CN102939377B - 使用锌指核酸酶对Rosa位点进行基因组编辑 - Google Patents
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Abstract
本文公开了使用融合蛋白质来对Rosa位点进行基因组编辑的方法以及组合物，所述融合蛋白质包含锌指蛋白和裂解功能域或裂解半功能域。本文还提供了编码所述融合蛋白质的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白质的细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年4月26号提交的美国临时申请号61/343,287的权益，该临时申请的公开内容以引用的方式全部并入本文。
在联邦资助研究下完成的发明的权利声明
不适用。
技术领域
本发明公开内容处于基因组工程领域，该公开内容包括体细胞基因和遗传基因插入/中断、基因组变化、产生携带随机突变的等位基因和/或插入转基因至Rosa位点。
背景
Rosa基因产物同时普遍地在发育的所有阶段中表达。因此，这种位点已经广泛用于从内源或引入的启动子中表达内源序列，并且用于产生转基因小鼠，例如从胚胎干细胞中。参见，例如Strathdee等(2006)PLoSONE，第1期，第4版；Nyabi等(2009)Nucl.Acids.Res.37：e55。
然而，靶向插入的传统方法可能需要复杂的靶载体组件。因此，存在对靶向插入和/或用靶向方式修饰Rosa基因方法的需求。基因组位点的精确靶向位点特异裂解为传统同源重组提供了有效补充和/或替代。双链断裂(DSB)的产生使靶向位点的同源重组次数增加了大于1000倍。更简单地说，通过非同源末端连接(NHEJ)实现的位点特异DSB不精确修复也可以导致基因中断。两种这样DSB的产生导致缺失任意大的区。锌指蛋白的模块DNA识别优先性使得合理设计位点特异的多指DNA结合蛋白。将II型限制性内切酶FokI功能域的核酸酶融合至位点特异的锌指蛋白使得产生位点特异的核酸酶。参见，例如，美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；20070134796；2008015164；20080131962；2008015996以及国际公布WO07/014275和2008/133938，这些专利皆描述了锌指核酸酶的用途，并且为了所有目的将这些专利以引用的方式全部并入。
概述
本文公开的是用于靶向插入Rosa基因位点的组合物以及方法。本文描述的组合物以及方法可以用于基因组编辑，包括但不限于：在动物细胞中裂解一种或多种基因导致一种或多种基因中靶向变化(插入、缺失和/或取代突变)，包括将这些靶向变化并入种系；靶向引入非内源核酸序列，使动物体内一种或多种基因部分或完全失活；诱导同源导向修复的方法，产生转基因动物(例如，啮齿类动物)和/或产生编码动物基因崭新等位基因形式的随机突变。
在一方面，本文描述的是锌指蛋白(ZFP)，该锌指蛋白结合至基因组(例如，啮齿类动物基因组)中Rosa基因中的靶位点，其中ZFP包括一个或多个改造的锌指结合功能域。在一个实施方案中，ZFP是裂解目标靶基因组区域的锌指核酸酶(ZFN)，其中ZFN包括一个或多个改造的锌指结合功能域和核酸酶裂解功能域或裂解半功能域。裂解功能域和裂解半功能域可以例如从各种限制性内切核酸酶和/或寻靶内切核酸酶中获得。在一个实施方案中，裂解半功能域从IIS型限制性内切核酸酶(例如，FokI)中得到。在某些实施方案中，锌指功能域可识别Rosa基因中的靶位点，例如Rosa26。
ZFN可以在基因编码区内或基因内部或其附近的非编码序列(如，例如，前导序列、尾随序列或内含子)中，或在编码区上游或下游的非转录区内结合至和/或裂解Rosa基因。
在另一方面，本文描述的是包括一种或多种本文描述的锌指核酸酶的组合物。在某些实施方案中，组合物包括一种或多种锌指核酸酶与药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本文描述的是多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种本文描述的ZFN。多核苷酸可以是例如mRNA。
在另一方面，本文描述的是ZFN表达载体，该表达载体包含可操作地与启动子连接的多核苷酸，该多核苷酸编码一种或多种本文描述的ZFN。
在另一方面，本文描述的是宿主细胞，该宿主细胞包括一种或多种如本文所描述的ZFN表达载体。宿主细胞可以是与一种或多种ZFP表达载体稳定转化或瞬间转染或其组合。在一个实施方案中，宿主细胞是胚胎干细胞。在其它实施方案中，一种或多种ZFP表达载体在宿主细胞中表达一种或多种ZFN。在另一个实施方案中，宿主细胞可以进一步包括外源多核苷酸供体序列。在任何的实施方案中，本文描述的宿主细胞可以包括胚胎细胞，例如一种或多种小鼠、大鼠、兔或其它哺乳动物细胞胚胎。
在另一方面，本文描述的是一种用于在细胞中裂解一种或多种Rosa基因的方法，所述方法包括：(a)将编码结合至一种或多种基因中的靶位点的一种或多种ZFN的一种或多种多核苷酸在使得ZFN得以表达并且一种或多种基因得以裂解的条件下引入细胞中。
在又一方面，本文描述的是一种用于将外源序列引入细胞基因组中的方法，该方法包括以下步骤：(a)将编码结合至Rosa基因中的靶位点的一种或多种ZFN的一种或多种多核苷酸在使得ZFN得以表达并且一种或多种基因得以裂解的条件下引入细胞中；以及(b)将细胞与外源多核苷酸接触；这样使得裂解基因刺激通过同源重组来将外源多核苷酸整合至基因组中。在某些实施方案中，将外源多核苷酸物理整合至基因组中。在其它实施方案中，通过由核酸复制过程(例如，双链断裂的同源导向修复)来将外源序列复制在宿主细胞基因组中，从而实现外源多核苷酸整合至基因组中。在其它的实施方案中，通过非同源依赖性靶向整合(例如“末端捕获”)来发生基因组整合。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶是IIS型限制性内切核酸酶裂解功能域与改造的锌指结合功能域之间的融合。在某些实施方案中，将外源序列整合至小的哺乳动物(例如兔或啮齿类动物如小鼠、大鼠等)Rosa基因中。
在另一个实施方案中，本文描述的是一种修饰细胞基因组中的一种或多种Rosa基因序列的方法，所述方法包括(a)提供含有一种或多种Rosa序列的细胞；以及(b)在细胞中表达第一和第二锌指核酸酶(ZFN)，其中第一ZFN在第一裂解位点裂解，并且第二ZFN在第二裂解位点裂解，其中基因序列位于第一裂解位点与第二裂解位点之间，其中第一和第二裂解位点的裂解导致通过非同源末端连接和/或同源导向修复来进行基因序列修饰。任选地，裂解导致也引入至细胞中的外源序列(转基因)插入。在其它实施方案中，非外源末端连接导致第一与第二裂解位点之间的缺失。基因序列缺失的大小通过第一与第二裂解位点之间的距离来确定。相对应地，可以获得任何感兴趣基因组区域中任何大小的缺失。可以获得25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个核苷酸对或在这个范围内的任何整数值核苷酸对的缺失。另外使用本文公开的方法以及组合物可以获得大于1,000个核苷酸对的任何整数值核苷酸对的序列缺失。
如本文所描述的修饰内源Rosa基因的方法可以用来产生动物(例如，人)疾病模型，例如通过将基因失活(部分地或完全地)或通过在定义的基因位置产生随机突变，该定义的基因位置允许辨别或选择转基因动物(例如，大鼠、兔或小鼠)，该转基因动物携带这些基因的新等位形式，通过插入人化的基因(非限制性地举例来说用于研究药物代谢)或通过插入目标突变等位基因来分析，例如，这种等位基因的表型影响。
在又一方面，本文描述的是用于一种或多种靶Rosa基因种系中断的方法，所述方法包括通过本文描述的任何方法来修饰胚胎的一种或多种细胞的基因组中一种或多种Rosa序列，其中修饰的基因序列存在于性成熟动物配子的至少一部分中。在某些实施方案中，动物是小的哺乳动物，如啮齿类动物或兔。
在另一方面，本文描述的是一种在目标至少一个Rosa位点中产生一种或多种遗传突变等位基因的方法，所述方法包括通过本文描述的任何方法来修饰动物胚胎的一种或多种细胞的基因组中的一种或多种Rosa位点；将胚胎培养至性成熟；以及使性成熟动物产生后代；其中至少一些后代包括突变等位基因。在某些实施方案中，动物是小的哺乳动物，例如兔或啮齿类动物如大鼠、小鼠或豚鼠。
在本文描述的任何方法中，编码锌指核酸酶的多核苷酸可以包括DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中，多核苷酸包括质粒。在其它实施方案中，编码核酸酶的多核苷酸包括mRNA。
