KR20140057642A - 니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도 - Google Patents

니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

(i) 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:1에 대해 90% 이상의 서열 상동성 또는 SEQ ID NO:4, 또는 SEQ ID NO:5에 대해 87% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드; (ii) (i)에 기재한 상기 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해서 인코딩되는 폴리펩티드; 또는 (iii) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드; 또는 (iv) (i)에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 벡터 또는 발현벡터를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 세포가 개시된다.

Description

니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도 {THREONINE SYNTHASE FROM NICOTIANA TABACUM AND METHODS AND USES THEREOF}
본 발명은 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 및 변종으로부터의 트레오닌 합성효소, 그의 상동체 및 단편을 개시하고 있다. 특히, 담배 식물과 같은-식물에서 유리 메티오닌 수준을 증가시키기 위해, 유전자의 발현의 변형 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질의 활성이 개시되어 있다. 이것은 그안에 메티오날의 수준을 상승시킴으로써 담배에서 바람직한 맛 및 향을 생성하기 위해서 사용될 수 있다.
담배에서-기질을 생성하는-향과 같은-풍미에서의 증진은 담배가 흡연될 때 바람직한 맛을 생성할 수 있다. 이러한 풍미는, 예를 들어 메일라드 반응을 거치는 아미노산으로부터 얻을 수 있다. 메티오날 (3-메틸티오)프로판알)은 "구운 감자"향에 대한 원인인 풍미 화합물이다. 메티오날의 생성은 메티오날이 메티오닌과 메티오닌 유도체로부터 유래할 경우 열적으로 유도될 수 있다. 메티오닌의 스트레커 저하는 알파-디카르보닐 화합물과의 상호작용을 포함하고, 이것은 메일라드 반응의 중간체이며, 메티오날의 형성을 가져온다.
식물에서 유리 메티오닌의 양을 증가시키기 위한 다양한 방법은 개발되었고, 예를 들어 외인성 아미노산이 식물에 첨가될 수 있다. 그러나 외인성으로 첨가된 아미노산의 사용은 안전 및 규제적 관심뿐만 아니라 생성 비용의 상당한 증가를 가져온다.
메티오닌과 트레오닌의 생합성은 둘다 아스파르트산염 경로에 연결된다. 식물에서, 그들의 생합성 경로는 O-포스포호모세린 (OPH)의 수준으로 나뉜다. 효소 시스타티오닌 감마-합성효소 (CGS)와 트레오닌 합성효소 (TS)는 일반적인 기질 O-포스포호모세린에 대해 경쟁한다. 유리 메티오닌 수준은 아스파르트산염 생합성 경로에 포함된 효소를 과-발현하거나 발현을 억제함으로써 잠재적으로 증가될 수 있다.
하나의 가능한 접근법은 시스타티오닌 감마-합성효소를 과발현하는 것이다. 또 다른 접근법은 트레오닌 합성효소의 발현을 저하하는 것이다. 그러나, 지금까지 트레오닌 합성효소 유전자를 변형하는 것에 관한 모든 이러한 노력은 전체 식물에 불리하게 영향을 미친 표현형을 가져왔다. Bartlem et al. (2000) Plant Physiol., 2000, 123:101-110)는 아라비도프시스 식물의 트레오닌 합성효소 유전자의 돌연변이를 기재한다. 트레오닌 합성효소를 인코딩하는 유전자 내에 하나의 염기쌍 돌연변이를 운반하는 개시된 돌연변이는 메티오닌의 과-축적을 나타내고 트레오닌의 수준을 현저하게 감소시켰다. 그러나, 아라비도프시스의 개시된 돌연변이는 야생형의 그것과 비교했을 때 감소된 성장을 겪는다. 성장이 저해된 분해는 트레오닌 또는 이소루신을 첨가할 때만 회복될 수 있다.
Zeh et al. (2001) Plant Physiol., 2001, 127:792-802 는 구성요소인 꽃양배추모자이크 바이러스 35S 프로모터를 이용하는 안티센스 형질전환 접근법에 의해 제조되는 형질전환 감자 식물을 개시한다. 개시한 유전자도입 감자 식물이 높은 수준의 메티오닌을 나타내는 반면, 또한 야생형의 식물의 그것과 비교했을 때 감소된 성장을 겪는다.
Avraham et al. (2005) Transgenic Research, 2005, 14: 299-311는 안티센스 유전자도입 접근법에 의해 제조되는 형질전환 아라비도프시스 식물을 개시한다. 개시된 형질전환 식물이 증가된 수준의 메티오닌을 나타내는 반면 그들은 상당한 성장 저해, 감소된 로제트형 잎 크기 및 백화잎을 포함하는, 수개의 비정상적인 표현형을 겪는다.
식물의 성장률 및 전체 크기와 같은- 특정한 농업형질적으로 바람직한 특성을 유지하면서-그리고 어느 외인성 성분을 첨가하는 것을 필요함이 없이, 유리 메티오닌의 증가된 수준을 결합하는-담배 식물과 같은-식물에 대한 필요성이 있다. 이러한 필요성을 충족시키는 것이 본 발명의 목적이다.
도 1은 메탄올로 추출 및 WatersXBridge Shield RP18 컬럼에 대한 분리 후에, VC-4, TN90-4, NtTS1-3, NtTS2-3, NtTS3-2의 경화된 잎의 프로파일을 예시한다. VC-4는 오직 벡터의 대조 식물; TN90은 배경을 제공하는 비-변형된 담배 식물; NtTS1-3. NtTS2-3 및 NtTS3-2은 트레오닌 합성효소 유전자를 사일런싱 RNAi를 가지는 Nicotiana tabacum 식물이다. 화살표는 약 5, 9,17 및 19분에서의 피크를 나타낸다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 담배 식물 또는 식물 세포와 같은-식물 또는 식물 세포에서 트레오닌 합성효소 발현 또는 활성의 감소 (예를 들어, 억제)가 대조 식물 또는 식물 세포와 비교했을 때 식물 세포 또는 하나 이상의 식물의 일부에서 메티오닌의 농도의 증가를 가져온다는 발견을 근거로 한다. 놀랍게도, 유전적으로 개변된 식물은 대조 식물과 비교했을 때 그것의 전반적인 시각적 외관에 대한 어떠한 변화도 나타내지 않는다. 이러한 발견은 유전자도입의 아라비드포시스 또는 감자 식물에서 관찰되는, 다양한 불리한 표현형의 관점에서 예기치 못한 일이다. 시각적 외관의 변형이 산업에 수용할 수 없거나 수용될 수 없을 정도로 감소된 생산율을 가져오는 경우, 식물은 담배를 포함하는 다양한 물품의 상업적 생성을 위해 사용되기 때문에 이 발견은 유리하기는 이용될 수 있다. 외인성 아미노산의 첨가도 필요하지 않다. 또한 담배를 가열할 때 방출되는 에어로졸은 대조 식물로부터 제조되는 담배와 비교했을 때 메티오날의 증가된 수준을 함유한다. 흡연 또는 에어로졸에서 메티오날의 증가는 담배가 사용될 때 바람직한 풍미, 향, 또는 둘다의 풍미와 향를 생성한다.
본 발명의 태양 및 구현예는 첨부하는 청구항에 기재한다.
하나의 태양에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 대해 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에 대해 87% 이상의 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 분리된 뉴클레오티드가 제공된다.
추가의 태양에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:20에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, SEQ ID NO:21에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 어느 하나 (예를 들어, 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개이상의) 구조체, 벡터 또는 발현 벡터가 제공된다.
또 다른 태양에서, 하나 이상의 (예를 들어, 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개이상의) 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 (예를 들어, 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개 이상의)폴리펩티드를 포함하는 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 식물 세포, 또는 형질전환 식물 세포가 제공된다. 또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 식물, 또는 형질전환 식물이 제공된다. 적절하게는, 하나 이상의 합성효소 코딩 서열의 발현 또는 그에 의해 인코딩된 트레오닌 합성효소 단백질의 활성이 감소되고, 담배 식물의 일부는, 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 감소되지 않는 대조 담배 식물과 비교했을 때 5% 이상의 메티오닌 함량이 증거나, 여기서 흡연 또는 에어로졸에서 메티오날의 농도는 대조 담배 식물로부터의 흡연 또는 에어로졸과 비교했을 때 5% 이상까지 증가한다.
추가의 태양은 담배 식물의 적어도 일부에서 메티오닌의 농도를 증가하기 위한 방법에 관한 것으로, (i) 바람직하기는, 여기서 트레오닌 합성효소는 여기에 기재한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 담배 식물에서 하나 이상의 (예를 들어, 두개 이상의, 세개 이상의, 네개 이상의) 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻은, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물의 적어도 일부에서 메티오닌의 농도를 측정하는 단계; 그리고 (iii) 대조 식물과 비교해서 거기에 메티오닌의 농도가 증가한, 담배 식물의 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환 담배 식물을 식별하는 단계를 포함한다. 바람직하기는, 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환 담배 식물의 전체의 시각적 외관은 필드 이식 뒤 3개월, 또는 토핑 뒤 36일과 같은 기간 후에, 대조 담배 식물과 실질적으로 유사하다.
하나의 구현예에서, 아미노산-예를 들어, 트레오닌 및/또는 이소루신과 같은 외인성 영양물의 첨가는 필요하지 않다.
또 다른 태양에서, 상기 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 그들로부터 유도되거나 유도될 수 있는 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 담배 식물 또는 형질전환 담배 식물, 또는 담배 식물이 제공된다.
또 다른 태양에서, 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 담배 식물 또는 형질전환 담배 식물이 제공되고, 여기서 서열을 코딩하는 하나 이상의 (예를 들어, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개 이상의) 트레오닌 합성효소의 발현 또는 그에 의해 코딩된 트레오닌 합성효소 단백질의 활성이 감소되고, 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조 담배 식물과 비교했을 때 담배 식물의 일부는 5% 이상의 메티오닌의 함량의 증가를 가지거나, 또는 여기서 연기 또는 에어로졸의 메티오날의 농도는 대조 담배 식물로부터의 연기 또는 에어로졸과 비교했을 때 5% 이상까지 증가된다.
적절하게는, 상기 식물의 전체적인 외관은 이를 한정하지는 않지만, 이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일과 같은 기간 후에 대조 식물에 대해 실질적으로 유사하거나 또는 시각적으로 구별할 수 없다. 바람직하기는, (i) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물의 줄기 높이가 이를 한정하지는 않지만, 필드 이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일과 같은 기간 뒤에 대조 담배 식물의 줄기 높이와 실질적으로 유사하고; (ii) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물의 엽록소 함량은 이를 한정하지는 않지만, 필드 이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일과 같은 기간 뒤에 대조 담배 식물의 엽록소 함량과 실질적으로 동일하고; 또는 (i)와 (ii)둘다이다.
적절하게는, 식물의 일부 (예를 들어, 잎)에서의 트레오닌의 농도는 대조 식물과 비교했을 때 증가하고; 그리고 바람직하기는, 여기서 (a) 식물의 일부 (예를 들어, 잎)에서 메티오닌의 농도는 약 0.03 mg/g이상이고; (b) 잎에서 트레오닌의 농도는 약 0.5 mg/g 이상이고; (c) 가열시 연기 또는 에어로졸에서의 메티오날의 농도는 약 2000 μg/g 이상이고; 또는 (a), (b) 및 (c)의 두개이상의 조합이다.
여기에 기재되는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환 식물로부터의 세포 또는 조직을 포함하는 바이오매스, 씨 또는 잎이 제공된다. 여기에 기재된, 비자연적으로 발생하는 식물인 돌연변이 또는 형질전환 식물의 일부, 그것의 바이오매스, 또는 그것의 잎, 또는 그것의 조합을 포함하는 담배 물품이 또한 제공된다.
추가의 태양에서,
(a) 여기에 기재된, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물의 일부; 바이오매스, 씨 또는 잎; 또는 담배 물품을 제공하는 단계; 그리고 (b) 거기에 열을 제공하는 단계를 포함하는 메티오날을 생성하기 위한 방법이 제공된다.
추가의 태양에서 가열시 메티오날의 상승된 수준을 에어로졸로 방출시키는 담배 재료를 식별하기 위한 방법이 제공되고, (a) 담배 재료의 샘플를 준비하는 단계; (b) 샘플의 분자량 프로파일을 측정하는 단계; 그리고 (c) 하나 이상의 질량: 전하비에서 분자량 프로파일을 비교하는 단계; 여기서 대조 식물과 비교했을 때 비질량:전하비의 증가는 에어로졸에서 메티오날의 수준이 상승되는 것을 나타내는 단계를 포함하는 메티오날을 제조하기 위한 방법이 제공된다.
이 방법에 의해서 식별되거나 또는 식별될 수 있는 담배 재료는 또한 본 개시물의 추가적인 태양으로 제공된다.
본 발명의 추가적인 태양은 아래에 기재한다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 유전자는 하나 이상의 조절 서열에 작동할 수 있게 연결된다.
15-30 이상의 뉴클레오티드, 30-50의 뉴클레오티드, 50-100의 뉴클레오티드, 100-150 뉴클레오티드, 150-200의 뉴클레오티드, 200-300의 뉴클레오티드, 300-400의 뉴클레오티드, 400-500의 뉴클레오티드, 500-600의 뉴클레오티드 또는 600-700의 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 필수적으로 구성되는 NtTS 폴리뉴클레오티드 구조체.
본 발명에 따른 식물재료, 바이오매스, 씨 또는 잎을 통합하거나 또는 이용하는 소모성 물품.
본 발명에 따라 (예를 들어, 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개 이상의) 분리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구조체, 이중가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현벡터 등을 포함하는 세포주.
NtTS DNA의 발현 또는 세포에서 그에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 조절하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 (예를 들어, 하나 이상의, 두개 이상의, 세개 이상의 또는 네개 이상의) 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구조체, 이중가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
NtTS 폴리뉴클레오티드를 검출, 분리, 증폭 또는 분석하기 위한 방법으로서, 본 방법은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플를 제공하는 단계 및 본 발명에 따른 분리된 뉴클레오티드 서열로부터 10개 이상의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 분자에 상기 폴리튜클레오티드를 혼성화하는 단계를 포함한다.
대조 식물과 비교했을 때 식물의 적어도 일부에서의 메티오닌의 함량을 5% 이상을 감소시키기 위해 NtTS DNA의 발현 및 그에 의해 인코딩된 단백질의 활성 또는 그에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 조절하는 시약의 용도.
본 발명에 따른 방법 또는 사용으로서, 여기서 시약은 NtTS DNA, 키메릭 NtTS 유전자, NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체, 안티센스 RNA, 이중가닥 RNA, cDNA, NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 컨쥬게이트 및 그곳에 공유결합된 하나 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분, 리보자임, 돌연변이원, 징크핑커, 소분자 또는 메가뉴클레아제이거나 그들로부터 유도된다.
또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편(들)은 안티센스 핵산, 리보자임, 스플라이스섬-매개 트랜스-접합, 간섭 RNA (RNAi), 가이드 RNA, 또는 다른 비-번역된 RNA 등에 영향을 미치는 RNA를 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 단편(들)은 RNAi를 인코딩한다.
추가의 태양에서, (a) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물로부터 씨를 얻는 단계; (b) 씨를 식물에 이식하고 성장시키는 단계; (c) 식물을 수확하는 단계; 그리고 (d) 수확된 식물로부터 담배 물품을 제조하는 단계를 포함하는, 담배 물품을 제조하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 구현예를 위에 개시된 각각의 태양의 구현예와 같이 기재한다.
본 출원의 범위 내에서 사용되는 기술적 용어 및 표현들은 일반적으로 식물의 관련 있는 분야 및 분자 생물학에서 그들에게 통상적으로 적용되는 의미가 주어진다. 다음의 모든 용어 정의는 출원의 전체 내용에 적용된다. 단어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정관사 "a" 또는 "an"는 복수를 배제하지 않는다. 단일 단계는 청구항에 재인용된 여러 특징의 기능을 만족할 것이다. 주어진 수많은 값 또는 범위의 내용에서 용어 "약", "본질적으로" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 내의 값 또는 범위를 나타낸다.
용어 "분리된"은 자연 환경으로부터 얻은 어느 개체를 의미하지만, 용어는 정제도를 내포하지 않는다.
"벡터"는 핵산의 운송을 가능하게 하기 위한 핵산 성분, 핵산 구조체 및 핵산 컨쥬게이트 등의 조합을 포함하는 핵산 비히클을 나타낸다. 적절한 벡터는 원형, 이중 가닥 DNA 플라스미드; 선형의 이중가닥 DNA 플라스미드; 및 어느 기원의 다른 벡터와 같은 과잉 염색체 외의 복제를 할 수 있는 에피솜을 포함한다.
"발현 벡터"는 핵산, 핵산 구조체 및 핵산 컨쥬게이트 등의 발현을 가능하게 하기 위한 DNA 성분의 조합을 포함하는 핵산 비히클이다. 적절한 발현 벡터는 원형, 이중가닥 DNA 플라스미드; 선형의 이중가닥 DNA 플라스미드; 및 어느 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 과잉 염색체 외의 복제를 할 수 있는 에피솜을 포함한다. 발현 벡터는 이하에 기재되는, 상류에 위치하고 핵산에 작동가능하게 연결된 적어도 프로모터, 핵산 구조체 또는 핵산 컨쥬게이트를 포함한다.
용어 "구조체"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥, 재조합 DNA 단편을 나타낸다. 구조체는 상보적인 "센스 또는 코딩 가닥"과 염기쌍인 "주형 가닥"을 포함한다. 주어진 구조체는 발현 벡터와 같은- 벡터 내에 위치된 프로모터의 배향과 관련하여 두개의 가능한 배향, 동일한 (또는 센스)배향 또는 역 (또는 안티-센스) 배향으로 삽입될 수 있다.
"프로모터"는 통상적으로 상류에 위치하고 이중 가닥 DNA 단편에 작동가능하게 연결되는, 핵산 요소/서열을 나타낸다. 프로모터는 관심의 네이티브 유전자에 근접한 영역으로부터 전체적으로 유도될 수 있거나, 또는 다른 네이티브 프로모터 또는 합성 DNA 단편으부터 유도되는, 다른 요소로 구성될 수 있다.
용어 "상동성, 상동성 또는 유사성"은 서열 배열에 의해서 비교되는 두개의 폴리펩티드 사이 또는 두개의 핵산 분자 사이의 서열 유사도를 나타낸다. 비교되는 두개의 별개의 핵산 서열 사이에서 상동성의 정도는 유사한 위치에서 동일하거나 또는 일치하는, 뉴클레오티드의 수의 함수이다. 퍼센트 상동성은 육안 검사 및 수학적 계산에 의해서 측정될 수 있다. 선택적으로, 두개의 핵산 서열에 대한 퍼센트 상동성은 ClustalW, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하는 서열 정보를 비교함으로써 측정될 수 있다.
용어 "식물"은 수명 또는 개발, 및 그것의 후손의 어느 단계의 어느 식물을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 식물은 니코티아나 속에 속하는 식물을 나타내는, 담배 식물이다. 담배 식물의 바람직한 종, 재배품종, 혼성체, 및 변종을 여기에 기재한다.
"식물 세포"는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 나타낸다. 식물 세포는 세포벽이 없는 원형질, 분리된 하나의 세포 또는 배양된 세포, 또는 이를 한정하지는 않지만, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같은 매우 조직화된 단위의 일부과 같은 형태일 수 있다.
용어 "식물재료"는 바이오매스, 잎, 잎의 얇은 막, 주맥, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 일부, 열매, 꽃가루, 난세포, 접합체, 씨, 꺾꽂이용 가지, 분비물, 추출물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 어느 다른 부분 또는 생산물을 포함하여, 식물로부터 얻을 수 있는 어느 고체, 액체 또는 기체 조성물, 또는 그것의 조합을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 식물재료는 바이오매스, 씨 또는 잎을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 식물재료는 잎을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
용어 "변종"은 동일한 종의 다른 식물로부터 그들을 분리하는, 일정한 특징을 공유하는 식물의 개체를 나타낸다. 하나 이상의 개별의 특징을 보유하면서, 변종의 특징은 이 변종 내에서 각각의 매우 작은 전체적인 변종인 것이다. 변종은 종종 상업적으로 시판된다.
여기에 사용되는 용어 "계통" 또는 "육종 계통"은 식물 육종 동안에 사용되는 식물군을 나타낸다. 계통은 각각에서 다른 특징에 대해 약간의 변이가 있을 수 있지만 각각에서 변이를 거의 나타내지 않기 때문에 계통은 변종으로부터 구별할 수 있다.
여기에 사용되는 용어 "감소" 또는 "감소되는"은 이들을 한정하지는 않지만 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현과 같은 양 또는 활성의 약 10% 내지 약 99%, 약 10%내지 약 95% 이하, 약 10% 내지 약 90% 이하의 감소 또는 약 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 이상의 감소를 나타낸다.
여기에 사용되는 용어 "억제" 또는 "억제되는"은, 이들을 한정하지는 않지만 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현과 같은, 양 또는 활성의 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 98% 이상, 99% 이상, 특히 100%의 감소를 나타낸다.
여기에 사용되는 "증가" 또는 "증가되는"은, 이들을 한정하지는 않지만 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현 등과 같은, 약 10% 내지 약 99%의 증가, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99%, 또는 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 또는 그 이상의 양 또는 활성을 나타낸다.
대조 식물 또는 대조 식물 세포의 함량에서의 용어 "대조"는 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 변형 (예를 들어, 증가되거나 감소되는)되지 않은 식물 또는 식물 세포를 의미하며 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 변형되지 않은 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 대조 식물은 빈 벡터를 포함할 수 있다. 대조 식물은 야생형 식물에 해당할 수 있다.
하나의 태양에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되고 그리고 서열 목록에 나타낸 어느 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 여기에 기재한 서열 중 어느 것에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성된다.
하나의 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO.2 및/또는 SEQ ID No.3에 대해 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID NO.3에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. SEQ ID NO: 1는 니코티아나.타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소의 DNA 서열이다. SEQ ID NO:2는 니코티아나.타바쿰으로부터 분리된 RNA (변종 Hicks Broad 잎)로부터 역전사효소 (RT)-PCT에 의해 증폭되고 시퀀스되는 트레오닌 합성효소의 DNA 서열이다. 이러한 서열은 RT-PCT 분석에 의해 증명된, 니코티아나.타바쿰, 니코티아나.실베트리스의 두가지 선조 중의 하나로 존재한다. SEQ ID NO:3은 니코티아나.타바쿰으로부터 분리된 RNA (변종 Hicks Broad 잎)으로부터 RT-PCR에 의해 증폭되는 트레오닌 합성효소의 DNA 서열이다.
또 다른 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO.4 또는 SEQ ID No.5에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:3의 게놈 DNA 서열에 해당한다. SEQ ID NO:1과 비교해서 137 bp의 인트론은 ATG 개시 코돈의 부위 (234)에 위치한다. SEQ ID NO:5는 니코티아나.토멘토시포르미스로부터의 트레오닌 합성효소의 게놈 DNA 서열에 해당한다.
또 다른 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO.20에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No.20에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다. SEQ ID NO: 20은 니코티아나.타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소의 DNA 서열이고 SEQ ID NO.1에 대해 85%의 서열 상동성, SEQ ID NO.2에 대해 86%의 서열 상동성, 그리고 SEQ ID NO.3에 대해 86%의 서열 상동성을 가진다.
