg 4140
cttatcttcc aaccccagca agtcacaagg ccgagcacag cgccttggct cctccagtgt 4200
gaggccaggc ttgtaccact actgcttcat ggccccgtac acccacttca cccaggccct 4260
cgctgacgcc agcctgagga acatggtgca ggcggagcag gagaacgaca cctcgggatg 4320
gtttgatgtc ctccagaaag tgtctaccca gttgaagaca aacctcacga gtgtcacaaa 4380
gaaccgtgca gataagaatg ctattcataa tcacattcgt ttgtttgaac ctcttgttat 4440
aaaagcttta aaacagtaca cgactacaac atgtgtgcag ttacagaagc aggttttaga 4500
tttgctggcg cagctggttc agttacgggt taattactgt cttctggatt cagatcaggt 4560
gtttattggc tttgtattga aacagtttga atacattgaa gtgggccagt tcagggaatc 4620
agaggcaatc attccaaaca tctttttctt cttggtatta ctatcttatg aacgctatca 4680
ttcaaaacag atcattggaa ttcctaaaat cattcagctc tgtgatggca tcatggccag 4740
tggaaggaag gctgtgacac atgccatacc ggctctgcag cccatagtcc acgacctctt 4800
tgtattaaga ggaacaaata aagctgatgc aggaaaagag cttgaaaccc aaaaagaggt 4860
ggtggtgtca atgttactga gactcatcca gtaccatcag gtgttggaga tgttcattct 4920
tgtcctgcag cagtgccaca aggagaatga agacaagtgg aagcgactgt ctcgacagat 4980
agctgacatc atcctcccaa tgttagccaa acagcagatg cacattgact ctcatgaagc 5040
ccttggagtg ttaaatacat tatttgagat tttggcccct tcctccctcc gtccggtaga 5100
catgctttta cggagtatgt tcgtcactcc aaacacaatg gcgtccgtga gcactgttca 5160
actgtggata tcgggaattc tggccatttt gagggttctg atttcccagt caactgaaga 5220
tattgttctt tctcgtattc aggagctctc cttctctccg tatttaatct cctgtacagt 5280
aattaatagg ttaagagatg gggacagtac ttcaacgcta gaagaacaca gtgaagggaa 5340
acaaataaag aatttgccag aagaaacatt ttcaaggttt ctattacaac tggttggtat 5400
tcttttagaa gacattgtta caaaacagct gaaggtggaa atgagtgagc agcaacatac 5460
tttctattgc caggaactag gcacactgct aatgtgtctg atccacatct tcaagtctgg 5520
aatgttccgg agaatcacag cagctgccac taggctgttc cgcagtgatg gctgtggcgg 5580
cagtttctac accctggaca gcttgaactt gcgggctcgt tccatgatca ccacccaccc 5640
ggccctggtg ctgctctggt gtcagatact gctgcttgtc aaccacaccg actaccgctg 5700
gtgggcagaa gtgcagcaga ccccgaaaag acacagtctg tccagcacaa agttacttag 5760
tccccagatg tctggagaag aggaggattc tgacttggca gccaaacttg gaatgtgcaa 5820
tagagaaata gtacgaagag gggctctcat tctcttctgt gattatgtct gtcagaacct 5880
ccatgactcc gagcacttaa cgtggctcat tgtaaatcac attcaagatc tgatcagcct 5940
ttcccacgag cctccagtac aggacttcat cagtgccgtt catcggaact ctgctgccag 6000
cggcctgttc atccaggcaa ttcagtctcg ttgtgaaaac ctttcaactc caaccatgct 6060
gaagaaaact cttcagtgct tggaggggat ccatctcagc cagtcgggag ctgtgctcac 6120
gctgtatgtg gacaggcttc tgtgcacccc tttccgtgtg ctggctcgca tggtcgacat 6180
ccttgcttgt cgccgggtag aaatgcttct ggctgcaaat ttacagagca gcatggccca 6240
gttgccaatg gaagaactca acagaatcca ggaatacctt cagagcagcg ggctcgctca 6300
gagacaccaa aggctctatt ccctgctgga caggtttcgt ctctccacca tgcaagactc 6360
acttagtccc tctcctccag tctcttccca cccgctggac ggggatgggc acgtgtcact 6420
ggaaacagtg agtccggaca aagactggta cgttcatctt gtcaaatccc agtgttggac 6480
caggtcagat tctgcactgc tggaaggtgc agagctggtg aatcggattc ctgctgaaga 6540
tatgaatgcc ttcatgatga actcggagtt caacctaagc ctgctagctc catgcttaag 6600
cctagggatg agtgaaattt ctggtggcca gaagagtgcc ctttttgaag cagcccgtga 6660
ggtgactctg gcccgtgtga gcggcaccgt gcagcagctc cctgctgtcc atcatgtctt 6720
ccagcccgag ctgcctgcag agccggcggc ctactggagc aagttgaatg atctgtttgg 6780
ggatgctgca ctgtatcagt ccctgcccac tctggcccgg gccctggcac agtacctggt 6840
ggtggtctcc aaactgccca gtcatttgca ccttcctcct gagaaagaga aggacattgt 6900
gaaattcgtg gtggcaaccc ttgaggccct gtcctggcat ttgatccatg agcagatccc 6960
gctgagtctg gatctccagg cagggctgga ctgctgctgc ctggccctgc agctgcctgg 7020
cctctggagc gtggtctcct ccacagagtt tgtgacccac gcctgctccc tcatctactg 7080
tgtgcacttc atcctggagg ccgttgcagt gcagcctgga gagcagcttc ttagtccaga 7140
aagaaggaca aataccccaa aagccatcag cgaggaggag gaggaagtag atccaaacac 7200
acagaatcct aagtatatca ctgcagcctg tgagatggtg gcagaaatgg tggagtctct 7260
gcagtcggtg ttggccttgg gtcataaaag gaatagcggc gtgccggcgt ttctcacgcc 7320
attgctaagg aacatcatca tcagcctggc ccgcctgccc cttgtcaaca gctacacacg 7380
tgtgccccca ctggtgtgga agcttggatg gtcacccaaa ccgggagggg attttggcac 7440
agcattccct gagatccccg tggagttcct ccaggaaaag gaagtcttta aggagttcat 7500
ctaccgcatc aacacactag gctggaccag tcgtactcag tttgaagaaa cttgggccac 7560
cctccttggt gtcctggtga cgcagcccct cgtgatggag caggaggaga gcccaccaga 7620
agaagacaca gagaggaccc agatcaacgt cctggccgtg caggccatca cctcactggt 7680
gctcagtgca atgactgtgc ctgtggccgg caacccagct gtaagctgct tggagcagca 7740
gccccggaac aagcctctga aagctctcga caccaggttt gggaggaagc tgagcattat 7800
cagagggatt gtggagcaag agattcaagc aatggtttca aagagagaga atattgccac 7860
ccatcattta tatcaggcat gggatcctgt cccttctctg tctccggcta ctacaggtgc 7920
cctcatcagc cacgagaagc tgctgctaca gatcaacccc gagcgggagc tggggagcat 7980
gagctacaaa ctcggccagg tgtccataca ctccgtgtgg ctggggaaca gcatcacacc 8040
cctgagggag gaggaatggg acgaggaaga ggaggaggag gccgacgccc ctgcaccttc 8100
gtcaccaccc acgtctccag tcaactccag gaaacaccgg gctggagttg acatccactc 8160
ctgttcgcag tttttgcttg agttgtacag ccgctggatc ctgccgtcca gctcagccag 8220
gaggaccccg gccatcctga tcagtgaggt ggtcagatcc cttctagtgg tctcagactt 8280
gttcaccgag cgcaaccagt ttgagctgat gtatgtgacg ctgacagaac tgcgaagggt 8340
gcacccttca gaagacgaga tcctcgctca gtacctggtg cctgccacct gcaaggcagc 8400
tgccgtcctt gggatggaca aggccgtggc ggagcctgtc agccgcctgc tggagagcac 8460
gctcaggagc agccacctgc ccagcagggt tggagccctg cacggcgtcc tctatgtgct 8520
ggagtgcgac ctgctggacg acactgccaa gcagctcatc ccggtcatca gcgactatct 8580
cctctccaac ctgaaaggga tcgcccactg cgtgaacatt cacagccagc agcacgtact 8640
ggtcatgtgt gccactgcgt tttacctcat tgagaactat cctctggacg tagggccgga 8700
attttcagca tcaataatac agatgtgtgg ggtgatgctg tctggaagtg aggagtccac 8760
cccctccatc atttaccact gtgccctcag aggcctggag cgcctcctgc tctctgagca 8820
gctctcccgc ctggatgcag aatcgctggt caagctgagt gtggacagag tgaacgtgca 8880
cagcccgcac cgggccatgg cggctctggg cctgatgctc acctgcatgt acacaggaaa 8940
ggagaaagtc agtccgggta gaacttcaga ccctaatcct gcagcccccg acagcgagtc 9000
agtgattgtt gctatggagc gggtatctgt tctttttgat aggatcagga aaggctttcc 9060
ttgtgaagcc agagtggtgg ccaggatcct gccccagttt ctagacgact tcttcccacc 9120
ccaggacatc atgaacaaag tcatcggaga gtttctgtcc aaccagcagc cataccccca 9180
gttcatggcc accgtggtgt ataaggtgtt tcagactctg cacagcaccg ggcagtcgtc 9240
catggtccgg gactgggtca tgctgtccct ctccaacttc acgcagaggg ccccggtcgc 9300
catggccacg tggagcctct cctgcttctt tgtcagcgcg tccaccagcc cgtgggtcgc 9360
ggcgatcctc ccacatgtca tcagcaggat gggcaagctg gagcaggtgg acgtgaacct 9420
tttctgcctg gtcgccacag acttctacag acaccagata gaggaggagc tcgaccgcag 9480
ggccttccag tctgtgcttg aggtggttgc agccccagga agcccatatc accggctgct 9540
gacttgttta cgaaatgtcc acaaggtcac cacctgctga gcgccatggt gggagagact 9600
gtgaggcggc agctggggcc ggagcctttg gaagtctgcg cccttgtgcc ctgcctccac 9660
cgagccagct tggtccctat gggcttccgc acatgccgcg ggcggccagg caacgtgcgt 9720
gtctctgcca tgtggcagaa gtgctctttg tggcagtggc caggcaggga gtgtctgcag 9780
tcctggtggg gctgagcctg aggccttcca gaaagcagga gcagctgtgc tgcaccccat 9840
gtgggtgacc aggtcctttc tcctgatagt cacctgctgg ttgttgccag gttgcagctg 9900
ctcttgcatc tgggccagaa gtcctccctc ctgcaggctg gctgttggcc cctctgctgt 9960
cctgcagtag aaggtgccgt gagcaggctt tgggaacact ggcctgggtc tccctggtgg 10020
ggtgtgcatg ccacgccccg tgtctggatg cacagatgcc atggcctgtg ctgggccagt 10080
ggctgggggt gctagacacc cggcaccatt ctcccttctc tcttttcttc tcaggattta 10140
aaatttaatt atatcagtaa agagattaat tttaacgtaa ctctttctat gcccgtgtaa 10200
agtatgtgaa tcgcaaggcc tgtgctgcat gcgacagcgt ccggggtggt ggacagggcc 10260
cccggccacg ctccctctcc tgtagccact ggcatagccc tcctgagcac ccgctgacat 10320
ttccgttgta catgttcctg tttatgcatt cacaaggtga ctgggatgta gagaggcgtt 10380
agtgggcagg tggccacagc aggactgagg acaggccccc attatcctag gggtgcgctc 10440
acctgcagcc cctcctcctc gggcacagac gactgtcgtt ctccacccac cagtcaggga 10500
cagcagcctc cctgtcactc agctgagaag gccagccctc cctggctgtg agcagcctcc 10560
actgtgtcca gagacatggg cctcccactc ctgttccttg ctagccctgg ggtggcgtct 10620
gcctaggagc tggctggcag gtgttgggac ctgctgctcc atggatgcat gccctaagag 10680
tgtcactgag ctgtgttttg tctgagcctc tctcggtcaa cagcaaagct tggtgtcttg 10740
gcactgttag tgacagagcc cagcatccct tctgcccccg ttccagctga catcttgcac 10800
ggtgacccct tttagtcagg agagtgcaga tctgtgctca tcggagactg ccccacggcc 10860
ctgtcagagc cgccactcct atccccaggc caggtccctg gaccagcctc ctgtttgcag 10920
gcccagagga gccaagtcat taaaatggaa gtggattctg gatggccggg ctgctgctga 10980
tgtaggagct ggatttggga gctctgcttg ccgactggct gtgagacgag gcaggggctc 11040
tgcttcctca gccctagagg cgagccaggc aaggttggcg actgtcatgt ggcttggttt 11100
ggtcatgccc gtcgatgttt tgggtattga atgtggtaag tggaggaaat gttggaactc 11160
tgtgcaggtg ctgccttgag acccccaagc ttccacctgt ccctctccta tgtggcagct 11220
ggggagcagc tgagatgtgg acttgtatgc tgcccacata cgtgaggggg agctgaaagg 11280
gagcccctcc tctgagcagc ctctgccagg cctgtatgag gcttttccca ccagctccca 11340
acagaggcct cccccagcca ggaccacctc gtcctcgtgg cggggcagca ggagcggtag 11400
aaaggggtcc gatgtttgag gaggccctta agggaagcta ctgaattata acacgtaaga 11460
aaatcaccat tccgtattgg ttgggggctc ctgtttctca tcctagcttt ttcctggaaa 11520
gcccgctaga aggtttggga acgaggggaa agttctcaga actgttggct gctccccacc 11580
cgcctcccgc ctcccccgca ggttatgtca gcagctctga gacagcagta tcacaggcca 11640
gatgttgttc ctggctagat gtttacattt gtaagaaata acactgtgaa tgtaaaacag 11700
agccattccc ttggaatgca tatcgctggg ctcaacatag agtttgtctt cctcttgttt 11760
acgacgtgat ctaaaccagt ccttagcaag gggctcagaa caccccgctc tggcagtagg 11820
tgtcccccac ccccaaagac ctgcctgtgt gctccggaga tgaatatgag ctcattagta 11880
aaaatgactt cacccacgca tatacataaa gtatccatgc atgtgcatat agacacatct 11940
ataattttac acacacacct ctcaagacgg agatgcatgg cctctaagag tgcccgtgtc 12000
ggttcttcct ggaagttgac tttccttaga cccgccaggt caagttagcc gcgtgacgga 12060
catccaggcg tgggacgtgg tcagggcagg gctcattcat tgcccactag gatcccactg 12120
