BR102013032929A2 - transformação de soja melhorada para produção de evento transgênico de alto e eficiente rendimento - Google Patents

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Abstract

transformação de soja melhorada para produção de evento transgênico de alto e eficiente rendimento. a presente invenção refere-se a um método, que é descrito para a transformação de linhagem germinativa mediada por agrobacterium de soja, compreendendo infectar as sementes de soja divididas, com uma porção do eixo embrionário, com agrobacterium tumefaciens contendo um transgene. método pode adicionalmente compreender a regeneração dos explantes produzidos a partir da transformação das sementes de soja divididas compreendendo uma porção do eixo embrionário in vitro em meio de seleção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRANSFORMAÇÃO DE SOJA MELHORADA PARA PRODUÇÃO DE E-VENTO TRANSGÊNICO DE ALTO E EFICIENTE RENDIMENTO".
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/739349, depositado em 19 de dezembro de 2012, aqui incorporado na sua totalidade para esta referência. REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA ELETRONICAMENTE [002] A cópia oficial da listagem sequência é enviada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequência formatada ASCII com um arquivo chamado "73502_ST25.txt", criado em 10 de dezembro de 2013 e com um tamanho de 19.301 bytes e é depositado simultaneamente com a especificação. A listagem de sequências contida neste documento formatado ASCII é parte da especificação e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO [003] A invenção refere-se genericamente ao melhoramento de plantas. São fornecidos métodos para a transformação de soja. Métodos de invenção são úteis para a produção transgênica de alto rendimento e eficiente de soja e desenvolvimento comercial de produtos de soja transgênica.
ANTECEDENTES [004] Soja (Glycine max) é uma das culturas mais importantes, com um rendimento de culturas anuais de mais de 200 milhões de toneladas, e um valor estimado superior a 40.000 milhões de dólares americanos em todo o mundo. A soja responde por mais de 97 % de toda a produção de oleaginosas a nível mundial. Assim, os métodos confiáveis e eficientes para melhorar a qualidade e o rendimento desta valiosa cultura são de interesse significativo. [005] Métodos de melhoramento tradicionais para melhorar a soja foram constrangidos porque a maioria dos cultivares de soja são derivados de apenas algumas linhagens parentais, levando a uma base de germoplasma estreita para a reprodução. Christou et al. TIBTECH 8:145-151 (1990). Esforços de pesquisa modernos têm focado em técnicas de engenharia genética de plantas para melhorar a produção de soja. Métodos transgênicos são projetados para introduzir genes desejados na linhagem germinal hereditária de plantas cultivadas para gerar linhagens de plantas de elite. A abordagem tem aumentado com sucesso a resistência de várias outras plantas cultivadas para doença, insetos e herbicidas, melhorando o valor nutritivo. [006] Vários métodos têm sido desenvolvidos para a transferência de genes para tecidos vegetais, incluindo microprojeção de alta velocidade, microinjeção, eletroporação, e absorção direta de DNA. Transformação genética mediada por Agrobacterium tem sido mais recentemente usada para introduzir genes de interesse em soja. No entanto, a soja tem provado ser um sistema de desafio para a engenharia transgênica. Transformação eficaz e regeneração de explantes de soja é difícil de conseguir, e frequentemente difícil de repetir. [007] Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria que habitam o solo, patogênica, tem a capacidade inerente de transferir seu DNA, chamado T-DNA, em células vegetais hospedeiras e induzir as células hospedeiras para produzir metabólitos úteis para a nutrição bacteriana. Usando técnicas recombinantes, alguns ou todos os T-DNA podem ser substituídos por um gene ou genes de interesse, criando um vetor bac-teriano útil para transformar a planta hospedeira. Transferência de genes mediada por Agrobacterium é tipicamente dirigido para as células indiferenciadas, em culturas de tecidos, mas também pode ser dirigida a células diferenciadas tomadas a partir da folha ou do caule da planta. Vários processos foram desenvolvidos para a transformação medi- ada por Agrobacterium de soja, que podem ser livremente classificados com base no tecido de explante sujeito a transformação. [008] Pat. U.S. No. 7.696.408, Olhoft, et al., divulga um método de nó cotiledonar para a transformação de plantas, tanto monocotile-dôneas quanto dicotiledôneas. O método "nó cot" envolve a remoção do hipocótila de plântulas de soja5-7 dias de idade, cortando logo a-baixo do nó cotiledonar, dividindo e separando o segmento de hipocó-tilo restante com os cotilédones, e removendo a epicótila do cotilédo-ne. O explante cotiledonar é ferido na região da gema axilar e/ou nó cotiledonar, e cultivado com Agrobacterium tumefaciens durante cinco dias no escuro. O método requer a germinação in vitro das sementes, e a etapa de ferida apresenta variabilidade significativa. [009] Pat. U.S. No. 6.384.301, Martinelli et al. divulga a entrega de genes mediada por Agrobacterium em tecido vivo de meristema a partir de embriões de soja excisados de sementes de soja, seguido por cultura do explante de meristema com um agente de seleção e hormônio para induzir a formação de brotos. Como o método de "nó cot", os explantes de meristemas são preferencialmente feridos antes da infecção. [010] Pat. U.S. No. 7.473.822, Paz et al., divulga um método de nó cotiledonar modificado chamado o método de "explante de meia semente". Sementes de soja maduras são embebidas, esterilizadas na superfície e divididas ao longo do hilo. Antes da infecção, o eixo embrionário e brotos são completamente removidos, mas nenhum outro ferimento ocorre. Transformação mediada por Agrobacterium prossegue, transformantes potenciais são selecionados e explantes são regenerados em meio de seleção. [011] Eficiências de transformação permanecem relativamente baixas com estes métodos, na ordem de 0,3% para 2,8% para o método de "nó cot", 1,2 para 4,7% para o método de "explante de meriste- ma", e entre 3,2% e 8,7% (em geral 4,9%) para o método de "explante de meia semente". Eficiências de transformação de cerca de 3% são típicas na área. [012] Um protocolo transgênico de "semente dividida" melhorado pode acelerar a produção e desenvolvimento de produtos de soja transgênica futuros. Um método eficiente e de alto rendimento para a integração estável de um transgene no tecido da soja facilitaria programas de melhoramento e tem o potencial de aumentar a produtividade das culturas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [013] A presente invenção refere-se a um método de transformação de células vegetais. Mais particularmente, a invenção refere-se a um método de transformação de soja (Glycine max), utilizando a transformação mediada por Agrobacterium de uma semente de soja dividida, em que a semente de soja dividida retém uma porção do eixo embrionário. [014] Em uma modalidade, a presente descrição refere-se a um método de produção de um evento transgênico, que inclui a inserção de uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente de soja para formar um primeiro segmento de cotilédone e um segundo segmento de cotilédone, inoculando o primeiro segmento de cotilédone que inclui uma porção do eixo embrionário com Agrobacterium, o Agrobacterium, incluindo pelo menos um transgene, e cultivando o segmento de cotilédone inoculado para produzir umo evento transgênico em uma célula vegetal transformada. [015] Em uma outra modalidade, a presente descrição refere-se a um método de produção de um evento transgênico, que inclui a inserção de uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente para formar um segmento de cotilédone incluindo uma porção do eixo embrionário, inocular o segmento de cotilédone que inclui a porção do eixo embrionário com Agrobacterium, o Agrobacteri-um, incluindo pelo menos um transgene, cultivar o segmento de cotilé-done inoculado para produzir umo evento transgênico em uma célula vegetal transformada, e produzir uma planta fértil, completa a partir do segmento de cotilédone inoculado cultivado, a planta fértil, completa incluindo o evento transgênico.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [016] A FIG. 1 é uma vista plana de uma semente de soja. [017] A FIG. 2 é uma vista em elevação lateral da semente de soja da FIG. 1. [018] A FIG. 3 é uma vista em elevação de seção transversal da semente de soja tomada ao longo da linha 3-3 na FIG. 1. [019] A FIG. 4 é uma vista semelhante à FIG. 3, que mostra uma ferramenta de corte engatada com uma porção do eixo embrionário da semente de soja. [020] A FIG. 5 é uma vista em elevação de seção transversal da semente de soja, tomada ao longo da linha 5-5 na FIG. 1, que mostra uma ferramenta de corte inserida na soja ao longo do eixo longitudinal da soja. [021] A FIG. 6 é uma vista plana de um par de segmentos de co-tilédones. [022] A FIG. 7 mostra um mapa do plasmídeo pDAB9381, um construto que pode ser utilizado na transformação mediada por Agrobacterium de explantes de soja, de acordo com uma modalidade particular. [023] A FIG. 8 mostra um mapa do plasmídeo pDAB107533. [024] A FIG. 9 mostra um gráfico que representa a percentagem de explantes que apresentem amarelecimento em, pelo menos, metade do cotilédone para taxas de variação de glifosato é fornecido. [025] A FIG. 10 mostra um mapa do plasmídeo pDAB105958.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [026] As sequências de ácidos nucleicos listadas na listagem de sequências que acompanham são mostradas usando abreviaturas de letra padrão para bases de nucleotídeos, como definido em 37 CFR § 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como sendo incluído por qualquer referência ao filamento exibido. Na listagem de sequências anexa: [027] SEQ ID NO: 1 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) YFP no construto de plasmídeo pDAB9381, para utilização na presente invenção. [028] SEQ ID NO: 2 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) PAT no construto de plasmídeo pDAB9381, para utilização na presente invenção. [029] SEQ ID NO: 3 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) DGT-28 no construto de plasmídeo pDAB107553, para utilização na presente invenção. [030] SEQ ID NO: 4 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) PAT no construto de plasmídeo pDAB107553, para utilização na presente invenção. [031] SEQ ID NO: 5 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) HPT no construto de plasmídeo pDAB105958, para utilização na presente invenção. [032] SEQ ID NO: 6 mostra a Unidade de Transcrição de Planta (PTU) PAT no construto de plasmídeo pDAB105958, para utilização na presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA [033] Descritos aqui são métodos para a transformação eficiente e de alto rendimento de soja. A implantação do método de transformação de soja divulgado resulta em frequências de transformação que são significativamente melhores em relação aos métodos conhecidos anteriores, e os resultados em frequências de transformação de até 20,3%. O novo sistema de transformação de soja é cerca de 3 a 8 vezes mais eficiente do que outros métodos, por exemplo, o método de "nó cot" e método de "explante de meia semente", e serve como uma base para melhorar o desenvolvimento comercial de plantas de soja transgênica. [034] Geralmente, as modalidades da invenção referem-se a um novo método para a transformação de semente de soja dividida que compreende uma porção de um eixo embrionário. O novo método é um melhoramento de outros métodos de transformação conhecidos, e como resultado a produção eficiente de plantas de soja transgênicas. [035] Em uma modalidade, um novo método para a transformação de soja com um transgene é divulgado. As modalidades deste método incluem a divisão de uma semente de soja longitudinalmente para se obter uma semente de soja dividida, em que uma porção de um eixo embrionário permanece ligada à semente de soja dividida. Em seguida, as sementes de soja dividida compreendendo uma porção do eixo embrionário, são transformadas com pelo menos um transgene, utilizando um método de transformação. Os transformantes de soja são selecionados a partir da semente de soja dividida transformada compreendendo uma porção do eixo embrionário. [036] Em uma modalidade da invenção sujeita, a semente de soja é absorvida antes de separar a semente de soja. As sementes de soja podem ser embebidas de 14 para 16 horas. Além disso, as sementes de soja podem ser embebidas por outros períodos de tempo alternativos. Por exemplo, a semente de soja pode ser embebida por 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, ou 48 horas de tempo. [037] Em uma segunda modalidade da invenção sujeita, a semente de soja é dividida longitudinalmente ao longo do hilo da semente de soja. [038] Em uma modalidade, a semente de soja é dividida de modo que o eixo embrionário permanece ligado à extremidade nodal da semente de soja. O eixo embrionário, que é retido com a semente de soja pode compreender qualquer porção da estrutura de semente do eixo embrionário. Como tal, qualquer porção ou quantidade de eixos embrionários que é retida durante a divisão das sementes de soja está dentro do âmbito da invenção. Modalidades incluem qualquer parte do eixo embrionário, que é mantida com a divisão da semente de soja compreendendo qualquer parte de corpo inteiro ou qualquer parte parcial ou eixo embrionário. Por exemplo, Vi, 1/3, Μ?, 2/3, 3A, ou todo o eixo embrionário pode ser mantido quando da divisão da semente de soja. [039] Em