WO2013102289A1

WO2013102289A1 - 特异结合和靶定dna-rna 杂合双链的方法

Info

Publication number: WO2013102289A1
Application number: PCT/CN2012/001717
Authority: WO
Inventors: 施一公; 颜宁; 邓东; 闫创业; 潘孝敬
Original assignee: 清华大学
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2013-07-11
Also published as: CN104093855B; CN104093855A

Abstract

本发明公开了一种特异结合和靶定DNA-RNA杂合双链的方法。该方法包括用TALE及其衍生蛋白来特异性识别特定的DNA-RNA杂合双链并与之结合。

Description

特异结合和耙定 DNA-RNA杂合双链的方法技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及特异结合和靶定 5 DNA-RNA杂合双链的方法。背景技术

TALE ( Transcription Activator Like Effectors, 转录激活子样效应因子）是植物致病菌黄单胞菌属 Xanthomo謹、的细胞内的一种蛋白质。 ! 0 当病原菌侵染植株时，病菌会通过其自身的 III型分泌系统将包括 TALE 在内的一系列效应分子注入到植物细包内。这些效应分子通过影响宿主细胞的信号传递，基因表达等方式来协助病菌进一步扩增。 TALE 则是这些效应分子中最大的一类，它像植物自身的转录激活子一样行使功

■6 β匕

匕

: TALE家族蛋白一般由 3个主要的功能结构域组成， N端结构域与

TALE的分泌转运有关； C端具有转录激活结构域和入核信号肽片段；位于 TALE中部的区域是 DNA结合结构域，但它的 DNA 结合结构域不同于其他已知的 DNA结合结构域，它是由一段串联的重复单元组成，大多数情况下每个重复单元由 34个氨基酸组成，个别重复单元由 33或

?.0 35个氨基酸残基组成。这 34个氨基酸中除了第 12和 13位的氨基酸变化较大之外，其他氨基酸高度保守。这两个不保守的氨基酸被命名为 RVD ( repeat variable diresidue , 重复可变双残基 )。 J. Boch等人和 M.J. Moscou等 (参见 J. Boch, H. Scholze, S. Schornack, A. Landgraf, S. Hahn, S. Kay, T. Lahaye, A. Nickstadt, U. Bonas, Breaking the code of DNA

?. binding specificity of TAL-type III effectors, Science, 326 (2009) 1 509- 1 5 12和 .J. Moscou, A.J. Bogdanove, A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors, Science, 326 (2009) 1501 )已于 2009年分别通过实验和生物信息学研究发现每个重复单元中第 12和 13位的氨基酸 ( RVD ) 与识别的核苷酸种类有特殊的对应关系，例如：表 1 部分 RVD与 DNA碱基序列的对应关系

RVD氨基酸序列 DNA碱基序列

HD C

NG T

NI A

N G/A

NS A/G/C/T

TALE蛋白的特异 DNA序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，科学家们可以设计组装任意的 TALE单元去识别任意的 DNA双螺旋序列。这一特性已经被用来构造切割特异双链 DNA序列的 DNA酶 TALEN (TALE nuclease, TALE核酸酶），用于在细胞基因组中引入定点突变、定点敲除等操作（A.J. Bogdanove, D.F. Voytas, TAL effectors: customizable proteins for D A targeting, Science, 333 (201 1) 1843-1846. ) 。在目前所有已知的报道中， TALE识别的都是双链的 DNA螺旋（ dsDNA ) 。发明内容

本发明提供了一种特异结合 DNA-RNA 杂合链的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别特定的 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

本发明提供了一种抑制以 RNA为模板来生成 DNA的方法，包括用

TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合。在一个优选实施方式中，本发明提供了一种抑制逆转录病毒基因组复制的方法，所述方法包括用 TALE及其衍生蛋白来特异结合 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

本发明提供了一种抑制以 RNA为引物、 DNA为模板来生成 DNA 的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合。在一个优选实施方式中，本发明提供了一种抑制细胞增殖，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合从而抑制细胞基因组复制。在一个更优选实施方式中，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识另¹ j DNA-RNA杂合双链并与之结合从而抑制肿瘤细胞基因组复制。本发明提供了一种抑制以 RNA为引物、 DNA为模板来生成 RNA 的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合，条件是生成的 RNA能与 DNA形成暂时稳定的双链体。

本发明提供了一种保护 DNA-RNA杂合链中 RNA分子不被 RNA水解酶 RNase H 降解的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

TALE蛋白可以为自然界已有的 TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强 DNA-RNA杂合链结合能力的 TALE衍生蛋白。所述 TALE衍生蛋白还包含具有 TALE蛋白 DNA 结合结构域的重组蛋白。

所述 DNA还可以包含修饰的 DNA衍生物，例如曱基化碱基、羟甲基化碱基等。

所述 RNA还可以包含修饰的 RNA衍生物，例如曱基化碱基、羟曱基化碱基等。

在一个优选实施方式中，所述逆转录病毒包括逆转录病毒科 ( Retroviridae )中所属病毒，包括但不限于：人类免疫缺陷病毒（ Human Immunodeficiency Virus, HIV ) 、劳斯肉瘤病毒 (Rous Sarcoma Virus, RSV)、鼠白血病病毒（Murine Leukemia Virus, MLV ) 、人类 T细胞白血病病毒（Human T-cell Leukemia Virus, HTLV ) 等等。所述逆转录病毒还包括在复制过程中形成 RNA-DNA 杂合双链的或以与已知逆转录病毒基因组复制方式类似的其他 RNA病毒，包括尚未发现的病毒种类。

在一个优选实施方式中，所述方法用于抑制哺乳动物中的肿瘤细胞增殖。

本发明提供了 TALE蛋白在制备特异性识别 DNA-RNA杂合双链的试剂中的用途。

本发明提供了 TALE蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病，例如，由逆转录病毒引起的人、畜、植物疾病，包括但不限于人免疫缺陷综合症（AIDS ) 、人 T 细胞白血病、人毛细胞白血病、鼠白血病、禽白血病等等。

本发明提供了 TALE蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。

本发明提供了治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病的方法，其通过 TALE及其衍生蛋白来干扰以 RN A为模板的 DNA复制来抑制逆转录病毒的复制。

本发明提供了治疗或预防肿瘤的方法，其中通过 TALE及其衍生蛋白来干扰以 RNA为引物的 DNA复制来抑制肿瘤细胞增殖。

本发明提供了用于特异性识别 DNA-RNA杂合双链的 TALE蛋白。本发明提供了用于治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病或用于治疗或预防肿瘤的 TALE蛋白。附图说明

图 1是 dHax3的 DNA结合域（ dHax3截短体，标记为 dHax3-A ) 与双链 DNA的高分辨率晶体结构（ 1.85埃）示意图。左图中的 1-10 表示 dHax3的 DNA结合域的每个重复单元，其识别右侧对应的 DNA序列。每个重复单元由两个 α螺旋组成，两个螺旋分别为和1)。该结构已上传到 PDB数据库中，代码为： 3V6T。其中 dHax3 ( designed Hax3 ) 指经过改造的 TALE蛋白 Hax3。

图 2是示意图，表明 dHax3与 DNA的相互作用主要集中于 DNA 的编码链。 A, dHax3的表面电荷势，显示 dHax3表面有一条正电荷分布。蓝色分布刚好与 DNA分子的磷酸基团相互作用（DNA 分子位于蛋白的中间，金黄色基团表示磷酸基团）。 B, 这种相互作用只存在于 dHax3 与具有其识别序列的 DNA链之间。 C, 每个重复单元中的第 16和 17 位的氨基酸残基 K和 Q会通过氢键与 DNA磷酸基团相互作用。 D, 每个重复单元中主链也会与 DNA磷酸基团形成氢键相互作用。

