KR20150096739A - 효율적이고 고 처리량 트랜스제닉 현상 생성을 위한 개선된 분열 종자 대두 형질전환 - Google Patents

Abstract

배축의 일부가 보존된 분열 대두 종자를, 트랜스진을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스로 감염시키는 것을 포함하는, 대두의 아그로박테리움-매개된 생식세포계 형질전환 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 선택 배지 상에서 시험관 내에서 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 형질전환으로부터 생성된 외식편을 재생시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

Description

효율적이고 고 처리량 트랜스제닉 현상 생성을 위한 개선된 분열 종자 대두 형질전환 {IMPROVED SPLIT SEED SOYBEAN TRANSFORMATION FOR EFFICIENT AND HIGH-THROUGHPUT TRANSGENIC EVENT PRODUCTION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2012년 12월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 61/739,349를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

서열 목록의 공식 사본은 2013년 12월 10일에 새롭게 작성된 19,301 바이트 크기의 파일명 "73502_ST25.txt"을 수반한 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통하여 전자적으로 제출되고, 본 명세서와 동시에 출원된다. 이러한 ASCII 포맷 문서에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용은 일반적으로, 식물 육종에 관한 것이다. 대두를 형질전환시키는 방법이 제공된다. 본 개시내용의 방법은 대두의 효율적이고 고 처리량 트랜스제닉 생성 및 트랜스제닉 대두 생성물의 상업적 개발에 유용하다.

대두 [글리시네 맥스 (Glycine max)]는 연간 수확량이 2억 톤을 초과하는, 전 세계적으로 400억 달러를 초과하는 것으로 추정되는 값어치로, 가장 중요한 농업 작물 중 하나이다. 대두는 전 세계적으로 모든 지방 종자 생산의 97% 초과를 차지한다. 따라서, 이러한 가치있는 작물의 품질과 수확량을 개선하는 것으로 믿을 수 있고 효율적인 방법이 중요한 관심사이다.

대두 재배종의 대부분이 단지 소수의 모친 계통으로부터 유래되어, 육종을 위해 협소한 생식질 기저를 초래하기 때문에, 대두를 개선하기 위한 전통적인 육종 방법은 제한되어 왔다 [Christou et al., TIBTECH 8:145-151 (1990)]. 현대 연구 노력은 대두 생산을 개선시키는 식물 유전 공학 기술에 초점을 맞추고 있다. 트랜스제닉 방법은 목적 유전자를 농작물의 유전 생식세포계 내로 도입하여 우량 식물 계통을 생성시키도록 설계된다. 이러한 접근 방식은 영양 가치를 향상시키면서 질병, 곤충 및 제초제에 대한 다른 여러 농작물의 저항성을 성공적으로 증가시켜 왔다.

유전자를 식물 조직 내로 전이시키기 위한 여러 방법이 개발되었는데, 이러한 방법은 고속 미소발사, 미세주사, 전기천공 및 직접 DNA 흡수를 포함한다. 관심 유전자를 대두 내로 도입하기 위하여, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 유전자 형질전환이 최근에 사용되었다. 그러나, 대두는 트랜스제닉 공학에 대해 어려운 과제 시스템인 것으로 입증되었다. 대두 외식편의 효율적인 형질전환과 재생은 달성하기가 곤란하고, 자주 반복하기가 어렵다.

토양에서 서식하는 병원성 박테리아인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 T-DNA로 불리우는 그의 DNA를 숙주 식물 세포 내로 전이시킬 수 있고, 박테리아의 영양에 유용한 대사물을 생산하도록 숙주 세포를 유도시킬 수 있는 고유 능력을 지니고 있다. 재조합 기술을 이용하여, 이러한 T-DNA의 일부 또는 전부를 관심 유전자(들)로 대체시켜, 숙주 식물을 형질전환시키는 데 유용한 박테리아성 벡터를 창출시킬 수 있다. 아그로박테리움-매개된 유전자 전이는 전형적으로, 조직 배양물 중의 미분화 세포를 대상으로 한 것이지만, 식물의 잎 또는 줄기로부터 취한 분화 세포를 대상으로 할 수도 있다. 대두의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 수많은 과정이 개발되었는데, 이는 형질전환시킨 외식편 조직에 근거하여 대략적으로 분류될 수 있다.

미국 특허 번호 7,696,408 (Olhoft, et al.)에는 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 둘 다를 형질전환시키기 위한 떡잎 마디 방법이 개시되어 있다. 이러한 "떡잎 마디" 방법은 떡잎 마디 바로 아래를 절단함으로써 5 내지 7일생 대두 묘목으로부터 하배축(hypocotyl)을 제거하는 단계, 나머지 하배축 절편을 떡잎으로 분열 및 분리시키는 단계, 및 떡잎으로부터 상배축(epicotyl)을 제거하는 단계를 포함한다. 떡잎 외식편은 곁눈 및/또는 떡잎 마디의 영역에 상처를 내고, 아그로박테리움 투메파시엔스와 함께 5일 동안 암실에서 배양한다. 상기 방법을 위해서는, 종자를 시험관내 발아시켜야 하고, 상처를 내는 단계로 인해 상당한 변동성이 도입된다.

미국 특허 번호 6,384,301 (Martinelli et al.)에는 대두 종자로부터 절제된 대두 배아로부터의 생 분열 조직 내로 아그로박테리움-매개된 유전자 전달한 다음, 이러한 분열조직 외식편을 선택 제제 및 호르몬과 함께 배양하여 싹 형성을 유도시키는 것이 개시되어 있다. "떡잎 마디" 방법과 마찬가지로, 분열조직 외식편은 감염시키기 이전에 상처를 내는 것이 바람직하다.

미국 특허 번호 7,473,822 (Paz et al.)에는 "반-종자 외식편" 방법으로 불리우는 변형된 떡잎 마디 방법이 개시되어 있다. 성숙한 대두 종자가 흡수되게 하고, 표면 멸균시키며, 제(hilum)를 따라 분열시킨다. 감염시키기 이전에, 배축(embryonic axis) 및 싹를 완전히 제거하지만, 다른 상처는 전혀 내지 않는다. 아그로박테리움-매개된 형질전환이 진행되고, 잠재적 형질전환체를 선택하며, 외식편을 선택 배지 상에서 재생시킨다.

이들 방법을 이용하는 경우에 형질전환 효율은 여전히 비교적 낮은데, "떡잎 마디" 방법의 경우에는 대략 0.3% 내지 2.8%이고, "분열조직 외식편" 방법의 경우에는 1.2% 내지 4.7%이며, "반-종자 외식편" 방법의 경우에는 3.2% 내지 8.7% (전반적으로 4.9%)이다. 관련 기술분야에서는 대략 3%의 형질전환 효율이 전형적이다.

개선된 "분열-종자" 트랜스제닉 프로토콜은 트랜스제닉 대두 생성물의 향후 생산과 개발을 가속시킬 수 있다. 트랜스진을 대두 조직 내로 안정적으로 통합시키기 위한 효율적이고 고 처리량 방법은 육종 프로그램을 촉진시킬 것이고, 작물 생산성을 증가시킬 수 있는 잠재력을 지니고 있다.

본 개시내용은 식물 세포를 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시내용은 분열 대두 종자의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 이용하여 대두 (글리시네 맥스)를 형질전환시키는 방법에 관한 것인데, 이러한 분열 대두 종자는 배축의 일부를 보유하고 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대두 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성하는 단계; 배축의 일부를 포함하는 제1 떡잎 절편에 아그로박테리움을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계; 및 이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여, 배축의 일부를 포함하는 떡잎 절편을 형성하는 단계; 이러한 배축의 일부를 포함하는 떡잎 절편에 아그로박테리움을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계; 이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계; 및 상기 배양되고 접종된 떡잎 절편으로부터 완전하고 생식력이 있는 식물을 생성시키며, 여기서 완전하고 생식력이 있는 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

도 1은 대두 종자의 평면도이다.
도 2는 도 1의 대두 종자의 측면도이다.
도 3은 도 1에서 라인 3-3을 따라 취한 대두 종자의 단면의 정면도이다.
도 4는 대두 종자의 배축의 일부와 맞물린 절삭 도구를 도시하는, 도 3과 유사한 도면이다.
도 5는 대두의 세로 축을 따라 대두 내로 삽입된 절삭 도구를 도시하는, 도 1에서 라인 5-5를 따라 취한 대두 종자의 단면의 정면도이다.
도 6은 한 쌍의 떡잎 절편의 평면도이다.
도 7은 특별한 실시양태에 따라서, 대두 외식편의 아그로박테리움-매개된 형질전환에 사용될 수 있는 구조물인 pDAB9381의 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
도 8은 pDAB107533의 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
도 9는 다양한 비율의 글리포세이트가 제공된 떡잎의 적어도 절반에 황변을 나타내는 외식편의 비율을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 10은 pDAB105958의 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
서열 목록
수반되는 서열 목록에 열거된 핵산 서열은 37 C.F.R. § 1.822에 정의된 바와 같은, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 이용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 한 가닥 만이 제시되지만, 상보성 가닥은 디스플레이된 가닥에 대한 어떠한 언급에 의해서도 포함되는 것으로 이해된다. 수반되는 서열 목록에서:
서열 1은 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB9381 내의 YFP 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.
서열 2는 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB9381 내의 PAT 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.
서열 3은 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB107553 내의 DGT-28 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.
서열 4는 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB107553 내의 PAT 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.
서열 5는 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB105958 내의 HPT 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.
서열 6은 본 개시내용에 사용하기 위한, 플라스미드 구조물 pDAB105958 내의 PAT 식물 전사 단위 (PTU)를 나타낸다.

본원에는 대두의 효율적이고 고 처리량 형질전환을 위한 방법이 개시되어 있다. 이와 같이 개시된 대두 형질전환 방법의 개발로 인해, 형질전환 빈도가 기존의 공지된 방법에 비해 상당히 개선되었고, 20.3%까지의 형질전환 빈도가 초래되었다. 이러한 신규 대두 형질전환 시스템은 다른 방법, 즉 "떡잎 마디" 방법 및 "반-종자 외식편" 방법 보다 약 3배 내지 8배 더 효율적이고, 트랜스제닉 대두 식물의 상업적 개발을 향상시키기 위한 토대로서 제공된다.

일반적으로, 본 개시내용의 실시양태는 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 형질전환 방법에 관한 것이다. 이러한 신규 방법은 다른 공지된 형질전환 방법의 개선책이고, 이로 인해 트랜스제닉 대두 식물이 효율적으로 생산된다.

특정 실시양태에서, 대두를 트랜스진으로 형질전환시키는 신규 방법이 개시된다. 이 방법의 실시양태는 대두 종자를 세로로 분열시켜 분열 대두 종자를 수득하는 것을 포함하며, 여기서 분열 대두 종자에 배축의 일부는 여전히 부착되어 있다. 그 다음, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자를, 형질전환 방법을 이용하여 하나 이상의 트랜스진으로 형질전환시킨다. 대두 형질전환체는 배축의 일부를 포함하는 형질전환된 분열 대두 종자로부터 선택된다.

본 개시내용의 한 실시양태에서, 대두 종자를 분열시키기 전에, 이러한 대두 종자가 흡수되게 한다. 대두 종자가 14 내지 16시간 동안 흡수되게 할 수 있다. 또한, 대두 종자가 다른 또 다른 기간 동안 흡수되게 할 수 있다. 예를 들어, 대두 종자가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 동안 흡수되게 할 수 있다.

본 개시내용의 제2 실시양태에서, 대두 종자는 이러한 대두 종자의 제를 따라 세로로 분열된다.

한 실시양태에서, 대두 종자는 배축이 대두 종자의 마디 끝에 여전히 부착되도록 분열된다. 대두 종자와 함께 보존되는 배축은 배축 종자 구조의 어떠한 부분도 포함할 수 있다. 따라서, 대두 종자를 분열시키는 동안 보존되는 배축의 어떠한 부분이나 양도 본 개시내용의 범위 내에 있다. 실시양태는 어느 완전한 길이의 부분 또는 어느 일부 부분 또는 배축을 포함하는 대두 종자의 분열시 보존되는 배축의 어떠한 부분도 포함한다. 예를 들어, 대두 종자를 분열시킬 때 배축의 ¼, ⅓, ½, ⅔, ¾, 또는 전체 배축이 보존될 수 있다.

추가 실시양태에서, 배축의 일부가 보존된 분열 대두 종자는 이러한 분열 대두 종자에, 구조물 내에 하나 이상의 트랜스진을 정착시킨 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 접종함으로써 형질전환시킨다. 부가 실시양태는 다른 형질전환 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고속 미소발사-매개된 형질전환 방법, 미세주사-매개된 형질전환 방법, 전기천공-매개된 형질전환 방법 또는 직접 DNA 흡수-매개된 형질전환 방법, 또는 다른 모든 식물 형질전환 방법이 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 배축의 일부가 보존된 분열 대두 종자를 형질전환시킴으로써, 트랜스진을 대두 세포 내로 도입시킨다. 이러한 트랜스진을 대두 세포 내에 도입하면, 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환된 대두 식물 세포가 생성될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 하나 이상의 트랜스진을 대두 식물 세포 내로 형질전환시킬 수 있다. 추가 실시양태에서, 트랜스진은 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 및 3' 비-번역 영역을 포함한다. 오픈 리딩 프레임은 유전자를 코딩할 수 있는데, 이러한 유전자는 마커 유전자, 작물학적 유전자, 또는 다른 모든 유형의 유전자이다.

