UA116438C2

UA116438C2 - Трансгенна рослина тютюну звичайного з підвищеною концентрацією вільного метіоніну, спосіб її одержання та використання

Info

Publication number: UA116438C2
Application number: UAA201403275A
Authority: UA
Inventors: Люсьєн Бове; Ніколас Сьєрро
Original assignee: Філіп Морріс Продактс С.А
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2018-03-26
Also published as: AU2012301350B2; US20150106971A1; KR20140057642A; EP2565271A1; IL231100B; MX362700B; KR102012531B1; AU2012301350A1; BR112014004641A2; JP6225108B2; ES2685797T3; IL231100A0; EP2751273A1; BR112014004641B1; EP2751273B1; MY172266A; RU2014112759A; SG11201400216VA; RU2689719C2; EP3395948A1

Abstract

Винахід належить до способу отримання рослини тютюну з підвищенною концентрацією вільного метіоніну порівняно з тютюном дикого типу, який включає зниження експресії або активності треонінсинтази у рослині тютюну шляхом введення в рослину полінуклеотиду, який проявляє активнісгь РНК-інтерференції проти мРНК треонінсинтази, вимірювання концентрації вільного метіоніну принаймні у частині трансгенної рослини, та ідентифікацію трансгенної рослини, в якій концентрація вільного метіоніну підвищилася порівняно з рослиною дикого типу, в якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена, і де зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким, як і зовнішній вигляд рослини дикого типу через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

Description

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід описує ген треонінсинтази тютюну звичайного (Місоїйапа їабасит) та його варіанти, гомологи та фрагменти. Зокрема, описується модифікація експресії цього гену або активність білка, кодованого таким чином, з метою підвищення рівнів вільного метіоніну у рослинах, таких як рослини тютюну. Винахід може використовуватися для створення бажаних смаків та ароматів тютюну шляхом підвищення в ньому рівнів метіоналу.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Посилення смаку, наприклад, речовин, що виробляють аромат, в тютюні може генерувати бажаний смак під час паління тютюну. Такі ароматизатори можуть бути отримані, наприклад, з амінокислот, які піддаються реакціям Майяра. Метіонал (3-(метилтіо)пропанал) є ароматичною сполукою, яка відповідає за аромат "печеної картоплі". Отримання метіоналу може бути індуковане термічно, якщо метіонал походить від метіоніну і похідних метіоніну. Розщеплення за

Штрекером метіоніну включає в себе взаємодію з альфа-дикарбонільними сполуками, які є проміжними у реакціях Майяра, і призводить до утворення метіоналу. Були розроблені різні способи збільшення кількості вільного метіоніну в рослинах, наприклад, екзогенні амінокислоти можуть додаватися до рослин. Проте, використання екзогенно-доданих амінокислот призводить до значного збільшення вартості виробництва, а також виникнення проблем, пов'язаних з безпекою та нормативними вимогами.

Біосинтез метіоніну і треоніну обидва пов'язані зі шляхом метаболізму аспартату. У рослин, їх біосинтетичні шляхи метаболізму розходяться на рівні О- фосфогомосеріну (ОРІ). Ферменти цистатіонін гамма-синтази (СО5) і треонінсинтази (Т5) конкурують за загальний субстрат О- фосфогомосеріну. Рівні вільного метіоніну можуть бути потенційно підвищені шляхом надекспресування або інгібування експресії ферментів, залучених до біосинтетичного шляху метаболізму аспартату.

Один з можливих підходів полягає в надекспрессуванні цистатіонін гамма-синтази. Інший підхід полягає в зниженні експресії треонінсинтази. Проте, на сьогоднішній день всі ці зусилля, спрямовані на зміну генів треонінсинтази, призвели до отримання фенотипів, які негативно впливали на усю рослину. Вапіет еї аї. (2000) Ріапі РНузіої!., 2000, 123:101-110) описує мутації гену треонінсинтази рослини Арабідопсису (Агабідорві5). Описані мутанти, які несуть точкову

Зо парну мутацію всередині гену, що кодує треонінсинтазу, виявляють надмірне накопичення метіоніну і помітно знижений рівень треоніну. Проте, описані мутанти Арабідопсису страждали від сповільненого росту порівняно із диким різновидом. Затримка росту може бути виправлена тільки після додаванні треоніну або ізолейцину. 7ей еї аї. (2001) Ріапі РНузіої!., 2001, 127:792- 802 описує трансгенні рослини картоплі, підготовлені за допомогою антисенсового трансгенного підходу з використанням конститутивного промотору 355 вірусу мозаїки цвітної капусти. Хоча описані трансгенні рослини картоплі виявили високі рівні метіоніну, вони також страждали від сповільненого росту порівняно із рослинами дикого різновиду.

Амгапат еї аї. (2005) Тктапздепіс Незеагсі, 2005, 14: 299-311 описує трансгенні рослини

Арабідопсису, підготовлені за допомогою антисенсового трансгенного підходу. Попри те, що описані трансгенні рослини виявили підвищений рівень метіоніну, вони страждали від виражених аномальних фенотипів, включаючи значну затримку росту, розетку листя зменшеного розміру і хлорозне листя.

Існує потреба для рослин, наприклад, рослин тютюну, у поєднанні підвищеного рівня вільного метіоніну при збереженні певних агрономічних бажаних властивостей, таких як швидкість росту і загального розміру рослин, без необхідності додавання будь-яких екзогенних речовин. Ціль даного винаходу - задовольнити цю потребу.

АСПЕКТИ І ВАРІАНТИ ВТІЛЕННЯ ВИНАХОДУ

Даний винахід грунтується, принаймні частково, на відкритті того факту, що зниження (наприклад, інгібування) експресії треонінсинтази або її активності у рослинах або рослинних клітинах, наприклад, тютюнових рослинах або рослинних клітинах, призводить до підвищення концентрації метіоніну, у рослинних клітинах або одній, або більше частинах рослини в порівнянні з контрольною рослиною або рослинною клітиною. Несподівано виявилося, що генетично модифікована рослина не виявляє жодної зміни у своєму загальному зовнішньому вигляді у порівнянні з контрольною рослиною. Це відкриття є несподіваним з урахуванням різних побічних фенотипів, які спостерігаються у трансгенних рослинах Арабідопсису або картоплі. Відкриття може з успіхом використовуватися, оскільки рослини використовуються для комерційного виробництва різних продуктів, включаючи тютюн, де зміни зовнішнього вигляду будуть або не прийнятними для промисловості, або можуть призвести до неприйнятного зниження продуктивності. Додавання екзогенної амінокислоти також є непотрібним. Крім того, бо аерозоль, який вивільняється при нагріванні тютюну, містить підвищений рівень метіоналу в порівнянні з тютюном, отриманим з контрольних рослин. Збільшення метіоналу в димі або аерозолю створює бажаний смак, аромат, або як смак, так і аромат при використанні тютюну.

Аспекти і варіанти втілення даного винаходу викладені у формулі винаходу, що додається.

В одному аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 90 95 ідентичність послідовності з зФЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 3.

В іншому аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 87 95 ідентичність послідовності з «ФЕО ІЮ МО: 4 або 5ЕО ІО МО: 5.

У ще одному аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 70 95, 75 95, 80 Фо, 85 У, 90 95, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ

МО: 20.

В іншому аспекті, пропонується ізольований поліпептид, який кодується будь-яким з полінуклеотидів за даним винаходом.

В іншому аспекті, пропонується ізольований поліпептид, що має принаймні 95 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО:7 або 5ЕО ІЮО МО: 8.

В іншому аспекті, пропонується ізольований поліпептид, що має принаймні 70 95, 75 905, 80 Фо, 85 У, 90 95, 95 Фо, 96 95, 97 Фо, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ

МО 21.

В іншому аспекті, пропонується конструкція, вектор або вектор експресії, які містять будь- який один (наприклад, один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше) з полінуклеотидів за даним винаходом.

В іншому аспекті, пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослинна клітина, що містить принаймні один (наприклад, один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше) з полінуклеотидів, або принаймні один (наприклад, один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше) з поліпептидів. В іншому аспекті, пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, що містить рослинну клітину за даним винаходом. Відповідно, експресія однієї або більше кодувальних послідовностей треонінсинтази або активність білків треонінсинтази, кодованих таким чином, знижується, і частина рослини тютюну має збільшення вмісту метіоніну принаймні на 5 95 порівняно з контрольною рослиною тютюну, у якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена, або де концентрація метіоналу в диму або аерозолі підвищується принаймні на 5 95 порівняно з димом або аерозолем від контрольної рослини тютюну.

Ще один аспект відноситься до способу підвищення концентрації метіоніну в принаймні частині рослини тютюну, що включає наступні стадії: (ї) зниження експресії або активності однієї або більше треонінсинтази (наприклад, дві або більше, три або більше, чотири або більше) у рослині тютюну, переважно, у якій треонінсинтаза включає в себе полінуклеотидну послідовність або поліпептидну послідовність, описані тут; (ії) вимірювання концентрації метіоніну принаймні у частині мутантної, що не зустрічається в природі, або у трансгенної рослини тютюну, отриманої на стадії (і); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини тютюну, в якій концентрація метіоніну підвищилася порівняно з контрольною рослиною. Переважно, загальний зовнішній вигляд мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини тютюну по суті є подібним до контрольної рослини тютюну після певного періоду часу, наприклад, через три місяці після пересаджування у поле, або 36 днів після прищипування верхівки.

В одному варіанті, додавання екзогенних поживних речовин, таких як амінокислоти, наприклад, треоніну та/або ізолейцину, є непотрібним.

В іншому аспекті, пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина тютюну, або тютюновий рослинний матеріал, похідний або який може бути похідним від них, що був отриманий або може бути отриманий за допомогою зазначеного способу.

В іншому аспекті, також пропонується мутантна, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина тютюну, в якій експресія однієї або більше кодувальних послідовностей треонінсинтази (наприклад, дві або більше, три або більше, чотири або більше) або активність білка треонінсинтази, кодованого таким чином, знижується, і частина рослини тютюну має збільшення вмісту метіоніну принаймні на 5 95 порівняно з контрольною рослиною тютюну, в якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена, або де концентрація метіоналу в диму або аерозолі підвищується принаймні на 595 порівняно з димом або аерозолем від контрольної рослини тютюну.

Відповідно, загальний зовнішній вигляд зазначеної рослини по суті є подібним або візуально не відрізняється від зовнішнього вигляду контрольної рослини через певний період часу, наприклад, але не обмежуючись, через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки. Переважно, (ї) висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин тютюну по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин тютюну через певний період часу, наприклад, але не обмежуючись, через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки; (ії) вміст хлорофілу в мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах тютюну по суті є таким же, що і вміст хлорофілу в контрольних рослинах тютюну через певний період часу, наприклад, але не обмежуючись, через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки; або мають місце обидва пункти (Її) та (ії).

Відповідно, концентрація треоніну в частині рослини (наприклад, листі) підвищується в порівнянні з контрольною рослиною, і переважно, де (а) концентрація метіоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 0,03 мг/г, (б) концентрація треоніну в листі становить принаймні 0,5 мг/г, (с) концентрація метіоналу в диму або аерозолі при нагріванні становить принаймні близько 2000 мкг/г, або є комбінацією з двох або більше (а), (Б) і (с).

Також пропонуються біомаса, насіння або листя, які містять клітини або тканини від мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, описаних тут. Також пропонується тютюнова продукція, яка містить частину мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, її біомасу, або її листя, або їх комбінацію, як описано тут.

У ще одному аспекті пропонується спосіб отримання метіоналу, який включає в себе наступні стадії: (а) забезпечення частини мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини тютюну; біомаси, насіння або листя; або тютюнової продукції, описаної тут, та (Б) її нагрівання.

У ще одному аспекті, запропоновано спосіб ідентифікації тютюнового матеріалу, який вивільняє підвищені рівні метіоналу в аерозоль при нагріванні, що включає в себе стадії: (а) отримання зразка тютюнового матеріалу, (б) визначення профілю молекулярної маси зразка, і (с) порівняння профілю молекулярної маси при одному або більше співвідношеннях маси/наповнення; де підвищення співвідношення питомої маси/наповнення в порівнянні з контрольною рослиною вказує на те, що рівні метіоналу в аерозолі будуть підвищеними.

Тютюновий матеріал, ідентифікований або який може бути ідентифікованим за допомогою цього способу також пропонується в подальшому аспекті даного винаходу.

Подальші аспекти даного винаходу викладені нижче.

Химерний ген, який містить полінуклеотид, функціонально пов'язаний з однією або більше регуляторними послідовностями.

Полінуклеотидна конструкція МЕТ5, яка містить, складається або складається по суті з принаймні 15-30 нуклеотидів, 30-50 нуклеотидів, 50-100 нуклеотидів, 100-150 нуклеотидів, 150- 200 нуклеотидів, 200-300 нуклеотидів, 300-400 нуклеотидів, 400-500 нуклеотидів, 500-600 нуклеотидів або 600-700 нуклеотидів.

Витратний матеріал, який включає в себе або використовує рослинний матеріал, біомасу, насіння або листя за даним винаходом.

Лінія клітин, що включає в себе (наприклад, один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше) ізольований полінуклеотид, химерний ген, полінуклеотидну конструкцію, дволанцюгову РНК, кон'югат або вектор експресії, тощо за даним винаходом.

Спосіб модуляції експресії ДНК МЕТ5 або активності білка, кодованого таким чином у клітині, причому зазначений спосіб включає в себе введення (наприклад, одного або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше) химерного гену, полінуклеотидної конструкції, дволанцюгової РНК, кон'югату або вектору експресії за даним винаходом.

Спосіб виявлення, ізолювання, ампліфікації або аналізу полінуклеотиду МЕТ5, причому спосіб включає в себе стадію забезпечення зразка, що містить полінуклеотид, і гібридизацію зазначеного полінуклеотиду у полінуклеотидну молекулу, що включає в себе нуклеотидну послідовність принаймні 10 суміжних нуклеотидів від ізольованої нуклеотидної послідовності за даним винаходом.

Використання агента, який модулює експресію ДНК МІТ5 і активність білка, кодованого таким чином, або активність білка, кодованого таким чином для зниження вмісту метіоніну принаймні у частині рослини принаймні на 5 95 порівняно з контрольною рослиною.

Спосіб або використання за даним винаходом, в якому агент являє собою або є похідним від

ДНК МО5, химерного гену МІ/Т5, полінуклеотидної конструкції, що містить полінуклеотид МЕТ5, 60 антисенсову РНК, дволанцюгову РНК, кДНК, кон'югат, що включає полінуклеотид МЕТ5, і принаймні один ненуклеотидний або неполінуклеотидний фрагмент, ковалентно-приєднаний до нього, рибозим, мутаген, цинковий палець, невелику молекулу або мегануклеазу.

В іншому варіанті, полінуклеотидний фрагмент (фрагменти) кодує антисенсову нуклеїнову кислоту, рибозим, РНК, що впливає на опосередкований сплайсосомою транс-сплайсинг, інтерферуючу РНК (РНКІ), гідову РНК, або іншу нетрансльовану РНК, тощо. В іншому варіанті, полінуклеотидний фрагмент (фрагменти) кодує РНКІ.

У ще одному аспекті, пропонується спосіб отримання тютюнової продукції, що включає в себе стадії: (а) отримання насіння від мутантної, що не зустрічаються в природі, або трансгенної рослини тютюну, (Б) посів та вирощування насіння для отримання рослини; (с) збір рослини, і (4) отримання тютюнової продукції із зібраної рослини.

Вищезазначені варіанти описані як варіанти кожного з аспектів, описаних вище.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

Фігура 1 ілюструє профілі рідинної хроматографії з мас-спектрометрією (РХ-МС) обробленого листя МС-4, ТМ90-4, МЕТ51-3, МІТ52-3, МІТ53-2, після екстракції метанолом і розділення на колонці УмМаїег5ХВгідде Зпієїй КРІ8. МС-4 є тільки векторною контрольною рослиною; ТМ90О є немодифікованою рослиною тютюну, що забезпечує фон; МЕГ51-3, МИ 52-3 і

МІТ53-2 є рослинами Тютюну звичайного (Місоїйапе Табасит), які мають підданий сайленсінгу ген треонінсинтази РНКІ. Стрілками показані піки приблизно на 5, 9 17 і 19 хвилинах.

ВИЗНАЧЕННЯ

Технічні терміни та вирази, які використовуються в об'ємі цієї заявки, як правило, мають значення, що зазвичай застосовуються до них у галузі рослинної та молекулярної біології.

Визначення усіх наступних термінів застосовуються до усього змісту цієї заявки. Слово "містить" не виключає інші елементи або стадії, а також однина не виключає множини. Одна стадія може виконувати функції кількох ознак, перерахованих у формулі винаходу. Терміни "близько", "по суті" і "приблизно" у контексті даного нумерованого значення або діапазону відносяться до значення або діапазону, що знаходяться в межах 20 95, в межах 10 95, або в межах 5 95, 4 95,

З У, 2 У або 1 95 від заданого значення або діапазону.

Термін "їзольований" відноситься до будь-якого об'єкту, взятого з його природного середовища, але цей термін не означає будь-якого ступеню очищення.

Зо "Вектор" відноситься до транспорту нуклеїнової кислоти, що містить комбінацію компонентів нуклеїнової кислоти для забезпечення транспортування нуклеїнової кислоти, конструкцій нуклеїнової кислоти і кон'югатів нуклеїнової кислоти, тощо. Відповідні вектори включають епісоми, здатні до екстра-хромосомної реплікації, такі як плазміди кільцевих, дволанцюгових

ДНК; плазміди лінеаризованих дволанцюгових ДНК; та інші вектори будь-якого походження. "Вектор експресії" являє собою транспорт нуклеїнової кислоти, що містить комбінацію компонентів ДНК для забезпечення експресії нуклеїнової кислоти, конструкцій нуклеїнової кислоти і кон'югатів нуклеїнової кислоти, тощо. Відповідні вектори включають епісоми, здатні до екстра-хромосомної реплікації, такі як плазміди кільцевих, дволанцюгових ДНК; плазміди лінеаризованих дволанцюгових ДНК; та інші функціонально еквівалентні вектори експресії будь- якого походження. Вектор експресії містить принаймні промотор, розташований попереду і функціонально пов'язаний з нуклеїнової кислотою, конструкціями нуклеїнової кислоти або кон'югатом нуклеїнової кислоти, як визначено нижче.

Термін "конструкція" відноситься до фрагменту дволанцюгової, рекомбінантної ДНК, що містить один або більше полінуклеотидів. Конструкція включає в себе "матричний ланцюг" основу, спарений з комплементарним "сенсовим або кодуючим ланцюгом". Дана конструкція може бути вставлена у вектор, в двох можливих орієнтаціях, або в аналогічній (чи сенсовій) орієнтації, або у зворотній (чи антисенсовій) орієнтації по відношенню до орієнтації промотору, розташованого всередині вектора, наприклад, вектора експресії. "Промотор" відноситься до елемента / послідовності нуклеїнової кислоти, зазвичай розташованих попереду і функціонально пов'язаних з фрагментом дволанцюгової ДНК.

Промотори можуть бути отримані повністю з ділянок поблизу нативного гену, що представляє інтерес, або можуть складатися з різних елементів, отриманих від різних нативних промоторів або сегментів синтетичної ДНК.

Терміни "гомологія, ідентичність чи схожість" відносяться до ступеня схожості послідовностей між двома поліпептидами або між двома молекулами нуклеїнової кислоти в порівнянні з вирівнюванням послідовностей. Ступінь гомології між двома дискретними послідовностями нуклеїнових кислот, що порівнюються, є функцією числа ідентичних або комплементарних нуклеотидів у порівнянних позиціях. Відсоток ідентичності може бути визначений шляхом візуального огляду і математичних розрахунків. Альтернативно, відсоток 60 ідентичності двох послідовностей нуклеїнових кислот може бути визначений шляхом порівняння інформації про послідовність за допомогою комп'ютерної програми, такої як Сіивіа!МУу, ВІ АТ,

ЕА5ТА або 5тіййп-У/аіептап.

Термін "рослина" відноситься до будь-якої рослини на будь-якій стадії її життєвого циклу або розвитку, і її нащадків. В одному варіанті винаходу, рослина є рослиною тютюну, яка відноситься до рослини, що належать до роду Місопапа. Переважні види, культурні сорти, гібриди та сорти рослин тютюну описані тут. "Рослинна клітина" відноситься до структурної та фізіологічної одиниці рослини. Рослинна клітина може бути у формі протопласта без клітинної стінки, ізольованої окремої клітини або культивованої клітин, або як частина вищої організованої одиниці, такої як, але не обмежуючись, рослинної тканини, рослинного органу або всієї рослини.

Термін "рослинний матеріал" відноситься до будь-якої твердої, рідкої або газоподібної композиції, або їх комбінації, що може бути отримана від рослини, в тому числі біомаси, листя, листової пластинки, головної жилки, стебла, коріння, квітів або частини квітки, фруктів, пилку, сім'ябруньки, зиготи, насіння, живця, секреції, екстрактів, культури клітин або тканин, або будь- яких інших частин або продуктів рослини. В одному варіанті, рослинний матеріал містить або складається з біомаси, насіння або листя. В іншому варіанті, рослинний матеріал містить або складається з листя.

Термін "сорт" відноситься до популяції рослин, які поділяють постійні характеристики, що відрізняють їх від інших рослин того ж виду. Володіючи однією або кількома відмінними рисами, сорт додатково характеризується дуже незначною загальною відмінністю між окремими рослинами в межах цього сорту. Сорт часто продається на комерційній основі.

Термін "лінія" або "селекційна лінія", як використовується тут, позначає групу рослин, які використовуються для селекції рослин. Лінія відрізняється від сорту, оскільки вона виявляє незначну відмінність між індивідуальними рослинами стосовно однієї або кількох ознак, що представляють інтерес, хоча може бути певна відмінність між індивідуальними рослинами щодо інших ознак.

Термін "знизити" або "знижений", як використовується тут, відноситься до зниження від близько 10 95 до близько 99 95, від близько 10 95 до близько 95 95 або менше, від близько 10 95 до близько 90 95 або менше, або зниження принаймні на 10 95, принаймні на 20 95, принаймні на 25 95, принаймні на 30 95, принаймні на 40 95, принаймні на 50 95, принаймні на 60 95, принаймні на 7095, принаймні на 7595, принаймні на 80 95, принаймні на 90 95, принаймні на 95 95, принаймні на 98 95, принаймні на 9995, або принаймні на 100 95 або більше кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та/або експресії білка.

Термін "інгібування" або "Іінгібований", як використовується тут, відноситься до зниження від близько 98 95 до близько 100 95, або до зниження принаймні на 98 95, принаймні на 99 95, але особливо на 100 95, кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та/або експресії білка.

Термін "підвищення" або "підвищений", як використовується тут, відноситься до підвищення від близько 10 95 до близько 99 95, або підвищення принаймні на 10 95, принаймні на 20 95, принаймні на 25 95, принаймні на 30 95, принаймні на 40 95, принаймні на 50 95, принаймні на 60 95, принаймні на 70 95, принаймні на 75 95, принаймні на 80 95, принаймні на 90 95, принаймні на 95 95, принаймні 98 95, принаймні на 99 95, або принаймні на 100 95, 200 95, 300 9», 400 95 або 500 95 або більше кількості або активності, наприклад, але не обмежуючись, поліпептидної активності, транскрипційної активності та/або експресії білка.

Термін "контрольний" у контексті контрольної рослини або контрольної рослинної клітини означає рослину або рослинні клітини, в яких експресія або активність треонінсинтази не була змінена (наприклад, підвищена або знижена), і таким чином, вона може забезпечити порівняння з рослиною, в якій експресія або активність треонінсинтази була змінена. Контрольна рослина може містити порожній вектор. Контрольна рослина може відповідати рослині дикого типу.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС

В одному аспекті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, та має принаймні 60 95 ідентичність послідовності із будь-якими з описаних тут послідовностей, включаючи будь-який з полінуклеотидів, представлених у переліку послідовностей. Відповідно, ізольовані полінуклеотиди містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що має принаймні 60 то, 61 зо, 62 то, 63 то, 64 то, 65 то, 66 то, 67 то, 68 то, 69 то, 70 о, 75 о, 80 то, 85 то, 87 90, 88 95, 89 965, 9090, 91 90, 9295, 9395, 94 965, 9595 96 96, 97 Уо, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з нею.

В одному варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 90 95 ідентичність послідовності з БЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 3.

Відповідно, ізольовані полінуклеотиди містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що має принаймні 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95, 99 96 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІЮ МО: 3. 5ЕО І МО: 1 являє собою послідовність ДНК треонінсинтази від М. їарасит. 5ЕБО ІО МО: 2 являє собою послідовність ДНК треонінсинтази, ампліфіковану зворотною транскриптазою (3Т)-ПЛР від ізольованої РНК від М. їарасит (сорт НісКке5 Вгоай І єаї) і яку піддали секвенуванню. Ця послідовність є наявною в одному з двох предків М. їарасит, , Місойапа 5уїмевзігіє, про що свідчить аналіз полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР). 5ЕО І

МО: З являє собою послідовність ДНК треонінсинтази, ампліфіковану ЗТ-ПЛР від РНК, ізольованої від М. їабасит, (сорт Ніск5 Вгоаай ГІ вай).

В іншому варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, що кодує треонінсинтазу і має принаймні бо оо, 65 95, 70 бо, 75 Уо, 80 о, 85 о, 86 95, 87 90, 88 Фо, 89 Фо, 90 Фо, 91 9, 92 90, 93 Фо, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 925, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 4 або 5ЕО ІЮО МО: 5.

ЗЕО ІЮ МО: 4 відповідає послідовності геномної ДНК 5ЕО ІЮ МО: 3. У порівнянні з БЕО ІЮ МО: 1 інтрон 137 рр знаходиться у положенні 234 від стартового кодону АТО. Послідовність 560 ІЮ

МО: 5 відповідає послідовності геномної ДНК треонінсинтази від М. Юютепіовіїоптів.

В іншому варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотидної послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 60 95, 65 в, 70 У, 75 У, 80 95, 85 95, 86 90, 87 95, 88 95, 89 96 або 90 95 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО: 20. Відповідно, ізольовані полінуклеотиди містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що має принаймні 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 9о, 96 95, 97 У, 98 925, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 20. 5ЕО ІЮО МО: 20 являє собою послідовність ДНК треонінсинтази від М. їабасит, і має 8595 ідентичність послідовності з 5ЕО ІЮО МО: 1, 8695 ідентичність послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 2, і 86 95 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО:3.

Термін "полінуклеотид МЕТ5" відноситься до полінуклеотидів, що кодують треонінсинтазу від

Місоїйапа іїабасит, які містять, складаються або складаються по суті з полінуклеотидів із істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або істотною ідентичністю з ЗЕО ІЮО МО: 1,

ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕБЕО ІЮО МО: 3, 5ЕБЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 20; фрагментів полінуклеотиду МЕТ5, включаючи фрагменти 5ЕО І МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 4 ЗЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 20; і фрагментів БЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3,

ЗЕБЕО ІЮ МО: 4, 5БО ІЮ МО: 5 або 5БО ІЮ МО: 20 з істотною гомологією (тобто, схожістю послідовності) або з істотною ідентичністю з ними, які мають принаймні близько 60 95, 65 95, 70 96, 75 90, 80 Фо, 85 9о, 87 Фо, 88 9о, 89 Фо, 90 9о, 91 Фо, 92 95, 93 о, 94 95, 95 Фо 96 9, 97 Фо, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з відповідними фрагментами ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ

МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 20. Приклади фрагментів представлені в 5ЕО ІЮ МО 9-19. Як описано вище, варіант може мати принаймні близько 60 95, 65 96, 70 96, 75 Фо, 80 Фо, 85 о, 86 95, 87 Фо, 88 9о, 89 Фо, 90 9, 91 Фо, 92 95, 93 Фо, 94 95, 95 95 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮО МО: 2,

ЗЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО І МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 20. Полінуклеотид МЕТ5 також включає послідовності, що містять достатню або істотну ступінь ідентичності або схожості з

ЗЕО ІЮ МО: 1, 5БЕО ІЮО МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 20 для кодування поліпептиду, який функціонує як треонінсинтаза. В одному варіанті, термін "полінуклеотид МІТ5" відноситься до полімеру нуклеотидів, який містить, складається або складається по суті з полінуклеотиду, позначеного тут як 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО І

МО: 3, ЗЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 20.

