CN103484481B - 改良的grg23 epsp合酶：组合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子除草剂抗性或耐性的组合物和方法。组合物包括编码除草剂抗性或耐性多肽的多核苷酸、包含那些多核苷酸的载体以及包含所述载体的宿主细胞。本发明的核苷酸序列可以在DNA构建物或表达盒中使用，用于在生物体——包括微生物和植物——中转化和表达。组合物也包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，提供了编码草甘膦抗性或耐性多肽的分离的多核苷酸。此外，也包括与多核苷酸对应的氨基酸序列。尤其是，本发明提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35中示出的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列。

Description

改良的GRG23 EPSP合酶：组合物和使用方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年11月20日，申请号为200780049630.6（PCT/US2007/085164），发明名称为“改良的GRG23EPSP合酶：组合物和使用方法”。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学，特别是涉及新型EPSP合酶多肽，所述合酶多肽赋予增加的对除草剂草甘膦的抗性和耐性。
背景技术
N-膦酰甲基甘氨酸，一般称为草甘膦，是重要的农学化学制品。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸（S3P）转化为5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。这种酶（5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，本文称为“EPSP合酶”或“EPSPS”）的抑制通过关闭莽草酸途径，从而抑制芳香族氨基酸的生物合成来杀死植物细胞。
由于草甘膦类除草剂抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，而且也对细菌细胞具有毒性。草甘膦抑制多种细菌EPSP合酶，因而对这些细菌具有毒性。然而，某些细菌EPSP合酶对草甘膦具有高的耐性。
可以通过转化植物细胞以表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶来产生抗草甘膦毒性的植物细胞。值得注意，来自根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株CP4的细菌基因已经被用于在植物中表达之后赋予植物细胞除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）菌株CT7的突变EPSP合酶赋予细菌细胞草甘膦抗性，并且赋予植物细胞草甘膦抗性（美国专利第4,535,060、4,769,061和5,094,945号）。
美国专利第6,040,497号报道了突变玉米EPSP合酶，其在102位具有苏氨酸到异亮氨酸的置换并且在106位具有脯氨酸到丝氨酸的置换（“TIPS”突变）。这样的改变赋予了玉米酶草甘膦抗性。来自鼠伤 寒沙门氏菌菌株CT7的突变EPSP合酶赋予细菌细胞的草甘膦抗性，并且据报道赋予植物细胞草甘膦抗性（美国专利第4,535,060、4,769,061和5,094,945号）。He等，((2001)Biochim et Biophysica Acta1568:1-6)已经通过在大肠杆菌（E.coli）和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因之间进行诱变和重组而开发了具有增加的草甘膦耐性的EPSP合酶，并且提出在位置42（T42M）和位置230（Q230K）的突变可能是造成观测到的抗性的原因。后续工作（He等，(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67:1405-1409）显示，T42M突变（苏氨酸到甲硫氨酸）足以提高大肠杆菌酶和鼠伤寒沙门氏菌酶两者的耐性。由于除草剂抗性植物提供的许多优势，除草剂抗性基因改善的抗草甘膦活性是期望的。
诱变的可选方法是“变换诱变（permutational mutagenesis）”方法，所述方法在2006年6月13日提交的美国专利申请第60/813,095号中被描述。
发明内容
提供了赋予抗性或耐性的组合物和方法。组合物包括抗草甘膦除草剂的EPSP合酶，以及编码这种酶的核酸分子，包含那些核酸分子的载体和包含这些载体的宿主细胞。组合物包括编码除草剂抗性多肽的核酸分子，其包括编码包含SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的多肽的那些核酸分子，以及SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。编码序列可以在DNA构建物或表达盒中使用，用于在生物体——包括微生物和植物——中转化和表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子，它们通过将本发明的组合物引入到生物体的基因组中而具有草甘膦抗性。在所述生物体是植物时，序列的引入允许含草甘膦的除草剂应用到植物以选择性地杀死对草甘膦敏感的杂草或其它未转化的植物，但是不杀死转化的生物体。该序列可以另外用作标记，用于选择在草甘膦条件下生长的植物细胞。
另外提供了鉴定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括在本发明的结构域存在的基础上鉴定对草甘膦具有抗性的另外的EPSP合酶序列。
附图说明
图1显示GRG23(ace1)(“M5”，SEQ ID NO:10)在37℃0至25小时相比于野生型GRG23(“WTGRG23”，SEQ ID NO:2)的酶促活性。
图2示出了GRG23和几种变体对草甘膦的抗性，表示为抑制常数，或Ki。
图3示出了GRG23和GRG23变体在37℃的半衰期。
具体实施方式
现在本发明将在下文中参考附图更充分地进行描述，其中，本发明的一些但不是全部实施方式被示出。实际上，这些发明可以以许多不同的形式加以体现并且不应该被解释为限于本文提出的实施方式；相反，这些实施方式被提供以使本公开满足可适用的法律要求。在全文中同样的数字是指同样的要素。
本发明相关领域的技术人员在了解了前述描述和相关附图中给出的教导的益处之后将会想到本文提出的发明的许多修改和其它实施方式。因此，应当理解，本发明不限于公开的具体实施方式并且修改和其它实施方式拟被包括在所附权利要求的范围之内。虽然本文使用了具体术语，但它们只以一般性和描述性的意义被使用，并不用于限制的目的。
本发明涉及用于调节生物体、尤其是植物和植物细胞中的除草剂抗性的组合物和方法。所述方法包括用编码本发明的抗草甘膦基因的核苷酸序列转化生物体。本发明的核苷酸序列可用于制备对除草剂草甘膦显示出增加的抗性的植物。因而，本发明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”基因意指SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中列出的核苷酸序列及其片段和变体，所述片段和变体编码草甘膦抗性或耐性多肽。同样，本发明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐性”多肽是具有SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35列出的氨基酸序列的多肽及其片段和变体，所述片段和变体赋予宿主细胞草甘膦抗性或耐性。
A.分离的多核苷酸及其变体和片段
在一些实施方式中，本发明包括分离的、重组的或纯化的多核苷酸。“分离的”“或“纯化的”多核苷酸或多肽、或其生物学活性部分在通过重组技术产生时基本上不含其它的细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学制品。“生物学活性的”意指具有天然多肽的所需生物学活性，也就是说，保持抗除草剂活性。“分离的”多核苷酸可以不含这样的序列（例如，蛋白质编码序列），所述序列天然地位于生物体的基因组DNA中的核酸侧翼（即，位于所述核酸的5'和3'端的序列），所述多核苷酸来源于所述生物体。对于本发明的目的，“分离的”当用于指多核苷酸时不包括分离的染色体。例如，在各种实施方式中，分离的草甘膦抗性编码多核苷酸可以包含小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其天然地位于细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼，所述多核苷酸来源于所述细胞。