在又一方面，本文提供的是一种用于将核酸序列位点特异整合至染色体Rosa位点的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)给胚胎注入(i)至少一种DNA载体，其中DNA载体包括位于待整合的核酸序列侧面的上游序列和下游序列，以及(ii)至少一种编码锌指核酸酶的RNA分子，该锌指核酸酶可识别Rosa位点中的整合位点，以及(b)培养胚胎以使锌指核酸酶表达，其中通过经由DNA载体进行的同源重组来修复通过锌指核酸酶引入至整合位点的双链断裂，以便将核酸序列整合至染色体。
适合的胚胎可以从数种不同的脊椎动物物种中得到，包括哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物以及鱼类。总体来说，适合的胚胎是可以加以收集、注入以及培养以便使锌指核酸酶表达的胚胎。在一些实施方案中，适合的胚胎可以包括来自小的哺乳动物(例如，啮齿类动物、兔等)、伴侣动物、家畜以及灵长类动物的胚胎。啮齿类动物的非限制性实例可以包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠以及豚鼠。伴侣动物的非限制性实例可以包括猫、犬、兔、刺猬以及雪貂。家畜的非限制性实例可以包括马、山羊、绵羊、猪、驼羊、羊驼以及牛。灵长类动物的非限制性实例可以包括卷尾猴、黑猩猩、狐猴、猕猴、绒猴、绢毛猴、蜘蛛猴、松鼠猴以及黑长尾猴。在其它实施方案中，适合的胚胎可以包括来自鱼、爬行动物、两栖动物或鸟的胚胎。可替代地，适合的胚胎可以是昆虫胚胎，例如，果蝇胚胎或蚊子胚胎。
也提供了包括至少一种DNA载体的胚胎，其中DNA载体包括位于待整合核酸序列侧面的上游序列和下游序列，以及至少一种编码锌指核酸酶的RNA分子，该锌指核酸酶可识别整合的染色体位点。也提供了从如本文所描述的任何胚胎中得到的有机体。
也提供了包括本发明ZFP的试剂盒。试剂盒可以包括编码ZFP的核酸(例如包含在适合表达载体中RNA分子或ZFP编码基因)、供体分子、适合的宿主细胞系、用于实施本发明方法的说明书等。
附图简述
图1描绘DNA印迹，该DNA印迹证明了如通过SurveyorTM(转基因组的)错配分析所分析的大鼠rosa26位点裂解后的NHEJ修复结果。“G”指示细胞用GFPZFN转染的反应，并且已编号的泳道指示特异ZFN对。箭头指示已经发生NHEJ的泳道。
图2描绘Rosa靶向的供体核苷酸插入小鼠基因组DNA中。
详述
本文描述的是用于在(例如，小的哺乳动物如小鼠、大鼠或兔)体内进行基因组编辑(例如，基因裂解；基因变化，例如通过裂解后插入(物理插入或通过由同源导向修复复制来插入)外源序列和/或裂解后非同源末端连接(NHEJ)来实现；将一种或多种基因部分或完全失活；产生具有随机突变的等位基因以引起内源基因的变化表达等)以及使引入种系中的基因组发生变化的组合物以及方法。也公开了制造以及使用这些组合物(试剂)例如用于编辑(改变)靶动物(例如，小的哺乳动物)细胞中一种或多种基因的方法。因此，本文描述的方法以及组合物提供了用于靶向基因改变(例如，敲入)和/或敲除(部分的或完全的)一种或多种基因和/或用于任何靶等位基因序列随机化突变，并且因此使得可产生人类疾病动物模型的高效方法。
本文描述的组合物以及方法提供了动物体内内源位点的快速、完全以及永久的靶向中断，而无需劳动密集的选择和/或筛选，并且具有最小的脱靶效应。也可以通过注入ZFNmRNA或ZFN表达框架来一步容易地产生整个动物基因敲除。
总述
除非另外指示，否则这些方法的实施以及本文公开的组合物的制备和用途将使用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA以及本领域技术内的相关领域中的传统技术。这些技术在文献中得以充分说明。参见，例如Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989以及第三版，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987以及定期更新；METHODSINENZYMOLOGY丛书，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，第三版，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman以及A.P.Wolffe编)，AcademicPress，SanDiego，1999；以及METHODSINMOLECULARBIOLOGY，第119卷，“ChromatinProtocols”(P.B.Becker编)HumanaPress，Totowa，1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”可交换使用，并且指的是呈直链或环状构象，以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。对本公开内容来说，这些术语不应理解为限制聚合物的长度。术语可以包含天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分(例如，硫代磷酸主链)中修饰的核苷酸。通常，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基成对特异性；即A的类似物将会与T碱基成对。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一种或多种氨基酸是对应的自然出现氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”指的是大分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)序列特异、非共价相互作用。不是所有的结合相互作用组分都需要序列特异(例如，与DNA主链中磷酸盐残基接触)，只要相互作用总体上是序列特异即可。这种相互作用通常特征在于10-6M-1或更低的分解常数(Kd)。“亲和力”指的是结合的强度：增加的结合亲和力与较低Kd有关。
“结合蛋白”是能够非共价结合另一分子的蛋白质。结合蛋白可以结合至例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。就蛋白质结合蛋白来说，它可以结合至其自身(以形成同源二聚体、同源三聚体等)和/或它可以结合至不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。举例来说，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合以及蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合功能域)是通过一个或多个锌指以序列特异的方式结合DNA的蛋白质，或较大蛋白质内的一个功能域，所述一个或多个锌指是结合功能域内的氨基酸序列区，该序列区的结构通过锌离子配位作用来稳定。术语锌指DNA结合蛋白经常缩写为锌指蛋白或ZFP。
锌指结合域可以是“改造的”以结合至预先确定的核苷酸序列上。用于改造的锌指蛋白方法的非限制性实例是设计以及选择。设计的锌指蛋白是不会出现在自然中的蛋白质，该蛋白质的设计/组成主要是合理标准的结果。用于设计的合理标准包括取代规则以及用于处理数据库信息的计算算法的应用，该数据库存储了现有ZFP设计和结合数据的信息。参见，例如美国专利6,140,081；6,453,242；以及6,534,261；也参见WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536以及WO03/016496。
“选择的”锌指蛋白是没有在自然中发现的蛋白质，该蛋白质的制造主要是经验过程的结果，如噬菌体展示、相互捕获或杂种选择。参见例如US5,789,538；US5,925,523；US6,007,988；US6,013,453；US6,200,759；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970WO01/88197以及WO02/099084。
术语“序列”指的是任何长度的核苷酸序列，该核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是直链的、环状的或支链的，以及可以是单链或双链的。术语“供体序列”指的是插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任何长度，例如2与10,000个核苷酸之间的长度(或任何在其间或其上的整数值)，优选地约100与1,000个核苷酸之间的长度(或任何在其间的整数值)，更优选地约200与500个核苷酸之间的长度。
