JP2016502856A - 効率的なハイスループットトランスジェニック事象生成のための改善された割れ種子ダイズ形質転換 - Google Patents

Abstract

胚軸の一部を保持する割れたダイズ種子を、導入遺伝子を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に感染させることを含む、ダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性生殖系列形質転換のための方法が開示される。方法は、胚軸の一部を含む割れたダイズ種子の形質転換から生成された外植片を、選択培地上でｉｎ ｖｉｔｒｏで再生させることをさらに含み得る。

Description

関連出願の相互参照
本願は、この参照により本明細書にその全文が組み込まれる、２０１２年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／７３９，３４９号の優先権を主張する。

電子的に提出された配列表への言及
配列表の認証謄本は、２０１３年１２月１０日に作製され、１９，３０１バイトの大きさを有し、本明細書と同時に出願された「７３５０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたファイルとともにＡＳＣＩＩ形式配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式の文書中に含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、概して、植物育種に関する。ダイズの形質転換のための方法が提供される。本開示の方法は、ダイズの効率的なハイスループットトランスジェニック生成およびトランスジェニックダイズ製品の商業的開発にとって有用である。

ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））は、最も重要な農作物の１種であり、年間作物収量が２億メートルトンを超え、推定価値が世界中で４００億米ドルを超える。ダイズは、全世界的にすべての油糧種子生産の９７％超を占める。したがって、この有益な作物の品質および収率を改善するための、信頼性のある、効率的な方法は、相当に興味深いものである。

ダイズを改良するための伝統的な育種方法は、ダイズ栽培品種の大部分が、育種について狭い生殖質基盤につながるほんの２、３種の親株に由来するので制約を受けてきた。Christou et al., TIBTECH 8:145-151 (1990)。現代の研究努力は、ダイズ生産を改善するための植物遺伝子工学技術に焦点を当ててきた。トランスジェニック法は、所望の遺伝子を作物の遺伝生殖系列中に導入して、エリート植物株を作製するよう設計される。このアプローチは、栄養的価値を改善しながら、疾患、昆虫および除草剤に対するいくつかのその他の作物の抵抗性の増大に成功した。

高速マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび直接ＤＮＡ取り込みを含め、遺伝子を植物組織中に移すためにいくつかの方法が開発されてきた。対象の遺伝子をダイズ中に導入するために、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性遺伝子形質転換が最近使用された。しかし、ダイズは、トランスジェニックエンジニアリングにとって困難な系であることがわかっている。効率的な形質転換およびダイズ外植片の再生は、達成することが難しく、反復することが困難であることが多い。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、病原性の土壌に生息する細菌は、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる、そのＤＮＡを宿主植物細胞に移し、宿主細胞が細菌栄養にとって有用な代謝産物を産生するよう誘導する固有の能力を有する。組換え技術を使用すると、Ｔ−ＤＮＡの一部またはすべてを対象の遺伝子（単数または複数）と置き換え、宿主植物を形質転換するのに有用な細菌ベクターを作製することができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性遺伝子導入は、通常、組織培養中の未分化細胞を対象とするが、植物の葉または茎から採取された分化細胞を対象とする場合もある。ダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換のために、いくつかの手順が開発されており、これらは、形質転換に付される外植片組織に基づいて大まかに分類され得る。

米国特許第７，６９６，４０８号、Olhoft, et al.には、単子葉植物および双子葉植物の両方を形質転換するための子葉節法が開示されている。「子葉節」法は、子葉節のすぐ下で切断することによって５〜７日齢のダイズ実生から胚軸を除去すること、子葉を有する残りの胚軸部分を分割し、分離すること、および子葉から上胚軸を除去することを含む。子葉外植片の腋芽および／または子葉節の領域に傷をつけ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）とともに暗所で５日間栽培する。方法は、種子のｉｎ−ｖｉｔｒｏ発芽を必要とし、傷をつけるステップは相当なばらつきを取り込む。

米国特許第６，３８４，３０１号、Martinelli et al.には、ダイズ種子から切り出したダイズ胚から得た生存している成長点組織中へのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性遺伝子送達と、それに続く、シュート形成を誘導するための選択物質およびホルモンと成長点外植片の培養が開示されている。「子葉節」法と同様に、成長点外植片は、感染に先立って傷をつけることが好ましい。

米国特許第７，４７３，８２２号、Paz et al.には、「半種子外植片」法と呼ばれる改変された子葉節法が開示されている。成熟ダイズ種子を吸水させ、表面滅菌し、へそに沿って分割する。感染に先立って、胚軸およびシュートを完全に除去するが、他の傷は生じない。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換が進行し、有望な形質転換体を選択し、外植片を選択培地で再生させる。

形質転換効率は、これらの方法を用いる場合比較的低いままであり、「子葉節」法について、およそ０．３％〜２．８％であり、「成長点外植片」法について、１．２〜４．７％であり、「半種子外植片」法について、３．２％から８．７％の間（全体に４．９％）である。およそ３％の形質転換効率が、当技術分野では通常である。

改善された「割れ種子」トランスジェニックプロトコールは、トランスジェニックダイズ製品の将来の製造および開発を加速し得る。ダイズ組織への導入遺伝子の安定な組み込みのための効率的なハイスループット法は、育種プログラムを促進し、作物生産性を増大する可能性を有する。

本開示は、植物細胞を形質転換する方法に関する。より詳しくは、本開示は、胚軸の一部を保持する割れダイズ種子のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換を使用してダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））を形質転換する方法に関する。

一実施形態では、本開示は、トランスジェニック事象を生成する方法であって、切断ツールをダイズ種子の種皮中に挿入して、第１の子葉切片および第２の子葉切片を形成することと、胚軸の一部を含む第１の子葉切片に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することとを含む、方法に関する。

別の実施形態では、本開示は、トランスジェニック事象を生成する方法であって、切断ツールを種子の種皮中に挿入して、胚軸の一部を含む子葉切片を形成することと、胚軸の一部を含む子葉切片に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することと、培養された接種された子葉切片から、トランスジェニック事象を含む稔性全植物を生産することとを含む、方法に関する。

ダイズ種子の平面図である。 図１のダイズ種子の側面図である。 図１中、線３−３に沿ったダイズ種子の横断面図である。 ダイズ種子の胚軸の一部と関係している切断ツールを示す図３と同様の図である。 ダイズの長手方向軸に沿ってダイズ中に挿入された切断ツールを示す図１中の線５−５に沿ったダイズ種子の横断面図である。 １対の子葉切片の平面図である。 ｐＤＡＢ９３８１、特定の実施形態に従うダイズ外植片のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換において使用され得る構築物のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０７５３３のプラスミドマップを示す図である。 種々の割合のグリホサートの、子葉の少なくとも半分で黄変を示す外植片のパーセンテージを表すグラフが提供されることを示す図である。 ｐＤＡＢ１０５９５８のプラスミドマップを示す図である。

配列表
添付の配列表に列挙された核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定されるように、ヌクレオチド塩基の標準文字略語を使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示される鎖の任意の参照によって含まれると理解される。添付の配列表では：
配列番号１は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ９３８１中のＹＦＰ植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。
配列番号２は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ９３８１中のＰＡＴ植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。
配列番号３は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ１０７５５３中のＤＧＴ−２８植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。
配列番号４は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ１０７５５３中のＰＡＴ植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。
配列番号５は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ１０５９５８中のＨＰＴ植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。
配列番号６は、本開示において使用するための、プラスミド構築物ｐＤＡＢ１０５９５８中のＰＡＴ植物転写単位（ＰＴＵ）を示す。

ダイズの効率的なハイスループット形質転換のための方法が、本明細書において開示される。開示されたダイズ形質転換方法の配置は、これまでの公知の方法を上回って大幅に改善された形質転換頻度をもたらし、最大２０．３％の形質転換頻度をもたらす。新規ダイズ形質転換系は、その他の方法、すなわち、「子葉節」法および「半種子外植片」法よりも約３〜８倍効率的であり、トランスジェニックダイズ植物の商業的開発を改善するための基礎として役立つ。

一般に、本開示の実施形態は、胚軸の一部を含む割れダイズ種子の形質転換のための新規方法に関する。新規方法は、その他の公知の形質転換法の改善であり、トランスジェニックダイズ植物の効率的な生産をもたらす。

一実施形態では、ダイズを導入遺伝子で形質転換するための新規方法が開示される。この方法の実施形態は、ダイズ種子を長手方向に分割して、割れダイズ種子を得ることを含み、ここで、胚軸の一部は、割れダイズ種子と付着したままである。次いで、形質転換法を使用して、胚軸の一部を含む割れダイズ種子を少なくとも１種の導入遺伝子で形質転換する。形質転換された、胚軸の一部を含む割れダイズ種子から、ダイズ形質転換体を選択する。

本開示の一実施形態では、ダイズ種子を吸水させ、その後、ダイズ種子を分割する。ダイズ種子は、１４〜１６時間吸水させてもよい。さらに、ダイズ種子は、その他の代替期間の間、吸水させてもよい。例えば、ダイズ種子は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８時間吸水させてもよい。

本開示の第２の実施形態では、ダイズ種子を、ダイズ種子のへそに沿って長手方向に分割する。

一実施形態では、ダイズ種子を、胚軸がダイズ種子の節の末端に付着したままであるよう分割する。ダイズ種子とともに保持される胚軸は、胚軸種子構造の任意の部分を含み得る。そのようなものとして、ダイズ種子を分割しながら保持される胚軸の任意の部分または量が、本開示の範囲内にある。実施形態は、胚軸の(or)任意の全長部分または任意の部分を含む、ダイズ種子の分割で保持される胚軸の任意の部分を含む。ダイズ種子を分割した場合に、例えば、１／４、１／３、１／２、２／３、３／４または全胚軸が保持され得る。