本发明的多核苷酸包括编码包含SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的草甘膦抗性多肽的那些多核苷酸，以及SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的多核苷酸序列。
“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸的任何除草剂形式（包括其任何盐）和导致草甘膦阴离子在植物中(in planta)产生的其它形式。“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”的表达产生的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞比不表达所述蛋白质的细胞耐受更高浓度的除草剂的能力，或赋予比不表达所述蛋白质的细胞耐受某一浓度的除草剂更长时间的能力。“草甘膦抗性蛋白”包括这样的蛋白质，其赋予细胞比不表达所述蛋白质的细胞耐受更高浓度的草甘膦的能力，或者比不表达所述蛋白质的细胞耐受某一浓度的草甘膦更长一段时间的能力。“耐受”或“耐性”意指存活或以不容易与未处理细胞区别的方式进行基本的细胞功能，例如蛋白质合成和呼吸。
本发明进一步考虑本文描述的多核苷酸的变体和片段。多核苷酸的“片段”可以编码多肽的生物学活性部分，或其可以是采用本文其它地方公开的方法可用作杂交探针或PCR引物的片段。取决于意图的用途，多核苷酸——其是多核苷酸的片段——包括至少大约15、20、50、 75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950个连续核苷酸，或可达存在于本文公开的全长多核苷酸的核苷酸数（例如包含SEQ ID NO:1的EPSP合酶多核苷酸）。“连续”核苷酸意指彼此紧邻的核苷酸残基。
本发明的多核苷酸片段一般将编码保持全长草甘膦抗性蛋白的生物学活性——即抗除草剂活性——的多肽片段。“保持抗除草剂活性”意指所述片段将具有本文公开的如SEQ ID NO:2、3或5的全长草甘膦抗性蛋白的至少大约30%，至少大约50%、至少大约70%、至少大约80%、85%、90%、95%、100%、110%、125%、150%、175%、200%、250%、至少大约300%或以上的抗除草剂活性。测量抗除草剂活性的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，美国专利第4,535,060和5,188,642号，其每一个通过引用以其全部并入本文。
编码本发明多肽的生物学活性部分的多核苷酸片段将编码至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400个连续氨基酸，或可达存在于本发明的全长多肽中的氨基酸的总数。
本发明也包括变体多核苷酸。多核苷酸的“变体”包括编码本文公开的多肽但由于遗传密码的简并性而保守地不同的那些序列，以及足够相同的那些序列。
术语“足够相同的”意指采用标准参数，应用比对程序之一，与参考序列相比具有至少大约60%或65%的序列同一性、大约70%或75%的序列同一性、大约80%或85%的序列同一性、大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽或多核苷酸序列。本领域普通技术人员将会认识到这些值可以适当调整以通过考虑密码简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个多核苷酸编码的多肽的对应同一性。
细菌基因很经常具有多个靠近开放阅读框起点的甲硫氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌如芽 孢杆菌（Bacillus sp.）也识别密码子GTG作为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质包含在第一个氨基酸处的甲硫氨酸。而且，经常不能先验确定这些密码子中的哪个在细菌中天然使用。因而，应理解的是，可选的甲硫氨酸密码子之一的使用可导致赋予除草剂抗性的变体产生。这些除草剂抗性蛋白被包括在本发明中并且可以在本发明的方法中使用。
可以应用熟知的分子生物学技术，如下面概述的聚合酶链式反应（PCR）和杂交技术，鉴定天然发生的等位基因变体。变体多核苷酸也包括合成来源的多核苷酸，其通过例如采用定点诱变或其它诱变策略产生，但是仍然编码具有期望的生物学活性的多肽。
技术人员将进一步理解，可以通过进一步突变本发明的多核苷酸从而导致所编码的多肽的氨基酸序列的进一步改变但不改变所述多肽的生物学活性来引入改变。因而，分离的变体多核苷酸可以通过引入一个或多个额外的核苷酸置换、添加或缺失到编码本文公开的EPSP合酶结构域的相应多核苷酸中而产生，以使一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被引入到所编码的多肽中。进一步的突变可以通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变或基因改组（gene shuffling）技术引入。这种变体多核苷酸也被本发明包括。
变体多核苷酸可以通过沿着全部或部分编码序列随机引入突变，如通过饱和突变来制备，并且可以筛选得到的突变体赋予抗除草剂活性的能力，以鉴定保持活性的突变体。
基因改组或有性PCR（sexual PCR）法（例如，Smith(1994)Nature370:324-325；美国专利第5,837,458、5,830,721、5,811,238和5,733,731号，其每一篇通过引用被并入本文）可以被用于进一步修饰或增强具有本发明的EPSP合酶结构域的多核苷酸和多肽（例如，赋予草甘膦抗性的多肽）。基因改组包括几种突变DNA的随机断裂，然后通过PCR将它们重装配成全长分子。各种基因改组法的例子包括但不限于，DNase处理后的装配、交错延伸法（staggered extension process,STEP）和体外随机引发重组（random priming in vitrorecombination）。在DNase介导的方法中，用DNaseI将从阳性突变体库分离的DNA区段切割成随机片段并且在未添加引物的情况下进行多轮PCR。当PCR循环进行 时，随机片段的长度接近未切割的区段的长度，导致在不同的克隆中的突变混合在一起并且在一些得到的序列中累积。多个循环的选择和改组已经导致几种酶的功能增强（Stemmer(1994)Nature370:389-391；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Crameri等，(1996)Nat.Biotechnol.14:315-319；Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；和Crameri等，(1997)Nat.Biotechnol.15:436-438）。可以例如对编码具有本发明的序列结构域的多肽的多核苷酸进行这类方法，以产生赋予草甘膦抗性的多肽。
应用方法如PCR、杂交等，相应除草剂抗性序列可以通过寻找本发明的EPSP合酶结构域来鉴定。见，例如，Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)和Innis等，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)。
B.分离的蛋白质及其变体和片段
除草剂抗性多肽也被包括在本发明之内。基本上不含细胞材料（cellularmaterial）的除草剂抗性多肽包括具有小于大约30%、20%、10%或5%（按干重计）的非除草剂抗性多肽（本文也称为“污染蛋白质”）的多肽制剂。在本发明中，“除草剂抗性蛋白”意指具有本发明的序列结构域的EPSP合酶多肽。片段、生物活性部分、及其变体也被提供，并且可以被用于实践本发明的方法。
“片段”或“生物活性部分”包括多肽片段，其含有编码除草剂抗性蛋白的氨基酸序列的一部分并保持抗除草剂活性。除草剂抗性蛋白的生物学活性部分可以是多肽，所述多肽的长度为例如10、25、50、100个或更多的氨基酸。这种生物学活性部分可以通过重组技术制备并且可以评价抗除草剂活性。
“变体”意指具有这样的氨基酸序列的蛋白质或多肽，所述氨基酸序列与具有本发明的EPSP合酶结构域的EPSP合酶多肽具有至少大约60%、65%、大约70%、75%、大约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。本领域普通技术人员将会意识到这些值可以被适当调整以通过考虑密码子简并性、 氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个多核苷酸编码的多肽的对应同一性。