gcgaagatgg tctccatatc agctctctgc agaagggagg aagactttat catgttccta 12180
aaaatctgtg gcaagcaccc atcgtattat ccaaattttg ttgcaaatgt gattaatttg 12240
gttgtcaagt tttgggggtg ggctgtgggg agattgcttt tgttttcctg ctggtaatat 12300
cgggaaagat tttaatgaaa ccagggtaga attgtttggc aatgcactga agcgtgtttc 12360
tttcccaaaa tgtgcctccc ttccgctgcg ggcccagctg agtctatgta ggtgatgttt 12420
ccagctgcca agtgctcttt gttactgtcc accctcattt ctgccagcgc atgtgtcctt 12480
tcaaggggaa aatgtgaagc tgaaccccct ccagacaccc agaatgtagc atctgagaag 12540
gccctgtgcc ctaaaggaca cccctcgccc ccatcttcat ggagggggtc atttcagagc 12600
cctcggagcc aatgaacagc tcctcctctt ggagctgaga tgagccccac gtggagctcg 12660
ggacggatag tagacagcaa taactcggtg tgtggccgcc tggcaggtgg aacttcctcc 12720
cgttgcgggg tggagtgagg ttagttctgt gtgtctggtg ggtggagtca ggcttctctt 12780
gctacctgtg agcatccttc ccagcagaca tcctcatcgg gctttgtccc tcccccgctt 12840
cctccctctg cggggaggac ccgggaccac agctgctggc cagggtagac ttggagctgt 12900
cctccagagg ggtcacgtgt aggagtgaga agaaggaaga tcttgagagc tgctgaggga 12960
ccttggagag ctcaggatgg ctcagacgag gacactcgct tgccgggcct gggcctcctg 13020
ggaaggaggg agctgctcag aatgccgcat gacaactgaa ggcaacctgg aaggttcagg 13080
ggccgctctt cccccatgtg cctgtcacgc tctggtgcag tcaaaggaac gccttcccct 13140
cagttgtttc taagagcaga gtctcccgct gcaatctggg tggtaactgc cagccttgga 13200
ggatcgtggc caacgtggac ctgcctacgg agggtgggct ctgacccaag tggggcctcc 13260
ttgtccaggt ctcactgctt tgcaccgtgg tcagagggac tgtcagctga gcttgagctc 13320
ccctggagcc agcagggctg tgatgggcga gtcccggagc cccacccaga cctgaatgct 13380
tctgagagca aagggaagga ctgacgagag atgtatattt aattttttaa ctgctgcaaa 13440
cattgtacat ccaaattaaa ggaaaaaaat ggaaaccatc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 13498
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 2
taaatgtgcc tgttgaaggg c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 3
aagaggtgca gagtcatcat c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 4
ttctggagga catcaaacca t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 5
tgaactggcc cacttcaatg t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 6
ttccattggc aactgggcca t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 7
taagcatgga gctagcaggc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 8
tagcgttgaa gtactgtccc c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 9
ttgaggcagc agcggctgtg c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 10
ttcatcagct tttccagggt c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 11
tggaattctc gggtgccaag g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 12
ccttggcacc cgagaattcc a 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 13
gcagagcaca gccgacgac 19
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 14
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga 50
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
cca 63
<210> 16
<211> 5483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 16
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 60
aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 120
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 180
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 240
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 300
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 360
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 420
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 480
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 540
aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 600
ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 660
cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 720
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg 780
atctgaattc aattcacgcg tggtacctct ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc 840
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 900
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 960
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 1020
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 1080
gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 1140
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 1200
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 1260
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 1320
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc 1380
accgcggtgg cggcctagag tcgacgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt 1440
ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact 1500
gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta 1560
aaagctgcgg aattgtaccc gcggccgatc caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg 1620
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 1680
acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 1740
agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 1800
cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 1860
agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 1920
actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 1980
tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 2040
acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 2100
tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 2160
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 2220
ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 2280
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cctagcgttt 2340
ccggcgacgg tgctagcgtc gaccagtgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg 2400
taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac 2460
aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc tggccgcact 2520
cgaaaacggg ccctctagac tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt 2580
tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 2640
ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 2700
aagcaattcg ttgatctgaa tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt 2760
agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 2820
ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 2880
ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg 2940
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 3000
cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 3060
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 3120
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 3180
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 3240
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 3300
aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 3360
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 3420
tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 3480
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc 3540
ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 3600
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 3660
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 3720
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 3780
tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 3840
ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 3900
atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 3960
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 4020
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 4080
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 4140
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 4200
cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 4260
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 4320
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 4380
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 4440
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 4500
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 4560
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 4620
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 4680
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 4740
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 4800
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 4860
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 4920
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 4980
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 5040
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 5100
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 5160
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 5220
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 5280
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 5340
ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 5400
taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 5460
agtgagcgag gaagcggaag agc 5483
<210> 17
<211> 5686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 17
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 60
aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 120
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 180
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 240
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 300
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 360
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 420
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 480
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 540
aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 600
ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 660
cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 720
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg 780
tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 840
