CN106455512A - 单倍体玉米转化 - Google Patents

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CN106455512A CN201580024275.1A CN201580024275A CN106455512A CN 106455512 A CN106455512 A CN 106455512A CN 201580024275 A CN201580024275 A CN 201580024275A CN 106455512 A CN106455512 A CN 106455512A
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T·L·斯特兰奇
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Abstract

公开了用于用位点特异性核酸酶转化雄性来源的单倍体细胞系的方法。在一些实施方案中，雄性来源的单倍体细胞系是玉米小孢子来源的植物组织培养物。此外，本公开提供了用于修饰(例如通过将供体DNA突变或靶向和整合到)单倍体或双单倍体组织基因组的特定基因座的方法。本公开进一步提供了可以从本公开获得从单倍体或双单倍体组织再生全植物的方法，所述组织包含在特定基因组基因座处的突变或在特定基因组基因座内整合的供体DNA。

Description

单倍体玉米转化
发明领域
本公开一般地涉及植物、植物组织和细胞系、再生植物、和用于在其中引入和/或重排核酸的方法。提供了用于在玉米雄性来源的单倍体细胞中转化(包括位点特异性插入)外源DNA和基因编辑的方法。
发明背景
转基因玉米生产通常涉及通过土壤杆菌(Agrobacterium)共培养或微粒轰击将转基因递送到二倍体体细胞组织，如未成熟合子胚的盾片区中。这些规程通常导致整合的转基因在原代转化体(T0)中“半合”并在T1植物世代中分离。将转基因转移到其它遗传背景中需要通过回交实现渐渗。因而，此类将转基因递送到二倍体体细胞组织或细胞的基因组中并将转基因转移到其它遗传背景中的方法有可能是费力、资源密集且耗时的。
使用编码位点特异性核酸酶的多核苷酸将转基因位点特异性地递送到二倍体植物基因组中的一个或多个预定位置(基因组编辑)可能造成另外一系列挑战，这是因为二倍体基因组具有两组相应的同源染色体，这些被编码的位点特异性核酸酶通过切割一对同源染色体中的一条或两条来修饰靶位点。由于切割位点的修复不完全造成的突变并不罕见。此外，由于基因组修复过程是基于模板的，修复过程可以使用外来的供体多核苷酸，也可以使用相应同源染色体上的等位序列作为模板。因此，在二倍体细胞中，相应的同源染色体上的等位序列可能与外来的供体多核苷酸竞争。当这一过程基于相应的同源染色体(而不是供体多核苷酸)而意外地修复了被切割的染色体时，会由此降低靶向转基因整合的效率。
已经描述了几种植物转化方法，其导致转基因随机整合到玉米的单倍体基因组中。这些方法包括通过聚乙二醇处理单倍体原生质体(Sukhapinda et al.,1993,PlantCell Reports,13:63-68；Jardinaud et al.,1995)，小孢子来源的胚样结构的微粒轰击(Protoplasma，187：138-143)和母本来源的胚的土壤杆菌共培养(美国专利号7,572,635)的转基因的随机整合。然而，仍然没有人探索过玉米的单倍体基因组中的选定位置的稳定的位点特异性(靶向)修饰。
因此，对玉米中的单倍体基因组进行稳定和靶向修饰的方法是为人期望的。
此外，单倍体细胞中仅有一套染色体，即，对于每个给定基因没有相应的等位序列，外来的供体多核苷酸作为模板容易为同源指导修复所获得，而没有相应同源染色体被当作修复模板的干扰，并且容易揭示突变。许多突变(例如敲除)的表型是隐性的，使得它们在二倍体组织中观察不到，但可以在单倍体中观察到。因此，在雄性来源的单倍体细胞系内借助位点特异性核酸酶进行转化和诱变，随后切割单倍体基因组DNA，并任选地在雄性来源的单倍体细胞系(例如小孢子来源的植物组织培养物的单倍体基因组)内靶向整合供体多核苷酸或靶向修饰特定序列(例如突变)，对用于上述过程的组合物和方法仍然存在需要。
因而，本公开提供了用于在雄性来源的单倍体细胞系(例如小孢子来源的植物组织培养物的单倍体基因组)内转化和递送位点特异性核酸酶的新组合物和方法。应用小孢子来源的植物组织培养物转化方法可以提高植物基因组内位点特异性核酸酶整合的效率，从而减少筛选大量转化事件的需要，进一步可降低完成这些类型的实验的相关成本和人员时间。例如，小孢子来源的植物的单倍体基因组的转化部署可以用于将供体DNA整合在特定基因组位点内，并且获得纯合植物，而不需要耗费金钱和人力筛选数万个植物事件。此外，使用雄性单倍体细胞系进行位点特异性核酸酶介导的定向诱变可以为隐性突变的高效鉴定和分离创造条件。
发明概述
本公开部分基于意外发现了一种通过玉米单倍体组织或细胞中的位点特异性诱变或供体转基因整合来稳定且靶向性地修饰单倍体基因组的方法。公开的基因组修饰方法可以与染色体加倍的方法一起使用，使位点特异性突变或转基因在完全固定的遗传背景中即时(instantaneously)变得纯合。此外，本文公开的在单倍体组织或细胞中稳定地修饰基因组的方法可以比其它二倍体组织中的方法更高效。在二倍体组织中，在第一条染色体上的每个基因组序列在第二条染色体上具有相应的等位序列，等位序列在同源性指导的修复作用(homology-directed repair)中充当模板，同源性指导的修复作用已经进化为可修复第一条染色体中插入的任何突变或转基因。相比之下，单倍体组织或细胞缺失相应的第二条染色体，即它们缺少通过同源性指导的修复作用所用来去除新引入的突变或转基因的修复模板。在一些情况下，外来的供体多核苷酸可以是同源性指导的修复作用最容易得到的模板，这样，有助于确保期望的靶向修饰稳定整合到单倍体基因组中。此外，公开的方法还可用于揭示具有隐性表型的稳定基因组修饰突变，例如敲除和基因失活。在二倍体组织中，隐性表型不明显，而在单倍体组织中，可以观察到导致隐性表型的此类靶向基因组修饰。
在一个方面中，本公开涉及用于修饰玉米基因组的方法，所述方法包括：提供玉米小孢子来源的、包含单倍体组织基因组的转化感受态单倍体组织；将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且确认所述单倍体组织基因组被编码的位点特异性核酸酶所修饰。在一些实施方案中，转化感受态单倍体组织是胚或愈伤组织。在公开的方法中，借助植物转化方法将编码所述位点特异性核酸酶多核苷酸的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织。在某些实施方案中，所述植物转化方法包括下组的任何方法：微粒轰击转化法，土壤杆菌转化法，磷酸钙转化法，聚凝胺(polybrene)转化法，电穿孔转化法，超声转化法，脂质体转化法，显微注射转化法，裸DNA转化法，质粒载体转化法，病毒载体转化法，碳化硅介导的转化法，气溶胶射束转化法(aerosol beaming transformationmethod)、和PEG转化法。在任何公开的方法中，位点特异性核酸酶多核苷酸编码选择的核酸酶，包括锌指核酸酶，TALEN核酸酶，大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。在一些实施方案中，位点特异性核酸酶优先切割单倍体玉米基因组的基因组DNA靶区域。在具体实施方案中，切割基因组DNA的两条链。在另一个实施方案中，切割基因组DNA的单链。在另外的实施方案中，任何前述方法可以进一步包括递送供体多核苷酸，并将供体多核苷酸稳定整合在修饰的单倍体组织基因组中。在一些实施方案中，每个供体多核苷酸包含至少一个与单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域至少85％相同的域。在另外的实施方案中，供体多核苷酸包含与单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域中的两个不同序列至少85％相同的两个域。在本文中公开的任何用于修饰单倍体玉米基因组的方法的另外的实施方案中，小孢子来源的转化感受态组织来自具有良种性能特征的玉米。例如，小孢子来源的转化感受态组织可以来自良种玉米系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的杂种玉米。另外，在任何公开的方法中，单倍体组织基因组被修饰的确认包括进行基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，Western印迹测定法，ELISA测定法、或下一代测序测定法。
来源于任何公开的方法的玉米小孢子的转化感受态单倍体组织可以如下获得：从玉米收获含有小孢子的雄穗；在约4-12℃的温度温育所述雄穗；从所述雄穗分离含有小孢子的花药；在花药培养基中培养花药以生成小孢子来源的胚；并且在愈伤组织培养基中培养所述小孢子来源的胚，从而生成小孢子来源的转化感受态单倍体组织。
在另一个实施方案中，可以用染色体加倍剂进一步处理包含经修饰的单倍体组织基因组的单倍体组织，从而生成包含经修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米组织。可以将双单倍体玉米组织培养或再生成包含经修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米植物。此外，此类双单倍体玉米植物对于单倍体组织的基因组修饰是纯合的。
在又一个方面中，本公开涉及用于靶向整合供体的方法，所述方法包括：提供包含单倍体组织基因组的玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织；将一个或多个供体多核苷酸和一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；以及确认一个或多个供体多核苷酸整合到单倍体组织基因组中且单倍体组织基因组由此被修饰。在一些实施方案中，转化感受态单倍体组织是胚或愈伤组织。在这些方法中，将一个或多个供体多核苷酸和一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织可以通过植物转化方法来实现。在一些实施方案中，所述植物转化方法包括微粒轰击转化法，土壤杆菌转化法，磷酸钙转化法，聚凝胺(polybrene)转化法，电穿孔转化法，超声转化法，脂质体转化法，显微注射转化法，裸DNA转化法，质粒载体转化法，病毒载体转化法，碳化硅介导的转化法，气溶胶射束转化法和PEG转化法。在另外的实施方案中，位点特异性核酸酶多核苷酸编码选自下组的核酸酶：锌指核酸酶，TALEN核酸酶，大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸编码优选切割单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域的位点特异性核酸酶。在另外的实施方案中，本文中公开的任何方法进一步包括一个或多个供体多核苷酸在单倍体组织基因组内的稳定整合。例如，一个或多个供体多核苷酸可以经由同源性指导的修复作用或通过非同源末端连接修复作用而整合在靶区域内。在本文中公开的任何用于修饰单倍体玉米基因组的方法中，小孢子来源的转化感受态组织来自具有良种性能特征的玉米。例如，小孢子来源的转化感受态组织来自杂种玉米，所述杂种玉米是良种玉米系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的。在本文中公开的用于修饰单倍体玉米基因组的任何方法中，单倍体组织基因组包括确认对单倍体组织基因组的整合包括进行基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，ELISA测定法或下一代测序测定法。在任何公开的实施方案中，进入单倍体组织基因组中的一个或多个供体多核苷酸可以赋予农艺学性状(例如，编码基因，当基因表达时提供具有农艺学性状的玉米)。例如，农艺性状可以选自杀虫抗性性状，除草剂耐性性状，氮利用效率性状，水利用效率性状，营养质量性状，DNA结合性状和选择标志物性状。在任何公开的实施方案中，供体多核苷酸可以在玉米植物中稳定表达。此外，任何公开的将供体多核苷酸整合到单倍体组织基因组中的方法可以进一步包括用染色体加倍剂处理单倍体组织以产生包含加倍的单倍体组织，该加倍的单倍体组织包含整合的供体多核苷酸，并且该整合的供体多核苷酸是纯合的。
在另一个方面中，本公开涉及包含供体多核苷酸的植物。在一个实施方案中，植物包含单倍体基因组。在另一个实施方案中，所述植物包含双单倍体基因组。此类植物可以从组织再生，所述组织包含本文中公开的任何方法的修饰的单倍体组织基因组或修饰的双单倍体组织基因组。
在另一方面，本公开涉及用于在玉米的单倍体基因组内引入突变的方法，所述方法包括：提供包含单倍体组织基因组的玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织；将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且确认单倍体玉米基因组包含由编码的位点特异性核酸酶多核苷酸引入的突变。转化感受态单倍体组织可以是胚或愈伤组织。可以经由植物转化方法将一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织。植物转化方法可以选自微粒轰击转化法，土壤杆菌转化法，磷酸钙转化法，聚凝胺转化法，电穿孔转化法，超声转化法，脂质体转化法，显微注射转化法，裸DNA转化法，质粒载体转化法，病毒载体转化法，碳化硅介导的转化法，气溶胶射束转化法和PEG转化法。在任何公开的方法中，位点特异性核酸酶多核苷酸编码核酸酶，包括锌指核酸酶、TALEN核酸酶、大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。编码的位点特异性核酸酶多核苷酸可以是优先在单倍体玉米基因组的靶区域处切割基因组DNA的多核苷酸。在任何公开的方法中，小孢子来源的转化感受态组织可以来自具有良种性能特征的玉米。例如，小孢子来源的转化感受态组织是来自杂种玉米，杂种玉米是良种玉米品系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的。在任何公开的方法中，确认单倍体玉米基因组被修饰包括进行基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，Western印迹测定法，ELISA测定法和下一代测序测定法。根据公开的方法引入的突变可以下调内源基因的表达。在一些实施方案中，内源基因的下调导致改变的代谢途径。此外，由此将供体多核苷酸整合到单倍体组织基因组中的任何公开的方法可以进一步包括用染色体加倍剂处理单倍体组织以生成加倍单倍体组织，所述加倍单倍体组织包含整合供体多核苷酸，并且该整合供体多核苷酸是纯合的。
在一个方面中，本公开涉及包含引入的突变的植物。在一些实施方案中，所述植物包含单倍体组织基因组。在其它实施方案中，植物包含双单倍体组织基因组。此类植物可以从根据本文中公开的任何方法生成的经修饰的单倍体组织或双单倍体组织再生。
在一个方面中，本公开涉及用于将一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸引入雄性来源的单倍体细胞系中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：提供转化感受态的雄性来源的单倍体细胞系；将一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至该转化感受态的雄性来源的单倍体细胞系；并确认该一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸修饰该雄性来源的单倍体细胞系的基因组。在一个实施方案中，雄性来源的单倍体细胞系是单倍体小孢子细胞系。在另一个实施方案中，将单倍体小孢子细胞系繁殖成胚或愈伤组织。在另一个实施方案中，该方法包括通过植物转化方法将一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至雄性来源的单倍体细胞系。多核苷酸可以通过植物转化方法，如例如生物射弹转化法、土壤杆菌转化法、磷酸钙转化法、聚凝胺转化法、电穿孔转化法、超声转化法、脂质体转化法、显微注射转化法、裸DNA转化法、质粒载体转化法、病毒载体转化法、碳化硅介导的转化法、气溶胶射束转化法和PEG转化法递送。每个位点特异性核酸酶多核苷酸可以编码选自锌指核酸酶、TALEN核酸酶、大范围核酸酶、和CRISPR核酸酶的核酸酶。在另一个实施方案中，所述方法包括递送一个或多个编码优先修饰基因组的基因组DNA靶区域的位点特异性核酸酶的多核苷酸。在具体实施方案中，基因组DNA靶区域的两条链的单链被切割。在其它实施方案中，基因组DNA靶区域的单链被切割。在任何公开的包括递送一个或多个供体多核苷酸的方法中，可以在修饰的基因组中整合稳定一个或多个供体多核苷酸。在某些实施方案中，每个供体多核苷酸包含至少一个与基因组的基因组DNA靶区域至少85％相同的域。在进一步的实施方案中，每个供体多核苷酸包含与基因组的基因组DNA靶区域中的两个不同序列至少85％相同的两个域。供体多核苷酸可以经由同源性指导的修复作用或通过非同源末端连接修复作用整合在基因组DNA靶区域内。在另一个实施方案中，通过基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，Western印迹测定法，ELISA测定法或下一代测序测定法确认编码位点特异性核酸酶的多核苷酸修饰所述基因组。在另一个实施方案中，确认将一个或多个供体多核苷酸整合到基因组DNA靶区域中包括进行基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，Western印迹测定法，ELISA测定法和下一代测序测定法。
在更进一步的实施方案中，任何公开的方法可以进一步包括获得包含经修饰的雄性来源的单倍体细胞系的基因组的单倍体组织；用染色体加倍剂处理所述单倍体组织；生成包含经修饰的双单倍体基因组的双单倍体组织；并且将双单倍体组织培养成包含经修饰的双单倍体基因组的双单倍体植物。在另一个实施方案中，雄性来源的单倍体细胞系获自玉米植物。在任何公开的实施方案中，所述修饰的双单倍体基因组是基因组切割的结果。
附图说明
图1提供了pDAB111879的质粒图。该质粒图是用于靶向基因组修饰的ZFN构建体的质粒图。
图2提供了pDAB111845的质粒图。该质粒图是用于在单倍体原生质体中靶向整合的供体构建体的质粒图。
图3提供了pDAB118783的质粒图。该质粒图是用于在单倍体愈伤组织细胞的特定基因组基因座内靶向aad-1整合的供体构建体的质粒图。
图4提供了序列比对的图示，显示在PPL1切割位点处的插入和缺失，证明在轰击单倍体愈伤组织后的靶向诱变。在比对中提供了例示缺失和插入的序列SEQ ID NO:33至SEQID NO:45。将这些改变的序列与SEQ ID NO:32比较，SEQ ID NO:32是锌指核酸酶意图结合并切割的基因组DNA靶序列。
图5提供了在秋水仙碱处理后来自二倍化愈伤组织的核的直方图，证明有效的染色体加倍。
发明详述
本公开提供了用于在源自玉米小孢子的转化感受态单倍体组织中修饰玉米基因组的方法。该方法包括将一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织，并确认该一个或多个编码的位点特异性核酸酶修饰单倍体玉米基因组。
所述雄性来源的细胞系可以作为小孢子来源的植物组织培养物维持。小孢子来源的植物组织培养生成仅含有一套染色体的单倍体组织培养物。所述雄性来源的单倍体细胞系从雄性组织如小孢子和花粉或孢子体组织(例如亲本单倍体胚)生成，并且可以作为胚或愈伤组织，悬浮液或原生质体培养物维持。在玉米中，雄核发育和单倍体植物生成的报道可追溯到20世纪70年代(Ku et al.,1978,Proc.Symp.Plant Tissue Cult.35-42)，然而，雄性胚的低生成频率以及与植物再生和染色体加倍相关的困难使得花药或小孢子来源的植物培养物在应用育种中无法广泛使用。这些基本问题中的许多已经随着高反应性种质(Petolino et al.,1988,Theor.Appl.Genet.76:157-159)和体外染色体加倍技术(Wan etal.,1991,Theor.Appl.Genet.77:889-892)的开发而得以克服，尽管在玉米中，这种技术已经在很大程度上已被弃之不用。
本公开还提供了用于将供体多核苷酸靶向整合到来源于玉米小孢子的转化感受态单倍体组织中的单倍体玉米基因组中的方法。该方法包括将一个或多个供体多核苷酸和一个或多个编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织；并确认一个或多个供体多核苷酸整合到玉米的单倍体基因组中。
本公开进一步提供了在来源于玉米小孢子的转化感受态单倍体组织中的单倍体玉米基因组内引入突变的方法；将编码一种或多种位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；以及确认所述一个或多个编码的位点特异性核酸酶修饰单倍体玉米基因组，其中通过切割突变单倍体玉米基因组，如基因组DNA内的插入或缺失的存在指示。
在另一方面，本公开提供了用于修饰转化感受态雄性来源的单倍体细胞系的基因组的方法。该方法包括将编码位点特异性核酸酶的一个或多个多核苷酸递送至转化感受态雄性来源的单倍体细胞系，并确认编码的位点特异性核酸酶修饰所述雄性来源的单倍体细胞系的基因组，其中雄性来源的单倍体细胞系的基因组通过切割而被修饰。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本公开相关领域的普通技术人员的通常理解相同。在冲突的情况下，应当以包括定义的本申请为准。除非上下文另有要求，单数术语应当包括多个，并且复数术语应当包括单数。本文中提及的所有出版物，专利和其它参考文献通过提及整体并入本文用于所有目的，如同每个单独的出版物或专利申请具体并且单独地指出通过提及并入一样，除非仅指出通过提及并入专利或专利公开文本的特定部分。
为了进一步阐明本公开，提供以下术语，缩写和定义。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“具有”、或“含有”或其任何其它变型意图是非排他性的或开放式的。例如，包括列出的多个要素的组合物，混合物，工艺，方法，制品或装置不一定仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的或这些组合物，混合物，工艺，方法，制品或装置内在具有的其它元素。此外，除非明确相反指出，“或”是指包括性的或而不是排他性的或。例如，条件A或B由以下任何一个满足：A是真(或存在)和B是假(或不存在)，A是假(或不存在)和B是真(或存在)，并且A和B两者都是真(或存在)。
此外，在本公开的实施方案的元件或组件之前的不定冠词“一个”和“一种”意图关于实例的数量(即，元件或组件的出现)是非限制性的。因此，“一个”或“一种”应当被理解为包括一个或至少一个，并且元素或组件的单数词语形式也包括复数，除非该数量明显意味着是单数。
如本文中所使用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在表示特定发明的任何单个实施方案，而是涵盖如本申请中公开的所有可能的实施方案。
如本文中所用，术语“植物”包括全植物和植物的任何后代，细胞，组织或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插枝；植物细胞；植物细胞培养；植物器官(例如花粉，胚，花，果实，芽，叶，根，茎和外植体)。植物组织或植物器官可以是组织成结构或功能单元的种子，原生质体，愈伤组织或任何其它组的植物细胞。植物细胞或组织培养物可以能够再生具有获得细胞或组织的植物的生理和形态特征的植物，以及再生具有与植物基本相同的基因型的植物。相反，某些植物细胞不能再生生成植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚，原生质体，分生细胞，愈伤组织，花粉，叶，花药，根，根尖，丝，花，谷粒(kernel)，穗，穗轴，壳或茎。
植物部分包括可收获部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如但不限于：种子；果实；插枝(cutting)；幼苗；块茎；和根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括例如但不限于：花；花粉；幼苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
植物细胞是植物的结构和生理单位，包括没有细胞壁的原生质体细胞和具有细胞壁的植物细胞。植物细胞可以是分离的单细胞或细胞聚集体(例如，脆弱的愈伤组织和培养的细胞)的形式，并且可以是高等组织单元(例如植物组织，植物器官，和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体，生成配子的细胞或可以再生成全植物的细胞或细胞集合。因而，在本文的实施方案中，种子——其包含多个植物细胞并能够再生成全植物——视为“植物细胞”。
如本文中使用，术语“分离的”是指生物组分(包括核酸或蛋白质)已经与该生物组分天然存在的生物体的细胞中的其它生物组分(即，其它染色体和染色体外DNA和RNA，和蛋白质)分开、与上述其他生物组分分别制备。
如本文中使用的，术语“纯化的”就核酸分子而言，不需要是绝对纯的(比如均质的制剂)；而是表明序列相对于其天然细胞环境更纯(与天然水平相比，该水平应该大至少2-5倍，例如就浓度或基因表达水平而言)。要求保护的DNA分子直接从总DNA或从总RNA获得。另外，cDNA克隆不是天然存在的，而是优选通过对部分纯化的天然存在的物质(信使RNA)进行人为操作而获得。从mRNA构建cDNA文库涉及创建文库。通过对携带cDNA文库的细胞克进行隆选择，可以从文库中生成单个cDNA克隆。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和选择不同cDNA克隆的方法生成天然信使的约106倍的纯化。同样，可以将启动子或基因DNA序列克隆到质粒中。此类克隆不是天然存在的，而是优选通过操作部分纯化的天然存在的物质如基因组DNA文库获得。因此，在这些技术中有利于纯化至少一个数量级，优选两个或三个数量级，更优选四个或五个数量级。
类似地，“合成”代表已经发生组分DNA序列的化学或功能变化的指示。已经“被合成”的核酸分子和蛋白质包括通过PCR扩增或通过重组方法生成的核酸分子和蛋白质，其中纯化的多核苷酸通过掺入质粒或载体内而被进一步修饰。术语“合成的”还包括通过重组DNA方法在宿主细胞(例如植物细胞)中制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子，蛋白质和肽。
在工程化改造基因以在植物中表达的过程中，可以确定预期的宿主植物的密码子偏爱，例如通过使用公众可获得的DNA序列数据库寻找关于植物基因组的密码子分布或者各种植物基因的蛋白质编码区的信息。一旦在纸上或在计算机上设计了优化的(例如植物优化的)DNA序列，则可以在实验室中合成序列上精确地对应于设计序列的真实DNA分子。此类合成核酸分子可以接受分子克隆和以其它方式操作，就像它们来源于自然或天然来源一样。
如本文中使用，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且可以包括：单个核酸；多个核酸；其核酸片段，变体或衍生物；和核酸构建体(例如，信使RNA(mRNA)和质粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列或其片段的核苷酸序列，包括未翻译的5'和/或3'序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以包含未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以由单链和双链DNA；作为单链和双链区域的混合物的DNA；单链和双链RNA；和作为单链和双链区域的混合物的RNA构成。包含DNA和RNA的杂合分子可以是单链，双链或单链和双链区的混合物。前述术语还包括多核苷酸或核酸的化学，酶和代谢修饰形式。
应当理解，特定的DNA还指其互补序列，其序列根据脱氧核糖核苷酸碱基配对的规则确定。