“同源、不相同的序列”指的是与第二序列共有一定程度的序列相同性，但是其序列不同于第二序列的第一序列。举例来说，包含突变基因野生型序列的多核苷酸与突变基因序列是同源的，并且是不同的。在某些实施方案中，，两个序列之间的同源程度足以使得利用标准的细胞机理在其间产生同源重组。两个同源不相同的序列可以是任何长度，并且它们的非同源程度可以小至单个核苷酸(例如，通过靶向同源重组用于校正基因组点突变)或大至10个或更多千碱基(例如，用于在染色体中预先确定的异位位点中插入基因)。两个包括同源不相同序列的多核苷酸不需要是相同的长度。举例来说，可以使用20与10,000个核苷酸或核苷酸对之间的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。
用于测定核酸和氨基酸序列相同性的技术在本领域是已知的。通常，这类技术包括测定用于基因的mRNA核苷酸序列和/或测定因此编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。基因组序列也可以用这个方式测定和比较。通常，相同性分别指的是两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定它们的相同性百分比来比较。不论核酸或氨基酸序列，两个序列的相同性百分比是两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度并且乘以100。
可替代地，多核苷酸之间的序列相似程度可以通过以下步骤来测定：在允许同源区之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，接着用单链特异核酸酶酶切，并且确定酶切片段大小。当如使用上述方法所测定，序列在所定义的分子长度上展现至少约70%至75%，优选地80%至82%，更优选地85%至90%，甚至更优选地92%，还更优选地95%以及最优选地98%序列相同性时，两个核酸或两个多核苷酸序列彼此是大致同源的。如本文所使用，大致同源也指展示与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。大致同源的DNA序列可以在例如如对于该具体系统所定义的严格条件下，在Southern杂交实验中识别。定义适当的杂交条件处于本领域技术内。参见，例如Sambrook等，上文；NucleicAcidHybridization：A PracticalApproach，B.D.Hames以及S.J.Higgins编，(1985)Oxford；Washington，DC；IRLPress)。
两个核酸片段的选择性杂交可以如下测得。两个核酸分子之间的序列相同程度影响这些分子之间杂交结果的效率和强度。部分相同的核酸序列将至少部分地抑制完全相同序列与靶分子的杂交。完全相同序列的杂交抑制可以使用杂交实验来评价，该杂交实验在本领域是众所周知的(例如，Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，(1989)ColdSpringHarbor，N.Y.)。这些实验可以使用不同程度的选择性来进行，例如，使用从低至高严格性变化的条件。如果采用低严格性的条件，非特异结合的缺少可以使用二级探针来评价，该二级探针甚至缺乏部分程度的序列相同性(例如，具有与靶分子小于约30%的序列相同性)，这样使得在缺少非特异结合的情况下，二级探针将不会与靶杂交。
当利用基于杂交的检测系统时，选择与参考核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择探针和参考序列会选择性地彼此杂交或结合以形成双链分子的适当条件。能够在适度严格杂交条件下与参考序列选择性杂交的核酸分子通常在允许检测至少约10至14个核苷酸长度的靶核酸序列的条件下杂交，该核酸序列具有与所选择的核酸探针的序列至少近似70%的序列相同性。严格的杂交条件通常允许检测至少约10至14个核苷酸长度的靶核酸序列，该核酸序列具有与所选择的核酸探针高于约90%至95%的序列相同性。适用于探针/参考序列杂交的杂交条件(在该条件下探针和参考序列具有特定程度的序列相同性)可以如本领域所知的来测定(参见，例如NucleicAcidHybridization：APracticalApproach，B.D.Hames以及S.J.Higgins编，(1985)Oxford；Washington，DC；IRLPress)。
用于杂交的条件是本领域技术人员众所周知的。杂交严格性指的是杂交条件不利于形成含有不匹配核苷酸的杂种的程度，较高的严格性与对于不匹配杂种的较低耐受性有关。影响杂交严格性的因素是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于温度、pH、离子强度以及有机溶剂(例如甲酰胺和二甲基亚砜)的浓度。如本领域技术人员所知的，杂交严格性通过较高温度、较低离子强度以及较低溶剂浓度而增加。
相对于杂交的严格性条件，本领域已知可以通过改变例如以下因素来采用许多等价的条件以确立具体的严格性：序列长度和性质、各种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液组分的浓度、在杂交溶液中存在或不存在封端剂(例如，葡聚糖硫酸酯和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数，以及改变洗涤条件。一组杂交条件的选择是依据本领域标准的方法选择的(参见，例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，(1989)ColdSpringHarbor，N.Y.)。
“重组”指的是两个多核苷酸之间基因信息交换的过程。对本公开内容来说，“同源重组(HR)”指的是这种交换的特定形式，该交换发生在例如经由同源导向修复机理所进行的细胞中双链断裂修复期间。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子以成为“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的修复模板，并且这个过程被不同地称为“无交叉基因转变”或“短序列基因转变”，因为它导致基因信息从供体向靶传递。不希望被任何具体理论束缚，这种传递可以涉及在断裂的靶和供体之间形成的异源双链体DNA的不匹配校正，和/或“取决于合成的链粘合”，在该粘合中供体用来重新合成将成为靶一部分的基因信息，和/或相关的过程。这种特定的HR经常导致靶分子序列的变化，这样使得供体多核苷酸的部分或所有序列并入靶多核苷酸中。
在本公开内容的方法中，如本文所描述的一种或多种靶向核酸酶可在预先确定的位点中，在靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂，并且与断裂区中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸可以引入细胞中。已经展示了存在双链断裂可促进供体序列的整合。供体序列可以物理整合或，可替代地，，供体多核苷酸被用作用于经由同源组合来修复断裂的模板，这将导致引入供体中的全部或部分核酸序列至细胞染色质中。因此，可以改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可以转变成存在于供体多核苷酸中的序列。因此，使用术语“替换”或“更换”可以理解为表示用另一核苷酸序列来替换一个核苷酸序列，(即，在信息意义上替换序列)，并且不必然需要用另一多核苷酸来物理或化学地替换一个多核苷酸。
在本文描述的任何方法中，额外的锌指蛋白对可以用于细胞内额外靶位点的额外双链裂解。
在用于靶向重组和/或替换和/或改变细胞染色质中感兴趣区域序列方法的实施方案中，染色体序列通过用外源“供体”核苷酸序列同源重组来改变。如果存在与断裂区同源的序列，那么可通过存在于细胞染色质中的双链断裂来刺激这种同源重组。