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 900
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 960
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1020
tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga 1080
gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag 1140
gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg 1200
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 1260
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 1320
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 1380
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 1440
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac 1500
tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt 1560
ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 1620
cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 1680
ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 1740
gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga 1800
aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc 1860
cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct 1920
gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgatccaccg 1980
gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 2040
gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 2100
gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 2160
tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 2220
cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 2280
accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 2340
gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 2400
ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 2460
cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 2520
cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 2580
gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 2640
cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 2700
tacaagtaaa gcggccctag cgtttccggc gacggtgcta gactcgagga cggggtgaac 2760
tacgcctgag gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 2820
cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 2880
aattttttgt gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat 2940
acccattacc ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct 3000
agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 3060
aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 3120
ccttaattaa cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 3180
cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 3240
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc 3300
gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 3360
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 3420
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 3480
tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 3540
gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 3600
cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 3660
gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 3720
gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 3780
ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 3840
taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 3900
cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 3960
acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 4020
ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 4080
atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa 4140
gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 4200
acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 4260
atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 4320
accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 4380
ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 4440
acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 4500
gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 4560
tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 4620
ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 4680
actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 4740
taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 4800
tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 4860
gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 4920
cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 4980
gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 5040
gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 5100
tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 5160
ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 5220
cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 5280
gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 5340
gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 5400
gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 5460
cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 5520
tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 5580
cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc 5640
cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagc 5686
<210> 18
<211> 5155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 18
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120
aagatcaatt caattcacgc gtcgacattg attattgact agctctggtc gttacataac 180
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 240
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 300
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc 360
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac 420
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg 480
tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt 540
atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg 600
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 660
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 720
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg 780
tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 840
cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat 900
gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt 960
tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg 1020
tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg 1080
ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cggggggggc 1140
tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg 1200
ggcgcgtcgg tcgggctgca accccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc 1260
ccggcttcgg gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg 1320
gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg 1380
ggggaggggc gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc 1440
cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt 1500
gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg 1560
tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt 1620
ccccttctcc ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga 1680
cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac 1740
catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg 1800
tctcatcatt ttggcaaaga attcatcgat accgtcgacg atctagcgtc gaccagtgga 1860
tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc 1920
actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag gcctgttact agcactcaca 1980
tggaacaaat ggcccagatc cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg 2040
aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 2100
tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgat cagatctgag gaacccctag tgatggagtt 2160
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg 2220
tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 2280
cccccccccc ccccccccct gcattctaga gagctccaat tcgccctata gtgagtcgta 2340
ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 2400
ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 2460
ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaagc 2520
gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 2580
taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 2640
gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 2700
cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 2760
ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 2820
gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 2880
ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 2940
cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 3000
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 3060
tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 3120
gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 3180
gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 3240
ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 3300
acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 3360
ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 3420
aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 3480
gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 3540
tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 3600
gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 3660
cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 3720
atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 3780
attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 3840
ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 3900
gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 3960
tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 4020
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 4080
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 4140
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 4200
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 4260
ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 4320