さらなる実施形態では、胚軸の保持された部分を有する割れダイズ種子を、割れダイズ種子に、構築物内に１種または複数の導入遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の株を接種することによって形質転換する。さらなる実施形態は、その他の形質転換法を含み得る。例えば、高速マイクロプロジェクション媒介性形質転換法、マイクロインジェクション媒介性形質転換法、エレクトロポレーション媒介性形質転換法または直接ＤＮＡ取り込み媒介性形質転換法または任意のその他の植物形質転換法が、本開示の範囲内で考慮される。

本開示の一実施形態では、胚軸の保持された部分を有する割れダイズ種子を形質転換し、それによって、導入遺伝子をダイズ細胞中に導入する。ダイズ細胞内への導入遺伝子の導入は、安定にまたは一過性に形質転換されたダイズ植物細胞をもたらし得る。この実施形態の一態様では、１種または複数の導入遺伝子がダイズ植物細胞中に形質転換され得る。さらなる実施形態では、導入遺伝子は、プロモーター、オープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域を含む。オープンリーディングフレームは、遺伝子をコードし得、ここで、遺伝子は、マーカー遺伝子、農学的遺伝子または任意のその他の種類の遺伝子である。

一実施形態では、形質転換された、胚軸の保持された部分を有する割れダイズ種子を、抗菌選択物質を使用して選択する。抗菌選択物質の例として、それだけには限らないが、グルホシネート、ホスフィノトリシン、２，４−Ｄ、カナマイシンおよびグリホサートが挙げられる。

本開示の実施形態は、胚軸の一部を含む割れダイズ種子から１つまたは複数の外植片を再生させることに関する。外植片の再生は、通常、選択培地で行われるが、当技術分野で公知のその他の種類の培地で行われてもよい。外植片の再生に成功すると、適当な培地での組織培養（例えば、「培養」）によって１つまたは複数のシュートの形成が誘導され得る。本開示のさらなる実施形態として、１つまたは複数のシュートが、稔性ダイズ全植物に栽培され得る。前記シュートが形質転換された生殖系列細胞を含み得る。

本開示のその後の実施形態では、成熟した稔性ダイズ全植物を別のダイズ植物と有性交雑して、ダイズ後代植物を作製することができる。本開示の別の実施形態では、胚軸の付着している部分を含む割れダイズ種子を形質転換することから生成された外植片を単離し、シュート誘導（選択なしで２週間および選択を用いて２週間）、シュート伸長（選択を用いて）および発根（選択なし）のための細胞組織培地に進める。細胞培養のこれらの段階を通して、トランスジェニックダイズ外植片の進展の結果、トランスジェニック植物が得られる。トランスジェニック植物は、分子的分析によって、ダイズゲノム中に安定に組み込まれている導入遺伝子を含有すると確認される。次いで、特定のトランスジェニックダイズ植物を、温室中で成熟まで成長させる。実験では、子葉法のものと同様の、Ｔ１後代の４５％が、後代ダイズ植物に遺伝性であった導入遺伝子の安定に組み込まれたコピーを有するとわかった。その後の世代への導入遺伝子の遺伝性は、除草剤Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）を用いる除草剤スクリーニングによっておよび分子的分析によって確認された。

別の実施形態では、本開示は、トランスジェニック事象を生成する方法であって、切断ツールをダイズ種子の種皮中に挿入して、第１の子葉切片および第２の子葉切片を形成することと、胚軸の一部を含む第１の子葉切片に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することとを含む、方法に関する。

一実施形態では、方法は、第１の子葉切片および第２の子葉切片から種皮を除去し、その後、第１の子葉切片に接種することを含む。さらなる実施形態では、方法は、切断ツールを挿入することと、胚軸を長手方向に切断して、胚軸の一部を各子葉切片とともに保持することとを含む。実施形態の一態様では、ダイズ種子の胚軸は、切断ツールを挿入する前に未切断の長さを有し、第１の子葉切片の胚軸の一部は、胚軸の未切断の長さの約１／３〜１／２である長さを有する。実施形態のなお別の態様では、第１の子葉切片の胚軸の一部は、切断されて、第１の子葉切片と付着している胚軸の一部を保持し、胚軸の保持された部分は、胚軸の未切断の長さの約１／３〜１／２である長さを有する。実施形態のさらなる態様では、ダイズ種子の胚軸は、切断ツールを挿入する前に未切断の長さを有し、第１の子葉切片の胚軸の一部は、未切断の長さと等しい長さを有する。

別の実施形態では、切断ツールを挿入することは、ダイズ種子をダイズ種子のへそに沿って長手方向に切断することを含む。実施形態の一態様では、ダイズ種子の外表面上のへそを位置決定し、切断ツールを、切断ツールをへそと並べるようにダイズ種子に対して方向づけし、その後、切断ツールを挿入する。実施形態のさらなる態様では、各子葉切片は、へその一部を含む。実施形態の別の態様では、ダイズ種子は、へそを通って伸びる長手方向軸を有し、長手方向軸は、ダイズ種子を第１の側および第２の側に分ける。実施形態のさらなる態様では、ダイズ種子の第１の側を把握し、その後、切断ツールを挿入する。

その後の実施形態では、本開示は、切断ツールを挿入することと、切断ツールがダイズ種子の胚軸中に進み、その後、第１および第２の子葉切片を形成することとに関する。代替実施形態では、第１および第２の子葉切片が形成され、その後、切断ツールを挿入し、切断ツールが胚軸中に進み、胚軸の未切断の長さの何分の一（例えば、約１／３〜１／２）である長さを有する胚軸の一部を保持する第１の子葉切片を生成する。

さらなる実施形態では、本開示の方法は、培養された、接種された子葉切片から、トランスジェニック事象を含む稔性ダイズ全植物を生産することを含む。実施形態の一態様では、稔性ダイズ全植物のトランスジェニック事象は、トランスジェニック事象を含む。さらなる実施形態では、本開示は、稔性ダイズ全植物の後代を生産することを含み、ここで、後代植物は、トランスジェニック事象を含み、任意選択で、後代植物からダイズ種子を生成することを含む。

実施形態の別の態様では、本開示は、開示される方法に従って生産される、トランスジェニック事象を含む、稔性ダイズ全植物の後代植物を提供する。実施形態のさらなる態様では、本開示は、後代植物から生成された、トランスジェニック事象を含むダイズ種子に関する。実施形態のその後の態様では、本開示は、稔性トランスジェニックダイズ全植物を、別のダイズ植物と交雑することによって後代植物を生産することに関する。実施形態のさらなる態様では、本開示は、稔性ダイズ全植物の、別のダイズ植物との交雑から得た、トランスジェニック事象を含む後代種子を収穫することによって後代植物を生産することに関する。実施形態の別の態様では、本開示は、後代種子を植えることによって後代植物を生産することに関する。実施形態のその後の態様では、本開示は、後代種子から後代植物を栽培することによって、トランスジェニック事象を含む後代植物を生産することに関する。実施形態のさらなる態様では、本開示は、より前の後代植物から、その後の後の世代の後代植物を生産することによって後の世代の後代植物を生産し、その結果、その後の後代植物がトランスジェニック事象を含むことに関する。

別の実施形態では、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素利用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養価遺伝子、ＤＮＡ結合遺伝子および選択マーカー遺伝子からなる群から選択される。

なお別の実施形態では、本開示は、トランスジェニック事象を生成する方法であって、切断ツールを種子の種皮中に挿入して、胚軸の一部を含む子葉切片を形成することと、子葉切片および胚軸の一部に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することと、培養された、接種された子葉切片から稔性全植物を生産することとを含む、方法を提供する。稔性全植物は、トランスジェニック事象を含む。

さらなる実施形態では、種子は、双子葉類種子である。

その後の実施形態では、本開示は、トランスジェニック事象を含む稔性全植物の後代植物を提供する。実施形態の一態様では、種子は、トランスジェニック事象を含む後代植物から生成され得る。したがって、本開示は、トランスジェニック事象を含む種子を提供し、これが、トランスジェニック事象を含む植物を栽培するために使用され得る。

別の実施形態では、切断ツールを種子の種皮中に挿入することは、第１の子葉切片および第２の子葉切片を形成する。各子葉切片は、胚軸の一部を含む。

さらなる実施形態では、導入遺伝子は、ｐａｔ、ｄｇｔ−２８またはｈｐｔ選択マーカー遺伝子を含む。

特に断りのない限り、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において「少なくとも１つの」を指す。

本明細書において使用される場合、用語「外植片」とは、ドナー植物から（例えば、ドナー種子から）採取または単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、適した培地中で成長できるダイズ組織の小片を指す。

本明細書において使用される場合、「子葉」は、一般に、種子植物の胚の胚葉または「初生葉」を指し得る。子葉はまた、当技術分野で「種子葉」とも呼ばれる。ダイズなどの双子葉種は、２枚の子葉を有する。子葉切片は、完全なもしくは全子葉であろうと、子葉の断片もしくは一部分であろうと子葉の任意の部分を指す。「子葉節」とは、種子または実生中の子葉の胚との結合点を指し、全般的に、その結合点と関連している組織を指す場合もある。

