JP2018521648A - 自動化された外植片調製のためのシステム及び使用方法 - Google Patents

Abstract

形質転換及びトランスジェニックエンジニアリング用の外植片を自動化または半自動化調製するためのシステム及び方法。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)項の規定により、2015年6月29日に出願された米国特許出願公開第62/186,059号の利益を主張するものであり、その出願の全開示が参照により本明細書に援用される。

本開示は、一般に、植物育種で用いる種子を調製するための装置に関し、より具体的には、遺伝子形質転換及びトランスジェニックエンジニアリング用の外植片を調製するための装置に関する。

ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））は最も重要な農作物の1つであり、年間収穫量は2億メートルトンを超え、評価価格は全世界で400億米ドルを超える。ダイズは、世界の全脂肪種子生産量のうちの97%超を占めている。したがって、この価値ある作物の品質及び収穫量を向上させる信頼性の高い効率的な方法に、大きな関心が集まっている。

ダイズ改良のための従来の育種方法には制約があったが、これは、多くのダイズ栽培品種がほんのわずかの親系統に由来しており、育種に対して生殖質系が限られるからである。Christou et al., TIBTECH 8:145-151 (1990)。最近の研究の取り組みは、ダイズの生産量を向上させる植物遺伝子工学技術に焦点を絞ってきている。トランスジェニック法は、所望の遺伝子を収穫植物の遺伝性生殖系列に導入して、優良種系統を生成するように設計される。このアプローチは、いくつかの他の収穫植物の病害、昆虫、及び除草剤に対する耐性を向上させつつ、栄養価を上げることに成功してきた。

遺伝子を植物組織内に移入するためにいくつかの方法が開発されており、遺伝子銃（高速微粒子銃など）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び直接DNA取り込みが挙げられる。ここ最近では、アグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換が、対象となる遺伝子をダイズ内に導入するのに用いられている。しかしながら、ダイズはトランスジェニックエンジニアリングには難しい系であることがわかってきた。ダイズ外植片の効率的な形質転換及び再生を達成するのが困難であり、また再現が難しいことが多いのである。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）という土壌に生息する病原菌は、T-DNAと称する自身のDNAを宿主植物細胞内に移入し、宿主細胞が細菌の栄養として利用できる代謝産物を産生するように誘導する固有の能力を持つ。組換え技術を用いると、T-DNAの一部または全てを対象の1つまたは複数の遺伝子と置き換えて、宿主植物を形質転換するのに有用な細菌ベクターを作製することができる。アグロバクテリウム媒介遺伝子導入は、通例、組織培養での未分化細胞を対象とするが、植物の葉または茎から採取された分化細胞を対象とする場合もある。ダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子形質転換に対していくつかの手順が開発されており、それらは形質転換に付される外植片組織に基づいて大まかに分類することができる。

米国特許第7,696,408号（Olhoftら）には、単子葉植物及び双子葉植物の両方を形質転換させる子葉節法が開示されている。この「子葉節」法は、5〜7日齢のダイズの実生から、子葉節の直下を切断することによって下胚軸を除去し、子葉と共に残った下胚軸片を分割及び分離し、子葉から上胚軸を除去することを要する。子葉外植片の腋芽及び／または子葉節の領域に傷をつけ、アグロバクテリウム（Agrobacterium）・ツメファシエンスと共に暗所で5日間培養する。この方法は、種子のin-vitro発芽を必要とし、また傷をつける工程は大きなばらつきを招く。

米国特許第6,384,301号（Martinelliら）には、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子をダイズ種子から切り取られたダイズ胚由来の生分裂組織に送達し、続いてその分裂組織外植片を選択剤とホルモンとで培養して苗条形成を誘導することが開示されている。「子葉節」法と同様に、分裂組織外植片には、感染させる前に傷をつけることが好ましい。

米国特許第7,473,822号（Pazら）には、「半種子外植片」法と称する改変された子葉節法が開示されている。成熟ダイズ種子を吸水させ、表面殺菌し、臍に沿って分割する。感染前に、胚軸と苗条とを完全に除去するが、他に傷をつけることは行わない。アグロバクテリウム媒介形質転換が進行し、有望な形質転換体が選択され、外植片が選択培地で再生される。

形質転換効率は、これらの方法を用いた場合、比較的低いままであり、「子葉節」法は約0.3%〜2.8%であり、「分裂組織外植片」法は約1.2%〜4.7%であり、「半種子外植片」法は約3.2%〜8.7%（全体として4.9%）である。当該技術では、形質転換効率は約3%であるのが典型的である。

改良された「分割種子」トランスジェニックプロトコルが、トランスジェニックダイズ製品の今後の生産及び開発を促進する可能性がある。導入遺伝子をダイズ組織に安定して組み込むための高効率かつハイスループットな方法は、育種プログラムに役立ち、また作物の生産性を向上させる可能性を有するはずである。

自動化された外植片調製のための方法及び装置が開示される。一態様によると、自動化された外植片調製方法は、複数の外植片を含む外植片ディッシュをアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で充填するようにポンプを操作することと、充填済外植片ディッシュをシェーカーステーションのシェーカープレート上に移動させるように第1のロボットアームを操作することと、複数の外植片をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染させるために、シェーカープレートを該シェーカープレートによって画定される面内のある方向に動かすようにシェーカーステーションを操作することと、外植片がアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染したとの判定に呼応して、充填済外植片ディッシュからの外植片を培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように第2のロボットアームを操作することと、を含み得る。

一部の実施形態では、方法は、培養培地ディッシュが該培養培地ディッシュ上に載置された所定の数の外植片を有するとの判定に呼応して、培養培地ディッシュを送達ステーションに移動させるように第1のロボットアームを操作することをさらに含み得る。また、一部の実施形態では、方法は、培養培地ディッシュが該培養培地ディッシュ上に載置された所定の数の外植片を有するとの判定をすることが、培養培地ディッシュが該培養培地ディッシュ上に載置されたn個の外植片を有し、かつ該外植片が培養培地ディッシュ上で360/n度ずつ離間して等間隔で配置されていると判定することを含むことを、さらに含み得る。

一部の実施形態では、培養培地ディッシュを移動させるように第1のロボットアームを操作することが、培養培地ディッシュの蓋を培養培地ディッシュの上にするように第1のロボットアームを操作することと、該蓋をした培養培地ディッシュを送達ステーションに移動させるように第1のロボットアームを操作することとを含み得る。

一部の実施形態では、方法は、充填済外植片ディッシュの基部の画像をカメラを用いて取り込むことと、該画像に基づいて充填済外植片ディッシュ内の外植片の位置を算出することと、該外植片を該位置で把持するように第2のロボットアームを操作することとをさらに含み得る。加えて、一部の実施形態では、外植片を移動させるように第2のロボットアームを操作することが、該外植片を把持するように第2のロボットアームを操作することに呼応して、該外植片を移動させるように第2のロボットアームを操作することを含み得る。

一部の実施形態では、充填済外植片ディッシュ内の外植片の位置を算出することが、充填済外植片ディッシュ内の複数の外植片の位置を算出することと、該複数の外植片から該外植片を選択することとを含み得る。

また、一部の実施形態では、方法は、複数の培養培地ディッシュから、該複数の培養培地ディッシュの各々の上に現状載置されている外植片の数に基づいて、該培養培地ディッシュを選択することをさらに含み得る。一部の実施形態では、培養培地ディッシュを選択することが、培養培地ディッシュ上に6個未満の外植片が現状載置されている培養培地ディッシュを選択することを含むことができ、また充填済外植片ディッシュからの外植片を、選択された培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように第2のロボットアームを操作することが、培養培地ディッシュ上に現状載置されている他の各外植片の位置に基づいて、該外植片の移動先となる選択された培養培地ディッシュ上の所定の位置を算出することを含み得る。

一部の実施形態では、方法は、複数の培養培地ディッシュのうちの各培養培地ディッシュを、該複数の培養培地ディッシュのうちの他の各培養培地ディッシュの位置とは異なる移送ステーション上の所定の位置に、ディッシュ供給器から移動させるように第1のロボットアームを操作することをさらに含み得る。一部の実施形態では、方法は、各培養培地ディッシュが該培養培地ディッシュ上に載置された所定の数の外植片を有するとの判定に呼応して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を、充填済外植片ディッシュからポンプで吸い出し、かつ溶液廃棄容器内にポンプで注入するように、第2のポンプを操作することをさらに含み得る。加えて、一部の実施形態では、方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液が充填済外植片ディッシュから除去されたとの判定に呼応して、充填済外植片ディッシュをディッシュ廃棄容器に移動させるように第1のロボットアームを操作することを含み得る。

一部の実施形態では、方法は、充填済外植片ディッシュを移動させるように第1のロボットアームを操作することが、充填済外植片ディッシュを捕捉するように圧縮空気源を用いて第1のロボットアームの爪状グリップを操作することを含み、外植片を移動させるように第2のロボットアームを操作することが、第2のロボットアームの負圧源を用いて外植片にかかる吸引力で外植片を固定するように第2のロボットアームを操作することを含み得ることを、包含し得る。一部の実施形態では、外植片を移動させるように第2のロボットアームを操作することが、外植片の感染に伴う所望の感染時間に達したとの判定に呼応して、外植片を充填済外植片ディッシュから移動させるように第2のロボットアームを操作することを含み得る。

一部の実施形態では、シェーカープレートを動かすようにシェーカーステーションを操作することが、該プレートによって画定される面内での回転移動または横方向移動の少なくとも1つを含む移動パターンで該プレートを動かすことを含み得る。さらに一部の実施形態では、方法は第2のロボットアームのグリップを殺菌することを含み得る。一部の実施形態では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含み得る。他の実施形態では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含み得る。加えて、一部の実施形態では、外植片はダイズ外植片を含み得る。他の実施形態では、外植片はキャノーラ胚軸片を含み得る。

別の態様によると、外植片調製装置は、移動のために外植片ディッシュを捕捉する爪状グリップを備えた第1のロボットアームと、移動のために吸引力を用いて外植片を固定する吸引グリップを備えた第2のロボットアームと、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を送達するように構成されたポンプと、シェーカープレートを備え、かつシェーカープレートを動かすように構成されたシェーカーステーションと、電子制御装置とを含み得る。一部の実施形態では、電子制御装置は、複数の外植片を含む外植片ディッシュをアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で充填するようにポンプを操作し、充填済外植片ディッシュをシェーカーステーションのシェーカープレート上に移動させるように第1のロボットアームを操作し、複数の外植片をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染させるために、シェーカープレートを該シェーカープレートによって画定される面内のある方向に動かすようにシェーカーステーションを操作し、外植片がアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染したとの判定に呼応して、充填済外植片ディッシュからの外植片を培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように第2のロボットアームを操作するよう構成され得る。

一部の実施形態では、外植片調製装置は、移動のために外植片ディッシュを捕捉する爪状グリップを備えた第3のロボットアームをさらに含み得る。一部の実施形態では、第1のロボットアームは圧縮空気源を含むことができ、電子制御装置は爪状グリップを開位置と閉位置との間で動かすために圧縮空気源を操作するように構成され得る。一部の実施形態では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含み得る。他の実施形態では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含み得る。加えて、一部の実施形態では、外植片はダイズ外植片を含み得る。他の実施形態では、外植片はキャノーラ胚軸片を含み得る。