例如，可以在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需的”氨基酸残基是可以在多肽的野生型序列中加以改变而不改变生物学活性的残基，而“必需的”氨基酸残基对于生物学活性是必需的。“保守氨基酸置换”是这样的置换，其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经被定义。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、无荷电极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-支化侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。氨基酸置换可以在保持功能的非保守区进行。一般而言，将不会对保守的氨基酸残基或对位于保守基序中的氨基酸残基——其中这类残基对于多肽活性是必需的——进行这样的置换。然而，本领域普通技术人员将会理解，功能变体可以在保守残基中具有不重要的保守或非保守改变。
本发明的多肽或其变体或片段的抗体也被包括。产生抗体的方法在本领域是熟知的（参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;美国专利第4,196,265号）。
C.多核苷酸构建物
编码本发明的EPSP合酶多肽的多核苷酸可以被修饰以获得或增强在植物细胞中的表达。编码本文鉴定的多肽的多核苷酸可以被提供于表达盒中，所述表达盒用于在目标植物中表达。“植物表达盒”包括DNA构建物——包括重组DNA构建物，其能够导致多核苷酸在植物细胞中的表达。所述盒可以包括以5'-3'的转录方向、可操作地连接到一个或多个感兴趣多核苷酸的转录起始区（即，启动子，特别是异源启动子）、和/或植物中发挥功能的翻译和转录终止区（即，终止区）。 所述盒可以额外包含至少一个将被引入到生物体的额外多核苷酸，如选择性标记基因。可选地，额外的多核苷酸（一个或多个）可以被提供在多个表达盒上。这种表达盒被提供有多个限制性位点，用于插入所述多核苷酸（一个或多个），使之受调节区的转录调节。
“异源的”一般是指这样的多核苷酸或多肽，其对于细胞而言不是内源的或对于它存在的天然基因组中的位置而言不是内源的，并且其通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微投影等被加入到细胞中。“可操作地连接”意指两个多核苷酸之间的功能连接。例如，当启动子可操作地连接到DNA序列时，该启动子序列起始并且调节所述DNA序列的转录。已经认识到，可操作地连接的多核苷酸可以相邻或可以不相邻，并且在用于指两个多肽编码区的接合时，所述多肽在同一阅读框中表达。
启动子可以是在选择的植物细胞、植物部分或植物中显示出转录活性的任何多核苷酸序列。启动子对于植物宿主和/或对于本发明的DNA序列可以是天然的或类似的，或者外源的或异源的。在启动子对于植物宿主是“内源的”或“类似的”时，意指该启动子在其被引入的天然植物中被找到。当启动子对于本发明的DNA序列是“外源的”或“异源的”时，意指该启动子对于本发明的可操作连接的DNA序列而言不是天然的或天然发生的启动子。启动子可以是诱导型或组成型。它可以是天然发生的，可以由各种天然发生的启动子部分组成，或可以是部分或全部合成的。启动子设计指导由启动子结构的研究提供，如Harley和Reynolds(1987)Nucleic Acids Res.15:2343-2361中的指导。同样，启动子相对于转录起始的位置可以被优化。见，例如，Roberts等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:760-764。许多用于植物的合适启动子在本领域中是熟知的。
例如，适合用于植物的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒组（peanut chlorotic streak caulimovirus(PClSV)）启动子（美国专利第5,850,019号）；来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子（Odell等，(1985)Nature313:810-812）；小球藻病毒甲基转移酶基因启动子（美国专利第5,563,328号）和来自玄参花叶病毒（FMV）的全长转录启动子（美国 专利第5,378,619号）；来自基因如水稻肌动蛋白（McElroy等，(1990)Plant Cell2:163-171）、泛素（Christensen等，(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等,(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689）、pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS(Velten等，(1984)EMBO J.3:2723-2730)、玉米H3组蛋白(Lepetit等，(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285和Atanassova等，(1992)Plant J.2(3):291-300)、油菜(Brassica napus)ALS3(PCT申请WO97/41228)的启动子；以及各种农杆菌属(Agrobacterium)基因的启动子（见，美国专利第4,771,002、5,102,796、5,182,200和5,428,147号）。
适合用于植物的诱导型启动子包括：来自对铜作出反应的ACE1系统的启动子（Mett等，(1993)PNAS90:4567-4571）；对苯磺酰胺除草剂安全剂作出反应的玉米In2基因的启动子（Hershey等，(1991)Mol.Gen.Genetics227:229-237和Gatz等，(1994)Mol.Gen.Genetics243:32-38）；和来自Tn10的Tet阻抑子的启动子（Gatz等，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237）。另外的用于植物的诱导型启动子是对诱导剂作出反应的启动子，植物通常对所述诱导剂不作出反应。这种类型的示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质类固醇激素诱导（Schena等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421）或通过嵌合转录激活剂XVE的最近应用来诱导，用于通过雌二醇活化的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统（Zuo等，(2000)Plant J.,24:265-273）。其它的用于植物的诱导型启动子在EP332104、PCT WO93/21334和PCT WO97/06269中被描述，其通过引用以其全部并入本文。也可以使用由其它启动子部分组成的启动子以及部分或全部合成的启动子。见，例如，Ni等，(1995)Plant J.7:661-676和PCT WO95/14098，它们描述了用于植物的这类启动子。
启动子可以包括，或被修饰以包括，一个或多个增强子元件。在一些实施方式中，启动子可以包括多个增强子元件。与不包含增强子元件的启动子相比，包含增强子元件的启动子提供了更高水平的转录。用于植物的合适增强子元件包括PClSV增强子元件（美国专利第5,850,019号）、CaMV35S增强子元件（美国专利第5,106,739和5,164,316号）和FMV增强子元件（Maiti等，(1997)Transgenic Res. 6:143-156）。也参见PCT WO96/23898。
通常，这种构建物可包含5'和3'非翻译区。这种构建物可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进感兴趣肽的共翻译或翻译后转运到某些细胞内结构如叶绿体（或其它质体）、内质网或高尔基体，或被分泌。例如，构建物可以被设计为包含信号肽来促进肽至内质网的转移。“信号序列”意指已知或疑似导致共翻译或翻译后肽运输穿过细胞膜的序列。在真核细胞中，这典型地包括分泌到高尔基体，带有一些因而发生的糖基化。“前导序列”意指当翻译时，导致足以引起肽链共翻译运输到亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因而，这包括通过进入内质网，到达液泡、包括叶绿体、线粒体等在内的质体而靶向运输和/或糖基化的前导序列。也可以优选的是，设计包含内含子的植物表达盒，以使内含子的mRNA加工对于表达是必需的。
“3'非翻译区”意指位于编码序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信号序列和编码调控信号的其它序列是3'非翻译区，所述调控信号能够影响聚腺苷酸束(polyadenylic acidtract)添加到mRNA前体的3'端。“5'非翻译区”意指位于编码序列上游的多核苷酸。
