CN102203243A - 转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转基因植物，具体为烟草植物，所述植物在其叶片中积累氨基酸苏氨酸。引起苏氨酸生产的生物合成路径被严格调控，而获得过量生产苏氨酸的转基因植物的以往尝试会损害植物的适合度。本发明已经克服这些困难并找到一种提高植物叶片中苏氨酸水平至相应野生型水平之上而不损害植物适合度的方法，其包含改变植物新陈代谢以在叶片衰老开始之后实现苏氨酸生产增加。本发明涉及一种基因构建体，其包含可操作性连接到一种编码序列的衰老特异性启动子，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。

Description

转基因植物
本发明涉及用于制备转基因植物的基因构建体。所述构建体可具有引起植物在其叶片中积累苏氨酸的能力，尤其是在叶片衰老过程中。本发明扩展至使用所述构建体转化的植物细胞，以及转基因植物本身。本发明还涉及生产转基因植物的方法，以及在衰老植物中增加苏氨酸浓度的方法。本发明还涉及收获的植物叶片，例如烟草叶片，其以所述基因构建体转化以及涉及包含所收获植物叶片的吸烟制品。
提升烤烟味道的一个主要目标是生产氨基酸苏氨酸。在突变体烟草植物的叶片中积累高水平苏氨酸可产生显著的味道和香气益处。但是，通常苏氨酸生产与天冬氨酸家族的其它氨基酸，即甲硫氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的生产同样被严格调控。因此，需要改变生产苏氨酸的生物合成路径以获得味道和香气益处。
如图1和2所示，天冬氨酸激酶(AK)为将天冬氨酸转换为包括苏氨酸的氨基酸的植物生物合成路径中的第一种酶。内源天冬氨酸激酶由来自赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制调控。因此，需要一种不经受反馈抑制的天冬氨酸激酶。但是，实现所述需求需要不强制植物进入甲硫氨酸饥饿或者消耗的天冬氨酸水平到依赖其的其它路径受限制的程度。
以往曾显示，包含反馈不敏感的天冬氨酸激酶的转基因植物，与野生型植物相比可以过量生产苏氨酸，其生长不良，并且如果所述植物为纯合突变，会显示灾难性的适合度损害。生长不良和适合度损害是农场主注意的植物生长中的任何不利改变。显然任何此类改变是不可取的。
因此本发明的发明人试图提供一种转基因植物，其可通过克服上述反馈抑制回路在叶片中积累苏氨酸，但理想地没有任何适合度损害。有鉴于此，本发明人开发了多种基因构建体，其中将编码苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)酶的基因置于一种启动子控制之下，以确定所述基因的过量表达对衰老叶片中苏氨酸水平有何种影响(如果有影响的话)。
叶片衰老是植物发育的一个阶段，在此阶段，在细胞死亡之前细胞经历截然不同的新陈代谢和结构变化。生理学和遗传学研究指出衰老是高度调控的过程。叶片经历衰老的进程可见的特点为失去叶绿素并随之发黄，其由叶绿体解体引起。所述发育阶段的特征，叶片叶绿素水平降低可通过例如溶剂萃取和分光光度测量或者通过叶绿素含量测定仪检测。降低的叶片叶绿素水平与记录的相同植物(优选地在恒定条件下生长)早前叶片叶绿素水平相比较，显示出衰老。
分子研究指出衰老与基因表达变化有关。衰老过程中编码涉及光合作用的蛋白质的mRNA水平降低，而编码据信涉及衰老的蛋白质的基因mRNA水平升高。衰老是由已知为衰老相关基因(SAG)的基因调控的高度有组织的过程。叶片衰老涉及蛋白质、核酸和膜的降解，以及随后由此降解导致的营养向植物其它区域输送，例如发育中的种子、叶片或贮藏器官。植物衰老的一个问题是衰老叶片中存在的很多有用的矿物质和营养会保留在叶片中，并因此会在叶片死亡时显著丢失。例如，衰老叶片中存在的苏氨酸以及很多其它氨基酸，如果不从将死的叶片中移除，将会浪费。
如实施例2所述，本发明人进行的实验涉及使用在植物中特定位点表达苏氨酸不敏感AK的基因构建体，即，使用叶片特异性豌豆质体蓝素启动子。但是，本发明人发现此类转基因植物的叶片苍白、增厚、易碎且呈带状。节间部缩短并随成熟度增加而显示褐变，并且芽或者不发育或者畸形。因此，此类转基因植物不能克服适合度损害。
因此，本发明人开发了一系列基因构建体，其中反馈不敏感的天冬氨酸激酶(AK)活性仅在植物已进入衰老之后表达(由SAG12启动子控制)，因此允许正常发育。本发明人观察到所开发的构建体，其允许使用这些构建体转化的转基因植物在反馈不敏感的天冬氨酸激酶(AK)启动之前正常生长至成熟(即，至衰老)，令人惊奇地能克服适合度损害。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种基因构建体，其包含可操作性连接到一种编码序列的衰老特异性启动子，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。
本发明人使用一种衰老特异性启动子连接到编码序列，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽，以形成第一个方面的构建体，然后将其用于转化植物。作为其研究结果，本发明人令人惊奇地发现根据本发明的构建体在衰老叶片中导致苏氨酸水平升高。此外，由衰老特异性启动子控制的转基因表达的时间限制克服了之前在生产苏氨酸积累植物的以往尝试中所见的适合度损害的负面影响。如实施例所示，得到的转基因植物在叶片衰老过程中生产苏氨酸的水平高于野生型。证明在叶片中发生苏氨酸积累，且升高的水平据信对包含所述构建体的烟草叶片以及用所述叶片制造的吸烟制品的味道有正面贡献。
第一个方面的基因构建体中的启动子可能可以诱导RNA聚合酶结合并开始转录所述编码序列，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。
“衰老特异性启动子”(SAG)可为任何与控制衰老相关基因表达有关的启动子。因此，所述启动子基本上专门在衰老组织中能限制其可操作性连接的编码序列(即基因)的表达。因此，衰老特异性启动子可为能在植物组织中以发育调控方式优先启动基因表达的启动子，使得3’蛋白质编码区域表达基本上仅当植物组织经历衰老时发生。应了解衰老易于在植物的较老部分发生，例如较老叶片，而不是在植物的较新部分，例如种子。
已知表达多种衰老相关基因的植物的一个示例为拟南芥(Arabidopsis)。因此，根据第一个方面的构建体中存在的启动子可从拟南芥中的衰老相关基因分离。Gepstein等人(The Plant Journal，2003，36，629-642)使用拟南芥作为模型进行了SAG及其启动子的详细研究。因此，所述基因构建体可包含来自此篇论文中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可选自：SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18，或者其功能变体或功能片段。
优选的启动子为SAG12和SAG13启动子。在一种实施方案中，所述启动子为本领域技术人员已知的SAG12启动子，或者其功能变体或功能片段(Gan&Amasino，1997，Plant Physiology，113：313-319)。编码SAG12启动子的DNA序列如图6所示，本文称为SEQ ID No.1，如下：
TCGAGACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGACAAAAAAGTAGAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTA
GTTTCATTACGTTTCGATAAAAAAATGATTAGTTTATCATAGCTTAATTATAGCATTGATTTCTAAATTT
GTTTTTTGACCACCCTTTTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGT
TCAAATTAATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTTAATGAAAACAGTTGA
ATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATATATGAACTCAGTT
GTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACAGATCATGAAGTGTTAAAAAGTGTCAGAATATGACAT
GAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATTCGAGTTATAGGTTTGGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATACTA
GTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAAGAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAG
ACACTCGTATTAGTTGGTACTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGA
CAACTCGTATCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTCAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGT
TGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAATAACAAAGTT
TTATAGATTTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTATTTACACCGCATTTTTCCC
TGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTTGACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACA
ATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAATATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATA
TCACTATAATAAAATAATTCTAATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGT
ATTTTAGACGTTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCC
CTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACATTTATATTGT
ATTCTAATGACAGGGAAACCTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGTGGGAAACATCATTGAACAGG
AAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAATACGTAGCGTAATGAAGTCCACTTGTTGTGA
ATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATTTTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTA
ACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGAC
AAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAA
AAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGAT
AGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGG
AAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGA
AATTAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAAATATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCAC
CACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAA
AATGACTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAAC
AAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTAT
AAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTAGG
SEQ ID NO：1
因此，本发明构建体中的启动子可包含基本上如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者其功能变体或功能片段。SAG12启动子序列可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，如美国专利5,689,042所述。在启动子为SAG12的实施方案中，应了解所述启动子可包含SEQ ID No：1的碱基1-2093的每一个。但是，所述启动子的功能变体或功能片段也可用于本发明的基因构建体。
“启动子的功能变体或功能片段”可为所述启动子的衍生物或一部分，其功能上足以启动其操作性连接的任何编码区域的表达。例如，在启动子基于SAG12的实施方案中，本领域技术人员应了解SEQ ID No：1可被修饰，或者仅需要SAG12启动子的某些部分，由此在所述构建体中其仍然会启动具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的基因表达。类似的修饰可用于任何其它已知SAG启动子的核苷酸序列，例如SAG13、SAG101、SAG21和SAG18。
启动子的功能变体或功能片段可通过以下方法容易地鉴定：评估转录酶是否结合假定的启动子区域，然后导致该编码序列转录为具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。备选地，此类功能变体和片段可通过当结合编码区域时在启动子上进行诱变并评估基因表达是否发生来检测。
第一个方面的基因构建体可能可以在衰老过程中引起具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽表达。所述启动子可诱导一种编码序列表达，所述编码序列编码显示苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。因此，所述基因构建体可包含至少一个编码苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)的编码序列，或者其功能变体或片段。因此，在第一个实施方案中，所述基因构建体可包含衰老特异性启动子和编码苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)的编码序列，或者其功能变体或片段。
如实施例3-4所述，通过使用本发明的构建体转化植物，本发明人发现在宿主细胞中苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶表达，引起苏氨酸水平的显著上升。此外，有利地，本发明人发现所述构建体对所转化植物的适合度没有任何不利影响。
如图1和2所示，在植物中，氨基酸赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸从天冬氨酸合成。在此路径中已发现多个反馈抑制回路。在此路径中的第一种酶，天冬氨酸激酶(AK)(EC 2.7.2.4)，伴随ATP水解催化天冬氨酸磷酸化以形成3-天冬氨酰磷酸。据信高等植物通常具有至少2种或3种AK同工酶。AK活性经受来自终产物氨基酸赖氨酸和苏氨酸的负反馈。至少一种AK同工酶由苏氨酸反馈抑制，另一种由赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反馈抑制。在大麦中，AK活性可分为3个同工酶峰，其中一个由苏氨酸抑制，另两个由赖氨酸抑制。其它反馈回路作用于所述生物合成路径的其它酶，例如二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)和高丝氨酸去饱和酶(HSD)。
如图1和2所示，高丝氨酸去饱和酶(HSD)(EC 1.1.1.3)，也称为高丝氨酸脱氢酶(HSDH)，催化仅与苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸生物合成相关的第一个反应，即3-天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。高等植物通常具有至少两种HSDH形式：一种苏氨酸敏感和一种苏氨酸不敏感形式。纯化HSDH和cDNA克隆的特性已证实HSDH同工酶在单个蛋白质上连接AK，因此称为“AK:HSDH”。
升高的叶片苏氨酸(Thr)含量取决于克服合成路径中的负反馈控制。例如，已生产出表达来自E.coli的赖氨酸不敏感AK的转基因烟草，其显示出苏氨酸积累表型。在这些转化体中，细菌AK在烟草中35S控制下表达，靶向细胞质或者叶绿体。AK内源活性仍完全受赖氨酸和苏氨酸抑制影响。导向叶绿体的转基因AK活性较高。在表达叶绿体形式的植物中发现较高的苏氨酸水平。但是，注意到植物生长不良，且纯合植物显示出适合度损失，包括上部叶片皱缩、开花延迟和部分不育。
在拟南芥中进行的工作(Paris等人，2003，The Journal of Biological Chemistry，第278卷，no.7，pp5361-5366)表明AK:HSDH酶的调控结构域包含两个同源的亚结构域，其特征为普通的环-α螺旋-环-β折叠-环-β折叠基序。使用定点诱变以明确苏氨酸结合位点。发现天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶单体的每个调控结构域具有两个非等同的苏氨酸结合位点，部分由Gln443和Gln524构成。苏氨酸结合Gln443抑制AK活性并促进第二个苏氨酸结合Gln524而导致HSDH抑制。
图3显示了苏氨酸抑制AK-HSDH的设想模型，其中AK和HSDH的活性催化结构域以正方形表示，被抑制的催化结构域以三角形表示。苏氨酸(Thr)结合第一个亚结构域引发(i)另一个亚结构域的构象改变，以及(ii)导致AK抑制的AK催化结构域构象改变。
第二个亚结构域的构象改变将诱导第二个苏氨酸结合，导致HSDH催化结构域的构象改变和HSDH抑制。
所述谷氨酰胺残基突变为丙氨酸使所述酶的苏氨酸抑制失效。所述突变不影响HSDH活性的动力学，只影响其对苏氨酸的敏感性；AK动力学仅被轻微改变。但是，不幸地，已引入并表达来自拟南芥的反馈不敏感AK:HSDH的转基因植物也导致适合度损害。