本明細書において使用される場合、用語「把握すること」とは、ダイズ種子を、ツールを用いてまたは手によって、保持することまたは捉えることを指す。ダイズ種子が堅く握られることを可能にする任意のその後の機序または作用は、用語把握することの範囲内にあると考えられる。

本明細書において使用される場合、用語「切断ツール」とは、種子、種子子葉、種皮（see coat）、へそ、胚軸または任意のその他の種子構造を切断する、分断するまたは剪断するためのツールを指す。切断ツールは、メス、カミソリの刃、包丁、ナイフ、小刀、彫刻刀、鎌、のみ、かんななどを含み得る。いくつかの態様では、切断ツールは、シャンクまたはハンドルとつながっている切断手段を含み得る。その他の態様では、切断ツールは、任意のその他の構造的特徴とつながっていない単一の切断手段のみを含み得る。切断ツールはまた、種子構造を第１および第２の子葉切片に分割するのに適したレーザーまたは高加圧流体を含み得る。

本明細書において使用される場合、用語「種皮」とは、種子の保護被膜として働く胚珠の外皮を指す。種皮は、当技術分野で公知のその他の同様の用語に加えて、「種皮（testa）」または「外皮（husk）」の代替記述用語によって記載され得る。種皮は、スベリン、クチン、リグニン、カロース、ペクチン、ワックスおよびフェノール酸化の不溶性生成物などの疎水性物質を含有し得る。マメ科植物では、ダイズ同様、種皮（testa）は、そのキャップがコルク化クチクラ下層中に伸長し、ろう様クチクラが厚いスベリン層の外側にある、長形厚壁異形細胞の柵状層を含有する。

本明細書において使用される場合、「胚軸」は、子葉の下の、根もしくは小根（胚根）の上の植物胚または実生の部分である。種子では、胚軸（hypocotyl）は、子葉節のすぐ下に見られ、「胚軸（hypocotyledonous stem）」または「胚軸（embryonic stem）」とも呼ばれ得る。本明細書において使用される場合、胚軸は、位置、ならびにそこに見られる組織を指し得る。「上胚軸」は、子葉の上、第一本葉の下の植物胚または実生の部分である。種子では、上胚軸は、子葉節のすぐ上に見られ、「胚性シュート」または「将来シュート」とさまざまに呼ばれ得る。本明細書において使用される場合、上胚軸は、記載されるような位置またはそこに見られる組織を指し得る。

本明細書において使用される場合、用語「胚軸（embryonic axis）」または「胚軸（embryo axis）」とは、植物の胚の主要部分を指し、一般に、上胚軸および胚軸を含む。

本明細書において使用される場合、用語「遺伝子改変された」または「トランスジェニック」植物とは、形質転換によって植物細胞、植物組織、植物の部分、植物生殖質または植物のゲノム中に導入される予め選択されたＤＮＡ配列を含む、植物細胞、植物組織、植物の部分、植物生殖質または植物を指す。

本明細書において使用される場合、用語「トランスジェニック」、「異種の」、「導入された」または「外来」ＤＮＡまたは遺伝子とは、組換えＤＮＡ配列または組換えＤＮＡもしくは遺伝子のレシピエントである植物のゲノム中に天然に生じない遺伝子、または形質転換されていない植物中とは異なる、ゲノム中の位置もしくは関係でレシピエント植物中に生じる遺伝子を指す。

本明細書において使用される場合、用語「植物」とは、全植物、植物組織、花粉、種子または胚を含めた植物の部分、植物生殖質、植物細胞または植物の群のいずれかを指す。本発明の方法において使用され得る植物のクラスは、ダイズに限定されず、一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方を含めた、形質転換技術を受け入れる任意の植物を含み得る。

本明細書において使用される場合、用語「後代」とは、トランスジェニック事象を含む最初の形質転換体（Ｔ０）から生成されるか、または由来する（直接的にまたは時間を隔ててのいずれか）、植物、植物の部分、植物組織の、植物種子の任意のその後の世代を指す。後代は、戻し交雑、フォワードブリーディング（forward breeding）、マーカー支援育種（marker assisted breeding）または最初の形質転換体のトランスジェニック事象の浸透性交雑をもたらす任意のその他の公知の育種方法論による、植物の個々のまたは特定の系統間の交雑によって生産される植物、植物の部分、植物組織の、または植物種子の任意のその後の世代（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ４、ＢＣ５など）をさらに含む。

本明細書において使用される場合、用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物への核酸または断片の転移および組込みを指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。形質転換の既知方法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）媒介性形質転換、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（微粒子銃）、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介性形質転換、エアゾールビーミングまたはＰＥＧ媒介性形質転換ならびに他の可能な方法が挙げられる。

遺伝的に修飾された植物の生産に関して、植物の遺伝子工学のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための植物形質転換のために、生物学的および物理的形質転換プロトコールを含めた多数の方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999);Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson、J. E.、Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織形質転換および植物の再生のためのベクターおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において入手可能である。

ＤＮＡを植物宿主細胞に形質転換するために多数の技術が利用可能である。それらの技術は、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用する武装解除したＴ−ＤＮＡを用いる形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃（biolistic）（微粒子銃（microparticle bombardment））、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性形質転換、エアゾールビーミングまたはＰＥＧおよびその他の可能性ある方法を含む。

例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中に直接的に導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ微粒子銃（particle bombardment）などの微粒子銃（biolistic）法を使用して植物組織に直接的に導入され得る（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327:70-73を参照のこと）。植物細胞形質転換のためのさらなる方法として、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性ＤＮＡ取り込みによるマイクロインジェクション（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418）が挙げられる。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換によって植物細胞中に導入され得る（例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号第１２／２４５，６８５号を参照のこと）。

植物形質転換の別の公知の方法として、ＤＮＡが微粒子（microprojectile）の表面に保持される微粒子（microprojectile）媒介性形質転換がある。この方法では、発現ベクターは、微粒子（microprojectiles）を、植物細胞壁および細胞膜を透過するのに十分な速度に加速させる微粒子銃（biolistic）装置を用いて、植物組織中に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。

あるいは、遺伝子導入および形質転換法として、それだけには限らないが、塩化カルシウム沈殿によるプロトプラスト形質転換、裸のＤＮＡのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション媒介性取り込み（Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828；およびShimamoto (1989) Nature 338:274-276を参照のこと）および植物組織のエレクトロポレーション（D’Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505）が挙げられる。

発現ベクターを植物中に導入するために利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換システムに基づいている。Horsch et al. Science 227:1229 (1985)。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが知られている植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保持する。Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入のための方法の記載はまた、例えば、Gruber et al., 前掲、Miki et al., 前掲、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)および米国特許第４，９４０，８３８号および同５，４６４，７６３号において入手可能である。

形質転換にアグロバクテリウムが使用される場合には、挿入されるべきＤＮＡは、特定のプラスミドに、すなわち、中間体ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされるべきである。中間体ベクターは、アグロバクテリウム中では自身で複製できない。中間体ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中に転移され得る。日本たばこスーパーバイナリー系は、このような系の一例である（Komari et al., (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang、ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41において；およびKomori et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-60に総説されている）。バイナリーベクターは、大腸菌（e. coli）およびアグロバクテリウムの両方において自身を複製できる。バイナリーベクターは、右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域によって囲まれている、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは、アグロバクテリウム中に直接、形質転換され得る（Holsters、1978）。宿主として使用されるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を保持するプラスミドを含むこととなる。ＴｉまたはＲｉプラスミドはまた、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ領域を含む。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの、植物細胞への転移にとって必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含有される場合もある。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性機能は、細胞が、バイナリーＴ ＤＮＡベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721）または同時培養手順（Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231）を使用して細菌に感染すると、構築物および隣接するマーカーを含有するＴ−鎖の、植物細胞ＤＮＡへの挿入を指示する。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を操作するために使用される（Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384;Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641）。アグロバクテリウム形質転換系はまた、単子葉植物および植物細胞を形質転換するため、ならびに単子葉植物および植物細胞にＤＮＡを転移するために使用され得る。米国特許第５，５９１，６１６号；Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041;Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179;Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40；およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434を参照のこと。

遺伝構築物の植物細胞への導入後に、植物細胞を成長させてもよく、シュートおよび根などの組織の分化が出現すると、成熟した植物が生成され得る。いくつかの実施形態では、複数の植物が生成され得る。植物を再生するための方法論は、当業者に公知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishersにおいて、およびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)において見出すことができる。一般に、本明細書において記載される修飾された植物は、発酵培地において培養し、土壌などの適した培地において成長させてもよい。いくつかの実施形態では、高等植物の適した成長培地は、それだけには限らないが、土壌、砂、根成長または水耕培養を支持する任意のその他の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）ならびに高等植物の成長を最適化する適した光、水および栄養補助物質を含めた、植物のための任意の成長培地を含み得る。

上記の形質転換技術のいずれかによって製造される形質転換された植物細胞を、培養して、形質転換された遺伝子型、ひいては、所望の表現型を有する全植物体を再生できる。このような再生技術は、組織培養成長培地中の特定の植物ホルモンの操作に頼るものであり、通常、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部からも得られ得る。このような再生技術は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486に全般的に記載されている。

別に具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。

形質転換された細胞または組織または植物の部分または植物の選択のためのリポーターまたはマーカー遺伝子の使用が、形質転換ベクターまたは構築物中に含まれ得るということが、当業者によって理解される。選択マーカーの例として、除草剤または抗生物質などの代謝拮抗剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994;Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983;Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983およびFraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, 1984;Waldron et al.. Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985;Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995も参照のこと）；細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995）が挙げられる。