如本文中使用的，术语“基因”是指编码功能产物(RNA或多肽/蛋白质)的核酸。基因可以包括编码功能产物的序列之前(5'非编码序列)和/或之后(3'非编码序列)的调节序列。
如本文中使用的，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。“调节序列”是指位于编码序列的上游(例如，5'非编码序列)，内部或下游(例如3'非编码序列)，影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列包括例如但不限于：启动子；翻译前导序列；内含子；多腺苷酸化识别序列；RNA加工位点；效应器结合位点；和茎-环结构。
如本文中使用，术语“多肽”包括单个多肽，复数个多肽及其片段。该术语是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指产物的特定长度或大小。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，蛋白质，氨基酸链和用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且前述术语在本文中与“多肽”可互换使用。多肽可以从天然生物来源纯化或通过重组技术生成，但特定多肽不一定从特定核酸翻译。多肽可以以任何适当的方式生成，包括例如但不限于通过化学合成。
如本文中使用，术语“天然的”是指在自然界中与其自身调节序列(若有的话)一起发现的多核苷酸，基因或多肽的形式。术语“内源的”是指多核苷酸，基因或多肽在生物体中或生物体基因组中在其自然位置中的天然形式。
相比之下，术语“异源”是指通常不在其参照(宿主)生物体中的位置处发现的多核苷酸，基因或多肽。例如，异源核酸可以是通常在参照生物体中在不同基因组位置处发现的核酸。作为另一个实例，异源核酸可以是在参照生物体中通常不存在的核酸。包含异源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物体可以通过将异源多核苷酸、基因或多肽导入宿主生物体中来生成。在具体的例子中，异源多核苷酸包括天然编码序列或其部分，其以不同于相应天然多核苷酸的形式被重新导入来源生物体中。在具体的例子中，异源基因包括天然编码序列或其部分，其以不同于相应天然基因的形式重新导入来源生物体中。例如，异源基因可以包括作为被重新导入天然宿主的嵌合基因的一部分的天然编码序列，所述嵌合基因包含非天然调节区。在具体的例子中，异源多肽是以不同于相应天然多肽的形式重新导入来源生物体中的天然多肽。
异源基因或多肽可以是这样的基因或多肽，其包含功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列，该功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列与另一种基因或多肽融合，生成嵌合多肽或融合多肽或编码嵌合多肽或融合多肽的基因。具体实施方案的基因和蛋白质包括具体示例的全长序列和这些序列的部分、区段、片段(包括连续片段，以及与全长分子相比的内部和/或末端缺失)、变体、突变体、嵌合体和融合物。
“内源的”是指源自生物体或细胞内的材料。
“外源的”是指源自生物体或细胞外部的材料。如本文中使用的，“外源”意指来自除受体细胞或组织之外的来源的任何核酸，而不管相似(但不相同)核酸是否可能已经存在于受体细胞或组织中。
如本文中使用，术语“修饰”可以指特定参照多核苷酸的变化，导致由参照多核苷酸编码的多肽的活性的降低、基本上消除或消除。或者，术语“修饰”可以指参照多核苷酸的变化，导致由参照多核苷酸编码的多肽的活性增加或增强，以及参照多肽的变化，导致参照多肽的活性增加或增强。当用于描述位点特异性核酸酶的活性时，“修饰”可意指参照分子的一部分的切割(例如，基因组DNA被切割；基因组DNA的双链或单链被切割)。如前所述的变化可以导致例如但不限于：参照分子的一部分被删除；参照分子突变(例如通过自发诱变，通过随机诱变，通过由增变基因引起的诱变，以及通过转座子诱变)；参照分子的一部分吧取代；参照分子中插入元件；参照分子的表达下调；参照分子的细胞位置改变；参照分子的状态改变(例如，通过参照多核苷酸的甲基化，以及通过参照多肽的磷酸化或泛素化)；参照分子的辅因子除去；靶向参照分子的反义RNA/DNA的引入；靶向参照分子的干扰RNA/DNA的引入；参照分子的化学修饰；参照分子的共价修饰；用UV辐射或X射线照射参照分子；改变参照分子的同源重组；改变参照分子的有丝分裂重组；参照分子的启动子的置换；和/或任何前述的组合。
在具体实例中，可以通过比较参照多核苷酸或多肽的序列与同源(例如，同源的酵母或细菌)多核苷酸或多肽的序列，并且最大化高同源性区域(保守区域)或共有序列中进行的修饰的数目，来寻求哪些核苷酸或氨基酸残基可以被修饰的指导。
术语“启动子”是指能够控制核酸编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。在例子中，受控编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以全部来源自天然基因，启动子可以由来源于不同的天然存在启动子的不同元件构成，或者启动子甚至可以包含合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或者响应不同的环境或生理条件表达。所有上述启动子均有已知的例子，并且在本领域中已被用于控制异源核酸的表达。在大多数时候指导基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成性(型)启动子”。此外，尽管本领域技术人员(在许多情况下不成功)尝试描绘调节序列的确切边界，但是人们已经开始理解，不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。可以使用本领域技术人员熟悉的技术测定特定核酸的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸上的联合，其中核酸序列之一的功能受另一个影响。例如，当启动子能够实现编码序列的表达(例如，编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接到调节序列。
如本文中使用，术语“表达”可以指源自DNA的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。如本文中使用的，术语“过表达”是指高于相同基因或相关基因的内源表达的表达。因此，如果异源基因的表达高于可比的内源基因的表达，那么它是“过表达的”。
如本文中使用，术语“转化”是指将核酸或其片段转移和整合到宿主生物体中，导致遗传上稳定的遗传。含有转化核酸的宿主生物称为“转基因的”，“重组的”或“经转化的”生物体。已知的转化方法包括例如：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)介导的转化；磷酸钙转化；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔；超声波方法(例如声致穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；用裸DNA的转化；用质粒载体转化；用病毒载体转化；生物射弹转化(微粒轰击)；碳化硅WHISKERS介导的转化；气溶胶射束；和PEG介导的转化。
如本文中使用，术语“导入”(在将核酸导入细胞中的背景下)包括转化细胞，以及使包含核酸的植物与第二植物杂交，使得第二植物含有核酸，如可利用常规植物育种技术进行的。此类育种技术是本领域已知的。关于植物育种技术的讨论，参见Poehlman(1995)Breeding Field Crops,4th Edition,AVI Publication Co.,Westport CT。
回交方法可以用于将核酸导入植物中。该技术已经使用了几十年来将性状引入植物中。回交(和其它植物育种方法)的描述的例子可以参见例如Poehlman(1995),见上文；及Jensen(1988)Plant Breeding Methodology,Wiley,New York,NY。在示例性回交方案中，将感兴趣的原始植物(“轮回亲本”)与携带待导入的核酸的第二植物(“非轮回亲本”)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次与轮回亲本杂交，并且重复该过程，直到获得这样的转化的植物，在该转化的植物中不但有来自非轮回亲本的核酸，还恢复了轮回亲本的基本上所有的期望形态和生理特征。
如本文中使用的，术语“同基因”是指具有基本上相同的基因型(例如，不超过1个基因在个体之间不同)的两个植物个体(或其部分，例如种子，细胞)。
如本文中使用的，术语“稳定整合”或“稳定转化”“遗传稳定遗传”或“稳定地”是指在生物体的基因组内引入核酸或多核苷酸区段(通常是异源核酸序列或基因)，所述生物体例如为先前不含有该核酸或多核苷酸区段的植物、植物组织、植物细胞器(即质体或叶绿体)或植物细胞。所得的整合固定于植物的基因组中，并且可以传递到后代植物中。优选地，转化导致核酸序列稳定整合到植物的基因组中。如本文中使用，术语“基因组”包括核基因组、质体基因组和线粒体基因组。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的核或含DNA的细胞器中，导致基因表达而没有遗传上稳定的遗传。
“结合”是指大分子(例如，蛋白质和核酸之间)的序列特异性的、非共价相互作用。结合相互作用不需要所有组分都是序列特异性的(例如，与DNA主链中的磷酸残基接触)，只要整个相互作用是序列特异性的即可。此类相互作用通常以10-6M-1或更低的解离常数(Kd)为特征。“亲和力”是指结合的强度：增加的结合亲和力与较低的Kd相关。
“切割”是指DNA分子的共价主链的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果发生。DNA切割可以导致平末端或交错末端的生成。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA切割，使得基因组DNA被修饰。
如本文中使用的，术语“质粒”和“载体”是指一种染色体外元件，其可以携带一个或多个不是细胞中心代谢的一部分的基因。质粒和载体通常是环状双链DNA分子。然而，质粒和载体可以是单链或双链DNA或RNA的线性或环状核酸，并且可以源自任何来源，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的构造，该构造能够将启动子片段和编码DNA序列连同任何合适的3'非翻译序列一起导入细胞。在实例中，质粒和载体可以包含自主复制序列、基因组整合序列和/或噬菌体或核苷酸序列。
术语“融合蛋白”表明蛋白质包括来源自超过一种亲本蛋白质或多肽的多肽组分。通常，融合蛋白从融合基因表达，其中编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列以符合读框的方式附加到编码来自另一种不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列，并且任选地通过接头与后者分开。然后，融合基因可以由重组宿主细胞表达为单一蛋白质。
“单倍体”是指具有一套(n)染色体的植物细胞、组织或植物。
“双单倍体”或“加倍单倍体”或“二倍体”指来源自单倍体的植物细胞、组织或植物。双单倍体具有两套(2n)染色体，并且通常是纯合的。然而，相比于通常在双二倍体中观察到的绝对纯合性，DNA中的突变、缺失或插入或其它类似修饰有可能导致一些偏离。类似地，本领域技术人员可以通过随机或靶向突变、缺失、插入，或通过改组DNA或其部分，来有意地修饰双单倍体DNA。此类“经修饰的双单倍体”包括在本公开内容中。如果想要的话，也可以使用本公开的方法获得多倍体。多倍体将具有三套或更多套染色体，并且除了上面讨论的修饰外，也应该是纯合的。
“染色体加倍剂”是指使得细胞中染色体数目加倍(例如，从单倍体到二倍体或二倍体到四倍体等)的化学品。此类试剂通常是抗微管剂，如秋水仙碱，神经酰胺或APM(甲基胺草磷(amiprophos-methyl))。氧化亚氮也被报道为加倍剂(美国专利申请2003/0005479，其全部内容通过提及并入本文)。本领域技术人员熟悉可以引起染色体加倍(例如通过阻断正常细胞周期分裂等)的化合物。
“愈伤组织”是指细胞或组织的去分化增殖团块。
“I型愈伤组织”是指作为形态上紧凑的玉米愈伤组织的愈伤组织，其中整株植物可以通过器官发生、胚发生、或两者的组合而再生。
“II型愈伤组织”是指形态学上脆弱的、高度胚发生性的玉米愈伤组织(Armstrong和Green,Planta.164:207-214.1985)。
“成熟胚”是指可以在授粉后大约15天以后获得，并且当在体外培养时通常不产生可再生的愈伤组织的合子胚。
“未成熟胚”是指可以在授粉后约15天以内获得，并且当在体外培养时通常可以产生可再生的愈伤组织的合子胚。
术语“合子胚”用于涵盖种子、从种子提取的成熟胚、成熟胚、或能够萌芽的未成熟胚。
“胚发生培养物”或“胚发生细胞”或“胚发生组织”或“胚”或“胚样结构”是指能够经培养的再生成植物的植物细胞和组织。
“植物生长调节剂或植物激素”是指影响植物生长的化合物。植物生长调节剂包括但不限于生长素、细胞分裂素、ABA、赤霉素、乙烯、油菜素类固醇和多胺。生长素在低浓度下影响芽和根的延伸，但在更高水平抑制生长。常用的生长素包括毒莠定(picloram)(4-氨基-3,5,6-三氯吡啶甲酸)，2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)，IAA(吲哚-3-乙酸)，NAA(α-萘乙酸)和麦草畏(dicamba)(3,6-二氯茴香酸)。细胞分裂素导致细胞分裂、细胞分化和芽分化。常用的细胞分裂素包括激动素、BA(6-苄基氨基嘌呤)、2-ip(2-异戊烯基腺嘌呤)、BAP(6-苄基氨基嘌呤)，噻苯隆(TDZ)，玉米素核苷和玉米素。
“单子叶植物”或“单子叶”是指具有单个子叶的植物。例子包括谷物，如玉米，稻，小麦，燕麦和大麦。
“表型”是指由于生物体的基因组(包括非基因组DNA和RNA，如质粒和人工染色体)和/或细胞器中的核酸的表达(或无表达)，而由生物体展现出的性状。
“再生”是指从植物细胞或组织培养出植物的过程。
“选择标志物”或“可筛选标志物”是指这样核酸序列，其表达赋予含有该核酸序列的细胞，组织或植物的易于鉴定的表型。
“孢子体”是指生命周期阶段中的植物，其特征在于具有双倍染色体数目。这与包括小孢子和花粉在内的“配子体”相反。
来源于雄性来源的单倍体细胞系的组织
通常，基因组的倍性水平指存在于细胞核内的染色体套数。倍性水平可能随着构成生物体的细胞类型和/或细胞来源而变化。单倍体数(n)是在生物体内仅存在一套染色体的指示。双二倍体或二倍体数(2n)是在生物体内存在两套染色体的指示。对于一些生物体，特别是植物物种，含有更大的染色体套数，例如三倍体(3n)，四倍体(4n)，五倍体(5n)和六倍体(6n)，是常见的。此类增加的染色体套数的实例，如三倍体或更多者，通常称为多倍体。
通常在生物体的整个生命周期中，二倍体(2n)多细胞阶段与单倍体(n)多细胞期交替出现。生物体生命周期的单倍体(n)阶段被认为是配子体阶段，例如配子生成。相比之下，生物体生命周期的二倍体(2n)阶段被视为孢子体阶段，例如产孢子。在孢子体阶段中，生物体通过称作减数分裂的过程生成单倍体(n)的小孢子(即孢子)。得到的小孢子可以生成配子，例如精子核，其在受精过程中与由大孢子生成的其它配子(例如卵子核)融合，生成二倍体合子。
在植物中，小孢子在雄性生殖器官中生成。雄性生殖器官称为花药。花药生成单倍体小孢子，单倍体小孢子成熟成为包含精子核的花粉。花粉代表着植物生命周期中一段短暂的雄性配子体阶段的开始，该阶段中两个精子核被递送到胚珠的胚囊中，用于进行双受精和随后的胚和胚乳形成。尽管高等植物生命周期的这个阶段通常仅包括几次细胞分裂，但是在某些实验条件下，可以诱导小孢子发育改变而生成胚样结构，中间没有受精。因而，这些胚样结构是单倍体(n)。此过程称为单雄生殖(androgenesis)，是名为花药或小孢子培养的体外技术的生物学基础。
在一个实施方案中，提供了转化感受态雄性来源的细胞系。在随后的实施方案中，从所述转化感受态雄性来源的细胞系获得单倍体小孢子细胞系。在另一个实施方案中，所述转化感受态单倍体组织来源自玉米小孢子。花药来源的培养物提供了在意图用于生产育种品系的植物中快速诱导纯合性的方法。花药培养包括从植物中分离未成熟的花药，并将它们置于培养基上，培养基诱导花药内通常将注定成为花粉粒的细胞，即小孢子，开始分裂并形成可从中再生植物的细胞培养物。关于花药培养的一般讨论，参见J.M.Dunwell,“Anther and Ovary Culture”,于S.W.J.Bright和M.G.K.Jones,(编),Cereal Tissue andCell Culture,Martinus Nijhoff Publisher,1985,Dordrecht,pp.1-44。所得的培养物是单倍体，并且仅含有来自原始植物的单套染色体。来源自这些培养物的植物是不育的，除非发生染色体加倍(自发地或通过诱导)以创建完全能育且完全近交的双倍单倍体。
在过去几十年中已经报道了许多以生成单倍体植物为目标的配子体细胞的体外培养的研究。也已经公开了大量的综述，书章和研讨会会刊(一般见Chu,“Haploids inPlant Improvement”,于I.K.Vasil,W.R.Scowcroft,K.J.Frey(eds.),Plant Improvementand Somatic Cell Genetics,New York:Academic Press,1982,pp.129-158；Heberle-Bors,1985,“In Vitro Haploid Formation of Pollen:A Critical Review”,Theor.Appl.Genet.71:361-374；及Hu和Yang,“Haploids of Higher Plants in Vitro.”Berlin,Heidelberg,Springer-Verlag,1986)。
花药培养代表了方法，通过该方法在理论上可以在体外从花药和/或小孢子直接生成大量的单倍体个体。参见Keller et al.,“Haploids from gametophytic cells--recent developments and future prospects”,于C.E.Green,D.A.Somers,W.P.Hackett,D.D.Biesoer(编),Plant Tissue and Cell Culture,Alan R Liss,New York,pp 223-241,1986。单倍体可以通过花药、小孢子、子房和胚珠的培养从雄性和雌性配子体细胞中再生。阳性体外响应将导致胚和/或愈伤组织的发育，从胚和愈伤组织可以再生植物。体外培养期间的早期事件已经在细胞学，超微结构和生物化学水平上得到了表征(Chen et al.,1984,“Segmentation Patterns and Mechanisms of Genome Multiplication inCultured Microspores of Barley”,J.Can,Genet.Cytol.,26:475-483；Raghavan,1984,“Protein Synthetic Activity during Normal Pollen Development and DuringInduced Pollen Embryogenesis in Hyoscyamus niger”,J.Can Bot.,62:2493-2513；Huang,“Ultrastructural Aspects of Pollen Embryogenesis in Hordeum,Triticumand Paeonia”,1986)。
在另外的实施方案中，来源自雄性来源的细胞系(例如玉米小孢子)的单倍体组织是胚或愈伤组织。在进一步的实施方案中，提供的方法可以经历，也可以不经历愈伤组织形成阶段。可以将单倍体胚置于“非愈伤组织促进培养基”上。术语“非愈伤组织促进培养基”是指不支持去分化的细胞或组织块增殖的培养基。优选的“非愈伤组织促进培养基”用于胚抢救，其含有本领域中公知的典型的盐和维生素配方。此类胚抢救或胚培养物含有很少或不含生长素(综述参见Raghaven,V.,1986,Biol.Rev.,41:1-58)。在一些实施方案中，胚成熟培养基也代表另一种优选的“非愈伤组织促进培养基”。胚成熟培养基用于促进体外培养的胚的发育，防止过早萌发，并且通常含有标准的盐/维生素配方(取决于物种)，升高的糖水平和/或外源添加的脱落酸，很少或没有生长素。另一种类型的培养基用于芽培养或多芽增殖。此多芽培养基可以同样含有极少量或减量的生长素，但含有升高水平的细胞分裂素，能促进分生组织增殖和生长。
已经采用花药培养获得了超过200个物种的小孢子来源的愈伤组织、胚和植物(Maheshwari et al.,1982,“Haploids from Pollen Grains-Retrospect andProspect”,Amer.J.Bot.,69:865-879)。然而，花药培养反应性在物种之间变化相当大。已经发现，反应性花药(每100个铺板的花药中形成胚和/或愈伤组织的花药)的最高产率在小麦中为87％(A.M.Wei,1982,“Pollen Callus Culture in Triticumaertivum”,Theor.Appl.Genet.,63,pp.71-73)，稻中为67％(S.L.Lin和H.S.Tsay,1983,J.Agr.Res.,China，在Dunwell中引用,1985)，玉米中为17％(Ting et al.,1981,“Improved AntherCulture of Maize”(Zea mays L.),Plant Science Lett.,23,pp.139-145)，在大麦中为1％(Z.H.Xu和N.Sunderland,1982,“Innoculation Density in the Culture of BarleyAnthers”,Scient.Sinic.,25,pp.961-968)。在黑麦中，每100个花药观察到43个发育结构(G.Wenzel et al.,1977,“Increased Induction and Chromosome Doubling ofAndrogenetic Haploid Rye”,Theor.Appl.Genet.,51,pp.81-86)。每100个培养花药的生成绿色植物的愈伤组织的频率在小麦中为72％(J.W.Ouyang et al.,1983,“The Responseof Anther Culture to Temperature in Triticum Aestivum”,Theor.Appl.Genet.,66,pp.101-109)，在稻中为12％(L.J.Chen et al.,“Medium Evaluation for Rice AntherCulture”,收录于A.Fujiwara(编),“Plant Tissue Culture”,pp.551-551.Jap.Assoc.Plant Tissue Culture Tokyo,1982)，在大麦中为10％(K.N.Kao,“PlantFormation from Barley Anther Cultures with Ficoll Media”,Z.Pflanzenzuchtg.,103,1981,pp.437-443)。
在另一个实施方案中，小孢子来自具有优良性能特征的玉米。在该实施方案的一个方面中，小孢子来自杂种玉米，所述杂种玉米是优良玉米品系与不同的具有高小孢子培养反应的玉米品系杂交而得到的。如美国专利No.5,306,864(在此通过提及整体并入)美国专利号No.5,602,310(本文通过提及整体并入)中提供的，花药培养物作为玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))中的单倍体育种手段的应用容易推广到不同的玉米基因型，包括优良性能系。能够用来鉴定表现出对花药培养物增强的应答的玉米种质的方法可以转用于增加其它挑选的基因型中的花药可培养性。此类方法是本领域中容易已知的，并且可以用于将玉米种质(包括优良性能品系)转化成从培养的花药和/或小孢子生成高水平的单倍体和/或双单倍体组织培养物的植物。
染色体加倍
在一个实施方案中，任何公开的生成具有经修饰的单倍体组织基因组的单倍体植物组织的方法还包括用染色体加倍剂处理经修饰的单倍体组织以生成双单倍体植物组织。在某些实施方案中，如此生成的双单倍体组织包含就在单倍体基因组中生成的修饰(例如，整合的供体多核苷酸或突变)而言是纯合的基因组。在另一个实施方案中，将包含经修饰的双单倍体基因组的玉米组织繁殖成对基因组修饰而言为纯合的成熟植物。
染色体加倍的方法公开于Antoine-Michard,S.et at,Plant cell,tissue organcult.,Cordrecht,the Netherlands,Kluwer Academic Publishers,1907,48(3):203-207；Kato,A.,Maize Genetics Cooperation Newsletter 1897,38-37；及Wan,Y.et al.,Theor.Appl.Genet.,1980,77:889-892,Wan,Y,et al.,Theor.Appl.Genet.,1991,81:205-211。其公开内容通过提及并入本文。典型的方法包括使细胞与秋水仙素、抗微管剂或抗微管除草剂、拿草特(pronamide)、氧化亚氮或任何有丝分裂抑制剂接触，以创建纯合的双重单倍体细胞。其它作用剂可以与有丝分裂抑制剂一起使用以改善加倍效率。此类作用剂可以是二甲亚砜(DMSO)，佐剂，表面活性剂等。
另外的染色体加倍剂是本领域中已知的，且在美国专利号No.5,866,51(其全部内容通过提及并入本文)中列出的化学品适合用于生成双单倍体植物。此外，表1列出了各种已知的染色体加倍剂。
表1：染色体加倍剂。
在一个实施方案中，本文中公开的用于幼苗浸泡方法的染色体加倍剂的合适剂量包括例如0.01μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM，125μM，150μM，200μM，500μM，和1000μM。合适的范围还包括例如0.1-10μM，1-100μM，5-125μM，25-200μM，50-500μM，15-150μM和1-10,000μM。
在另一个实施方案中，染色体加倍剂的范围可以为幼苗浸泡方法中使用的溶液的0.01％-0.5％。例如，可以使用0.01％，0.02％，0.025％，0.05％，0.075％，0.1％，0.125％，0.15％，0.175％，0.2％，0.225％，0.25％，0.275％，0.3％，0.325％，0.35％，0.375％，0.4％，0.425％，0.45％，0.475％，或0.5％的染色体加倍剂使染色体加倍。
在进一步的实施方案中，当与秋水仙碱(例如，在0.025％)相比时，本文公开的染色体倍加倍剂的低幼苗死亡率的范围可以例如为处理的幼苗或植物细胞总数的小于10％至约40％，或小于约5％至约20％，或小于约15％至约25％或小于50％。
在其它实施方案中，用于本文中公开的幼苗叶施用方法的染色体加倍剂的合适剂量包括例如3.5g ai/ha，70g ai/ha，140g ai/ha，280g ai/ha。合适的应用率范围包括例如5g ai/ha至1120g ai/ha，且更优选至2,800g ai/ha。
短语“接触”包括提及“直接接触”和“间接接触”。例如，包含加倍剂的培养基可以与单倍体细胞直接接触，或者包含加倍剂的培养基可以通过屏障，如滤纸、植物组织或其它细胞，与单倍体细胞分开，因此加倍剂透过滤纸或细胞或组织转移到单倍体细胞。接触以任何合适的方式实现，例如根的水培处理，喷雾，注射，浸润，浸泡和润湿。
可以用染色体加倍剂处理单倍体细胞、单倍体胚、单倍体种子、单倍体幼苗或单倍体植物。可以通过使单倍体细胞，如单倍体胚细胞与染色体加倍剂接触，从单倍体细胞再生纯合植物。单倍体细胞可以与加倍剂接触任何时间量。在一个实施方案中，单倍体细胞与加倍剂接触1分钟，2分钟，5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，45分钟，1小时，2小时，5小时，10小时，24小时或48小时。