相反，本发明的基因构建体引起具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸活性的多肽在衰老过程中表达，而不显示对转基因植物适合度的任何不利影响。因此，第一个方面的基因构建体可编码苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)，或者苏氨酸不敏感的双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)，或者它们的功能变体或功能片段。
所述苏氨酸不敏感的AK或双功能AK-HSDH，或者其功能变体或片段可源自任何合适的来源，例如植物。编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的编码序列可源自拟南芥属(Arabidopsis spp.)、玉米属(Zea spp.)、黄花菊属(Flaveria spp.)、或白花菜属(Cleome spp.)。编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的编码序列可源自拟南蓝、玉米、Flaveria trinervia、Flaveria bidentis、Flaveria brownie或白花菜。优选地，所述酶的编码序列可源自拟南芥属，例如拟南芥。
一种特别优选的苏氨酸不敏感酶为突变的AK-HSDH，其中至少一个苏氨酸结合位点已被改变。优选地，部分由Gln443和Gln524构成的苏氨酸结合位点中的一个或两个已被突变。例如，拟南芥AK-HSDH可在Gln443和/或Gln524突变。优选地，拟南芥AK-HSDH在Gln443和Gln524突变。本发明使用的突变AK:HSDH基因如图7所示，其中突变碱基以下划线标识。
因此，本文提供了编码拟南芥苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的一个实施方案(即Gln443Ala单突变)的DNA序列作为SEQ ID No：2，如下：
ATGGCGACTCTGAAGCCGTCATTTACTGTTTCTCCGCCGAATAGTAATCCGATTAGATTTGGAAGTTTTC
CGCCGCAATGCTTTCTCCGTGTTCCGAAACCGCGGCGACTTATATTGCCTAGGTTTCGGAAGACGACTGG
TGGTGGCGGCGGCTTGATTCGATGTGAGCTTCCAGATTTTCATCTATCAGCAACAGCAACTACTGTATCA
GGTGTATCGACGGTGAATTTAGTGGATCAAGTTCAGATTCCTAAAGGTGAAATGTGGAGTGTTCACAAGT
TTGGTGGGACTTGTGTGGGAAACTCTCAGAGGATCAGAAATGTAGCAGAGGTTATAATCAATGATAATTC
CGAAAGAAAACTTGTGGTTGTCTCGGCGATGTCGAAGGTTACGGACATGATGTATGACTTAATCCGCAAG
GCACAATCACGAGATGATTCTTATTTATCCGCGTTGGAAGCTGTCTTGGAAAAGCATCGTTTAACAGCTC
GTGACCTTCTCGATGGAGATGATCTCGCTAGTTTCTTGTCACATTTGCATAATGATATTAGTAATCTTAA
AGCAATGCTTCGTGCTATATACATAGCTGGCCATGCATCAGAGTCGTTTTCAGATTTTGTTGCAGGACAT
GGGGAGCTTTGGTCTGCTCAGATGCTATCATATGTTGTCAGAAAGACTGGGCTTGAGTGCAAGTGGATGG
ATACTAGAGACGTGCTCATTGTTAATCCCACCAGCTCTAATCAGGTTGATCCTGATTTTGGTGAATCTGA
GAAGAGACTCGATAAATGGTTCTCCTTAAATCCGTCGAAAATTATTATTGCGACTGGGTTTATTGCTAGC
ACTCCGCAAAATATTCCAACAACTTTGAAAAGAGATGGGAGTGATTTCTCAGCAGCTATTATGGGTGCTT
TATTGAGAGCTCGTCAAGTAACCATTTGGACAGATGTTGATGGTGTATACAGTGCGGATCCTCGTAAAGT
TAATGAGGCAGTGATACTCCAGACACTTTCTTATCAAGAGGCCTGGGAAATGTCTTATTTTGGAGCAAAT
GTGTTACATCCTCGCACCATCATTCCTGTGATGCGATATAATATTCCGATTGTGATTAGAAATATTTTCA
ATCTCTCTGCACCGGGAACAATAATCTGTCAACCTCCTGAAGATGATTATGACCTTAAACTGACAACTCC
TGTCAAAGGGTTTGCAACTATTGACAATTTGGCCCTCATAAATGTTGAAGGTACTGGAATGGCTGGTGTA
CCCGGTACTGCAAGTGACATTTTTGGCTGTGTAAAAGATGTTGGAGCTAATGTGATTATGATATCAGCTG
CTAGCAGTGAGCATTCTGTGTGCTTTGCTGTGCCTGAGAAGGAAGTAAACGCAGTCTCTGAGGCATTGCG
GTCGAGATTTAGTGAAGCTTTACAAGCGGGACGTCTTTCTCAGATTGAGGTGATACCAAACTGTAGCATC
TTAGCTGCAGTCGGCCAGAAAATGGCTAGTACACCTGGAGTTAGTTGTACACTTTTCAGTGCTTTGGCGA
AGGCTAATATTAATGTCCGAGCTATATCTCARGGTTGTTCTGAGTACAATGTTACTGTCGTTATTAAACG
TGAAGATAGCGTTAAGGCGTTAAGAGCTGTACACTCGAGGTTTTTCTTGTCAAGAACAACATTAGCAATG
GGAATCGTAGGACCGGGCTTGATTGGTGCAACATTACTTGACCAGCTGCGGGATCAGGCTGCTGTTCTCA
AACAAGAATTTAACATTGATCTGCGTGTTTTGGGAATCACTGGTTCAAAGAAGATGTTATTGAGTGACAT
TGGTATTGATTTGTCGAGATGGAGAGAACTTCTAAACGAGAAGGGAACAGAGGCGGATTTGGATAAATTC
ACTCAACAAGTGCATGGAAATCATTTTATCCCCAACTCTGTAGTGGTTGATTGTACAGCAGACTCTGCTA
TTGCAAGCCGTTACTATGATTGGTTACGAAAGGGAATTCATGTCATTACCCCAAATAAAAAGGCTAACTC
AGGTCCCCTCGATCAGTACTTGAAACTGAGAGATCTTCAAAGGAAATCCTACACTCATTACTTCTACGAA
GCCACTGTTGGAGCTGGTCTTCCAATTATCAGCACTTTACGTGGTCTCCTTGAGACAGGAGATAAGATAC
TACGCATAGAGGGCATTTGCAGTGGAACTTTGAGTTATCTATTCAACAATTTTGTTGGAGATCGAAGTTT
CAGCGAGGTTGTCACTGAAGCAAAGAACGCAGGTTTCACTGAGCCTGATCCAAGAGATGATTTATCTGGA
ACTGATGTTGCAAGGAAGGTGATTATCCTCGCTCGAGAATCTGGACTGAAATTGGACCTCGCTGATCTCC
CCATTAGAAGTCTCGTACCAGAACCTCTAAAAGGATGCACTTCTGTTGAAGAATTCATGGAGAAACTCCC
ACAGTACGATGGAGACCTAGCAAAAGAAAGGCTAGATGCTGAAAACTCTGGGGAAGTTCTGAGATATGTT
GGAGTGGTGGACGCTGTTAACCAAAAGGGAACAGTTGAACTTCGAAGATACAAGAAAGAACATCCATTTG
CGCAGCTCGCAGGTTCAGACAACATAATAGCCTTCACAACGACAAGGTACAAGGATCATCCACTTATAGT
CCGAGGACCTGGAGCTGGTGCTCAAGTCACGGCCGGTGGTATATTCAGCGACATACTAAGGCTTGCATCT
TATCTCGGTGCACCGTCTTAA
SEQ ID No：2
在SEQ ID No：2(即Q443A)中，突出显示的GCT对应于编码丙氨酸的突变Gln443，而突出显示的CAR对应于野生型Gln524，其中R可为G或A。
本文提供了编码拟南芥苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的另一实施方案(即Gln524Ala单突变)的DNA序列作为SEQ ID No：3，如下：
ATGGCGACTCTGAAGCCGTCATTTACTGTTTCTCCGCCGAATAGTAATCCGATTAGATTTGGAAGTTTTC
CGCCGCAATGCTTTCTCCGTGTTCCGAAACCGCGGCGACTTATATTGCCTAGGTTTCGGAAGACGACTGG
TGGTGGCGGCGGCTTGATTCGATGTGAGCTTCCAGATTTTCATCTATCAGCAACAGCAACTACTGTATCA
GGTGTATCGACGGTGAATTTAGTGGATCAAGTTCAGATTCCTAAAGGTGAAATGTGGAGTGTTCACAAGT
TTGGTGGGACTTGTGTGGGAAACTCTCAGAGGATCAGAAATGTAGCAGAGGTTATAATCAATGATAATTC
