CN105338806A

CN105338806A - 原核型异柠檬酸脱氢酶及其用于提高转基因植物氮利用的应用

Info

Publication number: CN105338806A
Application number: CN201380076568.5A
Authority: CN
Inventors: J·麦克拉伦; B·范德贝格
Original assignee: Iowa Corn Promotion Board
Current assignee: Iowa Corn Promotion Board
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2016-02-17
Also published as: WO2014142946A1; AU2013381961A1; CA2906278A1; ZA201602825B; EP2966987A1; EP2966987A4; CA2906278C; BR112015023546A2; MX360004B; PH12015502140A1; MX2015012951A

Abstract

本发明涉及转基因植物，其具有增加的氮利用效率、应激耐受性和/或减少增加产量的限制，或这些的组合，其已经用包括调节植物氮利用的合成异柠檬酸脱氢酶(icdh)基因的新载体构建体进行转化。本发明还涉及将icdh基因与其他调节植物氮利用的外源或异源基因(包括N-乙酰谷氨酸激酶基因)组合。本发明还涉及在植物中表达对应于调节植物氮利用或由氮条件调节的核酸序列的核酸分子的方法。

Description

原核型异柠檬酸脱氢酶及其用于提高转基因植物氮利用的应用

发明领域

本发明一般涉及具有改进的氮利用和应激耐受性的植物，更具体地，涉及植物中异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的异源表达，包括基于原核的异柠檬酸脱氢酶的过表达和表征，所述基于原核的异柠檬酸脱氢酶改进应激耐受性和氮摄取，新陈代谢或两者。本发明还包括将icdh基因与一个或更多个其他转基因组合(stacking)以改进氮利用和/或应激耐受性。

发明背景

植物在它们的营养生长和生殖生长期间需要氮。通过土壤矿物质化，施用氮肥或以上两者植物可以获得氮。但是，根据估计，给作物施用的氮的50-70％从植物-土壤系统损失[Peoples，M.B.etal.，“MinimizingGaseousLossesofNitrogen，”InNitrogenFertilizerintheEnvironment(Bacon，P.E.，ed.)MarcelDekker，pp.565-606(1995)]。氮是供应的最昂贵的植物营养物之一，氮肥并不总是以合理的价格提供，并且氮肥的过量施用可以产生环境挑战。玉米是农学上重要的植物实例，经常需要氮肥以发挥其遗传潜能。

天然ICDH可以存在于线粒体，叶绿体和胞浆中，每种均具有不同的生理效果，但是催化作用可以是类似的。一般来说，ICDHl定位于胞浆，ICDH2定位于叶绿体。

对于辅因子还原能力来说，ICDH可以使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP+)，取决于在哪种代谢途径中它是有活性的。一些出版物声称ICDH的主要功能可能是为其他代谢反应产生还原能力(NADH，NADPH)，例如，在不饱和脂肪酸的β-氧化中。其他理论包括以下意见，反应产物2-酮戊二酸(OG)可用于支持通过GOGAT循环的氨基酸合成(Hodges，M.Enzymeredundancyandtheimportanceof2-oxoglutarateinplantammoniumassimilation.J.Exp.Botany(2002)，53，905)。此外，与其他一或多个基因组合的ICDH酶的过表达可以允许有效利用额外的碳骨架。先前关于过表达线粒体icdh基因的转基因烟草植物的研究集中在氧化还原途径，既没有提及也没有鉴定对氮利用的任意可能影响(Gray，G.，Villarimo，A.，Whitehead，C.，McIntosh，L.TransgenicTobacco(NicotianatabacumL.)PlantswithIncreasedExpressionLevelsofMitochondrialNADP⁺-dependentIsocitrateDehydrogenase：EvidenceImplicatingthisEnzymeintheRedoxActivationoftheAlternativeOxidase，PlantandCellPhysiology2004；45，1413-1425)。

由于表达，底物，小室和翻译后调控，NAD-和NADP-依赖性异柠檬酸脱氢酶(NAD-ICDH，EC1.1.1.41和NADP_ICDH，EC1.1.1.42)的调控是复杂的。但是仍不清楚哪种ICDH形式产生用于氨基酸的OG，任意这类OG应该位于或进入叶绿体中，在那里氮被同化进氨基酸。文献表明ICDH的植物胞浆形式是同二聚体，具有大约47kD的亚基。线粒体ICDH疑似具有更多亚基。ICDH的细菌形式可以是单体的，被认为克服了植物中存在的与植物ICDH有关的表达与功能的典型调控，即磷酸化可以使所述同二聚体失活。

胞浆NADP-特异性ICDH催化柠檬酸转化为酮戊二酸。一种策略是设计包含编码单体原核型异柠檬酸脱氢酶基因(icdh)的基因的构建体，并指导ICDH在植物细胞质中过表达。表达的ICDH酶将通过增强碳流动入氮同化机制而增强植物利用可利用氮的能力。本文中，我们描述了合成icdh基因的过表达和表征，基于从细菌icdh序列的挑选并为了在玉米中表达而优化，以及icdh基因与其他转基因的组合。

发明概述

本发明涉及具有增加的氮利用效率、应激耐受性或这两者的转基因植物，所述转基因植物已经用包括调节植物氮利用的icdh核酸序列的新载体构建体转化。从数个细菌和植物基因组测序项目(已经保存于公众数据库，从中可以选择编码具有强活性的ICDH酶的序列)中鉴定多种icdh核酸序列用于本发明。然后对这些候选icdh序列进行筛选，以取消选择具有相对高含量的会抑制植物中表达的polyA区域的那些序列。将挑选以例示这些icdh序列的序列进行密码子优化以在玉米中表达(SEQIDNo1)。本发明还包括将icdh基因与一个或更多个异源基因组合以便诱导ICDH酶与氮同化酶的过表达。本发明还涉及用于转化植物的分离的载体，以及用于检测转化植物中目标核苷酸序列的表达的抗体。本发明还涉及在植物中表达对应于调节植物氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。

具体来说，使用核苷酸序列SEQIDNO：1和3以及其组合，变体，片段，和互补体构建用于转化植物和细菌细胞的载体。这些载体包括5′DNA启动子序列和3′终止子序列，其中核酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，启动子序列可以是组成型植物启动子或组织特异型启动子。

本发明还包括多克隆抗体，包括针对由核苷酸序列SEQIDNO：1和3及其组合编码的多肽的多克隆抗体。

本发明还包括用核苷酸序列SEQIDNO：1和3及其组合，变体和片段转化的植物。植物选自玉米(玉蜀黍)，高粱，小麦，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，和含油种子油菜，芸苔属，苜蓿，裸麦，粟，红花，花生，甘薯，木薯属，咖啡，椰子，菠萝，柑桔树，可可，茶树，芭蕉属植物，鳄梨树，无花果树，番石榴，芒果树，橄榄树，番木瓜树，腰果树，澳洲坚果，杏树，燕麦，蔬菜，草(如草皮草，饲草，或牧草)，观赏植物，树(如果树，坚果树，纸浆树，油棕)和针叶树。本发明还包括这类植物的组成部分，由这类植物产生的植物种子，和利用本发明的载体构建体转化的植物种子。

本发明还包括用选自SEQIDNO：1和3及其组合的核苷酸序列转化的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。

本发明还包括一种表达在植物中调节氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，和在所述转基因植物或从转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的条件下生长转基因植物或从转基因植物种子长成的植物。转基因植物的生长有效增加所述转基因植物或从转基因植物种子长成的所述植物的氮摄取，和/或增加所述转基因植物或从转基因植物种子长成的所述植物的氮利用效率，和/或减少限制使得所述转基因植物或从转基因植物种子长成的所述植物的产量增加。本发明还包括上述方法，其中提供转基因植物或提供转基因种子。本发明还包括上述方法，其中所述植物选自玉米(玉蜀黍)，高粱，小麦，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，和含油种子油菜，芸苔属，苜蓿，裸麦，粟，红花，花生，甘薯，木薯属，咖啡，椰子，菠萝，柑桔树，可可，茶树，芭蕉属植物，鳄梨树，无花果树，番石榴，芒果树，橄榄树，番木瓜树，腰果树，澳洲坚果，杏树，燕麦，蔬菜，草(如草皮草，饲草，或牧草)，观赏植物，树(如果树，坚果树，纸浆树，油棕)和针叶树。

本发明还包括一种通过在植物中表达被氮调节的核酸分子而提高植物的应激耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，和在所述转基因植物或由转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的条件下生长转基因植物或由转基因植物种子长成的植物。