图 3是电泳图，显示了 dHax3-NI变体（即 dHax3的 DNA结合域的第七个重复单元中的 RVD—— NS——通过点突变技术变成 NI。它具有与 dHax3相同的 DNA识别序列，同时具有更高的识别特异性）与双链 DNA(图 A泳道 1 -5, dsDNA )、单链 DNA(图 A泳道 6-10, ssDNA )、 DNA-RNA 杂合双链（图 B, 泳道 1-5: fDNA+rRNA , 泳道 6- 10:fRNA+rDNA ) 、双链 RNA (图 C泳道 1-5, dsRNA ) 和单链 DNA (图 C泳道 6-10, ssRNA )的凝胶阻滞实验。泳道 1-5和 6-10中， dHax3-NI 蛋白浓度分别为 0、 0.15 μΜ、 0.44 μΜ、 1.33 μΜ和 4μΜ, 同时每个泳道中含有大约 4 ηΜ 的带有 ³²Ρ 放射性标记的核酸探针。结果显示 dHax3-Nl可以特异性识别 DNA双链和一种 DNA-RNA杂合双链。 "Γ: 正向链。 "r": 反向链。

图 4显示了 dHax3-NI的 DNA结合域 (即 dHax3-NI的截短体，标记为 dHax3-NI-A)与 DNA-RNA杂合双链复合物的晶体结构。 dHax3-NI-A 以缎带模型表示， "DNA编码链 "和"互补 RNA链"分别标出。该结构已上传到 PDB数据库中，代码为： 4GG4。

图 5是电泳图，显示了 dHax3全长蛋白的纯化结果。泳道标注说明： 1. 全菌破碎液； 2. 全菌破碎离心沉淀； 3. 全菌破碎离心上清液； 4. 镍柱培养弃液； 5. 镍柱清洗液； 6. 镍柱洗脱回收液； 7. 镍柱柱材； 8. 分子量标志物。

图 6是电泳图，显示了 dHax3截短体蛋白（dHax3-A )的纯化结果。泳道标注说明： A. 全菌破碎液； P. 全菌破碎离心沉淀； S. 全菌破碎离心上清液； F. 镍柱穿透液； W1. 镍柱清洗液 1 ; W1. 镍柱清洗液 2; E. 镍柱洗脱回收液； R. 镍柱柱材； M. 分子量标志物。

图 7是示意图，显示了真核生物 DNA复制原理。

图 8是电泳图，显示了 dHax3-NI保护 DNA-RNA, 阻止 RNase H 对 DNA-RNA杂合双链中的 RNA的酶切。 1和 2道分别为在没有 RNase H情况下，有或者无 dHax3-NI的对照组； 3为加入 RNase H情况下，无 dHax3-NI的对照； 4~10为加入 RNase H情况下，加入梯度浓度的 dHax3-NI, 蛋白终浓度梯度为 0.004、 0.015、 0.05、 0.025、 0.1、 0.4和 1.6 μΜ。 13和 14道分别为制备的 RNA梯带（T1和 A )用于检测 RNase H的在 DNA-RNA杂合双链中的剪切位置。

图 9 是电泳图，显示了 dHax3-TALE₂₄ 重复单元嵌合蛋白保护 DNA-RNA, 阻止 RNase H对 DNA-RNA杂合双链中的 RNA的酶切， 0 和 1 1 道分别为制备的 RNA 梯带（T1 和 A ) 用于检测 RNase H 在 DNA-RNA杂合双链中的剪切位置。 1和 2道分别为在没有 RNase H情况下，有或者无 dHax3-TALE₂₄重复单元的对照组； 3道为加入 RNase H 情况下，无 dHax3-TALE₂₄重复单元的对照； 4~10道为加入 RNase H情况下，加入梯度浓度的 dHax3-TALE₂₄重复单元。蛋白的终浓度依次为： 0.004、 0.015、 0.05、 0.025、 0.1、 0.4和 1.6 μΜ。

图 10 是电泳图，显示了 dHax3-TALE_HIV重复单元嵌合蛋白保护 DNA-RNA, 阻止 RNase H对 DNA-RNA杂合双链中的 RNA的酶切。 1 和 2道分别为在没有 RNase H情况下，有或者无 dHax3-TALE_HIV重复单元的对照组； 3道为加入 RNase H情况下，无 dHax3-TALE_HIV重复单元的对照； 4〜10 道为加入 RNase H 情况下，加入梯度浓度的 dHax3- TALE_HIV重复单元, 蛋白的终浓度分别为： 0.004、 0.015、 0.05、 0.025、 0.1、 0.4和 1.6 μΜ; 1 1和 12道分别为在加入 dHax3-TALE_HIV重复单元情况下，有或者无 RNase H的对照； 13和 14 道分别为在加入 BSA情况下，有或者无 RNase H的对照。具体实施方式

发明人成功解析了经过改造的 TALE 蛋白 Hax3 (在本文中称为 : o dHax3 ( designed Hax3 ) ) 的 DNA结合结构域与 dsDNA的复合物晶体结构。该结构除了揭示出 TALE蛋白特异识别每一个 DNA碱基的分子基础，还显示双链 DNA里只有一条链（即具有 TALE识别序列的链）与 TALE相互作用。

发明人通过生物化学实验发现 TALE 蛋白可以特异识别 DNA - : s RNA杂合双链，并成功解析了 dHax3蛋白的 DNA结合结构域与 DNA - RNA杂合双链复合体的晶体结构。

发明人通过结构观察与生物化学手段首次发现 TALE蛋白可以特异识别 DNA - RNA杂合双链，这一发现拓宽了 TALE蛋白的应用前景。

(1 ) 对逆转录病毒的治疗。

?.0 逆转录病毒，以 RNA作为其遗传物质，比如对人类造成严重疾病的人类免疫缺陷病毒、人类 T细胞白血病病毒等等。它们要实现扩增，都必须通过在宿主细胞内逆转录的方式来完成病毒基因组的复制。逆转录病毒在通过侵染宿主复制自身的过程中，关键一步是在宿主内以病毒 RNA基因组作为模板，合成与 RNA互补的 DNA链。当基因组信息被？. 传递到单链的 DNA上后，病毒逆转录酶（Reverse Transcriptase ) 上的 RNA水解酶结构域 RNase H, 会将 DNA - RNA杂合双链中的 RNA链降解掉，释放出来的单链 DNA再作为模板，病毒逆转录酶将其复制成双链 DNA, 最后将双链 DNA插入到宿主的基因组中。

在病毒复制过程中，如果逆转录酶上的 RNase H结构域在逆转录之 30 后不能降解 RNA, 病毒就不能完成基因组复制。根据这个原理，以及发明人新发现的 TALE蛋白可以特异结合 DNA-RNA结合的特性，可以推测，当 TALE特异的结合 DNA-RNA杂合双链时，会占据逆转录酶和 RNase H的结合位点，使得 RNase H不能降解 RNA，从而达到抑制病毒复制的目的。

发明人首次发现的 TALE可以结合 DNA-RNA杂合链的现象为抑制逆转录病毒基因組复制过程提供了一种新型方式，从而为治疗由逆转录病毒引发的诸如人免疫缺陷综合症、人 T细胞白血病提供了一种新型的思路和方法。该方法还可用于治疗由在复制过程中形成 RNA-DNA杂合双链的病毒引发的疾病，所述病毒包括以与已知逆转录病毒基因组复制方式类似的其他 RNA病毒和尚未发现的病毒。

(2) 影响真核生物的 DNA 复制，从而为抑制肿瘤细胞增殖提供新方法。

如图 7所示，真核生物基因组中，双链 DNA以线性形式存在。由于 DNA的复制方向从 5， 3，，其中前导链可以从 5，端向 3，端连续复制下去；而滞后链则要以 RNA为引物，从 5'端向 3'端合成一段一段的冈崎片段 ( Okazaki fragment ) 。