uma outra modalidade, a separação das sementes de soja com uma porção retida de eixos embrionários é transformada ino-culando sementes de soja divididas com uma cepa de Agrobacterium tumefaciens abrigando um ou mais transgenes dentro de um constru-to. Modalidades adicionais podem incluir outros métodos de transformação. Por exemplo, um método de transformação mediado por mi-croprojeção de alta velocidade, um método de transformação mediado por microinjeção, um método de transformação mediado por eletropo-ração, ou um método de transformação mediado por absorção de DNA direta, ou qualquer outro método de transformação de plantas é considerado dentro do âmbito da invenção. [040] Em uma modalidade da invenção sujeita, a semente de soja dividida com uma porção retida do eixo embrionário é transformada, introduzindo assim um transgene em uma célula de soja. A introdução do transgene dentro da célula de soja pode resultar em uma célula vegetal de soja estável ou transientemente transformada. Em um aspec- to desta modalidade, um ou mais transgenes podem ser transformados na célula vegetal de soja. Em uma outra modalidade, o transgene compreende um promotor, um quadro de leitura aberta, e uma região 3' não traduzida. O quadro de leitura aberta pode codificar um gene, em que o gene é um gene marcador, um gene agronômico, ou qualquer outro tipo de gene. [041] Em uma modalidade, a sementes de soja dividida transformada com uma porção retida de um eixo embrionário é selecionada para usar um agente de seleção antimicrobiana. Exemplos de agentes de seleção antimicrobiana incluem, mas não estão limitados a, glufosi-nato, fosfinotricina, 2,4-D, canamicina, e glifosato. [042] Modalidades da presente invenção referem-se a regeneração de um ou mais explantes de semente de soja dividida compreendendo uma porção do eixo embrionário. A regeneração do explante é normalmente feita em meio de seleção, mas pode ser feita em outros tipos de meios conhecidos na área. Daí, regeneração bem sucedida de um explante, a formação de uma ou mais plantas pode ser induzida por cultura de tecidos (por exemplo, "cultura") em meio apropriado. Como uma outra modalidade da invenção, uma ou mais plantas podem ser cultivadas em uma planta de soja fétil, completa. Os brotos podem conter células germinativas transformadas. [043] Em modalidades subsequentes da presente invenção, a planta de soja fértil, completa madura pode ser sexualmente cruzada com uma outra planta de soja para gerar uma planta de soja progenito-ra. Em outra modalidade da invenção sujeita, os explantes produzidos a partir da transformação das sementes de soja dividida compreendendo uma porção ligada de eixos embrionários são isolados e avançados para o meio de tecido celular para indução por broto (duas semanas sem seleção e duas semanas com seleção), alongamento por broto (com seleção) e enraizamento (sem seleção). O avanço dos ex- plantes de soja transgênica através destes estágios de cultura de células resulta em plantas transgênicas. As plantas transgênicas são confirmadas para conter um transgene que é integrado de forma estável no genoma da soja através de análise molecular. Plantas de soja transgênicas específicas são então crescidas para a maturidade na estufa. Nas experiências, 45% de progênie T1, semelhante a do método cotiledonar, foram encontrados para possuir uma cópia integrada de forma estável do transgene que foi hereditária a progênie de plantas de soja. A hereditariedade do transgene para as gerações seguintes foi confirmada pela triagem de herbicidas com herbicida Liberdade ™ e pela análise molecular. [044] Em uma outra modalidade, a presente descrição refere-se a um método de produção de um evento transgênico, que inclui a inserção de uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente de soja para formar um primeiro segmento de cotilédone e um segundo segmento de cotilédone, inoculando o primeiro cotilédone segmento que inclui uma porção do eixo embrionário com Agro-bacteríum, o Agrobacterium, incluindo pelo menos um transgene, e cultivando o segmento de cotilédone inoculado para produzir umo e-vento transgênico em uma célula vegetal transformada. [045] Em uma modalidade, o método inclui a remoção do revestimento de semente do primeiro segmento do cotilédone e do segundo segmento de cotilédone antes de inocular o primeiro segmento de cotilédone. Em uma outra modalidade, o método inclui a inserção da ferramenta de corte e o corte do eixo embrionário longitudinalmente para reter uma porção do eixo embrionário, com cada segmento de cotilédone. Em um aspecto da modalidade, o eixo embrionário da semente de soja tem um comprimento não cortado antes de se inserir a ferramenta de corte, e a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone tem um comprimento que é cerca de 1/3 a 1/2 do com- primento não cortado do eixo embrionário. Em ainda outro aspecto da modalidade, a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone é cortada para reter uma porção do eixo embrionário ligado ao primeiro segmento de cotilédone, e a parte retida do eixo embrionário tem um comprimento que é cerca 1/3 a 1/2 do comprimento não cortado do eixo embrionário. Em um outro aspecto da modalidade, o eixo embrionário da semente de soja tem um comprimento não cortado antes de se inserir a ferramenta de corte, e a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone tem um comprimento igual ao comprimento não cortado. [046] Em uma outra modalidade, a inserção da ferramenta de corte inclui o corte da semente de soja longitudinalmente ao longo de um hilo da semente de soja. Em um aspecto da modalidade, o hilo sobre uma superfície externa das sementes de soja está localizado, e a ferramenta de corte é orientada em relação à semente de soja para alinhar a ferramenta de corte com o hilo antes de se inserir a ferramenta de corte. Em um outro aspecto da modalidade, cada segmento de cotilédone inclui uma porção do hilo. Em um outro aspecto da modalidade, a semente de soja tem um eixo longitudinal que se estende a-través do hilo, o eixo longitudinal que divide a semente de soja em um primeiro lado e um segundo lado. Em um outro aspecto da modalidade, o primeiro lado da semente de soja é agarrada antes de se inserir a ferramenta de corte. [047] Em uma modalidade posterior, a presente descrição refere-se a inserção da ferramenta de corte e o avanço da ferramenta de corte para o eixo embrionário da semente de soja antes da formação dos primeiro e segundo segmentos de cotilédones. Em uma modalidade alternativa, os primeiro e segundo segmentos de cotilédones são formados antes de se inserir a ferramenta de corte e o avanço da ferramenta de corte para o eixo embrionário para produzir um primeiro segmento de cotilédone que retém uma porção do eixo embrionário tem um comprimento que é uma fração (por exemplo, cerca de 1/3 a 1/2) de comprimento não cortado do eixo embrionário. [048] Em uma outra modalidade, o método da presente invenção inclui a produção de uma planta de soja fértil, completa a partir do segmento de cotilédone inoculado cultivado, a planta de soja fértil, completa, incluindo o evento transgênico. Em um aspecto da modalidade, o evento transgênico da planta de soja fértil, completa compreende o evento transgênico. Em uma modalidade adicional, a invenção sujeita compreende produzir uma progênie de planta de soja fértil, completa, em que a planta compreende o evento transgênico e, opcionalmente, compreende a produção de sementes de soja a partir da planta da progênie. [049] Em outro aspecto da modalidade, a presente invenção proporciona uma planta progênie da planta de soja fértil, completa, incluindo o evento transgênico, cuja planta de soja fértil, completa produzida de acordo com o método descrito. Em um outro aspecto da modalidade, a presente descrição refere-se a uma semente de soja produzida a partir da planta progênie, em que a semente de soja inclui o evento transgênico. Em um aspecto posterior da modalidade, a presente descrição refere-se a produção de uma planta progênie por cruzamento da planta de soja transgênica fértil completa com outra planta de soja. Em um outro aspecto da modalidade, a presente descrição refere-se a produção de uma planta progênie por colheita de uma semente progênie a partir do cruzamento da planta de soja fértil completa com outra planta de soja, em que a semente progênie inclui ao evento transgênico. Em um outro aspecto da modalidade, a presente descrição refere-se a produção de uma planta progênie plantando a semente progênie. Em um aspecto posterior da modalidade, a presente descrição refere-se a produção de uma planta progênie por crescimento da planta progênie a partir de sementes progênies, a planta progênie incluindo o evento transgênico. Em um outro aspecto da modalidade, a presente descrição refere-se a produção de uma planta progênie de geração posterior produzindo uma planta progênie de geração posterior subsequente a partir da planta progênie anterior, de tal forma que a planta progênie subsequente inclui o evento transgênico. [050] Em uma outra modalidade, o transgene é selecionado a partir do grupo que consiste em um gene de resistência a inseticida, gene de tolerância a herbicidas, gene de eficiência do uso do nitrogênio, gene de eficiência do uso da água, gene de qualidade nutricional, gene de ligação ao DNA, e gene marcador selecionável. [051] Em ainda outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de produção de um evento transgênico, que inclui a inserção de uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente para formar um segmento de cotilédone que inclui uma parte do eixo embrionário, inocular o segmento de cotilédone e a porção do eixo embrionário com Agrobacterium, o Agrobacterium, incluindo pelo menos um transgene, cultivar o segmento de cotilédone inoculado para produzir umo evento transgênico em uma célula vegetal transformada, e produzir uma planta fértil, completa a partir do segmento de cotilédone inoculado cultivado. A planta fértil, completa inclui o evento transgênico. [052] Em uma outra modalidade, a semente é uma semente dico-tiledônea. [053] Em uma modalidade subsequente, a invenção provê uma planta progênie da planta fértil, completa que inclui o evento transgênico. Em um aspecto da modalidade, uma semente pode ser produzida a partir da planta progênie que inclui o evento transgênico. Assim, a invenção provê semente compreendendo o evento transgênico, que pode ser usado para crescer plantas compreendendo o evento trans- gênico. [054] Em uma outra modalidade, a inserção da ferramenta de corte no revestimento de semente da semente forma um primeiro segmento de cotilédone e um segundo segmento de cotilédone. Cada segmento de cotilédone inclui uma porção do eixo embrionário. [055] Em uma outra modalidade, o transgene compreende uma gene marcador selecionável de pat, dgt-28 ou hpt. [056] Salvo indicação em contrário, os termos "um/uma" e "o/a", como aqui utilizado, referem-se a pelo menos um. [057] Tal como aqui utilizado, o termo "explante" refere-se a um pedaço de tecido de soja, que é removido ou isolado a partir de uma planta doadora (por exemplo, a partir de uma semente doadora), cultivada in vitro, e é capaz de crescimento em um meio adequado. [058] Tal como aqui utilizado, um "cotilédone" pode geralmente referir-se a uma folha embrionária ou "folha primária" de um embrião de uma semente de planta. Um dos cotilédones é também referido na técnica como uma "folha da semente". Espécies dicotiledôneas, tal como a soja, têm dois cotilédones. Um segmento de cotilédone refere-se a qualquer porção de um cotilédone, quer seja um cotilédone inteiro ou completo ou um fragmento ou porção parcial de um cotilédone. O "nó cotiledonar" refere-se ao ponto de ligação dos cotilédones ao embrião nas sementes ou plântulas, e pode, em geral referir-se ao tecido associado a esse ponto de ligação. [059] Tal como aqui utilizado, o termo "agarrar" refere-se à manter semear a semente soja com uma ferramenta ou pela mão. Qualquer mecanismo ou ação posterior que permite que a semente de soja seja firmemente apertada é considerado no âmbito do termo de preen-são. [060] Tal como aqui utilizado, o termo "ferramenta de corte" refe-re-se a uma ferramenta de corte, que pique ou cisalhe uma semente, cotilédones de sementes, revestimento de semente, hilo, eixo embrionário, ou qualquer outra estrutura de sementes. A ferramenta de corte pode incluir bisturis, lâminas de barbear, facas de cozinha, facas, ko-gatanas, buris, foices, formões, planos e assim por diante. Em alguns aspectos, a ferramenta de corte pode compreender um meio de corte ligado a uma haste ou manuseio. Em outros aspectos a ferramenta de corte pode compreender apenas um único dispositivo de corte que é desprendido de qualquer outra característica estrutural. A ferramenta de corte pode também incluir um laser ou fluido altamente pressurizado adequado para dividir uma estrutura de semente em um primeiro e segundo segmento de cotilédone. [061] Tal como aqui utilizado, o termo "revestimento de semente" refere-se a um tegumento do óvulo, que serve como um revestimento protetor da semente. Revestimento de semente pode ser descrito pelos termos descritivos alternativos de "testa" ou "casca", além de outros termos semelhantes conhecidos na técnica. Revestimentos de sementes podem conter substâncias hidrofóbicas, tais como a suberi-na, cutina, lignina, calose, pectina, ceras, e produtos insolúveis da oxi-dação de compostos fenólicos. Em leguminosas, como a soja, a testa contém uma camada paliçada de células macrosclereid de paredes espessas, cujas tampas se estendem para uma subcutícula suberiza-da, com uma cutícula de cera externa à camada de suberina mais espessa. [062] Tal como aqui utilizado, o "hipocótilo" é a porção do embrião de planta ou plântula abaixo dos cotilédones e acima da raiz ou da radícula (raiz embrionária). Na semente, o hipocótilo é encontrado logo abaixo do nó cotiledonar, e pode também ser referido como a "haste hipocotiledônea" ou "caule embrionário". Tal como aqui utilizado, o hipocótilo pode referir-se à localização, assim como o tecido encontrado nele. O "epicótilo" é a porção do embrião de planta ou plântula acima dos cotilédones e abaixo das primeiras folhas verdadeiras. Na semente, o epicótilo encontra-se logo acima do nó cotiledonar, e pode ser variavelmente referido como "broto embrionário" ou "broto futuro". Tal como aqui utilizado, o epicótilo pode referir-se à localização, tal como descrito, ou ao tecido encontrado nele. [063] Tal como aqui utilizado, os termos "eixo embrionário" ou "eixo do embrião" referem-se a maior parte do embrião da planta, e, geralmente, incluem epicótilo e hipocótilo [064] Tal como aqui utilizado, os termos "geneticamente modificado" ou planta "transgênica" referem-se a uma célula vegetal, tecido vegetal, parte de planta, germoplasma de planta, ou planta que compreende uma sequência de DNA pré-selecionada que é introduzida no genoma de uma célula vegetal, tecido vegetal, parte de planta, germoplasma de planta ou planta por transformação. [065] Tal como aqui utilizado, o termo DNA "transgênico", "hete-rólogo", "introduzido" ou "estrangeiro" ou gene refere-se a uma sequência de DNA recombinante ou gene que não ocorre naturalmente no genoma da planta que é o receptor do DNA recombinante ou gene, ou que ocorre na planta recipiente em um local ou associação diferente no genoma que na planta não transformada. [066] Tal como aqui utilizado, o termo "planta" refere-se a uma planta inteira, tecido vegetal, parte da planta, incluindo, pólen, sementes, ou um embrião, germoplasma, célula vegetal, ou um grupo de plantas. A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção não está limitada a soja, mas pode incluir geralmente todas as plantas que são passíveis de técnicas de transformação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. [067] Tal como aqui utilizado o termo "progênie" refere-se a qualquer geração subsequente de planta, parte de planta, tecido vegetal, semente de planta que é produzida ou derivada (quer direta ou remo- tamente) a partir de um transformante inicial (TO) que inclui um trans-gênico evento. Progênie inclui ainda qualquer geração subsequente de planta, parte da planta, tecido vegetal, ou sementes de plantas (F1, F2, F3, F4, F5, BC1, BC2, BC3, BC4, BC5, etc.) que é produzido por um cruzamento entre indivíduo ou linhagens específicas de plantas, através de retrocruzamento, melhoramento direto, marcador de reprodução assistida, ou qualquer outra metodologia de melhoramento conhecida que resulte na introgressão do evento transgênico do transformante inicial. [068] Tal como aqui utilizado, o termo "transformação" refere-se a transferência e integração de um ácido nucleico ou fragmento em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como "transgênicos" ou "recombinantes" ou organismos "transformados". Os métodos conhecidos para a transformação incluem transformação mediada por Agrobacterium tumefa-ciens ou Agrobacterium rhizogenes, transformação de fosfato de cálcio, transformação por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos de ultrasson (por exemplo, sonoporação), transformação de lipossomas, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores vi-rais, biolistica (bombardeamento de micropartículas), transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS™, aspersão com aerossol, ou transformação de PEG, bem como outros métodos possíveis. [069] No que diz respeito à produção de plantas geneticamente modificadas, métodos para a engenharia genética das plantas são bem conhecidos na área. Por exemplo, têm sido desenvolvidos vários métodos para a transformação de plantas, incluindo os protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas, assim como plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et ai, Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et ai, Methods in Plant Mole- cular Biology and Biotechnoiogy, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Em adição, os vetores e métodos de cultura in vitro para a célula vegetal ou transformação e regeneração de tecidos vegetais estão disponíveis, por e-xemplo, em Gruber et ai, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnoiogy, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993). [070] Um grande número de técnicas disponíveis para a transformação de DNA em uma célula hospedeira de planta. Estas técnicas incluem a transformação com T-DNA desarmado utilizando Agrobacte-rium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, transfecção de fosfato de cálcio, transformação por polibre-no, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos de ultrassons (por exemplo, sonoporação), transformação de lipossomas, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, biolistica (bombardeamento com micropartículas), transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS™, irradiação por aerossol, ou PEG, bem como outros métodos possíveis. [071] Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células vegetais, ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido vegetal utilizando métodos biolísticos, tal como o bombardeamento de partículas de DNA (vide, por exemplo, Klein et al. (1987) Na-ture 327:70-73). Métodos adicionais para a transformação de células vegetais incluem microinjeção via captação de DNA mediada por carboneto de silício WHISKERS™ (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Repórter 9:415-418). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal através de transformação de nanopartícu-las (vide, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. 12/245, 685, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). [072] Um outro método conhecido de transformação de plantas é a transformação mediada por microprojéteis em que o DNA é portado sobre a superfície de microprojéteis. Neste método, o vetor de expressão é introduzido em tecidos vegetais com um dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis para velocidades suficientes para penetrar nas paredes celulares das plantas e das membranas. Sanford et al., Part. Sei. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). [073] Alternativamente, os métodos de transferência e transformação de genes incluem, mas não estão limitados a, transformação de protoplastos por meio de precipitação com cloreto de cálcio, captação de DNA nu mediada por polietilenoglicol (PEG) ou eletroporação (vide Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:5824-5828; and Shimamoto (1989) Nature 338:274-276) and electroporation of plant tissues (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505). [074] Um método amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch et al., Science 227:1229 (1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas de plantas conhecidas como sendo úteis para transformar geneticamente as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, são portadores de genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sei. 10A (1991). Descrições de sistemas vetoriais de Agrobacterium e métodos para a transferência de genes mediada por Agrobacterium são também disponíveis, por exemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., su- pra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989), e Patente U.S. Nos. 4,940,838 e 5,464,763. [075] Se Agrobacterium é usado para a transformação, o DNA a ser introduzido deve ser clonado em plasmídeos especiais, nomeadamente quer em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Vetores intermediários não podem se reproduzir em Agrobacterium. O vetor intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo ajudante (conjugação). O sistema de Superbi-nário de Japan Tobacco é um exemplo de um sistema deste tipo (revisto por Komari et al. (2006) ln: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; and Komorí et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160). Vetores binários podem replicar-se tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são enquadrados pelas regiões de fronteira de T-DNA esquerda e direita. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). O Agrobacterium utilizado como célula hospedeira deve compreender um plasmídeo portador de uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA na célula vegetal. T-DNA adicional pode ser contido. [076] As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens irão dirigir a inserção de um t-filamento contendo o cons-truto e marcador adjacente no DNA de célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria com um vetor binário T DNA ((Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) or the co-cultivation procedure (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231). Geralmente, o sistema de transformação de Agrobacterium é utilizado para a engenharia de plantas dicotiledôneas (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Ro- gers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). O sistema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para transformar, assim como transferir, DNA para plantas monocotiledôneas e células vegetais. Ver Patente U.S. No 5,591,616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; and Gould et al. (1991) Plant Phy-siol. 95:426-434. [077] Após a introdução do construto genético em células vegetais, células vegetais podem ser cultivadas e após a emergência da diferenciação dos tecidos, tais como raízes e brotos, as plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas pode ser gerada. Metodologias para regeneração de plantas são conhecidas pelos versados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell Tissue and Culture, 1994, Vasil e Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). A planta geneticamente modificada aqui descrita pode ser cultivada em um meio de fermentação ou cultivada em um meio adequado, tal como o solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode incluir qualquer meio de crescimento para plantas, incluindo, mas não limitado a, terra, areia, qualquer outro meio de partículas que suporte o crescimento da raiz (por exemplo, vermiculita, perlita, etc.) ou cultura hidropônica, bem como luz adequada, água e suplementos nutricionais que otimizam o crescimento da planta superior. [078] As células vegetais transformadas que são produzidas por qualquer das técnicas de transformação supra podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e assim o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração confiam na manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente dependendo de um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido em conjunto com as sequências de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans, et ai., "Protoplasts Isola-tion and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Re-generation of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração pode também ser obtida a partir de caules de plantas, explantes, órgãos, pólen, embriões ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração estão descritas geralmente em Klee et ai (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 486. [079] A menos que de outra forma especificamente definida, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por aqueles versados na técnica à qual pertence esta invenção. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Ken-drew et al. (eds.), The Encvclopedia of Molecular Bioloqy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). [080] Será apreciado por um versado na técnica que o uso de genes repórter ou marcadores para seleção de células transformadas ou tecidos ou partes de plantas ou plantas pode ser incluído nos vetores de transformação ou construto. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabolitos, tais como herbicidas, ou antibióticos, por exemplo, di-hidrofolato redu-tase, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13:143-149, 1994, vide também Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983; Meijer et aiPlant Mol. Biol 16:807-820, 1991); neomicina-fosfotransferase, que confere resistência à neomici-na, canamicina e paromicina de aminoglicosídeos (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983, e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803 (1983)) e higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, 1984, vide também Wal-dron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995); trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 85:8047, 1988); manose-6-fosfato isomerase que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, In Current Communications in Molecular Bioloqy. Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e deaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995). [081] Os marcadores selecionáveis adicionais incluem, por e-xemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência a imidazolinona ou sulfonilureia (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), um mutante psbA, que confere resistência à atrazina (Smeda et al. Plant Physiol. 