さらなる選択マーカーとして、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988）、アトラジンに対する抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993）または突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）またはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与するその他のマーカーが挙げられる。適した選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983）；ストレプトマイシン（Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990）；ブロモキシニル（Stalker et al., Science 242:419-423, 1988）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, 1986）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987）に対する抵抗性をコードする遺伝子などが挙げられる。

選択遺伝子の使用のための１つの選択肢は、グルホシネート抵抗性をコードするＤＮＡであり、一実施形態では、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下の、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子である。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する抵抗性を付与する。例えば、Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25-37);Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., Biotechnology 11:835, 1993;White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062、1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990；およびAnzai et al.、Mol. Gen. Gen. 219:492、1989を参照のこと。ｐａｔ遺伝子の１つのバージョンとして、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子があり、米国特許第６，０９６，９４７号に記載されている。開示される方法において使用され得る別の選択マーカー遺伝子として、抵抗性グリホサートを付与するｄｇｔ−２８がある。特定の実施形態では、ｄｇｔ−２８は、双子葉類植物における発現について最適化され得る（例えば、ＵＳ２０１３０２０５４４０を参照のこと）。

さらに、ポリヌクレオチドをコードするマーカーを含有する植物細胞の同定を容易にするマーカーが使用され得る。配列の存在が、測定可能な産物をもたらし、植物細胞の破壊を伴わずに産物をもたらし得る場合には、スコア化可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは有用である。例として、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号および同５，５９９，６７０号）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907）；およびアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、使用されるマーカーは、ベータ−カロテンまたはプロビタミンＡ（Ye et al, Science 287:303-305-(2000)）である。この遺伝子は、イネの栄養を増強するために使用されてきたが、この例では、代わりに、スクリーニング可能なマーカーとしてとして使用され、対象とする遺伝子と連結している遺伝子の存在は、提供される金色によって検出される。遺伝子が、植物へのその栄養的な貢献のために使用される状況とは異なり、マーキング目的には、少量のタンパク質で十分である。その他のスクリーニング可能なマーカーとして、例えば、中でも、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の製造を調節する生成物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179;Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48）およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207）などのフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell(1989) 1:1175-1183）、ｐ１遺伝子（Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591;Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19）；ｂｒｏｎｚｅ遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197;Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）を含めた、全般的に、アントシアニン／フラボノイド遺伝子が挙げられる（Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127での考察を参照のこと）。

適したマーカーのさらなる例として、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54およびKato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54を参照のこと）；ルシフェラーゼをコードし、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度測定、微光ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用してその存在が検出され得る、ｌｕｘ遺伝子（Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84）；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が、赤色であり、したがって、視覚的に選択可能である、ＤｓＲｅｄ２（Dietrich et al. (2002) Biotechnologys 2(2):286-293）が挙げられる。さらなる例として、種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241）およびチロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、順に、これが縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703）が挙げられる。明確に、多数のこのようなマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。

特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、任意選択で、対象とする別のヌクレオチド配列と組み合わされ得る。用語「対象とするヌクレオチド配列」とは、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、転写されたＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子であり得る核酸分子（ポリヌクレオチドとも呼ばれ得る）を指し、必ずしもポリペプチドまたはタンパク質をコードしない、全遺伝子を構成しない核酸分子（例えば、プロモーター）も指し得る。例えば、特定の実施形態では、核酸分子は、グリホサートもしくは別の除草剤に対するさらなる抵抗性もしくは耐性、および／または選定された昆虫または疾患に対する抵抗性および／もしくは栄養強化および／もしくは改善された農学的特徴、および／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供する別のものと組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。

対象とするこのようなヌクレオチド配列として、それだけには限らないが、以下に提供される実施例が挙げられる。

１．有害生物または疾患に対して抵抗性を付与する遺伝子または配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvu）に対する抵抗性のための、トマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al.、1994 Cell 78:1089）が挙げられる。

（Ｂ）Ｂｔ δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入できる。

（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などの、レクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。

（Ｄ）昆虫有害生物に対する殺うじ剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などの、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号を参照のこと。

（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。

（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその変異体、それをベースとしたミメティックまたはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。

（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（allostatin）（Pratt,1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号）が挙げられる。

（Ｈ）蛇、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, 1992 Gene 116:165）。

（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素。

（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０２１９７）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。

（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。

（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および同５，６０７，９１４号を参照のこと；後者は、疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。

（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）。

（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される疾患発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照のこと。

（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al. (1994) Abstract #497、Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。

（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al. (1993) Nature 266:469を参照のこと。

（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., 1992) Biotechnology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)に記載されている。

（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌疾患に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., 1992). Biotechnology 10:3305。

（Ｓ）ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al.、米国特許第６，５０６，５５９号;Graham et al.同６，５７３，０９９号を参照のこと。

２．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダザリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。突然変異体アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）(Lee et al., 1988 EMBO J. 7:1241)のこのカテゴリーコード中の例示的遺伝子はまた、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)としても知られている。

（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１種または複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。欧州特許出願番号０３３３０３３および米国特許第４，９７５，３７４号には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願０２４２２４６に提供されている。De Greef et al. (1989) Biotechnology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。

（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173に記載されている。

（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（ＥＰ４１８１７５、ＥＰ４７０８５６、ＥＰ４８７３５２、ＥＰ５２７０３６、ＥＰ５６０４８２、ＥＰ６８２６５９、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、米国特許第５，５０６，１９５号）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および同６，２４５，９６８号および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。

（Ｅ）遺伝子。フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与する遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。

（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、ＷＯ２００７／０５３４８２ Ａ２に記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。

（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号を参照のこと）。

（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）。

（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照のこと。

３．価値が付加された形質を付与するか、またはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。

（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。

（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素の遺伝子コーディングを用いて形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., 1992 Biotechnology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al.、1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。

対象とする配列はまた、相同組換えによって、植物ゲノムの所定の領域中に導入されるヌクレオチド配列であり得る。相同組換えによって、植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を安定に組み込むための方法は、当技術分野内で記載されている。例えば、米国特許出願公開番号第２００９／０１１１１８８ Ａ１号に記載されるような部位特異的組込みは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体標的への導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を含む。さらに、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０２１２０７には、１種または複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に安定に組み込むためのジンクフィンガー媒介性相同組換えが記載されている。米国特許第６，７２０，４７５号に記載されるようなＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５，６５８，７７２号に記載されるようなＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用が、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に安定に組み込むために利用され得る。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体位置へターゲッティングするためのメガヌクレアーゼの使用は、Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060)に記載されている。

植物細胞内の部位特異的組込みのためのその他の種々の方法は、一般に、公知であり、適用可能である（Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定されている部位特異的組換え系は、植物における使用に適用され得る。このような系の例として、それだけには限らないが、酵母ザイゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のpSR1プラスミドに由来するR/RSリコンビナーゼ系（Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203）およびファージMuのGin/gix系（Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176）が挙げられる。

特定の例、アグロバクテリウム（Agrobacterium）株が本明細書に記載されているが、論じられている新規形質転換法の機能性は、同一判定基準を有するその他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株に移動され得る。本明細書に記載される新規形質転換法で使用され得るその他の株の例として、それだけには限らないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃ５８、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｃｈｒｙ５、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）株、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０１、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＭＯＧ１０１およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｔ３７が挙げられる。このような株の改変型は、より詳しくは、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ２０１２／１０６２２２ Ａ２に記載されている。

開示される新規形質転換法の実施形態では、成熟ダイズ種子を滅菌し、その後、切断ツールで切断し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）に感染させる。種子は、塩素ガス、塩化第二水銀、次亜塩素酸ナトリウム（sodium hypochloride）中への浸漬、炭酸ナトリウム中への浸漬または当技術分野で公知のその他の適した方法を使用して滅菌してよい。実施形態では、種子を、滅菌水またはその他の適した低張溶液を使用して吸水させ、その後、切断し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）に感染させる。６〜２４時間の種子の吸水は種子を柔らかくし、子葉をぬらし、後のシュート誘導を改善する。長期の、例えば、最大４８時間の吸水も使用され得る。

以下により詳細に記載され、図１〜６に例示されるように、ダイズは、種子の子葉をへそに沿って分割して、子葉を分離すること、次いで、種皮を除去することによって調製する。胚軸の一部の除去によって子葉と付着している軸の部分が残り、その後、形質転換する。いくつかの例では、胚軸の除去は、切断ツールを用いる胚軸のトリミングによって、または子葉の分割および分離の際に、胚軸を破壊、断裂することおよび／またはつまむことによって行われ得る。通常、胚軸の１／３から１／２の間が、子葉の節の末端に付着したままとなる。

ここで、図１を参照すると、双子葉類ダイズ種子１０が示されている。ダイズ種子１０は、種皮１６に包み込まれている、１対の子葉１２、１４を含む。ダイズ種子１０は、その最大寸法に沿って規定され、ダイズ種子１０の向かい合った長手方向末端２０、２２を通って伸びる、長手方向軸１８を有する。図１に示されるように、軸１８は、子葉１２、１４の間を伸びる。

ダイズ種子１０はまた、ダイズ種子１０の末端２０、２２の間に位置しているへそ２４を含む。例示的実施形態では、へそ２４は、種皮１６の外側に位置している外側部分２６および種皮１６の下に位置している内側部分２８を含む。

図１〜２に示されるように、へそ２４は、子葉１２、１４の上の背部に位置決定される。へそ２４の外側部分２６は、ダイズ種子１０の背側３０に位置している。へそ２４はまた、ダイズ種子１０の側面３２から（図２を参照のこと）または内側３４からも（図５を参照のこと）見られ得る。図２に示されるように、へそ２４は、種子１０の長手方向軸１８全体に対して並行に伸びる長手方向軸３６を有する。図１に示されるように、長手方向軸３６は、種子１０の軸１８と共通面３８にある。