现在发明人发现 TALE可以有效结合 DNA-RNA杂合链，那就可能与 DNA聚合酶竟争对于 DNA-RNA杂合链的结合，从而抑制 DNA复制。这样的后果是可能抑制细胞分裂，从而对抑制肿瘤细胞增殖提供了一个新思路和新方法。

基于这种特异识别 DNA-RNA杂合双链的新方法，为千扰细胞内所有通过形成 DNA-RNA杂合双链的过程，比如逆转录病毒在宿主细胞内的复制、细胞基因组 DNA的复制等重要过程，提供了新方法。

除非本文另有定义，本发明使用的相关科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、生物化学、结构生物学及相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：

本文所用的术语 "TALE 蛋白" 是指 Transcription Activator Like Effectors, 即转录激活子样效应因子。 TALE 蛋白可以为自然界已有的 TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强 DNA、或 DNA-RNA杂合链结合能力的 TALE ^"生蛋白。

本文所用的术语 "Hax3" 是指 TALE蛋白家族的成员之一。 Hax的全称为 "Homolog of avrBs3 in J¾w omo"iw，，，而 Hax3是从野油菜黄单刀包菌更种 Armor aciae ( Xanthomonas campestris pv. Armoraciae ) 養定出的 3个同源蛋白之一。作为 TALE蛋白家族的成员之一，它的功能与其他已知的 TALE蛋白如 AvrBs3的功能类似（参见 S. Kay, J. Boch, U. 5 Bonas, Characterization of AvrBs3-like effectors from a Brassicaceae pathogen reveals virulence and avirulence activities and a protein with a novel repeat architecture, Molecular plant-microbe interactions： MPMI, 1 8 (2005) 838-848. ) 。

本文所用的术语 "dHax3"是指人工改造的 Hax3 ( designed Hax3 ) , : o 其基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO: l , 氨基酸序列可参见 SEQ ID NO:2 (其中插入了 6XHis标签）。 M. Mahfouz等人设计了 dHax3以使其具有特异识别如下 DNA序列的能力： TCCCTTTATCTCK M.M. Mahfouz, L. Li, M. Shamimuzzaman, A. Wibowo, X. Fang, J.K. Zhu, De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid i nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108 (201 1 ) 2623-2628. ) 。

本文所用的术语" dHax3 截短体蛋白" ("dHax3-A")是指去除了 N端结构域和 C 端结构域的 dHax3 截短体蛋白，其为 dHax3 蛋白序列 ?.0 230-72 1 , 具有 1 1 .5个重复单元。

本文所用的术语" dHax3-NI，，是指 dHax3 的一种变体，其中在 DNA 结合域第七个重复单元中的 NS通过点突变技术变成 NI以获得与相应 DNA链更特异性的结合能力。 dHax3-NI与 dHax3 都具有特异识别如下 DNA序列的能力： TCCCTTTATCTCT。

？. - 本文所用的术语 "dHax3-NI-A"是指 dHax3-NI 变体的蛋白序列

230-72 1的截短体。

本文所用的术语" TALE₂₄重复单元"是指一种人工合成的 DNA结合域的重复单元，其具有 24个重复单元，具体设计和制备参见 P. Yin, D. Deng, C. Yan, X. Pan, J.J. Xi, N. Yan, Y. Shi, Specific DNA-RNA Hybrid 0 Recognition by TAL Effectors, Cell reports, 2 (2012) 707-713。

本文所用的术语" TALE_HIV重复单元"是指一种人工合成的的 DNA 结合域的重复单元，其特异性识别 HIV基因组中特定片段，具体设计和制备参见 P. Yin, D. Deng, C. Yan, X. Pan, J.J. Xi， N. Yan, Y. Shi, Specific DNA-RNA Hybrid Recognition by TAL Effectors, Cell reports, 2 (2012) 707-713₀

本文所用的术语 "dHax3-TALE₂₄重复单元"是指用 TALE₂₄重复单元 5 来置换 dHax3的 DNA结合域中的重复单元从而形成的嵌合蛋白。

本文所用的术语 "dHax3-TALE_HIV重复单元"是指用 TALE_HIV重复单元来置换 dHax3的 DNA结合域中的重复单元从而形成的嵌合蛋白。

由于所有 TALE蛋白中的 RVD识别 DNA碱基的分子机制相同，虽然不同的 TALE 蛋白存在一定序列差异性，但是涉及实施例中 dHax3 1 0 特异性识别 DNA-RNA 杂合双链的能力也同样适用于其他不同于实施例 dHax3序列的其他 TALE蛋白。同时，未使用表 1 中 RVD的 TALE 蛋白，例如具有 ND， N , NH, HG , N* ( *代表任意氨基酸）等等 RVD 的 TALE蛋白，都与 dHax3使用相同的分子机制识别 DNA, 也同样具有识别 DNA-RNA杂合双链的能力，所以也在本专利的保护范围之内。

: 实施例中所采用的各种试剂，包括緩冲液、酶、载体、试剂盒等，均可通过商业途径购得或者按照《分子克隆实验指南》第三版 (黄培堂, 科学出版社， 2002)所推荐的方法配制。实施例

?.0 实施例 1 : 几种 TALE蛋白的构建以及纯化

I 分子克隆及表达载体构建的实验方法如下：

» PCR扩增目的基因片段

50 μΐ标准 PCR反应体系组成如下表所示，如有需要可按照比例扩增体系；

25 50 μΐ PCR反应标准体系

成分体积（μΐ)

Ex Taq 0.25

Ι ΟχΕχ Tag 緩冲液 5

dNTP 4

DNA模板 2.5 ng

5' 引物 1

3 ' 引物 1 ddH₂0 补齐至 50 μΐ 成功扩增目的片段后，直接使用普通 DNA回收试剂盒回收扩增的目的基因片段。注意，如果是点突变的扩增基因片段需要先使用琼脂糖凝胶电泳去除 DNA模板，然后使用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收目的基因。

•限制性内切酶处理扩增片段和载体

使用相同的限制性内切酶处理扩增片段和载体，从而产生相同的 DNA粘性末端。 50 μΐ双酶切反应体系成分如下表所示：

50 μΐ标准双酶切反应体系

组分体积（μΐ)

PCR扩增片段或质粒 42 10χ酹切緩冲液（NEB 緩冲液 4) 5

Ndel 1.2 Xhol 1.8

： ϋ

37 °C温浴 30〜180 min, 估计反应完全后，进行凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒切胶回收 DNA片段。

• DNA连接

使用 T4 DNA连接酶将酶切后的目的基因片段连入载体， 16°C或室：5 温反应 30〜120 min。连接体系如下表所示：

10 μΐ标准连接体系

组分体积（μΐ)

酶切后目的基因片段 7

酶切后载体 1

10χΤ4连接酶緩沖液 1

Τ4 DNA连接酶 1 肇转化

将连接产物按照下述方法转入 DH5a感受态细胞中 , 准备筛选阳性 ?.0 克隆：在连接产物中加入 50~100μ1 ΟΗ5α感受态细胞，水上放置 30min;

42 °C热击 90s; 水上放置 2min; 将所有产物加到氨节抗性琼脂平板上，用涂布棒涂匀， 37 倒置培养 14- 16小时。

攀使用菌落 PCR法筛选阳性克隆

在前一步得到的平板上标记 4〜8个菌落，使用如下体系检验阳性克隆：菌落 PCR体系

成体积 (μΐ)

Taq 0.2

Ι ΟχΕχ Tag 緩沖液 3

dNTP 2

DNA 模板囷洛

5' 引物 0.3

3' 引物 0.3

ddH₂0 补齐至 30 μΐ 使用凝胶电泳确认结果，挑取阳性克隆，在氨苄抗性 LB培养基中 37 °C、 220 rpm培养过夜。

: 0 馨质粒提取

使用普通质粒小提试剂盒提取质粒，测序由金唯智（genewiz ) 生物科技有限公司完成。

馨重组蛋白的诱导表达

为了获得大量纯化的蛋白，需要进行过量表达。现有的过量表达体

: s 系有大肠杆菌 ( co/ )、酵母、昆虫细胞等。不同的蛋白可能适合在不同的体系中表达。目的蛋白是革兰氏阴性菌中的一种蛋白，所以选择大肠杆菌作为表达体系进行蛋白表达纯化。