其它的上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是用于增加启动子区表达的多核苷酸。增强子在本领域是熟知的，且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。
终止区可以是对转录起始区天然的，可以是对本发明的序列天然的，或可以源自另一来源。合适的终止区可从根癌农杆菌（A.tumefaciens）的Ti-质粒得到，如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合成酶终止区。也参见Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell2:1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene91:151-158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
在本发明的一个方面，合成的DNA序列被设计用于给定的多肽，如本发明的多肽。细胞中合成DNA序列的开放阅读框的表达导致本发明的多肽的产生。合成DNA序列可以用于简单地除去不必要的限制性内切核酸酶位点，以促进DNA克隆策略，改变或除去任何潜在的密码 子偏倚，改变或提高GC含量，除去或改变另起读框，和/或改变或除去内含子/外显子剪接识别位点、多腺苷酸化位点、SD序列、不必要的启动子元件和可能存在于天然DNA序列中的类似物。也可能的是，合成DNA序列可以被用于将其它改良引入DNA序列，如引入内含子序列、产生作为融合到细胞器引导肽的蛋白质表达的DNA序列，所述细胞器引导肽例如叶绿体转运肽、质外体/液泡导向肽、或导致所得到的肽保持在内质网中的肽序列。合成基因也可以使用宿主细胞优选的密码子合成，用于改进表达，或可以使用具有宿主优选的密码子使用频率的密码子进行合成。见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11；美国专利第6,320,100、6,075,185、5,380,831和5,436,391号，美国公布申请第20040005600和20010003849号、以及Murray等，(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，其通过引用并入本文。
在一种实施方式中，感兴趣的多核苷酸被靶向叶绿体来进行表达。在这种方式中，在感兴趣的多核苷酸不直接插入到叶绿体中时，表达盒将额外包含编码指引感兴趣的核苷酸到叶绿体中的转运肽的多核苷酸。这种转运肽在本领域是已知的。见，例如，Von Heijne等人，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；以及Shah等，(1986)Science233:478-481。
靶向叶绿体的感兴趣多核苷酸可以被优化，用于在叶绿体中表达，以说明在植物细胞核和该细胞器之间密码子使用的不同。在这种方式中，可以使用叶绿体优选的密码子合成感兴趣多核苷酸。见，例如，美国专利第5,380,831号，其通过引用并入本文。
这种植物表达盒可以被插入到植物转化载体中。“转化载体”意指允许转化细胞的DNA分子。这样的分子可以由一个或多个表达盒组成，并且可以组织成一个以上的载体DNA分子。例如，二元载体是植物转化载体，其利用两个非邻接DNA载体来编码所有必需的顺式-和反式作用功能，用于转化植物细胞（Hellens和Mullineaux(2000)Trends in PlantScience5:446-451）。“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的多核苷酸构建物。“表达载体”是指具有在外源细胞中掺入、整 合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。
植物转化载体包括一个或多个实现植物转化的DNA载体。例如，本领域内的常见做法是应用包含一个以上邻接DNA区段的植物转化载体。这些载体在本领域内通常称为二元载体。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌属介导的转化，其中实现有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂性是相当大的，并且将单独的功能分开在单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，所述质粒载体包含T-DNA转移必需的顺式作用序列（如左边界和右边界）、被工程化为能够在植物细胞中表达的选择性标记、和“感兴趣的多核苷酸”（被工程化为能够在植物细胞中表达的多核苷酸，转基因植物的产生对于所述植物细胞是期望的）。也在该质粒载体上存在的是细菌复制必需的序列。顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞并且在其中表达的方式排列。例如，选择性标记序列和感兴趣的序列位于左边界和右边界之间。第二质粒载体经常包含介导T-DNA从农杆菌属转移到植物细胞的反式作用因子。该质粒经常包含侵入性功能（Vir基因），其允许植物细胞被农杆菌属感染，以及通过在边界序列切割的DNA转移，和病毒介导的DNA转移，如本领域所理解的（Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science,5:446-451）。几种类型的农杆菌属菌株（例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等）可用于植物转化。第二质粒载体对于通过其它方法如显微投影、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等将多核苷酸引入到植物中不是必需的。
D.植物转化
本发明的方法包括将核苷酸构建物引入到植物中。“引入”意指将核苷酸构建物以该构建物进入到植物细胞内部的方式呈递给植物。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建物引入植物的具体方法，只需要核苷酸构建物进入到植物的至少一个细胞的内部。将核苷酸构建物引入植物中的方法在本领域是已知的，包括但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
一般而言，植物转化法包括将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，未成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随 后应用最大阈值水平的适当选择（取决于选择性标记基因并且在此情况下为“草甘膦”）以从未转化的细胞团中回收转化的植物细胞。外植体被典型地转移到新鲜供给的相同培养基中并且常规培养。之后，转化细胞在放置在补充有最大阈值水平的选择剂（例如，“草甘膦”）的再生培养基上之后分化成茎干。然后，茎干被转移到选择性生根培养基，用于回收生根的茎干或小植株。转基因小植株然后生长成为成熟的植物并且产生能育种子（例如，Hiei等，(1994)The Plant Journal6:271-282；Ishida等，(1996)Nature Biotechnology 14:745-750）。外植体典型地被转移到新鲜供给的相同培养基中并且常规培养。产生转基因植物的技术和方法的一般描述在Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42:107-120中找到。由于转化的材料包含许多细胞；转化的和未转化的细胞都出现在任何一块经受处理的靶愈伤组织或组织或细胞群中。杀死非转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。通常，除去非转化细胞的能力限制了转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生。分子方法和生化方法可以用于确定整合的感兴趣异源基因在转基因植物的基因组中的存在。
转基因植物的产生可以通过几种方法之一进行，包括但不限于，通过农杆菌属将异源DNA引入到植物细胞中（农杆菌属介导的转化），用附到粒子的异源外来DNA轰击植物细胞，和用于转移DNA的各种其它非粒子直接介导法（例如，Hiei等，(1994)The PlantJournal6:271-282；Ishida等，(1996)Nature Biotechnology14:745-750；Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13:219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42:107-120）。
