KR20110041575A - 트랜스제닉 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 잎에서 아미노산 트레오닌을 축적하는 트랜스제닉 식물, 특히 담배 식물을 제공한다. 트레오닌을 생성시키는 생합성 경로는 빈틈없이 조절되며, 트레오닌을 과생성하는 트랜스제닉 식물을 달성하려는 이전의 시도는 식물의 적응을 손상시켰다. 본 발명은 상기 난점을 극복하며, 잎 노화의 개시 후에 트레오닌의 증가된 생성을 달성하기 위해 식물 물질대사를 변경시키는 것을 포함하는, 식물 적응을 손상시키지 않고 상응하는 야생형 수준을 초과하도록 식물 잎에서 트레오닌의 수준을 증가시키는 방법인 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 노화 특이적 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 포함한다.

Description

트랜스제닉 식물{TRANSGENIC PLANTS}
본 발명은 트랜스제닉 식물의 제조에 사용되는 유전자 작제물(genetic constructs)에 관한 것이다. 상기 작제물은 식물이 특히 잎 노화 동안 잎에서 트레오닌을 축적하도록 하는 능력을 가질 수 있다. 본 발명은 상기 작제물로 형질전환된 식물 세포, 및 트랜스제닉 식물 자체까지 확대된다. 본 발명은 또한 트랜스제닉 식물을 생성시키는 방법, 및 노화 식물에서 트레오닌의 농도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 작제물로 형질전환된 수확된 식물 잎, 예를 들어, 담배 잎, 및 상기 수확된 식물 잎을 포함하는 흡연 물품에 관한 것이다.
가열 건조 담배(flue-cured tobacco)의 향미를 증가시키는 일차 표적은 아미노산 트레오닌의 생성이다. 돌연변이 담배 식물의 잎에서의 높은 수준의 트레오닌 축적은 현저한 향미 및 방향의 이점을 제공한다. 그러나, 일반적으로 트레오닌 생성은 아스파테이트 족의 다른 아미노산, 즉 메티오닌, 리신 및 이소루신의 생성과 함께 빈틈없이 조절된다. 따라서, 트레오닌을 생성하는 생합성 경로의 변형이 향미 및 방향의 이점을 달성하는데 필요하다.
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 아스파테이트 키나아제(AK)는 아스파테이트를 트레오닌을 포함하는 아미노산으로 전환시키는 식물 생합성 경로의 첫번째 효소이다. 내생 아스파테이트 키나아제는 리신 및 트레오닌 둘 모두로부터의 피드백 억제에 의해 조절된다. 따라서, 피드백 억제에 적용되지 않는 아스파테이트 키나아제가 필요하다. 그러나, 이는 식물을 메티오닌 기아 상태가 되도록 하거나 아스파테이트에 의존하는 다른 경로가 제한되는 범위까지 아스파테이트의 수준을 고갈시키지 않고 달성되는 것이 필요하다.
이전에, 피드백 둔감성 아스파테이트 키나아제를 함유하고, 야생형 식물에 비해 트레오닌을 과생성할 수 있는 트랜스제닉 식물이 불량하게 성장하는 것으로 밝혀졌고, 상기 식물은 상기 돌연변이에 대해 동형접합인 경우 막대한 적응 비용(catastrophic fitness cost)을 초래하였다. 불량한 성장 및 적응 비용은 농부가 인지하는 식물의 성장에서의 임의의 이롭지 않은 변화이다. 명백히, 임의의 이러한 변화는 바람직하지 않다.
따라서, 본 발명의 발명자는 이상적으로 적응에 대한 임의의 비용 없이 상기 논의된 피드백 억제 루프를 극복시킴으로써 잎에서 트레오닌을 축적할 수 있는 트랜스제닉 식물을 제공하는 것에 착수하였다. 상기를 염두하고, 본 발명자는 다수의 유전자 작제물을 개발하였고, 여기서 존재시 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK) 효소를 엔코딩하는 유전자의 과다발현이 노화 잎에서 트레오닌 수준에 미치는 영향을 결정하기 위해 상기 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK) 효소를 엔코딩하는 유전자가 프로모터의 조절하에 위치되었다.
잎 노화는 세포가 세포 사멸 전에 명백한 대사 및 구조적 변화를 겪는 동안의 식물 발달기이다. 생리학적 및 유전적 연구는 노화가 고도로 조절되는 과정임을 나타낸다. 노화를 통한 잎의 발달은 엽록소의 손실, 및 엽록체의 분해로부터 발생하는 이후의 황색화에 의해 시각적으로 명백해진다. 상기 발달 단계의 특징인 잎 엽록소의 수준 감소는, 예를 들어, 용매 추출 및 분광광도 측정, 또는 엽록소 함량 계량기에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는 일정한 조건하에서 성장한 동일 식물에 대해 기록된 초기의 잎 엽록소 수준에 비해 감소된 잎 엽록소 수준이 노화를 나타낸다.
분자 연구는 노화가 유전자 발현에서의 변화와 관련된 것을 나타낸다. 광합성과 관련된 단백질을 엔코딩하는 mRNA의 수준은 노화 동안 감소하는 반면, 노화와 관련된 것으로 생각되는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 mRNA 수준은 증가한다. 노화는 노화 관련 유전자(SAG)로 공지된 유전자에 의해 조절되는 고도로 조직화된 과정이다. 잎 노화는 단백질, 핵산 및 막의 분해, 및 분해로부터 발생한 영양소의 이후의 식물의 다른 영역, 예를 들어, 발달 종자, 잎 또는 저장 기관으로의 운반을 포함한다. 식물 노화의 한 문제점은 노화 잎에 존재하는 많은 유용한 광물 및 영양소가 상기 잎에 남아 있을 것이고, 이에 따라 상기 잎이 사멸함에 따라 상기 광물 및 영양소가 실제 손실될 것이라는 점이다. 예를 들어, 노화 잎에 존재하는 트레오닌 뿐만 아니라 많은 다른 아미노산이, 이들이 사멸하는 잎으로부터 분리되지 않는 경우 소모될 것이다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 잎 특이적 완두콩 플라스토시아닌 프로모터의 사용에 의해 식물 내의 특정 위치에서 트레오닌 둔감성 AK를 발현하는 유전자 작제물을 이용한 작업과 관련된 실험을 수행하였다. 그러나, 본 발명자는 상기 트랜스제닉 식물이 연한 색을 띠고, 비대(thickened)해지고, 부서지기 쉽고, 띠와 같은(strap-like) 잎을 갖는 것을 발견하였다. 마디와 마디사이는 짧아지고, 성숙도가 증가함에 따라 갈색화를 나타내었고, 싹은 발달하지 않거나 기형이 되었다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 식물은 적응 비용을 극복할 수 없었다.
결과적으로, 본 발명자는 식물이 노화에 진입한 후에만 피드백 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK) 활성이 발현(SAG12 프로모터의 조절하)됨에 따라, 정상적으로 발달하도록 하는 일련의 유전자 작제물을 개발하였다. 본 발명자는 본 발명자가 개발한 작제물로 형질전환된 트랜스제닉 식물이 피드백 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK)가 스위치온(switched on)되기 전에 성숙(즉, 노화)으로 정상적으로 성장하도록 하는 것을 가능케 하는 상기 작제물이 놀랍게도 적응 비용을 극복할 수 있는 것을 관찰하였다.
따라서, 본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 노화 특이적 프로모터를 포함하는 유전자 작제물이 제공된다.
본 발명자는 이후에 식물을 형질전환시키기 위해 사용되는 첫번째 양태의 작제물을 형성시키기 위해 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열에 연결된 노화 특이적 프로모터를 사용하였다. 연구의 결과로서, 본 발명자는 놀랍게도 본 발명에 따른 작제물이 노화 잎에서 트레오닌의 수준을 증가시킨 것을 발견하였다. 더욱이, 노화 특이적 프로모터에 의해 조절되는 트랜스진(transgene)의 발현에 대한 이러한 일시적 제한은 트레오닌 축적 식물을 생성시키려는 이전의 시도에서 이전에 관찰된 적응 비용의 부정적 영향을 극복한다. 실시예에 제시된 바와 같이, 발생된 트랜스제닉 식물은 잎 노화 동안 야생형 수준보다 높은 트레오닌을 생성한다. 트레오닌 축적은 잎에서 발생하는 것으로 입증되었고, 이러한 증가된 수준은 상기 작제물을 함유하는 담배 잎의 향미에 긍정적으로 기여함으로써, 상기 잎으로부터 제조된 흡연 물품에 긍정적으로 기여하는 것으로 생각된다.
첫번째 양태의 유전자 작제물 내의 프로모터는 RNA 중합효소가 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열에 결합하도록 유도하여 전사를 개시시킬 수 있다.
"노화 특이적 프로모터(SAG)"는 노화 관련 유전자의 발현 조절과 관련된 임의의 프로모터일 수 있다. 그러므로, 상기 프로모터는 노화 조직에서 사실상 독점적으로 작동가능하게 연결된 코딩 서열(즉, 유전자)의 발현을 제한할 수 있다. 따라서, 노화 특이적 프로모터는 실질적으로 식물 조직이 노화를 겪는 경우에만 3' 단백질 코딩 영역의 발현이 발생하도록 하는 발달적 조절 방식으로 식물 조직에서 유전자 발현을 우선적으로 촉진할 수 있는 프로모터일 수 있다. 노화가 식물의 오래된 부분, 예를 들어, 오래된 잎에서 발생하는 경향이 있고, 식물의 어린 부분, 예를 들어, 종자에서는 발생하지 않는 경향이 있는 것이 인지될 것이다.
다수의 노화 관련 유전자를 발현하는 것으로 공지된 식물의 한 예는 아라비돕시스(Arabidopsis)이다. 그러므로, 첫번째 양태에 따른 작제물에 존재하는 프로모터는 아라비돕시스의 노화 관련 유전자로부터 분리될 수 있다. 문헌[Gepstein et al. (The Plant Journal, 2003, 36, 629-642)]에서는 모델로서 아라비돕시스를 이용하여 SAG 및 이의 프로모터의 상세한 연구를 수행하였다. 따라서, 유전자 작제물은 상기 논문에 기재된 SAG 중 임의의 SAG로부터의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 및 SAG18, 또는 이의 기능적 변이체 또는 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 프로모터는 SAG12 및 SAG13 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 숙련된 기술자에게 공지되는 SAG12 프로모터, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편이다(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319). SAG12 프로모터를 엔코딩하는 DNA 서열은 도 6에 도시되어 있고, 이는 하기와 같이 서열 목록 번호:1로 본원에서 언급된다:
Figure pct00001
따라서, 본 발명의 작제물에서의 프로모터는 실질적으로 서열 목록 번호:1에 기재된 누클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. SAG12 프로모터 서열은 US 5,689,042호에 기재된 바와 같이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 수득될 수 있다. 프로모터가 SAG12인 구체예에서, 프로모터가 서열 목록 번호:1의 염기 1-2093의 각각을 포함할 수 있음이 인지될 것이다. 그러나, 프로모터의 기능적 변이체 또는 기능적 단편이 또한 본 발명의 유전자 작제물에 사용될 수 있다.
"프로모터의 기능적 변이체 또는 기능적 단편"은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 코딩 영역의 발현을 개시하기에 기능적으로 충분한 프로모터의 유도체 또는 일부일 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 SAG12에 기초한 구체예에서, 숙련된 기술자는 작제물에서 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 유전자 발현을 개시하는데 있어서 서열 목록 번호:1이 변형될 수 있거나, SAG12 프로모터의 일부만이 요구될 수 있음을 인지할 것이다. SAG13, SAG101, SAG21 및 SAG18와 같은 다른 공지된 SAG 프로모터 중 임의의 SAG 프로모터의 누클레오티드 서열에 대해 유사한 변형이 이루어질 수 있다.
프로모터의 기능적 변이체 및 기능적 단편은, 전사효소가 추정 프로모터 영역에 결합한 후, 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드로의 코딩 서열의 전사를 발생시킬 수 있는지 아닌지의 여부를 평가함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 대안적으로, 이러한 기능적 변이체 및 단편은 코딩 영역과 회합되는 경우 프로모터에 대한 돌연변이유발을 수행하고, 유전자 발현이 발생할 수 있는지 아닌지의 여부를 평가함으로써 시험될 수 있다.