Термін "полінуклеотид" відноситься до полімеру нуклеотидів, який може бути немодифікованою або модифікованою дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК), або рибонуклеїновою кислотою (РНК). Відповідно, полінуклеотид може бути, без обмеження, геномною ДНК, комплементарною ДНК (кКДНК), мРНК або антисенсовою РНК або їх фрагментом (фрагментами). Крім того, полінуклеотид може бути одноланцюговою або дволанцюговою ДНК,

ДНК, що являє собою суміш одноланцюгових і дволанцюгових ділянок, гібридною молекулою, що містить ДНК і РНК, або гібридною молекулою із сумішшю одноланцюгових і дволанцюгових ділянок або її фрагменту (фрагментів).

Полінуклеотид, як описано тут, зазвичай містить фосфодіефірні зв'язки, хоча в деяких 60 випадках, включені аналоги полінуклеотидів, які можуть мати альтернативні кістяки, що б включають, наприклад, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфородітіоат, або -(о- метилфосфороамідитні зв'язки, і пептид полінуклеотидні кістяки і зв'язки. Інші аналогічні полінуклеотиди включають в себе полінуклеотиди з позитивними кістяками; неіонні кістяки і не- рибозні кістяки. Модифікації рибозофосфатного кістяка можуть бути виконані з різних причин, наприклад, для підвищення стабільності і періоду напіврозпаду таких молекул у фізіологічних середовищах або як зонди на біочипі. Можуть бути отримані суміші полінуклеотидів, що зустрічаються в природі, і аналогів; альтернативно, можуть бути отримані суміші різних аналогів полінуклеотидів, і суміші полінуклеотидів, що зустрічаються в природі, і аналогів.

Різноманітні аналоги полінуклеотидів є відомими, включаючи, наприклад, фосфорамідат, фосфоротіоат, фосфородітідсат, або О-метилфосфороамідитні зв'язки, і пептидні полінуклеотидні кістяки і зв'язки. Інші аналогічні полінуклеотиди включають в себе полінуклеотиди з позитивними кістяками; неїіонні кістяки і не-рибозні кістяки. Полінуклеотиди, що містять один або більше карбоциклічних цукрів, також включені.

Інші аналоги полінуклеотидів включають пептидні нуклеїнові кислоти (РМА), що є пептидними аналогами полінуклеотидів. Ці кістяки є по суті неіонними в нейтральних умовах, на відміну від високозарядженого фосфодіефірного кістяка полінуклеотидів, що зустрічаються в природі. Це може призвести до отримання переваг. По-перше, кістяк РМА може виявляти покращену кінетику гібридизації. РМА мають більші зміни температури плавлення (Тт) для пар основ нуклеотидів, з порушеною комплементарністю, в порівнянні з абсолютно комплементарними парами основ. ДНК і РНК зазвичай мають 2-4"С зниження Тт для внутрішнього порушення комплементарності. З кістяком неіїонної РМА зниження становить ближче до 7-9 "С. Аналогічно, внаслідок своєї неіонної природи, гібридизація основ, з'єднаних з цими кістяками, є відносно нечутливою до концентрації солі. Крім того, РМА може не деградувати або деградувати меншою мірою клітинними ферментами, і, таким чином, може бути більш стабільною.

Серед способів використання описаних полінуклеотидів і комбінацій їх фрагментів, слід зазначити використання фрагментів як зондів при виконанні аналізу гібридизації нуклеїнової кислоти або як праймерів при виконанні ампліфікаційного аналізу нуклеїнової кислоти. Такі фрагменти зазвичай включають, принаймні, близько 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20

Зо або більше суміжних нуклеотидів послідовності ДНК. В інших варіантах, фрагмент ДНК містить, принаймні, близько 10, 15, 20, 30, 40, 50 або 60 або більше суміжних нуклеотидів послідовності

ДНК. Таким чином, в одному аспекті, також пропонується спосіб виявлення полінуклеотидів

МЕТ5, який включає в себе використання зондів та/або праймерів. Приклади праймерів наведені в послідовностях ЗЕО 10 МО: 10-14. Необов'язково, зазначені праймери можуть використовуватися як зонди. ілюстративні праймери або зонди можуть гібридизуватися у ділянках, що є гомологічними між ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 і З або ЗЕО ІО МО: 20. Ілюстративні праймери або зонди можуть гібридизуватися з нуклеотидами 1-46 послідовностей 5ЕО ІЮО МО: 1,2 ї 3; нуклеотидами 1-52 послідовності БЕО ІЮО МО: 20; нуклеотидами 99-141 послідовності БЗЕО ІЮ

МО: 1; нуклеотидами 102-144 послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 2 і БЕО ІЮО МО: 3; нуклеотидами 102- 153 послідовності зЕО ІЮ МО: 20; нуклеотидами 1325-1362 послідовностей ЗБЕО ІЮО МО: 1,2 і З; або нуклеотидами 1334-1371 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 20.

Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, та рекомендації щодо розробки відповідних умов описуються бБатргооК, )., Е. Р. Епївсй, апа Т. Мапіаїів (1989,

Моїіесшаг СіІопіпа: А І арогаюгу Мапиаї, Соїа 5ргіпу Нагбог І арогаїюгу Ргезз, Соїй бргіпа Нагбог,

М.М.). Використовуючи знання про генетичний код в поєднанні з амінокислотними послідовностями, описаними тут, можуть бути отримані набори вироджених олігонуклеотидів.

Такі олігонуклеотиди можуть використовуватися як праймери, наприклад, у полімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР), в результаті яких фрагменти ДНК ізолюються і ампліфікуються. У деяких варіантах, вироджені праймери можуть використовуватися як зонди для генетичних

БО бібліотек. Такі бібліотеки будуть включати в себе, але не обмежуються, бібліотеки кКДНК, геномні бібліотеки, і навіть електронні Е5Т (маркери експресованої послідовності) або бібліотеки ДНК.

Гомологічні послідовності, визначені цим способом, потім будуть використовуватися як зонди для визначення гомологів послідовностей М(Т5, визначених тут.

Також потенційне використання полінуклеотидів і олігонуклеотидів (наприклад, праймерів або зондів), які гібридизують в умовах зниженої жорсткості, як правило, помірно жорстких умовах, і зазвичай дуже жорстких умовах з полінуклеотидом МІТ5, як описано тут. Основні параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, та рекомендації щодо розробки відповідних умов наведені Затьгоок еї аї!. (1989, МоїІесшіаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї, Соїй

Зргіпд Натог, М.У.), і можуть бути легко визначені середнім фахівцем у даній галузі техніки на 60 основі, наприклад, довжини або базової композиції полінуклеотиду.

Один зі шляхів досягнення помірно жорстких умов включає в себе використання розчину для попереднього промивання, що містить 5х стандартний цитрат натрію, 0,5 95 додецилсульфат натрію, 1,0 мМ етилендіамінтетраоцетової кислоти (рН 8,0), буферний розчин для гібридизації близько 50 96 формаміду, бх стандартний цитрат натрію і має температуру гібридизації близько 55 "С (або інші подібні розчини для гібридизації, такі як розчин, що містить близько 50 95 формаміду, з температурою гібридизації близько 42 "С), і умови для промивання близько 60 "С, у 0,5 х стандартному цитраті натрію, 0,1 95 додецилсульфату натрію. Як правило, дуже жорсткі умови визначені як умови гібридизації, як описані вище, але з промиванням приблизно при 68 "С, 0,2 х стандартним цитратом натрію, 0,1 95 додецилсульфату натрію. 55РЕ (1 х 55РЕ являє собою 0,15 М хлориду натрію, 10 мМ фосфату натрію, і 1,25 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти, рН 7,4) може бути замінений на стандартній цитрат натрію (1 х стандартний цитрат натрію являє собою 0,15 М хлориду натрію і 15 мМ цитрату натрію) у буферних розчинах для гібридизації та промивання; промивання виконуються протягом 15 хвилин після завершення гібридизації. Слід розуміти, що температура промивання і концентрація солей у промивальному розчині можуть регулюватися за необхідності, щоб досягти бажаного ступеня жорсткості із застосуванням основних принципів, які регулюють реакції гібридизації і стабільність дуплексу, що є відомими фахівцям в даній галузі, і описані нижче (див., наприклад, бЗатбгооК єї аїЇ., взирга) При гібридизації полінуклеотиду з полінуклеотидом-мішенню з невідомою послідовністю, за гібридну довжину береться довжина полінуклеотиду, що гібридизує. При гібридизації полінуклеотидів з відомою послідовністю, гібридна довжина може бути визначена шляхом вирівнювання послідовностей полінуклеотидів та ідентифікації ділянки чи ділянок оптимальної комплементарності послідовності. Температура гібридизації для гібридів, що, як передбачається, будуть мати менше, ніж 50 пар основ у довжину, має становити від 5 до 10 "С менше, ніж температура плавлення (ТТ) гібрида, де Тт, визначається відповідно до наступних рівнянь. Для гібридів, що мають у довжину менше 18 пар основ, Тт (С) - 2 (кількість основ А ж Т) 4 (кількість основ С). Для гібридів, що мають у довжину понад 18 пар основ, Тт ("С) - 81,54-16,6 (логарифм 10 ІМахж|) 0,41 (95 С) - (60О0/М), де

М - це кількість основ у гібриді, і (Махж| означає концентрацію іонів натрію у буферному розчині для гібридизації (Мак для 1х стандартного цитрату натрію -0,165 М). Як правило, кожен такий

Зо гіоридизуючий полінуклеотид має довжину, яка принаймні становить 2595 (як правило, принаймні, 50 95, 60 95 або 70 95 і найчастіше принаймні 80 95) від довжини полінуклеотиду, З яким він гибрідизує, і має принаймні 60 95 ідентичність послідовності (наприклад, принаймні 7096, 7590, 80 95, 85 95, 90 95, 95 905, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95) з полінуклеотидом, з яким він гібридизує.

Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі техніки, лінійна ДНК має дві можливі орієнтації: напрямок від 5'-до-3 і напрямок від 3'-до-5ї. Наприклад, якщо еталонна послідовність розташована у напрямку від 5'-до-3", і якщо друга послідовність розташована у напрямку від 5'- до-- в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду, тоді еталонна послідовність і друга послідовність орієнтовані у одному напрямку, або мають однакову орієнтацію. Як правило, послідовність промотору та ген, що представляє інтерес, який регулюється даним промотором, розташовані в одній і тій же орієнтації. Проте, стосовно еталонної послідовності, розташованої у напрямку від 5'-до-37, якщо друга послідовність розташована у напрямку від 3'і-до-5 в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду, тоді еталонна послідовність і друга послідовність орієнтовані у антисенсовому напрямку, або мають антисенсову орієнтацію. Дві послідовності, що мають антисенсові орієнтації по відношенню одна до одної, можуть бути альтернативно описані, як такі, що мають однакову орієнтацію, якщо еталонна послідовність (напрямок від 5'- до-3) і зворотна ккомплементарна послідовність еталонної послідовності (еталонна послідовність розташована у напрямку від 5'-до-3) розташовані в межах однієї молекули/нитки полінуклеотиду. Послідовності, викладені тут, зображені у напрямку від 5'-до-3'.

Рекомбінантні конструкції, представлені тут, можуть використовуватися для трансформації рослин або рослинних клітин з метою модулювання рівнів експресії білка МІТ5. Рекомбінантна полінуклеотидна конструкція може включати в себе полінуклеотид, який кодує полінуклеотид

МЕТ5, як описано тут, функціонально пов'язаний з регуляторною ділянкою, що є придатною для експресії поліпептиду МЕТ5 у рослині або клітині. Таким чином, полінуклеотид може містити кодувальну послідовність, що кодує поліпептид МІТ5, як описано тут.

Поліпептид МІТ5, який кодується рекомбінантним полінуклеотидом, може бути нативним поліпептидом М(Т5, або може бути гетерологічним по відношенню до клітини. У деяких випадках, рекомбінантна конструкція містить полінуклеотид, який знижує або інгібує експресію поліпептиду, модулюючого МІТ5, що є функціонально пов'язаним із регуляторною ділянкою. 60 Приклади відповідних регуляторних ділянок описані в даному документі.

Також пропонуються вектори, що містять рекомбінантні полінуклеотидні конструкції, такі як описані тут. Відповідні кістяки векторів, включають в себе, наприклад, ті, що зазвичай використовуються в даній галузі техніки, такі як плазміди, віруси, штучні хромосоми, ВАСсЗ5,

МАС5, або РАС». Відповідні вектори експресії включають в себе, без обмеження, плазміди і вірусні вектори, похідні від, наприклад, бактеріофагу, бакуловірусів і ретровірусів. Численні вектори та системи експресії є комерційно доступними.

Вектори можуть також включати в себе, наприклад, точки початку реплікації, послідовності

ДНК, що мають здатність зв'язуватися з ядерним матриксом (ЗАК5), або маркери. Маркерний ген може надавати селектовуваний фенотип рослинній клітині. Наприклад, маркер може надавати біоцидну стійкість, наприклад, стійкість до антибіотика (наприклад, канаміцину, 5418, блеоміцину або гігроміціну), або гербіциду (наприклад, гліфосату, хлорсульфурону або фосфінотріцину). Крім того, вектор експресії може включати в себе маркерну послідовність, призначену для полегшення маніпуляцій або виявлення (наприклад, для очищення або локалізації) експресованого поліпептиду. Маркерні послідовності, такі як послідовності люциферази, бета-глюкуронідази (505), зеленого флуоресцентного білка (СЕР), глутатіон-5- трансферази (О5Т), полігістидіну, С-Мус або гемаглютиніну, як правило, експресовані у формі злиття з кодованим поліпептидом. Такі маркери можуть бути введені у будь-якому місці в межах поліпептиду, в тому числі як на карбоксильному кінці, так і на амінокислотному кінці білкового ланцюга.

Рослина або рослинна клітина може бути трансформована шляхом інтегрування рекомбінантного полінуклеотиду в її геном, щоб стати стабільно трансформованою. Стабільно трансформовані клітини зазвичай зберігають введений полінуклеотид з кожним клітинним поділом. Рослина або рослинна клітина також може бути тимчасово трансформована, таким чином, що рекомбінантний полінуклеотид не є інтегрованим у її геном. Тимчасово трансформовані клітини зазвичай втрачають усі або певну частину введеного рекомбінантного полінуклеотиду з кожним клітинним поділом, таким чином, що введений рекомбінантний полінуклеотид не може бути виявлений у дочірніх клітинах після достатньої кількості клітинних поділів.

Існує ряд способів в даній галузі техніки для трансформації рослинної клітини, що всі

Зо включені тут, в тому числі біолістика, способи генної гармати, трансформація, опосередкована агробактеріями, трансформація, опосередкована вірусним вектором та електропорація.

Агробактеріальна система для інтеграції чужорідної ДНК у хромосоми рослини була ретельно досліджена, модифікована і використовується в генній інженерії рослин. Голі молекули рекомбінантної ДНК, що містять послідовності ДНК, які відповідають досліджуваному очищеному білку тютюну, функціонально пов'язаному, у сенсовій або антисенсовій орієнтації, з регуляторними послідовностями, приєднуються до відповідних послідовностей Т-ДНК звичайними способами. Вони вводяться у протопласти тютюну за допомогою способів з використанням поліетиленгліколю або за допомогою способів електропорації, обидва з яких є стандартними. Альтернативно, такі вектори, що містять рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують досліджуваний очищений білок тютюну, вводяться в живі агробактеріальні клітини, які потім передають нуклеїнову кислоту у рослинні клітини. Трансформація за допомогою голої ДНК без супутніх векторних послідовностей Т-ДНК може бути здійснена шляхом злиття протопластів тютюну з ліпосомами, що містять ДНК, або шляхом електропорації.

Гола ДНК без супроводу векторних послідовностей Т-ДНК також може бути використана для трансформації клітин тютюну за допомогою інертної, високошвидкісної балістичної трансфекції.

Якщо клітина або тканина, яку культивують, використовується як тканина-реципієнт для трансформації, рослини можуть бути регенеровані з трансформованих культур, за бажанням, за допомогою способів, відомих фахівцям у даній галузі техніки.

Вибір регуляторних ділянок, які будуть включені у рекомбінантну конструкцію залежить від декількох факторів, включаючи, але не обмежуючись, ефективність, селективність, індуцибельність, бажаний рівень експресії і клітинна або тканинна переважна експресія. Для фахівця в даній галузі техніки є звичайною справою модулювання експресії кодувальної послідовності шляхом відповідного вибору і розміщення регуляторних ділянок по відношенню кодувальної послідовності. Транскрипція полінуклеотиду може модулюватися аналогічним чином. Деякі відповідні регуляторні ділянки ініціюють транскрипцію тільки або переважно в певних типах клітин. Способи визначення та характеризування регуляторних ділянок у геномній

ДНК рослини є добре відомими в даній галузі техніки.

Відповідні промотори включають в себе тканиноспецифічні промотори, визнані за їх тканиноспецифічні фактори, присутні у різних тканинах або типах клітин (наприклад, бо кореневоспецифічні промотори, паростковоспецифічні промотори, ксилема-специфічні промотори), або присутні під час різних стадій розвитку, або присутні як відповідь на різні умови навколишнього середовища. Відповідні промотори включають в себе конститутивні промотори, які можуть бути активовані у більшості типів клітин, не потребуючи спеціальних індукторів.

Приклади відповідних промоторів для контролю отримання поліпептиду РНКі МІ/Т5 включають в себе вірус мозаїки цвітної капусти 355 (Самм/355), 5510, 005, Іїр4, ОБР, 5ТІ 51, В33, по5 або убіквітинові, або фазеолінові промотори. Фахівці у даній галузі техніки здатні генерувати множинні варіації рекомбінантних промоторів.

Тканиноспецифічні промотори є транскрипційними елементами контролю, які є активними тільки у певних клітинах або тканинах у певний час розвитку рослини, наприклад, у вегетативних тканинах або репродуктивних тканинах. Тканиноспецифічна експресія може бути корисною, наприклад, коли перевага надається експресії полінуклеотидів у певних тканинах.

Приклади тканиноспецифічних промоторів під контролем розвитку, включають в себе промотори, які можуть ініціювати транскрипцію тільки (або переважно тільки) у певних тканинах, таких як вегетативні тканини, наприклад, коріння або листя, або у репродуктивних тканинах, таких як фрукти, сім'ябруньки, насіння, пилок, маточки, квіти, або будь-які ембріональні тканини.

Репродуктивні тканиноспецифічні промотори можуть бути, наприклад, пиловик-специфічними, сім'ябрунька-специфічними, ембріон-специфічними, ендосперм-специфічними, оболонка сім'ябруньки-специфічними, насіння і оболонка насіння-специфічними, пилок-специфічними, пелюстка-специфічними, чашолистик-специфічними, або їх комбінаціями.

Відповідні листоспецифічні промотори включають в себе пірувату, ортофосфат-дікінази (РРОК) промотор від рослини С4(кукурудза), промотор сар-піСат2 від кукурудзи, промотор тур-залежного гену арабідопсису (Айтуб5), рибулозобіфосфаткарбоксилази (АВС) промотори (наприклад, гени томату КВСО5 1, КВСО52 і КВСЗЗА, експресовані у листі і та розсаді, вирощеній із забезпеченням освітлення, гени КВС51 і КВС52, експресовані у плодах томату, що розвиваються, або рибулозобіфосфаткарбоксилази промотор, експресований майже виключно у клітинах мезофілу в листових пластинках і листових піхвах при високих рівнях).

Відповідні старіння-специфічні промотори включають в себе промотор томату, активний під час дозрівання плодів, старіння і опадання листя, промотор гену кукурудзи, що кодує цистеїн протеазу. Можуть використовуватися відповідні пиловик-специфічні промотори. Можуть також

Зо обиратися відповідні кореневоспецифічні промотори, відомі фахівцям у даній галузі техніки.

Відповідні насіння-специфічні промотори включають в себе, як насіння-спеціфічні промотори (ті промотори, що є активними під час розвитку насіння, такі як промотори запасних білків насіння), так і промотори проростання насіння (ті промотори, що є активними під час проростання насіння). Такі насіння-специфічні промотори включають в себе, але не обмежуються, Сіті! (цитокінін-індукована транскрипція); С219В1 (зеїн кукурудзи 19 КОа); тіїр5 (міо-інозит-1-фосфат- синтаза); т2Е40-2, також відомий як 2М-40; писіс; та сеЯ(А (целюлози синтаза). Гамма-зеїн є ендосперм-специфічним промотором. (31060-1 є ембріон-специфічним промотором. Для дводольних рослин, насіння-специфічні промотори включають, але не обмежуються, бета- фазеолін бобових, напін, п-конгліцинін, соєвий лектин, круціферін, тощо. Для однодольних рослин, насіння-специфічні промотори включають, але не обмежуються, промотор зеїну кукурудзи 15 Кба, промотор зеїну 22 КОа, промотор зеїну 27 КОба, промотор 4--зеїну, промотор у- зеїну 27 КОа (наприклад, промотор д2иб4А, див. інвентарний номер Генобанку 578780), восковий промотор, промотор "зморшкуватого" зерна 1, промотор "зморшкуватого" зерна 2, промотор глобуліну 1 (див. інвентарний номер Генобанку І 22344), промотор пр2, промотор сіт!, промотори кукурудзи епаї ї епаг2, промотор пис1, промотор 2М40, еер! і еер2; промотор

Ієд, тіоредоксіну Н; промотор тіїр15, промотор РСМАЗ2 і промотор "зморшкуватого" зерна 2.

Приклади індукованих промоторів включають в себе промотори, що реагують на атаки патогену, анаеробні умови, підвищену температуру, світло, посуху, низьку температуру або високу концентрацію солі. Патоген-індуковані промотори включають в себе промотори від патогенез-залежних білків (РЕ-білків), які індукуються після інфікування патогеном (наприклад,

РВА-білки, БАК-білки, бета-1,3-глюканаза, хітіназа).

Крім рослинних промоторів, інші відповідні промотори можуть мати бактеріальне походження, наприклад, октопінсинтази промотор, нопалін синтази промотор та інші промотори, що походять від плазмідів Ті, або можуть бути отримані від вірусних промоторів (наприклад, промотори РНК 355 і 195 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), конститутивні промотори вірусу мозаїки тютюну, промотори 195 і 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), або промотор 355 вірусу мозаїки ранника).

Термін "поліпептид МЕТ5" відноситься до поліпептиду, що кодує треонінсинтазу від Місоїапа їарасит, і включає в себе поліпептиди, які містять, складаються або складаються по суті з

Ге) амінокислотної послідовності, кодованої полінуклеотидом, з принаймні близько 60 95, 65 95,

70 96, 75 90, 80 Фо, 85 9о, 86 о, 87 9о, 88 Фо, 89 95, 90 Фо, 91 9, 92 Фо, 93 90, 94 Фо, 95 95 96 Фо, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з «ЕО ІЮ МО: 1, БЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІЮО МО:

З, або полінуклеотид, з принаймні близько 60 95, 65 У, 70 90, 7590, 80 95, 85 95, 86 95, 87 9, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 55 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з «ЕО ІЮ МО: 4, 5ЗЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 20; фрагменти полінуклеотиду

МЕТ5 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 20, а також фрагменти ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО І МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 або ЗЕО ІЮ МО: 20, які мають принаймні близько 60 95, 65 95, 70 95, 75 95, 80 95, 85 Фо, 87 95, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 55 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з відповідними фрагментами ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, 5БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ

МО: 4, ЗЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 20. Приклади фрагментів представлені у послідовностях

ЗЕО ІЮ МО 9-19. Поліпептиди МЕТ5 також включають в себе послідовності, що містять достатню або істотну ступінь ідентичності або схожості з «БО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІО МО: 7, або 5ЕО ІЮ МО: 8 для функціонування як треонінсинтаза, і включають в себе послідовності з принаймні 95 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮО МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 7, 5ЕО ІО МО: 8 або 5ЕО ІЮО МО: 21.

ЗЕО ІЮ МО. 6 є трансльованою послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1. 5ЕО ІЮО МО: 7 є трансльованою послідовність «ЕО ІЮ МО: 2. 5ЕО ІЮ МО: 8 є трансльованою послідовністю ЗЕО ІЮО МО. 3. 5ЕО

ІО МО: 21 є трансльованою послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 20 і має ідентичність послідовності 89 95 з

ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8 або 5ЕО ІО МО: 9.

В одному варіанті, фрагменти поліпептидів МЕТ5 зберігають активність треонінсинтази.

Поліпептиди МЕТ5 також включають в себе варіанти і мутанти, отримані шляхом введення будь- якого типу змін (наприклад, вставки, видалення або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно за умови, що вони досі функціонують як треонінсинтаза. Поліпептиди МЕТ5 можуть бути в лінійній формі або піддані циклізації з використанням відомих способів. Термін "поліпептид МЕТ5" може відноситися до поліпептиду, що містить, складається або складається по суті з послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 8 або 5ЕО ІО

МО: 21.

В іншому аспекті, пропонується ізольований поліпептид, що містить, складається або складається по суті з поліпептидної послідовності, що має принаймні 60 95 ідентичність послідовності з будь-якою з описаних тут послідовностей, включаючи будь-який з поліпептидів, представлених у переліку послідовності. Відповідно, ізольовані поліпептиди містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що має принаймні 60 9», 61 Фо, 62 95, 63 оо, 64 95, 65 95, 66 90, 67 о, 68 о, 69 90, 70 90, 75 Фо, 80 Фо, 85 Фо, 87 9о, 88 9о, 89 90, 90 90, 91 95, 92 9, 93 90, 94 90, 95 95 96 90, 97 У, 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з нею.

Поліпептиди МІТ5 включають в себе варіанти, отримані шляхом введення будь-якого типу змін (наприклад, вставки, видалення або заміни амінокислот, зміни станів глікозилювання, зміни, що впливають на рефолдинг або ізомеризації, тривимірні структури, або стани самоасоціації), які можуть бути навмисно створені шляхом генної інженерії або ізольовані природно. Варіант може мати зміни, які спричиняють "мовчазну" зміну і в результаті дають функціонально еквівалентний білок. Навмисні заміни амінокислоти можуть здійснюватися на основі подібності полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності та/або амфіпатичного характеру залишків до тих пір, поки вторинна активність зв'язування речовини зберігається. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту; позитивно заряджені амінокислоти включають лізин та аргінін; і амінокислоти з незарядженими полярними головними групами, що мають аналогічні значення гідрофільності, включають лейцин, ізолейцин, валін, гліцин, аланін, аспарагін, глутамін, серин, треонін, фенілаланін і тирозин. Консервативні заміни можуть бути зроблені, наприклад, відповідно до наведеної нижче Таблиці. Амінокислоти в одному блоці у другому стовпці і переважно в тому ж рядку у третьому стовпці можуть бути замінені одне на одного: . сту Аа Рго

Азп с . Авр Сім

ІАРОМАТИЧНАЇ (ЇЇ 77777777777777777юююИюИюИДИНнНнНнНОл|НівРЛєтруб:./:/Л/://///:/: «З:

Поліпептид МТЗ може бути зрілим білком або незрілим білком або білком, отриманим від незрілого білка. Поліпептиди МЕТ5 можуть бути в лінійній формі або піддаватися циклізації з використанням відомих способів. Поліпептиди МЕТ5 містять принаймні 10, принаймні 20, принаймні 30, або принаймні 40 суміжних амінокислот.

В одному варіанті, пропонується ізольований полінуклеотид, який кодується будь-яким з полінуклеотидів, що містять, складаються або по суті складаються з послідовності, що кодує треонінсинтазу, і має принаймні 60 бо, 65 Зо, 70 95, 75 0, 80 о, 85 95, 86 Фо, 87 95, 88 90, 89 Фо, 90 оо, 95 95, 96 95, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮО МО: 1, ЗЕО

ІЮО МО 2 або 5ЕО ІО МО: З або з будь-яким з полінуклеотидів, що містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що має принаймні 60 95, 6595, 7095, 7595, 80 95, 85 9о, 8695, 87 95, 8895, 89 95, 9095, 91 95, 92 95, 93 95, 9495, 95 90, 96 о, 97 95, 9895 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 20.

В іншому варіанті, пропонується ізольований поліпептид, який кодує треонінсинтазу, і містить, складається або складається по суті з поліпептидної послідовності, що має принаймні бО Фо, 65 95, 70 Ув, 75 95, 80 У, 85 9, 86 9о, 87 95, 88 Ус, 89 95, 90 У, 91 9, 92 У, 93 9, 94 Фо, 95 95, 96 9, 97 У, 98 9, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з послідовністю, представленою у

ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8 або ЗЕО ІЮ МО: 21.

В іншому варіанті, пропонується ізольований поліпептид, який кодує треонінсинтазу, і містить, складається або складається по суті з послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 6,

ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 8 або 5ЕО ІЮО МО: 21.