转化叶绿体的方法在本领域内是已知的。见，例如，Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于粒子枪输送含选择性标记的DNA以及通过同源重组将DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码和质体介导的RNA聚合酶的组织优选表达来反式激活沉默的质体携带的转基因来完成。这种系统已经在McBride等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA91:7301-7305中进行了报道。
按照常规方法，已经被转化的细胞可以生长成植物。参见，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后这些植物可以生长并且或者用同一转化株系或不同株系进行授粉，并且得到的杂种具有经过鉴定的期望表型特征的组成型表达。可以生长两代或两代以上以保证期望表型特征的表达被稳定地保持并且遗传，然后收获种子以确保期望表型特征的表达已经获得。以这种方式，本发明提供了转化种子（也称为“转基因种子”），其具有稳定掺入它们的基因组中的本发明的核苷酸构建物，例如，本发明的表达盒。
E.植物转化的评价
在将异源外来DNA引入到植物细胞中以后，异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法如与整合基因有关的核酸、蛋白质和代谢物的分析来证实。
PCR分析是移种到土壤之前筛选早期转化细胞、组织或茎中掺入基因存在的快速方法（Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)）。应用对感兴趣基因或农杆菌属载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实（Sambrook和Russell(2001)，见前）。一般而言，从转化体提取总DNA，用适当的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分离并且转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术（Sambrook和Russell,2001，见前），可以用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测所述膜或“印迹”，以证实被引入的基因在植物基因组中的整合。
在RNA印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序，从转化体的特异组织分离RNA，所述RNA在甲醛琼脂糖凝胶上进行分离，并且印迹到尼龙滤膜上（Sambrook和Russell(2001)，见前）。然后通过本领域内已知的方法（Sambrook和Russell(2001)，见前），使所述滤膜与源自GDC的放射性探针杂交，来检测由本发明的grg序列编码的RNA的表达。
根据标准程序（Sambrook和Russell(2001)，见前），使用与存在于除草剂抗性蛋白上的一个或多个表位结合的抗体，可以对转基因植物进行蛋白质印迹和生化分析等，以确定由除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在。
在本发明的一个方面，本文描述的grg基因可用作标记以评价细菌或植物细胞的转化。
F.植物和植物部分
“植物”意指全植物、植物器官（例如，叶、茎、根等）、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的（例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉）。本发明可以用于将多核苷酸引入任何植物种类中，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的例子包括但不限于，玉米（玉蜀黍）、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜（oilseed rape）、芸苔属某种、紫花苜蓿、裸麦、稷、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果树、澳大利亚坚果、杏树、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括但不限于，番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆和甜瓜属(genus Curcumis)的成员如黄瓜、甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于，杜鹃花、绣球花属、芙蓉属、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛属、石竹属、猩猩木和菊花。农作物植物也是感兴趣的，包括例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等。
本发明适合单子叶植物科的任何成员，包括但不限于，玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、裸麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和海枣。
G.增加植物产量的方法
提供了增加植物产量的方法。所述方法包括将包含本文公开的grg 序列的多核苷酸引入到植物或植物细胞中。如本文所定义的，植物的“产量”是指由植物产生的生物量的质量和/或数量。“生物量”意指任何测量的植物产物。生物量产率的增加是任何所测量的植物产物的产量的提高。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶的生物量可以增加多叶蔬菜的产量，用于人类和动物消费。此外，增加叶生物量可以用于增加植物来源的药品或工业产品的生产。产量的增加可以包括统计学上显著的增加，包括但不限于，至少1%的增加、至少3%的增加、至少5%的增加、至少10%的增加、至少20%的增加、至少30%的增加、至少50%的增加、至少70%的增加、至少100%的增加或更大的增加。
在具体的方法中，用有效浓度的除草剂处理植物，其中所述除草剂应用导致植物产量增加。“有效浓度”意指允许植物产量增加的浓度。感兴趣除草剂的这种有效浓度通常在本领域内是已知的。按照通常的除草剂施用技术，除草剂可以在芽前或芽后被施用到含有农作物的田地中，所述农作物已经通过异源表达本发明的grg基因而获得了除草剂抗性。
也提供了赋予植物或植物部分除草剂抗性的方法。在这种方法中，本文公开的grg多核苷酸被引入到植物中，其中所述多核苷酸的表达导致草甘膦耐性或抗性。通过这种方法产生的植物可以用有效浓度的除草剂处理并且显示出增加的对除草剂的耐性。本申请中除草剂的“有效浓度”是足以使植物或植物部分的生长减缓或停止的量，所述植物或植物部分对除草剂不具有天然抗性或没有获得对除草剂的抗性。
H.在田地中控制杂草的方法
也提供了在含有植物的田地中选择性控制杂草的方法。在一种实施方式中，作为本文公开的grg多核苷酸插入到植物种子或植物的结果，植物种子或植物具有草甘膦抗性。在具体的方法中，植物用有效浓度的除草剂处理，其中所述除草剂施用导致选择性控制杂草或其它未转化的植物。“有效浓度”意指控制杂草或其它未转化植物的生长或蔓延而不显著影响草甘膦抗性植物或植物种子的浓度。感兴趣除草剂的这种有效浓度通常在本领域内是已知的。按照通常的除草剂施用技 术，除草剂可以在芽前或芽后被施用到含有获得除草剂抗性的植物或植物种子的田地中。
I.温度谱
已经进行了几个植物中草甘膦代谢的研究，所述研究显示草甘膦不被植物代谢或代谢得非常缓慢。草甘膦迅速穿透角质层，并且在相当长的一段时间内被转移遍及整个植物（在Kearney和Kaufman,Eds(1988)Herbicides；Chemistry,Degradation & Mode ofAction Marcel Dekker,Inc.,New York,3:1-70以及Grossbard和Atkinson,Eds.(1985)，The Herbicide Glyphosate Butterworths,London,p.25-34中进行综述）。因而，可能的是，在农学上重要的植物中，草甘膦耐性在草甘膦暴露之后的一段持续时间中是必要的。在温度经常在生长季节期间超过30℃的情况下，使用可在升高的温度保持活性的草甘膦耐性EPSP合酶将会是有利的。