CGAAAGAAAACTTGTGGTTGTCTCGGCGATGTCGAAGGTTACGGACATGATGTATGACTTAATCCGCAAG
GCACAATCACGAGATGATTCTTATTTATCCGCGTTGGAAGCTGTCTTGGAAAAGCATCGTTTAACAGCTC
GTGACCTTCTCGATGGAGATGATCTCGCTAGTTTCTTGTCACATTTGCATAATGATATTAGTAATCTTAA
AGCAATGCTTCGTGCTATATACATAGCTGGCCATGCATCAGAGTCGTTTTCAGATTTTGTTGCAGGACAT
GGGGAGCTTTGGTCTGCTCAGATGCTATCATATGTTGTCAGAAAGACTGGGCTTGAGTGCAAGTGGATGG
ATACTAGAGACGTGCTCATTGTTAATCCCACCAGCTCTAATCAGGTTGATCCTGATTTTGGTGAATCTGA
GAAGAGACTCGATAAATGGTTCTCCTTAAATCCGTCGAAAATTATTATTGCGACTGGGTTTATTGCTAGC
ACTCCGCAAAATATTCCAACAACTTTGAAAAGAGATGGGAGTGATTTCTCAGCAGCTATTATGGGTGCTT
TATTGAGAGCTCGTCAAGTAACCATTTGGACAGATGTTGATGGTGTATACAGTGCGGATCCTCGTAAAGT
TAATGAGGCAGTGATACTCCAGACACTTTCTTATCAAGAGGCCTGGGAAATGTCTTATTTTGGAGCAAAT
GTGTTACATCCTCGCACCATCATTCCTGTGATGCGATATAATATTCCGATTGTGATTAGAAATATTTTCA
ATCTCTCTGCACCGGGAACAATAATCTGTCAACCTCCTGAAGATGATTATGACCTTAAACTGACAACTCC
TGTCAAAGGGTTTGCAACTATTGACAATTTGGCCCTCATAAATGTTGAAGGTACTGGAATGGCTGGTGTA
CCCGGTACTGCAAGTGACATTTTTGGCTGTGTAAAAGATGTTGGAGCTAATGTGATTATGATATCACARG
CTAGCAGTGAGCATTCTGTGTGCTTTGCTGTGCCTGAGAAGGAAGTAAACGCAGTCTCTGAGGCATTGCG
GTCGAGATTTAGTGAAGCTTTACAAGCGGGACGTCTTTCTCAGATTGAGGTGATACCAAACTGTAGCATC
TTAGCTGCAGTCGGCCAGAAAATGGCTAGTACACCTGGAGTTAGTTGTACACTTTTCAGTGCTTTGGCGA
AGGCTAATATTAATGTCCGAGCTATATCTGCTGGTTGTTCTGAGTACAATGTTACTGTCGTTATTAAACG
TGAAGATAGCGTTAAGGCGTTAAGAGCTGTACACTCGAGGTTTTTCTTGTCAAGAACAACATTAGCAATG
GGAATCGTAGGACCGGGCTTGATTGGTGCAACATTACTTGACCAGCTGCGGGATCAGGCTGCTGTTCTCA
AACAAGAATTTAACATTGATCTGCGTGTTTTGGGAATCACTGGTTCAAAGAAGATGTTATTGAGTGACAT
TGGTATTGATTTGTCGAGATGGAGAGAACTTCTAAACGAGAAGGGAACAGAGGCGGATTTGGATAAATTC
ACTCAACAAGTGCATGGAAATCATTTTATCCCCAACTCTGTAGTGGTTGATTGTACAGCAGACTCTGCTA
TTGCAAGCCGTTACTATGATTGGTTACGAAAGGGAATTCATGTCATTACCCCAAATAAAAAGGCTAACTC
AGGTCCCCTCGATCAGTACTTGAAACTGAGAGATCTTCAAAGGAAATCCTACACTCATTACTTCTACGAA
GCCACTGTTGGAGCTGGTCTTCCAATTATCAGCACTTTACGTGGTCTCCTTGAGACAGGAGATAAGATAC
TACGCATAGAGGGCATTTGCAGTGGAACTTTGAGTTATCTATTCAACAATTTTGTTGGAGATCGAAGTTT
CAGCGAGGTTGTCACTGAAGCAAAGAACGCAGGTTTCACTGAGCCTGATCCAAGAGATGATTTATCTGGA
ACTGATGTTGCAAGGAAGGTGATTATCCTCGCTCGAGAATCTGGACTGAAATTGGACCTCGCTGATCTCC
CCATTAGAAGTCTCGTACCAGAACCTCTAAAAGGATGCACTTCTGTTGAAGAATTCATGGAGAAACTCCC
ACAGTACGATGGAGACCTAGCAAAAGAAAGGCTAGATGCTGAAAACTCTGGGGAAGTTCTGAGATATGTT
GGAGTGGTGGACGCTGTTAACCAAAAGGGAACAGTTGAACTTCGAAGATACAAGAAAGAACATCCATTTG
CGCAGCTCGCAGGTTCAGACAACATAATAGCCTTCACAACGACAAGGTACAAGGATCATCCACTTATAGT
CCGAGGACCTGGAGCTGGTGCTCAAGTCACGGCCGGTGGTATATTCAGCGACATACTAAGGCTTGCATCT
TATCTCGGTGCACCGTCTTAA
SEQ ID No：3
在SEQ ID No：3(即Q524A)中，突出显示的GCT对应于编码丙氨酸的突变Gln524，而突出显示的CAR对应于野生型Gln443，其中R可为G或A。
本文提供了编码拟南芥苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的另一实施方案(即Gln443Ala；Gln524Ala双突变)的DNA序列作为SEQ ID No：4，如下：
ATGGCGACTCTGAAGCCGTCATTTACTGTTTCTCCGCCGAATAGTAATCCGATTAGATTTGGAAGTTTTC
CGCCGCAATGCTTTCTCCGTGTTCCGAAACCGCGGCGACTTATATTGCCTAGGTTTCGGAAGACGACTGG
TGGTGGCGGCGGCTTGATTCGATGTGAGCTTCCAGATTTTCATCTATCAGCAACAGCAACTACTGTATCA
GGTGTATCGACGGTGAATTTAGTGGATCAAGTTCAGATTCCTAAAGGTGAAATGTGGAGTGTTCACAAGT
TTGGTGGGACTTGTGTGGGAAACTCTCAGAGGATCAGAAATGTAGCAGAGGTTATAATCAATGATAATTC
CGAAAGAAAACTTGTGGTTGTCTCGGCGATGTCGAAGGTTACGGACATGATGTATGACTTAATCCGCAAG
GCACAATCACGAGATGATTCTTATTTATCCGCGTTGGAAGCTGTCTTGGAAAAGCATCGTTTAACAGCTC
GTGACCTTCTCGATGGAGATGATCTCGCTAGTTTCTTGTCACATTTGCATAATGATATTAGTAATCTTAA
AGCAATGCTTCGTGCTATATACATAGCTGGCCATGCATCAGAGTCGTTTTCAGATTTTGTTGCAGGACAT
GGGGAGCTTTGGTCTGCTCAGATGCTATCATATGTTGTCAGAAAGACTGGGCTTGAGTGCAAGTGGATGG
ATACTAGAGACGTGCTCATTGTTAATCCCACCAGCTCTAATCAGGTTGATCCTGATTTTGGTGAATCTGA
GAAGAGACTCGATAAATGGTTCTCCTTAAATCCGTCGAAAATTATTATTGCGACTGGGTTTATTGCTAGC
ACTCCGCAAAATATTCCAACAACTTTGAAAAGAGATGGGAGTGATTTCTCAGCAGCTATTATGGGTGCTT
TATTGAGAGCTCGTCAAGTAACCATTTGGACAGATGTTGATGGTGTATACAGTGCGGATCCTCGTAAAGT
TAATGAGGCAGTGATACTCCAGACACTTTCTTATCAAGAGGCCTGGGAAATGTCTTATTTTGGAGCAAAT
GTGTTACATCCTCGCACCATCATTCCTGTGATGCGATATAATATTCCGATTGTGATTAGAAATATTTTCA
ATCTCTCTGCACCGGGAACAATAATCTGTCAACCTCCTGAAGATGATTATGACCTTAAACTGACAACTCC
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CCCGGTACTGCAAGTGACATTTTTGGCTGTGTAAAAGATGTTGGAGCTAATGTGATTATGATATCAGCTG
CTAGCAGTGAGCATTCTGTGTGCTTTGCTGTGCCTGAGAAGGAAGTAAACGCAGTCTCTGAGGCATTGCG
GTCGAGATTTAGTGAAGCTTTACAAGCGGGACGTCTTTCTCAGATTGAGGTGATACCAAACTGTAGCATC
TTAGCTGCAGTCGGCCAGAAAATGGCTAGTACACCTGGAGTTAGTTGTACACTTTTCAGTGCTTTGGCGA