Фрагменти поліпептидних послідовностей також представлені в даному описі, відповідно, такі фрагменти зберігають активність треонінсинтази.

Варіанти мутантного поліпептиду можуть використовуватися для створення мутантних, що не зустрічаються в природі, і трансгенних рослин, що містять мутантний поліпептид МТ5.

Відповідно, мутантний поліпептид МІ/Т5 зберігає активність треонінсинтази.

Поліпептид може бути отримано шляхом культивування трансформованих або рекомбінантних клітин-хазяїв в умовах культивування, відповідних для експресії поліпептиду.

Отриманий експресований поліпептид може бути потім очищений від такої культури з використанням відомих способів очищення. Очищення поліпептиду може включати в себе

Зо використання колонки для афінної хроматографії, що містить агенти, які зв'язуються з поліпептидом; одну або більше стадій очищення на колонці з використанням таких смол для афінної хроматографії; одну або більше стадій, які передбачають хроматографію з гідрофобною взаємодією, або імуноафінну хроматографію. Альтернативно, поліпептид може бути також експресований у формі, яка полегшує очищення. Наприклад, він може бути експресований як злитий поліпептид, наприклад, як поліпептид, зв'язуючий мальтозу (МВР), глутатіон-5- трансфераза (557) або тіоредоксин (ТЕХ). Набори для експресії та очищення злитих поліпептидів Є комерційно доступними. Поліпептид може бути маркований епітопом, а потім очищений з використанням специфічного антитіла, спрямованого на такий епітоп. Одна або більше стадій рідинної хроматографії, наприклад, обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії, може застосовуватися для подальшого очищення поліпептиду. Деякі або всі з вищезазначених стадій очищення, в різних комбінаціях, можуть використовуватися для забезпечення по суті гомогенного рекомбінантного поліпептиду. Очищений таким способом поліпептид може бути по суті вільним від інших поліпептидів і визначається тут як "по суті очищений поліпептид"; такі очищені поліпептиди включають в себе поліпептиди МЕТ5, їх фрагменти, варіанти, тощо. Експресія, ізоляція та очищення поліпептидів і їх фрагментів може здійснюватися будь-яким придатним способом, включаючи, але не обмежуючись, способи, описані тут.

Крім того, можливо використовувати афінну колонку у такий спосіб, щоб генерувати моноклональні антитіла проти поліпептидів, з метою афінного очищення експресованих поліпептидів. Ці поліпептиди можуть бути видалені з афінної колонки з використанням звичайних способів, наприклад, в елююючому буфері з високим вмістом солі з наступною діалізацією у буферний розчин з меншим вмістом солі для використання або шляхом зміни значення рН або інших компонентів залежно від афінної матриці, що використовується, або шляхом конкурентного видалення з використанням природного субстрату афінної групи.

Поліпептид може бути також отриманий за допомогою відомого звичайного хімічного синтезу. Способи конструювання поліпептидів або їх фрагментів синтетичним шляхом є відомими фахівцям в даній галузі техніки. Синтетично-побудовані поліпептидні послідовності, в силу спільного володіння первинними, вторинними або третинними структурними або конформаційними характеристиками з нативними поліпептидами, можуть володіти біологічними 60 властивостями, спільними з ними, в тому числі біологічною активністю.

Термін "що не зустрічається в природі", як використовується тут, описує об'єкт (наприклад, полінуклеотид, генетичну мутацію, поліпептид, рослину, рослинну клітину і рослинний матеріал), який не утворюється в природі, або який не існує в природі. Такі об'єкти, що не зустрічаються в природі, або штучні об'єкти можуть бути отримані, синтезовані, ініційовані, модифіковані, піддані втручанню або обробці за допомогою способів, описаних тут, або способів, що є відомими в даній галузі техніки. Таким чином, як приклад, рослина, що не зустрічається в природі, рослинна клітина, що не зустрічається в природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається в природі, можуть бути отримані з використанням звичайних способів селекції рослин, таких як зворотне схрещування (беккрос), або за допомогою технологій генетичної маніпуляції, наприклад, антисенсової РНК, інтерферуючої РНК, мегануклеази, тощо. Як ще один приклад, рослина, що не зустрічається в природі, рослинна клітина, що не зустрічається в природі, або рослинний матеріал, що не зустрічається в природі, можуть бути отримані за допомогою інтрогресії або шляхом перенесення однієї або більше генетичних мутацій (наприклад, одного або більше поліморфізмів) від першої рослини або рослинної клітини у другу рослину або рослинну клітину (що сама може зустрічатися в природі), таким чином, що отримана рослина, рослинна клітина або рослинний матеріал або їх потомство включає в себе генетичну структуру (наприклад, геном, хромосому або її сегмент), що не утворюється в природі або не існує в природі. Отримана рослина, рослинна клітина або рослинний матеріал є, таким чином, штучними або такими, що не зустрічаються в природі.

Відповідно, штучна або така, що не зустрічається в природі, рослина або рослинна клітина може бути отримана шляхом модифікації генетичної послідовності у першій рослині або рослинній клітині, що зустрічається в природі, навіть якщо отримана в результаті генетична послідовність виникає природно у другій рослині або рослинній клітині, яка містить генетичний фон, відмінний від першої рослини або рослинної клітини. Відмінності у генетичному фоні можуть бути виявлені за допомогою фенотипових відмінностей або за допомогою способів молекулярної біології, відомих у даній галузі техніки, наприклад, секвенування нуклеїнової кислоти, наявності або відсутності генетичних маркерів (наприклад, маркерів мікросателітної

РНК).

В іншому варіанті, тут пропонуються антитіла, що є імунореактивними з поліпептидами

МЕТ5. Поліпептиди МІТ5, фрагменти, варіанти, злиті поліпептиди, тощо, як викладено в даному описі, можуть використовуватися як "імуногени" при утворенні антитіл, імунореактивних з ними.

Такі антитіла можуть специфічно зв'язуватися з поліпептгидами МІТ5 через антиген-зв'язуючі сайти антитіла. Специфічно-зв'язуючі антитіла є такими, що будуть специфічно розпізнавати і зв'язуватися з поліпептидами родини МІТ5, гомологами і їх варіантами, але не з іншими молекулами. В одному варіанті, антитіла є специфічними для поліпептидів, що мають амінокислотну послідовність М(Т5, як викладено в даному документі, і не вступають в перехресну реакцію з іншими поліпептидами.

Зокрема, поліпептиди, фрагмент, варіанти, злиті поліпептиди, тощо містять антигенні детермінанти або епітопи, які викликають утворення антитіл. Ці антигенні детермінанти або епітопи можуть бути, або лінійними, або конформаційними (переривчастими). Лінійні епітопи складаються з однієї секції амінокислот поліпептиду, а конформаційні або переривчасті епітопи складаються з секцій амінокислот з різних ділянок поліпептидного ланцюга, які розміщуються в безпосередній близькості під час складання поліпептидного ланцюга. Епітопи можуть бути визначені будь-яким зі способів, відомих у даній галузі техніки. Крім того, епітопи з поліпептидів можуть використовуватися як дослідні реагенти при виконанні аналізів, та для очищення специфічних зв'язуючих антитіл від таких речовин, як поліклональна сироватка або супернатанти від культивованих гібридом. Такі епітопи або їх варіанти можуть бути отримані з використанням способів, відомих у даній галузі техніки, таких як твердофазний синтез, хімічне або ферментативне розщеплення поліпептиду, або за допомогою технології рекомбінантної

ДНК.

Як поліклональні, так і моноклональні антитіла, для поліпептидів, можуть бути отримані звичайними способами. Клітинні лінії гібридоми, які утворюють моноклональні антитіла, специфічні для поліпептидів, також розглядаються в даному описі. Такі гібридоми можуть бути отримані та ідентифіковані за допомогою звичайних способів. Для утворення антитіл, різні тварини-хазяї можуть бути імунізовані за допомогою ін'єкції поліпептиду МЕТ5, його фрагменту, варіанту, або їх мутантів. Такі тварини-хазяї можуть бути, але не обмежуються, кроликами, мишами і щурами, серед інших. Різні ад'юванти можуть використовуватися для підвищення імунної відповіді. Залежно від виду хазяїна, такі ад'юванти включають, але не обмежуються, ад'юванти Фрейнда (повні та неповні), мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, поверхнево- 60 активні речовини, такі як лізолецитин, плюронові поліоли, поліаніони, пептиди, масляні емульсії,

гемоцианін лімфи равлика, динітрофенол і потенційно придатні людські ад'юванти, такі як БЦЖ (бацила Кальметта-Герена) і коринебактерія - Согупебрасієегішт рагмит. Моноклональні антитіла можуть бути відновлені за допомогою звичайних способів. Такі моноклональні антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи Ідс, ІМ, І9ЧЕ, ІдА, ІдО ії будь-який їх підклас.

Антитіла можуть також використовуватися в аналізах для виявлення присутності поліпептидів або фрагментів, або іп міго або іп мімо. Антитіла можуть також використовуватися при очищенні поліпептидів або їх фрагментів за допомогою імуноафінної хроматографії.

Композиції, які можуть знизити експресію або активність треонінсинтази, включають, але не обмежуються, послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати транскрипції одного або більше ендогенного гену (генів) треонінсинтази, послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати трансляції треонінсинтази РНК-транскриптів (наприклад, дволанцюгових РНК, мікроРНК, міРНК, рибозим); послідовність-специфічні поліпептиди, які можуть перешкоджати стабільності білків треонінсинтази; послідовність- специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати ферментативній активності білка треонінсинтази, або активності зв'язування білка треонінсинтази по відношенню до субстратів або регуляторних білків; антитіла, які виявляють специфічність щодо білка треонінсинтази; низькомолекулярні сполуки, які можуть перешкоджати стабільності білка треонінсинтази, або ферментативній активності білка треонінсинтази, або активності зв'язування білка треонінсинтази; білки "цинкові пальці", які зв'язують полінуклеотид треонінсинтази; та мегануклеази, які мають активність по відношенню до полінуклеотиду треонінсинтази.

Антисенсова технологія є одним з відомих способів, який можливо використовувати для модуляції (наприклад, зниження або інгібування) експресії поліпептиду МЕТ5. Полінуклеотид гену М(Т5, який підлягає репресуванню, клонується і функціонально пов'язується з регуляторною ділянкою та послідовністю термінації транскрипції, таким чином, що антисенсовий ланцюг РНК транскрибується. Рекомбінантну конструкцію потім трансформують у рослинах і отримують антисенсовий ланцюг РНК. Полінуклеотид не має бути всією послідовністю гену, що підлягає репресуванню, але зазвичай буде по суті комплементарним принаймні з частиною сенсового ланцюга гену, що підлягає репресуванню (незалежно від того, чи він знаходиться в кодувальній ділянці, або некодувальній ділянці).

Полінуклеотид може транскрибуватися в рибозим або каталітичну РНК, яка впливає на експресію МРНК. Рибозими можуть призначатися спеціально для спарювання з практично будь- якою РНК-мішенню і розщеплюють фосфодіефірний кістяк у певній локалізації, таким чином функціонально інактивуючи РНК-мішень. Гетерологічні полінуклеотиди можуть кодувати рибозими, призначені для розщеплення певних транскриптів мРНК, таким чином перешкоджаючи експресії поліпептиду. Рибозими у вигляді головки молотка використовуються для руйнування певних мРНК, хоча також можуть використовуватися різні рибозими, які розщеплюють мРНК у сайт-специфічних розпізнавальних послідовностях. Рибозими у вигляді головки молотка розщеплюють мРНК у локалізаціях, обумовлених фланкувальними ділянками, які формують комплементарні пари основ з мРНК-мішенню. Єдина вимога передбачає, щоб

РНК-мішень містила нуклеотидну послідовність 5'-0С-3'. Конструювання і отримання рибозим у вигляді головки молотка є відомим у даній галузі техніки. Послідовності рибозиму у вигляді головки молотка можуть бути вбудовані у стабільну РНК як транспортна РНК (тРНК) з метою підвищення ефективності розщеплення іп мімо.

В одному варіанті, послідовність-специфічні полінуклеотиди, які можуть перешкоджати трансляції РНК-транскрипту (транскриптів) треонінсинтази, являють собою РНКІі. РНК- інтерференція ("РНКі" або сайленсінг РНК є еволюційно-консервативним процесом, за допомогою якого специфічні МРНК можуть піддаватися ферментативному розщепленню. Одна дволанцюгова РНК (дволанцюгова РНК) має бути введена або вироблена клітиною (наприклад, вірус дволанцюгової РНК, або полінуклеотиди РНКі МЕТ5) з метою ініціювання шляху РНКІ.

Дволанцюгова РНК може бути конвертована у множинні міРНК-дуплекси довжиною 21-23 пар основ ("міРНК"У за допомогою РНКаз І, які являють собою дволанцюгові РНК-специфічні ендонуклеази ("Дайсер"). міРНК можуть надалі розпізнаватися за допомогою РНК-індукованого комплексу сайленсінгу ("КІЗС"), який сприяє розмотуванню міРНК через АТФ-залежний процес.

Розмотаний антисенсовий ланцюг міРНК спрямовує активований КІЗС до мРНК-мішені (наприклад, варіантів РНК МІТ5), що містить послідовність, комплементарну з антисенсовим ланцюгом міРНК. мРНК-мішень і антисенсовий ланцюг можуть утворити А-форму спіралі, і велика борозенка А-форми спіралі може розпізнаватися активованим КІЗС. мРНК-мішень може розщеплятися за допомогою активованого КІЗС в одному сайті, визначеному сайтом зв'язування 5'--кінця ланцюга міРНК. Активований КІЗС може рециркулюватися, щоб каталізувати іншу подію розщеплення.

Вектори експресії РНКіІ МТЗ можуть містити конструкції РНКі МЕТ5, що кодують полінуклеотиди РНКІі МІТ5, які виявляють активність РНК-інтерференції шляхом зниження рівня експресії МРНК МЕТ5, пре-мРНК МЕТ5, або пов'язаних варіантів РНК МЕТ5. Вектори експресії можуть включати в себе промотор, який розміщується вище і функціонально пов'язаний з конструкцією РНКІ МІТ5, як додатково описано в даному документі. Вектори експресії РНКі МЕТ5 можуть містити відповідний мінімальний основний промотор, конструкції РНКі МЕТ5, що представляють інтерес, верхню (5) регуляторну ділянку, нижню (3) регуляторну ділянку, включаючи термінацію транскрипції і сигнали поліаденілювання, та інші послідовності, відомі фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, різні маркери відбору.

Полінуклеотиди МТЗ можуть бути отримані у різних формах, включаючи, дволанцюгові структури (тобто, молекулу дволанцюгової РНК, що містить антисенсову нитку і комплементарну сенсову нитку), дволанцюгові шпилькоподібні структури ("длРНКІ"), або одноланцюгові структури (тобто, молекули олРНК, які містять тільки антисенсову нитку).

Структури можуть містити дуплекс, асиметричний дуплекс, шпильку або асиметричну шпилькову вторинну структуру, що мають самокомплементарні сенсові та антисенсові нитки. длЛРНКІі МІТ5 можуть ферментативно конвертуватися у дволанцюгові міРНК МЕТ5. Одна з ниток дуплексу міРНК МІ/Т5 може ренатурувати у комплементарну послідовність в межах мРНК МЕТ5 мішені і суміжних варіантів РНК МЕТ5. Дуплекси міРНК/мРНК розпізнаються за допомогою КІЗС, які можуть розщеплювати РНК МТЗ у кількох сайтах послідовність-залежним чином, що призводить в результаті до деградації МРНК МЕТ5 мішені і суміжних варіантів РНК МЕТ5.

Молекули дволанцюгової РНК можуть включати в себе молекули міРНК, зібрані з одного олігонуклеотиду у структурі "петля-на-стеблі", в якій самокомплементарні сенсові і антисенсові ділянки молекули міРНК зв'язані за допомогою лінкера (лінкерів) на полінуклеотидній основі або неполінуклеотидній основі, а також кільцеву одноланцюгову РНК, що має дві або більше петльових структур і стебло, які включають в себе самокомплементарні сенсові і антисенсові нитки, де кільцева РНК може бути оброблена або іп мімо, або іп міт, щоб генерувати активну молекулу міРНК, здатну до опосередкованого формування РНКІ.

Зо Використання молекул малої шпилькової РНК (мшРНК) також розглядається тут, і включає специфічну антисенсову послідовність на додаток до зворотної комплементарної (сенсової) послідовності, як правило, розділених спейсером або петльовою послідовністю. Розщеплення спейсера або петлі забезпечує молекулу одноланцюгової РНК і її зворотний комплемент, таким чином, що вони можуть ренатурувати з утворенням молекули дволанцюгової РНК (необов'язково з додатковими стадіями обробки, які можуть забезпечувати в результаті додавання або видалення одного, двох, трьох або більше нуклеотидів з З3' кінця або 5' кінця однієї або обох ниток). Спейсер може мати достатню довжину, щоб дозволити антисенсовій і сенсовій послідовностям ренатурувати, і сформувати дволанцюгову структуру (або стебло) до розщеплення спейсера (і, необов'язково, подальших стадій обробки, які можуть забезпечувати в результаті додавання або видалення одного, двох, трьох або більше нуклеотидів з З3' кінця або 5 кінця однієї або обох ниток). Спейсерна послідовність, як правило, являє собою непов'язану нуклеотидну послідовність, що знаходиться між двома ділянками комплементарної нуклеотидної послідовності, яка при ренатурації (відпалу) у дволанцюговий полінуклеотид, містить мшШРНК. Спейсерна послідовність зазвичай містить від близько З до близько 100 нуклеотидів.

Будь-який полінуклеотид РНК МЕТ5, що представляє інтерес, може бути отриманий шляхом вибору відповідної композиції послідовності, розміру петлі і довжини стебла для отримання шпилькового дуплексу М(Т5. Відповідний діапазон для проектування довжини стебла шпилькового дуплексу включає в себе довжину стебла принаймні близько 10, 11, 12, 13, 14, 15,

БО 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів, наприклад, близько 14-30 нуклеотидів, близько 30-50 нуклеотидів, близько 50-100 нуклеотидів, близько 100-150 нуклеотидів, близько 150-200 нуклеотидів, близько 200-300 нуклеотидів, близько 300-400 нуклеотидів, близько 400-500 нуклеотидів, близько 500-600 нуклеотидів, та близько 600-700 нуклеотидів. Відповідний діапазон для проектування довжини петлі шпилькового дуплексу включає в себе довжину петлі близько 4-25 нуклеотидів, близько 25-50 нуклеотидів, або довше, якщо довжина стебла шпилькового дуплексу є суттєвою. У деяких варіантах, молекула дволанцюгової РНК (длРНК) або одноланцюгової РНК (олРНК) має від близько 15 до близько 40 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула міРНК є молекулою длРНК або олРНК, що має від близько 15 до близько 35 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула мігРНК є молекулою длРНК або 60 ОолЛРНК, що має від близько 17 до близько 30 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті,

молекула міРНК є молекулою длРНК або олРНК, що має від близько 19 до близько 25 нуклеотидів у довжину. В іншому варіанті, молекула міРНК є молекулою длРНК або олРНК, що має від близько 21 до близько 23 нуклеотидів у довжину. У деяких варіантах, шпилькові структури з дуплексними ділянками довшими, ніж 21 нуклеотид, можуть сприяти ефективному сайленсінгу, спрямованому на міРНК, незалежно від послідовності і довжини петлі.

Послідовність мРНК-мішені зазвичай становить від близько 14 до близько 50 нуклеотидів у довжину. мРНК-мішені, таким чином, можуть бути відскановані в ділянках від близько 14 до близько 50 нуклеотидів у довжину, які переважно відповідають одному або більше з наступних критеріїв для цільової послідовності: співвідношення АжТ/(03-С від близько 2:1 і близько 1:2; динуклеотід АА або динуклеотід СА на 5'-кінці послідовності-мішені; послідовність принаймні 10 суміжних нуклеотидів, унікальних для мРНК-мішені (тобто послідовність, що не є присутньою в інших послідовностях мРНК від однієї рослини), та відсутність "відтинків" із понад трьох суміжних нуклеотидів гуаніну (б) або понад трьох суміжних нуклеотидів цитозину (С). Ці критерії можуть оцінюватися за допомогою різних способів, відомих у даній галузі техніки, наприклад, комп'ютерні програми, такі як ВГА5Т, можуть використовуватися для пошуку загальнодоступних баз даних, щоб визначити, чи є обрана послідовність-мішень унікальною для мРНК-мішені.

Альтернативно, послідовність-мішень може обиратися (а послідовність міРНК визначатися) з використанням комп'ютерного програмного забезпечення, що є комерційно доступним (наприклад, ОїЇїдоЕпдіпе, Тагуеї Ріпаеєг і вівМА Оезідп Тоо)ї, які є комерційно доступними).

В одному варіанті, обирають послідовності мРНК-мішені, що мають від близько 14 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. В іншому варіанті, обирають послідовності-мішені, що мають від близько 16 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. У ще одному варіанті, обирають послідовності-мішені, що мають від близько 19 до близько 30 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв. В іншому варіанті, обирають послідовності-мішені, що мають від близько 19 до близько 25 нуклеотидів у довжину, які задовольняють одному або більше із зазначених вище критеріїв.

В ілюстративному варіанті, молекули, які використовуються для модулювання експресії,

Зо містять специфічну послідовність (наприклад, антисенсову послідовність), що є комплементарною принаймні для 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше суміжних нуклеотидів будь-якої з МІТ5 полінуклеотидних послідовностей, описаних тут, наприклад, 5ЕО ІО МО: 1-5 або 20.

У ще одному ілюстративному варіанті, молекули, які використовуються для модулювання експресії включають в себе послідовність (наприклад, антисенсову послідовність), що є комплементарною принаймні для 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 або більше суміжних нуклеотидів з нуклеотидами 1-46 послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 ії 3; з нуклеотидами 1-52 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 20; з нуклеотидами 99-141 послідовності

ЗБЕО ІО МО: 1; з нуклеотидами 102-144 послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 2 і 5ЕО ІЮО МО: 3; з нуклеотидами 102-153 послідовностей ЗЕО 10 МО: 20; з нуклеотидами 1325-1362 послідовностей ЗЕО ІЮО МО: 1, 2 і 3, або з нуклеотидами 1334-1371 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 20.

У ще одному ілюстративному варіанті, молекули, які використовуються для модулювання експресії включають послідовність (наприклад, антисенсову послідовність), що є комплементарною принаймні для 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 або більше суміжних нуклеотидів з нуклеотидами 454-805 послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2, або 5ЕО ІЮ МО: З або з нуклеотидами 463-814 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 20.

Специфічна антисенсова послідовність, що складається з молекули міРНК, може бути ідентичною або по суті ідентичною з комплементом послідовності-мішені. В одному варіанті, специфічна антисенсова послідовність, що складається з молекули міРнК, є принаймні близько на 75 Фо, 80 95, 85 9, 90 9, 95 Фо, 96 90, 97 9», 98 Фо, 99 95 або 100 95 ідентичною з комплементом послідовності мРНК-мішені. Способи визначення ідентичності послідовності є відомими у даній галузі техніки і можуть бути визначені, наприклад, за допомогою програми ВІ А5ТМ програмного забезпечення Університету штату Вісконсін (пімег5йу ої М/івсопвіп Сотршїег Стоимир (йСС)) або за допомогою веб-сайту МСВІ.

Специфічна антисенсова послідовність молекул міРНК може демонструвати мінливість, відрізняючись (наприклад, шляхом заміни нуклеотидів, включаючи транзицію або трансверсію) на один, два, три, чотири або більше нуклеотидів від послідовності мРНК-мішені. Коли такі нуклеотидні заміни присутні в антисенсовій нитці молекули дволанцюгової РНК, комплементарний нуклеотид у сенсовій нитці, з якою замінюючий нуклеотид, як правило, 60 утворює водневий зв'язок шляхом спарювання основ, може або не може бути відповідним чином заміщений. Також розглядаються молекули дволанцюгової РНК, в яких одна або більше нуклеотидних замін відбувається у сенсовій послідовності, а не у антисенсовій нитці. Коли антисенсова послідовність молекули міРНК містить одне або більше порушень комплементарності між нуклеотидною послідовністю міРНК і нуклеотидною послідовністю- мішенню, як описано вище, порушення комплементарності можуть знаходитися на 3'-кінці, 5'- кінці або у центральній частині антисенсової послідовності.

В іншому варіанті, молекули міРНК містять специфічну антисенсову послідовність, що є здатною селективно гібридизуватися у жорстких умовах з частиною природного гену-мішені або

МРНК-мішені. Як відомо середнім фахівцям в даній галузі техніки, варіації жорсткості умов гібридизації можуть бути досягнуті шляхом зміни часу, температури або концентрації розчинів, що використовуються для стадій гібридизації та промивання. Відповідні умови можуть також частково залежати від конкретних використовуваних нуклеотидних послідовностей, наприклад, послідовності мРНК-мішені або гену-мішені.

Одним зі способів індукування сайленсінгу дволанцюгової РНК у рослинах є трансформація з генною конструкцією, що утворює шпилькову РНК (див. Зтіїй єї аї. (2000) Маїшге, 407, 319- 320). Такі конструкції містять інвертовані ділянки послідовності гену-мішені, розділені за допомогою відповідного спейсера. Введення функціональної інтронної ділянки рослини як спейсерного фрагмента додатково підвищує ефективність індукції сайленсінгу гену за рахунок генерації інтрон-сплайсованої шпилькової РНК (УУезієу еї аї. (2001) Ріапі 9., 27, 581-590).

Відповідно, довжина стебла становить від близько 50 нуклеотидів до близько 1 кілобаз у довжину. Способи отримання нітрон-сплайсованої шпилькової РНК добре описані в даній галузі техніки (див., наприклад, Віозсіепсе, Віоїесппоіоду, апа Віоспетівігу (2008) 72, 2, 615-617).

Молекули РНКІ, що мають дуплекс або дволанцюгову структуру, наприклад дволанцюгову

РНК або мшРНК, можуть мати тупі кінці, або можуть мати 3' або 5' липкі (виступаючі) кінці. Як використовується тут, "липкий кінець" відноситься до неспареного нуклеотиду або нуклеотидів, які виступають з дуплексної структури, коли 3'-кінець одного ланцюга РНК виходить за межі 5- кінця іншого ланцюга (3' липкий кінець), або навпаки (5' липкий кінець). Нуклеотиди, що містять липкий кінець, можуть бути рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами або їх модифікованими версіями. В одному варіанті, принаймні один ланцюг молекули РНКІі має 3' липкий кінець від близько 1 до близько 6 нуклеотидів у довжину. В інших варіантах, 3' липкий кінець має від близько 1 до близько 5 нуклеотидів, від близько 1 до близько З нуклеотидів, і від близько 2 до близько 4 нуклеотидів у довжину.

Коли молекула РНКІ має 3' липкий кінець на одному кінці молекули, інший кінець може бути тупим кінцем або може мати також липкий кінець (5' або 3). Коли молекула РНКІі має липкий кінець на обох кінцях молекули, довжина липких кінців може бути однаковою або різною. В одному варіанті, молекула РНКІ має 3' липкі кінці від близько 1 до близько З нуклеотидів на обох кінцях молекули. У ще одному варіанті, молекула РНКІ є дволанцюговою РНК, що має 3' липкий кінець з 2 нуклеотидів на обох кінцях молекули. У ще одному варіанті, нуклеотиди, що мають липкий кінець РНКІ, являють собою динуклеотиди ТТ або динуклеотиди ШИ.

При визначенні відсоткової ідентичності молекули РНКІ, що містить один або більше липких кінців, з послідовністю мРНК-мішені, липкий кінець (кінці) може бути або може не бути взятий до уваги. Наприклад, нуклеотиди від З' липкого кінця і до 2 нуклеотидів від 5- або 3'-кінця подвійного ланцюга можуть бути модифіковані без значної втрати активності молекули міРНК.

Молекули РНКІ можуть мати одну або більше 5' або 3'- кеп-структур. Молекула РНКІі може мати кеп-структуру на 3'-кінці сенсової нитки, антисенсової нитки, або як сенсової, так і антисенсової ниток, або на 5'-кінці сенсової нитки, антисенсової нитки, або як сенсової, так і антисенсової ниток молекули РНКІ. Альтернативно, молекула РНКІі може мати кеп-структуру, як на 3'-кінці, так ії на 5-кінці молекули РНКІі. Термін "кеп-структура" відноситься до хімічної модифікації, введеної на будь-якому кінці олігонуклеотиду, який захищає молекулу від екзонуклеазної деградації, а також може полегшити доставку або локалізацію всередині клітини.