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 4380
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 4440
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 4500
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 4560
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 4620
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 4680
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 4740
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 4800
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 4860
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 4920
ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 4980
gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 5040
ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 5100
acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aaggccttaa ttagg 5155
<210> 19
<211> 5223
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 19
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgattct 60
aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 120
cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 180
cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 240
ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 300
cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 360
ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 420
tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 480
ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 540
aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt 600
ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc 660
cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 720
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg 780
tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 840
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 900
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 960
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1020
tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga 1080
gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag 1140
gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg 1200
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 1260
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 1320
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 1380
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 1440
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac 1500
tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt 1560
ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 1620
cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 1680
ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 1740
gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga 1800
aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc 1860
cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct 1920
gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgcgtttaaa 1980
ccctgcaggt ctagaaagct tatcgatacc gtcgactaga gctcgctgat cagcctcgac 2040
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 2100
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 2160
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 2220
ggaagacaat agcagggtac aagtaaagcg gccctagcgt ttccggcgac ggtgctagac 2280
tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg 2340
gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 2400
ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aagcaattcg ttgatctgaa 2460
tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt 2520
aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 2580
actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 2640
agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 2700
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 2760
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 2820
aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 2880
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 2940
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 3000
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 3060
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 3120
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 3180
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 3240
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 3300
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 3360
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 3420
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 3480
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 3540
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 3600
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 3660
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 3720
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 3780
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 3840
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 3900
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 3960
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 4020
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 4080
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 4140
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 4200
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 4260
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 4320
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 4380
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4440
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4500
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4560
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 4620
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4680
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 4740
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4800
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4860
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4920
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4980
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 5040
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 5100
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 5160
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 5220
agc 5223
<210> 20
<211> 736
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 20
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 21
<211> 137
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 21
gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc 60
actgactgac agcctgctct cctagcttac aggacacaag gcctgttact agcactcaca 120
taacaaatgg ccctttt 137
<210> 22
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 22
gctcgagtga gcgcagcctg ctagctccat gcttactgta aagccaccag atgggtaagc 60
atggagctag caggcttcgc ctactagttt t 91
<210> 23
<211> 139
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 23
gccuggaggc uugcugaagg cuguaugcug uaagcaugga gcuagcaggc uguuuuggcc 60
acugacugac agccugcucu ccuagcuuac aggacacaag gccuguuacu agcacucaca 120
uggaacaaau ggcccuuuu 139
<210> 24
<211> 91
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 24
gcucgaguga gcgcagccug cuagcuccau gcuuacugua aagccaccag auggguaagc 60
auggagcuag caggcuucgc cuacuaguuu u 91
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 25
uaagcaugga gcuagcaggc u 21
Claims (27)
- (i) 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및
(ii) 각 miRNA가 서열식별번호: 1에 대하여 상보성인 시드 서열을 포함하는 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역
을 포함하는 단리된 핵산. - (i) 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제1 영역; 및
(ii) 각 miRNA가 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 2-10 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 포함하는 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역
을 포함하는 단리된 핵산. - (i) 제1 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 코딩하는 제1 영역; 및
(ii) 각 miRNA가 miRNA 백본 서열이 플랭킹되어 있는 서열식별번호: 1에 제시되어 있는 서열의 적어도 2개 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 연속되는 염기에 대하여 상보성인 서열을 포함하는 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 영역
을 포함하는 단리된 핵산. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 각 miRNA 백본 서열이 mir-155 백본 서열, mir-30 백본 서열 또는 mir-64 백본 서열인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 프로모터를 포함하는 것인 단리된 핵산.
- 제5항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터 또는 U6 프로모터인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 추가적으로 단백질을 코딩하는 것인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 miRNA가 트랜스진의 비번역 부분에 위치하는 것인 단리된 핵산.
- 제7항에 있어서, 비번역 부분이 인트론인 단리된 핵산.
- 제8항에 있어서, 비번역 부분이 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 최종 코돈과 폴리-A 테일 서열 사이, 또는 프로모터 서열의 최종 뉴클레오티드 염기와 폴리-A 테일 서열 사이에 존재하는 것인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전 말단 반복체 (ITR), 또는 그의 변이체를 포함하는 제3 영역을 추가적으로 포함하는 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 변이체에 기능성인 말단 분해 부위 (TRS)가 결핍되어 있으며, 임의적으로 여기서 ITR 변이체는 ΔTRS ITR인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 miRNA가 인간 헌팅틴 (예컨대 서열식별번호: 1)과 혼성화되어 그의 발현을 억제하는 것인 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
- 제14항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산, 또는 제14항 또는 제15항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- (i) 캡시드 단백질; 및
(ii) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산
을 포함하는 재조합 AAV (rAAV). - 제17항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 rAAV.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 캡시드 단백질이 서열식별번호: 20에 제시되어 있는 서열을 포함하는 것인 rAAV.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 자가-상보성 AAV (scAAV)인 rAAV.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 중추신경계 (CNS)에의 전달용으로 제제화되는 rAAV.
