MX2014002498A - Treonina sintasa de nicotiana tabacum y metodos y usos de la misma. - Google Patents

Abstract

Se describe una célula de planta mutante, de existencia no natural o transgénica que comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste de o consiste esencialmente de una secuencia de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, o SEC ID NO: 3 o al menos un 87% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5, (ii) un polipéptido codificado por cualquiera de dichos polinucleótidos establecidos en (i); o (iii) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8; o (iv) una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido como se establece en (i).

Description

TREONINA SINTASA DE NICOTIAN A TABACUM Y MÉTODOS Y USOS DE LA MISMA Campo de la Invención La presente invención describe el gen de treonina sintasa de Nicotiana tabacum y variantes, homólogos y fragmentos de la misma. En particular, se describe la modificación de la expresión de este gen o la actividad de la proteína codificada de esta forma para incrementar los niveles de metionina libre en plantas - tal como plantas de tabaco. Esto se puede utilizar para generar sabores y aromas deseables en el tabaco, elevando los niveles de metional en los mismos.

Antecedentes de la Invención Un incremento en sabor - tal como en sustancias que producen aroma - en tabaco puede generar un sabor deseable cuando se fuma el tabaco. Dichos sabores pueden obtenerse, por ejemplo, de aminoácidos que se someten a reacciones de Maillard. El (3-(metiltio)propanal) metional es un compuesto de sabor responsable de un aroma a "papa horneada". El producto de metional puede ser inducido en forma térmica, en donde el metional se origina de metionina y derivados de metionina. La degradación de Strecker de la metionina implica la interacción con compuestos de alfa-dicarbonilo, los cuales son intermediarios en las reacciones de Maillard, y dan como resultado la formación de metional.

Varios métodos para incrementar la cantidad de metionina libre en plantas han sido desarrollados, por ejemplo, se pueden agregar a las plantas aminoácidos exógenos. Sin embargo, el uso de aminoácidos agregados en forma exógena da como resultado un incremento significativo en el costo de producción, así como aspectos de seguridad y de regulación.

La biosíntesis de metionina y treonina ambas están ligadas a la trayectoria de aspartato. En plantas, sus trayectorias biosintéticas son diferentes en el nivel de O-fosfohomoserina (OPH). Las enzimas de cistationina gama-sintasa (CGS) y treonina sintasa (TS) compiten para la O-fosfohomoserina de substrato común. Los niveles de metionina libres pueden incrementarse potencialmente sobreexpresando o inhibiendo la expresión de enzimas implicadas en la trayectoria biosintética.

Un método posible es sobreexpresar la cistationina gama-sintasa. Otro método es disminuir la expresión de treonina sintasa. Sin embargo, hasta la fecha dichos esfuerzos dirigidos a alterar los genes de treonina sintasa han dado como resultado fenotipos que afectan adversamente a toda la planta.

Bartlem et al. (2000) Plant Physiol., 2000, 123:101-110) describe mutaciones en el gen de treonina sintasa de las plantas Arabidopsis. Los mutantes descritos que llevan una mutación de un solo par base dentro del gen que codifica la treonina sintasa, mostraron una sobre acumulación de metionina y un nivel marcadamente reducido de treonina. Sin embargo, los mutantes descritos de Arabidopsis padecieron de crecimiento reducido en comparación con los del tipo natural. El crecimiento maniobrado puede rescatarse únicamente al momento de la adición de treonina o isoleucina.

Zeh et al. (2001) Plant Physiol., 2001, 127:792-802 describe plantas de papa transgénicas preparadas por un método transgénico antisentido que utiliza el promotor de virus de mosaico de coliflor 35S constitutivo. Aunque las plantas de papa transgénicas descritas exhibieron altos niveles de metionina, también padecieron de crecimiento reducido, en comparación con el de las plantas tipo natural.

Avraham et al. (2005) Transgenic Research, 2005, 1: 299-311 describe plantas Arabidopsis transgénicas que se preparan a través de un método transgénico antisentido. Aunque las plantas transgénicas descritas mostraron un nivel incrementado de metionina, padecieron de fenotipos severamente anormales, incluyendo retardo de crecimiento considerable, tamaño de hoja de roseta reducido y hojas cloróticas.