在本发明的一个实施方式中，EPSP合酶在比周围环境温度高或低的温度下显示出热稳定性。“热稳定性”意指在比周围环境温度高或低的温度下，所述酶比在该温度下为非热稳定的EPSP合酶在更长的一段时间内具有活性。例如，热稳定EPSP合酶在比周围环境温度高或低的温度下具有酶促活性大于大约1小时、大于大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约20小时、大约25小时或更长。为了本发明的目的，“周围”环境温度为大约30℃。在一些实施方式中，高于周围温度是在或高于大约32℃、大约34℃、大约37℃、大约40℃、大约45℃、大约50℃、大约55℃、大约60℃、大约65℃或更高的温度。低于周围温度是在或低于大约28℃、低于大约27℃、大约26℃、大约25℃、大约23℃、大约20℃、大约18℃、大约15℃、大约10℃，在或低于大约5℃，或在0℃左右。分析EPSP合酶活性的方法在本文其它地方被进一步详细讨论。为了本发明的目的，当热稳定EPSP合酶以在该酶的最适温度观测到的最大活性水平的大约90%至100%、大约80%至大约90%、大约70%至大约80%、大约60%至大约70%或大约 50%至大约60%起作用时，其被认为是有活性的。
因而，本文提供的是在高于周围环境温度的温度下增加草甘膦耐性的方法和组合物。在一种实施方式中，所述方法包括将编码在SEQ ID NO:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦抗性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，并且使所述植物在高于周围环境温度的温度下生长。在具体实施方式中，所述生长温度在所述植物的生长季节期间高于周围温度平均至少大约2小时每天，至少大约3小时每天、至少大约4小时每天、至少大约5小时每天、大约6小时每天、大约7小时每天、大约8小时每天、大约9小时每天、大约10小时每天、大约11小时每天、大约12小时每天、大约14小时每天、大约16小时每天、大约18小时每天、大约20小时每天、至少大约22小时每天，或可达大约24小时一天。
在另一实施方式中，所述方法包括将编码在SEQ ID NO:8、10、14、28、30、32或34中所示的草甘膦耐性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物，使所述植物与除草有效浓度的草甘膦接触，和使所述植物在高于周围环境温度的温度下生长每天至少1小时、至少大约2小时、至少大约3小时、至少大约4小时或以上，在草甘膦施用给植物之后持续至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，其中温度高于周围环境温度的天数发生在所述植物的生长季节期间。
下列实施例作为说明而不是作为限制加以提供。
实验
实施例1.svngrg23设计和表达
GRG23(SEQ ID NO:2)是EPSP合酶，其具有极好的动力学数值Km、Ki和Vmax（美国专利申请第60/741,166号，2005年12月1日提交）。新的编码GRG23蛋白的基因序列（美国专利申请第60/741,166号，2005年12月1日提交）被设计并合成。所得到的序列在本文被提供为SEQ ID NO:6，并且在本文中称为“syngrg23”。通过本领域已知的方法，将开放阅读框克隆到表达载体pRSF1b(Invitrogen)中。
编码GRG23的syngrg23基因被克隆到pUC19载体中以产生 pAX748。应用MutazymeII系统(Stratagene)，使用在该载体中在syngrg23侧翼的PCR引物从pAX748扩增syngrg23，以将随机突变引入syngrg23编码区。在易错PCR（error-prone PCR）反应中，模板以1：50稀释，并且扩增进行30个循环。用限制性酶BamH I和Sgs I消化得到的PCR产物，凝胶纯化，并且连接到载体pRSF1b中，以产生诱变的syngrg23文库。
所述诱变的syngrg23文库被转化进大肠杆菌（E.coli）菌株BL21*DE3star(Invitrogen)中。转化后，单个菌落被铺板在含有150mM草甘膦的1×M63培养基上，以选择保持酶促活性和具有生长耐性的克隆。
实施例2.在平板上筛选草甘膦抗性
文库连接物被转化到BL21*DE3感受态大肠杆菌细胞（Invitrogen）中。根据制造商说明书进行转化，其中具有下列改变。在37℃，在SOC培养基中温育1小时之后，通过离心沉淀细胞（5分钟，1000×g，4℃）。用1ml M63+洗涤细胞，再次离心，并且倾析上清液。再一次用1mlM63+洗涤细胞，并且将细胞重悬于200ul M63+中。
为了选择在大肠杆菌中赋予草甘膦抗性的突变GRG23酶，细胞被铺板在含有150mM草甘膦、0.05mM IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)和50μg/ml卡那霉素的M63+琼脂培养板上。M63+培养基含有100mMKH2PO4、15mM(NH4)2SO4、50μM CaCl2、1μM FeSO4、50μM MgCl2、55mM葡萄糖、25mg/升L-脯氨酸、10mg/升盐酸硫胺素、足量的NaOH以调节pH至7.0、和15g/升琼脂。将所述平板在37℃温育36小时。
挑取单个菌落并且排列到384孔板中。以这种方式，产生了两个384孔板。从在没有草甘膦的平板上生长的菌落中挑取第三板的384个克隆。
实施例3.草甘膦抗性GRG23变体的分离和分析
通过在草甘膦平板上生长来鉴定用诱变的syngrg23和/或grg23变体转化的BL21*DE3细胞。制备诱变的syngrg23和/或grg23变体的提 取物并且分析其改进的酶促活性。用针将草甘膦平板上鉴定的菌落挑到含有LB培养基的96孔板中并且生长至O.D大约0.6。然后加入IPTG（0.5mM）并且将所述板在20℃温育过夜，以诱导蛋白质表达。使用POP培养试剂（Novagen）和Lysonase（Novagen），从细胞团中制备蛋白质提取物，并且在37℃加热提取物30分钟后，测量粗制溶解产物中的酶促活性。活性大于含有适当对照蛋白质（例如，GRG23）的一组提取物的平均值以上两个标准差的提取物被选择，用于进一步分析。
在作为粗制提取物温育之后显示出活性增加的克隆被生长在250mL LB培养物中，并用IPTG诱导蛋白质表达。诱导之后，使用钴树脂(cobalt resin)(Novagen)，通过亲和层析从每一培养物中纯化突变GRG23蛋白。然后，在37℃加热0、2、4、和大约16小时之后，检测纯化的蛋白质的酶促活性。
实施例4.改良的GRG23变体
从诱变syngrg23的DNA文库中，鉴定出几个在37℃具有改良的活性的克隆。与这些提取物对应的克隆的DNA序列被测定。表1示出了在6个保持草甘膦抗性的GRG23的变体中鉴定的氨基酸变化：grg23(L3P1.B20)(SEQ ID NO:20)，编码氨基酸序列GRG23(L3P1.B20)(SEQ ID NO:21)；grg23(L3P1.B3)(SEQ ID NO:22)，编码氨基酸序列grg23(L3P1B3)(SEQID NO:23)；GRG23(L3P1.F18)(SEQ ID NO:24)，编码氨基酸序列GRG23(L3P1.F18)(SEQ IDNO:25)；和grg23(L3P1.O23)(SEQ ID NO:26)，编码氨基酸序列GRG23(L3P1.O23)(SEQ IDNO:27)。
表1.在抗草甘膦的GRG23变体中鉴定出的突变
克隆 在GRG23中的氨基酸（AA）
L3P1B20 V206→I
L3P1B3 D75→H、E217→K
L3P1F18 T274→I
L3P1O23 R5→H
克隆在250mL LB培养物中生长，并且如上所述分离所诱导的蛋白质表达。然后，在37℃加热0、2、4、和大约16小时之后，检测纯化的蛋白质的酶促活性。发现克隆之一，称为“M5”，在37℃延长温育之后保持了增加比例的酶促活性（表2）。该克隆的DNA序列被测定，并且在本文中该基因被称为grg23(ace1)(SEQ ID NO:8)。从grg23(ace1)表达的蛋白质被称为GRG23(ACE1)(SEQ ID NO:9)。
表2.在升高的温度下GRG23(ACE1)对GRG23的半衰期
蛋白质 在37℃的半衰期（小时）
GRG23 7
GRG23（ACE1） 15.5
相对于野生型GRG23蛋白，GRG23(ACE1)包含两个氨基酸置换：A49→T和S276→T。含有该基因的pRSF1b被称为pAX3801。图1示出了在升高的温度下GRG23(ACE1)对GRG23的相对稳定性。
实施例5.GRG-23变体的EPSPS活性测定
分析了含有GRG-23变体蛋白的提取物的EPSP合酶活性，如2005年12月1日提交的美国专利申请第60/741,166号中所述，其通过引用以其全部并入本文。根据制造商说明书，在含有0.5mM莽草酸-3–磷酸、200uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1U/ml黄嘌呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、1U/ml辣根过氧化物酶、2mM草甘膦、50mM HEPES/KOH pH7.0、100mMKCl和Red(Invitrogen)的50μl终体积中进行分析。在室温下，提取物与除了莽草酸-3–磷酸之外的所有分析成分温育5分钟，并且通过加入莽草酸-3–磷酸开始进行分析。应用Spectramax Gemini XPS荧光分光计(Molecular Dynamics,激发：555nm；发射：590nm)，测量EPSP合酶活性。