在本文描述的任何方法中，第一核苷酸序列(“供体序列”)可以包含与感兴趣区域中基因组序列同源但不同的序列，因此将刺激同源重组以在感兴趣区域插入不相同序列。因此，在某些实施方案中，与感兴趣区域序列同源的供体序列部分展现了与所替换的基因组序列约80%至99%之间(或任何在其间的整数)的序列相同性。在其它实施方案中，供体和基因组序列之间的同源性高于99%，例如如果具有超过100个邻接碱基对的供体与基因组序列之间只有1个核苷酸不同。在某些情况下，供体序列的非同源部分可以包含不存在于感兴趣区域中的序列，这样使得新的序列引入感兴趣区域中。在这些情况下，非同源序列的侧面一般具有50至1,000个碱基对(或在其间的任何整数值)或任何大于1,000个碱基对数目的序列，这些序列与感兴趣区域中的序列同源或相同。在其它实施方案中，供体序列与第一序列是非同源的，并且供体序列通过非同源重组机理插入基因组中。
本文描述的任何方法可以通过中断感兴趣基因表达的供体序列靶向整合来用于细胞中一种或多种靶序列的部分或完全失活。也提供了具有部分或完全失活基因的细胞系。
此外，如本文所描述的靶向整合方法也可以用来整合一种或多种外源序列。外源核酸序列可以包括，例如一种或多种基因或cDNA分子，或任何类型编码或非编码的序列，以及一种或多种控制成分(例如，启动子)。另外，外源核酸序列可能产生一种或多种RNA分子(例如，小发夹结构的RNA(shRNA)、抑制的RNA(RNAis)、微型RNA(miRNA)等)。
“裂解”指的是DNA分子共价主链的破裂。裂解可以通过许多方法来起始，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链裂解与双链裂解皆是可能的，并且双链裂解可以由于两个截然不同的单链裂解现象而发生。DNA裂解可以导致平端或交错末端产生。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA裂解。
“裂解半功能域”是与第二多肽(相同的或不同的)连结的多肽序列，从而形成具有裂解活性(优选地双链裂解活性)的复合物。术语“第一和第二裂解半功能域”；“+和-裂解半功能域”以及“后和左裂解半功能域”可交换使用，指的是二聚化的裂解半功能域对。
“改造的裂解半功能域”是已经修饰以便与另一裂解半功能域(例如，另一改造的裂解半功能域)形成专性异二聚体的裂解半功能域。也参见美国专利公布号2005/0064474；2007/0218528以及2008/0131962，这些专利以引用的方式全部并入本文。
“染色质”是包括细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包括核酸(主要为DNA)以及蛋白质，该蛋白质包括组蛋白和非组蛋白的染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包括近似150个与八聚物相关的DNA碱基对，该八聚物包括组蛋白H2A、H2B、H3以及H4的每两个；并且接头DNA(取决于有机体具有可变长度)在核小体核心之间伸展。组蛋白H1分子一般与接头DNA相关。就本公开内容来说，术语“染色质”意指包含所有类型的细胞核蛋白，不论是原核的还是真核的。细胞染色质既包括染色体的染色质又包括游离基因的染色质。
“染色体”是包括细胞所有或部分基因组的染色质复合物。细胞基因组的特征通常在于它的核型，该核型是包括细胞基因组的所有染色体集合。细胞基因组可以包括一种或多种染色体。
“游离基因”是复制的核酸、核蛋白复合物或其它包括核酸的结构，该核酸不是细胞染色体核型的一部分。游离基因的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子所结合(只要存在足以结合的条件)核酸的一部分的核酸序列。举例来说，序列5’-GAATTC-3’是对于EcoRI限制性内切核酸酶的靶位点。
“外源”分子是通常不存在于细胞中，但可以通过一种或多种基因的、生物化学的或其它方法来引入细胞中的分子。“通常存在于细胞中”是相对于细胞的具体发育阶段和环境条件而测定。因此，例如，仅在肌肉胚胎发育期间存在的分子相对于成年肌肉细胞是外源分子。类似地，通过热激诱导的分子相对于非热激的细胞是外源分子。外源分子可以包括，例如不正常运行的内源分子的运行型式或正常运行的内源分子的不正常运行型式。外源分子也可以是通常在另一物种中发现的分子，例如引入动物基因组中的人类序列。
其中，外源分子可以是小分子，如通过组合化学过程而产生的小分子，或大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何上述分子的修饰衍生物或任何包含上述分子的一种或多种的复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以是任何长度。核酸包括能够形成双链体以及三联体的那些核酸。参见，例如美国专利号5,176,996以及5,422,251。蛋白质包括，但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶以及解旋酶。
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。举例来说，外源核酸可以包括感染的病毒基因组、引入细胞中的质粒或游离基因、或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导传递(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导传递以及病毒载体介导传递。
相反，“内源”分子是在具体环境条件下，在具体发育阶段通常存在于具体细胞中的分子。举例来说，内源核酸可以包括染色体、线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组、或自然出现的游离核酸。额外的内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是其中两个或更多个亚单位分子得以连接的分子，优选地共价连接。亚单位分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一种类型融合分子的实例包括但不限于融合蛋白质(例如，ZFPDNA结合功能域与裂解功能域之间融合)以及融合核酸(例如，编码上文中描述的融合蛋白的核酸)。第二种类型融合分子的实例包括但不限于形成三联体核酸与多肽之间融合以及小沟结合剂与核酸之间融合。
细胞中融合蛋白质的表达可以由融合蛋白质向细胞输送或通过编码融合蛋白质的多核苷酸向细胞输送而引起，其中转录多核苷酸，并且转译转录物以产生融合蛋白。分子间拼接、多肽裂解以及多肽连接反应也可以在细胞中的蛋白质表达中涉及到。用于多核苷酸和多肽向细胞输送的方法在本公开内容别处提出。
“基因”对本公开内容来说包括编码基因产物(参见下文)的DNA区，以及调控基因产物产生的所有DNA区，无论这些调控序列是否与编码和/或转录序列邻近。因此，基因包括，但不一定限于启动子序列、终止子、转译调控序列如核糖体结合位点和内核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界成分、复制起点、基质结合位点以及基因座控制区。
“基因表达”指的是将包含在基因中的信息转变成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA转译产生的蛋白质。基因产物也包括通过如加帽化、聚腺苷酸化、甲基化以及编辑的方法来修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化以及糖基化来修饰的蛋白质。
基因表达“调节”指的是基因活性变化。表达调节可以包括但不限于基因活化和基因阻抑。基因编辑(例如，裂解、变化、失活、随机突变)可以用来调节表达。基因失活指的是与不包括如本文所描述的ZFP的细胞相比，基因表达的任何减少。因此，基因失活可能是部分的或完全的。
“感兴趣区”是任何细胞染色质区，如，例如基因或基因内部或基因附近的非编码序列，其中结合外源分子是可取的。结合可以是为了靶向DNA裂解和/或靶向重组的目的。感兴趣区可以存在于例如染色体、游离基因、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染病毒基因组中。感兴趣区可以在基因编码区内，在转录的非编码区内，如例如前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游内的非转录区内。感兴趣区可以小至单个核苷酸对，或高达2,000个核苷酸对长度，或任何整数值的核苷酸对。
术语“有效连接”或“有效地连接”(或“可操作连接”)关于并列两种或更多种组分(如序列成分)可交换使用，其中组分经过安排，这样既使得组分运行正常又使得组分的至少一种可以介导对于其它组分的至少一种所施加的功能。作为说明，如果响应于一种或多种转录调控因子存在或缺失，转录调控序列控制编码序列转录水平，那么转录调控序列如启动子可有效连接至编码序列。转录调控序列一般以顺式与编码序列有效连接，但无需直接邻近编码序列。举例来说，增强子是有效连接至编码序列的转录调控序列，虽然它们不是邻接的。