용어 "NtTS 폴리뉴클레오티드"는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20에 대해 상당한 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 상당한 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며; SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 해당하는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는, 거기의 상당한 상동성 (즉, 서열 유사성) 또는 상당한 동일성을 가지는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 단편; 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 단편을 포함하는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 단편에 관한 것이다. 예시적인 단편은 SEQ ID NO Nos 9 내지 19에 기재한다. 여기에 기재된 바와 같이, 변종은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 서열에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 서열 상동성을 가질 수 있다. NtTS 폴리뉴클레오티드는 또한 트레오닌 합성효소로서 작용을 하는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하기 위해 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20에 대해 충분한 또는 상당한 상동성도 또는 유사도를 포함하는, 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용어 "NtTS 폴리뉴클레오티드"는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20와 같이 여기에 지정된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 뉴클레오티드의 중합체를 나타낸다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 개변하지 않거나 또는 개변한, 뉴클레오티드의 중합체를 나타낸다. 따라서 폴리뉴클레오티드는 한정없이, 게놈 DNA, 상보적 DNA (cDNA), mRNA, 또는 안티센스 RNA 또는 그의 단편(들)일 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA일 수 있고, DNA는 단일 가닥과 이중가닥의 영역의 혼합물, DNA와 RNA를 포함하는 혼성체, 또는 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물을 가지는 혼성체 분자 또는 그의 단편(들)이다.
여기에 기재한 바와 같은 폴리뉴크레오티드는 일부 경우에 폴리뉴클레오티드 유사체가, 예를 들어 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포포로아미디트 연결기를 포함하는 대안의 구조를 가질 수 있다는 것을 포함하지만, 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드는 양성 구조; 비-이온 구조, 및 비-리보스 구조를 가지는 그들을 포함한다. 리보스-인산 구조의 개변은 다양한 이유, 예를 들어 생리학적 환경에서의 이러한 분자 또는 바이오칩에 관한 프로브로서의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해서 이루어질 수 있다. 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드와 유사체의 혼합물은 제조될 수 있고; 선택적으로, 다른 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드와 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.
예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포포로아미데이트 결합 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 구조 및 결합을 포함하는 다양한 폴리뉴클레오티드 유사체가 알려져 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드는 양성 구조, 비이온 구조 및 비리보스 구조를 가지는 그들을 포함한다. 하나 이상의 카르복실 당을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.
다른 유사체는 펩티드 폴리뉴클레오티드 유사체인 펩티드 폴리뉴클레오티드 (PNA)를 포함한다. 이들 구조는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드의 고전하된 포스포디에스테르 구조와 반대로, 중성 조건 하에서 실질적으로 비-이온성이다. 이것은 이점들을 가져온다. 우선, PNA 구조는 개선된 혼성화 운동속도를 나타낼 수 있다. PNA는 잘못 매치된 대 잘 매치된 염기쌍을 위해 용융점 (Tm)의 큰 변화를 가진다. DNA 및 RNA는 통상적으로 내부 불일치에 대해 Tm의 2-4℃ 저하를 나타낸다. 비이온의 RNA 구조와 관련해서, 저하는 7-9℃에 근접하다. 유사하게는, 비이온성 성질로 인해 이들 구조에 결합되는 염기의 혼성화는 염농도에 비교적 둔감하다. 또한 PNA는 세포 효소에 의해서 저하되지 않거나 또는 덜 저하되어서 더 안정적일 수 있다.
개시된 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편의 조합 중에서, 핵산 혼성화에서의 프로브 또는 핵산 증폭 분석에서의 프라이머와 같은 단편의 사용이 개시된다. 이러한 단편은 일반적으로 적어도 약 10, 11, 12 , 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 이상의, DNA 서열의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 단편은 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 이상의, DNA 서열의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 하나의 태양에서, 프로브 및/또는 프라이머의 용도를 포함하는 NtTS 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법이 또한 제공된다. 예시적인 프라이머는 SEQ ID NOs: 10 내지 14dp 기재한다. 경우에 따라서는, 상기 프라이머는 프로브로서 사용될 수 있다. 예시적인 프라이머 또는 프로브는 SEQ ID NOs: 1,2 및 3 또는 SEQ ID NO:20 사이에서 상동성인 영역을 혼성화할 수 있다. 예시적인 프라이머 또는 프로브는 SEQ ID NOs: 1,2 및3의 1-46의 뉴클레오티드에; SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1-52에; SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 99-141에; SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 102-144에; SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 102-153에; SEQ ID NOs의 뉴클레오티드 1325-1362에; SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1334-1371에 혼성화할 수 있다.
혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 파라미터는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재된다. 여기에 기재한 아미노산 서열과 조합하는 유전자 코드의 인지를 사용하여, 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 세트가 제조될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 프라이머로서, 예를 들어 DNA 단편이 분리되고 증폭되는, 중합 연쇄 반응 (PCR)에 유용하다. 특정한 구현예에서, 축퇴성 프라이머는 유전적 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 이들을 한정하지는 않지만 cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 전자적 EST (발현 서열 태그) 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해 식별된 상동성 서열은 이때 여기에 식별된 NtTS 서열의 상동성을 식별하기 위해 프로브로서 사용될 수 있다.
여기에 기재한 바와 같은 NtTS 폴리뉴클리오티드에 대해 감소된 엄격도 조건, 통상적으로 적절하게 엄격한 조건, 및 일반적으로 고도로 엄격한 조건 하에서 혼성화하는, 잠재적인 사용은 또한 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머 또는 프로브)다. 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 파라미터는 Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 의해 기재되고 그리고 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 염기 조성에 기초하여, 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
적절하게 엄격한 조건을 얻는 한가지 방법은 5x 기본 구연산 나트륨, 0.5% 나트륨 도데실 황산염, 1.0 mM의 에틸렌디아민테트라아세트산 (pH 8.0)을 함유하는 사전세정 용액, 약 50%의 포름아니드, 6x 표준 구연산나트륨의 혼성화 완충액, 및 약 55의 온도의 혼성화 (또는 약 42의 혼성화온도를 가지는, 약 50%의 포름아미드를 함유하는 것과 같은 다른 유사한 혼성화 용액), 및 0.5x 표준 구연산나트륨, 0.1% 소듐도데실설페이트의 세정조건의 사용을 포함한다. 일반적으로, 매우 엄격한 조건은 약 68℃에서, 0.2x 표준 구연산나트륨, 0.1% 소듐도데실설페이트로 세척하면서, 위와 같은 혼성화 조건으로서 정의된다. SSPE (1x SSPE는 0.15M 염화나트륨, 10mM 인산나트륨, 및 1.25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, pH 7.4)는 혼성화 및 세척 완충액에서 표준 구연산나트륨 (1x 표준 구연산 나트륨은 0.15M 염화나트륨 및 15 mM 구연산나트륨이고)으로 대체될 수 있고; 세척은 혼성화가 완료된 후에 15분동안 수행된다. 세척 온도와 세척염 농도는 당업자에게 알려지고 이하 (예를 들어 Sambrook et al., supra 참조)에 더 기재한 바와 같이, 혼성화 반응 및 이중 안정성을 조절하는 기본 원리를 적용함으로써 원하는 엄격도를 얻기 위해 필요에 따라 조절될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 알려져 있지 않은 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 폴리뉴클레오티드를 혼성화할 때 혼성체 길이는 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 길이로 추정된다. 공지의 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화되면, 혼성화 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 배열하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별함으로써 측정될 수 있다. 길이가 50 미만의 염기쌍인 것으로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는, Tm이 다음의 식에 따라 결정되는 혼성체의 용융점 (Tm)보다 작은 5 내지 10℃이어야 한다. 염기쌍의 길이가 18보다 작은 혼성체의 경우, Tm (℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수)이다. 염기쌍의 길이가 18 이상인 혼성체인 경우, Tm (℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)이고, 여기서 N은 하이드리드에서 염기의 수이고, [Na+](1x 표준 구연산 나트륨=0.165M을 위한 [Na+])는 혼성화 완충액에서의 나트륨 이온의 농도이다. 통상적으로 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오티드는 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 길이의 25% 이상 (일반적으로 적어도 50%, 60% 또는 70%, 그리고 가장 일반적으로 적어도 80%)의 길이를 가지고, 그리고 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 60% 이상의 서열 상동성 (예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)을 가진다.
당업자에 의해 이해됨과 같이, 선형 DNA는 두가지 가능한 배향: 5'-대-3' 방향 및 3'-대-5' 방향을 가진다. 예를 들어, 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 참조 서열이 5'-대-3' 방향에 위치하고, 그리고 두번째 서열이 5'-대-3' 방향에 위치하면, 이때 참조 서열 및 두번째 서열은 동일한 방향으로 배향되거나, 동일한 배향을 가진다. 통상적으로, 주어진 프로모터의 조절 하에서 관심의 프로모터 서열 및 유전자는 동일한 배향으로 위치한다. 그러나 5'-대-3' 방향에 위치하는 참조 서열과 관련해서, 두번째 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 3'-대=5' 방향에 위치하면, 이때 참조 서열 및 두번째 서열은 안티센스 방향으로 배향되거나 안티센스 배향을 가진다. 서로에 관련해서 안티센스 배향을 가지는 두가지 서열은, 참조 서열 (5'-대-3' 방향) 및 참조 서열 (5'-대-3'에 위치하는 참조 서열)의 역 상보성 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에 위치한다면 동일한 배향을 가지는 것과 같이 선택적으로 기재될 수 있다. 여기에 기재한 서열은 5'-대-3' 방향으로 나타낸다.
여기에 제공된 재조합 구조체는 NtTS 단백질 발현 수준을 조절하기 위해서 변형 식물 또는 식물 세포를 형질전환하기 위해서 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구조체는 식물 또는 세포에서 NtTS 폴리펩티드를 발현시키기 위해 적합한 제어 영역이 작동가능하게 연결된, 여기에 기재된 바와 같은 NtTS 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 바와 같은 NtTS 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 NtTS 폴리펩티드는 네이티브 NtTS 폴리펩티드일 수 있거나, 세포에 대해 이형일 수 있다. 일부 경우에 재조합 구조체는 조절 영역에 작동가능하게 연결되는, NtTS-조절 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 억제하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 적절한 조절 영역의 예시는 여기에 기재하였다.
여기에 기재한 것들과 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 구조체를 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 구조는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BACSs, YACs, 또는 PACs와 같은 본 분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 한정 없이, 예를 들어, 박테리오파지, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유도되는, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템은 상업적으로 이용가능하다.
벡터는 예를 들어 복제의 기원, 지지체 결합 영역 (SARs) 또는 마커를 포함한다. 마커 유전자는 식물 세포에 대해 선택할 수 있는 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어 마커는 항생제 (예를 들어 카나마이신, G418, 블레오마이신 또는 히그로마이신), 또는 제초제 (예를 들어, 글리포세이트, 클로르설푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 항균제 내성을 부여할 수 있다. 또한 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출 (예를 들어 정제 또는 국소화)을 용이하게 하기 위해 고안된, 태그 서열을 포함한다. 루시퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제 (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST), 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티닌 서열과 같은 태그 서열은 통상적으로 인코딩된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단 중 하나를 포함하는, 폴리펩티드 내의 어느곳에나 삽입될 수 있다.
식물 또는 식물 세포는 안정하게 형질전환되기 위해 그의 게놈으로 통합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가짐으로써 형질전환될 수 있다. 안정하게 형질전환된 세포는 통상적으로 각각의 세포분열로 도입된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 식물 또는 식물 세포는 또한 일시적으로 형질전환되어서 재조합 폴리뉴클레오티드가 그것의 게놈으로 통합되지 않도록 한다. 일시적으로 형질변환된 세포는 통상적으로 각각의 세포 분할을 가지는 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 잃어서 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드는 수많은 세포분열 후에 낭세포에서 검출될 수 없도록 한다.
바이오리스틱 (biolistics), 유전자 건 (gun)기법, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환 및 전기천공법을 포함하는, 여기에 모두 포함되는 식물 세포를 형질전환하기 위해, 수많은 방법이 본 분야에서 이용할 수 있다. 식물 염색체로 외부 DNA를 통합시키기 위한 아그로박테리운 시스템은 식물 유전공학을 위해 광범위하게 연구되고, 변형되고 이용되어왔다. 조절 서열에, 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결된 대상 정제된 담배 단백질에 해당하는 DNA 서열을 포함하는 네이키드 재조합 DNA 분자는 통상적인 방법에 의해서 적절한 T-DNA 서열에 결합된다. 이들은 둘다가 표준인, 폴리에틸렌 글리콜 기술 또는 전기천공 기술에 의해 담배 원형질체에 도입된다. 선택적으로, 담배 단백질을 정한정 대상을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 이러한 벡터는 아그로박테리움 세포에 도입되며, 이때 핵산을 식물 세포로 변형한다. T-DNA 벡터 서열을 수반하지 않고 네이키드 DNA에 의한 형질전환은 담배 원형질체와 DNA-함유 리포솜과의 융합을 통해서 또는 전기천공법을 통해서 달성될 수 있다. T-DNA 벡터 서열에 의해 수반되지 않은 네이키드 DNA는 불활성인, 고속의 미세투사물을 통해서 담배 세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다.
세포 또는 배양된 조직은 형질전환을 위해 수용체 조직으로 사용된다면, 식물은 원한다면, 본 분야에 알려진 기술에 의해 형질전환된 배양물로부터 재생될 수 있다. 재조합 구조체에 포함되는 조절 영역의 선택은 이들을 한정하지는 않지만, 효율성, 선택성, 유도성, 바람직한 발현 수준, 및 세포- 또는 조직-선택적 발현을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 코딩 서열에 비해 조절 영역을 적절하게 선택하고 배치함으로써 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게 흔히 있는 일이다. 폴리뉴클레오티드의 전사는 유사하게 조절될 수 있다. 몇개의 적절한 조절 영역은 특정한 세포 유형에서 유일하게 또는 뚜렷하게 개시한다. 식물 게놈 DNA에서 조절 영역을 식별하고 특징화하기 위한 방법은 본 분야에 공지되어 있다.
적절한 프로모터는 다른 조직 또는 세포 유형 (예를 들어, 뿌리-특이 프로모터, 슈트-특이 프로모터, 크실렘-특이 프로모터)에 존재하거나, 또는 다른 개발 단계 동안에 존재하거나, 또는 다른 환경 조건에 반응하여 존재하는 조직-특이 요인에 의해 인식되는 조직-특이 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터는 특이적 유도체를 요구하지 않고 대부분의 세포 유형에서 활성화될 수 있는 구성적 프로모터를 포함한다. NtTS RNAIi 폴리펩티드 생성을 조절하기 위한 적절한 프로모터의 예시는 꽃양배추모자이크바이러스 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS, B33, 노스 또는 유비퀴틴-파세올린-프로모터를 포함한다. 당업자는 재조합 프로모터의 다중 변이체를 생산할 수 있다.
조직-특이 프로모터는 식물성 조직 또는 재생성 조직에서와 같은, 식물 발달 동안에 특정한 시간에서 특히 세포 또는 조직에서만 활성인 전사 제어 요소이다. 조직-특이 발현은 예를 들어, 특정한 조직에서의 폴리뉴클레오티드의 발현이 바람직할 때 유리할 수 있다. 개발적 제어 하에서 조직-특이 프로모터의 예시는 예를 들어 뿌리 또는 잎의 식물 조직, 또는 열매, 배주, 씨, 꽃가루, 피스톨, 꽃과 같은 재생성 조직, 또는 어느 미발달 조직과 같은 특정한 조직에서만 (또는 주로) 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 재생 조직-특이 프로모터는 예를 들어, 꽃밥-특이, 배주-특이, 배아-특이, 배유-특이, 외피-특이, 씨 및 종피-특이, 꽃가루-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 또는 그의 조합일 수 있다.
적절한 잎-특이 프로모터는 피루빈산염, C4 식물 (옥수수)에서의 오르토인산염 다이키나아제 (PPDK) 프로모터, 옥수수에서의 cab-m1Ca+2 프로모터, 애기장대 myb-관련 유전자 프로모터 (Atmyb5), 리불로오스 바이포스페이트 카복실라아제 (RBCS) 프로모터 (예를 들어, 잎 및 밝은-성장 모종에서 발현되는 토마토 RBCS 1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자, 높은 수준에서 잎새 및 잎집에 있는 엽육 세포에서 거의 독점적으로 발현되는 리불로오스 비스포스페이트 카복실라아제 프로모터).
적절한 노쇠-특이 프로모터는 열매 숙성 동안에 활성인 토마토 프로모터, 잎의 노쇠 및 절단, 시스테인 프로테아제를 인코딩하는 유전자의 옥수수 프로모터를 포함한다. 적절한 꽃밥-특이 프로모터가 사용될 수 있다. 당업자에게 알려진 적절한 뿌리-바람직한 프로모터가 선택될 수 있다. 적절한 씨-바람직한 프로모터는 씨-특이 프로모터 (씨 저장 단백질의 프로모터와 같은 씨 개발 동안에 활성인 이들 프로모터들)와 씨-발아 프로모터 (씨 발아 동안에 활성인 이들 프로모터들)둘다를 포함한다. 이러한 씨-바람직한 프로모터는 이들을 한정하지는 않지만, Cim1 (시토키닌-유도 메시지); cZ19B1 (옥수수 19 kDa 제인); milp (myo-이노시톨-1 인산 합성효소); 및 Zm-40으로 알려진 mZE40-2; nuclc; 및 celA (셀룰로오스 합성효소)를 포함한다. 감마-제인은 배유-특이 프로모터이다. Glob-1은 배아-특이 프로모터다. 쌍자엽의 경우, 씨-특이 프로모터는 이들을 한정하지는 않지만, 콩 베타-파세올린, 나핀, ß-콘글리신, 대두 렉틴, 십자화과 식물 등을 포함한다. 단자엽의 경우, 씨-특이 프로모터는 이들을 한정하지는 않지만, 옥수수 15 kDa 제인 프로모터, 22 kDa 옥수수 프로모터, 27 kDa 옥수수 프로모터, g-제인 프로모터, 27 kDa γ-제인 프로모터 (Genbank Accession number S78780 참조, gzw64A 프로모터와 같음), 왁시 (waxy) 프로모터, 주름진 1 프로모터, 주름진 2 프로모터, 글로불린 1 프로모터 (Genbank Accession number L22344 참조하라), Itp2 프로모터, cim1 프로모터, 옥수수 엔드1 및 엔드2 프로모터, nuc1 프로모터, Zm40 프로모터, eep1 및 eep2; lec1, 티오레독신 H 프로모터, mlip 15 프로모터, PCNA2 프로모터; 및 수축된-2 프로모터를 포함한다.
유도성 프로모터의 예시는 병원균 공격, 혐기성 조건, 상승된 온도, 빛, 가뭄, 저온, 또는 높은 염농도에 반응하는 프로모터를 포함한다. 병원균-유도성 프로모터는 병인-관련 단백질 (PR 단백질)로부터의 그들을 포함하고, 이것은 병원균 (예를 들어, PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나아제, 키티나아제)에 의해 다음의 감염에 의해 유도된다.
식물 프로모터 이외에, 다른 적합한 프로모터는 박테리아성 기원, 예를 들어 옥토파인 합성효소 프로모터, 노파린 합성효소 프로모터 및 (Ti 플라스미드로부터 유도되는) 다른 프로모터로부터 유도될 수 있거나, 바이러스성 프로모터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 구성적 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터)로부터 유도될 수 있다.
용어 "NtTS 폴리펩티드"는 니코티아나 타바쿰으로부터 트레오닌 합성효소를 인코딩하는 폴리펩티드를 나타내고 그리고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드; SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20에 대해 NtTS 폴리뉴클레오티드의 단편; 및 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 해당하는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:20의 단편에 의해 인코딩되는 아미노산을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 단편은 SEQ ID Nos 9 내지 19에 기재하였다. NtTS 폴리펩티드는 또한 트레오닌 합성효소로서 작용을 하는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:8에 대해 충분하거나 상당한 상동성 또는 유사성 정도를 포함하는 서열을 포함하고 그리고 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:21에 대해 적어도 95%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함한다. SEQ ID NO. 6은 SEQ ID NO: 1의 번역된 서열이다. SEQ ID NO:7은 SEQ ID NO: 2의 번역된 서열이다. SEQ ID NO:8은 SEQ ID NO. 3의 번역된 서열이다. SEQ ID NO:21은 SEQ ID NO:20의 번역된 서열이고 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:9에 대해 89%의 서열 상동성을 가진다.
하나의 구현예에서, NtTS 폴리펩티드의 단편은 트레오닌 합성효소 활성을 유지한다. NtTS 폴리펩티드는 또한 어느 유형의 변형 (예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실화 상태의 전하; 재접힘 또는 이성질화에 영향을 미치는 변화, 3차원의 구조, 또는 자가-결합 상태)을 도입함으로써 생성되는 변종 및 돌연변이를 포함하고, 이것은 그들이 여전히 트레오닌 합성효소로서 작용을 할 때, 의도적으로 조작되거나 자연적으로 분리될 수 있다. NtTS 폴리펩티드는 선형 형태이거나 공지의 방법을 이용하여 고리화될 수 있다. 용어 "NtTS 폴리펩티드"는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:21에 기재한 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다.
또 다른 태양에서, 서열 목록에 나타낸 어느 폴리펩티드를 포함해서, 여기에 기재한 서열 중 어느 것에 대해 60% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다. 적절하게는, 분리된 폴리펩티드는 여기에 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성된다.