한 실시양태에서, 배축의 일부가 보존된 형질전환된 분열 대두 종자는 항미생물성 선택 제제를 이용하여 선택된다. 항미생물성 선택 제제의 예는 글루포시네이트, 포스피노트리신, 2,4-D, 카나마이신 및 글리포세이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 개시내용의 실시양태는 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자로부터 하나 이상의 외식편을 재생시키는 것에 관한 것이다. 이러한 외식편의 재생은 전형적으로, 선택 배지 상에서 만들어지지만, 관련 기술분야에 공지된 다른 유형의 배지 상에서 만들어질 수 있다. 외식편을 성공적으로 재생시키면, 하나 이상의 싹의 형성이 적당한 배지 상에서 조직 배양 (예를 들어, "배양")에 의해 유도될 수 있다. 본 개시내용의 추가 실시양태로서, 하나 이상의 싹를 배양하여 완전하고 생식력이 있는 대두 식물로 만들 수 있다. 상기 싹는 형질전환된 생식세포계 세포를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 후속 실시양태에서, 완전하고 생식력이 있는 성숙한 대두 식물은 또 다른 대두 식물과 유성 교배시켜 대두 자손 식물을 발생시킬 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 배축의 일부가 부착된 분열 대두 종자를 형질전환시킨 것으로부터 생성된 외식편을 단리하고, 싹 유도 (선택 없이 2주 및 선택을 수반하여 2주), 싹 신장 (선택을 수반함), 및 발근 (선택을 수반하지 않음)을 위해 이를 세포-조직 배지에 진행시킨다. 이들 세포 배양 단계를 통하여 트랜스제닉 대두 외식편을 진행시키면, 트랜스제닉 식물이 생성된다. 트랜스제닉 식물은 분자 분석을 통하여 대두 게놈 내에 안정적으로 통합되는 트랜스진을 함유하는 것으로 확증된다. 이어서, 특이적 트랜스제닉 대두 식물을 온실에서 성숙되도록 성장시킨다. 실험에서는, 떡잎 방법과 유사하게 T1 자손의 45%가, 자손 대두 식물에 유전 가능하였던 트랜스진의 안정적으로 통합된 카피를 보유하는 것으로 밝혀졌다. 트랜스진의 다음 세대로의 유전 가능성은 제초제 리버티(Liberty™)를 이용한 제초제 스크리닝에 의해 및 분자 분석에 의해 확증하였다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대두 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성하는 단계; 배축의 일부를 포함하는 제1 떡잎 절편에 아그로박테리움을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계; 및 이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 제1 떡잎 절편에 접종하기 이전에, 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편으로부터 종피를 제거하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 절삭 도구를 삽입하는 단계 및 배축을 세로로 절단하여 각 떡잎 절편에 배축의 일부를 보존시키는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 대두 종자의 배축은 절삭 도구를 삽입하기 이전의 절단되지 않은 길이를 갖고 있고, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부는 배축의 절단되지 않은 길이의 약 1/3 내지 1/2인 길이를 갖는다. 또한 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부는, 이러한 제1 떡잎 절편에 부착된 배축의 일부가 보존되도록 절단하고, 이와 같이 배축의 보존된 부분은 배축의 절단되지 않은 길이의 약 1/3 내지 1/2인 길이를 갖는다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 대두 종자의 배축은 절삭 도구를 삽입하기 이전의 절단되지 않은 길이를 갖고 있고, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부는 배축의 절단되지 않은 길이와 동등한 길이를 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 절삭 도구를 삽입하는 단계는 대두 종자의 제를 따라 대두 종자를 세로로 절단하는 것을 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 대두 종자의 바깥쪽 표면 상에 제를 위치시키고; 절삭 도구를 삽입하기 이전에 절삭 도구가 상기 제와 정렬되도록 대두 종자에 대해 절삭 도구를 배향시킨다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 각 떡잎 절편은 제의 일부를 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 대두 종자는 제를 통하여 연장되는 세로 축을 갖는데, 이러한 세로 축은 대두 종자를 제1 면과 제2 면으로 나눈다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 절삭 도구를 삽입하기 이전에 대두 종자의 제1 면을 단단히 붙잡고 있다.

후속 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성시키기 이전에, 절삭 도구를 삽입하고, 이러한 절삭 도구를 대두 종자의 배축 내로 진행시키는 것에 관한 것이다. 대체 실시양태에서, 절삭 도구를 삽입하고 이러한 절삭 도구를 배축 내로 진행시키기 이전에, 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성시켜, 배축의 절단되지 않은 길이의 적은 일부 (예를 들어, 약 1/3 내지 1/2)인 길이를 갖는 배축의 일부를 보유하고 있는 제1 떡잎 절편을 생성시킨다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 배양되고 접종된 떡잎 절편으로부터 완전하고 생식력이 있는 대두 식물을 생성시키는 단계를 포함하는데, 이러한 완전하고 생식력이 있는 대두 식물은 트랜스제닉 현상을 포함한다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 완전하고 생식력이 있는 대두 식물은 트랜스제닉 현상을 포함한다. 부가 실시양태에서, 본 개시내용은 완전하고 생식력이 있는 대두 식물의 자손을 생성시키는 것을 포함하는데, 이러한 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하고, 임의로 자손 식물로부터 대두 종자를 생성시키는 것을 포함한다.

상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 현상을 포함하는, 완전하고 생식력이 있는 대두 식물의 자손 식물을 제공하는데, 완전하고 생식력이 있는 대두 식물은 본원에 개시된 방법에 따라서 생성된다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 본 개시내용은 자손 식물로부터 생성된 대두 종자에 관한 것인데, 이러한 대두 종자는 트랜스제닉 현상을 포함한다. 상기 실시양태의 후속 측면에서, 본 개시내용은 완전하고 생식력이 있는 트랜스제닉 대두 식물을 또 다른 대두 식물과 교배시킴으로써 자손 식물을 생성시키는 것에 관한 것이다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 본 개시내용은 완전하고 생식력이 있는 대두 식물와 또 다른 대두 식물과의 교배로부터 자손 종자를 수확함으로써 자손 식물을 생성시키는 것에 관한 것인데, 이러한 자손 종자는 트랜스제닉 현상을 포함한다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 자손 종자를 재식함으로써 자손 식물을 생성시키는 것에 관한 것이다. 상기 실시양태의 후속 측면에서, 본 개시내용은 자손 종자로부터 자손 식물을 성장시킴으로써 자손 식물을 생성시키는 것에 관한 것인데, 이러한 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함한다. 상기 실시양태의 추가 측면에서, 본 개시내용은 보다 이전 세대 자손 식물로부터 다음의 나중 세대 자손 식물을 생성시킴으로써 나중 세대 자손 식물을 생성시키는 것에 관한 것인데, 다음 세대 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 트랜스진은 살충제 저항성 유전자, 제초제 내성 유전자, 질소 이용 효율 유전자, 물 이용 효율 유전자, 영양 품질 유전자, DNA 결합 유전자, 및 선택 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여, 배축의 일부를 포함하는 떡잎 절편을 형성하는 단계; 이러한 배축의 일부를 포함한 떡잎 절편에 아그로박테리움을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계; 이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계; 및 상기 배양되고 접종된 떡잎 절편으로부터 완전하고 생식력이 있는 식물을 생성시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법을 제공한다. 상기 완전하고 생식력이 있는 식물은 트랜스제닉 현상을 포함한다.

추가 실시양태에서, 상기 종자는 쌍떡잎 종자이다.

후속 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 현상을 포함하는 완전하고 생식력이 있는 식물의 자손 식물을 제공한다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 종자는 트랜스제닉 현상을 포함하는 자손 식물로부터 생성될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 트랜스제닉 현상을 포함하는 식물을 성장시키기 위해 사용될 수 있는, 트랜스제닉 현상을 포함하는 종자를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 절삭 도구를 종자의 종피 내로 삽입하면, 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편이 형성된다. 각 떡잎 절편은 배축의 일부를 포함한다.

추가 실시양태에서, 트랜스진은 pat, dgt -28, 또는 hpt 선택 마커 유전자를 포함한다.

달리 표시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 단수형은 하나 이상을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "외식편"은 공여자 식물로부터 (예를 들어, 공여자 종자로부터) 제거 또는 단리되고, 시험관 내에서 배양되며, 적합한 배지에서 성장할 수 있는, 대두 조직의 조각을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, "떡잎"은 일반적으로, 종자 식물의 배아 잎 또는 배아의 "일차 잎"을 지칭한다. 떡잎은 또한, 관련 기술분야에서 "종자 잎"으로서 지칭된다. 대두와 같은 쌍떡잎 종은 2개의 떡잎을 갖는다. 떡잎 절편은 이것이 전체 또는 완전한 떡잎이든지 아니면 떡잎의 단편 또는 일부 부분이든지 간에, 떡잎의 어느 부분을 지칭한다. "떡잎 마디"는 종자 또는 묘목 내의 배아에 대한 떡잎의 부착 지점을 지칭하고, 일반적으로 이러한 부착 지점과 연관된 조직을 지칭할 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단단히 붙잡기"는 대두 종자를 도구 또는 손으로 잡고 있거나 꽉 붙잡는 것을 지칭한다. 대두 종자를 단단히 움켜잡을 수 있게 하는 어떠한 후속 기전이나 작용도 용어 "단단히 붙잡기"의 범위 내인 것으로 간주된다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "절삭 도구"는 종자, 종자 떡잎, 종피, 제, 배축, 또는 다른 모든 종자 구조물을 절단하거나, 잘라 내거나 또는 전단하기 위한 도구를 지칭한다. 절삭 도구는 메스, 면도날, 부엌칼, 칼, 코가타나(kogatana), 조각칼, 낫, 도끼, 대패 등을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 절삭 도구는 자루 또는 손잡이에 부착된 절삭 수단을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 절삭 도구는 다른 구조적 특색에 부착되지 않는 단일 절삭 수단만을 포함할 수 있다. 절삭 도구는 또한, 종자 구조를 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편으로 나누는 데 적합한 레이저 또는 고압 유체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종피"는 종자의 보호 피막으로서 제공되는 배주의 외피를 지칭한다. 종피는 관련 기술분야에 공지된 다른 유사한 용어 이외에, "외종피(testa)" 또는 "겉껍질(husk)"의 또 다른 설명 용어로써 기재될 수 있다. 종피는 소수성 물질, 예컨대 수베린, 쿠틴, 리그닌, 칼로스, 펙틴, 왁스, 및 페놀성 산화의 불용성 산물을 함유할 수 있다. 대두와 같은 콩과 식물에서는, 외종피가 두꺼운 벽이 있는 거대보강 세포(macrosclereid cell)의 책상 조직층을 함유하는데, 그의 캡은 코르크화한 표피 아래로 연장되고, 왁스 표피는 더 두꺼운 코르크질 층 외부에 있다.

본원에 사용된 바와 같은, "하배축"은 떡잎 아래에 있고 뿌리 또는 어린 뿌리 (배아 뿌리) 위에 있는 식물 배아 또는 묘목의 그 부분이다. 종자에서, 하배축은 떡잎 마디 바로 아래에서 발견되고, 이는 "하떡잎 줄기(hypocotyledonous stem)" 또는 "배아 줄기"로서 지칭될 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 하배축은 상기 위치 뿐만 아니라 그 안에서 발견된 조직을 지칭할 수 있다. "상배축"은 떡잎 위에 있고 제1 본 잎(true leaves) 아래에 있는 식물 배아 또는 묘목의 그 부분이다. 종자에서, 상배축은 떡잎 마디 바로 위에서 발견되고, "배아 싹" 또는 "미래의 싹"로서 다양하게 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 상배축은 기재된 바와 같은 위치, 또는 그 안에서 발견된 조직을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "배축" 또는 "배아 축"은 식물의 배아의 주요 부분을 지칭하고, 일반적으로 상배축과 하배축을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전적으로 변형된" 또는 "트랜스제닉" 식물은 형질전환에 의해 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분, 식물 생식질 또는 식물의 게놈 내로 도입되는, 미리 선택된 DNA 서열을 포함하는 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분, 식물 생식질 또는 식물을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "트랜스제닉", "이종", "도입된" 또는 "외래" DNA 또는 유전자는 재조합 DNA 또는 유전자의 수용자인 식물의 게놈에서 자연적으로 발생되지 않거나, 또는 형질전환되지 않은 식물에서 보다는 게놈 내의 상이한 위치 또는 연합에서 수용자 식물에서 발생되는 재조합 DNA 서열 또는 유전자를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "식물"은 완전 식물, 식물 조직, 식물 부분 (화분, 종자, 또는 배아 포함), 식물 생식질, 식물 세포, 또는 식물 군을 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 대두로 제한되지 않지만, 일반적으로 형질전환 기술을 잘 받아들이는 모든 식물 (외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 둘 다 포함)을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "자손"은 트랜스제닉 현상을 포함하는 초기 형질전환체 (T0)로부터 생성되거나 유래되는 (직접적으로 또는 원격으로) 식물, 식물 부분, 식물 조직 또는 식물 종자의 모든 다음 세대를 지칭한다. 자손은 추가로, 역교배, 정방향 육종, 마커 지원형 육종, 또는 초기 형질전환체의 트랜스제닉 현상의 유전자이입을 초래하는 다른 모든 공지된 육종 방법론을 통하여, 식물 개체들 간 또는 식물의 특이적 계통들 간의 교배에 의해 생성되는 식물, 식물 부분, 식물 조직, 또는 식물 종자의 모든 다음 세대 (F1, F2, F3, F4, F5, BC1, BC2, BC3, BC4, BC5 등)를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "형질전환"은 핵산 또는 단편을 숙주 유기체 내로 전이 및 통합시켜, 유전적으로 안정한 유전을 생성시키는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다. 공지된 형질전환 방법은 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)-매개된 형질전환, 인산칼슘 형질전환, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 [예를 들어, 소노포레이션(sonoporation)], 리포솜 형질전환, 미세주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 바이오리스틱스(biolistics) (극미립자 충격), 탄화규소 WHISKERS™ 매개된 형질전환, 에어로솔 비밍(beaming), 또는 PEG 형질전환 뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.

유전적으로 변형된 식물을 생산하는 것과 관련하여, 식물의 유전 공학 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라 외떡잎 식물에 대한 생물학적 및 생리적 형질전환 프로토콜을 포함한, 식물 형질전환을 위한 수많은 방법이 개발되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999)]; [Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]). 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환, 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은, 예를 들어 다음 문헌에서 이용 가능하다 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)].

DNA를 식물 숙주 세포 내로 형질전환시키기 위한 다수의 기술이 이용 가능하다. 이들 기술은 형질전환 작용제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용하여 비-아암 T-DNA로 형질전환시키는 것, 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 소노포레이션), 리포솜 형질전환, 미세주사, 있는 그대로의 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 벡터, 바이오리스틱스 (극미립자 충격), 탄화규소 WHISKERS 매개된 형질전환, 에어로솔 비밍, 또는 PEG 형질전환뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.

예를 들어, DNA 구조물은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 DNA 구조물은 DNA 입자 충격과 같은 바이오리스틱 방법을 이용하여 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 식물 세포 형질전환을 위한 부가 방법은 탄화규소 WHISKERS™ 매개된 DNA 흡수를 통한 미세주사를 포함한다 [Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418]. 또 다른 한편, DNA 구조물은 나노입자 형질전환을 통하여 식물 세포 내로 도입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 12/245,685 참조; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

또 다른 공지된 식물 형질전환 방법은 DNA를 미소발사체의 표면 상에 운반하는, 미소발사체-매개된 형질전환이다. 이러한 방법에서는, 미소발사체가 식물 세포 벽 및 막을 침투하기에 충분한 속도로 이를 가속화시켜 주는 바이오리스틱 장치를 이용하여 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입시킨다 [Sanford et al., Part. Sci . Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol . Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)].

또 다른 한편, 유전자 전이 및 형질전환 방법은 염화칼슘 침전을 통한 원형질체 형질전환, 있는 그대로의 DNA의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개된 또는 전기천공-매개된 흡수 (문헌 [Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722], [Potrykus et al. (1985) Molec . Gen. Genet. 199:169-177]; [Fromm et al. (1985) Proc . Nat. Acad. Sci . USA 82:5824-5828]; 및 [Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 (문헌 [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505])을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위해 광범위하게 활용되고 있는 방법은 아그로박테리움의 자연 형질전환 시스템에 근거하고 있다 [Horsch et al., Science 227:1229 (1985)]. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키기에 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스 각각의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전적 형질전환에 대해 책임이 있는 유전자를 수반한다 [Kado, C. I., Crit . Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)]. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개된 유전자 전이를 위한 방법에 관한 설명은 또한, 예를 들어 문헌 [Gruber et al., 상기 문헌], [Miki et al., 상기 문헌], [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 번호 4,940,838 및 5,464,763에서 이용 가능하다.