如以前所述（2005年12月1日提交的美国专利申请号60/741,166），对纯化的蛋白质的动力学参数进行全测定，调节由本领域内已知的Bradford分析确定的蛋白质量。对于任一种草甘膦浓度，EPSP合酶活 性被测量为范围广泛的PEP浓度的函数。采用软件（Synergy Software），数据被拟合到Michaelis-Menten方程，并被用于确定EPSP合酶在该草甘膦浓度下的Km(表观Km)。在不少于4个草甘膦浓度的情况下确定表观Km值，并且应用本领域已知的方程(m1*x/(m2+x);m1=1;m2=1)，根据表观Km对草甘膦浓度的曲线图，计算EPSPS对于草甘膦的Ki。
表3.GRG23(ACE1)对GRG23的动力学
实施例6.grg23(ace2)的鉴定
相对于GRG23，GRG23(ACE1)包含两个氨基酸改变。为了确定在这些位置的另外的置换是否能够进一步提高活性，产生DNA文库，其导致产生表达蛋白质的克隆，所述蛋白质在与GRG23(SEQ ID NO:2)对应的位置49和276上进行实质性突变。通过在草甘膦平板上生长，选择赋予草甘膦抗性的克隆，并且生长并分析动力学特性，如所述。
令人惊讶的是，一个克隆——本文称为grg23(ace2)(SEQ ID NO:10)，其编码GRG23(ACE2)蛋白(SEQ ID NO:11)——被鉴定为具有改进的热稳定性。grg23(ace2)的DNA序列显示GRG23(ACE2)包含单氨基酸改变（GRG23的残基276改变为精氨酸）。
实施例7.GRG23和GRG51的比较，以及不同残基的诱变
产生两个文库以通过GRG23和GRG51的氨基酸序列的比较评价可能的氨基酸序列的变换。第一个文库将变异从GRG51氨基酸序列引入grg23(ace2)编码区。第二个文库将变异从GRG23(ACE2)氨基酸序列引入grg51编码区。
评价所得到的文库的克隆：(1)赋予细胞草甘膦抗性的能力，和(2)在37℃延长温育后的活性。全部10个克隆被测序并且更详细地分析。 一个具体克隆——本文称为grg51.4(SEQ ID NO:12)，其编码蛋白质GRG51.4(SEQ ID NO:13)——相对于GRG23(ACE2)和GRG51包含几个氨基酸改变。相对于GRG23(ACE2)存在于GRG51.4中的氨基酸改变随后被引入grg23(ace2)基因中，以产生grg23(ace3)(SEQ ID NO:14)，其编码GRG23(ACE3)蛋白(SEQ ID NO:15)。GRG23(ACE3)显示出相对于GRG23和GRG23(ACE2)的较高的活性和热稳定性。
GRG23(ace1)被诱变，并且检测克隆以鉴定表达具有改进的热稳定性和/或活性的变体的克隆。一个克隆——grg23(L5P2.J2)(SEQ ID NO:16)，其编码GRG23(L5P2.J2)(SEQID NO:17)——由于其改进的动力学特性而被鉴定。GRG23(L5P2.J2)相对于GRG23(ACE1)包含三个氨基酸改变，如下面表4中所示。
表4.GRG23(L5P2.J2)中的氨基酸改变
寡核苷酸诱变被用于修饰grg23(ace3)编码区，以包含在GRG23(L5P2.J2)中鉴定的每一个氨基酸改变。具有包含这些修饰的基因的克隆被鉴定出，并且发现其编码相对GRG23(ACE3)具有改变的动力学特征的蛋白质。该基因被称为grg23(ace4)(SEQ ID NO:18)。由grg23(ace4)编码并被称为GRG23(ACE4)(SEQ ID NO:19)的蛋白质相对于GRG23(ACE3)包含单氨基酸改变（缬氨酸101改变为苯丙氨酸）。基于这种结果，进行单独的寡核苷酸诱变以检测在位置101处的每一个可能的氨基酸置换的动力学。与GRG23(ACE4)相比，没有一个氨基酸改变导致动力学特性的进一步改善。见表5。
表5.改进变体的动力学
实施例8.GRG23变体的改进热稳定性
通过将蛋白质样品在37℃温育一系列时间来测定GRG23和几种变体的热稳定性，然后如本文所述测定残留的EPSPS活性，并且将所述活性与在4℃温育的对照样品的活性进行比较。表6示出了GRG23变体GRG23(ACE1)、GRG23(ACE2)和GRG23(ACE3)具有改进的热稳定性。
表6.GRG23和GRG23变体的热稳定性
蛋白质 在37℃的t1/2
GRG23 10.1
GRG23(ACE1) 15.3
GRG23(ACE2) 34.2
GRG23(ACE3) 65.4
实施例9.grg23(ace3)的变体
寡核苷酸诱变被用于产生grg23(ace3)的变体，所述变体导致具有氨基酸残基修饰的蛋白质表达，所述氨基酸残基与SEQ ID NO:15的位置169至174相对应。使用试剂盒（Stratagene），根据制造商说明书，进行诱变反应。质粒克隆被转化到大肠杆菌细胞系BL21*DE3中，并且通过IPTG诱导蛋白质表达，如本领域中已知的。通过亲和结合到镍柱（TALON金属亲和树脂，Clontech）来纯化蛋白质。天然GRG23(ace3)蛋白也被表达和纯化，用作对照。在每一种酶纯 化之后，通过本领域内已知的Bradford分析来测量蛋白质浓度。
实施例10.GRG23(ace3)变体的动力学分析
如本文所述，通过酶分析表征GRG23(ace3)变体GRG23(ace3)R173K(SEQ ID NO:29,由SEQ ID NO:28编码)、GRG23(ace3)G169V/L170V(SEQ ID NO:31，由SEQ ID NO:30编码)、GRG23(ace3)R173Q(SEQ ID NO:33，由SEQ ID NO:32编码)和GRG23(ace3)I174V(SEQID NO:35，由SEQ ID NO:34编码)，并且将其与天然GRG23(ace3)酶相比较。对于每一种酶，在几种草甘膦浓度的每一浓度下测定Km(表观)，并且Km(表观)对草甘膦浓度的曲线图被用于计算每一种酶的Ki。通过在37℃温育酶16小时，评价每一种酶的热稳定性，然后量化相比于在4℃温育的对照酶的残留酶活性（以Vmax表示）。
动力学分析显示，GRG23(ace3)R173K、GRG23(ace3)R173Q、GRG23(ace3)I174V和GRG23(ace3)G169V/L170V实际上与天然GRG23(ace3)不能区别并且显示出几乎相同的催化速率、极高的草甘膦抗性和非常好的PEP亲和性。对于G169V/L170V，对PEP的观测Km为19μM（与对于GRG23(ace3)的15μM相比），可表示相对于GRG23(ace3)，对PEP的结合亲和力稍微较低。四种变体的每一种在37℃16小时之后具有大于95%的热稳定性。对于GRG23(ace3)变体GRG23(ace3)R173K、GRG23(ace3)R173Q和GRG23(ace3)I174V所测定的动力学值被示于表6中。
表7.GRG23(ace3)变体的动力学
Km（μM） Ki（mM） Vmax（nmol/min/μg）
GRG23(ace3) 16 14 16
GRG23(ace3)R173K 16.6 14.7 17.7
GRG23(ace3)R173Q 14.3 14.2 15.8
GRG23(ace3)I174V 15.5 15.0 15.5
实施例11.将syngrg23和grg23变体克隆到植物表达盒中
对于本文描述的syngrg23和每一种grg23变体（包括，例如，grg23(ace1)、grg23(ace2)、grg23(ace3)、grg23(ace4)、grg23(ace3)R173K、grg23(ace3)R173Q、grg23(ace3)I174V、grg23(ace3)G169V/L170V和grg23(L5P2.J2)，通过PCR从全长DNA模板扩增开放阅读框（ORF）。在PCR过程中，Hind III限制性位点被加入到ORF的每一个末端。此外，核苷酸序列ACC被直接添加到基因的起始密码子的5'端，以增加翻译效率（Kozak(1987)Nucleic AcidsResearch15:8125-8148；Joshi(1987)Nucleic Acids Research15:6643-6653）。应用本领域熟知的技术克隆PCR产物并且进行测序，以保证在PCR期间没有突变被引入。