NtTS 폴리펩티드는 어느 유형의 변형 (예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화에 영향을 미치는 변화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태)을 도입함으로써 생성될 수 있고, 이것은 의도적으로 조작되거나 자연적으로 분리될 수 있다. 변종은 미미한 변화를 만들고 기능적으로 동등한 단백질을 가져오는 변형을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 기질의 2차 결합 활성이 보유되는 한, 잔기의 양극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 특성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하된 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하고; 양전하된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성 값을 가지는 비전하된 극성 헤드기를 가지는 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 포함한다. 보존적 치환체는 예를 들어 이하의 표에 따라 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼에서의 동일한 블록에서의 및 바람직하기는 세번째 컬럼의 동일한 줄에서의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure pct00001
NtTS 폴리펩티드는 분화 단백질 또는 미분화 단백질 또는 미분화 단백질로부터 유도되는 단백질일 수 있다. NtTS 폴리펩티드는 선형이거나 공지의 방법을 이용해서 고리화될 수 있다. NtTS 폴리펩티드는 10 이상, 20 이상, 30 이상, 또는 40 이상의 인접한 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 또는 SEQ ID No. 3에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하고, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드 중 어느 하나에 의해, 또는 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 또는 SEQ ID NO:20에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 필수적으로 구성되는 폴리펩티드 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:21에 기재한 서열에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 그리고 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:21에 기재한 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리펩티드가 제공된다.
폴리펩티드 서열의 단편이 여기에 또한 개시되어 있고, 적절하게는 이러한 단편은 트레오닌 합성효소 활성을 보유한다.
돌연변이 폴리펩티드 변종은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 돌연변이 NtTS 폴리펩티드를 포함하는 형질전환 식물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 적절하게는, 돌연변이 NtTS 폴리펩티드는 트레오닌 합성효소 활성을 유지한다.
폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현시키기 위해서 배양 조건 하에 형질전환된 또는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 생성된 발현된 폴리펩티드는 이때 공지의 정제 공정을 이용해서 이러한 배양물로부터 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 정제는 폴리펩티드; 이러한 친화성 수지에 대한 하나 이상의 컬럼 단계; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 또는 면역친화성 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 단계에 결합할 시약을 함유하는 친화성 컬럼을 포함할 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는 또한 정제를 용이하게 하는 형태로 발현될 수 있다. 예를 들어, 말토오스 결합 폴리펩티드 (MBP), 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 티오레독신 (TRX)의 이들과 같은, 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제를 위한 키트는 상업적으로 이용할 수 있다. 폴리펩티드는 에피토프로 태그될 수 있고 연속적으로 이러한 에피토프에 관한 특이 항체를 이용함으로써 정제될 수 있다. 역-상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 액체 크로마토그래피 단계는 폴리펩티드를 더 정제하기 위해서 이용될 수 있다. 다양한 조합으로 앞선 정제 단계의 일부 또는 전부는 상당히 상동성인 재조합 폴리펩티드를 제공하기 위해서 이용될 수 있다. 따라서 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 유리된 다른 폴리펩티드일 수 있고 여기에 기재한 것은 "실질적으로 정제된 폴리펩티드"이고; 이러한 정제된 폴리펩티드는 NtTS 폴리펩티드, 단편, 변종 등을 포함한다. 폴리펩티드와 단편의 발현, 분리, 및 정제는 이들을 한정하지는 않지만 여기에 기재한 방법을 포함하여 어느 적절한 기술에 의해서 달성될 수 있다.
발현된 폴리펩티드를 친화성-정제하기 위해서, 폴리펩티드에 대해 발생하는 모노클로날 항체와 같은 친화성 컬럼을 이용하는 것이 또한 가능하다. 이들 폴리펩티드는 통상적인 기술, 예를 들어, 고염 용출 완충액에서 사용하기 위해 저염 완충액으로 희석되거나 이용되는 친화성 매트릭스에 따라 pH 또는 다른 성분을 변화함으로써 통상적인 기술을 이용해서 친화성 컬럼으로부터 제거될 수 있거나, 또는 친화성 부분의 자연적으로 발생하는 기질을 사용하여 경쟁적으로 제거될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 공지의 통상적인 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 합성 수단에 의한 폴리펩티드 또는 그의 단편을 구성하기 위한 방법은 본 분야에 알려져 있다. 네이티브 폴리펩티드와의 1차, 2차 또는 3차의 구조적 또는 형태학적 특징을 공유함으로써, 합성적으로-구성된 폴리펩티드 서열은 생물학적 활성을 포함해서, 여기에 공통으로 생물학적 특성을 가질 수 있다.
여기에 사용되는 용어 "비자연적으로 발생하는"은 자연적으로 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는 개체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전적 돌연변이, 폴리펩티드, 식물, 식물 세포 및 식물재료)를 기재한다. 이러한 비자연적으로 발생하는 개체 또는 인공적 개체는 여기에 기재되거나 본 분야에 알려진 방법에 의해 제조, 합성, 개시, 변형, 개입 또는 조작될 수 있다. 따라서 실시예에 의하여, 비자연적으로 발생하는 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 세포 또는 비자연적으로 발생하는 식물재료는 역교배와 같은-통상적인 식물 육종 기술을 사용하여-또는 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 메가뉴클레아제 등과 같은 유전자 조적 기술에 의해 이루어질 수 있다. 추가적인 실시예에 의하여, 비자연적으로 발생하는 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 세포 또는 비자연적으로 발생하는 식물재료는 첫번째 식물 또는 식물 세포로부터 두번째 식물 또는 식물 세포 (그자체로 자연적으로 발생할 수 있음)로 유전자이입하거나 또는 하나 이상의 유전적 돌연변이 (예를 들어 하나 이상의 다형성)를 변형함으로써 제조될 수 있어서, 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물재료 또는 그의 후손는 자연에 의해 형성되지 않거나 또는 자연에 존재하지 않는, 유전적 구조체 (예를 들어 게놈, 염색체 또는 그의 단편)을 포함한다. 따라서 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 제료는 인공적이거나 비자연적으로 발생한다. 따라서, 인공적이거나 비자연적으로 발생하는 식물 또는 식물 세포는, 생성된 유전적 서열이 첫번째 식물 또는 식물 세포와 다른 유전적 배경을 포함하는 두번째 식물 또는 식물 세포에 자연적으로 발생한다면, 자연적으로 발생하는 첫번째 식물 또는 식물 세포에서 유전적 서열을 변형함으로써 제조될 수 있다. 유전적 배경에서의 차이는 유전적 마커 (예를 들어, 마이크로새틀라이트 RNA 마커)가 있거나 없을 때, 핵산 서열화와 같이-표현형 차이점 또는 본 분야에 알려진 분자생물학 기술에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 구현예에서, NtTS 폴리펩티드와 면역반응성인 항체는 여기에 제공된다. 여기에 기재한 바와 같은 NtTS 폴리펩티드, 단편, 변종, 융합 폴리펩티드 등은 거기에 면역반응성인 항체를 생성하는 데 있어 "면역원"으로서 이용될 수 있다. 이러한 항체는 항체의 항원-결합 부위를 통해서 NtTS 폴리펩티드에 특정하게 결합할 수 있다. 특정하게 결합항체는 다른 분자를 제외한, NtTS 군 폴리펩티드, 상동체, 및 변종을 특정하게 인식하고 이들과 결합하는 것들이다. 하나의 구현예에서, 항체는 여기에 기재한 바와 같은 NtTS 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 특이적이고 다른 폴리펩티드와 교배-반응하지 않는다.
더욱 특정하게는, 폴리펩티드, 단편, 변종, 융합 폴리펩티드 등은 항체의 형성을 가져오는, 항원결정기 또는 에피토프를 함유한다. 이들 항원결정기 또는 에피토프는 선형 또는 입체적 (불연속적인)일 수 있다. 입체적 또는 불연속 에피토프가 폴리펩티드 접힘시에 아주 근접하게 되는 폴리펩티드 사슬의 다른 영역으로부터의 아미노산 섹션으로 이루어진 반면, 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산의 단일 섹션으로 이루어진다. 에피토프는 공지에 알려진 어느 방법에 의해 식별될 수 있다. 추가적으로, 폴리펩티드로부터의 에피토프는 폴리클로날 혈청 또는 배양된 하이브리도마로부터의 상청액과 같은 기질로부터 특이 결합항체를 정제하기 위해서, 분석에서 연구 시약으로서 사용될 수 있다. 이러한 에피토프 또는 그의 변종은 고체-상 합성, 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적 절단과 같은 본 분야에 알려진 기술을 사용하여, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 또한 여기에 고려된다. 이러한 하이브리도마는 통상적인 기술에 의해 생성되고 식별될 수 있다. 항체의 생성을 위하여 다양한 숙주 동물은 NtTS 폴리펩티드, 단편, 변종 또는 그의 돌연변이로 주입하여 면역될 수 있다. 이러한 숙주 동물은 이들을 한정하지는 않지만, 토끼, 쥐, 및 래트, 그 외를 포함한다. 다양한 보조체는 면역학적 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 종에 따라서, 이러한 보조체는 이들을 한정하지는 않지만, Freund's (완전하고 그리고 불완전함), 수산화 알루미늄과 같은 광물 겔, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 표면 활성 기질, BCG (bACILLE cALMETTE-gUERIN) 및 코리네박테리움 파르븀과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조체를 포함한다. 모노클로날 항체는 통상적인 기술에 의해 회수될 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및그의 어느 서브클래스 (subclass)을 포함하는 어느 면역글로불린 클래스일 수 있다.
항체는 또한 in vitro 또는 in vivo에서 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 감지하기 위해 분석에 사용될 수 있다. 항체는 또한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제하는 데 이용될 수 있다.
트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 조성물은 이들을 한정하지는 않지만, 하나 이상의 내인성 트레오닌 합성효소 유전자(들)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 트레오닌 합성효소 RNA 전사체 (예를 들어 이중가닥 RNAs, microRNA, siRNAs, 리보자임)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 트레오닌 합성효소의 단백질의 안정성을 방해할 수 있는 서열-특이 폴리펩티드; 기질 또는 조절 단백질과 관련해서 트레오닌 합성효소 단백질의 효소 활성 또는 트레오닌 합성효소 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 트레오닌 합성효소 단백질에 대한 특이성을 나타내는 항체; 트레오닌 합성효소 단백질의 안정성 또는 트레오닌 합성효소 단백질의 효소 활성 또는 트레오닌 합성효소 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 소분자 화합물; 트레오닌 합성효소 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질; 및 트레오닌 합성효소 폴리뉴클레오티드에 대한 활성을 가지는 메가뉴클레아제를 포함한다.
안티센스 기술은 NtTS 폴리펩티드의 발현을 조절 (예를 들어, 감소 또는 억제)하기 위해서 사용될 수 있는 공지의 방법이다. 억제될 NtTS 유전자의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 안티센스 가닥이 전사되도록 조절 영역 및 전사 종결 서열에 클론되고 작동가능하게 연결된다. 재조합 구조체는 이때 식물로 형질전환되고 RNA의 안티센스 가닥이 생성된다. 폴리뉴클레오티드는 유전자의 전체 서열이 억제될 필요는 없지만, 통상적으로 작아더 억제될 유전자의 센스 가닥의 일부에 (코딩 또는 비-코딩 영역인지에 상관없이)실질적으로 상보적일 것이다.
폴리뉴클레오티드는 mRNA의 발현에 영향을 미치는 리보자임 또는 촉매 RNA로 전사될 수 있다. 리보자임은 기능적으로 표적 RNA를 불활성함으로써, 표적 RNA를 특정하게 사실상 어느 표적 RNA와 쌍을 이루고 특정 위치에서 포스포디에스테르 구조를 절단하기 위해 고안될 수 있다. 이형의 폴리뉴클레오티드는 특정한 mRNA 전사체를 절단하기 위해 고안된 리보자임을 인코딩할 수 있으므로 폴리펩티드의 발현을 방지할 수 있다. 부위-특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 다양한 리보자임이 사용될 수 있지만 해머헤드 리보자임은 특정한 mRNA를 파괴시키는데 유용하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적 염기쌍을 형성하는 태양 영역에 의해 영향을 미치는 위치에서 mRNA를 절단한다. 하나의 요구조건은 표적 RNA가 5'-UG-3' 뉴클레오티드 서열을 함유한다는 것이다. 해머헤드 리보자임의 구조 및 생성은 본 분야에 알려져 있다. 해머헤드 리보자임 서열은 in vivo 절단 효능을 증가시키기 위한 전이 RNA (tRNA)와 같은 안정한 RNA에 함침될 수 있다.
하나의 구현예에서, 트레오닌 합성효소 RNA 전사체(들)의 번역을 간섭할 수 있느 서열-특이 폴리뉴클레오티드는 RNAi다. RNA 간섭 ("RNAi") 또는 RNA 사일런싱은 특이 mRNA가 효소성 저하를 위한 표적이 될 수 있는 것에 의해 진화적으로 유지된 공정이다. 이중가닥 RNA (이중가닥 RNA)는 RNAi 경로를 개시하기 위해 세포 (예를 들어, 이중가닥 RNA 바이러스, 또는 NtTS RNAi 폴리뉴클레오티드)에 도입되거나 생성되어야 한다. 이중가닥 RNA는 RNases III에 의해 21-23 bp 길이 ("siRNAs")의 다중 siRNA 이중체로 변환될 수 있고, 이것은 이중가닥의 RNA-특이 엔도뉴클레아제 ("Dicer")이다. siRNA는 ATP-의존 공정을 통해서 siRNA의 풀림을 촉진하는 RNA-유도된 사일런싱 복합체 ("RISC")에 의해 추후에 인식될 수 있다. siRNA의 풀린 안티센스 가닥은 siRNA 안티센스 가닥에 대한 서열 상보성을 포함하는, 표적으로 하는 mRNA (예를 들어, NtTS RNA 변이체)에 대해 활성화된 RISC를 가이드한다. 표적으로 하는 mRNA 및 안티센스 가닥은 A-형 나선을 형성할 수 있고, A-형 나선의 주요 홈은 활성화된 RISC에 의해 인식될 수 있다. 표적 mRNA는 siRNA 가닥의 5'-말단의 결합 부위에 의해 정의되는 단일 부위에서 활성화된 RISC에 의해 절단될 수 있다. 활성화된 RISC는 또 다른 전달 경우를 촉매화하기 위해 재활용될 수 있다.
NtTS RNAi 발현 벡터는 NtTS mRNAs, NtTS pre-mRNAs, 또는 관련된 NtTS RNA 변이체의 발현 수준을 감소시킴으로써 RNA 간섭 활성을 나타내는 NtTS RNAi 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 NtTS RNAi 구조체를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 여기에 더 기재된 바와 같은, 상류에 위치하고 NtTS RNAi 구조체에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. NtTS RNAi 발현 벡터는 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호를 포함하여 적절한 작은 코어 프로모터, 관심의 NtTS RNAi 구조체, 상류 (5') 조절 영역, 하류 (3') 조절 영역, 및 다양한 선택 마커와 같은 당업자에게 알려진 다른 서열을 포함할 수 있다.
NtTS 폴리뉴클레오티드는 이중가닥 구조 (즉, 안티센스 가닥과 상보적 센스 가닥을 포함하는 이중가닥 RNA 분자), 이중가닥 헤어핀-형 구조 ("dsRNAi") 또는 단일가닥 구조 (즉, 안티센스 가닥을 포함하는 ssRNA 분자)를 포함하여 다양한 형태로 제조될 수 있다. 구조는 자가 상보적 센스 및 안티센스 가닥을 가지는, 이중, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 이차구조를 포함할 수 있다. NtTS dsRNAi는 이중 가닥 NtTS siRNAs에 효소적으로 변환될 수 있다. NtTS siRNA 이중 중의 하나의 가닥은 표적 NtTS mRNA 및관련된 NtTS RNA 변이체 내에 상보적 서열에 어닐링할 수 있다. siRNA/mRNA 이중은 서열-의존적으로 다중 부위에서 NtTS RNAs를 절단할 수 있는 RISC에 의해 인식되고, 표적 NtTS mRNA 및 관련된 NtTS RNA 변종의 저하를 가져온다.
이중가닥 RNA 분자는, 여기서 siRNA 분자의 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역이 폴리뉴클레오티드 기재 또는 비-폴리뉴클레오티드-기재 연결기(들)에 의해서 연결되는 스템-루프 구조의 단일 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생산하기 위해 in vivo 또는 in vitro로 처리될 수 있는 두개이상의 루프 구조를 가지는 원형의 단일가닥 RNA 및 자가-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 스템으로부터 결합되는 siRNA 분자를 포함할 수 있다.
작은 헤어핀 RNA (shRNA)분자의 용도는 여기에 또한 고려되고 특이한 안티센스 서열뿐만 아니라, 통상적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해 분리되는, 역상보성 (센스)서열을 포함한다. 스페이서 또는 루프의 절단은 단일 가닥 RNA 분자 및 그의 역상보성을 제공해서, 이중가닥 RNA 분자를 형성하기 위해 어닐링할 수 있다 (경우에 따라서는, 하나 이상의 가닥의 3'말단 또는 5'말단으로부터 하나, 두개, 세개 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수 있는 추가적인 처리 단계를 사용). 스페이서는 안티센스 및 센스 서열이 이중가닥 구조 (또는 스템)를 어닐링하고 형성하도록 허용할 정도로 충분한 길이일 수 있고 이후에 스페이서를 절단할 수 있다 (그리고 경우에 따라서는, 하나 이상의 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단으로부터 하나, 두개, 세개, 네개 이상의 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거를 가져올 수 있는 연속 처리 단계). 스페이서 서열은 통상적으로 두개의 상보성 뉴클레오티드 서열 영역 사이에 위치하는 관련되지 않은 뉴클레오티드 서열이며, 이것은 이중가닥 폴리뉴클레오티드로 어닐링할 때 shRNA를 포함한다. 스페이서 서열은 일반적으로 약 3 내지 약 100의 뉴클레오티드를 포함한다.
관심의 NtTS RNA 폴리뉴클레오티드는 NtTS 헤어핀 이중체를 생성하기 위한 적절한 서열 조성물, 루프 크기, 및 스템 길이를 선택함으로써 생성될 수 있다. 헤어핀 이중체의 스템 길이를 고안하기 위한 적절한 범위는 약 14-30 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 약 200-300 뉴클레오티드, 약 300-400 뉴클레오티드, 약 400-500 뉴클레오티드, 약 500-600 뉴클레오티드, 및 약 600-700 뉴클레오티드와 같은 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 뉴클레오티드의 스템 길이를 포함한다. 헤어 이중체의 스템 길이가 상당하다면 헤어핀 이중체의 루프 길이를 고안하기 위한 적절한 범위는 약 4-25 뉴클레오티드, 약 25-50 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함한다. 특정한 구현예에서, 이중가닥 RNA (dsRNA) 또는 단일가닥 RNA (ssRNA)분자는 길이가 약 15내지 약 40의 뉴클레오티드다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 35의 뉴클레오티드의 dsRNA 또는 ssRNA 분자다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 17 내지 약 30의 뉴클레오티드의 dsRNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오티드의 dsRNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 21 내지 약 23의 뉴클레오티드의 dsRNA 또는 ssRNA 분자이다. 특정한 구현예에서, 21 뉴클레오티드보다 긴 이중 영역의 헤어핀 구조는 루프 서열과 길이에 상관없이 효과적인 siRNA-특이 사일런싱을 촉진할 수 있다.
표적 mRNA 서열은 통상적으로 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드이다. 그러므로 표적 mRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 다음의 기준; 약 2:1내지 약 1:2의 A+T/G+C 비율; 표적 서열의 5' 말단에서 AA 디뉴클레오티드 또는 CA 디뉴클레오티드; 표적 mRNA에 대해 특이적인 10 이상의 연속적 뉴클레티드의 서열 (즉, 서열은 동일한 식물로부터 다른 mRNA 서열에 존재하지 않음); 셋 이상의 연속적 구아닌 (G) 뉴클레오티드 또는 셋 이상의 연속적 사이토신 (C) 뉴클레오티드의 "가동" (run)이 없다)를 바람직하게 충족시키는, 길이가 약 14 내지 약 50의 뉴클레오티드의 영역을 스캔 (scanned)할 수 있다. 이러한 기준은 본 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있고, 예를 들어 BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램은 선택된 표적 서열이 표적 mRNA에 특이 여부를 결정하기 위해서 공적으로 이용할 수 있는 데이터베이스를 검색하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 표적 서열 (및 고안된 siRNA 서열)은 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 (예를 들어, 상업적으로 이용할 수 있는 OligoEngine, Target Finder 및 the siRNA Design Tool)를 사용하여 선택될 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 위의 기준을 충족시키는 길이가 약 14 내지 약 30의 뉴클레오티드인 표적 mRNA 서열이 선택된다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 위의 기준을 만족시키는 길이가 약 16내지 약 30의 뉴클레오티드인 표적 서열이 선택된다. 추가적인 구현예에서, 하나 이상의 위의 기준을 만족시키는 길이가 약 19 내지 약 30의 뉴클레오티드인 표적 서열이 선택된다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 상기 기준을 만족시키는 길이가 약 19 내지 약 25의 뉴클레오티드인 표적 서열은 선택된다.
예시적인 구현예에서, 발현을 조절하기 위해 사용되는 분자는 SEQ ID NOs:1 내지 5 또는 20와 같은 여기에 기재한 NtTS 폴리뉴클레오티드 서열 중의 어느 하나의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 이상의 인접한 뉴클레오티드에 상보적인 특이적 서열 (예를 들어, 안티센스 서열)을 포함한다.
추가의 예시적인 구현예에서, 발현을 조절하기 위해 사용되는 분자는 SEQ ID NOs의 뉴클레오티드 1-46: SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1-52; SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 99-141; SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 102-144; SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 102-153; SEQ ID NOs: 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 1325-1362; 또는 SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1334-1371의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 상보적인 서열 (예를 들어, 안티센스 서열)을 포함한다.
추가의 예시적인 구현예에서, 발현을 조절하기 위해 사용되는 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 454-805 또는 SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 463-814의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드에 대해 상보적인, 서열 (예를 들어, 안티센스 서열)을 포함한다.
siRNA 분자에 의해 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 서열의 보체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 하나의 구현예에서, siRNA 분자에 의해 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA 서열의 보체와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 동일하다. 서열 상동성을 측정하는 방법은 본 분야에 알려져 있고 예를 들어 University of Wisconsin Computer Group (GCG)의 BLASTN 프로그램을 사용해서 측정될 수 있거나 NCBI 웹사이트에 제공될 수 있다.
siRNA 분자의 특이적 안티센스 서열은 한개, 두개, 세개, 네개 이상의 뉴클레오티드에서 표적 mRNA의 서열과 상이 (예를 들어 전이 또는 전환을 포함하는 뉴클레오티드 치환에 의함)해서 가변성을 나타낼 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 치환체가 이중가닥 RNA 분자의 안티센스 가닥에 있으면, 치환체 뉴클레오티드가 수소결합 염기쌍을 전형적으로 형성하는 안티센스 가닥에서의 상보적 뉴클레오티드는 상응하여 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 치환이 센스 서열에서, 그렇지만 안티센스 가닥이 아닌 것에서 발생하는 이중가닥 RNA 분자가 또한 고려된다. siRNA 분자의 안티센스 서열이 위에 기재된 바와 같이, siRNA의 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 사이에 하나 이상의 불일치를 포함할 때 불일치는 안티센스 서열의 3' 말단, 5' 말단 또는 중앙부에서 발견될 수 있다.