さらなる別の態様によると、ディッシュ供給システムは、ハウジングと、該ハウジングに固定され、かつ縦軸を中心とした細長の本体であって、積み重ねられたペトリディッシュを縦軸に沿って固定するように構成された該細長の本体と、該ハウジング内に位置し、かつ積み重ねられたペトリディッシュのうちの1組のペトリディッシュを縦軸に沿って第1の方向に移動させて、積み重ねられたペトリディッシュのうちの第1のペトリディッシュを該1組のペトリディッシュから分離するように構成された第1の空気圧装置と、該ハウジング内に位置し、かつ該分離された第1のペトリディッシュを縦軸に直交する軸に沿って移動させるように構成された第2の空気圧装置とを含み得る。

一部の実施形態では、第1の空気圧装置は、1組のペトリディッシュのうちの最下部のペトリディッシュを固定するように構成された一対のディッシュグリップアームを含み得る。また、一部の実施形態では、第2の空気圧装置は、分離された第1のペトリディッシュをハウジング外側の位置まで移動させるように構成され得る。一部の実施形態では、ディッシュ供給システムは、ハウジング内に位置し、かつ分離された第1のペトリディッシュが第2の空気圧装置によって操作されるプレート延長部から除去されたとの判定に呼応して、1組のペトリディッシュを第1の方向とは反対の第2の方向に移動させるように構成された、第3の空気圧装置をさらに含み得る。

詳細な説明は、特に以下の図面を参照する。
図１及び図２は、遺伝子形質転換用に外植片（例えば、ダイズ種子外植片）を調製するためのシステムの斜視図である。 同上。 図３は、図１のシステムの上面図である。 図４は、図１に示すシステムのロボットアームの爪状グリップ組立体の側面図である。 図５は、図４に示す爪状グリップ組立体の爪状グリップの斜視図である。 図６は、図１に示すシステムのロボットアームの吸引グリップ組立体の斜視図である。 図７は、図１に示すシステムのポンピングシステムの斜視図である。 図８は、図７に示すポンピングシステムのうちの部分的に組み立てられた流体送達システムの斜視図である。 図９は、図８に示す組み立てられた流体送達システムの使用時の側面図である。 図１０は、図７に示すポンピングシステムのうちの流体抽出システムの使用時の側面図である。 図１１は、図１に示すシステムのシェーカーステーションの斜視図である。 図１２〜図１９は、種々の動作段階における図１に示すシステムのディッシュ供給システムの図である。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２０は、図１に示すシステムの送達ステーションの斜視図である。 図２１は、図１に示すシステムの殺菌装置の斜視図である。 図２２は、イメージングステーションを含む図１に示すシステムの移送ステーションの斜視図である。 図２３は、図１に示すシステムの簡略化したブロック図である。 図２４〜図２５は、図１に示すシステム用の例示的な操作手順を示すブロック図である。 同上。 図２６は、培養培地ディッシュを図１２〜図１９に示すディッシュ供給システムから図１に示すシステムの移送ステーションに移動させるための例示的な手順を示すブロック図である。 図２７は、感染済外植片を充填済外植片ディッシュから培養培地ディッシュまで移動させるための例示的な手順を示すブロック図である。 図２８は、培養培地ディッシュを図２０に示す送達ステーションに移動させるための例示的な手順を示すブロック図である。 図２９〜図３０は、図１のシステムによってピックアップされるべき外植片を特定するための図２７に示す操作手順のうちの画像取り込みプロセスを説明する図である。 同上。

本開示の概念は、様々な改変及び別形態を受容可能であるが、その特定の例示的な実施形態が図面において例として示されており、また本明細書に詳細に記載されることになる。ただし、本開示の概念を、開示される特定の形態に限定する意図はなく、むしろ逆に、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神及び範囲内にある全ての修正形態、均等物、及び代替形態を包含することを意図することが理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「捕捉」及び「把持」という用語は、外植片（例えば、ダイズ種子外植片またはキャノーラ胚軸片）を道具を用いて保持することまたは捕らえることを意味する。外植片を確実に握ることを可能にする任意の以後の機構または作用も、捕捉という用語の範囲内にあると見なされる。

本明細書で使用される場合、「遺伝子組換え」または「トランスジェニック」植物は、形質転換によって植物細胞、植物組織、植物部位、植物生殖質、または植物のゲノム中に導入される予め選択されたDNA配列を備えた植物細胞、植物組織、植物部位、植物生殖質、または植物を意味する。

本明細書で使用される場合、「トランスジェニック」、「異種」、「導入」もしくは「外来」DNAまたは遺伝子という用語は、組換えDNAまたは遺伝子のレシピエントである植物のゲノム中に天然には存在しないか、または、非形質転換の植物中とは異なるゲノム内の位置もしくは会合でレシピエント植物に存在する組換えDNA配列または遺伝子を意味する。

本明細書で使用される場合、「外植片」という用語は、ドナー植物から（例えばドナー種子から）除去または単離され、in vitroで培養され、好適な培地中で生長可能であるダイズ外植片組織またはキャノーラ胚軸などの植物組織（例えば形質転換可能な植物組織）の小片を意味する。

本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、植物全体、植物組織、植物部位（花粉、種子、もしくは胚を含む）、植物生殖質、植物細胞、または植物群のいずれかを意味する。本発明の方法で使用され得る植物の類は、ダイズに限定されず、一般に、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含めた、形質転換技術に適した任意の植物を含み得る。

本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝子学的に安定した遺伝をもたらす、宿主生物体への核酸または断片の移入及び組み込みを意味する。変換された核酸断片を含む宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。形質転換の既知の方法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）もしくはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）媒介性形質転換、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えばソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸DNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、遺伝子銃（微粒子銃）、シリコンカーバイドWHISKERS（商標）媒介性形質転換、エアゾールビーミング（aerosol beaming）、またはPEG形質転換、ならびに他の実行可能な方法が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「形質転換可能な植物組織」という用語は、植物において広範な宿主域を有し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）による形質転換に適した任意の植物部位を意味する。Nester E., Front Plant Sci.5:730 (2015)。形質転換可能な植物組織として、例えば、ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））、ナタネ（キャノーラとも称する）（ブラッシカ・ナプス（Brassica napus））、メイズ（トウモロコシとも称する）（ゼア・マイス（Zea mays））、ワタ（ゴシピウム属種（Gossypium spp.））、ベニバナ（カルタマス・チンクトリウス（Carthamus tinctorius））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Helianthus annuus））、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））、シロイヌナズナ、トウゴマの実（リシヌス・コムニス（Ricinus communis））、ココナツ（ココス・ヌシフェラ（Cocus nucifera））、コリアンダー（コリアンドラム・サティバム（Coriandrum sativum））、ラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Arachis hypogaea））、アブラヤシ（エラエイス・ギネイス（Elaeis guineeis））、オリーブ（オレア・ユーパエア（Olea eurpaea））、イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））、カボチャ（ククルビタ・マキシマ（Cucurbita maxima））、オオムギ（ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare））、サトウキビ（サッカルム・オフィシナルム（Saccharum officinarum））、イネ（オリザ・サティバ（Oryza sativa））、コムギ（トリチカム・デュラム（Triticum durum）及びトリチカム・アスティバム（Triticum aestivum）を含むトリチカム属種（Triticum spp.））、ウキクサ（レムナセアエ属種（Lemnaceae sp.））、テンサイ（ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris））、アルファルファ（メジカゴ・サチバ（Medicago sativa））、ソルガム、及びシバなどの双子葉植物種または単子葉植物種由来の細胞が挙げられる。したがって、任意の適した植物種または植物細胞が、形質転換可能な植物組織源として選択され得る。一部の実施形態では、形質転換可能な植物組織には、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、及び外植片が含まれる。

植物の再生に用いることができる形質転換可能な植物組織として、例えば、胚、未熟胚、胚軸細胞（例えば、キャノーラ胚軸片）、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸状物、花、及び仁由来の組織が挙げられる。また、形質転換可能な植物組織として、細胞壁を完全に及び部分的に除去した植物細胞を表すプロトプラスト及びスフェロプラストが挙げられる。

図１〜図３を参照すると、遺伝子形質転換用の外植片（例えばダイズ種子外植片またはキャノーラ胚軸片）を、任意の既知の方法により自動調製するためのシステム10が示されている。システム10は、トランスジェニックプロトコル及びトランスジェニックダイズ製品開発の一部として、ダイズ種子外植片（以下、種子外植片12）を調製するように例示的に構成されている。例示的なトランスジェニックプロトコルが、「IMPROVED SOYBEAN TRANSFORMATION FOR EFFICIENT AND HIGH-THROUGHPUT TRANSGENIC EVENT PRODUCTION」と題する米国特許出願公開第14/133,370号、及び 「IMPROVED SOYBEAN TRANSFORMATION FOR EFFICIENT AND HIGH-THROUGHPUT TRANSGENIC EVENT PRODUCTION」と題する米国特許出願公開第14/134,883号に記載され、これらの出願は参照により本明細書に明示的に援用される。さらに、一部の実施形態では、本明細書に記載の技術は、「SYSTEM FOR IMAGING AND ORIENTING SEEDS AND METHOD OF USE」と題する米国特許仮出願第61/989,266 号、「SYSTEM FOR SEED PREPARATION AND METHOD OF USE」と題する米国特許仮出願第61/989,275号、及び／または「SYSTEM FOR CUTTING AND PREPARING SEEDS AND METHOD OF USE」と題する米国特許仮出願第61/989,276号に記載された技術と併用されてもよく、これらの出願は参照により本明細書に明示的に援用される。

より具体的には、以下に記載するように、システム10は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を外植片（例えば、種子外植片または胚軸片12）入りのディッシュに送達し、外植片12を攪拌し（例えば、種子外植片12入りのディッシュを振盪することによって）、外植片12を培養培地ディッシュ（例えば、寒天生育培地入りのディッシュ）へ移送するように構成される。システム10は、この手順に係わる作業の繰り返しに付随してユーザーが負傷するというリスクを低減し、人のアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液への曝露を低減し、外植片12が品質保証のために一様に処理されることを確保する。

本明細書に記載の装置及び方法のいずれも、前述の出願に記載された形質転換方法と併用して使用され得ることが理解されるべきである。他の実施形態において、本明細書に記載の装置及び方法のいずれも、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含めた、形質転換技術に適した植物の他の類と共に使用するように構成され得ることも理解されるべきである。

システム10は、外植片12及び／またはディッシュ16を、テーブル18の上に配置された種々のステーション間で移動させる1組のロボットアーム14を含む。例示的な実施形態では、各ロボットアーム14は、他の各ロボットアーム14とは独立して操作するように構成されたエプソン製モデルC3の6軸多関節型アームである。他の実施形態では、ロボットアーム14は、本明細書に記載の自由度数とは異なる自由度数を有し得る。例えば、ロボットアーム14は、少なくとも2つの独立軸を有するロボットアームとして具現化されてもよい。