纯化出性质好，纯度高的蛋白质是进行生化实验及结晶实验的前提条件。从大肠杆菌中纯化重组表达蛋白技术已经相当成熟。为了方便的

?.0 使用亲和层析进行纯化，构建了带有各种标签的重组蛋白。经过比较，采用带有组氨酸标签的重組蛋白进行后续实验。 6个组氨酸组成的组氨酸标签可以以配位键的形式结合到带有镍等金属原子的柱材上。经过镍柱亲和层析和肝素亲和层析纯化就可以得到纯度大约 95%以上的蛋白。

具体纯化步骤如下：接入 50ml 含有氨苄青霉素或者氨苄青霉素 /氯霉素双抗的 LB培养基，并置于 37°C摇床培养过夜。

b. 将 5-10ml 的小瓶培养液转接到 1L含有抗生素的 LB培养基于 5 37°C摇床培养约 3小时。当 0D600=0.8~1.0时，加入 0.2mM 终浓度的 IPTG22°C诱导表达 14〜16小时。

c 完成诱导的大肠杆菌于 4°C4400rpm离心 lOmin, 弃上清。每升培养液离心收集的湿菌用 20 ml 裂菌液（25 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl ) 重悬。

: o d. 超声破菌后， MOOOrpm离心 50min, 取上清进行后续纯化。

e. 将上清緩缓加入事先用裂菌液（25 1«]^丁1^-1"^1 1^ 8.0， 500 mM NaCl ) 平衡好的镍柱中。将穿过液重复上述操作 1〜2次。

f. 加入清洗緩冲液 I ( 25 mM Tris-HCl pH 8.0， 1000 mM NaCl ) 10ml, 除去部分杂质。重复上述操作 3次。

： s g. 加入清洗緩沖液 II ( 25 mM Tris-HCl pH 8.0; 100 mM NaCl; l OmM Imidazole ) 10ml , 进一步除去杂蛋白。

h. 加入洗脱緩冲液（ 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 300mM

Imidazole ) 10ml, 将目的蛋白从镍柱上洗脱。用考马斯亮蓝 G-250检测是否洗脱干净，如洗脱不完全，重复上述操作。

0 I. 将洗脱下来的蛋白緩緩加入事先已用緩冲液 (25 mM Tris-HCl pH

8.0， 50 mM NaCl)平衡好的肝素柱（ heparin sepharose 6 Fast Flow ) 。将穿过液重复上述操作 1〜2次。

j. 加入清洗緩沖液 I ( 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl )

10 ml, 除去杂质。重复上述操作 3次。

5 k. 加入洗脱緩冲液（ 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 1000 mM NaCl, 10 mM

DTT ) 〗 0ml，将目的蛋白从肝素柱上洗脱。用考马斯亮蓝 G-250检测是否洗脱干净。如洗脱不完全，重复上述操作。使用 SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。

1. 经过上述两步亲和层析纯化得到的蛋白，使用超滤浓缩管浓缩到 0 〜10mg/ml。最后使用分子筛（Superdax 200) 进一步纯化蛋白并检测蛋白性质，分子筛所使用的緩冲液为 25 mM Tris-HCl pH8.0， 150 mM NaCl, 10 mM DTT。使用脱盐柱 ( Hiprep 26/10 ) 将 dHax3(23卜 720)蛋白所在緩冲液置换为 25 mM MES pH 6.0， 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, lOmM

DTT。

2. dHax3及 dHax3-A的构建与表达

dHax3( designed Hax3)基因通过全基因合成得到，序列如下（ SEQ

1DNO:! ) ：

-14-

合成的基因直接被连入 pET300 ( invitrogen )质粒。表达出来的全长蛋白， N端有 6个组氨酸标签，用于蛋白纯化时通过镍柱的亲和纯化。

LPQ

dHax3全长蛋白的纯化图如图 5所示（利用 6 χ组氨酸标签经由镍柱亲和层析纯化， SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝显色）。

通过蛋白质二级结构预测，发明人发现蛋白质的 N端和 C端都有 -大段没有二级结构区域。这些区域不适合蛋白质结晶，发明人于是设计了截短体蛋白（dHax3 截短体，标记为 dHax3-A ) , 包含蛋白序列 230-721 ) 来获得性质更加稳定的蛋白质。 dHax3 截短体被克隆到 pET21(Novagen)表达载体中。表达出来的 dHax3截短体蛋白序列如下，其中 C端含有 His₆标签，用于蛋白纯化时通过镍柱的亲和纯化（SEQ ID

DPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKLEHHHHHH

dHax3截短体蛋白的纯化图如图 6所示（利用 Histidine₆标签经由镍柱亲和层析纯化， SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝显色）。

3. dHax3 -NI及 dHax3 -ΝΙ-Δ的构建与表达

发明人还构建并表达了 dHax3-NI-A蛋白用于与 DNA-RNA共结晶实验，在 DNA结合域第七个重复单元中的 NS通过点突变技术变成 NI ，并且构建并表达了 dHax3-NI用于 EMSA实验以及 RNase H 酶切保护实

-NI-A的氨基酸序列如下 ( SEQ ID NO:4 ) ：

PALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKLEHHHHHH

4. TALE₂₄重复单元及丁八！^^^重复单元的构建

另外设计了两种 TALE的 DNA结构域的重复单元（TALE_HIV重复单元和 TALE₂₄重复单元）。相应 DNA结合域的重复单元通过合成得到。在合成的 DNA结合域的重复单元两端分別存在 Spel 和 Sail的限制性酶切位点。 TALE₂₄重复单元以及 TALE_HIV 重复单元的 DNA序列和蛋白序列如下表 2:

-81-

.1.100/Z10ZN3/X3d -61- LLOOiVOVOJLL VDOOV VVV OO丄 ΟΟ丄丄 V丄 VV丄 OV丄:) OJLLVO O

V丄 O丄丄 OVV3丄 VO丄:) ZLOVV丄：) VOO VC DOVV)丄 O丄:)丄 ) JLLOV

丄 3：)丄:) VO VVDVIOO VVVO:)丄 3丄:) OOV3VVV:>£)0丄 00丄 VV VV丄

£)V丄：) OIJLVO OV丄 0丄丄 OVV ODOO V:)丄:) iOO V DOVV:)丄

0L3丄 LLOV : 丄：) O丄：) 丄 OCOVVVOIX 丄：) OOV JVVV

OO丄丄 V 丄 OV丄：) OljyEOOVJLaLlOVVDCOOEODCOV:)丄:)：)

OO V C OVV 丄 0丄：)丄 LLOV C O丄:) VO VVDO丄 C VVVO丄

丄:)丄 3OOV VVV OO丄 OOOOO丄 VV10V丄： iOiJLVO OV丄 0丄丄 ovv:>o

OOV C OVVI VOO V OVV:)丄 0丄：)丄：) JLLDVDDV丄：)11：)：)0：)¥

V3:D丄 033VOVOJLL:)丄：) OOViDVVV OO丄 OO Vi LV 丄 0V丄:) OllVO

OV丄 OliOVVO丄 V0丄：)：)丄:) VV丄：) VOOIDV OVV IOL:)丄:) nov

丄：)：)丄:) VO VV V!DO VVVi):)丄:)丄:) OOVJVVVDOO丄 00丄 VV V

V丄 0V13011V{)30V丄 OLLOVV 丄 VOV V:)丄:) 丄:) OVV

31011ΐ:)1 0ν:):)1 : 丄：) O OVDiiOO VOVO X V OOVi

V OOLOOLLV丄 VV丄 0V丄：) OLLVO OV丄 OLLOVVDC OVCm VV丄 3

VOO V J OVV 丄 0丄:)丄:) XIOV V丄:) l DO VV lOi VOVO

UO丄：) OOV3VVV OO丄 OO VO丄丄 ov丄:) 0 VO OV丄 0丄丄 OVV

O OO DD V:)丄:) >00:)V:):):)OVV:)丄 0丄：)丄:) JLLOV :) )丄：) 0丄:) VD3

VV30丄 OODVVViXLLO丄 OOV:)VVV:)£)O丄 OODVOIYC)丄 0V丄：) 911V

0:>OVJ )丄 lOVV O ElDOD V:)丄 OO VO ODVV )丄 £)丄: >丄:) JLL

丄 30丄:) VO VV OlO VVVOll 丄：) OOVDVVV OO丄 oooo

01VV10V13911V930V10110VV30DOV0333VV13VD03V333

OVVD丄 0丄:)丄:) liiDV ViaLL DDDVVOlO V Oli:)丄:)