또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 엄격한 조건 하에서 자연적으로 발생하는 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 부분에 선택적으로 혼성화할 수 있는 특이적 안티센스 서열을 포함한다. 당업자에에 알려진 바와 같이 혼성화 조건의 엄격성의 변이는 혼성화 및 세척 단계를 위해 사용되는 시간, 온도 또는 용액의 농도를 변경함으로써 얻을 수 있다. 적절한 조건은 또한 사용되는 특정한 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적 mRNA 또는 유전자의 서열에 따라 부분적으로 달라질 수 있다.
식물에서 이중가닥 RNA-사일런싱을 유도하기 위한 하나의 방법은 헤어핀 RNA를 생성하는 유전자 구조체와의 형질전환이다 (Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320 참고). 이러한 구조체는 적절한 스페이서에 의해 분리되는, 표적 유전자 서열의 반전된 (inverted)영역을 포함한다. 스페이서 단편으로서 기능적 식물 인트론 영역의 삽입은 추가적으로 인트론 접합된 헤어핀 RNA의 생성으로 인해 유전자 사일런싱 유도의 효능을 증가키는 것이다 (Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590). 적절하게는, 스템 길이는 길이가 약 50 뉴클레오티드 내지 약 1 킬로베이스다. 인트론 접합된 헤어핀 RNA을 생성하기 위한 방법은 본 분야에 잘 기재되어 있다 (예를 들어, Bioscience, Biotechnology, 및 Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 참조).
이중 또는 이중가닥 구조, 예를 들어 이중가닥 RNA 또는 shRNA을 가지는 RNAi는 평활 (blunt)말단을 가질 수 있거나 3' 또는 5' 오버행을 가질 수 있다. 여기에 사용되는 바와 같이, "오버행"은 하나의 RNA 가닥의 3'-말단이 다른 가닥 (3' 오버행)의 5'-말단 이상으로 확장하거나, 또는 반대로 (5' 오버행)이면 이중 구조로부터 돌출되는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드를 의미한다. 오버행을 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 그의 개변된 버전일 수 있다. 하나의 구현예에서, RNAi 분자의 하나 이상의 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가진다. 또 다른 구현예에서, 3' 오버행은 길이가 약 1 내지 약 5의 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3의 뉴클레오티드 및 약 2 내지 약 4의 뉴클레오티드의 오버행을 가진다.
RNAi 분자가 분자의 하나의 말단에서 3' 오버행을 포함할 때 다른 말단은 평활-말단이거나 오버행 (5' 또는 3')을 또한 가질 수 있다. RNAi 분자가 분자의 양쪽 말단에서 오버행을 포함할 때 오버행의 길이는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 하나의 구현예에서, RNAi 분자는 분자의 양쪽 말단의 약 1 내지 약 3의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 추가적인 구현예에서, RNAi 분자는 분자의 양쪽 말단에서 2 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가지는 이중가닥 RNA이다. 그러나 또 다른 구현예에서, RNAi의 오버행을 포함하는 뉴클레오티드는 TT 디뉴클레오티드 또는 UU 디뉴클레오티드이다.
표적 mRNA 서열에 대해 하나 이상의 오버행을 포함하는 RNAi 분자의 퍼센트 상동성을 측정할 때, 오버행(들)은 중요하거나 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 이중가닥의 3' 오버행의 뉴클레오티드 및 5'- 또는 3'-말단의 2 뉴클레오티드는 siRNA 분자의 활성의 상당한 손실 없이 개변될 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 5' 또는 3'-캡 구조를 포함할 수 있다. RNAi는 RNAi 분자의 센스가닥, 안티센스가닥, 또는 센스와 안티센스가닥 둘다의 3'말단에서; 또는 센스가닥, 안티센스가닥, 또는 센스와 안티센스가닥 둘다의 5'-말단에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 선택적으로, RNAi 분자는 RNAi 분자의 3'-말단과 5'-말단에서 캡 구조를 포함할 수 있다. 용어 "캡 구조"는 올리고뉴클레오티드의 하나의말단에서 병합되는 화학적 변형을 의미하고, 이것은 엑소뉴클레아제 저하로부터 분자를 보호하며 또한 세포 내에 전달 또는 국소화를 용이하게 할 수 있다.
RNAi 분자에 적용할 수 있는 또 다른 개변은 RNAi 분자의 활성, 세포 분할, 세포 흡수, 생체이용성 또는 안정성을 증강시키는 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트의 RNAi 분자에 대한 화학적 결합이다. 폴리뉴클레오티드는 본 분야에 잘 확립되어 있는 방법에 의해 합성되거나 개변될 수 있다. 화학적 개변은 이들을 한정하지는 않지만, 2' 변형, 비자연적 염기의 도입, 리간드에 대한 공유결합, 및 포스페이트 연결과 티오포스페이트 연결의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 이중 구조의 강성은 하나 이상의, 통상적으로 두개의 화학적 결합에 의해서 강화된다. 화학적 연결은 다양한 잘 알려진 기술, 예를 들어 공유, 이온 또는 수소 결합; 수소성 상호작용, 반데르 발스 또는 스태킹 상호작용을 도입함으로써; 금속-이온 배위에 의해서 또는 푸린 유사체의 사용을 통해서 얻을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두개의 단일 가닥 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 세포 효소, 예를 들어 한정없이 특정한 뉴클레아제의 활성을 감소시키거나 억제하기 위해 변형될 수 있다. 세포 효소의 활성을 감소시키거나 억제시키기 위한 기술은 이들을 한정하지는 않지만, 2'-아미노 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-알킬 변형, 비전하된 구조 변형, 모르폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형, 및 포스포르아미데이트를 포함하여 분 분야에 알려져 있다. 그러므로 이중가닥 RNA에서 뉴클레오티드의 하나 이상의 2'-히드록실기는 화학적 작용기에 의해서 치환된다. 또한 하나 이상의 뉴클레오티드는 LOCKED 뉴클레오티드를 형성하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 고정된 뉴클레오티드는 리보스의 2'-산소와 리보스의 4'-탄소를 연결하는 메틸렌 또는 에틸렌 다리를 함유한다. 고정된 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드를 도입하는 것은 상보성 서열을 위한 친화성을 향상시키고 몇도의 융점을 증가시킨다.
리간드는 예를 들어 그것의 세포 흡수를 증강시키기 위해서 RNAi 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정한 구현예에서, 소수성 리간드는 분자에 컨쥬게이트되어서 세포막의 직접적 침투를 용이하게 할 수 있다. 이들 접근법은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 침투를 용이하게 하기 위해 사용되어왔다. 특정한 예시에서, 양이온 리간드의 올리고뉴클레오티드로의 컨쥬게이션은 종종 뉴클레아제에 대한 개선된 내성을 가져온다. 양이온 리간드의 대표적인 예시는 프로필암모늄과 디메틸프로필암모늄을 포함한다. 양이온 리간드가 올리고뉴클레오티드를 통해 분산될 때 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNAi에 대한 그들의 높은 결합친화성을 유지할 수 있다.
여기에 기재된 분자 및 뉴클레오티드는 고체상 합성의 잘 알려진 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 본 분야에 알려진 이러한 합성의 어떤 다른 방법은 부가적으로 또는 선택적으로 채택될 수 있다.
다양한 구현예는 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 NtTS 발현 벡터 또는 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 NtTS RNAi 구조체에 관한 것이다.
다양한 구현예는 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 NtTS RNAi 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 자가-어닐링할 수 있는, 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 NtTS RNAi 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것으로, 이 구조체는 (a) 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드; (b) 헤어핀 구조의 루프를 형성하는 스페이서 원소를 인코딩하는 두번째 서열; 및 (c) 첫번째 서열의 역상보성 서열을 포함하는 세번째 서열로, 이것은 첫번째 서열과 같은 동일한 배향에서 위치하고, 여기서 두번째 서열은 첫번째 서열과 세번째 서열 사이에 위치하고, 두번째 서열은 첫번째 서열과 두번째 서열에 작동가능하게 연결된다.
개시한 서열은 헤어핀 구조체를 형성하지 않는 다양한 NtTS 폴리뉴클레오티드를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, NtTS 이중가닥 RNA는 (1) 첫번째 프로포머를 작동가능하게 연결함으로써 NtTS DNA의 첫번째 서열을 전사하고 (2)두번째 프로모터에 작동가능하게 연결함으로써 NtTS DNA 단편의 첫번째 가닥의 역상보성 서열을 전사시킴으로써 형성될 수 있다. NtTS 폴리뉴클레오티드의 각 가닥은 동일한 발현 벡터로부터 또는 상이한 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. RNA 간섭 활성을 가지는 NtTS RNA 이중체는 siRNA에 효소적으로 전환될 수 있어서 NtTS RNA 수준을 감소시킨다.
따라서 다양한 구현예는 자가-어닐링할 수 있는 NtTS RNAi 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 NtTS 폴리뉴클레오티드 또는 NtTS RNAi 구조체를 포함하는 NtTS 발현 벡터에 관한 것으로, 이러한 구조체는 (a) 여기에 기재한 하나 이상의 NtTS 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 첫번째 서열의 상보성 (예를 들어, 역상보성)서열을 포함하는 두번째 서열로, 이것은 첫번째 서열과 동일한 배향으로 위치한다.
다양한 조성물 및 방법을 NtTS 유전자 발현의 공-억제를 촉진함으로써 NtTS의 외인성 발현을 감소시키기 위해 제공한다. 공-억제 현상은 이식유전자의 다중복제를 식물 세포주로 도입시켜서 발생하게 된다. 이식유전자의 다중복제의 통합은 이식유전자과 표적인 내인성 유전자의 감소된 발현을 가져온다. 공-억제의 정도는 이식유전자과 표적인 내인성 유전자 사이에 서열 상동성의 정도에 따라 다르다. 내인성 유전자와 이식유전자 둘다의 사일런싱은 전사를 방해할 수 있는 사일런싱 지역 (즉 관심의 내인성 프로모터 및 내인성 유전자)의 광범위한 메틸화에 의해 발생할 수 있다. 선택적으로 일부 경우에, 내인성 유전자와 이식유전자 유전자의 공-억제는 전사후 유전자 사일런싱 ("PTGS")에 의해 발생할 수 있고, 전사체는 생성될 수 있지만 증가된 저하율은 전사의 축적을 방해한다. PTGS에 의해 공-억제를 위한 메커니즘은 RNA 간섭과 유사한 것으로 사료되고, RNA는 이러한 공정에서 중요한 개시제 및 표적인 것으로 나타나며, 가능하다면 mRNAs의 RNA-관련 저하를 통해서, 동일한 분자 구조에 의해 적어도 부분적으로 조정될 수 있다.
NtTS 핵산의 공-억제는 NtTS 핵산 또는 이식유전자인 그의 단편의 다중 복제를 관심의 식물의 게놈으로 통합함으로써 얻을 수 있다. 숙주 식물은 NtTS 핵산 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 형질전환될 수 있다. 다양한 구현예는 NtTS 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, NtTS의 내인성 유전자의 공-억제를 발현시키기 위한 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 다중 복제를 (담배) 식물 게놈으로 통합시킴으로써 NtTS DNA의 발현 벡터를 조절 (예를 들어, 감소 또는 억제)하기 위한 방법에 관한 것으로, 이것은 숙주 세포를 NtTS 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는, 발현 벡터로 형질전환하는 것을 포함한다.
다양한 조성물 및 방법은 NtTS mRNA의 전사를 감소시키거나 억제함으로써 NtTS의 내인성 유전자 발현 수준을 감소시키기 위해 제공된다. 숙주 (담배) 식물 세포는 발현 벡터로 형질전환될 수 있고, 이것은 NtTS 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 서열 상보성을 가지는 RNA 폴리뉴클레오티드의 발현이 NtTS mRNA의 일부에서 가능하게 하기 위해 프로모터와 관련해서 안티센스 배향에 위치하는 프로모터를 포함한다.
NtTS mRNA의 전사를 감소시키거나 억제시키기 위한 다양한 발현 벡터는 서열이 프로모터와 관련해서 안티센스 배향으로 위치하는, NtTS 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 안티센스 NtTS RNA 폴리뉴클레오티드의 길이는 다양한데, 약 15-20 뉴클레오티드, 약 20-30 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-75 뉴클레오티드, 약 75-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 및 약 200-300 뉴클레오티드일 수 있다.
돌연변이 NtTS 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드을 얻기 위한 방법이 또한 제공된다. 식물 세포 또는 식물재료를 포함하는, 관심의 어느 식물은 총 유전자 합성, DNA 셔플링 및 다른 동등한 방법에 의해서 부위-특이 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-특이 돌연변이 유발, 화학적으로-유도된 돌연변이 유발, 조사-유발 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 갭 (gapped) 이중 DNA을 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 절단 돌연변이 유발, 돌연변이 유발을 포함하는, 돌연변이 유발을 유도하기 위해 다양한 공지의 방법에 의해서 유전적으로 변형될 수 있다.
선택적으로, NtTS 유전자는 식물에서 자가-절단 및 복제를 할 수 있는 소량의 원형 RNAs로부터 유도되는 리보자임을 도입함으로써 불활성을 목표로 할 수 있다. 이러한 RNAs는 단독 (바이로이드 RNAs) 또는 보조 바이러스 (새틀라이트 RNAs)로 복제할 수 있다. 적절한 RNAs의 예시는 아보카도 sunblotch 바이로이드로부터 유도된 것들 및 담배 원형반점 바이러스로부터 유도되는 세틀라이트 RNAs, 자주개자리 일시적 줄무늬 바이러스, 벨벳 담배 얼룩 바이러스, 솔라눔 노디플로룸 얼룩 바이러스, 및 땅속 클로버 얼룩 바이러스를 포함한다. 다양한 표적의 RNA-특이 리보자임은 당업자에게 알려져 있다.
일부 구현예에서, NtTS 폴리펩티드의 발현은 NtTS 유전자에서 하나 이상의 돌연변이와 같은 비-형질전환 수단에 의해 감소된다. 유전자 서열에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이 유발, EMS 돌연변이 유발 및 방사 돌연변이 유발을 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적 돌연변이를 세포로 도입하는 방법은 이들을 한정하지는 않지만 유전자 편집 기술, 특히 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발, ㅌ티틸링 (tilling) (게놈에서 유도된 국소 병변을 목적으로 함), 상동성 재조합, 올리고뉴클레오티드-특이 돌연변이 유발, 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이 유발을 포함한다.
돌연변이의 몇가지 이에 한정하는 것은 아니지만 예를 들면 하나 이상의 뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs) 및 단일 서열 반복의 결실, 삽입 및 미스센스 돌연변이다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 조기 중지 코돈, 그렇지 않으면 비-기능적인 NtTS 유전자를 형성하는 결실을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 돌연변이를 스크리닝하는 것은 NtTS 유전자 또는 단백질에 특이한 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 서열화하거나, 그의 사용에 의해서 수행될 수 있다. 감소된 NtTS 유전자 발현, NtTS mRNA의 감소된 안정성, 또는 NtTS 단백질의 감소된 안정성을 가져올 수 있는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 특정한 돌연변이가 생성될 수 있다. 이러한 식물은 돌연변이 식물로서 여기에 참고된다.
돌연변이 식물은 감소된 NtTS 폴리펩티드 수준을 초래하는 그 이상의 돌연변이 조성물을 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 식물은 단일 NtTS 유전자의 단일 NtTS 유전자 또는 여러 돌연변이에서 단일 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서, NtTS의 돌연변이 폴리펩티드 변종을 포함하는 돌연변이 식물이 나온다.
하나의 구현 예에서, 식물로부터의 종자는 돌연변이가 일어난 후, 제1세대 돌연변이 식물로 성장한다. 1세대 식물이 자가수분이 허용되고, 1세대 식물로부터의 종자가 그들의 NtTS 위치에서 돌연변이를 위해 검사되는 제2세대 식물에서 성장한다. 돌연변이를 일으킨 식물재료가 돌연변이를 검사할 수 있음에도 불구하고, 제2세대 식물을 검사하는 것의 장점은 모든 체세포 돌연변이가 생식세포 돌연변이와 일치하는 것이다. 본 분야의 기술 중 하나는 NtTS 돌연변이 식물을 생성하기 위해서, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 제한하지 않지만 포함하는 식물재료의 다양성에 돌연변이가 발생될 수 있다는 것을 이해하는 것이다. 그러나, 식물 핵산이 돌연변이에 대해 검사될 때, 돌연변이가 유발된 식물재료의 종류는 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 비 돌연변이 식물의 수분 전에, 꽃가루이 돌연변이 유발이 쉬울 때, 그 수분으로 인해 얻어진 종자는 1세대 식물에서 자라게 된다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 만든 돌연변이를 포함할 것이다; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신 NtTS 돌연변이에 대해 검사될 수 있다.
점 돌연변이, 짧은 결실, 삽입, 전환, 및 또는 화학적 돌연변이 또는 방사선 을 포함하는 전이를 만드는 돌연변이원은 돌연변이를 만드는 데 사용될 수 있다. 돌연변이은 에틸메탄술포네이트 (EMS), 메틸메탄술포네이트 (MMS), N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU), 트리데틸멜라민 (TEM), N-메틸-N-니트로소우레아 (MNU), 프로카바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 니트로젠 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘 (MNNG), 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈안트라센 (DMBA), 에틸렌 옥시드, 헥사메틸포스포라마이드, 비술판, 디에폭시알칸 (디에폭시옥탄 (DEO), 디에폭시부탄 (BEB) 등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-(에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 (ICR-170), 및 포름알데히드에 한정되지는 않는다. 돌연변이에 의해 바로 야기되지 않는 NtTS 위치에서, 자발적 돌연변이는 그들이 원하는 표현형의 결과가 나온 것이 제공됨이 또한 고려된다. 또한 적합한 돌연변이 유발제는 예를 들어, 전리 방사선 - X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사선과 같은 것을 포함한다. 본 분야에서 기술로 알려진 식물 핵산 제조방법은 NtTS 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 핵산을 준비하기 위해 사용될 수 있다. 본 분야에서 기술로 알려진 식물 핵산 준비 방법은 NtTS 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 핵산을 준비하기 위해 사용될 수 있다.
각각의 식물, 식물 세포 또는 식물재료로부터 제조된 핵산은 돌연변이가 유발된 식물 조직, 세포 또는 재료로부터 발생하는 식물 개체군의 NtTS 유전자에서 돌연변이에 대한 스크리닝을 신속하게 하기 위해 선택적으로 풀링될 수 있다. 식물, 식물 세포 또는 식물재료의 그 이상의 후속 세대는 스크리닝될 수 있다. 선택적으로 풀링 집단의 크기는 사용된 스크리닝 방법의 감도에 의존한다.
핵산 샘플이 선택적으로 풀링된 후, 중합 연쇄 반응 (PCR)과 같은, NtTS 폴리뉴클레오티드 특이적 증폭 기술을 실시할 수 있다. NtTS 유전자 또는 NtTS 유전자에 바로 인접서열에 특이적인 그 이상의 프라이머 또는 프로브는 선택적으로 모아진 핵산 샘플 내의 NtTS 서열을 증폭하는 데에 이용될 수 있다. 바람직하게, 그 이상의 프라이머는 유용한 돌연변이가 대부분 발생하는 NtTS 유전자 위치의 영역을 증폭하도록 설계되었다. 가장 바람직하게, 프라이머는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 영역 내에서 변이를 검출하도록 설계되었다. 또한, 이것은 점 돌연변이에 대한 스크리닝을 완화하기 위해 알려진 다형성 부위를 피하기 위해서 프라이머(들)에서 바람직하다. 증폭 산물의 검출을 촉진시키기 위해, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 종래의 표지 방법을 사용하여 표지될 수 있다. 프라이머(들) 또는 프로브는 기술 분야에서 잘 이해되는 방법을 사용하여 여기에 기재된 NtTS 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 다형성은 본 분야에서 알려진 방법에 의해 식별될 수 있다.
또 다른 태양에서 돌연변이 식물을 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 기능적인 NtTS 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물들의 적어도 하나의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 다음으로, 식물의 적어도 하나의 세포는 NtTS 유전자의 활성을 조절하는데 효과적인 조건 하에서 처리된다. 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포는는 대조식물의 것과 비교된 NtTS 폴리펩티드의 조절된 수치를 가지는 돌연변이 식물로 전이된다. 돌연변이 식물을 만드는 방법의 하나의 구현예에서, 처리 단계는 위에 기술됨으로써 및 효과적인 조건 하에서 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포를 수득하기 위해 화학적 돌연변이 유발원에 적어도 하나의 세포를 종속시키는 것을 포함한다. 이 방법의 또 다른 구현예에서, 처리 단계는 효과적인 조건 하에서 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포를 수득하기 위해서 방사원에 적어도 하나의 세포를 쓰는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은 적절 유전적 조작 또는 유전자 조작 (manipulation) 이외의 수단에 의해, 대조식물에 비해 유전자형이 개발된 돌연변이 식물을 포함한다.
특정한 구현예에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물 세포 또는 돌연변이 식물재료는 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물재료에서 자연적으로 발생한 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 원하는 특성을 부여할 수 있다. 돌연변이는 그곳에 원하는 특성을 도입하기 위해서 다른 식물, 식물 세포 또는 식물재료 (예를 들면, 돌연변이가 유래된 식물의 다른 유전적 배경을 가진 식물, 식물 세포 또는 식물재료)에 통합될 수 있다 (예를 들어, 유전자가 유입된). 따라서 예시의 방법으로서, 제1식물에서 자연적으로 발생한 돌연변이는 제2식물에 도입될 수 있다 - 제1식물과 다른 유전적 배경을 가진 제2식물과 같은. 그러므로 당업자는 조사할 수 있고, 그것의 게놈에서 원하는 형질을 도입하는 NtTS 유전자의 그 이상의 돌연변이 대립유전자를 자연적으로 운반하는 식물을 식별할 수 있다. 자연적으로 발생하는 돌연변이 대립유전자(들)은 육종, 역교배 및 계통, 재배품종 또는 NtTS 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 혼성체를 생산하기 위한 유전유리입을 포함하는 다양한 방법에 의해 제2식물에 전이될 수 있다. 원하는 특성을 나타내는 식물은 돌연변이 식물의 풀 밖에서 스크리닝될 수 있다. 적절하게는, 선택은 여기에 기재된 NtTS 뉴클레오티드 서열의 지식을 이용하여 수행된다. 결과적으로,유전적 특성은 대조군에 비해 유리 메티오닌의 증가 수준을 나타내는 유전적 특성의 스크리닝이 가능하다. 이러한 검출 방법은 여기에 논의된 바와 같이, 종래의 핵산 증폭 및/또는 혼성화 기법의 적용을 수반할 수 있다. 따라서, 추가적 태양은 다음의 단계를 포함하는 돌연변이 식물 식별하기 위한 방법에 관한 것이다: (a) 식물로부터 NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 대조식물의 NtTS 폴리뉴클레오티드에 비해 NtTS 폴리뉴클레오티드의 서열에서의 차이는 상기 식물은 NtTS 돌연변이 식물이라는 것을 나타내는, NtTS 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 결정하는 단계. 또 다른 태양에서 다음의 단계를 포함하는 대조식물에 비교되는 유리 메티오닌의 증가된 수치를 축적하는 돌연변이 식물을 식별하기 위한 방법이 제공된다: (a) 스크리닝되기 위해 식물로부터의 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 식물이 NtTS 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 구성할 지의 결정하는 단계; 및 (c) 상기 샘플이 대조식물과 비교하여 코딩된 단백질의 발현 또는 활성도를 조절하는 NtTS 폴리뉴클레오티드에서 그 이상의 돌연변이 및 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성도가 줄어들지 않은 대조식물과 비교하여 적어도 5%의 메티오닌 함량이 증가한 식물의 부분을 포함하는 곳에, 유리 메티오닌의 증가된 수치를 축적하는 자연적으로 발생하는 돌연변이 식물을 나타내는 경우, 상기 식물의 메티오닌 함량을 결정; 또 다른 태양은 다음의 단계를 구성하는 대조식물에 비해 유리 메티오닌의 증가된 수치를 축적하는 돌연변이 식물의 제조 방법이 제시된다: (a) 제1식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플은 그곳에서 유리 메티오닌의 증가된 수치의 축적을 야기한 NtTS 폴리뉴클레오티드에서 그 이상의 돌연변이를 구성할 지의 결정하는 단계; 그리고 (c) 하나 이상의 돌연변이는 제2식물로 전달하는 단계를포함한다. 유전 공학, 유전적 조작, 유전자 유입, 식물 육종, 역교배 등과 같은 본 분야에서 알려진 다양한 방법을 이용하여 제2식물에 전이될 수 있는 돌연변이. 하나의 구현예에서, 제1식물은 자연적으로 발생하는 식물이다. 하나의 구현예에서, 제2식물은 제1식물에 다른 유전적 배경을 갖는다. 다음의 단계를 포함하는 대조식물에 비해 유리 메티오닌의 증가된 수치를 축적하는 돌연변이 식물의 준비 방법이 제공된다. (a) 제1식물로부터 샘플을 제공하는 단계. (b) 상기 샘플이 여기서 유리 메티오닌의 증가된 수치의 축적을 야기하는 NtTS 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 구성할지의 결정하는 단계; 및 (c) 제2식물에 제1식물로부터 하나 이상의 돌연변이를 유전자 유입하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전자 유입의 단계는 식물 육종, 선택적으로 역교배하는 것 등을 포함하는 것을 구성한다. 하나의 구현예에서, 제1식물은 자연적으로 발생하는 식물이다. 하나의 구현예에서, 제2식물은 제1식물과 다른 유전적 배경을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제1식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이 아니다. 하나의 구현예에서, 제2식물은 재배품종 또는 엘리트 재배품종이다. 추가적 태양은 여기에 기술된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻어질 수 있는 돌연변이 식물 (재배품종 또는 엘리트 재배품종 돌연변이 식물을 포함하는 것)에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 돌연변이 식물은 식물의 특정 영역에 지역화된 그 이상의 돌연변이를 가질 수 있다 - NtTS 폴리뉴클레오티드의 서열 내와 같은. 본 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 나머지 게놈 서열은 동일하거나 또는 이전에 돌연변이 식물과 실질적으로 동일할 것이다.