本发明还包括一种通过在植物中表达被氮调节的核酸分子而改变植物的形态的方法，所述方法包括以下步骤：提供利用本发明的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，和在所述转基因植物或由转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的条件下生长转基因植物或由转基因植物种子长成的植物。

本发明还包括一种载体构建体，包括编码ICDH氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括SEQIDNO：2和4及其组合，5’DNA启动子序列，和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许所述核苷酸序列的转录。

本发明还包括一种载体构建体，包括调节植物中氮的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNO：1和3及其组合；与SEQIDNO：1和3及其组合的相应核苷酸序列具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物中调节氮；选自编码ICDH氨基酸序列SEQIDNO：2和4及其组合的那些核苷酸序列的核苷酸序列；和，编码与SEQIDNO：2和4及其组合的氨基酸序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物中调节氮；其中所述构建体还包括5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列，DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许所述核苷酸序列的转录。

附图简述

图1是质粒pMDO8901的载体图，其中质粒的主要元件(从顶端顺时针方向)是：右侧边界，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，icdh基因，35S终止子，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，nagk基因，35S终止子，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，草甘膦耐受SM(GRG23ac35)，35S终止子，左侧边界。

图2是质粒pMDO8902的载体图，其中质粒的主要元件(从顶端顺时针方向)是：右侧边界，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，icdh基因，35S终止子，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，来自EPSPS的叶绿体转运肽，nagk基因，35S终止子，ScUbi4启动子，5’UTR外显子，内含子，草甘膦耐受SM，35S终止子，左侧边界。

优选实施方案的详细说明

开发更有效利用氮的植物品种将减少过量输入氮的必要，节约农民的生产成本，造福发展中国家的农民(其无法获得肥料输入)，和减少与过量氮肥施用有关的环境污染。已经用于开发具有提高的氮利用的植物品种的一种方法依赖于传统的植物繁育技术。但是，由于缺乏遗传重组的规范，这类方法的成功率是不稳定的。

需要开发能够更有效地吸收和利用氮的植物品种。植物科学家已经采用简写术语氮利用效率(NUE)，并已经开发出各种测量和评估NUE的方法[Craswell，E.T.andGodwin，D.C.(1984)Theefficiencyofnitrogenfertilizersappliedtocerealsgrownindifferentclimates.TnAdvancesinPlantNutrition(Vol.1)(Tinker，P.B.andLauchli，A.，eds)，pp.1-55，PraegerPublishers；Steenbjerg，F.andJakobsen，S.T.(1963)Plantnutritionandyieldcurves.SoilSci.95，69-90；Siddiqi，M.Y.andGlass，D.M.(1981)Utilizationindex：amodifiedapproachtotheestimationandcomparisonofnutrientutilizationefficiencyinplants.J.PlantNutr.4，289-302；Moll，R.H.etal.(1982)Analysisandinterpretationoffactorswhichcontributetoefficiencyofnitrogenutilization.Agron.J.74，562-564]。在具体定义和使用背景中存在差异。例如，一些定义基于总生物量，而其他定义基于产生的籽粒重量。另一组定义使用从土壤提取氮的效率。可以通过农学效率(AE)，生理效率和利用效率的乘积，或NUEg(其是摄取效率和利用效率的乘积)测量施用氮肥用于提高籽粒产量的效率。其他定义考虑了生理因素。

如本说明书所述，术语氮利用效率，或NUE，被定义为包括同化途径中任意主要氮代谢库规模的可测量变化(例如，可能包括下列中一种或更多种的可测量变化：硝酸盐，亚硝酸盐，氨，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，亮氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，色氨酸，酪氨酸，植物部分的总蛋白含量，植物部分的总氮含量，和/或叶绿素含量)，或其中在更低氮施肥水平植物显示提供相同或提高的生物量或可收获产量，或其中在相同的氮施肥水平，当与未用本发明的调节氮的核酸构建体转化的植物相比时，植物显示提供提高的生物量或可收获产量。“可测量的变化”包括氮同化途径的任意组分(“代谢库”)的量的增加或降低。变化可以包括途径中一种或更多种代谢库的降低或增加，或一种或更多种库的降低以及一种或更多种其他库的伴随增加，如当为了产生另一种中间物或途径产物而使用氮同化途径的一种中间物。例如，在谷氨酸转化为谷氨酰胺时，谷氨酸的水平可以降低而谷氨酰胺的水平可以增加。因此，不受任何具体理论或机制的束缚，这些库中的一种或更多种的任意变化表明氮正被植物更有效地利用。

氮利用效率的增加可以伴随同化途径中任意主要氮代谢库规模的约5％，约10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，125％，150％，约200％或更大的可测量变化。在一个实施方案中，当与不包含本发明的调节氮的序列的植物相比时，本发明的转基因植物具有增加的从环境的氮摄取。“调节氮的序列”旨在表示调节NUE的核苷酸或氨基酸序列，非限制性实例如下：通过产生影响NUE的酶，或通过产生与涉及NUE的组分相互作用的蛋白，或通过产生影响调节NUE的内部稳态信号级联的蛋白，或通过导致N摄取、N同化、N代谢、N转运、N利用、N保存或这些组合的可测量变化的这些机制的组合。本发明还提供提高植物的应激耐受性的方法，通过在植物中表达一种或更多种调节氮的核苷酸序列而进行。在一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列是SEQIDNO：1，或其变体和片段。在另一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列是编码SEQIDNO：2的核苷酸序列或其变体和片段。在另一个实施方案中，调节氮的核苷酸序列分别是编码SEQIDNO：1加SEQIDNO：2的核苷酸序列或其变体和片段。

如本文使用，术语“应激”或“应激条件”是指植物、植物细胞等等暴露于物理、环境、生物或化学物质或条件，其对植物的代谢、生长、发育、增殖和/或存活(统称为“生长”)具有不利作用。归因于例如环境因素可以对植物施加应激，所述环境因素如水(例如洪水，干旱，失水)，缺氧条件(例如低水平的氧)，异常渗透条件，盐度或温度(例如，热/加热，冷，冰冻，霜)，营养物如氮、磷酸盐、钾、硫、微量营养素的缺失，或曝露于污染物，或由激素、第二信使或其他分子引起。厌氧应激，例如，归因于足以产生应激应答的氧水平的降低(缺氧或缺氧症)。洪水应激可能归因于植物、植物部分、组织或分离的细胞长时间或瞬间浸入液体介质，如发生在季风、雨季、暴发洪水或植物过量灌溉等等期间。冷应激或热应激可能分别归因于从对特定植物品种最适的生长温度范围的温度的降低或增加而发生。这类最适生长温度范围是本领域技术人员可以轻易确定或已知的。失水应激可以由细胞、组织、器官或整株植物的水丧失、膨压降低或含水量减少而诱导。干旱应激可以由脱除细胞、组织、器官或生物体的水或减少对细胞、组织、器官或生物体的水供给而诱导或与其相关。盐性应激(盐应激)可以与细胞的胞内或胞外环境渗透压的扰动相关或由其诱导。渗透应激还可以与例如植物细胞的胞内或胞外环境中分子浓度的变化(尤其是其中分子不能被分派穿过植物细胞膜)有关或由其诱导。

可以通过指定应激条件下对植物效能的任意定量或定性测量来评价应激耐受性的提高，并且与相同应激条件下生长的未用本发明的调节氮的序列转化的植物的效能进行比较。因此，植物可以显示提高的含氮量，改变的氨基酸或蛋白组成，改变的碳水化合物组成，改变的油组成，旺盛的生长特征，增加的植物产量或更好的种子产量和质量。这些植物可以通过检查任意下列参数进行鉴定：1)生长速度，按照新鲜或干重的增长率进行测量；2)成熟植物的植物产量，按照新鲜或干重；3)种子或果实产量；4)种子或结果重量；5)植物的总含氮量；6)果实或种子的总含氮量；7)植物的游离氨基酸含量；8)果实或种子的游离氨基酸含量；9)植物的总蛋白含量；10)果实或种子的总蛋白含量；11)碳水化合物或油的可测量变化。用于检查这些参数的流程和方法是本领域技术人员公知的。这些方法可以涉及测量酶/蛋白水平的酶测定法和免疫测定法；测量氨基酸组成、游离氨基酸库或各种植物组织的总氮含量的测定法；按照随时间的鲜重增加测量生长率；或按照总干重和/或总种子重量测量收获的植物。

