CN101356276A

CN101356276A - 芸苔属植物的微弹轰击转化法

Info

Publication number: CN101356276A
Application number: CNA2005800524896A
Authority: CN
Inventors: 陈文品; L·图尔西拉姆
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2005-11-10
Filing date: 2005-11-10
Publication date: 2009-01-28
Also published as: AU2005338055A1; CA2629284C; AU2005338055B2; CA2629284A1; EA200801303A1; WO2007055687A1; EP1945774A1

Abstract

本发明涉及植物、特别芸苔属植物的基因操作。本发明提供产生转基因芸苔属植物的方法，该方法包括通过微弹轰击将DNA构建体导入预孵育小孢子、小孢子衍生胚和小孢子衍生下胚轴内。该方法通过掺入所需农艺性状而应用于芸苔属植物的农业品种改良的开发。

Description

芸苔属植物的微弹轰击转化法

发明领域

本发明领域涉及植物的遗传工程，具体地说，涉及芸苔属(Brassica)植物的遗传转化方法。

发明背景

芸苔属各品种均可用作植物油、动物饲料、蔬菜和调味料的来源。用作蔬菜生产的芸苔属植物包括卷心菜、花椰菜、青花椰菜、羽衣甘蓝、球茎甘蓝、雪里蕻和芜菁甘蓝。白芥(B.hirta)的种子被用来生产颇受欢迎的美国调味品黄芥末酱。然而，在全球性基础上，芸苔属品种最重要的经济用途是由种子获得的植物油产品。种植用于油品生产的主要芸苔属品种是甘兰型油菜(B.napus，亦称欧洲油菜)，其次是芥菜型油菜(B.juncea，亦称芥菜)和白菜型油菜(B.rapa，亦称芜青)。甘兰型油菜、芥菜型油菜和白菜型油菜的种子都被称为油菜籽。所种植的主要用于油品生产的芸苔属品种常被称为含油种子油菜。在北美，一直被用来筛选种子中低水平的芥子酸和芥子油苷的一类含油种子油菜-双低油菜(canola，亦称甘兰型油菜)，是为了生产人类消费用植物油品而种植的主要芸苔属植物。虽然低芥子酸油菜籽油，例如甘兰型油菜油，可能有利于人类消费，但是高芥子酸油菜籽油也是多种工业应用所需要的，包括用于化妆品、润滑剂、增塑剂和表面活性剂的生产。

因为芸苔属植物在农业和工业上的重要性，所以植物育种人员正致力于开发农艺性状改良的新品种。虽然传统育种方法十分重要，但是最近通过遗传转化方法，在栽培芸苔属品种中，将重组DNA导入芸苔属基因组的研究取得了重大进展。许多经遗传修饰的芸苔属品种已经种植在北美农场主的田间。经遗传修饰而具有除草剂抗性的转基因甘兰型油菜品种，迅速获得横贯美国和加拿大甘兰型油菜种植区农业生产者的青睐。转基因甘兰型油菜品种在北美取得的重大成功加速了新的甘兰型油菜转基因品种的开发。对于甘兰型油菜和其它芸苔属品种，正在开发基于重组DNA的掺入新性状的新策略，所述新性状例如抗病、抗虫、改良种子油组成和改良种子蛋白质组成。所有这些策略都依赖于将重组DNA导入芸苔属植物基因组的遗传转化方法。

最近，芸苔属品种最有利的转化方法包括利用土壤杆菌。虽然基于土壤杆菌的转化方法为将外源DNA导入植物提供了可靠的方法，但是涉及利用土壤杆菌的植物转化法存在许多缺点。首先，所有基于土壤杆菌的方法不理想的结果是将至少一个T-DNA边界序列(T-DNAborder)导入受体植物基因组。虽然T-DNA边界序列是土壤杆菌将DNA转移到植物细胞遗传机制的必不可少的元件，但是T-DNA边界序列却不是外源基因在受体植物中表达所必需的。另外，整个植物基因组中多个T-DNA边界序列的累积可能对植物或其子代产生有害作用。其次，植物组织与土壤杆菌共培养可能减缓从转化细胞再生出转化植物。共培养期后，必需从植物组织培养物中清除土壤杆菌。必须将高水平的杀细菌剂应用到植物培养物中以杀死土壤杆菌。虽然培养物中所用的杀细菌剂水平一般对植物组织不是致死的，但是培养物中存在的杀细菌剂可能对植物生长产生负面影响，因此减缓转化植物的再生。第三，在DNA转移到植物中之前，土壤杆菌中可能发生天然的遗传过程，例如遗传重组和DNA重排，这可能对转移到植物中的DNA片段产生不良作用。这种不良作用可能改变或清除已导入DNA片段的既定遗传功能。

有效但不涉及利用土壤杆菌的芸苔属转化方法是十分需要的。US6,051,756、US 6,495,741、US 2003/0093840和US 2004/0045056记载了用粒子轰击对幼苗下胚轴的转化。US 6,297,056记载了子叶柄的转化。US 6,515,206和US 2003/0200568记载了真叶中质体转化的用途。Chen和Beversdorf(Theor.Appl.Genet.88：187-192(1994))描述了涉及DNA吸涨的小孢子衍生下胚轴的生物射弹转化方法(biolistictransformation procedure)。Fukuoka等(Plant Cell Reports 17：323-328(1998))描述了新生小孢子的生物射弹转化。最后，Nehlin等(PlantPhysiol.第156卷：175-183(2000))描述了预孵育小孢子的瞬时生物射弹转化，但是没有报道稳定的转基因植物。

为了满足当今全球对农业日趋增加的需求，必须加快开发甘兰型油菜和其它芸苔属品种的转基因新品种的步伐。加快芸苔属品种的开发步伐取决于有效可靠的转化方法以及转化的芸苔属植物有效可靠的再生方法。

发明概述

本发明提供产生转基因芸苔属植物的方法。该方法包括通过微弹轰击(microprojectile bombardment)导入DNA构建体。所导入的DNA构建体可编码蛋白质或者可抑制内源基因。所述方法通过掺入所需农艺性状而应用于农业、特别是芸苔属植物改良品种的开发中。该方法包括通过微弹轰击将DNA构建体导入能够再生出稳定转化的芸苔属植物的芸苔属细胞中，并且由该细胞再生出这样的芸苔属植物。

本发明一方面提供通过粒子轰击产生转化的芸苔属细胞的方法，该方法包括：(a)在轰击前，将含有细胞的预孵育小孢子衍生的外植体在质壁分离条件下培养约0.5小时至约4小时；(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入预孵育小孢子衍生的外植体表面上暴露的细胞内，其中外植体处于质壁分离的条件下；和(c)将经过轰击的预孵育小孢子衍生的外植体在质壁分离的条件下继续培养约4小时至约20小时，以产生转化的芸苔属细胞。预孵育小孢子衍生的外植体是在轰击前已培养了介于1天和30天之间的小孢子或由小孢子衍生的任何组织(例如小孢子衍生的胚或小孢子衍生的下胚轴)。质壁分离条件可选自：(a)在渗透培养基(osmotic medium)上培养外植体，和(b)在湿滤纸上培养外植体。外植体可以是预孵育小孢子(pre-incubated microspore)、预孵育小孢子衍生胚或预孵育小孢子衍生下胚轴。该方法还包括由转化细胞再生出转化植物的步骤，该步骤包括：(a)在再生培养基上培养所述小孢子衍生的外植体以产生再生胚或组织；和(b)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

本发明一方面提供产生稳定转化的芸苔属植物的方法，该方法包括：(a)通过微弹轰击将DNA构建体导入预孵育的外植体，它可以是小孢子或小孢子衍生胚或小孢子衍生胚的部分；(b)培养预孵育的外植体以产生胚或组织；和(c)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。步骤(a)中，在轰击前，将小孢子在培养基中大约培养2-10天的一段时间，可产生预孵育小孢子。这段时间可约为4-8天，或者7-8天。该方法还包括在轰击前、轰击期间及轰击后诱导预孵育小孢子质壁分离的步骤。例如，质壁分离可按照下列方法诱导：(a)在轰击前、轰击期间及轰击后，在渗透培养基上培养预孵育小孢子，或者(b)在轰击前、轰击期间及轰击后，在湿滤纸上培养预孵育小孢子。渗透培养基大约可以含有17％～19％蔗糖以及0.8％～1.6％Phytagel^TM琼脂(重量/体积)。预孵育小孢子可在渗透培养基上，在轰击前大约培养0.5小时至4小时，然后在轰击后大约培养4小时至20小时。

该方法还包括轰击后的筛选步骤，所述步骤包括将经过轰击的预孵育小孢子在含有针对DNA构建体编码基因的选择剂的培养基上进行培养。例如，选择剂可选自卡那霉素、G418和草甘膦(glyphosate)。G418的浓度可介于约5mg/L和10mg/L之间。培养基中草甘膦的浓度可介于约0.1mM和0.2mM之间。该方法还可包括在轰击期间使预孵育小孢子定向以便在轰击期间使小孢子表面暴露出来的步骤。该方法还可包括在轰击前收集有存活力并能进行胚发生的预孵育小孢子的步骤。该预孵育小孢子的收集步骤可以是过滤步骤或者是珀可(

)梯度离心的步骤(珀可(

)浓度为35-45％)。可用孔径约15-48μm的筛进行过滤步骤。

所述方法的步骤(a)中，可用轰击因子(bombardment factor)进行微弹轰击，轰击因子包括约12.5ng-5μg的所述DNA构建体，每枪金颗粒大约15μg-100μg，大小为0.4微米至0.6微米，约2.5M CaCl₂和650-900psi爆破盘(rupture disk)。再生出稳定转化植物的步骤可包括将经过轰击的预孵育小孢子在第一液体选择培养基中培养第一段时间，在第二液体选择培养基中培养第二段时间，然后将由预孵育小孢子获得的抗性胚或组织转移到固体培养基上培养第三段时间。第一段时间可约为7天，预孵育小孢子可避光培养。预孵育小孢子或者由预孵育小孢子衍生的组织或胚，可在约240英尺烛光或2,583勒克斯的暗光下，在第二液体选择培养基中培养约14天。第二液体培养基可为液体NLN-6.5S并且还含有生长调节剂。第二液体选择培养基中的生长调节剂可包括0.5mg/L NAA和0.05mg/L BAP。此外，第一液体选择培养基、第二液体选择培养基或者第一液体选择培养基及第二液体选择培养基两种培养基可含有G418或草甘膦。此外，固体培养基可含有诱导再生的生长调节剂，任选还含有针对DNA构建体编码基因的选择剂。固体培养基可为含吲哚乙酸(IAA)、赛苯隆(thidiazuron，TDZ)和硝酸银(AgNO₃)的MMW培养基。固体培养基还可含有针对DNA构建体编码基因的选择剂。该方法还包括使用染色体加倍剂(chromosome doubling agent)来产生加倍单倍体转基因植物。可以在轰击后1天内给予加倍剂，可给予约7天。

如果本发明经过轰击的外植体是小孢子衍生胚，则该方法可包括：(a)在轰击前，将小孢子衍生胚在渗透培养基上培养约0.5小时至约4小时；(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入小孢子衍生胚在渗透培养基上的暴露面；(c)将经过轰击的小孢子衍生胚在渗透培养基上继续培养约4小时至约20小时；(d)在再生培养基上培养所述经过轰击的小孢子衍生胚以产生再生胚或组织；和(e)由再生胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。小孢子衍生胚可生长约11天至20天。小孢子衍生胚可生长约为11天至14天。该方法还包括用吸液管收集胚并在步骤(a)之前将胚转移到滤纸上的步骤。步骤(d)可包括将胚在液体培养基中培养第一段时间，然后在固体培养基上培养第二段时间。第一段时间可约为7-14天。该方法还包括从再生胚切取下胚轴并于再生培养基上培养下胚轴的任选步骤。另外，该方法还包括筛选转化胚或组织的步骤，所述步骤包括将胚在补充了针对DNA构建体编码基因的选择剂的培养基上进行培养。该方法包括使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体转基因植物。