103:911-917, 1993), ou um protoporfirinogênio oxida-se mutante (vide Patente U.S. No. 5, 767, 373), ou outros marcadores que conferem resistência a um herbicida, tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: genes que codificam para resistência ao cloranfeni-col (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); estreptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996); bleomici-na (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); sulfonamida (Gueri- neau et alPlant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); bromoxinil (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233:478-481, 1986); fosfinotricin (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987), e outros semelhantes.. [082] Uma alternativa para o uso de um gene seletivo é um DNA de codificação com resistência ao glufosinato, e em uma modalidade pode ser a fosfinotricina acetil transferase (PAT), gene pat otimizado por milho ou o gene bar sob o controle do promotor do Vírus do Mosaico da Veia da Mandioca. Estes genes conferem resistência a biala-fos. Vide, por exemplo, Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37); Gor-don-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechno-logy 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spen-cer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; and Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989. A versão do gene pat é o gene pat otimizado do milho, descrito na Patente U.S. No. 6.096.947. Um outro gene marcador selecionável que pode ser utilizado no método descrito é dgt-28, que confere resistência ao glifosato. Em modalidades particulares, dgt-28 pode ser otimizado para a expressão em plantas dicotile-dôneas (vide, por exemplo, US20130205440). [083] Além disso, os marcadores que facilitam a identificação de uma célula vegetal contendo o polinucleotídeo que codifica o marcador pode ser empregue. Marcadores contáveis ou detectáveis são úteis, em que a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula vegetal. Exemplos incluem β-glucuronidase, ou o gene uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, patentes norte-americanas 5.268.463 e 5.599.670); cioranfe-nicol acetil transferase (Jefferson et al. The EMBO Journal vol 6. No. 13 pp 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é o beta-caroteno ou provitamina A (Ye et al., Sei- ence 287:303-305-(2000)). O gene tem sido usado para melhorar a nutrição de arroz, mas neste caso é utilizado no lugar de um marcador detectável, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada fornecida. Ao contrário da situação em que o gene é usado para a sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para fins de marcação. Outros marcadores selecionáveis incluem os genes antociani-na/flavonóides em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Ceil (1990) 2:115-127), incluindo, por exemplo, um gene R-locus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antociani-na (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al., in Chromo-some Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam a biossíntese de pigmentos flavonóides, tal como o gene do milho C1 (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e milho C2 (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553; Sido-renko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); os genes locus de bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), entre outros. [084] Outros exemplos de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) (Boite et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), o gene da proteína fluorescente amarela (PHIYFP™ de Evrogen; ver Boite et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54.), um gene lux, que codifica uma luciferase, a presença do qual pode ser detectada utilizando, por exemplo, filme de raios-X, contagem de cintilação, espectrofo-tometria fluorescente, câmeras de vídeo com pouca iluminação, câme- ras de contagem de fótons ou luminometria multipoço (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343.), um gene da proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) (5) 8:777-84), e DsRed2 onde as células vegetais transformadas com o gene marcador são de cor vermelha, e, assim, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002) Bio-techniques 2 (2):286-293). Exemplos adicionais incluem um gene β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogêni-ca), um gene xylE (Zukowsky et al., Proc Nat'l Acad Sei. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica um catecol dioxigenase que pode converter ca-tecóis cromogênicos, um gene α-amilase (Ikuta et al., Biotech (1990) 8:241); e um gene tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona, que em por sua vez, se condensa para formar a melanina composta facilmente detectável. Evidentemente, muitos destes marcadores estão disponíveis e são conhecidos de um versado na técnica. [085] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos pode ser opcionalmente combinada com outra sequência de nucleotídeos de interesse. O termo "sequência de nucleotídeos de interesse" refere-se a uma molécula de ácido nucleico (que pode também ser referida como um polinucleotídeo) que pode ser uma molécula de RNA transcrito, bem como molécula de DNA, que codifica para um polipeptídeo ou proteína desejada, mas também pode referir-se a moléculas de á-cido nucleico que não constituem um gene completo, e que não têm, necessariamente, que codificar um polipeptídeo ou proteína (por e-xemplo, um promotor). Por exemplo, em certas modalidades a molécula de ácido nucleico pode ser combinada ou "empilhada" com uma outra, que proporciona resistência adicional ou tolerância ao glifosato ou um outro herbicida, e/ou fornece a resistência para selecionar insetos ou doenças e/ou melhoramentos nutricionais e/ou características a-gronômicas melhoradas, e/ou proteínas ou outros produtos úteis em ração, alimentos, uso industrial, farmacêutico ou outros usos. O "empi-Ihamento" de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse dentro de um genoma de planta pode ser conseguido, por exemplo, por meio de reprodução de plantas convencionais, utilizando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, re-transformação de uma planta transgênica, ou adição de novas características através da integração direcionada através de recombinação homóloga. [086] Tais sequências de nucleotídeos de interesse incluem, mas não estão limitadas a, aqueles exemplos fornecidos abaixo: [087] Genes ou sequência (por exemplo, iRNA) que conferem resistência a pragas ou doença [088] Genes de Resistência a Doenças. Defesas das plantas são muitas vezes ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (AVR) no agente patogênico. Uma variedade de planta pode ser transformada com o gene de resistência clo-nado para engenharia de plantas que sejam resistentes a cepas de agentes patogênicos específicos. Exemplos de tais genes incluem, o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al. 1994 Science 266:789), gene Pto do tomate, que codifica uma proteína quinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e gene RSSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al. de 1994 Cell 78:1089). [089] Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado do mesmo ou um polipeptídeo sintético modelado, tal como, uma sequên- cia de nucleotídeos de um gene δ-endotoxina Bt (Geiser et ai., 1986 Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (vide, por exemplo, Estruch et ai. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além disso, as moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxinas podem ser adquiridas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD), sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995e 31998. [090] Uma lectina, tal como, as sequências nucleotídicas de vários genes de lectina de ligação a manose de Clivia miniata (Van Damme et al., 24:825 1994 Plant Moles. Biol.) [091] Uma proteína de ligação da vitamina, tais como avidina e homólogos de avidina, que são úteis como larvicidas contra pragas de insetos. Ver Patente U.S.. No. 5659026. [092] um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor da protea-se ou um inibidor da amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de cisteína protease do arroz (Abe et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor de protease do tabaco I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor de α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). [093] Um hormônio específico de inseto ou feromônios tal como um hormônio eediesteróide ou juvenil e uma variante do mesmo, um respectivo mimético baseado no mesmo, ou um antagonista ou um seu agonista, tal como a expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenl (Hammock et al., 1990 Nature 344:458). [094] Um peptídeo específico de inseto ou neuropeptídeo que, após expressão, perturba a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diu-rético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diplop-tera punctata (Pratt, 1989), e neurotoxinas paralíticas específicas de inseto (Patente U.S.. No. 5.266.361). [095] Um veneno específico do inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc., como um peptídeo insetotócixo de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165). [096] (I), uma enzima responsável para um hiperacúmulo de mo-noterpeno, um sesquiterpeno, um esteróide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanóide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida. [097] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-translacional, de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, de enzimas glicolíticas, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma estera-se, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, quitinase e glucanase, natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem, um gene calas (pedido PCT publicado WO93/02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, a partir de ATCC sob os números de acesso 67152 e 3999637), ancilóstomo quitinase do tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), e gene de poliubiquitina UBI4-2 da salsa (Kawalleck etal., 1993 Plant Moles. Biol. 21:673). [098] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. E-xemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeos de clones de cDNA de calmodulina de feijão mungo (Garrafa et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone de calmodulina de cDNA de milho (Griess et al., 1994 Plant Phy-siol 104: 1467). [099] (G) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Ver Patente U.S.. Nos. 5659026 e 5607914, o último ensina peptídeos antimicrobi-anos sintéticos que conferem resistência a doenças. [0100] (M) Uma membrana permease, uma formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico de cecropina-β (Jaynes et al., 1993 Plant Sei. 89:43), que torna as plantas de tabaco transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum. [0101] (N) Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, a acumulação de proteínas de revestimento viral em células vegetais transformadas confere resistência a infecções virais e/ou desenvolvimento da doença efetuada pelo vírus a partir do qual o gene da proteína da cápside é derivado, bem como pelos vírus relacionados. Resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida sobre plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, o vírus streak do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus de corrosão do tabaco, vírus de chocalho de tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Vide, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. [0102] (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica no intestino do inseto pode inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract # 497, Seventh lnt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions mostra inativação enzimática em tabaco transgênico via produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única. [0103] (P) Um anticorpo específico de vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam os genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra o ataque de vírus. [0104] (Q) Uma proteína desenvolvimental-arrestive produzida na natureza por um agente patogênico ou um parasita. Assim, a-1,4-D poligalacturonases endo fúngicas facilitam a colonização fúngica e liberação de nutrientes vegetais através da solubilização de homo-a-1,4-D-galacturonase da parede celular vegetal (Cordeiro et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora de endopoligalacturonase do feijão é descrito por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367). [0105] (R) Uma proteína desenvolvimental-arrestive produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação de ribossoma de cevada, que proporciona uma maior resistência à doença fúngica (Longemann etal., 1992). Bio/Technology 10:3305. [0106] (S) Interferência de RNA, em que uma molécula de RNA é utilizada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA, em um exemplo, é parcialmente ou totalmente de cadeia dupla, que provoca uma resposta de silenciamento, resultando em divagem de dsRNA em pequenos RNAs de interferência, que são em seguida incorporados em um complexo de direcionamento que destrói mRNAs homólogos. Vide, por exemplo, incêndios et al., Patente U.S. 6.506.559; Graham et al 6, 573,099. [0107] Genes que conferem resistência a um herbicida [0108] Genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida de imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Exemplos de genes deste código de categoria para acetolactato sintase mutante (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241), também conhecido como enzima de sintetase acetohidroxiácido (AHAS) (Miki et al., 1990, Theor. Appl. Genet 80: 449). [0109] Um ou mais genes adicionais que codificam para a resistência ou a tolerância ao glifosato transmitido por sintase EPSP mutante e genes aroA, ou através de inativação metabólica, tais como os genes GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono, tais como glufosinato (genes pat e bar; DSM-2), e ácidos ariloxifenoxipropiônico e ciclohexanodionas (genes que codificam inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente U.S..