例示的な実施形態では、ロボットアーム14のうちの1つ（以下、ロボットアーム20）は、外植片12を捕捉及び保持するように構成された吸引グリップ22を含み（図６を参照）、他のロボットアーム14の各々（以下、ロボットアーム24）は、ディッシュ16またはディッシュ16の一部（例えば、ディッシュ16の基部またはディッシュ16の蓋）を捕捉及び保持するように構成された爪状グリップ26を含む。一部の実施形態では、システム10は、非稼働時にロボットアーム24のうちの1つを用いて操作することができる。また、他の実施形態では、システム10は、テーブル18の上に配置された種々のステーション間でディッシュ16を移動させる単一のロボットアーム24のみを含んでいてもよいことが理解されるべきである。さらに、例示的な実施形態では、各ロボットアーム14は、対応するグリップ22、26をアームの軸の周りに少なくとも180度回転させることができる。

図１〜図３に示すように、テーブル18の上に配置されたステーションは、一対の送達ステーション28と一対の移送ステーション30とを含む。例示的な実施形態では、送達ステーション28は、テーブル18の両端部寄りのテーブル18後部に位置し、そこでは、ユーザーがシステム10での処理用にディッシュ16を置くことができ、システム10での処理後にはユーザーが回収用にディッシュ16を置くことができる。また、移送ステーション30は、移送ステーション30の各々がロボットアーム20及びロボットアーム24のうちの少なくとも1つによってアクセス可能であるようにテーブル18の中央部寄りに位置する。以下により詳細に説明するように、移送ステーション30は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液で感染した外植片12を培養培地（例えば、寒天）を備えたディッシュ16へ移送するのに用いられる。

移送ステーション30の各々はまた、ディッシュ16内にある外植片12の多数の画像を取り込むように操作可能なイメージングステーション32を含む。さらに、システム10は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液の入ったディッシュ16内にある外植片12を攪拌または振盪するように操作可能である一対のシェーカーステーション34を含む。システム10はまた、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16に送達し、かつこれらのディッシュ16の中に含まれる外植片12をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染させた後に、ディッシュ16からアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を抽出するように構成されたポンピングシステム36を含む。加えて、システム10は、システム10で使用するためのディッシュ16を収容かつ供給するように構成された一対のディッシュ供給システム38を含む。例示的な実施形態では、ディッシュ供給システム38の各々は、一度に50個と同数のディッシュを収容するように構成される。さらに、システム10は、ロボットアーム20の吸引グリップ22を殺菌するように構成された殺菌装置40と、システム10での使用後に廃棄されたディッシュ16を受け取る一対のディッシュ廃棄容器42とを含む。

作動中、形質転換用にいくつかの外植片12を自動的に感染させるようにシステム10を操作することができる。それを行うため、システム10は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を外植片12入りのディッシュ16内にポンプで注入することができる。続いて、システム10は、外植片12が適正に感染するのを保証する所定の時間（例えば30分間）、外植片12入りのアグロバクテリウム（Agrobacterium）充填済ディッシュ16をシェーカーステーション34上に載置するように、ロボットアーム24を操作することができる。外植片12がシェーカーステーション34のところにある間、システム10は、寒天などの培養培地を含むディッシュ16を移送ステーション30上の所定の位置に供給するように、ロボットアーム24を操作することができる。シェーカーステーション34で所定の時間が経過した後に、システム10は、感染した外植片12入りのアグロバクテリウム（Agrobacterium）充填済ディッシュ16をイメージングステーション32の上に移動させるようにロボットアーム24を操作することができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）充填済ディッシュ16の1つ以上の画像がイメージングステーション32で取り込まれて、ディッシュ16上における外植片12の位置を算出することができる。取り込まれた画像（複数可）に基づいて、システム10は、外植片12を個々にディッシュ16から捕捉し、かつ外植片12の各々を培養培地ディッシュ16内の所定の位置に移動させるようにロボットアーム20を操作することができる。培養培地ディッシュ16が所定の数の感染済外植片12で充填された後、システム10は、充填済の培養培地ディッシュ16の各々を、システム10のユーザーがこれらの培養培地ディッシュ16を回収できる場所となる対応した送達ステーション28に移動させるようにロボットアーム24を操作することができる。システム10は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液の抽出を目的としてアグロバクテリウム（Agrobacterium）充填済ディッシュ16をポンピングシステム36に移動させ、かつ空になったディッシュ16をディッシュ廃棄容器42に廃棄するようにロボットアーム24を操作することができる。これらの処理工程の各々と、システム10の種々の構成要素とを、図４〜図３０を参照して以下により詳細に説明する。

ここで図４〜図５を参照すると、爪状グリップ26を含むロボットアーム24のうちの1つの一部が詳細に示されている。この例示的な実施形態では、ロボットアーム24の各々は、ディッシュ16またはディッシュ16の一部（例えば、ディッシュ16の基部またはディッシュ16の蓋）を捕捉及び保持するように構成されたグリップ組立体44を含む。この例示的な実施形態では、グリップ組立体44は、各アーム24の末端部分48に接続した本体46を含む。爪状グリップ26は、本体46の末端部分50に固定されている。

グリップ組立体44の例示的な爪状グリップ26は、グリップ組立体44に沿って画定される縦軸54から半径方向内側及び外側に動くように構成された3つの指部52を含み、爪状グリップ26、より詳細には指部52が、ディッシュ16と接触した状態及び接触していない状態になることができるようにする。例示的な実施形態では、爪状グリップ26の指部52は、各指部52が他の指部52の各々から縦軸54の周りに約120度ずつ離間して配置されるように等間隔で離間配置されている。

図示するように、指部52の各々は、グリップ組立体44の本体46の末端部分50から遠位に延在している。さらに、指部52の各々は、該当する指部52の遠位端58において画定される開口部56を含む。また、接触ねじ64が、指部52の遠位端58を貫通して縦軸54に向かって半径方向に延在し、ディッシュ16と接触してディッシュ16を捕捉するように構成される。本明細書で使用されるディッシュ16の各々は、ペトリディッシュとして、または基部60と蓋62とを含み、該蓋62が基部60に固定される際に基部60の上面に置かれ、かつ基部60を覆う任意の他のディッシュとして、具現化され得ることが理解されるべきである。

図４に示すように、グリップ組立体44は、ディッシュ16と接触した爪状グリップ26の指部52を動かすことによって、ディッシュ16を捕捉及び保持するように構成される。ディッシュ16が爪状グリップ26によって捕捉される際に、蓋62（まだ除去されていない場合）は開口部56で支えられるように構成され、接触ねじ64は、基部60と接触するように構成される。さらに、ロボットアーム24はグリップ組立体44を操作して、指部52をディッシュ16の基部60と接触するすぐ手前の位置に動かし、続いてグリップ組立体44を縦軸54に沿って基部60から離れる方向に動かすことによって、ディッシュ16の蓋62を除去することができる。

例示的な実施形態では、ロボットアーム24は、グリップ組立体44と爪状グリップ26とに供給される圧縮空気の圧力を調整するように構成された圧縮空気源66（例えば、圧縮空気ポンプ）を含む。例示的な実施形態では、圧縮空気源66は、ディッシュ16が捕捉される際に、壊れるおそれのあるディッシュ16を押しつぶすことなくディッシュ16を確実に保持するのに必要な圧力を供給するように構成される。例示的実施形態では、グリップ組立体44の本体46は、SMC Pneumatics社から市販されている、三指の32mmのボアグリッパー（bore gripper）（D-Y59AZ型位置決めグリッパーを備えた品番MHSL3-32D）として具現化される。

ここで、図６を参照すると、システム10のロボットアーム20は、外植片12を捕捉及び保持するように構成されたグリップ組立体80を含む。この例示的な実施形態では、グリップ組立体80は、ロボットアーム20の末端部分84に接続した本体82を含む。グリップ組立体80はまた、本体82を吸引グリップ22に連結する懸架機構86を含む。本体82は、末端部分84に固定された近位ディスク88と、近位ディスク88から遠位ディスク92へ延びる複数の支柱90とを有する。

懸架機構86は、ディスク92に固定された近位端94から遠位端96に延在している。図１３に示すように、グリップ22は懸架機構86の遠位端96に固定される。懸架機構86は、矢印98、100で示すようなグリップ22の軸方向移動を可能にし、グリップ22が外植片12と接触した状態で外植片を押しつぶすことなく前進することができるように構成される。例示的な実施形態では、懸架機構86は、例えば、グリップ22を外側に矢印100で示す方向に付勢するコイルばね102などの付勢要素を含む。

組立体80のグリップ22は、外植片12を捕捉及び保持するように構成される。例示的な実施形態では、グリップ22は、懸架機構86の遠位端96に固定された円筒体104を含む。円筒体104は、例えば、デュポン社から市販されているヴァイトン（Viton）などのエラストマー材料で形成される。他の実施形態では、他のエラストマー材料を使用できることが理解されるべきである。円筒体104は、円筒体104に限定的な可撓性をもたらすベローズを含む。円筒体104はまた、グリップ22の殺菌を可能にする高温定格を有する。例示的実施形態では、温度定格は華氏446度である。他の実施形態では、他のエラストマー材料を使用できることが理解されるべきである。

グリップ組立体80は、外植片12を真空により捕捉及び保持するように構成される。そのため、グリップ22は、軸108に沿って円筒体104を貫通して縦方向に延在する中空通路106を含む。通路106は、懸架機構86内に画定された通路110、ならびにグリップ組立体80の本体82及び負圧源112に連結される。負圧源112は、例示的にポンプとして具現化され、制御装置500に電気的に接続されている。制御装置500は負圧源112を操作して、通路106、110を介して真空に引き、外植片12をグリップ22に固定することができる。例示的な実施形態では、グリップ22は、外植片12の平均長（例えば種子外植片12の特定の種類に依存して変動し得る）の50パーセント未満の半径を有する。

ここで、図７〜図１０を参照すると、ポンピングシステム36は、複数のポンプ150を含み、ポンプの各々は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16に送達するか、またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16から抽出する（例えば、ディッシュ16内で外植片12を感染させた後）ように構成される。図示するように、例示的な実施形態では、ポンピングシステム36は、8つのポンプ150を含み、ポンプ150のうちの6つがアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を送達するのに用いられ（すなわち、流出ポンプ）、ポンプ150のうちの2つがアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をサイホンで吸い上げる／除去するのに用いられる（すなわち、流入ポンプ）。一部の実施形態では、ポンプ150は一方向だけに循環するように配線され、サイホンでの吸い上げに使用するポンプ150が間違って逆方向に動いたり、使用済のアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液がテーブル18上にこぼれたりするのを防止する。例示的な実施形態では、ポンプチューブ154はポンプ150をアグロバクテリウム（Agrobacterium）を貯蔵する溶液容器152に連結し、容器のうちの一部は未使用のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を貯蔵するのに用いてもよく、残りは使用済のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を貯蔵するのに用いてもよい。特に、使用時に、特定のポンプ150が、溶液容器152のうちの1つから未使用のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を抽出し、その抽出された溶液をディッシュ16に送達する。使用後に、別のポンプ150が使用済のアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16から抽出し、その使用済の溶液を溶液容器152のうちの別の1つに吐出することができる。一部の実施形態では、ポンプ150の各々は蠕動ポンプ（例えば、株式会社ウエルコ（Welco）から市販されている蠕動ポンプ）として具現化され得る。さらに、ポンプチューブ154は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社から市販されている3/16インチのPharMed（登録商標）BPT蠕動ポンプチューブとして具現化され得る。