ダイズ種子１０の胚軸４０は、子葉１２を子葉１４とつなげる。胚軸４０は、子葉１２、１４とともに種皮１６に包み込まれている。図１に示されるように、胚軸４０は、へそ２４と同様に、ダイズ種子１０の長手方向軸１８の中心にある。図３に示されるように、胚軸４０は、へそ２４の内側部分２８の上に位置している先端４２から、種子１０の長手方向末端２０に隣接して位置する基部４４に伸びる。当然のことではあるが、その他の実施形態では、胚軸４０は、軸先端４２が、へその内側部分２８から離れているように、へそ２４と重ならない場合もある。

図３を参照すると、ダイズ種子１０の内部構造が、より詳細に示されている。種皮１６は、子葉１２、１４および胚軸４０を囲む薄い外層５０を含む。へそ２４の内側部分２８は、層５０の裏面と付着しており、へそ２４の外側部分２６は、外層５０の端５２と接続している。胚軸４０は、種子１０の外周の一部の周囲に、その先端４２から、種子の末端２０に隣接して位置しているその基部４４に伸びる。

図４〜５を参照すると、形質転換のためにダイズ種子１０を調製するための例示的技術が示されている。例示的実施形態では、作成者は、種子１０を、種子１０の背側３０を上向きに方向づけるよう、その側面３２および内側３４で把握している。その他の実施形態では、作成者は、種子１０を適所に保持するために、３２、３４の側のうち一方のみを把握し、反対側を垂直面に保証し得る。さらにその他の実施形態では、作成者は、例えば、背側３０を水平に面するよう方向づけし得る。このような実施形態では、作成者は、種子１０を適所に保持するために、３２、３４の側のうち一方のみを把握し、反対側を水平面に保証し得る。

作成者は、種子１０を切断する、先のとがった刃の先端６２を含む切断ツール６０を選択し得る。上記のように、切断ツール６０は、メス、カミソリの刃、ナイフなどの形態をとり得る。例示的実施形態では、作成者は、胚軸４０をトリミングするよう切断ツール６０を方向づけし得る。そうするために、切断ツール６０は、刃の先端６２が種子１０に対して下向きに方向づけされ得、刃の先端６２は、種子１０の軸１８（したがって、種子自体）に対して横断して伸びる。図４に示されるように、ツール６０は、種皮１６を通って種子１０中に挿入され得る。刃の先端６２は、胚軸４０を通って進められ、軸４０の残りから軸４０の先端４２を分離し得る。上記のように、通常、胚軸４０の１／３から１／２の間が付着したままとなり得る。言い換えれば、胚軸４０の１／２から２／３の間が、先端４２とともに胚軸４０の残りの部分からトリミングされ得る。

例示的実施形態では、ツール６０の刃の先端６２は、胚軸４０がトリミングされる場合に、子葉１２、１４を貫通しない。いくつかの実施形態では、刃の先端６２を種子１０中にさらに進めることによって子葉１２、１４を傷つけることが望ましいものであり得る。胚軸４０をトリミングした後、作成者は、切断ツール６０を種子１０から引き抜いてもよい。

作成者はまた、同一切断ツール６０（または異なる切断ツール）を使用して、種子１０を２つの子葉切片に分割し得る。そうするために、切断ツール６０は、刃の先端６２が種子１０に対して下向きに方向づけされ得る。図５に示されるように、刃の先端６２は、へそ２４の長手方向軸３６および種子１０の長手方向軸１８によって規定される面３８と並べられる。切断ツール６０を並べるために、作成者は、種子１０の背側３０を上に、刃の先端６２をへそ２４の長手方向軸３６の中心に方向づけし得る。切断ツール６０が適切に並べられる場合には、作成者は、刃の先端６２を種子１０中に挿入し、面３８に沿って種皮１６およびへそ２４を通って薄く切り、それによって種子１０中に開口７０を作製し得る。作成者は、切断ツール６０を種子１０中に進行させ続け、胚軸４０を、子葉１２と付着している内側部分７２および子葉１４と付着している側面部分７４に薄く切ることができる。刃の先端６２が、胚軸４０の基部４４を通る場合には、作成者は、種子１０からツール６０を引き抜いてもよい。その他の実施形態では、作成者は、ツール６０を種子１０を通って進行させ続けてもよい。

作成者は、開口７０を、子葉１２、１４をさらに露出するよう広げることによって、種皮１６を子葉１２、１４から分離してもよい。子葉１２、１４は、種皮１６から除去され、種皮１６は廃棄され得る。図６に示されるように、割れダイズ種子または子葉切片と呼ばれ得る各子葉は、胚軸の区分を含む。例示的実施形態では、子葉切片１２は、胚軸４０の区分７２を含み、子葉切片１４は、胚軸４０の区分７４を含む。子葉切片１２、１４の各々は、次いで、さらに傷つけることまたはアグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物を用いる接種を含めたさらなる処理のために準備される。

割れダイズ種子に傷をつけることは、開示された方法を用いる場合には必要ではないが、子葉節法および成長点外植片法を含めたその他の方法を使用する場合には、形質転換効率を高めると報告される。植物材料に傷をつけることは、切断すること、擦過すること、刺し通すこと、超音波処理すること、プラズマで傷をつけることまたは真空浸潤によって促進され得る。したがって、形質転換に先立って胚軸の一部を含む第１の子葉切片をさらに傷つけることが、本開示の一実施形態として利用され得る。

胚軸の一部を含む割れダイズ種子に、典型的には、適した遺伝構築物を含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物を約０．５〜３．０時間、より典型的には約０．５時間接種し、適した培地での同時培養期間を最大約５日間続ける。推定上、導入遺伝子のコピーを含有する外植片が、形質転換された、胚軸の一部を含む割れダイズ種子を培養することから生じる。さらなる組織増殖のために、これらの外植片を同定し、単離する。

シュート誘導は、適した誘導培地中で外植片をおよそ２週間培養することと、それに続いて、グルホシネートなどの選択物質を含有する培地中でさらに２週間培養することによって促進され得る。選択物質を含まない培地と選択物質を含む培地の間を交互にすることが好ましい。シュート誘導培地が選択物質を含むか、またはシュート誘導培地および選択培地が選択マーカーを含む単一培地中に組み合わされるその他のプロトコールの使用に成功することができる。シュート誘導の期間の後、胚軸の一部を含有する組織単離物を切り出し、適したシュート伸長培地に移してもよい。特定の実施形態では、子葉の基部を切断することによって、子葉を除去してもよく、胚軸を含有する生き生きとしたシュートパッドを切り出してもよい。実施例２を参照のこと。

通常、形質転換後に、１種または複数の選択物質が、割れ種子外植片に適用される。選択物質は、形質転換されていないダイズ細胞を死滅させるか、またはその成長を遅延させ、残存するアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を排除するのに役立ち得る。適した物質として、グルホシネートまたはビアラホスが挙げられる。その他の適した物質として、それだけには限らないが、除草剤グリホサートまたは選択物質およびシュート誘導ホルモンの両方として作用する除草剤２，４−Ｄが挙げられる。さらに、選択物質は、使用される選択マーカーに応じて、スペクチノマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８を含めた種々の抗生物質を含み得る。使用される物質に応じて、１日〜７日間の選択が適当であり得る。

伸長したシュートの発根は、それだけには限らないが、種々の濃度のオーキシンおよびサイトカイニンを含む適した物質を使用して促され得る。例えば、植物材料を当業者に公知の適した発根培地に移す前に使用される細胞組織培養培地中に、オーキシン、インドール３−酪酸（butryic acid）（ＩＢＡ）を組み込んでもよい。根形成には、ＩＢＡへの曝露後、およそ１〜４週間、より通常は、１〜２週間かかる。

成長するシュートを栽培することは、当技術分野で一般的に知られる方法によって達成され得、成熟トランスジェニックダイズ植物につながる。例えば、実施例２を参照のこと。

トランスジェニック事象の成功の存在は、それだけには限らないが、感染およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）との同時培養後の任意の段階での、ダイズ中の組み込まれた選択マーカーおよび／またはリポーター遺伝子構築物の、Ｔａｑｍａｎ（商標）、ＰＣＲ分析およびサザン分析；リポーター構築物の証拠を示す植物もしくは植物生殖質の表現型アッセイ；または適した選択培地での外植片の選択を含めた、当技術分野で公知の技術を使用して確認され得る。

実施形態では、開示される方法は、対象の遺伝子を発現する近交系ダイズ系統の開発およびエリートダイズ栽培品種の開発のための育種プログラムを促進するために使用され得る。安定に組み込まれた導入遺伝子を含む近交系ダイズ系統を、その他の近交系ダイズ系統と交雑して、対象の遺伝子を発現するハイブリッド植物を生産してもよい。所望の形質の、エリートダイズ系統およびハイブリッドへの浸透性交雑は、開示される方法および当技術分野で公知の方法を使用して迅速に達成され得る。

本明細書に引用された、刊行物、特許および特許出願を含めたすべての参考文献は、本開示の明確な詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、そして、各参考文献が、参照により組み込まれるよう個別に、具体的に示されるかのように、その全文が本明細書に示されるかのように同程度に組み込まれる。本明細書において論じられる参考文献は、単に、本願の出願日に先行するその開示のために提供される。いかなるものも、本明細書において、本発明者らが、先行発明のためにこのような開示に先行する資格を与えられないということの承認と解釈されるべきではない。