Іншою модифікацією, що застосовується до молекул РНКІ, є хімічний зв'язок з молекулою

РНКІі одного або декількох фрагментів або кон'югатів, які підвищують активність, клітинний розподіл, клітинне поглинання, біодоступність і стабільність молекули РНКІ. Полінуклеотиди можуть бути синтезовані або модифіковані способами, що є добре відомими в даній галузі техніки. Хімічні модифікації можуть включати, але не обмежуються, до 2' модифікацій, введення ненатуральних основ, ковалентне приєднання до ліганда, і заміну фосфатних зв'язків тіофосфатними зв'язками. У цьому варіанті, цілісність дуплексної структури посилена принаймні одним, а зазвичай двома, хімічними зв'язками. Хімічне зшивання може бути досягнуте за допомогою будь-якого з різних добре відомих способів, наприклад, шляхом введення 60 ковалентних, іонних або водневих зв'язків; гідрофобних взаємодій, сил Ван-дер-Ваальса або стекінг-взаємодій; за допомогою метало-іонної координації, або шляхом використання аналогів пурину.

У ще одному варіанті, нуклеотиди в одній або обох з двох окремих ниток можуть бути модифіковані з метою зниження або інгібування активації клітинних ферментів, таких як, наприклад, без обмеження, певних нуклеаз. Способи зниження або інгібування активації клітинних ферментів є добре відомими в даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись, 2-аміно модифікації, 2-фтор модифікації, 2-алкіл модифікації, модифікації незарядженого кістяка, морфолінові модифікації, 2'-0-метил модифікації, і фосфорамідат. Таким чином, принаймні, одна 2'-гідроксильна група нуклеотидів на дволанцюговій РНК замінюється хімічною групою. Крім того, принаймні один нуклеотид може бути модифікованим з метою формування заблокованого нуклеотиду. Такий заблокований нуклеотид містить метиленовий або етиленовий міст, що з'єднує 2'-кисень рибози з 4"-вуглецем рибози. Введення заблокованого нуклеотиду в олігонуклеотид покращує спорідненість для комплементарних послідовностей і підвищує температуру плавлення на кілька градусів.

Ліганди можуть бути кон'юговані з молекулою РНКІ, наприклад, для підвищення її клітинного поглинання. У деяких варіантах, гідрофобний ліганд кон'югується з молекулою для сприяння безпосередньому проникненню клітинної мембрани. Ці підходи були використані для сприяння проникненню клітин антисенсових олігонуклеотидів. У деяких випадках, кон'югація катіонного ліганда з олігонуклеотидами часто призводить до покращеної резистентності до дії нуклеаз.

Репрезентативні приклади катіонних лігандів включають в себе пропіламоній (і диметилпропіламоній. Антисенсові олігонуклеотиди можуть зберігати свою високу афінність зв'язування з мРНК, коли катіонний ліганд є розосередженим по всьому олігонуклеотиду.

Молекули і нуклеотиди, описані тут, можуть бути отримані з використанням добре відомих способів твердофазного синтезу. Додатково або альтернативно можуть використовуватися будь-які інші засоби для такого синтезу, відомі в даній галузі техніки.

Різні варіанти відносяться до векторів експресії МЕТ5, що містять один або більше полінуклеотидів МЕТ5, або конструкцій РНКі МЕТ5, що містять один або більше полінуклеотидів

МІТ5.

Різні варіанти відносяться до векторів експресії, що містять один або більше полінуклеотидів

Ко) МЕТ5, або один, або більше конструкцій РНКі МЕТ5.

МЕТ5, або один, або більше конструкцій РНКі МіТ5, що кодують один або більше полінуклеотидів РНКі М(Т5, здатних до саморенатурації (самовідпалу) з метою формування шпилькової структури, в якій конструкція включає в себе: (а) один або більше полінуклеотидів

МЕТ5, (5) другу послідовність, що кодує спейсер, який формує петлю шпилькової структури, і (с) третю послідовність, що містить зворотну комплементарну послідовність першої послідовності, розташовану в тій же самій орієнтації, що і перша послідовність, при цьому друга послідовність розташована між першою послідовністю і третьою послідовністю, і друга послідовність є функціонально пов'язаною з першою послідовністю і з третьою послідовністю.

Описані послідовності можуть використовуватися для конструювання різних полінуклеотидів

МЕТ5, які не утворюють шпилькових структур. Наприклад, дволанцюгова РНК МІТ5 може бути сформована шляхом (1) транскрибування першої нитки ДНК МЕТ5 шляхом функціонального зв'язування з першим промотором, і (2) транскрибування зворотної комплементарної послідовності фрагмента першої нитки ДНК МЕТ5 шляхом функціонального зв'язування з другим промотором. Кожна нитка полінуклеотиду МІТЗ може бути транскрибована з одного вектора експресії, або з різних векторів експресії. Дуплекс РНК МІТ5, що має активність РНК- інтерференції, може бути ферментативно конвертований у міРНК для зниження рівнів РНК

МІТ5.

Таким чином, різні варіанти відносяться до векторів експресії М(Т5, що містять полінуклеотид МІТ5, або конструкцію РНКІі МЕТ5, що кодує полінуклеотиди РНКІі МЕТ5, здатні до самовідпалу, в яких конструкція включає в себе: (а) один або більше полінуклеотидів МЕТ5, описаних тут, і (Б) другу послідовність, що містить комплементарну (наприклад, зворотну комплементарну) послідовність першої послідовності, розташовану в тій же самій орієнтації, що і перша послідовність.

Пропонуються різні композиції і способи для зниження рівнів ендогенної експресії МЕТ5 шляхом стимулювання косупресії генної експресії МЕТ5. Явище косупресії має місце в результаті введення декількох копій трансгену у рослинну клітину-хазяїн. Інтеграція декількох копій трансгену може привести до зниження експресії трансгену і ендогенного гену-мішені.

Ступінь косупресії залежить від ступеня ідентичності послідовностей між трансгеном і 60 ендогенним геном-мішенню. Сайленсінг, як ендогенного гену, так і трансгену, може здійснюватися шляхом екстенсивного метилування локусів, підданих сайленсінгу (тобто, ендогенного промотору і ендогенного гену, що представляє інтерес), які можуть перешкоджати транскрипції. Альтернативно, в деяких випадках, косупресія ендогенного гену і трансгену може здійснюватися шляхом посттранскрипційного сайленсінгу генів ("РТО5"), при якому транскрипти можуть бути отримані, але підвищена швидкість деградації виключає накопичення транскриптів.

Механізм косупресії шляхом РТО5, як вважають, є схожим на РНК-інтерференцію, в тому сенсі, що РНК, судячи з усього, є як важливим ініціатором, так і мішенню в цих процесах, і може бути опосередковано опрацьована принаймні частково одним і тим же молекулярним механізмом, можливо, через РНК-спрямовану деградацію мРНК.

Косупресія нуклеїнової кислоти М(Т5 може досягатися шляхом інтеграції декількох копій нуклеїнової кислоти МЕТ5 або її фрагментів, як трансгенів, у геном рослини, що представляє інтерес. Рослина-хазяїн може бути трансформована за допомогою вектора експресії, що містить промотор, функціонально пов'язаний з нуклеїновою кислотою МІТ5 або її фрагментами.

Різні варіанти відносяться до векторів експресії для стимулювання косупресії ендогенних генів

МТ5, що містять промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом МІТ5.

Різні варіанти відносяться до способів модуляції (наприклад, зниження або інгібування) рівня експресії ДНК МЕТ5 шляхом інтеграції множинних копій полінуклеотиду МІТ5 у геном рослини (тютюну), що включає в себе: трансформацію рослинної клітини-хазяїна вектором експресії, який містить промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом МЕТ5.

Пропонуються різні композиції і способи зниження рівня експресії ендогенного гену МЕТЗ шляхом зниження або інгібування трансляції мРНК МІТ5. Рослинна клітина-хазяїн (тютюну) може бути трансформована вектором експресії, що включає в себе: промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом МІТ5, розташованим у антисенсовій орієнтації по відношенню до промотору, для забезпечення експресії полінуклеотидів РНК, які мають послідовність, комплементарну з частиною мРНК МЕТ5.

Різні вектори експресії для зниження або інгібування трансляції мРНК МЕГ5 можуть містити: промотор, функціонально-пов'язаний з полінуклеотидом М(Т5, в якому послідовність розташована в антисенсовій орієнтації по відношенню до промотору. Довжина антисенсових полінуклеотидів РНК МІТ5 може змінюватися, і може становити від близько 15-20 нуклеотидів,

Ко) близько 20-30 нуклеотидів, близько 30-50 нуклеотидів, близько 50-75 нуклеотидів, близько 75- 100 нуклеотидів, близько 100-150 нуклеотидів, близько 150-200 нуклеотидів і близько 200-300 нуклеотидів.

Також пропонуються способи отримання мутантних полінуклеотидів і поліпептидів МЕТ5.

Будь-яка рослина, що представляє інтерес, у тому числі рослинна клітина або рослинний матеріал, може бути генетично модифікована різними відомими способами, які індукують мутагенез, включаючи сайт-спрямований мутагенез, олігонуклеотид-спрямований мутагенез, хімічно-індукований мутагенез, опромінення-індукований мутагенез, мутагенез із використанням модифікованих основ, мутагенез із використанням "рваної" дволанцюгової ДНК, мутагенез із дволанцюговим розривом, мутагенез із використанням репаративних дефіцитних штамів-хазяїв, мутагенез шляхом загального генного синтезу, перестановку в ДНК та інші еквівалентні способи.

Альтернативно, гени МЕТ5 можуть бути мішенями для інактивації шляхом введення рибозим, отриманих від ряду невеликих кільцевих РНК, які є здатними до саморозщеплення і реплікації у рослинах. Ці РНК можуть реплікуватися або самостійно (РНК віроїди) або з вірусом- помічником (сателітні РНК). Приклади відповідних РНК включають РНК, похідні від віроїдних і сателітних РНК "сонячної" плямистості авокадо, похідні від вірусу кільцевої плямистості тютюну, вірусу тимчасової смугастості люцерни, вірусу оксамитової плямистості тютюну, вірусу плямистості пасліну (Зоїапит поашогит) та вірусу плямистості конюшини підземної (Тгйоїїйшт з,ибіегапешцт). Різні РНК-мішені-специфічні рібозими є відомими фахівцям у даній галузі техніки.

У деяких варіантах, експресія поліпептиду МЕТ5 знижується за допомогою нетрансгенних засобів, таких як створення однієї або кількох мутацій у гені МЕТ5. Способи, які вводять мутацію довільним чином у нуклеотидну послідовність гену, можуть включати в себе хімічний мутагенез,

ЕМ5 (етилметансульфонат)-мутагенез та радіаційний мутагенез. Способи, які вводять одну або кілька цільових мутацій у клітину, включають, але не обмежуються, технологію редагування геному, зокрема цинк-палецьва нуклеаза-опосередкований мутагенез, "Шіпуд" (таргетінг- індуковані локальні ушкодження в геномах), гомологічну рекомбінацію, олігонуклеотид- спрямований мутагенез і мегануклеаза-опосередкований мутагенез.

Деякі необмежувальні приклади мутацій включають в себе делеції, вставки та міссенс- мутації принаймні одного нуклеотиду, одиночні нуклеотидні поліморфізми (ЗМР) і простий бо повтор послідовності. Після мутації, може бути виконаний скринінг, щоб визначити делеції, які створюють передчасні стоп-кодони чи інакше нефункціональні гени МЕТ5. Скринінг мутантів може здійснюватися шляхом секвенування, або з використанням одного або більше зондів або праймерів, специфічних для гену або білка М(Т5. Специфічні мутації можуть також бути створені у полінуклеотидах МІТ5, що може призвести до зниження генної експресії МЕТ5, зниження стабільності мРНК МТЗ або зниження стабільності білка МЕТ5. Такі рослини згадуються тут як мутантні рослини.

Мутантні рослини можуть мати будь-яку комбінацію однієї або декількох мутацій, що призводить до зниження рівнів поліпептиду МІТ5. Наприклад, мутантні рослини можуть мати одну мутацію в одному гені МЕТ5 або декілька мутацій в одному гені МІТ5. Відповідно, тут описані мутантні рослини, що містять варіанти мутантного поліпептиду МЕТ5.

В одному варіанті, насіння рослин піддали мутагенізації, і потім вирощували для отримання мутантних рослин першого покоління. Рослинам першого покоління дали можливість самозапилюватися, і насіння від рослин першого покоління виростили для отримання рослин другого покоління, які потім піддали скринінгу на предмет мутацій в їхніх локусах МІТ5. Хоча мутагенізований рослинний матеріал може піддаватися скринінгу на наявність мутацій, перевага скринінгу рослин другого покоління полягає в тому, що всі соматичні мутації відповідають мутаціям зародкової лінії. Фахівцеві у даній галузі техніки буде зрозуміло, що різні рослинні матеріали, включаючи, але не обмежуючись, насіння, пилок, рослинну тканину або рослинні клітини можуть бути мутагенізовані з метою створення мутантних рослин МЕТ5. Проте, тип мутагенізованого рослинного матеріалу може впливати на результати, коли нуклеїнову кислоту рослини піддають скринінгу на наявність мутацій. Наприклад, коли пилок піддають мутагенезу перед запиленням немутагенізованої рослини, насіння, отримане в результаті цього запилення, вирощують для отримання рослин першого покоління. Кожна клітина рослин першого покоління буде містити мутації, створені в пилку, таким чином, ці рослини першого покоління можуть потім бути піддані скринінгу на наявність мутацій МЕТ5 замість того, щоб чекати на друге покоління. Мутагени, які створюють точкові мутації, короткі делеції, вставки, трансверсії та/або транзиції включаючи хімічні мутагени або випромінювання, можуть використовуватися для створення мутацій. Мутагени включають, але не обмежуються, етилметансульфонат (ЕМ5), метилметансульфонат (ММ5), М-етил-М-нітрозосечовину (ЕМ),

Зо триетилмеламін (ТЕМ), М-метил-М-нітрозосечовини (ММ), прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамід, діетилсульфат, мономер акриламіду, мелфалан, азотистий іприт, вінкристин, диметилнітрозамін, М-метил-М'-нітро-нітрозогуанідін (ММЯМС), нітрозогуанідін, 2-амінопурін, 7,12 диметил-бенз(адантрацен (ОМВА), етиленоксид, гексаметилфосфорамід, бісульфан, діепоксиалкени (діепоксиоктан (ОЕС), діепоксибутан (ВЕВ) тощо), 2-метокси-6-хлор-9|3-(етил-2- хлор-етил)амінопропіламіно|(акридину дигідрохлорид (ІСК-170) і формальдегід. Спонтанні мутації в локусі МЕТ5, які не можуть бути безпосередньо спричинені мутагеном, також розглядаються за умови, що вони призводять до отримання бажаного фенотипу. Відповідні мутагенні агенти також включають, наприклад, іонізуюче випромінювання, наприклад, рентгенівські промені, гамма-промені, швидке нейтронне опромінення і УФ-випромінювання.

Будь-який спосіб отримання нуклеїнової кислоти рослини, відомий в даній галузі техніки, може використовуватися для отримання нуклеїнової кислоти рослини для скринінгу МЕГ5-мутації.

Будь-який спосіб отримання нуклеїнової кислоти рослини, відомий в даній галузі техніки, може використовуватися для отримання нуклеїнової кислоти рослини для скринінгу МИ 5-мутації.

Отримана нуклеїнова кислота від окремих рослин, рослинних клітин або рослинного матеріалу може необов'язково об'єднуватися з метою прискорення скринінгу на предмет наявності мутацій в гені МЕТ5 популяції рослин, що походить від мутагенізованої рослинної тканини, клітин або матеріалу. Одне або кілька наступних поколінь рослин, рослинних клітин або рослинного матеріалу можуть піддаватися скринінгу. Розмір необов'язково об'єднаної групи залежить від чутливості способу скринінгу, що використовується.

Після того, як зразки нуклеїнових кислот були необов'язково об'єднані, вони можуть піддаватися полінуклеотид МЕТ5-специфічним способам ампліфікації, таким як, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Будь-який один або більше праймерів або зондів, специфічних для гену МІТ5 або послідовностей, що є безпосередньо суміжними до гену М(Т5, можуть використовуватися для ампліфікації послідовностей МІТ5 в межах необов'язково об'єднаного зразка нуклеїнової кислоти. Переважно, один або більше праймерів призначені для ампліфікації ділянок локусу МІТ5, в яких корисні мутації виникають найбільш імовірно. Найбільш переважно, праймер призначений для виявлення мутацій у ділянках полінуклеотиду МТЗ. Крім того, переважно, щоб праймер (праймери) уникав відомих поліморфних сайтів для полегшення скринінгу на предмет наявності точкових мутацій. З метою сприяння виявленню продуктів 60 ампліфікації, один або більше праймерів або зондів можуть маркуватися за допомогою будь-

якого звичайного способу маркування. Праймер (праймери) або зонди можуть бути сконструйовані на основі послідовностей МІТ5, описаних тут, з використанням способів, які є добре відомими в даній галузі техніки. Поліморфізми можуть бути ідентифіковані за допомогою засобів, відомих у даній галузі техніки.

У ще одному аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини. Спосіб включає в себе отримання принаймні однієї клітини рослини, що містить ген, який кодує функціональний поліпептид МТ5. Далі, принаймні одну клітину рослини обробляють в умовах, ефективних для модулювання активності гену М(Т5. Потім принаймні одна мутантна рослинна клітина переноситься у мутантну рослину, де мутантна рослина має модульований рівень поліпептиду

МЕТ5 у порівнянні з контрольною рослиною. В одному варіанті цього способу отримання мутантної рослини, стадія обробки включає в себе застосування принаймні до однієї клітини хімічного мутагенізуючого агента, як описано вище, і в умовах, ефективних для отримання принаймні однієї мутантної рослинної клітини. В іншому варіанті цього способу, стадія обробки включає в себе застосування принаймні до однієї клітини джерела випромінювання в умовах, ефективних для отримання принаймні однієї мутантної рослинної клітини. Термін "мутантна рослина" включає в себе мутантні рослини, в яких генотип є модифікованим у порівнянні з контрольною рослиною, відповідно за допомогою засобів, відмінних від генної інженерії або генетичної модифікації.

У деяких варіантах, мутантна рослина, мутантна рослинна клітина або мутантний рослинний матеріал може містити одну або більше мутацій, які виникли природно в іншій рослині, рослинній клітині або рослинному матеріалі, і надають бажаної ознаки. Ця мутація може бути введена (наприклад, шляхом інтрогресії) в іншу рослину, рослинну клітину або рослинний матеріал (наприклад, рослину, рослинну клітину або рослинний матеріал з генетичним фоном, відмінним від рослини, з якої була отримана мутація) для надання їм бажаної ознаки. Таким чином, як приклад, мутація, що виникла природно у першій рослині, може бути введена у другу рослину, наприклад, другу рослину з генетичним фоном, відмінним від першої рослини.

Спеціаліст у даній галузі техніки, таким чином, має можливість вести пошук і ідентифікувати рослину, що містить природно у своєму геномі один або більше мутантних алелів гену МЕТ5, які надають бажану ознаку. Мутантний алель (алелі), який виникає природно, може передаватися другій рослині за допомогою різних способів, включаючи селекцію, зворотне схрещування і інтрогресію для отримання ліній, сортів або гібридів, які мають одну або більше мутацій у гені

МЕТ5. Рослини, які демонструють бажану ознаку, можуть піддаватися скринінгу окремо від пулу мутантних рослин. Відповідно, вибір здійснюється з використанням знання нуклеотидних послідовностей МЕТ5, як описано тут. Отже, існує можливість скринінгу на наявність генетичної ознаки, що свідчить про підвищені рівні вільного метіоніну в порівнянні з контрольною рослиною. Такий скринінговий підхід може передбачати застосування звичайної ампліфікації нуклеїнової кислоти та/або способів гібридизації, як описано тут. Таким чином, ще один аспект відноситься до способу ідентифікації мутантної рослини, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка, що містить полінуклеотид МІТ5 від рослини, і (б) визначення нуклеотидної послідовності полінуклеотиду МІТ5, в якому відмінність у послідовності полінуклеотиду МИТ 5 порівняно з полінуклеотидом МІТ5 контрольної рослини свідчить про те, що зазначена рослина є мутантною рослиною МІТ5. В іншому аспекті, пропонується спосіб ідентифікації мутантної рослини, яка акумулює підвищені рівні вільного метіоніну в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від рослини, що підлягає скринінгу, (Б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді МЕТ5; і (с) визначення вмісту метіоніну у зазначеній рослині; при цьому, якщо зразок містить одну або більше мутацій у полінуклеотиді МЕТ5, що модулюють експресію або активність білка, кодованого в порівнянні з контрольною рослиною, і частина рослини має підвищення вмісту метіоніну принаймні на 5 95 порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена, є свідченням мутантної рослини, що зустрічається в природі, яка накопичує підвищені рівні вільного метіоніну. В іншому аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини, яка акумулює підвищені рівні вільного метіоніну в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від першої рослини, (Б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді

МЕТ5, які призводять до накопичення підвищених рівнів вільного метіоніну в ньому, і (с) перенесення однієї або більше мутацій у другу рослину. Мутація (мутації) може переноситися у другу рослину з використанням різних способів, відомих у даній галузі техніки, наприклад, за допомогою генної інженерії, генетичної маніпуляції, інтрогресії, селекції рослин, зворотного схрещування (беккросу), тощо. В одному варіанті, перша рослина є рослиною, що зустрічається бо в природі. В одному варіанті, друга рослина має генетичний фон, відмінний від першої рослини.

В іншому аспекті, пропонується спосіб отримання мутантної рослини, яка акумулює підвищені рівні вільного метіоніну в порівнянні з контрольною рослиною, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка від першої рослини, (б) визначення, чи зазначений зразок має одну або більше мутацій у полінуклеотиді МІТ5, які призводять до накопичення підвищених рівнів вільного метіоніну в ньому, і (с) введення шляхом інтрогресії однієї або більше мутацій від першої рослини у другу рослину. В одному варіанті, стадія інтрогресії включає в себе селекцію рослини, що необов'язково включає зворотне схрещування, тощо. В одному варіанті, перша рослина є рослиною, що зустрічається в природі. В одному варіанті, друга рослина має генетичний фон, відмінний від першої рослини. В одному варіанті, перша рослина не є культурним сортом або елітним культурним сортом. В одному варіанті, друга рослина являє собою культурний сорт або елітний культурний сорт. Ще один аспект відноситься до мутантної рослини (включаючи культурний сорт або елітний культурний сорт мутантної рослини), отриманої або такої, що може бути отримана способами, описаними тут. У деяких варіантах, мутантні рослини можуть мати одну або більше мутацій, локалізованих тільки у певній ділянці рослини, наприклад, у послідовності полінуклеотиду МЕТ5. Відповідно до цього варіанту, геномна послідовність мутантної рослини, що залишається, буде такою ж або по суті такою ж, як у рослини до мутагенезу.

У деяких варіантах, мутантні рослини можуть мати одну або більше мутацій, локалізованих в більш ніж одній ділянках рослини, наприклад, у послідовності полінуклеотиду МЕТ5, і в одній або декількох подальших ділянках геному. Відповідно до цього варіанту, геномна послідовність мутантної рослини, що залишається, не буде такою ж, або не буде по суті такою ж, як у рослини до мутагенезу. У деяких варіантах, мутантні рослини можуть не мати однієї або більше мутацій в одному або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, або п'яти, або більше екзонах полінуклеотиду МІТ5; або можуть не мати однієї або більше мутацій в одному або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, або п'яти, або більше інтронах полінуклеотиду МІТ5, або можуть не мати однієї або більше мутацій у промоторі полінуклеотиду МІТ5; або можуть не мати однієї або більше мутації у 3' нетрансльованій ділянці полінуклеотиду МІТ5; або можуть не мати однієї або більше мутацій у 5'-нсетрансльованій ділянці полінуклеотиду МЕТ5; або можуть не мати однієї або більше мутацій у кодувальній

Зо ділянці полінуклеотиду МЕТ5, або можуть не мати однієї або більше мутацій у некодувальній ділянці полінуклеотиду МЕТ5, або будь-яку комбінацію двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше; або шести, або більше їх частин відповідно.

В одному варіанті, послідовність (наприклад, комплементарна послідовність), що має принаймні 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 або більше суміжних нуклеотидів з нуклеотидами 1-46 послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 і 3; з нуклеотидами 1-52 послідовності БЕО ІЮ МО: 20; з нуклеотидами 99-141 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1; з нуклеотидами 102-144 послідовностей 5ЕО ІЮО МО: 2 і 5ЕО ІЮО МО: 3; з нуклеотидами 102-153 послідовності зЗЕО ІЮ МО: 20; з нуклеотидами 1325-1362 послідовностей 5ЕО ІО МО: 1, 2 і 3, або з нуклеотидами 1334-1371 послідовності зЕО ІЮО МО: 20, використовується для модулювання експресії.

В іншому варіанті послідовність (наприклад, комплементарна послідовність), що має принаймні 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 або більше суміжних нуклеотидів з нуклеотидами 454-805 послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2, або

ЗЕО ІЮ МО: З або з нуклеотидами 463-814 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 20, використовується для модулювання експресії У ще одному аспекті пропонується спосіб ідентифікації рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, що містить мутацію в гені, який кодує МІТ5, що включає в себе: (а) застосування до рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу мутагенезу, (6) отримання зразка нуклеїнової кислоти від зазначеної рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу або їх нащадків, і (с) визначення послідовності нуклеїнової кислоти гену, що кодує МТЗ, або його варіанту, або фрагменту, де відмінність у зазначеній послідовності свідчить про наявність однієї або більше мутацій в них.

Білки "цинкові пальці" можуть використовуватися для модулювання експресії або активності треонінсинтази. У різних варіантах, послідовність геномної ДНК, що містить частину або всю кодувальну послідовність полінуклеотиду МЕТ5, модифікується за допомогою цинк-пальцевої нуклеази-опосередкованого мутагенезу. Послідовність геномної ДНК піддається пошуку на наявність унікального сайту для зв'язування з білками "цинкові пальці". Альтернативно, послідовність геномної ДНК піддається пошуку на наявність двох унікальних сайтів для зв'язування з білками "цинкові пальці", де обидва сайти знаходяться на протилежних нитках і близько одне від одного, наприклад, на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше пар основ одне від одного. Відповідно, пропонуються білки "цинкові пальці", які зв'язуються з полінуклеотидами

МІТ5.

Білок "цинкові пальці" може бути сконструйований засобами генної інженерії для розпізнавання обраного сайта-мішені у гені МЕТ5. Білок "цинкові пальці" може містити будь-яку комбінацію мотивів, похідних від природних ДНК цинкові пальці-зв'язуючих доменів і неприродних ДНК цинкові пальці-зв'язуючих доменів, за допомогою відсікання або розширення, або процесу сайт-спрямованого мутагенезу в поєднанні зі способом селекції, наприклад, але не обмежуючись, селекцією фагового дисплею, бактеріальною двогібрідною селекцією або бактеріальною одногібридною селекцією. Термін "неприродний ДНК цинкові пальці-зв'язуючий домен" відноситься до ДНК цинкові пальці-зв'язуючого домену, який зв'язує послідовність з трьох пар основ у ДНК-мішені і, який не виникає у клітині чи організмі, що містить ДНК, яка має бути модифікована. Способи конструювання білка "цинкові пальці", який зв'язується із певними нуклеотидними послідовностями, що є унікальними для гену-мішені, є відомими у даній галузі техніки.

Цинк-пальцева нуклеаза може бути сконструйована шляхом злиття першого полінуклеотиду, що кодує білок "цинкові пальці", який зв'язується з полінуклеотидом МТ, і другого полінуклеотиду, що кодує неспецифічні ендонуклеази, такі як, але не обмежуючись, ендонуклеази типу ІЇ5. Злитий білок між білком "цинкові пальці" і нуклеазою може містити спейсер, що складається з двох пар основ або, альтернативно, спейсер може містити три, чотири, п'ять, шість, сім або більше пар основ. У різних варіантах, цинк-пальцева нуклеаза вводить дволанцюговий розрив у регуляторну ділянку, кодувальну ділянку, або некодувальну ділянку послідовності геномної ДНК полінуклеотидів МЕТ5 і призводить до зниження рівня експресії полінуклеотиду МІТ5, або зниження активності білка, кодованого таким чином.