특정한 구현예에서, 돌연변이 식물은 식물의 하나 이상의 영역에서 국소화된 그 이상의 돌연변이를 가질 수 있다 - NtTS 폴리뉴클레오티드의 서열 내 및 게놈 에서 그 이상의 추가적 영역들에서처럼. 본 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 나머지 게놈 서열은 동일하지 않거나 또는 이전에 돌연변이가 발생된 식물과 상당히 동일하지 않을 것이다. 특정한 구현예에서, 돌연변이 식물은 NtTS 폴리뉴클레오티드의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 엑손에서 그 이상의 돌연변이를 가지지 않았을 것이다; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 인트론에서 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 프로모터에서 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 3' 비번역된 영역에서 그 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 5' 비번역된 영역에서 그 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 인코딩 영역에서 그 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 비인코딩 영역에서 그 이상의 돌연변이를 갖지 않았을 것이고; 또는 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 어떠한 조합; 또는 그곳에서 여섯 이상.
하나의 구현예에서, 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 1-46에 인접한 뉴클레오티드; SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 1-52; SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 99-141; SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 102-144; SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 102-153; SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 1325-1362; 또는 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 1334-1371은 발현을 조절하기 위해서 사용된다.
또 다른 구현예에서, 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 이상의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 454-805 또는 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 463-814에 인접한 뉴클레오티드; SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 1-52은 발현을 조절하기 위해서 사용된다. 추가적 태양에서 NtTS을 인코딩하는 유전자에서 돌연변이를 포함하는 식물, 식물세포 또는 식물재료를 식별하는 방법이 제공된다. (a) 돌연변이 유발에 식물, 식물 세포 또는 식물재료를 다루는 단계; (b) 상기 식물, 식물 세포 또는 식물재료로부터 핵산 샘플 또는 그것의 후손을 획득하는 단계; (c) NtTS 또는 변이체 또는 언급한 서열의 차이는 그곳에 그 이상의 돌연변이를 나타내는 곳의 단편을 인코딩하는 유전자의 핵산 서열의 결정하는 단계를 포함한다.
아연 집게 단백질은 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, NtTS 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열을 일부 또는 모두를 포함하는 게놈 DNA 서열은 아연 집게 뉴클레아제-매개 돌연변이 유발에 의해 개변된다. 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 특이적 부위를 위해 조사된다. 선택적으로, 게놈 DNA 서열은 아연 집게 단백질 결합을 위한 두 특이적 부위를 위해 조사되며, 그곳의 두 부위는 반대 가닥에 있고, 서로 가까이에 있다, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기쌍 분리이다. 따라서, NtTS 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 집게 단백질이 제공된다.
아연 집게 단백질은 NtTS 유전자에서 선택된 표적 부위를 인식하도록 조작될 수 있다. 아연 집게 단백질은 절단 또는 확장에 의한 자연적 아연 집게 DNA-결합 도메인 및 비-자연적 아연 집게 DNA-결합 도메인으로부터 유래된 모티프 또는 파지 디스플레이 선택, 박테리아의 2 혼성체 선택 또는 박테리아 1 혼성체 선택과 같은 선택 방법에 연관되었지만, 제한되지는 않은 부위 특이적 변이의 과정의 어떠한 조합을 구성할 수 있다. 용어 "비 자연적 아연 집게 DNA-결합 도메인"은 표적 DNA 안에 세 염기쌍 서열을 결합하고, 조절될 수 있는 DNA를 구성하는 세포나 유기체 안에서 발생되지 않은 아연 집게 DNA-결합 도메인을 지칭한다. 표적 유전자에 특이적인 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 아연 집게 단백질의 설계 방법은 본 분야에서 알려져 있다.
아연 집게 뉴클레아제는 NtTS 폴리뉴클레오티드에 결합한 아연 집게 단백질을 코딩하는 첫번째 폴리뉴클레오티드, 및 엔도뉴클레아제 IIS형과 같지만 제한되지 않는 비 특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드의 결합을 만듬으로써 구성될 수 있다. 아연 집게 단백질과 뉴클레아제 사이의 융합 단백질은 두 염기쌍을 포함하는 스페이서를 포함할 수 있고, 또는 선택적으로, 스페이서는 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 이상의 염기쌍을 구성할 수 있다. 다양한 구현예에서, 아연 집게 뉴클레아제는 조절 영역, 코딩 영역 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 게놈 DNA 서열의 비 코딩 영역에서 발생한 이중 가닥을 도입하고, NtTS 폴리뉴클레오티드 발현 수준의 감소 또는 그곳에서 코딩된 단백질 활성도의 감소를 이끈다. 아연 집게 뉴클레아제에 의한 절단은 비 상동 말단 연결에 의해 다음 DNA 리페어를 이끄는 분열 부위에서 DNA 결실이 종종 일어난다.
다른 구현예에서는, 아연 집게 단백질은 NtTS 폴리뉴클레오티드의 조절 서열에 결합하기 위해 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 조절 서열은 전사 개시 부위, 개시 코돈, 엑손 영역 ,엑손-인트론의 경계, 종결 인자, 또는 종결 코돈을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 NtTS 유전자 부근 또는 이내에서 아연 집게 뉴클레아제-매개 변이에 의해 생산된 식물 세포, 및 아연 집게 뉴클레아제-매개 변이에 의한 식물 또는 식물 세포에 의해 만들어지는 방법을 제공한다. 식물에 아연 집게 단백질과 아연 집게 뉴클레아제를 전달하는 방법은 메가뉴클레아제의 전달을 위해 아래에 설명된 것과 유사하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 또는 그렇지 않으면 메가뉴클레아제를 사용하는 유전적으로-개변된 식물 - L- Crel과 같은 - 을 위한 방법을 추가로 제공한다. 재조합 메가뉴클레아제뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제는 NtTS 유전자의 파괴를 허용할 식물의 게놈 DNA에서 단일 부위 또는 비교적 적은 부위에서 이중 가닥 절단을 특정하게 유발하기 위해 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변경된 DNA 인식 특성을 가진 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제 단백질은 본 분야에서 알려진 다양한 다른 메커니즘에 의해 식물 세포에 전달될 수 있다.
발명은 식물 세포 또는 식물에 NtTS 폴리뉴클레오티드를 불활성화하는 메가뉴클레아제의 사용을 포함한다. 특히, 발명은 메가뉴클레아제를 이용하는 식물에서 NtTS 폴리뉴클레오티드를 불활성화하는 방법을 제공하고: (a) NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계; (b) 메가뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제를 상기 식물 세포에 코딩하는 구조를 도입하는 단계; (c) NtTS 폴리뉴클레오티드를 상당히 불활성화하기 위한 메가뉴클레아제의 허용하는 단계를 포함한다.
메가뉴클레아제는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역 내의 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 절단은 비-상동성 말단 연결에 의한 돌연변이 유발 DNA의 리페어 이후에 메가뉴클레아제 인식 부위에서 DNA의 결실이 발생한다. 유전자 코딩 서열에서 이러한 돌연변이는 통상적으로 유전자를 불활성화하기에 충분하다. 식물 세포를 조절하는 이 방법은 먼저, 적절한 형질전환 방법을 사용하여 식물 세포에 메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달을 포함한다. 높은 효율을 위해, 선택 마커에 메가뉴클레아제 발현 카세트를 연결하고, 선택 항원의 존재하에 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이 접근법은 게놈에 메가뉴클레아제 발현 카세트의 통합을 초래할 것이지만, 만약 식물이 규제 승인을 요구할 경우 바람직하지 않을 수 있다. 이러한 경우, 메가뉴클레아제 발현 카세트 (및 연결된 선택 마커 유전자) 종래의 육종 기술을 이용하는 후속 식물 세대로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 식물 세포는 선택 마커가 결여된 메가뉴클레아제 발현 카세트로 초기에 형질전환될 수 있으며, 선택 항원이 결여된 배지에서 성장될 수 있다. 이러한 조건 하에서 처리된 세포의 분획은 메가뉴클레아제 발현 카세트를 취득하고, 게놈에서 메가뉴클레아제 발현 카세트를 통합하지 않고 일시적으로 조작된 메가뉴클레아제를 표현할 것이다. 변환 효율을 고려하지 않기 때문에, 후자의 변환 절차는 매우 많이 처리된 세포가 원하는 게놈 변형을 얻기 위해서 검출되는 것을 요구한다. 상기 방법은 또한 아연 집게 단백질 또는 아연 집게 뉴클레아제 이용시 식물 세포를 조절하기 위해 적용될 수 있다. 메가뉴클레아제의 발현 카세트와 식물 세포가 제공된 후, 그것이 사용된 특정 변환 절차에 대한 일반적인 조건에서 처음 재배된다. 이것은 종종 어둠 속에서, 26℃ 이하의 온도의 배지에서 성장 형질전환된 세포가 자라는 것을 의미한다. 이러한 표준 조건은 바람직하게 1-4일의 기간동안 형질전환 과정에서 회복하기 위해서 식물 세포를 허용하는 것이 사용될 수 있다. 이 초기 회복 기간 뒤에 어떤 시점에서, 성장 온도는 메가뉴클레아제 인식 부위를 절단하고 돌연변이 조작된 메가뉴클레아제의 활성을 자극하기 위하여 발생될 수 있다.
특정한 적용을 위해서, 식물의 게놈으로부터 NtTS 폴리뉴클레오티드를 정확하게 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 응용은 각각에 의도된 결실의 한쪽에 있는 메가뉴클레아제 인식 부위를 쪼개는 조작된 메가뉴클레아제의 쌍에 사용 가능하다.
발명에 따른 유전자 개변에 사용하기 위해 적합한 식물은 다음 패밀리 중 하나로부터의 종을 포함하는 단자엽과 쌍자엽 식물 및 식물 세포계를 포함한다: 쥐꼬리망초과, 부추과, 알스트로에메리아과, 수선화과, 협죽도과, 야자과, 국화과, 매자나무과, 빅사과, 십자화과, 파인애플과, 삼과, 석죽과, 개비자나무과, 명아주과, 콜치카세아과, 박과, 마과, 마황과, 코카나무과, 대극과, 콩과, 꿀풀과, 아마과, 석송과, 아욱과, 멜란디움과, 파초과, 도금양과, 니사과, 양귀비과, 소나무과, 질경이과, 벼과, 장미과, 꼭두서니과, 버드나무과, 무환자나뭇과, 가지과, 주목과, 차나무과, 또는 포도과.
적당한 종은 아벨모슈스속, 전나무속, 단풍나무속, 겨이삭속, 아리움속, 알스트로메리아속, 아나나스속, 안드로그라피스속, 바랭이새속, 쑥속, 왕갈대속, 아트로파속, 매자나무속, 베타속, 빅사속 , 배추속, 금잔화속, 동백나무속, 캄프토테카속, 삼속, 고추속, 잇꽃속, 카란타투스속, 개비자나무속, 국화속, 킹코나속, 수박속, 코페아속, 콜키쿰속, 콜레우스속, 오이속, 호박속, 우산잔디속, 독말풀속, 패랭이꽃속, 디기탈리스속, 마속, 엘라에이스속, 마황속, 에리안투스속, 코카나무속, 유칼립투스속, 김의털속, 딸기속, 갈란투스속, 콩속, 목화속, 해바라기속, 헤베아속, 보리속, 사리풀속, 자트로파속, 왕고들빼기속, 아마속, 호밀풀속, 루피너스속, 리코페르시콘속, 석송속, 마니호트속, 개자리속, 멘타속, 억새속, 파초속, 니코티아나속, 벼속, 기장속, 양귀비속, 돼지풀아재비속, 수크령속, 페튜니아속, 갈풀속, 산조아재비속, 소나무속, 포아풀속, 포인세티아속, 사시나무속, 라우월피아속, 아주까리 속, 장미속, 개사탕수수속, 버드나무속, 산귀나리아속, 미치광이풀속, 호밀속, 가지속, 수수속, 스파르티나속, 시금치속, 쑥국화속, 주목속, 테오브로마속, 라이밀속, 밀속, 우니올라속, 여로속, 빈카속, 포도속 및 옥수수속의 구성원을 포함할 수 있다.
적당한 종은 기장 종, 수수 종, 억새 종, 사카룸 종, 에리안투스 종, 포플라 종, 안드로포곤 제라르디 (큰 나도기름새), 페니세툼 퍼푸레움 (코끼리부들), 갈풀 (리이드케너리그라스), 우산잔디 (버뮤다 그래스), 페스투카 아룬디나세아 (톨페스큐), 스파르티나 펙티나타 (프레리 콜드그라스), 메디카고 사티바 (자주개자리), 아룬도 도낙스 (물대), 사초용 호밀 (호밀), 버드나무 종 (버드나무), 유칼립투스 종 (유칼립투스), 라이밀 (밀속- 밀 X 호밀), 대나무, 헤리안서스 안누스 (해바라기), 잇꽃 (홍화), 자트로파 커카스 (자트로파), 아주까리 (피마자), 기름야자 (야자나무), 리늄 우시타티시엄 (아마), 브라씨카 준세아, 베타 불가리스 (사탕무), 마니호트 에스쿠렌타 (카사바), 리코페르시콘 에스클렌탐 (토마토), 락투카 사티바 (상추), 무사 파라디시아카 (바나나), 솔라눔 투베로 숨 (감자), 브라시카 올레라케아 (브로콜리, 꽃양배추, 방울다다기양배추), 카멜리아 시넨시스 (차), 프라가리아 아나나사 (딸기), 테오브로마 카카오 (코코아), 커피 아라비카 (커피), 비티스 비니페라 (포도), 아나나스 코모수스 (파인애플), 오색 고추 (맵고 달콤한 고추), 알리움 세파 (양파), 참외 (메론), 쿠쿠미스 사티부스 (오이), 서양계 호박 (스쿼시), 동양계 호박 (스쿼시), 스피나케에 올레라케에 (시금치), 시트룰러스 라나투스 (수박), 아벨모스쿠스 에스쿨렌투스 (오크라), 솔라눔 멜롱게나 (가지), 로사 종 (장미), 디안투스 카리오필루스 (카네이션), 피튜니아 종 (피튜니아), 포인세치아 풀체리마 (포인세티아), 루피너스 알버스 (루핀), 우니올라 파니쿨라타 (귀리) , 벤트그래스 (겨이삭), 포퓰러스 트레물로이데스 (사시나무), 소나무 종 (소나무), 전나무 종 (전나무), 단풍나무 종 (단풍 나무), 호르데움 불가레 (보리) , 포아 푸라텐시스 (블루그래스), 롤리움 종 (라이그라스) 및 큰조아재비 (티모시) , 큰개기장 (스위치 그래스), 사탕수수 (수수, 수단그라스), 미스캔써스 기간테우스 (억새), 사카룸 종 (에너지케인), 발삼포플러 (포플러), 제아 메이스 (옥수수) , 글리신 맥스 (대두), 브라시카 내퓨스 (카놀라), 트리티쿰 에스티붐 (밀), 고시피움 힐수툼 (면), 오리자 사티바 (벼), 헬리안투스 아뉴스 (해바라기), 메디카고 사티바 (알팔파), 베타 불가리스 (사탕무), 또는 펜니세툼 글라우쿰 (펄 밀렛)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예는 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 그곳에서 NtTS의 발현 수준은 대조식물과 비교하여 이익이 되는 식물 조직 내에서 감소되는 담배 식물과 같은 식물을 생산하는 NtTS 유전자 발현 수준을 줄이기 위해 변형된 형질전환 식물에 관한 것이다. 개시된 조성물 및 방법은 니코티아나.루스티카 담배 (N. rustica) 및 니코티아나.타바쿰 (N. tabacum) (예를 들어, LA B21, LNKY171, TI 1406, 바스마 (Basma), 갈파오 (Galpao), 페리큐 (Perique), 베인하트 (Beinhart) 1000-1 및 페티코 (Petico))를 포함하는 니코티아나(Nicotiana) 속의 어떠한 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 니코티아나.아카울리스 (N. acaulis), 니코티아나.아쿠미나타 (N. acuminata), 니코티아나.아쿠미나타 멀티플로라(N. acuminata var. multiflora), 니코티아나.아프리카나 (N. africana), 니코티아나.아라타 (N. alata), 니코티아나.암플렉시카울리스 (N. amplexicaulis), 니코티아나.아렌트시 (N. arentsii), 니코티아나.아테누아타 (N. attenuata), 니코티아나.베나비데시 (N. benavidesii), 니코티아나.벤타미아나 (N. benthamiana), 니코티아나.비젤로비 (N. bigelovii), 니코티아나.보나리엔시스(N. bonariensis), 니코티아나.카비콜라 (N. cavicola), 니코티아나.클수준란디 (N. clevelandii), 니코티아나.코르디폴리아 (N. cordifolia), 니코티아나.코림보사 (N. corymbosa), 니코티아나.데브네이 (N. debneyi), 니코티아나.엑셀시어 (N. excelsior), 니코티아나.폴게티아나 (N. forgetiana), 니코티아나.프라그란스 (N. fragrans), 니코티아나.글라우카 (N. glauca), 니코티아나.글루티노사 (N. glutinosa), 니코티아나.굿스피디 (N. goodspeedii), 니코티아나.고세이 (N. gossei), 니코티아나.하이브리드 (N. hybrid), 니코티아나.인굴바 (N. ingulba), 니코티아나.카와카미 (N. kawakamii), 니코티아나.나이티아나 (N. knightiana), 니코티아나.랑스도르피 (N. langsdorffii), 니코티아나.니코티아나.리네아리스 (N. linearis), 니코티아나.롱기후로라 (N. longiflora), 니코티아나.마리티마 (N. maritima), 니코티아나.메가로시폰 (N. megalosiphon), 니코티아나.미엘시 (N. miersii), 니코티아나.녹티플로라 (N. noctiflora), 니코티아나.누디카울리스 (N. nudicaulis), 니코티아나.옵투시폴리아 (N. obtusifolia), 니코티아나.옥시덴탈리스 (N. occidentalis), 니코티아나.옥시덴탈리스 아종 헤스페리스 (N. occidentalis subsp. hesperis), 니코티아나.오토포라 (N. otophora), 니코티아나.파니쿠라타 (N. paniculata), 니코티아나.파우시플로라 (N. pauciflora), 니코티아나.페투니오이데스 (N. petunioides), 니코티아나.플룸바지니포리아 (N. plumbaginifolia), 니코티아나.쿠아드리발비스 (N. quadrivalvis), 니코티아나.라이몬디 (N. raimondii), 니코티아나.레판다 (N. repanda), 니코티아나.로술라타 (N. rosulata), 니코티아나.로술라타 아종 인굴바 (N. rosulata subsp. ingulba), 니코티아나.로툰디포리아 (N. rotundifolia), (N. setchellii), 니코티아나.시물란스 (N. simulans), 니코티아나.소라니포리아 (N. solanifolia), 니코티아나.스페가지니이 (N. spegazzinii), 니코티아나.스톡토니 (N. stocktonii), 니코티아나.스와베오렌스 (N. suaveolens), 니코티아나.실베스트리스 (N. sylvestris), 니코티아나.티르시프로라 (N. thyrsiflora), 니코티아나.토멘토사 (N. tomentosa), 니코티아나.토멘토시포르미스 (N. tomentosiformis), 니코티아나.트리고노필라 (N. trigonophylla), 니코티아나.엄브라티카 (N. umbratica), 니코티아나.운둘라타 (N. undulata), 니코티아나.벨루티나 (N. velutina), 니코티아나.위간디오이데스 (N. wigandioides) 및 니코티아나.산데레 (N. x sanderae)를 포함한다.
비자연적으로 발생하는 형질전환 또는 돌연변이 식물은 그러므로 담배변종 또는 하나 이상의 이식유전자, 또는 그곳에서 하나 이상의 유전적 돌연변이 또는 조합을 구성하는 엘리트 담배 재배품종일 수 있다. 유전적 돌연변이(들) (예를 들어, 하나 이상의 다형성)는 각각의 담배변종 또는 담배 재배품종에서 자연적으로 존재하지 않는 돌연변이 일 수 있고, 또는 자연적으로 발생하는 유전적 돌연변이에 각각의 담배변종 또는 담배 재배품종 (예를 들어, 우량종의 담배 재배품종)에서 자연적으로 발생하지 않는 돌연변이가 제공될 수 있다. 특히 유용한 니코티아나 담배변종은 버얼리종, 어두운 형, 황색종, 및 오리엔탈 종을 포함한다. 변종 또는 재배품종의 비제한적인 예는 다음과 같다: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, 코커(Coker) 176, 코커 319, 코커 371 골드(Gold), 코커 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao 담배, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, 혼성체 403LC, 혼성체 404LC, 혼성체 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, 리틀 크리텐던 (Little Crittenden), 맥 네어(McNair) 373, 맥 네어 944, msKY 14xL8, 좁은 잎 마도레 (Narrow Leaf Madole), 좁은 잎 마도레 LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC 7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, 닐 스미스 마도레 (Neal Smith Madole), 옥스포드(OXFORD) 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, '페리크 (Perique)' 담배, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, 스페이트(Speight) 168, 스페이트 172, 스페이트 179, 스페이트(Speight) 210, 스페이트 220, 스페이트 225, 스페이트 227, 스페이트 234, 스페이트 G-28, 스페이트 G-70, 스페이트 H-6, 스페이트 H20, 스페이트 NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950 , TR (톰로슨(Tom Rosson)) 마도레(Madole), VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, 크산티(미첼-모르) (Xanthi(Mitchell-Mor)), Bel-W3, 79-615, 삼순 홈즈(Samsun Holmes) NN, KTRDC 2번 혼성체 49, 버얼리 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, P03, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, 뱅켓(BANKET) A1, 바스마 드라마(Basma Drama) B84/31, 바스마 I 지크나 (Basma I Zichna) ZP4/B, 바스마 크산티(Basma Xanthi) BX 2A, 바텍 (Batek), 베수키 젬버 (Besuki Jember), C104, 코커(Coker) 347, 크리올료 미시오네로 (Criollo Misionero), 델크레스트 (Delcrest), 제벨 (Djebel) 81, DVH 405 갈파오 코뭉(Galpao Comum), HB04P, 힉스 브로드리프(Hicks Broadleaf), 카바쿠락 에라쏘나 (Kabakulak Elassona), 쿠트사제 (Kutsage) E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110 레드 러시안(Red Russian), 삼순(Samsun), 사프락 (Saplak), 심마바 (Simmaba), 탈가르 (Talgar) 28, 위스리카 (wislica), 야얄다그 (Yayaldag), 프리레프 (Prilep) HC -72, 프리레프 P23, 프리레프 PB 156/1, 프리레프 P12-2/1, 야카(Yaka) JK-48, 야카 JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, 바스마(Basma), TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, 바스마 크산티(Basma Xanthi), GR149, GR153, 페팃 하바나 (Petit Havana). 여기에서 구체적으로 확인되지 않더라도, 위의 낮은 변환 아변종들은 또한 고려된다.
구현예들은 또한 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물 또는 대조군과 비교하여 식물의 그 이상의 부분(예: 잎)에서 유리 메티오닌 농도의 상승을 초래하는 트레오닌 합성효소 발현 또는 활성을 감소시키기 위하여 변형된 형질전환 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 또는 수득 되는 형질전환 식물은 식물을 대조군과 전체적인 외관이 유사 또는 실질적으로 동일하다. 성숙도, 식물당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입 각도, 잎 크기(폭 및 길이), 절간 거리,잎몸-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성은 현지 관찰에 의해 평가될 수 있다.
하나의 태양은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 발명의형질전환 식물의 종자이다. 바람직하게는, 종자는 담배 종자이다. 발명의 또 다른 태양은 꽃가루 또는 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물,발명의 형질전환 식물의 밑씨이다. 또한, 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 웅성불임성을 부여하는 핵산을 포함하는 바와 같은 형질전환 식물이 제공된다.
발명은 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 혼성체 식물, 또는 형질전환 식물, 또는 모체의 모든 형태학적 및 생리학적 특성을 발현할 수 있는 배양 재생 식물 한 부분의 조직 배양을 제공한다. 발명의 재생 가능한 세포는 잎, 꽃가루, 배아, 떡잎, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃과 그 일부, 밑씨, 싹, 줄기, 줄기대, 중과피 및 포자낭 또는 캘러스 또는 그것으로부터 얻어진 원형질체를 포함하지만 한정되지는 않는다.