以下の実施例は、本開示の特定の特徴および／または態様を例示するために提供される。これらの実施例は、開示を、本明細書に記載される特定の特徴または態様に制限すると解釈されるべきではない。
［実施例］

ベクター構築
ｐＤＡＢ９３８１と名付けられた単一のバイナリーベクター（図７）を、当技術分野で承認された手順を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３８１は、２種の植物転写単位（ＰＴＵ）を含有する。第１のＰＴＵ（配列番号１）は、ジャガイモ（Solanum tuberosum）から単離されたイントロン、光特異的組織誘導性ＬＳ−１遺伝子（ＳＴ−ＬＳ１イントロン；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０４７５３）を含有し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ；Gelvin et al., 1987）によって終結される黄色蛍光タンパク質コード配列（ＰｈｉＹＦＰ；Shagin et al., 2004）を駆動するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン−１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis et al., 1990）からなる。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＰＡＴ；Wohlleben et al., 1988）を駆動するために使用されるキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al., 1996）からなり、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）オープンリーディングフレーム−１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ；Huang et al., 1990）によって終結される第２のＰＴＵ（配列番号２）を、イソペンテニルトランスフェラーゼコード配列（ｉｐｔ ＣＤＳ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００６３９．１）内にクローニングした。得られたバイナリーベクターは、視覚的リポーター遺伝子および抗生物質選択マーカー遺伝子を含有しており、続いて、ダイズの形質転換のために使用された。

バイナリーベクター、ｐＤＡＢ９３８１を、エレクトロポレーションを使用してＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株（Hood et al., 1986）中に動員した。抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地で成長する個々のコロニーを同定した。単一コロニーを単離し、ｐＤＡＢ９３８１バイナリーベクターの存在を制限酵素消化によって確認した。

胚軸の一部を含む割れ種子を使用するダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換
種子調製。新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性ダイズ形質転換プロトコールを開発した。成熟ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））栽培品種マーベリック（Maverick）の種子を、塩素ガスを１６時間用い、一晩滅菌した。塩素ガスで滅菌した後、種子をＬａｍｉｎａｒ（商標）フローフード中で開放容器中に入れ、塩素ガスを消散させた。次いで、滅菌種子を滅菌Ｈ２Ｏを用い、２４℃でブラックボックスを使用して暗所で１６時間吸水させた。

割れ種子ダイズの調製。胚軸の一部を含む割れダイズ種子プロトコールには、切断ツール（例えば、メスに取り付けられた１０番の刃）を使用して長手方向に切断するダイズ種子材料の調製が必要であった。切断ツールを、種子のへそに沿ってダイズ種子の種皮中に挿入し（図５）、種皮を分離、除去し、種子を２つの子葉区分に分割した（図６）。注意深く、胚軸を部分的に除去し、ここで、胚軸の約１／２〜１／３が子葉の節の末端に付着したままとなった（図４）。本方法は、成熟種子を２つの子葉区分に分割する場合に胚軸のほぼ完全な除去をもたらすこれまでに記載された形質転換法とは異なっていた。

接種。次いで、胚軸の一部を含む割れダイズ種子を、ｐＤＡＢ９３８１バイナリープラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０１またはＥＨＡ１０５の溶液中に３０分間浸漬した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液を、λ＝０．６ ＯＤ６５０の最終濃度に希釈し、その後、胚軸を含む子葉を浸漬した。

同時培養。接種後、割れダイズ種子を、フィルター紙の小片で覆ったペトリディッシュ中で、同時培養培地（Wang, Kan. Agrobacterium Protocols 2.1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.）上で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株と５日間同時培養させた。

シュート誘導。５日の同時培養後、割れダイズ種子を、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌの第一鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、１．１１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、１００ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシンからなる液体シュート誘導（ＳＩ）培地（ｐＨ５．７）で洗浄した。次いで、割れダイズ種子を、Ｂ５塩、Ｂ５ビタミン、７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天、２８ｍｇ／Ｌの第一鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロース、０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、１．１１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５０ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシンからなるシュート誘導Ｉ（ＳＩ Ｉ）培地（ｐＨ５．７）で培養し、子葉の平坦な側を上に向け、子葉の節の末端を培地中に埋め込んだ。２週間培養した後、形質転換された、割れダイズ種子から得られた外植片を、６ｍｇ／Ｌのグルホシネート（Ｌｉｂｅｒｔｙ（登録商標））を補足したＳＩ Ｉ培地を含有するシュート誘導ＩＩ（ＳＩ ＩＩ）培地に移した。

シュート伸長。ＳＩ ＩＩ培地で２週間培養した後、子葉の基部を切断することによって、外植片から子葉を除去し、胚軸を含有する生き生きとしたシュートパッドを切り出した。子葉から単離されたシュートパッドを、シュート伸長（ＳＥ）培地に移した。ＳＥ培地は、ＭＳ塩、２８ｍｇ／Ｌの第一鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロースおよび０．６ｇ／ＬのＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１００ｍｇ／ＬのＬ−ピログルタミン酸、０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＧＡ３、１ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、５０ｍｇ／ＬのＴｉｍｅｎｔｉｎ（商標）、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのバンコマイシン、６ｍｇ／Ｌのグルホシネート、７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天からなっていた（ｐＨ５．７）。培養物を、２週間毎に新鮮なＳＥ培地に移した。培養物を、２４℃、８０〜９０μｍｏｌ／ｍ２ｓｅｃの光強度で１８時間の明期でＣｏｎｖｉｒｏｎ（商標）成長チャンバー中で成長させた。

発根。子葉シュートパッドから発達した伸長したシュートを、子葉シュートパッドの基部で伸長したシュートを切断することによって単離し、伸長したシュートを１ｍｇ／ＬのＩＢＡ（インドール３−酪酸）中に、１〜３分間浸漬して、発根を促進した。次いで、伸長したシュートを、ｐｈｙｔａトレイ中の発根培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌの第一鉄、３８ｍｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ、２０ｇ／Ｌのスクロースおよび０．５９ｇ／ＬのＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌのアスパラギン、１００ｍｇ／ＬのＬ−ピログルタミン酸 ７ｇ／ＬのＮｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．６）に移した。

栽培。２４℃、１８時間明期で、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）成長チャンバー中で１〜２週間培養した後、根を発達させたシュートを、覆いをしたサンデーカップ中の土壌ミックス中に移し、一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓｅｃの光強度で長日条件（１６時間明／８時間暗）下で、苗木の順化の間、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）成長チャンバー（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）中に入れた。発根した苗木を、サンデーカップ中で数週間順化し、その後、それらを、さらなる順化および頑強なトランスジェニックダイズ植物の確立のために温室に移した。

胚軸の一部を含む割れダイズ種子のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換によるトランスジェニック事象の確認
ＹＦＰおよびＰＡＴ ＰＴＵを含んでなるＴ鎖挿入部分を含有するトランスジェニックダイズ事象を、実施例２に記載される、胚軸の一部を含む割れダイズ種子の形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換を使用して生成した。

ＥＨＡ１０１およびＥＨＡ１０５株各々に３回の実験からなる合計６回の独立した形質転換実験を、新規方法を使用して完了した。温室で成長させたＴ０ダイズ推定トランスジェニック事象を、それぞれ、ＰＡＴおよびＹＦＰ ＰＴＵの、Ｔａｑｍａｎ（商標）およびＰＣＲ分析によってさらに確認した。平均形質転換頻度の結果が、表１および表２に示されている。全体で、胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換は、１３．３％（範囲：４．６％〜２０．５％）および２０．３％（範囲：１４．０〜２６．５％）の前例のない形質転換効率をもたらした。これらの形質転換効率結果は、Zeng et al. (2004) Plant Cell Rep 22:478-482の子葉節形質転換法およびPaz et al. (2006) Plant Cell Rep 25:206-213の半種子形質転換法を使用した当技術分野で記載されたダイズ形質転換法について報告されたダイズ形質転換効率よりも相当に高い。

胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換は、Zeng et al. (2004)のダイズ子葉節形質転換法と比較して、形質転換頻度の約３．７倍の増大をもたらした。これまでの文献の報告は、Zeng et al. (2004)のダイズ子葉節形質転換法が５．９％ほどの高い形質転換効率レベルに達したことを示した。しかし、胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換の結果は、文献内でこれまでに報告されたダイズ子葉節形質転換法形質転換効率よりもさらに予想外に効率的である。

同様に、胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換は、Paz et al. (2006)の半種子形質転換法と比較して、形質転換頻度の約１４倍の増大をもたらした。これまでの文献の報告は、Paz et al. (2006)の半種子形質転換法は、３．８％の全体的な形質転換効率をもたらしたことを示した。しかし、胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法の新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換の結果は、文献内でこれまでに報告されたダイズ半種子形質転換法形質転換効率よりもさらに予想外に効率的である。