例示的なポンピングシステム36は、ポンピングシステム36が容器（例えば、種子外植片12入りのディッシュ16）内に流体をポンプで注入するように構成されている場所である流体送達ステーション160と、ポンピングシステム36が容器（例えば、使用済アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液入りのディッシュ16）から流体を抽出するように構成されている場所である流体抽出ステーション162とを含む。例示的な実施形態では、ポンピングシステム36は、各ロボットアーム24用の個々の流体送達ステーション160と、各アーム24用の個々の流体抽出ステーション162とを含む（例えば、ポンピングシステム36の両側端に位置する）。

図８〜図９に示すように、流体送達ステーション160は、ポンプチューブ154の端部166を固定して、流体をディッシュ16内にポンプで注入する際に、ポンピングシステム36からの流体の流れ方向を制御するように構成されたチューブホルダ164を含む。ポンプチューブ154は、チューブホルダ164における端部166から、対応するポンプ150まで延在していることが理解されるべきである。例示的な実施形態では、チューブホルダ164は、基部168と、その基部168から略垂直方向に延在しているチューブ部170とを含む。チューブホルダ164の基部168は、基部に画定され、基部168を通って通路を画定する複数の開口部172を含む。図示するように、ポンピングシステム36の流体送達ステーション160は、流体送達ステーション160の基部176から水平方向外側に延在する水平プレート174を含む。また、流体送達ステーション160は、水平プレート174から垂直方向上方に延在した、かつ基部168の複数の開口部172内に受けられるように構成された対応する複数の支柱175を含む。例示的な実施形態では、流体送達ステーション160は、1組の3つの開口部172と、対応する1組の3つの支柱175を含むが、他の実施形態では、流体送達ステーション160は、異なる数の支柱175及び／または開口部172を含み得る。

チューブホルダ164のチューブ部170は、そこに画定され、基部168から垂直方向に延在した、かつポンプチューブ154を固定するように設計された複数の溝178を含む。すなわち、例示的な実施形態では、流体送達に用いられるポンプチューブ154の各1本ずつが、対応する溝178によって画定される通路を通り、かつ該通路内に確実に保持されるように構成される。さらに、例示的な実施形態では、流体送達ステーション160は、チューブホルダ164の下に位置した、かつチューブホルダ164においてポンプチューブ154の端部166から意図せずに滴る任意の流体を入れるように構成された滴受け皿180（例えば、空のディッシュ16）を含む。図９に示すように、使用時に、ロボットアーム24は爪状グリップ26を制御して、ディッシュ16を固定し、ディッシュ16をポンプチューブ154の端部166下側の位置に移動させる。ディッシュ16が適正に載置された後、ポンピングシステム36が、対応するポンプ（複数可）150を操作して、流体（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液）をディッシュ16に送達することができる。

図１０に示すように、流体抽出ステーション162は、流体抽出ステーション162の基部184から延在した、かつ流体を容器（例えば、ディッシュ16）から抽出するように構成された抽出チューブ182を含む。抽出チューブ182は、流体抽出ステーション162で抽出された流体を廃棄するための溶液容器152内まで延在しているポンプチューブ154と第1の端部188で連結した、第1の直線部分186を含む。また、抽出チューブ182は、第1の直線部分186の第2の端部192に、曲線部分194を経由して連結した第2の直線部分190を含む。例示的な実施形態では、曲線部分194は、第1の直線部分186と第2の直線部分190とが相互に略垂直になるように90度の相互接続として具現化される。例示的な実施形態では、抽出チューブ182は、ディッシュ16を吸引しないようにチューブの端部に画定された小さい開口部で90度曲がった、中空1/4インチステンレス鋼チューブの6インチ切断部として具現化される。しかしながら、抽出チューブ182は、他の実施形態では別の方法で構成されてもよい。使用時に、ロボットアーム24は爪状グリップ26を制御してディッシュ16を固定し、ディッシュ16を、抽出チューブ182の遠位端196がディッシュ16の槽198内に置かれる位置まで移動させることができる。ディッシュ16の各々は、外植片12及び／またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を入れる槽198を含むことが理解されるべきである。一部の実施形態では、ディッシュ16は、ペトリディッシュとして具現化され得る。動作時に、抽出チューブ182が槽198内に挿入されるようにディッシュ16を移動させる際に、ロボットアーム24は、流体が抽出チューブ182の端部196の方へ向かうように、ディッシュ16を抽出チューブ182に向かって傾けることができる。ポンピングシステム36は、対応するポンプ150を操作して、流体（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液）をディッシュ16から抽出することができる。

上述したように、例示的なシステム10は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液を含有するディッシュ16内にある外植片12を攪拌または振盪するように操作可能である一対のシェーカーステーション34を含む。特に、例示的な実施形態では、シェーカーステーション34のうちの一方には、ロボットアーム24のうちの一方が到達でき、他方のシェーカーステーション34には、他方のロボットアーム24が到達できる（図３を参照）。図１１に示すように、例示的な各シェーカーステーション34は、駆動ステージ200と、該駆動ステージ200に接続したシェーカープレート202とを含む。例示的な実施形態では、駆動ステージ200は、シェーカープレート202上に置かれたディッシュ16の内容物を攪拌するために、シェーカープレート202をシェーカープレート202によって画定される面内で動かすように構成される。特に、例示的な実施形態では、シェーカーステーション34は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中の外植片12入りのディッシュ16を4つまで30分間振盪する。他の実施形態では、外植片12は、異なる時間の間、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と共に曝露及び／または混合され得る。

例示的な駆動ステージ200は、以下に説明する制御装置に電気的に接続した、かつシェーカープレート202によって画定される面内の回転運動、横方向運動、及び／または他の種類の運動でシェーカープレート202を動かすように操作可能である電動モーター（図示せず）を含むことが理解されるべきである。一部の実施形態では、シェーカーステーション34は、ゼイバー・テクノロジーズ（Zaber Technologies）社から市販されている駆動ステージ（モデルT-LSM025B）か、またはサーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社から市販されているVariomag Teleshakeユニットを含み得る。さらに、特定の実施形態に応じて、シェーカープレート202は、アルミニウム、プレキシガラス、テフロン(登録商標）、及び／または他の適切な材料で構成されていてもよい。

上述したように、例示的なシステム10は、システム10で使用するためのディッシュ16を収容かつ供給するように構成された一対のディッシュ供給システム38を含む。特に、例示的な実施形態では、ディッシュ供給システム38は、培養培地（例えば、寒天）で充填されたディッシュ16を供給することができる。ここで、図１２〜図１９を参照すると、ディッシュ供給システム38のうちの1つ及びその動作が示されている。図１２に示したように、ディッシュ供給システム38は、ハウジング300と、ハウジング300に固定され、ハウジング300から上方に延在する細長の本体302とを含む。細長の本体302は、ハウジング300に固定された曲線状ベースプレート304と複数の支柱306とを含み、該支柱の各々は、曲線状ベースプレート304に支柱306の近位端308で固定され、曲線状ベースプレート304から遠位端310まで上方に延在している。支柱306は、遠位端310で曲線状プレート312によって固定され、かつ支柱306の近位端308と遠位端310との間の箇所で別の曲線状プレート314によって固定される。このように、例示的な実施形態では、ディッシュ供給システム38は、支柱306が動いたり、反ったりしないように、3箇所で固定される3つの支柱306を備える。他の実施形態では、ディッシュ供給システム38は、異なる数の支柱306及び／または支持箇所を備えていてもよい。

例示的実施形態では、細長の本体302の支柱306及び曲線状プレート304、312、314は、縦軸318を中心とした、遠位端310から及びハウジング300へと延在する通路316を画定する（図１４〜図１９を参照）。1組のディッシュ16は、縦軸318が各ディッシュ16の略中心を通るように通路316内に積み重ねられ得る。

図１４〜図１９に示すように、複数の空気圧装置が、ディッシュ供給システム38のハウジング300内に備えられており、積み重ねられたディッシュ16からディッシュ16を取り出すためにディッシュ供給システム38の種々の構成要素を動かし、ディッシュ16をハウジング300から離して差し出すように構成され、その結果、対応するロボットアーム24がシステム10で使用するディッシュ16を取り出すことができるようになる。例えば、図１３に示すように、動作時に、空気圧装置340（図１６を参照）は、ディッシュ16をハウジング300内からハウジング300の外側の位置までハウジング300内で画定された通路322を通って保持するプレート延長部320を動かすように構成される。ディッシュ供給システム38のうちの1つ以上の構成要素は、他の構成要素を強調するために、及び／または明確化のために、図１４〜図１９から削除される場合があることが理解されるべきである。

ここで図１４〜図１９を参照すると、ハウジング300内のディッシュ供給システム38の構成要素が、ディッシュ供給システム38の種々の動作段階において、ハウジング300を除いて図示されている。図１４に示すように、動作時に、空気圧装置324は、一対のグリップアーム326を操作して、積み重ねられたディッシュ16のうちのあるディッシュ16を固定及び／または放出するように構成される。例示的な実施形態では、グリップアーム326は相互に平衡であり、各グリップアーム326は、そこに画定された、蓋62付のディッシュ16の凸状輪郭部と符合する凹状輪郭部（図示せず）を備えた部分328を有する。例示的な実施形態では、ディッシュ16の蓋62は、ディッシュ16で画定される凹状輪郭部のレッジ（図示せず）に載せられるように構成される。このようにして、グリップアーム326はディッシュ16を押しつぶすことなく固定することができる。

図１５に示すように、動作時に、空気圧装置324は、グリップアーム326を閉じて積み重ねの最下部から2番目のディッシュ16を固定し、また空気圧装置330は、把持されたディッシュ16と、把持されたディッシュ16の上に積み重ねられたその他のディッシュ16とを、縦軸318に沿って矢印332で示す方向に持ち上げる。そうすることによって、ディッシュ供給システム38は、積み重ねられたディッシュ16から最下部のディッシュ16を分離する。最下部のディッシュ16は、縦軸318に沿って空気圧装置336により可動するディッシュ上昇台334によって、正しい位置に保たれる。図１６に示すように、空気圧装置340は、プレート延長部320と、ディッシュ上昇台334によって支持された最下部のディッシュ16とを、矢印342で示すように縦軸318に対して垂直方向に移動させるように操作可能である。プレート延長部320は、ロボットアーム24がディッシュ16を捕捉できるように、ディッシュ16を通路322を通ってハウジング300の外側の位置まで移動させるように構成される。以下に説明するように、ロボットアーム24は、ディッシュ16をプレート延長部320から捕捉し（図１７を参照）、ディッシュ16を該当する移送ステーション30に移動させる。空気圧装置340は、プレート延長部320を矢印344で示す方向に動かすことによって、プレート延長部320が積み重ねられたディッシュ16とディッシュ上昇台334との間に配置される位置まで、プレート延長部320を後退させる。

図１８に示すように、動作時に、ディッシュ16をプレート延長部320から除去し、プレート延長部320を後退させた後に、空気圧装置336がディッシュ上昇台334を上昇させる。特に、空気圧装置336は、ディッシュ上昇台334を、ディッシュ上昇台334がグリップアーム326によって保持された積み重ねられたディッシュ16の最下部のディッシュ16と接触（または、ほぼ接触）するまで、縦軸318に沿って矢印332で示す方向に移動させる。こうした方法で、ディッシュ上昇台334は、積み重ねられたディッシュ16の重量を支えることができる位置まで移動する。図１９に示すように、空気圧装置330、324は、積み重ねられたディッシュ16を縦軸318に沿って矢印346で示す方向に下降させるように、相互に連動して操作する。積み重ねられたディッシュ16が下降した後、空気圧装置330は、グリップアーム326を開いて最下部のディッシュ16を放出することができる。図１４〜図１９を参照して記載された手順は、ディッシュ供給システム38が培養培地入りのディッシュ16を該当するロボットアーム24に提供する度毎に繰り返され得ることが理解されるべきである。