Розщеплення за допомогою цинк-пальцевої нуклеази часто призводить до делеції ДНК у сайті розщеплення з наступною репарацією ДНК шляхом негомологічного з'єднання кінців.

В інших варіантах, білок "цинкові пальці" може обиратися для зв'язування з регуляторною послідовністю полінуклеотиду МІТ5. Зокрема, регуляторна послідовність може містити сайт ініціації транскрипції, стартовий кодон, ділянку екзону, екзон-інтронний стик, термінатор або стоп-кодон. Відповідно, винахід пропонує мутанту, що не зустрічається в природі, або трансгенну рослину, або рослинні клітини, отримані шляхом цинк-пальцевої нуклеази- опосередкованого мутагенезу в безпосередній близькості або всередині гену МІТ5, і способи отримання такої рослини або рослинної клітини за допомогою цинк-пальцевої нуклеази- опосередкованого мутагенезу. Способи доставки білка "цинкові пальці" і цинк-пальцевої нуклеази у рослину є аналогічними тим, що описані нижче для доставки мегануклеази.

В іншому аспекті, винахід також відноситься до способів отримання мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних, або іншим чином генетично модифікованих рослин з використанням мегануклеаз, таких як І-СтеЇ. Природні мегануклеази, а також рекомбінантні мегануклеази, можуть використовуватися для цілеспрямованого створення дволанцюгового розриву в одному сайті або відносно невеликій кількості сайтів у геномній ДНК рослини з метою забезпечення порушення гену М(Т5. Мегануклеаза може бути генетично-інженерною (сконструйованою) мегануклеазою із зміненими властивостями ДНК-розпізнавання. Білки мегануклеази можуть доставлятися у клітини рослин за допомогою множини різних механізмів, відомих у даній галузі техніки.

Винахід охоплює використання мегануклеази для інактивації полінуклеотидів МТЗ у рослинній клітині або рослині. Зокрема, винахід відноситься до способу інактивації полінуклеотиду МЕТ5 у рослині з використанням мегануклеази, який включає в себе: (а) отримання рослинної клітини, що містить полінуклеотид МЕТ5, (Б) введення мегануклеази або конструкції що кодує мегануклеазу, у зазначену рослинну клітину; і (с) забезпечення можливості для мегануклеази істотно інактивувати полінуклеотид МІТ5.

Мегануклеази можуть використовуватися для розщеплення сайтів розпізнавання мегануклеази в межах кодувальних ділянок полінуклеотиду МІТ5. Таке розщеплення часто призводить до делеції ДНК у сайті розпізнавання мегануклеази з наступною репарацією мутагенної ДНК шляхом негомологічного з'єднання кінців. Такі мутації у кодувальній послідовності гену, як правило, є достатніми, щоб інактивувати ген. Цей спосіб модифікації рослинної клітини включає в себе, по-перше, доставку касети експресії мегануклеази у рослинну клітину, використовуючи відповідний спосіб трансформації. Для досягнення максимальної ефективності, бажано зв'язати касету експресії мегануклеази із селектовним маркером і вибирати успішно трансформовані клітини у присутності селективного агента. Такий підхід призведе до інтеграції касети експресії мегануклеази у геном, проте, це може бути бо небажаним, якщо рослина, ймовірно, потребуватиме схвалення регулюючих органів. У таких випадках касета експресії мегануклеази (і пов'язаний селектовний маркерний ген) можуть бути відокремлені в наступних поколіннях рослини з використанням звичайних селекційних способів.

Крім того, рослинні клітини можуть бути із самого початку трансформовані за допомогою касети експресії мегануклеази, що не має селектовного маркера, і можуть вирощуватися у середовищі без селективного агента. У таких умовах, частка оброблених клітин набуде касету експресії мегануклеази і буде експресувати генно-інженерну мегануклеазу тимчасово без інтеграції касети експресії мегануклеази у геном. Оскільки цей підхід не враховує ефективності трансформації, така остання процедура трансформації потребує, щоб більша кількість оброблених клітин піддавалася скринінгу для отримання бажаної модифікації геному. Даний підхід може бути застосований для модифікації рослинної клітини при використанні білка "цинкові пальці" або цинк-пальцевої нуклеази.

Після доставки касети експресії мегануклеази, рослинні клітини вирощують, на початковому етапі, в умовах, характерних для певної процедури трансформації, що була використана. Це може означати вирощування трансформованих клітин на носієві при температурах нижче 26 "С, часто в темряві. Такі стандартні умови можуть застосовуватися протягом певного періоду часу, переважно 1-4 дні, щоб дозволити рослинній клітині відновитися після процесу трансформації.

У будь-який момент після цього початкового періоду відновлення, температура росту може бути підвищена, щоб стимулювати активність генно-інженерної мегануклеази для розщеплення і мутування сайту розпізнавання мегануклеази.

Для деяких застосувань може бути бажаним точно видалити полінуклеотид МТ5 з генома рослин. Такі застосування є можливими за допомогою пари генно-інженерних мегануклеаз, кожна з яких розщеплює сайт розпізнавання мегануклеази по обидві сторони від передбачуваної делеції.

Рослини, що є придатними для використання в генетичній модифікації за даним винаходом включають в себе однодольні і дводольні рослини і системи рослинних клітин, включаючи види з однієї з наступних родин: Асапіпасєає, АПіасеає, А|Ібігоетегіасєає, АтагуїІйдасеає,

Аросупасеає, Агесасеєає, Авієгасеає, Вегрегідасеає, Віхасєає, Вгаз5зісасеає, Вготеїасеєав,

Саппабрасеавє, СагуорпуПасеєавє, СерпаІоїахасеєаєвє, Спепородіасеавє, СоіІспісасєавє,

Сисигбіїасеає, Оіозсогеасеає, Ерпедгасеає, Егуїпгохуіїасеає, Еирпогріасеає, Еабасеєає,

Зо Іатіасєеає, Ііпасеає, Іусородіасеає, Маїмасеає, Меїапіпйасеає, Мизасеєає, Мупасєає,

Муззасеає, Рарамегасеає, Ріпасеає, Ріапіадіпасеєає, Роасеає, озасеає, Рибіасеєавє,

Заїїсасєає, Заріпдасеає, Зоіапасєає, Тахасеае, ТПеасеає або Міїасеає.

Відповідні види можуть включати в себе членів родів АбеІтовспив5, АбБіє5, Асег, Адгозіїв5,

АйЦит, АїІвігоетегіа, Апапа5, Апагодгарпі5, Апагородоп, Апетівзіа, Агипао, Аїгора, Вегбегів,

Веїа, Віха, Вгазвзіса, Саієпаціа, СатейПа, Сатріоїпеса, Саппаріх, Сарзісит, Сапйпатив,

Сашагапійих, Серпаіотахи5, Спгузапіпетит, Сіпспопа, СіїгиПи5, СоПйеа, СоІспісит, Соівив5, биситів, Сиситйа, Суподоп, Оаїшига, Оіапіпив, Рідйаїййв, Оіозсогеа, Еіаєї5, Ерпедга, Егпапіпив,

Егуїнгохуїпт, Еисаїуріив, Ревійса, Егадагіа, Саіапіпив, Сіусіпе, Соззуріит, Неїїапіпив, Неува,

Ногдеит, Нуозсуатиз, Уаїорна, І асіиса, І іпит, Гоїїшт, Гиріпи5, Гусорегвісоп, І усородійт,

Мапіної, Медісадо, Мепіпа, Мізсапіпив5, Миза, Місоїйапа, Огуга, Рапісит, Рарамег, Рапепійт,

Реппізешт, Реїшпіа, РІаїагі5, Рпієит, Ріпив, Роа, Роіпзейціа, Роршив, Нашмоїа, Нісіпи5, Ноза,

Засснагит, заїїх, Запапціпагіа, 5сороїїа, бЗесаіє, бБоїапит, бБогайит, брапіпа, 5ріпасеа,

Тапасешт, Тахив, Тпеобгота, Тийісозесаїе, Тийісит, Опіоіа, Мегаїит, Міпса, Мікіз і 2еа.

Відповідні види можуть включати в себе Рапісит в5рр., Зогупит 5рр., Мівсапіпив5 врр.,

Засспагит 5рр., Епапійи5 5рр., Рорши5 5рр., Апдгородоп дегагаїї (бородач), Реппізешт ригригешт (слонова трава), РНаїагі5 агипаіпасеа (двокісточник тростинний), Суподоп дасіуіюп (бермудська трава), ЕРевзіиса агипаіпасеа (костриця лучна), Зрагіпа ресіїпада (спатина витончена), Медісадо займа (люцерна), Агипдо. допах (арундо тростяний), Зесаїеє сегеаїе (жито), Заїїх 5рр. (верба), Еисаїуріи5 5рр. (евкаліпт), Тгйісозесаіе (тритикале - гібрид жита з пшеницею), бамбук, Неїїапіпих аппиив (соняшник), Саййпатив Ііпсіогіиє (сафлор), Чдаїгорна сигсаз (ятрофа), Кісіпиз5 соттипіх (рицина звичайна), ЕЇІаеї5 диіпеепзі5 (пальма), Гіпит изіїаїіввітит (льон), Вгаззіса |ппсеєа, Веїа мипЇдагі5 (цукровий буряк), Мапіпої езсцшепіа (маніок їстівний), Гусорегбзісоп езсшепішт (томат), Гасіиса займа (салат-латук), УЛиза рагадівіаса (банан), БЗоїапит їшбегозит (картопля), Вгавззіса оІєгтасеа (броколі, цвітна капуста, брюссельська капуста), Сатеїа 5іпепвів (чай), Егадагіа апапазза (полуниця), Тпеобгота сасао (какао), Соїйєа агабіса (кава), Міїїв міпітета (виноград), Апапа5 сотовзив (ананас), Сарвісит аппит (гострий і солодкий перець), АПит сера (цибуля), Сиситів тео (диня), Сиситів заїїмив (огірок), Сисигріа тахіта (гарбуз великоплідний), СисигЬйа то5спайа (гарбуз мускатний),

Зріпасеа оІегасєа (шпинат), СпгиПив5 Іапайв (кавун), АбеІтовспив5 езсцепив (бамія), Зоїапит бо теїопдепа (баклажан), Коза 5рр. (роза), Оіапіпи5 сагуорпуїи5 (гвоздика), Реїшпіа 5рр.

(петунія), Роіпзеціа риЇсНегтіта (пуансетія), Гиріпиє аіриє (люпин), Опіоїа рапісшаїа (овес), польовиця (Адговії5 5рр.), Роршиз5 ігептиіоідез5 (осика), Ріпиз 5рр. (сосна), Абрієз5 5зрр. (ялина),

Асег зрр. (клен), Ногдеит миїЇдаге (ячмінь), Роа ргаїепвів (тонконіг), Гоїйшт 5рр. (райграс) і

Рпїєшт ргаїепзе (тимофіївка), Рапісит мігдайт (просо прутеподібне), 5огдпит бБісоїог (сорго, суданська трава), Мізсапіпих дідапієи5 (міскантус), Засспагит 5р. (цукрова тростина), Роршив5 раІзатітега (тополя), 7єа тауз (кукурудза), Сіусіпе тах (соя), Вгазвіса париз (канола), Тийісит аевіїмит (пшениця), Собзурішт Пігшит (бавовна), Огуга взаїїма (рис), НеїЇйапіпи5 аппийв (соняшник), Медісадо заїїма (люцерна), Веїа мипїЇдагі5 (цукровий буряк) або Реппізешт діанисит (просо африканське).

Різні варіанти відносяться до мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються в природі, і трансгенних рослин, модифікованих для зниження рівнів генної експресії МЕТ5, таким чином, отримуючи рослини, такі як рослини тютюну, в яких рівень експресії МЕТ5 є зниженим у тканинах рослин, що представляють інтерес, порівняно з контрольною рослиною. Описані композиції і способи можуть бути застосовані до будь-яких видів роду Місоїйапа, включаючи М. гивіїса і М. їабасит (наприклад, ГА В21, ЇМ КМ171, ТІ 1406, Вахта, Саїрао, Регідие, Веіппагї 1000-1, і

Реїісо). Інші види включають М. асаціїв, М. аситіпаїа, М. аситіпайїа маг. тийШога, М. аїйісапа, М. аіаїа, М. атріехісаціїв5, М. агепівії, М. айепиаїа, М. репамідевії, М. репіпатіапа, М. Бідеїомії, М. ропаїпепвів5, М. самісоїа, М. сіємеїапай, М. согайойа, М. согутроза, М. дерпеуї, М. ехсеївіог, М.

Ттогдейапа, М. їадгапв, М. діаиса, М. дішіпоза, М. доодзреєдії, М. до55е6ї, М. пурта, М. іпдиїба, М.

КамжакКатії, М. Кпіднбапа, М. Іапозаопіії, М. Іпеагів, М. ІюопуШйога, М. тагйіта, М. тедапіовірноп, М. тієгвії, М. посійога, М. пидісаціїв, М. обіив5ітоїїа, М. оссідепіаїй5, М. оссідепіайїйв 5!йр5р. пезретгів, М. оюрпога, М. рапісшіайа, М. райсійога, М. реїшипіоіде5, М. ріитбвадіпітоїйа, М. диадимамів, М. гаіїтопай, М. герапда, М. го5шага, М. го5Шаа 5иИиБ5р. іпашціба, М. «оїшпайоїйа, М. 5еїснеїіїї, М. вітшіапв, М. зоіапітоїа, М. 5зредаг?іпії, М. віосКіопії, М. зиамеоієпв5, М. зуїмевігів, М. Іугзйога, М.

ТОотепіоза, М. тотепіовіїогптів, М. Мідопорпуйа, М. итбкгаїйса, М. ипашіайа М. меїІшіпа, М. мідапаїіоідез і М. х запаегає.

Трансгенна, що не зустрічається в природі, або мутантна рослина, таким чином, може бути сортом тютюну або елітним культурним сортом тютюну, який містить один або більше трансгенів, або одну або більше генетичних мутацій, або їх комбінацію. Генетична мутація

Зо (мутації) (наприклад, один або більше поліморфізмів) може являти собою мутації, які не існують у природі в окремому сорті тютюну або культурному сорті тютюну (наприклад, елітному культурному сорті тютюну), або може являти собою генетичну мутацію (мутації), яка виникає природно за умови, що ця мутація не зустрічаються в природі в окремому сорті тютюну або культурному сорті тютюну (наприклад, елітному сорті тютюну). Особливо корисні сорти

Місойапа Табасит включають в себе тютюн типу Берлі, темного типу, димового сушіння і орієнтального типу. Необмежувальні приклади сортів або культурних сортів включають в себе наступні: ВО 64, СС 101, СС 200, СС 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СО 800, С 900, СоКег 176, СоКег 319, СоКег 371 Сюоїд, СоКег 48, СО 263, ОЕ911, ОТ 538 І С Саїрао іобассо, сі 2бН, 1 350, 1 600, 1 737, 1 939, 1 973, НВ 04Р, НВ 04Р ІС, НВЗЗО07РІ С, Нубгіа 403І С, Нубгіа 4041 С, Нубгій 501 1 С, К 149, К 326, К 346, К 358, КЗ394, К 399, К 730, КОН 959, КТ 200, КТ2041С, КМ10, КМ14, КМ 160, КМ 17, КМ 171, КМ 907, КМ9071С, КТУ14ХІ8 1 С, І їШе

Стйепаєп, МеМаїг 373, МеМаїг 944, тек 14Хі 8, МаІтом І єаї Мадої!є, Мао І єаї Мадоїє 1 С,

МВН 98, М-126, М-7771 0, М-73711 С, МО 100, МО 102, МО 2000, МО 291, МО 297, МО 299, МО 3,

МО 4, МО 5, МО 6, МС7, МО 606, МО 71, МО 72, МО 810, МО ВН 129, МО 2002, Меа! тій Мадоїе,

ОХРОНО 207, РО 73021 С, РО 7309 1 С, РО 7312 І С, "Регідце" їобассо, РУНОЗ, РУНОЗ, РМУНІ9,

РМУН5БО, РУН5БТ, А 610, А 630, ВА 7-11, А 7-12, Ва 17, Ва 81, Ва Н5т1, Ван 4, Ван 51, 85 1410, зЗреїдні 168, Зреїдні 172, бреїдні 179, 5реїдні 210, 5реїдні 220, 5реїсні 225, 5реїсні 227, Зреїдні 234, Зреіднпі С-28, Зреїдні Сп-70, бреїдні Н-6, 5реїдані Н2О, бреїдні МЕЗ, ТІ 1406, ТІ 1269, ТМ 86,

ТМ86І С, ТМ 90, ТМ 97, ТМ971 С, ТМ 094, ТМ 0950, ТА (Тот Ноззоп) Мадоїє, МА 309, МАЗ59, АА 37-В 1ЗР, Хапійі (МіїспеїІ-Мог), ВеІ-м/3, 79-615, Затвип Ноїтез ММ, КТАВОС питрег 2 НуБгіа 49,

Випеу 21, КМ 8959, КМ 9, МО 609, РОО1, РО 04, РОТ, РО2, РОЗ, КО 11, КО 8, МА 509, АБ5А4,

ВапКеї АТ, Вазта Огата В84/31, Вахта І /існпа 7РА/В, Вазта Хапіпі ВХ 2А, Ваїек, Везикі

Уетбег, С104, СоКег 347, СтіоПо Мівіопего, Овєїсгеві, біебеї 81, ОМН 405, СаІрао Сотит, НВО4Р,

Ніск5 ВгоааіІєаї, Карбакшак Еіаззопа, Киїзаде ЕТ, ГА ВИ 21, МО 2326, МО 297, РУН2110, Неа

Виввіап, Зат5ип, ЗаріаКк, біттаба, ТаїЇдаг 28, М/івіса, Мауаідад, Риїєр НО-72, Риїер Р23, Рийїер

РВ 156/1, Ріїєер Р12-2/1, МаКа УК-48, Мака УВ 125/3, ГІ-1068, КОН-960, ТІ-1070, ТМ/136, Вахта,

ТКЕ 4028, 18, ТКЕ 2002, 28141, Вахта хапійі), 5К149, ОК153, Реїй Намапа. Підсорти з незначними відмінностями вищезазначених сортів, навіть якщо не були конкретно ідентифіковані тут, також розглядаються.

Варіанти також відносяться до композицій і способів отримання мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються в природі, гібридних рослин, або трансгенних рослин, які були модифіковані для зниження експресії або активності треонінсинтази, що призводить до підвищення концентрації вільного метіоніну в одній або більше частинах (наприклад, листі) рослини в порівнянні з контрольною рослиною. Переважно, отримані мутантні рослини, рослини, що не зустрічаються в природі, гібридні рослини і трансгенні рослини є подібними або по суті такими ж за зовнішнім виглядом до контрольних рослин. Різні фенотипічні характеристики, такі як ступінь зрілості, кількість листя на рослині, висота стебла, кут вростання листа, розмір листа (ширина і довжина), відстань міжвузловини, і співвідношення листової пластинки - головної жилки, можуть оцінюватися за допомогою польових спостережень.

Одним з аспектів є насіння мутантної рослини, рослини, що не зустрічається в природі, гібридної рослини, трансгенної рослини за винаходом. Переважно, насіння являє собою насіння тютюну. Іншим аспектом даного винаходу є пилок або сім'ябрунька мутантної рослини, рослини, що не зустрічається в природі, гібридної рослини, трансгенної рослини за винаходом. Крім того, пропонується мутантна рослина, рослина, що не зустрічається в природі, гібридна рослина, трансгенна рослина, як описано тут, яка додатково включає в себе нуклеїнову кислоту, що додає чоловічої стерильності.

Винахід також пропонує тканинну культуру клітин, здатних до регенерації, мутантної рослини, рослини, що не зустрічається в природі, гібридної рослини, або трансгенної рослини або їх частини, культура яких регенерує рослини, здатні до експресії всіх морфологічних та фізіологічних характеристик рослини-батька. Клітини, здатні до регенерації, за винаходом включають в себе, але не обмежуються, клітини від листя, пилку, зародків, сім'ядолей, гіпокотилів, коренів, кінчиків коренів, пиловиків, квітів і їх частини, сім'ябруньок, пагонів, стовбурів, стебла, серцевини і коробочок або калюсу, або протопластів, отриманих з них.

В одному варіанті, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки. Наприклад, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин є не меншою, ніж висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів

Зо після прищипування верхівки. В іншому варіанті, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин становить близько на 10 95, 9 95, 8 У, 7 Зо, 6 У, 5 У, 4 9,

З 95, 2 У5 або 1 95 вище або нижче, ніж висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки. В іншому варіанті, вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах по суті є таким же, що і вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки. Наприклад, вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах є не меншим, ніж вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки. В іншому варіанті, вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах становить близько на 10 95, 9 95, 8 Зо, 7 У, 6 У, 5 У, 4 9,

З 95, 2 У5 або 1 95 вище або нижче, ніж вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування. В іншому варіанті, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки і вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах по суті є таким же, що і вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле, або 36 днів після прищипування верхівки. Наприклад, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин є не меншою, ніж висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки і вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах є не меншим, ніж вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки. В іншому варіанті, висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин становить близько на 10 95, 9 95, 8 о, 7 Зо, 6 90, 5 о, 4 96, З Уо, 2 У або 1 95 вище або нижче, ніж висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки і вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах становить близько на 10 95, 9 95, 8 90, 7 У, б У, 5 У, 4 90, З У, 2 У або 195 вище або нижче, ніж вміст хлорофілу у контрольних рослинах через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування. В інших варіантах, одна або більше з бо наступних характеристик: ступінь зрілості, кількість листя на рослині, висота стебла, кут вростання листа, розмір листа (ширина і довжина), відстань міжвузловини, співвідношення листової пластинки - головної жилки і забарвлення листя мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, по суті є такими ж, що і у контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

В іншому аспекті, запропоновано спосіб підвищення концентрації вільного метіоніну в принаймні частині рослини (наприклад, листі), що включає наступні стадії: (і) зниження експресії або активності треонінсинтази у рослині, переважно, у якій треонінсинтаза включає в себе полінуклеотидну послідовність, описану тут, або поліпептидну послідовність, описану тут; (ії) вимірювання концентрації вільного метіоніну принаймні у частині (наприклад, листі) мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, отриманої на стадії (ї); та (ії) ідентифікацію мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, в якій концентрація вільного метіоніну підвищилася порівняно з контрольною рослиною. Відповідно, загальний зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким же, що і зовнішній вигляд контрольної рослини через три місяці після пересаджування у поле, або 36 днів після прищипування верхівки.

Зниження експресії треонінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 5 95 до близько 100 95, від близько 5 95 до близько 99 95 або менше, від близько 5 95 до близько 9595 або менше, від близько 595 до близько 9095 або менше, або зниження принаймні на 10 95, принаймні на 20 95, принаймні на 25 95, принаймні на 30 95, принаймні на 40 95, принаймні на 50 95, принаймні на 60 95, принаймні на 70 95, принаймні на 75 95, принаймні на 80 95, принаймні на 90 95, принаймні на 95 95, принаймні на 98 95 або 100 95, що включає в себе зниження транскрипційної активності та/або експресії білка. В одному варіанті, зниження експресії треонінсинтази є частковим зниженням експресії яке включає в себе зниження транскрипційної активності та/або експресії білка. В одному варіанті, часткове зниження експресії дозволяє мутантній, що не зустрічається в природі, або трансгенній рослині або рослинній клітині підтримувати залишкові рівні треонінсинтази.

Зниження активності треонінсинтази в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 5 95 до близько 100 95, від близько 5 95 до близько 99 95 або менше, від близько 5 95 до близько 9595 або менше, від близько 595 до близько 9095 або менше, або зниження

Зо принаймні на 10 95, принаймні на 20 95, принаймні на 25 95, принаймні на 30 95, принаймні на 40 95, принаймні на 50 95, принаймні на 60 95, принаймні на 70 95, принаймні на 75 95, принаймні на 80 95, принаймні на 90 95, принаймні на 95 95, принаймні на 98 95 або 100 95 або більше. В одному варіанті, зниження активності треонінсинтази є частковим зниженням активності. В одному варіанті, часткове зниження активності дозволяє мутантній, що не зустрічається в природі, або трансгенній рослині або рослинній клітині підтримувати залишкові рівні треонінсинтази.

Підвищення концентрації вільного треоніну в порівнянні з контрольною рослиною може становити від близько 5 95 до близько 100 95, або підвищення принаймні на 10 95, принаймні на 20 95, принаймні на 25 95, принаймні на 30 95, принаймні на 40 95, принаймні на 50 95, принаймні на 6095, принаймні на 70 95, принаймні на 7595, принаймні на 80 95, принаймні на 90 965, принаймні на 95 95, принаймні на 98 95 або до 100 95.

У деяких варіантах, експресія 5ЕО ІЮО МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІО МО: З або 5ЕО ІЮ

МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 1 і 5ЕО ІЮ МО: 2 або

ЗЕО ІО МО: З або 5ЕО ІЮО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІЮ МО: 2 і 5ЕО ІЮ МО: З або 5ЕО ІО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія 5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: З і 5ЕО ІЮО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується).

У деяких варіантах, експресія 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: З ї 5БЕО ІЮО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮО МО: З і ЗЕО ІЮО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: З ії 5ЕО ІЮО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: З ії 5ЕО ІО МО: 20 або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 і 5ЕО ІО МО: 20 або 60 активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія ЗЕО ІЮО МО: 1, ЗЕО ІЮО МО: 2 і ЗЕО ІЮО МО: З або активність білка, кодованого таким чином, знижується (наприклад, піддається сайленсінгу або інгібується). У деяких варіантах, експресія кожної з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮ МО: 2, або 5ЕО ІО МО: 3, або активність кожного з білків, кодованих таким чином, окремо або в комбінації, знижується більшою мірою, ніж експресія ЗЕО ІЮ МО: 20. В одному варіанті, додавання екзогенних компонентів, таких як амінокислоти, наприклад, треонін та/або ізолейцин, є непотрібним для отримання рослин з прийнятним зовнішнім виглядом.

Однією з цілей є створення мутантних рослин, трансгенних рослин або рослин, що не зустрічаються в природі, які демонструють підвищений рівень вільного метіоніну при збереженні по суті такого ж зовнішнього вигляду і однієї або більше агрономічних характеристик в порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно, тут описані мутантні рослини, трансгенні рослини або рослини, що не зустрічаються в природі, або генетично модифіковані клітини, які мають підвищений рівень вільного метіоніну і знижену активність або експресію треонінсинтази в порівнянні з контрольними клітинами тютюну чи контрольними рослинами. Мутантні, трансгенні або такі, що не зустрічаються в природі, рослини або клітини були модифіковані з метою зниження синтезу треонінсинтази шляхом зниження експресії одного або більше поліпептидів, що кодують полінуклеотидні послідовності, описані тут, переважно кодовані одним або більше полінуклеотидуми, які містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що кодує треонінсинтазу і має принаймні 87 95, 88 Фо, 89 Фо, 90 9, 95 95, 96 95, 97 9о, 98 Фо, 99 9р і 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮО МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 та/або 5ЕО ІО МО: 3, або одним або більше полінуклеотидуми, які містять, складаються або складаються по суті з послідовності, що кодує треонінсинтазу і має принаймні 90 95, 91 Фо, 92 Фо, 93 У, 94 ФУ, 95 ую, 96 Фо, 97 Чо, 98 Уо або 100 95 ідентичність послідовності з послідовностями 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО ІОЮ

МО: 6 або ЗЕО ІЮ МО: 20.

Ще один аспект стосується мутантних рослин, рослин, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин, у яких експресія треонінсинтази або активність білка, кодованого таким чином, знижується, і частина рослини (наприклад, листя) має підвищений вміст метіоніну принаймні на 595 порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена. Переважно, концентрація метіоналу в димові або аерозолі

Зо тютюнових виробів є підвищеною принаймні на 595 порівняно з димом або аерозолем тютюнового виробу, виготовленого з контрольної рослини.

Підвищення вмісту метіоніну в порівнянні з контрольною рослиною може становити принаймні близько 5 95, принаймні близько 10 95, принаймні близько 20 95, принаймні близько 2595, принаймні близько 30 95, принаймні близько 40 95, принаймні близько 50 95, принаймні 35 близько 60 95, принаймні близько 70 95, принаймні близько 75 95, принаймні близько 80 95, принаймні близько 90 95, принаймні близько 95 95, принаймні близько 96 95, принаймні близько 97 95, принаймні близько 98 95, принаймні близько 99 95, або близько 100 95 або більше.