아그로박테리움을 상기 형질전환에 사용할 경우, 삽입시키고자 하는 DNA는 특수 플라스미드, 즉 중간 벡터 또는 이원성 벡터 내로 클로닝해야 한다. 중간 벡터는 그 자체가 아그로박테리움에서 복제할 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드를 통하여 (접합) 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 전이될 수 있다. 일본 담배 슈퍼바이너리(Japan Tobacco Superbinary) 시스템이 이러한 시스템의 한 예이다 (문헌 [Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2^nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41]; 및 [Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160]에 의해 고찰됨). 이원성 벡터는 그 자체가 이. 콜라이 (E. coli)와 아그로박테리움 둘 다에서 복제할 수 있다. 이는 선택 마커 유전자, 및 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 프레임되는 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이는 아그로박테리움 내로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters, 1978). 숙주 세포로서 사용된 아그로박테리움은 vir 영역을 수반하는 플라스미드를 포함해야 한다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한, T-DNA의 전이에 필요한 vir 영역을 포함한다. 이러한 vir 영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전이시키는 데 필요하다. 부가의 T-DNA를 함유할 수 있다.

아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 독력 기능은, 식물 세포가 이원성 T DNA 벡터 (문헌 [Bevan (1984) Nuc . Acid Res. 12:8711-8721]) 또는 공동 배양 과정 (문헌 [Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231])을 이용하여 상기 박테리아에 의해 감염되는 경우에, 이러한 식물 세포 DNA 내로 상기 구조물 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥을 삽입하는 것을 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템을 사용하여 쌍떡잎 식물을 조작한다 [Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641]. 아그로박테리움 형질전환 시스템을 또한 사용하여 DNA를 외떡잎 식물 및 식물 세포로 형질전환시킬 수 있을 뿐만 아니라 전이시킬 수 있다 (미국 특허 번호 5,591,616; 문헌 [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041]; [Hooykass Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol . Biol. 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434] 참조).

상기 유전적 구조물을 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 세포는 성장할 수 있고, 싹 및 뿌리와 같은 분화성 조직의 출아시 성숙한 식물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생시키기 위한 방법론은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 문헌 [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers] 및 [Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 발견될 수 있다. 본원에 기재된 유전적으로 변형된 식물은 발효 배지에서 배양하거나 또는 토양과 같은 적합한 배지에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 고등 식물에 적합한 성장 배지는 모든 식물용 성장 배지를 포함할 수 있는데, 이는 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지해주는 다른 모든 미립자 배지 (예를 들어, 질석, 펄라이트 등) 또는 수경 재배 뿐만 아니라 적합한 빛, 물, 및 고등 식물의 성장을 최적화시켜 주는 영양 보충제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 형질전환 기술 중 어느 것에 의해 생성되는 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고 있으므로 목적하는 표현형을 갖는 완전 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지 중의 특정 식물 호르몬의 조작에 좌우되는데, 전형적으로 이는 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입시킨 살생물제 및/또는 제초제 마커에 좌우된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 재생은 또한, 식물 캘러스, 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 수득할 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로, 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기재되어 있다.

달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상의 용어에 관한 정의는, 예를 들어 문헌 [Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8]에서 발견될 수 있다.

형질전환된 세포 또는 조직 또는 식물 부분 또는 식물을 선택하기 위한 리포터 또는 마커 유전자의 사용이 형질전환 벡터 또는 구조물에 포함될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 인지할 것이다. 선택 마커의 예는 항대사제, 예컨대 제초제 또는 항생제에 대한 저항성을 부여해주는 것, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여해주는 디히드로폴레이트 환원효소 (문헌 [Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994]; [Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983]; [Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991] 참조); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (문헌 [Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983] 및 [Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)]) 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (문헌 [Marsh, Gene 32:481-485, 1984]; [Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985]; [Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995] 참조); 세포가 트립토판 대신 인돌을 활용할 수 있게 해주는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 활용할 수 있게 해주는 hisD (문헌 [Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988]); 세포가 만노스를 활용할 수 있게 해주는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627); 오르니틴 데카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴 (DFMO)에 대한 저항성을 부여해주는 오르니틴 데카르복실라제 (문헌 [McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.]); 및 블라스티시딘 S에 대한 저항성을 부여해주는, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 데아미나제 (문헌 [Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995])를 포함한다.

부가의 선택 마커는, 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여해주는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (문헌 [Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988]), 아트라진에 대한 저항성을 부여해주는 돌연변이체 psbA (문헌 [Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993]), 또는 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제(protoporphyrinogen oxidase) (미국 특허 번호 5,767,373 참조), 또는 글루포시네이트와 같은 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 다른 마커를 포함한다. 적합한 선택 마커 유전자의 예는 클로람페니콜에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983]); 스트렙토마이신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987]); 스펙티노마이신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996]); 블레오마이신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990]); 술폰아미드에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990]); 브로목시닐에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Stalker et al., Science 242:419-423, 1988]); 글리포세이트에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [Shaw et al., Science 233:478-481, 1986]); 포스피노트리신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자 (문헌 [DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987]) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

선택적 유전자의 사용을 위한 한 가지 선택 사항은 글루포시네이트-저항성 코딩 DNA이고, 한 실시양태에서는 카사바 베인 모자이크(Cassava Vein Mosaic) 바이러스 프로모터의 제어 하의, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (pat), 옥수수 최적화 pat 유전자 또는 bar 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 비알라포스에 대한 저항성을 부여해준다 (예를 들어, 문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37)]; [Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990]; [Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993]; [White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990]; [Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990]; 및 [Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989] 참조). pat 유전자의 한 버전은 미국 특허 번호 6,096,947에 기재된 옥수수 최적화 pat 유전자이다. 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 또 다른 선택 마커 유전자는 글리포세이트에 대한 저항성을 부여해주는 dgt-28이다. 특별한 실시양태에서, dgt -28은 쌍떡잎 식물에서의 발현을 위해 최적화시킬 수 있다 (예를 들어, US20130205440 참조).

또한, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 세포의 확인을 촉진시켜 주는 마커를 이용할 수 있다. 스코어링 가능하거나 스크리닝 가능한 마커가 유용한데, 여기서는 서열의 존재로 인해 측정 가능한 생성물이 생성되고, 식물 세포의 붕괴를 수반하지 않으면서 상기 생성물이 생성될 수 있다. 그의 예는 β-글루쿠로니다제, 또는 그에 대한 다양한 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 uidA 유전자 (GUS) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,268,463 및 5,599,670); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (문헌 [Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907]); 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 마커는 베타-카로텐 또는 프로비타민 A이다 [Ye et al., Science 287:303-305- (2000)]. 상기 유전자를 사용하여 벼의 영양을 증대시켜 왔지만, 이러한 경우에는 이를 스크리닝 가능한 마커로서 대신 이용하고 있고, 관심 유전자와 연결된 유전자의 존재는 제공된 금색에 의해 탐지된다. 상기 유전자가 식물에 대한 그의 영양적 기여를 위해 사용되는 상황과는 달리, 제조 목적을 위해서는 보다 적은 양의 단백질도 충분하다. 다른 스크리닝 가능한 마커는 일반적으로 안토시아닌/플라보노이드 유전자 (문헌 [Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115-127]에서의 논의 참조)를 포함하는데, 이는 예를 들어, 식물 조직 내에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생성을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (문헌 [Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)]); 플라보노이드 색소의 생합성을 제어하는 유전자, 예컨대 옥수수 C1 유전자 (문헌 [Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179]; [Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48]) 및 옥수수 C2 (문헌 [Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207]); B 유전자 (문헌 [Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183]), p1 유전자 (문헌 [Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591]; [Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553]; [Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999) 39:11-19]); 청동 유전자좌 유전자 (문헌 [Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197]; [Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049])를 포함한다.

적합한 마커의 추가 예는 시안 형광성 단백질 (CYP) 유전자 (문헌 [Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54] 및 [Kato et al. (2002) Plant Physiol. 129: 913-42]), 황색 형광성 단백질 유전자 [에브로젠 (Evrogen)으로부터의 PHIYFP™] (문헌 [Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54] 참조); 루시퍼라제를 코딩하는 lux 유전자 (그의 존재는, 예를 들어 X-선 필름, 신틸레이션 계수, 형광성 분광 광도 측정법, 저-광도 비디오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 멀티웰 발광법을 이용하여 탐지할 수 있음) (문헌 [Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343]); 녹색 형광성 단백질 (GFP) 유전자 (문헌 [Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84]); 및 DsRed2 (여기서, 마커 유전자로 형질전환시킨 식물 세포는 적색이므로, 가시적으로 선택 가능함) (문헌 [Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2):286-293])를 포함한다. 부가 예는 그에 대한 다양한 발색 기질이 공지된 효소 (예를 들어, 발색 세팔로스포린인 PADAC)를 코딩하는 β-락타마제 유전자 (문헌 [Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737]); 발색 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (문헌 [Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101]); α-아밀라제 유전자 (문헌 [Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241]); 및 티로신을 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하여, 결국에는 용이하게 탐지 가능한 화합물 멜라닌을 형성하도록 축합되는 티로시나제 유전자 (문헌 [Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703])를 포함한다. 명백하게도, 이러한 많은 마커는 입수 가능하고, 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

특정의 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열을 임의로, 또 다른 관심 뉴클레오티드 서열과 조합할 수 있다. 용어 "관심 뉴클레오티드 서열"은 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자 뿐만 아니라 전사된 RNA 분자일 수 있는 핵산 분자 (이는 또한, 폴리뉴클레오티드로서 지칭될 수 있음)를 지칭할 뿐만 아니라 전체 유전자를 구성하지 않고 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 프로모터)을 반드시 코딩하지 않는 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 특정의 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 부가의 저항성 또는 내성을 제공하고/하거나, 선택 곤충 또는 질환 및/또는 영양 향상에 대한 저항성, 및/또는 개선된 작물학적 특징, 및/또는 사료, 식품, 산업, 제약 또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 생성물을 제공하는 또 다른 핵산 분자와 조합하거나 또는 "스태킹"될 수 있다. 식물 게놈 내에 2개 이상의 관심 핵산 서열의 "스태킹"은, 예를 들어 2가지 이상의 현상을 이용한 통상적인 식물 육종, 식물을 관심 서열을 함유하는 구조물로 형질전환시키는 것, 트랜스제닉 식물을 재형질전환시키는 것, 또는 상동 재조합을 통한 표적화 통합을 통하여 새로운 형질을 부가하는 것을 통하여 달성할 수 있다.

이러한 관심 뉴클레오티드 서열은 다음에 제공된 예를 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:

1. 병충해 또는 질환에 대한 저항성을 부여해주는 유전자 또는 서열 (예를 들어, iRNA)

(A) 식물 질환 저항성 유전자. 식물 방어는 종종, 식물 내의 질환 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 상응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 간의 특이적 상호 작용에 의해 활성화된다. 식물 품종을 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환시켜, 특이적 병원체 균주에 대해 저항성인 식물을 조작할 수 있다. 이러한 유전자의 예는 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성의 경우, 토마토 Cf-9 유전자 (문헌 [Jones et al., 1994 Science 266:789]); 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) pv. 토마토에 대한 저항성의 경우, 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (문헌 [Martin et al., 1993 Science 262:1432]); 및 슈도모나스 시린가에에 대한 저항성의 경우 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (문헌 [Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089])를 포함한다.

(B) 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체 또는 그 위에 모델링된 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자 (문헌 [Geiser et al., 1986 Gene 48:109]) 및 식물 생장과 관계된 살충성 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조)의 뉴클레오티드 서열. 더욱이, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입할 수 있다.

(C) 렉틴, 예컨대 몇 가지 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 [Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825].

(D) 비타민 결합 단백질, 예컨대 곤충 병충해에 대항하여 유충을 죽이는 약제로서 유용한 아비딘 및 아비딘 상동체 (미국 특허 번호 5,659,026 참조).

(E) 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 이러한 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (문헌 [Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793]), 담배 프로테이나제 억제제 I (문헌 [Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985]), 및 α-아밀라제 억제제 (문헌 [Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243])를 포함한다.

(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 및 유충 호르몬, 그의 변이체, 그 위에 기초한 유사작용제, 또는 그의 길항제 또는 작동제, 예컨대 유충 호르몬의 불활성인자인, 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바쿨로바이러스 발현 [Hammock et al., 1990 Nature 344:458].

(G) 발현시, 병든 해충의 생리학을 붕괴시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 [J. Biol. Chem. 269:9]. 이러한 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (문헌 [Regan, 1994]), 디플로프테라 푼크타타(Diploptera punctata)에서 확인된 알로스타틴 (문헌 [Pratt, 1989]), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 번호 5,266,361)를 포함한다.

(H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산된 곤충-특이적 사독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 [Pang, 1992 Gene 116:165].

(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체, 또는 살충 활성을 지닌 또 다른 비-단백질 분자의 과축적에 대해 책임이 있는 효소.

(J) 생물학상 활성 분자의 변형 (번역 후 변형 포함)에 관여한 효소; 예를 들어, 자연적이든 합성이든지 간에, 당분해성 효소, 단백질 분해성 효소, 지질 분해성 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 이러한 유전자의 예는 칼라스 유전자 (PCT 공개 출원 WO93/02197), 키티나제-코딩 서열 (이는, 예를 들어 수탁 번호 3999637 및 67152 하에 ATCC로부터 수득할 수 있음), 담배 구충 키티나제 (문헌 [Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691]), 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (문헌 [Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673])를 포함한다.

(K) 신호 변환을 자극하는 분자. 이러한 분자의 예는 녹두 칼모둘린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757]) 및 옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467]).

(L) 소수성 순간 펩티드 (미국 특허 번호 5,659,026 및 5,607,914 참조) (후자 특허는 질환 저항성을 부여해주는 합성 항미생물성 펩티드를 교시함).

(M) 채널 형성자 또는 채널 차단자인 막 투과효소, 예컨대 트랜스제닉 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성이 되게 하는 세크로핀-β 용해성 펩티드 유사체 (문헌 [Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43]).

(N) 바이러스-침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 바이러스 외피 단백질이 형질전환된 식물 세포에 축적되는 것이, 외피 단백질 유전자가 유래되는 바이러스 뿐만 아니라 관련 바이러스에 의한 바이러스성 감염 및/또는 이러한 바이러스에 의해 수행된 질환 발생에 대한 저항성을 부여해준다. 외피 단백질-매개된 저항성은 식물을 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 스트리크 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 에치(etch) 바이러스, 담배 래틀(rattle) 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대항하여 형질전환시킬 때 부여되었다 (예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451] 참조).

(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 소화관에서의 결정적 대사 기능을 표적화하는 항체는, 병에 걸린 효소를 불활성화시켜 곤충을 사멸시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]에는 단일 쇄 항체 단편의 생성을 통한 트랜스제닉 담배에서의 효소적 불활성화가 제시되어 있다.

(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호된다는 것을 제시하는 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469]을 참조할 수 있다.

(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산된 발육-저지 단백질. 따라서, 진균성 엔도 α-1,4-D 폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균성 집락화 및 식물 영양분 방출을 촉진시킨다 [(Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436]. 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제성 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 성상 확인은 문헌 [Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)]에 기재되어 있다.

(R) 식물에 의해 자연에서 생산된 발육-저지 단백질, 예컨대 진균성 질환에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 [(Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305].