上述のように、システム10は一対の送達ステーション28を含む。例示的な実施形態では、各送達ステーション28は、複数の目的を達成するように構成される。特に、システム10のユーザー／オペレーターは、外植片12入りのディッシュ16を、システム10で使用するために各送達ステーション28のデッキ360上に置くことができる。システム10の動作が開始した後に、制御装置500は、以下に示すように、該当するロボットアーム24を操作して、外植片12入りのディッシュ16を捕捉し、かつディッシュ16をポンピングシステム36まで移動させて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で充填する（図２４〜図２８を参照）。外植片12がアグロバクテリウム（Agrobacterium）で感染し（すなわち、該当するシェーカーステーション34において）、生長のために培養培地入りのディッシュ16の上に載置された後に、ロボットアーム24は、培養培地入りのディッシュ16を、ユーザー／オペレーターがアクセスできるように該当する送達ステーション28まで戻す。

図２０に示すように、送達ステーション28は2つのセンサ362、364を含む。例示的な実施形態では、センサ362、364は、キーエンス社から市販されている型式LV-NH32スポット可変センサとして具現化され、これらのセンサは、センサ内部のレーザーからビームが放射され、何かがビームの光路内にあるとセンサに反射して戻る反射型センサであり、効果的にディッシュ16の存在を検出するものである。センサ362は、デッキ360に載置された第1のディッシュ16または最下部のディッシュ16の存在を検出するように構成され、センサ364は、積み重ねられたディッシュ16を示唆するものである、第1のディッシュ16の上に積み重ねられた第2のディッシュ16の存在を検出するように構成される。このように、制御装置500は、センサ362、364のセンサデータを利用して、送達ステーション28の状態（例えば、ディッシュ16がないこと、1つのディッシュ16があること、または複数のディッシュ16があること）を判定することができる。さらに、その状態は、制御装置500によってユーザーに伝達され、及び／またはシステム10により使用され得る（例えば、外植片12がロボットアーム24によってピックアップ可能な時を確認するためなど）。例示的な送達ステーション28は、2つのスポット可変センサを含むが、他の実施形態は、異なる数及び／または異なる種類のセンサを用いる場合があることが理解されるべきである。例えば、一部の実施形態では、センサ362、364は、光学センサ、光センサ、圧力センサ、イメージセンサ、モーションセンサ、慣性センサ、圧電センサ、及び／または本明細書に記載の機能を果たすのに適した任意の他の種類のセンサとして具現化され得る。

ここで、図２１を参照すると、システム10は、ロボットアーム20の吸引グリップ22を殺菌するように構成された殺菌装置40を含む。殺菌を行うため、制御装置500はロボットアーム20を操作して、吸引グリップ22を、エタノールまたは別の適切な殺菌溶液で充填された容器370（図２〜図３を参照）内に挿入する。例示的な実施形態では、溶液は70%アルコールを含有する。ロボットアーム20を操作して、グリップ22をエタノール内で上下左右に一定期間動かした後、図２１に示すようにグリップ22を殺菌装置40の開口部372内に前進させることができる。例示的な実施形態では、殺菌装置40は、例えば、InoTech BioScience社のSteri 250などの乾燥ガラスビーズ滅菌器である。例示的な実施形態では、ロボットアーム20を、再度グリップ22を滅菌器40内で上下に数秒間動かすように操作してもよい。続いて、ロボットアーム20は、グリップ22を冷却するために、グリップ22を滅菌器40から引き出すことができる。滅菌器40により生成される熱により、グリップ22のベローズが付着し合い、その結果、グリップ22の性能が損なわれるおそれがある。こうした状況で、ロボットアーム20は、ベローズを離すための手順を実行することができる（例えば、殺菌した表面を吸引し、ベローズを伸ばすことによって）。

上述したように、移送ステーション30を使用して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染した外植片12を培養培地（例えば、寒天）を含むディッシュ16に移送する。ここで図２２を参照すると、移送ステーション30のうちの1つの一部が示されている。上述したように、移送ステーション30は、外植片12入りのディッシュ16の画像を取り込むように構成されたイメージングステーション32を含み、それらの画像は制御装置500によって分析されて、外植片12のディッシュ16上での位置を算出する。ロボットアーム20は、外植片12のディッシュ16上での算出された位置に基づいて、特定の外植片12を捕捉できることが理解されるべきである。例示的な実施形態では、移送ステーション30は、複数のディッシュ16が載置され得る透明のデッキ380を含む。例えば、透明のデッキ380は、プレキシガラス、アクリル、ガラス、及び／または別の適切な透明材料製であってもよい。他の実施形態では、デッキ380は、デッキ380の1つ以上の部分（例えば、イメージングステーション32の外側）で不透明であるか、半透明である場合がある。

イメージングステーション32は、イメージングステーション32上に置かれたディッシュ16内の外植片12に光を当てるために、透明のデッキ380の下に位置した、かつイメージングステーション32と符合した透明のデッキ380の一部に光を当てるように構成された光源382を含む。光源382は、赤色発光ダイオード（LED）として例示的に具現化される。他の実施形態では、他の色のLEDを使用できることが理解されるべきである。さらに他の実施形態では、他の光源を使用することができる。

システム10はカメラ384を含み、カメラ384は、上昇台からイメージングステーション32の上に搭載される（図３を参照）。カメラ384は、イメージングステーション32でディッシュ16の内容物の画像を取り込むように操作可能である。例示的な実施形態では、カメラ384は、白黒画像を取り込むように構成されるが、他の実施形態では、カメラ384は、カラー画像、グレースケール画像、及び／または他の種類の画像を取り込むように構成されてもよい。カメラ384のアパーチャを適正に設定することによって、取り込まれた画像における透明体（例えば、ディッシュ16）の全ての形跡、またはほぼ全ての形跡を削除できることが理解されるべきである。さらに、白黒カメラを用いると、光源382から放射される赤色光は取り込み画像では明白色に見え、固形物体（例えば、種子外植片12）は黒色に見える。カメラ384は、電子制御装置500に電気的に接続されている（図２３を参照）。以下により詳細に説明するように、画像は、制御装置500に送信されて、ディッシュ16内の外植片12の相対的な位置及び向きを算出することができ、その結果、システム10が回収用にロボットアーム20を外植片12に指向させることができる。

ここで図２３を参照すると、システム10は電子制御装置500を含む。制御装置500は、基本的に、システム10に関連付けられたセンサによって送信された電気信号を解釈すること、及びシステム10に関連付けられた電子制御式構成要素を作動するまたは該構成要素に通電することを担うマスターコンピュータである。例えば、電子制御装置500は、センサ362、364、空気圧装置324、330、336、340、ポンプ150、駆動ステージ210、及びカメラ384などの動作を制御するように構成される。電子制御装置500は図２３に単一ユニットとして示されているが、制御装置500は、種々の構成要素のためのいくつかの個別の制御装置を含み、ならびに種々の個別の制御装置からの信号を送信及び受信する中央コンピュータを含んでいてもよい。また、電子制御装置500は、システム10の各種の動作が実行されるべき時を判定する。以下により詳細に説明するように、電子制御装置500は、システム10がトランスジェニックプロトコルで使用するためのダイズ外植片12を選択及び処理するように、システム10の構成要素を制御することができる。

それを行うため、電子制御装置500は、電気機械システムの制御に用いる電子ユニットに通常関連付けられるいくつかの電子部品を備える。例えば、電子制御装置500は、こうした装置に通常含まれる部品の中でも特に、マイクロプロセッサ502などのプロセッサと、プログラマブル読出し専用メモリ装置（「PROM」）（消去可能なPROM（EPROMまたはEEPROM）を含む）などのメモリ装置504とを備えていてもよい。メモリ装置504は、例えば、マイクロプロセッサ502が実行する際に、電子制御装置500がシステム10の動作を制御できるようにするソフトウェアルーチン（複数可）の形態で、特に命令を格納するために設けられる。

また、電子制御装置500は、アナログインターフェイス回路506を含む。アナログインターフェイス回路506は、種々の構成要素からの出力信号を、マイクロプロセッサ502の入力への提示に適切な信号に変換する。特に、アナログインターフェイス回路506は、アナログデジタル（A/D）変換器（図示せず）などを使用することにより、センサで得られたアナログ信号をマイクロプロセッサ502で使用するデジタル信号に変換する。A/D変換器は、個別の1つの装置もしくはいくつかの装置として具現化されてもよく、またはマイクロプロセッサ502に一体化されてもよいことが理解されるべきである。また、システム10に関連付けられたセンサのうちの任意の1つ以上がデジタル出力信号を生じる場合、アナログインターフェイス回路506はバイパスされてもよいことも理解されるべきである。

同様に、アナログインターフェイス回路506は、マイクロプロセッサ502からの信号を、システム10に関連付けられた電子制御式構成要素（例えば、ロボットアーム14）への提示に適切な出力信号に変換する。特に、アナログインターフェイス回路506は、デジタルアナログ（D/A）変換器（図示せず）などを使用することにより、マイクロプロセッサ502で得られたデジタル信号をシステム10に関連付けられた電子制御式構成要素で使用するアナログ信号に変換する。上述のA/D変換器と同様に、D/A変換器は、個別の1つの装置もしくはいくつかの装置として具現化されてもよく、またはマイクロプロセッサ502に一体化されてもよいことが理解されるべきである。また、システム10に関連付けられた電子制御式構成要素のうちの任意の1つ以上がデジタル入力信号で動作する場合、アナログインターフェイス回路506はバイパスされてもよいことも理解されるべきである。

したがって、電子制御装置500は、システム10の動作を制御するように操作することができる。特に、電子制御装置500は、主として制御スキームを含むルーチンを実行し、その中で電子制御装置500がシステム10に関連付けられたセンサの出力をモニターし、システム10の電子制御式構成要素への入力を制御する。それを行うために、電子制御装置500は、ロボットアーム14への通電、ポンプ150への通電、画像コントラストを上げるための光源382の光強度変更などの機能を実施するアルゴリズムを実行すべく、連続的にまたは断続的に、予めプログラムされた表中の値のルックアップを含めた数多くの計算を実施する。一部の実施形態では、制御装置500はまた、システム10のユーザーからの入力を受信するユーザー入力装置508、及び／またはユーザーへの出力を提供するユーザー出力装置510を含んでもよい。ユーザー入力装置508は、キーボード、マウス、タッチスクリーン、及び／または本明細書に記載の機能を実施するように構成された他の入力装置などの任意の集積装置または周辺装置として具現化され得る。同様に、ユーザー出力装置510は、ディスプレイ、スピーカー、及び／または本明細書に記載の機能を実施するように構成された他の出力装置などの任意の集積装置または周辺装置として具現化され得る。