첫번째 양태의 유전자 작제물은 노화 동안 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 야기할 수 있다. 프로모터는 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 따라서, 유전자 작제물은 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK)를 엔코딩하는 하나 이상의 코딩 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 그러므로, 첫번째 구체예에서, 유전자 작제물은 노화 특이적 프로모터 및 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK)를 엔코딩하는 코딩 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
실시예 3-4에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 본 발명의 작제물을 이용한 식물의 형질전환에 의한 숙주 세포에서의 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 발현이 트레오닌 수준을 현저히 증가시킨 것을 발견하였다. 더욱이, 유리하게는 본 발명자는 작제물이 형질전환된 식물의 적응에 임의의 유해한 영향을 미치지 않은 것을 발견하였다.
도 1 및 2에 예시된 바와 같이, 식물에서 아미노산 리신, 트레오닌, 메티오닌 및 이소루신은 아스파테이트로부터 합성된다. 상기 경로에서 여러 피드백 억제 루프가 발견되었다. 상기 경로에서의 첫번째 효소인 아스파테이트 키나아제(AK)(EC 2.7.2.4)는 아스파테이트의 인산화를 촉매하여, ATP 가수분해 동반과 함께 3-아스파틸 포스페이트를 형성한다. 보다 고등한 식물은 일반적으로 2개 또는 3개 이상의 AK 동종효소를 지니는 것으로 생각된다. AK 활성은 최종 생성물 아미노산인 리신 및 트레오닌으로부터 양성 피드백을 겪는다. 하나 이상의 AK 동종효소는 트레오닌, 및 리신 및 S-아데노실 메티오닌에 의해 피드백 억제된다. 보리에서, AK 활성은 3개의 동종효소 피크로 분리될 수 있고, 이중 하나는 트레오닌에 의해 억제되고, 나머지 두개는 리신에 의해 억제된다. 추가 피드백 루프는 디히드로피콜리네이트 합성효소(DHPS) 및 호모세린 디새츄라아제(homoserine desaturase, HSD)와 같은 생합성 경로의 다른 효소에서 작용한다.
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 호모세린 데히드로게나아제(HSDH)로도 공지된 호모세린 디새츄라아제(HSD)(EC 1.1.1.3)는 트레오닌, 메티오닌 및 이소루신 생합성과 독특하게 관련된 첫번째 반응, 즉, 3-아스파르트산 세미알데히드의 호모세린으로의 전환을 촉매한다. 보다 고등한 식물은 일반적으로 적어도 두개 형태의 HSDH인 트레오닌 민감성 및 트레오닌 둔감성 형태를 갖는다. 정제된 HSDH 및 cDNA 클론의 특성규명은 HSDH 동종효소가 단일 단백질 상의 AK에 연결된 것을 나타내었고, 따라서 "AK:HSDH"로 표시하였다.
잎 트레오닌(Thr) 함량을 상승시키는 것은 합성 경로에 대한 음성 피드백 조절을 극복하는 것에 좌우된다. 예를 들어, E. 콜리(E.coli)로부터의 리신 둔감성 AK를 발현하는 트랜스제닉 담배가 생성되었고, 이는 트레오닌 축적 표현형을 나타내었다. 이러한 형질전환체에서, 세포질 또는 엽록체로 표적화된 박테리아 AK가 담배에서 35S의 조절하에 발현되었다. AK의 내생 활성은 리신 및 트레오닌 둘 모두에 의한 억제에 매우 민감하였다. 엽록체 특이적 트랜스진은 보다 높은 AK 활성을 발생시켰다. 엽록체 형태를 발현하는 식물에서 보다 높은 트레오닌 수준이 발견되었다. 그러나, 불량한 식물 성장이 인지되었고, 동형접합 식물은 주름진 윗잎(upper leave), 개화 지연 및 부분적 생식불능을 포함하는 적응 손실을 나타내었다.
아라비돕시스에서 수행된 작업(Paris et al, 2003, The Journal of Biological Chemistry, Vol 278, no. 7, pp5361-5366)은 AK:HSDH 효소의 조절 도메인이 공통의 루프-α 헬릭스-루프-β 가닥-루프-β 가닥 모티프에 의해 규정되는 두개의 상동성 서브-도메인을 함유하는 것을 입증하였다. 트레오닌 결합 부위를 해명하기 위해 부위 특이적 돌연변이유발이 이용되었다. 아스파테이트 키나아제-호모세린 데히드로게나아제의 단량체의 각각의 조절 도메인이 Gln443 및 Gln524에 의해 부분적으로 구성되는 2개의 동등하지 않은 트레오닌 결합 부위를 갖는 것으로 밝혀졌다. Gln443으로의 트레오닌의 결합은 AK 활성을 억제하고, 또한 Gln524로의 제 2의 트레오닌의 결합을 촉진하여, HSDH의 억제를 발생시킨다.
도 3은 트레오닌에 의한 AK-HSDH의 억제에 대한 제안 모델을 도시하며, 여기서 AK 및 HSDH의 활성 촉매 도메인은 사각형으로 제시되고, 억제된 촉매 도메인은 삼각형으로 제시된다. 첫번째 서브-도메인 상에서의 트레오닌(Thr) 결합은 (ⅰ) 다른 서브-도메인의 형태 변형, 및 (ⅱ) AK 억제를 발생시키는 AK 촉매 도메인의 형태 변형 둘 모두를 유도한다. 두번째 서브-도메인의 형태 변형은 HSDH 촉매 도메인의 형태 변형 및 HSDH 억제를 발생시키는 두번째 트레오닌의 결합을 유발시킨다.
알라닌으로의 상기 글루타민 잔기의 돌연변이는 효소의 트레오닌 억제가 효과가 없도록 만든다. 돌연변이는 HSDH 활성의 동역학에 영향을 미치지 않고, 트레오닌에 대한 이의 민감성만 영향을 미치고, AK 동역학은 단지 약간 변형된다. 그러나, 불운하게도, 아라비돕시스로부터의 피드백 둔감성 AK:HSDH가 도입되고 발현된 트랜스제닉 식물이 또한 적응 비용을 발생시킨다.
대조적으로, 본 발명의 유전자 작제물은 노화 동안 트레오닌 둔감성 아스파테이트 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 야기시키고, 트랜스제닉 식물의 적응에 대한 임의의 유해한 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 첫번째 양태의 유전자 작제물은 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK), 또는 트레오닌 둔감성 이기능성 아스파테이트 키나아제-호모세린 데히드로게나아제 효소(AK-HSDH), 또는 이의 기능적 변이체 또는 기능적 단편을 엔코딩할 수 있다.
트레오닌 둔감성 AK 또는 이기능성 AK-HSDH, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편은 임의의 적합한 공급원, 예를 들어, 식물로부터 유래될 수 있다. 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열은 아라비돕시스 종, 제아(Zea) 종, 플라베리아(Flaveria) 종, 또는 클레오메(Cleome) 종으로부터 유래될 수 있다. 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 제아 마이스(Zea mays), 플라베리아 트리네르비아(Flaveria trinervia), 플라베리아 비덴티스(Flaveria bidentis), 플라베리아 브로우니(Flaveria brownie) 또는 클레오메 기난드라(Cleome gynandra)로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 효소의 코딩 서열은 아라비돕시스 종, 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다.
특히 바람직한 트레오닌 둔감성 효소는 트레오닌 결합 부위 중 하나 이상이 변경된 돌연변이된 AK-HSDH이다. 바람직하게는, Gln443 및 Gln524에 의해 부분적으로 구성된 트레오닌 결합 부위 중 하나 또는 둘 모두가 돌연변이된다. 예를 들어, 아라비돕시스 AK-HSDH는 Gln443 및/또는 Gln524에서 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 아라비돕시스 AK-HSDH는 Gln443 및 Gln524에서 돌연변이된다. 본 발명에 사용된 돌연변이된 AK:HSDH 유전자는 도 7에 도시되어 있고, 여기서 돌연변이된 염기에는 밑줄이 있다.
따라서, 아라비돕시스 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 한 구체예(즉, Gln443Ala 단일 돌연변이)를 엔코딩하는 DNA 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:2로 본원에 제공된다:
Figure pct00002
서열 목록 번호:2(즉, Q443A)에서, 강조된 GCT는 알라닌을 엔코딩하는 돌연변이된 Gln443에 해당하고, 강조된 CAR은 야생형 Gln524에 해당하고, 여기서 R은 G 또는 A일 수 있다.
아라비돕시스 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 또 다른 구체예(즉, Gln524Ala 단일 돌연변이)를 엔코딩하는 DNA 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:3으로 본원에 제공된다:
Figure pct00003
서열 목록 번호:3(즉, Q524A)에서, 강조된 GCT는 알라닌을 엔코딩하는 돌연변이된 Gln524에 해당하고, 강조된 CAR은 야생형 Gln443에 해당하고, 여기서 R은 G 또는 A일 수 있다.
아라비돕시스 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 또 다른 구체예(즉, Gln443Ala; Gln524Ala 이중 돌연변이)를 엔코딩하는 DNA 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:4로 본원에 제공된다:
Figure pct00004
서열 목록 번호:4(즉, Q443A; Q524A)에서, 강조된 GCT는 알라닌을 엔코딩하는 돌연변이된 Gln443 및 Gln524에 해당한다.
따라서, 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열은 실질적으로 서열 목록 번호:2, 3 또는 4 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 한 구체예(즉, Gln443Ala 단일 돌연변이)의 폴리펩티드 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:5로 본원에 제공된다:
Figure pct00005
서열 목록 번호:5에서, 위치 443의 돌연변이 알라닌(A), 및 위치 524의 야생형 글루타민(Q)이 강조되어 있다.
트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 또 다른 구체예(즉, Gln524Ala 단일 돌연변이)의 폴리펩티드 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:6으로 본원에 제공된다:
Figure pct00006
서열 목록 번호:6에서, 위치 524의 돌연변이 알라닌(A), 및 위치 443의 야생형 글루타민(Q)이 강조되어 있다.
트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제의 또 다른 구체예(즉, Gln443Ala; Gln524Ala 이중 돌연변이)의 폴리펩티드 서열이 하기와 같이 서열 목록 번호:7로 본원에 제공된다:
Figure pct00007
서열 목록 번호:7에서, 위치 443 및 524의 돌연변이 알라닌(A)이 강조되어 있다.
따라서, 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드 서열은 실질적으로 서열 목록 번호:5, 6 또는 7 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현에 적합할 수 있는 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본 발명의 유전자 작제물은 벡터에 통합되지 않고 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자일 수 있는 유전자 작제물은 리포솜 또는 바이러스 입자 내에 통합될 수 있다. 대안적으로, 정제된 핵산 분자(예를 들어, 히스톤이 없는 DNA, 또는 네이키드(naked) DNA)는 적합한 수단, 예를 들어, 직접적인 세포내이입 흡수에 의해 숙주 세포로 직접 삽입될 수 있다. 유전자 작제물은 트랜스펙션, 감염, 미세주입, 세포 융합, 원형질체 융합 또는 탄도 폭격(ballistic bombardment)에 의해 숙주 피검체(예를 들어, 식물)의 세포에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 유전자 작제물은 입자총(particle gun)을 이용하여 숙주 세포에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 유전자 작제물은 적합한 숙주 세포에서의 발현을 위해 재조합 벡터 내에 포함될 수 있다.
그러므로, 두번째 양태에서, 첫번째 양태에 따른 유전자 작제물을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
재조합 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지일 수 있다. 이러한 재조합 벡터는 첫번째 양태의 유전자 작제물을 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 여기서 발현 카세트를 복제시키는데 매우 유용하다. 숙련된 기술자는 본 발명의 유전자 작제물이 발현을 위해 많은 유형의 백본 벡터와 조합될 수 있음을 인지할 것이다. 백본 벡터는 이원 벡터(binary vector), 예를 들어, E. 콜리아그로박테리움 투메파시엔스 둘 모두에서 복제할 수 있는 이원 벡터일 수 있다. 예를 들어, 적합한 벡터는 pBIN 플라스미드, 예를 들어, pBIN19일 수 있다. 그러나, 바람직한 백본 벡터는 pBINPLUS를 기초로 하고(F. A. van Engelen et al . Transgenic Research (1995) A, 288-290), SAG12 프로모터를 지니는 BNP1380000001이다. 이러한 벡터의 구체예가 도 16에 도시되어 있다.