(S) RNA 간섭 (여기서는, RNA 분자를 사용하여 표적 유전자의 발현을 억제함). 한 예에서의 RNA 분자는 부분적 또는 완전히 이중 가닥인데, 이는 억제 반응을 촉발시켜 dsRNA를 저분자 간섭 RNA로 절단시킨 다음, 이를 상동 mRNA를 붕괴시키는 표적화 복합체 내로 혼입시킨다 (예를 들어, Fire et al., 미국 특허 번호 6,506,559; Graham et al., 미국 특허 번호 6,573,099 참조).

2. 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 유전자

(A) 생장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다잘리논, 술폰아닐리드 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이러한 범주 내의 예시 유전자는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소로서 공지되기도 한 (문헌 [Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449]) 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS)를 코딩한다 (문헌 [Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241]).

(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해 부여되거나, 또는 유전자, 예컨대 GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat 및 bar 유전자; DSM-2), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)에 의한 대사 불활성화를 통하여 부여된 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 하나 이상의 부가 유전자 (예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,940,835 참조). 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 상기 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 출원 번호 0 242 246에 제공된다. 문헌 [De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생성이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온에 대한 저항성을 부여해주는 예시 유전자, 예컨대 세톡시딤 및 할옥시폽은 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.

(C) 광합성을 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자). 문헌 [Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169]에는 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 형질전환시키기 위해 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용하는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에 입수 가능하다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173]에 기재되어 있다.

(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)를 호모젠티세이트 내로 형질전환시키는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)와 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 효소. 이는 제초제, 예컨대 이속사졸 [EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, 미국 특허 번호 5,424,276], 특히 옥수수에 대한 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 [EP496630, EP496631], 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 [EP625505, EP625508, 미국 특허 번호 5,506,195], 특히 술코트리온 및 피라졸리네이트를 포함한다. 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자가 상기 제초제에 대한 내성 또는 저항성을 제공할 수 있는데, 이는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 번호 20030066102에 기재된 유전자를 포함한다.

(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자, 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 부여해줄 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 미국 특허 번호 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.

(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자, 및 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루록시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여해줄 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.

(G) 디캄바(dicamba)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030135879 참조).

(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 번호 5,767,373 참조).

(I) 포토시스템 II 반응 센터 (PS II)의 코어 단백질과 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대, 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대, 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (문헌 [Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).

3. 가치-부가된 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자

(A) 예를 들어, 옥수수 또는 브라시카를 안티센스 유전자 또는 스테아로일-ACP 불포화효소로 형질전환시켜 상기 식물의 스테아르산 함량을 증가시킴으로써 변형된 지방산 대사 [Knultzon et al., 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624].

(B) 감소된 피테이트 함량

(1) 피타제-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자 (문헌 [Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87])의 도입은 피테이트의 붕괴를 증강시켜, 보다 자유로운 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가시켜 준다.

(2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자를 도입할 수 있다. 옥수수에서, 이는 예를 들어, 저 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 대해 책임이 있는 단일 대립 유전자와 연관된 DNA를 클로닝 및 재도입함으로써 달성할 수 있다 [Raboy et al., 1990 Maydica 35:383].

(C) 예를 들어, 식물을, 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 수행된 변형된 탄수화물 조성. 이러한 효소의 예는 스트렙토코쿠스 무쿠스(Streptococcus mucus) 프럭토실트랜스퍼라제 유전자 (문헌 [Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810]), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (문헌 [Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genet. 200:220]), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제 (문헌 [Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292]), 토마토 전화효소 유전자 (문헌 [Elliot et al., 1993]), 보리 아밀라제 유전자 (문헌 [Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480]), 및 옥수수 내배엽 전분 분지화 효소 II (문헌 [Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450])를 포함한다.

관심 서열은 또한, 상동 재조합을 통하여 식물 게놈의 미리 결정된 구역 내로 도입된 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동 재조합을 통하여 식물 세포의 특이적 염색체 부위 내에서 폴리뉴클레오티드 서열을 안정적으로 통합시키기 위한 방법은 관련 기술분야에 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0111188 A1에 기재된 바와 같은 부위 특이적 통합은 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 염색체 표적 내로 도입하는 것을 매개하기 위해 재조합효소 또는 인테그라제를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 국제 특허 출원 번호 WO 2008/021207에는 게놈의 특이적 위치 내에서 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 안정적으로 통합시키기 위한 아연 핑거 매개된 상동 재조합이 기재되어 있다. 미국 특허 번호 6,720,475에 기재된 바와 같은 FLP/FRT, 또는 미국 특허 번호 5,658,772에 기재된 바와 같은 CRE/LOX와 같은 재조합효소의 사용을 활용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적 염색체 부위 내로 안정적으로 통합시킬 수 있다. 최종적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 특이적 염색체 위치 내로 표적화하기 위해 메가뉴클레아제를 사용하는 것은 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에 기재되었다.

식물 세포 내에서 부위 특이적 통합시키기 위한 다른 다양한 방법이 일반적으로 공지되어 있고 적용 가능하다 [Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159]. 더욱이, 몇 가지 원핵 및 하등 진핵 유기체에서 확인된 바 있는 부위-특이적 재조합 시스템을 식물에서 사용하기 위해 적용할 수 있다. 이러한 시스템의 예는 효모 지고사카로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (문헌 [Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203]), 및 파지 뮤(Mu)의 Gin/gix 시스템 (문헌 [Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176])을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 예시적인 아그로박테리움 균주가 본원에 기재되긴 하지만, 논의된 신규 형질전환 방법의 기능성은 동일한 기준을 갖는 다른 아그로박테리움 균주로 이동할 수 있었다. 본원에 기재된 신규 형질전환 방법과 함께 사용할 수 있었던 다른 균주의 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 C58, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 Chry5, 아그로박테리움 리조게네스 균주, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA101, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 MOG101, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 T37을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 균주의 변형된 버전은 보다 특히, 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 번호 WO 2012/106222 A2에 기재되어 있다.

개시된 신규 형질전환 방법의 실시양태에서, 성숙한 대두 종자는 절삭 도구로 절단하고 아그로박테리움으로 감염시키기 이전에 멸균시킨다. 종자는 염소 가스, 염화수은, 차아염소산 나트륨에서의 침지, 탄산나트륨에서의 침지, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법을 이용하여 멸균시킬 수 있다. 실시양태에서, 종자는 절단 및 아그로박테리움으로의 감염 이전에 멸균수 또는 다른 적합한 저긴장성 용액을 이용하여 흡수되게 한다. 종자가 6 내지 24시간 동안 흡수되게 하는 것이 종자를 부드럽게 하고, 떡잎을 흠뻑 적시며, 나중의 싹 유도를 향상시킨다. 보다 장 기간, 예를 들어 48시간까지 흡수되게 할 수도 있다.

다음에 보다 상세히 기재되고 도 1 내지 6에 예시되는 바와 같이, 대두는 제를 따라 종자의 떡잎을 분열시켜 떡잎을 분리시킨 다음, 종피를 제거함으로써 제조된다. 형질전환 이전에, 배축의 일부를 제거하면, 이러한 배축의 일부분이 떡잎에 부착된 채로 있다. 일부 예에서는, 떡잎의 분열 및 분리 동안 배축을 부수고/부수거나, 찢고/찢거나 핀칭함으로써 또는 배축을 절삭 도구로 트리밍(trimming)함으로써 배축을 제거할 수 있다. 전형적으로, 배축의 1/3 내지 1/2이 떡잎의 마디 끝에 부착된 채로 있다.

도 1을 참조로 하면, 쌍떡잎 대두 종자(10)가 도시되어 있다. 이러한 대두 종자(10)는 종피(16)에 싸여진 한 쌍의 떡잎(12, 14)을 포함한다. 대두 종자(10)는 세로 축(18)을 갖는데, 이는 그의 최대 차수를 따라 규정되고, 대두 종자(10)의 반대편 세로 끝(20, 22)을 통하여 연장된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 축(18)은 떡잎(12, 14) 사이를 연장시킨다.

대두 종자(10)는 또한, 대두 종자(10)의 끝(20, 22) 사이에 위치한 제(24)를 포함한다. 예시 실시양태에서, 이러한 제(24)는 종피(16)의 외부에 위치하는 바깥쪽 단면(26) 및 종피(16) 아래에 위치하는 안쪽 단면(28)을 포함한다.

도 1 내지 2에 도시된 바와 같이, 제(24)는 떡잎(12, 14) 위에 등쪽으로 위치하고 있다. 제(24)의 바깥쪽 단면(26)은 대두 종자(10)의 등의 측면(30) 상에 위치하고 있다. 제(24)는 또한, 대두 종자(10)의 측면(32)으로부터 볼 수 있거나 (도 2 참조) 또는 내측(34)으로부터 볼 수 있다 (도 5 참조). 도 2에 도시된 바와 같이, 제(24)는 종자(10)의 전체 세로 축(18)과 나란히 연장되는 세로 축(36)을 갖는다. 도 1에 도시된 바와 같이, 세로 축(36)은 종자(10)의 축(18)과 공통 평면(38)에 있다.

대두 종자(10)의 배축(40)은 떡잎(12)을 떡잎(14)과 연결시킨다. 배축(40)은 종피(16) 내의 떡잎(12, 14)으로 싸여 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 배축(40)은 제(24)와 마찬가지로, 대두 종자(10)의 세로 축(18) 위의 중앙에 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 배축(40)은 제(24)의 안쪽 단면(28) 위에 위치한 팁(42)에서부터 종자(10)의 세로 끝(20)에 인접하여 위치한 기저(44)까지 연장된다. 다른 실시양태에서는, 배축(40)이 제(24)와 중복될 수 없어서, 축 팁(42)이 이러한 제의 안쪽 단면(28)으로부터 이격된다는 것을 인지해야 한다.

도 3을 참조로 하면, 대두 종자(10)의 내부 구조가 보다 상세히 도시되어 있다. 종피(16)는 떡잎(12, 14)과 배축(40)을 둘러 싸고 있는 얇은 바깥쪽 층(50)을 포함한다. 제(24)의 안쪽 단면(28)은 상기 층(50)의 밑면(50)에 부착되어 있지만, 제(24)의 바깥쪽 단면(26)은 바깥쪽 층(50)의 가장자리(52)에 연결되어 있다. 배축(40)은 종자(10)의 바깥쪽 원주의 부분 둘레에서 그의 팁(42)에서부터 종자 끝(20)에 인접하여 위치한 그의 기저(44)까지 연장된다.

도 4 내지 5를 참조로 하면, 형질전환하기 위하여 대두 종자(10)를 제조하는 예시적 기술이 도시되어 있다. 이러한 예시적 실시양태에서, 제조자는 종자(10)을 그의 측면(32)과 내측(34)에서 단단히 붙잡아 종자(10)의 등의 측면(30)이 위를 향하도록 맞춘다. 다른 실시양태에서, 제조자는 상기 면(32, 34) 중 하나만을 단단히 붙잡을 수 있고, 수직 표면에 대항하여 그 반대쪽 면과 맞물리게 하여 종자(10)를 제위치에 유지시킨다. 또한 다른 실시양태에서, 제조자는, 예를 들어 등의 측면(30)이 수평으로 직면되도록 이를 맞출 수 있다. 이러한 실시양태에서, 제조자는 상기 면(32, 34) 중 하나만을 단단히 붙잡을 수 있고, 수평 표면에 대항하여 그 반대쪽 면과 맞물리게 하여 종자(10)를 제위치에 유지시킨다.

제조자는 종자(10)를 절단하기 위하여 뾰족하게 깍은 절삭 날(62)을 포함한 절삭 도구(60)를 선택할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 절삭 도구(60)는 메스, 면도날, 칼 등의 형태를 취할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 제조자는 절삭 도구(60)가 배축(40)을 다듬도록 맞출 수 있다. 이렇게 하기 위해, 절삭 도구(60)는 절삭 날(62)이 종자(10)을 향하여 아래 방향을 가리키도록 맞출 수 있는데, 이러한 절삭 날(62)은 종자(10)의 축(18)까지 가로로 연장된다 (이로써 종자 그 자체로 연장됨). 도 4에 도시된 바와 같이, 도구(60)는 종피(16)를 통하여 종자(10) 내로 삽입될 수 있다. 절삭 날(62)은 배축(40)을 통하여 진행되어 축(40)의 팁(42)을 축(40)의 나머지 부분으로부터 분리시킬 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 전형적으로, 배축(40)의 1/3 내지 1/2은 부착된 채로 남아있을 수 있다. 달리 언급하면, 배축(40)의 1/2 내지 2/3은 배축(40)의 나머지 부분으로부터 팁(42)과 함께 다듬어질 수 있다.

예시적 실시양태에서, 도구(60)의 절삭 날(62)은, 배축(40)이 다듬어지는 경우에 떡잎(12, 14)을 뚫고 들어가지 못한다. 일부 실시양태에서는, 절삭 날(62)을 추가로 종자(10) 내로 진행시킴으로써 떡잎(12, 14)에 상처를 내는 것이 바람직할 수 있다. 배축(40)을 다듬은 후, 제조자는 종자(10)로부터 절삭 도구(60)를 빼낼 수 있다.

제조자는 또한, 종자(10)를 2개의 떡잎 절편으로 분열시키기 위해 동일한 절삭 도구(60) (또는 상이한 절삭 도구)를 이용할 수 있다. 이렇게 하기 위해, 절삭 도구(60)는 절삭 날(62)이 종자(10)를 향하여 아래쪽 방향을 가리키도록 맞출 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 절삭 날(62)은 제(24)의 세로 축(36)과 종자(10)의 세로 축(18)에 의해 규정된 평면(38)과 정렬된다. 절삭 도구(60)를 정렬시키기 위해, 제조자는 종자(10)의 등의 측면(30)이 위를 향하도록 맞출 수 있고, 절삭 날(62)을 제(24)의 세로 축(36) 상의 중앙에 둘 수 있다. 절삭 도구(60)가 적당히 정렬되는 경우, 제조자는 절삭 날(62)을 종자(10) 내로 삽입할 수 있는데, 평면(38)을 따라 제(24) 및 종피(16)를 통하여 슬라이싱함으로써, 종자(10) 내에 개구(70)를 창출시킬 수 있다. 제조자는 절삭 도구(60)를 종자(10) 내로 지속적으로 진행시킬 수 있는데, 배축(40)은 떡잎(12)에 부착된 내측 단면(72)과 떡잎(14)에 부착된 측 단면(74)이 되도록 슬라이싱된다. 절삭 날(62)이 배축(40)의 기저(44)를 관통하는 경우, 제조자는 종자(10)로부터 도구(60)를 꺼낼 수 있다. 다른 실시양태에서, 제조자는 종자(10)를 통하여 도구(60)를 지속적으로 진행시킬 수 있다.

제조자는 개구(70)를 확대하여 떡잎(12, 14)을 추가로 노출시킴으로써 떡잎(12, 14)으로부터 종피(16)를 분리할 수 있다. 떡잎(12, 14)을 종피(16)로부터 제거할 수 있고, 종피(16)는 폐기하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 분열 대두 종자 또는 떡잎 절편으로서 지칭될 수 있는 각 떡잎은 배축의 단면을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 떡잎 절편(12)은 배축(40)의 단면(72)을 포함하지만, 떡잎 절편(14)은 배축(40)의 단면(74)을 포함한다. 이어서, 떡잎 절편(12, 14) 각각은 추가의 가공 처리 (이는 부가의 상처 내기 또는 아그로박테리움 배양물 접종을 포함함)를 위해 준비된다.