ここで、図２４〜図２５を参照すると、自動化された外植片調製のための例示的な操作手順1000が示されている。手順1000の開始に先立ち、制御装置500はシステム10を較正し、ユーザーにメッセージを提供し、ユーザー入力を読み出し、安全機構（例えば、光カーテン）を初期状態にし、また他のセットアップ機能を実施することができると理解されるであろう。例えば、制御装置500は、まだ実施されていない場合、任意の適切なプロトコルを用いてシステム10を較正して、ロボットアーム20の座標系をカメラ384の座標系にマッピングさせるか、または関連付けることができ、その結果、画像に取り込まれた物体の位置が、その物体のアーム20に対しての位置に変換され得る。さらに、制御装置500は、システム10を較正して、ロボットアーム20、24が該当外植片12及び／またはディッシュ16を適切な位置で確実に取り出しかつ放すように、ロボットアーム20、24の座標系をシステム10の個々の既定の位置（例えば、移送ステーション30、シェーカーステーション34、送達ステーション28、ポンピングシステム36、ディッシュ供給システム38上の特定の箇所など）と関連付けることができる。加えて、一部の実施形態では、制御装置500は、ディスプレイもしくは他のユーザー出力装置510でユーザーにセットアップ指示（例えば、送達ステーション28上に外植片12入りのディッシュ16を置くなど）を提供することができ、及び／またはユーザー入力装置508を介してユーザーからの入力（例えば、システム10を一時停止するなど）を読み出すことができる。

ブロック1002では、システム10が、オペレーターが外植片12入りのディッシュ16を送達ステーション（複数可）28上に置いたか否かを判定する。上述したように、一部の実施形態では、システム10はセンサ362、364で得られたセンサデータに基づいてこうした判定をする。既述を明確にするために、手順1000は、システム10またはテーブル18の一方である「片側」（例えば、1つのロボットアーム24）に対して本明細書で説明されているが、手順1000はシステム10の両側で並行して実施され得ることが理解されるべきである。外植片ディッシュ16が送達ステーション28上に載置されると、手順1000はブロック1004に進み、そこで、制御装置500はロボットアーム24を操作して、外植片ディッシュ16を捕捉し、外植片ディッシュ16を送達ステーション28からポンピングシステム36に移動させる。特に、上述のように、ロボットアーム24は、外植片ディッシュ16を流体送達ステーション160まで移動させる。

手順1000はブロック1006に進み、そこで、制御装置500はポンプ150のうちの1つを操作して、外植片ディッシュ16をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液で充填する。一部の実施形態では、ユーザーは、特定の実験において、複数の異なる種類の溶液を用いることを要望してもよいことが理解されるべきである。こうした実施形態では、ポンピングシステム36のポンプ150は異なる溶液を抽出するように構成されてもよく、また制御装置500は、適切な溶液が一定の時間にディッシュ16に確実に送達されるようにポンピングシステム36を制御することができる。ブロック1008では、制御装置500がロボットアーム24を操作して、充填済の外植片ディッシュ16を該当するシェーカーステーション34の既定の位置の上に移動させる。例示的な実施形態では、シェーカーステーション34はシェーカープレート202上にディッシュ16を置くことができる4箇所の既定の位置を有しており、したがって、4つの外植片ディッシュ16をシェーカーステーション34で処理（すなわち、攪拌）できる。上述したように、ロボットアーム24は、初期化の間に較正されて、これらの位置に係わるデータを格納する（すなわち、位置を「記憶させる」）ことができる。

ブロック1010では、外植片12をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液で感染させるために、シェーカーステーション34が、外植片12入りのディッシュ（複数可）16を攪拌／振盪するように構成されている。一部の実施形態では、制御装置500は、タイマーを利用して特定のディッシュ16がシェーカーステーション34で処理される時間を追跡することができる。シェーカーステーション34が外植片12入りのディッシュ（複数可）16を処理する一方で、制御装置500はロボットアーム24を操作して、培養培地（例えば、寒天）入りのディッシュ16をディッシュ供給システム38から移送ステーション30の所定の位置まで移動させる。例示的な実施形態では、制御装置500はロボットアーム24に指示して、5つの培養培地ディッシュ16を、図３に示す移送ステーション30上の5箇所の個別の既定／較正された位置に移動させる。

例示的な実施形態では、図２６に示すように、手順1100を用いて培養培地ディッシュ16を移送ステーション30に移動させることができる。手順1100は、ブロック1102から開始し、そこで、制御装置500はロボットアーム24を操作して、培養培地入りのディッシュ16をディッシュ供給システム38から（すなわち、プレート延長部320から）捕捉し、ディッシュ16をイメージングステーション32に移動させる。手順1100はブロック1104に進み、そこで、制御装置500はロボットアーム24を操作して、培養培地ディッシュ16の蓋62を捕捉し、ディッシュ16から蓋62を除去する。ブロック1106では、制御装置500はロボットアーム24を操作して、ディッシュ16の蓋62を移送ステーション30の所定の位置（例えば、上述した5箇所の所定の位置のうちの1つ）に移動させる。ブロック1108では、制御装置500はロボットアーム24を操作して、蓋の開いた培養培地ディッシュ16（すなわち、ディッシュ16の基部60）をイメージングステーション32にて捕捉し、対応する蓋62が設置された移送ステーション30上の位置に移動させる。言い換えると、図２２に示すように、ロボットアーム24はディッシュ16の基部60を対応する蓋62の上に載置する。

手順1100はブロック1110に進み、そこで制御装置500は別の培養培地ディッシュ16を移動させるか否かを判定する。上述のように、例示的な実施形態では、制御装置500は、5つの培養培地ディッシュ16をディッシュ供給システム38から移送ステーション30の既定位置まで移動させるようにプログラムされている。したがって、例示的な実施形態では、制御装置500は5つの培養培地ディッシュ16を移送ステーション30に既に移動させたか否かを判定する。既に移動させた場合には、手順1110が終了する。移動させていない場合には、手順1110はブロック1102に戻り、そこで制御装置500はロボットアーム24に指示して別の培養培地ディッシュ16を捕捉する。例示的な実施形態では5つの培養培地ディッシュ16の使用法が説明されているが、他の実施形態では、システム10は本明細書に記載の技術と整合する任意の適切な数の培養培地ディッシュ16を使用することができる。

図２４に戻ると、制御装置500が適切な数の培養培地ディッシュ16を移送ステーション30に移動させた後になる。図２６に示すように、手順1000はブロック1014に進み、そこで、制御装置500は、外植片ディッシュ（複数可）16が外植片12をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液で完全に感染させるのに十分シェーカーステーション34で処理されたか否かを判定する。例えば、例示的な実施形態では、制御装置500はタイマーを利用して、特定の外植片ディッシュ16がシェーカーステーション34により所定の最小感染時間（例えば、30分間）攪拌されたことを保証する。しかしながら、他の実施形態では、システム10が任意の他の適切な条件（複数可）及び／または外植片12が感染したか否かを判定する技術を利用できることが理解されるべきである。

所望の感染時間に達した（または他の感染条件が満たされた）場合、手順1000は図２５のブロック1016に進み、そこで、制御装置500はシェーカーステーション34から外植片ディッシュ16（例えば、感染タイマーが満了した外植片ディッシュ16）を選択しかつロボットアーム24を操作して、該外植片ディッシュ16を捕捉し、イメージングステーション32に移動させる。手順1000はブロック1018に進み、そこで、制御装置500はロボットアーム20を操作して、感染済外植片12をイメージングステーション32の外植片ディッシュ16から培養培地ディッシュ16の所定の位置に移動させる。それを行うため、図２７に示すような例示的な手順1200を用いることができる。

ここで図２７を参照すると、手順1200はブロック1202から開始し、そこで、制御装置500はカメラ384を操作して、ディッシュ16内の感染済外植片12の画像をイメージングステーション32で取り込む。こうした画像600の1つが図３０に示されている。図３０に示すように、外植片12は、ディッシュ16内で互いに対して任意の位置及び向きで配置され得る。ブロック1204では、制御装置500は取り込んだ画像600を処理して、感染済外植片12のディッシュ16上の位置を特定することができる。一部の実施形態では、制御装置500は、特定可能な外植片12の全ての位置を算出するように構成されるのに対し、他の実施形態では、制御装置は単一の外植片12のみを特定するように構成される。

制御装置500は、外植片の位置を算出する任意の適切な画像処理技術を利用できることが理解されるべきである。例えば、例示的な実施形態では、制御装置500は画像をバイナリー画像（すなわち白黒）に変換し、エプソン製モデルC3 6軸多関節型アームに付属のソフトウェアパッケージにある幾何学的物体識別機能を利用する。特に、ユーザーによりロードされ、制御装置500のメモリ装置504に格納された外植片12の参照画像604（図２９を参照）が、取り込まれた外植片12の画像600と比較されて、一致するもの606を特定する。幾何学的物体識別機能は、縁部に基づいた幾何学的特徴を使用することによって、参照画像（すなわち、物体モデル）に一致するものを識別するアルゴリズム法を用いている。さらに、幾何学的物体識別機能は、別の画像との比較に用いられる参照画像、一致するもの606に要求される容認もしくは許容レベル、一致するもの606の最小もしくは最大物体サイズ、及び／または他の適切なパラメータなどの様々なパラメータを含む。

制御装置500が、他の外植片12と分離された個々の外植片12の位置を特定することはできないが、外植片12の一群610（例えば、重なり合った外植片12）の位置を特定できる場合、制御装置500は重なり合った外植片12の一群610を分離させるプロトコルを実行する。例えば、例示的な実施形態では、制御装置500は、適切な画像処理アルゴリズムを用いて（例えばその群の質量中心を検出することにより）一群610の幾何学的中心を特定することができ、ロボットアーム20に指示して、吸引グリップ22をディッシュ16の槽198に（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液の中に）挿入し、外植片を分散させるために外植片12の一群610をかき混ぜ、または攪拌する。他の実施形態では、制御装置500はロボットアーム20に指示して、外植片を分離させるために一群610内の外植片12のうちの1つを捕捉及び放出してもよい。さらに他の実施形態では、制御装置500は吸引グリップ22を槽198内の一群610のある位置に移動させ、負圧源112を逆に作動させて（特定のシステム10で可能である場合）、外植片12を分離させるために圧縮空気を槽198内に吐出してもよい。

システム10は、他の実施形態において、外植片12の一群610を分離させる任意の他の適切な機構を利用できることが理解されるべきである。さらに、制御装置500は、ディッシュ16内の外植片12の位置を特定するための任意の適切な画像処理アルゴリズム及び技術を利用することができる。例えば、制御装置500は、SURF（Speeded Up Robust Features）、SIFT（Scale-Invariant Feature Transform）、MOPS（Multi-Scale Oriented Patches）、Canny法、画像勾配演算子、及びソーベルフィルタなどの、特徴検出アルゴリズム、技術、及びフィルタを利用して、画像600及び外植片参照画像604の特徴（例えば、角部、縁部、小塊部などの着目点）を識別することができる。一部の実施形態では、制御装置500は、RANSAC（Random Sample Consensus）アルゴリズムなどの特徴マッチングアルゴリズムを利用して、画像600及び外植片参照画像604で識別される任意の特徴が相互に一致するか否かを判定し、一致する場合には、これらの特徴の該当位置を算出することができる。加えて、または別の方法として、制御装置500は、画像内の物体を識別するための画像分割アルゴリズム（例えば、ピラミッド分割、流域アルゴリズムなど）を利用することができる。特定の実施形態に応じて、制御装置500は、取り込み画像の分析の間、上述のアルゴリズムのうちの任意の1つ以上を利用できることが理解されるであろう。