可以分离单倍体胚。它可以包含在籽粒、胚珠或种子内，它也可以在穗(ear)上，如玉米穗上，或在穗(spike)上(在其它谷物如小麦的情况下是如此)。穗包括：单倍体胚可以在植物上或从植物分离。穗也可以切片。染色体加倍后，双倍单倍体胚将包含2拷贝的母本来源的染色体。从单倍体胚中获得双倍单倍体植物的方法的效率可以大于10％，20％，30％，50％，60％，70％，80％或90％。
植物转化
本公开文本所公开的方法包括植物转化方法。可以用于本公开文本的方法的植物转化方法包括但不限于：位点特异性微粒轰击，土壤杆菌转化法，磷酸钙转化法，聚凝胺转化法，电穿孔转化法，超声转化法，脂质体转化法，显微注射转化法，裸DNA转化法，质粒载体转化法，病毒载体转化法，碳化硅介导的转化法，气溶胶射束转化法或PEG转化法。通常，任何植物转化方法均可用于将DNA或任何其它多核苷酸序列插入宿主细胞的基因组中。因此，可以使用任何可提供有效转化/转染的方法。
已经开发了许多用于植物转化的方法，包括用于双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Goto-Fumiyuki et al.,Nature Biotech17:282-286(1999)；Miki et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编,CRC Press,Inc.,Boca Raton,pp.67-88(1993))。此外，包含基因表达盒的载体和用于植物细胞或组织转化和植物再生的体外培养方法可以在例如Gruber etal.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.,CRC Press,Inc.,Boca Raton,pp.89-119(1993)中找到。
有许多技术可供用于将包含基因表达盒的DNA插入植物宿主细胞中。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂用卸甲的(disarmed)T-DNA转化，磷酸钙转染，聚凝胺转化，原生质体融合，电穿孔，超声方法(例如声致穿孔)，脂质体转化，显微注射，裸DNA，质粒载体，病毒载体，生物弹射(微粒轰击)，碳化硅WHISKERSTM介导的转化，气溶胶射束或聚乙二醇介导的转化以及其它可能的方法。
例如，可以使用诸如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体等技术将包含基因表达盒的DNA构建体直接引入植物细胞的基因组DNA中。此类植物转化方法包括例如经由氯化钙沉淀，聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的DNA摄取的原生质体转化(参见Paszkowski et al.(1984)EMBO J 3:2717-2722,Potrykus et al.(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm et al.(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82:5824-5828；及Shimamoto(1989)Nature338:274-276)和植物组织的电穿孔(D'Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-1505)。
可以使用生物射弹方法，如DNA颗粒轰击，将DNA构建体直接导入植物组织(参见例如Klein et al.(1987)Nature 327:70-73)。生物射弹方法包括微粒介导的转化，其中DNA携带在微射弹的表面上。在该方法中，用生物射弹装置将表达载体导入植物组织中，该生物射弹装置将微射弹加速至足以穿透植物细胞壁和膜的速度。Sanford et al.,Part.Sci.Technol.5:27(1987),Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988),Sanford,J.C.,Physiol.Plant 79:206(1990),Klein et al.,Biotechnology 10:268(1992)。
用于植物细胞转化的其它方法包括通过碳化硅WHISKERSTM介导的DNA摄取的显微注射(Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reporter 9:415-418)。或者，可以经由纳米颗粒转化将DNA构建体导入植物细胞中(参见例如美国专利申请No.12/245,685，其通过提及整体并入本文)。
一种广泛使用的将包含基因表达盒的载体导入植物中的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统。Horsch et al.,Science227:1229(1985)。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是已知可用于遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌的和发根土壤杆菌分别由Ti质粒和Ri质粒携带负责植物遗传转化的基因。Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述也可以从，例如，Gruber et al.,见上文,Miki et al.,见上文，Moloney et al.,Plant Cell Reports8:238(1989)，和美国专利No.4,940,838和5,464,763获取。
当土壤杆菌用于植物转化时，可以将待插入的DNA克隆到称为中间载体的特殊质粒中或克隆到二元载体中。中间载体在不存在辅助质粒的情况下无法在土壤杆菌中复制(接合)。日本烟草超二元系统是这种系统的一个例子(参见综述Komari et al.,(2006)收 录于:Methods in Molecular Biology No.343:Agrobacterium Protocols(2nd Edition,Vol.1)(K.Wang,ed.)Humana Press Inc.,Totowa,NJ,pp.15-41；及Komori et al.,(2007)Plant Physiol.145:1155-1160)。
二元载体可以在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它们包含被左右T-DNA边界区所框定的选择标志物基因和接头或多接头。可以将二元载体直接转化到土壤杆菌中(Holsters，1978)。土壤杆菌可以用作包含质粒，例如携带vir区的Ti或RI质粒的宿主细胞，vir区对于T-DNA转移到植物细胞中而言通常是必需的。
可以利用根癌土壤杆菌宿主的毒力，指导含有T链的供体DNA插入通过土壤杆菌二元T DNA载体技术(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共培养规程(Horsch etal.(1985)Science 227:1229-1231)感染的单倍体组织或细胞中。通常，土壤杆菌转化系统用于工程化双子叶植物(Bevan et al.(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-384；Rogers et al.(1986)Methods Enzymol.118:627-641)。土壤杆菌转化系统也可以用于将DNA转化以及转移到单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616；Hernalsteen et al.(1984)EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren et al.(1984)Nature 311:763-764；Grimsley et al.(1987)Nature 325:1677-179；Boulton et al.(1989)PlantMol.Biol.12:31-40；和Gould et al.(1991)Plant Physiol.95:426-434。
在通过植物转化导入包含基因表达盒的遗传构建体后，可以培养植物细胞，并且在分化组织，如芽和根出现后，可以生成成熟的植物。在一些实施方案中，可以生成多个植物。用于再生植物的方法是本领域中普通技术人员已知的，并且可以参见例如：Plant Celland Tissue Culture,1994,Vasil和Thorpe编Kluwer Academic Publishers和Plant CellCulture Protocols(Methods in Molecular Biology 111,1999Hall Eds HumanaPress)。可以在发酵培养基中培养，或在合适的培养基如土壤中种植本文中描述的经遗传修饰的植物。在一些实施方案中，用于高等植物的合适的生长培养基可以包括用于植物的任何生长培养基，包括但不限于土壤，沙，支持根生长的任何其它颗粒培养基(例如蛭石，珍珠岩等)或水培培养，以及适当的光，水和营养补充剂，其优化高等植物的生长。
可以培养通过任何上述植物转化技术生成的经转化的植物细胞，以再生拥有经转化的基因型、并因此具有期望的表型的全植物。此类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于与期望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记物。来自培养的原生质体的植物再生描述于Evans,et al.,“ProtoplastsIsolation and Culture”in Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,MacmillianPublishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration of Plants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈伤组织，外植体，器官，花粉，胚或其部分获得。此类再生技术在Klee et al.(1987)Ann.Rev.of PlantPhys.38:467-486中有一般性的描述。
可以通过对经工程化改造的植物材料选择或筛选由转化DNA上存在的标志物基因编码的性状来鉴定并分离经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，转化基因构建体赋予针对某种抗生素或除草剂的抗性，可以通过在含有抑制量的该抗生素或除草剂的培养基上培养经工程化改造的植物材料，来进行选择。此外，还可以通过筛选可以存在于重组核酸构建体上的任何可见标志物基因(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶，萤光素酶或gfp基因)的活性来鉴定经转化的植物和植物细胞。选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。
术语转基因“事件”是指通过用异源DNA(例如，包括感兴趣的转基因的表达盒)转化和再生单个植物细胞生成的重组植物。术语“事件”指包括异源DNA的转化体的原始转化体和/或转化体的后代。术语“事件”还指通过转化体和另一植物之间的有性异型杂交生成的后代。即使在与轮回亲本重复回交后，插入的DNA和来自经转化的亲本的侧翼DNA也存在于杂交后代中相同的染色体位置处。通常，植物组织的转化生成多个事件，每个事件代表DNA构建体在植物细胞基因组的不同位置中的插入。基于转基因或其它期望的特征的表达选择特定的事件。在本公开的实施方案中，特定事件包括插入在靶定的基因组基因座内的供体DNA多核苷酸。
如本文中使用，“插入DNA”是指异源DNA，如供体DNA多核苷酸内的转基因，其可以包含用于转化植物材料的基因表达盒，而“侧翼DNA”或“接合部DNA”可以包括天然存在于生物体，如植物中的基因组DNA，或通过与插入DNA分子无关的转化过程导入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关联的片段。如本文中使用的，“接合部”或“侧翼区”或“侧翼序列”是指至少20，50，100，200，300，400，1000，1500，2000，2500，或5000个碱基对或更大的序列，其位于插入DNA分子的紧邻上游并与之连续，或位于插入DNA分子的紧邻下游并与之连续。
对于通过任何上述转化技术得来的经转化的单倍体胚，可以加以培养以再生拥有经转化的基因型的全植物。此类再生技术称作胚抢救(embryo rescue)。胚抢救培养基可以包含某些植物激素和能源，或仅包含能源。生长培养基还可以含有选择剂，如杀生物剂和/或除草剂。此选择剂可以用于指示经由转化过程导入的标志物。玉米的转化和再生已经描述在例如Gordon-Kamm et al.,The Plant Cell 2:603-618(1990)中。
从胚生成植物是本领域中公知的。可以用于将未成熟的双倍单倍体胚生成为植物的胚抢救技术也是已知的(Recent Research Developments in Genetics&Breeding.Vol.1,Part II,237-303 2004)。其公开内容通过提及并入本文。
载体和供体多核苷酸
在一个实施方案中，本公开涉及导入插入靶定的基因组基因座内的一个或多个供体DNA多核苷酸。在一些实施方案中，供体多核苷酸包含编码序列。编码序列可以编码例如赋予农艺性状的基因(例如转基因)。在进一步的实施方案中，农艺性状选自包括杀虫抗性性状，除草剂耐性性状，氮利用效率性状，水利用效率性状，营养质量性状，DNA结合性状和选择标志物性状的组。在另外的实施方案中，在植物内表达供体多核苷酸。本公开的实施方案包括包含一种或多种供体多核苷酸的植物。在实施方案的一个方面中，植物包含单倍体基因组。在实施方案的另一方面中，所述植物包含双单倍体基因组。
在一些实施方案中，供体多核苷酸包含基因表达盒。用于构建本文中使用的基因表达盒的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中公知的，并且描述于例如Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)；和Silhavy et al.,Experimentswith Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984)；和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。
可以在供体多核苷酸中采用许多指导基因在植物中表达的启动子。此类启动子可以选自组成性，化学调节性，诱导型，组织特异性和种子优选性的启动子。用于指导核酸表达的启动子取决于具体应用。例如，适合于宿主细胞的组成性强启动子通常用于表达和纯化表达的蛋白质。
植物启动子的非限制性例子包括源自拟南芥(A.thaliana)泛素-10(ubi-10)的启动子序列(Callis,et al.,1990,J.Biol.Chem.,265:12486-12493)；根癌土壤杆菌甘露氨酸合酶(Δmas)(Petolino et al.,U.S.Patent No.6,730,824)；和/或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer et al.,1996,Plant Molecular Biology31:1129-1139)。其它组成性启动子包括例如核心花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812)；稻肌动蛋白启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171)；玉米泛素启动子(美国专利号5,510,474；Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632及Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU启动子(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)；玉米组蛋白启动子(Chaboutéet al.Plant Molecular Biology,8:179-191(1987))；等等。
其它有用的植物启动子包括组织特异性和诱导型启动子。诱导型启动子是能够响应诱导物而直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因的转录的启动子。在不存在诱导物的情况下，DNA序列或基因不会被转录。通常，与诱导型调节元件特异性结合以激活转录的蛋白因子以无活性形式存在，然后通过诱导物直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学剂，例如蛋白质，代谢物，生长调节剂，除草剂或酚类化合物，或通过热，冷，盐或有毒元素直接施加，或在病原体或疾病介质(例如病毒)的作用下间接施加的生理应激。通常，与诱导型调节元件特异性结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，然后通过诱导物直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学试剂，例如蛋白质，代谢物，生长调节剂，除草剂或酚类化合物，或通过热，冷，盐或有毒元素直接施加的生理应激，或通过病原体或疾病介质(如病毒)的作用下间接施加的生理应激。通常，与诱导型调节元件特异性结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，然后通过诱导物直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学剂，如蛋白质，代谢物，生长调节剂，除草剂或酚类化合物，或通过热，冷，盐或有毒元素直接施加，或经由病原体或疾病介质，如病毒的作用间接施加的生理应激。可以通过将诱导物外部施加于细胞或植物，如通过喷雾，浇水，加热或类似方法，而将含有诱导型调节元件的植物细胞暴露于诱导物。
任何诱导型启动子均可以在本公开的实施方案中使用。参见Ward et al.,PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。示例性诱导型启动子包括蜕皮激素受体启动子(美国专利No.6,504,082)；响应铜的来自ACE1系统的启动子(Mett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:4567-4571(1993))；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2-1和In2-2基因(美国专利号5,364,780；Hershey et al.,Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991)和Gatz et al.,Mol.Gen.Genetics 243:32-38(1994))；来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991)；或来自类固醇激素基因的启动子，其转录活性由糖皮质激素激发诱导，Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421(1991)和McNellis et al.,(1998)Plant J.14(2):247-257；玉米GST启动子，其由用作萌发前除草剂的疏水性亲电子化合物活化(参见美国专利号5,965,387和国际专利申请公开号WO 93/001294)；和烟草PR-1a启动子，其由水杨酸活化(参见Ono S,Kusama M,Ogura R,HiratsukaK.,“Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor DefenseGene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System,”BiosciBiotechnol Biochem.2011Sep23；75(9):1796-800)。感兴趣的其它化学调节的启动子包括四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见，例如Gatz et al.,(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美国专利号5,814,618和5,789,156)。
感兴趣的其它可调节启动子包括冷响应性调节元件或热休克调节元件，其转录可以分别响应对冷或热的暴露而实现(Takahashi et al.,Plant Physiol.99:383-390,1992)；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach et al.,PNAS USA79:2981-2985(1982)；Walkeret al.,PNAS 84(19):6624-6628(1987))，可由厌氧条件诱导；和自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因来源的光诱导型启动子(Yamamoto et al.,(1997)Plant J.12(2):255-265)；光诱导型调节元件(Feinbaum et al.,Mol.Gen.Genet.226:449,1991；Lam和Chua,Science248:471,1990；Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Bio.23(6):1129-1138)，植物激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki et al.,Plant Mol.Biol.15:905,1990；Kares et al.,PlantMol.Biol.15:225,1990)等等。诱导型调节元件也可以是玉米In2-1或In2-2基因的启动子，其响应苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey et al.,Mol.Gen.Gene.227:229-237,1991；Gatzet al.,Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994)，和转座子Tn10的Tet阻抑物(Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.227:229-237,1991)。应激诱导型启动子包括盐/水应激诱导型启动子，如P5CS(Zang et al.,(1997)Plant Sciences 129:81-89)；冷诱导型启动子，如cor15a(Hajela et al.,(1990)Plant Physiol.93:1246-1252)，cor15b(Wilhelm et al.,(1993)Plant Mol Biol23:1073-1077)，wsc1(Ouellet et al.,(1998)FEBS Lett.423-324-328)，ci7(Kirch et al.,(1997)Plant Mol Biol.33:897-909)，ci21A(Schneider et al.,(1997)Plant Physiol.113:335-45)；干旱诱导型启动子，如Trg-31(Chaudhary et al.,(1996)Plant Mol.Biol.30:1247-57)，rd29(Kasuga et al.,(1999)NatureBiotechnology18:287-291)；渗透诱导型启动子，如Rab17(Vilardell et al.,(1991)Plant Mol.Biol.17:985-93)和逆渗透蛋白(Raghothama et al.,(1993)Plant MolBiol23:1117-28)；和热诱导型启动子，如热休克启动子(Barros et al.,(1992)PlantMol.19:665-75；Marrs et al.,(1993)Dev.Genet.14:27-41)，smHSP(Waters et al.,(1996)J.Experimental Botany 47:325-338)，和来自欧芹泛素启动子的热休克诱导型元件(WO 03/102198)。其它应激诱导型启动子包括rip2(美国专利号5,332,808和美国公开号2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki et al.,(1993)Mol.Gen.Genetics 236:331-340)。某些启动子可由创伤诱导，包括土壤杆菌pMAS启动子(Guevara-Garcia et al.,(1993)Plant J.4(3):495-505)和土壤杆菌ORF13启动子(Hansen et al.,(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。
可以利用组织优选性启动子靶向特定植物组织内的增强的转录和/或表达。当提及优先表达时，是指在特定植物组织中比在其它植物组织中更高水平的表达。这些类型的启动子的例子包括种子优选的表达，如由菜豆球蛋白启动子(Bustos et al.,(1989)ThePlant Cell Vol.1,839-853)，和玉米球蛋白-1基因(Belanger,et al.(1991)Genetics129:863-972)提供的表达。对于双子叶植物，种子优选性启动子包括但不限于豆类β-菜豆球蛋白，napin，β-伴大豆球蛋白，大豆凝集素，十字花科素(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子优选性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白，22kDa玉米醇溶蛋白，27kDa玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白，蜡质蛋白(waxy)，皱缩蛋白1(shrunken1)，皱缩蛋白2，球蛋白1等。种子优选性启动子还包括那些将大部分基因表达引导到种子内的特定组织的启动子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳优选启动子，来自烟草的隐藏启动子(Fobert et al.,(1994)T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco.PlantJ.4:567-577)；来自玉米的P基因启动子(Chopra et al.,(1996)Alleles of the maize Pgene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins withC-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158,Erratum in Plant Cell.1997,1:109)，来自玉米的球蛋白-1启动子(Belenger和Kriz(1991)Molecular basis for AllelicPolymorphism of the maize Globulin-1gene.Genetics 129:863-972)，以及指导表达到玉米籽粒的种皮或外壳的启动子，例如果皮特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Muhitch etal.,(2002)Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1- 2Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in TransgenicMaize.Plant Science 163:865-872)。
除了启动子之外，表达盒(其可以在例如载体中)通常含有转录单元或表达盒，其含有在宿主细胞(原核或真核)中表达核酸需要的所有其他元件。因此，典型的表达盒含有可操作地连接于编码基因产物(例如蛋白质)的核酸序列的启动子。表达盒还可以包括根据本领域已知方法可操作地连接的别的元件：转录物的高效多聚腺苷酸化需要的信号、转录终止需要的信号、核糖体结合位点、或翻译终止需要的信号。另外，表达盒可以包括增强子和/或异源剪接信号。