如果本发明经过轰击的外植体是小孢子衍生胚部分，则该方法可包括：(a)在轰击前，将从小孢子衍生胚切取的下胚轴在渗透培养基上培养约0.5小时至约4小时；(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入小孢子衍生下胚轴在渗透培养基上的暴露面；(c)将经过轰击的小孢子衍生下胚轴在渗透培养基上继续培养约4小时至20小时；(d)在再生培养基上培养所述小孢子衍生下胚轴以产生再生胚或组织；和(e)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。可在介于约21天和26天之间从小孢子衍生胚切取小孢子衍生的下胚轴。该方法还包括轰击前将小孢子衍生下胚轴在细胞分裂诱导培养基上培养约1-20小时的步骤，该培养基中含有植物生长调节剂。步骤(d)可包括将胚在第一固体培养基上培养第一段时间，然后在第二固体培养基上培养第二段时间。第一固体培养基中可含有诱导发芽的植物生长调节剂。第二固体培养基中可不含植物生长调节剂，或者可含有用于枝条形成的植物生长调节剂。该方法还包括筛选转化胚或组织的步骤，所述步骤包括将胚或组织在补充了针对DNA构建体编码基因的选择剂的培养基上进行培养。该方法还包括使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体转基因植物。

本发明的另一方面提供用上述任一种方法产生的芸苔属细胞或稳定转化的芸苔属植物。所述植物或细胞可选自甘兰型油菜(Brassicanapus，亦称欧洲油菜)、白菜型油菜(Brassica rapa，亦称芜青)、芥菜型油菜(Brassica juncea，亦称芥菜)、野甘蓝(Brassica oleracea)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)和黑芥(Brassica nigra)。本发明还提供所述植物和细胞的子代。

发明详述

本发明涉及芸苔属植物的转化方法。该方法用于农业以便开发出农艺性状改良的转基因作物。该方法特别应用于将所需性状导入芸苔属植物。这类新的性状可以是例如除草剂抗性、病原体和昆虫抗性、改良的种子油组成等。该方法包括将DNA构建体导入芸苔属植物细胞基因组并且由该细胞再生出稳定转化的植物。

以下部分将对本文所用的多个术语进行定义和阐明。

术语“芸苔属细胞”是指来自芸苔属植物的细胞，或通过体外培养法产生的细胞及由芸苔属植物细胞传代下来的细胞。

术语“体细胞胚”是指由体细胞发育而来的胚。由细胞发育成体细胞胚的发育过程称为“体细胞胚发生”。这种“体细胞胚”与由合子发育而来的“合子胚”截然不同。

术语“小孢子衍生(的)胚”是指由小孢子发育而来的胚。因为它由生殖细胞发育而来，所以这种“小孢子衍生(的)胚”与分别由体细胞和合子发育而来的体细胞胚和合子胚两者都截然不同。

术语“小孢子衍生(的)下胚轴”是指由小孢子发育而来的胚的下胚轴。

术语“不定(的)”是指不是起源于植物体通常位置上的植物器官或其它结构。例如，起源于小孢子衍生胚的下胚轴的枝条(shoot)是“不定枝(adventitious shoot)”。

术语“甘兰型油菜(canola)”是指芸苔属植物或得自芸苔属植物的油，其中油中芥子酸所占比例必定在2％以下，而且种子固体组分中每克风干不含油固体所含有的以下成分任一种或任何以下成分的混合物必定是小于30微摩尔：葡萄糖异硫氰酸3-丁烯酯(3-butenylglucosinolate)、葡萄糖异硫氰酸4-戊烯酯、葡萄糖异硫氰酸2-羟基-3-丁烯酯和葡萄糖异硫氰酸2-羟基-4-戊烯酯。

术语“器官发生”是指其中一个细胞或细胞群长出例如枝条、芽或根等器官的发育过程。

术语“染色体加倍”是指细胞中每条染色体都被加倍，导致了细胞的染色体数目加倍。

术语“倍性”是指细胞核中整套染色体的数目。“单倍体”细胞具有一套染色体，而“二倍体”细胞具有两套染色体。

术语“有效量”是指能够在生物中引起所需效果的物质、化合物或植物生长调节剂的量。一般认为“有效量”可随例如生物、生物的靶组织、施药方法、温度、光照、相对湿度等因素而变化。此外，一般还认为特定物质的“有效量”可通过给予生物一定用量范围的物质，然后测定哪种或哪些用量引起所需的效果来确定。

术语“预孵育小孢子衍生的外植体(pre-incubatedmicrospore-derived explant)”是指在轰击前大约培养了1天至30天之间的小孢子或者由这种小孢子得到的任何组织(例如小孢子衍生胚或小孢子衍生下胚轴)。例如，预孵育小孢子可自从供体植株分离出小孢子起培养约2-10天。例如，预孵育小孢子衍生胚可自从供体植株分离出小孢子起培养约11天至20天。例如，预孵育小孢子衍生下胚轴可自从供体植株分离出小孢子起培养约21天至26天。

术语“子代”是指特定细胞或植物的后代，该细胞或植物包含插入T0植物细胞基因组基因座中的至少一部分转基因。例如，子代可以是植物结出的种子以及由这些种子生长出的植物。例如，植物子代包括T0、T1、T2和后代植物结出的种子，以及由这类种子生长出的植物。子代还包括用T0、T1、T2、T3等植物的花粉通过异花传粉所结出的种子。例如，子代可以是自交、远交或回交的结果。子代还可包括由包含至少一部分插入T0植物细胞基因组基因座的转基因的T0、T1、T2等植物或细胞衍生的无性繁殖的植物或细胞。例如，包含至少一部分插入T0植物细胞基因组基因座的原始转基因，通过插条、组织培养、小孢子培养等所产生的植物也视为子代。

本发明提供转化芸苔属植物的方法。该方法包括用DNA构建体通过微弹轰击转化芸苔属细胞。该方法还包括转化细胞再生出转化的芸苔属植物。这种转化的芸苔属植物具有掺进其基因组的至少一个拷贝的DNA构建体或其部分。本发明的转化芸苔属植物可以是稳定转化的芸苔属植物。这种转化的芸苔属植物能够产生至少一个子代，该子代具有至少一拷贝稳定掺进其基因组的本发明DNA构建体或其部分。

本发明的细胞可来源于(1)预孵育小孢子，(2)小孢子衍生胚，或者(3)小孢子衍生下胚轴。一般认为这些组织的细胞很有可能是单倍体。如果细胞经历自发染色体加倍，或者如果细胞受染色体加倍剂作用，则细胞可能是二倍体。单倍体细胞的转化是有利的，因为所得染色体加倍的转基因植物是纯合的。

将目标DNA构建体通过微弹轰击导入细胞内。已知微弹轰击的其它术语还包括粒子轰击、微粒子轰击、射弹微粒子加速(ballisticparticle acceleration)和生物射弹转化。一般地讲，这些方法包括将目标DNA构建体涂在或者包裹在微粒表面，然后将包被有DNA的微弹递送到靶组织，递送速度足以允许该粒子穿过细胞壁和细胞膜从而进入植物细胞。参见例如Sanford等，美国专利第4,945,050号；Tomes等，美国专利第5,879,918号；Tomes等，美国专利第5,886,244号；Bidney等，美国专利第5,932,782号；Tomes等(1995)“Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microprojectile Bombardment(通过微弹轰击指导DNA转移至完整植物细胞中)”，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental.Methods，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)”和McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926。

本发明的方法不依赖于特定的DNA构建体。本发明方法可以采用通过微弹轰击导入细胞的任何DNA构建体。本发明的DNA构建体可包含至少一个与驱动在植物细胞中进行表达的启动子操作性连接的目标核苷酸序列。DNA构建体可包含选择标记基因和至少一个与驱动在植物细胞中进行表达的启动子操作性连接的另外的目标核苷酸序列。另外，DNA构建体可包含选择标记基因和至少一个能够赋予芸苔属植物所需性状的另外的核苷酸序列。

本发明的方法另还包括使本发明的转化细胞再生出稳定转化的芸苔属植物。转化植物的再生包括在引起转化细胞生长和发育成转化植物的条件下培养转化细胞。转化细胞或其后代可发育成转化胚，特别是发育成转化小孢子衍生胚或体细胞胚，随后再发育成转化植物。或者，转化细胞及其后代可发育成转化器官，例如不定枝。一般认为由转化细胞通过不定枝再生出转化的芸苔属植物另可包括不定枝形成之前愈伤组织的形成。这种不定枝可用来通过本领域已知方法产生稳定转化的芸苔属植物。该方法一般包括在有利于在不定枝上形成不定根的培养基和环境下培养不定枝。

不定枝生根的方法为本领域所知。本发明的方法不依赖于用于转化芸苔属枝条生根的特定方法。本发明方法可采用本领域已知的不定枝生根的任何方法。一般而言，使不定枝生根可包括将枝条在含有效量的植物生长素(例如吲哚丁酸)的培养基上孵育一段时间，以诱导根系形成。参见例如Moloney等(1989)Plant Cell Reports 8：238-242和Radke等(1992)Plant Cell Reports 11：499-505。然后可由培养物中取出生根枝条，移栽到土壤或盆栽基质(potting medium)中，并放在利于生长、成熟和种子产生的环境条件下。

一般认为本发明的转化胚、转化不定器官和转化植物可以是嵌合的。也就是说，这些转化胚、器官和植物既可包括转化细胞又可包括非转化细胞，或者可包括两种或更多种不同的转化细胞。一般还认为这些嵌合植物可产生子代植物，该子代植物包含稳定掺进所有体细胞和生殖系细胞基因组的目标DNA构建体或其部分。

本发明的方法包括芸苔属植物细胞的转化。细胞可以是单倍体细胞。虽然单倍体细胞一般不产生二倍体植物，但是一般认为单倍体细胞有时可自发产生能够发育成能育植物的二倍体细胞。必要时，本发明方法可采用染色体加倍剂从而使单倍体细胞的倍性增至两倍。也就是说，单倍体细胞变成二倍体细胞。这种二倍体细胞可产生稳定转化的能育芸苔属植物。本发明的方法不依赖于特定的染色体加倍遗传机制。然而，很有可能是发生在例如在有丝分裂期但没有胞质分裂时的染色体复制而导致染色体加倍。

诱导本发明染色体加倍的方法包括给予细胞、优选单倍体细胞有效量的染色体加倍剂。已知增加细胞倍性的任何物质都可用于本发明的方法。染色体加倍剂包括但不限于氟乐灵、秋水仙素、安磺灵(oryzalin)、甲基消草磷和拿草特。根据所需结果，可在将DNA构建体通过微弹轰击导入细胞前、导入细胞后，或者既在导入前又在导入后，给予组织或其细胞染色体加倍剂。在本发明的某些方法中，在轰击后给予有效量的染色体加倍剂。

由转化的芸苔属细胞再生出的植物称为T0代或T0植物。通过T0代植物的各种有性杂交所产生的种子称为T1子代或T1代。当T1种子萌发时，所得植物亦称T1代。T1植物或者用T1花粉杂交所产生的种子称为T2种子，T2种子产生T2植物。T2植物或者用T2花粉杂交所产生的种子称为T3种子。T3种子产生T3植物。因此，通过T4、T5、T6等进行传代。可对T1、T2、T3、T4等的种子和植物进行分析以确保转基因的成功遗传。各种有性杂交是可行的。例如，植物可以是自交、远交或回交。或者，转基因植物(T0、T1、T2等)可以无性繁殖，例如按照本领域技术人员已知方法进行克隆、组织培养、插条、小孢子培养等。