3VVV300100DV01V310V130HV039V10119VV303003333

V3丄：) OO iV iOOVV)丄 0丄：)丄：) 110V33:)丄:) O丄：) VO VVDO丄 0：) )

VVVOLL 丄:) DOV VVV OO丄 OOOOO丄 VV丄 9V丄:) 01XV0:)0V丄 OJ_L

0VV303E)V:):):):)VV丄：) VOO V i OVV:)丄 0丄:)丄) JLLOV JV丄:) 11

OOVV C)丄 OOVOVOii:)丄) OOV VW OO丄 OCOVOIVD丄 OV丄：)

£)jjyo:)ovio丄丄 O O OO i OV:)丄:) OO V O JOVV:)丄 0丄:)丄

aULOVCO:)丄：) 0丄 ) V03VV30丄 E DVVVOli:)丄：) OOVOVVVJOO丄 0

90001VV10V1D0JLLV030V1011DVV303D0D33DV31DD003V

OVV 丄 0丄:)丄:)丄丄 OV :) )丄：) 0丄:) VO JVV OIO VVVOJLL 丄：)

09V3VVV39OlOO3V91V31OV130 iVO39V10ii0VV393OO3

)V:)丄:) DOO V DVV:)丄 0丄:)丄 3JLLOV:):):)丄：) 0丄:) V03VVOO丄

O V Oli 丄：) OOV3VVV OO丄 00000丄 VV丄 OVl OilVO OV丄

0丄丄 0VV3丄 VOV :>:) )V:)丄：) VOO V 丄：) OVV 丄 DULL:)丄丄 0V33丄丄:)

：)丄：) [iO OV LLOEOVOVOlJL V OOV VVV iOO丄 OOUVIYV丄 DV

丄 30丄丄 VO DV丄 0丄丄丄 VOV Vl VOO V C OVV:)

£)丄:)丄:) IJ VD VI V丄：) VOOOV LLOL VOVOLL V OOV VVV

3001009001VV10V1391J.V03DV1D11DVV31V0V333DV113V

OO JVDC OVV O丄:)丄：) JLLOV V丄 ) V丄:) VO OV JLLO丄：) VOVO丄

丄：) V OOV VVViOO丄 OOOOO丄 VV丄 0V丄：) OJLLVO OV丄 0丄丄 OVV O

OOCOC iV L OC V OVV:)丄 0丄：)丄:) llOVJ i O丄 3VO0V

V O丄 9 3VVV0 1:)丄 OOV VVVOOi)丄 OOOOO丄 VV10V丄:) £JJLV£)

0 :3丄：) o丄:) vo>vv)o丄 Ε νννοιι 丄:) oov:>vvv:)i oo:)vo

OV :)V丄：) IX O VV 丄 OV VOVOli DOOV ( O VVV3O91OO0VO1V319V13OJJLVO3OV19U.OVV393OVD333V

V丄:) vo£) v:):):)ovv:)丄 0丄:)丄：) XIOV V丄： JL OJVV IO V αι 0HS ) · OVOU 丄：) OOV VVV3OO丄 OO VO丄 V3丄 £) 1 V:)VOVVOV丄:) JJY H^¾nv丄

0 fi ^ νκα 古罩 3iv丄

Z.l.l00/3l03M3/X d - -

°^¾"fp :)voaLO) Il^S 4(丄 DV丄 3V) ds

VlH39VVVlVlDD130D¥03iQ0D003VDJ.V3 39V1D0JL1V0D9V10IJL9VVD030V33D3VVI5V003V3V30VV3

£)丄 )丄：) IIOV DV丄：) UL OO VV O丄 OV VOVOJJL OOOOV VVV

D091903VOXVD 0V1DOJJ.VODOV 0119VV3030V3333VV13

V£)0)V:)V:)OVV:):)0丄 )丄 DilOV V丄 [Dil O VV ):)丄 OV3VOVC)