분열 대두 종자의 상처 내기가 본원에 개시된 방법에 요구되지는 않지만, 떡잎 마디 방법 및 분열조직 외식편 방법을 포함한 다른 방법을 이용하여 형질전환 효율을 증가시키는 것으로 보고된다. 식물 재료의 상처 내기는 절단, 연마, 피어싱, 초음파 처리, 플라즈마 상처 내기, 또는 진공 침윤에 의해 촉진될 수 있다. 따라서, 형질전환시키기 이전에, 배축의 일부를 포함한 제1 떡잎 절편의 부가의 상처 내기가 본 개시내용의 실시양태로서 활용될 수 있다.

배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자에 전형적으로, 적합한 유전 구조물을 함유하는 아그로박테리움 배양물을 약 0.5 내지 3.0시간, 보다 전형적으로 약 0.5시간 동안 접종한 다음, 약 5일 이하 동안 적합한 배지 상에서 공동-배양한다. 배축의 일부를 포함하는 형질전환된 분열 대두 종자를 배양하는 것으로부터, 트랜스진의 카피를 함유하는 것으로 추정되는 외식편이 발생된다. 향후 조직 증식을 위해 이들 외식편을 확인 및 단리한다.

적합한 유도 배지에서 외식편을 대략 2주의 기간 동안 배양한 다음, 선택 제제, 예컨대 글루포시네이트를 함유하는 배지에서 2주 더 배양함으로써 싹 유도를 촉진시킬 수 있다. 선택 제제를 수반하지 않은 배지와 선택 제제를 수반하는 배지 간을 교대로 이용하는 것이 바람직하다. 다른 프로토콜이 성공적으로 이용될 수 있는데, 여기서는 싹 유도 배지가 선택 제제를 포함하거나 또는 싹 유도 배지와 선택 배지를 합하여, 선택 마커를 포함하는 단일 배지로 만든다. 싹 유도 기간 후, 배축의 일부를 함유하는 조직 단리물을 절제하고, 이를 적합한 싹 신장 배지로 옮길 수 있다. 특정의 실시양태에서는, 떡잎을 제거할 수 있고, 배축을 함유하는 절제된 플러시 싹 패드는 상기 떡잎의 기저에서 절단함으로써 절제할 수 있다 (실시예 2 참조).

전형적으로, 하나 이상의 선택 제제를 형질전환 후 분열-종자 외식편에 적용한다. 선택 제제는 형질전환되지 않은 대두 세포를 사멸시키거나 이러한 세포의 성장을 지연시키고, 잔류 아그로박테리움 세포를 제거하는 데 도움을 줄 수 있다. 적합한 제제는 글루포시네이트 또는 비알라포스(Bialaphos)를 포함한다. 다른 적합한 제제는 선택 제제와 싹 유도성 호르몬 둘 다로서 작용하는, 제초제 글리포세이트 또는 제초제 2,4-D를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 선택 제제는 사용된 선택 마커에 따라서, 스펙티노마이신, 카나마이신, 네오마이신, 파로모마이신, 젠타마이신 및 G418을 포함한 다양한 항생제를 포함할 수 있다. 사용된 상기 제제에 따라서, 1일 내지 7일 동안 선택하는 것이 적당할 수 있다.

신장된 싹를 발근하는 것은 다양한 농도의 옥신 및 사이토킨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 제제를 이용하여 장려할 수 있다. 예를 들어, 옥신, 즉 인돌 3-부티르산 (IBA)을, 통상의 기술자에게 공지된 적합한 발근 배지에 식물 재료를 옮기기 이전에 사용되는 세포 조직 배양 배지 내로 혼입할 수 있다. IBA에 노출시킨 후, 뿌리가 형성되기까지는 대략 1 내지 4주, 보다 전형적으로 1 내지 2주가 소요된다.

성장하고 있는 싹를 배양하는 것은 성숙한 트랜스제닉 대두 식물을 초래하는 것으로 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, 실시예 2 참조).

성공적인 트랜스제닉 현상이 존재하는 것은 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 확증할 수 있는데, 이러한 기술은 아그로박테리움으로의 감염 및 공동-배양 후의 어느 단계 하의 대두에서 통합된 선택 마커 및/또는 리포터 유전자 구조물의 태크만(Taqman™), PCR 분석 및 서던 분석; 리포터 구조물의 명백한 증거를 디스플레이하는 식물 또는 식물 생식질에 대한 표현형별 검정; 또는 적합한 선택 배지 상에서의 외식편의 선택을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 이용하여 관심 유전자를 발현하는 근친 교배시킨 대두 계통의 개발과 우량 대두 재배종의 개발을 위한 육종 프로그램을 촉진시킬 수 있다. 안정적으로 통합된 트랜스진을 포함하는 근친 교배시킨 대두 계통을, 다른 근친 교배시킨 대두 계통과 교배시켜 관심 유전자를 발현하는 혼성체 식물을 생성시킬 수 있다. 목적하는 형질을 우량 대두 계통 및 혼성체 내로 유전자이입하는 것은, 본원에 개시된 방법 및 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 신속하게 달성될 수 있다.

본 명세서에서 인용된 공개 공보, 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부 사항과 일관되는 정도로 본원에 참조로 포함되고, 마치 각각의 참고문헌이 개별적이고도 구체적으로 참조로 포함된다고 표시되고 그 전문에 본원에 제시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원에서 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 이전에 그의 개시내용을 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도, 본 발명자가 선행 발명에 의해서 상기 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

다음 실시예는 본 개시내용의 특별한 특색 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 개시내용을 본원에 기재된 특별한 특색 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 벡터 구축

pDAB9381로서 표지된 단일 이원성 벡터 (도 7)를, 당해 기술분야에서 승인된 과정을 이용하여 구축하였다. pDAB9381은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하고 있다. 제1 PTU (서열 1)는 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)으로부터 단리된 인트론, 광 특이적 조직 유도성 LS-1 유전자 (ST-LS1 인트론; 유전자은행 수탁 번호 X04753)를 함유하는 황색 형광 단백질 코딩 서열 (PhiYFP; 문헌 [Shagin et al., 2004])을 구동하고 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR; 문헌 [Gelvin et al., 1987])에 의해 종결되는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴-10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; 문헌 [Callis et al., 1990])로 이루어진다. 제2 PTU (서열 2)는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 코딩 서열 (PAT; 문헌 [Wohlleben et al., 1988])을 구동시키기 위해 사용되고, 에이. 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR; 문헌 [Huang et al., 1990])에 의해 종결되는, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; 문헌 [Verdaguer et al., 1996])로 이루어지는, 이소펜테닐트랜스퍼라제 코딩 서열 (ipt CDS; 유전자은행 수탁 번호 X00639.1) 내에서 클로닝되었다. 이로써 생성되는 이원성 벡터는 가시적 리포터 유전자 및 항생제 선택 마커를 함유하였고, 이를 대두의 형질전환을 위하여 연속해서 사용되었다.

이원성 벡터인 pDAB9381을, 전기천공을 이용하여 EHA101 및 EHA105의 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 (문헌 [Hood et al., 1986]) 내로 가동화시켰다. 항생제 스펙티노마이신을 함유하는 YEP 배지 상에서 성장시킨 개개의 집락을 확인하였다. 단일 집락을 단리하고, 제한 효소 분해를 통하여 pDAB9381 이원성 벡터의 존재를 확증하였다.

실시예 2: 배축의 일부를 포함하는 분열-종자를 이용하는 대두의 아그로박테리움 -매개된 형질전환

종자 제조. 신규 아그로박테리움-매개된 대두 형질전환 프로토콜을 개발하였다. 성숙한 대두 (글리시네 맥스) cv. 마베릭 (Maverick) 종자를 16시간 동안 염소 가스로 밤새 멸균시켰다. 염소 가스로 멸균시킨 후, 종자를 라미나르(Laminar™) 유동 후드 내의 개방 용기에 놓아두어 염소 가스를 없앴다. 그 다음, 이와 같이 멸균시킨 종자는 24℃ 하의 블랙 박스를 이용하여 암실에서 16시간 동안 멸균 H2O를 흡수하게 하였다.

분열-종자 대두의 제조. 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자 프로토콜을 위해서는, 절삭 도구 (예를 들어, 메스에 고착된 #10 날)를 이용하여 세로로 절단시킨 대두 종자 재료를 제조할 필요가 있다. 상기 절삭 도구를 종자의 제를 따라 대두 종자의 종피 내로 삽입하여 (도 5) 종피를 분리 및 제거하고, 종자를 2개의 떡잎 단면으로 분열시켰다 (도 6). 배축을 부분적으로 제거하는 데 세심한 주의가 필요하였는데, 배축의 약 1/2 내지 1/3이 상기 떡잎의 마디 끝에 여전히 부착된 채로 있다 (도 4). 이러한 방법은 성숙한 종자를 2개의 떡잎 단면으로 분열시키는 경우에 배축을 거의 완전히 제거시키는 기존에 보고된 형질전환 방법과는 상이하였다.

접종. 이어서, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자를, pDAB9381 이원성 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA 101 또는 EHA 105의 용액에 30분 동안 침지시켰다. 배축을 포함하는 떡잎을 침지시키기 전에, 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 용액을 희석시켜 λ=0.6 OD650의 최종 농도가 되도록 하였다.

공동-배양. 접종시킨 후, 분열 대두 종자를 필터지 조각으로 덮은 페트리 디쉬 내의 공동-배양 배지 (문헌 [Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.]) 상에서 5일 동안 아그로박테리움 투메파시엔스 균주와 함께 공동-배양할 수 있었다.

싹 유도. 공동-배양한지 5일 후, 분열 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 28 mg/L 철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 슈크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 100 mg/L 티멘틴(Timentin™), 200 mg/L 세포탁심(cefotaxime), 및 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 액체 싹 유도 (SI) 배지에서 세척하였다. 이어서, 분열 대두 종자를 B5 염, B5 비타민, 7 g/L 노블(Noble) 한천, 28 mg/L 철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 슈크로스, 0.6 g/L MES, 1.11 mg/L BAP, 50 mg/L 티멘틴™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신 (pH 5.7)으로 이루어진 싹 유도 I (SI I) 배지 상에서 배양하였는데, 상기 떡잎의 편평한 면은 위를 향해 있고 떡잎의 마디 끝은 상기 배지 내로 함몰되었다. 배양한지 2주 후, 형질전환된 분열 대두 종자로부터의 외식편을, 6 mg/L 글루포시네이트 [리버티®]를 보충시킨 SI I 배지를 함유하는 싹 유도 II (SI II) 배지에 옮겼다.

싹 신장. SI II 배지 상에서 배양한지 2주 후, 외식편으로부터 떡잎을 제거하고, 떡잎의 기저에서 절단을 수행함으로써, 배축을 함유하는 플러시 싹 패드를 절제하였다. 이와 같이 떡잎으로부터 단리된 싹 패드를 싹 신장 (SE) 배지에 옮겼다. SE 배지는 MS 염, 28 mg/L 철, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L 슈크로스 및 0.6 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 0.1 mg/L IAA, 0.5 mg/L GA3, 1 mg/L 제아틴 리보시드(zeatin riboside), 50 mg/L 티멘틴™, 200 mg/L 세포탁심, 50 mg/L 반코마이신, 6 mg/L 글루포시네이트, 7 g/L 노블 한천 (pH 5.7)으로 이루어졌다. 이 배양물을 2주마다 신선한 SE 배지에 옮겼다. 이 배양물을 80 내지 90 μmol/m2sec의 광 세기 하에 18 h 광주기를 이용하여 24℃ 하의 콘비론(Conviron™) 성장 챔버 내에서 성장시켰다.

발근. 떡잎 싹 패드로부터 발생된 신장된 싹는, 이러한 떡잎 싹 패드의 기저에서 상기 신장된 싹를 절단하고, 이러한 신장된 싹를 1 내지 3분 동안 1 mg/L IBA (인돌 3-부티르산)에 담가두어 발근을 증진시킴으로써 단리하였다. 그 다음, 신장된 싹를 피타 트레이 (phyta tray) 내의 발근 배지 (MS 염, B5 비타민, 28 mg/L 철, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/L 슈크로스 및 0.59 g/L MES, 50 mg/L 아스파라긴, 100 mg/L L-피로글루탐산, 7 g/L 노블 한천, pH 5.6)에 옮겼다.

배양. 1 내지 2주 동안 24℃, 18 h 광주기 하에 콘비론™ 성장 챔버에서 배양한 후, 뿌리를 발생한 싹를, 덮은 아이스크림 선디 컵 내의 토양 혼합물에 옮기고, 모종의 적응을 위해 일정한 온도 (22℃) 및 습도 (40 내지 50%) 하에 120 내지 150 μmol/m2sec의 광 세기 하에 장일 조건 (16시간 조명/8시간 암실) 하에 콘비론™ 성장 챔버 [모델 CMP4030 및 CMP3244; 컨트롤드 엔바이런먼츠 리미티드 (Controlled Environments Limited; 캐나다 매니토바주 윈니펙)]에 놓아두었다. 이와 같이 발근된 모종은 아이스크림 선디 컵에서 수 주 동안 적응시킨 후에, 강건한 트랜스제닉 대두 식물의 향후 적응과 정립을 위해 온실로 옮겼다.

실시예 3: 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 아그로박테리움 - 매개된 형질전환을 통한 트랜스제닉 현상의 확증

실시예 2에 기재된, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법을 이용하여, YFP 및 PAT PTU로 구성된 T-가닥 삽입물을 함유하는 트랜스제닉 대두 현상을 생성시켰다.

상기 신규 방법을 이용하여, EHA101 및 EHA105 균주 각각에 대한 3가지 실험으로 이루어진 총 6가지 독립적인 형질전환 실험을 완료하였다. 온실에서 성장시켰던 T0 대두 추정상의 트랜스제닉 현상을, PAT 및 YFP PTU 각각의 태크만™ 및 PCR 분석에 의해 추가로 확증하였다. 평균 형질전환 빈도의 결과가 표 1 및 표 2에 제시되어 있다. 전반적으로, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법으로 인해, 전례 없는 형질전환 효율 13.3% (범위: 4.6% 내지 20.5%) 및 20.3% (범위: 14.0 내지 26.5%)가 야기되었다. 이들 형질전환 효율 결과는 문헌 [Zeng et al. (2004) Plant Cell Rep 22: 478-482]의 떡잎 마디 형질전환 방법 및 문헌 [Paz et al. (2006) Plant Cell Rep 25: 206-213]의 반-종자 형질전환 방법을 이용하는 관련 기술분야에 언급된 대두 형질전환 방법에 대해 보고되었던 대두 형질전환 효율 보다 상당히 더 높다.