在本发明的第一个实施方案中，本发明提供转化芸苔属预孵育小孢子并由其再生出稳定转化的植物的方法。

第一个实施方案的方法包括用包被有目标DNA构建体的微弹轰击预孵育小孢子。通过本领域技术人员已知方法分离出小孢子。例如参见Fukuoka等(1996)Plant Physiol.111：39-47、Keller等(1987)Proc.7^th Int.Rapeseed Congr.(Plant Breeding and Acclimatization Institute，Poznan，Poland)，第152-157页；Swanson等(1987)Plant Cell Reports 6：94-97和Baillie等(1992)Plant Cell Reports 11：234-237。小孢子为单倍体。可分离出小孢子，然后在含有高浓度蔗糖(例如17％蔗糖)的培养基中培养2-3天。我们建议使用高浓度的蔗糖以便紧接分离后确保小孢子的完整性。此外，高渗胁迫可能对胚发生诱导产生积极作用(Maraschin等，2005 J Exp Bot 56：1711-1726和Prem等，2005，In VitroCell.Dev.Biol.-Plant 41：266-273)。然后将小孢子在含有低浓度蔗糖(例如10％蔗糖的范围内)的培养基中培养4-8天，以促进小孢子分裂。因此，2-10天的预孵育期也落在本发明的范围内。

预孵育期后，按富集有生命力和胚发生性小孢子的方式收集预孵育小孢子。例如，这可以通过用孔径为15-48μm的Nitex^TM筛进行。孔径可介于15μm和25μm之间。胚发生性小孢子还可通过珀可(

)梯度离心富集化(Touraev 1996 Sex Plant Reprod 9：209-215)。珀可(

)浓度介于35％至45％之间。然后将容纳有预孵育小孢子的Nitex^TM筛在轰击前、轰击期间和轰击后一段时间内放到渗透处理培养基上。渗透处理引起小孢子轻微的质壁分离以确保它们不致于因轰击过程而破裂。轰击期间，小孢子表面可暴露在包被有DNA的轰击粒子的通道中，以促使该颗粒进入，还能防止培养基的任何突然涌入(即暴露的小孢子表面不埋入培养基中)。渗透处理有利于这一点。例如，可将预孵育小孢子在轰击前、轰击期间进行渗透处理1-2小时，并且在轰击后进行1-24小时。例如，渗透处理可包括将预孵育小孢子放到培养基上，培养基中含有0.8-1.6％的Phytagel^TM即琼脂、17％～19％的蔗糖及1g/L MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)。还可以在轰击前、轰击期间和轰击后将小孢子(任选过筛)放入培养皿(直径3.5cm)中进行渗透处理。将用NLN-13S培养基湿润的一张滤纸(直径3.2cm)放入培养皿中以防止小孢子脱水。

在轰击后，可将小孢子和筛在含有加倍剂和高浓度蔗糖(例如13％蔗糖)的培养基中大约培养7天。

如果目标DNA构建体包含选择标记基因，则可将经过轰击的预孵育小孢子转移到含有用于特定选择标记基因的合适选择剂的培养基中。这种转移可紧随轰击后进行或者经一段时间后进行。例如，转移可在轰击后零天至约30天之间进行。

在筛选阶段，预孵育小孢子可以在选择NLN培养基中进行传代培养，NLN培养基中可含有低浓度(例如6.5％)的蔗糖和生长调节剂(例如细胞分裂素和植物生长素)。选择可在光照下进行。然后可监测预孵育小孢子出现的转化胚和/或不定枝。然后，可将这些转化胚和/或不定枝在枝条再生培养基中培养，再生培养基中含有MS或B5组分，而且还可在含有或不含植物生长调节剂时含有选择剂(例如卡那霉素或草甘膦)。再生枝条在含有0.1mg/L GA₃的B5培养基中生根。

在本发明的第二个实施方案中，提供用包被有目标DNA构建体的微弹转化来自小孢子衍生胚的细胞的方法。该方法是本领域已知用来由芸苔属小孢子产生胚的方法。参见Fukuoka等(1996)Plant Physiol.111：39-47和Keller等(1987)Proc.7^th Int.Rapeseed Congr.(PlantBreeding and Acclimatization Institute，Poznan，Poland)第152-157页。如同小孢子本身一样，包含这种细胞的小孢子衍生胚是单倍体。本发明的方法中，整个小孢子衍生胚受到包被有DNA的微弹轰击。小孢子衍生胚的生长期可超过10天，尺寸约大于1.5mm。小孢子衍生胚的生长期可介于11天和20天之间。胚可以是球形或心形的。出于上述同样的原因，在轰击前、轰击期间及轰击后，将胚在渗透培养基上进行培养。胚的至少一个表面会在轰击期间暴露于轰击粒子的通道(即不接触培养基)，以利于粒子进入细胞，并且避免培养基突然涌入细胞内。例如，胚可在轰击前进行渗透处理约4小时，并且在轰击后进行约20小时(例如过夜)。例如，渗透处理可包括含有17-19％蔗糖和1.5％琼脂的培养基，用于防止胚细胞在轰击期间和轰击后破裂。或者，渗透处理可包括将胚放在具有湿滤纸的培养皿中。然后将胚转移到再生培养基上。再生培养基中可包括但不限于B5培养基、基于MS的培养基(MS盐与有机物、2％(重量/体积)蔗糖、0.6％(重量/体积)琼脂(西格玛公司(Sigma))，pH 5.8)。可切取胚衍生的下胚轴，放在选择培养基中培养以诱导转基因枝条。通常，由于顶端分生组织或下胚轴区生长的结果，小孢子衍生胚产生1条不定枝或几条不定枝。第二和第三实施方案的方法可包括小孢子衍生胚和小孢子衍生下胚轴的不定枝再生。这种方法应用于增加从转化实验中再生出转化植株的数量。

不定枝再生包括从小孢子衍生胚形成多条枝。因此，单个小孢子衍生胚通过转化可产生多条转化枝。通常，一般认为由单个小孢子衍生胚中产生的所有转化枝条都是独立的转化体。也就是说，每条转化枝衍生自独立的转化细胞，因此在遗传上是截然不同的。然而，对于本研究的目的，所有得自各个胚的多重事件都是关联的。

不定枝再生的方法为本领域所知。虽然本发明的方法不依赖于不定枝再生的特定方法，但是该方法可包括使小孢子衍生胚接触有效量的细胞分裂素以诱导不定枝。可以在给予小孢子衍生胚细胞分裂素后约30天以内实现不定枝再生。可以在给予细胞分裂素约10天以内实现不定枝再生。本发明的第二种再生方法另可包括使小孢子衍生胚接触有效量的植物生长素。在示例性方法中，在轰击后，在含有或不含有效量的植物生长素时给予小孢子衍生胚有效量的细胞分裂素，以诱导不定枝再生。

如果第二个实施方案方法所用的DNA构建体包含选择标记基因，则可以紧随轰击后或者在轰击后少于2天至约30天的时间内进行筛选。可以使小孢子衍生胚与有效量的目标DNA构建体选择标记基因的合适选择剂接触，来进行筛选。可将有效量的选择剂加到培养小孢子衍生胚的培养基中。选择剂可以单用或者与一种或多种其它化合物(例如染色体加倍剂或植物生长调节剂)合用。

在本发明第三个实施方案中，提供用于粒子轰击小孢子衍生下胚轴的方法。如上所述，小孢子是按照本领域技术人员已知方法分离和培养的。培养后大约21天，当胚一般呈鱼雷形时，原培养基用新鲜培养基稀释，将小孢子大约再多培养5天。培养物中大多数的胚在26天后一般处于子叶期。从胚中切取下胚轴切片，在补充了植物生长调节剂的培养基上培养一段时间以诱导细胞分裂。例如，切取的下胚轴可在MMW+4mg/L BAP+0.25mg/L NAA上培养过夜。

在轰击前、轰击期间和轰击后，按照上述方法将切取的下胚轴进行渗透处理。另外，将与轰击路线直接成一直线的下胚轴表面暴露于轰击粒子通道(即与轰击路线直接成一直线的下胚轴表面不埋入培养基中)，以利于包被有DNA的粒子进入，并且避免培养基的任何突然涌入。渗透培养基中可含有17-19％蔗糖、1.5％琼脂和1g/L MES。可将下胚轴在渗透培养基上在轰击前培养4小时，然后在轰击后再培养过夜。渗透处理后，可将下胚轴转移至芽诱导培养基(例如MMW+4mg/L BAP+25-100mg/L KAN)中。芽可以是未成熟的枝条、叶、胚或花。然后可将包含不定芽的下胚轴转移到枝条再生培养基(例如无激素MMW或MMW+0.2mg/L BAP)中。可在轰击后将选择剂加到任何培养基中。

另外，第一、第二、第三个实施方案的方法可包括在轰击前或任选轰击后，将有效量的染色体加倍剂加到培养基中。添加染色体加倍剂并不是所有情况都必需的，因为自发加倍的比率可能较高，尤其在使用小孢子衍生胚和小孢子衍生下胚轴的实施方案中。这种染色体加倍剂和使用方法为本领域技术人员所知，有关论述见上文。

本发明方法包括植物生长素和细胞分裂素等植物生长调节剂的用途。本发明的植物生长调节剂包括但不限于游离和缀合两种形式的天然存在的植物生长调节剂。另外，本发明的植物生长调节剂包括这类天然存在的植物生长调节剂的合成类似物和前体。

植物生长素天然存在的类似物和合成类似物包括但不限于吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚丁酸(IBA)、α-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4，5-T)、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)、4-(4-氯-2-甲基苯氧基)丁酸(MCPB)、2甲4氯丙酸(mecoprop)、2，4-滴丙酸(dicloprop)、二氯喹啉酸、毒莠定、定草酯、二氯皮考啉酸、氟草烟和麦草畏。

细胞分裂素天然存在的类似物和合成类似物包括但不限于细胞分裂素、赛苯隆(TDZ)、玉米素、玉米素核苷、磷酸玉米素核苷(zeatinriboside phosphate)、二氢玉米素、异戊基腺嘌呤和6-苄基腺嘌呤(BAP)。

本发明的方法可包括作为选择剂的G418二硫酸盐(Gibco^TM，Fluka公司亦按Geneticin^TM销售)或者作为选择剂的草甘膦的用途。在轰击预孵育小孢子后，可先避光然后在低强度的光(例如约240英尺-烛光或2,583勒克斯)下在液体培养基中进行筛选。然而，可以使用本领域技术人员已知的其它选择剂。例如有卡那霉素(Beck等(1982)Gene 19：327-336；Mazodier等(1985)Nucleic Acids Res.13：195-205)和其它除草剂如Basta^TM和Chlorsulfuron^TM等。

稳定的转基因植物可通过聚合酶链式反应(PCR)分析和DNA印迹杂交分析得到证实。

本文所用术语“DNA构建体”并非将本发明局限于包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员应当理解的是，本文所公开的方法中还使用核苷酸构建体，特别是包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸组合的多核苷酸和寡核苷酸。

因此，本发明的DNA构建体包括本发明方法所采用的转化芸苔属植物的所有核苷酸构建体，包括但不限于包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合的核苷酸构建体。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子又包括合成类似物。本发明的DNA构建体还包括所有形式的核苷酸构建体，这些形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。

此外，一般认为本发明方法可采用能够在转化植物中指导表达至少一种蛋白质或至少一种RNA(例如rRNA、tRNA或与至少一部分mRNA互补的反义RNA)的DNA构建体。这种DNA构建体通常由蛋白质编码序列或与5’和3’转录调节区操作性连接的RNA组成。或者，一般还认为本发明方法可采用不能在转化植物中指导表达蛋白质或RNA的DNA构建体。

另外，一般认为本发明方法不依赖于将整个DNA构建体掺入基因组内，只是芸苔属植物基因组由于DNA构建体导入芸苔属细胞而发生改变。例如，基因组的改变包括基因组中核苷酸的添加、缺失和置换。虽然本发明方法不依赖于核苷酸任何特定数目的添加、缺失或置换，但是一般认为这种添加、缺失或置换包括至少一个核苷酸。

本发明的DNA构建体还包括核苷酸构建体，它可用于在生物中使基因组核苷酸序列发生改变或突变的方法，包括但不限于嵌合载体、嵌合突变载体、嵌合修复载体、混合双链体寡核苷酸、自我互补嵌合寡核苷酸(self-complementary chimeric oligonucleotide)和诱重组性寡核苷碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这些核苷酸构建体和使用方法(例如嵌合修复术(chimeraplasty))为本领域所知。嵌合修复术包括使用这些核苷酸构建体以便在生物体内引起基因组DNA序列的位点专一性变化。参见美国专利号5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984。另参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778。