재조합 벡터는 프로모터 외에 다양한 다른 기능적 요소(예를 들어, 노화 관련 프로모터), 및 하나 이상의 코딩 서열(돌연변이된 AK-HSDH를 엔코딩함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 숙주 세포의 세포질에서 자율적으로 복제하도록 설계될 수 있다. 이러한 경우, DNA 복제를 유도하거나 조절하는 요소가 재조합 벡터에서 요구될 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터는 숙주 세포의 유전체로 통합되도록 설계될 수 있다. 이러한 경우, 표적화된 통합을 촉진(예를 들어, 상동 재조합에 의함)하는 DNA 서열이 예견된다.
재조합 벡터는 또한 클로닝 과정에서 선택성 마커로 사용될 수 있는, 즉, 트랜스펙션되거나 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하고, 이종성 DNA를 포함하는 벡터를 지니는 세포의 선택을 가능하게 하는 유전자를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, 선택성 마커 유전자는 관심 유전자를 함유하는 벡터와 함께 동시에 사용되는 상이한 벡터에 존재할 수 있다. 벡터는 또한 코딩 서열의 조절 발현과 관련되거나, 숙주 세포의 특정 부분, 예를 들어, 엽록체로 발현된 폴리펩티드를 표적화하기 위한 DNA를 포함할 수 있다. 그러므로, 두번째 양태의 벡터는 선택성 마커 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자); 폴리펩티드 종료 신호; 및 단백질 표적화 서열(예를 들어, 엽록체 전이 펩티드)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 요소를 포함할 수 있다.
적합한 마커 유전자의 예는 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 카나마이신, 제네티신(G418) 및 히그로마이신(npt-Ⅱ, hyg-B)에 내성을 부여하는 유전자; 제초제 내성 유전자, 예를 들어, 포스피노트리신 및 술폰아미드 기반의 제초제에 내성을 부여하는 유전자(각각, barsuⅠ; EP-A-242246, EP-A-0249637); 및 스크리닝가능한 마커, 예를 들어, 베타-글루쿠로니다아제(GB2197653), 루시퍼라아제 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함한다.
마커 유전자는 세포에서 발현을 가능하게 함으로써 식물 발달의 임의의 단계에서 마커를 함유하는 세포 또는 조직의 선택을 가능하게 하는, 종자에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 제 2의 프로모터(노화 관련 프로모터이거나 아닐 수 있음)에 의해 조절될 수 있다. 적합한 제 2의 프로모터는 아그로박테리움의 노팔린 합성효소 유전자의 프로모터 및 35S 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 전사체를 엔코딩하는 유전자로부터 유래된 프로모터이다. 그러나, 임의의 다른 적합한 제 2의 프로모터가 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물의 다양한 구체예가 실시예 2에 기재되고, 하기와 같이 요약될 수 있는 적합한 클로닝 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 야생형 AK-HSDH를 엔코딩하는 유전자는 적합한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 유전체 또는 cDNA 주형으로부터 증폭될 수 있다. 야생형 AK-HSDH 유전자의 증폭에 적합한 프라이머는 서열 목록 번호:8 및/또는 서열 목록 번호:9일 수 있다. PCR 생성물은 아가로오스 젤 전기영동을 이용하여 시험될 수 있다. 이후, Gln443Ala 및 Gln524Ala 단일 돌연변이 또는 이중 돌연변이를 생성시키기 위해 위치 443 및/또는 524에서 야생형 코돈을 돌연변이시키기 위해 적합한 프라이머 쌍을 이용한 부위 특이적 돌연변이유발이 수행될 수 있다. 예를 들어, Gln443에 대한 코돈을 변경시키기에 적합한 프라이머는 서열 목록 번호:10 및/또는 서열 목록 번호:11일 수 있다. Gln524에 대한 코돈을 변경시키기에 적합한 프라이머는 서열 목록 번호:12 및/또는 서열 목록 번호:13일 수 있다.
이후, 두개의 단일한 돌연변이 중 어느 하나 또는 이중 돌연변이를 엔코딩하는 PCR 생성물은 클로닝에 적합한 벡터, 예를 들어, 인비트로겐(Invitrogen)사에서 수득가능한 상표명 pCR4 Blunt-TOPO 벡터로 시판되는 벡터에 라이게이션될 수 있다. 이후, PCR 생성물을 지닌 벡터는 적합한 숙주, 예를 들어, E. 콜리에서 성장될 수 있다. 이후, E. 콜리 집락은 적합한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 스크리닝될 수 있고, 정확한 제한 효소 절단 패턴을 나타내는 플라스미드 내의 삽입물이 적합한 프라이머를 이용하여 서열분석될 수 있다.
TOPO-cDNA(AK-HSDH)를 지닌 E. 콜리 집락이 배양되어 적합한 양의 플라스미드를 생성할 수 있고, 이는 이후에 정제될 수 있다. 이후, 플라스미드는 분해되어 돌연변이 AK-HSDH를 엔코딩하는 DNA 단편을 방출할 수 있고, 이는 이후 적합한 프로모터, 예를 들어, SAG 프로모터(바람직하게는, SAG12)를 지닌 벡터, 예를 들어, pBNP 플라스미드로 클로닝될 수 있다. 생성된 플라스미드는 pBNP138-0453-001로 명명되었다. 두번째 양태에 따른 벡터의 구체예는 실질적으로 도 15에 기재된 바와 같을 수 있다.
세번째 양태에서, (ⅰ) 첫번째 양태의 유전자 작제물, 또는 두번째 양태의 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고, (ⅱ) 형질전환된 세포로부터 식물을 재생성시키는 것을 포함하는, 동일 조건하에서 배양된 상응하는 야생형 식물보다 높은 수준의 트레오닌을 잎에 축적하는 트랜스제닉 식물을 생성시키는 방법이 제공된다.
식물 잎 내의 트레오닌의 수준, 및 식물 성장 속도를 결정하는 방법이 실시예 1에 기재되어 있다. 세번째 양태의 방법은 첫번째 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 두번째 양태에 따른 벡터로 시험 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다. 유전자 작제물 또는 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다.
네번째 양태에서, 첫번째 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 두번째 양태에 따른 재조합 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
세포는 식물 세포일 수 있다. 본 발명자는 숙주 세포에서의 노화 특이적 프로모터의 조절하에서의 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제를 발현시키는 것이 놀랍게도 적응을 손상시키지 않고 노화 잎에서 트레오닌 농도를 증가시키는데 효과적임을 관찰함에 따라, 네번째 양태의 세포가 첫번째 양태의 하나 이상의 작제물, 또는 두번째 양태의 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
세포는 공지된 기술을 이용하여 본 발명에 따른 유전자 작제물 또는 벡터로 형질전환될 수 있다. 숙주 세포로 유전자 작제물을 도입시키는데 적합한 수단은, 예를 들어, EP-A-0116718 및 EP-A-0270822에 기재된 바와 같이 당 분야에 공지된 절차에 의해 아그로박테리움에 의해 전달되는 무력화된(disarmed) Ti-플라스미드 벡터의 사용을 포함할 수 있다. 추가 방법은 먼저 세포벽을 제거하고, 핵산을 도입시킨 후, 세포벽을 재형성시키는 것을 포함하는 식물 원형질체를 형질전환시키는 것일 수 있다. 형질전환된 세포는 이후 식물에서 성장될 수 있다.
다섯번째 양태에서, 첫번째 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 두번째 양태에 따른 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물이 제공된다.
다섯번째 양태에 따른 트랜스제닉 식물은 브라시카씨에(Brassicaceae) 과, 예를 들어, 브라시카 종을 포함할 수 있다. 식물은 브라시카 나푸스(Brassica napus)(평지씨기름(oilseed rape))일 수 있다.
다섯번째 양태에 따른 트랜스제닉 식물의 추가 예는 포알레스(Poales) 과, 예를 들어, 트리티씨에(Triticeae) 종을 포함한다. 상기 식물은 트리티쿰(Triticum) 종(밀)일 수 있다. 밀에서 곡물 단백질 함량을 증가시키는 것을 상기 밀을 포함하는 식품, 예를 들어, 빵의 부피를 증가시킬 수 있다.
다섯번째 양태에 따른 적합한 트랜스제닉 식물의 추가 예는, 예를 들어, 흰독말풀(jimson weed), 가지(eggplant), 맨드레이크(mandrake), 벨라도나(deadly nightshade, belladonna), 고추(파프리카, 칠리 페퍼), 감자 및 담배를 포함하는 솔라나씨에(Solanaceae) 과의 식물을 포함한다. 솔라나씨에의 적합한 속의 한 예는 니코티아나(Nicotiana)이다. 니코티아나의 적합한 종은 담배 식물, 또는 간단히 담배로 언급될 수 있다. 첫번째 양태의 유전자 작제물, 또는 두번째 양태의 벡터로 식물을 형질전환시키기 위한 다양한 방법은 공지되어 있고, 본 발명에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 담배는 하기와 같이 형질전환될 수 있다. 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)은 본질적으로 문헌[Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)]에 기재된 바와 같은 잎 절편 공동배양 방법을 이용하여 형질전환된다. 가장 어린 두개의 발달된 잎이 7주령의 담배 식물로부터 수득될 수 있고, 10분 동안 8% 도메스토스™(Domestos™)에서 표면 멸균될 수 있고, 멸균 증류수로 6회 세척될 수 있다. 잎 절편은 넘버 6 콜크 보러(cork borer)를 이용하여 절단될 수 있고, 약 2분 동안 적절한 이원 벡터(본 발명에 따른 이원 벡터)를 함유하는 아그로박테리움 현탁액에 배치될 수 있다. 잎 절편은 2개 시트의 멸균 필터 종이 사이에서 가볍게 블로팅(blotting)될 수 있다. 10개의 잎 절편이 LS 3% 수크로오스 + 2μM BAP + 0.2μM NAA 플레이트 상에 배치될 수 있고, 이는 이후에 성장실에서 2일 동안 인큐베이션될 수 있다.
잎 절편은 500 g/l 크라포란(claforan) 및 100 g/l 카나마이신이 보충된 LS + 3% 수크로오스 + 2μM BAP + 0.2 μM NAA의 플레이트로 옮겨질 수 있다. 잎 절편은 2주 후에 상기 배지의 새로운 플레이트로 옮겨질 수 있다. 추가 2주 후, 잎 절편은 500 mg/l 크라포란 및 100 mg/l 카나마이신이 보충된 LS + 3% 수크로오스 + 0.5μM BAP를 함유하는 플레이트로 옮겨질 수 있다. 잎 절편은 2주마다 새로운 배지로 옮겨질 수 있다. 새싹이 출현함에 따라, 이들은 절제되고, 500 mg/l 크라포란이 보충된 LS +3% 수크로오스의 배양통(jar)으로 옮겨질 수 있다. 배양통에서의 새싹은 약 4주 후에 LS + 3% 수크로오스 + 250 mg/l 크라포란으로 옮겨질 수 있다. 추가 3-4주 후, 식물은 LS + 3% 수크로오스(항생제 없음)로 옮겨질 수 있고, 발근될 수 있다. 식물이 발근된 후, 이들은 온실 내의 토양으로 옮겨질 수 있다.
여섯번째 양태에서, 다섯번째 양태에 따른 트랜스제닉 식물로부터 수득가능한 식물 증식 생성물이 제공된다.
"식물 증식 생성물"은 식물로부터 수득된 임의의 식물 물질일 수 있고, 이로부터 추가 식물이 생성될 수 있다. 적합하게는, 식물 증식 생성물은 종자일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 트랜스제닉 식물로부터 수확된 잎을 포함하며, 상기 수확된 잎은 동일 조건하에서 배양된 상응하는 야생형 식물로부터 수확된 잎보다 높은 수준의 트레오닌을 함유한다.
따라서, 일곱번째 양태에서, 동일 조건하에서 배양된 야생형 식물로부터 수확된 잎 내의 상응하는 트레오닌의 수준보다 높은 수준의 트레오닌을 함유하는 수확된 잎이 제공되며, 상기 잎은 다섯번째 양태에 따른 트랜스제닉 식물로부터 수확되거나, 세번째 양태에 따른 방법에 의해 생성된다.
본 발명의 여덞번째 양태는 돌연변이 담배 식물로부터 수득된 트레오닌 부화(enriched) 담배를 포함하는 흡연 물품을 제공하며, 상기 돌연변이는 노화 잎에서 트레오닌을 과생성할 수 있다.
유리하고, 바람직하게는, 돌연변이 담배 식물은 본 발명의 유전자 작제물 또는 벡터로 형질전환될 수 있다. 흡연 물품은 궐련, 엽궐련, 소형 엽궐련, 또는 말아 피우는 담배(rolling tobacco) 등일 수 있다.