可以包括供体多核苷酸或载体的其它组分，这也取决于供体多核苷酸的意图用途。例子包括选择标志物，靶向或调节序列，转运肽序列，如优化的转运肽序列(参见美国专利号5,510,471)，稳定化序列如RB7MAR(参见Thompson和Myatt,(1997)Plant Mol.Biol.,34:687-692和国际专利公开号WO9727207)或前导序列，内含子等。植物表达载体和报告基因的一般描述和例子可见于Gruber,et al.,“Vectors for Plant Transformation”收录于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick et al编；CRCPress pp.89-119(1993)。合适的表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体导入宿主中的方法。表达盒还将在感兴趣的异源核苷酸序列的3’末端处包括在植物中有功能的转录和翻译终止区。终止区可以是本公开的实施方案的启动子核苷酸序列所固有的，可以是感兴趣的DNA序列所固有的，或者可以来源自其他来源。方便的终止区可获自根癌土壤杆菌的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶(nos)终止区(Depicker et al.,Mol.andAppl.Genet.1:561-573(1982)和Shaw et al.(1984)Nucleic Acids Research vol.12,No.20pp7831-7846(nos))；还参见Guerineau et al.Mol.Gen.Genet.262:141-144(1991)；Proudfoot,Cell 64:671-674(1991)；Sanfacon et al.Genes Dev.5:141-149(1991)；Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272(1990)；Munroe et al.Gene 91:151-158(1990)；Ballas et al.,Nucleic Acids Res.17:7891-7903(1989)；Joshi et al.Nucleic AcidRes.15:9627-9639(1987)。
另外，表达盒可以含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域中已知的，并且举例而言，包括细小核糖核酸病毒(picornavirus)前导，EMCV前导(脑心肌炎5’非编码区)，Elroy-Stein et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:6126-6130(1989)；马铃薯Y病毒组(potyvirus)前导，例如TEV前导(烟草蚀纹病毒)Carrington和Freed Journal of Virology,64:1590-1597(1990)，MDMV前导物(玉米矮花叶病毒)，Allison et al.,Virology154:9-20(1986)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak et al.,Nature353:90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒的壳体蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导，Jobling et al.,Nature 325:622-625(1987)；烟草花叶病毒前导(TMV)，Gallie et al.,(1989)Molecular Biology of RNA，第237-256页；和玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus)前导(MCMV)Lommel et al.,Virology81:382-385(1991)。还可参见Della-Cioppa et al.,Plant Physiology 84:965-968(1987)。
表达盒构建体还可以含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。一个例子是拟南芥的组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子。Chaubet et al.,Journal ofMolecular Biology,225:569-574(1992)。
在期望表达盒表达的基因产物被引导到特定细胞器，特别是质体，造粉体或内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒可以进一步包含转运肽的编码序列。此类转运肽是本领域中公知的，包括但不限于酰基载体蛋白的转运肽，RUBISCO的小亚基，植物EPSP合酶和向日葵(Helianthus annuus)(美国专利号5,510,417)，玉蜀黍Brittle-1叶绿体转运肽(Nelson et al.,Plant Physiol 117(4):1235-1252(1998)；Sullivan et al.,Plant Cell 3(12):1337-48；Sullivan et al.,Planta(1995)196(3):477-84；Sullivanet al.,J.Biol.Chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合叶绿体转运肽是本领域中已知的，如优化的转运肽(美国专利号5,510,471)。先前已经在美国专利号5,717,084和美国专利号5,728,925中描述另外的叶绿体转运肽。本领域技术人员将容易理解可用于将产物表达到特定细胞器的许多选择。例如，大麦α淀粉酶序列经常用于将表达引导到内质网(Rogers,J.Biol.Chem.260:3731-3738(1985))。
本领域技术人员应当理解，可以使用重组DNA技术操纵例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数、转录那些核酸分子的效力、翻译所得的转录物的效率、和翻译后修饰的效率，从而更好地控制转染的核酸分子表达。另外，与天然启动子相比，可以遗传工程改造启动子序列以提高表达水平。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括但不限于：将核酸分子稳定整合到一个或多个宿主细胞染色体中，向质粒添加载体稳定性序列，取代或修饰转录控制信号(例如启动子，操纵子，增强子)，取代或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点，Shine-Dalgarno或Kozak序列)，修饰核酸分子使之对应于宿主细胞的密码子选择，和删除使转录物不稳定的序列。
可以在转化载体中包括用于选择经转化的细胞或组织或植物部分或植物的报告基因或标志物基因。选择标志物的例子包括赋予对抗代谢物，如除草剂或抗生素的抗性的那些，例如二氢叶酸还原酶，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(LifeSci.Adv.)13:143-149,1994；还可见Herrera Estrella et al.,Nature 303:209-213,(1983)；Meijer et al.,Plant Mol.Biol.16:807-820,(1991))；新霉素磷酸转移酶，其赋予对新霉素、卡那霉素和巴龙霉素(paromycin)等氨基糖苷的抗性(Herrera-Estrella,EMBO J.2:987-995,1983及Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:4803(1983))，和潮霉素磷酸转移酶，其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene 32:481-485,(1984)；另见Waldron et al.,Plant Mol.Biol.5:103-108,(1985)；Zhijian et al.,PlantScience108:219-227,(1995))；trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:8047,(1988))；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(国际专利申请号WO94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2(二氟甲基)-DL鸟氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,收录于:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratoryed.)；和土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338,(1995))。
另外的选择标志物包括例如赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶(Lee et al.,EMBO J.7:1241-1248,(1988))，突变体psbA，其赋予对阿特拉嗪的抗性(Smeda et al.,Plant Physiol.103:911-917,(1993))或突变原卟啉原氧化酶(参见美国专利号5,767,373)或赋予对除草剂例如草丁磷(glufosinate)的抗性的其它标志物。合适的选择标志物基因的例子包括但不限于编码对氯霉素(Herrera Estrella et al.,EMBOJ.2:987-992,(1983))；链霉素(Jones et al.,Mol.Gen.Genet.210:86-91,(1987))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard et al.,Transgenic Res.5:131-137,(1996))；博莱霉素(Hilleet al.,Plant Mol.Biol.7:171-176,(1990))；磺酰胺(Guerineau et al.,PlantMol.Biol.15:127-136,(1990))；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker et al.,Science 242:419-423,(1988))；草铵膦(glyphosate)(Shaw et al.,Science 233:478-481,(1986))；膦丝菌素(phosphinothricin)(DeBlock et al.,EMBO J.6:2513-2518,(1987))等的抗性的基因。
使用选择性基因的一个选项是草丁磷抗性编码DNA，并且在一个实施方案中可以是在木薯叶脉花叶病毒启动子控制下的膦丝菌素乙酰转移酶(pat)、玉米优化的pat基因、或bar基因。这些基因赋予对双丙氨膦(bialaphos)的抗性。参见，(参见Wohlleben et al.,(1988)Gene 70:25-37)；Gordon-Kamm et al.,Plant Cell 2:603；1990；Uchimiya etal.,BioTechnology 11:835,1993；White et al.,Nucl.Acids Res.18:1062,1990；Spencer et al.,Theor.Appl.Genet.79:625-631,1990；及Anzai et al.,Mol.Gen.Gen.219:492,1989)。pat基因的形式是玉米优化的pat基因，记载于美国专利号6,096,947中。
此外，可以采用便于鉴定含有编码标志物的多核苷酸的植物细胞的标志物。可评分的或可筛选的标志物，其中序列的存在产生可测量的产物并且可以在不破坏植物细胞的条件下产生产物，是有用的。实例包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码已知具有各种生色底物的酶(例如，美国专利号5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson et al.The EMBO Journal，第6卷，第13期，第3901-3907页)；和碱性磷酸酶。在优选的实施方案中，使用的标志物是β-胡萝卜素或维生素原A(Ye et al.,Science287:303-305-(2000))。该基因已经用于增强稻的营养，但在此情况下，它是用作可筛选标志物，并且通过所提供的金色检测与感兴趣的基因连接的基因的存在。与该基因用于对植物的贡献营养的情况不同，用于标记目的时，较少量的蛋白质就足够了。其它可筛选标志物一般包括花色素苷/黄酮类基因(参见Taylor和Briggs,The Plant Cell(1990)2:115-127的讨论)，包括例如R基因座基因，其编码的产物调节植物组织中花色素苷产物(红色)生成(Dellaportaet al.,于Chromosome Structure and Function,Kluwer Academic Publishers,Appels和Gustafson编,pp.263-282(1988))；控制黄酮类色素的生物合成的基因，如玉米C1基因(Kao et al.,Plant Cell(1996)8:1171-1179；Scheffler et al.,Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2(Wienand et al.,Mol.Gen.Genet.(1986)203:202-207)；B基因(Chandler et al.,Plant Cell(1989)1:1175-1183)，p1基因(Grotewold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)88:4587-4591；Grotewold et al.,Cell(1994)76:543-553；Sidorenko et al.,Plant Mol.Biol.(1999)39:11-19)；青铜色基因座基因(bronzelocus genes)(Ralston et al.,Genetics(1988)119:185-197；Nash et al.,Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)等。
合适的标志物的其它例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因(Bolte et al.,(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato et al.,(2002)Plant Physiol 129:913-42)，黄色荧光蛋白基因(来自Evrogen的PHIYFPTM；参见Bolte et al.,(2004)J.Cell Science 117:943-54)；lux基因，其编码萤光素酶，所述萤光素酶的存在可以使用例如X射线胶片，闪烁计数，荧光分光光度法，低光摄像机，光子计数照相机或多孔发光测定法检测(Teeri et al.(1989)EMBO J.8:343)；绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen et al.,Plant J.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，其中用标志物基因转化的植物细胞是红色的，因此可目视选择(Dietrich et al.,(2002)Biotechniques 2(2):286-293)。另外的例子包括β-内酰胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)，其编码具有已知各种生色底物的酶(例如PADAC，生色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α淀粉酶基因(Ikuta et al.,Biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(Katz et al.,J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其编码的酶能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌，二者继而缩合以形成可容易检测的化合物黑色素。很明显，许多此类标记物可用并且是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，表达盒中的编码基因产物的转基因的核苷酸序列任选地可以与盒和/或植物中的另一感兴趣的核苷酸序列组合。术语“感兴趣的核苷酸序列”是指可以是转录的RNA分子以及编码期望的多肽或蛋白质的DNA分子的核酸分子(其也可以称为多核苷酸)，但也可以指不构成整个基因并且不一定编码多肽或蛋白质的核酸分子(例如启动子)。例如，在某些实施方案中，转基因可以与另一种感兴趣的核苷酸序列组合或“堆叠”，所述另一种感兴趣的核苷酸序列提供对草甘膦或另一种除草剂的额外的抗性或耐受性，和/或提供对挑选的昆虫或疾病的抗性和/或提供营养强化，和/或改进的农艺学特性，和/或可用于饲料，食物，工业，药物或其它用途的蛋白质或其它产物。植物基因组内两个或更多个感兴趣的核酸序列的“堆叠”可以例如通过使用两个或更多个事件进行常规植物育种、用含有感兴趣的序列的构建体转化植物、对转基因植物的再转化、或通过同源重组靶向整合添加新性状等来实现。
此类感兴趣的核苷酸序列包括但不限于下文提供的赋予(1)对有害生物或疾病的抗性，(2)对除草剂的抗性，和(3)增值性状的基因或编码序列的那些例子：
1.赋予对有害生物或疾病的抗性的基因或编码序列(例如iRNA)
(A)植物疾病抗性基因。通常通过植物中的疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒力(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体菌株有抗性的植物。此类基因的例子包括：对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)(Jones et al.,1994Science 266:789)有抗性的番茄Cf-9基因，编码蛋白激酶的番茄Pto基因，用于对丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的抗性(Martin et al.,1993Science 262:1432)和用于对丁香假单胞菌的抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos et al.,1994Cell 78:1089)。
(B)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白，其衍生物或其上模拟的合成多肽，如Btδ-内毒素基因的核苷酸序列(Geiser et al.,1986Gene 48:109)和营养型杀虫(VIP)基因(参见例如Estruch et al.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，可以在ATCC保藏号40098，67136，31995和31998下从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购买编码δ-内毒素基因的DNA分子。
(C)凝集素，如几种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994Plant Molec.Biol.24:825)。
(D)维生素结合蛋白，如可用作针对昆虫有害生物的杀幼虫剂的亲合素和亲合素同系物。参见美国专利号5,659,026。
(E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。此类基因的例子包括稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Abe et al.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huubet al.,1993Plant Molec.Biol.21:985)和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
(F)昆虫特异性激素或信息素，如脱皮素和保幼激素，其变体，基于其的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达，保幼激素的灭活剂(Hammock et al.,1990Nature 344:458)。
(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时破坏受影响的有害生物的生理学(J.Biol.Chem.269:9)。此类基因的例子包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，太平洋硕蠊(Diploptera punctata)中鉴定的allostatin(Pratt,1989)和昆虫特异性麻痹性神经毒素(美国专利号5,266,361)。
(H)由蛇，黄蜂等自然生成的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,(1992)Gene 116:165)。
(I)负责单萜，倍半萜，类固醇，异羟肟酸，苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或另一种具有杀虫活性的非蛋白质分子的高度积累的酶。
(J)参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶，蛋白水解酶，脂肪分解酶，核酸酶，环化酶，转氨酶，酯酶，水解酶，磷酸酶，激酶，磷酸化酶，聚合酶，弹性蛋白酶，壳多糖酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的。此类基因的例子包括愈伤组织基因(PCT公开申请WO93/02197)，壳多糖酶编码序列(其可例如从ATCC以保藏号3999637和67152获得)，烟草钩虫壳多糖酶(Kramer et al.,(1993)Insect Molec.Biol.23:691)和欧芹ubi4-2聚泛素基因(Kawalleck et al.,(1993)Plant Molec.Biol.21:673)。
(K)刺激信号转导的分子。此类分子的例子包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,(1994)Plant Molec.Biol.24:757)和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess et al.,(1994)Plant Physiol.104:1467)。
(L)疏水性力矩肽。参见美国专利号5,659,026和5,607,914；后者教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽。
(M)膜通透酶，通道形成物或通道阻断剂，如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes etal.,(1993)Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。
(N)病毒侵入性蛋白或由其来源的复合毒素。例如，转化的植物细胞中病毒壳体蛋白的积累赋予对病毒感染和/或由来源壳体蛋白基因的病毒以及相关病毒实现的疾病形成的疾病形成的抗性。已经对经转化的植物赋予针对苜蓿花叶病毒，黄瓜花叶病毒，烟草条纹病毒，马铃薯病毒X，马铃薯病毒Y，烟草蚀纹病毒，烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的壳体蛋白介导的抗性。参见例如Beachy et al.,(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。
(O)昆虫特异性抗体或由其来源的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将灭活受影响的酶，杀死昆虫。例如，Taylor et al.,(1994)Abstract#497,Seventh Int'l.Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions显示经由生成单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活。
(P)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki et al.,(1993)Nature 266:469，其显示保护表达重组抗体基因的转基因植物免受病毒攻击。
(Q)自然界中由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白。因此，真菌内切α-1,4-D聚半乳糖醛酸酶)通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(homo-α-1,4-D-galacturonase促进真菌定殖和植物营养物释放(Lamb et al.,(1992)Bio/Technology10:1436)。编码豆多聚半乳糖醛酸内切酶抑制蛋白的基因的克隆和表征由(Toubart etal.,(1992)Plant J.2:367)描述。
(R)由植物天然生成的发育阻遏蛋白，如对真菌疾病提供增强的抗性的大麦核糖体失活基因(Longemann et al.,(1992).Bio/Technology 10:3305)。
(S)RNA干扰，其中编码RNA分子的DNA多核苷酸用于抑制靶基因的表达。在一个例子中，RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默反应，导致dsRNA切割成小的干扰RNA，然后将其掺入到破坏同源mRNA的靶向复合物中。参见例如，Fire et al.,美国专利号6,506,559；Graham et al.,美国专利号6,573,099。
2.赋予对除草剂的抗性的基因或编码序列
(A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮，磺酰苯胺或磺酰脲除草剂)的抗性或耐受性的基因。该类别中的示例性基因编码突变体ALS酶(Lee et al.,(1988)EMBOJ.7:1241)，其也称为AHAS酶(Miki et al.,(1990)Theor.Appl.Genet.80:449)。
(B)一种或多种其它基因，其编码对草甘膦(由突变体EPSP合酶和aroA基因或通过由基因如GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)的代谢失活赋予)和其它膦酰基(phosphono)化合物，如草丁磷(pat和bar基因；DSM-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己烷二酮(ACC酶抑制剂编码基因)抗性或耐受性。参见例如美国专利号4,940,835，其公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变型aroA基因的DNA分子可以在ATCC保藏号39256下获得，并且在美国专利号4,769,061中公开突变体基因的核苷酸序列。欧洲专利申请号0 333 033和美国专利号4,975,374公开了赋予除草剂如L-膦丝菌素抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。在欧洲专利申请号0 242 246中提供了膦丝菌素乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.,(1989)Bio/Technology 7:61描述了表达嵌合bar基因的转基因植物的生成，所述嵌合bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶活性。赋予对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮类(例如烯禾啶(sethoxydim)和吡氟氯禾灵)抗性的基因的例子是由Marshall et al.,(1992)Theor.Appl.Genet.83:435描述的Accl-S1，Accl-S2和Accl-S3基因。