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TTGCAAGCCGTTACTATGATTGGTTACGAAAGGGAATTCATGTCATTACCCCAAATAAAAAGGCTAACTC
AGGTCCCCTCGATCAGTACTTGAAACTGAGAGATCTTCAAAGGAAATCCTACACTCATTACTTCTACGAA
GCCACTGTTGGAGCTGGTCTTCCAATTATCAGCACTTTACGTGGTCTCCTTGAGACAGGAGATAAGATAC
TACGCATAGAGGGCATTTGCAGTGGAACTTTGAGTTATCTATTCAACAATTTTGTTGGAGATCGAAGTTT
CAGCGAGGTTGTCACTGAAGCAAAGAACGCAGGTTTCACTGAGCCTGATCCAAGAGATGATTTATCTGGA
ACTGATGTTGCAAGGAAGGTGATTATCCTCGCTCGAGAATCTGGACTGAAATTGGACCTCGCTGATCTCC
CCATTAGAAGTCTCGTACCAGAACCTCTAAAAGGATGCACTTCTGTTGAAGAATTCATGGAGAAACTCCC
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GGAGTGGTGGACGCTGTTAACCAAAAGGGAACAGTTGAACTTCGAAGATACAAGAAAGAACATCCATTTG
CGCAGCTCGCAGGTTCAGACAACATAATAGCCTTCACAACGACAAGGTACAAGGATCATCCACTTATAGT
CCGAGGACCTGGAGCTGGTGCTCAAGTCACGGCCGGTGGTATATTCAGCGACATACTAAGGCTTGCATCT
TATCTCGGTGCACCGTCTTAA
SEQ ID No：4
在SEQ ID No：4(即Q443A；Q524A)中，突出显示的GCT对应于均编码丙氨酸的突变Gln443和Gln524。
因此，编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的编码序列可包含基本上如SEQ ID No：2、3或4中任一序列所示的核酸序列，或者其功能变体或片段。
本文提供了苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的一个实施方案(即Gln443Ala单突变)的多肽序列作为SEQ ID No：5，如下：
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GVVDAVNQKGTVELRRYKKEHPFAQLAGSDNIIAFTTTRYKDHPLIVRGPGAGAQVTAGG
IFSDILRLASYLGAPS
SEQ ID No：5
在SEQ ID No：5中，突出显示了位点443的突变丙氨酸(A)和位点524的野生型谷氨酰胺(Q)。
本文提供了苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的另一实施方案(即Gln524Ala单突变)的多肽序列作为SEQ ID No：6，如下：
MATLKPSFTVSPPNSNPIRFGSFPPQCFLRVPKPRRLILPRFRKTTGGGGGLIRCELPDF
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GVVDAVNQKGTVELRRYKKEHPFAQLAGSDNIIAFTTTRYKDHPLIVRGPGAGAQVTAGG
IFSDILRLASYLGAPS
SEQ ID No：6
在SEQ ID No：6中，突出显示了位点524的突变丙氨酸(A)和位点443的野生型谷氨酰胺(Q)。
本文提供了苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶的另一实施方案(即Gln443Ala；Gln524Ala双突变)的多肽序列作为SEQ ID No：7，如下：
MATLKPSFTVSPPNSNPIRFGSFPPQCFLRVPKPRRLILPRFRKTTGGGGGLIRCELPDF
HLSATATTVSGVSTVNLVDQVQIPKGEMWSVHKFGGTCVGNSQRIRNVAEVIINDNSERK
LVVVSAMSKVTDMMYDLIRKAQSRDDSYLSALEAVLEKHRLTARDLLDGDDLASFLSHLH
NDISNLKAMLRAIYIAGHASESFSDFVAGHGELWSAQMLSYVVRKTGLECKWMDTRDVLI
VNPTSSNQVDPDFGESEKRLDKWFSLNPSKIIIATGFIASTPQNIPTTLKRDGSDFSAAI
MGALLRARQVTIWTDVDGVYSADPRKVNEAVILQTLSYQEAWEMSYFGANVLHPRTIIPV
MRYNIPIVIRNIFNLSAPGTIICQPPEDDYDLKLTTPVKGFATIDNLALINVEGTGMAGV
PGTASDIFGCVKDVGANVIMISAASSEHSVCFAVPEKEVNAVSEALRSRFSEALQAGRLS
QIEVIPNCSILAAVGQKMASTPGVSCTLFSALAKANINVRAISAGCSEYNVTVVIKREDS
VKALRAVHSRFFLSRTTLAMGIVGPGLIGATLLDQLRDQAAVLKQEFNIDLRVLGITGSK
KMLLSDIGIDLSRWRELLNEKGTEADLDKFTQQVHGNHFIPNSVVVDCTADSAIASRYYD
WLRKGIHVITPNKKANSGPLDQYLKLRDLQRKSYTHYFYEATVGAGLPIISTLRGLLETG
DKILRIEGICSGTLSYLFNNFVGDRSFSEVVTEAKNAGFTEPDPRDDLSGTDVARKVIIL
ARESGLKLDLADLPIRSLVPEPLKGCTSVEEFMEKLPQYDGDLAKERLDAENSGEVLRYV
GVVDAVNQKGTVELRRYKKEHPFAQLAGSDNIIAFTTTRYKDHPLIVRGPGAGAQVTAGG
IFSDILRLASYLGAPS
SEQ ID No：7
在SEQ ID No：7中，突出显示了位点443和524的突变丙氨酸(A)。
因此，具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽序列可包含基本上如SEQ ID No：5、6或7中任一序列所示的氨基酸序列，或者其功能变体或片段。
本发明的基因构建体可为表达盒形式，其可能适合在宿主细胞中表达编码序列。本发明的基因构建体可引入宿主细胞而不需整合进载体。例如，所述基因构建体，其可为核酸分子，可整合在脂质体或病毒颗粒中。替代地，纯化的核酸分子(例如无组蛋白DNA，或裸DNA)可通过合适的方法直接插入宿主细胞，例如直接胞吞摄取。所述基因构建体可通过转染、感染、微注射、细胞融合、原生质体融合或微弹轰击法直接引入宿主对象(例如植物)的细胞。替代地，本发明的基因构建体可使用基因枪直接引入宿主细胞。替代地，所述基因构建体可包含在重组载体中，用于合适的宿主细胞内表达。
因此，在第二个方面，提供了一种重组载体，其包含根据第一个方面的基因构建体。
所述重组载体可为质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体高度有益于使用第一个方面的基因构建体转化宿主细胞，并在其中复制所述表达盒。本领域技术人员应了解本发明的基因构建体可结合多种类型的骨架载体用于表达目的。所述骨架载体可为双元载体，例如在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中都可复制的载体。例如，合适的载体可为pBIN质粒，例如pBIN19。但是，优选的骨架载体为BNP1380000001，其基于pBINPLUS(F.A.van Engelen等人Transgenic Research(1995)4，288-290)，且其包含SAG12启动子。此类载体的一种实施方案如图16所示。
除启动子(例如衰老相关启动子)之外重组载体可包括多种其它功能元件，以及至少一种编码序列(编码突变AK-HSDH)。例如，可设计重组载体以使其在宿主细胞的胞质溶胶中自主复制。在这种情况下，重组载体中可能需要诱导或调控DNA复制的元件。替代地，可设计重组载体以使其整合进入宿主细胞的基因组。在这种情况下，考虑易于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可包含编码可在克隆过程中用作选择标记的基因的DNA，即，可选择已被转染或转化的细胞，以及可选择包含整合异源DNA的载体的细胞。替代地，选择标记基因可在不同的载体中与包含目标基因的载体共同使用。该载体还可包含涉及调控编码序列表达、或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞某一部分例如叶绿体的DNA。因此，第二个方面的载体可包含至少一种其它元件，其选自：选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；以及蛋白质靶向序列(例如叶绿体转运肽)。
合适的标记基因的实施例包括抗生素抗性基因，例如对卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II，hyg-B)赋予抗性的基因；除草剂抗性基因，例如对基于膦丝菌素和磺胺的除草剂赋予抗性的基因(分别为bar和suI；EP-A-242246，EP-A-0249637)；以及可筛选标记，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GB2197653)、荧光素酶和绿色荧光蛋白质(GFP)。