트레오닌 감소 담배는 트레오닌 농도가 동일 조건하에서 배양된 야생형 식물에서의 상응하는 농도보다 높은 담배를 포함할 수 있다. 이러한 흡연 물품은 본 발명의 첫번째 양태에 따른 유전자 작제물, 또는 두번째 양태에 따른 벡터로 형질전환될 수 있는 돌연변이 담배 식물로부터 수득된 담배를 포함할 수 있다. 트레오닌 부화 담배의 향미 및 방향은 개선된다.
본 발명이 식물 적응을 손상시키지 않고 상응하는 야생형 수준보다 트레오닌 수준을 식물 잎에서 증가시키는 방법을 제공하는 것이 인지될 것이며, 상기 방법은 잎 노화의 개시 후에 트레오닌의 증가된 생성을 달성하기 위해 식물 물질대사를 변경시키는 것을 포함한다.
그러므로, 본 발명의 아홉번째 양태에서, 식물 적응을 손상시키지 않고 상응하는 야생형 수준보다 트레오닌 수준을 식물 잎에서 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 잎 노화의 개시 후에 트레오닌의 증가된 생성을 달성하기 위해 식물 물질대사를 변경시키는 것을 포함한다.
바람직하고, 유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 발생되는 식물의 건강 또는 적응을 손상시키지 않는다. 바람직하게는, 상기 방법은 시험 식물, 바람직하게는 이의 잎을 첫번재 양태의 유전자 작제물, 또는 두번째 양태의 벡터로 형질전환시키는 것을 포함한다.
실시예 4에 기재된 바와 같이, 본 발명의 형질전환된 식물에서 트레오닌 수준을 측정하고, 노화 잎에서 트레오닌 농도가 증가하는 것을 나타내는 것 외에, 본 발명자는 또한 트랜스제닉 식물에서 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 및 히스티딘을 포함하는 다른 아미노산의 농도를 측정하였다. 도 10-14에 도시된 바와 같이, 상기 아미노산 각각의 농도는 대조군과 동등하거나 심지어 더 높았고, 이는 트랜스제닉 식물의 적응이 손상되지 않은 것을 강하게 암시한다. 따라서, 요약하면, 본 발명의 작제물은 적합하게는 트랜스제닉 식물의 적응에 부정적으로 영향을 미치지 않고 노화 잎에서 트레오닌의 수준을 증가시키는데 사용될 수 있다.
본 발명이 본원에 언급된 서열 중 임의의 서열의 아미노산 또는 핵산 서열을 실질적으로 포함하는 임의의 핵산 또는 펩티드 또는 이의 변이체, 유도체 또는 유사체, 예를 들어, 기능적 변이체 또는 기능적 단편으로 확대되는 것이 인지될 것이다. 용어 "실질적인 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열", "기능적 변이체" 및 "기능적 단편"은 본원에 언급된 서열 중 어느 하나의 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열과 40% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 서열 목록 번호:1로 확인되는 프로모터(즉, SAG12 프로모터) 또는 서열 목록 번호:2, 3 또는 4로 확인되는 유전자(AK-HSDH 효소의 다양한 구체예를 엔코딩함)와 40%의 동일성, 또는 서열 목록 번호:5, 6 또는 7로 확인되는 폴리펩티드(즉, 돌연변이 AK-HSDH 효소의 다양한 구체예)와 40%의 동일성을 갖는 서열 등일 수 있다.
본원에 언급된 서열 중 임의의 서열과 65% 초과, 더욱 바람직하게는 70% 초과, 더욱 더 바람직하게는 75% 초과, 더욱 더 바람직하게는 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열이 또한 예견된다. 바람직하게는, 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열은 본원에 언급된 서열 중 임의의 서열과 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 92% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 본원에 언급된 서열 중 임의의 서열과 99% 이상의 동일성을 갖는다.
숙련된 기술자는 두개의 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열 사이에서 동일성 백분율을 계산하는 방법을 인지할 것이다. 두개의 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위해, 먼저 두개 서열의 정렬이 준비된 후, 서열 동일성 값의 계산이 후속되어야 한다. 두개 서열에 대한 동일성 백분율은, (ⅰ) 서열을 정렬하는데 사용되는 방법, 예를 들어, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(다양한 프로그램으로 이행됨), 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ⅱ) 정렬 방법에 의해 사용되는 파라미터, 예를 들어, 국소 대 전역 정렬, 사용되는 쌍-스코어 매트릭스(예를 들어, BLOSUM62, PAM250, Gonnet 등), 및 갭-페널티, 예를 들어, 함수 형태 및 상수에 따라 다양한 값을 취할 수 있다.
정렬이 이루어진 후, 두개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 많은 다양한 방법이 존재한다. 예를 들어, 동일성의 수를, (ⅰ) 가장 짧은 서열의 길이; (ⅱ) 정렬의 길이; (ⅲ) 서열의 평균 길이; (ⅳ) 비-갭 위치의 수; 또는 (ⅳ) 오버행을 제외한 동일한 위치의 수로 나눌 수 있다. 더욱이, 동일성 백분율이 또한 매우 길이 의존적임이 인지될 것이다. 따라서, 서열의 쌍이 짧을수록 보다 높은 서열 동일성이 우연히 발생할 것이 예상될 수 있다.
그러므로, 단백질 또는 DNA 서열의 정확한 정렬이 복잡한 과정임이 인지될 것이다. 대중적인 다수 정렬 프로그램 ClustalW(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)가 본 발명에 따른 단백질 또는 DNA의 다수의 정렬을 발생시키기 위한 바람직한 수단이다. ClustalW에 대한 적합한 파라미터는 하기와 같을 수 있다: DNA 정렬을 위해, Gap Open Penalty = 15.0, Gap Extension Penalty = 6.66, 및 Matrix = Identity. 단백질 정렬을 위해, Gap Open Penalty = 10.0, Gap Extension Penalty = 0.2, 및 Matrix = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬을 위해, ENDGAP = -1, 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적 서열 정렬을 위해 상기 파라미터 및 다른 파라미터를 변경시키는 것이 필요할 수 있음을 인지할 것이다.
바람직하게는, 두개 아미노산/폴리누클레오티드/폴리펩티드 서열 사이의 동일성 백분율의 계산은 이후 (N/T)*100과 같은 정렬로부터 계산될 수 있고, 여기서 N은 서열이 동일한 잔기를 공유하는 위치의 수이고, T는 갭을 포함하나 오버행은 배제하는 비교된 위치의 전체 수이다. 그러므로, 두개의 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하기 위한 가장 바람직한 방법은, (ⅰ) 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 파라미터의 적합한 세트를 이용한 ClustalW 프로그램을 이용하여 서열 정렬을 준비하는 것; 및 (ⅱ) 서열 동일성 = (N/T)*100의 식에 N 및 T의 값을 삽입하는 것을 포함한다.
유사한 서열을 확인하기 위한 대안적 방법은 당업자에게 널리 공지될 것이다. 예를 들어, 실질적으로 유사한 누클레오티드 서열은 엄격한 조건하에서 서열 목록 번호:1, 2, 3 또는 4에 도시된 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화되는 서열에 의해 엔코딩될 것이다. 엄격한 조건에 관하여, 본 발명자는 누클레오티드가 약 45℃에서 3x 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC) 중에서 필터 결합된 DNA 또는 RNA에 하이브리드화된 후, 약 20-65℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척되는 것을 의미한다. 대안적으로, 실질적으로 유사한 폴리펩티드는 서열 목록 번호:5, 6 또는 7에 도시된 서열과 1개 이상이나, 5, 10, 20, 50 또는 100개 미만의 아미노산이 상이할 수 있다.
유전 부호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 임의의 핵산 서열이 엔코딩되는 단백질의 서열에 실질적으로 영향을 미치지 않고 변경되거나 변형되어, 기능적 변이체를 제공할 수 있음이 명백하다. 적합한 누클레오티드 변이체는 서열 내에서 동일한 아미노산을 엔코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 서열을 가짐에 따라 침묵(silent) 변화를 발생시키는 변이체이다. 다른 적합한 변이체는 상동성 누클레오티드 서열을 가지나, 치환되는 아미노산과 유사한 생물리학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산을 엔코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되는 서열 전부 또는 일부를 포함하여 보존성 변화를 발생시키는 변이체이다. 예를 들어, 작은 비극성의 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 큰 비극성의 소수성 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성으로 하전된(염기성) 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다. 음성으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 따라서, 아미노산이 유사한 생물리학적 특성을 갖는 아미노산으로 대체될 수 있음이 인지될 것이고, 숙련된 기술자는 상기 아미노산을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 알 것이다.
본원에 기재된 특징 모두(임의의 수반된 청구항, 초록 및 도면을 포함함), 및/또는 이에 기재된 임의의 방법 또는 과정의 단계 모두는 상기 특징 및/또는 단계의 적어도 일부가 상호 양립할 수 없는 조합을 제외한 임의의 조합으로 상기 양태 중 임의의 양태와 조합될 수 있다.
본 발명의 보다 나은 이해, 및 본 발명의 구체예가 수행되는 방법을 나타내기 위해, 예를 들어, 하기 수반되는 도면이 참조될 수 있다:
도 1은 아스파테이트가 다른 아미노산으로 전환되는 식물 생합성 경로의 일부를 도시한다. 관련된 효소는 아스파테이트 키나아제(AK) 및 호모세린 디새츄라아제(HSDH)이다;
도 2는 아스파테이트가 트레오닌을 포함하는 다른 아미노산으로 전환되는 식물 생합성 경로를 도시한다. 상기 경로에서의 첫번째 효소 활성은 아스파테이트-키나아제(AK)이다. 식물은 이기능성 효소 아스파테이트-키나아제:호모세린 데히드로게나아제(AK-HSDH)를 생성할 수 있다. 생합성 경로는 최종 생성물에 의한 양성 및 음성 피드백을 수반하여 빈틈없이 조절된다;
도 3은 아라비돕시스에서의 트레오닌에 의한 아스파테이트 키나아제-호모세린 데히드로게나아제의 알로스테리 조절에 대한 모델을 도시한다(after Paris et al (2003));
도 4는 돌연변이된 이기능성 아스파테이트 키나아제 호모세린 디새츄라아제 효소를 개략적으로 도시한다;
도 5는 실시예 2의 잎 절편에서 검출된 트레오닌의 수준을 도시한다;
도 6은 SAG12 프로모터의 서열을 도시한다;
도 7은 돌연변이된 아스파테이트 키나아제 호모세린 디새츄라아제 효소의 서열을 도시한다. 트레오닌에 의한 피드백 억제를 극복하는데 필요한 돌연변이된 염기가 명암지고, 밑줄이 그어져 있다;
도 8은 트레오닌 둔감성 AK-HSDH가 실시예 3에 기재된 노화 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 트랜스제닉 식물로부터 수거된 잎 절편 내의 트레오닌의 양을 도시한다;
도 9는 실지 시험(field trial)에 의해 성장된 건조 잎에서의 트레오닌의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 10은 실지 시험에 의해 성장된 건조 잎에서의 글루타민의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 11은 실지 시험에 의해 성장된 건조 잎에서의 글루탐산의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 12는 실지 시험에 의해 성장된 건조 잎에서의 아스파라긴의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 13은 실지 시험에 의해 성장된 건조 잎에서의 아스파르트산의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 14는 실지 시험에 의해 성장된 건조 잎에서의 히스티딘의 함량을 나타내는 막대 차트이다;
도 15는 본 발명에 따른 벡터의 한 구체예의 플라스미드 맵이다;
도 16은 본 발명에 따라 사용되는 백본 벡터의 플라스미드 맵이다.
실시예
실시예 2에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 변형된 피드백 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK:HSDH)가 잎 특이적 프로모터의 조절하에서 발현되는 트랜스제닉 식물을 개발하였다. 그러나, 본 발명자는 잎으로의 변형된 AK:HSDH의 국소화된 발현이 트랜스제닉 식물에 대한 적응 비용을 발생시킨 것을 발견하였다. 따라서, 실시예 3-4에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 이후 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드(AK:HSDH)를 엔코딩하는 코딩 서열에 연결된 노화 특이적 프로모터(SAG12)를 사용하였다. 생성된 트랜스제닉 식물은 식물의 적응을 손상시키지 않고 잎 노화 동안 야생형 수준 보다 높은 트레오닌을 생성하였다.