(C)编码对抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibilla et al.,(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列公开于美国专利号4,810,648中，并且含有这些基因的DNA分子在ATCC保藏号53435,67441和67442下可获得。Hayes et al.,(1992)Biochem.J.285:173描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
(D)编码对结合羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)(催化其中对羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸的反应的酶)的除草剂的抗性或耐受性的基因。这包括除草剂如异恶唑(isoxazoles)(欧洲专利号418175，欧洲专利号470856，欧洲专利号487352，欧洲专利号527036，欧洲专利号560482，欧洲专利号682659，美国专利号5,424,276)，特别是异恶唑草酮(其是玉米的选择性除草剂)，二酮腈(diketonitriles)(欧洲专利号496630，和欧洲专利号496631)，尤其是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮(欧洲专利号625505，欧洲专利号625508，美国专利号5,506,195)，特别是磺草酮(sulcotrione)和吡唑啉盐(pyrazolinates)。在植物中生成HPPD过多的基因可以提供对此类除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利号6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开号20030066102中描述的基因。
(E)编码对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且还可赋予对芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草剂的抗性或耐受性的基因。此类基因的实例包括美国专利号7,838,733中描述的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(aad-1)基因。
(F)编码对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且还可赋予对吡啶氧基生长素除草剂如氟草烟(fluroxypyr)或定草酯(triclopyr)的抗性或耐受性的基因。此类基因的例子包括WO 2007/053482A2中描述的α-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因(aad-12)。
(G)编码对麦草畏的抗性或耐受性的基因(参见例如美国专利公开号20030135879)。
(H)提供对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(参见美国专利号5,767,373)。
(I)提供对结合光系统II反应中心(PS II)的核心蛋白的尿素衍生物(例如敌草隆(diuron))除草剂和三嗪除草剂(例如阿特拉嗪(atrazine))的抗性或耐受性的基因(Brussian et al.,(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。
3.赋予或促成增值性状的基因
(A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属(Brassica)以增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。
(B)降低的肌醇六磷酸含量。
(1)肌醇六磷酸酶编码基因如黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,(1993)Gene 127:87)的引入增强肌醇六磷酸的分解，向经转化的植物添加更多的游离磷酸盐。
(2)可以引入降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆并然后重新引入与负责以低水平肌醇六磷酸为特征的玉米突变体的单个等位基因相关的DNA来完成(Raboy et al.,(1990)Maydica 35:383)。
(C)例如通过用编码改变淀粉分枝模式的酶的基因转化植物而实现的经修饰的碳水化合物组成。此类酶的例子包括粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,(1988)J.Bacteriol.170:810)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(Steinmetz et al.,(1985)Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(Pen et al.,(1992)Bio/Technology10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,(1993)，大麦淀粉酶基因(Sogaard et al.,(1993)J.Biol.Chem.268:22480)和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher et al.,(1993)PlantPhysiol.102:10450)。
位点特异性核酸酶
在实施方案中，本文中描述的方法和组合物利用一种或多种位点特异性核酸酶。公开的方法包括将一种或多种编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至自玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织。这些位点特异性核酸酶可以通过切割DNA或诱导DNA断裂来修饰基因组DNA，所述DNA断裂可以是双链断裂或单链断裂。位点特异性核酸酶的实施方案包括TALEN、大范围核酸酶、CRISPR核酸酶或锌指核酸酶。
在一个实施方案中，在公开的方法中使用的位点特异性核酸酶是工程化(非天然存在的)TALEN核酸酶。参见例如美国专利公开号20110301073，通过提及将其全部内容并入本文。已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物病原性细菌在重要的作物植物中引起许多疾病。黄单胞菌的致病性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，其将超过不同效应物蛋白注射到植物细胞中。这些注射的蛋白质之一是转录激活物样(TALEN)效应物，其可模拟植物转录激活物并操纵植物转录组(参见Kay et al(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白质含有TAL效应物DNA结合域和转录激活域。表征得最充分的TAL效应物之一是来自野油菜黄单胞菌叶斑病致病株(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)(参见Bonas et al(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430)。TAL效应物包含一个由串联重复构成的中心化域，每个重复包含约34个氨基酸，其是这些蛋白质的DNA结合特异性的关键。此外，它们含有核定位序列和酸性转录激活域(综述参见Schornack S,et al(2006)J Plant Physiol163(3):256-272)。在植物病原菌青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中，已经发现青枯雷尔氏菌生物变型菌株GMI1000和生物变型4菌株RS1000中称为brg11和hpx17的两个基因与黄单胞菌的AvrBs3家族同源(参见Heuer et al(2007)Appl and Enviro Micro 73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此是98.9％相同的，但在hpx17的重复域中由于缺失1575bp而不同。然而，这两种基因产物与黄单胞菌的AvrBs3家族蛋白具有小于40％的序列同一性。参见例如美国专利公开号20110301073，其全部内容通过提及并入本文。
这些TAL效应物的特异性取决于串联重复域的序列。在某些实施方案中，每个重复序列包含约102bp；并且重复通常彼此91-100％同源(Bonas等人，同上)。重复通常包括多态性，多态性通常位于位置12和13，并且在位置12和13处的高变双残基的身份与在TAL效应物的靶序列中连续核苷酸的身份之间似乎存在一对一的对应关系(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science326:1501及Boch et al(2009)Science 326:1509-1512)。实验上，已经确定这些TAL效应物的DNA识别的天然代码是这样的：位置12和13处的HD序列导致与胞嘧啶(C)的结合，NG结合T，NI结合A，C，G或T，NN结合A或G，而ING结合T。已经有人将这些DNA结合重复序列装配成具有新的组合和数目的重复序列的蛋白质，以制备能够与新序列相互作用并激活植物细胞中的非内源报告基因表达的人工转录因子(Boch等人，同上)。已经有人将工程化的TAL蛋白连接到FokI切割半域以生成TAL效应物域核酸酶融合物(TALEN)，在酵母报道分子测定法(基于质粒的靶标)中显示了活性。
在另一个实施方案中，可以将本公开方法中使用的位点特异性核酸酶工程化改造为包括(非天然存在的)大范围核酸酶(也称为归巢内切核酸酶)。归巢内切核酸酶或大范围核酸酶如I-SceI，I-CeuI，PI-PspI，PI-Sce，I-SceIV，I-CsmI，I-PanI，I-SceII，I-PpoI，I-SceIII，I-CreI，I-TevI，I-TevII和I-TevIII的识别序列是已知的。也参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–303388；Dujon et al.(1989)Gene 82:115–118；Perler et al.(1994)Nucleic AcidsRes.22,11127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble et al.(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast et al.(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和New EnglandBiolabs目录。此外，可以工程化改造归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性以结合非天然的靶位点。参见，例如Chevalier et al.(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat et al.(2003)Nucleic Acids Res.5 31:2952-2962；Ashworth et al.(2006)Nature 441:656-659；Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号20070117128。归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合域可以在整个核酸酶的背景中改变(即，使得核酸酶包括关联切割域)或可以与异源切割域融合。
在进一步的实施方案中，在公开的方法中使用的位点特异性核酸酶是工程化(非天然存在的)CRISPR核酸酶。CRISPR(聚簇规定散布短回文重复(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats))/Cas(CRISPR关联)核酸酶系统是一种新近工程化的核酸酶系统，以一种可以用于基因组工程的细菌系统为基础。它是基于许多细菌和古细菌的适应性免疫反应的一部分。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入者的DNA的片段通过“免疫”应答转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，此crRNA通过部分互补性区域与称为tracrRNA的另一种类型的RNA结合，将Cas核酸酶(例如Cas9)引导至靶DNA中的与crRNA同源的区域，称为“原间隔物(protospacer)”。Cas核酸酶在由包含在crRNA转录物内的引导序列规定的位点处切割DNA，在DSB处生成平端。Cas9的位点特异性DNA识别和切割需要crRNA和tracrRNA两者。此系统现在已经被工程化，使得crRNA和tracrRNA可以组合成一个分子(“单引导RNA”)，并且单引导RNA的crRNA等同物可以被工程化改造以引导Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(参见Jinek et al(2012)Science 337,p.816-821,Jinek et al,(2013),eLife 2:e00471，及David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此，可以工程化改造CRISPR/Cas系统以在基因组中的期望靶标处生成双链断裂(DSB)，并且可以通过使用修复抑制剂影响DSB的修复，从而引起易错修复的增加。
在某些实施方案中，Cas核酸酶可以是天然存在的Cas核酸酶的“功能性衍生物”。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽共同的质量性生物学性质的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽共同的核酸酶活性。本文中考虑的核酸酶活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖：多肽的氨基酸序列变体、共价修饰、和其融合物。Cas核酸酶或其核酸酶片段的合适衍生物包括但不限于：Cas蛋白或其核酸酶片段的突变体、融合物、共价修饰。Cas核酸酶或其功能衍生物可以从细胞获得，或者可以化学合成、或者通过这两种程序的组合合成。细胞可以是天然生成Cas核酸酶的细胞，也可以是天然生成Cas核酸酶、然后经过遗传工程化改造，从而以更高的表达水平生成内源Cas蛋白或从外源导入的核酸生成Cas核酸酶的细胞，所述核酸编码的Cas核酸酶与内源Cas可以相同也可以不同。在一些情况下，细胞不天然生成Cas蛋白，而是被遗传工程化改造以生成Cas核酸酶。通过用引导RNA共表达Cas核酸酶，将Cas核酸酶部署在哺乳动物细胞中(而且可推定在植物细胞内)。可以使用两种引导RNA形式促进Cas介导的基因组切割，如LeCong,F.,et al.,(2013)Science339(6121):819-823中公开的。
在某些实施方案中，用于细胞基因组的体内切割和/或靶向切割的一种或多种核酸酶的DNA结合域包含锌指蛋白。在一些实施方案中，锌指蛋白是非天然存在的，并且被工程化改造以结合选择的靶位点。参见，例如Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan et al.(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Chooet al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利No.6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其全部内容通过提及并入本文。
与天然存在的锌指蛋白相比，经工程化改造的锌指结合域可以具有新的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见例如美国专利号6,453,242和6,534,261，其全部内容通过提及并入本文。
靶位点的选择；用于设计和构建融合蛋白(和编码它们的多核苷酸)的ZFP和方法是本领域技术人员已知的，并且在美国专利号6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中详细描述。
此外，可以使用任何合适的接头序列将锌指域和/或多指锌指蛋白连接在一起，所述接头序列包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列，也参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文中所述的蛋白质可以包含蛋白质的个别锌指之间的合适接头的任何组合。
因此，在整合本文中公开的供体多核苷酸的方法中，位点特异性核酸酶包含特异性结合玉米基因组中期望插入供体DNA多核苷酸(其可以包含至少一个转基因)的基因座处的靶位点的DNA结合域。
可以将任何合适的切割域与DNA结合域可操作连接以形成核酸酶融合蛋白。例如，已经有人将ZFP DNA结合域与核酸酶域融合以创建ZFN，ZFN是一种功能性实体，能够借助其工程化改造的(ZFP)DNA结合域识别其意图的核酸靶标，使得DNA在核酸酶活性的作用下在ZFP结合位点附近被切割。参见，例如，Kim et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160。新近，ZFN已经用于多种生物体中的基因组修饰。参见，例如，美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和国际公开WO 07/014275。同样，TALEN DNA结合域已经与核酸酶域融合以创建TALEN。参见例如美国公开号20110301073。
如上所述，切割域可以与DNA结合域是异源的，例如锌指DNA结合域和来自不同核酸酶的切割域，或TALEN DNA结合域和来自不同核酸酶的切割域，或大范围核酸酶DNA结合结构域和来自不同核酸酶的切割域。异源切割域可以从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可以作为切割域来源的示例性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见例如2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；及Belfort etal.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；也参见Linn等人(编)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可以用作切割域和切割半域的来源。
类似地，切割半域可以来源于任何需要二聚化以产生切割活性核酸酶或其部分，如上文列举的。通常，如果融合蛋白包含切割半域，则需要两个融合蛋白用于切割。或者，可以使用包含两个切割半域的单一蛋白质。两个切割半域可以来源自相同的内切核酸酶(或其功能片段)，或者，每个切割半域可以来源于不同的内切核酸酶(或其功能片段)。此外，优选地，两个融合蛋白的靶位点具有这样的相对排布，使得两个融合蛋白与其各自靶位点的结合后，各切割半域彼此采取一定的空间取向，使得各切割半域能够形成功能性切割域，例如通过二聚化。因此，在某些实施方案中，各靶位点的近缘相距5-8个核苷酸或15-18个核苷酸。然而，两个靶位点之间可以插入任何整数数目的核苷酸或核苷酸对(例如，2至50个核苷酸对或更多)。通常，切割位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA(在识别位点)进行序列特异性的结合，并在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如IIS型)在与识别位点远离的位点切割DNA，并具有可分离的结合和切割域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链切割，在一条链上距其识别位点的9个核苷酸处切割，在另一条链上距其识别位点的13个核苷酸处切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的切割域(或切割半域)和一个或多个锌指结合域，其可以是，也可以不是经工程化改造的。
一种示例性IIS型限制酶(其切割域与结合域可分开)是Fok I。这种酶是作为二聚体有活性的。Bitinaite et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，为了本公开的目的，认为公开的融合蛋白中使用的Fok I酶的部分是切割半域。因此，为了使用锌指Fok I融合物的靶向双链切割和/或靶向替代细胞序列，可以使用两个融合蛋白(分别包含一个Fok I切割半域)来重建催化活性切割域。或者，也可以使用含有锌指结合域和两个Fok I切割半域的单个多肽分子。使用锌指Fok I融合物的靶向切割和靶向序列改变的参数在本公开内容的其它地方提供。
切割域或切割半域可以是蛋白质中任何保留切割活性或保留多聚化(例如二聚化)形成功能性切割域的能力的部分。
示例性的IIS型限制酶描述于国际专利申请公开WO 07/014275中，其全部内容并入本文。别的限制酶也含有可分开的结合域和切割域，并且这些是本公开考虑到的。参见例如Roberts et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在某些实施方案中，切割域包含一个或多个可极大减少或阻止同二聚化的工程化切割半域(也称为二聚化域突变体)，例如美国专利公开号20050064474；20060188987；20070305346和20080131962中公开的，所有这些的公开内容通过提及以其整体并入本文。Fok I的位置446，447，479，483，484，486，487，490，491，496，498，499，500，531，534，537，和538处的氨基酸残基都是影响FokI切割半域的二聚化的靶标。
示例性的形成专性异二聚体的Fok I的工程化切割半域包括这样的成对切割半域，其中第一切割半域包括在Fok I的位置490和538处的氨基酸残基处的突变，并且第二切割半域包括在氨基酸残基486和499处的突变。
因此，在一个实施方案中，490处的突变用Lys(K)替换Glu(E)；538处的突变用Lys(K)替代Iso(I)；在486处的突变用Glu(E)替代Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)替代Iso(I)。具体地，本文中描述的工程化切割半域是这样制备的：在一个切割半域中突变位置490(E→K)和538(I→K)生成称为“E490K:I538K”的工程化切割半域，并且在另一切割半域中突变位置486(Q→E)和499(I→L)以生成称为“Q486E:I499L”的工程化切割半域。本文中描述的工程化切割半域是专性的异二聚体突变体，其中极大减少或者消除了异常切割。参见例如美国专利公开号2008/0131962，其公开内容通过提及整体并入本文用于所有目的。在某些实施方案中，工程化的切割半域包含在位置486，499和496(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如用Glu(E)残基替换位置486处的野生型Gln(Q)残基，用Leu(L)残基替换位置499处的野生型Iso(I)残基，用Asp(D)或Glu(E)残基替换位置496处的野生型Asn(N)残基的突变(也分别称为“ELD”和“ELE”域)。在其它实施方案中，工程化切割半域包含在位置490，538和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置490处用Lys(K)替换野生型Glu(E)残基，用Lys(K)残基替换位置538处的野生型Iso(I)残基和用Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基(也分别称为“KKK”和“KKR”域)。在其它实施方案中，工程化切割半域包含在位置490和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如用Lys(K)残基替换位置490处的野生型Glu(E)残基和用Lys(K)残基或Arg(R)残基替换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别称为“KIK”和“KIR”域)。(参见美国专利公开号20110201055)。在其它实施方案中，工程化切割半域包含“Sharkey”和/或“Sharkey”突变(参见Guo et al,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。
可以使用任何合适的方法制备本文中描述的工程化切割半域，例如通过野生型切割半域(Fok I)的定点诱变，如美国专利公开号20050064474；20080131962；和20110201055中描述的。
或者，可以使用所谓的“分裂酶(split-enzyme)”技术(参见例如美国专利公开号20090068164)在核酸靶位点处在体内装配核酸酶。此类分裂酶的构件可以在分别的表达构建体上表达，或者可以连接在一个可读框中，其中各个构件例如通过自切割2A肽或IRES序列分开。构件可以是单个锌指结合域或大范围核酸酶核酸结合域的域。
可以在使用前筛选核酸酶的活性，例如在如WO 2009/042163和20090068164中描述的基于酵母的染色体系统中。可以使用本领域中已知的方法容易地设计核酸酶表达构建体。参见例如美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和国际公开WO 07/014275。核酸酶的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下。
“靶标”或“靶位点”或“靶定基因组基因座”或“基因组DNA靶区域”是限定核酸中会与结合分子(例如位点特异性核酸酶)结合的一部分的核酸序列，只要存在足够的结合条件。
在一个实施方案中，基因组基因座序列包括存在于染色体，附加体，细胞器基因组(例如线粒体，叶绿体)，人工染色体和细胞中存在的任何其它类型的核酸中的那些，如例如扩增的序列，双重微小染色体和内源性或感染性细菌和病毒的基因组。基因组基因座序列可以是正常(即野生型)或突变体；突变体序列可以包括例如插入(例如，先前插入的外源多核苷酸)，缺失，易位，重排和/或点突变。基因组基因座序列还可以包含多种不同等位基因中的一种。
本文中还描述了用于在基因组基因座内插入供体DNA多核苷酸序列的方法作为本公开的实施方案。报告和观察到的靶向基因组修饰的频率表明，在植物内对基因组基因座的靶向是相对低效的。此类方法的成功率低，部分是由于同源重组的效率差，以及供体DNA非特异性插入基因组中靶位点之外区域中的频率高。本公开提供了用于鉴定被靶定的基因组基因座内的供体DNA多核苷酸的方法。
本文中公开了使用位点特异性核酸酶(例如，与切割域融合的工程化锌指结合域)在细胞DNA中生成一个或多个靶向的双链断裂的方法。尽管公开的方法不依赖于特定的作用机制，但是已知细胞DNA中的双链断裂在切割位点附近刺激细胞修复机制增加数千倍，这样的靶向切割为改变或替换(通过同源指导性修复)基因组中几乎任何位点的序列提供了条件。