EOOO C VO丄:) OO VD DVVO丄 OLD丄:) X DV3: :)丄:) O丄:) VD3

丄 D VVVOli 丄 3OOV VVV:) )O丄 £)DOOO丄 VVIOV丄:) D1 V

COOV丄 O丄丄 OVV DZ^V VV丄:) VOCOV OVV:)丄 OL )丄:) 110

V3 V丄 LLDDO VV :)丄 ODDVOVOii:)丄：) OOV VVV OOLOO VO

丄丄 OV丄 OilVOOOV丄 0丄丄 {WV3丄 vo丄:)：)丄：) vv丄:) νοο ν ον

V 丄 0丄:)丄：) uov aL :)丄：) vcovv v丄 ocovvvo 丄:)丄：) οον ν

VV 9O丄 OOL VV丄 ον丄 oiivo ov丄 OXIO IYOV:):):):)V:)丄

：) 丄:) OVV )丄 DULL LLOV3)ii:):)丄：) DE OV llDDZiVDV

£)JLL3V OOV:)VVV:)OO丄 OO! OYV丄 0V丄:) DUYO OV丄 0丄丄

丄 V0丄 33丄: 丄:) VOO V OVV 丄 9丄：)丄：) ULOV 丄丄 ) VO V

V3V丄 OD VVVO:)丄：)丄：) OOVOVVV OO丄 0£)丄 VV VV丄 0V丄:) 01 V0

30V丄 OllOVV 丄 VOV OV 丄:) VOO V 丄:) OVV 丄 OLLLZ)丄丄 0V

：：)!!：)：)丄：) O DV iiOO VOVOllOV OOVWVV OOlOOllV丄

VV丄 £)V丄:) OllVO OVIO丄丄 OVV:)丄 VOL 丄: VV丄 DVOO V Z^OVV

：)丄 0丄:)丄: )！！£>¥：)：)：)丄:)：)丄：) VO >VV:)V丄 D3 VVVD:)丄:)丄：) 0£)V:)VV

V300丄 90丄 VV VV丄 OV丄:) OllVC DV丄 DllOVV 丄 VOV V 丄：）

V£)03V:)丄：) OVV IOLLL UOV:):)!!:):)丄 COO OV 丄丄 90 V9VO

ll VDOOViVVV OO丄 OOJJY丄 VV丄 0V丄 OllVODOVIO丄丄 DVV O

丄:) OO V OVV 丄 0丄:)丄:)！！£)¥：>：)：)丄：) 0丄:) V03V

V 9丄 OO VVVOli)丄：) OOVOVVV OOLOO VO丄 V 丄 0V丄: )Oi VO

OV丄 OJLLOVV:>0:)OV:):):)yVV丄:) VOO V i OVV:)丄 0丄： 3丄3丄丄 0V

Vi)丄丄 ί θ νν 丄 OCOVDVOUL 丄:) 0£VZ)VVV )00100:)V0丄

丄 0V丄：) OUYCOOVIO丄丄 OVV 丄 V0丄:)：)丄：) VV丄：) VOO ViZOOVV

3丄 0丄丄：) l OV 丄：)丄 ) VO VV V丄 OD VVVfD:)丄:)丄:) 00V3VV

V300丄 00丄 VV VV丄 0V丄：) OliVC OV丄 OLLOVV:)丄 VOVD V )丄:）

V£)£)3V)丄:) OVV3丄 01 13110¥：)：)11：)：)丄OC OV:)丄丄 90 VOVO

HDyDOOVDVVVDDDlOOllVlVyiOVlJOllVODDVlOllOVyDO

iDOO V 丄：) OO V OVVZ)丄 0丄:)丄 31X0V:):):)丄:) 0丄:) V03V

V OLO VVVOi 丄：) OOV VVV OO丄 OOOOO丄 VV丄 OVI OilVO

0OV丄 OJLLOVV ODOO i V)丄：) OO V OVV 丄 0丄:)丄：)丄丄 3V

3：)丄:) 0丄:) V0:DVV)0丄 O VVVOl 丄:) OOV VVV Oi OOOOO丄

VV丄 0V丄：) 01XVO OV丄 0丄丄 0VV31V0丄:)：)丄：) VV丄:) VDO r ZJOVV

丄 0丄：)丄:) XXOVD D丄:) 3丄：) VO3VV V丄 O VVVO 丄：)丄：) OOV VV

丄 00丄 VV VV丄 0V丄：) OUYCOOVIOIIOVV )丄 VOV3:O:)V:)丄：）

V093VO丄：) 丄 Oil DllOV ):)!!):)丄: OO OV JLLOCOVOVO

JJ^V OOV VVVOOO丄 0011V丄 VV丄 0V丄：) OULVO OV丄 0丄丄 ovvoo

003 ：)：)¥：)丄:) OO V OVV 丄 0丄：)丄 ilOV :):)丄:) 0丄 3V03V

V30丄 OOVVVOii:)丄:) OOV VVVDOO丄 OOOOO丄 VV丄 0V丄:)

ov丄 aLLOvv o oo ^v L oc v iovv LaLaL LLOv

3：)：)丄：) 0丄：) vo vv o丄 OD VVVOU 丄:) οον:>ννν:)θθ丄 ocovo

丄 v i v丄 3θΐινο:)ον丄 oLLovv jc ovcm vv丄:) voo vzmo .

VV 丄 0丄:)丄：)丄丄 OV DVl lliJO VVi LO i VOVOil lDOOV:) ( 80N

VVVD091003V91VD10V1391XV0D0V19JLL0VV3030VDD33V Q\ ^HS Y^~k

V丄:) VOOOVDCOOVV 丄 OLOL LLOVCOV丄： XLLDDO VV ))丄 EO V _Λ1Η ' , θνθϋΖ)丄 3D0V VVV:>0D丄 OOOVaLV JLO^L VOVVOV丄 3X1V 泰 ^31V1

"^― VJXiDOVVV

丄 v丄：) aL Di ajDo oo丄 vv:> 30v丄：) auYO Dv丄 u,ovv:>丄

VOViD VC^ci SiD V:)丄:) OVV 丄 OJJLL JJ )V:):)113:)丄：)

68^0l/£lOZ OAV 表 3显示了实验中涉及的 TALE重复单元的 RVD与其识别的 DNA对应关系：表 3: 实验中涉及的 RVD与 DNA碱基序列的对应关系

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 1 5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 dHax3-NI τ C C C T T T A T C T C T

HD HD HD NG NG NG NI NG HD NG HD NG

24 τ C C C T T T A T C T C T C T C C A G C T C G A G

HD HD HD NG NG NG NI NG HD NG HD NG HD NG HD HD NI NN HD NG HD 爾 NI NN

HIV τ C C C T A G T T A G C C A G A G A G C T C C C

HD HD HD NG NI 爾 NG NG NI NN HD HD NI 爾 NI NN NI NN HD NG HD HD HD

5. dHax3-TALE₂₄重复单元嵌合蛋白与 dHax3-TALE_fflV重复单元嵌合蛋白的构建

将合成的 TALE₂₄重复单元或 dHax3-TALE_HIV重复单元插入 dHax3 基因的 Nhel和 Sail之间，从而取代 dHax3重复单元形成两种嵌合蛋白 dHax3-TALE₂₄重复单元与 dHax3-TALE_mv重复单元。实施例 2 : 获得 dHax3-A 与双链 DNA 的复合物晶体结构以及 dHax3-NI-A与 DNA-RNA双链体复合物的晶体结构

•单双链 DNA的获得

为了检验 dHax3 与单双链 DNA 的结合能力，以及获得蛋白质与 dsDNA 复合物的晶体，发明人通过化学合成的方法得到单链 DNA ( 17nt ) ： ( Invitrogen & Takara )

5' TG TCCCTTTATCTCT CT 3， (SEQ ID N0.9 )

3' AC AGGGAAATAGAGA GA 5' (SEQ ID NO: 10)

将合成得到的单链 DNA溶解至 1 mM，等摩尔比将两条单链 DNA 混合， 85 °C 温浴 3 min以上，緩慢降温到 22°C，此过程不得少于 3个小时。为了长期保存退火的双链 DNA可以进行冻干超低温保存。

• DNA-RNA杂合链的获得

为了检验 dHax3与 DNA-RNA杂合链的结合能力，以及获得蛋白质与 DNA-RNA复合物的晶体，发明人通过化学合成的方法得到单链 DNA ( 17nt ) 和 RNA： (核酸的合成由 Invitrogen & Takara公司完成）

DNA 5' TG TCCCTTTATCTCT CT 3' (SEQ ID NO:9)

RNA 3' AC AGGGAAAUAGAGA GA 5' (SEQ ID NO: l l) 将合成得到的单链 DNA或 RNA溶解至 1 mM, 等摩尔比将两条单链混合， 85 °C 温浴 3 min以上，緩慢降温到 22°C，此过程不得少于 3 个小时。为了长期保存退火的 DNA-RNA杂合链可以进行冻干超低温保存。

*复合物结晶的获得

将纯化好的 dHax3-A (全长序列中的 231-720)调整蛋白浓度在 6〜7 mg/ml , 加入摩尔比 1.5 ： 1的退火后的双链 DNA, 4 °C孵育 30 min. 前期的结晶条件筛选主要是基于商业化的 Screen Kit , 包括： Hampton公司的 SaltRX, Natrix, PEG/Ion, Crystal Screen, Index; Emerald 公司的 Wizard I, II , III ； Molecular dimension的 ProPlex。

从上述 Kit中筛选出蛋白结晶的条件，通过调节沉淀剂浓度，种类；盐离子的浓度和种类；緩冲液的浓度和种类优化结晶条件。使用 Addtive Screen和 Detergent Screen Kit对晶体进行优化。同时对晶体进行脱水，退火等尝试，以提高晶体的衍射质量。

使用蛋白质结晶没有规律可循，所以到目前为止仍然还是一门艺术。起始阶段常用 Sparse matrix screen, 即购买各公司配置的结晶条件进行筛选。大多数情况下，初筛得到的结晶条件中并不能长出衍射质量高的晶体，在接下来的实验中，发明人又进一步对初始结晶条件的基础上进一步细化，包括调整沉淀剂、 pH 緩冲液、盐、添加还原剂、去垢剂或醇；调整结晶实验的温度，时间等。最后采用的结晶条件为将如下结晶母液与孵育好的蛋白核酸复合物通过 1 : 1的体积比混合，通过悬滴法 ( hanging drop vapor diffusion method ) 在 18 °C培养两天，即可获得晶体。