배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법으로 인해, 문헌 [Zeng et al. (2004)]의 대두 떡잎 마디 형질전환 방법과 비교해서 형질전환 빈도가 약 3.7배 정도 증가하였다. 기존 문헌의 보고서에는 문헌 [Zeng et al. (2004)]의 대두 떡잎 마디 형질전환 방법으로, 형질전환 효율 수준이 5.9% 정도로 높게 도달하였다고 표시되었다. 그러나, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법 결과는 여전히 예상치 못하게도, 기존 문헌에 보고된 대두 떡잎 마디 형질전환 방법의 형질전환 효율 보다 더 효율적이다.

마찬가지로, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법으로 인해, 문헌 [Paz et al. (2006)]의 반-종자 형질전환 방법과 비교해서 형질전환 빈도가 약 14배 정도 증가하였다. 기존 문헌의 보고서에는 문헌 [Paz et al. (2006)]의 반-종자 형질전환 방법으로, 전반적인 형질전환 효율 3.8%가 초래되었다고 표시되었다. 그러나, 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법 결과는 여전히 예상치 못하게도, 기존 문헌에 보고된 대두 반-종자 형질전환 방법의 형질전환 효율 보다 더 효율적이다.

[표 1]

배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자로부터 생성된 트랜스제닉 현상의 첫 번째 실험. 평균 형질전환 빈도는 EHA101 및 EHA105 아그로박테리움 균주를 이용하여 완료한 모든 형질전환 실험의 결과이다.

[표 2]

배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자로부터 생성된 트랜스제닉 현상의 두 번째 실험.

실시예 4: 배축의 일부를 수반한 분열 대두 종자의 아그로박테리움- 매개된 형질전환을 통하여 생성된 트랜스제닉 현상의 유전 가능성의 결정

YFP 및 PAT 트랜스진의 카피를 함유하는 것으로 확증되었던 T0 대두 식물을 자가 수정시키고, 총 247개의 트랜스제닉 현상으로부터 생성된 T1 종자를 대상으로 하여 유전 가능성에 관하여 추가로 스크리닝하였다. 트랜스제닉 T1 대두 종자를 심고 온실에서 성장시켰다. 발생 V1-V2 단계에서 (1 내지 2개의 세 잎과 함께 심은 후 대략 10 내지 14일), 상기 식물에 글루포시네이트의 1.0% v/v 용액 [리버티® (410 g ae/haL; 바이엘 크롭 사이언스 (Bayer Crop Sciences) LLC)]을 살포하였다. 또한, 태크만™ 및 PCR 분석을 이용하여 PAT 및 YFP 식물 전사 단위 둘 다에 대한 분자 분석을 T1 대두 식물 상에서 완료하였다. 글루포시네이트 제초제 내성, 및 pat 및 yfp 트랜스진의 존재로부터 결정된 바와 같이, 총 116개 현상 (47%)이 T1 세대에서 트랜스제닉인 것으로 확증되었다 (표 3). 나머지 대두 현상은 pat 및 yfp 트랜스진을 T0 세대에서 T1 세대로 전달하지 못하였다. 이들 T1 대두 식물에 상기 트랜스진이 내재되지 못한 것은 비-생식세포계 대두 조직 내로 형질전환된 pat 및 yfp 트랜스진으로 구성된 T0 대두 현상의 생성에 따른 결과이다. 트랜스진이 비-생식세포계 대두 조직 내로 통합되는 것은 관련 기술분야에 공지된 다른 대두 형질전환 방법에 대해 흔히 보고되었던 통상의 기술적 문제점이고, 이는 배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자의 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법에만 독특한 것은 아니다.

[표 3]

배축의 일부를 포함하는 분열 대두 종자를 이용하여 생성된 트랜스제닉 대두 현상의 유전 가능성.

실시예 5: 선택 제제로서의 글리포세이트 및 배축의 일부를 포함하는 분열-종자 외식편을 이용하는 대두의 아그로박테리움- 매개된 형질전환

상기 언급된 대두 형질전환 프로토콜 (실시예 2 참조)을, 글리포세이트 내성 형질을 발현하는 트랜스진의 선택 및 형질전환에 활용하였다. DGT-28 유전자 (국제 특허 공개 번호 WO2013116700)를 선택 및 제초제 내성 형질로서 유전자 발현 카세트 내로 혼입하고, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자 외식편의 형질전환에 사용하였다.

초기에는, 용량 반응 연구를 완료하였다. 상기 외식편에 대한 글리포세이트의 효과를 시험하기 위하여, 싹 개시 단계부터 사용된 배지에 글리포세이트를 계속 가하였다. 0.025 내지 0.2 mM 범위의 글리포세이트를 시험하였다. 이러한 농도 범위 내의 글리포세이트를 조직 배양 배지에 혼입하는 것이 대두 (문헌 [Clemente et al., 2000]; [Hinchee et al., 1996]; [Martinell et al., 2006]; [Martinell et al., 1999]; [Martinell et al., 2002]), 담배 (문헌 [Singer et al., 1985]), 면 (문헌 [Zhao et al., 2006]) 및 밀 (문헌 [Hu et al., 2003])에서 보고되었다. 5가지 농도의 글리포세이트를 대상으로 하여, 형질전환되지 않은 대두 외식편의 배양에 관하여 시험하였다. SI-2 배지 내로 혼입된 농도는 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM 및 0.2 mM였다. 형질전환되지 않은 대두 외식편을 SI-2 배지부터 조직 배양 프로토콜의 완료까지의 계대배양의 모든 후속 단계에 대해 동일한 글리포세이트 선택 비율로 유지시켰다. 건강한 외식편의 수를 각 계대배양 단계에서 계수하였다. 사멸된 외식편은 버리고, 건강한 외식편을 적당한 배지 상으로 추가로 계대배양하였다.

다양한 글리포세이트 농도를 함유하는 SI-2 배지 상에서 배양이 끝날 무렵 (예를 들어, 약 2주 시간), 외식편은 떡잎의 황변을 나타내었다. 황변 정도는 배지에 적용된 글리포세이트의 용량에 정비례하였다. 외식편의 성장은 또한, 글리포세이트 함유 배지 상에서 지연되었다. 그 다음, 상기 떡잎을 제거하고 외식편을 SI-2로부터 SE 배지로 계대배양하였다. SE 배지 상에서 선택한지 2주가 더 지날 무렵, 외식편을 상이한 수준의 글리포세이트에 노출시킨 경우에 외식편의 성장에 있어서의 상당한 차이점이 관찰되었다. 외식편의 성장 지연은 글리포세이트의 용량 증가에 비례하였다. 유사하게, 사멸된 외식편의 수는 또한, 글리포세이트의 용량 증가에 비례하였다. 사멸된 외식편의 수는 글리포세이트의 용량이 증가함에 따라 증가하였다. 이 연구에서 활용된 가장 높은 농도 (예를 들어, 0.2 mM)에서는, SE-1이 끝날 무렵 단지 1개의 외식편만이 생존하였다. 비교적, 거의 모든 외식편은 글리포세이트를 함유하지 않았던 대조군 배지 상에서 살아있었다. 일부 외식편이 SE-1이 끝날 무렵 시험된 모든 수준의 글리포세이트에서 생존할 수 있었지만, 선택 6주 후인 SE-2가 끝날 무렵에는 모든 외식편이 사멸하였다 (표 4). 이들 결과는 심지어 조직 배양 배지에서 시험된 글리포세이트의 가장 낮은 용량 (예를 들어, 0.025 mM) 하에서도, 글리포세이트 선택 6주 후에 어떠한 대두 외식편도 생존할 수 없었다고 표시한다. 연속해서, 3가지 상이한 농도의 글리포세이트 (예를 들어, 0.025 mM, 0.05 mM 및 0.1 mM)를, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자 외식편의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 선택 방식 내로 혼입하였다.

[표 4]

용량 반응 연구의 결과. 다음 표는 소정의 범위의 글리포세이트를 함유하는 상이한 배지 유형 상에서 계대배양의 각 단계를 통하여 진행시켰던 외식편의 수를 제공한다.

pDAB107553으로서 표지된 단일 이원성 벡터 (도 8)를, 당해 기술분야에서 승인된 과정을 이용하여 구축하였다. pDAB107553은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하고 있다. 제1 PTU (서열 3)는 엽록소 전이 펩티드 TraP23 (Trap23; 국제 특허 공개 번호 WO2013116764)을 함유하는 dgt-28 코딩 서열 (DGT-28; 샤긴(Shagin) 국제 특허 공개 번호 WO2013116700)을 구동하고 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR; 문헌 [Gelvin et al., 1987])에 의해 종결되는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; 문헌 [Callis et al., 1990])로 이루어진다. 제2 PTU (서열 4)는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 코딩 서열 (PAT; 문헌 [Wohlleben et al., 1988])을 구동시키기 위해 사용되고, 에이. 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3'UTR; 문헌 [Huang et al., 1990])에 의해 종결되는, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; 문헌 [Verdaguer et al., 1996])로 이루어진다. 이로써 생성되는 이원성 벡터는 제초제 내성 선택 마커/저항성 유전자 및 항생제 선택 마커를 함유하였고, 이를 대두의 형질전환을 위하여 연속해서 사용되었다.

이원성 벡터인 pDAB107553을, 전기천공을 이용하여 EHA105의 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 (문헌 [Hood et al., 1986]) 내로 가동화시켰다. 항생제 스펙티노마이신을 함유하는 YEP 배지 상에서 성장시킨 개개의 집락을 확인하였다. 단일 집락을 단리하고, 제한 효소 분해를 통하여 pDAB107553 이원성 벡터의 존재를 확증하였다.

실시예 2에 기재된, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법을 이용하여, 성숙한 대두 (글리시네 맥스) cv. 마베릭 종자를 pDAB107553을 정착시킨 아그로박테리움 균주로 형질전환시켰다. 3가지 상이한 농도의 글리포세이트 (예를 들어, 0.025 mM, 0.05 mM 및 0.1 mM)를, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환 방법을 위한 선택 방식 내로 혼입하였다.

형질전환 실험이 다양한 계대배양 단계를 통하여 진행됨에 따라, 대두 외식편의 건강이 악화되었다. 가장 큰 생리학적 부작용이 가장 높은 수준의 글리포세이트 (예를 들어, 0.1 mM)에서 관찰되었고, 이러한 생리학적 부작용은 글리포세이트의 농도가 감소함에 따라 저하되었다. 제1 선택 주기 (즉, SI-2 배지 상에서 2주) 후, 글리포세이트 선택시 대두 외식편 배양에 대하여 떡잎의 황변이 인지되었다. 떡잎 황변의 세기는 보다 큰 비율의 글리포세이트 상에서 배양된 대두 외식편에서 더 두드러졌다 (도 9).

대두 외식편을 글리포세이트를 함유하는 배지 상에서 유지되게 하였지만, 이러한 외식편은 배지와 직접적으로 접촉되었던 식물 조직의 표면 상에서 연화를 나타낸 것으로 관찰되었다. 외식편의 표면은 점조도에 있어 부드럽고 크림같이 변하였다. 이러한 연화 효과는 SE-1 단계가 끝날 무렵 이후에 매우 확연하였다. 따라서, 상기 외식편을 글리포세이트 선택 제제를 함유하지 않았던 배지로 옮겼다. 복제 1 및 복제 2 외식편의 절반을, SE-1 단계가 끝날 무렵 어떠한 글리포세이트 선택 제제도 함유하지 않았던 배지 상으로 옮겼다. 연속해서, 모든 외식편을, SE-2가 끝날 무렵 어떠한 글리포세이트 선택 제제도 함유하지 않았던 배지로 이동시켰다 (표 5). 복제 1 및 복제 2에서 연화가 매우 확연하였기 때문에, 복제 3 외식편의 절반을, SI-2 단계가 끝날 무렵 어떠한 글리포세이트 선택 제제도 함유하지 않았던 배지 상으로 옮겼다. SE-1 단계가 끝날 무렵까지, 복제 3 외식편 모두를, 어떠한 글리포세이트 선택 제제도 함유하지 않았던 배지 상으로 옮겼다.

[표 5]

계대배양의 각 단계를 통하여 진행된 외식편의 수를 나타낸다. 선택시 배양의 각 단계에서의 외식편의 수가 제공되는 반면, 밑줄친 수는 선택 배지로 옮기지 않은 외식편의 수를 나타낸다.

3가지 복제 모두에 대해서, 글리포세이트를 함유하지 않았던 배지로 외식편을 옮긴 경우에 이러한 외식편의 연화 효과는 종료되지 않았고, 외식편 연화는 계대배양의 모든 후속 단계에서 지속되었다. 이들 결과는 외식편이 일단 글리포세이트에 노출되면, 이러한 노출이 조직의 연화를 개시시키고, 심지어 외식편을 나중에 글리포세이트 무함유 배지로 옮긴 경우에도 영속된다는 것을 표시한다.

살아남은 모든 싹로부터의 샘플을 상기 외식편으로부터 단리하였고, 이들이 트랜스제닉이었는지를 확증하기 위한 분자 분석을 위해 이들 외식편을 보냈다. 싹에 트랜스진이 존재 또는 부재하는 지를 확증한 후, 트랜스제닉 대두 현상을 발근 배지로 이동시킨 다음, 적응을 위해 그리고 토양에서의 향후 성장을 위해 온실로 보냈다.

표 6에 제시된 바와 같이, 조직 배양 배지 내의 글리포세이트를 각각 특별히 처리하면, 트랜스제닉 싹가 생성되었다. 글리포세이트에 노출된 외식편에 대한 연화 효과가 존재함에도 불구하고, 시험된 모든 농도의 글리포세이트에 대해 트랜스제닉 싹가 생성되었다. 더욱이, 이러한 싹를 발근 배지로 옮겼는데, 많은 싹가 성공적으로 뿌리를 내렸다. 전반적으로, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환으로 인해, 형질전환 효율 5.3% 내지 3.9%가 야기되었다. 그러나, 트랜스제닉 식물이 일부 손실되었는데, 이는 뿌리를 생성하지 못하였다. 또한, 트랜스제닉 식물이 온실에서 생존하지 못한 경우에는 형질전환 빈도가 감소되었다. 따라서, 온실에서 생존하였고 종자를 심을 수 있었던, 뿌리를 내린 트랜스제닉 식물에 대해 0.63% 형질전환 빈도 (예를 들어, 8개의 트랜스제닉 식물이 생성됨)가 수득되었다. 이들 실험으로부터, 선택 제제로서의 글리포세이트를 혼입시킨, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환 방법을 이용하여, 트랜스제닉 대두 식물을 생성시켰다.

[표 6]

초기 분석 (발근 전)에 근거하여 상기 실험에서 평가된 각 처리로부터의 형질전환 빈도 및 성공적으로 뿌리를 내린 트랜스제닉 싹의 수를 나타낸다.

실시예 6: 선택 제제로서의 히그로마이신 및 배축의 일부를 포함하는 분열-종자 외식편을 이용하는 대두의 아그로박테리움- 매개된 형질전환

상기 언급된 대두 형질전환 프로토콜 (실시예 2 참조)을, 히그로마이신 내성을 부여하는 트랜스진의 선택 및 형질전환에 활용하였다. hpt 유전자 (문헌 [Gritz, L. and Davies, J. (1983) Gene 25 (2-3); 179-188])를 선택 마커로서 유전자 발현 카세트 내로 혼입하고, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환에 사용하였다.