Existe la necesidad de plantas - tal como plantas de tabaco - que combinen un nivel incrementado de metionina libre, manteniendo al mismo tiempo ciertas propiedades agrónomamente deseables - tal como rango de crecimiento y tamaño general de las plantas - y sin requerir la adición de cualquiera ingredientes exógenos. Es un objeto de la presente invención satisfacer esta necesidad.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se basa al menos en parte, en el descubrimiento de que una reducción (por ejemplo, inhibición) en la expresión de treonina sintasa o actividad en plantas o células de plantas - tal como plantas o células de planta de tabaco - da como resultado un incremento en la concentración de metionina, en células de planta o una o más partes de una planta en comparación con una planta o célula de planta de control. Sorprendentemente, la planta genéticamente modificada no presenta cambio alguno en su apariencia visual general, en comparación con una planta de control. Este descubrimiento es inesperado en virtud de los diversos fenotipos adversos observados en plantas de papa o Arabidposis transgénicas. El descubrimiento puede ser explotado en forma conveniente debido a que las plantas se utilizan para la producción comercial de diversos productos incluyendo tabaco, en donde las alteraciones en la apariencia visual pueden ya sea no ser aceptables para la industria, o pueden dar como resultado rendimientos de producción inaceptablemente reducidos. Tampoco se requiere la adición de aminoácidos exógenos. Además, el aerosol que se libera al momento de calentar el tabaco contiene un nivel elevado de metional en comparación con el tabaco preparado de una planta de control. El incremento en metional en el humo y aerosol produce un sabor, aroma o tanto sabor como aroma deseables cuando se utiliza el tabaco.

Se establecen en las reivindicaciones adjuntas el aspecto y las modalidades de la presente invención.

En un aspecto se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3.

En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 87% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:4 o SEC ID NO:5.

En un aspecto adicional, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:20.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado codificado para cualquiera de uno de los polinucleótidos de la presente invención.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado que tiene al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 21.

En otro aspecto, se proporciona una construcción, vector o vector de expresión que comprende cualquiera de (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o cuatro o más) de los polinucleótidos de la presente invención.

En otro aspecto, se proporciona una célula de planta mutante, de existencia no naturalo célula de planta transgénica, que comprende al menos uno (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o cuatro o más) de los polinucleótidos, o al menos uno (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o cuatro o más) de los polipéptidos. En otro aspecto, se proporciona una planta mutante, de existencia no naturalo una planta transgénica que comprende la célula de la planta de acuerdo con la presente invención. En forma adecuada, la expresión de una o más secuencias que codifican treonina sintasa o la actividad de las proteínas de treonina sintasa codificadas de esta forma, es reducida, y una parte de la planta de tabaco tiene un incremento en el contenido de metionina de al menos el 5% en comparación con una planta de tabaco de control, en la cual la expresión o la actividad de treonina sintasa no ha sido reducida, o en donde la concentración metional en humo o aerosol es incrementada en al menos el 5% en comparación con el humo o aerosol de la planta de tabaco de control.

Un aspecto adicional se refiere a un método para incrementar la concentración de metionina en al menos una parte de la planta de tabaco, en donde el método comprende los pasos de: (i) reducir la expresión o actividad de una o más treoninas sintasas (por ejemplo, dos o más, tres o más o cuatro o más) en la planta de tabaco, preferentemente, en donde la treonina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir la concentración de metionina en al menos una parte de la planta de tabaco mutante, de existencia no naturalo transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identificar una planta mutante, de existencia no naturalo una planta de tabaco transgénica en donde la concentración de metionina en la misma ha incrementado en comparación con una planta de control. Preferentemente, la apariencia visual general de la planta mutante, de existencia no naturalo planta de tabaco transgénica es sustancialmente similar a la planta de tabaco de control, después un período, tal como tres meses después del trasplante en campo, o 36 días después del desmoche.

En una modalidad, no se requiere la adición de nutrientes exógenos - tal como aminoácidos - por ejemplo, treonina y/o isoleucina.

En otro aspecto, se proporciona una planta de tabaco mutante, de existencia no naturalo una planta de tabaco transgénica, o un material de planta de tabaco derivado o que se puede derivar de la misma, que se obtiene o es obtenido a través de este método.