No. 4940835, que descreve a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob Número de Acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é divulgada na Patente U.S.. No. 4769061. O pedido de patente europeu no. 0 333 033 e Patente U.S.. No. 4.975.374 divulga sequências nucleotídicas dos genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas, tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene fosfinotricinacetil-transferase é fornecida no pedido de patente europeia No. 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bi-o/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam para atividade fosfino-tricina acetil transferase. Exemplos de genes de resistência aos ácidos e ariloxifenoxipropiônico ciclohexanodionas, tais como setoxidim e ha-loxifope, são os genes de Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descrito por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. [0110] Genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam os genes psbA mutantes para transformar Clamidomonas. As sequências nucleotídicas para os genes de nitrilase são divulgadas na Patente U.S. No. 4.810.648, e DNA de moléculas que contêm esses genes estão disponíveis sob números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codifica para uma glutationa S-transferase é descrito por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173. [0111] Genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que se ligam a dioxigenases hidroxifenilpiruvato (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que para- hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisate. Isto inclui herbicidas, como isoxazo- les (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pat U.S. No. 5424276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para o milho, dicetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano- 1.3- diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2, 3CI2fenil) propano- 1.3- diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Pat. U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz um excesso de HPPD nas plantas pode proporcionar tolerância ou resistência a herbicidas tais, incluindo, por exemplo, genes descritos na Patente U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102. [0112] Genes que codificam a resistência ou tolerância a herbicidas da auxina fenóxi, tais como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que pode também conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (AAD-1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733. [0113] Genes que codificam a resistência ou tolerância a herbicidas de auxina fenoxi, tais como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas auxina piridilóxi, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (AAD-12), descrito no documento WO 2007/ 053482 A2. [0114] Genes que codificam a resistência ou tolerância a dicamba (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879). [0115] Genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas que inibem protoporfirinogênio oxidase (PPO) (vide Patente U.S.. No. 5.767.373). [0116] Genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (por exemplo, atrazina) e derivados de ureia (tal como diu- ron) herbicidas que se ligam a centros de reação de proteínas núcleo de fotossistema II (PS II) (vide Brussian et al. (1989.) EMBO J. 1989, 8 (4): 1237-1245. [0117] Genes que Conferem ou Contribuir para um Traço de Valor Adicionado [0118] metabolismo de ácido graxo modaificado, por exemplo, a-través da transformação de milho ou Brassica com um gene antissen-tido ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido este-árico da planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 89:2624. [0119] Conteúdo de fitato dimunuído [0120] Introdução de um gene que codifica para a fitase, tal como o gene da fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), aumenta a desagregação de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. [0121] Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. No milho, este, por exemplo, pode ser conseguido por clonagem e depois reintroduzindo DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho, caracterizado por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383). [0122] Composição do carboidrato modificado efetuada, por e-xemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica para uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem, gene de frutosiltransferase do muco de Strep-tococcus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, gene Bacillus subtilis levansucrase (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), Bacillus licheniformis α-amilase (PEN et al., 1992 Bi-o/Technology 10:292), genes invertase de tomate (invertase Elliot et al., 1993), gene amilase de cevada (Sogaard et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:22480), e enzima de ramificação II amido de milho endos- perma (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450). [0123] A sequência de interesse, também pode ser uma sequência de nucleotídeos introduzida em uma área predeterminada do genoma da planta por meio de recombinação homóloga. Os métodos para integrar de forma estável uma sequência polinucleotídica dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula vegetal através de recombinação homóloga têm sido descritos na técnica. Por exemplo, a integração específica de sítio, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2009/ 0111188 A1 envolve a utilização de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um alvo cromossômico. Além disso, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/ 021207 descreve recombinação homóloga mediada por dedo de zinco para integrar esta-velmente uma ou mais sequências polinucleotídicas doadoras dentro de localizações específicas do genoma. A utilização de recombinases, tais como FLP/DRF, conforme descrito na Patente U.S. No. 6.720.475, ou CRE/LOX, tal como descrito na Patente U.S. No. 5.658.772, pode ser utilizada para integrar de forma estável uma sequência de polinucleotídeo para um sítio cromossômico específico. Finalmente, o uso de meganucleases para alvejar polinucleotídeos doadores para um local cromossômico específico foi descrito em Puchta et al., PNAS USA 93 (1996), pp 5055-5060). [0124] Outros vários métodos para a integração específica de local dentro das células vegetais são geralmente conhecidas e aplicáveis (Kumar et al., Trends in Plant Sei. 6 (4) (2001), pp 155-159). Além disso, sistemas de recombinação específicas de sítio que foram identificados em vários organismos procariotas e eucariotas inferiores podem ser aplicados para o uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas não estão limitados também, o sistema recombinase R/RS do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol Biol 182: 191-203), e o sistema Gin/gix do fago Mu (Ma-eser e Kahlmann (1991) Mol Gen. Genet 230:170-176). [0125] Enquanto determinadas cepas exemplares de Agrobacteri-um são aqui descritas, a funcionalidade dos novos métodos de transformação discutidos poderíam ser transferidas para outras cepas de Agrobacterium com os mesmos critérios. Exemplos de outras cepas que podem ser utilizadas com o novo método de transformação aqui descrito incluem, mas não se limitam a, Agrobacterium tumefaciens cepa C58, Agrobacterium tumefaciens cepa Chry5, Agrobacterium rhi-zogenes cepas, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA101, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105, Agrobacterium tumefaciens cepa MOG101 e Agrobacterium tumefaciens cepa T37. Versões modificadas de tais cepas são descritas com mais detalhes no Pedido de Patente Internacional No. WO 2012/106222 A2, aqui incorporado por referência. [0126] Em modalidades do novo método de transformação descrito, sementes de soja maduras são esterilizadas antes do corte com a ferramenta de corte e a infecção com Agrobacterium. As sementes podem ser esterilizadas utilizando cloro gasoso, cloreto de mercúrio, imersão em hipoclorito de sódio, imersão em carbonato de sódio, ou outros métodos adequados conhecidos na técnica. Em modalidades, as sementes são embebidas com água estéril ou outras soluções hipo-tônicas adequadas antes do corte e da infecção com Agrobacterium. Embeber as sementes para 6-24 horas suaviza as sementes, satura os cotilédones, e melhora a indução de brotações posteriores. Períodos mais longos de embebição também pode ser usados, por exemplo, até 48 horas. [0127] Conforme descrito em maior detalhe abaixo e ilustrado nas figuras 1-6, a soja é preparada através da divisão dos cotilédones de sementes ao longo do hilo para separar os cotilédones, em seguida, remover o revestimento de semente. A remoção de uma porção do eixo do embrião deixa parte do eixo ligada aos cotilédones antes da transformação. Em alguns exemplos, a remoção do eixo embrionário pode ser feita por recorte do eixo do embrião com uma ferramenta de corte ou quebra, rasgo, e/ou comprimindo o eixo do embrião durante a divisão e a separação dos cotilédones. Tipicamente, entre 1/3 e 1/2 do eixo do embrião é deixado anexado no final nodal do cotilédone. [0128] Com referência agora à FIG. 1, uma semente de soja dicoti-ledônea 10 é mostrada. A semente de soja 10 inclui um par de cotilédones 12, 14, que são envoltos em um revestimento da semente 16. A semente de soja 10 tem um eixo longitudinal 18, que é definido ao longo da sua maior dimensão, e estende-se entre as extremidades longitudinais opostas 20, 22 da semente de soja 10. Como mostrado na FIG. 1, o eixo 18 estende-se entre os cotilédones 12, 14. [0129] A semente de soja 10 também inclui um hilo 24 posicionado entre as extremidades 20, 22 da semente de soja 10. Na modalidade ilustrativa, o hilo 24 inclui uma seção exterior 26 que está posicionada fora do revestimento de semente 16 e uma seção interior 28 que está posicionada por baixo do revestimento de semente 16. [0130] Conforme mostrado nas FIGS. 1-2, o hilo 24 está localizado dorsalmente acima dos cotilédones, 12, 14. A seção exterior 26 do hilo 24 é posicionada sobre um lado dorsal 30 da sementes de soja 10. O hilo 24 pode também ser visto a partir do lado lateral 32 (vide FIG. 2) ou do lado mediai 34 (vide FIG. 5) da semente de soja 10. Como mostrado na FIG. 2, o hilo 24 tem um eixo longitudinal 36 que se estende paralelamente ao eixo longitudinal geral 18 da semente 10. Como mostrado na FIG. 1, o eixo longitudinal 36 encontra-se em um plano comum 38 com o eixo 18 da semente 10. [0131] Um eixo embrionário 40 da semente de soja 10 conecta o cotilédone 12 ao cotilédone 14. O eixo embrionário 40 é encerrado com os cotilédones 12, 14 no tegumento da semente 16. Como mostrado na FIG. 1, o eixo embrionário 40, como o hilo 24, está centrado sobre o eixo longitudinal 18 da semente de soja 10. Como mostrado na FIG. 3, o eixo embrionário 40 prolonga-se a partir de uma ponta 42 posicionada acima da seção interior 28 do hilo 24 para uma base 44 posicionada adjacente à extremidade longitudinal 20 da semente 10. Deve ser notado que, em outras modalidades o eixo embrionário 40 pode não se sobrepor com o hilo 24 de tal modo que a ponta de eixo 42 encontra-se afastada da seção interior 28 do hilo. [0132] Com referência à FIG. 3, a estrutura interna da semente de soja 10 é mostrada em maior detalhe. O tegumento 16 inclui uma fina camada exterior 50 que envolve os cotilédones 12, 14 e o eixo embrionário 40. A seção interior 28 do hilo 24 está ligada ao lado inferior da camada 50, enquanto que a seção exterior 26 do hilo 24 está ligada a uma borda 52 da camada externa 50. O eixo embrionário 40 se estende em torno de uma porção da circunferência exterior da semente 10 a partir da sua ponta 42 na sua base 44 posicionada adjacente à extremidade da semente 20. [0133] Com referência às fig. 4-5, uma técnica ilustrativa para a preparação de sementes de soja 10, para transformação é mostrada. Na modalidade ilustrativa, um preparador agarra a semente 10 na sua face lateral 32 e o lado mediai 34 para orientar a parte dorsal 30 da semente 10 para cima. Em outras modalidades, o preparador pode compreender apenas um dos lados 32, 34 e engatar no lado oposto contra uma superfície vertical, para segurar a semente 10 na posição. Em ainda outras modalidades, o preparador pode, por exemplo, orientar a parte dorsal 30, de modo que ela faceia horizontalmente. Em tais modalidades, o preparador pode compreender apenas um dos lados 32, 34 e engatar no lado oposto contra uma superfície horizontal para prender a semente 10 na posição. [0134] Um preparador pode selecionar uma ferramenta de corte 60, incluindo uma ponta afiada 62 para cortar a semente 10. Como descrito acima, a ferramenta de corte 60 pode ter a forma de um bistu-ri, lâmina, uma faca, e outros semelhantes. Na modalidade ilustrativa, o preparador pode orientar a ferramenta de corte 60 para cortar o eixo embrionário 40. Para fazer isso, a ferramenta de corte 60 pode ser orientada com a borda de corte 62 que aponta para baixo na direção das sementes 10, com a borda de corte 62 estendendo-se transversalmente em relação ao eixo 18 da semente 10 (e, portanto, a própria semente). Como mostrado na FIG. 4, a ferramenta 60 pode ser inserida na semente 10, através do revestimento de semente 16. A borda de corte 62 pode ser avançada através do eixo embrionário 40 para separar a extremidade 42 do eixo 40 do resto do eixo 40. Tal como descrito acima, tipicamente, entre 1/3 e 1/2 do eixo embrionário 40 pode permanecer ligado. Em outras palavras, entre 1/2 e 2/3 do eixo embrionário 40 pode ser cortado, juntamente com a ponta 42 do resto do eixo embrionário 40. [0135] Na modalidade ilustrativa, a borda de corte 62 da ferramenta 60 não penetra nos cotilédones 12, 14, quando o eixo embrionário 40 é aparado. Em algumas modalidades, pode ser desejável ferir os cotilédones 12, 14, avançando a borda de corte 62 mais para dentro da semente 10. Após o corte do eixo embrionário 40, o preparador pode retirar a ferramenta de corte 60 da semente 10. [0136] O preparador pode também utilizar a mesma ferramenta de corte 60 (ou uma ferramenta de corte diferente) para separar a semente 10 em dois segmentos de cotilédones. Para fazer isso, a ferramenta de corte 60 pode ser orientada com a borda de corte 62 que aponta para baixo na direção da semente 10. Como mostrado na FIG. 5, a borda de corte 62 está alinhada com o plano 38 definido pelo eixo longitudinal 36 do hilo 24 e o eixo longitudinal 18 da semente 10. Para alinhar a ferramenta de corte 60, o preparador pode orientar lado dorsal 30 da semente 10 para cima e centralizar a borda de corte 62 no eixo longitudinal 36 do hilo 24. Quando a ferramenta de corte 60 está alinhada corretamente, o preparador pode inserir a borda de corte 62 na semente 10, cortando o revestimento de semente 16 e hilo 24 ao longo do plano 38 e criando, assim, uma abertura 70 na semente 10. O preparador pode continuar a avançar a ferramenta de corte 60 para a semente 10, cortando o eixo embrionário 40 para dentro de uma seção mediai 72 ligada ao cotilédone 12 e uma seção transversal de corte 74 ligada ao cotilédone 14. Quando a borda de corte 62 passa através da base 44 do eixo embrionário 40, o preparador pode retirar-se a ferramenta 60 da semente 10. Em outras modalidades, o preparador pode continuar a avançar a ferramenta 60 atrave's da semente 10. [0137] O preparador pode separar o revestimento da semente 16 dos cotilédones 12, 14, ampliando a abertura 70 para expor ainda mais os cotilédones 12, 14. Os cotilédones 12, 14 podem ser removidos do revestimento de semente 16, e o revestimento de semente 16 descartado. Como mostrado na FIG. 6, cada cotilédone, que pode ser referido como uma semente de soja dividida ou segmento de cotilédone, inclui uma seção do eixo embrionário. Na modalidade ilustrativa, o segmento de cotilédone 12 inclui a seção 72 do eixo embrionário 