制御装置500が外植片（複数可）16の位置（複数可）を算出した後に、手順1200はブロック1206に進む。ブロック1206では、制御装置500は、上述したように移送ステーション30上の培養培地ディッシュ16に移動させる感染済外植片12を識別及び選択する（例えば、任意にまたはアルゴリズムにより）。ブロック1208では、制御装置500は、選択された外植片12の移動先となる培養培地ディッシュ16を選択する。より詳細には、ブロック1210では、制御装置500は、選択された外植片12を載置する培養培地ディッシュ16上の所定の位置を決定する。

例示的な実施形態では、システム10のユーザー／オペレーターにより提供された元の外植片12入りのディッシュ16（図２４のブロック1002を参照）には約30個の種子外植片があり、制御装置500は、6個の外植片12を5つの培養培地ディッシュ16の各々の上に所定の位置で載置するように構成される。例えば、制御装置500は、外植片12を培養培地ディッシュ16上で相互に等間隔で円状に（例えば、約60度ずつ離間して）載置するように構成されてもよい。したがって、例示的な実施形態では、制御装置500は、培養培地ディッシュ16と、外植片12が置かれていた元の位置に基づいた、外植片12を該培養培地ディッシュ16上に載置する位置とを選択する。例示的な実施形態では、制御装置500は、複数の外植片12が同一の位置に載置されることを防ぐために、元の位置（すなわち、外植片12が現状置かれている位置）をメモリ504に格納する。一方、他の実施形態では、システム10は、こうした決定をするために、例えばカメラ及び画像処理技術を利用することができる。

手順1200はブロック1212に進み、そこで、制御装置500はロボットアーム20を操作して、選択された外植片12をイメージングステーション32のディッシュ16から把持する。外植片12をディッシュ16から捕捉するために、グリップ組立体80は、把持位置／外植片12の地点（例えば、外植片12の中心）の上に位置し、グリップ組立体80の中空通路106が把持位置と略同一直線上にあるようにすることが理解されるべきである。次に、グリップ組立体80は、吸引グリップ22が外植片12の外側表面と完全に接触するまで外植片12に向かって下側に進む。上述のように、懸架機構86は、グリップ22が外植片12の表面と完全に接触して、吸引力の損失を限定的にすることを保証しつつ、外植片12が押しつぶされることを防止するように作動する。続いて、負圧源112は、外植片をグリップ22に固定するように駆動することができる。

ブロック1214では、制御装置500は、ロボットアーム20を操作して、把持した外植片12を選択された培養培地ディッシュ16に移動させ、かつディッシュ16上の算出された位置に移動させる。ブロック1216では、制御装置500は、各培養培地ディッシュ16が満杯であるか否かを判定する。満杯である場合、手順1200が終了する。満杯ではない場合、手順1200はブロック1202まで戻り、そこで、制御装置500はカメラ384に指示して、ディッシュ16の別の画像をイメージングステーション32で取り込む。一部の実施形態では、手順1200は、カメラ384で取り込んだ以前の画像600を利用してもよい（図２７の破線矢印で示す）。上述のように、例示的な実施形態では、培養培地ディッシュ16は、ディッシュ16上に6個の外植片12を有する場合、「満杯」と見なされる。他の実施形態では、制御装置500は、加えて、または別の方法で、こうした決定をするために他の判断基準を用いてもよい。例えば、一部の実施形態では、制御装置500は、イメージングステーション32でディッシュ16上に残っている任意の外植片12があるか否かを判定してもよく、もし残っていない場合には手順1200が終了し得る。

一部の実施形態では、システム10は、各培養培地ディッシュ16上で外植片12の所定の数（n個）を等間隔に離間配置することにより、外植片12が培養培地ディッシュ16上で相互に約360/n度ずつ離間して配置されるように構成されてもよい。さらに、一部の実施形態では、特定の培養培地ディッシュ16上に載置する外植片12の所定の数（n個）が、システム10のオペレーターによって選択され得る。例えば、6個の外植片12を各培養培地ディッシュ16上に載置することを、オペレーターが選択する、あるいはシステム10が決定する実施形態では、これらの6個の外植片12は、該当する培養培地ディッシュ16上で相互に約60度（360/60=60）ずつ離間して配置されるであろう。システム10が4個の外植片12を各培養培地ディッシュ16に載置することを決定する実施形態では、これらの4個の外植片12は、該当する培養培地ディッシュ16上で相互に約90度（360/4=90）ずつ離間して配置されるであろう。こうした実施形態では、n個の外植片12全てが培養培地ディッシュ16上に載置される（例えば、一様に載置される）場合、培養培地ディッシュ16は「満杯」であると見なすことができる。

図２５に戻ると、感染済外植片12が培養培地ディッシュ16に移動した後に、手順1000はブロック1020に進む。ブロック1020では、制御装置500はロボットアーム24に指示して、ディッシュ16を感染済外植片12の移動元であるイメージングステーション32で捕捉し、ポンピングシステム36まで、より詳細には流体抽出ステーション162まで移動させる。上述のように、ロボットアーム24は、ディッシュ16を、抽出チューブ182の遠位端196がディッシュ16の槽198内に配置される位置へと移動させる。ブロック1022では、制御装置500は適切なポンプ150を操作して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16から抽出し、対応する溶液容器152（使用済溶液用）の中にポンプで注入する。上述のように、制御装置500は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の全てまたは大部分をディッシュ16から確実に除去するために、ロボットアーム24を同時に操作して、抽出の間にディッシュ16を抽出チューブ182に向かって傾けることができる。

手順1000はブロック1024に進み、そこで、制御装置500はロボットアーム24を操作して、空のディッシュ16を適切なディッシュ廃棄容器42に移動させる。ロボットアーム24は、その把持を解除し、ディッシュ16を廃棄容器42内に落とす。ディッシュ16を廃棄する前に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液をディッシュ16から除去することによって、アグロバクテリウム（Agrobacterium）が廃棄の間にこぼれたり、はねたりするリスクを低減させるか、または最小化することが理解されるべきである。ブロック1026では、制御装置500がロボットアーム20を操作して、吸引グリップ22を殺菌する。殺菌するために、制御装置500は、図２１を参照して上述した手順と同様な手順を用いることができる。

ブロック1028では、制御装置500はロボットアーム24を操作して、感染済外植片12で「満杯」の培養培地ディッシュ16を送達ステーション28に移動させる。上述したように、培養培地ディッシュ16は、システム10のユーザー／オペレーターの回収用に送達ステーション28上に積み重ねられ得る。さらに、制御装置500は、完了時に、ユーザー出力装置510を介して、ユーザー／オペレーターに培養培地ディッシュ16がピックアップ可能であることを知らせることができる。

例示的な実施形態では、図２８に示すように、手順1300を用いて、満杯の培養培地ディッシュ16を送達ステーション28に移動させることができる。手順1300はブロック1302から開始し、そこで、制御装置500はロボットアーム24を操作して、感染済外植片12で満杯の培養培地ディッシュ16のうちの1つを選択し（任意にまたはアルゴリズムにより）、イメージングステーション32に移動させる。上述のように、例示的な実施形態では、培養培地ディッシュ16は元々移送ステーション30に置かれ、各ディッシュ16の基部60がその蓋62の上に置かれるようになっていた。したがって、例示的な実施形態では、より具体的に述べると、制御装置500はロボットアーム24を操作して、培養培地ディッシュ16の基部60を捕捉し、イメージングステーション32に移動させる。

ブロック1304では、ロボットアーム24がイメージングステーション32に移動した培養培地ディッシュの基部60に蓋62をする。つまり、制御装置500はロボットアーム24を操作して、選択された培養培地ディッシュ16の蓋62を移送ステーション30から捕捉し、その蓋62をイメージングステーション32にある培養培地ディッシュ16の基部60上まで移動させる。ブロック1306では、制御装置500はロボットアーム24を操作して、蓋をした感染済外植片12を有する培養培地ディッシュ16を送達ステーション28に移動させる。上述のように、別の培養培地ディッシュ16が既に送達ステーション28に置かれている場合、ロボットアーム24はディッシュ16を積み重ねる。

手順1300は、ブロック1308に進み、そこで制御装置500は別の満杯の培養培地ディッシュ16を移動させるか否かを判定する。言い換えると、制御装置500は、任意の培養培地ディッシュ16が移送ステーション30に残っているか否かを判定する。残っていない場合、手順1300が終了する。残っている場合、手順1300はブロック1302に戻って、手順1300を繰り返し、別の満杯の培養培地ディッシュ16を送達ステーション28に移動させる。例示的な実施形態では、システム10が感染済外植片12を移送ステーション30上の5つの培養ディッシュ16に移動させるので、システム10は、感染済外植片12をディッシュ上に適正に配置させた後、5つの培養ディッシュ16を送達ステーション28上に積み重ねることが理解されるべきである。

アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養は、植物への発現ベクターの導入に広く利用されている方法であり、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然形質転換系に基づいている。Horsch et al., Science 227:1229 (1985)。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが知られている植物病原性土壌細菌である。A.ツメファシエンス（A. tumefaciens）及びA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のそれぞれTiプラスミドとRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持している。Kado, C. I., Crit.Rev. Plant.Sci.10:1 (1991)。また、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ベクター系及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介遺伝子導入方法の記載は入手可能であり、例えば、Gruber et al., 前掲、Miki et al., 前掲、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)、ならびに米国特許第4,940,838号及び同第5,464,763号などがある。

アグロバクテリウム（Agrobacterium）が形質転換に使用される場合には、挿入されるべきDNAは、固有のプラスミド、すなわち、中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされるべきである。中間ベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）中では自己複製できない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム（Agrobacterium）中に導入され得る。日本たばこスーパーバイナリー系は、このような系の一例である（Komari et al. (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2^nd Edition, Vol. 1) Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15-41、及びKomori et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160で総説されている）。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）の両方において、自己複製可能である。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子と、右及び左のT-DNA境界領域により枠取られたリンカーまたはポリリンカーとを含む。これらは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）内で直接形質転換され得る（Holsters, 1978）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウム（Agrobacterium）は、vir領域を保有するプラスミドを含むものである。また、TiプラスミドまたはRiプラスミドは、T-DNAの導入に必要なvir領域を含む。vir領域は、T-DNAを植物細胞に導入するのに必要である。さらなるT-DNAが含まれている場合もある。

アグロバクテリウム（Agrobacterium）宿主の病原性機能は、バイナリーT DNAベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または共存培養手順（Horsch et al. (1985) Science227:1229-1231）を使用して細胞を細菌感染させる場合、構築物と隣接するマーカーとを含有するT鎖を植物細胞DNAへ挿入させる。一般的に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換系は、双子葉植物を操作するために用いられる（Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384；Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641）。アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換系は、単子葉植物及び植物細胞へのDNAの形質転換ならびに導入にも用いられ得る。米国特許第5, 591,616号；Hernalsteen et al.(1984) EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren et al.(1984) Nature 311:763-764；Grimsley et al.(1987) Nature325:1677-179；Boulton et al.(1989) Plant Mol.Biol.12:31-40；及びGould et al.(1991) Plant Physiol.95:426-434を参照されたい。