标记基因可由第二个启动子(可能是或可能不是衰老相关启动子)控制，其允许在细胞中表达，可能在或可能不在种子中，由此允许在植物发育的任何阶段选择包含标记的细胞或组织。合适的第二个启动子为农杆菌胭脂碱合酶基因的启动子，以及源自编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。但是，可使用任何其它合适的第二个启动子。
本发明的基因构建体的多个实施方案可使用合适的克隆步骤制备，如实施例2中描述，可总结如下。编码野生型AK-HSDH的基因可使用合适的引物通过PCR从基因组或cDNA模板扩增。用于扩增野生型AK-HSDH基因的合适的引物可为SEQ ID No：8和/或SEQ ID No：9。PCR产物可使用琼脂糖凝胶电泳检测。然后可使用合适的引物对进行定点诱变以将野生型密码子在位点443和/或524突变以产生Gln443Ala和Gln524Ala单突变或双突变。例如，用于改变Gln443密码子的合适的引物可为SEQ ID No：10和/或SEQ ID No：11。用于改变Gln524密码子的合适的引物可为SEQ ID No：12和/或SEQ ID No：13。
然后编码两种单突变体之中任意一个或双突变体的PCR产物可连接进入用于克隆目的的合适的载体，例如可购自Invitrogen的商品名为pCR4Blunt-TOPO载体的载体。然后包含PCR产物的载体可在合适的宿主中生长，例如E.coli。然后E.coli菌落可使用合适的引物通过PCR筛选，显示正确的限制性内切酶消化图谱的质粒插入片段可使用合适的引物测序。
可培养携带TOPO-cDNA(AK-HSDH)的E.coli菌落以生产合适数量的质粒，然后纯化。然后可消化所述质粒以释放编码突变体AK-HSDH的DNA片段，然后其可克隆进入包含合适的启动子例如SAG启动子(优选地，SAG12)的载体，例如pBNP质粒。产生的质粒命名为pBNP138-0453-001。根据第二个方面的质粒的一个实施方案可基本上如图15所示。
在第三个方面，提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物在叶片中积累的苏氨酸水平高于在相同条件下培育的对应野生型植物，所述方法包含：
(i)使用第一个方面的基因构建体或者第二个方面的载体转化植物细胞，以及
(ii)从转化细胞再生植物。
确定植物叶片中苏氨酸水平以及植物生长率的方法如实施例1所述。第三个方面的方法可包含以根据第一个方面的基因构建体或者根据第二个方面的载体转化试验植物细胞。所述基因构建体或载体可使用任何合适的方法引入宿主细胞。
在第四个方面，提供了一种细胞，其包含根据第一个方面的基因构建体或者根据第二个方面的重组载体。
所述细胞可为植物细胞。由于本发明人已观察到在宿主细胞中在衰老特异性启动子控制下表达苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶令人惊奇地在衰老叶片中有效增加苏氨酸浓度而不损害适合度，第四个方面的细胞可包含第一个方面的一个或多个构建体，或者第二个方面的一个或多个载体。
可使用已知技术以根据本发明的基因构建体或载体转化细胞。将基因构建体引入宿主细胞的合适的方法可包括通过本领域已知的方法使用农杆菌携带的卸甲Ti质粒载体，例如如EP-A-0116718和EP-A-0270822中所述。另一种方法可为转化植物原生质体，其涉及首先去除细胞壁并引入核酸，然后重建细胞壁。然后该转化的细胞可生长为植物。
在第五个方面，提供了一种转基因植物，其包含根据第一个方面的基因构建体或者根据第二个方面的载体。
根据第五个方面的转基因植物可包括十字花科，例如Brassica spp。所述植物可为Brassica napus(油菜)。
根据第五个方面的转基因植物的其它实施例包括禾本科，例如Triticeae spp。所述植物可为Triticum spp.(小麦)。增加小麦中籽粒蛋白含量可引起包含此类小麦例如面包的食品体积增加。
根据第五个方面的合适的转基因植物的其它实施例包括茄科植物，其包括，例如曼陀罗、茄子、曼德拉草、颠茄(belladonna)、辣椒(红辣椒、尖椒)、马铃薯和烟草。茄科合适的属的一个实施例为烟草属(Nicotiana)。烟草属的合适的种可指烟草植物，或简称烟草。以第一个方面的基因构建体或者第二个方面的载体转化植物的多种方法是已知的并可用于本发明。
例如，烟草可如下转化。使用基本如Horsch等人(Science 227：1229-1231，1985)所述的叶盘协同培养方法转化烟草。两片最嫩展开叶可取自7周龄烟草植物，可在8％DomestosTM中表面消毒10分钟并使用无菌蒸馏水洗涤6次。叶盘可使用6号软木打孔器切取并置于包含合适双元载体(根据本发明)的农杆菌悬浮液中约2分钟。所述叶盘可在两层无菌滤纸之间轻轻吸干。10片叶盘可置于LS 3％蔗糖+2μM BAP+0.2μM NAA平板上，然后可在生长室中培养2天。
叶盘可转移至补充500g/l凯福隆和100g/l卡那霉素的LS+3％蔗糖+2μM BAP+0.2μM NAA平板。两周后所述叶盘可转移至上述培养基的新鲜平板。再过两周之后，该叶盘可转移至包含补充500mg/l凯福隆和100mg/l卡那霉素的LS+3％蔗糖+0.5μM BAP的平板上。该叶盘可每两周转移至新鲜培养基。幼苗出现时，可切除并转移至补充500mg/l凯福隆的LS+3％蔗糖瓶中。约4周后瓶中的幼苗可转移至LS+3％蔗糖+250mg/l凯福隆。再过3-4周之后，该植物可转移至LS+3％蔗糖(无抗生素)并生根。植物一旦生根即可转移至温室土壤中。
在第六个方面，提供了一种可获自根据第五个方面的转基因植物的植物繁殖产品。
“植物繁殖产品”可为获自植物并从其中可产生更多植物的任何植物物质。适当地，所述植物繁殖产品可为种子。
本发明还包含从本发明的转基因植物收获的叶片，其中收获的叶片包含的苏氨酸水平高于在相同条件下培育的对应野生型植物收获的叶片。
因此，在第七个方面，提供了收获的叶片，其包含的苏氨酸水平高于获自相同条件下培育的野生型植物的收获叶片中的对应苏氨酸水平，其中所述叶片收获自根据第五个方面的转基因植物，或者通过根据第三个方面的方法生产。
本发明的第八个方面提供了一种吸烟制品，其包含获自突变体烟草植物的苏氨酸富集烟草，所述突变体能够在衰老叶片中过量生产苏氨酸。
有利地并优选地，所述突变体烟草植物可以本发明的基因构建体或载体转化。所述吸烟制品可为香烟、雪茄、小雪茄、或卷烟，或诸如此类。
苏氨酸富集的烟草可包括苏氨酸浓度高于在相同条件下培育的野生型植物的对应浓度的烟草。此类吸烟制品可包含获自突变体烟草植物的烟草，所述突变体烟草植物可以根据本发明第一个方面的基因构建体或者根据第二个方面的载体转化。所述苏氨酸富集烟草的味道和香气有所改进。
应了解本发明提供了一种提高植物叶片中苏氨酸水平至对应野生型水平以上而不损害植物适合度的方法，这包含改变植物新陈代谢以在叶片衰老开始之后实现苏氨酸生产增加。
因此，在本发明的第九个方面中，提供了一种提高植物叶片中苏氨酸水平至对应野生型水平以上而不损害植物适合度的方法，所述方法包含改变植物新陈代谢以在叶片衰老开始之后实现苏氨酸生产增加。
优选地并有利地，根据本发明的方法并不损害产生的植物的健康或适合度。优选地，所述方法包含以第一个方面的基因构建体或者第二个方面的载体转化试验植物，且优选地转化其叶片。
如实施例4所述，除测定本发明的转化植物的苏氨酸水平及显示衰老叶片中苏氨酸浓度增加之外，本发明人还测定了所述转基因植物中其它氨基酸的浓度，包括谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸。如图10-14所示，所述氨基酸中每种氨基酸的浓度都与对照相当乃至更高，强烈提示所述转基因植物的适合度未被损害。因此总的来说，本发明的构建体可适用于增加衰老叶片中的苏氨酸水平而不负面影响转基因植物的适合度。
应了解本发明扩展至任何核酸或肽或者其变体、衍生物或类似物，其包含本文提及的任何序列的基本氨基酸或核酸序列，包括其功能变体或功能片段。术语“基本氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”可为与本文提及的任一序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列具有至少40％序列一致性的序列，例如与确定为SEQ ID No：1的启动子(即SAG12启动子)或者确定为SEQ ID No.2、3或4的基因(其编码AK-HSDH酶的多种实施方案)40％一致，或者与确定为SEQ ID No.5、6或7的多肽(即突变体AK-HSDH酶的多种实施方案)40％一致，等等。
还预期具有序列一致性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列，其与提及的任何序列具有高于65％、更优选地高于70％、更优选地高于75％、及更优选地高于80％序列一致性。优选地，所述氨基酸/多核苷酸/多肽序列与提及的任何序列具有至少85％一致性，更优选地与本文提及的任何序列具有至少90％一致性、更优选地至少92％一致性、更优选地至少95％一致性、更优选地至少97％一致性、甚至更优选地至少98％一致性、以及最优选地至少99％一致性。
本领域技术人员应了解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性。为计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性，必须首先准备两个序列比对，然后计算序列一致性数值。两个序列的百分比一致性可有不同数值，取决于：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同程序中执行)，或者3D比较的结构比对；以及(ii)比对方法使用的参数，例如局部与全局比对，使用的配对计分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)，以及空位罚分，例如函数形式和常数。