초기에는, 용량 반응 연구를 완료하였다. 상기 외식편에 대한 히그로마이신의 효과를 시험하기 위하여, 싹 초기 단계부터 사용된 배지에 히그로마이신을 계속 가하였다. 글리시네 맥스 c.v. 잭(Jack) 및 글리시네 맥스 c.v. 마베릭 식물 상에서 5 mg/L 내지 25 mg/L 범위의 히그로마이신을 시험하였다. 5가지 농도의 히그로마이신을 2개의 상이한 공급업체, 즉 시그마 알드리히 (Sigma Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스) 및 피토테크 (Phytotech; 미국 캔자스주 쇼니 미션)로부터 구입하였고, 이를 대상으로 하여, 형질전환되지 않은 대두 외식편의 배양에 관하여 시험하였다. SI-2 배지 내로 혼입된 농도는 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L였다. 형질전환되지 않은 대두 외식편을 SI-2 배지부터 조직 배양 프로토콜의 완료까지의 계대배양의 모든 후속 단계에 대해 동일한 히그로마이신 선택 비율로 유지시켰다. 건강한 외식편의 수를 각 계대배양 단계에서 계수하였다. 사멸된 외식편은 버리고, 건강한 외식편을 적당한 배지 상으로 추가로 계대배양하였다.

히그로마이신을 함유하는 배지 상에서 배양이 끝날 무렵, 외식편을 상이한 수준의 히그로마이신에 노출시킨 경우에 외식편의 성장에 있어서의 상당한 차이점이 관찰되었다 (표 7). 외식편의 성장 지연은 히그로마이신의 용량 증가에 비례하였다. 유사하게, 사멸된 외식편의 수는 또한, 히그로마이신의 용량 증가에 비례하였다. 사멸된 외식편의 수는 히그로마이신의 용량이 증가함에 따라 증가하였다. 이 연구에서 활용된 보다 높은 용량 (10 mg/L 내지 25 mg/L)에서는, 소수의 외식편만이 생존하였다. 마찬가지로, 5 mg/L의 히그로마이신을 함유하는 배지 상에서는 다수의 외식편이 생존할 수 있었다. 비교적, 거의 모든 외식편은 히그로마이신을 함유하지 않았던 대조군 배지 상에서 살아있었다. 다수의 외식편이 SE-1이 끝날 무렵 시험된 모든 수준의 히그로마이신에서 생존할 수 있었지만, 10 mg/L 내지 25 mg/L의 농도 하의 히그로마이신을 함유하는 배지 상에서 배양된 외식편의 경우에는 대부분의 외식편이 SE-2가 끝날 무렵 사멸되었다. 이들 결과는 시험된 5 mg/L 용량의 히그로마이신이 조직 배양 배지에 사용하도록 허용될 수 있다는 것을 표시한다.

[표 7]

용량 반응 연구의 결과. 다음 표는 소정의 범위의 히그로마이신을 함유하는 상이한 배지 유형 상에서 계대배양의 각 단계를 통하여 진행시켰던 외식편의 수를 제공한다.

pDAB105958로서 표지된 단일 이원성 벡터 (도 10)를, 당해 기술분야에서 승인된 과정을 이용하여 구축하였다. pDAB105958은 2개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유하고 있다. 제1 PTU (서열 5)는 hpt 코딩 서열 (HPT; 문헌 [Gritz and Davies, 1983])을 구동하고 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR; 문헌 [Gelvin et al., 1987])에 의해 종결되는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV 프로모터; 문헌 [Verdaguer et al., 1996])로 이루어진다. 제2 PTU (서열 6)는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 코딩 서열 (PAT; 문헌 [Wohlleben et al., 1988])을 구동시키고, 에이. 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3'UTR; 문헌 [Huang et al., 1990])에 의해 종결되는, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 프로모터 (AtUbi10 프로모터; 문헌 [Callis et al., 1990])로 이루어진다. 이로써 생성되는 이원성 벡터는 제초제 내성 선택 마커/저항성 유전자 및 항생제 선택 마커 유전자를 함유하였고, 이를 대두의 형질전환을 위하여 연속해서 사용되었다.

이원성 벡터인 pDAB105958을, 전기천공을 이용하여 EHA105의 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 (문헌 [Hood et al., 1986]) 내로 가동화시켰다. 항생제 스펙티노마이신을 함유하는 YEP 배지 상에서 성장시킨 개개의 집락을 확인하였다. 단일 집락을 단리하고, 제한 효소 분해를 통하여 pDAB105958 이원성 벡터의 존재를 확증하였다.

실시예 2에 기재된, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 신규 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법을 이용하여, 성숙한 대두 (글리시네 맥스) cv. 마베릭 종자를 pDAB105958을 정착시킨 아그로박테리움 균주로 형질전환시켰다. 3가지 상이한 농도의 히그로마이신 (예를 들어, 8 mg/L, 5 mg/L 및 3 mg/L)을, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환 방법을 위한 선택 방식 내로 혼입하였다.

대두 외식편을 히그로마이신을 함유하는 배지 상에서 유지되게 하였지만, 이러한 외식편은 배지와 직접적으로 접촉되었던 식물 조직의 표면 상에서 연화를 나타낸 것으로 관찰되었다. 따라서, 상기 외식편을 배양의 SE-3 단계에서 히그로마이신 선택 제제를 함유하지 않았던 배지로 옮겼다 (표 8).

[표 8]

히그로마이신의 농도, 및 선택의 각 단계가 끝날 무렵 살아남은 외식편의 수를 나타낸다.

살아남은 모든 싹로부터의 샘플을 상기 외식편으로부터 단리하였고, 이들이 트랜스제닉이었는지를 확증하기 위한 분자 분석을 위해 이들 외식편을 보냈다. 싹에 트랜스진이 존재 또는 부재하는 지를 확증한 후, 트랜스제닉 대두 현상을 발근 배지로 이동시킨 다음, 적응을 위해 그리고 토양에서의 향후 성장을 위해 온실로 보냈다. 표 9에 제시된 바와 같이, 조직 배양 배지 내의 히그로마이신을 절반 처리하면, 트랜스제닉 싹가 생성되었다. 히그로마이신에 노출된 외식편에 대한 연화 효과가 존재함에도 불구하고, 히그로마이신 선택 제제를 함유하는 배지 상에서 트랜스제닉 싹가 생성되었다. 이들 실험으로부터, 선택 제제로서의 히그로마이신을 혼입시킨, 배축의 일부를 포함하는 대두 분열-종자의 형질전환 방법을 이용하여, 트랜스제닉 대두 싹를 생성시켰다.

[표 9]

초기 분석 (발근 전)에 근거하여 상기 실험에서 평가된 각 처리로부터의 형질전환 빈도 및 성공적으로 생성된 트랜스제닉 싹의 수를 나타낸다.

본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 이러한 상세 내역은 단지 예시 목적을 위한 것이고, 다음 청구범위로써 규정되는 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서 통상의 기술자는 그에 대한 변동을 만들 수 있는 것으로 이해된다.