相对于融合多肽，术语“有效地连接”可以指的是如下事实：每个组分在与其它组分的连接状态下执行与其在未这样连接的情况下所执行的功能相同的功能。举例来说，相对于ZFPDNA结合功能域融合至裂解功能域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFPDNA结合功能域能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，同时裂解功能域能够在靶位点附近裂解DNA，那么ZFPDNA结合功能域和裂解功能域是有效连接的。
蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列不同于全长蛋白质、多肽或核酸，但仍保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可以拥有比对应天然分子更多、更少或相同数量的残基，和/或可以包含一种或多种氨基酸或核酸取代物。用于测定核酸功能(例如，编码功能，可杂交另一核酸的能力)的方法在本领域是众所周知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是众所周知的。举例来说，多肽的DNA结合功能可以例如通过过滤结合、电泳迁移位移或免疫沉淀实验来测定。DNA裂解可以通过凝胶电泳来分析。参见Ausubel等，上文。蛋白质可与另一蛋白质相互作用的能力可以通过例如共免疫沉淀、双杂交实验或既是基因的又是生物化学的互补作用来测定。参见，例如Fields等(1989)Nature340：245-246；美国专利号5,585,245以及PCTWO98/44350。
锌指核酸酶
本文描述的是可以用于一种或多种Rosa基因基因组编辑(例如，裂解、变化、失活和/或随机突变)的锌指核酸酶(ZFN)。ZFN包括锌指蛋白(ZFP)和核酸酶(裂解)功能域(例如，裂解半功能域)。
A.锌指蛋白
锌指结合功能域可以经过改造以便结合在选择序列上。参见，例如Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20：135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19：656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。改造的锌指结合功能域与自然发生的锌指蛋白相比，可以具有崭新的结合特异性。工程方法包括，但不限于合理设计和各种类型选择。合理设计包括，例如使用包括三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，在其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指的一个或多个氨基酸序列相关，该锌指结合具体的三联体或四联体序列。参见，例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，该专利以引用的方式全部并入本文。
包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759以及6,242,568；以及WO98/37186；WO98/53057；WO00/27878；WO01/88197以及GB2,338,237中。另外，已经在例如共有的WO02/077227中描述了用于锌指结合功能域的结合特异性增强。
靶位点的选择；用于设计和构造融合(以及编码这些蛋白质的多核苷酸)的ZFP和方法是本领域技术人员已知的，并且详细描述于美国申请公开号20050064474和20060188987中，该申请公开以引用的方式全部并入本文。
另外，如在这些和其它参考文献中所公开的，锌指功能域和/或多指的锌指蛋白可以使用任何适合的接头序列来连接在一起，包括例如5个或更多氨基酸长度的接头(例如，TGEKP(SEQIDNO:1)、TGGQRP(SEQIDNO:2)、TGQKP(SEQIDNO:3)，和/或TGSQKP(SEQIDNO:4))。关于示例性6个或更多个氨基酸长度接头序列，也参见美国专利号6,479,626；6,903,185以及7,153,949。本文描述的蛋白质可以包括单独蛋白质锌指之间适合接头的任何组合。
如下所述，在某些实施方案中，四、五或六指结合功能域融合至裂解半功能域，如例如IIs型限制性内切核酸酶如FokI的裂解功能域。这种锌指/核酸酶半功能域融合的一个或多个对可用于靶向裂解，如在例如美国专利公布号20050064474中所公开。
对于靶向裂解，结合位点的近边可以通过5个或更多核苷酸对来分开，并且融合蛋白质各自可以结合至DNA靶的相反链。所有成对组合1可以用于Rosa基因靶向裂解。根据本公开内容，ZFN可以靶向至动物基因组中的任何序列。
在一些实施方案中，DNA结合功能域是来自TAL效应物的工程功能域，该TAL效应物从植物病原体黄单胞菌中得到(参见Boch等，(2009)Science326：1509-1512以及Moscou和Bogdanove，(2009)Science326：1501)。
B.裂解功能域
ZFN也包括核酸酶(裂解功能域、裂解半功能域)。本文公开的融合蛋白质的裂解功能域部分可以从任何内切核酸酶或外切核酸酶中获得。可以从其中得到裂解功能域的示例性的内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和寻靶内切核酸酶。参见，例如2002-2003Catalogue，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA；以及Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388。额外裂解DNA的酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNaseI；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；也参见Linn等(编)Nucleases，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1993)。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作裂解功能域和裂解半功能域的来源。
类似地，裂解半功能域可以从任何核酸酶或其部分中得到，如上所阐述，该裂解半功能域或其部分需要用于裂解活性的二聚作用。通常地，如果融合蛋白质包括裂解半功能域，那么裂解需要两个融合蛋白质。可替代地，可以使用单个包括两个裂解半裂解功能域的蛋白质。两个裂解半功能域可以从相同内切核酸酶(或其功能片段)中得到，或每个裂解半功能域可以从不同内切核酸酶(或其功能片段)中得到。另外，两个融合蛋白质的靶位点是优选地相对于彼此布置的，这样使得两个融合蛋白质与它们各自的靶位点的结合将裂解半功能域放置于使得半功能域例如通过二聚作用来形成功能裂解功能域的彼此空间定位中。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边通过5至8个核苷酸或通过15至18个核苷酸来分开。然而任何整数的核苷酸或核苷酸对可以介于两个靶位点之间(例如，从2至50个核苷酸对或更多)。通常地，裂解的位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种，并且能够序列特异地结合至DNA(在识别位点处)，并且能够在结合位点或附近裂解DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在远离识别位点的位点裂解DNA，并且具有独立的结合和裂解功能域。举例来说，IIS型酶FokI在离一条链上识别位点的9个核苷酸处和在离另一条链上识别位点13个核苷酸处催化DNA双链裂解。参见，例如美国专利5,356,802；5,436,150以及5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白质包括来自至少一种IIS型限制性酶的裂解功能域(或裂解半功能域)以及一个或多个锌指结合功能域，该锌指结合功能域可能是或可能不是改造的。