结晶母液： 8-10% PEG3350 (w/v)， 12% ethanol, 0.1 M MES pH 6.0。攀数据收集及处理

使用上海同步辐射中心（ SSRF ) BL17U线束站或者日本 SPRING-8 BL41XU线束站进行数据收集。所有收集的衍射数据用 HKL2000软件进行积分计算，进一步的数据处理通过 CCP4 软件实现。使用不结合 DNA的 dHax3作为置换的模式，通过分子置换的方法，解析 dHax3与 DNA复合物的结构。最后使用 Phenix 和 COOT 两个软件完成对结构的修正处理。数据处理和结构解析、修正完成之后， dHax3蛋白的结构分辨率达到 2.4A， dHax3-A 蛋白与 dsDNA 复合物结构均达到 1.85A; dHax3-NI-A蛋白结合 DNA-RNA双链体的晶体结构达到 2.5 A。数据收集和结构修正的统计数据，见表 4-表 5: 数据收集和结构修正的统计数据

表 4. dHax3晶体结构以及 DNA-结合的 dHax3-A复合物晶体结构的数据收集和结构修正的统计数据

数据 dHax3 (270-703) DNA-结合的 dHax3-A

Integration Package HKL2000 HKL2000

Space Group C222, P2,

Unit Cell (A) 74.76, 95.51, 153.21 81.719, 87.679, 88.494

Unit Cell (°) 90, 90, 90 90.00, 103.04, 90.00

Wavelength (A) 0.97915 1.00000

Resolution (A) 40-2.4 (2.49-2.4) 40-1.85 (1.92-1.85)

R-merge (%) 4.9 (35.0) 6. 1 (60.8)

1/sigma 24.1 (4.4) 22.5 (2.6)

Completeness (%) 95.6 (98.2) 99.7 (99.9)

Number of measured 84,417 391 ,380

reflections

Number of unique 20,832 】03,239

reflections

Redundancy 4.1 (4.1) 3.8 (3.7)

Wilson B factor (A²) 60.9 24.6

R 1 iree (%) 21.1 1/ 26.36 19.07 1 21.99

No. atoms

Overall 2760 9579

Protein 271 1 7066

DNA 0 1383

Water 49 1 130

Other entities 0 0

Average B value (A²)

Overall 63.86 33.26

Protein 63.89 31.94

DNA 0.0 33.98

Water 62.47 40.58

Other entities 0.0 0.0 R.m.s deviations

Bonds (A) 0.009 0.008 Angle (。） 1.301 1.184

Ramachandran plot

statistics (%)

Most favourable 92.7 93.5 Additionally allowed 7.3 6.5 Generously allowed 0.0 0.0 Disallowed 0.0 0.0

表 5.dHax3-NI-A-DNA/RNA 双链体复合物晶体结构的数据收集和结构修正的统计„

dHax3 -ΝΙ-Δ-DNA/RNA双链体

Data collection

Space Group P6,

Cell dimensions

a, b, c (A) 99.74, 99.74, 134.49

a, β, γ, (。 ) 90, 90,】20

Resolution (A) 40-2.50 (2.59-2.50)

merge (%) 9.9 (68.8)

1 / σΐ 16.5 (2.4)

Completeness (%) 98.4 (99.2)

Redundancy 4.0 (4.0)

Refinement

Resolution (A) 40-2.50

No. reflections 25,803

R-work I R-t'ree (%) 19.29/ 24.26

No. atoms

Protein 3522

DNA/RNA 687

Water 56

B - factors

Protein 5 1 .30

DNA/RNA 46.00

Water 39.77

R. m. s. deviations

Bond lengths (A) 0.008

Bond angles ( ° ) 1 .3 10

Ramachandran plot statistics

(%)

Most favoured 94. 1

Additional allowed 5.9

Generously allowed 0.0

Disallowed 0.0

发明人解析了 dHax3-A与双链 DNA ( dsDNA ) 的高分辨率晶体结构（ 1.85埃）。该结构清晰地展示了 dHax3展现右手螺旋结构，将 dsDNA 包裹于整个复合体的中间。蛋白质缠绕在 DNA外面，嵌入 DNA的大沟 (见图 1 ) 。

结构分析显示 dHax3与 DNA的相互作用主要集中于具有识别序列的 DNA链，而其互补链则不参与蛋白 -DNA的相互作用（见图 2 )。即使互补链变成 RNA, dHax3也应同样能结合。结构分析还进一步显示： 5 非编码链不直接与 dHax3接触，因此可以容忍相当程度针对碱基及骨架的修饰，即非编码链可以是 DNA、 RNA, 或者它们的衍生、修饰后分子。

图 4 ^示了 dHax3-NI-A与 DNA-RNA杂合双链复合物的晶体结构。实施例 3:凝胶阻滞实^ ^验证 dHax3-NI可以与 DNA - RNA 杂合双

! 0 链相互作用

• EMSA ( electrophoretic mobility shift assay, 电泳迁移率变动分析，又称凝胶阻滞实验）

凝胶阻滞实验是一种体外研究 DNA/RNA 与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。其基本原理为：在凝胶电泳中，由于电场的作用，

1 5 小分子的核酸片段比其结合了蛋白质的核酸片段向阳极移动的速度快。

因此，可标记短的核酸片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的 DNA与特异性蛋白质结合，其移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射自显影，就可以找到核酸结合蛋白。同时通过统计结合蛋白的 DNA 和未结合蛋白的 DNA 的量，可以比较准确的拟合计算出， ?.0 蛋白质对核酸的结合能力（ binding affinity ) 。

• DNA/DNA oligo和 DNA/RNA oligo

用于凝胶阻滞实验的 DNA/DNA oligo的片段，如下表所示：

49 -正义 5 ' ccacatatgtcatacg TGTCCCTTTATCTCTCT ccag etc gag gaa ttc

(SEQ ID NO : 12)

49-反义 5 ' gaattcct gagctgg AGAGAGATAAAGGGACA cgta tga cat atg tgg

(SEQ ID NO: 13)

25 用于凝胶阻滞实验的 DNA/RNA oligo的片段，如下表所示:

4 -DNA 5 ' ccacatatgtcatacg TGTCCCTTTATCTCTCT ccag etc gag gaa ttc

(SEQ ID NO: 12) 49-RNA 5、 gaauuccucgagc gg AGAGAGAUAAAGGGACA cgua uga cau aug ugg

(SEQ ID N0: 14)

• DNA/RNA ^端 i己

待磷酸化 DNA 1 ~ 20 pmol(5'末端）

反应緩冲液 A(10X) 2 μΐ

[γ- ²Ρ]-ΑΤΡ (3,000Ci/mmol) 20 pmol

补充无核酸酶的去离子水至 19 μ1

T4多聚核苷酸激酶 (lOU/μΙ) 1 μΐ 按照上表设置好反应体系后，轻轻混匀，置于 37 °C孵育 30 min; 使用 G25 预装脱盐层析柱出去多余的 [γ-³²Ρ]-ΑΤΡ, 加入过量的未标记的互补链，退火生成双链 DNA或者 DNA-RNA 杂合双链。

• DNA/RNA和蛋白相互作用体系

将反应成分按上述比例加入反应体系中，混匀后 4 °C孵育 20 min; 将反应好的样品跑 6 % 非变性胶；

跑完胶用千胶仪将胶干透，放在磷屏上曝光过夜；

用 Typhoon 9400 varible 扫描仪读取图像数据。

发明人通过凝胶阻滞实验证明了 dHax3-Nl蛋白可以与 DNA - RNA 杂合双链相互作用，并保持了很强的结合能力，详见图 3。实施例 4： RNase H晦切保护实验验证用于 RNase H酶切保护实验的 DNA-RNA链的序列如下： dHax3 DNA 5' CCACATATGTCATACGTGTCCCTTTATCTCT (SEQ ID NO;15)

(SEQ ID NO:16)

TALE24 DNA 5' CCACATATGTCATACGTGTCCCTTTATCTCTCTCCAGCTCGAG (SEQ ID NO:17)

(SEQ ID NO: 18)

TALEHIV DNA5' GTGGGTTCCCTAGCCAGAGAGCTCCC (SEQ ID NO:19)