Підвищення концентрації метіоналу в димові або аерозолі, отриманому з тютюнового виробу в порівнянні з контрольною рослиною може становити принаймні близько 5 965, 40 принаймні близько 10 95, принаймні близько 20 95, принаймні близько 25 95, принаймні близько 95, принаймні близько 40 95, принаймні близько 50 95, принаймні близько 60 95, принаймні близько 70 95, принаймні близько 7595, принаймні близько 80 95, принаймні близько 90 95, принаймні близько 95 95, принаймні близько 96 95, принаймні близько 97 95, принаймні близько 98 95, принаймні близько 99 95, або близько 100 95 або більше.

Відповідно, зовнішній вигляд або одна, або більше агрономічних характеристик зазначеної рослини є по суті такими ж, що і в контрольній рослині через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки, переважно, при цьому висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки та/або вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах є по суті таким же, що і вміст хлорофілу в контрольній рослині через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

Відповідно, концентрація вільного метіоніну в частині рослини (наприклад, листі) підвищується в порівнянні з контрольною рослиною.

Відповідно, (і) концентрація вільного метіоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні близько 0,026 мг/г, переважно принаймні близько 0,027 мг/г, переважно принаймні близько 0,028 мг/г, переважно принаймні близько 0,029 мг/г, переважно принаймні близько 0,03 мг/г, переважно принаймні близько 0,031 мг/г, переважно принаймні близько 0,032 мг/г, переважно принаймні близько 0,032 мг/г, переважно принаймні близько 0,033 мг/г, бо переважно принаймні близько 0,034 мг/г; (ії) концентрація вільного треоніну у частині рослини

(наприклад, листі) складає принаймні 0,5 мг/г, переважно принаймні близько 0,52 мг/г, переважно принаймні близько 0,54 мг/г, переважно принаймні близько 0,56 мг/г, переважно принаймні близько 0,58 мг/г, переважно принаймні близько 0,6 мг/г, і (ії) концентрація метіоналу в аерозолі при нагріванні частини рослини (наприклад, листя) становить принаймні близько 2000 мкг/г, переважно принаймні близько 2100 мкг/г, переважно принаймні близько 2200 мкг/г, переважно принаймні близько 2500 мкг/г, переважно принаймні близько 2750 мкг/г, переважно принаймні близько 3000 мкг/г, переважно принаймні близько 3250 мкг/г, переважно принаймні близько 3500 мкг/г, переважно принаймні близько 3750 мкг/г, переважно принаймні близько 3800 мкг/г або вище.

Відповідно, (І) концентрація вільного метіоніну у частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні 0,03 мг/г; (ії) концентрація вільного треоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить від близько 0,5 мг/г до 0,65 мг/г, і (ії) концентрація метіоналу в аерозолі при нагріванні частини рослини (наприклад, листя) становить принаймні 2200 мкг/г.

Відповідно, (і) концентрація вільного метіоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить принаймні 0,03 мг/г; (її) концентрація вільного треоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить від близько 0,5 мг/г до 0,65 мг/г, і (ії) концентрація метіоналу в аерозолі при нагріванні частини рослини (наприклад, листя) становить від близько 2200 мкг/г до близько 4000 мкг/г, переважно від близько 2200 мкг/г до близько 3850 мкг/г.

Рослина може нагріватися до 100 "С або вище, наприклад, принаймні, до 125 "С, принаймні до 150 "С, принаймні до 175 "С або принаймні до 200 "С для вивільнення аерозолю.

У ще одному аспекті, пропонується мутантна рослина, рослина, що не зустрічається в природі, або трансгенна рослина, в якій експресія треонінсинтази або активність білка, кодованого таким чином, знижується і (ї) концентрація вільного метіоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить близько 0,03 мг/г; (її) концентрація вільного треоніну в частині рослини (наприклад, листі) становить близько від 0,5 до близько 0,7 мг/г, і (ії) концентрація метіоналу в аерозолі при нагріванні частини рослини (наприклад, листя) становить принаймні близько 2000 мкг/г, і відповідно, в якій зовнішній вигляд або одна, або більше агрономічних характеристик зазначеної рослини є по суті такими ж, що і в контрольній рослині через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки, переважно, при

Зо цьому висота стебла мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин по суті є такою ж, що і висота стебла контрольних рослин через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки та/або вміст хлорофілу у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах є по суті таким же, що і вміст хлорофілу в контрольній рослині через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

Відповідно до опису, рослина, яка містить модифікований алель треонінсинтази, може використовуватися у програмі селекції рослин для створення корисних ліній, сортів і гібридів.

Модифікований алель може бути мутантним алелем. Зокрема, модифікований алель треонінсинтази вводиться шляхом інтрогресії в комерційно важливих сорти, описані вище.

Таким чином, пропонуються способи селекції, які включають в себе схрещування мутантної рослини, рослини, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, як описано тут, з рослиною, що має відмінну генетичну ідентичність. Спосіб може додатково включати схрещування рослини-нащадка з іншою рослиною і, необов'язково, повторення схрещування до тих пір, поки не буде отримано потомство з бажаними генетичними ознаками або генетичним фоном. Однією з цілей, яку переслідують такі способи селекції, є введення бажаної генетичної ознаки в інші сорти, селекційні лінії, гібриди або культурні сорти, особливо тих ознак, які представляють комерційний інтерес. Іншою ціллю є стимулювання стекінг-взаємодії генетичних модифікацій різних генів у сортах, лініях, гібридах або культурних сортах однієї рослини.

Розглядаються внутрішньовидове, а також міжвидове схрещування. Рослини-нащадки, які виникають внаслідок таких схрещувань, які також згадуються як селекційні лінії, є прикладами рослин, що не зустрічаються в природі, відповідно до винаходу.

В одному варіанті, пропонується спосіб отримання рослини, що не зустрічається в природі, який включає в себе: (а) схрещування мутантної або трансгенної рослини з другою рослиною для отримання насіння потомства тютюну, (б) вирощування насіння потомства тютюну, в умовах зростання рослини, для отримання рослини, що не зустрічається в природі. Спосіб може додатково включати: (с) схрещування попереднього покоління рослини, що не зустрічається в природі, з собою або іншою рослиною для отриманням насіння потомства тютюну, (а) вирощування насіння потомства тютюну, отриманого на стадії (с), в умовах зростання рослини, для отримання додаткових рослин, що не зустрічаються в природі, і (е) повторення бо схрещування і вирощування за стадіями (с) і (а) кілька разів для отримання наступних поколінь рослин, що не зустрічаються в природі. Спосіб може необов'язково включати перед стадією (а), стадію отримання батьківської рослини, що містить генетичну ідентичність, яка характеризується, і яка не є ідентичною мутантній або трансгенній рослині. У деяких варіантах, залежно від програми селекції, стадії схрещування і вирощування повторюються від 0 до 2 разів, від 0 до З разів, від 0 до 4 разів, від 0 до 5 разів, від 0 до 6 разів, від 0 до 7 разів, від О до 8 разів, від 0 до 9 разів або від 0 до 10 разів, з метою отримання поколінь рослин, що не зустрічаються в природі. Зворотне схрещування (беккрос) є прикладом такого способу, в якому потомство схрещується з одним зі своїх батьків або іншою рослиною, що є генетично подібною до свого батька, з метою отримання рослини-нащадка в наступному поколінні, яка має генетичну ідентичність, що є ближчою до генетичної ідентичності одного з батьків. Способи селекції рослин, зокрема селекції рослини тютюну, є добре відомими і можуть бути використані у способах даного винаходу. Винахід додатково пропонує рослини, що не зустрічаються в природі, отримані цими способами.

У деяких варіантах способів, описаних тут, лінії, отримані в результаті селекції та скринінгу варіантів генів треонінсинтази, оцінюються у польових умовах з використанням стандартних процедур польових досліджень. Контрольні генотипи, включаючи вихідну батьківську рослину, що не піддавалася мутагенезу, включені і посіви розташовані у полі відповідно до рандомізованого повноблочного плану або іншої відповідної структури поля. Для тютюну, використовуються стандартні агрономічні практики, наприклад, тютюн збирають, зважують і відбирають проби для хімічних і інших загальних тестів до і під час сушіння. Статистичні аналізи даних проводяться для підтвердження схожості обраних ліній з батьківською лінією.

Цитогенетичні аналізи відібраних рослин необов'язково проводяться, щоб підтвердити взаємозв'язки хромосомних наборів та хромосомної кон'югації.

ДНК-дактилоскопія, одиничний нуклеотидний поліморфізм, мікросателітні маркери, або аналогічні технології, можуть використовуватися у програмі селекції з використанням вибору за допомогою маркерів (МА5) для передачі або селекції модифікованих або мутантних алелів гену треонінсинтази в інших рослинах тютюну, як описано тут. Наприклад, селекціонер може створити популяції після розщеплення від гібридизації генотипу, що містить мутантний алель з агрономічно бажаним генотипом. Рослини у поколіннях Е2 або поколіннях, отриманих шляхом

Зо зворотного схрещування, можуть бути піддані скринінгу з використанням маркера, сконструйованого з геномної послідовності треонінсинтази або її фрагмента, з використанням одного зі способів, перерахованих тут. Рослини, ідентифіковані як такі, що володіють мутантним алелем, може піддаватися зворотному схрещуванню або самозапилюватися для створення другої популяції, що має піддаватися скринінгу. Залежно від передбачуваної схеми спадкування або технології МА5, що використовується, може знадобитися самозапилювання обраних рослин перед кожним циклом зворотного схрещування для полегшення ідентифікації бажаних окремих рослин. Зворотне схрещування (беккросинг) або інша процедура селекції може повторюватися до тих пір, поки бажаний фенотип рекурентної батьківської форми не буде відновлено.

Відповідно до опису, у програмі селекції, успішні кроси дають покоління рослин НЕ1, які є фертильними. Відібрані рослини Е1 можуть схрещуватися з одним з батьків, і рослини першого покоління зворотного схрещування самозапилюються для отримання популяції, яка знову піддається скринінгу на предмет наявності варіантної експресії гену треонінсинтази (наприклад, нульова версія гену треонінсинтази). Процес зворотного схрещування (беккросинг), самозапилення та скринінг повторюється, наприклад, принаймні, 4 рази до тих пір, поки остаточний скринінг не забезпечить отримання рослини, що є фертильною і досить схожою на рекурентну батьківську рослину. Ця рослина, якщо бажано, самозапилюється, а потомство згодом піддається скринінгу для підтвердження того, що рослина виявляє варіантну експресію гену треонінсинтази. У деяких варіантах, популяція рослини у поколінні Е2 піддається скринінгу на предмет наявності варіантної експресії гену треонінсинтази, наприклад, рослина була ідентифікована як така, що не змогла експресувати треонінсинтазу у зв'язку з відсутністю гену треонінсинтази відповідно до стандартних способів, наприклад, за допомогою способу ПЛР з праймерами, на основі інформації про нуклеотидну послідовність щодо треонінсинтази, описаної тут.

Гібридні сорти можуть бути отримані шляхом запобігання самозапиленню жіночих батьківських рослин (тобто, батьківського насіння) першого сорту, дозволяючи пилку від чоловічих батьківських рослин другого сорту запліднювати жіночі батьківські рослини, і дозволяючи насінню гібрида Е1 формуватися на жіночих рослинах. Самозапиленню жіночих рослин можливо запобігти шляхом видалення незрілих маточок у квітах на ранній стадії розвитку квітки. Альтернативно, формуванню пилка можливо запобігти на жіночих батьківських бо рослинах шляхом використання форми чоловічої стерильності. Наприклад, чоловіча

Зо стерильність може бути отримана шляхом цитоплазматичної чоловічої стерильності (СМ5), або трансгенної чоловічої стерильності, де трансген інгібує мікроспорогенез та/або утворення пилку, або шляхом самонесумісності. Жіночі батьківські рослини, що містять СМ5, є особливо корисними. У варіантах, в яких жіночі батьківські рослини мають СМ5, пилок збирається з чоловічих фертильних рослин і наноситься вручну на приймочки СМ5 жіночих батьківських рослин, і отримане насіння Е1 збирають.

Сорти та лінії, описані тут, можуть використовуватися для формування простих гібридів Е1 (одиничним схрещуванням). У таких варіантах, рослини батьківських сортів можуть вирощуватися як по суті гомогенні суміжні популяції, щоб полегшити природне перехресне запилення від чоловічих батьківських рослин до жіночих батьківських рослин. Насіння Р1, сформоване на жіночих батьківських рослинах, вибірково збирають за допомогою звичайних засобів. Можливо також вирощувати два сорти батьківської рослини в загальній групі і зібрати врожай суміші Е1 гібридного насіння, сформованого на жіночій батьківській рослині, і насіння, сформованого на чоловічій батьківській рослині, в результаті самозапилення. Альтернативно, потрійне схрещування може здійснюватися, в якому простий (одиночний) гібрид 1 використовується як жіноча батьківська рослина, і схрещується з різною чоловічою батьківською рослиною. Як інша альтернатива, можуть створюватися подвійні гібриди, де потомство Еїдвох різних простих (одиночних) гібридів схрещується між собою.

Популяція мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин може піддаватися скринінгу або вибору тих представників популяції, які мають бажану ознаку або фенотип. Наприклад, популяція потомства, отриманого шляхом одиночної трансформації, може піддаватися скринінгу на предмет пошуку тих рослин, які мають бажаний рівень експресії поліпептиду або полінуклеотиду МІТ5. Фізичні та біохімічні способи можуть використовуватися для ідентифікації рівнів експресії Вони включають в себе Саузерн-блотинг або ПЛР ампліфікацію для виявлення полінуклеотиду; Нозерн-блотинг, захист від РНКази 51, подовження праймера, або ЗТ-ПЛР ампліфікацію для виявлення РНК-транскриптів; ферментативні аналізи для виявлення активності ферменту або рибозиму поліпептидів і полінуклеотидів, а також гель-електрофорез білків, Вестерн-блотинг, імунопреципітацію і імуноферментний аналіз для виявлення поліпептидів. Інші способи, такі як локальна (іп 5йи)

Зо гіоридизація, рарбування ферменту та імунне фарбування, також можуть використовуватися для виявлення присутності або експресії поліпептидів або полінуклеотидів.

Мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослинні клітини та рослини, описані тут, містять один або більше рекомбінантних полінуклеотидів, наприклад, один або більше ізольованих полінуклеотидів М(/Т5, одну або більше полінуклеотидних конструкцій, одну або більше дволанцюгових РНК, один або більше кон'югатів, або один або більше векторів / векторів експресії.

У деяких варіантах, рослина, в якій експресія полінуклеотиду МІТ5 є зниженою, може мати підвищення концентрації вільного метіоніну, зокрема у листі. Концентрація вільного метіоніну може бути підвищена принаймні на 5 95, 6 о, 7 Уо, 8 о, 9 о, 1095, 11 90, 12 90, 13 95, 14 90, 15 Об, 16 У, 17 У, 18 У, 19 У, 20 Зв, 25 Ув, ЗО Зв, 35 У, 40 90, 45 У, 50 Зв, 55 У, 60 Зо, 70 У, 80 Ус, 90 У, 9596, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95, або більше в порівнянні з концентрацією вільного метіоніну у відповідній контрольній рослині, в якій експресія полінуклеотиду МЕТ5 не була знижена.

У деяких варіантах, рослина, в якій експресія полінуклеотиду МІТ5 є зниженою, може мати зниження концентрації вільного треоніну, зокрема у листі. Концентрація вільного треоніну може бути знижена принаймні близько на 5 95, 6 9, 7 Фо, 8 Фо, 9 90, 10 90, 11 95, 12 905, 13 95, 14 Фо, 15 95, 16 У, 17 У, 18 У, 19 У, 20 Зв, 25 Ув, ЗО Зв, 35 У, 40 90, 45 У, 50 Зв, 55 У, 60 Зо, 70 У, 80 Ус, 90 У, 9596, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95, або більше в порівнянні з концентрацією вільного треоніну у відповідній контрольній рослині, в якій експресія полінуклеотиду МТ5 не була знижена. В одному варіанті, концентрація вільного треоніну може бути знижена принаймні близько на 20 95, 25 95, 30 95, 35 У, 40 90, 45 95, 50 95, 55 90, 60 90, 70 о, або 80 95, або більше в порівнянні з концентрацією вільного треоніну у відповідній контрольній рослині, в якій експресія полінуклеотиду МЕТ5 не була знижена.

Експресія МЕТ5 може оцінюватися з використанням способів, в тому числі, наприклад, зворотної транскриптази полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР), Нозерн-блотингу, захисту від РНКази, подовження праймера, Вестерн-блотингу, гель-електрофорезу білків, імунопреципітації, імуноферментного аналізу, лабораторії на чипі і мас-спектрометрії. Слід зазначити, якщо поліпептид експресується під контролем тканепреферентного або широко експресуючого промотору, експресія може оцінюватися у всій рослині або в обраній тканині.

Подібним чином, якщо поліпептид експресується у певний час, наприклад, у певний час розвитку або після індукції, експресія може оцінюватися вибірково через бажаний період часу.

Без обмеження, рослини, описані тут, можуть бути модифіковані для інших цілей або до того, або після того, як експресія або активність треонінсинтази була модульована. Одна або більше з наступних додаткових генетичних модифікацій можуть бути присутніми у мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослинах за даним винаходом. В одному варіанті, один або кілька генів, залучених до поглинання важких металів або транспорту важких металів, модифікуються, в результаті чого рослини або частини рослин (наприклад, листя) мають нижчий вміст важких металів, ніж у контрольних рослинах або їх частинах без модифікації (модифікацій). Необмежувальні приклади включають гени, що належать до родини посередників катіонної дифузії (СОР), родини 2п-, ІРТ-подібних білків (2ІР), родини катіонообмінників (САХ), родини транспортерів міді (СОРТ), родини АТФаз Р-типу важких металів (НМА5, як описано у М/О2009074325), родини гомологів природних резистентність- пов'язаних білків макрофагів (МКАМР), і родини АТФф-зв'язуючих касетних (АВС) транспортерів, які беруть участь у транспорті важких металів. Термін "важкий метал", як використовується тут, включає в себе перехідні метали. В іншому варіанті, один або більше генів, які беруть участь у конверсії азотистих проміжних продуктів метаболізму, модифікуються, в результаті чого рослини або частини рослин (наприклад, листя) при нагріванні виробляють нижчі рівні принаймні одного тютюн-специфічних нітрозамінів (наприклад, 4-(метилнітрозаміно)-1-(3- піридил)-1-бутанон, М-нітрозонорнікотин, М-нітрозоанатабін, і М-нітрозоанабазін), ніж контрольні рослини або їх частини. Необмежувальні приклади генів, які можуть бути модифіковані, включають гени, що кодують нікотин деметилазу, наприклад, СУР8Ф2Е4, СУРВ82Е5 і СУР82Е10, які беруть участь у конверсії нікотину в норнікотин, і описані в патентах УУО2006091194,

УмОо2008070274, ММО2009064771 і РСТ/О5З2011/021088.

Приклади інших модифікацій включають резистентність до гербіцидів, наприклад, гліфосату, що є активним інгредієнтом багатьох гербіцидів широкого спектру дії. Гліфосат-резистентні трансгенні рослини були отримані шляхом передачі гену АгоА (гліросат ЕРЗР синтетази від

ЗаІтопеїа їурпітигіит і Е.соїї). Сульфонілсечовина-резистентні рослини були отримані шляхом трансформації мутантного гену АЇ 5 (ацетолактат синтетази) від Арабідопсису. ОВ білок

Зо фотосистеми Ії від мутантної рослини Атагапіпив пургідиз був переданий рослинам для отримання атразин-резистентних трансгенних рослин; і бромоксініл-резистентні трансгенні рослини отримали шляхом включення гену Бхп від бактерії Кіерзієйа рпешитопіаеє. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, стійкі до ураження комахами- шкідниками. Токсини ВасіЇн5 ІПигіпдіеєпвіз (ВО можуть забезпечити ефективний спосіб затримки появи Ві-резистентних комах-шкідників, як нещодавно було проілюстровано на прикладі броколі, де пірамідні сгуїАс і стуЇС Ві гени контролювали міль капустяну, стійку до будь-якого одного білка, і значно затримали еволюцію стійких комах. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, стійкі до захворювань, спричинених патогенними мікроорганізмами (наприклад, вірусами, бактеріями, грибками). Рослини, які експресують ген Хаг1 (резистентності до бактеріозу) із рослинами, що експресують, як злитий ген Ві, так і ген хітинази (резистентності до жовтого стеблового точильника і стійкості до захворювань піхви листка), були створені шляхом генної інженерії. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати змінений репродуктивний потенціал, наприклад, чоловічу стерильність. Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, стійкі до абіотичних стресів (наприклад, посухи, температура, солоності), та толерантні трансгенні рослини отримані шляхом передачі ферменту ацилгліцеринфосфату від Арабідопсису; гени, що кодують маніт дегідрогеназу, (4 сорбітолдегідрогеназу, які беруть участь у синтезі маніту і сорбіту, покращують посухостійкість.

Інша ілюстративна модифікація дозволяє отримати рослини, які виробляють білки, що мають сприятливі імуногенні властивості для використання в організмі людини. Наприклад, рослини, здатні виробляти білки, в яких по суті відсутні альфа-1,3-пов'язані залишки фукози, бета-1,2- пов'язані залишки ксилози, або обидва, в яких може використовуватися М-глікан. Інші ілюстративні модифікації дозволяють отримати рослини з покращеними запасними білками і оліями, рослини з підвищеною ефективністю фотосинтезу, рослини з тривалим терміном зберігання, рослини з підвищеним вмістом вуглеводів, і рослини, стійкі до грибків; рослини, що кодують фермент, який бере участь у біосинтезі алкалоїдів. Також розглядаються трансгенні рослини, в яких експресія 5-аденозил-! -метіоніну (ЗАМ) та/або цистатіонін гамма-синтази (Со5) була модульована.

Одна або декілька таких ознак можуть вводиться шляхом інтрогресії у мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини тютюну за винаходом від іншого культурного бо сорту тютюну, або можуть безпосередньо трансформуватися в ньому. Інтрогресія ознаки

(ознак) у мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини за винаходом може бути досягнута будь-яким способом селекції рослин, відомим у даній галузі техніки, наприклад, шляхом схрещування потомства, зворотного схрещування (беккросу), подвійного гаплоїдного схрещування, тощо (див., М/егпетап, Е. А, апа Вийпу, В. С. 1987. Спарієї Земепівеп. Торассо.

Радез 669-698 Іп:. Сипімаг Оемеіортепі. Стор бресієв5. МУ. Н. Еенг (вд.), МасміПап Рибіївпіпу Со,

Іпс., Мем Моїк, М.М 761 рр.). Способи на основі молекулярної біології, описані вище, зокрема

ЕРГР і мікросателітні маркери, можуть використовуватися у таких беккроссах для ідентифікації потомства, що має найвищу ступінь генетичної ідентичності з рекурентним батьком. Це дозволяє прискорити селекцію сортів, що мають принаймні 90 906, переважно принаймні 95 95, більш переважно принаймні 99 95 генетичну ідентичність з рекурентним батьком, ще більш переважно є генетично ідентичними рекурентному батьку, і додатково включають в себе ознаку (ознаки), що була введена шляхом інтрогресії від донорської батьківської рослини. Таке визначення генетичної ідентичності може грунтуватися на молекулярних маркерах, відомих у даній галузі техніки.

Останнє покоління зворотного схрещування може самозапилюватися для отриманням чистого селекційного потомства для перенесення нуклеїнової кислоти (кислот). Отримані в результаті рослини, як правило, мають по суті всі морфологічні та фізіологічні характеристики мутантних, що не зустрічаються в природі, або трансгенних рослин за винаходом, на додаток до переданої ознаки (ознак) (наприклад, одна або більше моногенних ознак). Точний протокол зворотного схрещування залежатиме від ознаки, що піддається зміні, 3 метою визначення відповідного протоколу тестування. Хоча способи зворотного схрещування спрощуються, коли ознака, що передається, є домінантним алелем, рецесивний алель також може передаватися. У цьому випадку, може знадобитися введення тестування потомства, щоб визначити, чи бажана ознака була успішно передана.

Різні варіанти винаходу забезпечують мутантні рослини, рослин, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, а також біомасу, в яких рівень експресії полінуклеотиду МЕТ5 є зниженим з метою підвищення в них концентрації вільного метіоніну, зокрема у листі, але не обмежуючись ним.

Частини таких рослин, зокрема рослин тютюну, і більш конкретно листової пластинки і

Зо жилки тютюнових рослин, можуть бути включені чи використані при виготовленні різних витратних матеріалів, включаючи, але не обмежуючись, матеріали, що утворюють аерозоль, пристрої, що утворюють аерозоль, вироби для паління, курильні вироби, бездимні продукти і тютюнові вироби. Приклади матеріалів, що утворюють аерозоль, зокрема матеріалів, що утворюють нікотиновий аерозоль, включають, але не обмежуються, тютюнові композиції, тютюни, екстракт тютюну, різаний тютюн, різаний наповнювач, сушений тютюн, підірваний тютюн, гомогенізований тютюн, відновлений тютюн і люлькові тютюни. Вироби для паління і курильні вироби є типами пристроїв, що утворюють аерозоль, включаючи пристрої, що утворюють нікотиновий аерозоль. Приклади виробів для паління або курильних виробів включають, але не обмежуються, сигарети, сигарили, і сигари. Приклади бездимних продуктів включають жувальний тютюн і нюхальний тютюн. У деяких пристроях, що утворюють аерозоль, не шляхом спалювання, тютюнові композиції чи інший матеріал, що утворює аерозоль, нагрівають одним або кількома електричними нагрівальними елементами для отримання аерозолю. В іншому типі пристрою, що утворює аерозоль шляхом нагрівання, аерозоль отримують шляхом передачі тепла від горючого паливного елемента або джерела тепла до фізично відокремленого матеріалу, що утворює аерозоль, який може бути розташований в межах, близько, суміжно або нижче за потоком від джерела тепла. Вироби з бездимного тютюну та різні тютюнові матеріали, що утворюють аерозоль, можуть містити тютюн у будь-якій формі, в тому числі як висушені частинки, стружку, гранули, порошки або суспензію, нанесені поверх, змішані всередині, або іншим чином поєднані з іншими інгредієнтами в будь-якому форматі, наприклад, пластівці, плівки, таблетки, піни, або гранули. Як використовується тут, термін "дим" використовується для опису типу аерозолю, який утворюється під час паління таких виробів, як сигарети (наприклад, сигаретний дим), або при спалюванні матеріалу, що утворює аерозоль.

В одному варіанті, пропонується також висушений рослинний матеріал, зокрема висушене листя або висушені частини рослини від мутантних, трансгенних, та таких, що не зустрічаються в природі, рослин тютюну, описаних тут. Процеси сушіння зеленого листя тютюну є відомими спеціалістам у даній галузі техніки і включають в себе, без обмеження, тіньове сушіння, вогневе сушіння, димове сушіння і сонячне сушіння. Процес сушіння зеленого листя тютюну залежить від типу зібраного тютюну. Наприклад, тютюн типу Вірджинія світлий (Мігаіпіа Бідні), як правило, піддається димовому сушінню, тютюн Берлі (Вигієу) і деякі темні штами зазвичай піддаються тіньовому сушінню, і люльковий тютюн, жувальний тютюн та нюхальний тютюн, як правило, піддаються вогневому сушінню.

В іншому варіанті, описуються тютюнові вироби, які включають в себе матеріали, що утворюють нікотиновий аерозоль, або тютюн, який містять матеріали, що утворюють аерозоль, включаючи листя, переважно висушене листя, виготовлені з листя мутантних рослин тютюну, трансгенних рослин тютюну або рослин тютюну, що не зустрічаються в природі, описаних тут.

Тютюнові вироби, описані тут, можуть бути змішаними тютюновими виробами, які можуть додатково містити тютюн від одного або більше інших сортів рослин тютюну, в тому числі немодифікованих рослин тютюну.

Відсоток вільного метіоніну в матеріалах або тютюнових композиціях за винаходом, що утворюють аерозоль, становить принаймні близько на 5 95, 10 Фо, 15 9, 20 Фо, 25 У, ЗО Фо, 35 Об,

АО бю, 4590, т, 55 95, 60 95, 65 90, 70 Ую, 75 Ую, 80 Уо, 85 У, 90 95, 95 95, 96 95, 97 У, 98 Ус, 99 90 і 100 95 вище, порівняно з матеріалами або тютюновими композиціями, що утворюють аерозоль, отриманими від немутантних, що не зустрічаються в природі, або нетрансгенних відповідних рослин.

Мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини можуть мати інше застосування, наприклад, у сільському господарстві. Наприклад, мутантні, що не зустрічаються в природі, або трансгенні рослини, описані тут, можуть використовуватися для виготовлення тваринного корму і продуктів харчування людини.

Винахід також відноситься до способів отримання насіння, який включає в себе вирощування мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини, описаних тут, і збирання насіння з вирощених рослин. Насіння від рослин, описаних тут, може бути оброблене і упаковане в пакувальному матеріалі за допомогою засобів, відомих у даній галузі техніки, для отримання готового виробу. Пакувальний матеріал, такий як папір і тканини, є добре відомими у даній галузі техніки. Пакет насіння може мати маркування, наприклад, ярлик або етикетку, прикріплені до пакувального матеріалу, етикетку, надруковану на пакувальному матеріалі, або етикетка, вставлену всередину пакету, яка описує характеристику насіння, що знаходиться всередині.

Ще один аспект відноситься до способу отримання метіоналу, який включає в себе стадії:

Зо (а) отримання частини мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини; біомаси, насіння або листя, або матеріалів, що утворюють аерозоль, як описано тут, і (б) їх підігрівання. Композиції, способи та набори для генотипування рослин для ідентифікації, відбору, або селекції включені у винахід і можуть містити засоби для виявлення наявності полінуклеотиду МТЗ у зразку полінуклеотиду. Відповідно, описується композиція, яка містить один або більше праймерів для специфічної ампліфікації принаймні частини полінуклеотиду

МЕТ5, і необов'язково один або більше зондів і, необов'язково один або більше реагентів для проведення ампліфікації або для виявлення. Відповідно, описані ген-специфічні олігонуклеотидні праймери або зонди, що містять близько 10 або більше суміжних полінуклеотидів, які відповідають полінуклеотиду МІТ5. Зазначені праймери або зонди можуть містити або складатися з близько 15, 20, 25, 30, 40, 45 або більше 50 суміжних полінуклеотидів, що гібридизують (наприклад, спеціально гібридизують) з полінуклеотидом МІТ5. У деяких варіантах, праймери або зонди можуть містити або складатися з близько від 10 до 50 суміжних нуклеотидів, близько від 10 до 40 суміжних нуклеотидів, близько від 10 до 30 суміжних нуклеотидів, або близько від 15 до 30 суміжних нуклеотидів, які можуть використовуватися у послідовність-залежних способах ідентифікації гену (наприклад, гібридизації за Саузерном) або ізоляція (наприклад, іп 5йи гібридизації колоній бактерій або бляшок бактеріофага), або виявлення генів (наприклад, як один або більше праймерів ампліфікації при ампліфікації або виявленні нуклеїнової кислоти). Один або більше специфічних праймерів або зондів можуть бути сконструйовані і використані для ампліфікації або виявлення частини або усього полінуклеотиду МІТ5. Як конкретний приклад, два праймери можуть використовуватися у протоколі полімеразної ланцюгової реакції для ампліфікації фрагмента нуклеїнових кислот, який кодує нуклеїнові кислоти М(ІТ5, такі як ДНК або РНК. Полімеразна ланцюгова реакція також може виконуватися з використанням одного праймеру, похідного від послідовності нуклеїнової кислоти МТ5, і другого праймеру, який гібридизує з послідовністю вище або нижче послідовності нуклеїнової кислоти М(Т5, такою як послідовність промотору МІТ5, 3'-кінець МРНК попередника або послідовність, похідна з вектора. Приклади термічних та ізотермічних способів, придатних для іп міго ампліфікації полінуклеотидів, є добре відомими у даній галузі техніки. Зразок може бути або може походити з рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, або тютюнового виробу, виготовленого або похідного з рослини, рослинної клітини 60 або рослинного матеріалу, як описано тут.

Таким чином, в іншому аспекті пропонується також спосіб виявлення полінуклеотиду МЕТ5 у зразку, який включає в себе стадію: (а) отримання зразка, що містить, або імовірно містить полінуклеотид, (Б) контактування зазначеного зразка одним або більше праймерами, або одним або більше зондами для виявлення зокрема принаймні частини полінуклеотиду МІТ5, і (с) виявлення наявності продукту ампліфікації, при цьому наявність продукту ампліфікації свідчить про присутність полінуклеотиду МТЗ у зразку. У іншому аспекті, також пропонується використання одного або більше праймерів або зондів для виявлення зокрема принаймні частини полінуклеотиду МІТ5. Також пропонуються набори для виявлення принаймні частини полінуклеотиду МЕТ5, які містять один або більше праймерів або зондів для виявлення зокрема принаймні частини полінуклеотиду МЕТ5. Набір може містити реагенти для полінуклеотидної ампліфікації наприклад, для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або реагенти для технології гіоридизації-виявлення із зондом для нуклеїнової кислоти, наприклад, Саузерн- блотингу, Нозерн-блотингу, іп 5йш гібридизації, або гібридизації на мікрочипах. Набір може містити реагенти для технології антитілозв'язуючого виявлення, наприклад, Вестерн-блотингу,

ЕПІЗА5, 5ЕЇ ОЇ мас-спектрометрії або тест-смужок. Набір може містити реагенти для секвенування ДНК. Набір може містити реагенти та/або інструкції для визначення вмісту метіоніну, треоніну та/або метіоналу. У деяких варіантах, набір може включати в себе інструкції для одного або більше описаних способів. Описані набори можуть бути корисними для визначення генетичної ідентичності, філогенетичних досліджень, генотипування, гаплотипування, аналізу родоводу або селекції рослин, особливо з кодомінантним скорингом.

Даний винахід також пропонує спосіб генотипування рослини, рослинної клітини або рослинного матеріалу, що містить полінуклеотид МІТ5. Генотипування забезпечує засоби для розрізнення гомологів пари хромосом і може використовуватися для диференціації сегрегантів у популяції рослин. Способи молекулярних маркерів можуть використовуватися для філогенетичних досліджень, для характеризування генетичних відносин між сортами сільськогосподарських культур, ідентифікації схрещувань (кросів) або соматичних гібридів, локалізації хромосомних сегментів, що впливають на моногенні риси, клонування на основі генетичних мап, і дослідження кількісної спадковості. Певний спосіб генотипування може використовувати будь-яку кількість аналітичних способів на сонові молекулярних маркерів,

Зо включаючи поліморфізми довжини фрагмента ампліфікації (АРІ Р). АРІ Р. є продуктом алельних відмінностей між фрагментами ампліфікації спричиненими варіативністю нуклеотидної послідовності. Таким чином, даний винахід додатково пропонує засоби для подальшої сегрегації гену МЕТ5 або нуклеїнової кислоти, а також хромосомних послідовностей, генетично- пов'язаних з цими генами або нуклеїновими кислотами, з використанням таких способів, як аналіз АРІ Р.

Кореляція між метіоніном, що виробляється у рослинах, в результаті сайленсінгу треонінсинтази, і хімічними сполуками, які містяться у висушеному тютюні, піддається контролю у висушеному листі за допомогою мас-спектрометрії. Профілі мас-спектрометрії рослинних екстрактів свідчать про те, що сайленсінг треонінсинтази у рослинах переносить зміни в рослинах, оскільки чотири піки засвідчили змінені профілі у лініях, підданих сайленсінгу треонінсинтази, порівняно з екстрактами від контрольних рослин (див. Фігуру 1). Три піки підвищуються у достатній кількості, в той час як один знижується у достатній кількості. Ці зміни профілю можуть використовуватися для ідентифікації рослин, у яких рівні метіоналу в аерозолі, ймовірно, будуть підвищеними. Відповідно, в іншому аспекті, запропоновано спосіб ідентифікації тютюнового матеріалу, який вивільняє підвищені рівні метіоналу в аерозолі при нагріванні, що включає в себе наступні стадії: (а) отримання зразка тютюнового матеріалу; (Б) визначення профілю молекулярної маси зразка, і (с) порівняння профілю молекулярної маси при одному або більше співвідношеннях маси/наповнення із профілем контрольної рослини; де певна зміна співвідношення маси/наповнення в порівнянні з контрольною рослиною вказує на те, що рівні метіоналу в аерозолі є підвищеними. Відповідно, молекулярна маса вимірюється за допомогою мас-спектрометрії, переважно, рідинної хроматографії з мас-спектрометрією (РХ-

МС), газової хроматографії з мас-спектрометрією (ГХ-МС). У ще одному аспекті пропонується тютюновий матеріал, ідентифікований або такий, що може бути ідентифікованим, за допомогою цього способу.

Винахід додатково описано в наведених нижче Прикладах, які мають на меті більш докладно описати винахід. Ці приклади, що визначають переважний спосіб, який наразі розглядається для реалізації даного винаходу, призначені для ілюстрації, а не для обмеження винаходу.

Приклади бо Приклад 1: Ідентифікація треонінсинтази тютюну

Ген треонінсинтази тютюну ідентифікується з використанням послідовностей Е5Т тютюну, що містяться в "Ініціативі геному тютюну" (Торассо Сепоте Іпійаїйме). Інший контіг ЕТ тютюну (МСВІ 45312-мгрер-її), що є близьким до треонінсинтази тютюну, збирається з послідовностей

МОВІ Е5Т. Ця кодувальна послідовність має точно таку ж довжину (1569рр), що і треонінсинтаза тютюну. Дані з використанням екзонних афіметричних ДНК-мікрочипів (зонди послідовності від

МЕРМІа19193542е1) свідчать про те, що треонінсинтаза тютюну є однаково експресованою у корінні, трихомах, зеленому і в'янучому листі М. тарасит. Жодних серйозних змін у рівнях експресії генів не було знайдено між листям тютюну димового сушіння (К326, К399) і тютюну типу Берлі (ТМ90О, Виб4). Крім того, стрес від холоду і кадмію не впливає на рівні експресії треонінсинтази тютюну, таким чином, вказуючи на те, що ця треонінсинтаза дуже імовірно є конститутивно експресованою у листі тютюну.

Приклад 2: Надекспресія цистатіонін гамма-синтази (СО5)

Арабідопсис (Агарідорзів ІНнаійапа) (МТО1, ТАІЕ номер послідовності АТ3901120) вводиться під транскрипційним контролем промотору 355 вірусу мозаїки цвітної капусти у тютюн Берлі

ТМе9О шляхом Адгобасіегішт ішптегазсіеп5 (агробактеріальної трансформації) з використанням класичної процедури листових дисків, як описано в літературі. Також вводиться ген вибору антибіотику канаміцину.

Приклад 3: Сайленсінг експресії треонінсинтази у рослинах тютюну

За допомогою фрагменту ДНК 5ЕО ІО МО: 1, генеруються праймери для сайленсінгу МЕТ у тютюні з використанням підходу РНКі. Праймери, що використовуються, являють собою послідовності 5'-сідаааіїсдасаасодаїдата-3" (ЗЕО ІЮО МО: 9) і 5'-саассааіаасіаасддаден-3' (5ЕО ІЮ

МО: 10). Відповідна послідовність РНКі ампліфікується з кКДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР), а потім вставляється у шлюзовий вектор рв7сУМІМУС2(І) за допомогою вихідного вектора, точно, як детально описано виробником ("Іпмігодеп"). Цей вектор містить промотор для конститувної експресії (промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти Саму) трансгену в усіх тканинах рослини і гену канаміцину для вибору антибіотика канаміцину на чашках з агаром (100 мг/мл). Цю конструкцію потім вставляють у геном тютюну Берлі ТМ9О шляхом Аагобасієгійт їштеїавзсіеєп5 з використанням класичної процедури листових дисків. Окремі лінії регенерували з калусу, і відбирали на

Зо канаміцині. Лінії ТО, піддані РНКІі-сайленсінгу, контролювали шляхом (ї) ЗТ-ПЛР і вирощували для отримання насіння на геномній ДНК з використанням одного праймера у промоторі 355 (5'- дадсаїсдіддааааадаадас-3) і одного праймера у межах фрагменту, що використовувався для сайленсінгу (5'-аадсіссанадстіандайцо-3) і (ї) ЗТ-ПЛР з використанням специфічних праймерів, фланкуючих вставку, що використовувалися для сайленсінгу (5'-Ядайсасдідісдаїаадас-3), і вирощували для отримання насіння. Насіння Т1 зібрали, знову виростили на агарі, що містить канаміцин, і піддали контролю точно так, як паростки ТО. ПЛР на геномній гГгДНК свідчить про те, що фрагмент ДНК М(Т5 був вставлений у геном, і ефективно пригнічує експресію треонінсинтази тютюну.

Приклад 4: Вирощування рослин тютюну, в яких треонінсинтаза була піддана сайленсінгу.

Канаміцин-стійкі рослини вирощували у гідропонних лотках до їх пересадження у поле (Кентуккі, США). Двадцять рослини лінії, підданій сайленсінгу треонінсинтази (лінії РНКі МЕТ5;

Приклад 2), лінії цистатіонін гамма-синтази (Приклад 3), векторний контроль (МС, рв7СУММУМО2(І)) і базовий тютюн США ТМ90, вирощували у чотирьох репліках з 20 рослин.

Через три місяці після пересадження у поле (36 днів після прищипування верхівки), один лист з середини стебла відбирали як зразок у 10 ідентичних рослин з 20 для кожної репліки. Листя ("зелене листя") відразу ж зберігати у сухому льоду і ліофілізували. Десять рослини з кращих двох ліній відбиралися, і потім висушували відповідно до сільськогосподарської практики щодо тютюну Берлі. Після сушіння, відбирали три листа з середини стебла як зразки. Для контролю ефекту сайленсінгу у лініях, підданих сайленсінгу треонінсинтази, і їх порівнянню з лініями цистатіонін гамма-синтази, "зелене листя" з трьох ліній подрібнили і піддали аналізу вільної амінокислоти.

Приклад 5: Аналізу метіоналу

Кореляція між метіоніном, що виробляється у зеленому листі, в результаті сайленсінгу треонінсинтази, і хімічними сполуками, які містяться у висушеному тютюні, піддається контролю у висушеному листі за допомогою рідинної хроматографії з мас-спектрометрією (РХ-МС) з використанням ліній, описаних вище. Екстракцію здійснюють у метанолі. Обладнання, що використовується, являє собою систему "МУаїег5 Асдийу ШРІС" у поєднанні з мас- спектрометрією (МС). Колонка являє собою "МаїетХВг'гідде Зпієїй ВР18" з використанням як рухомої фази А - води:ацетонітрилу (95:5 об/об.) і як рухомої фазі В - метанолу. Профілі РХ-МС бо свідчать про те, що сайленсінг треонінсинтази у зеленому листі переносить хімічний сигнал у висушене листя. Дійсно, чотири піки засвідчили змінені профілі у лініях, підданих сайленсінгу треонінсинтази, порівняно з контрольною групою (див. Фігуру 1). Три піки чітко підвищуються у достатній кількості, в той час як один знижується. Це свідчить про те, що метіонін, який накопичується в зеленому листі, перетворюється або у продукти розкладання сірки, або у похідні метіоніну у висушеному листі.

Оскільки метіонін є можливим попередником метіоналу, ми проаналізували вміст метіоналу в аерозолі, що утворюється після нагрівання висушеного тютюну (ТМУ90, МС, МЕТ5-1, МІТ5-1 ії

МІТ5-3 обрані зареєстровані репліки), і піддали охолоджувальній пастці. Як платформа для паління використовується симулятор паління з джерелом тепла типу "Масог" (54ММ), включаючи режим 12 випускань диму за 2 сек. Перед палінням, висушену пластинку тютюну обрізали і просочили 20 95 гліцерину. Аерозолі, отримані шляхом нагрівання просоченого висушеного тютюну (100 мг, З повних репліки), конденсували з використанням кріогенної системи, розробленої "Аїк І ідицїа" і розчинили у дихлорметані (2 рази 5 мл). Рівні метіоналу в аерозольних розчинах були визначені за допомогою газової хроматографії з мас-спектрометрією (ГХ-МС) після дериватизації. Іон, який виробляє найбільш поширений сигнал, використали для отримання кількісних даних за допомогою режиму одноіонного моніторингу (ІМ).

Кореляція між метіоніном, що виробляється у зеленому листі, в результаті сайленсінгу треонінсинтази, і хімічними сполуками, які містяться у висушеному тютюні, піддавалася контролю у висушеному листі за допомогою РХ-МС з використанням ліній реплікації, описаних вище. Екстракцію здійснювали у метанолі. Обладнання, що використовувалося, являло собою систему "Маїег5 Асдийу ОРІ-С" у поєднанні з МС. Колонка являла собою "Маїег5ХВг'гідде Зпівїа

ВРІ8" з використанням як рухомої фази А - води:ацетонітрилу (95:5 об/об.) і як рухомої фазі В - метанолу. Результати представлені в Таблиці 1.

Як показано в Таблиці 1, рослини РНКІі МІТ5 не виявили жодних візуальних відмінностей від контрольних рослин. Наприклад, висота рослин і вміст хлорофілу в рослинах тютюну, підданих сайленсінгу треонінсинтази, були майже ідентичними контрольним рослинам. Концентрація вільного метіоніну у зеленому листі рослин тютюну, підданих сайленсінгу треонінсинтази, була вищою, ніж у контрольних рослинах. Концентрація метіоналу в аерозолі була значно вищою у рослинах тютюну, підданих сайленсінгу треонінсинтази, ніж у контрольних рослинах. Вміст

Зо треоніну у зеленому листі відзначався зниженням понад 2095 у рослинах тютюну, підданих сайленсінгу треонінсинтази, в порівнянні з контрольними рослинами.

Приклад 6: Аналіз експресії треонінсинтази у лініях тютюну РНКі МЕТ5

Послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, 2, З і 20 були вирівняні на основі консенсусу 1587 основ від початку до стоп-кодону. Ділянки фрагменту, що є гомологічними між послідовностями ЗЕО ІЮ

МО: 1, 2 ї З і відрізняються від БЗЕО ІЮ МО: 20 є нуклеотидами 1-46 послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 1,2 13 та нуклеотидами 1-52 послідовності зБЕО ІЮ МО: 20; нуклеотидами 99-141 послідовності

ЗБЕО ІЮ МО: 1, нуклеотидами 102-144 послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 2 їі 5ЕБЕО ІО МО: З і нуклеотидами 102-153 послідовності 5ЕО ОО МО: 20; та нуклеотидами 1325-1362 послідовностей 5ЕО ІО МО: 1, 2 і 3, і нуклеотидами 1334-1371 послідовності зЕО ІЮ МО: 20. Ці послідовності використовуються для конструювання праймерів, специфічних для ЗЕО ІЮ МО: 1,2,3. Набір праймерів, специфічних для ЗЕО ІЮ МО: 20, також був розроблений.

Лінії РНКІ МЕТ5 отримують з використанням ділянок, відповідних нуклеотидам 454-805 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; нуклеотидам 454-805 5ЕО ІО МО: 2: нуклеотидам 456-805 5ЕО ІЮ

МО: З і нуклеотидам 463-814 5ЕО ІО МО: 20. Три (3) індивідуальних рослин з З незалежних ліній

РНКі МЕТ (МЕТ51, М52 і МІТ53), що позитивно експресують трансген (трансгени) для сайленсінгу РНКІ (перевірено за допомогою ПЛР на наявність промотору 355 у ГДНК), піддали напівкількісній ЗТ-ПЛР з використанням праймерів, специфічних для 5ЕО ІЮ МО: 1,21 31 праймерів, специфічних для 5ЕО ІЮ МО: 20. Тубулін використовується як контроль для експресії конститутивних ("домашнього господарства") генів. Три (3) рослини Випеу ТМо0 використовували як контрольні рослини для експресії транскриптів, пов'язаних з БЕО ІЮО МО: 1, 2,3120.

Використання праймерів, специфічних для 5ЕО ІЮ МО: 1, 2 і 3, або праймерів, специфічних тільки для 5ЕО ІЮО МО: 3, або праймерів, специфічних тільки для 5ЕО ІЮО МО: 1 і 2 у напівкількісній ЗТ-ПЛР вказує на те, що частковий сайленсінг експресії треонінсинтази мав місце у кожній з 3-х незалежних ліній РНКі МТЗ порівняно з контрольними рослинами.

Використання праймерів, специфічних для 5ЕО ІО МО: 20 вказує на те, що частковий сайленсінг у рослинах РНКІі МІТ5 мав місце, і що рівень сайленсінгу є меншим, ніж той, що було досягнуто для 5ЕО ІЮ МО: 1-3. Як спостерігалося, сайленсінг був більш ефективним для 5ЕО ІЮО МО: 3, ніж для ЗЕО ІЮ МО: 20, хоча відсоткова (95) ідентичність послідовності між послідовностями є 60 ідентичною.

Будь-яка публікація, що цитується або описана тут, містить відповідну інформацію, розкриту до дати реєстрації цієї заявки. Інформація, заявлена у даному документі, не може тлумачитися як допущення того, що винахідники не мають права датувати заднім числом таке розкриття сутності винаходу. Всі публікації, згадані у вищенаведеному описі, включені тут шляхом посилання. Різні модифікації і варіації винаходу будуть очевидними фахівцям у даній галузі техніки без відхилення від обсягу та суті винаходу. Хоча винахід було описано у зв'язку з конкретними переважними варіантами його здійснення, слід розуміти, що винахід, як заявлено, не має бути неналежним чином обмежений такими конкретними варіантами здійснення. Дійсно, різні модифікації описаних способів здійснення винаходу, що є очевидними фахівцям у галузі клітинної, молекулярної біології та біології рослин або суміжних областях, мають на меті бути включеними в обсяг наступної формули винаходу.

Таблиця 1

Висота стебла (см)

Вміст хлорофілу (довільний об'єкт) 17 18 17 18

Лінія 1:

Концентрація вільного (0008) 0,025 0,017 0 82 от3) метіоніну у зеленому листі Лінія 2. (0,004) (0,003) ' Дінія 2: (мг/г) 0,022 (середнє) (середнє) 0,034 (0,006) 0,016

Лінія І:

Концентрація вільного 0,876 Лінія 1:

Коен ре зеленому листі (0,221) 0,851 0,915 0,567 (0,051) (мг/г) Лінія 2: (0,053) (0,110) Лінія 2: 1,091 0,609 (0,022) 0,087

Лінія 1:

Концентрація метіоналу в 3822 аерозолі (мкг/г) 916 1400 Лінія 2: 2200

. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕЙ ІЮ МО1 (Послідовність ДНК треонінсинтази А. габаситі) ахадсадсесстеЕесакдсісацдаєсьссьтесссестстссеЕсст сь ЕсСссаассссатсассааєсссст с ссаа агссавааєсасаєсаєссасесєсаєсаасссааєсааздссассдесьісстасаааєдасддсааєсоЯєссстссссава адсассассодссссудссдасдвавасасссясоаадуадосдсасоссядссосайстссесссасаав с сессосс азасасчкЕссьсссаасчесуаєсессадесссдвасдчааєддеасссссссчаєдчазаєсараєассочадссЯсьс садсадасвастсчасдЕЕсадсаєчасасддасссстдзадаваєсьчасдоассадтаєсоддсотдесаскдаессу агєЕсасосдєЕсадіаадассасяаєдудссягасоді єсаддсо єс сдсссіЕааавачдааєдадісстасседаааєс часадсчаєчастаєтчсеадсоссссссоааудааасістааєсьст Ессе ЧадсоЯаєссьддсадасачтсься ададсаєдчадсдасі сасоддсаваасасс с додав: садссаєрасудасаЧукссгааусаєсьсодЕасддасеуєве тдасдадссаад:дазссддЕ сааддааазс: дсасааассаді сасасоаєЧчєадосьседесессассадедасаса ксздссасаєсаєседстсастодєдсаєседсоддадаєсссаєссяктотаст се сассадсаааєзадаєаєстає

ЧчдсдсадсеуддсасаассазкауесаасодадестседсдесдацтаседасассдаєтсЕЧасучеЕсоваєдсаЧчь кЧчаєссасчаачьсассосачачесосссатссасссочсдаакссЯяастдзакгаче с дачу садаачоадсаваад асграсаосаастдадаєсссосадсауєссоасоосазаадтасссоастЧчадедаєаціасесстодаддадазасЕссаЧа сааєасаваєосєссєсьасааачаі ссстасцчаєдтасачачассссозаусьздссдассягаєсссьадчсс каса

Чедсісаачсачссаасусізаєссуєстєсассідсаєсаєааасссодс с дуаааудасьсссаасссоєдавоосу аасассасаєєсдсаєссдссасасадаєтсуадчедсаєссадеЕдЧЕсстаєадасададст дес с сеЕсодсссєдаадазасьЯ

Едасодсасачісдадаадосвасодадаачдачесоасодасуставоусесадусадастсаастдоваєотеса кесусссоусасасьзусчхсдосасєдастдесстдіЕсСвадЕсдадагзасзуєздачеЕсассддассязаєдаєтаад аседесад:сссуадсасадсасаєддаєсдаадеі с: сасссааєсавадаєсдаєкассасссавааддаааєзазаса сасаддчаакассудессостаасссассеосодаауе чавадсадчаєсссудаєсадссасодаєдсссьсаздааає аєссрЕсдадсаазаасдссаадсасєссда

БЕ І МО: 2 (Послідовність ДНК треонінсинтази М. їарасит (Ніске Вгоаа ГІ. гаї), що також є присутньою у ЛМісойапа вуїкевігів) ахаасаддсьсстрссасодстсадаєсьссттессьосєсссстсстЕсЕссссаасіссабсассааєссссесссаа агстааєсасасвавссассесаг саасссаассааацесассяссістасаааєдасуєаассаєссстссесача аасакєсдєсадассссосссасуаазасасссосоаадачасадсодсуссодсссасстсстсосасааттссессдсс адасасоєсєсстсссааєсдседассссадсьссдасуааєдасасесьсєісцаєсазаєкасасассодадссясіс содеддстгасьсдаєдсєсадсаєдатаєддассостстдаасаааєсьдаєдассадєаєсодсодесасьсьса асссасусдссудсаадассассокодссогасзасесаачсоєстодессаааааауаасодуєсстасстодаавіс чаєадчечаєдаєавестсадсост с Есдгадчааасісстааєсья єс БЕ даостєдадсоє Ессадасааасацссся аддсаєчачідассстасдадіаааасасьдсддааєсадссасасаууєацесЕсазудасстьдачсасассясиє тачедадссаадедаассаді сааодадзаасдсасазассядбсассаасчсааддсдЕссьсссассодесдасасу

ЕсадсьдсасьчеЕсадсссассдіосаєстадсадддаєсссассдатедкастестасесоасавасаздадасаєстає часдсадскЕддсасаассчасадссаасядаасьсЕв ас соадчсастдасассчасссеЕЧчаєчасьдсаєдсаді

ЕчакєкЕсЯаєЧчааусєсасьтдстьдчачЕсудссяавесасЕсадсааастссссдуаасачс ссададуєсадаадддсааваач аседсздсааєсдазаєсссосаччсачесЕЧассддсазасесссссаєвдадедасачі Есседдадасаасе вас

ЕаагагаєсаєдсЯясєсставааадці єЕсахдасдедсазададт єсачусєсЯчЕЕЧаєсясаєссстаадесвавцЕ чеасесаадсадсузасасктаагссусєєсасеєусаєеЕ асаааєссочЕ с ддазадасьсссаасссдЯдЕдаасясс аасассасаєссдсаєседссасасасаєсдоасдасссаді дЕСваєадаєсададссує се есдсссєдазозасід таасддзаєачеачадчадасавасоаздадчаччадЕєдаєссаєдссасдосссаддсадастьсаасьдосаєаєеса сЕсдсссусасассядсагсдосасЕдассусссідсЕссааці сдадааасадсодадссассдддссаваєсаєаау ассасаЧчссстдадсасадсасаєддаєсуааді ссасьсааєсааадаєсдатсассасссаазодазаасааздда саєсчдзаєдеЕссдсскассаасссасссдсддазасадааадсадаєссссдассадесзеЕдааєдеЕссстсаацдазає асссдссдачсазааасуссаачсасьда