- 헌팅톤병에 걸려 있거나 그것이 발병할 위험이 있는 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 헌팅톤병의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 헌팅톤병의 치료 방법.
- 제22항에 있어서, 대상체가 36개를 초과하는 CAG 반복체, 40개를 초과하는 반복체 또는 100개를 초과하는 반복체를 가지는 헌팅틴 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 대상체가 연령 20세 미만인 방법.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 중추신경계 (CNS)에 대한 단리된 핵산 또는 rAAV의 전달을 발생시키는 것인 방법.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 주사, 임의적으로는 정맥내 주사 또는 선조체내 주사를 통하는 것인 방법.
- 서열식별번호: 2-10 또는 21-22 중 어느 하나에 제시되어 있는 서열을 코딩하는 단리된 핵산.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662398487P | 2016-09-22 | 2016-09-22 | |
US62/398,487 | 2016-09-22 | ||
PCT/US2017/052902 WO2018057855A1 (en) | 2016-09-22 | 2017-09-22 | Aav treatment of huntington's disease |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20190053236A true KR20190053236A (ko) | 2019-05-17 |
KR102271675B1 KR102271675B1 (ko) | 2021-07-02 |
Family
ID=61691085
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020197010964A KR102271675B1 (ko) | 2016-09-22 | 2017-09-22 | 헌팅톤병의 aav 치료 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10457940B2 (ko) |
EP (1) | EP3515505A4 (ko) |
JP (3) | JP6884430B2 (ko) |
KR (1) | KR102271675B1 (ko) |
CN (2) | CN117025677A (ko) |
AU (1) | AU2017330411A1 (ko) |
BR (2) | BR112019005548B1 (ko) |
CA (1) | CA3037929A1 (ko) |
CL (1) | CL2019000732A1 (ko) |
CO (1) | CO2019003846A2 (ko) |
IL (2) | IL265528B2 (ko) |
MX (2) | MX2019003376A (ko) |
MY (1) | MY195386A (ko) |
PE (1) | PE20191351A1 (ko) |
PH (1) | PH12019500626A1 (ko) |
RU (1) | RU2749971C2 (ko) |
SA (1) | SA519401379B1 (ko) |
WO (1) | WO2018057855A1 (ko) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10975391B2 (en) | 2014-04-25 | 2021-04-13 | University Of Massachusetts | Recombinant AAV vectors useful for reducing immunity against transgene products |
RU2764587C2 (ru) | 2016-05-18 | 2022-01-18 | Вояджер Терапьютикс, Инк. | Способы и композиции для лечения хореи гентингтона |
US10457940B2 (en) | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
SG11201909868YA (en) * | 2017-05-05 | 2019-11-28 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating huntington's disease |
SG11202009697RA (en) | 2018-03-30 | 2020-10-29 | Univ Geneve | Micro rna expression constructs and uses thereof |
WO2019213128A1 (en) * | 2018-04-30 | 2019-11-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions and therapeutics methods of microrna gene delivery |
WO2019222413A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | University Of Massachusetts | Modified aav constructs and uses thereof |
WO2020112967A1 (en) * | 2018-11-29 | 2020-06-04 | University Of Massachusetts | Modulation of sptlc1 via recombinant adeno-associated vectors |
MX2021008331A (es) * | 2019-01-09 | 2021-08-05 | Univ De Coimbra | Arn bicatenario y usos del mismo. |
EP4051795A1 (en) * | 2019-11-01 | 2022-09-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof |
CN115443339A (zh) * | 2019-12-20 | 2022-12-06 | 阿斯克肋匹奥生物制药公司 | 用于治疗亨廷顿病的方法 |
US20240084323A1 (en) * | 2021-01-13 | 2024-03-14 | Dignity Health | Modulation of chitinase protein expression |
WO2022206819A1 (zh) * | 2021-03-30 | 2022-10-06 | 南京大学 | 一种用于治疗亨廷顿病的rna递送系统 |
CN115487315B (zh) * | 2022-04-20 | 2023-08-04 | 暨南大学 | 治疗亨廷顿病的药物 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016102664A1 (en) * | 2014-12-24 | 2016-06-30 | Uniqure Ip B.V. | Rnai induced huntingtin gene suppression |
JP2017522005A (ja) * | 2014-05-20 | 2017-08-10 | ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション | ハンチントン病の治療化合物 |
Family Cites Families (139)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5549910A (en) | 1989-03-31 | 1996-08-27 | The Regents Of The University Of California | Preparation of liposome and lipid complex compositions |
US5252334A (en) | 1989-09-08 | 1993-10-12 | Cygnus Therapeutic Systems | Solid matrix system for transdermal drug delivery |
JP3218637B2 (ja) | 1990-07-26 | 2001-10-15 | 大正製薬株式会社 | 安定なリポソーム水懸濁液 |
JP2958076B2 (ja) | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
US5399363A (en) | 1991-01-25 | 1995-03-21 | Eastman Kodak Company | Surface modified anticancer nanoparticles |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5543158A (en) | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US5741516A (en) | 1994-06-20 | 1998-04-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US6204059B1 (en) | 1994-06-30 | 2001-03-20 | University Of Pittsburgh | AAV capsid vehicles for molecular transfer |
US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5697899A (en) | 1995-02-07 | 1997-12-16 | Gensia | Feedback controlled drug delivery system |
IE80468B1 (en) | 1995-04-04 | 1998-07-29 | Elan Corp Plc | Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin |
US5738868A (en) | 1995-07-18 | 1998-04-14 | Lipogenics Ltd. | Liposome compositions and kits therefor |
US6001650A (en) | 1995-08-03 | 1999-12-14 | Avigen, Inc. | High-efficiency wild-type-free AAV helper functions |
US5656016A (en) | 1996-03-18 | 1997-08-12 | Abbott Laboratories | Sonophoretic drug delivery system |
US5797898A (en) | 1996-07-02 | 1998-08-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Microchip drug delivery devices |
US5783208A (en) | 1996-07-19 | 1998-07-21 | Theratech, Inc. | Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid |
US5779708A (en) | 1996-08-15 | 1998-07-14 | Cyberdent, Inc. | Intraosseous drug delivery device and method |
WO1998010088A1 (en) | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase |
US6177403B1 (en) | 1996-10-21 | 2001-01-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions, methods, and apparatus for delivery of a macromolecular assembly to an extravascular tissue of an animal |
US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
US6156303A (en) | 1997-06-11 | 2000-12-05 | University Of Washington | Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom |
US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
US6346415B1 (en) | 1997-10-21 | 2002-02-12 | Targeted Genetics Corporation | Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors |
US6953690B1 (en) | 1998-03-20 | 2005-10-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses |
JP4060531B2 (ja) | 1998-05-28 | 2008-03-12 | アメリカ合衆国 | Aav5ベクターおよびその使用 |
US20030110526A1 (en) | 1998-08-25 | 2003-06-12 | Robert H. Brown | Dysferlin mutations |
JP4693244B2 (ja) | 1999-03-18 | 2011-06-01 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法 |
US6498244B1 (en) | 1999-05-28 | 2002-12-24 | Cell Genesys, Inc. | Adeno-associated virus capsid immunologic determinants |
AU7895700A (en) | 1999-10-15 | 2001-04-30 | Dalhousie University | Method and vector for producing and transferring trans-spliced peptides |
US7638120B2 (en) | 2000-03-14 | 2009-12-29 | Thomas Jefferson University | High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type |
WO2002053703A2 (en) | 2001-01-05 | 2002-07-11 | Children's Hospital, Inc. | Aav2 vectors and methods |
US7749492B2 (en) | 2001-01-05 | 2010-07-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | AAV vectors and methods |
US20050032219A1 (en) | 2001-07-03 | 2005-02-10 | Patrick Aubourg | Methods of administering vectors to synaptically connected neurons |
BR0211111A (pt) * | 2001-07-12 | 2004-06-22 | Univ Massachusetts | Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula |
WO2003006616A2 (en) | 2001-07-13 | 2003-01-23 | University Of Iowa Research Foundation | Pseudotyped adeno-associated viruses and uses thereof |
AU2002326589B2 (en) * | 2001-08-07 | 2008-06-05 | University Of Delaware | Compositions and methods for the prevention and treatment of Huntington's disease |
NZ532635A (en) | 2001-11-13 | 2007-05-31 | Univ Pennsylvania | A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method |
JP4769417B2 (ja) | 2001-12-17 | 2011-09-07 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | アデノ随伴ウイルス(aav)血清型9の配列、それを含むベクターおよびその使用 |
US20050137153A1 (en) | 2002-02-20 | 2005-06-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
WO2003089612A2 (en) | 2002-04-17 | 2003-10-30 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | IMPROVED rAAV VECTORS |
AU2003221745A1 (en) | 2002-04-19 | 2003-11-03 | University Of Florida | rAAV VECTOR-BASED COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MAMMALIAN DISEASES |
JP3943048B2 (ja) | 2002-04-29 | 2007-07-11 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 組織の細胞dnaからの組込みウイルスの直接レスキュー及び増幅の方法 |
US20060093589A1 (en) | 2004-02-19 | 2006-05-04 | Warrington Kenneth H | Vp2-modified raav vector compositions and uses therefor |
US20050106731A1 (en) * | 2002-08-05 | 2005-05-19 | Davidson Beverly L. | siRNA-mediated gene silencing with viral vectors |
US20050255086A1 (en) | 2002-08-05 | 2005-11-17 | Davidson Beverly L | Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene |
US20080274989A1 (en) | 2002-08-05 | 2008-11-06 | University Of Iowa Research Foundation | Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof |
US20060206949A1 (en) | 2003-01-28 | 2006-09-14 | Sylvain Arnould | Custom-made meganuclease and use thereof |
US20040219528A1 (en) | 2003-04-15 | 2004-11-04 | Morris David W. | Novel therapeutic targets in cancer |
US7387896B2 (en) | 2003-03-26 | 2008-06-17 | The Regents Of The University Of Michigan | MicroRNA vectors |
US20060228800A1 (en) | 2003-05-15 | 2006-10-12 | Shi-Lung Lin | Novel Transgenic Methods Using intronic RNA |
EP3502252B1 (en) | 2003-06-02 | 2023-04-05 | University of Massachusetts | Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing |
US8680063B2 (en) * | 2003-09-12 | 2014-03-25 | University Of Massachusetts | RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders |
ES2648241T3 (es) * | 2003-09-30 | 2017-12-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos |
EP2363483A3 (en) | 2004-03-05 | 2014-07-16 | Benitec, Inc. | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of RNAi agents |
WO2005096781A2 (en) | 2004-04-06 | 2005-10-20 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using rna interference |
WO2005116224A2 (en) | 2004-05-18 | 2005-12-08 | Children's Memorial Hospital | Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system |
US7427396B2 (en) | 2004-06-03 | 2008-09-23 | Genzyme Corporation | AAV vectors for gene delivery to the lung |
CA2591544A1 (en) | 2004-12-15 | 2006-06-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Chimeric vectors |
WO2006104913A2 (en) | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Medtronic, Inc. | USE OF ANTI-TNF OR ANTI-ILl RNAI TO SUPPRESS PRO- INFLAMMATORY CYTOKINE ACTIONS LOCALLY TO TREAT PAIN |
ES2525067T3 (es) | 2005-04-07 | 2014-12-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de incremento de la función de un vector de AAV |
WO2006119432A2 (en) | 2005-04-29 | 2006-11-09 | The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services | Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes |
KR20130114758A (ko) | 2005-05-27 | 2013-10-17 | 오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘. | Mi-rna를 포함하는 유전자 벡터 |
US20070213292A1 (en) | 2005-08-10 | 2007-09-13 | The Rockefeller University | Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof |
ATE494372T1 (de) | 2005-08-29 | 2011-01-15 | Regulus Therapeutics Inc | Verfahren für mir-122a-modulation |
EP2487257B1 (en) | 2006-01-05 | 2015-07-01 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers |
EP1979485A2 (en) | 2006-01-31 | 2008-10-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same |
EP2495327B1 (en) | 2006-03-03 | 2016-09-28 | ProMIS Neurosciences Inc. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases |
WO2007120542A2 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Aav capsid library and aav capsid proteins |
US20080199961A1 (en) * | 2006-08-25 | 2008-08-21 | Avi Biopharma, Inc. | ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS |
DK2094086T3 (da) | 2006-11-08 | 2013-11-25 | Veritas Bio LLC | Indgivelse in vivo af dobbeltstrenget rna til en målcelle |
PL2191001T3 (pl) | 2007-04-09 | 2017-01-31 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Kompozycje wektora RAAV mające białka kapsydu zmodyfikowane tyrozyną i sposoby ich zastosowania |
WO2008125846A2 (en) | 2007-04-12 | 2008-10-23 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth | Genetic suppression and replacement |
WO2008137862A2 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods of using mir34 as a biomarker for tp53 functional status |