40, enquanto que o segmento de cotilédone 14 inclui a seção 74 do eixo embrionário 40. Cada um dos segmentos de cotilédones, 12, 14 está então pronto para o processamento posterior, incluindo ferimento adicional ou inoculação com uma cultura de Agrobacterium. [0138] Ferimento da semente de soja dividida não é necessário com o método descrito, mas é relatado aumentar a eficiência de transformação utilizando outros métodos, incluindo o método de nó cotile-donar e o método de explante do meristema. Ferimento do material vegetal pode ser facilitado por corte, abrasão, perfuração, ultrassom, ferimento de plasma, ou infiltração de vácuo. Por conseguinte, o ferimento adicional do primeiro segmento de cotilédone incluindo uma porção do eixo embrionário antes da transformação pode ser utilizado como uma modalidade da presente invenção. [0139] Sementes de soja dividida compreendendo uma porção de um eixo embrionário são tipicamente inoculadas com a cultura de A-grobacterium contendo um construto genético apropriado por cerca de 0,5 a 3,0 horas, mais tipicamente de cerca de 0,5 hora, seguida por um período de cocultura em meio de cultura adequado por até cerca de 5 dias. Os explantes que contêm putativamente uma cópia do transgene surgem a partir da cultura de sementes de soja dividida transformadas compreendendo uma porção de um eixo embrionário. Estes explantes são identificados e isolados para posterior propagação do tecido. [0140] Indução de broto pode ser facilitada cultivando explantes em meios de indução adequados por um período de cerca de duas semanas, seguido por cultura em meio contendo um agente de seleção, tal como glufosinato, por mais duas semanas. Alternar entre meios sem um agente selecionável, e meios com um agente selecionável, é preferido. Outros protocolos podem ser utilizados com sucesso, em que o meio de indução de broto compreende um agente de seleção e em que o meio de indução de broto e o meio de seleção são combinados em um único meio que inclui o marcador de seleção. Após um período de indução de broto, um isolado de tecido contendo uma porção do eixo embrionário pode ser excisado, e transferido para um meio de alongamento de broto adequado. Em certas modalidades, os cotilédo-nes podem ser removidos, e uma almofada de broto de descarga exci-sada contendo o eixo embrionário pode ser excisada, cortando na base do cotilédone. Vide Exemplo 2. [0141] Em geral, um ou mais agentes seletivos são aplicados aos explantes de semente dividida após a transformação. O agente seletivo mata ou retarda o crescimento de células de soja não transformadas, e pode ajudar a eliminar as células de Agrobacterium residual. Os agentes adequados incluem glufosinato ou bialafos. Outros agentes adequados incluem, mas não estão limitados a, o herbicida glifosato ou o herbicida 2,4-D, que atuam como ambos um agente selecionável e hormônio de indução de broto. Além disso, os agentes seletivos podem incluir diversos antibióticos, incluindo espectinomicina, canamici-na, neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, dependendo do marcador selecionável utilizado. Dependendo do agente usado, seleção por um a sete dias pode ser adequada. [0142] Enraizamento de brotos alongados pode ser estimulado por meio de agentes adequados, incluindo, mas não limitado a várias concentrações de auxinas e citocininas. Por exemplo, a auxina, ácido in-dol 3-butírico (IBA), pode ser incorporada no meio de cultura de tecido celular que é usado antes da transferência do material de planta para meio de enraizamento adequado conhecido dos versados na técnica. Formação de raízes leva cerca de 1-4 semanas, mais tipicamente 1-2 semanas após a exposição ao IBA. [0143] O cultivo de brotos de crescimento pode ser obtido por métodos geralmente conhecidos na técnica, levando à maturação das plantas de soja transgênicas. Vide, por exemplo, Exemplo 2. [0144] A presença de fenômenos transgênicos bem sucedidos pode ser confirmada utilizando técnicas conhecidas na área, incluindo, mas não limitado a Taqman™, análise de PCR, e análise de Southern de marcadores selecionáveis integrados e/ou construtos de gene repórter na soja em qualquer estágio após a infecção e cocultivo com Agrobacterium-, ensaio fenotípico para plantas ou germoplasma vegetal que apresentam evidências de um construto repórter, ou seleção de explantes em meios de seleção adequada. [0145] Em modalidades, o método descrito pode ser usado para facilitar programas de melhoramento para o desenvolvimento de linhagens endogâmicas de soja que expressam os genes de interesse, e o desenvolvimento de cultivares de soja elite. Linhagens de soja puras que compõem transgenes integrados de forma estável podem ser cruzadas com outras linhagens de soja puras para produzir plantas híbridas que expressam genes de interesse. A introgressão de uma característica desejada em linhagens de soja elite e híbridos pode ser rapidamente conseguida usando o método e os métodos conhecidos na técnica divulgada. [0146] Todas as referências, incluindo as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, são aqui incorporados para referência na medida em que não são inconsistentes com os detalhes concretos desta invenção, e são portanto incorporados na mesma medida como se cada referência fosse indicada individual e especificamente para ser incorporada para referência e fosse estabelecida em sua totalidade aqui. As referências aqui discutidas são fornecidas somente para sua invenção antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar a invenção em virtude da invenção anterior. [0147] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar características e/ou aspectos particulares da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes da invenção das características específicas ou aspectos aqui descritos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Construção de Vetor [0148] Um vetor binário único rotulado como pDAB9381 (Fig. 7) foi construído utilizando processos reconhecidos na técnica. pDAB9381 contém duas unidades de transcrição de Planta (PTUs). A primeira PTU (SEQ ID NO: 1) é composta por promotor Arabidopsis thaliana ubiquitina-10 (AtUbilO promotor; Callis et al., 1990.) Que dirige a sequência de codificação de proteína de fluorescência verde (PhiYFP; Shagin et al., 2004.) que contem um íntron isolado do Solanum tube-rosum, gene LS-1 induzível do tecido específico leve (íntron ST- LS1; Genbank Acc No. X04753), e é terminado pelo quadro de leitura Agro-bacterium tumefaciens 23 região 3' não traduzida aberta (AtuORF23 3'UTR; Gelvin et al., 1987). A segunda PTU (SEQ ID NO: 2) foi ciona-da dentro da sequência de codificação isopenteniltransferase (ipt CDS; Genbank Acc No. X00639.1), consistindo no promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (promotor CsVMV; Verdaguer et al., 1996.) que é utilizado para conduzir a sequência de codificação de fosfinotri-cina acetil transferase (PAT;. Wohlleben et al., 1988), terminado pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta A. tumefaciens 1 (AtuORFI3'UTR; Huang et al., 1990). O vetor binário resultante continha um gene repórter visual e um gene marcador selecionável de antibióticos e foi subsequentemente utilizado para a transformação de soja. [0149] O vetor binário, pDAB9381, foi mobilizado para as cepas de Agrobacterium tumefaciens de EHA101 e EHA105 (Hood et al., 1986), utilizando eletroporação. Colônias individuais foram identificadas as quais cresceram nos meios YEP contendo o antibiótico espectinomici-na. As colônias únicas foram isoladas e a presença do vetor binário pDAB9381 foi confirmada por meio de digestão com enzimas de restrição. EXEMPLO 2: Transformação mediada por Agrobacterium de Soja usando sementes divididas compreendendo uma parte de um eixo embrionário [0150] Preparação de semente. Um novo protocolo de transformação mediado por Agrobacterium de soja foi desenvolvido. Soja madura (Glycine max) cv. sementes Maverick foram esterilizadas durante a noite com o gás de cloro durante dezesseis horas. Após a esterilização com gás de cloro, as sementes foram colocadas em um recipiente a-berto, em uma capela de fluxo Laminar™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas foram embebidas com H20 estéril por 16 horas no escuro usando uma caixa preta a 24 O. [0151] Preparação de sojas de sementes divididas. A semente de soja dividida que compreende uma parte de um protocolo de eixo embrionário necessitou de preparação de material de semente de soja que foi cortada longitudinalmente, usando uma ferramenta de corte (por exemplo, lâmina #10 afixada a um bisturi). A ferramenta de corte foi inserida no revestimento de semente da semente de soja (Figura 5) ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento de semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédones (Fig. 6). Uma atenção cuidadosa foi feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 -1/3 do eixo do embrião permaneceu ligada à extremidade nodal de cotilédones (Fig. 4). O método difere dos métodos de transformação previamente descritos, que resultam na remoção completa ou quase completa do eixo embrionário, quando da divisão da semente madura em duas seções de cotilédones. [0152] Inoculação. As sementes de soja divididas compreendendo uma porção parcial dos eixos embrionários foram então imersas durante 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens cepa EHA 101 ou EHA 105 contendo o plasmídeo binário pDAB9381. A solução de Agrobacterium tumefaciens foi diluída para uma concentração final de λ = 0,6 OD650 antes de imergir os cotilédones que compreendem o eixo do embrião. [0153] Cocultivo. Após a inoculação, a semente de soja dividida foi autorizado a cocultivar com o Agrobacterium tumefaciens cepa durante 5 dias em meio de cocultivo (Wang, Kan Agrobacterium Protocolos 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro. [0154] Indução Broto. Após 5 dias de cocultivo, as sementes de soja dividida foram lavadas em meios de Indução Broto líquido (SI) consistindo em sais B5, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de Timentin™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de van-comicina (pH 5,7). As sementes de soja foram, então, divididas em cultura em meios de Indução Broto I (SI I) que consiste em sais B5, vitaminas B5, 7 g/L de agar Noble, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 50 mg/L de Timentin ™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomici-na (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone embutida no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes de semente de soja divididas transformadas foram transferidos para o meio de Indução Broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (Liberty ®). [0155] Alongamento de Broto. Após 2 semanas de cultura em meio SI II, os cotilédones foram removidos dos explantes e uma almofada de broto de descarga que contém o eixo embrionário foi retirada por meio de corte na base do cotilédone. A sessão de almofada isolada do cotilédone foi transferida para o meios de alongamento de brotos (SE). O meio SE consistiu em sais MS, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de aspa- ragina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribosídeo zeatina, 50 mg/L de Timentin ™, 200 mg/L de cefotaxima 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, 7 g/L de agar Noble, (pH 5.7). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas foram crescidas numa câma- ra de crescimento Conviron™ a 24 °C com um fotoperíodo de 18 h a uma intensidade luminosa de 80-90 pmol/m2sec. [0156] Enraizamento. Brotos alongados que se desenvolveram a partir da almofada de broto cotilédones foram isolados por corte do broto alongado na base da almofada de broto de cotilédones, e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido índole 3-butírico) durante 1-3 minutos, para promover enraizamento. Em seguida, os brotos alongados foram transferidos para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de á-cido L-piroglutâmico de 7 g/L de agar Noble, pH 5,6) em tabuleiros Phytá. [0157] Cultivo. Após a cultura em uma câmara de crescimento Conviron™ a 24 ° C, 18 h de fotoperíodo, durante 1-2 semanas, os brotos que tinham desenvolvido raízes foram transferidos para uma mistura de solo em um copo Sundae coberto e colocado em uma câmara de crescimento Conviron™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlied Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) em condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuro) com uma intensidade de luz de 120-150 pmol/m2sec sob temperatura constante (22 Ό) e umidade (40 -50%) para a aclimatação de mudas. As mudas enraizadas foram aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para posterior a-climatação e desenvolvimento de plantas de soja transgênica robustas. EXEMPLO 3: Confirmação de eventos transgênicos via Transformação mediada por Agrobacteríum de semente de soja dividida que compreende uma parte do eixo embrionário [0158] Eventos de soja transgênica contendo uma inserção no filamento T composta da YFP e PAT PTUs foram produzidas usando a nova transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja dividida compreendendo uma porção do método de transformação do eixo embrionário descrito no Exemplo 2. [0159] Um total de seis experimentos de transformação independentes, consistindo em três experimentos cada um para as cepas E-HA101 e EHA105, foram completadas com o novo método. Os eventos transgênicos de soja putativos TO que foram cultivados em estufa foram também confirmados por Taqman™ e análise de PCR com o PAT e YFP PTUs, respectivamente. Os resultados da frequência de transformação média são apresentados na Tabela 1 e Tabela 2. Em geral, a nova transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja dividida que compreende uma porção do método de transformação do eixo embrionário resultou em eficiências de transformação sem precedentes de 13,3% (intervalo: 4,6 % -20,5 %) e de 20,3 % (intervalo: 14,0-26,5 %). Estes resultados de eficiência de transformação são consideravelmente mais elevados do que as eficiências de transformação de soja que foram descritas para os métodos de transformação de soja descritos na área, utilizando o método de transformação do nó cotiledonar de Zeng et al. (2004) Plant Cell Rep 22: 478-482, e do método de transformação de meia semente de Paz et al. (2006) Plant Cell Rep 25: 206-213. [0160] A nova transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja dividida que compreende uma porção do método de transformação do eixo embrionário resultou em um ~ 3,7 vezes de aumento na frequência de transformação em comparação com o método de transformação de nó cotiledonar de soja de Zeng et al. (2004). [0161] Do mesmo modo, a nova transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja dividida que compreende uma porção do método de transformação do eixo embrionário resultou em um aumento de ~ 14 vezes na frequência de transformação em comparação com o método de transformação de meia semente de Paz et al. (2006). Relatos na literatura anterior indicaram que o método de transformação de meia semente de Paz et al. (2006) resultou em um rendimento global de transformação de 3,8 %. No entanto, a nova transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja dividida que compreende uma porção dos resultados de método de transformação de eixos embrionários ainda são inesperadamente mais eficientes do que a eficiência de transformação de método de transformação de meia semente de soja previamente reportados na literatura. [0162] A Tabela 1: Primeiro experimento de eventos transgênicos produzidos a partir de sementes de soja dividida compreendendo uma porção do eixo embrionário. A frequência de transformação média é o resultado de todas as experiências de transformação que foram cumpridos usando as cepas Agrobacterium EHA101 e EHA105.