细菌或植物细胞的转化

本文提供的是调节植物氮利用效率的新的核苷酸序列。还提供本发明蛋白的氨基酸序列，其可以是调节氮的或通过氮浓度进行调节的。

本发明的调节氮的核苷酸序列可以被修饰以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的调节氮的核苷酸序列可以在表达盒中提供以便在目标植物中表达。“植物表达盒”包括能够导致在植物细胞中从开放阅读框表达蛋白的DNA构建体。按照5′-3′的转录方向，所述盒将包括与本发明的DNA序列可操作连接的转录启始区(即启动子)，以及在植物中有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。所述盒另外还可以包含至少一种待共转化入生物体的额外基因，如选择标记基因或不同功能的组合(stacked)基因。或者，所述额外基因可以在多个表达盒中提供。这类表达盒配备多个限制性位点用于插入受调控区转录调控的调节氮的序列。

“启动子”意在表示用于指导下游编码序列的转录的核酸序列。启动子，以及其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达目标DNA序列必需的。优选地，启动子是已知在引入本发明核苷酸序列的生物体中刺激转录的序列。

对于植物宿主和/或本发明的DNA序列来说，启动子可以是天然的或类似的，或外源或异源的。此外，启动子可以是天然序列或另外是合成序列。当启动子对植物宿主是“天然”或“同源”的时，旨在表示所述启动子是在天然植物(其中引入所述启动子)中发现的。当启动子对本发明的DNA序列是“外源”或“异源”的时，旨在表示所述启动子不是用于本发明可操作连接DNA序列的天然的或天然存在的启动子。“异源”一般表示对于核酸序列所在的细胞或天然基因组部分不是内源的核酸序列，它们是通过感染、转染、微注射、电穿孔、显微投射等添加到细胞。“可操作连接”旨在表示启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列起始并调节对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，“可操作连接”旨在表示被连接的核酸序列是连续的，包括外显子和内含子，必要时连续的并在相同阅读框内连接两个蛋白编码区。

在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。用于植物的合适组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(PClSV)启动子(美国专利号5,850,019)；花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odelletal.(1985)Nature313：810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利号5,563,328)和来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利号5,378,619)；来自如水稻肌动蛋白这类基因的启动子(McElroyetal.(1990)PlantCell2：163-171)；泛素(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12：619-632和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)，包括TrpPro5启动子(美国专利申请号10/377,318；2005年3月16日提交)；pEMU(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；玉米H3组蛋白(Lepetitetal.(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-285和Atanassovaetal.(1992)PlantJ.2(3)：291-300)；芸苔ALS3(PCT申请WO97/41228)；以及各种土壤杆菌基因的启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147)。

在另一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。常用的组织特异性启动子列表可以参见Moore等人(2006)PlantJ.45(4)：651-683的综述，其以全文引入本文作为参考。

通常这类构建体还将包含5′和3′非翻译区。这类构建体可以包含“信号序列”或“前导序列”以便将目标肽共翻译或翻译后输送到某些胞内结构如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体，或被分泌。例如，可以将基因工程化为包含信号肽以便将肽转移到内质网。“信号序列”旨在表示已知或疑似导致共翻译或翻译后肽输送穿过细胞膜的序列。在真核生物中，这通常导致分泌入高尔基体，产生一些糖基化。“前导序列”旨在表示翻译时产生足以触发肽链共翻译输送到亚细胞细胞器的氨基酸序列的任意序列。因此，这包括靶向输送和/或糖基化的前导序列，通过输送入内质网，输送到液胞、包括叶绿体、线粒体等的质体进行。还优选工程化植物表达盒以包含内含子，这样的话需要内含子的mRNA加工以便表达。

“3′非翻译区”旨在表示位于编码序列下游的核苷酸序列。多聚腺苷酸信号序列及其他编码调节信号(能够影响多聚腺苷酸段添加到mRNA前体3′端)的序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”旨在表示位于编码序列上游的核苷酸序列。

其他上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是作用于增加启动子区表达的核苷酸序列。增强子是本领域公知的，包括但不限于，SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区可以对转录启始区来说是天然的，或对本发明的调节氮的序列来说是天然的，或可以源自另一来源。适宜的终止区获自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区，或马铃薯蛋白酶抑制剂II序列(PinII)，如下所述：Liuetal.(2004)ActaBiochimBiophysSin36(8)：553-558。还可参见Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5：141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell2：1261-1272；Munroeetal.(1990)Gene91：151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903；和Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15：9627-9639。

在合适情况下，可以对基因进行优化以便增加在转化宿主细胞中的表达。也就是说，可以使用宿主细胞优选的密码子来合成基因以便提高表达，或可以按照宿主优选的密码子使用频率使用密码子来合成基因。通常，将增加基因的GC含量。参见例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11关于宿主优选密码子使用的讨论。本领域已知用于合成宿主优选基因的方法。参见例如美国专利号6,320,100；6,075,185；5,380,831；和5,436,391，美国公开的申请号20040005600和20010003849，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，在此引入作为参考。

在一个实施方案中，目标核酸靶向叶绿体进行表达。采用这种方式，当目标核酸不是直接插入叶绿体时，表达盒将另外包含编码转运肽(其将目标基因产物导向叶绿体)的核酸。这种转运肽是本领域已知的。参见例如VonHeijneetal.(1991)PlantMol.Biol.Rep.9：104-126；Clarketal.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romeretal.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shahetal.(1986)Science233：478-481。

为了在叶绿体中表达可以将靶向叶绿体的目标核酸进行优化，以便弥补植物细胞核和所述细胞器之间密码子使用的差异。采用这种方式，可以使用叶绿体优选密码子合成目标核酸。参见例如美国专利号5,380,831，引入本文作为参考。

通常这些“植物表达盒”将插入“植物转化载体”。“转化载体”旨在表示细胞的有效转化所需的DNA分子。这类分子可以由一个或更多个表达盒组成，并且可以组织成不止一种“载体”DNA分子。例如，双元载体是利用两个非连续DNA载体来编码用于转化植物细胞的所有必需顺式和反式作用功能的植物转化载体(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience5：446-451)。“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够将异源DNA序列或片段在外源细胞中掺入、整合和表达的载体。

这种植物转化载体可以包括用于实现植物转化所需的一种或更多种DNA载体。例如，本领域的一般惯例是利用包括不止一种连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域通常被称为“双元载体”。双元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂程度是相当高的，有利的是在不同的DNA分子上分开功能。双元载体通常包含质粒载体，其包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左侧边界和右侧边界)，被工程化以便能在植物细胞中表达的选择标记，和“目标核苷酸序列”(被工程化以便能在植物细胞(其是产生转基因植物所需的)中表达的核苷酸序列)。该质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。将顺式作用序列按照允许有效转移入植物细胞并在其中表达的方式进行排列。例如，将选择标记基因和目标基因置于左侧和右侧边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，其介导来自土壤杆菌的T-DNA转移到植物细胞。这种质粒通常包含毒性功能(Vir基因)，其允许通过土壤杆菌感染植物细胞，以及通过在边界序列切割转移DNA和vir-介导的DNA转移，如本领域所理解的(HellensandMullineaux(2000)TrendsinPlantScience，5：446-451)。可以使用数种土壤杆菌菌株(例如LBA4404，GV3101，EHA101，EHA105等)用于植物转化。第二质粒载体不是通过其他方法(如显微投射，微注射，电穿孔，聚乙二醇等)转化植物所必需的。

可用于本发明构建体的改变或改进的变体

已经意识到可用于本发明的核苷酸和氨基酸序列可以通过各种方法进行改变，并且这些改变可以导致序列编码蛋白的氨基酸序列不同于本文公开的调节氮的序列编码的氨基酸序列。

可用于本发明的核苷酸序列包括SEQIDNO：1和3所示的序列，以及其组合，变体，片段和互补序列。如本文使用，术语“核苷酸序列”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。“互补序列”旨在表示与指定核苷酸序列足够互补的核苷酸序列，使得其可以与指定核苷酸序列杂交从而形成稳定双链。由这些核苷酸序列编码的调节氮的蛋白的相应氨基酸序列如SEQIDNO：2和4所示，以及其组合，变体和片段。本发明还包括核酸分子的用途，所述核酸分子包括编码部分长度的调节氮的蛋白的核苷酸序列及其互补序列。

作为这些调节氮的核苷酸序列的片段的核酸分子也可用于本发明。“片段”旨在表示编码调节氮的蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码调节氮的蛋白的生物学活性部分，或其可以是可用作利用下文公开方法的杂交探针或PCR引物的片段。作为调节氮的核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少约15，20，50，75，100，200，300，350或至少约400个连续核苷酸，或最多达到本文公开的全长调节氮的核苷酸序列中存在的核苷酸数目，取决于预期用途。“连续”核苷酸旨在表示彼此紧密邻接的核苷酸残基。