除了使用本文中描述的位点特异性核酸酶外，靶向替换(或插入)选定的基因组序列还需要导入供体DNA多核苷酸。可以在位点特异性核酸酶表达之前、同时、或之后将供体DNA多核苷酸导入细胞中。供体DNA多核苷酸含有与基因组序列足够的同源性以支持供体DNA多核苷酸和同源基因组序列之间的同源重组(或同源性指导修复)。供体DNA多核苷酸和基因组基因座之间的约25，50，100，200，500，750，1,000，1,500，2,000个核苷酸或更多的序列同源性(或10和2,000个核苷酸或更多之间的任何整数值)将支持其间的同源重组。供体DNA多核苷酸序列的长度范围可以为10至5,000个核苷酸(或其间的核苷酸的任何整数值)或更长。供体DNA多核苷酸序列不需要与其替换的基因组序列相同。例如，供体DNA多核苷酸的序列相对于基因组序列可以含有一个或多个单碱基改变，插入，缺失，倒位或重排，只要存在与染色体序列的足够的同源性即可。或者，供体DNA多核苷酸序列可以含有由两个同源性区域侧翼的非同源序列。另外，供体DNA多核苷酸序列可以包含载体分子，载体分子含有不与细胞染色质中感兴趣的区域同源的序列。通常，供体DNA多核苷酸序列的同源区与期望重组的基因组基因座具有至少50％的序列同一性。在某些实施方案中，供体DNA多核苷酸序列在供体DNA多核苷酸和基因组基因座之间的25个或更多个，50个或更多个，100个或更多个，200个或更多个，300个或更多个，400个或更多个，500个或更多个，750个或更多个，1,000个或更多个，1500个或更多个，或2,000个或更多个具有序列同源性的核苷酸跨度里具有60％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或99.9％序列同一性。
供体DNA多核苷酸分子可以含有两个或更多个与细胞染色质同源的不连续区域。例如，为了靶向插入通常不存在于感兴趣的基因组区域中的转基因序列，这样的转基因序列的侧翼可以有与供体DNA多核苷酸中感兴趣的基因组区域具有同源性的区域。
在其它实施方案中，选定的基因组序列的靶向替换还需要通过非同源末端连接机制(NHEJ)在靶定的基因组基因座内引入替换或供体DNA多核苷酸序列。随后，供体链整合供体多核苷酸序列不需要用到同源臂。由于靶定的基因组基因座内双链断裂，供体多核苷酸序列整合在染色体内。NHEJ修复途径提供了在基因组内整合供体多核苷酸的另一种备选机制。参见WO2013169802，通过提及并入本文。
供体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以以线性或环状形式导入细胞中。如果以线性形式导入，那么可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，免于核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3'末端和/或将自身互补的寡核苷酸连接到一个或两个末端。参见，例如，Chang et al.,(1987)Proc.Natl Acad.Sd.USA 84:4959-4963；Nehls et al.,(1996)Science 272:886-889。用于保护外源多核苷酸免于降解的其它方法包括但不限于添加末端氨基基团和使用经修饰的核苷酸间连接，如例如硫代磷酸酯，氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
供体DNA多核苷酸可以以具有额外序列(如例如复制起点，启动子和编码抗生素抗性的基因)的载体分子的一部分的形式导入细胞中。此外，供体DNA多核苷酸可以作为裸核酸，以与诸如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)的试剂复合的核酸导入，或者可以通过细菌或病毒(例如土壤杆菌属物种，根瘤菌属物种NGR234，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboiummeliloti)，百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobiumloti)，烟草花叶病毒，马铃薯病毒X，花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒递送。参见例如Chung et al.(2006)Trends Plant Sd.11(1):1-4)。在另外的实施方案中，可以通过如本文中描述的微粒轰击转化方法将供体DNA多核苷酸导入细胞中(例如，在雄激素愈伤组织中)。
申请人的方法可以将工程化ZFP的强大的靶向能力与切割域(或切割半域)结合，以将双链断裂特异性地靶向到基因组中期望插入外源序列的区域。尽管对申请人的方法而言并非必需，但似乎在细胞序列中双链断裂的存在，连同与邻近或围绕断裂的区域具有同源性的外源DNA分子的存在，可激活修复断裂的细胞机制；所述细胞基质通过将序列信息从供体分子转移到细胞(例如，基因组或染色体)序列中，即通过同源性指导的修复(又称“基因转换”)的过程，修复断裂。
为了改变染色体序列，不必复制供体的整个序列到染色体中，只要足够的供体序列被复制以实现期望的序列改变即可。
通过同源重组插入供体序列的效率与细胞DNA中双链断裂和期望重组的位点之间的距离成反比。当双链断裂更接近需要重组的位点时，通常观察到更高的同源重组效率。在不需要精确的重组位点的情况下(例如，期望的重组事件可以一段基因组序列内发生)，可以选择供体核酸的长度和序列以及切割位点以获得期望的重组事件。在期望的事件被设计为改变基因组序列中单个核苷酸的序列的情况下，在该核苷酸的任一侧的10,000个核苷酸内切割细胞染色质。例如，切割可发生在该核苷酸任一侧的2到1,000个核苷酸之间的任何整数值内。在某些例子中，在基因组序列中改变的核苷酸的任一侧的1,000，500，200，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，或2个核苷酸内发生切割。
如上文详述的，两个分别包含锌指结合域和切割半域的融合蛋白的结合位点可以相距5-8或15-18个核苷酸，自每个结合位点的最接近另一个结合位点的边缘处测量，切割在结合位点之间发生。是否在结合位点之间的单个位点或在多个位点发生切割是无关紧要的，因为切割的基因组序列会被供体序列替代。因此，为了通过靶向重组高效地改变单个核苷酸对的序列，结合位点之间的区域的中点在距该核苷酸对的10,000个核苷酸内，优选在1,000个核苷酸，或500个核苷酸，或200个核苷酸，或100核苷酸，或50个核苷酸，或20个核苷酸，或10个核苷酸，或5个核苷酸，或2个核苷酸，或1个核苷酸内，或在感兴趣的核苷酸对处。
在某些实施方案中，同源染色体可以充当供体DNA多核苷酸。因此，例如，杂合子中的突变的校正可以通过工程化改造融合蛋白来实现，所述融合蛋白结合并切割一条染色体上的突变体序列，但不切割同源染色体上的野生型序列。带有突变的染色体上的双链断裂刺激基于同源性的“基因转换”过程，其中来自同源染色体的野生型序列被复制到切割的染色体中，从而恢复野生型序列的两个拷贝。
还提供了可以增强靶向重组水平的方法和组合物，包括但不限于使用另外的ZFP功能性域融合物来激活参与同源重组的基因的表达，如例如，RAD52上位性组的成员(例如，Rad50，Rad51，Rad51B，RadSIC，RadSID，Rad52，Rad54，Rad54B，Mrell，XRCC2，XRCC3)，其产物与上述基因产物相互作用的基因(例如BRCA1，BRCA2)和/或在NBS1复合物中的基因。参见，例如Boyko et al.(2006)Plant Physiology 141:488-497和LaFarge et al.(2003)Nucleic Acids Res 31(4):1148—1155。类似地，可以使用与本文中公开的方法和组合物组合的ZFP功能域融合抑制参与非同源末端连接的基因的表达(例如，Ku70/80，XRCC4，聚(ADP核糖)聚合酶，DNA连接酶4)。参见，例如，Riha et al.(2002)EMBO 21:2819-2826；Freisner et al.(2003)Plant J.34:427-440；Chen et al.(1994)European Journal ofBiochemistry 224:135-142。使用锌指结合域和功能域之间的融合来激活和抑制基因表达的方法公开于例如，与本申请具有共同拥有者的美国专利6,534,261；6,824,978和6,933,113中。另外的抑制方法包括使用靶向待抑制的基因序列的反义寡核苷酸和/或小干扰RNA(siRNA或RNAi)。
检测测定法
在某些实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括确认基因组DNA的修饰，如靶玉米基因组的切割、供体DNA多核苷酸在靶玉米基因组内的整合、或掺入靶玉米基因组内的突变。在某些实施方案中，确认基因组的此类修饰的方法包括通过基于PCR的测定法、Southern印迹测定法、Northern印迹测定法、蛋白质表达测定法、Western印迹测定法、ELISA测定法或下一代测序测定法来确认。
因此，可以以多种方式，包括使用序列的引物或探针，确认基因组中的基因组DNA的修饰，如基因组中的切割、整合的转基因或突变。在某些实施方案中，稳定整合的转基因可以基于转基因在植物的一些组织中或在某些发育阶段的组成性或选择性表达来检测，或者转基因可以基本上沿着其整个生命周期在基本上所有植物组织中表达。
可以通过任何合适的扩增方法实施靶向基因组修饰，整合的转基因或突变的确认。一般参见Kwoh et al.,Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。合适的扩增技术的例子包括但不限于聚合酶链式反应，连接酶链式反应，链置换扩增(一般参见G.Walker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396(1992)；G.Walker et al.,Nucleic Acids Res.20,1691-1696(1992))，基于转录的扩增(参见D.Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 86,1173-1177(1989))，自身持续性序列复制(或“3SR”)(参见J.Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878(1990))，Qβ复制酶系统(参见P.Lizardi et al.,BioTechnology 6,1197-1202(1988))，基于核酸序列的扩增(或“NASBA”)(参见R.Lewis,Genetic Engineering News 12(9),1(1992))，修复链反应(或“RCR”)(参见R.Lewis,见上文)，和飞镖DNA扩增(boomerang DNA amplification)(或“BDA”)(参见R.Lewis,见上文)。一般优选聚合酶链式反应。
“扩增”是核酸复制的一种特殊情形，涉及模板的特异性。它与非特异性模板复制(即，模板依赖性但不依赖于特定模板的复制)形成对比。模板特异性在这里区别于复制的保真性(即正确的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脱氧核糖)的特异性。模板特异性通常用“靶”特异性为度量来描述。
如本文中使用的，术语“聚合酶链式反应”和“PCR”通常是指在不克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中靶序列的区段的浓度的方法(美国专利号4,683,195；4,683,202；和4,965,188；通过提及并入本文)。用于扩增靶序列的此方法包括将过量的两种寡核苷酸引物引入含有期望的靶序列的DNA混合物，接着是在DNA聚合酶存在下的精确的热循环序列。这两个引物与它们各自的双链靶序列的链互补。为了实现扩增，使混合物变性，然后将引物退火至其在靶分子内的互补序列。退火后，用聚合酶延伸引物以形成新的互补链对。变性，引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复许多次(即，变性，退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)，以获得高浓度的期望的靶序列的扩增区段。期望的靶序列的扩增区段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此，此长度是可控参数。凭借方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(下文为“PCR”)。由于靶序列的期望的扩增区段变为混合物中的主要序列(就浓度而言)，它们被说成是“PCR扩增的”。
术语“逆转录酶”或“RT-PCR”是指一种类型的PCR，其中起始材料是mRNA。使用逆转录酶将起始mRNA酶促转化为互补DNA或“cDNA”。然后将cDNA用作“PCR”反应的“模板”。
在一个实施方案中，量化扩增反应。在其它实施方案中，使用标签概况(signatureprofile)定量扩增反应，其中标签概况从包括解链温度和荧光标记概况的组中选择。
本公开的实施方案的核酸分子或其区段可以用作PCR扩增的引物。在实施PCR扩增中，在引物和模板之间可以容许一定程度的错配。因此，示例性引物的突变，缺失和插入(特别是5’或3’末端的核苷酸的添加)落入本公开的范围内。可以通过普通技术人员已知的方法在给定引物中生成突变，插入和缺失。
已经描述了用于序列检测的分子信标。简言之，设计与侧翼基因组和插入DNA接合部重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有一种二级结构，该二级结构将荧光和淬灭部分保持得非常接近。在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中，一个引物在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构去除，而荧光和淬灭部分在空间上分离。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼基因组/转基因插入序列的存在。此类用于检测扩增反应的分子信标测定法是本公开的实施方案。
水解探针测定法，又称为(Life Technologies,Foster City,Calif.)，是一种检测和量化DNA序列存在的方法。简言之，设计FRET寡核苷酸探针，其中一个寡聚物在转基因内，并且一个在侧翼基因组序列中用于事件特异性检测。在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入的DNA序列中，一个引物在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的淬灭部分切割下来并释放出来。由于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。此类用于检测扩增反应的水解探针测定法是本公开的实施方案。
KASPar测定法是一种检测和定量DNA序列的存在的方法。简言之，使用称为测定系统的基于聚合酶链反应(PCR)的测定法筛选包含靶定基因组基因座的基因组DNA样品。在本公开的实践中使用的测定法可以利用含有多种引物的PCR测定混合物。在PCR测定混合物中使用的引物可以包含至少一个正向引物和至少一个反向引物。正向引物含有对应于供体DNA多核苷酸的特定区域的序列，并且反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。此外，PCR测定混合物中使用的引物可以包含至少一个正向引物和至少一个反向引物。例如，PCR测定混合物可以使用对应于两个不同等位基因的两个正向引物和一个反向引物。正向引物之一含有对应于内源基因组序列的特定区域的序列。第二正向引物包含对应于供体DNA多核苷酸的特定区域的序列。反向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。用于检测扩增反应的此类测定法是本公开的实施方案。
在一些实施方案中，荧光信号或荧光染料选自HEX荧光染料，FAM荧光染料，JOE荧光染料，TET荧光染料，Cy 3荧光染料，Cy 3.5荧光染料，Cy 5荧光染料，Cy 5.5荧光染料，Cy7荧光染料和ROX荧光染料。
在其它实施方案中，使用合适的第二荧光DNA染料运行扩增反应，所述第二荧光DNA染料能够以可被流式细胞术检测的浓度范围染色细胞DNA，并且具有可通过实时热循环仪检测的荧光发射谱。本领域普通技术人员应当理解，其它核酸染料是已知的并且不断被鉴定出来。可以采用任何具有合适的激发和发射谱的合适的核酸染料，如SYTOX SYBR Green和在一个实施方案中，第二荧光DNA染料是以小于10μM，小于4μM或小于2.7μM使用的
在进一步的实施方案中，可以利用下一代测序(NGS)确认基因组修饰。如Brautigma等人，2010所述，DNA序列分析可以用于测定分离和扩增的片段的核苷酸序列。可以分离扩增的片段并亚克隆到载体中，并使用链终止法(也称为Sanger测序)或染料终止剂测序来测序。此外，可以用下一代测序对扩增子进行测序。NGS技术不需要亚克隆步骤，并且可以在单个反应中完成多个测序读取。有三种NGS平台已商品化，来自454Life Sciences/Roche的Genome Sequencer FLX，来自Solexa的Illumina Genome Sequencer和AppliedBiosystems的SOLiD(首字母缩写词，代表：“寡聚物连接和检测测序(Sequencing by OligoLigation and Detection)”)。此外，目前正在开发两种单分子测序方法。这些包括来自Helicos Bioscience的真实单分子测序(tSMS)和来自Pacific Biosciences的单分子实时测序(SMRT)。
由454Life Sciences/Roche推出的Genome Sequencer FLX是长读段NGS，其使用乳液PCR和焦磷酸测序来生成测序读段。可以使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kbp片段的文库。反应每次运行可以生成超过100万个约250至400个碱基的读段，总产量为250至400兆碱基。与其它NGS技术相比，此技术生成的读段最长，但每次运行的总序列输出较低。
由Solexa推出的Illumina基因组分析仪是一种短读段NGS，其利用荧光染料标记的可逆终止剂核苷酸边合成边测序，并且以固相桥式PCR为基础。可以使用含有高达10kb的DNA片段的配对末端测序文库的构建。反应生成长度为35-76个碱基的超过1亿个短读段。此数据可以每次运行生成3-6千兆碱基。
由Applied Biosystems推出的寡聚物连接和检测测序(SOLiD)系统是一种短读段技术。此NGS技术使用长度最多可达10kbp的片段化双链DNA。该系统使用通过染料标记的寡核苷酸引物的连接和乳液PCR测序以生成10亿个短读段，其导致每次运行高达30千兆碱基的总序列输出。
Helicos Bioscience的tSMS和Pacific Biosciences的SMRT应用使用单个DNA分子进行序列反应的不同方法。tSMS Helicos系统生成高达8亿个短读段，每次运行导致21千兆碱基。这些反应使用荧光染料标记的虚拟终止剂核苷酸完成，其被描述为“边合成边测序”方法。
由Pacific Biosciences销售的SMRT下一代测序系统使用通过合成的实时测序。由于不受可逆终止剂限制，此技术可以生成长度高达1000bp的读段。使用此技术每天可以生成相当于二倍体人类基因组的一倍覆盖度的原始读取通量。
在另一个实施方案中，可以使用印迹法测定法完成基因组修饰的确认，包括Western印迹，Northern印迹和Southern印迹。此类印迹法测定法是用于生物样品的鉴定和量化的生物研究中常用的技术。这些测定法包括首先通过电泳手段分离凝胶中的样品组分，接着将电泳分离的组分从凝胶转移到转移膜，诸如用硝化纤维，聚偏二氟乙烯(PVDF)或尼龙的材料制成的转移膜。分析物也可以直接点样在这些支持物上，或通过施加真空，毛细管作用或压力而定向到支持物上的特定区域，而不需要在先分离。然后通常对转移膜进行转移后处理，以增强分析物彼此区分的能力，和通过检视或通过自动读取器检测的能力。
在进一步的实施方案中，可以使用ELISA测定法来完成基因组修饰的确认，所述ELISA测定法使用固相酶免疫测定法检测液体样品或湿样品中物质(通常是抗原)的存在。将来自样品的抗原附着于平板的表面。然后，将另外的特异性抗体施加在表面上，使得其可以结合所述抗原。此抗体是与酶连接的，并且在最后的步骤中，添加含有酶底物的物质。随后的反应生成可检测的信号，最常见的是底物中的颜色变化。
将转基因渐渗入后代植物中
本公开提供了用于将包含转基因的供体多核苷酸从雄性愈伤组织来源的双单倍体植物渐渗入后代植物中的方法。本文中描述了双单倍体植物的生成，包括就转基因而言为纯合的双单倍体植物。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
i)将雌性亲本植物与雄性亲本植物杂交，其中所述雄性亲本植物是双单倍体植物，并且其中所述雌性亲本植物是能育的亲本植物；
ii)从(a)的杂交收获后代种子；
iii)种植后代种子；并且
iv)种植所述后代种子，其中所述后代种子包含含有所述转基因的供体多核苷酸。
在该方法的某些实施方案中，雌性和雄性亲本植物是玉米植物。在进一步的实施方案中，雌性亲本植物是良种玉米植物。
此类生成后代种子的杂交可以使用常规植物育种技术完成。关于植物育种技术的讨论，参见Poehlman(1995)Breeding Field Crops.AVI Publication Co.,WestportConn,第4版。可以使用回交方法将基因导入植物中。关于这种技术和其它用于将性状引入植物中的植物育种方法的描述，可以参见参考文献，如Poehlman，见上文，和Plant Breeding Methodology,Neal Jensen编,John Wiley&Sons,Inc.(1988)。在典型的回交方案中，将感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的感兴趣的单个基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后，将此次杂交得到的后代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程，直到获得这样的植物：其中转化的植物不但获得了来自非轮回亲本的单一转移基因，还恢复了轮回亲本的基本上所有的期望形态和生理特征。
因此，本公开提供了使用根据本文中的方法生成的双单倍体植物制备玉米植物的方法，所述方法包括杂交。例如，本主题公开包括生成后代种子的方法，该方法使含有供体多核苷酸的双单倍体植物(根据本文中公开的方法制备)与遗传上不同的第二植物(例如近交亲本)杂交，收获所得的后代种子，并使用实时PCR等方法检测整合的供体多核苷酸以确定接合性。
可以如下育种玉米植物：(i)将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而生成多个第一后代植物，所述第一亲本玉米植物是从含有包含转基因的供体多核苷酸的株系的种子种植而来的；(ii)然后选择含有包含转基因的供体多核苷酸的第一后代植物；并(iii)使所述第一后代植物自交，由此生成多个第二后代植物；然后从所述第二后代植物中选择含有包含农艺学性状的供体多核苷酸的植物。这些步骤还可以包括(iv)将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交。
当将本公开的玉米植物与另一近交植物杂交以生成后代或杂种时，原始亲本可以在杂种中充当具有基本上相同特征的母本或父本植物。有时，母本遗传特征可能差异表达，取决于决定哪个亲本用作雌性。然而，往往亲本植物之一由于种子产率较高和优选的生产特性，如最佳种子大小和质量或除去雄穗的容易性等，而优选作为母本植物。一些植物生成更紧密的穗壳，导致更多的损失，例如由于腐烂，或者穗壳可能太紧以致须不能完全推出尖端，阻碍完全授粉，从而导致种子产率较低。在须形成中可能有延迟，这会不利地影响一对亲本近交系的繁殖周期的时机。在一个植物中种衣特征可能是优选的，这可能影响杂种种子产品的货架期。一个植物可能更好地脱落花粉，使得该植物成为优选的雄性亲本。
在一些实施方案中，将雌性亲本植物与雄性双单倍体亲本植物“杂交”的第一步包括种植第一玉米植物和不同的第二雌性近交玉米植物的种子，优选在可授粉的附近区域内种植。在一些实施方案中，可以使用手动传粉杂交雄性和雌性亲本。在其它实施方案中，用于杂交雄性和雌性亲本的手动传粉可以借助工具或通过机械手段来实施。在进一步的实施方案中，如下实施用于杂交雄性和雌性亲本的手动传粉：从雄性植物获得花粉并将花粉施用于雌性植物的柱头(通过花粉管)。
进一步的步骤包括培育或种植带有花的雌性亲本植物和雄性亲本植物的种子。如果亲本植物在性成熟的时间不同，那么可以用技术获得适当的时机，即，确保当指定为雌株的亲本玉米植物上的须可接受花粉时，指定为雄株的亲本玉米植物的花粉可用。可以用于获得期望的时机的方法包括延迟较快成熟的植物的开花，例如但不限于推迟较快成熟的种子的种植，切掉或烧掉较快成熟的植物的顶叶(而不杀死植物)或加速较慢成熟植物的开花，如通过用设计成加速萌发和生长的膜覆盖较慢成熟的植物，或通过切开幼穗芽(earshoot)的尖端以露出须。
在某些实施方案中，用种植者认为合适的一种或多种农用化学品处理雌性亲本植物和雄性亲本植物。
进一步的步骤包括从接收花粉的植物的穗收获接近成熟或处于成熟的种子。在一个具体的实施方案中，从雌性亲本植物收获种子，并且当期望时，可以种植收获的种子以生成后代或第一代(F1)杂种玉米植物。
又一个步骤包括将种子干燥和调理(conditioning)，包括种子的处理/分筛(或分级)，并包装以出售给种植者以用于生产谷物或草料。与近交种子一样，可以用组合物处理杂种种子，使得种子和从其生长的幼苗在暴露于不利条件时更加耐寒(hardy)。可以出售所得的后代或杂种种子给种植者用于生产谷物和草料，而不用于育种或种子生产。
仍进一步，本公开提供了通过种植在雌性亲本植物上生成并收获的种子所生成的后代玉米植物，以及由后代玉米植物生成的谷物。
在随后的实施方案中，本公开提供了将赋予期望的性状的供体多核苷酸导入后代植物中的方法。在实施方案的一个方面中，期望的性状选自下组：杀虫剂抗性性状，除草剂耐受性性状，疾病抗性性状，产量增加性状，营养质量性状，农艺增加性状、及其组合。期望的性状的其它例子包括改变的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2624(1992)。减少的肌醇六磷酸含量：(i)肌醇六磷酸酶编码基因的引入将增强肌醇六磷酸盐的分解，为转化的植物添加更多的游离磷酸盐。例如，关于黑曲霉肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开，参见Van Hartingsveldt et al.,Gene 127:87(1993)。(ii)可以引入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆并然后再导入与单个等位基因相关的DNA来实现，所述单个等位基因造成以低水平的肌醇六磷酸为特征的玉米突变体。参见Raboy et al.,Maydica 35:383(1990)。(iii)修饰的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉分支模式的酶的基因转化植物而实现。参见Shiroza et al.,J.Bacteriol.170:810(1988)(变异链球菌(Streptococcus mutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz et al.,Mol.Gen.Genet.200:220(1985)(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen et al.,Bio/Technology 10:292(1992)(表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物的生成)，Elliot et al.,Plant Molec.Biol.21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard et al.,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher et al.,Plant Physiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。潜在期望的特征的其它例子包括更大的产率，更好的茎，更好的根，缩短的作物成熟前时间，更好的农艺质量，更高的营养价值，更高的淀粉可提取性或淀粉发酵能力，对杀虫剂、除草剂、有害生物、热和干旱、和疾病的抗性和/或耐受性，以及萌发时间、建植(standestablishment)、生长速率、成熟度和籽粒大小的一致性。