ЗЕФІР МО:3 (Послідовність ДНК треонінсинтази М. гарасит (НісКв Вгоасі і еваї)) асадсадессессссасоасьсадасстьсесссессстстссьессобсосоессзаєкссассассавааєсьссьссза ахссааєсссастаєссасьтсаєсааєсссааєссааадссассуссісстасаааєдасосазесассссіссссада аасассдеосдссстодссуасааааасаєссоастаачадассосссуссуссссасесссстоссасаатссстссусс адасасусассссссаакусууаєссазассссдаєдаародьасесьстечаєсчазаєсаєстассоуачесястс суддсдассвасесдаєдеЕєсаасаєдаєасацасосяссагзааааче с сдасадесаусасьддадчесасьсс 4 ахсссасчсЯассодчазачасчасусччсстсасчдуссадаєсчесссодЧдсстаадаачдчааєдучісстасссаваєс часачссаєчаєаєсцесадсуссЕ ст дазасааасссааасст сс сасасісачечі сс ддсазасачесЕ сь ааачасаєдачЧчЕЧасесасдоадЕаагасасеЕсчсучааєсачесасасаддсадссссааддчаєсЕЗзаасавдассасс кадедадесааоєдаассодьсагодааааєдсавааассяачт ЧЕ Ед гдсоддссовосвЕссасьодсдасасо есаустусаєєдеЕсадсетассдєдасасссуусоададчасєссаєсчат т огтассссьасстасааасазчаєаєсьає адесчсауссдасасаассуасадстаасодадсе сс сс ЕдсеЧадсаєсдасасссаєсст дає єзсаєдсаці. хааєссоєдазуксаседсу Чад сдссааєсеасЕвдусчдаасєсоєєудаасачс сЕдадоаєсадагоадасаааач аседсадсазаєєсадаєстсосадсаді ссдастоадсаадсссссдаєссодсідасадеЕсссьодадачаасс каса

ЄаакасасаєдсоєєсскагтавадоєвЕссасдасасдсазачачесодудсссуєсдаєсуваєссстачасьсуває чедсесгадсадстаасяасаааєссоссстасесасаєстасзааєссддетасааачасе сссаасссосдаазяесЗ азасассасасстасаєсстостасасачаєссадгчасссздєдестагадаєадчадссЯссстЕдссосєоаадаасьа счасяадасачі: ддаададасаасачаддадчачеЕсчасодаєдсстасодсассаасусауасьсодасссадчасоєтсся кЕЕасссосасассядеЧчсдоасаєсчасідсссіціссаачссдадааасастпдадесассодассаваєчаєсааз ассаєаЧчЕсЧчедадсасадсасасдчакі даадссстасісаассавадаєьсаєсассасісаааучааасаавада саєадаасдесуддіЕсастаасссасссдсадаасі дазадсачаєсссодассачссасззасдсссссаадааає асссодссдадсааааасдссяассастда

ЕЙ Ір МО:4 (Послідовність геномної ДНК ЗЕО ІЮ МО: 3) сдсачсьостесаастаст в ссдасасьссаєсаасддсоадсьссьсесасодсссадассьтссьсуссистьсксестс сеЕсстсоссазсессаєсассазасссссісстааасссааєсссастаєєсассесаєсаас:ссааєсавассасс ассеЕссасаааєдасосаатсассссіссссадааасасесоссусосєдссуасдаааатасєссдсддгадаадссяс єсассуссссассьссьісссасаас с ссЕССЧссадуєаєдсачдачазудакєасастауссазаєсдаасадаєваєта адсааваєдааваєасть счацЕссагааєсасазсаасе сасесаєєдсессаєєсаєстазеЕдессдасаєсяагааді чссасосаєуесасьссаууєвасаєдестькЕсаасдсоддаєссвадчсессуаєччаатсудтаєсстстсуаєсєазаєс акскассоуачсесассссуассЯсссаст чає ссаасаєчаєаєсддасудстїсаазааасе с сЧасодссачіа сЕсЧчадоаєсассесьсдасссасогогссудуаачассасосудссттасадас саду ЧЕ со сеаадаачцаає чачесссасссдаааєссдасачедчаєсасаседЕсасчедсьс ЕЕ сддазаддазасссаааєські ЕЕ содоассЧуаусоє кЕссасагасацЕ ссстаддсаєдачЕЧчаєссасаадасаааасасеі ці дозаєсаді сасасадуєацє в ссазуда хстаадасаєдассдссссддсєдадссаадеЕЧаассудЕсааддазааєчсавааассадчЕі ЧЕ соЧасстаЧчасьЧсЧ ссгссастодгдасассаєсачстодсаїсчссадсскастодсусаєсстосодддаєсссаєсцчаєсовтаввестсасс чсааасвзачасаєссасддсосадсьуасасаассдасадстаасадачесЕ Есе ссадсаєєдасассдаес є часа сосасосадЕсцЧаєссєдаауєсасьусьчачьсассаасесасеєдасадааєссоассовасассвда адассачазаддусаааацастудсадсазеЕ сдацасессдсассадчЕ с сзаєсддсааді ссссчаєєсдадсчатсачех ссрддачодаасі сдсасвасасакасуєдссєсстасааацаєсссасдаєдЕадсааасачесдачссьсасєдЧаєся каксосеЕадоаст і дес Чсдсссаздсадстаасдсадаасєссдстєвассрдсаєсагаваєссяді садазачась

ЕЕсаасссдєзаадасдаасассасаєєссуусаєсьссьасасачаєєсаасчасссадс де ссасачасачадчсвасії гЕсдсссЕЧчазувзассдсдасоучасачсодаддаддсаасадасцадоазЧчєєдЧасддаєдстасудодставддсада сесчасетдадаєдеЕєЕсаєесдсссоясасассудсусуасаєстастяссстЯдсЕсаадч сдадавзасачсададеска

ЕсодассаааєдасаадассясЧуасЕдЕдадсасадсасаєдчаєсчаачессасесааєссагачаєсчаєссаєсас ксазаддагастаааадасаєдаааєсдссадестассавсссасссдеддаассдазадсадаєссвддассадесає

ЧчаєчссстісаадавасаєсьдЕсдадсаааааєдесавздсасьда

ЗЕ О МО:5 (Послідовність геномної ДНК треонінсинтази Місойпіа г(отепіозПогтів) сусауесусссстазстасссссдасастссаттаасадсадетЕсЕсЕсасосссадавасесеєсессясьстсесьс стестосссвасьссаєсассваєсьсстсссаваєссяаєсссастатесастксаєсваєссааєсаваадссасс ассссстасазассасасаассасссссссссадазасассесоссяссесстдссдасуаааасасєссдсдаздаддадесос ксоссЯдссссасесссісссасаагсЕстіссоссадціаєдеададдаачасасастадсдааасцаасадасааса ачусаааасччааааєсачьддчЕссааваєсасааєааєссасьсаєсоасьсавссарссаасдсууасаєсааааадіь дседсасасдссассосадчсасоєдссскссаасдсддаєссазадсессдаєдаасдоасасєсьсесоаєдаваєте акекассододадссаястссаддссасссасстсдаєці саасаєдаєаєддасасі ссааазаачсссдасодеЕСвута седччаддссассстссдасссасосдісаддаачасчасясддссісассдоаєсадчсссссадсстаацсааоддаає чадесскасссдазааєсчаєадЕЧаєсчаєаєєдеЕвадесдсессваааудааасьсазасгсессеЕссдавусьчачечс

Ессадсааасаде ссссадоасаєчачсдаєссасоддудсазазасассаєдсаасіадссасасачаєадісссазода кссаадеаєдассуссссоодсуачессаадедаассодстааддаааасдсасааассячс:саскачсосддвастаа сесссзстддЕЧасасоссадседсасєдЕСвусєсаседеЕдсаєсстдсододаєтосаєссаєсоваксьссасся

ЧчсааакаачакаєсстасадсосвдсьочЕасаассуасадстзасоодадсестЕсЕЧтсдадсаєсдасассдавьсьс іваєдчеедсасдсадессдасксаєдвачессассдседадбєдосзаєьсасттдасовасксовтдаавачє ска сассачааддудсаааздаседсадсаат соазчасьссосадсадсссуаєссаддсаацієсссдчаєсачаєчатадес сессддадсдзасткЕдодеЕаасасасаєчедЕ єсьаєааааці сссаєуасдсусааачаче сдвоасссєсваєся каєссстадасі счсЧдсасасеісазусадссаасосдааєссосіскакссудсаєсасаааєссояцдЕсоодазачась еЕсаасссдгсдаадасядасассасавь сдсаєсьдстасасадаєсаЧчЕЧчасссадсчсссасачасачачсьде є ж Есдесстдаадаасьчсдасодчаєаугочдадададудсаасадчачовадаассдасачасоассасдадстсадасада сесцасідддаєдєссатссдсссосасассадесчЕсдсаєстсасьусессЕдЕЕсаауссдадавасачесодчачека

СсудассазасаасаздассоясоддЕсЧдесЧчадтасадсасатдчаєссааде ссасісвассазадчасєсаєтаєсас ді

ЕсаааудааасазасєуасастедазсоссЯЧЕсЕдссаасссазсстдтддааді даагдсадаєтЕсоадассадеісає ччасясссссаадааасассідсЕдадсаазааєуссаадсасьда

ЗЕО ІО МО:6 (Трансльована послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1)

МААБЕМІКЗБЕГБ5РРОБОЇ,ННОБРЗКМНІЇНЕТМРІКАТАЗТМОАТУРРОКНЕЕРАОЕМІВЕЕААККЕТООЗНМЕВА

КУМРЕМАВРОЗОЕМНУЗООЕТІУВБВБССІБОУОНОМРАБККЕОСОТИВВБКЕОБАУСКТТИРУСБОУКЗККЕНУТРЕЇ

ВБ5О0РІУБАБЕСМНОМІЕМАВВЕОКОКТОМеОГИУКНССТОКТОЗЕКОСМТУТ ОМА АКМиКРУМОМОСАВТОСОТ

БААГЦЗАТСАБАСТРОІМЕТРАМКІВМАСОТУОРІАМНСАЕУСБІВТОКОССМОСІВЕУТАЕБРІУЦСАМНЗЬМОВОЕСОК

ТААТЕТТООБОСКУРОМУТУРССМІСМІТАКУКСЕММСВЕСОБУОВІРВСУСАОААМАМРІУІНУКЗСИКОКОРУКА

МТТЕАЗАТОІСОРУБІОНАЧУЕАКМСОСТУЄВАТЕ ЕТ МОАМАОАООТОМЕІСРНТОУАІТАСЕКОВМЗОУІ1СРМОК

ТУУУЄТАНСЬКЕТОЄКІОХНЗКЕІКОМЕСВРАМРРУБУКАОЕСВУМОУІЖКУБІБКМАКН Й

8ЕО І МО:7 (трансльована послідовність 5ЕО ІВ МО: 2)

МААБЕМІ,КЗБЕГ5РРОРОГННОБРЗКЗМНТІНЕІЧРІКАТАБТМОАІТІРРОКНЕЕРАОЕМІВЕЕААВАРТВЗНМЕБА

КУУРЕМАОРОБРЕЖУВІОЕТІТЕЗеБОСЬГОУОНОМОАЬККЕрСОУИКВОКОВУСКТТИКУСЗСУИЗККЕМУОРЕІ

ОБОБІУЗАКЕЕСМОМОЦЕМАКЕВКОКОВКІ ОМВО ИЯУКНСОІ5НТОБЕКОТСМТУСУБОУМВТАКМНКРУУСУССАВТООТ

БААББАХСАБАСІРОІМКІ,РАМКІБМАОСТМОРІАНСАЕУСВІЮСТОКрОСМОСІВЕМТАБОРІУСАМВІНЗОВСЕСОК

ТААТЕТБООБОМОУРОНУІУРОСМЬСМІТАКУКСЕММСКЕСОТУОКТРАЕДУСВОЛАМАМРІУГНУКБОМКОКОРУКА

МТТЕАБАТОІСОРУБІОВАМЕАСКМСОСІУЕЕАТЕЕЕМОАМАОАОТОМЕТСРНТОУАГТАСЕКІВНІСМІСРМОК

ТУЧМУБТАНСІКЕТОБКІСУНОУКЕІКОМЕСЕЕАМРРУЄУКАРЕОЗУМОУТККУТІБКНАКН

5ЕО 0 МО:8 (Трансльована послідовність ЕС ІЮ МО: 3)

МААЗЕМІВЗ5ЕТ5РРОРОБННОЗЕРКУМРТІНЕІМРІКАТАЗТМОАТІРЕОКНВЕРАОЕМІКЕКААВЕАРТВЕНМНЕБА

ВУУРЕКАОРБЗОЕХУЗОБІТУВЗВОССТЬОУОНОМОАЬККЕОСОУИВВЬЕОВВУСКТТИРУСЄСУНЯККЕЙУЬРЕІ

ОЗОСІУЗАРГЕСКОМЕЧАБВЕСКОКІСМБОСЯУКНССІЗНТ ОВ ЕКОСОМТУБУВБОУМВІВКМНЕРУУСУВСАЗТООТ

БААІБАУСАБАСІРБІУВКІРАМКІЗМАОГМОРІАМОАЕУСЗІОТОЕрРОСМОГІКЕУТАЕБРІУГАМВМЗСВГЕСОК

ТАВІЕІСООКОМОУРОМНУКУРООМІЬСМІУАЕТКСЕММСКЕТОПУОВІРВІУСАОААМАМРЬТІНУКВОЯКОКО РУКА

МТТЕАБАІОІСОРУБІОВАМЕАСКМСОСІУЕЕАТЕВКІМОАМАКАОЗТОМЕІСЕРНТОУАБТАБЕКЦЕМВСУІСРКОК

ТАЛЛІЗТАНСІКЕТОЗКІРУНЗКЕІКОМЕСЕГАНЕРУЄУКАРЕО5УМОМІ ККУ, ЗКМАКН 5ЕО І МО:9 (Праймер) сгдааассдасадсЧчаєдаєса

ЗЕО ІЮ МО:109 (Праймер) саассаакадссаасочачдссї

ЗЕ О МО:11 (Праймер) садсахєсутоадааазасаацсас

ЗЕО ІЮ МО:12 (Праймер) зачесссабсадссаєсодЕва й

ЗЕД ІО МО:13 (Праймер) тсЧасссасясуссадсаадас

ЗЕ ІО МО: 14(Послідовність РНКі, що використовується для сайленсінгу треонінсинтази) седазассдасадсзатдзсассостадсдссссєдааууааасьсьааєссу єс ссддоссдадсдс сс одсава садЕссссздасаєзачічасьсагддд:аавасасьдс-ддааєсадссасзсудагадссссааоддаєсьдддса є дассочсеЕкЕЕдсдацссаадесдаассодссааддазааасуусасагзассачессасзаа:Часоадассяасастссесаста

ЧчедасасцесадсеЕссаєєдеЕсадсегасеЕдсосаєстасодуцатєссаєссаєсосасссестассадсааасазч ахаєссаєдосояосасседусасаассазасадссаасоячадссс

ЗЕ ІО МО: 15 (Послідовність РНКІ, що використовується для сайленсінгу треонінсинтази) сегдазаєсозсачечаєсдчатаседкєзасдсссссдазудЧчазассссааєсьдс єс додсссадсдєсесддсаза садсвЕстаддсаєчасесасетсасудчсагаасассдсодчавассачссасасадатачесстаадчаєссодувах чассдгЕссодЕЧчаедесаазсдаассоддєсааддаазаєдсасавассядЕ все садчсчЕдадесувасессссасса

ЧЕдасасдєсадссасаєссд:садессаседсадсаєссдсасодасессассачастдсаєсеЕссассьдсазаєзад аксасстаєддсосачдссдусасазассуасадссзасодачссь

ЗЕО ІЮ МО: 16(Послідовність РНК, що використовується для сайленсінгу треонінсинтази) ссдазаєсуаєадєдаєсдчасавєсісадедсЕ с сгсдааддааастсазаєськь вс ЕдодстдаседЧЕ ве едосава садсссссаддсаєсзадедастсасдоддсаагасасьдсддааєсадесасасадасадесссаадчаєссачоває дасеассЕсддсдадссааді:даассддссазддазаасдсасазассуди дес сЗсадссдеодсєсссассо чеЕЧчасасчєсадседсаєсцссадсесастдедсаєскасдддадаєсссатедавсдеавссесассвдсазасазу асасссасдасодсадчссодсасаассояаєадсстаасядаусье

БЕ ОО МО: 17 (Послідовність РНКі, що використовується для сайпенсінту треонінсинтази) ссдаааєссаєадеєчаєдасаєсогсадсосс сс сдаадчцдааастсазаєсьсесесЕадосьдадсоєсесдасаай садесесссадусаєчадедасссасодосазааасасечсоаааєссазесаєасацусаЧчеЕтЕсааодасстадусає дасєдЕсЕсаддЕЧачесазадчесчаассудесаадчаааасдсагавассодісуссадсосадаседсдсьсссасід зсдасасзєсадстасатіудссзасссастоаєусаєссдсодоадчасесссаєсчастатасссссассгідсааасяад асаксеяагдчсдсадссддсасвассдаєадсеаасоядадесяе 5ЕО І МО: 18(Послідовність РНКІі, що використовується для сайленсінгу треонінсинтази) ссдааассзасачеЧаєсчатассдсгадедссвссуааддавасссваасстксеседсастдадсусссодсаза сачеЕсссаддсаєчачечаєссаєддосаааасаст чі дозаєсадеєсатасаддесаЧчЕсскаасааєстачатає часечссссаЧЕдадссаачі дагссддс ааддазааєдсаєааассядєсаскодеосадасЕЧеЕдсьсссасьу

ЧчечасасчісадсєдсавЕдЧЕСадсЕсаседеЕсакєстасодадаєссссаєсяаєстоваєсьссассвусаааєаач асаєссаєсддсасазасідасасаассуасаастаасадчадсь є

ЗЕС ИЮ МО: 19(Послідовність РНКІ, що використовується для сайленсінгу треонінсинтази)

СбдаааєсцасадідаєчасаєєцЕ засос ссазддазасьсеааєсьст ссЕдочодсьдаусає СЕ одсава сачЕсЕссаддсасдауєдасссасосусазаасастосудаассадссасасачдсадесгссвзаддасссдоадтає чассчссЕсддсдадссаачс:даасссЯєсааддаазакцдесасазассадссоЧссдагасадустдєдсевссасьд

ЧдЕдчасасчссадседсассді садсттасьуєдсаєстдсочоачасстссаєсчаєсоасасссссасссдсаавеазу асасссасаддсядсадсі ддЕасаассдагадсезасададсь с

ЗЕ ІЮ МО: 20 (Послідовність ДНК іншої треонінсинтази М. габасит) асчдсудсеЕесьссаасьсодсаєсьсасчавссьстссськсеЕстсссаассіссаєссавадсаасавссссстьасєгаа аєсссаасодсусссадссссссастсстасстааадссасадеє кс єстасадаєдатасаасстссосаєстасасаає сеісазаазсассуссдсссгусодасдадаасаєссяссачдзадесссуссуссасаєсястесссасааттссєсвсс ачасасусоссесссаасдссуассстаасіссячеЧчачеоасасссссіссасуадаєсакєсеяссасаассясьсяда годестастсчасдсссадсаєчасаєддасуєссьсзадазаєссдасодссачіасьадчечесссстосьвчассссс ччЧчсЧудсаачассасссадсськасадде стадо Еддсссаадазаддазсодаєсстасстдчазастдасачедай часассчссадідсьсссуаассагасуссаатсткскссавдастдаачеЧчЕсЕсодсавасачсссстссасасавасоа гЕсадсдаассааасаєєдсадааесаздссяасастоутадесесаадасєстсддсатдчастатассадссадесаяаздтіаа аксодкЕЕдсаодаазасдсасавассачісстсдусассудетасдсесссастодадасасассачстусассоєсодеє сассасасаєсьдсадусаєсссассаассотаєтстсасстдсааасазацдаєєтстасддсдсааст дує єссаассаає адссааєдчадасесссЕаЧсоседадесссдасастдаєссєдаєосаєдсаєдсачетссаєтсдссоаадесасасстдади сасесаєссасьЕсасаааєсссссааасаасстдадоссадаадоадсаааачасодсачстасадачассссьсосадсач сотчаседудсаачссссісасссоаусчасваєссессадсддавассьсддсаасасасасосаєсссасазаау4дєсесса авгчЕдсааудассьдадастсосідассусассесадасеЕсдцЕсстуєдсЕСяадсадессаасцсаватссЯястевасі гасассатадаєстоддссодавадаастсаааєстьдссаадуасавзасасаасаєссусаєсстудсктасасадчасєсддедас сседевесевссдасададсЕовскаєдсассдаадаастссвасодаасадсададсадусаасьдаддаздадт сдає счасасчасчЧсЕсадусачасссазстддатасссасасдосссосасассудсасддсассуасадсаєтаєссяаде таасааачасяддддаєтаєстаддссаасЕчаєтадчассуєчассосдацьасазсьсасаччдссдаадасссасссаатсе заччессчассаєсасссаааадазасааасаасасцчазагсассЯдчЕ ЕЕ одстааессассадс: чсава є дааадсачася є кеадассадссасудасчссстсаадааатассьдседчадсавнавастсьаачі єства

БЕ ІЮ МО: 21 (Трансльована послідовність ЕС ІЮ МО: 21)

МААЗОТСМЕВЗ5ЕЕЗРМІНРКООБРАКОМОСУОКЕТРІКАТАЗВТОРАТЗАЗТОРОКНЕВРАРЕМІНЕКЕАВВНІЗБНМЕБА

ВХМРЕМАРРМОБЕМХЗПОЕІІ1ХВ5А5ОСІОУОНОМОСАБККЕОСОУМАВОЕО5УСКТТИРУСЗОМИЗККЕЯМСРЕІ 050

РІМБАБЕСМ5МІОЕКАЕВЕСКОРІЕМЗО 1 МУКНОСІЗЕТОЗЕКОБСМТУСУЗОУМЕ,АКМНКРУУОУОСАВТООТБААТЗА

ХСАЗАБІРЗІУЕСРАМНКІЗМАО1?ОРІАМОАЕУ З БОТОКОССМОБІКЕМТАЕЦСРІХУСАМВОМОЦАГЕСОКТААТЕІЦОВ

ЕОЧЕМРОЖЧУІІРОСМІСМІТАЕУКОКОМСКЕСІУОВІВЕВГІСАОВАМАМРІОХІНУКОСИКЕЕКОУКАМНТТКАБАчОТОО С

РУБІОВАУТАСКМЯМСІУМЕКАТЕЕЕІМОАМАОАОСТОМЕІСРНТОУАТТАІ1ЗКІВКТОУІВРТОВТУУУВТАНСОТКЕТОЄ

КУОУНУЗКЕТКМНМЕСВКАМРРУОУКАСКОБУМОУСККУТІ5КМБКЕ

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб отримання рослини тютюну з підвищеною концентрацією вільного метіоніну порівняно з тютюном дикого типу, що включає в себе наступні стадії: (а) зниження експресії або активності треонінсинтази у рослині тютюну шляхом введення в рослину полінуклеотиду, який проявляє активність РНК-інтерференції проти мРНК треонінсинтази, де треонінсинтаза включає в себе () полінуклеотид, який складається з послідовності, що кодує треонінсинтазу, та має принаймні 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 3; (ії) поліпептид, який кодується будь-яким із зазначених полінуклеотидів, визначених у (ї), або (ії) поліпептид, який має принаймні 95 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7 або ЗЕО ІО МО: 8 та має активність треонінсинтази; (Б) вимірювання концентрації вільного метіоніну принаймні у частині трансгенної рослини, отриманої на стадії (і), та (с) ідентифікацію трансгенної рослини, в якій концентрація вільного метіоніну підвищилася порівняно з рослиною дикого типу, в якій експресія або активність треонінсинтази не була знижена, і де зовнішній вигляд зазначеної мутантної, що не зустрічається в природі, або трансгенної рослини по суті є таким, як і зовнішній вигляд рослини дикого типу через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

2. Трансгенна рослина тютюну, яка має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з рослиною тютюну дикого типу, де трансгенну рослину тютюну отримують у спосіб зап. 1, і де трансгенна рослина тютюну включає в себе полінуклеотид, який проявляє активність РНК- інтерференції проти мРНК треонінсинтази.

З. Трансгенний тютюновий рослинний матеріал, який має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з тютюновим рослинним матеріалом дикого типу, де трансгенний тютюновий рослинний матеріал походить від рослини тютюну, отриманої у спосіб за п. 2, і де трансгенний тютюновий матеріал включає в себе полінуклеотид, який проявляє активність РНК- інтерференції проти мРМК треонінсинтази.

4. Трансгенна рослина тютюну, яка має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з рослиною тютюну дикого типу, де експресія треонінсинтази або активність білка, кодованого таким чином, знижується, і частина трансгенної рослини тютюну має підвищення вмісту метіоніну принаймні на 5 95 порівняно з рослиною тютюну дикого типу, де експресія або активність треонінсинтази не була знижена, і де концентрація метіоналу в аерозолі, отриманому шляхом нагрівання трансгенної рослини тютюну, підвищилася принаймні на 5 95 порівняно з аерозолем, отриманим шляхом нагрівання рослини дикого типу, і де треонінсинтаза складається з поліпептиду, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8, де зовнішній вигляд зазначеної рослини по суті є таким, як і зовнішній вигляд рослини дикого типу через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки, де висота стебла трансгенних рослин по суті є такою, як і висота стебла рослини дикого типу через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки, і/або вміст хлорофілу у трансгенній рослині по суті є таким, як і вміст хлорофілу у рослині дикого типу через три місяці після пересадження у поле або 36 днів після прищипування верхівки.

5. Трансгенна рослина тютюну за п. 4, де концентрація вільного треоніну в частині рослини є підвищеною порівняно з рослиною дикого типу; переважно в якій Зо () концентрація вільного метіоніну в листі становить принаймні близько 0,03 мг/г; (ії) концентрація вільного треоніну в листі становить принаймні близько 0,5 мг/г; і (ії) концентрація метіоналу в аерозолі при нагріванні становить принаймні близько 2000 мкг/г.

6. Насіння, яке має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з насінням рослини тютюну дикого типу та містить клітини або тканину рослини тютюну за одним з пп. 2 і 4-5.

7. Рослинний матеріал, який має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з тютюновим рослинним матеріалом дикого типу та включає в себе біомасу або листя, що містить клітини або тканину рослини за будь-яким з пп. 2 і 4-5 або рослинний матеріал за п. 3.

8. Курильний виріб, який включає в себе сигарету, сигарилу або сигару, що має підвищену концентрацію вільного метіоніну порівняно з курильним виробом, отриманим з тютюнового рослинного матеріалу дикого типу, та містить частину рослини за будь-яким з пп. 2 і 4-5 або рослинний матеріал за п. З або 7.

9. Спосіб отримання метіоналу, який включає в себе наступні стадії: (а) забезпечення частини трансгенної рослини тютюну за будь-яким з пп. 2 і 4-5, рослинного матеріалу за п. З або 7або курильного виробу за п. 8; і (Б) їхнє нагрівання; і (с) добуття метіоналу.

вв 13.32 13.70 14.59 Зсап ЕВ» 100 вв142113 224 ве Вау | о не МеБлем таз? Рі » і Ж вза | оЗ6И А вис ввй 15 т 2доев . ТІЛА В а 13,84 17065 оз о 4. - ЯМА знай втру ев али тва 0 301 1000 200 400 6.00 8.00 10.00 12.00 1400 16.00 18.00 2000 ший еВ Її Бл 1093 зво 15 у пз 100 63095148 220 Бе во дві ее й Гете т8-2-3 ВІ Б І Я / 1057 12.88 - тв, 2.98 о 7.598.15 у 4 6,30 11.84 1667! А 793 0 ОМ Ловв юг/ вдототрвеи їв зо дов А МАВ лі два зт до 2.00 400 6.00 8.00 10.0 12.00 1400 16.00 16.00 20.00 22.00 10010807 сама 5 а їй в 1084-1139 п ТИ увв вл ; тв бсвп ев - ! ; і 16.1 Фо 244 (05 Й ва1288 и ЖИМ ЦА 257е8 К І Дадвзле ї Де» табу М ее Му і | | м погля й 40041 000 2.00 40 6.00 8.00 во3 10.00 0 1400 16.00 І8.00 20.00 2200 1005 0854 14724 5578 вазі | дова МАЯ Б в Троя бе єве » М і ол А25АЮВ і влз тові ее ВЗ І КД, | 32-и І ІЙ ї Пітт 150 7 ов4е8 о а А і КОЛИ дж А АТ КЛ и ИЮ ннятнттнте ал 000 240 400 65.00 8.00 10.00 12.00 то 16.00 18.00 2000 22 а ЕВ щу Бл 87. 133013. пох 1005 085142146 2 23 в і вв; ТОВ 6343 13754657 Ма ВРІ » ги 4 46 А тзавле Мово М Дивеівоз ВАК леви антві 2лвев зм А |вовтиАА Й й і 6717481 19.74 Й б -- Маса Д Дона нев Кутя Час 0600 200 ч95| 1 600 во | ф0б 4200 409 4600 | 8091 2000220

Фіг. 1