실시예 1 - 잎에서의 트레오닌 수준에 대한 시험
트레오닌 수준에 대한 시험을 녹색 또는 황색화 잎에서 수행하였다. 잎 절편을 수득하고, 분석에 사용하였고, 측정은 잎 절편당 트레오닌의 양(즉, thr의 양/잎 영역)을 기초로 하거나, 상층액 내의 단백질의 양(즉, thr의 양/단백질 mg)과 관련되었다. 잎 절편을 고정된 부피의 물과 함께 짓이기고, 불용성 잎 부스러기를 침전시키기 위해 원심분리시켰다. 상기 과정으로부터의 상층액을 이후 페노메넥스 이지패스트 키트(Phenomenex EZfaast Kit)를 이용하여 가공하였다. 이는 1c/ms 설정을 이용하여 정량될 수 있도록 추출물 내의 아미노산을 유도체화시키는데 사용되는 전매 키트이다.
보정은 정량되는 각각의 아미노산에 대한 외부 표준에 의해 이루어지고, 유도체화 단계의 효율은 내부 표준 과정의 포함에 의해 샘플 사이에 표준화된다. 크로마토그램은 피크 영역에 의해 평가되고, 이는 1c/ms 소프트웨에서의 적분 알고리듬을 이용한 농도와 관련된다. 소프트웨어 또는 작업자에 의해 피크가 확실히 확인될 수 없는 경우, 이는 "검출 하한"으로 언급된다. 이는 빈-벡터(empty-vector) 대조군의 일부 및 다음 세대의 무분리(segregating null) 식물의 일부에 대한 경우에서 발견되었다.
실시예 2 - 잎 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 피드백 둔감성 AK:HSDH를 갖는 트랜스제닉 식물
본 발명자는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 이작용성 AK:HSDH 야생형 서열에 대해 부위 특이적 돌연변이유발을 수행하였다(At4g19710). 그러므로, 하기 프라이머를 이용한 PCR에 의해 아라비돕시스 탈리아나로부터 잎 특이적 cDNA 라이브러리로부터 야생형 서열을 먼저 분리시켰다:
Figure pct00008
야생형 서열을 하기 3개의 방법 중 하나로 변형시켰다: Thr 결합에 의한 조절을 금지하기 위해, (ⅰ) AK 도메인만을 돌연변이시키거나, (ⅱ) HSDH 도메인을 돌연변이시키거나, (ⅲ) 상기 둘 모두의 도메인을 돌연변이시켰다. 특정 돌연변이는 효소 조절 도메인 내의 Gln443 & Gln524에 위치하였고, 둘 모두를 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 알라닌으로 돌연변이시켰다(Paris et al (2003), "Mechanism of control of Arabidopsis thaliana aspartate kinase-homoserine dehydrogenase by threonine". J. Biol . Chem 278:5361-5366. 및 Frankard et al (1992), "Two feedback-insensitive enzymes of the aspartate pathway in Nicotiana sylvestris" Plant Physiol 99:1285-1293).
스트라타진®(Stratagene®)사의 퀵체인지®(QuikChange®) 부위 특이적 돌연변이유발 키트(Catalog #200518)를 상기 절차에 사용하였다. Glu443을 코딩하는 코돈을 변경시키기 위해, 부위 특이적 돌연변이유발 반응에서 하기 프라이머를 사용하였다:
Figure pct00009
Gln524에 대해, 하기 프라이머쌍을 사용하였다:
Figure pct00010
상기 3개의 돌연변이 서열을 니코티아나 타바쿰 식물을 형질전환시키기 위해 개별적으로 사용하였고, 야생형 아라비돕시스 AK:HSDH에도 마찬가지로 사용하였다. 모든 경우에서, 관심 유전자를 잎 특이적 완두-플라스토시아닌 프로모터의 조절하에서 발현시켰다. 모든 집단의 식물을 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 생성시키고, 영국 캠브리지에서 온실 조건하에서 성장시켰다. 각각의 샘플 내의 자유 아미노산을 추출하고, 유도체화시키기 위해 이지패스트(EZfaast) 아미노산 키트(Phenomenex®)를 사용하였다. 이후, LC/MS에 의해 정량화를 수행하였다.
결과는 도 5 및 표 1에 제시되어 있다. 도 5에서, AK 도메인만이 돌연변이된 일련의 식물은 AK로 시작하는 명칭을 가지고, HSDH 도메인만이 돌연변이된 일련의 식물은 HSDH로 시작하는 명칭을 가지고, AK 및 HSDH 둘 모두의 도메인이 돌연변이된 일련의 식물은 AK/HSDH로 시작하는 명칭을 가지고, 야생형 식물은 WT로 시작하는 명칭을 가지고, 빈 벡터 대조군을 함유하는 트랜스제닉 식물은 EV로 시작하는 명칭을 가진다.
본 발명자는 돌연변이되지 않은 아라비돕시스 서열로 형질전환된 것을 포함하는 아라비돕시스 서열로 형질전환된 모든 집단에서 상승된 잎 트레오닌 수준을 달성하였다. AK 도메인에서 돌연변이된 서열로 형질전환된 집단이 가장 높은 잎 Thr 수준을 발생시켰다. 이는 심하게 손상된 적응을 나타내는 집단 중 가장 높은 비율과 관련이 있었다. 본 발명자는 수정에 대한 변형의 효과를 감소시키기 위해 잎 특이적 프로모터를 사용하였으나, 이들이 가진 효과는 전체 식물이 효소에 대한 피드백 조절의 통제해제의 대사 결과에 의해 여전히 영향을 받기에 충분하였다.
그러나, 상승된 트레오닌을 나타내는 모든 식물에서, 변경된 성장 습성과 상호 관계가 있었다. 잎들은 연한 색을 띠고, 비대해지고, 부서지기 쉽고, 띠와 같은(strap-like) 모양이었다. 마디와 마디 사이는 짧았고, 성숙도가 증가함에 따라 갈색화를 나타내었다. 싹은 발생하지 않거나 기형이었다. 결론적으로, 부위 특이적 돌연변이유발은 상승된 잎 트레오닌을 제공하는데 성공적이었다. 그러나, 높은 잎 트레오닌을 갖는 작물학적으로 실용적인 식물이 상기 방법으로부터 발생되도록 하기 위해 아스파테이트 키나아제에 대한 피드백 조절을 해방하는 적응 비용이 극복되는 것이 여전히 요구되었다.
표 1
Figure pct00011
실시예 3 - 노화 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 트레오닌 둔감성 AK:HSDH를 포함하는 트랜스제닉 식물
니코티아나 타바쿰 식물인 품종 K326을 노화 특이적 프로모터 SAG12(이의 서열은 도 6, 즉 서열 목록 번호:1에 도시되어 있음)의 조절하에서 관심 유전자(즉, 돌연변이된 AK:HSDH, 이의 서열은 도 7, 즉 서열 목록 번호:2, 3 및 4에 도시되어 있음)를 갖는 이원 벡터로 이전에 형질전환(전기천공을 통함)된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefasciens)와 공동배양된 잎 절편을 제공하기 위해 사용하였다. 이원 벡터가 프로모터를 함유하나 AK:HSDH 유전자를 함유하지 않은 대조군 집단을 동시에 발생시켰다. 이후, 이러한 잎 절편을 조직 배양 프로토콜에 따라 처리하여 모종(plantlet)을 발생시켰다(Horsch et al . Science 227: 1229-1231, 1985). 각각의 모종은 DNA가 박테리아로부터 운반되어 식물의 유전체 DNA로 통합된 단일한 형질전환 사건으로부터 발생되었다. 이러한 식물을 온실로 옮기고, 성숙시켰다. 성숙된 잎을 식물로부터 떼어내고, 72시간 동안 35℃에서 어두운 곳에서 폴리텐 백에 두었다. 상기 시간 후, 상기 잎을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 트레오닌 함량에 대해 측정되는 잎 절편을 제공하는데 사용하였다.
결과가 도 8에 제시되어 있고, 이는 일부 식물에서 높은 수준의 트레오닌이 수득된 것을 나타낸다. 유리하게는, 이러한 식물은 정상적으로 성장하였다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 식물은 실시예 2에 기재된 식물에서 관찰된 바와 같은 적응 손실을 나타내지 않았다.
실시예 4 - SAG12 프로모터에 연결된 트레오닌 둔감성 AK : HSDH 를 포함하는 트랜스제닉 식물의 실지 시험
SAG12:아스파테이트 키나아제의 실험 집단으로부터 선택된 식물 세포주(pBNP 138-0253-001)를 북캐롤라이나에서 2008년 동안 들판에서 성장시켰다. 잎을 가열 건조시키고, 선택 자유 아미노산의 존재에 대해 분석하였다. 분석은 내부 및 외부 표준 보정을 통해 확인된 LC/MS에 의해 수행하였다. 분석물이 보정에 대해 사용된 범위를 초과하는 경우, 표 2에서 ">S"로 나타내었고, 도면에서 관련 막대 상에 별표로 나타내었다. 샘플 목록을 본 발명의 유전자 작제물로 변형된 K326 백그라운드 선인 "AK" 번호, 및 3개의 대표적 대조군인 변형되지 않은 K326, 변형되지 않은 KV1, 변형되지 않은 NC71으로 나누었고, 이들은 모두 동일 조건하에서 동시에 성장시키고 건조시켰다.
표: 2
Figure pct00012
도 9를 참조하면, 3개의 대조군(K326, KV1 및 NC7)에 비한 5개의 시험 식물(AK1-AK5)에 의해 생성된 트레오닌의 농도를 예시하는 막대 차트가 제시된다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 시험 식물 5개 모두가 어떠한 대조군보다 현저하게 많은 트레오닌을 생성시켰다. 또한, 5개 시험 식물 중 어떠한 것도 성장 적응에 대한 임의의 비용을 경험하지 않았다. 이러한 데이터는 본 발명에 따른 작제물로 형질전환된 시험 식물이 상업적인 실지(field) 조건하에서 상승된(적어도 2배 내지 3배) 자유 트레오닌을 갖는 잎을 생성하고, 이러한 것이 건조 과정 동안 지속된다는 관찰을 강하게 뒷받침한다. 더욱이, 시험 식물은 상기 실지 조건하에서 패널티를 발생시키지 않는 것을 나타낸 비-분리 계통이었다.
본 발명자는 또한 실지 시험 식물로부터 생성된 건조된 잎에서의 여러 다른 아미노산(GLN: 글루타민; GLU: 글루탐산; ASN: 아스파라긴; ASP: 아스파르트산; HIS: 히스티딘)의 농도를 평가하였고, 이러한 데이터는 도 10-14에 제시되어 있다.
도 10에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 세포주 AK3에 대해 글루타민의 농도는 3개의 대조군 세포주에서의 농도와 동등하였다. 도 11에 제시된 바와 같이, AK1-3은 대조군과 동일한 양의 글루탐산을 가졌으나, AK4-5는 약간 더 높은 농도를 가졌다. 도 12는 아스파라긴의 각각의 농도를 나타낸다.
도 13을 참조하면, 아스파르트산의 농도는 시험 세포주 AK1-AK3에서 대조군과 거의 동일한 것으로 관찰될 수 있으나, AK4-5에서는 농도가 보다 높은 것으로 나타났다. 최종적으로, 도 14에서 관찰되는 바와 같이, 히스티딘의 농도는, 상승된 수준을 나타낸 시험 세포주 AK4를 제외하고는 전체에 걸쳐 대략 동일하였다.