하나의 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 줄기 높이보다 적지 않다. 또 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물보다 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 높거나 또는 낮다. 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 염록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 같다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 엽록소 함량보다 적지 않다. 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물보다 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 높거나 또는 낮다. 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 같고, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 같다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이이 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 줄기 높이보다 낮지 않고, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량이 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 엽록소 함량보다 낮지 않다. 다른 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물보다 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 높거나 또는 낮고, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물보다 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 높거나 또는 낮다. 다른 구현예에서, 다음과 같은 특성 중 하나 또는 하나 이상: 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 잎의 성숙도, 식물당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입 각도, 잎 크기 (폭 및 길이), 절간 거리, 잎몸-주맥 비율 및 천연색은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 같다.
또 다른 구현예에서, 다음의 단게를 포함하는 식물 (예를 들어, 잎)의 적어도 일부에서의 유리 트레오닌 농도 증가를 위한 방법을 제공한다: (i) 바람직하게, 트레오닌 합성효소가 여기에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 여기에 설명된 폴리펩티드 서열을 구성하는 식물에서, 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성 감소하는 단계; (ⅱ) 돌연변이, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 단계(i)에서 수득된 유전자 변형 식물의 적어도 한 부분 (예: 잎)에서 유리 메티오닌의 농도를 측정하는 단계; 및 (iii) 돌연변이, 비자연적으로 발생하거나, 그 내부 유리 메티오닌의 농도가 대조식물에 비해 증가된 유전자 변형 식물을 식별. 적절하게는, 상기 돌연변이, 비 자연적 발생 또는 유전자 변형 식물의 전체 외관은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 같다. 적절하게는, 잎과 같은 식물의 부분에서 유리 트레오닌 농도는 대조식물에 비해 증가된다.
대조식물에 비해 트레오닌 합성효소의 발현 감소는, 전사 활성 및/또는 단백질 발현에서 감소를 포함하는 약 5%에서 약 100%, 약 5%에서 약 99% 또는 이하, 5%에서 약 95% 또는 이하, 약 5%에서 약 90% 또는 이하, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 것이다. 하나의 구현예에서, 트레오닌 합성효소의 발현 감소는, 전사 활성 및/또는 단백질 발현에서 감소를 포함하는 발현에서 부분적인 감소이다. 하나의 구현예에서, 발현의 부분적인 감소는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 트레오닌 합성효소의 잔류 수준을 유지하기 위한 식물 세포를 허용한다.
대조식물에 비해 트레오닌 합성효소의 활성 감소는, 약 5%에서 약 100%, 약 5%에서 약 99% 또는 이하, 5%에서 약 95% 또는 이하, 약 5%에서 약 90% 또는 이하, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 또는 그 이상의 감소일 것이다. 하나의 구현예에서, 트레오닌 합성효소의 활성 감소는, 활성에서 부분적인 감소이다. 하나의 구현예에서, 활성의 부분적인 감소는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 트레오닌 합성효소의 잔류 수준을 유지하기 위한 식물 세포를 허용한다.
대조식물에 비해 유리 트레오닌 농도에서의 증가는 약 5%에서 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100% 까지일 것이다.
특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성은 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성은 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 20의 발현 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3 또는 그에 인코딩되는 단백질의 활성이 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 특정한 구현예에서, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 3, 또는 그에 인코딩되는 각각, 개별적으로 또는 결합시의 단백질 활성이 SEQ ID NO: 20의 발현보다 크게 감소된다 (예를 들어, 사일런싱 또는 억제된). 하나의 구현예에서, 아미노산과 같은 외인성 성분의 첨가 - 예를 들어, 트레오닌 및/또는 이소루신 - 은 적당한 시각적 외형의 식물을 얻기 위해 요구되지 않는다.
한 개체가 돌연변이 식물, 형질전환 식물 또는 실질적으로 동일한 시각적 외관 및 대조식물에 비해 그 이상의 농업적 특성을 유지하면서 유리 메티오닌의 증가된 수치를 나타내는 비자연적으로 발생하는 식물을 제공하기 위해서이다. 따라서, 돌연변이 식물, 형질전환 식물 또는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 담배 세포 또는 대조식물의 조절과 비교하여, 유리 메티오닌의 증가된 수치 및 감소된 트레오닌 합성효소 활성 또는 발현을 가지는 유전적으로 조절된 세포가 여기에서 설명된다. 돌연변이, 형질전환 또는 비자연적으로 발생하는 식물 또는 세포는, 바람직하게 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되거나 또는 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 20에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100% 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하고, 구성하고, 필수적으로 구성하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된, 여기에 기재된 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현을 감소시킴으로써 트레오닌 합성효소의 합성을 감소시키기 위해 조절된다.
추가적 태양에서, 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 트레오닌 합성효소의 발현 또는 그곳에서 코딩된 단백질의 활성 및 식물(예를 들어,잎)의 부분이, 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 줄어들지 않은 대조군과 비교하여 적어도 5%의 메티오닌 함량이 증가하는 형질전환 식물과 관련한다. 바람직하게, 담배 물품의 연기 또는 에어로졸에서의 메티오날 농도는 대조식물로부터 만들어진 담배 물품의 연기나 에어로졸에 비교하여 적어도 5 %만큼 증가된다.
대조식물과 비교하여 메티오닌 함량의 증가는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 또는 그 이상일 것이다.
대조식물에 비해 담배 물품으로부터 생성된 연기 또는 에어로졸에서의 메티오날 농도의 증가는 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 또는 그 이상일 것이다.
적절하게는, 상기 식물의 시각적 외관 또는 하나 이상의 재배적 특징은 실질적으로 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 동일하고, 바람직하게는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 엽록소 함량과 동일하며, 및/또는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 엽록소 함량과 동일하다.
적절하게는, 식물(예를 들면, 잎)의 일부에서 유리 메티오닌 농도는 대조식물과 비교하여 증가된다.
적절하게는, (ⅰ) 식물(예를 들면, 잎)의 일부에 유리 메티오닌 농도는 적어도 약 0.026㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.027㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.028㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.029㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.03㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.031㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.032㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.032㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.033㎎/g, 적합하게는 적어도 약 0.034㎎/g 이고; (ii) 일부 식물의 유리 트레오닌 농도 (예를 들면, 잎)는 약 0.5㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.52㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.54㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.56㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.58㎎/g, 적절하게 적어도 약 0.6㎎/g이고; 및 (ⅲ) 식물(예를 들면, 잎)의 가열부에 따른 에어로졸의 메티오날 농도는 약 2000㎍/g, 적절하게 적어도 약 2100㎍/g, 적절하게 적어도 약 2200㎍/g, 적절하게 적어도 약 2500㎍/g, 적절하게 적어도 약 2750㎍/g, 적절하게 적어도 약 3000㎍/g, 적절하게 적어도 약 3250㎍/g, 적절하게 적어도 약 3500㎍/g, 적절하게 적어도 약 3750㎍/g, 적합하게 적어도 약 3,800㎍/g 또는 이상이다.
적절하게는, (ⅰ) 식물의 일부(예를 들어,잎)에 유리 메티오닌 농도는 적어도 약 0.03㎎/g이고; (ⅱ) 식물(예를 들어,잎)의 일부에 유리 트레오닌 농도는 0.5㎎/g~ 0.65㎎/g 사이이고; 및 (ⅲ) 식물(예를 들어, 잎)의 가열부에 따른 에어로졸의 메티오날 농도는 적어도 약 2200㎍/g 이다.
적절하게는, (ⅰ) 식물의 일부(예를 들어,잎)에 유리 메티오닌 농도는 적어도 약 0.03㎎/g; (ⅱ) 식물(예를 들어,잎)의 일부에 유리 트레오닌 농도는 0.5㎎/g~ 0.65㎎/g 사이이고; 및 (ⅲ) 식물(예를 들어, 잎)의 가열부에 따른 에어로졸의 메티오날 농도는 약 2200㎍/g에서 약 4000㎍/g, 적절하게는, 약 2200㎍/g에서 약 3850㎍/g이다.
식물은 에어로졸을 방출하기 위해서 적어도 125℃, 적어도 150℃, 적어도 175℃ 또는 적어도 200℃와 같은 100℃ 또는 그 이상으로 가열될 수 있다.
또 다른 태양에서, 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 또는 트레오닌 합성효소의 발현 또는 그에 코드된 단백질의 활성이 줄어든 형질전환 식물을 제공하고, (ⅰ) 일부 식물(예를 들면, 잎)에서 유리 메티오닌 농도는 약 0.03㎎/g이다; (ⅱ) 일부 식물(예를 들면, 잎)에서 유리 메티오닌 농도는 약 0.5에서 약 0.7㎎/g이다; (ⅲ) 식물(예를 들면, 잎)의 가열부에 따라 에어로졸의 메티오날 농도는 적어도 약 2000㎍/g이고, 적절하게 외관 또는 하나 또는 그 이상인 상기 식물의 작물학적 특성은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 줄기 높이과 상당히 동일하고, 바람직하게, 여기서 돌연변이 식물, 비 자연적 발생 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 상당히 동일하고 및/또는 돌연변이 식물, 비 자연적 발생 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물의 엽록소 함량과 상당히 동일하다.
발명에 따라, 조절된 트레오닌 합성효소 대립유전자를 운반하는 식물은 유용한 계통, 품종과 혼성체을 생성하는 식물 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 개변된 대립유전자는 돌연변이 대립유전자일 수 있다. 특히, 조절된 트레오닌 합성효소 대립유전자는 앞에 설명된 것과 같이 상업적으로 중요한 품종에 유전자가 유입된다. 따라서, 육종 식물에 대한 방법은 교배하는 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 다른 유전적 상동성을 포함하는 식물로 여기에 설명된 형질전환 식 구성된 것이 제공된다. 이 방법은 다른 식물에 교배하는 후손 식물, 및 선택적으로 바람직한 유전 형질 또는 유전적 배경을 가진 후손 식물이 얻어질 때까지의 반복 교배로 구성될 수 있다. 이러한 육종법이 제공된 목적은 바람직한 유전형질을 다른 품종, 육종계통, 혼성체 또는 재배품종, 특히 상업적인 이익이 있는 것에 도입하기 위해서이다. 또 다른 목적은 단일 식물변종, 계통, 혼성체 또는 재배품종에서 다른 유전자의 많은 유전적 변형을 용이하게 하는 것이다. 종간뿐만 아니라 종내 교배가 고려된다. 이러한 교배에서 발생하고 육종 계통과 관련된 후손 식물은 발명의 비자연적으로 발생하는 식물의 예이다.
하나의 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되고: (a) 후손 담배 종자를 얻기 위해서, 돌연변이, 형질전환 식물을 수득제 식물에 교배하는 단계; (b) 비자연적으로 발생하는 식물을 얻기 위해서 식물 성장 조건 하에 후손 담배 종자를 성장하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가로 포함한다: (c) 후손 담배 종자를 얻기 위해서, 비자연적으로 발생하는 식물의 이전 세대와 자체 또는 다른 식물을 교배; (d) 추가적으로, 비자연적으로 발생하는 식물을 얻기 위해서 식물 성장 조건 하에서 단계 (c)의 후손 담배 종자를 성장하는 단계; 및 (e) 비자연적으로 발생하는 식물의 추가적인 세대를 발생시키기 위해서 및 (c) 및 (d)의 교배 및 성장 단계를 여러번 반복. 상기 방법은 (a)단계 이전에, 특징지어지고, 그 돌연변이 또는 유전자 변형 식물과 동일하지 않은 유전적 상동성을 구성하는 모체식물을 제공하는 단계를 선택적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 발생하는 식물의 세대를 생성하기 위해, 육종 프로그램에 따라, 교배 및 성장 단계는 0에서 2번, 0에서 3번, 0에서 4번, 0에서 5번, 0에서 6번, 0에서 7번, 0에서 8번, 0에서 9번 또는 0에서 10번 반복된다. 역교배는 이러한 방법의 예이다. 여기서 후손이 모체 중 한 모체 유전적으로 비슷한 다른 식물, 모체 중 하나의 것에 가까운 유전적 상동성을 가지는 다음 세대의 후손 식물을 얻기 위해, 후손은 그들의 모체 또는 그들의 모체와 유전적으로 유사한 다른 식물의 하나에 교배된다. 식물 육종을 위한 기술, 특히 담배 식물 육종에 대한 기술은 잘 알려져 있고, 이 발명의 방법으로 사용될 수 있다. 발명은 또한 이러한 방법으로 생산된 비자연적으로 발생하는 식물을 제공한다.
여기에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 변이체 트레오닌 합성효소 유전자 검출을 위한 육종 및 스크리닝으로부터 얻어진 계통은 표준 필드 절차를 사용하여 필드에서 평가된다. 원래 돌연변이가 일어나지 않은 모체를 포함한 대조 유전자형이 포함되고, 개체는 완전 임의 배치법 또는 다른 적절한 필드 디자인 분야에 배치되어 있다. 담배의 경우, 표준 재배법은 예를 들어, 담배가 수확되고, 무게 달아지고, 및 화학적, 및 숙성 전이나 그 동안에 다른 일반적인 검사가 시도되는 경우에 사용된다. 데이터의 통계 분석은 모체의 계통과 선택된 계통과의 유사성을 확인하기 위해 수행된다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석은 선택적으로 염색체 보완 및 염색체 쌍의 관계를 확인하기 위해 수행된다.
DNA 지문, 단일 뉴클레오티드 다형성, 마이크로새틀라이트 마커, 또는 유사한 기술은, 여기에서 설명한 바와 같이, 트레오닌 합성효소 유전자의 조절된 또는 돌연변이 대립유전자를 다른 담배에 전이시키거나 또는 육종시키기 위한 마커-보조 선택 의존선발(MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 농경법적으로 바람직한 유전자형을 가진 돌연변이 대립유전자를 함유하는 유전자형의 교배에서 분리한 개체군을 만들 수 있다. F2 또는 역교배 세대의 식물은 여기에 나열된 기술 중 하나를 사용하여, 트레오닌 합성효소 게놈 서열 또는 이들의 단편으로부터 개발된 마커를 사용하여 검사될 수 있다. 돌연변이 대립유전자를 가진 것으로 확인되는 식물은 역교배된 또는 검출되기 위한 두 번째 개체군을 만들기 위해서 자가수분 될 수 있다. 예상 양식 또는 사용된 MAS 기술에 따라, 원하는 개별적인 식물의 식별을 돕기 위해서 역교배의 각 순환 전에, 선택된 식물을 자가수분해야 할 필요가 있다. 역교배 또는 다른 육종 과정은 반복친의 원하는 표현형이 나올 때까지 반복될 수 있다.
발명에 따르면, 육종 프로그램에서 성공적인 교배는 F1 식물을 얻을 수 있다. 선택된 F1 식물은 그 모체 중 하나와 교배될 수 있고, 제1 역교배 세대 식물은 변이체 트레오닌 합성효소 유전자 발현(예를 들면, 트레오닌 합성효소 유전자의 무의미한 형태)을 위해 다시 검출된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분된다. 역교배, 자가수분, 및 스크리닝의 과정은 최종 검출이 생식력 있고, 반복친과 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4회 반복된다. 바람직하다면, 이 식물이 자가수분되고, 이후 후손이 변종 트레오닌 합성효소 유전자 발현을 나타내는 것을 확인하기 위해 다시 검출된다. 일부 구현예에서, F2세대의 식물 개체군은, 예를 들면, 식물이 표준 방법에 따라 트레오닌 합성효소 유전자의 부재로 트레오닌 합성효소를 표현하는 데 실패한 것이 확인되고, 예를 들면, 여기에 기재된 트레오닌 합성효소에 대한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초한 프라이머로 PCR 방법을 사용함으로써, 변형 트레오닌 합성효소 유전자 발현을 위해 검출되었다.
혼성체 변이체는 첫번째 변종의 교배모수 식물(즉, 종자친)의 자가수분을 방지하고, 교배모수 식물을 비옥하게 하는 제2 종류의 웅성 식물에서 꽃가루를 허용하며, 교배모수 식물을 생식력을 부여하기 위해서 두 번째 품종의 친 모체 식물로부터 꽃가루을 허용하고, 및 교배모수에서 형성하기 위한 F1 혼성체 종자를 허용함으로써 생산될 수 있다. 암그루의 자화 수분은 꽃 발달의 초기 단계에서 꽃을 제거함으로써 억제될 수 있다. 선택적으로, 꽃가루 형성이 웅성불임의 형태를 통해 교배모수 식물에서 억제될 수 있다. 예를 들어, 웅성 불임은 세포질적 웅성불임성, 또는 형질전환 웅성 불임성에 의해 만들어질 수 있고, 여기서 이식유전자는 소포자 형성 및/또는 꽃가루 형성, 또는 자기불화합성을 억제한다. CMS를 포함하는 교배모수 식물은 특히 유용하다. 교배모수 식물이 CMS인 구현예에서, 꽃가루은 친 생식력을 가진 식물로부터 수확되고, CMS 교배모수 식물의 암술머리에 수동으로 적용되며, 및 얻어진 F1 종자는 수확된다.
여기에 기술된 품종과 계통은 단일 교배 F1 혼성체를 형성하는데 사용될 수 다. 이러한 구현예에서, 모체 변이체의 식물은 웅성 식물에서 교배모수 식물로 자연 교배 수분을 용이하게 하기 위해서, 실질적으로 동종의 인접한 개체군으로써 성장될 수 있다. 기존의 방법으로, 교배모수 식물에 형성된 F1 종자는 선택적으로 수확된다. 하나는 대량으로 두 모체 식물 품종을 재배할 수 있고, 형성된 F1 혼성체 종자와 자가수분의 결과로 친 모체에서 형성된 종자와의 조합을 수확할 수 있다. 선택적으로, 삼원 교혼성체은 단일 교배 F1 혼성체은 교배모수로서 사용되고, 다른 친 모체와 교배됨으로써 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 이중 교배 혼성체은 서로 다른 단일 교배의 두 F1 후손이 그들 스스로 교배되어 만들 수 있다.
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 검사될 수 있거나 원하는 특성이나 표현형을 가진 개체군의 해당 구성원이 선택될 수 있다. 예를 들어, 후손 개체군의 단일 형질전환 특성정보는 NtTS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 원하는 발현 수치를 갖는 식물에 대해 스크리닝될 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법은 발현 수준을 식별하는 데 사용될 수 있다. 이는 폴리뉴클레오티드의 검출을 위해 서던 분석 또는 PCR 증폭을 포함한다; RNA 전사체를 검출하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머 높이법; 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석; 및 폴리펩티드를 검출하기 위해서, 단백질 젤 전기천공법, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 및 효소면역측정법. 가시적 분자결합화, 효소 스테이닝, 및 면역 염색법과 같은 다른 기술들은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하는데 또한 사용될 수 있다.
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 세포 및 식물은, 하나 이상의 분리된 NtTS 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구조체, 하나 이상의 이중가닥 RNAs, 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 하나 이상의 벡터/발현벡터와 같은 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이 여기에서 설명된다.
일부 구현예에서, NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소된 식물은, 특히 잎에서, 유리 트레오닌 농도의 증가를 얻을 수 있다. 유리 트레오닌 농도는, NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소되고 있지 않은 해당 대조식물에서 유리 트레오닌 농도에 비교하여, 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 그 이상에 의해 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소된 식물은, 특히 잎에서, 유리 트레오닌 농도의 감소를 얻을 수 있다. 유리 트레오닌 농도는, NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소되고 있지 않은 해당 대조식물에서 유리 트레오닌 농도에 비교하여, 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 그 이상에 의해 감소될 수 있다. 하나의 구현예에서, 유리 트레오닌 농도는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소되지 않은 해당하는 대조 식물에서 유리 트레오닌 농도와 비교했을 때 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 80%로 감소될 수 있다.
NtTS의 발현은 예를 들어, RT-PCR, 노던 블롯, RNase 보호, 프라이머 높이법, 웨스턴 블롯, 단백질 겔 전기천공법, 면역 침강법, 효소면역측정법, 칩 분석, 및 질량 분석법을 포함한 방법들을 사용하는 것으로 측정될 수 있다. 이것은 폴리펩티드는 조직 우선적 조절 또는 넓게 발현하는 프로모터 하에 발현되는 경우, 발현은 식물 전체 또는 선택된 조직으로 평가될 수 있다는 것을 주목해야한다. 유사하게, 폴리펩티드가 예를 들면, 성장 또는 유도의 특정 시간에 발현된다면, 발현은 원하는 시간에 선택적으로 평가될 수 있다.
제한 없이, 본 명세서에 기재된 식물은 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 조절되기 전 또는 후 중에서 다른 용도로 개변될 수 있다. 다음의 유전적 개변중 하나 또는 하나 이상은 발명의 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물에 존재할 수 있다. 하나의 구현예에서, 중금속 흡수 또는 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 유전자는 변형된다. 식물 또는 이의 대조식물 또는 변형이 없는 그것의 부분보다 낮은 중금속 함량을 가진 식물의 부분(잎과 같은)의 결과로 조절된다. 비제한적인 예로는 양이온 확산 촉진자(CDF) 패밀리, Zrt- 패밀리, Irt같은 단백질(ZIP), 양이온 교환체(CAX) 패밀리, 구리 운반체 (CORT) 패밀리, 중금속 P형 ATP 효소(HMA들, WO2009074325 에 설명된 대로) 패밀리, 자연 저항 관련 대식세포 단백질 (NRAMP)의 상동 패밀리, 및 중금속의 운반에 관여하는 ATP 결합 카세트(ABC) 운반체 과에 속하는 유전자들을 포함한다. 여기에서 사용된 중금속 용어는 전이 금속을 포함한다. 다른 구현예에서, 질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는 식물 또는 가열할 때, 대조식물 또는 그것의 부분보다는 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민(예를 들어, 4-(메틸니트로사민)-1-(3-피리딜)-1-부탄온, N-니트로소노르니코틴, N-니트로소마나타빈 및 N-니트로소마나바신)의 저수준을 생성하는 식물의 부분(예: 잎)에서 얻어진 것이 변성된다. 변성될 수 있는 유전자의 비제한적인 예는 니코틴에서 노르니코틴으로의 전환에 참여하고, WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 및 PCT/US2011/021088에 설명되어 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10과 같은 니코틴 탈메틸효소를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 개변의 예는 제초제 내성을 포함하는데, 예를 들면, 글리포세이트는 많은 광역 스펙트럼 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 내성 형질전환 식물은 aroA 유전자(살모넬라 티피뮤리움 및 대장균으로부터의 글리포세이트 EPSP 합성효소)를 전이함으로써 개발되었다. 술포닐우레아 내성 식물은 애기장대의 돌연변이 ALS(아세토락테이트 합성효소) 유전자를 변형시킴으로써 생산되었다. 돌연변이 긴털비름으로부터의 광계 II의 OB 단백질은 아트라진 내성 형질전환 식물을 생산하기 위해서 식물에 전이되었다; 및 브로목시닐 내성 형질전환 식물은 박테리아 폐렴 간균으로부터 bxn 유전자를 통합함으로써 생산되었다. 또 다른 예의 개변은 곤충에 내성이 있는 식물에서의 결과이다. 바실러스 투린지엔시스(Bt) 독소는 최근 피라미드형을 가진 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자들은 단일 단백질 및 곤충 내성의 진화가 상당히 지연된 것 중 하나에서 배추좀나방 내성을 조절했던 브로콜리로 설명된 바와 같이 Bt 해충 내성의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다. 또 다른 예시적인 변형은 병원체 (예, 바이러스, 박테리아, 곰팡이)으로 인한 질병에 저항하는 식물의 결과이다. Bt 융합 유전자 및 키티나아제 유전자 (노란색 줄기 나무좀에 대한 저항 및 잎집에 대한 내성) 둘 다 표현하는 식물의 Xa21 유전자를 발현하는 식물(세균성 병충해의 내성)은 유전자가 조작되었다. 또 다른 예시적인 변형은 웅성불임성과 같은 변형된 생식 능력에서의 결과이다. 또 다른 예시적인 변형은 비 생물적 스트레스 (예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 내성이 있는 식물에서의 결과이고, 내성 형질전환 식물은 애기장대로부터 아실 글리세롤 포스페이트 효소를 전달함으로써 생산된다; 만니톨 및 소르비톨의 합성이 포함된 만니톨 탈수소효소 및 소르비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 가뭄 내성을 향상시킨다. 또 다른 예시적인 변형은 인간의 사용을 위한 유리한 면역적 특성을 가진 단백질을 생산하는 식물에서의 결과가 있다. 예를 들어, 식물은 N-글리칸이 유용한, 알파-1,3-결합된 푸코오스 잔기, 베타-1,2-결합된 크실로오스 잔기, 또는 둘 다가 상당히 결여된 단백질을 생산할 수 있다. 다른 예시적인 변형은 향상된 저장 단백질 및 오일을 가진 식물, 향상된 광합성 효율을 가진 식물, 연장된 저장 수명을 가진 식물, 향상된 탄수화물 함량을 가진 식물 및 곰팡이에 저항하는 식물의 결과를 낼 수 있다; 알칼로이드의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 식물. S-아데노실 -L-메티오닌(SAM) 및/또는 시스타티오닌 감마 합성효소(CGS)의 발현이 변형된 형질전환 식물 또한 고려된다.