Continuação [0163] A Tabela 2: Segunda experiência de eventos transgênicos produzidos a partir de sementes de soja dividida compreendendo uma porção do eixo embrionário.
Continuação EXEMPLO 4: Determinação da herdabilidade dos eventos trans-gênicos produzidos via Transformação mediada por Agrobacterí-um de sementes de soja divididas com uma parte do eixo embrionário [0164] As plantas de soja TO que foram confirmadas para conter cópias dos transgenes YFP e PAT foram autofertiiizadas, e a semente T1 resultante de um total de 247 eventos transgênicos foi ainda selecionada para herdabilidade. A semente de soja transgênica T1 foi plantada e cultivada em uma estufa. Na fase V1-V2 de desenvolvimento (cerca de 10-14 dias após a plantação, com 1-2 trifolíolos), as plantas foram pulverizadas com uma solução de 1,0 % v/v de glufosinato (Liberty ® (410 g ea/Hal; Bayer Crop Sciences LLC). Além disso, a a-nálise molecular para ambas as unidades de transcrição de plantas PAT e YFP utilizando os ensaios Taqman ™ e PCR foi realizada sobre as plantas de soja T1. Um total de 116 eventos (47 %) foram confirmados como sendo transgênicos na geração T1 como determinado a partir da tolerância de herbicida ao glufosinato, e a presença de transgenes pat e YFP (Tabela 3). O remanescente dos eventos de soja não transmitem os transgenes pat e YFP da geração TO para a T1. A falha destas plantas de soja T1 a para serem inerentes ao transgene é uma sequência de produção de eventos de soja TO que foram compostos por transgenes pat e YFP transformados em tecidos de soja não sem linhagem germinativa. A integração de transgenes no tecido da soja sem linhagem germinativa é um problema técnico comum que tem si- do comumente descrito por outros métodos de transformação de soja conhecidos na técnica e não é único para a transformação mediada por Agrobacterium de sementes de soja, compreendendo uma porção de divisão do método de transformação do eixo embrionário. [0165] A Tabela 3: Hereditariedade dos eventos de soja transgê-nicos produzidos com sementes de soja dividida compreendendo uma porção do eixo embrionário. EXEMPLO 5: Transformação mediada por Agrobacterium de soja utilizando explantes de semente dividida compreendendo uma parte de um eixo embrionário e Glifosato como Agentes de Seleção [0166] O protocolo de transformação de soja acima descrito (vide Exemplo 2) foi utilizado para transformação e seleção de um transge-ne que expressa uma característica tolerante ao glifosato. O gene DGT-28 (Pub. de Pat. Internacional. No. WO2013116700) foi incorporado em um cassete de expressão do gene como uma característica selecionável e tolerante a herbicida e usado para transformação de explantes de sementes de soja dividida compreendendo uma porção de um eixo embrionário. [0167] Inicialmente, um estudo de resposta de dose foi concluído. Para testar o efeito do glifosato sobre os explantes, o glifosato foi adicionado aos meios usados a partir da fase de iniciação do broto e em diante. O glifosato foi testado a partir do intervalo de 0,025-0,2 mM. Incorporação de glifosato no meio de cultura de tecidos dentro deste intervalo de concentrações foi relatada em plantas de soja (Clemente et al., 2000; Hinchee et ai1996; Martinell et al2006; Martinell et al 1999; Martinell et al., 2002), tabaco (singer et al., 1985), algodão (Zhao et al., 2006) e trigo (Hu et al., 2003). Cinco concentrações de glifosato foram testadas para a cultura de explantes de soja não transformadas. As concentrações incorporadas nos meios SI-2 foram de 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM e 0,2 mM. Os explantes de soja não transformada foram mantidos com a mesma taxa de seleção de glifosato para todas as fases sucessivas de subcultura a partir do meio Sl-2 para a finalização do protocolo de cultura de tecidos. O número de explantes saudáveis foi contado em cada fase de subcultura. Explantes mortos foram descartados e explantes saudáveis foram repicados em meios mais apropriados. [0168] No final da cultura de no meio SI-2 contendo várias concentrações de glifosato (por exemplo, cerca de 2 semanas de tempo), explantes mostraram amarelecimento dos cotilédones. A extensão da cor amarela foi diretamente proporcional à dose de glifosato aplicado aos meios. Crescimento dos explantes também foi retardado em meio contendo glifosato. Em seguida, os cotilédones foram removidos e os explantes foram subcultivados do meio SI-2 para SE. No fim de mais duas semanas de seleção no meio SE, nenhuma diferença significativa foi observada no crescimento dos explantes, quando os explantes foram expostos a diferentes níveis de glifosato. O retardo no crescimento dos explantes foi proporcional ao aumento da dose de glifosato. De igual modo o número de explantes mortos foi também proporcional ao aumento da dose de glifosato. O número de explantes mortos aumentou à medida que a dose de glifosato foi aumentada. Na dose mais e-levada utilizada neste estudo (por exemplo, 0,2 mM), apenas um ex-plante sobreviveu no final de SE-1. Comparativamente, quase todos os explantes estavam vivos no meio de controle que não continha glifosato. Embora alguns explantes fossem capazes de sobreviver em todos os níveis de glifosato testado no final de SE-1, todos os explantes foram mortos no final de SE-2, que é após seis semanas de seleção (Tabela 4). Estes resultados indicam que, mesmo na dose mais baixa de glifosato testado em meio de cultura de tecido (por exemplo, 0,025 mM), nenhum dos explantes de soja foram capazes de sobreviver a-pós 6 semanas de seleção de glifosato. Subsequentemente, três concentrações diferentes de glifosato (por exemplo, 0,025 mM, 0,05 mM e 0,1 mM) foram incorporadas nos esquemas de seleção para a transformação mediada por Agrobacterium de explantes de soja de semente dividida que compreendem uma porção de um eixo embrionário. [0169] Tabela 4: Resultados de estudos de resposta de dose. A tabela fornece o número de explantes que avançaram através de cada estágio de subcultura em diferentes tipos de meio contendo um intervalo de glifosato. [0170] Um único vetor binário rotulado como pDAB107553 (FIG. 8) foi construído utilizando processos reconhecidos na técnica. pDAB107553 contém duas unidades de transcrição de Planta (PTUs). A primeira PTU (SEQ ID NO: 3) consiste no promotor de Arabidopsis thaliana ubiquitina-10 (AtUbilO promotor; Callis et al., 1990.) Que a-ciona a sequência de codificação dgt-28 (DGT-28; Shagin Pub, de Pat Pub. Internacional No. WO2013116700) que contém o peptídeo de trânsito da clorofila, TraP23 (Trap23; Pub. de Pat. Internacional No. WO2013116764), e é terminado pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens 23 (3'UTR Atu-ORF23; Gelvin et al., 1987). A segunda PTU (SEQ ID NO: 4) é constituída pelo promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (promotor CsVMV; Verdaguer et al., 1996.) que é utilizado para conduzir a sequência de codificação de fosfinotricina acetil transferase (PAT; Wo-hlleben et al., 1988.), terminado pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta de A. tumefaciens 1 (3'UTR AtuORFI; Huang et al., 1990). O vetor binário resultante continha um gene marcador/de resistência tolerante a herbicidas selecionável e um gene marcador sele-cionável de antibióticos e foi subsequentemente utilizado para a transformação de soja. [0171] O vetor binário, pDAB107553, foi mobilizado para a cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 (Hood et al., 1986) utilizando ele-troporação. Colônias individuais foram identificadas as quais cresceram no meio YEP contendo o antibiótico spectinomicina. As colônias únicas foram isoladas e a presença do vetor binário pDAB107553 foi confirmada por meio de digestão com enzimas de restrição. [0172] A nova semente dividida de soja mediada por Agrobacterium que compreende uma parte de um método de transformação do eixo embrionário descrito no Exemplo 2 foi utilizada para transformar soja madura (Glycine max), cv. sementes Maverick com uma cepa A-grobacterium abrigando pDAB107553. Três diferentes concentrações de glifosato (por exemplo, 0,025 mM, 0,05 mM e 0,1 mM) foram incorporadas aos sistemas de seleção para a semente dividida de soja compreendendo uma parte de um método de transformação do eixo embrionário. [0173] Conforme a experiência de transformação evoluiu por várias fases subcultura, a saúde dos explantes de soja deteriorou. Os maiores efeitos fisiológicos adversos foram observados com o mais alto nível de glifosato (por exemplo, 0,1 mM) e os efeitos fisiológicos adversos reduzidos com a diminuição da concentração de glifosato. Após o primeiro ciclo de seleção (ou seja, duas semanas em meio Sl-2), amarelecimento dos cotilédones foi observado para a cultura de explantes de soja na seleção de glifosato. A intensidade da coloração amarelada dos cotilédones foi mais proeminente em explantes de soja cultivados em maiores taxas de glifosato (Fig. 9). [0174] Enquanto os explantes de soja foram sendo mantidos em meio contendo glifosato, observou-se que os explantes foram mostrando amaciamento nas superfícies dos tecidos vegetais que estavam em contato direto com o meio. A superfície dos explantes foi transformando macia e cremosa em consistência. O efeito de amolecimento foi muito pronunciado no final da fase SE-1 em diante. Por conseguinte, os explantes foram transferidos para o meio que não contêm o a-gente seletivo de glifosato. Metade dos explantes de replicação 1 e replicação 2 foram transferidos para meios que não continham qualquer agente de seleção de glifosato no final da fase SE-1. Subsequentemente, todos os explantes foram transferidos para meios que não continham qualquer seleção de glifosato no final de SE-2 (Tabela 5). Uma vez que o amaciamento foi muito pronunciado na replicação 1 e replicação 2, a metade dos explantes de replicação 3 foram transferidos para meios que não continham qualquer agente de seleção de glifosato no final da fase SI-2. Até o final da fase SE-1, todos os explantes da replicação 3 foram transferidos para um meio que não continha qualquer agente de seleção de glifosato. [0175] Tabela 5: Mostra o número de explantes que avançaram através de cada estágio de subcultura. Os números de explantes em cada fase da cultura de seleção são providos, enquanto os números sublinhados mostram o número de explantes não movidos para ne- nhum meio de seleção. [0176] Para todos as três repetições, o efeito de amaciamento dos explantes não termina quando os explantes foram transferidos para um meio que não continha glifosato, e os explantes macios continuaram em todas as fases subsequentes da subcultura. Estes resultados indicam que uma vez, os explantes foram expostos ao glifosato, a exposição inicia o amolecimento do tecido, que persiste, mesmo quando os explantes são depois mudados para meio livre de glifosato. [0177] As amostras de todos os brotos que sobreviveram foram isoladas dos explantes e foram enviadas para análise molecular para confirmar se eram transgênicas. Depois de confirmar a presença ou ausência do transgene nos brotos, os eventos de soja transgênica foram transferidos para meio de enraizamento e foram posteriormente enviados para a estufa para aclimatação e para um maior crescimento no solo. [0178] Conforme demonstrado na Tabela 6, cada tratamento particular de glifosato no meio de cultura de tecidos resultou na produção de brotos transgênicos. Apesar da presença de um efeito amaciador nos explantes expostos ao glifosato, brotos transgênicos foram produzidos para todas as concentrações testadas de glifosato. Além disso, os brotos foram transferidos para meio de enraizamento e muitos dos brotos enraizados com sucesso. Em geral, a semente dividida de soja compreendendo uma porção de uma transformação do eixo embrionário resultou em uma eficiência de transformação de 5,3 % para 3,9 %. No entanto, houve alguma perda de plantas transgênicas, que não produzem raízes. Além disso, a frequência de transformação foi reduzida quando as plantas transgênicas não sobrevivem na estufa. Como tal, uma frequência de transformação de 0,63% (por exemplo, o que resulta em 8 plantas transgênicas) foi obtida para as plantas transgênicas enraizadas que sobreviveram na estufa e foram capazes de definir semente. A partir destas experiências, as plantas de soja transgênicas foram produzidas usando a semente dividida de soja compreendendo uma parte de um método de transformação do eixo embrionário que incorporou o glifosato como o agente de seleção. [0179] Tabela 6: Mostra frequência de transformação a partir de cada tratamento avaliado nesses experimentos com base na análise precoce (antes de enraizamento) e para número de brotos transgênicos enraizados com sucesso.