另外，本文所用术语“包被有DNA的微弹”并非使本发明的方法局限于包被有DNA的微弹。相反，本文所用术语“包被有DNA的微弹”包括用如上所述的本发明DNA构建体的任一种或多种包被的微弹。

本发明的DNA构建体可包括在目标芸苔属植物中进行表达的表达盒。表达盒可包括与目标基因操作性连接的5’和3’调节序列。术语“操作性连接(的)”是指调节序列与第二序列之间的功能性连接，其中调节序列影响相应于第二序列的DNA序列转录的开始和调节。一般而言，操作性连接是指所连接的核酸序列是相邻的，而且如果需要便将两个蛋白编码区在同一读框内相邻地连接在一起。表达盒另可含有至少另一个共转化到生物中的基因。或者，另外的基因可用多个表达盒提供。

本发明提供的这种表达盒具有在调节区的转录调节下插入目标基因序列的多个限制位点。表达盒另可含有选择标记基因。

表达盒自5’-3’转录方向可包括在植物中起作用的转录和翻译起始区、目标基因和转录和翻译终止区。转录起始区即启动子对于植物宿主可以是天然的(或类似的)或外源的(或异源的)。另外，启动子可以是天然序列或是合成序列。术语“外源”是指将天然植物不存在的转录起始区导入转录起始区。本文所用的嵌合基因包含编码序列及与其操作性连接的转录起始区，该转录起始区对编码序列来说是异源的。

虽然可优选使用异源启动子来表达目标基因，但是也可使用天然启动子序列。这些构建体可改变植物或植物细胞内目标基因的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表型。

终止区与转录起始区可以是天然的、与操作性连接的目标DNA序列可以是天然的，或者可得自其它来源。根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒获得便利的终止区，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另可参见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

适当时，可使基因最优化以增加在转化植物中的表达。也就是说，可用植物优选的密码子合成基因以改进表达。有关宿主优选的密码子使用的论述参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。

已知另外的提高细胞宿主基因表达的序列修饰。这些包括消除以下的编码序列：假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列(transposon-like repeat)和其它已充分表征的可能对基因表达有害的一些序列。可调节序列G-C含量至所给定细胞宿主的平均水平，参照宿主细胞中已知基因的表达计算出平均水平。可能时，对序列进行修饰以避免预计的发夹型二级mRNA结构。另外，基因可经过基因改组以提高表达。例如，对用于实施例中的草甘膦乙酰基转移酶基因进行基因改组(Castle等(2004)Science 304：1151-1154和WO02/36782A2)。

表达盒可在表达盒构建体中另含有5’-前导序列。这种前导序列可以起到提高翻译的作用。翻译前导序列为本领域所知，包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’-非编码区)(Elroy-Stein等(1989)PNAS USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)(Allison等(1986)Virology154：9-20)；MDMV前导序列(玉米矮缩花叶病毒)；Virology 154：9-20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature353：90-94)；得自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等(1989)，载于Molecular Biology ofRNA，编辑Cech(Liss，New York)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81：382-385)。另参见Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可采用已知的提高翻译的其它方法，例如内含子等。

在制备表达盒时，可以对各种DNA片段进行处理，以便提供正确方向(适当时在合适的读框内)的DNA序列。为此，可使用衔接子或接头以连接DNA片段，或者可包括其它操作以提供便利的限制位点、除去过量DNA、除去限制位点等。为此目的，可以包括体外诱变、引物修补、限制、复性、再置换例如转换和颠换。

许多启动子可用于本发明的实施中。可根据所需结果选择启动子。本发明核酸可与用于在芸苔属植物中表达的组成型启动子、组织优选型启动子或其它启动子组合。

这种组成型启动子包括例如Rsyn7的核心启动子(美国专利第6,072,050号)；核心CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature313：810-812)；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等(1990)Plant Cell2：163-171)；遍在蛋白启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-25 632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)、SCP(WO 97/47756A1、WO 99/438380)；H2b(Rasco-Gaunt等(2003)Plant Cell Rep.21：569-576)；SCP1(美国专利号6,677,503B1)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142。

组织优选型启动子可用来以提高目标基因在特定植物组织内的表达为目标。组织优选型启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hanson等(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol 112(2)：513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等(1993)Plant Mot Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)：495-505。必要时，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。

“种子优选型”启动子包括“种子发育”启动子(在种子发育期间优先起作用的启动子，例如种子贮藏蛋白启动子)以及“种子萌发性”启动子(在种子萌发期间优先起作用的启动子)。参见Thompson等(1989)BioEssays 10：108。这类种子优选型启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息(cytokinin-induced message))；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)和celA(纤维素合酶)(参见美国专利第6,225,529号)。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于以下启动子：豆类β-菜豆蛋白(Chandrasekharan等，2003Plant J.33：853-866)、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)(Chamberland等1992 Plant Mol.Biol.19：937-949)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。

表型的各种变化受到关注，包括改进植物的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制、提高非生物胁迫耐受性等。可通过在植物中提供异源产物表达或增加内源产物表达而获得这些结果。或者，可通过减少植物中一种或多种内源产物、特别是酶或辅因子的表达，而获得这样的结果。这些改变导致转化植物的表型发生改变。

目标基因或目标核苷酸序列反映出参与农作物开发方的市场和利益。目标农作物和市场发生变化，而且由于发展中国家面向全球市场开放，新的农作物和技术也将涌现。另外，正如我们所了解的农艺性状和特性(例如产量和杂种优势)得到改进，用于转化的基因选择也将因此而改变。目标基因的总体范畴包括例如参与信息的基因(例如锌指)、参与通信的基因(例如酶)和参与持家的基因(例如热休克蛋白)。转基因更具体的范畴包括例如编码以下重要性状的基因：农艺、抗虫、抗病、抗除草剂、不育、谷粒和商品性状。目标基因一般包括参与油、淀粉、糖或营养物代谢的基因以及影响谷粒大小、蔗糖负载等的基因。

除采用传统育种方法外，可以通过本发明的方法从遗传上改变农艺方面的重要性状，例如油、淀粉和蛋白质含量。所述改变包括增加油酸、饱和与不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸，还包括淀粉改性。Hordothionin蛋白质修饰参见美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409。另一个实例是由大豆2S白蛋白基因编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，参见美国专利第5,850,801号，以及得自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制物，参见Williamson等(1987)Bur.J.Biochem.165：99-106。

可以通过定点诱变来制备编码序列的衍生物，以提高所编码的多肽中预选氨基酸的水平。例如，大麦高赖氨酸多肽(BHL)编码基因得自大麦胰凝乳蛋白酶抑制物(WO 98/20133)。其它蛋白质包括例如得自向日葵种子的富含甲硫氨酸的植物蛋白(Lilley等(1989)Proceedings ofthe World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods andAnimal Feedstuffs(人类食物和动物饲料应用植物蛋白质世界大会会议录)，编辑Applewhite(American Oil Chemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页)；玉米(Pedersen等(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等(1988)Gene 71：359)；和水稻(Musumura等(1989)Plant Mol.Biol.12：123)。其它农艺学上重要的基因编码胶乳(latex)、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。

抗虫基因可编码对产量造成极大损失的害虫的抗性，例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。这样的基因包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881和Geiser等(1986)Gene 48：109)；凝集素基因(Van Damme等(1994)Plant Mol.Biol.24：825；Ahman等2000WO0001223)等。

抗病性状编码基因包括解毒基因，例如抗串珠镰孢菌素基因(美国专利第5,792,931号)；减毒(avr)和抗病(R)基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432和Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)等。赋予核盘菌属(Sclerotinia)抗性的基因已被导入向日葵和芸苔属中(美国专利号6,441,275B1)。在组成型启动子下的内切壳多糖酶基因被导入甘兰型油菜(Brassica napus var.oleifera)近交系中。转化植物的子代在田间试验中用三种不同的真菌病原体(Cylindrosporium concentricum、黑胫茎点霉(Phoma lingam)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))攻击。与非转基因母本植物相比，该植物显示对病害的耐受性增强(Grison等(1996)Nature Biotechnology 14：643-646)。有关另外的抗病性基因的论述参见Stewart和Broadway，2005(US6927322)；Salmeron等2003(US6528702)及Chye和Zhao 2002(US20030097682)。

除草剂抗性性状可包括发挥抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂抗性、特别是磺酰脲型除草剂(例如因含有突变而导致这种抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，特别是S4和/或Hra突变)抗性的编码基因；起着抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂(例如膦丝菌素或

)抗性的编码基因(例如bar基因)，或者是本领域已知的这类基因。ALS-基因突变型编码除草剂氯磺隆抗性(Swanson等(1989)Theor Appl Genet78：525-530，EP0257993B1)。草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予草甘膦抗性(Castle等(2004)Science 304：1151-1154)。

表达盒中还可编码不育基因，为物理去雄提供替代方法。用于这种方法的基因的实例包括雄性组织优选型基因和具有雄性不育表型(例如抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白)的基因，参见美国专利第5,962,769号(Albertsen等，1999)和Barnase(Block和Debrouwer(1993)Planta 189：218-225)。其它基因包括酶和雄性或雌性配子体发育毒性化合物的编码基因。

种子品质反映在性状中，例如油的水平和类型、饱和与不饱和状况、必需氨基酸的质量和数量以及纤维素的水平。例如在美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409中，描述了对于所需目的的蛋白质修饰。

还可将商业性状编码在一个或多个基因上，这可增加例如淀粉以用于乙醇生产，或者进行蛋白质表达。转化植物的其它重要商业用途是生产聚合物和生物塑料(bioplastics)，例如参见美国专利第5,602,321号。基因例如R-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等(1988)J.Bacleriol.170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。

外源产物包括植物酶和植物产物以及来自包括原核生物和其它真核生物在内的其它来源的产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可以增加蛋白质水平，特别是增加具有改进的氨基酸分布使得植物营养价值提高的修饰蛋白质。这可通过表达这类氨基酸含量提高的蛋白质来实现。

一般认为本发明的DNA构建体可包含与目标基因的至少部分信使RNA(mRNA)互补的反义构建体。构建反义核苷酸使之与相应的mRNA杂交。可以对反义序列进行修饰，只要该序列与相应的mRNA杂交并且干扰相应的mRNA的表达。按这种方式，可以使用与互补序列的序列同一性为70％、80％或85％或以上的反义构建体。此外，反义核苷酸部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或以上的序列。通常，这种反义构建体将与驱动在植物中表达的启动子操作性地连接。

本发明的DNA构建体还可用于有义抑制方法(sense suppressionmethod)以抑制植物内源基因的表达。以有义方向(sense orientation)使用核苷酸序列来抑制基因在植物中表达的方法为本领域所知。该方法一般包括用DNA构建体来转化植物，所述构建体包含可驱动在植物中进行表达的启动子及与其操作性连接的至少部分与内源基因转录物相应的核苷酸序列。通常，这种核苷酸序列与内源基因转录物的序列具有相当大的序列同一性，例如序列同一性大于约65％、85％或95％。参见美国专利号5,283,184和5,034,323。

一般而言，表达盒可包含用于筛选转化细胞的选择标记基因。选择标记基因用于筛选转化细胞或组织。标记基因包括抗生素抗性编码基因，例如新霉素磷酸转移酶II(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的编码基因。还可以使用赋予除草剂化合物抗性的基因，除草剂化合物例如草甘膦乙酰基转移酶、草铵膦(glufosinate ammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等(1980)，载于The Operon，第177-220页；Hu等(1987)Cell 48：555-566；Brown等(1987)Cell49：603-612；Figge等(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)，博士论文，University of Heidelberg；Reines等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)，博士论文，University ofHeidelberg；Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等(1988)Nature 334：721-724。

另外，表达盒可包含筛选标记基因(screenable marker gene)，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)编码基因(Jefferson等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8447-8451；Jefferson等(1987)EMBO J.6：3901-3907)或绿色荧光蛋白(GFP)编码基因(Chalfie等(1994)Science 263：802-805)。