하나 이상의 이러한 특성은 다른 담배 재배품종으로부터 발명의 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 담배 식물에 유입될 수 있고 또는 그 안에서 바로 형질전환이 일어날 수 있다. 발명의 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 유입은 본 분야에서 알려진 식물 육종법, 예를 들어, 계통 육종, 역교배, 이게놈 반수체 육종 등에 의해 이뤄질 수 있다. (Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.참고). 앞에 기술된 분자 생물학-기반 기술들은, 특히 RFLP 마커 및 마이크로새틀라이트 마커에서, 반복친과의 유전적 상동성에서 최고도를 가진 후손을 식별하기 위해서 이러한 역교배에서 사용될 수 있다. 이것은 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 보다 바람직하게 적어도 99%로 반복친과의 유전적 상동성, 더욱더 바람직하게 반복친과 유전적으로 동일하고, 및 기증자 모체로부터 유입된 특성을 추가로 포함하는 품종의 생산을 촉진하기 위한 하나를 허용한다. 유전적 상동성에 대한 이러한 결정은 본 분야에서 기술된 분자 마커에 기초할 수 있다.
마지막 역교배 세대는 전이되는 핵산(들)에 대해 순수 육종 후손을 주기 위해서 자가수분될 수 있다. 생성된 식물은 일반적으로 발명의 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 형태학적 및 생리학적 특성, 추가적으로 전이된 특성(예를 들어, 하나 이상의 단일 유전자 형질)을 본질적으로 가진다. 정확한 역교배 프로토콜은 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 변경되는 특성에 따라 달라진다. 전이되는 특성이 지배적인 대립유전자의 경우, 역교배 방법이 단순화되어있음에도 불구하고, 열성 대립유전자는 전이될 수 있다. 이 경우, 그것은 원하는 특성이 성공적으로 전이되었는지 확인하기 위해서 후손의 검사를 도입할 필요가 있다.
다양한 구현예들은 NtTS 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은 그 내부에 유리 메티오닌 농도를 증가시키기 위해 줄어든 바이오매스뿐만 아니라 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물 또는 형질전환 식물을 제공하고, 특히 잎에 한정되지는 않는다.
이러한 식물, 특히 담배 식물, 및 더 특히 담배 식물의 잎몸 및 주맥의 부분은 그 안에 포함되거나, 다양한 소비 물품을 포함하여 만들기에 이용될 수 있지만, 에어로졸 형성 재료, 에어로졸 형성 장치, 흡연물품, 흡연가능한 물품, 무연 생성물, 및 담배 생성물에 제한되지는 않는다. 형성 물질의 예로는 에어로졸 형성 물질, 특히 니코틴 에어로졸을 포함하지만, 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 컷 담배, 경화된 담배, 확장된 담배, 균질화 담배, 재생 담배, 및 파이프 담배에 한정되지 않는다. 흡연 물품 및 흡연가능한 물품은 니코틴 에어로졸 형성 장치를 포함하는 에어로졸 형성 장치의 유형이다. 흡연 물품 또는 흡연가능한 물품의 예는 종이로 만 담배, 가는 담배, 및 시가를 포함하지만, 한정되지는 않는다. 무연 물품의 예는 씹는 담배, 및 코담배를 포함한다. 오히려 연소, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 물질보다 특정 에어로졸 형성 장치에서, 에어로졸을 생성하기 위해 하나 이상의 전기적 가열 요소에 의해 가열된다. 가열된 에어로졸 형성 장치의 다른 유형에서, 에어로졸은 안, 주변, 인접 또는 열원의 하류에 위치할 수 있는 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 물질에 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터의 열전달에 의해 생산된다. 무연 담배 물품 및 각종 담배 함유 에어로졸 형성 재료는 건식 입자, 파편, 과립, 분말, 또는 현탁액을 포함하고, 의존하고, 혼합되고, 둘러싸여 지고, 그 반대로 이러한 조각, 막, 캡슐, 거품, 또는 구슬 같은 형식의 다른 성분이 혼합된 어떠한 형태의 담배를 포함할 수 있다. 여기에서 사용되는 대로, 용어 '연기'는 담배(예를 들어, 담배 연기)와 같은 흡연 물품에 의해 또는 에어로졸 형성 물질이 연소됨에 따라 생성되는 에어로졸의 형태를 설명하기 위해서 사용된다.
하나의 구현예에서, 경화된 잎이나 돌연변이, 유전자 변형 및 여기에 기재된 비자연적으로 발생하는 담배 식물로부터의 경화된 식물 부분들을 포함하는 경화된 식물 물질이 또한 제공된다. 녹색 담배 잎 경화 공정은 본 분야에 기술을 가진 사람들에 의해 알려졌고, 음건, 화건, 및 볕 말리기의 제한 없이 포함된다. 녹색 잎담배 경화공정은 수확된 담배의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 전형적으로 버지니아 연도 (밝은) 담배는 일반적으로 황색종, 버얼리종 및 특정 어두운 종류는 공기 경화이고, 일반적으로 파이프 담배, 씹는 담배, 및 코담배는 불 경화이다.
또 다른 구현예에서, 담배 생성물은 여기에 기술된 돌연변이 담배 식물, 형질전환 담배 식물 또는 비자연적으로 발생하는 식의 잎으로부터 만들어진 잎, 바람직하게 경화된 잎을 포함하는 니코틴 에어로졸 형성 물질 또는 담배 함유 에어로졸 형성 물질을 포함한 담배 물품에 대하여 설명한다. 여기에 기재된 담배 물품은 비 변형된 담배 식물을 포함하는 하나 이상의 다른 종으로부터 담배를 포함하는 혼합된 담배 물품일 수 있다.
에어로졸 형성 재료 또는 비 돌연변이, 비 자연적 발생 또는 비 형질전환 상대 식물로부터 유래된 담배 조성물과 비교했을 때, 에어로졸 형성 재료 또는 발명의 담배 조성물에서의 유리 메티오닌 백분율은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, t, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 이상의 가치가 있다,
비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물은 예를 들면, 농업의 다른 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 여기에 설명된 형질전환 식물은 동물 사료 및 인간의 음식 물품을 만드는 데 사용될 수 있다.
발명은 또한 돌연변이 식물, 비자연적으로 발생하는 식물, 본 설명서에 언급된 형질전환 식물을 재배하고, 재배 식물의 종자를 수집하는 것을 포함하는 종자를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 여기에 기재된 식물로부터의 종자는 제조품을 형성하기 위해 기술 분야에서 알려진 방법에 의해 조절되고 포장재료를 넣을 수 있다. 종이 및 천 등과 같은 재료를 포장하는 것은 본 분야에 알려져 있다. 종자의 포장은 예를 들어, 포장재료에 고정된 태그 또는 라벨, 포장 재료에 인쇄된 라벨, 또는 그 안에 있는 종자의 본질로 설명된 포장 안에 삽입된 라벨인 라벨이 붙어있다.
또 다른 태양은 다음의 단계를 포함하는 메티오날을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다: (a) 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 부분; 바이오매스, 종자 또는 잎; 또는 여기에 설명된 재료와 같은 에어로졸 형성 물질하는 단계; 및 (b) 그것에 열을 제공하는 단계를 포함한다.
조성물, 방법 및 식별, 선택 또는 사육을 위한 유전자형 식물의 키트는 발명에 포함되고, 폴리뉴클레오티드의 샘플에서 NtTS 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 증폭 또는 검출을 수행하기 위해 특히 NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부 및 선택적으로 하나 이상의 프로브 및 하나 이상의 시약을 특히 증폭하기 위해 많은 프라이머 중 하나를 포함하는 것이 설명된다. 따라서, 유전자 특이 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 NtTS 폴리뉴클레오티드와 일치하는 약 10개 이상의 연속하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 프로브는 발견된다. 언급된 프라이머 또는 프로브는 NtTS 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 (예를 들어, 특히 혼성체이 된) 약 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 연속하는 폴리뉴클레오티드에 포함 또는 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 유전자 식별(예를 들어, 서던 혼성화)의 서열-의존적 방법으로 사용될 수 있고, 또는 분리 (예를 들어, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 가시적 분자결합화) 또는 유전자 검출 (예를 들어, 핵산 증폭 또는 검출에서의 하나 이상의 증폭 프라이머)에서 사용될 수 있는 약 10-50 연속하는 뉴클레오티드, 약 10-40 연속하는 뉴클레오티드, 약 10-30 연속하는 뉴클레오티드, 또는 약 15-30 연속하는 뉴클레오티드로 포함 또는 구성될 수 있다. 하나 이상의 특정 프라이머 또는 프로브는 설계될 수 있고, NtTS 폴리뉴클레오티드의 전부를 증폭하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 특정 예의 방법으로, 두 프라이머는 DNA 또는 RNA와 같은 NtTS 핵산을 코딩하는 핵산 단편을 증폭시키기 위한 중합 효소 사슬 반응 프로토콜에서 사용될 수 있다. 중합 연쇄 반응은 NtTS 핵산 서열로부터 유래된 하나의 프라이머 및 NtTS 프로모터 서열, mRNA의 전구체의 3 '말단 또는 벡터로부터 유래된 서열과 같은 NtTS 핵산 서열의 상류 또는 하류 서열에서 혼성화하는 두번째 프라이머를 사용하여 또한 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 체외 증폭에 유용한 열 및 등온 기술의 예는 본 분야에서 잘 알려져 있다. 샘플은 식물, 식물세포 또는 식물 물질 또는 여기에 기술된 식물, 식물 세포 또는 식물 물질로부터 만들어지거나 유래된 담배 물품일 수 있고, 이로부터 유래될 수 있다.
따라서, 추가의 태양에서, 다음의 단계를 포함하는 샘플에서 NtTS 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법이 또한 제공되고: (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; (b) NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 특별히 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 하나 이상의 프로브의 언급된 샘플을 접촉하는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출; 증폭 산물의 존재는 샘플에서의 NtTS 폴리뉴클레오티드의 존재를 포함한다. 추가적 태양에서, NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 특별히 검출하기 위한 많은 프라이머 또는 프로브들 중 하나의 사용이 제공된다. NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 검출하기 위한 키트는 NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 특별히 검출하기 위한 더 많은 프라이머 또는 프로브들 중 하나를 포함하는 것이 또한 제공된다. 키트는 중합 연쇄 반응(PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 시약 또는 서던 블롯, 노던 블롯, 가시적 분자결합화, 또는 마이크로 어레이와 같은 핵산 프로브 혼성화 검출 기술의 시약을 포함할 수 있다. 키트는 웨스턴 블롯, ELISA, SELDI 질량 분석 또는 테스트 스트립과 같은 항체 결합 검출 기술을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 염기서열 결정법을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 메티오닌, 트레오닌 및/또는 메티오날 함량을 결정하기 위한 시약 및/또는 지시를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 설명한 방법 중 하나 또는 그 이상에 대한 지침을 포함할 수 있다. 설명된 키트는 유전적 상동성 결정, 계통발생학적 연구, 유전자형, 단상형, 혈통 분석 또는 특히 공동 지배 기록을 가진 식물 육종을 위해서 유용할 수 있다.
본 발명은 식물, 식물 세포 또한 NtTS 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물재료 유전자형의 방법을 또한 제공한다. 유전자형은 염색체 쌍의 동족체를 구별하는 수단을 제공하고, 식물 개체군에서 분리개체들을 구별하는데 사용될 수 있다. 분자 마커 방법은 계통발생학적 연구, 작물변종 간의 유전적 관계를 특징짓는 것, 교배 또는 체세포 혼성체을 식별, 단일 유전자적 특성에 영향을 미치는 염색체 단편을 배치하는 것, 지도 기반 복제, 및 계량적인 유전의 연구를 위해 사용될 수 있다. 유전자형의 구체적인 방법은 증폭 단편 길이 다형성 (AFLP)을 포함하는 분자 마커 분석 기법의 임의의 수를 채택할 수도 있다. AFLP는 뉴클레오티드 서열의 변화에 의한 증폭 단편 사이의 대립유전자 차이의 물품이다. 따라서, 본 발명은 유전적으로 AFLP 분석과 같은 기술을 이용한 이들 유전자 또는 핵산에 유전적으로 연결된 염색체 서열뿐만 아니라, NtTS 유전자 또는 핵산의 분리를 수행하기 위한 수단을 추가로 제공한다.
트레오닌 합성효소의 사일런싱으로 인해 만들어진 식물에서 생산된 메티오닌과 경화 담배에서 발견된 화학적 화합물 사이의 상관 관계는 질량 분석기를 사용하는 경화된 잎에서 검사된다. 네 개의 피크는 대조식물(도1 참고)로부터 추출물에 비해 트레오닌 합성효소에서 바뀐 프로파일을 보여주기 때문에, 식물 추출물의 질량 분석 프로파일은, 식물에서 트레오닌 합성효소를 사일런싱하는 것은 식물에서의 앞선 변화를 운반하는 것을 나타낸다. 하나는 풍부하게 감소하는 반면 세 개의 피크는 풍부하게 증가한다. 프로파일의 이러한 변화는 에어로졸에서 메티오날의 수준이 증가될 가능성이 있는 식물을 식별하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 태양에서, 가열에 의해 에어로졸 안에서 메티오날의 증가된 수준이 나타난 담배 물질을 식별하기 위한 방법이 제공되고: (a) 담배 재료의 샘플를 준비하는 단계; (b) 샘플에서 분자 질량 프로파일을 결정하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 질량에서 분자 질량 프로파일을 비교하는 단계: 대조식물의 것과 충전비; 대조식물에 비교하여 충전비는 에어로졸에서 메티오날의 수치가 증가됨을 나타낸다. 적절하게는, 분자량은 질량 분석법, 바람직하게, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS), 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)에 의해 측정된다. 또 다른 태양에서, 식별된 또는 이 방법에 의해 식별될 수 있는 담배 재료가 제공된다.
발명은 더욱 더 상세하게 본 발명을 설명하기 위해서 제공된 아래 예에 추가로 기재되어 있다. 이 발명을 수행하기 위해서 현재 고려된, 선호된 방법에서 제시된 이 예들은 설명하고, 발명에 제한되지 않도록 의도된다.
실시예
실시예 1: 담배 트레오닌 합성효소의 식별
담배 트레오닌 합성효소 유전자를 담배 게놈 계획에서 발견된 담배 EST 서열을 사용하여 식별한다. 담배 트레오닌 합성효소에 가까운 또 다른 담배 EST 콘틱 (NCBI_45312-v2pep-fl)은 NCBI EST 서열에서 결합된다. 이러한 코딩 서열은 담배 트레오닌 합성효소로 정확하게 동일한 길이(1569bp)를 가진다. DNA-마이크로 어레이 엑손 어피메트릭스 칩 (NtPMIa1g193542e1으로부터의 서열 프로브)을 사용하는 데이터는 담배 트레오닌 합성효소는 뿌리, 분비모, 니코티아나.타바쿰의 푸른 및 노화 잎에 동등하게 발현됨을 보여준다. 유전자 발현 수준에서 주요 변화는 화건종(K326, K399)과 버얼리(TN90, Bu64) 담배의 잎 사이에서 찾을 수 없다. 또한, 추위 및 카드뮴 스트레스는 트레오닌 합성효소가 담배 잎에서 구조적으로 잘 발현되는 것을 나타내는 담배 트레오닌 합성효소 발현 수준에 영향을 미치지 않는다.
실시예 2: 시스타티오닌 감마-합성효소(CGS)의 과발현
애기장대 CGS (MT01, TAIR 접근 AT3901120)를 여기에 설명된 고전적인 잎 절편 절차를 사용하는 토양 박테리아를 통한 버얼리 담배 TN90 안에서 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 전사조절하에 도입한다. 카나마이신 항생제 선택 유전자 또한 삽입한다.
실시예 3: 담배 식물에서 트레오닌 합성효소 발현의 사일런싱
SEQ ID NO: 1, 프라이머의 DNA 단편을 사용은 RNAi의 접근을 사용하여 담배에서 NtTS를 사일런싱하기 위해 생성된다. 사용된 프라이머들은 5'-ctgaaatcgacagcgatgata-3' (SEQ ID NO: 9) 및 5'-caaccaatagctaacggagctt-3' (SEQ ID NO: 10)이다. 대응하는 RNAi의 서열을 역 전사-중합 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 cDNA로부터 증폭시키고, 제조업체 (Invitrogen)에 의해 설명된 대로, 입력 벡터를 통해 게이트웨이 벡터 pB7GWIWG2(II)에 삽입한다. 이 벡터는 모든 조직에서 전이유전자의 구조적 발현(꽃양배추 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터) 및 한천 평판(100 ㎎/㎖)에 카나마이신 항생제 선택을 위한 카나마이신 유전자를 위한 프로모터를 포함한다. 구조체를 고전적인 잎 절편 절차를 사용하는 토양 박테리아를 통해서 버얼리 담배 TN90의 게놈안에 삽입ㅎ한. 캘리로부터, 각각의 계통은 재발생되고 카나마이신에 선택된다. RNAi 사일런싱 T0 계통은 (i) RT- PCR에 의해 관찰되고, 35S 프로모터(5'-gagcatcgtggaaaaagaagac-3') 및 사일런싱(5'-ttgattcacgtgtcggtaagac-3')을 위해 사용된 단편 내의 하나의 프라이머를 사용하는 게놈 DNA에서 종자 생산을 위해 재배되며, 그리고 사일런싱(5'-aagctccgttagctattggttg-3')에 사용된 삽입을 조각화하는 특이 프라이머를 사용하는 (ii) RT- PCR에 의해 관찰되고, 종자 생산을 위해 재배된다. T1 종자를 수집하고, 카나마이신 함유 한천에서 다시 성장하며, 정확하게 T0 묘목으로 검사된다. 게놈 gDNA에 대한 PCR은 NtTS DNA 단편이 게놈에 삽입되어 있는지를 보여주고, 효과적으로 담배 트레오닌 합성효소를 사일런싱한다.
실시예 4: 트레오닌 합성효소의 배양은 담배 식물이 사일런싱된다
카나마이신 내성 식물을 필드 (켄터키, 미국)에서 재배하기 전에 부유 트레이에서 재배한다. 사일런싱 트레오닌 합성효소 계통 (NtTS RNAi의 계통, 예 2)의 20 식물, 시스타티오닌 감마-합성효소 계통(예 3), 벡터 대조군 (VC, pB7GWIWG2(II)) 및 TN90 미국 배경 담배는 20 식물들의 네 개의 반복에서 재배한다. 필드 이식 뒤 (토핑 뒤 36일) 석 달, 중간 줄기 위치의 하나의 잎은 각 복제에 대한 20 외의 10 동일 식물에서 샘플링한다. 잎("녹색 잎")은 즉시 드라이아이스 및 동결 건조되어 저장한다. 최고의 두 계통의 10 식물은 버얼리 농업 관행에 따라 선택되고, 경화된다. 경화 후, 중간 줄기의 위치에서 세 개의 잎이 샘플링하였다. 사일런싱 트레오닌 합성효소 계통의 사일런싱 효과를 감시하기 위해서 및 시스타티오닌 감마-합성효소 계통을 비교하기 위해서, 세 계통으로부터의 "녹색 잎"은 기본이 되고, 유리 아미노산 분석의 대상이 된다.
실시예 5: 메티오날 분석
트레오닌 합성효소 사일런싱, 경화된 담배에서 발견된 화학적 화합물로 인해, 녹색 잎에서 생산된 메티오닌 사이의 상관 관계는 위에 설명된 계통을 사용한 LC -MS를 이용하여 경화된 잎에서 검사한다. 추출을 메탄올에서 수행한다. 사용된 장비는 MS에 연결된 워터스 액쿼티 UPLC 시스템이다. 컬럼은 A 이동상으로 물:아세토니트릴(95:5 V/V) 및 B 이동상으로 메탄올을 사용하는 워터스엑스브리지(WatersXBridge) RP18 이다. LC -MS 프로파일은 녹색 잎에서 트레오닌 합성효소 사일런싱이 경화된 잎의 화학 신호를 앞으로 전달하는 것을 나타낸다. 실제로 네 개의 피크는 대조군에 비해 트레오닌 합성효소 사일런싱 계통에 변경된 프로파일을 보여주었다. 하나는 감소하는 반면, 명확하게 세 개의 피크는 풍부하게 증가한다. 이것은 녹색 잎에 축적된 메티오닌이 황색종에서 황 생성물 또는 메티오닌 유도체의 분해 중 하나가 변환되는 것을 암시한다.
메티오닌을 메티오날의 가능한 전구체로서, 경화된 담배 (TN90, VC, NtTS-1, NtTS-1 및 NtTS-3 선택되고 제출된 복제물) 및 콜드 트랩의 대상을 가열한 후에 형성된 에어로졸에서 메티오날의 함량을 분석하였다. 사용된 담뱃대는 2초 12 퍼프의 방식을 포함하는 MACOR형 열원(54W)을 가진 흡연 모의실험 장치이다. 흡연 전에, 담배 경화된 막은 절단하고, 20% 글리세린으로 포화시켰다. 포화된 경화 담배 (100㎎, 3 완전 복제물)를 가열함으로써 생성된 에어로졸은, 에어 리퀴드(Air Liquid)에 의해 개발된, 극저온 시스템을 사용하여 농축하였고, 디클로로메탄(2회 5㎖)에 용해하였다. 에어로졸 용액에서의 메티오날 수치를 유도체화 한 후 GC- MS에 의해 결정하였다. 가장 풍부한 신호를 생성하는 이온을 단일 이온 모니터링(SIM) 모드에서 정량적 데이터를 획득하기 위해 사용하였다.
트레오닌 합성효소 사일런싱, 황색종 담배에서 발견된 화학적 화합물로 인해, 녹색 잎에서 생산된 메티오닌 사이의 상관관계는 위에 설명된 복제된 계통을 사용한 LC -MS를 이용하여 경화된 잎에서 검사된다. 추출을 메탄올에서 수행하였다. 사용된 장비는 MS에 연결된 워터스 액쿼티 UPLC 시스템이다. 컬럼은 A 이동상으로 물:아세토니트릴(95:5 V/V) 및 B 이동상으로 메탄올을 사용하는 워터스엑스브리지(WatersXBridge) RP18이었다. 결과를 표1에 나타내었다.
표1에 나타낸 바와 같이, NtTS-RNAi의 식물은 대조식물에서 어떤 시각적 차이를 보이지 않았다. 예를 들면, 식물 높이 및 트레오닌 합성효소-사일런싱 담배 식물에서의 엽록소 함량은 대조식물과 거의 동일하였다. 트레오닌 합성효소-사일런싱 담배 식물의 녹색 잎에서 유리 메티오닌 농도는 대조식물에 비해 높았다. 에어로졸의 메티오날 농도는 대조식물보다 트레오닌 합성효소-사일런싱 담배 식물에서 훨씬 높았다. 녹색 잎의 트레오닌 함량은 대조식물과 비교하여 트레오닌 합성효소-사일런싱 담배 식물에서 20% 이상의 감소를 나타내었다.
실시예 6: NtTS-RNAi의 담배 계통에서 트레오닌 합성효소의 발현 분석
SEQ ID NOs: 1, 2, 3 및 20은 개시에서 종결 코돈까지의 1,587 염기의 일치로 정렬된다. 단편 영역은 SEQ ID NOs: 1, 2 및 3 사이의 동족체이고, SEQ ID NO: 20으로부터의 차이는 SEQ ID NOs: 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 1-46 및 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 1-52이다; SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 99-141, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 102-144 및 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 102-153; SEQ ID NOs: 1, 2 및 3의 뉴클레오티드 1325-1362 및 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 1334-1371. 이러한 서열을 SEQ ID NOs 1, 2, 3에 대한 특이적 프라이머를 설계하는 데 사용한다. SEQ ID NO: 20을 위한 특정 프라이머 세트 또한 설계하였다.
NtTS-RNAi의 계통은 SEQ ID NO: 1의 454-805 뉴클레오티드에 대응하는 영역 을 사용하여 제조된다; SEQ ID NO: 2의 454-805 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 3의 456-805 뉴클레오티드 및 SEQ ID NO: 20의 463-814 뉴클레오티드. 긍정적으로 RNAi 사일런싱(gDNA에서의 35S 프로모터의 존재에 대해 PCR에 의해 테스트) 을 위해 전이 유전자를 발현하는 3 독립적인 NtTS-RNAi의 계통(NtTS1, NtTS2 및 NtTS3)으로부터 각각의 3 식물은 SEQ ID NOs: 1, 2 및 3을 위한 특정 프라이머 및 SEQ ID NO: 20을 위한 특정 프라이머를 사용하는 반정량적인 RT-PCR을 할 수 있다. 튜불린은 하우스키핑 유전자의 발현을 위한 대조군으로 사용된다. 3 버얼리 TN90 식물은 SEQ ID NOS: 1, 2, 3 및 20과 관련된 전사체의 발현을 위한 대조군에 사용된다. 반정량적인 RT-PCR에서, SEQ ID NOS: 1, 2, 3을 위한 특정 프라이머 또는 단지 SEQ ID NO: 3만을 위한 특정 프라이머, 단지 SEQ ID NOS: 1 및 2 만을 위한 특정 프라이머를 사용하는 것은 트레오닌 합성효소 발현에서의 부분적인 사일런싱은 대조군과 비교하여 각 3 독립적인 NtTS - RNAi 계통을 야기하는 것을 나타낸다. SEQ ID NO: 20을 위한 특정 프라이머를 사용하는 것은 NtTS - RNAi 식물에서 부분적인 사일런싱을 야기하고, 사일런싱의 수치가 SEQ ID NOS: 1-3을 이루기 위한 것보다 적은 것을 나타낸다. 서열 사이의 % 서열 상동성이 동일 하더라도, 사일런싱은 SEQ ID NO: 20을 위한 것보다 SEQ ID NO: 3을 위한 것이 더 효과적인 것으로 관찰되었다.
여기에 인용된 또는 설명된 출판물은 이전에 본 출원의 출원일에 공개된 관련 정보를 제공한다. 여기에서 명세서는 발명자가 이러한 공시에 선행하기 위한 자격이 되지 않는 허용은 이해되지 않는다. 상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 여기에 참고로 인용된다. 발명의 다양한 조절 및 변형은 발명의 범위 및 의미에서 벗어나지 않고 본 분야에서 기술된 것과 명백할 것이다. 발명이 특정한 선호되는 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구된 대로 발명은 부당하게 특정한 구현예들에 한정되지 않아야 하는 것을 이해해야한다. 실제로, 세포적, 분자적 및 식물 생물학 또는 관련 분야에 기술된 것이 명백한 이 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한 변형은 다음의 청구범위에 포함되는 것이 의도된다.
Figure pct00002
SEQUENCES
SEQ ID NO:1 (니코티아나.타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소의 DNA 서열)
Figure pct00003