RNA5' AG AUC UGAGCCUGGG AGC UCUCUGGCUAACUAGGG A (SEQ ID NO:2Q) 获得 DNA-RNA杂合双链的与 EMSA实验相同，但是用于 RNase H 酶切保护实^ ^的 DNA-RNA的杂合双链进行了放射性标记。

5 将带有 P³²标记的 DNA-RNA双链核酸分别与上述三种 TALE蛋白质（ dHax3-NI、 TALE24和 TALE_HIV repeats )混合或者与作为对照的 BSA 混合后置于冰上孵育 20分钟。孵育的缓冲体系为： 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM DTT。孵育结束后加入 0.1 U/μΙ RNase H (Takara)于室温反应 5分钟，使用酚氯仿终止反应，使用乙醇

: o 沉淀纯化反应后生成的核酸片段。经过醇沉处理的样品重悬于 RNA-上样緩冲液（95%曱酰胺、 18 mM EDTA, 0.025% 二甲苯蓝，0.025% 溴酚蓝）。样品使用 12% 7 M尿素聚丙烯酰胺凝胶进行鉴定。跑完胶用干胶仪将胶干透，放在磷屏上曝光过夜；使用 Typhoon 9400 读取图像数据。 RNA梯带使用 RNase T1或者 RNase A酶切 ssRNA制备。

! 5 如图 8所示， dHax3-NI 保护 DNA-RNA,阻止 RNase H对 DNA-RNA 杂合双链中的 RNA的酶切。第 1和 2道分别为在没有 RNase H情况下，有或者无 dHax3 的对照组中， RNA没有明显的降解条带出现；在第 3 道中，加入 RNase H情况下，无 dHax3的对照实验发现： RNA绝大部分都被降解成小片段；在第 4~10道中在加入 RNase H情况下同时加入 0 梯度浓度的 dHax3-NI ( 0.004, 0.015, 0.05 , 0.025, 0.1 , 0.4, 1.6 μΜ ) , 出现如箭头所示的部分降解 RNA 条带，这些 RNA 条带直接说明了 dHax3-Ni结合到 DNA-RNA双链上，直接起到了保护的作用，阻止了 RNase H对 DNA-RNA双链中 RNA链的降解。 13和 14道分别为制备的 RNA梯带（ T1和 A ) 用于检测 RNase H的在 DNA-RNA杂合双链中的剪切位置。

为了研究 TALE蛋白对 DNA-RNA双链保护作用是否具有普遍性，即这种保护作用是否只存在于 dHax3—种 TALE蛋白 ,发明人设计了另一种具有不同长度的重复单元—— TALE24重复单元，其具有 24个重复单元，能识别更长的 DNA-RNA杂合双链（参见 P. Yin, D. Deng, C. Yan, X. Pan, J.J. Xi, N. Yan, Y. Shi, Specific DNA-RNA Hybrid Recognition by TAL Effectors, Cell reports, 2 (2012) 707-713 )。如图 9所示，通过 RNase H保护实验，发明人惊讶地发现 dHax3-TALE₂₄重复单元嵌合蛋白也可以保护 DNA-RNA, 阻止 RNase H对 DNA-RNA杂合双链中的 RNA的酶切。因此， TALE24重复单元同样可以阻止 RNase H对 DNA-RNA双链中 RNA链的降解。

为了研究 TALE在 HIV治疗中的潜在作用，发明人设计了可以特异性识别 HIV基因组中特定片段的 TALE_HIV重复单元（参见 P. Yin, D. Deng, C. Yan, X. Pan, J.J. Xi, N. Yan, Y. Shi, Specific DNA-RNA Hybrid Recognition by TAL Effectors, Cell reports, 2 (2012) 707-713 ) , 并构建了 dHax3-TALE_HIV重复单元嵌合蛋白进行 RNase H降解实验。发明人惊讶地发现， TALE_HIV重复单元阻止 RNase H对 DNA-RNA双链中 RNA链的降解。如图 10所示, 在梯度浓度的 dHax3-TALE_HIV重复单元（0.004， 0.015, 0.05 , 0.025 , 0.1 , 0.4, 1.6 μΜ ) 蛋白保护下 RNA 的降解逐渐减弱。这里没有出现部分降解的原因是因为暴露在 TALE_HIV重复单元保护外面的 DNA-RNA双链较短。这表明具有 TALE_HIV重复单元的 TALE 蛋白能够在 HIV基因组的复制过程中，阻止 RNA链的降解。

HIV在核酸复制过程中，通过逆转录酶将 RNA逆转录生成 DNA, 进一步逆转录酶上的 RNase H 结构域将 RNA 降解，得到释放的单链 DNA会利用 DNA聚合酶复制出互补 DNA链，形成 DNA双链，因此 DNA-RNA双链中 RNA的降解是 HIV复制过程中一个必须环节。利用识别 HIV基因组中特定片段的 TALE能够阻止 HIV基因组在复制过程中， RNA链的降解。从而达到抑制或者减緩 HIV复制过程的功能。

尽管在本文中参考示例性的实施方案详细描述了本发明，但是应当理解的是，本发明不限于所述实施方案。具有本领域普通技能且可获取本文教导的人员会认识到在本发明范围内的其它变化、修改和实施方案。因此，本发明应与后面所述的权利要求一致地被广义地解释。

Claims

权利要求

1. 一种特异结合 DNA-RNA杂合链的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别特定的 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

2. 一种抑制以 RNA为模板来生成 DNA的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

3. 一种抑制以 RNA为引物、 DNA为模板来生成 DNA的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA 杂合双链并与之结合。

4. 一种抑制以 RNA为引物、 DNA为模板来生成 RNA的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA 杂合双链并与之结合，条件是生成的 RNA能与 DNA形成暂时稳定的双链体。

5. 一种保护 DNA-RNA杂合链中 RNA分子不被 RNA水解酶 RNase H 降解的方法，包括用 TALE及其衍生蛋白来特异性识别 DNA-RNA杂合双链并与之结合。

6. 权利要求 1 -5中任一项的方法，其中所述 TALE蛋白为自然界已有的 TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强 DNA、或 DNA-RNA杂合链结合能力的 TALE衍生蛋白。

7. 权利要求 1 -5 中任一项的方法，其中所述 DNA 还包含修饰的 DNA衍生物，包括但不限于曱基化碱基、羟曱基化碱基。

8. 权利要求 1 -5 中任一项的方法，其中所述 RNA 还包含修饰的 RNA衍生物，包括但不限于曱基化碱基、羟曱基化碱基。

9. 权利要求 1或 2的方法，其中所迷方法用于抑制逆转录病毒的复制。

10. 权利要求 9的方法，其中所述逆转录病毒包括人类免疫缺陷病毒、人类 T细包白血病病毒、鼠白血病病毒、劳斯肉瘤病毒。

1 1. 权利要求 1或 3的方法，其中所述方法用于抑制哺乳动物中的肿瘤细胞增殖。

12. TALE蛋白及其衍生蛋白在制备特异性识别 DNA-RNA杂合双链的试剂中的用途。

13. TALE蛋白及其衍生蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病。

14. 权利要求 13的用途，其中所述疾病为由逆转录病毒引起的人、畜、禽、植物疾病，例如人免疫缺陷综合症、人 T细胞白血病、人毛细胞白血病、鼠白血病、禽白血病等等。

15. TALE蛋白及其衍生蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治 5 疗或预防肿瘤。

16. 一种治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病的方法，其通过 TALE及其衍生蛋白来干扰以 RNA为模板的 DNA复制来抑制逆转录病毒的复制。

17. 一种治疗或预防肿瘤的方法，其中通过 TALE及其衍生蛋白来 ! 0 干扰以 RNA为引物的 DNA复制来抑制肿瘤细胞增殖。

18. TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于特异性识别 DNA-RNA杂合双链

19. TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于治疗或预防由逆转录病毒感染引起的疾病或用于治疗或预防肿瘤。

! 5