以上所列的选择标记基因和筛选标记基因并不是限制性的。任何选择和/或筛选标记基因都可用于本发明。

本发明的芸苔属植物包括但不限于埃塞俄比亚芥(Brassicacarnata)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、甘兰型油菜(Brassica napus)、瑞典芜菁(Brassica napus var.rapifera)、黑芥(Brassica nigra)、野甘蓝(Brassica oleracea)、羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)、中国芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis，结球嫩茎花椰菜)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、抱子甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera)、球茎甘蓝(Brassica oleraceavar.gongylodes)、芜青(Brassica rapa；亦称白菜型油菜(Brassicacampestris))、小白菜(Brassica rapa subsp.chinensis)和大白菜(Brassicarapa subsp.pekinensis)。

在本发明的某些实施方案中，本发明的芸苔属植物是油料种子芸苔属植物。这些油料种子芸苔属植物用于油品生产，包括但不限于芥菜型油菜、甘兰型油菜和白菜型油菜。芸苔属植物可以是甘兰型油菜植物。这种甘兰型油菜植物是精选的油料种子芸苔属植物(白菜型油菜、甘兰型油菜和芥菜型油菜)，其种子中含有低水平的芥子酸和低水平的芥子油苷。甘兰型油菜油中芥子酸所占比例必定在2％以下，而且种子的固体组分中每克风干不含油固体所含有的以下成分任一种或任何以下成分的混合物必定是小于30微摩尔：葡萄糖异硫氰酸3-丁烯酯、葡萄糖异硫氰酸4-戊烯酯、葡萄糖异硫氰酸2-羟基-3-丁烯酯和葡萄糖异硫氰酸2-羟基-4-戊烯酯。这种甘兰型油菜植物的种子有利于提取食用油。

实验

小孢子衍生胚

实验1-2描述了用小孢子衍生胚作为靶组织所进行的研究工作。按照本领域技术人员已知方法(例如参见Swanson等，1987)分离出小孢子，将小孢子在NLN培养基(对于本发明所使用的所有培养基的组分，可参见小标题为“培养基配方”的部分)中大约培养11-14天。然而，可将小孢子衍生胚培养11-20天。胚由小孢子产生，肉眼可观察到。小孢子衍生胚的大小一般＜1mm，胚为球形或心形。

收集小孢子衍生胚以富集有生命力的胚。例如，这可以用吸液管并将胚转移到滤纸或滤膜(例如Gelman^TM滤膜(产品目录号60110))上来进行。滤纸或滤膜孔径可为0.8μm。将胚和滤膜在渗透培养基上进行培养，例如，渗透培养基中可含有17-19％蔗糖+0.8-1％琼脂+1g/LMES，pH 6.0。在轰击前、轰击期间和轰击后，对胚进行渗透处理。例如，在轰击前对胚进行渗透处理4小时。在轰击中使用的DNA构建体是PHP18644。PHP18644和所用的其它载体见表9。按照本领域技术人员已知方法进行轰击，每份制备物用大约10ng-5μg DNA，每枪约0.4-1.0微米、15μg-300μg的金颗粒，CaCl₂浓度为0.5M-2.5M，爆破盘为650psi、900psi或1100psi。轰击后，将胚在渗透培养基上培养4小时至20小时(大致过夜)，然后转移到液体NLN培养基中。将经过轰击的胚随后培养7-14天。将经过轰击的胚或者从生长3-4周的胚中切取的下胚轴，从液体NLN培养基转移到固体选择培养基MMW+IAA+TDZ+K25-50(胚)或MMW+BAP+K25-50(下胚轴)中以诱导发芽。切取抗性再生芽，放在MMW-H+K50-100上进行培养，再生出植株。

实验1：各种爆破盘对用小孢子衍生胚的GUS瞬时表达的影响

本实验的目的是筛选不同的爆破盘以确定可以导致最大转化效率的爆破盘。

A部分：将生长了14天的小孢子衍生胚在含有17％蔗糖、1g/LMES和10g/L琼脂的渗透培养基(pH 6.0)上预孵育4小时。小孢子衍生胚用沉积在金颗粒上的PHP18644轰击(100μg/枪)。在轰击后，将经过轰击的胚在含有17％蔗糖、1g/L MES和10g/L琼脂的渗透培养基(pH 6.0)上培养4小时，然后在NLN培养基中培养。对450psi、650psi和900psi爆破盘进行了测试。

用本领域技术人员已知的GUS分析，通过分析经过轰击的胚来测定瞬时转化效率。GUS分析的结果见表1。在本实验中爆破盘900psi产生GUS表达细胞的数目最多。

表1：栽培种和爆破盘对用小孢子衍生胚的GUS瞬时表达的影响

重复编号	爆破盘	经过轰击的胚数	GUS斑点/胚
重复编号	爆破盘	经过轰击的胚数	GUS斑点/胚	重复1	450psi650psi900psi	200193207	45.72.9
重复2	450psi650psi900psi	1075451	7.520.431.4	重复1	450psi650psi900psi	200193207	45.72.9
重复2	450psi650psi900psi	1075451	7.520.431.4	重复3	450psi650psi900psi	393951	69.276.980.4

B部分：所用的构建体是PHP18644。将经过轰击的小胚在NLN-13S中培养2-3周。将胚或从胚切取的下胚轴在芽再生培养基MMW+IAA+TDZ+卡那霉素(50mg/L)(胚)或MMW+BAP+卡那霉素(50mg/L)(对于下胚轴)中进行培养。

表2表示用不同的爆破盘强度形成抗性枝条的结果。在实验的B部分中，使用650psi、900psi或1100psi爆破盘未发现显著差异。650psi和900psi爆破盘最易使用，因为只需要较少时间就能获得使盘破裂的压力。因此，将650psi和900psi爆破盘用于随后的实验当中。

表2还表示由经过轰击的胚切取的下胚轴节段形成抗性枝条。

表2：爆破盘对由经过轰击的小孢子衍生胚产生抗性芽的影响

重复编号	爆破盘(psi)	下胚轴数或胚数	抗性芽(％)
重复编号	爆破盘(psi)	下胚轴数或胚数	抗性芽(％)	重复1	6509001100	300(E)350(E)450(E)	0(0.0)0(0.0)1(0.2)
重复2	6501100	150(H)150(H)	2(1.3)0(0.0)	重复1	6509001100	300(E)350(E)450(E)	0(0.0)0(0.0)1(0.2)
重复2	6501100	150(H)150(H)	2(1.3)0(0.0)	重复3	6509001100	400(E)400(E)400(E)	0(0.0)1(0.3)0(0.0)
重复4	6509001100	850(H)525(H)775(H)	5(0.6)3(0.6)3(0.4)	重复3	6509001100	400(E)400(E)400(E)	0(0.0)1(0.3)0(0.0)

实验2.经过轰击的小孢子衍生胚在固体卡那霉素选择培养基中产生抗性枝条以及通过聚合酶链式反应(PCR)分析证实卡那霉素抗性植株

本实验的目的是证实由经过轰击的小孢子衍生胚产生卡那霉素抗性植株。所用的构建体是PHP18644，栽培种为46A65。通过轰击小孢子衍生胚产生卡那霉素抗性枝条。该枝条再生出卡那霉素抗性植株。用得自西格玛公司(Sigma)的REDExtract-N-AMP^TM植物PCR试剂盒，按照本领域技术人员已知方法分析卡那霉素抗性植株。从14株卡那霉素抗性植株中提取DNA，通过PCR对nptII基因进行分析。表3表明14株植株中有12株存在nptII基因。因此，通过轰击小孢子衍生胚获得了稳定的转基因植株。

表3.检测由经过轰击的小孢子衍生胚再生出的卡那霉素抗性植株的nptII基因

重复	事件数	PCR-nptII阳性
重复	事件数	PCR-nptII阳性	重复1	9	7
重复2	5	5	重复1	9	7
重复2	5	5	总计	14	12

小孢子衍生的下胚轴：

实验3-7描述了用小孢子衍生下胚轴所进行的研究工作。按照本领域技术人员已知方法分离出小孢子，在NLN培养基中培养21-28天(Swanson等，1987)。当胚大小约为3-5mm时，从由小孢子产生的胚上切取下胚轴。

将栽培种46A65的小孢子在NLN培养基中培养约21天。在第21天，更换NLN培养基，并用新鲜的NLN培养基稀释(1∶20)，将胚再多培养5天。从胚上切取下胚轴，放在MMW+BAP(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)上预处理过夜。将下胚轴转移到渗透培养基(例如17％蔗糖+1％琼脂+1g/L MES，pH 6.0)上4小时，然后进行轰击。轰击所用的DNA构建体是PHP18644。轰击后，将下胚轴在渗透培养基上大约培养4小时至20小时(例如过夜)。然后，将经过轰击的下胚轴在MMW+BAP(4mg/L)+卡那霉素(25-50mg/L)上培养以诱导发芽。将再生芽在MMW+卡那霉素(50-100mg/L)或MMW+BAP(0.2mg/L)+卡那霉素(50-100mg/L)上培养，再生出植株。

为了测试蔗糖浓度的影响、金颗粒的用量和爆破盘对转化频率的影响，进行了下面的实验。

实验3：渗透培养基中的蔗糖浓度对小孢子衍生下胚轴瞬时GUS表达的影响

本实验的目的是找出渗透培养基中蔗糖的合适浓度(蔗糖+1％琼脂+1g/L MES，pH 6.0)以产生最大转化效率。

对蔗糖浓度15％、17％、19％和21％的测试见表4。结果表明，用19％蔗糖产生的瞬时转化细胞的数目最多。

表4.渗透培养基中的蔗糖浓度对小孢子衍生下胚轴瞬时GUS表达的影响

蔗糖(％)	下胚轴数	含GUS的数目	斑点总数	斑点数/下胚轴
蔗糖(％)	下胚轴数	含GUS的数目	斑点总数	斑点数/下胚轴	15	24	23	236	9.8
17	24	23	242	10.1	15	24	23	236	9.8
17	24	23	242	10.1	19	24	23	475	19.8
21	24	24	400	16.7	19	24	23	475	19.8

实验4.测定每枪所用金的含量对小孢子衍生下胚轴的瞬时GUS表达的影响

本实验的目的是确定每次轰击金颗粒的最佳用量。

所用的构建体是PHP18644。表5表示用100μg金/枪、200μg金/枪和300μg金/枪的结果。三次实验的结果不一致。在余下的实验中使用100μg金颗粒/枪。

表5.每次轰击时金颗粒的用量对用小孢子衍生下胚轴的GUS瞬时表达的影响

重复编号	金用量/枪(μg)	下胚轴数	含GUS的斑点数	斑点/下胚轴
重复编号	金用量/枪(μg)	下胚轴数	含GUS的斑点数	斑点/下胚轴	1	100200300	323233	144	0.10.51.3
2	100200300	242425	242425	39.629.635.4	1	100200300	323233	144	0.10.51.3
2	100200300	242425	242425	39.629.635.4	3	100200300	242424	212424	20.126.840.1

实验5.爆破盘对小孢子衍生下胚轴的GUS瞬时表达的影响

本实验的目的是确定所测的4种爆破盘强度中哪一种产生数目最多的GUS表达细胞。

所用的构建体是PHP18644。表6表示使用450psi、650psi、900psi或1100psi爆破盘强度的GUS瞬时表达的结果。结果表明，使用爆破盘650psi和900psi产生瞬时表达GUS的细胞数目最多。

表6.爆破盘强度对用小孢子衍生下胚轴的GUS瞬时表达的影响

重复	爆破盘	下胚轴数	含GUS斑点数	GUS斑点数/下胚轴
重复	爆破盘	下胚轴数	含GUS斑点数	GUS斑点数/下胚轴	1	4506509001100	24242524	23242422	19.548.337.427.5
2	6509001100	242525	242525	60.760.549.4	1	4506509001100	24242524	23242422	19.548.337.427.5

实验6.确定爆破盘对用小孢子衍生下胚轴产生抗性芽的影响的第二项实验

本实验的目的是筛选爆破盘以确定在50mg/L卡那霉素中产生抗性芽数目最多的爆破盘。

所用的构建体是PHP18644。表7表示使用450psi、650psi和900psi爆破盘的结果。在本实验中爆破盘450psi、650psi和900psi之间不存在显著差异。