요약하면, 도 10-14는 상기 아미노산 각각의 농도가 대조군과 동등하거나 심지어 더 높은 것을 명백히 나타내고, 이는 트랜스제닉 식물의 적응이 손상되지 않았다는 우수한 지표를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Advanced Technologies (Cambridge) Limited <120> Transgenic plants <130> AXH/57177PCT1 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2093 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tcgagacccg attgttattt ttagactgag acaaaaaagt agaatcgttg attgttaaaa 60 tttaaaatta gtttcattac gtttcgataa aaaaatgatt agtttatcat agcttaatta 120 tagcattgat ttctaaattt gttttttgac cacccttttt tctctctttg gtgttttctt 180 aacattagaa gaacccataa caatgtacgt tcaaattaat taaaaacaat atttccaagt 240 tttatatacg aaacttgttt tttttaatga aaacagttga atagttgatt atgaattagt 300 tagatcaata ctcaatatat gatcaatgat gtatatatat gaactcagtt gttatacaag 360 aaatgaaaat gctatttaaa tacagatcat gaagtgttaa aaagtgtcag aatatgacat 420 gaagcgtttt gtcctaccgg gtattcgagt tataggtttg gatctctcaa gaatattttg 480 ggccatacta gttatatttg ggcttaagcg ttttgcaaag agacgaggaa gaaagattgg 540 gtcaagttaa caaaacagag acactcgtat tagttggtac tttggtagca agtcgattta 600 tttgccagta aaaacttggt acacaactga caactcgtat cgttattagt ttgtacttgg 660 tacctttggt tcaagaaaaa gttgatatag ttaaatcagt tgtgttcatg aggtgattgt 720 gatttaattt gttgactagg gcgattcctt cacatcacaa taacaaagtt ttatagattt 780 tttttttata acatttttgc cacgcttcgt aaagtttggt atttacaccg catttttccc 840 tgtacaagaa ttcatatatt atttatttat atactccagt tgacaattat aagtttataa 900 cgtttttaca attatttaaa taccatgtga agatccaaga atatgtctta cttcttcttt 960 gtgtaagaaa actaactata tcactataat aaaataattc taatcattat atttgtaaat 1020 atgcagttat ttgtcaattt tgaatttagt attttagacg ttatcacttc agccaaatat 1080 gatttggatt taagtccaaa atgcaatttc gtacgtatcc ctcttgtcgt ctaatgatta 1140 tttcaatatt tcttatatta tccctaacta cagagctaca tttatattgt attctaatga 1200 cagggaaacc ttcatagaga ttcagataga tgaaattggt gggaaacatc attgaacagg 1260 aaacttttag caaatcatat cgatttatct acaaaagaat acgtagcgta atgaagtcca 1320 cttgttgtga atgactatga tttgatcaaa ttagttaatt ttgtcgaatc atttttcttt 1380 ttgatttgat taagctttta acttgcacga atggttctct tgtgaataaa cagaatcttt 1440 gaattcaaac tatttgatta gtgaaaagac aaaagaagat tccttgtttt tatgtgatta 1500 gtgattttga tgcatgaaag gtacctacgt actacaagaa aaataaacat gtacgtaact 1560 acgtatcagc atgtaaaagt atttttttcc aaataattta tactcatgat agattttttt 1620 tttttgaaat gtcaattaaa aatgctttct taaatattaa ttttaattaa ttaaataagg 1680 aaatatattt atgcaaaaca tcatcaacac atatccaact tcgaaaatct ctatagtaca 1740 caagtagaga aattaaattt tactagatac aaacttccta atcatcaaat ataaatgttt 1800 acaaaactaa ttaaacccac cactaaaatt aactaaaaat ccgagcaaag tgagtgaaca 1860 agacttgatt tcaggttgat gtaggactaa aatgactacg tatcaaacat caacgatcat 1920 ttagttatgt atgaatgaat gtagtcatta cttgtaaaac aaaaatgctt tgatttggat 1980 caatcacttc atgtgaacat tagcaattac atcaacctta ttttcactat aaaaccccat 2040 ctcagtaccc ttctgaagta atcaaattaa gagcaaaagt catttaactt agg 2093 <210> 2 <211> 2751 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) single mutant (Q443A); R = A or G <400> 2 atggcgactc tgaagccgtc atttactgtt tctccgccga atagtaatcc gattagattt 60 ggaagttttc cgccgcaatg ctttctccgt gttccgaaac cgcggcgact tatattgcct 120 aggtttcgga agacgactgg tggtggcggc ggcttgattc gatgtgagct tccagatttt 180 catctatcag caacagcaac tactgtatca ggtgtatcga cggtgaattt agtggatcaa 240 gttcagattc ctaaaggtga aatgtggagt gttcacaagt ttggtgggac ttgtgtggga 300 aactctcaga ggatcagaaa tgtagcagag gttataatca atgataattc cgaaagaaaa 360 cttgtggttg tctcggcgat gtcgaaggtt acggacatga tgtatgactt aatccgcaag 420 gcacaatcac gagatgattc ttatttatcc gcgttggaag ctgtcttgga aaagcatcgt 480 ttaacagctc gtgaccttct cgatggagat gatctcgcta gtttcttgtc acatttgcat 540 aatgatatta gtaatcttaa agcaatgctt cgtgctatat acatagctgg ccatgcatca 600 gagtcgtttt cagattttgt tgcaggacat ggggagcttt ggtctgctca gatgctatca 660 tatgttgtca gaaagactgg gcttgagtgc aagtggatgg atactagaga cgtgctcatt 720 gttaatccca ccagctctaa tcaggttgat cctgattttg gtgaatctga gaagagactc 780 gataaatggt tctccttaaa tccgtcgaaa attattattg cgactgggtt tattgctagc 840 actccgcaaa atattccaac aactttgaaa agagatggga gtgatttctc agcagctatt 900 atgggtgctt tattgagagc tcgtcaagta accatttgga cagatgttga tggtgtatac 960 agtgcggatc ctcgtaaagt taatgaggca gtgatactcc agacactttc ttatcaagag 1020 gcctgggaaa tgtcttattt tggagcaaat gtgttacatc ctcgcaccat cattcctgtg 1080 atgcgatata atattccgat tgtgattaga aatattttca atctctctgc accgggaaca 1140 ataatctgtc aacctcctga agatgattat gaccttaaac tgacaactcc tgtcaaaggg 1200 tttgcaacta ttgacaattt ggccctcata aatgttgaag gtactggaat ggctggtgta 1260 cccggtactg caagtgacat ttttggctgt gtaaaagatg ttggagctaa tgtgattatg 1320 atatcagctg ctagcagtga gcattctgtg tgctttgctg tgcctgagaa ggaagtaaac 1380 gcagtctctg aggcattgcg gtcgagattt agtgaagctt tacaagcggg acgtctttct 1440 cagattgagg tgataccaaa ctgtagcatc ttagctgcag tcggccagaa aatggctagt 1500 acacctggag ttagttgtac acttttcagt gctttggcga aggctaatat taatgtccga 1560 gctatatctc arggttgttc tgagtacaat gttactgtcg ttattaaacg tgaagatagc 1620 gttaaggcgt taagagctgt acactcgagg tttttcttgt caagaacaac attagcaatg 1680 ggaatcgtag gaccgggctt gattggtgca acattacttg accagctgcg ggatcaggct 1740 gctgttctca aacaagaatt taacattgat ctgcgtgttt tgggaatcac tggttcaaag 1800 aagatgttat tgagtgacat tggtattgat ttgtcgagat ggagagaact tctaaacgag 1860 aagggaacag aggcggattt ggataaattc actcaacaag tgcatggaaa tcattttatc 1920 cccaactctg tagtggttga ttgtacagca gactctgcta ttgcaagccg ttactatgat 1980 tggttacgaa agggaattca tgtcattacc ccaaataaaa aggctaactc aggtcccctc 2040 gatcagtact tgaaactgag agatcttcaa aggaaatcct acactcatta cttctacgaa 2100 gccactgttg gagctggtct tccaattatc agcactttac gtggtctcct tgagacagga 2160 gataagatac tacgcataga gggcatttgc agtggaactt tgagttatct attcaacaat 2220 tttgttggag atcgaagttt cagcgaggtt gtcactgaag caaagaacgc aggtttcact 2280 gagcctgatc caagagatga tttatctgga actgatgttg caaggaaggt gattatcctc 2340 gctcgagaat ctggactgaa attggacctc gctgatctcc ccattagaag tctcgtacca 2400 gaacctctaa aaggatgcac ttctgttgaa gaattcatgg agaaactccc acagtacgat 2460 ggagacctag caaaagaaag gctagatgct gaaaactctg gggaagttct gagatatgtt 2520 ggagtggtgg acgctgttaa ccaaaaggga acagttgaac ttcgaagata caagaaagaa 2580 catccatttg cgcagctcgc aggttcagac aacataatag ccttcacaac gacaaggtac 2640 aaggatcatc cacttatagt ccgaggacct ggagctggtg ctcaagtcac ggccggtggt 2700 atattcagcg acatactaag gcttgcatct tatctcggtg caccgtctta a 2751 <210> 3 <211> 2751 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) single mutant (Q524A); R = A or G <400> 3 atggcgactc tgaagccgtc atttactgtt tctccgccga atagtaatcc gattagattt 60 ggaagttttc cgccgcaatg ctttctccgt gttccgaaac cgcggcgact tatattgcct 120 aggtttcgga agacgactgg tggtggcggc ggcttgattc gatgtgagct tccagatttt 180 catctatcag caacagcaac tactgtatca ggtgtatcga cggtgaattt agtggatcaa 240 gttcagattc ctaaaggtga aatgtggagt gttcacaagt ttggtgggac ttgtgtggga 300 aactctcaga ggatcagaaa tgtagcagag gttataatca atgataattc cgaaagaaaa 360 cttgtggttg tctcggcgat gtcgaaggtt acggacatga tgtatgactt aatccgcaag 420 gcacaatcac gagatgattc ttatttatcc gcgttggaag ctgtcttgga aaagcatcgt 480 ttaacagctc gtgaccttct cgatggagat gatctcgcta gtttcttgtc acatttgcat 540 aatgatatta gtaatcttaa agcaatgctt cgtgctatat acatagctgg ccatgcatca 600 gagtcgtttt cagattttgt tgcaggacat ggggagcttt ggtctgctca gatgctatca 660 tatgttgtca gaaagactgg gcttgagtgc aagtggatgg atactagaga cgtgctcatt 720 gttaatccca ccagctctaa tcaggttgat cctgattttg gtgaatctga gaagagactc 780 gataaatggt tctccttaaa tccgtcgaaa attattattg cgactgggtt tattgctagc 840 actccgcaaa atattccaac aactttgaaa agagatggga gtgatttctc agcagctatt 900 atgggtgctt tattgagagc tcgtcaagta accatttgga cagatgttga tggtgtatac 960 agtgcggatc ctcgtaaagt taatgaggca gtgatactcc agacactttc ttatcaagag 1020 gcctgggaaa tgtcttattt tggagcaaat gtgttacatc ctcgcaccat cattcctgtg 1080 atgcgatata atattccgat tgtgattaga aatattttca atctctctgc accgggaaca 1140 ataatctgtc aacctcctga agatgattat gaccttaaac tgacaactcc tgtcaaaggg 1200 tttgcaacta ttgacaattt ggccctcata aatgttgaag gtactggaat ggctggtgta 1260 cccggtactg caagtgacat ttttggctgt gtaaaagatg ttggagctaa tgtgattatg 1320 atatcacarg ctagcagtga gcattctgtg tgctttgctg tgcctgagaa ggaagtaaac 1380 gcagtctctg aggcattgcg gtcgagattt agtgaagctt tacaagcggg acgtctttct 1440 cagattgagg tgataccaaa ctgtagcatc ttagctgcag tcggccagaa aatggctagt 1500 acacctggag ttagttgtac acttttcagt gctttggcga aggctaatat taatgtccga 1560 gctatatctg ctggttgttc tgagtacaat gttactgtcg ttattaaacg tgaagatagc 1620 gttaaggcgt taagagctgt acactcgagg tttttcttgt caagaacaac attagcaatg 1680 ggaatcgtag gaccgggctt gattggtgca acattacttg accagctgcg ggatcaggct 1740 gctgttctca aacaagaatt taacattgat ctgcgtgttt tgggaatcac tggttcaaag 1800 aagatgttat tgagtgacat tggtattgat ttgtcgagat ggagagaact tctaaacgag 1860 aagggaacag aggcggattt ggataaattc actcaacaag tgcatggaaa tcattttatc 1920 cccaactctg tagtggttga ttgtacagca gactctgcta ttgcaagccg ttactatgat 1980 tggttacgaa agggaattca tgtcattacc ccaaataaaa aggctaactc aggtcccctc 2040 gatcagtact tgaaactgag agatcttcaa aggaaatcct acactcatta cttctacgaa 2100 gccactgttg gagctggtct tccaattatc agcactttac gtggtctcct tgagacagga 2160 gataagatac tacgcataga gggcatttgc agtggaactt tgagttatct attcaacaat 2220 tttgttggag atcgaagttt cagcgaggtt gtcactgaag caaagaacgc aggtttcact 2280 gagcctgatc caagagatga tttatctgga