可以使用包括实时PCR测定法的方法快速检测包含玉米种子的玉米作物或其后代以确定接合性，然后种植，所述玉米种子含有包含农艺学性状的供体多核苷酸。包括实时PCR测定法以确定接合性的方法可以改善此过程的效率。
本主题的包括实时PCR测定法以确定接合性的方法可用于例如玉米育种程序以及质量控制，特别是用于玉米种子的商业化生产。此方法也可以帮助产品注册和产品管理(stewardship)。可以使用此方法进行加速育种渐渗策略。本公开的检测技术尤其可用于与植物育种渐渗结合，以确定在含有事件的亲本植物与另一植物系杂交之后，哪些后代植物包含含有农艺学性状的供体多核苷酸，以试图将农艺学性性状赋予到后代中。包括实时PCR测定法以确定接合性的公开的方法有益于玉米育种渐渗程序以及质量控制，特别是商业化玉米种子。
本公开内容可以用于标志物辅助育种(MAB)方法。本公开可以与其它用于鉴定包含农艺性状的供体多核苷酸附近的遗传连锁标志物的方法(例如，AFLP标记，RFLP标志物，RAPD标志物，SNP和SSR)组合使用。包括实时PCR测定法以确定接合性的方法允许追踪在植物育种杂交的后代中包含农艺学性状的供体多核苷酸。本公开的包括实时PCR测定法以确定接合性的方法可以用于鉴定任何含有包含农艺学性状的供体多核苷酸的玉米品种。
应当理解，本文中所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，本领域技术人员参考这些实施例和实施方案能够作出各种修改或改变，这些修改或改变涵盖在本申请的精神和范围内，并落入所附权利要求书的范围。这些实施例不应被解释为限制性的。
实施例
实施例1：小孢子来源的单倍体愈伤组织的生成
当小孢子处于早期双核发育阶段(花药长约3mm，明亮，光泽黄色)时，从温室种植的玉米植物(约5-6周龄)收获玉米基因型139/39-05(美国专利号5,306,864)的萌前雄穗(Pre-emergent tassel)。将雄穗包裹在湿纸巾和铝箔中，并置于设定在8℃的培养箱中7-14天。在表面灭菌(在0.08％v/v ChloroxTM中15分钟，接着无菌水漂洗)后，将花药无菌分离，在6孔皿中在每孔6mL培养基中以60个花药的密度置于液体“花药培养基培养基”(N6盐和维生素，60g/L蔗糖，5g/L活性炭，500mg/L酪蛋白水解产物，0.1mg/L TIBA，调节至pH5.8)的表面上，并在28℃在黑暗中温育。将出现在14-28天之间的小孢子来源的胚样结构转移到“愈伤组织培养基”(MS盐和维生素，30g/L蔗糖，700mg/L L-脯氨酸，500mg/L MES，100mg/L酪蛋白水解产物，15mg/L硝酸银，3.3mg/L麦草畏和2.5g/L GelriteTM，调节至pH 5.8)。每14天将结节性、胚发生的愈伤组织传代培养至新鲜的“愈伤组织培养基”使之长大，之后进行倍性测定和转化。
前述提供了源自玉米小孢子的雄激素转化感受态单倍体组织的例子，其可以用于修饰单倍体玉米基因组的公开的方法。
实施例2：愈伤组织的倍性测定
为了测定细胞倍性水平，将1g实施例1中制备的愈伤组织转移至无菌PetriTM皿(Fisher Scientific，St.Louis，MO)。通过在1-2mL过滤的冰冷Gailbraith缓冲液(0.01MMgSO4，0.005M KCl，0.0005M HEPES，1mg/mL DTT)以及“MMG培养基”(4mM MES[pH 6.0]，0.6M甘露醇，15mM MgCl2)和0.25％Triton X-100TM存在下用单刃剃刀刀片切碎愈伤组织释放出核。用另外2mL缓冲液漂洗PetriTM皿，将其与初始核提取物合并以使最终浆液体积为约5mL。然后通过转移至玻璃组织匀浆器，柱塞上下泵动数次，温和均化粗制核提取物。然后，匀浆通过滤茶器过滤，40μm Steri-flipTM(Millipore；Billerica,Massachusetts,USA)吸出所得的滤液以分离核。使用10μL/200μL样品用碘化丙啶(Sigma-Aldrich；St.Louis,Missouri,USA)对分离的核染色并用Beckman QuantaTM流式细胞仪(Beckman-Coulter,Brea,CA,USA)分析。对于每个样品，收集至少50,000个核，并将75μL样品加到细胞计数器中以使用对数标度显示进行分析。流式细胞仪结果显示大的单倍体(G0/G1)峰和较小的二倍体(G2)二倍体峰。结果证实，根据实施例1制备的愈伤组织由适合用于修饰单倍体玉米基因组的公开的方法中的单倍体细胞组成。
实施例3：用于在从单倍体愈伤组织分离的原生质体中的靶向基因组修饰的构建体
对于靶向基因组修饰，使用锌指核酸酶(ZFN)构建体pDAB111879(描绘于图1中)。ZFN的表达由玉米ubi1启动子驱动，并用玉米per5 3’UTR终止。此表达盒含有“T2A”构造，该构造包含两个锌指单体域(zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1)，由单独一个编码区编码并表达。表达的转录物包含T2A停顿信号(stutter signal)(Mattion et al.,1996,J.Virol.,70:8124-7)以引入核糖体停顿，其在翻译过程中释放第一多肽，并且设计为在进一步翻译时生成等摩尔量的第一和第二多肽。在用于靶向核的两种ZF单体中包括opaque2核定位序列(NLS)。两个NLS-ZF域融合物中都拥有对表2中所示的玉米基因组的独特序列的结合特异性。锌指单体还包括FokI核酸酶功能域(Kim et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:1156-1160)，利用单子叶优选密码子表对其进行了密码子偏倚设置。
表2：由设计的锌指蛋白识别的玉米基因组中的锌指结合域和独特序列。
锌指蛋白单体 SEQ ID NO: 结合DNA序列5-3’
zmPPL_1360-r23a1 SEQ ID NO:1 ACTCCGTATGCGAAGGCA
zmPPL_1360-30a1 SEQ ID NO:2 TTCGCGGTGGGACACTTG
使用供体多核苷酸构建体pDAB111845(在图2中描绘)，利用ZFN构建体定点双链切割和随后的DNA修复，将DNA靶向整合到单倍体愈伤组织来源的原生质体中。该构建体含有两种ZF单体，zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1的DNA结合序列。另外，此构建体含有称为“UZI”的110bp序列，用于经由内/外PCR对靶向插入的下游分析，即引物位点设计。此质粒与pDAB111879(ZFN构建体)的共递送导致当ZFN表达时，在独特的基因组序列处和供体构建体pDAB118845内发生切割，促使供体构建体通过非同源末端连接DNA修复和重组而靶向整合到基因组切割位点中。
前文提供了可以用于本公开的修饰单倍体玉米基因组的方法中的构建体的例子：用于递送位点特异性锌指核酸酶的pDAB111879和用于靶向整合供体多核苷酸的pDAB111845。
实施例4：在从单倍体愈伤组织分离的原生质体中的靶向基因组修饰
将单倍体愈伤组织(约5克)转移到无菌PetriTM皿中，并添加5mL“MMG培养基”。使用单刃剃刀刀片将愈伤组织细碎成小块，直到获得奶油状浆液。使用无菌刮刀将浆液转移至无菌50mL锥形管(Fisher Scientific)和20mL“酶溶液”(溶解于“MMG培养基”中的3％CellulaseTM[Onozuka R10，Yakult Pharmaceuticals，Japan]，0.3％PectolyaseTM[MPBiomedicals,San Diego,CA])。将管用ParafilmTM包裹并置于Vari-MixTM平台摇床(ThermoScientific，Waltham，MA)上，并在24℃在黑暗中剧烈摇动约16-18小时。在无菌的50mL锥形管中，用100μm细胞过滤器(Falcon)缓慢过滤“酶溶液”。漂洗该细胞过滤器(具有细胞)，方法是移取10mL的“W5+培养基”(1.86mM MES[pH6.0],0.5mL 0.2M MES[pH6.0],192mM NaCl,6.7mL 1.54M NaCl,154mM CaCl2,8.3mL1M CaCl2,4.7mM KCl,1.25mL of 0.2M KCl和37mL水)，使之流过该100μm细胞过滤器。使用70μm细胞过滤器(Falcon)重复该步骤以捕获较小的碎片。然后使用40μm细胞过滤器(Falcon)过筛滤液，并再次用10mL“W5+培养基”漂洗，得到40mL的最终滤液体积。然后，温和倒转管，将8mL“重梯度溶液”(500mM蔗糖，1mM CaCl2和5mM MES[pH 6.0])缓慢添加到管中的原生质体/“酶溶液”/“W5+”混合物下的滤液。然后用转臂浮桶式转头(来自Eppendorf，Hauppauge，NY)以1500rpm离心该管10分钟。然后，使用10mL窄孔移液管尖端缓慢移出原生质体层(可见于“重梯度溶液”和“酶溶液”/“W5+培养基”之间)，并置于无菌的50mL锥形管中。然后，使用“W5+培养基”使管达到35mL的体积，缓慢倒转几次，并以1000rpm离心10分钟。然后，除去上清液而不干扰离心沉淀。然后，将含有原生质体的离心沉淀重悬于5mL“MMG培养基”中。首先将离心沉淀重悬于5mL“MMG培养基”中，然后在96孔板中添加30μL至270μL“MMG培养基”，使用Beckman QuantaTM流式细胞仪测定每mL原生质体的浓度。
对于转染，使用“MMG培养基”将原生质体稀释至每mL 167万个。将300μL的每个样品(约500,000个原生质体)转移到无菌的2mL管中。向每个管添加总共40μg的质粒DNA(36μg的pDAB111845[供体多核苷酸]+4μg的pDAB111879[编码ZFN的多核苷酸])，并通过翻转管缓慢混合，并在室温温育5分钟。将PEG4000TM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)缓慢添加(300μL)至原生质体/DNA混合物中，并温和倒转直至内容物完全混合。将管在室温下温育5分钟，偶尔温和倒转混合。温育后，缓慢添加1mL“W5+培养基”，将管温和倒转5-10次。然后，将管在微量离心机(Eppendorf)中以1500rpm离心5分钟。小心地除去上清液，确保不干扰离心沉淀。一旦除去上清液，每个管加1mL“WI培养基”(4mM MES[pH6.0]，1mL 0.2mM MES[pH6.0]，0.6M甘露醇，30mL 1M甘露醇，20mM KCl，5mL 0.2M KCl和14mL水)，并温和倒转以重悬离心沉淀。然后用铝箔覆盖管以避光，并且将它们侧放过夜温育，此后提取基因组DNA并分析靶向基因组修饰。
前文演示了本公开的方法用于在从小孢子来源的愈伤组织分离的原生质体中靶向修饰(例如位点特异性整合)单倍体玉米基因组的一个实例，所述原生质体用供体多核苷酸和编码锌指核酸酶(ZFN)的多核苷酸转化。
实施例5：具有靶向基因组修饰的单倍体原生质体的分子分析
使用不对称巢式内-外(in-out)PCR(ANIO)(美国临时申请号61/873719)检测从实施例4的转染原生质体提取的基因组DNA中的靶向基因组修饰。表3中显示用于检测的引物对。一对引物设计用于特异性结合基因组序列，另一对引物设计用于结合供体多核苷酸DNA序列。在初始变性后，使用EX-TAQ HSTMPCR试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.；MountainView,California,USA)，扩增程序包括：98℃12秒和66℃30秒，15个循环；然后72℃10分钟，最后保持在4℃。然后，将第一PCR产物用于巢式第二PCR反应。在第一PCR产物初始变性后，扩增程序包括：98℃12秒、66℃30秒、然后68℃1分钟，30个循环；然后72℃10分钟，最后保持在4℃。使用1％E-gelTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)通过凝胶电泳解析PCR产物。电泳的结果产生PCR产物的预期凝胶片段大小(700bp和1053bp，分别为5'和3'接合部)，指示靶向插入的存在。
由此，前文表明，本公开的方法导致了供体多核苷酸转基因在玉米单倍体基因组中的靶向插入。
表3：用于ANIO PCR反应的引物。
前文演示了本公开的方法于确认供体多核苷酸在玉米小孢子来源的单倍体组织的基因组中的靶向整合的一个实例。
实施例6：用于单倍体愈伤组织的靶向基因组修饰的构建体
为了对单倍体愈伤组织的靶向转基因整合，使用供体构建体pDAB118783，其含有一条约500bp的序列，该序列与在玉米基因组中的独特zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1识别序列的侧翼序列同源(图3)。这些序列被称为“同源臂”。此供体构建体还含有用于在含有吡氟氯禾灵(haloxyfop)的培养基上进行体外选择的aad-1表达盒。该aad-1基因表达受玉米ubi1启动子控制，并以玉米per5 3’UTR终止。作为该构建体与pDAB111879(ZFN构建体)的共递送的结果，独特基因组序列处的双链基因组DNA由于ZFN表达而被切割。“同源臂”提供同源性指导的修复的模板，从而将aad-1表达盒整合到基因组切割位点中。
前文演示了供体多核苷酸(pDAB118783)，其包含选择标志物转基因aad1，并且适合用于本文公开的通过将转基因靶向整合到单倍体基因组中来修饰单倍体玉米基因组的方法。
实施例7：在单倍体愈伤组织中的靶向基因组修饰
在轰击前三天，使用一次性解剖刀将单倍体愈伤组织切成约1-2mm的块，置于新鲜“愈伤组织培养基”的表面上并在28℃在黑暗中温育。在轰击之前约4小时，将愈伤组织块排列在含有“渗透培养基”(“愈伤组织培养基”中添加山梨糖醇和甘露醇各45.5g/L)的100x15mm PetriTM皿的中心的一个1cm直径的圆圈中，并在黑暗中在28℃温育。使用PDS-1000颗粒加速装置TM(BioRad；Hercules，California，USA)，在900psi和6cm飞行距离下，用总共0.5μgDNA(仅pDAB111879[ZFN]；或pDAB118783[供体]与pDAB111879[ZFN]的10:1组合)轰击愈伤组织，所述DNA用2.5μgCaCl2和0.1M亚精胺沉淀到150μg 0.6μ金的表面上。
前文演示了本公开的方法用于以ZFN和供体多核苷酸对小孢子来源的单倍体愈伤组织进行微粒轰击来靶向修饰单倍体玉米基因组的一个实例。
实施例8：具有靶向基因组修饰的单倍体愈伤组织的分子分析
将实施例7中仅用pDAB111879(ZFN)通过微粒轰击转化的愈伤组织样品冻干，使用Qiagen(Germantown，Maryland，USA)植物DNA提取试剂盒TM根据制造商的说明进行基因组DNA提取。将基因组DNA重悬浮于200μL水中，并通过(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)测定浓度。所有样品在0.8％琼脂糖E-gelsTM(Invitrogen)上电泳以估计DNA的完整性。将所有样品标准化(25ng/μL)用于PCR扩增，使用来自(SanDiego，CA)的系统对产生的扩增子测序。
对于制备性PCR，合并来自每个重复的5μL，对每个模板进行5个单独的小规模PCR反应，所述PCR反应使用24μL反应体系，其中有0.2μM适当的带条码的引物、Accuprime Pfx(Invitrogen)、和25ng模板基因组DNA。循环参数包括在95°(5分钟)初始变性，接着是35个循环的变性(95℃，15秒)、退火(55℃，30秒)、延伸(68℃，1分钟)；和最终延伸(72℃，7分钟)。将PCR产物合并在一起，使用Qiagen MinEluteTM凝胶提取/纯化试剂盒在4％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。测定凝胶纯化的扩增子的浓度，并且通过合并来自ZFN靶向的和对应的野生型对照的约200ng的带条码的扩增子来制备PCR扩增子样品(表4)。
表4：用于扩增基因组靶序列的引物。
进行测序并使用序列分析脚本进行分析。滤出低质量序列(质量评分截止<5的序列)，剩余的序列根据条码进行解析。然后，将条码目录与参照序列比对，并对插入和/或缺失进行打分。切割活性作为具有由易错NHEJ修复导致的插入和/或缺失的高质量序列的函数来检测。一组有代表性的改变的序列(SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:45)作为与基因组DNA靶序列(SEQ ID NO:32)的比对提供，以显示得到的缺失和添加(图4)。在表5中示出了频率的汇总。
表5：在经轰击的愈伤组织对对照愈伤组织中PPL1基因座处的插入-缺失(Indel)频率。
因此，上文表明，本公开的方法在玉米单倍体基因组的PPL1基因座处产生了靶向诱变。上文还演示了本公开的方法用于确认单倍体基因组的靶向诱变的例子。
实施例9：单倍体愈伤组织的染色体加倍、选择和植物再生
次日早晨将经过pDAB118783(供体)和pDAB111879(ZFN)共轰击的来自实施例7的愈伤组织转移到含有新鲜“愈伤组织培养基”的100x 25PetriTM皿中，放置在皿表面上的滤纸(Whatman#4)上，用1mL的0.025％秋水仙素溶液浸泡，并且在黑暗中在28℃温育。48小时后，使用100μ细胞过滤器(Falcon352360)，用4mL液体“愈伤组织培养基”漂洗经过秋水仙素处理的愈伤组织，在无菌滤纸上吸干，并转移至含有新鲜“愈伤组织培养基”的100x 20mmPetriTM皿。在黑暗中在28℃再过4天(轰击后8天)后，通过流式细胞仪确认愈伤组织的加倍单倍体性质，其结果示于图5中。然后，将愈伤组织转移至“选择培养基”(具有100μM吡氟氯禾灵TM的“愈伤组织培养基”)。
在“选择培养基”上14天后，将愈伤组织转移到新鲜的“选择培养基”，再过14天，并于28℃在低光中放置。在“选择培养基”上经过总共4周(自轰击起5周)后，将愈伤组织转移至含有“预再生培养基”(MS盐和维生素，45g/L蔗糖，350L-脯氨酸，250mg/L MES，100mg/L肌醇，2.5mg/L ABA，1mg/L BAP，0.5mg/L NAA，1mg/L硝酸银，2.5g/L GelriteTM，具有100μM的吡氟氯禾灵，调节至pH5.8)的100x 25mm PetriTM皿，并置于28℃的光照(50μM)中。7天后，将愈伤组织转移到含有“再生培养基”(MS盐和维生素，60g/L蔗糖，100mg/L肌醇，2.5g/LGelriteTM，对于pDAB118873+pDAB111879具有100μM吡氟氯禾灵TM]，调节到5.8)的PhytaTrayTMII(Sigma-Aldrich；St.Louis,Missouri,USA)，并在28℃置于光照(160μM)中。14-21天后，将芽转移至“芽伸长培养基”(MS盐，N6维生素，30g/L蔗糖，500mg/L MES，5.5g/L琼脂，具有100μM吡氟氯禾灵TM，调节至pH5.8)，和于28℃置于光照(190μM)。
将生根的植物移植到含有Pro-Mix BXTM(Premier Tech；Riviere-du-Loup,Canada)的10cm塑料盆中，并放置在具有16/8小时光周期和27/24℃温度的生长室(Conviron；Winnipeg,Canada)中。然后将植物移植到含有95％Pro-Mix BXTM和5％粘土/壤土土壤的混合物的5加仑盆中，并转移到具有由金属卤化物和高压钠灯提供的补充光照的温室中，光周期16/8小时，温度30/20℃。然后，让植物生长至成熟并自花授粉。
前文演示了本公开的方法用于从小孢子来源的单倍体愈伤组织再生加倍单倍体植物的一个实例，所述愈伤组织包含整合到其基因组中的靶向转基因。
实施例10：加倍单倍体转基因植物的分子分析
将实施例9的双单倍体植物的组织样品收集在96孔收集板中，并冻干2天。使用Genogrinder 2010TM(SPEX Sample Prep)和不锈钢珠进行组织浸软。在组织浸软后，使用BioSprint试剂盒TM(Qiagen；Germantown,Maryland,USA)根据制造商建议的方案以高通量形式分离基因组DNA。用Quant-IT Pico Green DNA测定试剂盒TM(Molecular Probes；Invitrogen，Carlsbad，California，USA)定量基因组DNA。使用Biomek NXPTM自动化液体处理器(Beckman Coulter；Pasadena,California,USA)将经定量的基因组DNA调整至2ng/μL以便进行水解探针测定法。
水解探针测定法利用实时PCR测定转基因拷贝数，实时PCR使用480系统(Roche Applied Science；Indianapolis,Indiana,USA)。使用Probe Design软件2.0为aad-1和内部参照基因转化酶(Genbank登录号：U16123.1)设计了测定法。为了扩增，以1X终浓度制备480探针主混合物(Roche AppliedScience)，多重反应体积10μL，含有0.4μM的每种引物和0.2μM的每种探针(表6)。对于aad-1/转化酶进行两步扩增反应，在60℃延伸40秒，采集荧光。实时PCR数据的分析基于ΔΔCt方法，使用软件版本1.5，使用相对定量模块。为此，每次运行中包括来自单拷贝校准品的gDNA样品和已知的2拷贝核对品。
表6：用于aad-1和内部参照(转化酶)的水解探针测定法的引物和探针信息。
引物名称 SEQ ID NO: 序列 检测
GAAD1F SEQ ID NO:15 5’TGTTCGGTTCCCTCTACCAA 3’ ---
GAAD1R SEQ ID NO:16 5’CAACATCCATCACCTTGACTGA 3’ ---
GAAD1P SEQ ID NO:17 5’FAM-CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA 3’ FAM
IVF-Taq SEQ ID NO:18 5’TGGCGGACGACGACTTGT 3’ ---
INR-Taq SEQ ID NO:19 5’AAAGTTTGGAGGCTGCCGT 3’ ---
IV-Probe SEQ ID NO:20 5’HEX-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC 3’ HEX
使用个别的“内-外”PCR反应检测具有靶向转基因插入的事件。表7中显示了用于检测的引物对(一个对侧翼基因组序列特异性，另一个对供体构建体特异性)。初始变性后，扩增程序包括：94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟，35个循环；然后72℃10分钟，之后最后保持在4℃。PCR反应使用EX-TAQ PCR试剂盒TM(Clontech Laboratories，Inc)。使用1％琼脂糖凝胶解析和鉴定PCR产物。
表7：用于内-外PCR反应的引物。
引物名称 SEQ ID NO: 序列
MAS863 SEQ ID NO:21 5’AAGCGGTGCGTTGGTATTAG 3’
MAS872 SEQ ID NO:22 5’GCGTTTAACAGGCTGGC 3’
MAS873 SEQ ID NO:23 5’CGATGCTCACCCTGTTGTTTG 3’
MAS864 SEQ ID NO:24 5’TCGCATACGACGGGCAT 3’
通过水解探针测定法测定切割位点的ZFN介导的破坏，使用480系统(Roche Applied Science)进行实时PCR。测定法的设计使得引物和探针与位于ZFN结合位点及内部参照转化酶的侧翼的序列退火。为了扩增，在10μL体积多重反应中以1X终浓度制备480探针主混合物，所述多重反应含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表8)。进行两步扩增反应，在60℃延伸30秒，采集荧光。实时PCR数据的分析使用软件版本1.5，使用相对定量模块，比较靶标参照比(target toreference ratio)。在每次运行中包括来自非转基因对照植物的基因组DNA的样品。
表8：用于基因组基因座破坏的水解探针测定法的引物和探针信息。
对于通过“内-外”PCR和基因座破坏qPCR测定法确定的含有靶向aad-1构建体的T0双倍单倍体玉米植物，选用于进行Sothern印迹分析。如先前描述进行Southern印迹和探查。然后，用HindIII(New England BioLabs,Ipswich,MA)在37℃消化样品过夜。使用表9中显示的引物产生探针，这些引物结合“同源臂”外部的基因组序列。所得的Southern印迹确认了转基因事件含有靶向aad-1构建体的全长拷贝。
表9：用于生成探针以进行Southern印迹分析的引物。
引物名称 SEQ ID NO: 序列
MAS864 SEQ ID NO:30 5’TCGCATACGACGGGCAT 3’
MAS865 SEQ ID NO:31 5’TGGCAGCCGGTGCGA 3’
前文演示了本公开的方法用于确认加倍单倍体植物(从小孢子来源的单倍体愈伤组织再生的)展现靶向转基因整合的几个例子。
序列表
<110> 美国陶氏益农公司
J·F·佩达利诺
T·F·斯特兰奇
J·P·塞缪尔
R·C·布卢
M·A·辛普森.
<120> 单倍体玉米转化
<130> 75428
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZFP单体
<400> 1
actccgtatg cgaaggca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZFP单体
<400> 2
ttcgcggtgg gacacttg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cgccacaaat ctgaaccagc a 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ccacgatcga cattgatctg gcta 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ccagcataca gttagggccc a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gttgccttgg taggtccagc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gcgacatatc aggccaacag g 21
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gggatatgtg tcctaccgta tcagg 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
cgaaaactca gcatgcggga a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gagccatcag tccaacactg c 21
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
tacgtatggc actaatctca ccggct 26
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
tacgtaagtc ttagaagtac gctaccgt 28
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