作为这些调节氮的多肽的片段的多肽也可用于本发明。“片段”旨在表示编码如SEQIDNO：2和/或4所示的调节氮的蛋白的氨基酸序列的一部分，并且保留氮利用效率。调节氮的蛋白的生物学活性部分可以是多肽，其例如长度为10，25，50，100，125，150，175，200，250，300，350，400或更多个氨基酸。可以通过重组技术制备这类生物学活性部分并评估氮利用效率。如本文所用，片段包括SEQIDNO：2和/或4的至少8个连续氨基酸。但是，本发明包括其他片段，如所述蛋白中大于约10，20，30，50，100，150，200，250，300，350或400个氨基酸的任意片段。

本发明还包括变体核酸分子或变体氨基酸序列在本发明的方法和组合物中的用途。调节氮的核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的调节氮的蛋白但因为遗传密码的简并性而具有保守性差异的那些序列，以及与上述序列足够相同的序列。可以使用公知的分子生物学技术(如下文所列的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)鉴定天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，其例如使用定点诱变产生，但其仍然编码如下文所述的本发明公开的调节氮的蛋白。可用于本发明的变体蛋白具有生物学活性，即它们保留天然蛋白的所需生物学活性，即氮利用效率和/或提高的应激耐受性。

“变体”旨在表示具有与SEQIDNO：2和/或4的氨基酸序列至少约60％，65％，约70％，75％，80％，85％，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列的蛋白或多肽。变体还包括由核酸分子编码的多肽，所述核酸分子在严格条件下与SEQIDNO：1和/或3的核酸分子或其互补序列杂交。变体包括由于诱变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明包括的变体蛋白具有生物学活性，即它们仍然具有天然蛋白的所需生物学活性，即保留氮利用效率和/或提高的应激耐受性。

可用于本发明的优选调节氮的蛋白是由与SEQIDNO：1和/或3的核苷酸序列足够相同的核苷酸序列编码的。术语“足够相同的”旨在表示使用本文描述的比对程序之一(利用标准参数)与参照序列相比，具有至少约60％或65％序列相同性，约70％或75％序列相同性，约80％或85％序列相同性，或约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将认识到，这些值可以被适当调整以确定两条核苷酸序列编码的蛋白的相应相同性，需要考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框位置等等。

为了确定两条氨基酸序列或两种核酸的百分比相同性，将序列为了最优比较目的进行比对。两条序列的百分比相同性是所述序列共有的相同位置数目的函数(即百分比相同性＝相同位置数目/位置总数目(例如重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两种序列具有相同长度。可以使用与如下所述类似的技术(允许或不允许缺口)来确定两条序列之间的百分比相同性。在计算百分比相同性时，通常只计数完全匹配。

可以利用数学算法确定两条序列之间的百分比相同性。用于比较两种序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264的算法，并如下进行了改进：Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877。这类算法被整合入Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：403等人的BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸检索可以利用BLASTN程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明的调节氮的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以利用BLASTX程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与本发明的调节氮的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了比较目的获得有缺口的比对，可以如Altschul(1997)NucleicAcidsRes.25：3389等人描述使用GappedBLAST。或者，可以使用PSI-Blast进行重复检索(其检测分子之间的较远关系)。参见Altschuletal.(1997)见上文。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22：4673-4680)。ClustalW比较序列并比对完整的氨基酸或DNA序列，从而提供有关完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法被用于数个商品化供应的DNA/氨基酸分析软件包，如VectorNTIProgramSuite的ALIGNX模块(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评价氨基酸百分比相同性。一个可用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(KarlNicholas)允许评估多个蛋白之间的氨基酸(或DNA)相似性和相同性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS4(1)：11-17的算法。这种算法被整合到ALIGN程序(2.0版本)，其是GCG序列比对软件包的一部分(获自Accelrys，Inc.，9865ScrantonRd.，SanDiego，California，USA)。当利用AUGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)，缺口长度罚分12，和缺口罚分4。

优选的程序是GAP版本10，其利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法。GAP版本10可以使用下列参数：用于核苷酸序列的％相同性和％相似性使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；用于氨基酸序列的％相同性和％相似性使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62评分矩阵。还可以使用等同程序。“等同程序”旨在表示任意序列比较程序，对于考虑的任意两种序列，当与GAP版本10产生的相应比对结果进行比较时，产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列百分比相同性的比对结果。

技术人员还将理解，可以通过突变在本发明的核苷酸序列中引入改变，从而导致编码的调节氮的蛋白的氨基酸序列的改变，但不改变蛋白的生物学活性。因此，可以通过在本文公开的相应核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸取代、添加或缺失来产生分离的变体核酸分子，由此在编码的蛋白中引入一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术引入突变，如定点诱变和PCR介导的诱变。本发明也包括这类变体核苷酸序列。

例如，可以在一个或更多个预测的、优选非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从调节氮的蛋白的野生型序列中改变而不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性所需的。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。可以在维持功能的非保守区域中进行氨基酸取代。一般来说，不对保守氨基酸残基或位于保守基序(其中这类残基对蛋白活性来说是必不可少的)内的氨基酸残基进行这类取代。但是，本领域技术人员将理解，功能变体可以在保守残基中具有较小保守或非保守的改变。保守的并且对蛋白活性必不可少的残基的实例包括，例如，在已知参与氮同化的类似或相关序列的比对中包含的全部蛋白之间都相同的残基。保守的但允许保守氨基酸取代并且仍然保留活性的残基的实例包括，例如，在已知参与氮同化的类似或相关序列的比对中包含的全部蛋白之间只具有保守取代的残基。

或者，可以沿着编码序列的全部或一部分随机引入突变来制备变体核苷酸序列，如通过饱和诱变，可以针对提供氮利用效率的能力筛选获得的突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，可以重组表达编码的蛋白，并使用标准测定技术来确定蛋白的活性。

使用如PCR、杂交等方法，可以鉴定相应的调节氮的序列，这类序列具有与本发明序列实质上的相同性。参见例如SambrookJ.，andRussell，D.W.(2001)MolecularCloning：ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)和Innis，etal.(1990)PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress，NY)。在杂交方法中，可以使用调节氮的核苷酸序列的全部或一部分来筛选cDNA或基因组文库。用于构建这类cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并公开于Sambrook和Russell，2001，见上文。

本发明的核苷酸或氨基酸序列的变体和片段通常将编码保留全长调节氮的蛋白的生物学活性的蛋白片段；即保留氮利用效率。“保留氮利用效率”旨在表示，变体或片段将具有如本文SEQIDNO：2和/或4公开的全长调节氮的蛋白或如本文SEQIDNO：1和/或3公开的全长调节氮的核苷酸序列的氮利用效率和/或应激耐受性的至少约30％，至少约50％，至少约70％，或至少约80％。用于监测氮利用效率的方法包括检测同化途径中任意主要氮代谢库大小的变化(例如，以下可测量的变化：硝酸盐，亚硝酸盐，氨，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，亮氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，色氨酸，酪氨酸，植物部分的总蛋白含量，植物部分的总氮含量，和/或叶绿素含量)或检测与不包含或表达本发明的调节氮的序列的植物相比，植物在较低氮施肥水平下提供相同或提高的产量的能力，或植物在相同氮施肥水平下提供提高的产量的能力。“相同”或“更低”的氮施肥水平的表述是指通常应用于不表达本发明的调节氮的序列的植物的氮水平。对于大部分(如果不是全部的话)的目标植物品种来说，足够的氮水平是本领域已知的。其他指导可以参见例如Hewitt(1966)SandandWaterCultureMethodsUsedintheStudyofPlantNutrition，2nded.，FarnhamRoyal(Bucks)，CommonwealthAgriculturalBureaux；和Hewitt(1975)PlantMineralNutrition，London，EnglishUniversityPress。

可用于本发明的多肽序列可以采用多种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于这类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过核苷酸序列的突变制备本文公开的调节氮的蛋白的氨基酸序列变体。这可以通过数种诱变形式之一和/或定向进化来实现。在一些方面，氨基酸序列编码的变化不会实质上影响蛋白的功能。这类变体将具有所需的氮利用效率。但是，应当理解本发明的调节氮的序列改变或提高氮利用的能力可以通过对本发明的组合物使用这类技术得到进一步提高。例如，可以在宿主细胞中表达本文公开的核苷酸序列，其在DNA复制期间显示高比例的碱基误掺入，如XL-1Red(Stratagene，LaJolla，CA)。在这类菌株中增殖后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过PCR扩增并将所获PCR片段克隆入载体)，如本文别处所述将其转化入植物，并测量氮利用效率。