用Hind III消化包含PCR产物的质粒，并且分离包含完整ORF的片段。该片段被克隆到质粒如pAX200——一种包含水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，(1991)Molec.Gen.Genet.231:150-160)和PinII终止子(An等,(1989)The Plant Cell1:115-122)的植物表达载体——的HindIII位点。然后，来自该中间质粒的启动子-基因-终止子片段被亚克隆到质粒pSB11（Japan Tobacco,Inc.）中，以形成最终的基于pSB11的质粒。在一些情况下，可优选的是产生可选的构建物，其中叶绿体前导序列被编码为融合到syngrg23、grg23(ace1)、grg23(ace2)、grg23(ace3)、grg23(ace4)、grg23(L5P2.J2)、grg23(ace3)R173K、grg23(ace3)R173Q、grg23(ace3)I174V或grg23(ace3)G169V/L170V构建物的N-端。通常，这些基于pSB11的质粒被组构，以使包含启动子-基因-终止子构建物或启动子-叶绿体前导区-基因-终止子构建物的DNA片段可以通过限制性酶如Kpn I和Pme I的双消化来切除，并且用于通过气溶胶束注射而转化入植物。得到的基于pSB11的克隆的结构通过限制性消化和凝胶电泳以及通过跨过各种克隆链接点的测序来证实。
应用本领域熟知的三亲交配法（triparental mating procedures），质粒被移动到也具有质粒pSB1(Japan Tobacco,Inc.)的根癌农杆菌菌株LBA4404中，并且在含有壮观霉素（spectinomycin）的培养基上铺板。基于pSB11的质粒克隆携带壮观霉素抗性但是是窄宿主范围质粒并且不能在农杆菌属中复制。当基于pSB11的质粒通过同源重组整合到宽宿主范围质粒pSB1中时，壮观霉素抗性菌落出现。通过DNA杂交， 证实pSB1和基于pSB11的质粒的共整合产物。具有共整合的农杆菌属菌株被用于通过本领域已知的方法例如PureIntro法（Japan Tobacco）转化玉米。
实施例12.通过农杆菌属介导转化进行植物细胞的转化
最好在授粉后8-12天收集玉米穗。从穗分离胚，且那些大小0.8-1.5mm的胚被优选用于转化。胚以盾片侧朝上被平铺在合适的温育培养基上，所述合适的温育培养基如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐，1ml/L(1000×储存液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1ml/L(1mg/ml储存液)2,4-D)。然而，除了DN62A5S以外的培养基和盐是适合的并且在本领域是已知的。胚在25℃在黑暗中温育过夜。然而，本身并非必须将胚温育过夜。
得到的外植体被转移到方形网格（每平板30-40个），转移到渗透介质上大约30-45分钟，然后转移到光照板(beaming plate)（见，例如，PCT公布WO/0138514和美国专利第5,240,842号）。
应用基本上如在PCT公布WO/0138514中所述的条件，采用气溶胶束加速器（aerosol beam accelerator），促进DNA构建物到植物组织中，所述DNA构建物被设计来在植物细胞中表达本发明的GRG蛋白。光照之后，胚在渗透介质上温育大约30分钟，并且在黑暗中在25℃被置于温育培养基上过夜。为了避免过度损害光照的外植体，在转移到恢复培养基之前，这些外植体被温育至少24小时。然后，在25℃在黑暗中，胚被铺展在恢复期培养基上大约5天，随后被转移到选择培养基。外植体在选择培养基中温育可达8周，这取决于所使用的具体选择的种类和特性。在选择期之后，得到的愈伤组织被转移到胚成熟培养基，直到观察到成熟的体细胞胚形成。然后，得到的成熟体细胞胚被放置在弱光下，并且通过本领域已知的方法起始再生过程。所得到的茎干被允许在生根培养基上生根，并且所得到的植物被转移到苗盆并且作为转基因植物繁殖。
材料
DN62A5S培养基
用1N KOH/1N KCl调节溶液的pH至pH5.8，加入Gelrite（Sigma）至3g/L，并且高压灭菌。在冷却至50℃之后，加入5mg/ml的硝酸银储存液（Phytotechnology Labs）至2ml/L。该配方得到大约20块平板。
实施例13.通过农杆菌属介导的转化将EPSP合酶转化到玉米植物细胞中
最好在授粉后8-12天收集穗。从穗分离胚，并且那些大小0.8-1.5mm的胚被优选用于转化。胚以盾片侧朝上被平铺在合适的温育培养基上，并且在25℃在黑暗中温育过夜。
然而，本身并非必须将胚温育过夜。胚与含有适当载体的农杆菌属菌株接触大约5-10分钟，用于Ti质粒介导的转移，所述适当载体具有本发明的EPSP合酶，然后平铺到共培养培养基上大约3天（25℃，在黑暗中）。共培养之后，外植体被转移至恢复期培养基大约5天（25℃，在黑暗中）。外植体在选择培养基中温育可达8周，这取决于所使用的具体选择的种类和特性。在选择期之后，得到的愈伤组织被转移到胚成熟培养基，直到观察到成熟的体细胞胚形成。然后，得到的成熟体细胞胚被放置在弱光下，并且通过本领域已知的方法起始再生过程。 所得到的茎干被允许在生根培养基上生根，并且所得到的植物被转移到苗盆并且作为转基因植物繁殖。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域普通技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用被并入本文，其程度如同具体并个别地指出各个单独的出版物或专利申请通过引用被并入。
尽管为了清楚理解的目的，以说明和实施例的方式在一些细节上描述了前述发明，但是显然某些变化和改变可以在所附的权利要求的范围内实践。

Claims (23)

1.分离的或重组的核酸分子，其选自：
a)核酸分子，其由SEQ ID NO:30的核苷酸序列组成；和
b)核酸分子，其编码由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的多肽。
2.权利要求1所述的分离的或重组的核酸分子，其中所述核苷酸序列是设计用于在植物中表达的合成序列。
3.载体，其包含权利要求1或2所述的核酸分子。
4.权利要求3所述的载体，进一步包含编码异源多肽的核酸分子。
5.宿主细胞，其含有权利要求3所述的核酸分子。
6.权利要求5所述的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。
7.权利要求1或2所述的核酸分子在制备植物细胞中的应用。
8.权利要求5所述的宿主细胞在制备转基因植物中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。
10.权利要求1所述的核酸分子在制备转基因种子中的应用。
11.分离的或重组的多肽，其选自：
a)多肽，其由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成；和
b)多肽，其由SEQ ID NO:30的核苷酸序列编码。
12.权利要求11所述的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。
13.产生具有抗草甘膦活性的多肽的方法，包括在表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，所述多肽选自：
a)多肽，其由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成；和
b)多肽，其由SEQ ID NO:30的核苷酸序列编码。
14.赋予植物草甘膦抗性的方法，所述方法包括用DNA构建物转化所述植物和再生转化的植物，所述构建物包含驱动在植物细胞中表达的启动子，所述启动子与选自SEQ ID NO:30的核苷酸序列可操作地连接。
15.权利要求1所述的核酸分子在制备植物中的应用，其中在植物的基因组中稳定地掺入包含权利要求1所述的核酸分子的DNA构建物，所述核酸分子编码具有抗草甘膦活性的蛋白质；
其中所述核酸分子可操作地连接到驱动编码序列在植物细胞中表达的启动子。
16.权利要求15所述的应用，其中所述植物是植物细胞。
17.权利要求15所述的应用，其中所述植物是大豆植物。
18.权利要求15所述的应用，其中所述植物是玉米植物。
19.权利要求15所述的应用，其中所述植物选自玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。
20.赋予植物草甘膦抗性的方法，包括：
a)提供包含SEQ ID NO:30中所示的核苷酸序列的植物；
b)使所述植物与有效浓度的草甘膦接触；和
c)在与所述草甘膦接触之后，使所述植物在温度高于周围环境温度的条件下生长每天至少2个连续小时，持续至少4天，其中所述接触之后的天数在所述植物的生长季节内。
21.权利要求20所述的方法，其中步骤c)中的温度为32℃至60℃。
22.权利要求21所述的方法，其中步骤b)中的温度为37℃。
23.权利要求1所述的分离的或重组的核酸分子，其中所述核苷酸序列与能在植物细胞中指导编码序列表达的启动子可操作地连接。
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