actgatgttg caaggaaggt gattatcctc 2340 gctcgagaat ctggactgaa attggacctc gctgatctcc ccattagaag tctcgtacca 2400 gaacctctaa aaggatgcac ttctgttgaa gaattcatgg agaaactccc acagtacgat 2460 ggagacctag caaaagaaag gctagatgct gaaaactctg gggaagttct gagatatgtt 2520 ggagtggtgg acgctgttaa ccaaaaggga acagttgaac ttcgaagata caagaaagaa 2580 catccatttg cgcagctcgc aggttcagac aacataatag ccttcacaac gacaaggtac 2640 aaggatcatc cacttatagt ccgaggacct ggagctggtg ctcaagtcac ggccggtggt 2700 atattcagcg acatactaag gcttgcatct tatctcggtg caccgtctta a 2751 <210> 4 <211> 2751 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) double mutant (Q443A; Q524A); R = A or G <400> 4 atggcgactc tgaagccgtc atttactgtt tctccgccga atagtaatcc gattagattt 60 ggaagttttc cgccgcaatg ctttctccgt gttccgaaac cgcggcgact tatattgcct 120 aggtttcgga agacgactgg tggtggcggc ggcttgattc gatgtgagct tccagatttt 180 catctatcag caacagcaac tactgtatca ggtgtatcga cggtgaattt agtggatcaa 240 gttcagattc ctaaaggtga aatgtggagt gttcacaagt ttggtgggac ttgtgtggga 300 aactctcaga ggatcagaaa tgtagcagag gttataatca atgataattc cgaaagaaaa 360 cttgtggttg tctcggcgat gtcgaaggtt acggacatga tgtatgactt aatccgcaag 420 gcacaatcac gagatgattc ttatttatcc gcgttggaag ctgtcttgga aaagcatcgt 480 ttaacagctc gtgaccttct cgatggagat gatctcgcta gtttcttgtc acatttgcat 540 aatgatatta gtaatcttaa agcaatgctt cgtgctatat acatagctgg ccatgcatca 600 gagtcgtttt cagattttgt tgcaggacat ggggagcttt ggtctgctca gatgctatca 660 tatgttgtca gaaagactgg gcttgagtgc aagtggatgg atactagaga cgtgctcatt 720 gttaatccca ccagctctaa tcaggttgat cctgattttg gtgaatctga gaagagactc 780 gataaatggt tctccttaaa tccgtcgaaa attattattg cgactgggtt tattgctagc 840 actccgcaaa atattccaac aactttgaaa agagatggga gtgatttctc agcagctatt 900 atgggtgctt tattgagagc tcgtcaagta accatttgga cagatgttga tggtgtatac 960 agtgcggatc ctcgtaaagt taatgaggca gtgatactcc agacactttc ttatcaagag 1020 gcctgggaaa tgtcttattt tggagcaaat gtgttacatc ctcgcaccat cattcctgtg 1080 atgcgatata atattccgat tgtgattaga aatattttca atctctctgc accgggaaca 1140 ataatctgtc aacctcctga agatgattat gaccttaaac tgacaactcc tgtcaaaggg 1200 tttgcaacta ttgacaattt ggccctcata aatgttgaag gtactggaat ggctggtgta 1260 cccggtactg caagtgacat ttttggctgt gtaaaagatg ttggagctaa tgtgattatg 1320 atatcagctg ctagcagtga gcattctgtg tgctttgctg tgcctgagaa ggaagtaaac 1380 gcagtctctg aggcattgcg gtcgagattt agtgaagctt tacaagcggg acgtctttct 1440 cagattgagg tgataccaaa ctgtagcatc ttagctgcag tcggccagaa aatggctagt 1500 acacctggag ttagttgtac acttttcagt gctttggcga aggctaatat taatgtccga 1560 gctatatctg ctggttgttc tgagtacaat gttactgtcg ttattaaacg tgaagatagc 1620 gttaaggcgt taagagctgt acactcgagg tttttcttgt caagaacaac attagcaatg 1680 ggaatcgtag gaccgggctt gattggtgca acattacttg accagctgcg ggatcaggct 1740 gctgttctca aacaagaatt taacattgat ctgcgtgttt tgggaatcac tggttcaaag 1800 aagatgttat tgagtgacat tggtattgat ttgtcgagat ggagagaact tctaaacgag 1860 aagggaacag aggcggattt ggataaattc actcaacaag tgcatggaaa tcattttatc 1920 cccaactctg tagtggttga ttgtacagca gactctgcta ttgcaagccg ttactatgat 1980 tggttacgaa agggaattca tgtcattacc ccaaataaaa aggctaactc aggtcccctc 2040 gatcagtact tgaaactgag agatcttcaa aggaaatcct acactcatta cttctacgaa 2100 gccactgttg gagctggtct tccaattatc agcactttac gtggtctcct tgagacagga 2160 gataagatac tacgcataga gggcatttgc agtggaactt tgagttatct attcaacaat 2220 tttgttggag atcgaagttt cagcgaggtt gtcactgaag caaagaacgc aggtttcact 2280 gagcctgatc caagagatga tttatctgga actgatgttg caaggaaggt gattatcctc 2340 gctcgagaat ctggactgaa attggacctc gctgatctcc ccattagaag tctcgtacca 2400 gaacctctaa aaggatgcac ttctgttgaa gaattcatgg agaaactccc acagtacgat 2460 ggagacctag caaaagaaag gctagatgct gaaaactctg gggaagttct gagatatgtt 2520 ggagtggtgg acgctgttaa ccaaaaggga acagttgaac ttcgaagata caagaaagaa 2580 catccatttg cgcagctcgc aggttcagac aacataatag ccttcacaac gacaaggtac 2640 aaggatcatc cacttatagt ccgaggacct ggagctggtg ctcaagtcac ggccggtggt 2700 atattcagcg acatactaag gcttgcatct tatctcggtg caccgtctta a 2751 <210> 5 <211> 916 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) single mutant (Q443A) <400> 5 Met Ala Thr Leu Lys Pro Ser Phe Thr Val Ser Pro Pro 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640 Pro Asn Ser Val Val Val Asp Cys Thr Ala Asp Ser Ala Ile Ala Ser 645 650 655 Arg Tyr Tyr Asp Trp Leu Arg Lys Gly Ile His Val Ile Thr Pro Asn 660 665 670 Lys Lys Ala Asn Ser Gly Pro Leu Asp Gln Tyr Leu Lys Leu Arg Asp 675 680 685 Leu Gln Arg Lys Ser Tyr Thr His Tyr Phe Tyr Glu Ala Thr Val Gly 690 695 700 Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Thr Leu Arg Gly Leu Leu Glu Thr Gly 705 710 715 720 Asp Lys Ile Leu Arg Ile Glu Gly Ile Cys Ser Gly Thr Leu Ser Tyr 725 730 735 Leu Phe Asn Asn Phe Val Gly Asp Arg Ser Phe Ser Glu Val Val Thr 740 745 750 Glu Ala Lys Asn Ala Gly Phe Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu 755 760 765 Ser Gly Thr Asp Val Ala Arg Lys Val Ile Ile Leu Ala Arg Glu Ser 770 775 780 Gly Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Leu Pro Ile Arg Ser Leu Val Pro 785 790 795 800 Glu Pro Leu Lys Gly Cys Thr Ser Val Glu Glu Phe Met Glu Lys Leu 805 810 815 Pro Gln Tyr Asp Gly Asp Leu Ala Lys Glu Arg Leu Asp Ala Glu Asn 820 825 830 Ser Gly Glu Val Leu Arg Tyr Val Gly Val Val Asp Ala Val Asn Gln 835 840 845 Lys Gly Thr Val Glu Leu Arg Arg Tyr Lys Lys Glu His Pro Phe Ala 850 855 860 Gln Leu Ala Gly Ser Asp Asn Ile Ile Ala Phe Thr Thr Thr Arg Tyr 865 870 875 880 Lys Asp His Pro Leu Ile Val Arg Gly Pro Gly Ala Gly Ala Gln Val 885 890 895 Thr Ala Gly Gly Ile Phe Ser Asp Ile Leu Arg Leu Ala Ser Tyr Leu 900 905 910 Gly Ala Pro Ser 915 <210> 6 <211> 916 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) single mutant (Q524A) <400> 6 Met Ala Thr Leu Lys Pro Ser Phe Thr Val Ser Pro Pro Asn Ser Asn 1 5 10 15 Pro Ile Arg Phe Gly Ser Phe Pro Pro Gln Cys Phe Leu Arg Val Pro 20 25 30 Lys Pro Arg Arg Leu Ile Leu Pro Arg Phe Arg Lys Thr Thr Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Leu Ile Arg Cys Glu Leu Pro Asp Phe His Leu Ser Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Thr Val Ser Gly Val Ser Thr Val Asn Leu Val Asp Gln 65 70 75 80 Val Gln Ile Pro Lys Gly Glu Met Trp Ser Val His Lys Phe Gly Gly 85 90 95 Thr Cys Val Gly Asn Ser Gln Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Val Ile 100 105 110 Ile Asn Asp Asn Ser Glu Arg Lys Leu Val Val Val Ser Ala Met Ser 115 120 125 Lys Val Thr Asp Met Met Tyr Asp Leu Ile Arg Lys Ala Gln Ser Arg 130 135 140 Asp Asp Ser Tyr Leu Ser Ala Leu Glu Ala Val Leu Glu Lys His Arg 145 150 155 160 Leu Thr Ala Arg Asp Leu Leu Asp Gly Asp Asp Leu Ala Ser Phe Leu 165 170 175 Ser His Leu His Asn Asp Ile Ser Asn Leu Lys Ala Met Leu Arg Ala 180 185 190 Ile Tyr Ile Ala Gly His Ala Ser Glu Ser Phe Ser Asp Phe Val Ala 195 200 205 Gly His Gly Glu Leu Trp Ser Ala Gln Met Leu Ser Tyr Val Val Arg 210 215 220 Lys Thr Gly Leu Glu Cys Lys Trp Met Asp Thr Arg Asp Val Leu Ile 225 230 235 240 Val Asn Pro Thr Ser Ser Asn Gln Val Asp Pro Asp Phe Gly Glu Ser 245 250 255 Glu Lys Arg Leu Asp Lys Trp Phe Ser Leu Asn Pro Ser Lys Ile Ile 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Ser Thr Pro Gln Asn Ile Pro Thr Thr 275 280 285 Leu Lys Arg Asp Gly Ser Asp Phe Ser Ala Ala Ile Met Gly Ala Leu 290 295 300 Leu Arg Ala Arg Gln Val Thr Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Asp Pro Arg Lys Val Asn Glu Ala Val Ile Leu Gln Thr Leu 325 330 335 Ser Tyr Gln Glu Ala Trp Glu Met Ser Tyr Phe Gly Ala Asn Val Leu 340 345 350 His Pro Arg Thr Ile Ile Pro Val Met Arg Tyr Asn Ile Pro Ile Val 355 360 365 Ile Arg Asn Ile Phe Asn Leu Ser Ala Pro Gly Thr Ile Ile Cys Gln 370 375 380 Pro Pro Glu Asp Asp Tyr Asp Leu Lys Leu Thr Thr Pro Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Ala Thr Ile Asp Asn Leu Ala Leu Ile Asn Val Glu Gly Thr Gly 405 410 415 Met Ala Gly Val Pro Gly Thr Ala Ser Asp Ile Phe Gly Cys Val Lys 420 425 430 Asp Val Gly Ala Asn Val Ile Met Ile Ser Gln Ala Ser Ser Glu His 435 440 445 Ser Val Cys Phe Ala Val Pro Glu Lys Glu Val Asn Ala Val Ser Glu 450 455 460 Ala Leu Arg Ser Arg Phe Ser Glu Ala Leu Gln Ala Gly Arg Leu Ser 465 470 475 480 Gln Ile Glu Val Ile Pro Asn Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Gly Gln 485 490 495 Lys Met Ala Ser Thr Pro Gly Val Ser Cys Thr Leu Phe Ser Ala Leu 500 505 510 Ala Lys Ala Asn Ile Asn Val Arg Ala Ile Ser Ala Gly Cys Ser Glu 515 520 525 Tyr Asn Val Thr Val Val Ile Lys Arg Glu Asp Ser Val Lys Ala Leu 530 535 540 Arg Ala Val His Ser Arg Phe Phe Leu Ser Arg Thr Thr Leu Ala Met 545 550 555 560 Gly Ile Val Gly Pro Gly Leu Ile Gly Ala Thr Leu Leu Asp Gln Leu 565 570 575 Arg Asp Gln Ala Ala Val Leu Lys Gln Glu Phe Asn Ile Asp Leu Arg 580 585 590 Val Leu Gly Ile Thr Gly Ser Lys Lys Met Leu Leu Ser Asp Ile Gly 595 600 605 Ile Asp Leu Ser Arg Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Lys Gly Thr Glu 610 615 620 Ala Asp Leu Asp Lys Phe Thr Gln Gln Val His Gly Asn His Phe Ile 625 630 635 640 Pro Asn Ser Val Val Val Asp Cys Thr Ala Asp Ser Ala Ile Ala Ser 645 650 655 Arg Tyr Tyr Asp Trp Leu Arg Lys Gly Ile His Val Ile Thr Pro Asn 660 665 670 Lys Lys Ala Asn Ser Gly Pro Leu Asp Gln Tyr Leu Lys Leu