或者，可以对许多蛋白的蛋白序列在氨基或羧基端进行基本上不影响活性的改变。这可以包括通过现代分子方法引入的插入，缺失或突变，如PCR，包括PCR扩增，其通过在PCR扩增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延伸蛋白编码序列。或者，添加的蛋白序列可以包括完整的蛋白编码序列，如本领域用于产生蛋白融合物常用的那些。这类融合蛋白通常被用于(1)增加目标蛋白的表达，(2)引入结合结构域，酶活性，或表位以便于蛋白纯化，蛋白检测，或本领域已知的其他实验用途，或(3)蛋白的靶向分泌或翻译到亚细胞细胞器，如革兰氏阴性菌的外周质间隙，或真核细胞的内质网，其中后者通常导致蛋白的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包括来源于诱变和重组发生步骤(如DNA改组)的序列。利用这类步骤，一种或更多种不同的调节氮的蛋白编码区可用于产生具有所需特性的新的调节氮的蛋白。采用这种方式，从相关序列多核苷酸群(包括具有实质序列相同性并可在体外或体内同源重组的序列区域)产生重组多核苷酸文库。例如，使用这种方法，编码目标结构域的序列基序可以在用于本发明的调节氮的序列和其他已知的调节氮的序列之间改组以便获得编码具有改善的目标特性(如改进的氮利用)的蛋白的新序列。用于这类DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Nad.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15：436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Cramerietal.(1998)Nature391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

植物转化

本发明的方法涉及将一种或更多种调节氮的核苷酸序列引入植物。在一些实施方案中，只将一种本文公开的调节氮的序列引入植物。在其他实施方案中，引入至少2种，至少3种，至少4种或更多种序列。当引入多个序列时，各个核苷酸序列是不同的。如果它们在至少一个核苷酸位置不同，则认为两个核苷酸序列是不同的。因此，不同的核苷酸序列包括两个或更多个不同的核苷酸序列(其各自编码相同的氨基酸序列(例如，为了在植物中的表达而优化了一个或更多个))，以及编码至少两种不同氨基酸序列的两个或更多个不同的核苷酸序列。

“引入”旨在表示向植物呈现包括一种或更多种调节氮的序列的一种或更多种构建体以便所述构建体能够到达植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用将核苷酸构建体引入植物的特定方法，只要所述核苷酸构建体能够到达至少一种植物细胞的内部。将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化法，瞬时转化法，和病毒介导法。

一般来说，植物转化法涉及将异源DNA转移入靶植物细胞(例如未成熟的或成熟的胚胎，悬浮培养物，未分化的愈合组织，原生质体等等)，然后应用适合选择的最大阈水平(取决于选择标记基因)以从未转化的细胞团块中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移到新鲜提供的相同培养基中并进行常规培养。随后，在置于补加最大阈水平的选择剂(即抗生素，如壮观霉素和卡那霉素)的再生培养基后，转化细胞分化成芽。然后将芽转移到选择性生根培养基以回收根蘖或幼苗。然后将转基因幼苗生长为成熟植物并产生能育种子(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6：271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnology14：745-750)。通常将外植体转移到新鲜提供的相同培养基中并进行常规培养。关于产生转基因植物的技术和方法的概述可以参见Ayres和Park(1994)CriticalReviewsinPlantScience13：219-239和BommineniandJauhar(1997)Maydica42：107-120。因为转化的材料包含许多细胞，转化和未转化的细胞均存在于相关靶愈合组织或组织或细胞团的任意部分。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力导致转化的植物培育。通常，去除未转化细胞的能力是快速回收转化植物细胞和成功产生转基因植物的瓶颈。然后可以使用分子和生化方法证实整合的异源目标基因在转基因植物基因组中的存在。

转基因植物的产生可以使用数种方法之一实施，包括但不限于通过土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞(土壤杆菌介导的转化)，用粘附在颗粒上的异源外源DNA轰击植物细胞，以及各种其他非颗粒直接介导的方法(例如Hieietal.(1994)ThePlantJournal6：271-282；Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnology14：745-750；AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantScience13：219-239；BommineniandJauhar(1997)Maydica42：107-120)来转移DNA。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svabetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8526-8530；SvabandMaliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917；SvabandMaliga(1993)EMBOJ.12：601-606。所述方法依赖于包含选择标记的DNA的颗粒枪输送，并通过同源重组将DNA靶向到质体基因组。此外，可以通过核编码和质体指导的RNA聚合酶的组织优选表达来反式激活沉默的质体载有的转基因，实现质体转化。这类系统报道于McBrideetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305。

可以通过本领域已知的数种技术之一实现细菌细胞的转化，包括但不限于电穿孔或化学转化(参见例如Ausubel，ed.(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Inc.，Indianapolis，IN)。可以使用提供对有毒物质抗性的标记来鉴定转化细胞(已摄取并表达测试DNA)和未转化细胞(不包含或不表达测试DNA的那些细胞)。

在本发明的一个方面，本发明的核苷酸序列可用做评价细菌或植物细胞转化的标记。采用这种方式，如上所述通过监测氮利用效率评价转化。

可以采用类似的方式实现植物细胞的转化。“植物”旨在表示整株植物，或包括植物器官(例如叶，茎，根等)的组成部分，种子，植物细胞，繁殖体，胚胎和它们的子代。植物细胞可以是分化或未分化的(例如愈合组织，悬浮培养细胞，原生质体，叶细胞，根细胞，韧皮部细胞，花粉)。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已将外源核酸序列或DNA片段掺入或整合入植物细胞的植物。“稳定的转化”旨在表示引入植物的核苷酸构建体整合入植物基因组并且能够被其子代遗传。

已经转化的细胞可以按照常规方式培育成植物。参见例如McCormicketal.(1986)PlantCellReports5：81-84。然后生长这些植物，利用同一转化株或不同株授粉，鉴定获得的具有所需表型特征的组成型表达的杂交株。可以培育两代或更多代以确保所需表型特征的表达是稳定维持和遗传的，然后收集种子以确保已经实现所需表型特征的表达。采用这种方式，本发明提供具有本发明核苷酸构建体(例如，稳定掺入它们基因组的本发明表达盒)的转化种子(还称为“转基因种子”)。

通过调节氮利用增加植物产量的方法

提供增加植物产量的方法。所述方法包括将本文公开的调节氮的核苷酸序列引入植物或植物细胞，由此氮利用效率的增加对应于植物产量的增加。如本文所定义，植物的“产量”是指植物产生的生物量的质量和/或数量，和/或可收获产量。“生物量”旨在表示任意测定的植物产物(例如植物的任意组成部分，如种子，茎，根，籽粒，叶等)。生物量产生的增加是测量的植物产物的产量的任意提高。可收获产量的增加是使用已知收获方法容易收集的植物组分的重量更高，或收获部分中目标化合物的组成量增加：一个非限制性的实例，是每单位土地面积收获的氨基酸如赖氨酸的量。增加植物产量或可收获产量具有数种商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物食用的叶菜类的产量。此外，增加叶生物量可用于增加植物来源药物或工业产品的产量。产量增加可以包括任意统计上显著的增加，包括但不限于，与未引入本发明的调节氮利用的核苷酸序列的植物的产量相比，植物产量至少增加1％，至少增加3％，至少增加5％，至少增加10％，至少增加20％，至少增加30％，至少增加50％，至少增加70％，至少增加100％或更大的增加。

植物

本发明可以用于转化任意植物品种，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括，但不限于，玉米(玉蜀黍)，高粱，小麦，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，和含油种子油菜，芸苔属，苜蓿，裸麦，粟，红花，花生，甘薯，木薯属，咖啡，椰子，菠萝，柑桔树，可可，茶树，芭蕉属植物，鳄梨树，无花果树，番石榴，芒果树，橄榄树，番木瓜树，腰果树，澳洲坚果，杏树，燕麦，蔬菜，草(如草皮草，饲草，或牧草)，观赏植物，树(如果树，坚果树，纸浆树，油棕)和针叶树。

蔬菜包括，但不限于，洋葱，番茄，莴苣，绿豆，利马豆，豌豆，和黄瓜属的成员如黄瓜，棱瓜和甜瓜。观赏植物包括，但不限于，杜鹃花，八仙花，木槿，玫瑰，郁金香，黄水仙，矮牵牛，康乃馨，猩猩木，和菊花。优选本发明的植物是作物(例如玉蜀黍，高粱，小麦，向日葵，番茄，十字花科植物，胡椒，马铃薯，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，烟草，大麦，含油种子油菜等)。