胚軸の一部分を含む分割されたダイズ種子は、典型的には、好適な遺伝子構築物を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）培養液、またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）培養液を用いて約0.5〜3.0時間、より典型的には約0.5時間接種され、続いて、最大約5日間、好適な培地上で共存培養の期間を経て接種され得る。導入遺伝子のコピーを含有すると推定される外植片は、胚軸の一部分を備える形質転換された分割ダイズ種子の培養から生じる。これらの外植片を特定し、さらなる組織増殖のために単離することができる。

いくつかの代替技術を使用して、DNAを宿主植物細胞に挿入することもできる。これらの技術として、限定するものではないが、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるT-DNAを用いた形質転換が挙げられる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術の例は、例えば、米国特許第5,177,010号、米国特許第5,104,310号、欧州特許出願公開第0131624B1号、欧州特許出願公開第120516号、欧州特許出願公開第159418B1号、欧州特許出願公開第176112号、米国特許第5,149,645号、米国特許第5,469,976号、米国特許第5,464,763号、米国特許第4,940,838号、米国特許第4,693,976号、欧州特許出願公開第116718号、欧州特許出願公開第290799号、欧州特許出願公開第320500号、欧州特許出願公開第604662号、欧州特許出願公開第627752号、欧州特許出願公開第0267159号、欧州特許出願公開第0292435号、米国特許第5,231,019号、米国特許第5,463,174号、米国特許第4,762,785号、米国特許第5,004,863号、及び米国特許第5,159,135号に記載されている。植物細胞の形質転換へのT-DNA含有ベクターの使用は、研究が集中的になされ、欧州特許出願公開第第120516号；Anら(1985, EMBO J. 4:277-284)、Fraleyら(1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46)、ならびにLee及びGelvin(2008, Plant Physiol. 146: 325- 332)においてよく説明されており、この分野で十分に確立されている。

植物形質転換の既知の別の方法は、DNAが微粒子（microprojectile）の表面上に担持される微粒子媒介形質転換である。この方法では、微粒子を植物細胞壁及び植物細胞膜を貫通するのに十分な速度まで加速する遺伝子銃装置を用いて、発現ベクターを植物組織内に導入する。Sanford et al., Part.Sci.Technol.5:27 (1987)、Sanford, J. C., Trends Biotech.6:299 (1988)、Sanford, J. C., Physiol.Plant 79:206 (1990)、Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。

あるいは、遺伝子導入法及び形質転換法として、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿によるプロトプラスト形質転換、裸DNAのポリエチレングリコール（PEG）媒介またはエレクトロポレーション媒介取り込み（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722、Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177；Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828；及びShimamoto (1989) Nature338:274-276を参照）、及び植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluin et al.(1992) Plant Cell 4:1495-1505）が挙げられる。

本開示が図面及び先述の説明に詳細に例示及び説明されてきたが、こうした例示及び説明は、限定するものではなく例示となる性質のものと見なされるべきであり、この点において、例示的な実施形態のみが提示及び記載されており、ならびに本開示の精神の範囲内となる全ての変更及び修正の保護が望まれると解する。

本開示には、本明細書に記載された方法、装置、及びシステムの種々な特徴から生じる複数の利点がある。なお、本開示の方法、装置、及びシステムの代替の実施形態は、記載された特徴の全てを含むとは限らないが、こうした特徴の利点のうちの少なくとも一部から恩恵を受け得る。当業者は、本発明の特徴のうちの1つまたは複数を組み込んだ、かつ添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神及び範囲に含まれる、方法、装置、及びシステムの独自の実施形態を容易に考案することができる。

Claims (26)

1. 自動化された外植片調製のための方法であって、
   複数の外植片を含む外植片ディッシュをアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で充填するようにポンプを操作することと、
   前記充填済外植片ディッシュをシェーカーステーションのシェーカープレート上に移動させるように第1のロボットアームを操作することと、
   前記複数の外植片を前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染させるために、前記シェーカープレートを前記シェーカープレートによって画定される面内のある方向に動かすように前記シェーカーステーションを操作することと、
   前記充填済外植片ディッシュからの外植片を、前記外植片が前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染したとの判定に呼応して、培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように第2のロボットアームを操作することと、を含む前記方法。
2. 前記培養培地ディッシュが前記培養培地ディッシュ上に載置された所定の数の外植片を有するとの判定に呼応して、前記培養培地ディッシュを送達ステーションに移動させるように前記第1のロボットアームを操作することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養培地ディッシュが前記培養培地ディッシュ上に載置された前記所定の数の外植片を有するとの判定をすることが、前記培養培地ディッシュが前記培養培地ディッシュ上に載置されたn個の外植片を有し、前記外植片が前記培養培地ディッシュ上で360/n度ずつ離間して等間隔で配置されていると判定することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記培養培地ディッシュを移動させるように前記第1のロボットアームを操作することが、
   前記培養培地ディッシュの蓋を前記培養培地ディッシュの上にするように前記第1のロボットアームを操作することと、
   前記蓋をした培養培地ディッシュを前記送達ステーションに移動させるように前記第1のロボットアームを操作することとを含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記充填済外植片ディッシュの基部の画像をカメラを用いて取り込むことと、
   前記画像に基づいて前記充填済外植片ディッシュ内の外植片の位置を算出することと、
   前記外植片を前記位置で把持するように前記第2のロボットアームを操作することとを含み、
   前記外植片を移動させるように前記第2のロボットアームを操作することが、前記外植片を把持するように前記第2のロボットアームを操作することに呼応して、前記外植片を移動させるように前記第2のロボットアームを操作することを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記充填済外植片ディッシュ内の前記外植片の位置を算出することが、
   前記充填済外植片ディッシュ内の前記複数の外植片の位置を算出することと、
   前記複数の外植片から前記外植片を選択することとを含む、請求項５に記載の方法。
7. 複数の培養培地ディッシュから、前記複数の培養培地ディッシュの各々の上に現状載置されている外植片の数に基づいて、前記培養培地ディッシュを選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記培養培地ディッシュを選択することが、6個未満の外植片が現状上に載置されている培養培地ディッシュを選択することを含み、
   前記充填済外植片ディッシュからの前記外植片を前記選択された培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように前記第2のロボットアームを操作することが、前記培養培地ディッシュ上に現状載置されている他の各外植片の位置に基づいて、前記外植片の移動先となる前記選択された培養培地ディッシュ上の所定の位置を算出することを含む、請求項７に記載の方法。
9. 複数の培養培地ディッシュのうちの各培養培地ディッシュを、前記複数の培養培地ディッシュのうちの他の各培養培地ディッシュの位置とは異なる移送ステーション上の所定の位置に、ディッシュ供給器から移動させるように前記第1のロボットアームを操作することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 各培養培地ディッシュが前記培養培地ディッシュ上に載置された所定の数の外植片を有するとの判定に呼応して、前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を、前記充填済外植片ディッシュからポンプで吸い出し、かつ溶液廃棄容器内にポンプで注入するように、第2のポンプを操作することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液が前記充填済外植片ディッシュから除去されたとの判定に呼応して、前記充填済外植片ディッシュをディッシュ廃棄容器に移動させるように前記第1のロボットアームを操作することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記充填済外植片ディッシュを移動させるように前記第1のロボットアームを操作することが、前記充填済外植片ディッシュを捕捉するように圧縮空気源を用いて前記第1のロボットアームの爪状グリップを操作することを含み、
    前記外植片を移動させるように前記第2のロボットアームを操作することが、前記第2のロボットアームの負圧源を用いて前記外植片にかかる吸引力で前記外植片を固定するように前記第2のロボットアームを操作することを含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記外植片を移動させるように前記第2のロボットアームを操作することが、前記外植片の感染に伴う所望の感染時間に達したとの判定に呼応して、前記外植片を前記充填済外植片ディッシュから移動させるように前記第2のロボットアームを操作することを含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記シェーカープレートを動かすように前記シェーカーステーションを操作することが、前記プレートによって画定される面内での回転移動または横方向移動の少なくとも1つを含む移動パターンで前記プレートを動かすことを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記第2のロボットアームのグリップを殺菌することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液がアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液がアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含む、請求項１に記載の方法。
18. 移動のために外植片ディッシュを捕捉する爪状グリップを備えた第1のロボットアームと、
    移動のために吸引力を用いて外植片を固定する吸引グリップを備えた第2のロボットアームと、
    アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液を送達するように構成されたポンプと、
    シェーカープレートを備え、かつ前記シェーカープレートを動かすように構成されたシェーカーステーションと、
    電子制御装置であって、
    複数の外植片を含む外植片ディッシュをアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で充填するようにポンプを操作し、
    前記充填済外植片ディッシュをシェーカーステーションのシェーカープレート上に移動させるように前記第1のロボットアームを操作し、
    前記複数の外植片を前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染させるために、前記シェーカープレートを前記シェーカープレートによって画定される面内のある方向に動かすように前記シェーカーステーションを操作し、
    前記外植片が前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で感染したとの判定に呼応して、前記充填済外植片ディッシュからの外植片を培養培地ディッシュ上の所定の位置に移動させるように前記第2のロボットアームを操作するよう構成された前記電子制御装置とを含む、外植片調製装置。
19. 移動のために外植片ディッシュを捕捉する爪状グリップを備えた第3のロボットアームをさらに含む、請求項１８に記載の外植片調製装置。
20. 前記第1のロボットアームが圧縮空気源を含み、
    前記電子制御装置が、前記爪状グリップを開位置と閉位置との間で動かすために前記圧縮空気源を操作するように構成された、請求項１８に記載の外植片調製装置。
21. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液がアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含む、請求項１８に記載の外植片調製装置。
22. 前記アグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液がアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含む、請求項１８に記載の外植片調製装置。
23. ハウジングと、
    前記ハウジングに固定され、かつ縦軸を中心とした細長の本体であって、積み重ねられたペトリディッシュを前記縦軸に沿って固定するように構成された前記細長の本体と、
    前記ハウジング内に位置し、かつ前記積み重ねられたペトリディッシュのうちの1組のペトリディッシュを前記縦軸に沿って第1の方向に移動させて、前記積み重ねられたペトリディッシュのうちの第1のペトリディッシュを前記1組のペトリディッシュから分離するように構成された第1の空気圧装置と、
    前記ハウジング内に位置し、かつ前記分離された第1のペトリディッシュを前記縦軸に直交する軸に沿って移動させるように構成された第2の空気圧装置とを含む、ディッシュ供給システム。
24. 前記第1の空気圧装置が、前記1組のペトリディッシュのうちの最下部のペトリディッシュを固定するように構成された一対のディッシュグリップアームを含む、請求項２３に記載のディッシュ供給システム。
25. 前記第2の空気圧装置が、前記分離された第1のペトリディッシュを前記ハウジング外側の位置まで移動させるように構成された、請求項２３に記載のディッシュ供給システム。
26. 前記ハウジング内に位置し、かつ前記分離された第1のペトリディッシュが前記第2の空気圧装置によって操作されるプレート延長部から除去されたとの判定に呼応して、前記1組のペトリディッシュを前記第1の方向とは反対の第2の方向に移動させるように構成された第3の空気圧装置をさらに含む、請求項２３に記載のディッシュ供給システム。