SEQUENCE LISTING <110> Pareddy, Dayakar Chennareddy, Siva Minnicks, Tatyana Karpova, Olga Griffin, David Pon Samuel, Jayakumar Smith, Kelley Sarria-Millan, Rodrigo <120> Improved Soybean Transformation for Efficient and High-Throughput Transgenic Event Production <130> 14764-227992 (73502) <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2783 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> YFP Plant Transcription Unit <400> 1 gtcgacctgc aggtcaacgg atcaggatat tcttgtttaa gatgttgaac tctatggagg 60 tttgtatgaa ctgatgatct aggaccggat aagttccctt cttcatagcg aacttattca 120 aagaatgttt tgtgtatcat tcttgttaca ttgttattaa tgaaaaaata ttattggtca 180 ttggactgaa cacgagtgtt aaatatggac caggccccaa ataagatcca ttgatatatg 240 aattaaataa caagaataaa tcgagtcacc aaaccacttg ccttttttaa cgagacttgt 300 tcaccaactt gatacaaaag tcattatcct atgcaaatca ataatcatac aaaaatatcc 360 aataacacta aaaaattaaa agaaatggat aatttcacaa tatgttatac gataaagaag 420 ttacttttcc aagaaattca ctgattttat aagcccactt gcattagata aatggcaaaa 480 aaaaacaaaa aggaaaagaa ataaagcacg aagaattcta gaaaatacga aatacgcttc 540 aatgcagtgg gacccacggt tcaattattg ccaattttca gctccaccgt atatttaaaa 600 aataaaacga taatgctaaa aaaatataaa tcgtaacgat cgttaaatct caacggctgg 660 atcttatgac gaccgttaga aattgtggtt gtcgacgagt cagtaataaa cggcgtcaaa 720 gtggttgcag ccggcacaca cgagtcgtgt ttatcaactc aaagcacaaa tacttttcct 780 caacctaaaa ataaggcaat tagccaaaaa caactttgcg tgtaaacaac gctcaataca 840 cgtgtcattt tattattagc tattgcttca ccgccttagc tttctcgtga cctagtcgtc 900 ctcgtctttt cttcttcttc ttctataaaa caatacccaa agcttcttct tcacaattca 960 gatttcaatt tctcaaaatc ttaaaaactt tctctcaatt ctctctaccg tgatcaaggt 1020 aaatttctgt gttccttatt ctctcaaaat cttcgatttt gttttcgttc gatcccaatt 1080 tcgtatatgt tctttggttt agattctgtt aatcttagat cgaagacgat tttctgggtt 1140 tgatcgttag atatcatctt aattctcgat tagggtttca taaatatcat ccgatttgtt 1200 caaataattt gagttttgtc gaataattac tcttcgattt gtgatttcta tctagatctg 1260 gtgttagttt ctagtttgtg cgatcgaatt tgtcgattaa tctgagtttt tctgattaac 1320 agagatctcc atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga 1380 gatggaaggg aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc 1440 ctcagtggga aaggtatgtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcacta 1500 attagtagta atatagtatt tcaagtattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc 1560 tattgctttt ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg 1620 accaaaacat ggtgatgtgc aggttgatgc acaattcatc tgtactaccg gagatgttcc 1680 tgtgccttgg agcacacttg tcaccactct cacctatgga gcacagtgct ttgccaagta 1740 tggtccagag ttgaaggact tctacaagtc ctgtatgcca gatggctatg tgcaagagcg 1800 cacaatcacc tttgaaggag atggcaactt caagactagg gctgaagtca cctttgagaa 1860 tgggtctgtc tacaataggg tcaaactcaa tggtcaaggc ttcaagaaag atggtcacgt 1920 gttgggaaag aacttggagt tcaacttcac tccccactgc ctctacatct ggggagacca 1980 agccaaccac ggtctcaagt cagccttcaa gatatgtcat gagattactg gcagcaaagg 2040 cgacttcata gtggctgacc acacccagat gaacactccc attggtggag gtccagttca 2100 tgttccagag tatcatcata tgtcttacca tgtgaaactt tccaaagatg tgacagacca 2160 cagagacaac atgagcttga aagaaactgt cagagctgtt gactgtcgca agacctacct 2220 ttgagtagtt agcttaatca cctagagctc ggtcaccagc ataattttta ttaatgtact 2280 aaattactgt tttgttaaat gcaattttgc tttctcggga ttttaatatc aaaatctatt 2340 tagaaataca caatattttg ttgcaggctt gctggagaat cgatctgcta tcataaaaat 2400 tacaaaaaaa ttttatttgc ctcaattatt ttaggattgg tattaaggac gcttaaatta 2460 tttgtcgggt cactacgcat cattgtgatt gagaagatca gcgatacgaa atattcgtag 2520 tactatcgat aatttatttg aaaattcata agaaaagcaa acgttacatg aattgatgaa 2580 acaatacaaa gacagataaa gccacgcaca tttaggatat tggccgagat tactgaatat 2640 tgagtaagat cacggaattt ctgacaggag catgtcttca attcagccca aatggcagtt 2700 gaaatactca aaccgcccca tatgcaggag cggatcattc attgtttgtt tggttgcctt 2760 tgccaacatg ggagtccaag gtt 2783 <210> 2 <211> 1828 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAT Plant Transcription Unit (PTU) <400> 2 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360 tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420 ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480 ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtaggt accagatctg gatcccaaac 540 catgtctccg gagaggagac cagttgagat taggccagct acagcagctg atatggccgc 600 ggtttgtgat atcgttaacc attacattga gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc 660 acaaacacca caagagtgga ttgatgatct agagaggttg caagatagat acccttggtt 720 ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg tattgcttac gctgggccct ggaaggctag 780 gaacgcttac gattggacag ttgagagtac tgtttacgtg tcacataggc atcaaaggtt 840 gggcctagga tctacattgt acacacattt gcttaagtct atggaggcgc aaggttttaa 900 gtctgtggtt gctgttatag gccttccaaa cgatccatct gttaggttgc atgaggcttt 960 gggatacaca gcccggggta cattgcgcgc agctggatac aagcatggtg gatggcatga 1020 tgttggtttt tggcaaaggg attttgagtt gccagctcct ccaaggccag ttaggccagt 1080 tacccaaatc tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg atcggcggca atagcttctt 1140 agcgccatcc cgggttgatc ctatctgtgt tgaaatagtt gcggtgggca aggctctctt 1200 tcagaaagac aggcggccaa aggaacccaa ggtgaggtgg gctatggctc tcagttcctt 1260 gtggaagcgc ttggtctaag gtgcagaggt gttagcggga tgaagcaaaa gtgtccgatt 1320 gtaacaagat atgttgatcc tacgtaagga tattaaagta tgtattcatc actaatataa 1380 tcagtgtatt ccaatatgta ctacgatttc caatgtcttt attgtcgccg tatgtaatcg 1440 gcgtcacaaa ataatccccg gtgactttct tttaatccag gatgaaataa tatgttatta 1500 taatttttgc gatttggtcc gttataggaa ttgaagtgtg cttgaggtcg gtcgccacca 1560 ctcccatttc ataattttac atgtatttga aaaataaaaa tttatggtat tcaatttaaa 1620 cacgtatact tgtaaagaat gatatcttga aagaaatata gtttaaatat ttattgataa 1680 aataacaagt caggtattat agtccaagca aaaacataaa tttattgatg caagtttaaa 1740 ttcagaaata tttcaataac tgattatatc agctggtaca ttgccgtaga tgaaagactg 1800 agtgcgatat tatggtgtaa tacatagg 1828 <210> 3 <211> 3323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGT-28 Plant Transcription Unit (PTU)t <400> 3 gtcgacctgc aggtcaacgg atcaggatat tcttgtttaa gatgttgaac tctatggagg 60 tttgtatgaa ctgatgatct aggaccggat aagttccctt cttcatagcg aacttattca 120 aagaatgttt tgtgtatcat tcttgttaca ttgttattaa tgaaaaaata ttattggtca 180 ttggactgaa cacgagtgtt aaatatggac caggccccaa ataagatcca ttgatatatg 240 aattaaataa caagaataaa tcgagtcacc aaaccacttg ccttttttaa cgagacttgt 300 tcaccaactt gatacaaaag tcattatcct atgcaaatca ataatcatac aaaaatatcc 360 aataacacta aaaaattaaa agaaatggat aatttcacaa tatgttatac gataaagaag 420 ttacttttcc aagaaattca ctgattttat aagcccactt gcattagata aatggcaaaa 480 aaaaacaaaa aggaaaagaa ataaagcacg aagaattcta gaaaatacga aatacgcttc 540 aatgcagtgg gacccacggt tcaattattg ccaattttca gctccaccgt atatttaaaa 600 aataaaacga taatgctaaa aaaatataaa tcgtaacgat cgttaaatct caacggctgg 660 atcttatgac gaccgttaga aattgtggtt gtcgacgagt cagtaataaa cggcgtcaaa 720 gtggttgcag ccggcacaca cgagtcgtgt ttatcaactc aaagcacaaa tacttttcct 780 caacctaaaa ataaggcaat tagccaaaaa caactttgcg tgtaaacaac gctcaataca 840 cgtgtcattt tattattagc tattgcttca ccgccttagc tttctcgtga cctagtcgtc 900 ctcgtctttt cttcttcttc ttctataaaa caatacccaa agcttcttct tcacaattca 960 gatttcaatt tctcaaaatc ttaaaaactt tctctcaatt ctctctaccg tgatcaaggt 1020 aaatttctgt gttccttatt ctctcaaaat cttcgatttt gttttcgttc gatcccaatt 1080 tcgtatatgt tctttggttt agattctgtt aatcttagat cgaagacgat tttctgggtt 1140 tgatcgttag atatcatctt aattctcgat tagggtttca taaatatcat ccgatttgtt 1200 caaataattt gagttttgtc gaataattac tcttcgattt gtgatttcta tctagatctg 1260 gtgttagttt ctagtttgtg cgatcgaatt tgtcgattaa tctgagtttt tctgattaac 1320 agagatctcc atggcacaga tcaacaagtc tgctaatggg gttaggaacg cttcactgat 1380 aagcaacttc tccaataccc gtcaagccaa atcccctttc tccctctcat gcggaacaag 1440 actgaagaac agcagcagag gtttgaagaa ggtggcagtt aggctcattg gctcccgtgt 1500 caaagtgtct gcctcagcaa gagggatgcc agccttgtct ttacctggat caaagagtat 1560 cacagctagg gcactctttc ttgctgctgc tgctgatggg gttactactt tggtgaggcc 1620 attgagaagt gacgacacag aaggattcgc tgaggggtta gttcgtttag gctatcgtgt 1680 agggaggaca cccgatactt ggcaagtcga tggcagacca caaggaccag cagtggctga 1740 ggctgacgtc tactgtagag acggagcaac caccgctaga ttcttgccaa ccttagcagc 1800 tgctggtcac ggaacataca gatttgatgc ttcaccacag atgaggagac gtcctctttt 1860 gcccttaagc agagccttga gggatttggg tgtcgatctt agacacgaag aagctgaagg 1920 tcatcaccct ctgactgtcc gtgctgctgg ggttgaagga ggagaggtta ctttggatgc 1980 tggtcagtca agtcagtatc tcactgcctt gttgctcctt ggtcccctta caagacaagg 2040 actgaggata agggttactg atttggtgtc agcaccatac gtggagatta cgcttgcaat 2100 gatgagggct ttcggagttg aagtggcaag ggagggagat gtgttcgttg ttccacctgg 2160 tggatatcgt gcaactacgt atgctataga acccgacgca agtactgctt cttacttctt 2220 cgcagctgct gctttgactc ctggagctga agtgactgta cctgggttag gcacgggagc 2280 acttcaagga gatttgggat ttgtagatgt cttaaggaga atgggagccg aggtgtccgt 2340 aggagctgat gcaaccactg ttagaggaac tggtgaattg cgtggcctta cagccaacat 2400 gagagacata agtgatacga tgccgaccct cgctgcaata gcaccctttg ctagtgctcc 2460 agttagaatc gaggatgttg ccaacactcg tgtcaaagaa tgtgacagac ttgaggcttg 2520 tgcagagaac cttaggaggt tgggagtaag ggttgcaacg ggtccggact ggattgagat 2580 acaccctggt ccagctactg gtgctcaagt cacaagctat ggtgatcaca gaattgtgat 2640 gtcatttgca gtgactggac ttcgtgtgcc tgggatcagc ttcgacgacc ctggctgtgt 2700 tcgtaagact tttcctgggt ttcacgaggc tttcgcagaa ttgaggcgtg gcattgggag 2760 ctgagtagtt agcttaatca cctagagctc ggtcaccagc ataattttta ttaatgtact 2820 aaattactgt tttgttaaat gcaattttgc tttctcggga ttttaatatc aaaatctatt 2880 tagaaataca caatattttg ttgcaggctt gctggagaat cgatctgcta tcataaaaat 2940 tacaaaaaaa ttttatttgc ctcaattatt ttaggattgg tattaaggac gcttaaatta 3000 tttgtcgggt cactacgcat cattgtgatt gagaagatca gcgatacgaa atattcgtag 3060 tactatcgat aatttatttg aaaattcata agaaaagcaa acgttacatg aattgatgaa 3120 acaatacaaa gacagataaa gccacgcaca tttaggatat tggccgagat tactgaatat 3180 tgagtaagat cacggaattt ctgacaggag catgtcttca attcagccca aatggcagtt 3240 gaaatactca aaccgcccca tatgcaggag cggatcattc attgtttgtt tggttgcctt 3300 tgccaacatg ggagtccaag gtt 3323 <210> 4 <211> 1818 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAT transcription unig <400> 4 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360 tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420 ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480 ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtagat ctccatgtct ccggagagga 540 gaccagttga gattaggcca gctacagcag ctgatatggc cgcggtttgt gatatcgtta 600 accattacat tgagacgtct acagtgaact ttaggacaga gccacaaaca ccacaagagt 660 ggattgatga tctagagagg ttgcaagata gatacccttg gttggttgct gaggttgagg 720 gtgttgtggc tggtattgct tacgctgggc cctggaaggc taggaacgct tacgattgga 780 cagttgagag tactgtttac gtgtcacata ggcatcaaag gttgggccta ggatccacat 840 tgtacacaca tttgcttaag tctatggagg cgcaaggttt taagtctgtg gttgctgtta 900 taggccttcc aaacgatcca tctgttaggt tgcatgaggc tttgggatac acagcccgtg 960 gtacattgcg cgcagctgga tacaagcatg gtggatggca tgatgttggt ttttggcaaa 1020 gggattttga gttgccagct cctccaaggc cagttaggcc agttacccag atctgactga 1080 gcttgagctt atgagcttat gagcttagag ctcagatcgg cggcaatagc ttcttagcgc 1140 catcccgggt tgatcctatc tgtgttgaaa tagttgcggt gggcaaggct ctctttcaga 1200 aagacaggcg gccaaaggaa cccaaggtga ggtgggctat ggctctcagt tccttgtgga 1260 agcgcttggt ctaaggtgca gaggtgttag cggggatgaa gcaaaagtgt ccgattgtaa 1320 caagatatgt tgatcctacg taaggatatt aaagtatgta ttcatcacta atataatcag 1380 tgtattccaa tatgtactac gatttccaat gtctttattg tcgccgtatg caatcggcgt 1440 cacaaaataa tccccggtga ctttctttta atccaggatg aaataatatg ttattataat 1500 ttttgcgatt tggtccgtta taggaattga agtgtgcttg cggtcgccac cactcccatt 1560 tcataatttt acatgtattt gaaaaataaa aatttatggt attcaattta aacacgtata 1620 cttgtaaaga atgatatctt gaaagaaata tagtttaaat atttattgat aaaataacaa 1680 gtcaggtatt atagtccaag caaaaacata aatttattga tgcaagttta aattcagaaa 1740 tatttcaata actgattata tcagctggta cattgccgta gatgaaagac tgagtgcgat 1800 attatggtgt aatacata 1818 <210> 5 <211> 2135 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HPT Plant Transcription Unit (PTU) <400> 5 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360 tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420 ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480 ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtagat ctaaacaatg aaaaagcctg 540 aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc 600 tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg 660 gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc 720 ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg 780 agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg ctcagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg 840 aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc tatggatgct atcgctgcgg 900 ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca 960 ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg 1020 tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg 1080 ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg ttcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc 1140 tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt 1200 cccaatacga ggtcgccaat atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc 1260 agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt 1320 atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg 1380 atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg 1440 ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac 1500 tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa taagtgacta 1560 gttagcctag tcaattcact gaatcaatcg atcagtgagc tcggtcacca gcataatttt 1620 tattaatgta ctaaattact gttttgttaa atgcaatttt gctttctcgg gattttaata 1680 tcaaaatcta tttagaaata cacaatattt tgttgcaggc ttgctggaga atcgatctgc 1740 tatcataaaa attacaaaaa aattttattt gcctcaatta ttttaggatt ggtattaagg 1800 acgcttaaat tatttgtcgg gtcactacgc atcattgtga ttgagaagat cagcgatacg 1860 aaatattcgt agtactatcg ataatttatt tgaaaattca taagaaaagc aaacgttaca 1920 tgaattgatg aaacaataca aagacagata aagccacgca catttaggat attggccgag 1980 attactgaat attgagtaag atcacggaat ttctgacagg agcatgtctt caattcagcc 2040 caaatggcag ttgaaatact caaaccgccc catatgcagg agcggatcat tcattgtttg 2100 tttggttgcc tttgccaaca tgggagtcca aggtt 2135 <210> 6 <211> 1818 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PAT Plant Transcription Unit (PTU) <400> 6 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360 tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420 ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480 ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtagat ctccatgtct ccggagagga 540 gaccagttga gattaggcca gctacagcag ctgatatggc cgcggtttgt gatatcgtta 600 accattacat tgagacgtct acagtgaact ttaggacaga gccacaaaca ccacaagagt 660 ggattgatga tctagagagg ttgcaagata gatacccttg gttggttgct gaggttgagg 720 gtgttgtggc tggtattgct tacgctgggc cctggaaggc taggaacgct tacgattgga 780 cagttgagag tactgtttac gtgtcacata ggcatcaaag gttgggccta ggatccacat 840 tgtacacaca 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atagtccaag caaaaacata aatttattga tgcaagttta aattcagaaa 1740 tatttcaata actgattata tcagctggta cattgccgta gatgaaagac tgagtgcgat 1800 attatggtgt aatacata 1818

Claims (24)

1. 대두 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성하며, 여기서 종자는 배축을 포함하는 것인 단계;
   배축의 일부를 포함하는 제1 떡잎 절편에 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계; 및
   이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계
   를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 제1 떡잎 절편에 접종하기 이전에, 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편으로부터 종피를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 절삭 도구를 삽입하는 단계가 배축을 세로로 절단하여 각 떡잎 절편을 수반한 배축의 일부를 보존시키는 것을 포함하는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 대두 종자의 배축이 절삭 도구를 삽입하기 이전의 절단되지 않은 길이를 갖고 있고, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부가 대두 종자의 배축의 절단되지 않은 길이의 약 1/3 내지 1/2인 길이를 갖는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부를 대두 종자의 배축의 절단되지 않은 길이의 약 1/3 내지 1/2인 길이로 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 대두 종자의 배축이 절삭 도구를 삽입하기 이전의 절단되지 않은 길이를 갖고 있고, 제1 떡잎 절편의 배축의 일부가 절단되지 않은 길이와 동등한 길이를 갖는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 절삭 도구를 삽입하는 단계가 대두 종자의 제를 따라 대두 종자를 세로로 절단하는 것을 포함하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 대두 종자의 바깥쪽 표면 상에 제를 위치시키는 단계, 및 절삭 도구를 삽입하기 이전에 절삭 도구가 상기 제와 정렬되도록 대두 종자에 대해 절삭 도구를 배향시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 각 떡잎 절편이 제의 일부를 포함하는 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 대두 종자가 제를 통하여 연장되는 세로 축을 갖고, 여기서 세로 축은 대두 종자를 제1 면과 제2 면으로 나누는 것이며; 절삭 도구를 삽입하기 이전에 대두 종자의 제1 면을 단단히 붙잡는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 절삭 도구를 삽입하는 단계가 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성시키기 이전에 절삭 도구를 대두 종자의 배축 내로 진행시키는 것을 포함하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 배양되고 접종된 떡잎 절편으로부터 완전하고 생식력이 있는 대두 식물을 생성시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 완전하고 생식력이 있는 대두 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 방법.
13. 트랜스제닉 현상을 포함하는, 제12항의 방법에 의해 생성된 완전하고 생식력이 있는 대두 식물.
14. 제12항에 있어서, 완전하고 생식력이 있는 대두 식물의 자손을 생성시키며, 여기서 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하고, 자손 식물로부터 대두 종자를 생성시키는 단계를 임의로 포함하는 방법.
15. 트랜스제닉 현상을 포함하는, 제14항의 방법에 의해 생성된 자손 식물.
16. 자손 식물로부터 생성되고 트랜스제닉 현상을 포함하는, 제14항의 방법에 의해 생성된 대두 종자.
17. 제14항에 있어서,
    (a) 완전하고 생식력이 있는 대두 식물을 또 다른 대두 식물과 교배시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 교배로부터 자손 종자를 수확하며, 여기서 자손 종자는 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계;
    (c) 자손 종자를 재식하는 단계;
    (d) 자손 종자로부터 자손 식물을 성장시키며, 여기서 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계;
    (e) 단계 (d)에서 성장한 자손 식물로부터 다음 세대 자손 식물을 생성시키며, 여기서 다음 세대 자손 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계
    를 추가로 포함하는, 자손 식물을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 트랜스진이 살충제 저항성 유전자, 제초제 내성 유전자, 질소 이용 효율 유전자, 물 이용 효율 유전자, 영양 품질 유전자, DNA 결합 유전자, 및 선택 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. 종자의 종피 내로 절삭 도구를 삽입하여, 배축의 일부를 포함하는 떡잎 절편을 형성하는 단계;
    이러한 배축의 일부를 포함한 떡잎 절편에 아그로박테리움을 접종하며, 여기서 아그로박테리움은 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 것인 단계;
    이와 같이 접종된 떡잎 절편을 배양하여, 형질전환된 식물 세포에서 트랜스제닉 현상을 생성시키는 단계; 및
    이와 같이 배양되고 접종된 떡잎 절편으로부터 완전하고 생식력이 있는 식물을 생성시키며, 여기서 완전하고 생식력이 있는 식물은 트랜스제닉 현상을 포함하는 것인 단계
    를 포함하는, 트랜스제닉 현상을 생성시키는 방법.
20. 제19항에 있어서, 종자가 쌍떡잎 종자인 방법.
21. 트랜스제닉 현상을 포함하는, 제19항의 완전하고 생식력이 있는 식물의 자손 식물.
22. 트랜스제닉 현상을 포함하는, 제21항의 자손 식물로부터 생성된 종자.
23. 제19항에 있어서, 절삭 도구를 종자의 종피 내로 삽입하여, 제1 떡잎 절편과 제2 떡잎 절편을 형성하며, 여기서 각 떡잎 절편은 배축의 일부를 포함하는 것인 방법.
24. 제18항에 있어서, 트랜스진이 pat, dgt -28, 또는 hpt 선택 마커 유전자를 포함하는 것인 방법.

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