Continuação EXEMPLO 6: Transformação mediada por Agrobacterium de soja utilizando Explantes de semente dividida que compreende uma parte de um eixo embrionário e Higromicina como Agente de Seleção [0180] O protocolo de transformação de soja acima descrito (vide Exemplo 2) foi utilizado para transformação e seleção de um transge-ne que confere tolerância à higromicina. O gene HPT (Gritz, L. e Davi-es, J. (1983) Gene 25 (2-3), 179-188), foi incorporado em um cassete de expressão do gene como marcador selecionável e utilizado para semente dividida de soja que compreende uma porção de uma transformação do eixo embrionário. [0181] Inicialmente, um estudo de resposta de dose foi concluído. Para testar o efeito da higromicina nos explantes, higromicina foi adicionada aos meios utilizados desde a fase de iniciação do broto e em diante. Higromicina foi testada a partir do intervalo de 5 mg/L e 25 mg/L em Glycine max e Glycine max Jack c.v. plantas Maverick. Cinco concentrações de higromicina foram obtidas a partir de dois fornecedores diferentes, Sigma Aldrich (St. Louis, MO) e Phytotech (Shawnee Mission, KS), e testadas para a cultura de explantes de soja não transformadas. As concentrações incorporadas nos meios SI-2 foram de 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L e 25 mg/L. Os explantes de soja não transformada foram mantidos na mesma taxa de seleção de higromicina para todas as fases sucessivas de subcultura de meios SI-2 para a modalidade do protocolo de cultura de tecidos. O número de explantes saudáveis foram contados em cada fase de subcultura. Explantes mortos foram descartados e explantes saudáveis foram adicionalmente subcultivados em meios apropriados. [0182] No final da cultura no meio contendo higromicina, diferenças significativas no crescimento dos explantes foram observadas, quando os explantes foram expostos a diferentes níveis de higromicina (Tabela 7). O retardo de crescimento dos explantes foi proporcional ao aumento da dose de higromicina. Da mesma forma, o número de explantes mortos foi também proporcional ao aumento da dose de higromicina. O número de explantes mortos aumentou à medida que a dose de higromicina foi aumentada. Nas doses mais elevadas utilizadas neste estudo (10 mg/L e 25 mg/L), apenas um pequeno número de explantes sobreviveu. Do mesmo modo, um grande número de explantes foi capaz de sobreviver em meio contendo 5 mg/L de higromicina. Comparativamente, quase todos os explantes estavam vivos no meio de controle que não continha higromicina. Embora um grande número de explantes foi capaz de sobreviver em todos os níveis de higromicina testada no final de SE-1, a maior parte dos explantes estava morta no final da SE-2 para explantes cultivados em meio contendo higromicina em concentrações de 10 mg/L até 25 mg/L. Estes resultados indicam que uma dose de 5 mg/L de higromicina testada é aceitável para utilização em meios de cultura de tecidos. [0183] Tabela 7: Resultados de estudos de resposta à dose. A tabela fornece o número de explantes que foi avançado através de cada estágio de subcultura em diferentes tipos de meios contendo uma série de higromicina. [0184] Um vetor binário único rotulado como pDAB105958 (FIG. 10) foi construído utilizando processos reconhecidos na técnica. pDAB105958 contém duas unidades de transcrição de Planta (PTUs). A primeira PTU (SEQ ID NO: 5) é constituída pelo promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (promotor CsVMV; Verdaguer et al 1996.) que aciona a sequência de codificação hpt (HPT; Gritz e Davi-es, 1983), e é terminada pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens 23 (AtuORF23 3'UTR;. Gel-vin et al., 1987). A segunda PTU (SEQ ID NO: 6) consiste no promoto Arabidopsis thaliana de ubiquitina-10 (promotor AtUbilO; Callis et al., 1990.) que aciona a sequência de codificação de fosfinotricina acetil transferase (PAT; Wohlleben et al., 1988.), terminada pela região não traduzida 3' de quadro de leitura aberta de A. tumefaciens 1 (3'UTR AtuORFI; Huang et al., 1990). O vetor binário resultante continha um gene marcador/de resistência tolerante a herbicidas selecionáveis e um gene marcador selecionável a antibióticos e foi subsequentemente utilizado para a transformação de soja. [0185] O vetor binário, pDAB105958, foi mobilizado para a cepa Agrobacterium tumefaciens de EHA105 (Hood et al., 1986) utilizando eletroporação. Colônias individuais foram identificada as quais cresceram em meio YEP contendo o antibiótico spectinomicina. As colônias únicas foram isoladas e a presença do vetor binário pDAB105958 foi confirmada por meio de digestão com enzimas de restrição. [0186] A nova semente dividida de soja mediada por Agrobacteri-um que compreende uma parte de um método de transformação do eixo embrionário descrito no Exemplo 2 foi utilizada para transformar soja madura (Glycine max), cv. sementes Maverick com uma cepa A-grobacterium abrigando pDAB105958. Três concentrações diferentes de higromicina (por exemplo, de 8 mg/L, 5 mg/L e 3 mg/L) foram incorporadas nos esquemas de seleção para a semente dividida de soja que compreende uma parte de um método de transformação do eixo embrionário. [0187] Enquanto os explantes de soja foram sendo mantidos em meio contendo higromicina, observou-se que os explantes foram mostrando amaciamento nas superfícies dos tecidos vegetais que estavam em contato direto com o meio. Por conseguinte, os explantes foram transferidos para o meio que não contêm o agente seletivo de higromicina no estágio SE-3 de cultura (Tabela 8). [0188] Tabela 8: Mostra a concentração de higromicina e o número de explantes que sobreviveram no final de cada fase de seleção. [0189] As amostras de todos os brotos que sobreviveram foram isoladas dos explantes e foram enviadas para análise molecular para confirmar se eram transgênicas. Depois de confirmar a presença ou ausência do transgene no broto, os eventos de soja transgênica foram transferidos para meio de enraizamento e foram posteriormente enviados para a estufa para aclimatação e para um maior crescimento no solo. Como mostrado na Tabela 9, a metade dos tratamentos de hi-gromicina dentro do meio de cultura de tecidos resultou na produção de brotos transgênicos. Apesar da presença de um efeito amaciador nos explantes expostos à higromicina, brotos transgênicos foram produzidos em meio contendo o agente seletivo de higromicina. A partir destas experiências, brotos de soja transgênica foram produzidos u-sando a semente dividida de soja que compreende uma parte de um método de transformação do eixo embrionário que incorporava a higromicina como agente de seleção. [0191] Tabela 9: Mostra frequência transformação a partir de cada tratamento avaliado nesses experimentos com base na análise precoce (antes de enraizamento) e no número de brotos transgênicos produzidos com sucesso. [0192] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe, enten-de-se que tal detalhe destina-se unicamente ao propósito de ilustração, e variações podem ser feitas pelos versados na técnica sem se afastar do espírito e escopo da invenção, que é definido pelas seguintes reivindicações.

Claims (24)

1. Método de produção de um evento transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende: inserir uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente de soja para formar um primeiro segmento de cotilédone e um segundo segmento de cotilédone, em que a semente inclui um eixo embrionário; inocular o primeiro segmento de cotilédone incluindo uma porção do eixo embrionário com Agrobacterium, o Agrobacterium incluindo pelo menos um transgene, e cultivar o segmento de cotilédone inoculado para produzir um evento transgênico em uma célula vegetal transformada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a remoção do revestimento de semente do primeiro segmento do cotilédone e do segundo segmento de cotilédone antes de inocular o primeiro segmento de cotilédone.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inserção da ferramenta de corte compreende o corte do eixo embrionário longitudinalmente para reter uma porção do eixo embrionário com cada segmento de cotilédone.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o eixo embrionário da ferramenta de semente de soja tem um comprimento não cortado antes de se inserir a ferramenta de corte, e a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone tem um comprimento que é cerca de 1/3 a 1/2 do comprimento não cortado do eixo embrionário da semente de soja.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cortar a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone para o comprimento que é cerca de 1/3 a 1/2 do comprimento não cortado do eixo embrionário da semente de soja.
6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o eixo embrionário da semente de soja tem um comprimento não cortado antes de se inserir a ferramenta de corte, e a porção do eixo embrionário do primeiro segmento de cotilédone tem um comprimento igual ao comprimento não cortado.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inserção da ferramenta de corte compreende o corte da semente de soja longitudinalmente ao longo de um hilo da semente de soja.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a localização do hilo sobre a superfície exterior da semente de soja, e orientar a ferramenta de corte em relação à semente de soja para alinhar a ferramenta de corte com o hilo antes de se inserir a ferramenta de corte.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada segmento de cotilédone inclui uma porção do hilo.
10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a semente de soja tem um eixo longitudinal que se estende através do hilo, o eixo longitudinal dividindo a semente de soja em um primeiro lado e um segundo lado, o método adicionalmente compreendendo a agarrar o primeiro lado da semente de soja antes da inserção a ferramenta de corte.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inserção da ferramenta de corte compreende o a-vanço da ferramenta de corte para o eixo embrionário da semente de soja antes da formação dos primeiro e segundo segmentos de cotilé-dones.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a produção de uma planta de soja fértil, completa a partir do segmento de cotilédone inoculada cultivada, em que a planta de soja fértil, completa compreende o evento transgê-nico.
13. Planta inteira, fértil, de soja, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 12, em que o evento transgênico de uma planta de soja fértil, completa, compreende o evento transgênico.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a produção de uma progênie de uma planta de soja fértil, completa em que a planta compreende o e-vento transgênico e, opcionalmente, compreende a produção de sementes de soja a partir da planta da progênie.
15. Planta progênie, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 14, em que a planta compreende o evento transgênico.
16. Semente de soja, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido na reivindicação 14, em que a semente de soja é produzida a partir da planta progênie de sementes de soja, que compreende o evento transgênico.
17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a produção de uma planta progênie, o método adicionalmente compreendendo as etapas de: cruzar a planta de soja fértil, completa com outra planta de soja, colher a semente progênie do cruzamento da etapa (a), em que a semente progênie inclui do evento transgênico, plantar a semente de progênie, crescer a planta progênie a partir da semente de progênie, a planta progênie incluindo o evento transgênico, e produzir uma planta progênie subsequente a partir da planta progênie cultivada na etapa (d), a planta progênie subsequente, incluindo o evento transgênico.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene é selecionado dentre o grupo consistindo no gene de resistência a inseticida, gene de tolerância a herbicidas, gene de eficiência de utilização do nitrogênio, gene de eficiência de uso da água, gene de qualidade nutricional, gene de ligação ao DNA, e gene marcador selecionável.
19. Método de produção de um evento transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende: inserir uma ferramenta de corte em um revestimento de semente de uma semente para formar um segmento de cotilédone incluindo uma porção do eixo embrionário, inocular o segmento de cotilédone que inclui a porção do eixo embrionário com Agrobacterium, o Agrobacterium, incluindo pelo menos um transgene, cultivar o segmento de cotilédone inoculado para produzir um evento transgênico em uma célula vegetal transformada, e produzir uma planta inteira, fértil do segmento de cotilédone inoculado cultivado, a planta fértil, inteira incluindo o evento transgênico.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente dicotiledônea.
21. Planta progênie da planta fértil, completa de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a planta progênie inclui o evento transgênico.
22. Semente, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da planta progênie, como definida na reivindicação 21, a semente incluindo o evento transgênico.
23. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a inserção da ferramenta de corte no revestimento de semente da semente forma um primeiro segmento de cotilédone e um segundo segmento de cotilédone, cada segmento de cotilédone incluindo uma porção do eixo embrionário.
24. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o transgene compreende uma gene marcador se-lecionável pat, dgt-28 ou hpt.
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