本发明尤其适合单子叶植物家族的任意成员，包括但不限于，玉蜀黍，水稻，大麦，燕麦，小麦，高粱，裸麦，甘蔗，菠萝，山药，洋葱，芭蕉属植物，椰子，和枣。

植物转化的鉴定

将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法(如分析与整合基因有关的核酸、蛋白和代谢产物)证实异源基因转化或整合入植物基因组。

PCR分析是一种快速方法，可以在移植入土壤的较早阶段筛选转化细胞、组织或芽中整合核苷酸序列的存在(SambrookandRussell(2001)MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。使用对目标基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物进行PCR。

通过基因组DNA的Southern印迹分析证实植物转化(Sambrook和Russell，2001，上文)。一般来说，从转化体提取总DNA，用合适的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶上分离并转移到硝酸纤维素或尼龙膜。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，上文)，利用例如放射性标记的³²P靶DNA片段探查膜或“印迹”以证实引入的基因整合入植物基因组。

在Northern分析中，根据本领域常用的标准方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，从转化体的特定组织分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上分离，并印迹在尼龙滤膜上。然后通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell，2001上文)，利用滤膜与源于本发明多核苷酸的放射性探针进行杂交，检验本发明核苷酸序列编码的RNA的表达。

通过标准方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，使用结合调节氮的蛋白上存在的一种或更多种表位的抗体，对转基因植物进行蛋白印迹和生化测定等以确定调节氮的基因编码的蛋白的存在。例如，可以使用本发明方法产生的多克隆抗体来检测调节氮的蛋白的存在。

抗体

本发明还包括针对可用于本发明的多肽的抗体，或其变体或片段。用于产生抗体的方法是本领域公知的(参见例如HarlowandLane(1988)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.；美国专利号4,196,265)。

实验

I.icdh基因

材料和方法

使用基因组工具，在Genbank的植物和细菌icdh基因中进行多重检索。目标聚焦在细胞溶质的，单体的，NADP+依赖形式，并且在polyA信号中具有特定的“AT”模式(其对植物中的表达不是抑制性的)。这项工作最终产生来自固氮菌属的序列(其符合所述标准)。对挑选的细菌异柠檬酸脱氢酶基因(icdh)的序列进行优化以便在玉蜀黍中表达。产生编码ICDH酶的合成基因(SEQIDNO：1)：

ATGAGCACCCCCAAGATCATCTACACCTTGACAGATGAGGCGCCGGCGCTGGCCACCTACAGCTTGCTGCCCATCATCAAGGCTTTCACTGGAAGCTCAGGCATTGCTGTGGAAACAAGGGACATCTCCCTTGCTGGAAGGCTGATCGCCACCTTCCCAGAATATTTGACAGACACCCAGAAGATCTCTGATGATCTTGCTGAGCTGGGGAAGCTGGCCACCACGCCAGATGCCAACATCATCAAGCTGCCAAACATCTCTGCTTCAGTTCCTCAGCTGAAGGCCGCCATCAAGGAACTCCAGCAGCAAGGCTACAAGCTGCCAGATTATCCAGAAGAACCAAAAACAGACACAGAGAAGGATGTCAAGGCAAGATATGACAAGATCAAGGGCAGCGCCGTCAACCCCGTGCTGAGAGAAGGAAATTCAGACCGCCGCGCGCCGCTCTCCGTCAAGAACTATGCAAGGAAGCATCCTCACAAGATGGGCGCCTGGAGCGCCGACAGCAAGAGCCATGTTGCTCACATGGACAATGGAGATTTCTATGGATCAGAGAAGGCGGCGCTGATTGGTGCTCCTGGAAGCGTCAAGATTGAGCTGATCGCCAAGGATGGAAGCAGCACCGTGCTGAAGGCCAAGACATCAGTTCAAGCTGGAGAGATCATCGACAGCTCCGTGATGAGCAAGAATGCTCTGAGGAACTTCATTGCTGCCGAGATTGAAGATGCCAAGAAGCAAGGAGTGCTGCTCTCCGTCCACCTCAAGGCCACCATGATGAAGGTTTCAGATCCCATCATGTTTGGCCAGATTGTTTCAGAGTTCTACAAGGATGCTCTCACCAAGCATGCTGAGGTGCTGAAGCAGATTGGATTTGATGTCAACAATGGCATTGGAGATCTCTATGCAAGGATCAAGACCCTACCAGAAGCAAAGCAGAAGGAGATTGAAGCTGACATCCAAGCTGTTTATGCTCAAAGGCCGCAGCTGGCAATGGTGAACAGCGACAAGGGCATCACCAACCTCCATGTTCCTTCTGATGTCATCGTCGACGCCTCCATGCCGGCCATGATCAGAGATTCAGGGAAGATGTGGGGGCCAGATGGCAAGCTGCATGACACCAAGGCCGTCATCCCAGATCGCTGCTATGCTGGCGTCTACCAGGTGGTGATTGAAGATTGCAAGCAGCATGGCGCCTTCGACCCAACAACAATGGGCTCAGTTCCAAATGTTGGGCTGATGGCGCAGAAGGCAGAAGAATATGGAAGCCATGACAAGACCTTTCAGATCCCTGCTGATGGCGTCGTCCGCGTCACTGATGAAAGCGGCAAGCTGCTGCTGGAGCAATCAGTGGAAGCTGGAGACATCTGGAGGATGTGCCAAGCAAAGGATGCTCCCATCCAAGATTGGGTGAAGCTCGCCGTCAACAGGGCGCGCGCCACCAACACGCCGGCGGTGTTCTGGCTGGACCCAGCAAGGGCTCATGATGCTCAGGTGATCGCCAAGGTGGAGAGATATCTAAAGGATTATGACACCTCCGGCCTGGACATCAGGATCTTGTCGCCGGTGGAAGCAACAAGGTTCTCCTTGGCAAGGATCAGAGAAGGAAAGGACACCATCTCAGTGACAGGAAATGTGCTGAGGGACTACCTCACCGACCTCTTCCCCATCATGGAGCTGGGCACCTCCGCCAAGATGCTCTCCATTGTTCCTCTGATGAGCGGCGGCGGCCTCTTTGAAACTGGAGCTGGAGGATCAGCGCCCAAGCATGTTCAGCAGTTCCTGGAAGAAGGCTACCTCAGATGGGACAGCCTTGGAGAGTTCCTGGCGCTCGCCGCCTCCTTGGAGCATCTTGGAAATGCCTACAAGAACCCAAAGGCGCTGGTGCTGGCCTCCACCCTAGATCAAGCTACTGGCAAGATCCTGGACAACAACAAGAGCCCAGCAAGGAAGGTTGGTGAGATCGACAACAGAGGAAGCCACTTCTACCTGGCGCTCTACTGGGCTCAAGCTCTTGCTGCTCAAACAGAGGACAAGGAGCTACAAGCTCAGTTCACCGGCATTGCCAAGGCGCTGACAGACAATGAAACAAAAATTGTTGGAGAGCTGGCTGCTGCTCAAGGAAAGCCGGTGGACATTGCTGGCTACTACCATCCAAACACCGACCTCACCAGCAAGGCCATCAGGCCATCTGCCACCTTCAATGCTGCTCTGGCGCCGCTGGCATAGTAAGG

上文显示的icdhDNA序列编码下列ICDH蛋白序列(SEQIDNO：2)(741个氨基酸)：

用于过表达ICDH的载体构建

将先前部分描述的开放阅读框引入载体用于植物表达。载体还包含编码草甘膦耐受性EPSPS酶(GRG23ace5)的基因，其被用作玉蜀黍转化期间的选择标记。这些基因中每一种的表达受到ScUbi4启动子的控制以在玉蜀黍中产生有力表达。这种载体(称为pMDO8901)的载体图显示于图1。

植物转化

使用pMDO8901载体进行土壤杆菌介导的玉蜀黍转化。在载体构建和土壤杆菌转化后，利用本领域已知的方法通过Southern印迹确认载体。通过这些检验的阳性土壤杆菌株在固体培养基上生长以产生用于大规模转化实验的细胞。

通过电穿孔将载体pMDO8901引入根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株。通过该土壤杆菌株的Southern印迹杂交确认重组载体pMDO8901的形成。用于这些实验的选择剂是草甘膦。