进行比对之后，有多种不同方法计算两个序列之间的百分比一致性。例如，可用一些数量除以(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位点的数量；或者(v)除突出部外相同位点的数量。此外，应了解百分比一致性也大大取决于长度。因此，一对序列越短，可预期偶然发生的序列一致性越高。
因此，应了解蛋白质或DNA序列的精确比对是复杂的过程。常见的多重比对程序ClustalW(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680；Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research，24，4876-4882)是一种优选的产生根据本发明的蛋白质或DNA多重比对的方法。用于ClustalW的合适的参数可为以下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位伸展罚分＝6.66，矩阵＝一致性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位伸展罚分＝0.2，矩阵＝Gonnet。对于DNA与蛋白质比对：ENDGAP＝-1，GAPDIST＝4。本领域技术人员应了解为优化序列比对可能必须改变这些和其它参数。
优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性计算可从例如比对(N/T)*100计算，其中N为序列共有相同碱基的位点数量，T为比较的位点总数，包括空位但不包括突出部。因此，用于计算两个序列之间百分比一致性的最优选方法包含(i)使用ClustalW程序，使用一组合适的参数，例如上述参数准备序列比对；以及(ii)将N和T值插入下列公式：序列一致性＝(N/T)*100。
识别相似序列的备选方法为本领域技术人员已知。例如，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与SEQ ID No 1、2、3或4所示序列或其互补序列杂交的序列编码。就严格条件而言，我们意为核苷酸在约45℃在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交结合滤纸的DNA或RNA，然后在约20-65℃在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤至少一次。替代地，基本上相似的多肽可与SEQ ID No：5、6或7所示序列相差至少1个但少于5、10、20、50或100个氨基酸。
由于遗传密码的简并性，很明确本文描述的任何核酸序列可变化或改变而不实质影响由其编码的蛋白质的序列，从而提供了其功能变体。合适的核苷酸变体为具有被编码序列中相同氨基酸的不同密码子替换改变，由此产生沉默改变的序列的那些。其它合适的变体具有同源核苷酸序列，但包含所有或部分被不同密码子替换改变的序列，所述密码子编码具有与被替换氨基酸相似生物物理性质的侧链的氨基酸，由此产生保守改变。例如小的非极性、疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、和甲硫氨酸。大的非极性、疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应了解氨基酸可以具有相似生物物理性质的氨基酸替换，本领域技术人员已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。
本文描述的所有要素(包括任何随附权利要求、摘要和插图)，和/或公开的任何方法或过程的所有步骤，可以任何组合与任一上述方面结合，其中至少某些此类要素和/或步骤互相排斥的组合除外。
为更好理解本发明，并显示本发明的实施方案可如何实现，现以示例方式对附图注解，其中：
图1显示了天冬氨酸转换为其它氨基酸的植物生物合成路径的一部分。涉及的酶为天冬氨酸激酶(AK)和高丝氨酸脱氢酶(HSDH)；
图2显示了天冬氨酸转换为其它氨基酸包括苏氨酸的植物生物合成路径。在所述路径中第一个酶活性为天冬氨酸激酶(AK)。植物可生产双功能酶天冬氨酸激酶：高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)。所述生物合成路径被严格调控，包括终产物的正和负反馈；
图3显示了拟南芥中苏氨酸对天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶别构调节的模型(Paris等人(2003)之后)；
图4概略显示了突变的双功能天冬氨酸激酶高丝氨酸去饱和酶；
图5显示了实施例2中在叶盘中检测的苏氨酸水平；
图6显示了SAG12启动子的序列；
图7显示了突变的天门冬氨酸激酶高丝氨酸去饱和酶的序列。克服苏氨酸反馈抑制所需的突变碱基以阴影和下划线标记；
图8显示了获自转基因植物的叶盘中苏氨酸的含量，如实施例3所述，所述转基因植物中苏氨酸不敏感的AK-HSDH由衰老特异性启动子控制；
图9为显示田间试验生长的烤干叶片中苏氨酸含量的柱状图；
图10为显示田间试验生长的烤干叶片中谷氨酰胺含量的柱状图；
图11为显示田间试验生长的烤干叶片中谷氨酸含量的柱状图；
图12为显示田间试验生长的烤干叶片中天冬酰胺含量的柱状图；
图13为显示田间试验生长的烤干叶片中天冬氨酸含量的柱状图；
图14为显示田间试验生长的烤干叶片中组氨酸含量的柱状图；
图15为根据本发明的载体的一个实施方案的质粒图谱；以及
图16为根据本发明使用的一个骨架载体的质粒图谱。
实施例
如实施例2所述，本发明人已开发出转基因植物，其中改变的反馈不敏感的天冬氨酸激酶(AK:HSDH)在叶片特异性启动子控制下表达。但是，本发明人发现，改变的AK:HSDH在叶片中的局部表达导致转基因植物的适合度损害。因此，如实施例3-4所述，本发明人使用了连接到编码序列的衰老特异性启动子(SAG12)，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性(AK:HSDH)的多肽。得到的转基因植物在叶片衰老过程中生产苏氨酸的水平高于野生型水平而不损害该植物的适合度。
实施例1-叶片中苏氨酸水平的试验
苏氨酸水平的试验在绿色或发黄叶片上进行。取叶盘并用于分析，因此测量基于每个叶盘的苏氨酸含量(即苏氨酸含量/叶片面积)或者与上清液中的蛋白质含量(即苏氨酸含量/mg蛋白质)相关。叶盘使用一定量的水捣碎并离心以沉淀不溶的叶片残渣。然后将来自所述过程的上清液使用Phenomenex EZfaast Kit处理。这是一种专用试剂盒，其用于在提取物中衍生氨基酸，使得它们可使用标准液相色谱/质谱(lc/ms)装置定量。
使用待定量的每种氨基酸的外标准进行校准，通过在过程中包含内标准在样品之间标准化衍生步骤的效率。色谱图通过峰面积评估并使用液相色谱/质谱软件中的积分算法与浓度相关。如果没有峰可被软件或操作者确定鉴定，这称为“低于检测限”。发现这是某些空载体对照和后代中某些分离的无效植物的情况。
实施例2-具有可操作性连接叶片特异性启动子的反馈不敏感AK:HSDH 的转基因植物
本发明人在来自拟南芥的双功能AK:HSDH野生型序列(At4g19710)上进行定点诱变。因此，首先使用下列引物通过PCR从来自拟南芥的叶片特异性cDNA文库中分离所述野生型序列：
At4g19710正向  ATGGCGACTCTGAAGCCGTCATTTAC(SEQ ID No：8)；
At4g19710反向  TTAAGACGGTGCACCGAGATAAGATGC(SEQ ID No：9).
所述野生型序列以三种方法之一改变：(i)仅AK结构域突变，(ii)HSDH结构域突变，或者(iii)两个结构域都突变，以不接受通过苏氨酸结合的调控。所述特异性突变在Gln443和Gln524，两者都在酶调控结构域中，两者都通过定点诱变突变为丙氨酸(Paris等人(2003)，“Mechanism of control of Arabidopsis thaliana aspartate kinase-homoserine dehydrogenase by threonine”，J.Biol.Chem278：5361-5366，及Frankard等人(1992)，“Two feedback-insensitive enzymes of the aspartate pathway in Nicotiana sylvestris”Plant Physiol 99：1285-1293。
Stratagene
Figure BPA00001348803500211
QuikChange
Figure BPA00001348803500212
定点诱变试剂盒(目录#200518)用于此步骤。为改变编码Glu443的密码子，下列引物用于定点诱变反应：
Gln443正向  GTGATTATGATATCAGCTGCTAGCAGTGAGCATTCTG
(SEQ ID No：10)；以及
Gln443反向  CAGAATGCTCACTGCTAGCAGCTGATATCATAATTCAC
(SEQ ID No：11).
对于Gln524，使用下列引物对：
Gln524正向  GTCCGAGCTATATCTGCTGGTTGTTCTGAGTACAATG；
(SEQ ID No：12)；以及
Gln524反向  CATTGATCTCAGAACAACCAGCAGATATAGCTCGGAC
(SEQ ID No：13).