表7.爆破盘强度对用小孢子衍生下胚轴作为轰击组织产生卡那霉素抗性枝条的影响

重复编号	爆破盘	下胚轴数	含绿芽数
重复编号	爆破盘	下胚轴数	含绿芽数	1	450psi650psi900psi	375525300	6(1.6％)8(1.5％)5(1.7％)
2	450psi650psi900psi	200225100	1(0.5％)1(0.4％)1(1.0％)	1	450psi650psi900psi	375525300	6(1.6％)8(1.5％)5(1.7％)
2	450psi650psi900psi	200225100	1(0.5％)1(0.4％)1(1.0％)	3	450psi650psi900psi	300300300	2(0.7％)1(0.3％)2(0.7％)
4	450psi650psi900psi	300250300	0(0.0％)0(0.0％)3(1.0％)	3	450psi650psi900psi	300300300	2(0.7％)1(0.3％)2(0.7％)
4	450psi650psi900psi	300250300	0(0.0％)0(0.0％)3(1.0％)	5	450psi650psi900psi	150275200	1(0.7％)5(1.8％)3(1.5％)
6	450psi650psi900psi	1257525	0(0.0％)0(0.0％)1(4.0％)	5	450psi650psi900psi	150275200	1(0.7％)5(1.8％)3(1.5％)

实验7.对卡那霉素抗性植株进行GUS分析的结果

本实验的目的是通过GUS分析确定卡那霉素抗性植株的转基因状态。表8表示通过GUS分析对7株卡那霉素抗性植株进行分析。6株植株为阳性。这就证实通过轰击小孢子衍生下胚轴产生了稳定的转基因植株。

表8.通过GUS分析确定得自小孢子衍生下胚轴的卡那霉素抗性植株的转基因状态

重复编号	抗性植株	GUS阳性植株
重复编号	抗性植株	GUS阳性植株	重复1	2	2
重复2	3	2	重复1	2	2
重复2	3	2	重复3	1	1
重复4	1	1	重复3	1	1

预孵育小孢子：

实验8-17描述了用预孵育小孢子进行的研究工作。将小孢子在NLN-17S/10S中培养2-10天。最好将小孢子培养5-7天。肉眼无法观察到胚。用Nitex^TM筛(孔径15-36μm)或珀可(

)(35-45％)梯度离心收集胚发生性小孢子，使之保持生命力和胚发生性。

预孵育小孢子被用作受轰击材料。可以使用通过小孢子培养能够再生的任何芸苔属品系。将小孢子在NLN-17S中于31.5℃培养1-3天，然后在NLN-10S中于25℃培养4-5天。用于轰击的构建体是PHP18644、PHP21965、PHP22024、PHP22021和PHP23560(参见表9)。构建体可以是完整的质粒或者仅是表达盒。例如，PHP22024既可是表达盒又可是完整质粒。预孵育小孢子用孔径为15μm-36μm的筛进行过滤。所收集的小孢子用于轰击。将小孢子装入15μm或20μm筛的两层滤纸上，在1分钟内干燥。将小孢子和筛转移到含有B5组分、1g/L MES和0.8-1.6％脱乙酰吉兰糖胶、15-21％蔗糖的渗透培养基(pH 6.0)上。轰击前，将小孢子在渗透培养基上处理至少1小时。预孵育小孢子每份制备物用12.5ng-5μg DNA、每枪15-100μg Au颗粒、2.5M CaCl₂和650-900psi爆破盘进行轰击。在轰击期间将预孵育小孢子表面暴露在包被有DNA的轰击颗粒的通道(即该表面不埋入培养基中)。轰击后，将经过轰击的小孢子在渗透培养基中培养至少4小时。将容纳小孢子的一个或两个筛在5ml NLN-13S(含或不含草甘膦/板)中避光培养约7天。7天后，每个板被消耗的培养基用10ml NLN-6.5S更换，或者将被消耗的培养基稀释以使各板蔗糖浓度为6.5％。如果选择标记基因是NPTII基因，则将NAA、BAP和G418加到培养基中。如果选择标记基因是GAT，则在培养基中加入草甘膦。将胚在这种含有6.5％蔗糖的培养基中，在约240英尺-烛光或2,583勒克斯的暗光下进行培养。G418的终浓度为10mg/L，草甘膦的浓度为0.1mM或0.2mM。任选将加倍剂加到培养基中。培养2-3周后记录抗性胚。

利用预孵育小孢子将PHP18644和GAT(草甘膦乙酰基转移酶)构建体(参见表9)用于转化实验。从细菌中分离出GAT基因，见Castle等(2004)Science 304：1151-1154。将该基因进行11轮改组以提高草甘膦乙酰基转移酶的表达水平。每轮改组都有1个到若干个变异体。PHP18644还含有GUS标记基因。所用构建体见表9。

表9.构建体

构建体	启动子	选择标记	变异体和轮数
构建体	启动子	选择标记	变异体和轮数	PHP18644	CaMV	NPT11	NA
PHP22024	H2b	GAT	GAT4604，R8	PHP18644	CaMV	NPT11	NA
PHP22024	H2b	GAT	GAT4604，R8	PHP21965	SCP1	GAT	GAT4604，R8
PHP22021	H2b	GAT	GAT4618，R11	PHP21965	SCP1	GAT	GAT4604，R8
PHP22021	H2b	GAT	GAT4618，R11	PHP23560	SCP1	GAT	GAT4621，R11

有关该方案的详述，可参见下列实施例中标注为“方案”的部分。实验8：采用遗传霉素(Geneticin)(G418)(Sigma G8168)绘出筛选杀死曲线

本实验的目的是确定杀死非转基因小孢子的G418浓度。

在本项实验前，在固体培养基上而不是在液体培养基中进行筛选。利用液体筛选芸苔属转基因细胞是新的方法。在液体培养基中进行筛选是有利的，原因至少有下列几点：(a)允许早期进行筛选，从而免除随后转移外植体的需要，(b)使筛选更纯，因为当外植体在液体培养基中时，外植体一般较小，而且液体使得外植体的所有表面都暴露于选择剂中，(c)降低了嵌合的频率，和(d)需要的选择剂含量较低，因此降低了对研究人员和环境的毒性。对不同浓度卡那霉素对生长在液体培养基中的胚的影响进行了试验。结果显示，10mg/L卡那霉素足以漂白未经过轰击的胚并抑制未经过轰击胚的生长。然而，10mg/L和20mg/L的卡那霉素无法抑制经过轰击胚的生长，虽然该胚的颜色呈浅绿色和紫色。因此，难以将转基因组织或胚与非转基因组织或胚区别开来。在NLN加上6.5％蔗糖的培养基中用5-10mg/L G418替换卡那霉素，使筛选更纯。表10表示5-10mg/L G418足以将转化细胞与未转化细胞区别开来。

表10.G418对胚生长和存活的影响

G418浓度(mg/L)	胚数	绿色胚数或含绿岛胚数
G418浓度(mg/L)	胚数	绿色胚数或含绿岛胚数	0	3030	3030
1.25	3028	30(较浅)28(较浅)	0	3030	3030
1.25	3028	30(较浅)28(较浅)	2.5	2525	14(浅绿，尺寸较小)11(浅绿，尺寸较小)
5	2525	00	2.5	2525	14(浅绿，尺寸较小)11(浅绿，尺寸较小)
5	2525	00	10	3030	00

实验9：预孵育小孢子经过轰击后，随即在含有G418或草甘膦的液体培养基中筛选，产生G418和草甘膦抗性组织和抗性芽

本实验的目的是通过轰击培养了多达11天的预孵育小孢子，在补充了10mg/L G418或0.1mM和0.2mM草甘膦的液体培养基中筛选出抗性组织和抗性芽，从而获得转基因植株。

在第一批实验中，将生长了7天、8天、9天和11天的预孵育小孢子用PHP18644轰击。将两种生长调节剂NAA(0.5mg/L)和BAP(0.05mg/L)加到含有10mg/L G418的选择培养基中以改进细胞生长条件。将抗性小孢子转移并培养在选择培养基MMW+IAA+TDZ+AgNO₃5+C+K100中以诱导抗性芽并证实抗性。因此，筛选始于含有G418的液体培养基，并在使用卡那霉素的固体培养基中完成。

在第二批实验中，将生长了3天、4天和5天的预孵育小孢子用PHP23560轰击。将草甘膦加到液体和固体培养基中进行筛选。

实验结果见表11。数据表明轰击预孵育小孢子后，用G418或草甘膦在液体培养基中进行筛选产生了抗性芽和PCR阳性枝条。

表11.预孵育期对抗性芽产生的影响

实验编号	培养天数	胚	抗性芽(％)	经PCR证实的枝条
实验编号	培养天数	胚	抗性芽(％)	经PCR证实的枝条	1	9	2399	0(0.0)	NA
2	11	5629	0(0.0)	NA	1	9	2399	0(0.0)	NA
2	11	5629	0(0.0)	NA	3	8	1297	4(0.3)	NA
4	7	1998	4(0.2)	NA	3	8	1297	4(0.3)	NA
4	7	1998	4(0.2)	NA	5	5	NA	NA	6
6	4	NA	NA	3	5	5	NA	NA	6
6	4	NA	NA	3	7	3	NA	NA	3

实验10.测定轰击后渗透培养基对抗性胚产生的影响

本实验的目的是测定轰击后将经过轰击的组织在渗透培养基上培养是否提高转化效率。

表12表明轰击后将经过轰击的预孵育小孢子在渗透培养基上培养4小时，比轰击后未随即培养在渗透培养基上的经过轰击的预孵育小孢子产生数量较多的转基因部分。渗透处理后，将经过轰击的预孵育小孢子培养在液体NLN培养基中。

表12.轰击后渗透培养对抗性胚产生的影响

处理	胚数	含绿岛胚数
处理	胚数	含绿岛胚数	轰击后培养0小时	2329	0(0.0％)
轰击后培养4小时	5057	80(1.6％)	轰击后培养0小时	2329	0(0.0％)

实验11.测定在补充10mg/L G418的液体培养基中筛选出的经过轰击的预孵育小孢子产生抗性芽的效率并通过PCR分析证实抗性植株。

本实验的目的是证实在液体培养基中的筛选产生抗性芽。

所用的构建体是PHP18644。将在液体选择培养基中呈现抗性的胚培养在MMW+IAA(0.25-4mg/L)+TDZ(1mg/L)+AgNO₃(5mg/L)中。抗性芽经分离后培养在B5+GA+卡那霉素(100mg/L)或MMW+卡那霉素(100mg/L)中以产生枝条。表13表示由具有抗性部分的胚再生出来的抗性芽。因此，G418液体培养基中的筛选是有效的。

表13.有关抗性芽产生的G418液体培养基的筛选效率

重复编号	绿色胚或绿岛数	具有抗性芽的胚数
重复编号	绿色胚或绿岛数	具有抗性芽的胚数	重复1	51	40
重复2	25	17	重复1	51	40
重复2	25	17	重复3	1	1
重复4	26	11	重复3	1	1

用PCR分析证实了抗性植株中的nptII基因。随机选取8株植株进行分析，发现其中6株具有nptII基因(表14)。

表14.抗性植株的PCR分析

重复	抗性植株	PCR-nptII阳性
重复	抗性植株	PCR-nptII阳性	重复1	1	1
重复2	1	1	重复1	1	1
重复2	1	1	重复3	2	1
重复4	4	3	重复3	2	1
重复4	4	3	总计	8	6

实验12.草甘膦抗性胚的筛选：用PHP22021和PHP22024轰击预孵育小孢子后在含有0.1mM和0.2mM草甘膦的液体培养基NLN-6.5S中进行筛选

本实验的目的是比较草甘膦浓度对筛选效率的影响。表15表示用0.1mM或0.2mM两种浓度的草甘膦可以鉴定出抗性胚。产生了正常胚和异常胚。尽管用0.1mM和0.2mM两种浓度的草甘膦都可以鉴定出转基因胚，但是用0.2mM筛选得到的假阳性结果较少。它更加有效并且免除了额外的转移。