胚軸の一部を有する割れダイズ種子のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換によって生成されたトランスジェニック事象の遺伝性の決定
ＹＦＰおよびＰＡＴ導入遺伝子のコピーを含有すると確認されたＴ０ダイズ植物を、自家受粉させ、合計２４７のトランスジェニック事象から得られたＴ１種子を、遺伝率についてさらにスクリーニングした。トランスジェニックＴ１ダイズ種子を、温室に植え、成長させた。発達のＶ１〜Ｖ２段階（１〜２本の三出葉をつけて植え付けたおよそ１０〜１４日後）で、植物にグルホシネート（Ｌｉｂｅｒｔｙ（登録商標）（４１０ｇ ａｅ／ｈａＬ；Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ）の１．０％ ｖ／ｖ溶液を噴霧した。さらに、Ｔａｑｍａｎ（商標）およびＰＣＲアッセイを使用するＰＡＴおよびＹＦＰ植物転写単位両方の分子的分析を、Ｔ１ダイズ植物で完了した。合計１１６の事象（４７％）が、グルホシネート除草剤耐性ならびにｐａｔおよびｙｆｐ導入遺伝子の存在から決定されたＴ１世代で、トランスジェニックであると確認された（表３）。ダイズ事象の残りのものは、Ｔ０からＴ１世代へｐａｔおよびｙｆｐ導入遺伝子を伝えなかった。これらのＴ１ダイズ植物が導入遺伝子を遺伝（inherent）できないことは、非生殖系列ダイズ組織中に形質転換されたｐａｔおよびｙｆｐ導入遺伝子を含んでなるＴ０ダイズ事象の生成の結果である。導入遺伝子の非生殖系列ダイズ組織への組み込みは、当技術分野で公知のその他のダイズ形質転換法について一般的に記載されてきたよくある技術的問題であり、胚軸の一部を含む割れダイズ種子形質転換法のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換に特有のものではない。

胚軸の一部を含む割れ種子外植片および選択物質としてグリホサートを使用するダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換
グリホサート耐性形質を発現する導入遺伝子の形質転換および選択に、上記のダイズ形質転換プロトコール（実施例２を参照のこと）を利用した。ＤＧＴ−２８遺伝子（国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１６７００）を、選択および除草剤耐性形質として遺伝子発現カセットに組み込み、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子外植片の形質転換に使用した。

最初に、用量反応研究を完了した。外植片に対するグリホサートの効果を調べるために、グリホサートを、シュート開始段階以降に使用される培地に添加した。グリホサートは、０．０２５〜０．２ｍＭの範囲で調べた。この濃度範囲内での組織培養培地へのグリホサートの組み込みは、ダイズ（Clemente et al, 2000; Hinchee et al, 1996; Martinell et al, 2006; Martinell et al, 1999; Martinell et al, 2002）、タバコ（Singer et al, 1985）、ワタ（Zhao et al, 2006）およびコムギ（Hu et al, 2003）において報告されている。形質転換されていないダイズ外植片の培養について５種の濃度のグリホサートを調べた。ＳＩ−２培地へ組み込まれた濃度は、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０７５ｍＭ、０．１ｍＭおよび０．２ｍＭとした。形質転換されていないダイズ外植片を、ＳＩ−２培地から組織培養プロトコールの完了まで、継代培養のすべての連続段階の間、同じ割合のグリホサート選択で維持した。各継代培養段階で、健常な外植片の数を計数した。死滅した外植片を廃棄し、健常な外植片を適当な培地にさらに継代培養した。

種々のグリホサート濃度を含有するＳＩ−２培地での培養の最後に（例えば、約２週間の時間）、外植片は子葉の黄変を示した。黄色性の程度は、培地に適用されたグリホサートの用量に正比例していた。外植片の成長もまた、グリホサート含有培地で遅延された。次いで、子葉を除去し、外植片をＳＩ−２からＳＥ培地へ継代培養した。ＳＥ培地でのさらに２週間の選択の最後に、外植片が異なるレベルのグリホサートに曝露された場合に、外植片の成長の有意差が観察された。外植片の遅延された成長は、グリホサートの用量の増大に比例していた。同様に、死滅した外植片の数も、グリホサートの用量の増大に比例していた。死滅した外植片の数は、グリホサートの用量が増大するにつれ増大した。この研究で利用された最高用量（例えば、０．２ｍＭ）で、ＳＥ−１の最後に１つの外植片のみが生き残った。比較上、グリホサートを含有しない対照培地では、ほとんどすべての外植片が生存していた。ＳＥ−１の最後までは、試験されたグリホサートのすべてのレベルで、いくつかの外植片が生き残ることができたが、選択で６週間後であるＳＥ−２の最後には、外植片のすべてが死滅した（表４）。これらの結果は、組織培養培地において試験された最低用量のグリホサート（例えば、０．０２５ｍＭ）でさえ、ダイズ外植片のうち、６週間のグリホサート選択後に生き残ることができたものはなかったことを示す。その後、グリホサートの３種の異なる濃度（例えば、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．１ｍＭ）を、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子外植片のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換の選択スキーム中に組み込んだ。

ｐＤＡＢ１０７５５３と名付けられた単一のバイナリーベクター（図８）を、当技術分野で承認された手順を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０７５５３は、２種の植物転写単位（ＰＴＵ）を含有する。第１のＰＴＵ（配列番号３）は、クロロフィルトランジットペプチド、ＴｒａＰ２３（Ｔｒａｐ２３；国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１６７６４）を含有し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ；Gelvin et al., 1987）によって終結されるｄｇｔ−２８コード配列（ＤＧＴ−２８；Ｓｈａｇｉｎ国際特許公開番号ＷＯ２０１３１１６７００）を駆動するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン−１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis et al., 1990）からなる。第２のＰＴＵ（配列番号４）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＰＡＴ；Wohlleben et al., 1988）を駆動するために使用されるキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al., 1996）からなり、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）オープンリーディングフレーム−１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ；Huang et al., 1990）によって終結される。得られたバイナリーベクターは、除草剤耐性選択マーカー／抵抗性遺伝子および抗生物質選択マーカー遺伝子を含有しており、続いて、ダイズの形質転換のために使用された。

バイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０７５５３を、エレクトロポレーションを使用してＥＨＡ１０５のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株中に動員した（Hood et al., 1986）。抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地で成長する個々のコロニーを同定した。単一コロニーを単離し、ｐＤＡＢ１０７５５３バイナリーベクターの存在を制限酵素消化によって確認した。

実施例２に記載された、新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法を使用して、成熟ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））栽培品種マーベリック（Maverick）種子を、ｐＤＡＢ１０７５５３を保有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株で形質転換した。３種の異なる濃度のグリホサート（例えば、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．１ｍＭ）を、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法の選択スキーム中に組み込んだ。

種々の継代培養段階を通して形質転換実験が進むにつれ、ダイズ外植片の健康は、悪化した。最高レベルのグリホサート（例えば、０．１ｍＭ）で最大の有害な生理学的作用が観察され、グリホサートの濃度の低下につれて有害な生理学的作用は低減した。第１の選択サイクル（すなわち、ＳＩ−２培地で２週間）後、グリホサート選択でのダイズ外植片培養について子葉の黄変が気づかれた。子葉黄変の強度は、より多い割合のグリホサートで培養されたダイズ外植片においてより顕著であった（図９）。

ダイズ外植片が、グリホサートを含有する培地で維持される間、外植片が、培地と直接接触している植物組織の表面で軟化を示していることが観察された。外植片の表面は、一貫して柔らかく、クリーム状となった。軟化効果は、ＳＥ−１段階の最後以降で極めて顕著であった。したがって、外植片をグリホサート選択物質を含有しない培地に移した。複製１および複製２外植片の半分を、ＳＥ−１段階の最後にグリホサート選択物質を全く含有しない培地に移した。続いて、ＳＥ−２の最後に、外植片のすべてを、グリホサート選択を全く含有しない培地に移動した（表５）。複製１および複製２では軟化が極めて顕著であったので、複製３外植片の半分を、ＳＩ−２段階の最後にグリホサート選択物質を全く含有しない培地に移した。段階ＳＥ−１の最後までに、複製３外植片のすべてを、グリホサート選択物質を全く含有しない培地に移した。

３種の複製すべてについて、外植片の軟化効果は、外植片がグリホサートを含有しない培地に移されたときに終わらず、外植片軟化は、継代培養のすべてのその後の段階で続いた。これらの結果は、ひとたび外植片がグリホサートに曝露されると、曝露が、組織の軟化を開始し、これは、外植片が後にグリホサート不含培地に移動される場合であっても持続することを示す。

すべての生き残ったシュートに由来する試料を、外植片から単離し、それらがトランスジェニックであるかどうかを確認するために分子的分析のために送った。シュート中の導入遺伝子の有無を確認した後、トランスジェニックダイズ事象を、発根培地に移動し、続いて、順化のためおよび土壌でのさらなる成長のために温室に送った。

表６に示されるように、組織培養培地内のグリホサートの各特定の処置は、トランスジェニックシュートの生成をもたらした。グリホサートに曝露された外植片での軟化効果の存在にもかかわらず、グリホサートの試験された濃度のすべてについてトランスジェニックシュートが生成された。さらに、シュートを発根培地に移動し、シュートのうち多数が、発根に成功した。全体に、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換は、５．３％〜３．９％の形質転換効率をもたらした。しかし、トランスジェニック植物の幾分かの喪失があり、それらは、根を生成しなかった。さらに、トランスジェニック植物が温室において生き残らなかった場合に形質転換頻度は低下した。そのようなものとして、温室で生き残り、結実することができた、発根したトランスジェニック植物について、０．６３％の形質転換頻度（例えば、８個のトランスジェニック植物をもたらす）が得られた。これらの実験から、選択物質としてグリホサートを組み込んだ、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法を使用してトランスジェニックダイズ植物を生産した。