包含共合体的土壤杆菌株可用于转化植物，例如通过PureIntro方法(JapanTobacco，Inc.)。

蛋白印迹分析

通过产生特异性结合ICDH蛋白的抗体来检查这些植物中icdh的表达。简单来说，将icdh基因亚克隆入载体pRSF1b(Novagen)以允许IPTG诱导后ICDH蛋白在大肠杆菌中的过表达。载体还在蛋白的N端引入6xHis标签。蛋白过表达后，通过钴柱层析法纯化ICDH蛋白并通过N端测序确认纯化蛋白的身份。然后使用纯化的蛋白免疫兔，在免疫后42天开始血清收集。

随后，通过蛋白印迹分析，使用ICDH抗血清评价转基因玉蜀黍植物中的蛋白表达。在温室生长4周后从各个植物提取叶样品，通过在水中研磨植物材料制备蛋白提取物。通过Bradford测定法确定每种提取物中的蛋白浓度，在4-12％梯度的聚丙烯酰胺凝胶上分离25ug每种提取物。将分离的蛋白转移到硝酸纤维素，然后用1∶5000稀释的兔抗血清进行探查。洗涤步骤后，将硝酸纤维素与偶联辣根过氧化物酶的山羊抗兔(1∶10,000稀释)接触，使用ECL检测试剂(GEHealthcare)显色抗体复合物。在T0期，发现大部分icdh事件表达ICDH。两个事件具有特别好的表达水平，并进展到T1期。

玉蜀黍氮分析

已经开发出定量植物的氮中间物的一系列测定法。这些氮测定方法描述于先前的专利申请(WO2008/051608“Plantswithimprovednitrogenutilizationandstresstolerance”)。本文使用这些测定法来分析总共10种包含icdh基因的转基因植物。在温室土壤中生长4周后对每种植物进行取样(叶)。对这些叶样品进行处理以确定它们的硝酸盐，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，铵，总氨基酸，叶绿素和总蛋白水平。分析中并列包含的是利用只包含GRG23ace5选择标记(没有icdh也没有nagk)的构建体转化的植物。在第4周对这些植物同样取样，称作“无GOI”植物。对两种植物类型进行的氮测定结果示于下表1。

这些数据证实我们设计的合成基因编码功能性ICDH酶。

包含icdh基因的玉蜀黍植物相对于对照显示差异

选择事件15122和15125，并进展到T1期。按照先前的描述，对T1植物进行取样和评估。结果显示于表2-4。

表2-由于提高的谷氨酰胺，T0事件进展到T1检验

表3-由于提高的天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺，T0事件进展到T1检验

表4-对照

T1植物的数据指示对转基因事件的较低天冬酰胺水平(对于平均值和大部分植物来说)。各个植物具有不同于对照的结果；例如，事件15122植物#5，与对照相比具有更高的谷氨酸和更高的叶绿素但是更低的氨基酸和更低的蛋白水平。

在事件15125中，植物#4具有高得多的谷氨酸水平。记录的数值是如此之高，看起来它可能是异常值或取样误差。但是，与对照相比，同一植物具有更高的叶绿素和更高的蛋白水平(叶绿素和蛋白测量值取自与谷氨酰胺不同的样品)，因此所有提高的水平无法归因于同一实验误差，即使假定对于谷氨酰胺存在误差。

总而言之，数据表明对于测量的库规模(例如更低的天冬酰胺)和对于各个植物来说其他物质(例如叶绿素)的一些潜在作用。更低的天冬酰胺可能归因于更多的N掺入其他库，导致更少的N用于内部输送(通过输送氨基酸，天冬酰胺)。

II.icdh基因+nagk基因

用于过表达细菌icdh+nagk的载体构建

对ICDH载体pMDO8901进一步修饰以添加编码精氨酸不敏感型N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)蛋白的基因。将这种新载体(pMDO8902；图2)设计为引入ICDH和NAGK两种蛋白的过表达以进一步提高植物的氮利用。

编码NAGK，SEQIDNO：3的DNA序列如下所示，包括获自藻类莱茵衣藻(Chlamydimonasreinhardtii)的烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)基因的5′末端的叶绿体转运肽(CTP)。CTP序列不同于nagk基因在于nagk基因用粗体字表示：

SEQIDNO：3

ATGCAGCTGCTCAACCAGCGGCAGGCGCTGCGGCTGGGAAGAAGCTCCGCCAGCAAGAACCAGCAGGTGGCGCCGCTGGCATCAAGGCCGGCAAGCAGCCTCTCCGTCTCCGCCTCCTCCGTGGCGCCGGCGCCGGCCTGCTCGGCGCCGGCCGGCGCCGGCCGCCGCGCCGTGGTGGTGCGCGCCTCCGCCACCAAGGAGAAGGTGGAGGAGCTCACCATCCAG

NAGK(去除CTP后)的这种氨基酸序列，SEQIDNO：4，在此处显示(277个氨基酸)：

SEQIDNO：4：

利用载体pMDO8902的玉蜀黍转化

按照先前描述，将植物载体pMDO8902转化入土壤杆菌，随后进入植物转化实验，以将组合的基因引入玉蜀黍基因组。用于这些实验的选择剂是草甘膦。

蛋白印迹分析

如前所述，在蛋白印迹中使用产生的多克隆抗体来确定转基因蛋白是否正在表达。在T0期，发现大部分icdh事件表达ICDH。两个事件进展到T1期，其每一个均具有良好的表达水平。

氮测定，T0事件

已经开发出定量植物氮中间物的一系列测定法。这些氮测定方法在先前部分已经描述。简单来说，在温室土壤中生长4周后对每种植物进行取样(叶)。对这些叶样品进行处理以确定它们的硝酸盐，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，铵，总氨基酸，叶绿素和总蛋白水平。分析中并列包含的是利用只包含草甘膦选择标记(无icdh，nagk，基因)的构建体转化的植物，被称作对照“无GOI”植物。

T0数据显示于表5。

与对照(和标准差)相比，1个T0事件(15109)具有更高的天冬氨酸水平。几个事件具有比对照更高的谷氨酰胺水平，更高的总氨基酸和更高的蛋白。根据这些结果，选择事件15105(提高的Glu，Asp，Gln，总AA)和15106(提高的Gln，总AA，蛋白)用于T1期鉴定。

T1结果

对于每个选择的事件，按照先前描述，产生6株T1植物，培育并取样。进行测定，结果显示于表6。

与对照平均值(和标准差)相比，平均值显示15105具有更低的天冬酰胺，更高的叶绿素和更高的总氨基酸；15106具有更高的谷氨酸，更高的叶绿素和更高的总氨基酸。

因为组合ICDH+NAGK看起来具有数种积极效果，尤其是在后来的含氮代谢产物(例如叶绿素，总氨基酸)中，我们利用先前关于NAGK效果的数据(美国专利申请系列号12/916,854，2010年11月1日提交，全文引入本文作为参考)并与单独的ICDH和ICDH+NAGK进行比较。结果显示于表7(数据是对照的％)。

表7-关于单独的NAGK，单独的ICDH和ICDH+NAGK的数据

我们从ICDH值排除了1株植物(15125#4)，因为它看起来是高的异常值。结果显示以下模式，其中：(1)单独的NAGK倾向于影响中间物N-代谢产物(Asp，Asn，Glu，Gln)；(2)单独的ICDH影响叶绿素；和(3)ICDH+NAGK显示对叶绿素和总氨基酸的影响。这种组合效应表明，与单独的基因相比，N被同化和向终产物进展到更大的程度。

上述说明书和附图包括本发明的示例性实施方案。本文描述的上述实施方案和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和喜好而改变。仅仅按照某种顺序的方法步骤不构成对所述方法的步骤顺序的任何限制。上述说明书和附图仅仅解释和说明本发明，本发明不受其限制。阅读本文内容的本领域技术人员将能够对其进行修改和改变而不脱离本发明的范围。