表15.草甘膦的浓度对抗性胚筛选的影响

质粒	重复编号	草甘膦	板数	胚(正常)数/板	胚(异常)数/板
质粒	重复编号	草甘膦	板数	胚(正常)数/板	胚(异常)数/板	PHP22021	1	0.1mM	12	3	23.8
PHP22021	2	0.1mM0.2mM	66	1.10	10	PHP22021	1	0.1mM	12	3	23.8
PHP22021	2	0.1mM0.2mM	66	1.10	10	PHP22021	3	0.1mM0.2mM	99	0.60.1	0.20
PHP22024	4	0.1mM0.2mM	88	9.80.9	8.41.4	PHP22021	3	0.1mM0.2mM	99	0.60.1	0.20
PHP22024	4	0.1mM0.2mM	88	9.80.9	8.41.4	PHP22024	5	0.1mM0.2mM	76	2.10	2.40
PHP22024	6	0.1mM0.2mM	88	3.41.5	5.93.9	PHP22024	5	0.1mM0.2mM	76	2.10	2.40

实验13.测定渗透培养基中的蔗糖浓度对抗性胚产生的影响

本实验的目的是找出渗透培养基中蔗糖的最佳浓度。

采用17S/10S方案将小孢子培养4-7天。所用的构建体是PHP23560，DNA浓度为28ng/制备物。爆破盘为900psi。将经过轰击的小孢子在含有加倍剂和0.2mM草甘膦的NLN-13S中避光培养7-10天。培养物用不含草甘膦的NLN-0S至含有0.1mM草甘膦的NLN-6.5S进行稀释。经稀释的培养物在光下孵育2-3周。用15％、17％和19％蔗糖产生的绿色胚(正常和异常)数目无显著差异。

重复实验见表16。本实验的结果显示4次实验中17％蔗糖浓度获得的结果与19％蔗糖浓度的相似。

表16.渗透培养基中的蔗糖浓度对抗性胚产生的影响

重复编号	蔗糖浓度	板数	抗性胚/板
重复编号	蔗糖浓度	板数	抗性胚/板	1	17％19％	88	2.31.8
2	17％19％	16	01	1	17％19％	88	2.31.8
2	17％19％	16	01	3	17％19％	66	2.71.8
4	17％19％	78	5.13.9	3	17％19％	66	2.71.8
4	17％19％	78	5.13.9	总计	17％19％		2.52.1

实验14.测定渗透处理时间对抗性胚产生的影响

本实验的目的是测定在渗透培养基中培养4小时或20小时是否导致数目更多的转基因事件。

所用的构建体是PHP21965。将小孢子预孵育6-7天，然后用25μMNitex^TM筛收集。随后将收集到的小孢子加到孔径为20μm的Nitex^TM筛中。轰击后，将经过轰击的小孢子和Nitex^TM筛在渗透培养基B5+1g/L MES+190g/L蔗糖+12g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH 5.8-6.0)上培养4小时或20小时。表17显示处理小孢子4小时产生的抗性胚数与处理小孢子20小时的相当。

表17.渗透处理时间对抗性胚产生的影响

重复编号	渗透时间	轰击前数目	抗性胚数
重复编号	渗透时间	轰击前数目	抗性胚数	1	4小时44小时	84	71
2	4小时20小时	88	811	1	4小时44小时	84	71
2	4小时20小时	88	811	3	4小时20小时	88	204
4	4小时20小时	88	710	3	4小时20小时	88	204
4	4小时20小时	88	710	5	4小时20小时	88	2740
累计	4小时20小时(包括44小时)	4137	69(1.7/轰击)66(1.8/轰击)	5	4小时20小时	88	2740

实验15.测定爆破盘强度对抗性胚产生的影响

本实验的目的是比较650psi和900psi爆破盘强度对抗性胚产生的影响。构建体PHP23560用于轰击。共进行了9次实验，以对650psi和900psi强度的爆破盘进行比较。650psi和900psi强度的爆破盘之间未发现显著差异(表18)。爆破盘650psi比900psi爆破盘易于使用，因为只需要较少时间便可达到氦气压力。

表18.爆破盘强度对抗性胚产生的影响

重复编号	爆破盘	轰击次数	抗性胚数
重复编号	爆破盘	轰击次数	抗性胚数	1	650900	88	2117
2	650900	94	15	1	650900	88	2117
2	650900	94	15	3	650900	87	1020

4	650900	88	1613
4	650900	88	1613	5	650900	88	85
6	650900	88	63	5	650900	88	85
6	650900	88	63	7	650900	88	01
8	650900	88	13	7	650900	88	01
8	650900	88	13	9	650900	76	42
累计	650900	7265	67(0.93/轰击)69(1.06/轰击)	9	650900	76	42

实验16.PCR分析证实通过轰击预孵育小孢子产生转基因植株

在33次转化实验中，用PCR分析证实125株抗性植株呈阳性。平均每次实验产生3.8株转基因植株(表19)。PHP22024和PHP22021的数据包括用DNA表达盒和完整质粒两种情况所得出的数据。例如，在PHP22024下所列的13次实验中，9次是用质粒进行的，而4次是用表达盒进行的。GAT阳性植株的数目分别为55和34。

表19.抗性植株的PCR分析结果

实验17.GAT转基因植株的转基因拷贝数分析

被鉴定为草甘膦抗性的转基因(T1)植株用DNA印迹杂交分析法进行分析。用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液提取植物基因组DNA(Rogers等，(1994)Plant Molecular Biology Manual，第二版，1：1-8)。DNA样品用Bam HI或Pst I消化。杂交探针是GAT基因。按照Rajasekaran等人的方法((2000)Plant Cell Rep.19：539-545)进行杂交。对于每次消化，采用杂交印迹，由数目最多的条带确定GAT基因拷贝数。例如，如果对于一次事件从Bam HI和Pst I印迹只产生一个条带，则表明该事件具有1个拷贝的GAT基因。42次事件的结果显示17次事件(或40％)仅有1个拷贝的GAT基因(表20)。

表20：GAT转基因植株的转基因拷贝数分析

本说明书中所提及的所有出版物和专利申请代表着本发明所属领域技术人员的水平，并且通过引用结合到本文中。

虽然为了清楚理解本发明，本发明之前已通过示例和实施例进行了一些详述，但是显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些变动和修改。

方案

预孵育小孢子的产生

按照本领域技术人员已知方法培养小孢子，例如参见Fukuoka等(1996)Plant Physiol.111：39-47；Keller等(1987)Proc.7^th Int.RapeseedCongr.(Plant Breeding and Acclimatization Institute，Poznan，Poland)第152-157页，Swanson等(1987)Plant Cell Reports 6：94-97和Baillie等(1992)Plant Cell Reports 11：234-237。详细方法如下：

在对小孢子培养敏感和再生敏感的芸苔属品种(例如46A65、Westar或Topas)在单核小孢子期收集大约400个芽。将芽放入5％次氯酸钠溶液(100％商用漂白溶液)中消毒，并放置15-20分钟。将芽放入无菌水中5分钟以漂净漂白液。重复该步骤多两次。取芽放入搅拌杯中，加入20-25ml B5-W后低速搅拌8秒钟。将内容物通过2个嵌套44μm Nitex过滤器过滤到50ml离心管中。用20-25ml B5-W洗涤过滤器，盖上离心管，以约1,000转/分钟(rpm)离心6分钟。倾析出B5-W，加入45ml B5-W，离心，再倾析，加入45ml B5-W后离心，共重复洗涤4次。小孢子接种前，采用血细胞计数器用NLN-17S调节小孢子密度至100,000个小孢子/ml。将小孢子悬液按6ml/板接种到9cm板上。将各板(大约40个)在31.5℃下培养2-3天，然后在NLN-10S中培养。将各板在25℃下再培养3-4天。

粒子轰击

粒子轰击方法为本领域技术人员所知。购买粒子枪时会提供详细的说明书和步骤。例如，参见生物射弹PDS-1000/He粒子递送系统(Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System)指南。更多文献可参见Sanford等，美国专利第4,945,050号；Tomes等，美国专利第5,879,918号；Tomes等，美国专利第5,886,244号；Bidney等，美国专利第5,932,782号；Tomes等(1995)“Direct DNA Transfer into Intact PlantCells via Microprojectile Bombardment(通过微弹轰击指导DNA转移到完整植物细胞内)”，载于Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)和McCabe等(1988)Biotechnology 6：923-926。详细步骤如下：

金颗粒的等分

使用直径为0.6微米的250mg金颗粒。加入1000μl EtOH并用超声处理5-8秒钟。将金悬液分为两管(各500μl)(Fisher 05-541-27)。离心(13,000rpm)1分钟，用吸液管吸出EtOH。用1ml无菌蒸馏水洗涤三次。金沉淀用1000μl EtOH洗涤，用吸液管吸出EtOH。向各管中加入800μl EtOH，使金颗粒悬浮。将16只管(Fisher 05-541-27)称重。将100μl金悬液等分至各管中。离心30秒钟，用吸液管吸出EtOH。干燥1小时，将管/金称重以计算各管中的金重量。向各管加入无菌水调节金浓度至3mg/50μl。用吸液管吸取-释放使金颗粒悬浮，进行超声处理(3秒钟)。将金悬液按50μl/管(3mg/管)等分到新的1.5ml管中。保存于-20℃冰箱内。

将DNA包被在金颗粒上

每枪金颗粒的量为100μg/枪(3mg/30枪)。将3pg DNA/bp/制备质粒DNA、50μl CaCl₂(2.5M，等分成小体积)、20μl亚精胺(0.1M，游离碱，等分为小体积)加到金颗粒等量管中。加入每一种成分后用吸液管吸打30-50次。在涡旋振荡器中振荡3分钟。以10,000rpm离心10秒钟，弃去上清液。缓慢加入200μl 100％EtOH，放置在冰浴中10分钟，弃去上清液。用200μl 100％EtOH缓慢洗涤两次，弃去洗涤液。加入150μl 100％EtOH。用10μl吸液管头使金沉淀悬浮。将金颗粒充分悬浮。超声处理31/2 dips以使小沉淀破碎。将巨载体盘(macro-carrierdisc)放入70％EtOH中消毒最少10分钟。转移到100％EtOH后在超净工作台中干燥。将5μl包被有DNA的金颗粒悬液加到无菌巨载体盘的中央并干燥至少0.5小时。

生物射弹枪操作

可通过将微载体发射装配件(microcarrier launch assembly part)、巨载体固定器、爆破保持盖(rupture retaining cap)、巨载体、培养皿固定器和终止屏(stopping screen)浸泡在70％EtOH中(或用70％EtOH喷洒)15分钟并在超净工作台上进行干燥灭菌，或者可通过高压灭菌进行灭菌。可将爆破盘放入50％异丙醇中消毒10-30秒钟。喷洒70％EtOH对枪膛(chamber)消毒。建立大于爆破盘的氦气压力。装填带有盖和微载体发射组件的爆破盘，并装配到枪膛中。将微载体发射组件放在顶部下第一个槽中。将样品安置在培养皿固定器的第三槽上。关闭枪膛。将基因枪的真空开关设在VAC位置。一旦达到真空水平，或者超过27英寸Hg，便将真空开关设在HOLD位置。按下FIRE开关不放直到爆破。迅速松开点火开关，将VACUUM转到VENT位置。释放真空后，取出样品和微载体发射组件。重复直到完成对所有样品的轰击。

预孵育小孢子的轰击与筛选

采用NLN-17S/10S方案培养小孢子6-8天。用孔径为25μm的Nitex尼龙筛收集小孢子。将小孢子转移到一块Nitex尼龙筛上，用额外的培养基渗入滤纸。将小孢子和Nitex转移到渗透培养基(B5+17％蔗糖+1g/L MES+0.8％脱乙酰吉兰糖胶，pH 6.0)上，处理至少1小时。用爆破盘650psi或900psi轰击样品。使样品留在渗透培养基上至少4小时。将小孢子和Nitex转移到NLN-13S中。加入染色体加倍剂。培养基不含选择剂(nptII选择)或含有0.1-0.2mM草甘膦(GAT选择)。各板(9cm)装有5ml培养基和一块小孢子/Nitex。将经过轰击的小孢子于25℃避光培养7天。如果用nptII基因作为选择标记，则将原培养基更换为10ml NLN-6.5S与最终浓度的NAA0.5BAP0.05+G418(10mg/L)，或者如果用gat基因作为选择标记，则加入5ml NLN-0S与草甘膦0.1-0.2mM。在光下培养2周。