胚軸の一部を含む割れ種子の外植片および選択物質としてハイグロマイシンを使用するダイズのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換
ハイグロマイシン耐性を付与する導入遺伝子の形質転換および選択に、上記のダイズ形質転換プロトコール（実施例２を参照のこと）を利用した。ｈｐｔ遺伝子（Gritz, L. and Davies, J. (1983) Gene 25 (2-3); 179-188）を、選択マーカーとして遺伝子発現カセット中に組み込み、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換に使用した。

最初に、用量反応研究を完了した。外植片に対するハイグロマイシンの効果を調べるために、ハイグロマイシンを、シュート開始段階以降に使用される培地に添加した。ハイグロマイシンは、ダイズ（Glycine max）栽培品種ジャック（Jack）およびダイズ（Glycine max）栽培品種マーベリック（Maverick）植物で５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲で調べた。２種の異なる供給業者、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＰｈｙｔｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）から５種の濃度のハイグロマイシンを入手し、形質転換されていないダイズ外植片の培養について試験した。ＳＩ−２培地中に組み込まれた濃度を、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌおよび２５ｍｇ／Ｌとした。形質転換されていないダイズ外植片を、ＳＩ−２培地から組織培養プロトコールの完了まで、継代培養のすべての連続段階の間、同じ割合のハイグロマイシン選択で維持した。各継代培養段階で、健常な外植片の数を計数した。死滅した外植片を廃棄し、健常な外植片を適当な培地にさらに継代培養した。

外植片が異なるレベルのハイグロマイシンに曝露された場合に、ハイグロマイシンを含有する培地での培養の最後に、外植片の成長において有意差が観察された（表７）。外植片の遅延された成長は、ハイグロマイシンの用量の増大に比例していた。同様に、死滅した外植片の数もハイグロマイシンの用量の増大に比例していた。死滅した外植片の数は、ハイグロマイシンの用量が増大するにつれ増大した。この研究で利用された高い用量（１０ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ）では、少数の外植片のみが生き残った。同様に、５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含有する培地では、多数の外植片が生き残ることができた。比較上、ハイグロマイシンを含有しない対照培地では、ほとんどすべての外植片が生存していた。ＳＥ−１の最後までは、試験されたハイグロマイシンのすべてのレベルで多数の外植片が生き残ることができたが、１０ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの濃度のハイグロマイシンを含有する培地で培養された外植片については、ＳＥ−２の最後には外植片のほとんどが死滅した。これらの結果は、試験された５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンの用量は、組織培養培地において使用するために許容されることを示す。

ｐＤＡＢ１０５９５８と名付けられた単一のバイナリーベクター（図１０）を、当技術分野で承認された手順を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０５９５８は、２種の植物転写単位（ＰＴＵ）を含有する。第１のＰＴＵ（配列番号５）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）オープンリーディングフレーム−２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ；Gelvin et al., 1987）によって終結される、ｈｐｔコード配列（ＨＰＴ；Gritz and Davies, 1983）を駆動するキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al., 1996）からなる。第２のＰＴＵ（配列番号６）は、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）オープンリーディングフレーム−１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ；Huang et al., 1990）によって終結される、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード配列（ＰＡＴ；Wohlleben et al., 1988）を駆動するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン−１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis et al., 1990）からなる。得られたバイナリーベクターは、除草剤耐性選択マーカー／抵抗性遺伝子および抗生物質選択マーカー遺伝子を含有しており、続いて、ダイズの形質転換のために使用された。

バイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０５９５８を、エレクトロポレーションを使用して、ＥＨＡ１０５のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株（Hood et al., 1986）中に動員した。抗生物質スペクチノマイシンを含有するＹＥＰ培地で成長する個々のコロニーを同定した。単一コロニーを単離し、ｐＤＡＢ１０５９５８バイナリーベクターの存在を制限酵素消化によって確認した。

実施例２に記載される、新規アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法を使用して、成熟ダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））栽培品種マーベリック（Maverick）種子を、ｐＤＡＢ１０５９５８を保有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株で形質転換した。３種の異なる濃度のハイグロマイシン（例えば、８ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌおよび３ｍｇ／Ｌ）を、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法の選択スキーム中に組み込んだ。

ダイズ外植片が、ハイグロマイシンを含有する培地で維持される間、外植片が、培地と直接接触している植物組織の表面で軟化を示していることが観察された。したがって、培養のＳＥ−３段階で外植片をハイグロマイシン選択物質を含有しない培地に移した（表８）。

生き残っているシュートのすべてに由来する試料を外植片から単離し、それらがトランスジェニックであるかどうかを確認するために分子的分析のために送った。シュート中の導入遺伝子の有無を確認した後、トランスジェニックダイズ事象を、発根培地に移動し、続いて、順化のためおよび土壌でのさらなる成長のために温室に送った。表９に示されるように、組織培養培地内のハイグロマイシンの処置の半分が、トランスジェニックシュートの生成をもたらした。ハイグロマイシンに曝露された外植片での軟化効果の存在にもかかわらず、ハイグロマイシン選択物質を含有する培地でトランスジェニックシュートが生成された。これらの実験から、選択物質としてハイグロマイシンを組み込んだ、胚軸の一部を含むダイズの割れ種子の形質転換法を使用して、トランスジェニックダイズシュートが生成された。

本発明を詳細に記載してきたが、このような詳細は単に、例示目的を意図するのであって、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によってここで変法が行われ得るということが理解される。

Claims (24)

1. トランスジェニック事象を生成する方法であって、
   切断ツールをダイズ種子の種皮中に挿入して、第１の子葉切片および第２の子葉切片を形成し、ここで、種子が胚軸を含むことと、
   胚軸の一部を含む第１の子葉切片に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、
   接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することと
   を含む、方法。
2. 第１の子葉切片および第２の子葉切片から種皮を除去し、その後、第１の子葉切片に接種することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 切断ツールを挿入することが、胚軸を、胚軸の一部を各子葉切片とともに保持するよう長手方向に切断することを含む、請求項１に記載の方法。
4. ダイズ種子ツールの胚軸が、切断ツールを挿入する前に未切断の長さを有し、第１の子葉切片の胚軸の一部が、ダイズ種子の胚軸の未切断の長さの約１／３〜１／２である長さを有する、請求項３に記載の方法。
5. 第１の子葉切片の胚軸の一部を、ダイズ種子の胚軸の未切断の長さの約１／３〜１／２である長さに切断することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. ダイズ種子の胚軸が、切断ツールを挿入する前に未切断の長さを有し、第１の子葉切片の胚軸の一部が、未切断の長さに等しい長さを有する、請求項３に記載の方法。
7. 切断ツールを挿入することが、ダイズ種子を、ダイズ種子のへそに沿って長手方向に切断することを含む、請求項１に記載の方法。
8. へそをダイズ種子の外表面で位置決定し、切断ツールをへそと並べるよう、切断ツールをダイズ種子に対して方向づけし、その後、切断ツールを挿入することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 各子葉切片が、へその一部を含む、請求項８に記載の方法。
10. ダイズ種子が、へそを通って伸びる長手方向軸を有し、長手方向軸が、ダイズ種子を、第１の側および第２の側に分け、ダイズ種子の第１の側を把握し、その後、切断ツールを挿入することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
11. 切断ツールを挿入することが、切断ツールをダイズ種子の胚軸中に進行させ、その後、第１および第２の子葉切片を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
12. 培養された接種された子葉切片から、トランスジェニック事象を含む稔性ダイズ全植物を生産することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 請求項１２に記載の方法によって生産された稔性ダイズ全植物であって、稔性ダイズ全植物のトランスジェニック事象がトランスジェニック事象を含む、稔性ダイズ全植物。
14. 稔性ダイズ全植物の後代を生産することをさらに含み、ここで、後代植物が、トランスジェニック事象を含み、任意選択で、後代植物からダイズ種子を生成することを含む、請求項１２に記載の方法。
15. トランスジェニック事象を含む、請求項１４に記載の方法によって生産された後代植物。
16. 後代植物から生成され、トランスジェニック事象を含む、請求項１４に記載の方法によって生成されるダイズ種子。
17. 後代植物を生産することをさらに含み、
    （ａ）稔性ダイズ全植物を、別のダイズ植物と交雑するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の交雑から得た、トランスジェニック事象を含む後代種子を収穫するステップと、
    （ｃ）後代種子を植えるステップと、
    （ｄ）後代種子から、トランスジェニック事象を含む後代植物を栽培するステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）において栽培された後代植物から、トランスジェニック事象を含むその後の後代植物を生産するステップと
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
18. 導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、窒素利用効率遺伝子、水利用効率遺伝子、栄養価遺伝子、ＤＮＡ結合遺伝子および選択マーカー遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
19. トランスジェニック事象を生成する方法であって、
    切断ツールを種子の種皮中に挿入して、胚軸の一部を含む子葉切片を形成することと、
    胚軸の一部を含む子葉切片に、少なくとも１種の導入遺伝子を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を接種することと、
    接種された子葉切片を培養して、形質転換された植物細胞においてトランスジェニック事象を生成することと、
    培養された、接種された子葉切片から、トランスジェニック事象を含む稔性全植物を生産することと、
    を含む、方法。
20. 種子が、双子葉類種子である、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１９に記載の稔性全植物の、トランスジェニック事象を含む後代植物。
22. 請求項２１に記載の後代植物から生成された、トランスジェニック事象を含む種子。
23. 切断ツールを種子の種皮中に挿入することが、第１の子葉切片および第２の子葉切片を形成し、各子葉切片が、胚軸の一部を含む、請求項１９に記載の方法。
24. 導入遺伝子が、ｐａｔ、ｄｇｔ−２８またはｈｐｔ選択マーカー遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。