acgtactggc actaatctca ccggct 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
acgtacagtc ttagaagtac gctaccgt 28
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tgttcggttc cctctaccaa 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
caacatccat caccttgact ga 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tggcggacga cgacttgt 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
aaagtttgga ggctgccgt 19
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
aagcggtgcg ttggtattag 20
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gcgtttaaca ggctggc 17
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
cgatgctcac cctgttgttt g 21
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
tcgcatacga cgggcat 17
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ataagacatc gagctagtgt aagcgtaggc 30
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
tcacaactgt ttaggcgtgt cctcttaa 28
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
aaagctgcag ctgcctgttc cctgtac 27
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
caaataagac atcgagctag tgtaag 26
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ctgtttaggc gtgtcctctt 20
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tcgcatacga cgggcat 17
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
tggcagccgg tgcga 15
<210> 32
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Genomic DNA recognition target sequence
<400> 32
gctacgtgcc ttcgcatacg gagtagttta ttcgcggtgg gacacttgat agaaaggcta 60
cggtagcgta cttcta 76
<210> 33
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 33
ctacgtgcct tcgcatacgg agtttcgcgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 34
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 34
ctacgtgcct tcgcatacgg agtttcgtgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 35
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 35
ctacgtgcct tcgcatacgg agtattcgcg gtgggacact tgatagaaag gctacggtag 60
cgtacttca 69
<210> 36
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 36
tacgtgcctt cgcatacgga gtaggcgcgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 37
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 37
tacgtgcctt cgcatacgga gtattcgcgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 38
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 38
tacgtgcctt cgcatacgga gtcattcgcg gtgggacact tgatagaaag gctacggtag 60
cgtacttct 69
<210> 39
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 39
tacgtgcctt cgcatacgga gtttcgcggt gggacacttg atagaaaggc tacggtagcg 60
tacttcta 68
<210> 40
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 40
tacgtgcctt cgcatacgga gtcattcgcg gtgggacact tgatagaaag gctacggtag 60
cgtactcta 69
<210> 41
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 41
acgtgccttc gcatacggag tcattcgcgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 42
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 42
acgtgccttc gcatacggag taggcgcggt gggacacttg atagaaaggc tacggtagcg 60
tacttcta 68
<210> 43
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 43
acgtgccttc gcatacggag tattcgcggt gggacacttg atagaaaggc tacggtagcg 60
tacttcta 68
<210> 44
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 44
cgtgccttcg catacggagt agtttcgcgg tgggacactt gatagaaagg ctacggtagc 60
gtacttcta 69
<210> 45
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶位点处的ZFN切割所致的插入缺失
<400> 45
cgtgccttcg catacggagt aggcgcggtg ggacacttga tagaaaggct acggtagcgt 60
acttcta 67

Claims (22)

1.一种用于修饰玉米基因组的方法，所述方法包括：
(a)提供包含单倍体组织基因组的玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织；
(b)将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且
(c)确认所述单倍体组织基因组被编码的位点特异性核酸酶所修饰。
2.权利要求1的方法，其中所述转化感受态单倍体组织是胚或愈伤组织。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括通过植物转化方法将编码所述位点特异性核酸酶多核苷酸的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织，所述植物转化方法选自下组：微粒轰击转化法、土壤杆菌转化法、磷酸钙转化法、聚凝胺转化法、电穿孔转化法、超声转化法、脂质体转化法、显微注射转化法、裸DNA转化法、质粒载体转化法、病毒载体转化法、碳化硅介导的转化法、气溶胶射束转化法和PEG转化法。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述位点特异性核酸酶多核苷酸编码选自下组的核酸酶：锌指核酸酶、TALEN核酸酶、大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法进一步包括
(b)递送供体多核苷酸，并将所述供体多核苷酸稳定整合在修饰的单倍体组织基因组中。
6.权利要求5的方法，其中所述供体多核苷酸包含一个或两个域，并且每个域与所述单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域中的序列至少85％相同。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态组织来自具有良种性能特征的玉米。
8.权利要求7的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态组织来自良种玉米系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的杂种玉米。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法包括通过实施基于PCR的测定法、Southern印迹测定法、Northern印迹测定法、蛋白质表达测定法、Western印迹测定法、ELISA测定法、或下一代测序测定法来确认所述单倍体组织基因组被修饰。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法还包括：
(d)用染色体加倍剂处理所述包含修饰的单倍体组织基因组的单倍体组织；
(e)生成包含修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米组织；并且
(f)将所述双单倍体玉米组织再生为包含纯合的修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米植物。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态单倍体组织是通过包括：
(i)从玉米收获含有小孢子的雄穗；
(ii)在约4-12℃的温度温育所述雄穗；
(iii)从所述雄穗分离含有小孢子的花药；
(iv)在花药培养基中培养花药以生成小孢子来源的胚；并且
(v)在愈伤组织培养基中培养所述小孢子来源的胚，从而生成小孢子来源的转化感受态单倍体组织
的方法生成的。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法包括
(b’)递送供体多核苷酸，并将所述供体多核苷酸稳定整合在所述修饰的单倍体组织基因组中，
(b”)将所述供体多核苷酸稳定整合到所述单倍体组织基因组的靶区域中；并且
(c)确认所述供体多核苷酸整合到了所述单倍体组织基因组的靶区域中。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述整合的供体多核苷酸在所述玉米单倍体组织内表达。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述整合的供体多核苷酸赋予农艺性状。
15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述方法还包括
(b)表达所述位点特异性核酸酶并向玉米的单倍体基因组中引入突变，并且
(c)确认所述单倍体玉米基因组包含突变。
16.从包含权利要求1-15中任一项的修饰的单倍体组织基因组的组织再生的玉米植物。
17.从权利要求1-16中任一项的修饰的双单倍体组织基因组再生的玉米植物，其中所述再生的植物包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的基因组修饰。
18.从权利要求10的修饰的双单倍体组织基因组再生的双单倍体玉米植物，其中所述再生的植物包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰。
19.一种生成玉米后代植物的方法，所述玉米后代植物包含由编码的位点特异性核酸酶引入的修饰
(a)将权利要求17的玉米植物与不同亲本玉米系的植物杂交以生成F1后代植物；
(b)选择一个或多个具有由所述编码的位点特异性核酸酶引入的基因组修饰的F1后代植物，以生成一个或多个包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰的玉米后代植物；并且
(c)任选地，(i)将F1后代植物与权利要求18的玉米植物或不同亲本玉米系回交以生成回交后代植物，(ii)选择包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的基因组修饰的回交后代植物，并且(iii)进一步任选地重复步骤(i)和(ii)以生成一个或多个玉米后代植物，所述玉米后代植物包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的所述修饰。
20.一种生成包含由编码的位点特异性核酸酶引入的修饰的玉米后代植物的方法，
(a)将权利要求18的玉米植物与不同亲本玉米系的植物杂交，以生成F1后代植物；
(b)选择一个或多个具有由所述编码的位点特异性核酸酶引入的基因组修饰的F1后代植物，以生成一个或多个包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰的玉米后代植物；并且
(c)任选地，(i)将F1后代植物与权利要求18的玉米植物或不同的亲本玉米系回交以生成回交后代植物，(ii)选择包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的基因组修饰的回交后代植物，并且(iii)进一步任选地重复步骤(i)和(ii)以生成一个或多个包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰的玉米后代植物。
21.来自根据权利要求19的方法生成的玉米后代植物的谷粒，所述玉米后代植物包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰。
22.来自根据权利要求20的方法生成的玉米后代植物的谷粒，所述玉米后代植物包含由所述编码的位点特异性核酸酶引入的修饰。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107034233A (zh) * 2017-05-18 2017-08-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法
CN111471788A (zh) * 2020-04-15 2020-07-31 中国农业科学院作物科学研究所 转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用
CN112512310A (zh) * 2018-06-07 2021-03-16 韩国生命工学研究院 用于无糖基化抗体产生的转基因小鼠和由此产生的无糖基化抗体的用途
CN113544290A (zh) * 2018-12-21 2021-10-22 先正达参股股份有限公司 同时基因编辑和单倍体诱导
CN115067208A (zh) * 2022-07-21 2022-09-20 北京市农林科学院 一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN107920486B (zh) 2015-06-30 2023-06-20 明尼苏达大学董事会 用于加速基因组编辑的单倍体诱导系
EP3365357B1 (en) 2015-10-23 2024-02-14 President and Fellows of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
AU2017306676B2 (en) 2016-08-03 2024-02-22 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CN117604023A (zh) 2016-08-17 2024-02-27 孟山都技术公司 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
EP4256951A3 (en) * 2016-11-04 2023-12-06 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
WO2018102816A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Syngenta Participations Ag Simultaneous gene editing and haploid induction
US10519456B2 (en) 2016-12-02 2019-12-31 Syngenta Participations Ag Simultaneous gene editing and haploid induction
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
SG11201906795SA (en) * 2017-01-28 2019-08-27 Inari Agriculture Inc Novel plant cells, plants, and seeds
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN107083395A (zh) * 2017-04-11 2017-08-22 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 提高小麦幼胚基因枪瞬时转化效率的方法和培养基配方
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11603536B2 (en) 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11802288B1 (en) 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
WO2019161151A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
WO2019234129A1 (en) * 2018-06-05 2019-12-12 KWS SAAT SE & Co. KGaA Haploid induction with modified dna-repair
WO2019234132A1 (en) * 2018-06-05 2019-12-12 KWS SAAT SE & Co. KGaA Base editing in polymerase theta deficient plants
JP2022526908A (ja) 2019-03-19 2022-05-27 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
AU2021267940A1 (en) 2020-05-08 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
CN116267583A (zh) * 2023-03-15 2023-06-23 北京市农林科学院 一种玉米优异性状精准导入与鉴定方法
CN116602212B (zh) * 2023-06-06 2024-05-03 北京市农林科学院 芍药属植物离体培养和增殖方法及专用培养基

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602310A (en) * 1988-12-02 1997-02-11 Petolino; Joseph F. Increasing the anther culturability of maize
US20020023278A1 (en) * 2000-05-08 2002-02-21 Lyznik Leszek Alexander Genetic transformation in plants using site-specific recombination and wide hybridization
CN101356276A (zh) * 2005-11-10 2009-01-28 先锋高级育种国际公司 芸苔属植物的微弹轰击转化法
CN101849010A (zh) * 2007-06-29 2010-09-29 先锋高级育种国际公司 用于改变单子叶植物细胞的基因组的方法
US20130198893A1 (en) * 2001-04-20 2013-08-01 Pioneer Hi Bred International Inc Methods of transforming plants

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8796508B2 (en) * 2005-11-10 2014-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Microprojectile bombardment transformation of Brassica
AP3195A (en) * 2007-06-11 2015-03-31 Bayer Cropscience Nv Insect resistant cotton plants and methods for identifying same
US20110203012A1 (en) * 2010-01-21 2011-08-18 Dotson Stanton B Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding
EP2612918A1 (en) * 2012-01-06 2013-07-10 BASF Plant Science Company GmbH In planta recombination
RU2650819C2 (ru) * 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602310A (en) * 1988-12-02 1997-02-11 Petolino; Joseph F. Increasing the anther culturability of maize
US20020023278A1 (en) * 2000-05-08 2002-02-21 Lyznik Leszek Alexander Genetic transformation in plants using site-specific recombination and wide hybridization
US20130198893A1 (en) * 2001-04-20 2013-08-01 Pioneer Hi Bred International Inc Methods of transforming plants
CN101356276A (zh) * 2005-11-10 2009-01-28 先锋高级育种国际公司 芸苔属植物的微弹轰击转化法
CN101849010A (zh) * 2007-06-29 2010-09-29 先锋高级育种国际公司 用于改变单子叶植物细胞的基因组的方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUDES FRANCOIS ET AL.: "Engineering the haploid genome of microspores", 《BIOCATALYSIS AND AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY》 *
GUANGYUAN HE ET AL.: "An improved system to establish highly embryogenic haploid cell and protoplast cultures from pollen calluses of maize (Zea mays L.)", 《PLANT CELL》 *
JUAN M.VEGA ET AL.: "Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors", 《PLANT MOLECULAR BIOLOGY》 *
K. SUKHAPINDA ET AL.: "Transformation of maize (Zea mays L.) protoplasts and regeneration of haploid transgenic plants", 《PLANT CELL REPORTS》 *
KABIN XIE ET AL.: "RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPR-Cas System", 《MOLECULAR PLANT》 *
KHAOULA BELHAJ ET AL.: "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system", 《PLANT METHODS》 *
KUNLING CHEN ET AL.: "Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements", 《PLANT CELL REPORTS》 *
YONG ZHANG ET AL.: "Transcription Activator-Like Effector Nucleases Enable Efficient Plant Genome Engineering", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
蒋武生等: "玉米单倍体胚诱导与基因枪转化研究", 《全国作物细胞工程与分子技术育种学术研讨会论文集》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107034233A (zh) * 2017-05-18 2017-08-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法
CN112512310A (zh) * 2018-06-07 2021-03-16 韩国生命工学研究院 用于无糖基化抗体产生的转基因小鼠和由此产生的无糖基化抗体的用途
CN113544290A (zh) * 2018-12-21 2021-10-22 先正达参股股份有限公司 同时基因编辑和单倍体诱导
CN111471788A (zh) * 2020-04-15 2020-07-31 中国农业科学院作物科学研究所 转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用
CN115067208A (zh) * 2022-07-21 2022-09-20 北京市农林科学院 一种利用赤霉素提高玉米单倍体加倍效率的方法

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