分别使用这3种突变体序列转化烟草植物，如野生型拟南芥AK:HSDH一样。在所有情况下，目标基因在叶片特异性豌豆质体蓝素启动子控制下表达。所有种群的植物通过农杆菌介导的转化产生，并在Cambridge，UK在温室条件下生长。使用EZfaast氨基酸试剂盒(Phenomenex
Figure BPA00001348803500213
)在每个样品中提取并衍生游离氨基酸。通过液相色谱/质谱进行定量。
结果如图5和表1所示。在图5中，仅AK结构域突变的系列植物名称以AK起始，仅HSDH结构域突变的系列植物名称以HSDH起始，AK和HSDH结构域都突变的系列植物名称以AK/HSDH起始，野生型植物名称以WT起始，包含空载体对照的转基因植物名称以EV起始。
本发明人在以拟南芥序列转化的所有种群-包括以非突变拟南芥序列转化的种群中实现了叶片苏氨酸水平升高。以在AK结构域突变的序列转化的种群叶片苏氨酸水平最高。这与该种群显示严重损害适合度的比例最高相符合。虽然本发明人已使用一种叶片特异性启动子试图减少繁殖力改变的影响，但其影响足以使整株植物仍然被下调对该酶的反馈控制的新陈代谢结果所影响。
但是，在所有显示苏氨酸升高的植物中，具有改变的生长习性的相关性。叶片苍白、增厚、易碎且呈带状。节间部缩短并随成熟增加而显示褐变。芽或者不发育或者畸形。总之，所述定点诱变成功提供了叶片苏氨酸升高。但是，如果要从所述方法得到农业可行的高叶片苏氨酸植物，仍然需要克服释放对天冬氨酸激酶的反馈控制产生的适合度损害。
表1
Figure BPA00001348803500231
实施例3-包含可操作性连接到衰老特异性启动子的苏氨酸不敏感 AK:HSDH的转基因植物
烟草植物的栽培种K326用于提供与农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)协同培养的叶盘，农杆菌预先使用携带目标基因(即突变的AK:HSDH，其序列如图7所示，即SEQ ID No 2、3和4)的双元载体在衰老特异性启动子SAG 12(其序列如图6所示，即SEQ ID No：1)控制下转化(通过电穿孔)。同时培养对照种群，其中双元载体包含启动子但没有AK:HSDH基因。然后这些叶盘通过组织培养方法处理以提供小植物(Horsch等人Science 227：1229-1231，1985)。每株小植物都产生于单个转化事件，其中DNA转自细菌并整合进入植物基因组DNA。这些植物被转移至温室并培养至成熟。从植物分离成熟叶并置于在黑暗中的聚乙烯袋中在35℃下持续72小时。这段时间之后叶片用于提供叶盘，叶盘如上述实施例1所述评估苏氨酸含量。
结果如图8所示，其显示在一些植物中获得了高水平的苏氨酸。有利地，这些植物生长正常。因此，这些转基因植物未显示出实施例2所述植物中观察到的适合度损害。
实施例4-包含连接到SAG 12启动子的苏氨酸不敏感AK:HSDH的转 基因植物的田间试验
选自SAG 12：天冬氨酸激酶(pBNP 138-0253-001)实验种群的植物细胞系在2008年在北卡罗来纳田间种植。叶片被烤干并分析所选游离氨基酸的存在。通过液相色谱/质谱分析并通过内外标准校准确证。当分析物超出用于校准的范围时，其在表2中标示为“＞S”，且在附图中以相关条柱上方的星形标示。
样品列表分为“AK”编号，其为以本发明的基因构建体改变的K326背景品系，以及3种代表性对照；未改变的K326、未改变的KV1、未改变的NC71，都在相同条件下在相同时间生长并烤干。
表2
Figure BPA00001348803500241
参考图9，显示的柱状图显示了与3种对照(K326、KV1和NC7)相比较，5种试验植物(AK1-AK5)生产的苏氨酸浓度。如可看到，所有5种试验植物生产的苏氨酸显著多于任何对照。此外，5种试验植物中没有一种遭受对其生长适合度的损害。这些数据有力支持了下述观察，即，使用根据本发明的构建体转化的试验植物在商业田间条件下生产游离苏氨酸升高(至少2到3倍)的叶片，并且在烤干过程中保持这一点。此外，该试验植物为非分离品系，其在这些田间条件下未显示产量损失。
本发明人还评估了产自田间试验植物的烤干叶片中多种其它氨基酸(GLN：谷氨酰胺；GLU：谷氨酸；ASN：天冬酰胺；ASP：天冬氨酸；HIS：组氨酸)的浓度，数据如图10-14所示。
如图10中可见，对于细胞系AK3，谷氨酰胺的浓度与3种对照细胞系中的相当。如图11所示，AK1-3的谷氨酸含量与对照相同，而AK4-5浓度稍高。图12显示了各天冬酰胺的浓度。
参考图13，可见天冬氨酸浓度在试验细胞系AK1-AK3中与在对照中大致相同，而在AK4-5中其浓度显得较高。最后，如图14所示，组氨酸浓度始终大致相同，除了试验细胞系AK4显示水平升高。
总之，图10-14清晰显示这些氨基酸各自的浓度与对照相当或更高，表明转基因植物的适合度未被损害。
Figure ISB00000512373800021
Figure ISB00000512373800031
Figure ISB00000512373800051
Figure ISB00000512373800061
Figure ISB00000512373800071
Figure ISB00000512373800091
Figure ISB00000512373800101
Figure ISB00000512373800111
Figure ISB00000512373800121
Figure ISB00000512373800131
Figure ISB00000512373800141
Figure ISB00000512373800151
Figure ISB00000512373800161
Figure ISB00000512373800171
Figure ISB00000512373800181
Figure ISB00000512373800201
Figure ISB00000512373800211

Claims (25)

1.一种基因构建体，其包含可操作性连接到一种编码序列的衰老特异性启动子，所述编码序列编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述衰老特异性启动子已从拟南芥中的衰老相关基因分离。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因构建体，其中所述衰老特异性启动子选自：SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18，或者其功能变体或片段。
4.根据权利要求3所述的基因构建体，其中所述衰老特异性启动子为SAG12，或者其功能变体或片段。
5.根据权利要求3或4所述的基因构建体，其中所述启动子包含基本上如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者其功能变体或片段。
6.根据任何上述权利要求所述的基因构建体，其中所述多肽为苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)或者其功能变体或片段。
7.根据上述权利要求所述的基因构建体，其中所述多肽为苏氨酸不敏感的双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)酶。
8.根据任何上述权利要求所述的基因构建体，其中所述编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的编码序列源自拟南芥属(Arabidopsis spp.)、玉米属(Zea spp.)、黄花菊属(Flaveria spp.)、或白花菜属(Cleome spp.)。
9.根据任何上述权利要求所述的基因构建体，其中所述编码具有苏氨酸不敏感的天冬氨酸激酶活性的多肽的编码序列源自拟南芥属(Arabidopsis spp.)，优选地为拟南芥。
10.根据权利要求7-9中任一权利要求所述的基因构建体，其中AK-HSDH的至少一个苏氨酸结合位点突变。
11.根据权利要求7-10中任一权利要求所述的基因构建体，其中拟南芥AK-HSDH在Gln443和/或Gln524突变。
12.根据权利要求7-11中任一权利要求所述的基因构建体，其中AK-HSDH在Gln443和Gln524突变。
13.一种载体，其包含根据权利要求1-12中任一权利要求所述的基因构建体。
14.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物在叶片中积累的苏氨酸水平高于在相同条件下培育的对应野生型植物，所述方法包含
(i)以根据权利要求1-12中任一权利要求所述的基因构建体或者根据权利要求13所述的载体转化植物细胞；以及
(ii)从转化细胞再生植物。
15.一种细胞，其包含权利要求1-13中任一权利要求所述的基因构建体或者根据权利要求13所述的载体。
16.一种转基因植物，其包含权利要求1-9中任一权利要求所述的基因构建体或者根据权利要求13所述的载体。
17.根据权利要求16所述的转基因植物，其中所述植物来自十字花科、禾本科或茄科。
18.根据权利要求16或17所述的转基因植物，其中所述植物为烟草植物。
19.一种植物繁殖产品，其可获自权利要求16-18中任一权利要求所述的转基因植物。
20.根据权利要求19所述的植物繁殖产品，其中所述植物繁殖产品为种子。
21.一种收获的叶片，其包含的苏氨酸水平高于获自在相同条件下培育的野生型植物收获的叶片中的对应苏氨酸水平，其中所述叶片收获自根据权利要求16-18中任一权利要求所述的转基因植物，或者通过根据权利要求14所述的方法生产。
22.一种吸烟制品，其包含获自突变体烟草植物的苏氨酸富集烟草，所述突变体能够在衰老叶片中过量生产苏氨酸。
23.根据权利要求22所述的吸烟制品，其中所述突变体烟草植物已使用权利要求1-12中任一权利要求所述的基因构建体或者根据权利要求13所述的载体转化。
24.一种提高植物叶片中苏氨酸水平至对应野生型水平以上而不损害植物适合度的方法，其包含改变植物新陈代谢以在叶片衰老开始之后实现苏氨酸生产增加。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法包含使用根据权利要求1-12中任一权利要求所述的构建体或者根据权利要求13所述的载体转化植物。
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