植物再生

将绿色胚或组织在含有25mg/L卡那霉素或0.1mM草甘膦的MMW+IAA2+TDZ0.5+STS6中培养4周(STS6为浓度为6μM的硫代硫酸银)。分离出再生芽，在MMW+BAP0.2或B5+GA与50mg/L卡那霉素或0.1mM草甘膦中进行培养。切取枝条并转移至含有25mg/L卡那霉素或B5+GA与0.1mM草甘膦的生根培养基1/2MMW+1％蔗糖+IBA2中。

将抗性植株移栽到土壤中以及PCR分析

当根充分发育后，将抗性植株移栽到36区浅苗床(36-cell flat)的土壤中。为了保持湿度，在顶部加盖，为时1周或者直到枝条自身在土壤中伸展。用得自西格玛公司(Sigma)的PCR试剂盒(REDExtract-N-Amp植物PCR试剂盒)，通过PCR分析测定转基因。须将转基因植株标注为“转基因”或“GMO”。

GUS分析

GUS分析为本领域技术人员所知。该方案可参照多种参考文献，例如Wu H，McCormac AC，Elliott MC，Chen DF(1998)Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspension culturesof barley(Hordeum vulgare)(土壤杆菌介导的大麦(Hordeum vulgare)细胞悬液培养物的稳定转化)。Plant Cell Tissue and Organ Culture54：161-171。

GAT和NPTII基因的PCR分析

PCR分析为本领域技术人员所知。该方案可参照多种参考文献。例如，按照以下文献进行nptII基因的PCR分析：Broothaerts W，Wiersma PA，Lane WD((2001)Multiplex PCR combining transgene andS-allele control primers to simultaneously confirm cultivar identity andtransformation in apple(结合转基因和S-等位基因控制引物的多重聚合酶链式反应以同时证实苹果栽培种的特性和转化)，Plant Cell Rep20：349-353)。

按照Sigma^TM技术公报代码(Technical Bulletin Code)MB-850并应用REDExtract-N-Amp^TM植物PCR试剂盒提取植物DNA。对于GAT基因扩增，温度循环为95℃，2分钟；(94℃，30秒钟；64℃，30秒钟；72℃，30秒钟)共35次循环；75℃，5秒钟，或者对于nptII基因，为95℃，2分钟；(95℃，15秒钟；60℃，30秒钟；72℃，30秒钟)共35次循环；75℃，5秒钟。

产物大小

GAT4604和4618：317bp；GAT4621：255bp；NPTII：700bp。

PCR反应

试剂	体积
试剂	体积	水	5.2μl
REDExtract-N-Amp PCR反应混合物	10μl	水	5.2μl
REDExtract-N-Amp PCR反应混合物	10μl	引物-F(10pM/μl)	0.4μl
引物-R(10pM/μl)	0.4μl	引物-F(10pM/μl)	0.4μl
引物-R(10pM/μl)	0.4μl	叶盘提取物	4μl
总体积	20μl	叶盘提取物	4μl

DNA印迹杂交分析

DNA印迹杂交分析为本领域技术人员所知。参见例如Rajasekarran等(2002)Plant Cell Rep.19：539-545。

培养基配方

MMW

MS盐和有机物(Murashige和Skoog 1962 Physiol.Plant.15：473-479)

蔗糖(3％)

MES(2g/L)

西格玛公司的琼脂#1296(0.6％)pH 5.8

MMW+IAA+TDZ+AgNO₃+Gly

MMW

IAA(2mg/L)

TDZ(0.5mg/L)

硝酸银(5mg/L)

草甘膦(0.1mM)

MMW+BAP+Kan 25-50

MMW

BAP(4mg/L)

卡那霉素(25-50mg/L)

MMW+kan 50-100

MMW

卡那霉素(50-100mg/L)

B5

B5维生素和矿物质(Gamborg等(1968)Exp.Cell Res.50：151-158)

蔗糖(2％)

西格玛公司的琼脂(0.6％)

pH 5.8

B5+GA+Gly

B5

GA3(0.1mg/L)

草甘膦(0.1mM)

B5-W

B5(无琼脂)

蔗糖(130g/L)

NLN

各成分参见Lichter(1982)Z Pflanzenphysiol 105：427-434，其中不含马铃薯培养液和植物生长调节剂。培养基pH为6.0。

NLN-17S，NLN-10S，NLN-6.5S

NLN含有17％、10％或6.5％蔗糖

用于预孵育小孢子的渗透培养基

B5

蔗糖170g/L

MES(1g/L)

植物凝胶(Phytagel)(8-16g/L)

pH：6.0

生根培养基(1/2MMW+1％蔗糖+2IBA)

1/2MMW

蔗糖(10g/L)

IBA(2mg/L)

*商品名

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Claims

1.一种通过粒子轰击产生转化芸苔属细胞的方法，该方法包括：

(a)在轰击前，将由预孵育小孢子衍生的外植体在质壁分离的条件下培养约0.5小时至约4小时，所述外植体包含细胞；

(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入外植体表面上暴露的细胞内，其中所述外植体处于质壁分离的条件下；和

(c)在质壁分离的条件下，将外植体继续培养约4小时至约20小时，以产生转化的芸苔属细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述质壁分离的条件选自(a)在渗透培养基上培养外植体，和(b)在湿滤纸上培养外植体。

3.权利要求1的方法，其中所述外植体是预孵育小孢子。

4.权利要求1的方法，其中所述外植体是由预孵育小孢子衍生的胚。

5.权利要求1的方法，其中所述外植体是由预孵育小孢子衍生的下胚轴。

6.权利要求1的方法，该方法还包括由转化细胞再生出转化植物的步骤，该步骤包括：

(a)在再生培养基上培养所述小孢子衍生的外植体以产生再生胚或组织；和

(b)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

7.一种通过权利要求6的方法所产生的稳定转化的植物或其子代。

8.权利要求7的稳定转化的植物或其子代，其中所述植物选自甘兰型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、野甘蓝(Brassica oleracea)、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)和黑芥(Brassica nigra)。

9 一种通过权利要求6的方法由稳定转化的植物或其子代产生的植物细胞。

10.权利要求9的植物细胞，其中所述植物或其子代选自甘兰型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、野甘蓝、埃塞俄比亚芥和黑芥。

11.权利要求8的植物或其转化子代，其中所述植物或其子代是甘兰型油菜。

12.一种通过权利要求1的方法产生的植物细胞。

13.权利要求12的植物细胞，其中所述植物细胞选自甘兰型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、野甘蓝、埃塞俄比亚芥和黑芥。

14.权利要求13的植物细胞，其中所述植物细胞是甘兰型油菜植物细胞。

15.一种产生稳定转化的芸苔属植物的方法，该方法包括：

(a)通过微弹轰击将DNA构建体导入预孵育小孢子内；

(b)培养预孵育小孢子以产生胚或组织；和

(c)由胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

16.权利要求15的方法，其中步骤(a)中，在轰击前，将新鲜小孢子在培养基中培养一段时间以产生预孵育小孢子，其中所述一段时间在约2天至约10天的范围内。

17.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前、轰击期间及轰击后诱导预孵育小孢子质壁分离的步骤。

18.权利要求17的方法，其中所述诱导质壁分离的步骤选自(a)在轰击前、轰击期间及轰击后，在渗透培养基上培养预孵育小孢子，和(b)在轰击前、轰击期间及轰击后，在湿滤纸上培养预孵育小孢子。

19.权利要求18的方法，其中将所述预孵育小孢子在渗透培养基上在轰击前大约培养0.5小时至4小时，在轰击后大约培养4小时至20小时。

20.权利要求15的方法，该方法还包括轰击后的筛选步骤，该步骤包括将经过轰击的预孵育小孢子在培养基中或在培养基上进行培养，所述培养基含有针对DNA构建体编码基因的选择剂。

21.权利要求15的方法，其中所述选择剂选自卡那霉素、G418和草甘膦。

22.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前使预孵育小孢子定向以便在轰击期间使小孢子表面暴露出来的步骤。

23.权利要求15的方法，该方法还包括在轰击前收集有存活力和胚发生的预孵育小孢子的步骤。

24.权利要求23的方法，其中所述预孵育小孢子的收集步骤选自过滤步骤和珀可梯度离心步骤。

25.权利要求15的方法，其中在步骤(a)中，微弹轰击是用包含约12.5ng-5μg所述DNA构建体的轰击因子进行的，每枪约15μg-100μg金颗粒，大小为0.4微米至0.6微米，约2.5M CaCl₂和650-900psi爆破盘。

26.权利要求15的方法，其中再生出稳定转化植物的步骤包括将经过轰击的预孵育小孢子在第一液体选择培养基中培养第一段时间，在第二液体选择培养基中培养第二段时间，然后将由预孵育小孢子衍生的精选的胚或组织转移到固体培养基上培养第三段时间。

27权利要求15的方法，该方法还包括使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体转基因植物。

28.一种通过粒子轰击产生稳定转化的芸苔属植物的方法，该方法包括：

(a)在轰击前，将小孢子衍生胚在渗透培养基上培养约0.5小时至约4小时；

(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入小孢子衍生胚在渗透培养基上的暴露面；

(c)将经过轰击的小孢子衍生胚在渗透培养基上继续培养约4小时至约20小时；

(d)在再生培养基上培养所述经过轰击的小孢子衍生胚以产生再生胚或组织；和

(e)由再生胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

29.权利要求28的方法，其中所述小孢子衍生胚大约生长了11天至20天。

30.权利要求28的方法，该方法还包括在步骤(a)之前，用吸液管收集胚并将胚转移到滤纸上的步骤。

31.权利要求28的方法，其中步骤(d)包括将胚在液体培养基中培养第一段时间，然后在固体培养基上培养第二段时间。

32.权利要求28的方法，该方法还包括从再生胚切取下胚轴并且在再生培养基上培养下胚轴的任选步骤。

33.权利要求28的方法，该方法还包括筛选转化胚的步骤，该步骤包括将胚在补充了针对DNA构建体编码基因的选择剂的培养基中或培养基上进行培养。

34.权利要求28的方法，该方法还包括使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体转基因植物。

35.一种通过粒子轰击产生稳定转化的芸苔属植物的方法，该方法包括：

(a)在轰击前，将小孢子衍生下胚轴在渗透培养基上培养约0.5小时至约4小时；

(b)通过微弹轰击将DNA构建体导入小孢子衍生下胚轴在渗透培养基上的暴露面；

(c)将经过轰击的小孢子衍生下胚轴在渗透培养基上继续培养约4小时至20小时；

(d)在再生培养基上培养所述小孢子衍生下胚轴以产生再生胚或组织；和

(e)由所述胚或组织再生出稳定转化的芸苔属植物。

36.权利要求35的方法，其中所述小孢子衍生下胚轴是从约21至26天的小孢子衍生胚切取的。

37.权利要求35的方法，该方法还包括在轰击前将小孢子衍生下胚轴在细胞分裂诱导培养基上培养约1-20小时的步骤，所述培养基中含有植物生长调节剂。

38.权利要求35的方法，其中步骤(d)包括将胚在第一固体培养基上培养第一段时间，然后在第二固体培养基上培养第二段时间。

39.权利要求38的方法，其中这两种固体培养基均含有植物生长调节剂，或者其中一种含有植物生长调节剂。

40.权利要求35的方法，该方法还包括筛选转化胚或组织的步骤，该步骤包括将胚或组织在补充了针对DNA构建体编码基因的选择剂的培养基上进行培养。

41.权利要求35的方法，该方法还包括使用染色体加倍剂来产生加倍单倍体转基因植物。