裂解功能域是与结合功能域分开的一种示例性的IIS型限制性酶是FokI。这个具体的酶以二聚体的形式起作用。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10，570-10，575。因此，对本公开内容来说，认为用于公开融合蛋白质中的FokI酶部分是裂解半功能域。因此，对于使用锌指FokI融合体来靶向双链裂解和/或靶向取代细胞序列，可以使用两个融合蛋白质(每个该融合蛋白质包括FokI裂解半功能域)来重新构成催化活性的裂解功能域。可替代地，也可以使用包含锌指结合功能域和两个FokI裂解半功能域的单个多肽分子。在本公开内容别处提供了使用锌指FokI融合体来靶向裂解和靶向序列变化的参数。
裂解功能域或裂解半功能域可以是蛋白质的任何部分，该蛋白质保留裂解活性或保留多聚(例如，二聚)以形成功能裂解功能域的能力。
示例性的IIS型限制性酶描述于国际公布WO07/014275中，该公布以引用的方式全部并入本文。额外的限制性酶也包含独立的结合和裂解功能域，并且这些酶是本公开内容涵盖的。参见，例如Roberts等(2003)NucleicAcidsRes.31:418-420。
在某些实施方案中，裂解功能域包括将均二聚减至最低程度或防止均二聚的一个或多个改造的裂解半功能域(也称为二聚功能域突变体)，如例如美国专利公布号20050064474；20060188987以及20080131962中所描述，所有这些公布的公开内容以引用的方式全部并入本文。在FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537以及538上的氨基酸残基全部是用于影响FokI裂解半功能域二聚的靶。
形成专性异二聚体的FokI的示例性工程裂解半功能域包括如下对，在该对中第一种裂解半功能域包括在FokI的位置490和538上的氨基酸残基的突变，并且第二种裂解半功能域包括在氨基酸残基486和499上的突变。
因此，在一个实施方案中，490上的突变用Lys(K)替换了Glu(E)；在538上的突变用Lys(K)替换了Iso(I)；486上的突变用Glu(E)替换了Gln(Q)；并且位置499上的突变用Lys(K)替换了Iso(I)。更确切地说，本文描述的工程裂解半功能域通过在一个裂解半功能域上突变位置490(E→K)和538(I→K)以产生指定的“E490K：I538K”工程裂解半功能域，以及通过在另一裂解半功能域上突变位置486(Q→E)和499(I→L)以产生指定的“Q486E：I499L”工程裂解半功能域来制备。本文描述的工程裂解半功能域是专性异二聚突变体，在该突变体中异常裂解被减至最低或消除。参见，例如WO07/139898的实施例1。在某些实施方案中，工程裂解半功能域包括在位置486、499以及496(相对于野生型FokI编号)上的突变，例如在位置486上用Glu(E)残基替换野生型Gln(Q)残基、在位置499上用Leu(L)残基替换野生型Iso(I)残基以及在位置496上用Asp(D)或Glu(E)残基(也分别称为“ELD”和“ELE”功能域)替换野生型Asn(N)残基的突变。在其它实施方案中，工程裂解半功能域包括在位置490、538以及537(相对于野生型FokI编号)上的突变，例如在位置490上用Lys(K)残基替换野生型Glu(E)残基、在位置538上用Lys(K)残基替换野生型Iso(I)残基以及在位置537上用Lys(K)残基或Arg(R)残基(也分别称为“KKK”和“KKR”功能域)替换野生型His(H)残基的突变。在其它实施方案中，工程裂解半功能域包括在位置490和537(相对于野生型FokI编号)上的突变，例如在位置490上用Lys(K)残基替换野生型Glu(E)残基以及在位置537上用Lys(K)或Arg(R)残基(也分别称为“KIK”和“KIR”功能域)替换野生型His(H)残基的突变。(参见美国申请号12/931,660)。
本文描述的工程裂解半功能域可以使用任何适合的方法来制备，例如通过如美国专利公布号20050064474中所描述的野生型裂解半功能域(FokI)位点导向突变发生来制备。
C.用于靶向裂解的额外方法
任何在任何Rosa基因中具有靶位点的核酸酶可以用在本文公开的方法中。举例来说，寻靶内切核酸酶和大范围核酸酶具有十分长的识别序列，在统计基础上，这些识别序列的一些可能存在于人类大小的基因组中。可以使用任何这种在Rosa基因中具有靶位点的核酸酶来代替或除了锌指核酸酶之外用于靶向裂解。
示例性的寻靶内切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII。它们的识别序列是已知的。也参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene82：115–118；Perler等(1994)NucleicAcidsRes.22，1125–1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12：224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280：345–353以及新英格兰生物实验室目录(theNewEnglandBiolabscatalogue)。
虽然大多数寻靶内切核酸酶的裂解特异性相对于它们的识别位点不是绝对的，但是该位点有足够的长度以致可以通过在细胞中表达寻靶内切核酸酶来获得每个哺乳动物大小基因组单个裂解现象，该细胞包含它识别位点的单个副本。也已经报道了可以改造寻靶内切核酸酶和大范围核酸酶的特异性以结合非自然的靶位点。参见，例如Chevalier等(2002)Molec.Cell10：895-905；Epinat等(2003)NucleicAcidsRes.31：2952-2962；Ashworth等(2006)Nature441：656-659；Paques等(2007)CurrentGeneTherapy7：49-66。
输送
本文描述的ZFN可以通过任何适合的手段输送至靶细胞中，包括例如通过注入ZFNmRNA。参见Hammerschmidt等(1999)MethodsCellBiol.59：87-115。
在例如美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219以及7,163,824中描述了输送包括锌指的蛋白质的方法，所有这些专利的公开内容以引用的方式全部并入本文。
本文描述的ZFN也可以使用包含序列的载体来输送，该序列编码ZFN的一个或多个。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体以及腺相关病毒载体等。也参见美国专利6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219以及7,163,824，这些专利以引用的方式全部并入本文。此外，任何这些载体明显可以包括编码一个或多个ZFN的序列。因此，当ZFN的一个或多个对引入至细胞时，ZFN可以携带于相同载体上或不同载体上。当使用多个载体时，每个载体可以包括编码一个或多个ZFN的序列。
可以使用传统病毒和非病毒的基因传递方法来将编码改造的ZFP的核酸引入细胞中。这种方法可以用来体外施用编码ZFP的核酸于细胞中。在某些实施方案中，编码ZFP的核酸可以施用于体内或离体。
非病毒载体输送系统包括电穿孔、脂转染、微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸露DNA、人工病毒颗粒以及试剂增强吸收的DNA。使用例如Sonitron2000系统(Rich-Mar)的声孔效应也可以用于核酸输送。病毒载体输送系统包括DNA和RNA病毒，这两种病毒向细胞输送后具有游离基因或整合的基因组。额外示例性的核酸输送系统包括通过AmaxaBiosystems(Cologne，Germany)，Maxcyte，Inc.(Rockville,Maryland)、BTXMolecularDeliverySystems(Holliston,MA)以及CopernicusTherapeuticsInc，(参见US6008336实施例)提供的那些。脂转染描述于例如US5,049,386、US4,946,787以及US4,897,355）中，并且脂转染试剂市场上有售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO91/17424、WO91/16024的那些。输送可以是向细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。脂质：核酸复合物，包括靶向的脂质体如免疫脂质复合物的制备是本领域技术人员众所周知的(参见，例如Crystal，Science270：404-410(1995)；Blaese等，CancerGeneTher.2：291-297(1995)；Behr等，BioconjugateChem.5：382-389(1994)；Remy等，BioconjugateChem.5：647-654(1994)；Gao等，GeneTherapy2：710-722(1995)；Ahmad等，CancerRes.52：4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