SEQ ID NO:2 (니코티아나 실베스트리스에 또한 존재하는 니코티아나.타바쿰 (Hicks Broad Leaf)로부터의 트레오닌 합성효소의 DNA 서열)
Figure pct00004

SEQ ID NO:3 (니코티아나.타바쿰 (Hicks Broad Leaf)로부터의 트레오닌 합성효소의 DNA 서열)
Figure pct00005

SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO: 3의 게놈 DNA 서열)
Figure pct00006

SEQ ID NO:5 (니코티아나 토멘토시포르미스로부터의 트레오닌 합성효소의 게놈 DNA 서열)
Figure pct00007

SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO: 1의 번역된 (translated)서열)
Figure pct00008

SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO: 2의 번역된 (translated)서열)
Figure pct00009

SEQ ID NO:8 (SEQ ID NO. 3의 번역된 (translated)서열)
Figure pct00010

SEQ ID NO:9 (프라이머)
Figure pct00011

SEQ ID NO:10 (프라이머)
Figure pct00012

SEQ ID NO:11 (프라이머)
Figure pct00013

SEQ ID NO:12 (프라이머)
Figure pct00014

SEQ ID NO:13 (프라이머)
Figure pct00015

SEQ ID NO: 14 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00016

SEQ ID NO: 15 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00017

SEQ ID NO: 16 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00018

SEQ ID NO: 17 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00019

SEQ ID NO: 18 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00020

SEQ ID NO: 19 (트레오닌 합성효소를 사일런싱하기 위해 사용되는 RNAi 서열)
Figure pct00021

SEQ ID NO: 20 (니코티아나.타바쿰으로부터의 추가의 트레오닌 합성효소의 서열)
Figure pct00022

SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO: 21의 번역된 서열)
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. <120> Threonine Synthase from Nicotiana tabacum and Methods and Uses Thereof <130> 307486-20832 <140> PCT/EP2012/003663 <141> 2011-09-02 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1569 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 atggcggctt ctttcatgct cagatcttct ttcctctctc ctccttgttc ccaactccat 60 caccaatccc cttccaaatc taatcacatt attcacttca ttaatccaat caaagccacc 120 gcctctacaa atgacgcaat tgtccctccc caaaagcacc gccgccccgc cgacgaaaac 180 atccgcgaag aggcggcgcg ccgccgcacc tcctcccaca atttctccgc caggtacgtt 240 cctttcaatg ccgatcccag ctccgacgaa tggtattctc tcgatgaaat tatataccgg 300 agccgctccg gtggattact tgatgttcag catgatatgg acgctctgaa gaaatttgat 360 ggccagtatt ggcggtcact gtttgattca cgtgtcggta agaccacgtg gccgtacggt 420 tcaggcgttt ggtctaaaaa ggaatgggtc ctacctgaaa tcgacagcga tgatattgtt 480 agtgcttttg aaggaaactc taatctgttt tgggctgagc gttttggcaa acagtttcta 540 ggcatgagtg acttatgggt aaaacactgt ggaatcagcc atacgggtag ttttaaggat 600 ctgggtatga ccgttttggt gagtcaagtg aaccggttaa ggaaaatgca taaaccagtt 660 gtaggtgtgg gctgtgcttc cactggtgac acgtcagctg cattgtcagc ttactgtgca 720 tctgcgggga ttccatccat tgtattttta ccagcaaata agatatctat ggcgcagctg 780 gtacaaccaa tagctaacgg agcttttgtg ttgagtattg acaccgattt tgatggttgt 840 atgcagttga ttcgcgaagt cactgcagag ttgcctattt acttggcgaa ttcgttgaat 900 agtttgaggt tagaagggca aaagactgca gcaattgaga ttttgcagca gtttgatggc 960 aaagtacccg attgggtgat agtacctgga gggaacttgg gtaatatata tgctttctat 1020 aaaggtttta tgatgtgcag agagttgggg ctagttgacc gtatccctag gcttgtgtgt 1080 gctcaagcag ctaacgctaa tccgctttac ttgcattata aatccggttg gaaagacttt 1140 caacccgtga aggcgaacac cacatttgca tctgctatac agattggtga tccagtgtct 1200 atagatagag ctgtttttgc cctgaagaac tgtgacggga tagttgagga ggcaacggag 1260 gaggagttga tggatgctat ggctcaggca gactcaactg ggatgttcat ttgcccgcac 1320 actggtgtgg cattgactgc cctgttcaag ttgagaaaca gtggagttat tggaccaaat 1380 gataagactg tggttgtgag tacagcacat ggattgaagt ttactcaatc aaagattgat 1440 taccactcaa aggaaataaa ggacatggaa tgtcggtttg ctaacccacc tgtggaagtg 1500 aaagcagatt ttggatcagt catggatgtt ctcaagaaat atttgttgag caaaaatgcc 1560 aagcactga 1569 <210> 2 <211> 1569 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 2 atggcggctt ctttcatgct cagatcttct ttcctctctc ctccttctcc ccaactccat 60 caccaatccc cttccaaatc taatcacact attcacttca tcaatccaat caaagccacc 120 gcctctacaa atgacgcaat tatccctccc cagaaacatc gtcgccccgc cgacgaaaac 180 atccgcgaag aggcggcgcg ccggcccacc tcctcccaca atttctccgc caggtacgtt 240 cctttcaatg ccgaccccag ctccgacgaa tggtattctc tcgatgaaat tatataccgg 300 agccgctccg gtggcttact tgatgttcag catgatatgg acgctctgaa gaaatttgat 360 ggccagtatt ggcggtcact gtttgattca cgtgtcggta agaccacgtg gccgtacggt 420 tcaggcgttt ggtctaaaaa ggaatgggtc ctacctgaaa tcgatagtga tgatattgtt 480 agtgcttttg aaggaaactc taatctgttt tgggctgagc gttttggtaa acagtttcta 540 ggcatgagtg acttatgggt aaaacactgt ggaattagcc atacaggtag ttttaaggat 600 ctgggtatga ccgttttggt gagtcaagtg aaccggttaa ggaaaatgca taaaccggtt 660 gttggtgtgg gctgtgcttc cactggtgac acgtcagctg cattgtcagc ttactgtgca 720 tctgcgggga ttccatcgat tgtattttta cctgcaaata agatatctat ggcgcagctg 780 gtacaaccga tagctaacgg agcttttgtg ttgagcattg acaccgattt tgatggttgt 840 atgcagttga ttcgtgaagt cactgctgag ttgccaattt acttggcgaa ttctttgaat 900 agtttgaggt tagaagggca aaagactgca gcaattgaga ttttgcagca gtttgattgg 960 caagttcccg attgggtgat agttcctgga ggtaacttgg gtaatatata tgcgttctat 1020 aaaggtttta tgatgtgcaa agagttgggg ctcgttgatc gtatccctag gcttgtgtgt 1080 gctcaagcag ctaacgctaa tccgctttac ttgcattata aatccggttg gaaagacttt 1140 caacccgtga aggcgaacac cacatttgca tctgctatac agattggtga cccagtgtct 1200 atagatagag ctgtttttgc cctgaagaac tgtgacggga tagtggagga ggcaacggag 1260 gaggagttga tggatgctat ggctcaggca gactcaactg ggatgttcat ttgcccgcac 1320 actggtgtgg cattgactgc cctgttcaag ttgagaaaca gtggagttat cgggccaaat 1380 gataagactg tggttgtgag tacagcacat ggattgaagt ttactcaatc aaagattgat 1440 taccactcaa aggaaataaa ggacatggaa tgtcggtttg ctaacccacc tgtggaagtg 1500 aaagcagatt ttggatcagt catggatgtt ctcaagaaat atttgttgag caaaaatgcc 1560 aagcactga 1569 <210> 3 <211> 1569 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 atggcggctt ctttcatgct cagatcttct ttcctctctc ctccttctcc ccaactccat 60 caccaatctc ctcctaaatc caatcccact attcacttca tcaatccaat caaagccacc 120 gcctctacaa atgacgcaat tatccctccc cagaaacacc gccgccctgc cgacgaaaat 180 atccgcgaag aggccgctcg ccgccccacc tcctcccaca atttctccgc caggtacgtg 240 cctttcaatg cggatccaag ctccgatgaa tggtattctc tcgatgaaat catctaccgg 300 agccgctccg gcggcctact tgatgttcaa catgatatgg acgctttaaa aaagtttgac 360 ggtcagtact ggaggtcact ttttgattca cgtgtcggga agacgacgtg gccttacggg 420 tcaggtgttt ggtctaagaa ggaatgggtc ctacccgaaa tcgatagtga tgatattgtt 480 agtgcttttg aaggaaactc aaatcttttt tgggctgagc gttttggcaa acagtttcta 540 ggcatgagtg atttatgggt aaaacactgt ggaattagtc atacaggtag ttttaaggat 600 ctaggtatga ctgttttggt gagtcaagtg aaccggttaa ggaaaatgca taaaccggtt 660 gttggtgtgg gctgtgcttc cactggtgac acgtcagctg cattgtcagc ttactgtgca 720 tctgcgggga ttccatcgat tgtattttta cctgcaaata agatatctat ggcgcagctg 780 gtacaaccga tagctaacgg agcttttgtg ttgagcattg acaccgattt tgatggttgt 840 atgcagttga ttcgtgaagt cactgctgag ttgccaattt acttggcgaa ttcgttgaat 900 agtttgaggt tagaagggca aaagactgca gcaattgaga ttttgcagca gtttgattgg 960 caagttcccg attgggtgat agttcctgga gggaacttgg gtaatatata tgcgttctat 1020 aaaggtttta tgatgtgcaa agagttgggg ctcgttgatc gtatccctag gcttgtgtgt 1080 gctcaagcag ctaacgcgaa tccgctttat ttgcattata aatccggttg gaaagacttt 1140 caacccgtga aggcgaacac cacatttgca tctgctatac agattggtga cccagtgtct 1200 atagatagag ctgtttttgc cctgaagaac tgtgacggga tagtggagga ggcaacagag 1260 gaggagttga tggatgctat ggctaaggca gactcgactg ggatgttcat ttgcccgcac 1320 actggtgtgg cattgactgc cctgttcaag ttgagaaaca gtggagttat cggaccaaat 1380 gataagaccg tggttgtgag tacagcacat ggattgaagt ttactcaatc aaagattgat 1440 tatcactcaa aggaaataaa ggacatggaa tgtcggtttg ctaacccacc tgtggaagtg 1500 aaagcagatt ttggatcagt catggatgtt ctcaagaaat atttgttgag caaaaatgcc 1560 aagcactga 1569 <210> 4 <211> 1740 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 4 cgcagctgct ttaactattt tcgacactcc attaatggcg gcttctttca tgctcagatc 60 ttctttcctc tctcctcctt ctccccaact ccatcaccaa tctcctccta aatccaatcc 120 cactattcac ttcatcaatc caatcaaagc caccgcctct acaaatgacg caattatccc 180 tccccagaaa caccgccgcc ctgccgacga aaatatccgc gaagaggccg ctcgccgccc 240 cacctcctcc cacaatttct ccgccaggta tgtaggggaa gatatactag cgaaatgaat 300 agataataag caaaatgaaa atagtgggtc taaaattaca ataatttact cattgctcat 360 ttatttaatg ctgacatcaa aaagtgctgc gtatgtcact gcaggtacgt gcctttcaat 420 gcggatccaa gctccgatga atggtattct ctcgatgaaa tcatctaccg gagccgctcc 480 ggcggcctac ttgatgttca acatgatatg gacgctttaa aaaagtttga cggtcagtac 540 tggaggtcac tttttgattc acgtgtcggg aagacgacgt ggccttacgg gtcaggtgtt 600 tggtctaaga aggaatgggt cctacccgaa atcgatagtg atgatattgt tagtgctttt 660 gaaggaaact caaatctttt ttgggctgag cgttttggca aacagtttct aggcatgagt 720 gatttatggg taaaacactg tggaattagt catacaggta gttttaagga tctaggtatg 780 actgttttgg tgagtcaagt gaaccggtta aggaaaatgc ataaaccggt tgttggtgtg 840 ggctgtgctt ccactggtga cacgtcagct gcattgtcag cttactgtgc atctgcgggg 900 attccatcga ttgtattttt acctgcaaat aagatatcta tggcgcagct ggtacaaccg 960 atagctaacg gagcttttgt gttgagcatt gacaccgatt ttgatggttg tatgcagttg 1020 attcgtgaag tcactgctga gttgccaatt tacttggcga attcgttgaa tagtttgagg 1080 ttagaagggc aaaagactgc agcaattgag attttgcagc agtttgattg gcaagttccc 1140 gattgggtga tagttcctgg agggaacttg ggtaatatat atgcgttcta taaaggtttt 1200 atgatgtgca aagagttggg gctcgttgat cgtatcccta ggcttgtgtg tgctcaagca 1260 gctaacgcga atccgcttta tttgcattat aaatccggtt ggaaagactt tcaacccgtg 1320 aaggcgaaca ccacatttgc atctgctata cagattggtg acccagtgtc tatagataga 1380 gctgtttttg ccctgaagaa ctgtgacggg atagtggagg aggcaacaga ggaggagttg 1440 atggatgcta tggctaaggc agactcgact gggatgttca tttgcccgca cactggtgtg 1500 gcattgactg ccctgttcaa gttgagaaac agtggagtta tcggaccaaa tgataagacc 1560 gtggttgtga gtacagcaca tggattgaag tttactcaat caaagattga ttatcactca 1620 aaggaaataa aggacatgga atgtcggttt gctaacccac ctgtggaagt gaaagcagat 1680 tttggatcag tcatggatgt tctcaagaaa tatttgttga gcaaaaatgc caagcactga 1740 <210> 5 <211> 1740 <212> DNA <213> Nicotiana tomentosiformis <400> 5 cgcagctgct ttaactattt tcgacactcc attaatggcg gcttctttca tgctcagata 60 ttctttcctc tctcctcctt ctccccaact ccatcaccaa tctcctccta aatccaatcc 120 cactattcac ttcatcaatc caatcaaagc caccgcctct acaaatgacg caattatccc 180 tccccagaaa caccgccgcc ctgccgacga aaatatccgc gaagaggccg ctcgccgccc 240 cacctcctcc cacaatttct ccgccaggta tgtaggggaa gatatactag cgaaatgaat 300 agataataag caaaatgaaa atagtgggtc taaaattaca ataatttact cattgctcat 360 ttatttaatg ctgacatcaa aaagtgctgc gtatgtcact gcaggtacgt gcctttcaat 420 gcggatccaa gctccgatga atggtattct ctcgatgaaa tcatctaccg gagccgctcc 480 ggcggcctac ttgatgttca acatgatatg gacgctttaa aaaagtttga cggtcagtac 540 tggaggtcac tttttgattc acgtgtcggg aagacgacgt ggccttacgg gtcaggtgtt 600 tggtctaaga aggaatgggt cctacccgaa atcgatagtg atgatattgt tagtgctttt 660 gaaggaaact caaatctttt ttgggctgag cgttttggca aacagtttct aggcatgagt 720 gatttatggg taaaacactg tggaattagt catacaggta gttttaagga tctaggtatg 780 actgttttgg tgagtcaagt gaaccggtta aggaaaatgc ataaaccggt tgttggtgtg 840 ggctgtgctt ccactggtga cacgtcagct gcattgtcag cttactgtgc atctgcgggg 900 attccatcga ttgtattttt acctgcaaat aagatatcta tggcgcagct ggtacaaccg 960 atagctaacg gagcttttgt gttgagcatt gacaccgatt ttgatggttg tatgcagttg 1020 attcgtgaag tcactgctga gttgccaatt tacttggcga attcgttgaa tagtttgagg 1080 ttagaagggc aaaagactgc agcaattgag attttgcagc agtttgattg gcaagttccc 1140 gattgggtga tagttcctgg agggaacttg ggtaatatat atgcgttcta taaaggtttt 1200 atgatgtgca aagagttggg gctcgttgat cgtatcccta ggcttgtgtg tgctcaagca 1260 gctaacgcga atccgcttta tttgcattat aaatccggtt ggaaagactt tcaacccgtg 1320 aaggcgaaca ccacatttgc atctgctata cagattggtg acccagtgtc tatagataga 1380 gctgtttttg ccctgaagaa ctgtgacggg atagtggagg aggcaacaga ggaggagttg 1440 atggatgcta tggctcaggc agactcgact gggatgttca tttgcccgca cactggtgtg 1500 gcattgactg ccctgttcaa gtcgagaaac agtggagtta tcggaccaaa tgataagacc 1560 gtggttgtga gtacagcaca tggattgaag tttactcaat caaagattga ttatcactca 1620 aaggaaataa aggacatgga atgtcggttt gctaacccac ctgtggaagt gaaagcagat 1680 tttggatcag tcatggatgt tctcaagaaa tatttgttga gcaaaaatgc caagcactga 1740 <210> 6 <211> 522 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 6 Met Ala Ala Ser Phe Met Leu Arg Ser Ser Phe Leu Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Ser Gln Leu His His Gln Ser Pro Ser Lys Ser Asn His Ile Ile His 20 25 30 Phe Ile Asn Pro Ile Lys Ala Thr Ala Ser Thr Asn Asp Ala Ile Val 35 40 45 Pro Pro Gln Lys His Arg Arg Pro Ala Asp Glu Asn Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Ala Ala Arg Arg Arg Thr Ser Ser His Asn Phe Ser Ala Arg Tyr Val 65 70 75 80 Pro Phe Asn Ala Asp Pro Ser Ser Asp Glu Trp Tyr Ser Leu Asp Glu 85 90 95 Ile Ile Tyr Arg Ser Arg Ser Gly Gly Leu Leu Asp Val Gln His Asp 100 105 110 Met Asp Ala Leu Lys Lys Phe Asp Gly Gln Tyr Trp Arg Ser Leu Phe 115 120 125 Asp Ser Arg Val Gly Lys Thr Thr Trp Pro Tyr Gly Ser Gly Val Trp 130 135 140 Ser Lys Lys Glu Trp Val Leu Pro Glu Ile Asp Ser Asp Asp Ile Val 145 150 155 160 Ser Ala Phe Glu Gly Asn Ser Asn Leu Phe Trp Ala Glu Arg Phe Gly 165 170 175 Lys Gln Phe Leu Gly Met Ser Asp Leu Trp Val Lys His Cys Gly Ile 180 185 190 Ser His Thr Gly Ser Phe Lys Asp Leu Gly Met Thr Val Leu Val Ser 195 200 205 Gln Val Asn Arg Leu Arg Lys Met His Lys Pro Val Val Gly Val Gly 210 215 220 Cys Ala Ser Thr Gly Asp Thr Ser Ala Ala Leu Ser Ala Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ile Pro Ser Ile Val Phe Leu Pro Ala Asn Lys Ile Ser 245 250 255 Met Ala Gln Leu Val Gln Pro Ile Ala Asn Gly Ala Phe Val Leu Ser 260 265 270 Ile Asp Thr Asp Phe Asp Gly Cys Met Gln Leu Ile Arg Glu Val Thr 275 280 285 Ala Glu Leu Pro Ile Tyr Leu Ala Asn Ser Leu Asn Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ala Ile Glu Ile Leu Gln Gln Phe Asp Gly 305 310 315 320 Lys Val Pro Asp Trp Val Ile Val Pro Gly Gly Asn Leu Gly Asn Ile 325 330 335 Tyr Ala Phe Tyr Lys Gly Phe Met Met Cys Arg Glu Leu Gly Leu Val 340 345 350 Asp Arg Ile Pro Arg Leu Val Cys Ala Gln Ala Ala Asn Ala Asn Pro 355 360 365 Leu Tyr Leu His Tyr Lys Ser Gly Trp Lys Asp Phe Gln Pro Val Lys 370 375 380 Ala Asn Thr Thr Phe Ala Ser Ala Ile Gln Ile Gly Asp Pro Val Ser 385 390 395 400 Ile Asp Arg Ala Val Phe Ala Leu Lys Asn Cys Asp Gly Ile Val Glu 405 410 415 Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Met Asp Ala Met Ala Gln Ala Asp Ser 420 425 430 Thr Gly Met Phe Ile Cys Pro His Thr Gly Val Ala Leu Thr Ala Leu 435 440 445 Phe Lys Leu Arg Asn Ser Gly Val Ile Gly Pro Asn Asp Lys Thr Val 450 455 460 Val Val Ser Thr Ala His Gly Leu Lys Phe Thr Gln Ser Lys Ile Asp 465 470 475 480 Tyr His Ser Lys Glu Ile Lys Asp Met Glu Cys Arg Phe Ala Asn Pro 485 490 495 Pro Val Glu Val Lys Ala Asp Phe Gly Ser Val Met Asp Val Leu Lys 500 505 510 Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Ala Lys His 515 520 <210> 7 <211> 522 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 7 Met Ala Ala Ser Phe Met Leu Arg Ser Ser Phe Leu Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Gln Leu His His Gln Ser Pro Ser Lys Ser Asn His Thr Ile His 20 25 30 Phe Ile Asn Pro Ile Lys Ala Thr Ala Ser Thr Asn Asp Ala Ile Ile 35 40 45 Pro Pro Gln Lys His Arg Arg Pro Ala Asp Glu Asn Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Ala Ala Arg Arg Pro Thr Ser Ser His Asn Phe Ser Ala Arg Tyr Val 65 70 75 80 Pro Phe Asn Ala Asp Pro Ser Ser Asp Glu Trp Tyr Ser Leu Asp Glu 85 90 95 Ile Ile Tyr Arg Ser Arg Ser Gly Gly Leu Leu Asp Val Gln His Asp 100 105 110 Met Asp Ala Leu Lys Lys Phe Asp Gly Gln Tyr Trp Arg Ser Leu Phe 115 120 125 Asp Ser Arg Val Gly Lys Thr Thr Trp Pro Tyr Gly Ser Gly Val Trp 130 135 140 Ser Lys Lys Glu Trp Val Leu Pro Glu Ile Asp Ser Asp Asp Ile Val 145 150 155 160 Ser Ala Phe Glu Gly Asn Ser Asn Leu Phe Trp Ala Glu Arg Phe Gly 165 170 175 Lys Gln Phe Leu Gly Met Ser Asp Leu Trp Val Lys His Cys Gly Ile 180 185 190 Ser His Thr Gly Ser Phe Lys Asp Leu Gly Met Thr Val Leu Val Ser 195 200 205 Gln Val Asn Arg Leu Arg Lys Met His Lys Pro Val Val Gly Val Gly 210 215 220 Cys Ala Ser Thr Gly Asp Thr Ser Ala Ala Leu Ser Ala Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ile Pro Ser Ile Val Phe Leu Pro Ala Asn Lys Ile Ser 245 250 255 Met Ala Gln Leu Val Gln Pro Ile Ala Asn Gly Ala Phe Val Leu Ser 260 265 270 Ile Asp Thr Asp Phe Asp Gly Cys Met Gln Leu Ile Arg Glu Val Thr 275 280 285 Ala Glu Leu Pro Ile Tyr Leu Ala Asn Ser Leu Asn Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ala Ile Glu Ile Leu Gln Gln Phe Asp Trp 305 310 315 320 Gln Val Pro Asp Trp Val Ile Val Pro Gly Gly Asn Leu Gly Asn Ile 325 330 335 Tyr Ala Phe Tyr Lys Gly Phe Met Met Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val 340 345 350 Asp Arg Ile Pro Arg Leu Val Cys Ala Gln Ala Ala Asn Ala Asn Pro 355 360 365 Leu Tyr Leu His Tyr Lys Ser Gly Trp Lys Asp Phe Gln Pro Val Lys 370 375 380 Ala Asn Thr Thr Phe Ala Ser Ala Ile Gln Ile Gly Asp Pro Val Ser 385 390 395 400 Ile Asp Arg Ala Val Phe Ala Leu Lys Asn Cys Asp Gly Ile Val Glu 405 410 415 Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Met Asp Ala Met Ala Gln Ala Asp Ser 420 425 430 Thr Gly Met Phe Ile Cys Pro His Thr Gly Val Ala Leu Thr Ala Leu 435 440 445 Phe Lys Leu Arg Asn Ser Gly Val Ile Gly Pro Asn Asp Lys Thr Val 450 455 460 Val Val Ser Thr Ala His Gly Leu Lys Phe Thr Gln Ser Lys Ile Asp 465 470 475 480 Tyr His Ser Lys Glu Ile Lys Asp Met Glu Cys Arg Phe Ala Asn Pro 485 490 495 Pro Val Glu Val Lys Ala Asp Phe Gly Ser Val Met Asp Val Leu Lys 500 505 510 Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Ala Lys His 515 520 <210> 8 <211> 522 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 8 Met Ala Ala Ser Phe Met Leu Arg Ser Ser Phe Leu Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Gln Leu His His Gln Ser Pro Pro Lys Ser Asn Pro Thr Ile His 20 25 30 Phe Ile Asn Pro Ile Lys Ala Thr Ala Ser Thr Asn Asp Ala Ile Ile 35 40 45 Pro Pro Gln Lys His Arg Arg Pro Ala Asp Glu Asn Ile Arg Glu Glu 50 55 60 Ala Ala Arg Arg Pro Thr Ser Ser His Asn Phe Ser Ala Arg Tyr Val 65 70 75 80 Pro Phe Asn Ala Asp Pro Ser Ser Asp Glu Trp Tyr Ser Leu Asp Glu 85 90 95 Ile Ile Tyr Arg Ser Arg Ser Gly Gly Leu Leu Asp Val Gln His Asp 100 105 110 Met Asp Ala Leu Lys Lys Phe Asp Gly Gln Tyr Trp Arg Ser Leu Phe 115 120 125 Asp Ser Arg Val Gly Lys Thr Thr Trp Pro Tyr Gly Ser Gly Val Trp 130 135 140 Ser Lys Lys Glu Trp Val Leu Pro Glu Ile Asp Ser Asp Asp Ile Val 145 150 155 160 Ser Ala Phe Glu Gly Asn Ser Asn Leu Phe Trp Ala Glu Arg Phe Gly 165 170 175 Lys Gln Phe Leu Gly Met Ser Asp Leu Trp Val Lys His Cys Gly Ile 180 185 190 Ser His Thr Gly Ser Phe Lys Asp Leu Gly Met Thr Val Leu Val Ser 195 200 205 Gln Val Asn Arg Leu Arg Lys Met His Lys Pro Val Val Gly Val Gly 210 215 220 Cys Ala Ser Thr Gly Asp Thr Ser Ala Ala Leu Ser Ala Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ile Pro Ser Ile Val Phe Leu Pro Ala Asn Lys Ile Ser 245 250 255 Met Ala Gln Leu Val Gln Pro Ile Ala Asn Gly Ala Phe Val Leu Ser 260 265 270 Ile Asp Thr Asp Phe Asp Gly Cys Met Gln Leu Ile Arg Glu Val Thr 275 280 285 Ala Glu Leu Pro Ile Tyr Leu Ala Asn Ser Leu Asn Ser Leu Arg Leu 290 295 300 Glu Gly Gln Lys Thr Ala Ala Ile Glu Ile Leu Gln Gln Phe Asp Trp 305 310 315 320 Gln Val Pro Asp Trp Val Ile Val Pro Gly Gly Asn Leu Gly Asn Ile 325 330 335 Tyr Ala Phe Tyr Lys Gly Phe Met Met Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val 340 345 350 Asp Arg Ile Pro Arg Leu Val Cys Ala Gln Ala Ala Asn Ala Asn Pro 355 360 365 Leu Tyr Leu His Tyr Lys Ser Gly Trp Lys Asp Phe Gln Pro Val Lys 370 375 380 Ala Asn Thr Thr Phe Ala Ser Ala Ile Gln Ile Gly Asp Pro Val Ser 385 390 395 400 Ile Asp Arg Ala Val Phe Ala Leu Lys Asn Cys Asp Gly Ile Val Glu 405 410 415 Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Met Asp Ala Met Ala Lys Ala Asp Ser 420 425 430 Thr Gly Met Phe Ile Cys Pro His Thr Gly Val Ala Leu Thr Ala Leu 435 440 445 Phe Lys Leu Arg Asn Ser Gly Val Ile Gly Pro Asn Asp Lys Thr Val 450 455 460 Val Val Ser Thr Ala His Gly Leu Lys Phe Thr Gln Ser Lys Ile Asp 465 470 475 480 Tyr His Ser Lys Glu Ile Lys Asp Met Glu Cys Arg Phe Ala Asn Pro 485 490 495 Pro Val Glu Val Lys Ala Asp Phe Gly Ser Val Met Asp Val Leu Lys 500 505 510 Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Ala Lys His 515 520 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..21 <223> /note = "Description of artificial sequence: Primer" <400> 9 ctgaaatcga cagcgatgat a 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /note = "Description of artificial sequence: Primer" <400> 10 caaccaatag ctaacggagc tt 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /note = "Description of artificial sequence: Primer" <400> 11 gagcatcgtg gaaaaagaag ac 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /note = "Description of artificial sequence: Primer" <400> 12 aagctccgtt agctattggt tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /note = "Description of artificial sequence: Primer" <400> 13 ttgattcacg tgtcggtaag ac 22 <210> 14 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 14 ctgaaatcga cagcgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactctaat ctgttttggg 60 ctgagcgttt tggcaaacag tttctaggca tgagtgactt atgggtaaaa cactgtggaa 120 tcagccatac gggtagtttt aaggatctgg gtatgaccgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccagttgtag gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atccattgta tttttaccag 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccaatagc taacggagct t 351 <210> 15 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 15 ctgaaatcga tagtgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactctaat ctgttttggg 60 ctgagcgttt tggtaaacag tttctaggca tgagtgactt atgggtaaaa cactgtggaa 120 ttagccatac aggtagtttt aaggatctgg gtatgaccgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccggttgttg gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atcgattgta tttttacctg 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccgatagc taacggagct t 351 <210> 16 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 16 ccgaaatcga tagtgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactcaaat cttttttggg 60 ctgagcgttt tggcaaacag tttctaggca tgagtgattt atgggtaaaa cactgtggaa 120 ttagtcatac aggtagtttt aaggatctag gtatgactgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccggttgttg gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atcgattgta tttttacctg 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccgatagc taacggagct t 351 <210> 17 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 17 ccgaaatcga tagtgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactcaaat cttttttggg 60 ctgagcgttt tggcaaacag tttctaggca tgagtgattt atgggtaaaa cactgtggaa 120 ttagtcatac aggtagtttt aaggatctag gtatgactgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccggttgttg gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atcgattgta tttttacctg 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccgatagc taacggagct t 351 <210> 18 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 18 ccgaaatcga tagtgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactcaaat cttttttggg 60 ctgagcgttt tggcaaacag tttctaggca tgagtgattt atgggtaaaa cactgtggaa 120 ttagtcatac aggtagtttt aaggatctag gtatgactgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccggttgttg gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atcgattgta tttttacctg 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccgatagc taacggagct t 351 <210> 19 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> source <222> 1..351 <223> /note = "Description of artificial sequence: RNAi sequence used to silence threonine synthase" <400> 19 ctgaaatcga tagtgatgat attgttagtg cttttgaagg aaactctaat ctgttttggg 60 ctgagcgttt tggtaaacag tttctaggca tgagtgactt atgggtaaaa cactgtggaa 120 ttagccatac aggtagtttt aaggatctgg gtatgaccgt tttggtgagt caagtgaacc 180 ggttaaggaa aatgcataaa ccggttgttg gtgtgggctg tgcttccact ggtgacacgt 240 cagctgcatt gtcagcttac tgtgcatctg cggggattcc atcgattgta tttttacctg 300 caaataagat atctatggcg cagctggtac aaccgatagc taacggagct t 351

Claims (15)

  1. (i) 트레오닌 합성요소를 인코딩하고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 대해 90% 이상의 서열 상동성 또는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에 대해 87% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) (i)에 기재된 상기 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나에 의해 인코딩되는 폴리펩티드; 또는
    (iii) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드; 또는
    (iv) (i)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 세포.
  2. 제1항에 따른 식물 세포를 포함하는 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물.
  3. 적어도 식물의 일부, 바람직하기는 담배 식물에서 유리 메티오닌의 농도를 증가시키기 위한 방법으로서,
    (a) 식물에서 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계로 바람직하기는, 여기서 트레오닌 합성효소는
    (i) 트레오닌 합성효소를 인코딩하고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 대해 90% 이상의 서열 상동성 또는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에 대해 87% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
    (ii) (i)에 기재된 상기 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나에 의해 인코딩되는 폴리펩티드; 또는
    (iii) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 단계;
    (b) 단계 (i)에서 얻은 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 적어도 일부에서 유리 메티오닌의 농도를 측정하는 단계; 그리고
    (c) 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교해서 거기에 유리 메티오닌의 농도가 증가한, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물을 식별하는 단계로, 그리고 여기서 상기 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 시각적 외관은 필드 (field) 이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조식물과 실질적으로 동일한 단계를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 따른 방법에 의해 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 그들로부터 유도되거나 유도될 수 있는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물 또는 식물재료, 바람직하기는 담배 식물 또는 식물재료.
  5. 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물, 바람직하기는 담배 식물로서, 여기서 트레오닌 합성효소의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조 담배 식물과 비교했을 때 트레오닌 합성효소의 발현 또는 그에 의해 인코딩된 단백질의 활성은 감소되고 식물의 일부는 메티오닌 함량이 5% 이상 증가하게 되고 그리고 여기서 에어로졸에서 메티오날의 농도는 대조 식물로부터의 에어로졸과 비교했을 때 5% 이상으로 증가하고, 바람직하기는 여기서 상기 식물의 시각적 외관은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물과 실질적으로 동일하고, 바람직하기는 여기서 상기 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 줄기 높이는 필드 이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물의 줄기 높이와 실질적으로 동일하고 및/또는 상기 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 엽록소 함량은 필드이식 뒤 3개월 또는 토핑 뒤 36일에 대조 식물의 엽록소 함량과 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물, 바람직하기는 담배 식물.
  6. 제5항에 있어서, 식물 일부의 유리 트레오닌 농도는 대조 식물과 비교했을 때 증가되고; 바람직하기는 여기서 (i) 잎에서 유리 메티오닌 농도는 약 0.03 mg/g 이상이고; (ii) 잎에서 유리 트레오닌 농도는 약 0.5 mg/g 이상이고; 그리고 (iii) 가열시 에어로졸에서 메티오날의 농도는 약 2000 μg/g 이상인, 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물.
  7. 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식물로부터 세포 또는 조직을 포함하는 씨.
  8. 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식물로부터의 세포 또는 조직을 포함하는 바이오매스나 잎을 포함하는 식물재료.
  9. 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 식물의 일부 또는 제8항에 따른 식물재료를 포함하는 담배 물품.
  10. (a) 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 비자연적으로 발생하는 돌연변이 또는 형질전환 식물의 일부, 제8항에 따른 식물재료 또는 제9항에 따른 담배 물품을 제공하는 단계; 그리고
    (b) 거기에 열을 제공하는 단계를 포함하는, 메티오날을 제조하기 위한 방법.
  11. (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 포함하는 것으로 예상되는 샘플를 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플를 NtTS 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 특정하게 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 그리고
    (c) 증폭 생성물의 존재를 검출하되, 여기서 증폭 생성물의 존재가 샘플에서 NtTS 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 단계를 포함하는, 샘플에서 NtTS 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 방법.
  12. 트레오닌 합성요소를 인코딩하고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 대해 90% 이상의 서열 상동성을 가지거나 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에 대해 87% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 필수적으로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 기재한 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 인코딩되는, 분리된 폴리펩티드.
  14. SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:8에 대해 95% 이상의 서열 상동성을 가지는, 분리된 폴리펩티드.
  15. 제12항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조체, 벡터 또는 발현 벡터.




KR1020147008615A 2011-09-02 2012-08-31 니코티아나 타바쿰으로부터의 트레오닌 합성효소 및 그의 방법 및 용도 KR102012531B1 (ko)

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