序列表

SEQIDNO：1

SEQIDNO：2

SEQIDNO：3

ATGCAGCTGCTCAACCAGCGGCAGGCGCTGCGGCTGGGAAGAAGCTCCGCCAGCAAGAACCAGCAGGTGGCGCCGCTGGCATCAAGGCCGGCAAGCAGCCTCTCCGTCTCCGCCTCCTCCGTGGCGCCGGCGCCGGCCTGCTCGGCGCCGGCCGGCGCCGGCCGCCGCGCCGTGGTGGTGCGCGCCTCCGCCACCAAGGAGAAGGTGGAGGAGCTCACCATCCAGATGCTGCATGAGGTGATGGTGATCAAGTGCGGCGGCAGCATGCTGGAGCAGCTGCCGGAGAGCTTCTACAACAAGCTGGCGACGCTGCAAGCAGAAGGAAGAAGCATCGTCATTGTTCATGGAGGAGGGCCGGCCATCAACCAGATGCTGGAGCAGCTGAAGATTGAGCCAACCTTCTCAAATGGGCTGAGGGTGACAGATGAGCCAACAATGCAAGCTGTGGAGATGGTGCTCTCAGGGCCCATCAACAAGCTGGTGGTGAGGAAGCTGCTGCACGCCGGCGGCAAGGCATGGGGCCTCAGCGGCGTGGATGGAAGCCTGCTGCAAGCTGTTGAGAAGACTCAAGGCCTCGGCCTGGTGGGCAGCATCACCGTGGTGGATCAAGCGCCGCTCCAGCTGCTGCTGAGCAATGGCTACATCCCGGTGGTGTCTCCCATCGCCGTCTCAGAAGATGGAAGAACAAGATACAACTGCAACGCCGACACCGTCGCCGGCGCCATTGCTTCAGCTCTCGGCGCCAAGCAGCTGCTGATGCTCACTGATGTTCCTGGCATCTGGGCAGAAAATGAGCTGGGAGAGAAGCAGCTGCTGCCGACGGTGACAACAGAAGATATTCAGCTGATGATGAAGAACCAGATCATCACCGGCGGCATGATCCCCAAGGTGCAAGCGGCGCTGGATGCTCTAGCTCAAGGAGTTCAAGAAGTGGTGATCTGCAAAGGAGAAGCTGAGACGCTGGACGGCGTGGTGAAGGGCATGGCCGTCGGCACCTCCATCTCCGCCGAGATGAGCAGAGGACAAGATTCTCAAGCCTTCATCAGCAACAAGGTGTGAGG

SEQIDNO：4：

Claims

1.一种植物、植物细胞、植物材料或植物种子，其包括icdh基因和任选包括一种或更多种调节植物氮利用的基因，所述基因的每一种对于所述植物、植物细胞、植物材料或植物种子是外源或异源的。

2.从权利要求1所述的植物细胞或种子再生的植物。

3.权利要求1所限定的植物，其中与相同条件下培养的野生型植物相比，所述植物显示提高的氮利用效率。

4.一种提高植物氮利用效率的方法，包括利用至少icdh基因和任选利用一种或更多种调节植物氮利用的基因转化植物的步骤。

5.icdh序列，包括选自以下的核苷酸序列：

a)核苷酸序列SEQIDNO：1；

b)与SEQIDNO：1具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用；

c)编码SEQIDNO：2的氨基酸序列的核苷酸序列；和，

d)编码与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用。

6.一种表达载体，包括选自以下的核苷酸序列：

a)核苷酸序列SEQIDNO：1；

c)编码SEQIDNO：2的氨基酸序列的核苷酸序列；和，

7.权利要求6所述的表达载体，还包括5’DNA启动子序列和3’终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许所述核苷酸序列的转录。

8.权利要求7所述的表达载体，其中所述启动子序列选自组成型植物启动子和组织特异型启动子。

9.一种多克隆抗体，包括针对核苷酸序列SEQIDNO：1编码的氨基酸序列的多克隆抗体。

10.一种植物，包括用至少一种选自以下的第一核苷酸序列转化的植物：

a)核苷酸序列SEQIDNO：1，3；

b)与SEQIDNO：1，3具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用；

c)编码SEQIDNO：2，4的氨基酸序列的核苷酸序列；和，

d)编码与SEQIDNO：2，4的氨基酸序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用。

11.权利要求10所述的植物，其中所述植物选自玉米(玉蜀黍)；高粱；小麦；向日葵；番茄；十字花科植物；胡椒；马铃薯；棉花；水稻；大豆；甜菜；甘蔗；烟草；大麦；和含油种子油菜；芸苔属；苜蓿；裸麦；粟；红花；花生；甘薯；木薯属；咖啡；椰子；菠萝；可可；茶树；芭蕉属植物；鳄梨树；无花果树；番石榴；芒果树；橄榄树；番木瓜树；腰果树；澳洲坚果；杏树；燕麦；蔬菜；草；蔬菜，包括但不限于洋葱，番茄，莴苣，绿豆，利马豆，豌豆，和黄瓜属成员如黄瓜，棱瓜，和甜瓜；观赏植物，包括但不限于杜鹃花，八仙花属，木槿，玫瑰，郁金香，黄水仙，矮牵牛，康乃馨，猩猩木，和菊花；纸浆树；油棕；和针叶树。

12.权利要求11所述的植物的组成部分。

13.权利要求11所述的植物产生的植物种子。

14.用权利要求6所述的载体转化的植物种子。

15.一种宿主细胞，包括用至少一种选自以下的第一核苷酸序列转化的宿主细胞：

a)核苷酸序列SEQIDNO：1，3；

c)编码SEQIDNO：2，4的氨基酸序列的核苷酸序列；和，

16.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包括至少一种选自(a)、(b)、(c)或(d)的第二核苷酸序列，其中所述第一和所述第二核苷酸序列是不同的。

17.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和植物细胞。

18.一种载体构建体，包括：

a)至少一种选自以下的编码氨基酸序列的第一核苷酸序列：

i)核苷酸序列SEQIDNO：1，3及其组合；

ii)与SEQIDNO：1，3及其组合具有至少85％序列相同性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用；

iii)编码SEQIDNO：2，4及其组合的氨基酸序列的核苷酸序列；和，

iv)编码与SEQIDNO：2，4及其组合的氨基酸序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列调节植物的氮利用；

b)5'DNA启动子序列；和，

c)3'终止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA启动子序列和终止子序列是可操作连接的，以允许所述核苷酸序列的转录。

19.权利要求18所述的载体构建体，还包括至少一种选自(a)(i)、(a)(ii)、(a)(iii)或(a)(iv)的编码氨基酸序列的第二核苷酸序列，其中由所述第一和所述第二核苷酸序列编码的氨基酸序列是不同的。

20.一种在植物中表达调节氮的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供用权利要求1所述的载体构建体转化的转基因植物或植物种子，和在所述转基因植物或从转基因植物种子长成的所述植物中有效表达所述核酸分子的条件下生长所述转基因植物或从所述转基因植物种子长成的植物。

21.权利要求20所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效减少限制，使得所述转基因植物或由所述转基因植物种子长成的所述植物的产量增加。

22.权利要求20所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效增加所述转基因植物或由所述转基因植物种子长成的所述植物的氮利用效率。

23.权利要求20所述的方法，其中植物选自玉米(玉蜀黍)；高粱；小麦；向日葵；番茄；十字花科植物；胡椒；马铃薯；棉花；水稻；大豆；甜菜；甘蔗；烟草；大麦；和含油种子油菜；芸苔属；苜蓿；裸麦；粟；红花；花生；甘薯；木薯属；咖啡；椰子；菠萝；可可；茶树；芭蕉属植物；鳄梨树；无花果树；番石榴；芒果树；橄榄树；番木瓜树；腰果树；澳洲坚果；杏树；燕麦；蔬菜；草；蔬菜，包括但不限于，洋葱，番茄，莴苣，绿豆，利马豆，豌豆，和黄瓜属成员如黄瓜，棱瓜，和甜瓜；观赏植物，包括，但不限于，杜鹃花，八仙花属，木槿，玫瑰，郁金香，黄水仙，矮牵牛，康乃馨，猩猩木，和菊花；纸浆树；油棕；和针叶树。

24.权利要求20所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效提高所述转基因植物或由所述转基因植物种子长成的所述植物的应激耐受性。

25.权利要求20所述的方法，其中所述核酸分子的表达有效改变所述转基因植物或由所述转基因植物种子长成的所述植物的形态。

26.一种转基因玉米植物，包括利用icdh基因和至少一种提高玉米的氮利用效率的NAGK基因转化的起始玉米植物，其中所述转化的玉米植物具有比所述起始玉米植物增加的叶绿素。

27.一种转基因玉米植物，包括利用ICDH基因和至少一种提高玉米的氮利用效率的nagk基因转化的起始玉米植物，其中所述转化的玉米植物具有比所述起始玉米植物增加的总氨基酸。

28.一种提高玉米植物的籽粒数目的方法，包括以下步骤：向所述植物基因组中引入icdh基因和提高氮利用效率的nagk基因，和生长所述转化的植物以生产籽粒。