额外的输送方法包括使用将待输送的核酸封装至EnGeneIC输送工具(EDV)中。这些EDV使用双特异性抗体特异性地向靶组织输送，其中该抗体的一个臂具有对于靶组织的特异性，并且另一个臂具有对于EDV的特异性。抗体将EDV带入靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV带入细胞中。当在细胞中时，将释放内含物(参见MacDiarmid等(2009)NatureBiotechnology第27卷(7)643页)。
如以上所表明，公开的方法和组合物可以用于任何类型的细胞中。也可以使用动物细胞的后代、变异体以及衍生物。
应用
公开的方法和组合物可以用于任何一种或多种Rosa基因的基因组编辑。在某些应用中，方法和组合物可以用于基因组Rosa序列的失活。在其它应用中，方法和组合物使得随机突变产生，包括产生基因的崭新等位基因形式，其与未编辑的基因或人化的基因整合体相比具有不同表达，这又使得动物模型产生。在其它应用中，方法和组合物可以用于在允许鉴别或选择携带那些基因崭新等位基因形式的动物的基因确定位置上产生随机突变。在其它的应用中，方法和组合物使得外源(供体)序列靶向整合在任何选择的基因组区域中，例如，小鼠或大鼠Rosa基因。调控序列(例如启动子)可以用靶向方式整合在感兴趣位点上。通过“整合”意指既物理插入(例如，在宿主细胞的基因组中)，又另外通过由核酸复制过程将供体序列复制至宿主细胞基因组中来整合。供体序列也可以包括核酸如shRNA、miRNA等。这些小的核酸供体可以用来研究它们对基因组内感兴趣基因的作用。额外的感兴趣供体序列可以是人类基因，该人类基因编码疾病模型相关的蛋白质。这种基因的非限制性实例包括人类因子VIII和人类因子IX。因此将这些基因插入在Rosa位点中可以使研究者能够在体内更为详细地调查研究这些蛋白质。可以实现基因组编辑(例如，失活、整合和/或靶向或随机突变)，例如通过单个裂解现象、通过裂解后非同源末端连接、通过裂解后同源导向修复机理、通过裂解后物理整合供体序列、通过在两个位点裂解后连接以便缺失两个裂解位点之间的序列、通过将错义或无义密码子靶向重组至编码区、通过将不相关序列(即，“填充片段”序列)靶向重组至基因或它的调控区以便中断基因或调控区，或通过将拼接受体序列靶向重组至内含子以引起转录错拼接。参见美国专利公布号20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；以及国际公布WO07/014275，这些专利的公开内容为了所有目的以引用的方式全部并入本文。
还有各种对于Rosa基因ZFN介导基因组编辑的应用。本文描述的方法和组合物使得人类疾病模型产生。举例来说，编辑位置53基因使得“癌症大鼠”产生，该“癌症大鼠”提供了用于研究癌症和测试癌症治疗的动物模型。
实施例
实施例1：构造限制性片段长度多态性(RFLP)供体核酸，用于靶向整合至大鼠基因组的rRosa26核酸区。
也构造质粒以将NotI和PmeIRFLP位点靶整合至大鼠基因组的rRosa26区。质粒的设计和构造如在以上所描述。用于扩增同源性rRosa26区的PCR引物对描述在表1中。
靶向大鼠Rosa26中指示靶位点的锌指设计在表2和表3中示出。通过ZFP识别螺旋体来接触的靶位点中核苷酸用大写字母指示；未接触的核苷酸用小写指示。
表2：大鼠rosa26指设计
表3：大鼠rosa26靶位点
大鼠C6细胞用GFP对照或8对ZFN的每个来转染。DNA从转染后一天的细胞中制备。ZFN裂解使用经过各自引物扩增的产物，用SurveyorTM核酸酶来分析，如在例如美国专利公布号20080015164；20080131962以及20080159996中所描述。结果在图1中呈现。箭头指示仅在包含ZFN对的样品中发现裂解，但未在细胞用对GFP具有特异性的ZFN转染的对照样品中发现裂解。
实施例2：对于小鼠Rosa26位点具有特异性的锌指核酸酶
靶向小鼠Rosa26中指示靶位点的锌指设计在表4和表5中示出。通过ZFP识别螺旋体来接触的靶位点中核苷酸用大写字母指示；未接触的核苷酸用小写指示。
表4：小鼠Rosa26锌指设计
表5：小鼠Rosa26靶位点
如以上关于ZFN对18473/18477和18473/25096所描述来进行Cel-I分析，并且NHEJ百分比如以下所见：使用ZFN对18477/18473的26.5%NHEJ和具有ZFN对18473/25096的35.70%NHEJ。
实施例3：将供体多核苷酸靶向整合至小鼠基因组的Rosa26位点
通过克隆PCR产物来构造Rosa供体，该PCR产物使用以下寡核苷酸制备：对于527bp左臂，用于PCR的寡核苷酸是5’-ggctcgagtgagtcatcagacttctaagatcagg-3’(SEQIDNO:31)；对于413bp左臂供体，5’-ggctcgagttttgataaggctgcagaag-3’(SEQIDNO:32)与反向引物5’-ctgaattcgaatgggcgggagtcttctgggca-3’(SEQIDNO:33)连结。
对于640bp右臂，用于PCR的寡核苷酸是5’-ccaagcttggaggtaggtggggtgagg-3’(SEQIDNO:34)；对于200bp臂，5’-ccaagcttagtcgctctgagttgttatc-3’(SEQIDNO:35)；对于100bp臂，5’-ccaagctttctgggagttctctgctgcc-3’(SEQIDNO:36)与反向引物5’-cattcgaattcagaaagactggagttgcagatc-3’(SEQIDNO:37)连结。单独的臂扩增子由融合PCR连接，并且克隆产生具有变化同源性臂的供体。Neuro2a细胞(200,000)使用Amaxa-ShuttleNeuro2a高效法用分别为400ng的SBS18473和18477共转染，并在溶液SF中有2μg指示的供体。
在转染后72小时收获基因组DNA，并且在粘合温度68℃下，将100ng连同5’-cccagctacagcctcgattt-3’,5’-cacaaatggcgtgttttggt-3’以及每个样品5μCi的32P-dATP以及32P-dCTP用于PCR，并且在72℃下两分钟伸展28个循环。在G-50柱纯化后，每50uL反应的10uL在37℃下用EcoRI消化两小时，并且装入10%聚丙烯酰胺凝胶。
如在图2中所示，以指示的频率将供体核苷酸插入Rosa位点。
所有本文提到的专利、专利申请以及专利公布特此以引用的方式全部并入。
虽然为了清楚理解，比较详细地用说明和实施例的方式提供了公开内容，但本领域技术人员明显可以实施不背离本公开内容精神或范围的各种改变和改进。因此，前面的描述和实施例不应理解为具有限制性。
Claims (22)
1.一对融合蛋白质，包括第一和第二条融合蛋白质，每种融合蛋白质包含FokI核酸酶功能域和改造的锌指功能域，其中所述改造的锌指功能域结合大鼠Rosa内含子靶位点，所述Rosa内含子包含序列SEQIDNO:75-90，其中所述锌指功能域包含以F1-F4、F1-F5、或F1-F6命名并从N端到C端排列的锌指DNA-结合域，其中一对融合蛋白质中的至少一个锌指DNA-结合域包含：RSANLTR(SEQIDNO:42)或QNAHRKT(SEQIDNO:22)或TSSNLSR(SEQIDNO:71)，所述包含识别区的锌指DNA-结合域对选自下组：
(i)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:DRSDLSR(SEQIDNO:38)，F2：RSDDLTR(SEQIDNO:39)，F3:TSGHLSR(SEQIDNO:40)，F4：RSDNLSV(SEQIDNO:41)，和F5:RSANLTR(SEQIDNO:42)；和第二种锌指功能域是F1:QSDHLTK(SEQIDNO:43),F2:NSSNLSR(SEQIDNO:44),F3:RSDHLTK(SEQIDNO:45),F4：NSDHLSR(SEQIDNO:46)，和F5:RSDHLSR(SEQIDNO:47)；