JP5637533B2 (ja) | 2007-05-23 | 2014-12-10 | ジーイー ヘルスケア ダーマコン,インク. | マイクロ−rnaスキャホールドおよび非天然存在型マイクロ−rna |
DK2164967T3 (en) | 2007-05-31 | 2015-10-19 | Univ Iowa Res Found | Reduction of off-target rna interferenstoksicitet |
EP2058401A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
US9090894B2 (en) | 2007-12-17 | 2015-07-28 | California Institute Of Technology | Modulating immune system development and function through microRNA MIR-146 |
US20090215879A1 (en) | 2008-02-26 | 2009-08-27 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for adeno-associated virus (aav) with hi loop mutations |
US8404659B2 (en) | 2008-03-07 | 2013-03-26 | Santaris Pharma A/S | Pharmaceutical compositions for treatment of MicroRNA related diseases |
WO2009146178A1 (en) | 2008-04-15 | 2009-12-03 | President And Fellows Of Harvard College | Angiogenin and amyotrophic lateral sclerosis |
US9217155B2 (en) | 2008-05-28 | 2015-12-22 | University Of Massachusetts | Isolation of novel AAV'S and uses thereof |
US8222221B2 (en) | 2008-06-04 | 2012-07-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation of gene expression through endogenous small RNA targeting of gene promoters |
EP2297185A1 (en) | 2008-06-17 | 2011-03-23 | Amsterdam Molecular Therapeutics (AMT) B.V. | Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region |
WO2010005850A1 (en) | 2008-07-08 | 2010-01-14 | The J. David Gladstone Institutes | Methods and compositions for modulating angiogenesis |
AU2009288657A1 (en) | 2008-09-04 | 2010-03-11 | Galenea Corp. | Synaptic vesicle cycling assays and systems |
WO2010034314A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Aarhus Universitet | Retroviral delivery of synthectic gene cassettes |
WO2010071454A1 (en) | 2008-12-17 | 2010-06-24 | Auckland Uniservices Limited | Adeno-associated viral vectors and uses thereof |
US20110305772A1 (en) | 2009-02-26 | 2011-12-15 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for ex vivo hepatic nucleic acid delivery |
ES2786039T3 (es) * | 2009-04-30 | 2020-10-08 | Ospedale San Raffaele Srl | Vector génico |
WO2010129021A1 (en) | 2009-05-02 | 2010-11-11 | Genzyme Corporation | Gene therapy for neurodegenerative disorders |
US8734809B2 (en) * | 2009-05-28 | 2014-05-27 | University Of Massachusetts | AAV's and uses thereof |
EP2261242A1 (en) | 2009-06-10 | 2010-12-15 | Universite Catholique De Louvain | Aspartate-N-acetyltransferase enzyme, diagnostic method and therapeutic method |
HUE033113T2 (en) * | 2009-09-11 | 2017-11-28 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Modifying Huntingtin expression |
US20120270930A1 (en) | 2009-10-29 | 2012-10-25 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Methods and compositions for dysferlin exon-skipping |
EP2498825B1 (en) | 2009-11-09 | 2017-03-29 | Genepod Therapeutics Ab | Novel viral vector construct for neuron specific continuous dopa synthesis in vivo |
CN102741405B (zh) | 2009-11-19 | 2015-03-04 | 国立大学法人冈山大学 | 提高基因表达的系统和保持有该系统的载体 |
WO2011088081A1 (en) | 2010-01-12 | 2011-07-21 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors |
CN105838737A (zh) | 2010-01-28 | 2016-08-10 | 费城儿童医院 | 用于病毒载体纯化的可扩缩生产平台和用于基因治疗中的如此纯化的病毒载体 |
CA2791974A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Nucleic acids for targeting multiple regions of the hcv genome |
WO2011133901A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Aav-based treatment of cholesterol-related disorders |
WO2011133874A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Multicistronic expression constructs |
DK2826860T3 (en) | 2010-04-23 | 2018-12-03 | Univ Massachusetts | CNS targeting AAV vectors and methods for their use |
US8785413B2 (en) | 2010-09-27 | 2014-07-22 | Florida Atlantic University Research Corporation | Materials and methods for the treatment of pathological neovascularization in the eye |
EP2673286B1 (en) | 2011-02-12 | 2019-07-03 | University of Iowa Research Foundation | Therapeutic compounds |
BR112013020734A2 (pt) | 2011-02-17 | 2017-06-13 | Univ Pennsylvania | composições e métodos para alterar a especificidade do tecido e aprimorar a transferência gênica mediada por aav9 |
EP2500434A1 (en) | 2011-03-12 | 2012-09-19 | Association Institut de Myologie | Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery |
EP2699258A4 (en) | 2011-04-15 | 2014-10-29 | Us Sec Dep Of Health And Human Services | TRANSFER OF AAV-MEDIATED CTLA-4 GENE TO TREAT THE SJÖGREN SYNDROME |
EP3318635A1 (en) | 2011-04-21 | 2018-05-09 | University of Massachusetts | Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies |
US8609088B2 (en) | 2011-05-10 | 2013-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Intranasal delivery of therapeutic enzymes to the central nervous system for the treatment of lysosomal storage diseases |
EP3170899B1 (en) | 2011-10-11 | 2020-06-24 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Microrna mir-155 in neurodegenerative disorders |
US20130142861A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-06 | National Yang Ming University | Compositions And Method For Detecting And Treating Abnormal Liver Homeostasis And Hepatocarcinogenesis |
CA2864879C (en) | 2012-02-17 | 2021-07-20 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues |
JP6385920B2 (ja) | 2012-05-09 | 2018-09-05 | オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー | アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター |
JP6417322B2 (ja) | 2012-06-21 | 2018-11-07 | アソシアシオン・アンスティテュ・ドゥ・ミオロジーAssociation Institut De Myologie | 遺伝子治療ベクターの広範な遺伝子送達 |
US20140066595A1 (en) * | 2012-09-04 | 2014-03-06 | Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. | Modulators of Protein Production in a Human Cell Line and Cell-free Extracts Produced Therefrom |
ES2658401T3 (es) | 2012-12-12 | 2018-03-09 | The Broad Institute, Inc. | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas |
WO2014110552A1 (en) | 2013-01-14 | 2014-07-17 | Recombinetics, Inc. | Hornless livestock |
AU2014244167A1 (en) | 2013-03-13 | 2015-10-08 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof |
CA2904396A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for dual glycan binding aav vectors |