Arg Asp 675 680 685 Leu Gln Arg Lys Ser Tyr Thr His Tyr Phe Tyr Glu Ala Thr Val Gly 690 695 700 Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Thr Leu Arg Gly Leu Leu Glu Thr Gly 705 710 715 720 Asp Lys Ile Leu Arg Ile Glu Gly Ile Cys Ser Gly Thr Leu Ser Tyr 725 730 735 Leu Phe Asn Asn Phe Val Gly Asp Arg Ser Phe Ser Glu Val Val Thr 740 745 750 Glu Ala Lys Asn Ala Gly Phe Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu 755 760 765 Ser Gly Thr Asp Val Ala Arg Lys Val Ile Ile Leu Ala Arg Glu Ser 770 775 780 Gly Leu Lys Leu Asp Leu Ala Asp Leu Pro Ile Arg Ser Leu Val Pro 785 790 795 800 Glu Pro Leu Lys Gly Cys Thr Ser Val Glu Glu Phe Met Glu Lys Leu 805 810 815 Pro Gln Tyr Asp Gly Asp Leu Ala Lys Glu Arg Leu Asp Ala Glu Asn 820 825 830 Ser Gly Glu Val Leu Arg Tyr Val Gly Val Val Asp Ala Val Asn Gln 835 840 845 Lys Gly Thr Val Glu Leu Arg Arg Tyr Lys Lys Glu His Pro Phe Ala 850 855 860 Gln Leu Ala Gly Ser Asp Asn Ile Ile Ala Phe Thr Thr Thr Arg Tyr 865 870 875 880 Lys Asp His Pro Leu Ile Val Arg Gly Pro Gly Ala Gly Ala Gln Val 885 890 895 Thr Ala Gly Gly Ile Phe Ser Asp Ile Leu Arg Leu Ala Ser Tyr Leu 900 905 910 Gly Ala Pro Ser 915 <210> 7 <211> 916 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) double mutant (Q443A; Q524A) <400> 7 Met Ala Thr Leu Lys Pro Ser Phe Thr Val Ser Pro Pro Asn Ser Asn 1 5 10 15 Pro Ile Arg Phe Gly Ser Phe Pro Pro Gln Cys Phe Leu Arg Val Pro 20 25 30 Lys Pro Arg Arg Leu Ile Leu Pro Arg Phe Arg Lys Thr Thr Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Leu Ile Arg Cys Glu Leu Pro Asp Phe His Leu Ser Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Thr Val Ser Gly Val Ser Thr Val Asn Leu Val Asp Gln 65 70 75 80 Val Gln Ile Pro Lys Gly Glu Met Trp Ser Val His Lys Phe Gly Gly 85 90 95 Thr Cys Val Gly Asn Ser Gln Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Val Ile 100 105 110 Ile Asn Asp Asn Ser Glu Arg Lys Leu Val Val Val Ser Ala Met Ser 115 120 125 Lys Val Thr Asp Met Met Tyr Asp Leu Ile Arg Lys Ala Gln Ser Arg 130 135 140 Asp Asp Ser Tyr Leu Ser Ala Leu Glu Ala Val Leu Glu Lys His Arg 145 150 155 160 Leu Thr Ala Arg Asp Leu Leu Asp Gly Asp Asp Leu Ala Ser Phe Leu 165 170 175 Ser His Leu His Asn Asp Ile Ser Asn Leu Lys Ala Met Leu Arg Ala 180 185 190 Ile Tyr Ile Ala Gly His Ala Ser Glu Ser Phe Ser Asp Phe Val Ala 195 200 205 Gly His Gly Glu Leu Trp Ser Ala Gln Met Leu Ser Tyr Val Val Arg 210 215 220 Lys Thr Gly Leu Glu Cys Lys Trp Met Asp Thr Arg Asp Val Leu Ile 225 230 235 240 Val Asn Pro Thr Ser Ser Asn Gln Val Asp Pro Asp Phe Gly Glu Ser 245 250 255 Glu Lys Arg Leu Asp Lys Trp Phe Ser Leu Asn Pro Ser Lys Ile Ile 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Ser Thr Pro Gln Asn Ile Pro Thr Thr 275 280 285 Leu Lys Arg Asp Gly Ser Asp Phe Ser Ala Ala Ile Met Gly Ala Leu 290 295 300 Leu Arg Ala Arg Gln Val Thr Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Asp Pro Arg Lys Val Asn Glu Ala Val Ile Leu Gln Thr Leu 325 330 335 Ser Tyr Gln Glu Ala Trp Glu Met Ser Tyr Phe Gly Ala Asn Val Leu 340 345 350 His Pro Arg Thr Ile Ile Pro Val Met Arg Tyr Asn Ile Pro Ile Val 355 360 365 Ile Arg Asn Ile Phe Asn Leu Ser Ala Pro Gly Thr Ile Ile Cys Gln 370 375 380 Pro Pro Glu Asp Asp Tyr Asp Leu Lys Leu Thr Thr Pro Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Ala Thr Ile Asp Asn Leu Ala Leu Ile Asn Val Glu Gly Thr Gly 405 410 415 Met Ala Gly Val Pro Gly Thr Ala Ser Asp Ile Phe Gly Cys Val Lys 420 425 430 Asp Val Gly Ala Asn Val Ile Met Ile Ser Ala Ala Ser Ser Glu His 435 440 445 Ser Val Cys Phe Ala Val Pro Glu Lys Glu Val Asn Ala Val Ser Glu 450 455 460 Ala Leu Arg Ser Arg Phe Ser Glu Ala Leu Gln Ala Gly Arg Leu Ser 465 470 475 480 Gln Ile Glu Val Ile Pro Asn Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Gly Gln 485 490 495 Lys Met Ala Ser Thr Pro Gly Val Ser Cys Thr Leu Phe Ser Ala Leu 500 505 510 Ala Lys Ala Asn Ile Asn Val Arg Ala Ile Ser Ala Gly Cys Ser Glu 515 520 525 Tyr Asn Val Thr Val Val Ile Lys Arg Glu Asp Ser Val Lys Ala Leu 530 535 540 Arg Ala Val His Ser Arg Phe Phe Leu Ser Arg Thr Thr Leu Ala Met 545 550 555 560 Gly Ile Val Gly Pro Gly Leu Ile Gly Ala Thr Leu Leu Asp Gln Leu 565 570 575 Arg Asp Gln Ala Ala Val Leu Lys Gln Glu Phe Asn Ile Asp Leu Arg 580 585 590 Val Leu Gly Ile Thr Gly Ser Lys Lys Met Leu Leu Ser Asp Ile Gly 595 600 605 Ile Asp Leu Ser Arg Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Lys Gly Thr Glu 610 615 620 Ala Asp Leu Asp Lys Phe Thr Gln Gln Val His Gly Asn His Phe Ile 625 630 635 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Lys Gly Thr Val Glu Leu Arg Arg Tyr Lys Lys Glu His Pro Phe Ala 850 855 860 Gln Leu Ala Gly Ser Asp Asn Ile Ile Ala Phe Thr Thr Thr Arg Tyr 865 870 875 880 Lys Asp His Pro Leu Ile Val Arg Gly Pro Gly Ala Gly Ala Gln Val 885 890 895 Thr Ala Gly Gly Ile Phe Ser Asp Ile Leu Arg Leu Ala Ser Tyr Leu 900 905 910 Gly Ala Pro Ser 915 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) wild type PCR primers (forward) <400> 8 atggcgactc tgaagccgtc atttac 26 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) wild type PCR primers (reverse) <400> 9 ttaagacggt gcaccgagat aagatgc 27 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) mutant PCR primers (Q443A) (forward) <400> 10 gtgattatga tatcagctgc tagcagtgag cattctg 37 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) mutant PCR primers (Q443A) (reverse) <400> 11 cagaatgctc actgctagca gctgatatca taattcac 38 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) mutant PCR primers (Q524A) (forward) <400> 12 gtccgagcta tatctgctgg ttgttctgag tacaatg 37 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aspartate kinase (At4g19710) mutant PCR primers (Q524A) (reverse) <400> 13 cattgatctc agaacaacca gcagatatag ctcggac 37

Claims (25)

  1. 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 노화 특이적 프로모터를 포함하는 유전자 작제물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 노화 특이적 프로모터가 아라비돕시스(Arabidopsis)의 노화 관련 유전자로부터 분리된 것인 유전자 작제물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 노화 특이적 프로모터가 SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 및 SAG18, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 유전자 작제물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 노화 특이적 프로모터가 SAG12, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편인 유전자 작제물.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 프로모터가 실질적으로 서열 목록 번호:1에 기재된 누클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 포함하는 유전자 작제물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제(AK) 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편인 유전자 작제물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 트레오닌 둔감성 이기능성 아스파테이트 키나아제-호모세린 데히드로게나아제(aspartate kinase-homoserine dehydrogenase, AK-HSDH) 효소인 유전자 작제물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열이 아라비돕시스 종, 제아(Zea) 종, 플라베리아(Flaveria) 종, 또는 클레오메(Cleome) 종으로부터 유래된 것인 유전자 작제물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레오닌 둔감성 아스파테이트 키나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 코딩 서열이 아라비돕시스 종, 바람직하게는 A. 탈리아나(A.thaliana)로부터 유래된 것인 유전자 작제물.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AK-HSDH의 하나 이상의 트레오닌 결합 부위가 돌연변이된 것인 유전자 작제물.
  11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아라비돕시스 AK-HSDH가 Gln443 및/또는 Gln524에서 돌연변이된 것인 유전자 작제물.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AK-HSDH가 Gln443 및 Gln524에서 돌연변이된 것인 유전자 작제물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 유전자 작제물을 포함하는 벡터.
  14. ⅰ) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 유전자 작제물, 또는 제 13항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 형질전환된 세포로부터 식물을 재생성(regeneration)시키는 단계를 포함하는, 동일 조건하에서 배양된 상응하는 야생형 식물보다 높은 수준의 트레오닌을 잎에 축적하는 트랜스제닉 식물을 생성시키는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 유전자 작제물, 또는 제 13항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  16. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 유전자 작제물, 또는 제 13항에 따른 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 식물이 브라시카씨에(Brassicaceae) 과, 포알레스(Poales) 과 또는 솔라나씨에(Solanaceae) 과로부터 유래된 것인 트랜스제닉 식물.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 식물이 담배 식물인 트랜스제닉 식물.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 식물로부터 수득가능한 식물 증식 생성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 식물 증식 생성물이 종자(seed)인 식물 증식 생성물.
  21. 동일 조건하에서 배양된 야생형 식물로부터 수확된 잎에서의 상응하는 수준의 트레오닌보다 높은 수준의 트레오닌을 함유하는 수확된 잎으로서, 상기 잎이 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 식물, 또는 제 14항에 따른 방법에 의해 생성된 트랜스제닉 식물로부터 수확된 잎.
  22. 노화 잎에서 트레오닌을 과생성할 수 있는 돌연변이 담배 식물로부터 수득된 트레오닌 부화(enriched) 담배를 포함하는 흡연 물품.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 돌연변이 담배 식물이 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 청구된 유전자 작제물, 또는 제 13항에 따른 벡터로 형질전환된 것인 흡연 물품.
  24. 잎 노화의 개시 후에 트레오닌의 증가된 생성을 달성하기 위해 식물 물질대사를 변경시키는 것을 포함하는, 식물 적응을 손상시킴이 없이 상응하는 야생형 수준을 초과하도록 식물 잎에서 트레오닌의 수준을 증가시키는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 방법이 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 작제물, 또는 제 13항에 따른 벡터로 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는 방법.
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