(ii)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:RSDHLSE(SEQIDNO:48)，F2:RSAALAR(SEQIDNO:49)，F3:RSDHLST(SEQIDNO:50)，F4:QNAHRIT(SEQIDNO:51)，和F5:RSAVLSE(SEQIDNO:52)；和第二种锌指功能域是
F1:QSGDLTR(SEQIDNO:17),F2:TSGSLTR(SEQIDNO:18),F3:RSANLTR(SEQIDNO:42),F4:RSDHLTK(SEQIDNO:45),和F5:NSDHLSR(SEQIDNO:46)；
(iii)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:RSANLTR(SEQIDNO:42)，F2:QSGDLTR(SEQIDNO:17)，F3:QSGDLTR(SEQIDNO:17)，F4:RSANLAR(SEQIDNO:53)，和F5:RSDNLRE(SEQIDNO:54)；和第二种锌指功能域是F1:RSDHLST(SEQIDNO:50)，F2:DNRDRIK(SEQIDNO:55)，F3:RSDTLSE(SEQIDNO:56)，F4:QSSHLAR(SEQIDNO:57)，和F5:QNAHRKT(SEQIDNO:22)；
(iv)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:QSGDLTR(SEQIDNO:17)，F2:QSGDLTR(SEQIDNO:17)，F3:RSDNLTR(SEQIDNO:58)，F4:RSDNLSE(SEQIDNO:21)，和F5:QNAHRKT(SEQIDNO:22)；
和第二种锌指功能域是F1:DRSDLSR(SEQIDNO:38)，F2:RSDHLST(SEQIDNO:50)，F3:DNRDRIK(SEQIDNO:55)，F4:RSDTLSE(SEQIDNO:56)，和F5:QSSHLAR(SEQIDNO:57)；
(v)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:QSGDLTR(SEQIDNO:17)，F2:RSDNLTR(SEQIDNO:58)，F3:RSDNLSE(SEQIDNO:21)，F4:QNAHRKT(SEQIDNO:22)，F5:RSDHLSE(SEQIDNO:48)，和F6：TSSTRKT(SEQIDNO:59)；
和第二种锌指功能域是F1:TSGNLTR(SEQIDNO:60)，F2:QSGNLAR(SEQIDNO:61)，F3:RSDALSV(SEQIDNO:62)，F4:DSSHRTR(SEQIDNO:63)，和F5:RSDVLSE(SEQIDNO:64)；
(vi)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:RSDNLSE(SEQIDNO:21)，F2:QNAHRKT(SEQIDNO:22)，F3:RSDHLSE(SEQIDNO:48)，F4:TSSTRKT(SEQIDNO:59)，和F5:TSGHLSR(SEQIDNO:40)；
和第二种锌指功能域是F1:TSGNLTR(SEQIDNO:60)，F2:QSGNLAR(SEQIDNO:61)，F3:RSDALSV(SEQIDNO:62)，和F4:DSSHRTR(SEQIDNO:63)；
(vii)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:QRSNLVR(SEQIDNO:65)，F2:RSDHLTQ(SEQIDNO:66)，F3:QSGHLQR(SEQIDNO:67)，和F4:DRSHLAR(SEQIDNO:68)；
和第二种锌指功能域是F1:RSDVLSE(SEQIDNO:64)，F2：QRNHRTT
(SEQIDNO:69)，F3:TKRSLIE(SEQIDNO:70)，F4:TSSNLSR
(SEQIDNO:71)，F5:RSDDLSK(SEQIDNO:25)，和F6DNRDRIK(SEQIDNO:55)；
(viii)融合蛋白质对中的第一种锌指功能域是F1:RSDHLSA(SEQIDNO:72)，F2:QSGHLSR(SEQIDNO:24)，F3:RSDHLSR(SEQIDNO:47)，F4:QNDNRIK(SEQIDNO:73)，和F5:QSGNLAR(SEQIDNO:61)；和
第二种锌指功能域是F1:NNRDLIN(SEQIDNO:74)，F2:TSSNLSR(SEQIDNO:71)，F3:RSDVLSE(SEQIDNO:64)，F4:QRNHRTT(SEQIDNO:69)，F5:TKRSLIE(SEQIDNO:70)，F和6:TSSNLSR(SEQIDNO:71)。
2.如权利要求1所述的一对融合蛋白质，其中所述fokI功能域是自然发生的或改造的。
3.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1或2所述的融合蛋白质对。
4.一种细胞，其包含根据权利要求1或2中所述的融合蛋白质对或根据权利要求3所述的多核苷酸，所述细胞不是人胚胎细胞。
5.如权利要求4所述的细胞，其中所述细胞是胚胎细胞。
6.一种组合物，其包含根据权利要求1或2所述的融合蛋白质对或根据权利要求3所述的多核苷酸以及药学上可接受的赋形剂。
7.一种用于裂解细胞中的一种或多种Rosa基因的方法，所述方法包括：
将一种或多种根据权利要求1或2所述的融合蛋白质对或一种或多种根据权利要求3所述的多核苷酸引入所述细胞中，这样使得一种或多种Rosa基因得以裂解。
8.一种将外源多核苷酸序列引入所述细胞基因组中的方法，所述方法包括
根据权利要求7所述的方法裂解一种或多种Rosa基因；以及
将所述细胞与外源多核苷酸序列接触；
其中所述一种或多种基因的裂解刺激通过同源重组进行的所述外源多核苷酸序列整合至所述基因组中。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述外源多核苷酸序列物理地进入所述基因组中。
10.如权利要求9所述的方法，其中经由核酸复制过程将所述外源多核苷酸序列整合至所述基因组中。
11.如权利要求9所述的方法，其中经由非同源依赖性靶向整合将所述外源多核苷酸序列整合至所述基因组中。
12.一种修饰所述细胞基因组中的Rosa基因序列的方法，所述方法包括
根据权利要求8所述的方法裂解一种或多种Rosa基因，其中
(i)第一ZFN在第一裂解位点裂解，并且第二ZFN在第二裂解位点裂解；
(ii)所述Rosa基因序列位于所述第一裂解位点与所述第二裂解位点之间；
(iii)所述第一和第二裂解位点的裂解导致通过非同源末端连接或同源导向修复进行的所述基因序列修饰。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述修饰包括缺失。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述修饰包括插入外源序列。
15.一种产生转基因动物的方法，所述方法包括；
根据权利要求12至14中任一项所述来修饰胚胎细胞中的Rosa基因序列；以及
使所述胚胎发育成动物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰包括在指定位置上的一种或多种随机突变。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰包括插入人化基因。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述人化基因与药物代谢相关。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述动物是性成熟动物，并且所述修饰的基因序列存在于所述性成熟动物的配子的至少一部分中。
20.一种在至少一种目标Rosa位点中产生一种或多种遗传突变等位基因的方法，所述方法包括
产生根据权利要求15至17中任一项所述的转基因动物，其中所述胚胎被培养至性成熟；以及
使所述性成熟动物产生后代；其中所述后代的至少一些包含所述突变等位基因。
21.一种试剂盒，其包含根据权利要求1或2所述的融合蛋白质对或根据权利要求3所述的多核苷酸。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其进一步包含选自由以下组成的组的额外组分：一种或多种外源序列、使用说明书以及其组合。
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