ES2704677T3 (es) | 2013-04-18 | 2019-03-19 | Fond Telethon | Suministro eficaz de genes grandes por vectores de AAV duales |
WO2014186746A1 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | HAIRPIN mRNA ELEMENTS AND METHODS FOR THE REGULATION OF PROTEIN TRANSLATION |
EP3417880A1 (en) | 2013-06-05 | 2018-12-26 | Duke University | Rna-guided gene editing and gene regulation |
KR20160030187A (ko) | 2013-06-17 | 2016-03-16 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 간의 표적화 및 치료를 위한 CRISPRCas 시스템, 벡터 및 조성물의 전달 및 용도 |
US10155794B2 (en) | 2013-07-16 | 2018-12-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment of disorders related to CEP290 |
CN105980569A (zh) | 2013-08-05 | 2016-09-28 | 莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院 | 重组aav-crumbs同源物组合物及治疗lca-8和进行性rp的方法 |
HRP20230015T1 (hr) | 2013-08-27 | 2023-02-17 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Proizvodi i postupci liječenja amiotrofične lateralne skleroze |
BR112016010175A2 (pt) * | 2013-11-11 | 2017-10-03 | Sangamo Biosciences Inc | Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica |
GB201401707D0 (en) | 2014-01-31 | 2014-03-19 | Sec Dep For Health The | Adeno-associated viral vectors |
GB201403684D0 (en) | 2014-03-03 | 2014-04-16 | King S College London | Vector |
WO2015150922A2 (en) | 2014-03-17 | 2015-10-08 | The Hospital For Sick Children | β-HEXOSAMINIDASE PROTEIN VARIANTS AND ASSOCIATED METHODS FOR TREATING GM2 GANGLIOSIDOSES |
EP3750907A3 (en) | 2014-03-18 | 2021-04-28 | University of Massachusetts | Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
US10975391B2 (en) | 2014-04-25 | 2021-04-13 | University Of Massachusetts | Recombinant AAV vectors useful for reducing immunity against transgene products |
HUE054768T2 (hu) | 2014-05-02 | 2021-09-28 | Genzyme Corp | AAV vektorok retina és CNS génterápiára |
CN107073051B (zh) | 2014-10-21 | 2021-08-24 | 马萨诸塞大学 | 重组aav变体及其用途 |
CA2980337A1 (en) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | University Of Massachusetts | Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mrna |
US20190000940A1 (en) | 2015-07-31 | 2019-01-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of aadc deficiency |
US10457940B2 (en) | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
-
2017
- 2017-09-15 US US15/705,909 patent/US10457940B2/en active Active
- 2017-09-22 BR BR112019005548-7A patent/BR112019005548B1/pt active IP Right Grant
- 2017-09-22 MX MX2019003376A patent/MX2019003376A/es unknown
- 2017-09-22 IL IL265528A patent/IL265528B2/en unknown
- 2017-09-22 IL IL308514A patent/IL308514A/en unknown
- 2017-09-22 CN CN202311001472.4A patent/CN117025677A/zh active Pending
- 2017-09-22 KR KR1020197010964A patent/KR102271675B1/ko active IP Right Grant
- 2017-09-22 CA CA3037929A patent/CA3037929A1/en active Pending
- 2017-09-22 PE PE2019000712A patent/PE20191351A1/es unknown
- 2017-09-22 CN CN201780072293.6A patent/CN110035776B/zh active Active
- 2017-09-22 WO PCT/US2017/052902 patent/WO2018057855A1/en active Application Filing
- 2017-09-22 RU RU2019111648A patent/RU2749971C2/ru active
- 2017-09-22 MY MYPI2019001524A patent/MY195386A/en unknown
- 2017-09-22 JP JP2019515997A patent/JP6884430B2/ja active Active
- 2017-09-22 AU AU2017330411A patent/AU2017330411A1/en active Pending
- 2017-09-22 BR BR122020019033-7A patent/BR122020019033B1/pt active IP Right Grant
- 2017-09-22 EP EP17853966.4A patent/EP3515505A4/en active Pending
-
2019
- 2019-03-21 CL CL2019000732A patent/CL2019000732A1/es unknown
- 2019-03-21 SA SA519401379A patent/SA519401379B1/ar unknown
- 2019-03-22 PH PH12019500626A patent/PH12019500626A1/en unknown
- 2019-03-22 MX MX2022013356A patent/MX2022013356A/es unknown
- 2019-04-15 CO CONC2019/0003846A patent/CO2019003846A2/es unknown
- 2019-09-17 US US16/573,412 patent/US11046957B2/en active Active
-
2021
- 2021-04-30 JP JP2021077175A patent/JP7205933B2/ja active Active
- 2021-05-21 US US17/326,400 patent/US11773392B2/en active Active
-
2022
- 2022-12-22 JP JP2022205188A patent/JP2023052024A/ja active Pending
-
2023
- 2023-08-17 US US18/451,147 patent/US20240084303A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017522005A (ja) * | 2014-05-20 | 2017-08-10 | ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション | ハンチントン病の治療化合物 |
WO2016102664A1 (en) * | 2014-12-24 | 2016-06-30 | Uniqure Ip B.V. | Rnai induced huntingtin gene suppression |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102271675B1 (ko) | 헌팅톤병의 aav 치료 | |
CN108753824B (zh) | 用于治疗视网膜营养不良的病毒载体 | |
CN113271955A (zh) | 用于细胞介导的溶瘤病毒疗法的增强的系统 | |
KR20180105709A (ko) | 중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 t 세포의 투여 | |
KR20190135000A (ko) | Aav 벡터를 기반으로 하는 인플루엔자 백신 | |
AU2016343979A1 (en) | Delivery of central nervous system targeting polynucleotides | |
CN107635575A (zh) | 重组glut1腺相关病毒载体构建体以及用于恢复glut1表达的相关方法 | |
KR20210092755A (ko) | 신경원성 세로이드 리포푸신증에 대한 유전자 요법 | |
CN107466325A (zh) | 多重载体系统及其应用 | |
KR20200023280A (ko) | 신경 세로이드 지질갈색소증에 대한 유전자 요법 | |
US20220193262A1 (en) | High efficiency gene delivery system | |
CN115666722A (zh) | 包封的rna复制子和使用方法 | |
CN115768890A (zh) | 通过分子和物理启动对t细胞免疫疗法的热控制 | |
KR20210151785A (ko) | 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도 | |
CN117642173A (zh) | 用于诱导对基因递送靶媒剂的免疫耐受性的方法和试剂盒 | |
KR20220139344A (ko) | 신경변성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
RU2812852C2 (ru) | Невирусные днк-векторы и варианты их применения для экспрессии терапевтического средства на основе фактора viii (fviii) | |
US20240091380A1 (en) | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses | |
CN117836420A (zh) | 重组tert编码病毒基因组和运载体 | |
KR20230083287A (ko) | Cln2 질환의 안구 징후에 대한 유전자 요법 | |
WO2023177885A2 (en) | Therapeutic adeno-associated virus using codon optimized nucleic acid encoding alpha-glucosidase (gaa) for treating pompe disease, with signal peptide modifications | |
TW202227634A (zh) | 表現γ—肌聚醣之腺相關病毒載體之全身性遞送及肌肉失養症之治療 | |
CN116801912A (zh) | 表达载体组合物 | |
CN112111519A (zh) | Nd4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用 | |
CN112111517A (zh) | Nd4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
A302 | Request for accelerated examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right |