En otro aspecto, también se proporciona una planta de tabaco mutante, de existencia no naturalo una planta de tabaco transgénica, en donde la expresión de una o más secuencias de codificación de treonina sintasa (por ejemplo, dos o más, tres o más o cuatro o más) o la actividad de la proteína de treonina sintasa codificada de esta forma se reduce, y una parte de planta de tabaco tiene un incremento en el contenido de metionina de al menos el 5% en comparación con una planta de tabaco de control en donde no se ha reducido la expresión o la actividad de treonina sintasa, o en donde la concentración metional en el humo o aerosol se incrementa en al menos el 5% en comparación con el humo o aerosol de la planta de tabaco de control.

En forma adecuada, la apariencia general de la planta es sustancialmente similar o visualmente indistinguible a la de la planta de control después de un período, tal como pero sin limitarse a tres meses después del trasplante en campo o 36 días después del desmoche. Preferentemente, (i) la altura del tallo de las plantas de tabaco mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es sustancialmente igual a la altura del tallo de las plantas de tabaco de control después de un período, tal como sin limitarse a tres meses después del trasplante en campo o 36 días después del desmoche; (i¡) el contenido de clorofila de las plantas de tabaco mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es sustancialmente igual al contenido de clorofila de las plantas de tabaco de control después un período, tal como sin limitarse a tres meses después del trasplante en campo o 36 días después del desmoche; o tanto (i) como (ii).

En forma adecuada, la concentración de treonina en una parte de la planta (por ejemplo, las hojas) se incrementa en comparación con la planta de control; y preferentemente, en donde (a) la concentración de metionina en la parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 0.03 mg/g; (b) la concentración de treonina en las hojas es de al menos aproximadamente 0.5 mg/g; (c) la concentración de metional en humo y aerosol al momento de calentarse es de al menos aproximadamente 2000 Mg/g; o una combinación de dos o más de (a), (b) y (c).

También se proporciona la biomasa, semilla u hojas que comprenden células o tejido de la planta mutante, de existencia no naturalo planta transgénica aquí descrita. También se proporciona un producto de tabaco que comprende una parte de la planta mutante, de existencia no naturalo planta transgénica, su biomasa, o sus hojas o una combinación de las mismas, tal como aquí se describe.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir metional que comprende los pasos de: (a) proporcionar una parte de una planta de tabaco mutante, de existencia no naturalo transgénica; biomasa, semillas u hojas; o el producto de tabaco aquí descrito; y (b) proporcionar calor al mismo.

En un aspecto adicional se proporciona un método para identificar un material de tabaco que libera los niveles elevados de metional en un aerosol al momento del calentamiento, en donde el método comprende los pasos de: (a) preparar una muestra de material de tabaco; (b) determinar el perfil de masa molecular de la muestra; y (c) comparar el perfil de masa molecular en una o más de una proporción de masa:carga; en donde los incrementos en las proporciones de masa específica:carga en comparación con una planta de control, son indicativos de que se elevarán los niveles de metional en el aerosol.

El material de tabaco identificado o que se puede identificar a través de este método también se proporcionan en un aspecto adicional de la presente descripción.

Los aspectos adicionales de la presente invención se establecen a continuación.

Un gen quimérico que comprende un polinucleótido enlazado en forma operable a una o más secuencias reguladoras.

Una construcción de polinucleótido NtTS, que comprende, consiste o consiste esencialmente de al menos 15 a 30 nucleótidos, 30 a 50 nucleótidos, 50 a 100 nucleótidos, 100 a 150 nucleótidos, 150 a 200 nucleótidos, 200 a 300 nucleótidos, 300 a 400 nucleótidos, 400 a 500 nucleótidos, 500 a 600 nucleótidos o 600 a 700 nucleótidos.

Un producto consumible que incorpora o utiliza material de planta, biomasa, semilla u hojas de acuerdo con la presente invención .

Una línea celular que comprende el (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o cuatro o más) polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión y similares de acuerdo con la presente invención.

Un método para modular la expresión de ADN NtTS o la actividad de la proteína codificada está formando una célula, en donde el método comprende administrar el (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más o cuatro o más) gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.

Un método para detectar, aislar, amplificar o analizar un polinucleótido de NtTS, en donde el método comprende el paso de proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido e hibridar el polinucleótido para una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido de al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótido aislada de acuerdo con la presente invención.

El uso de un agente que modula la expresión de ADN NtTS y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma para reducir el contenido de metionina en al menos una parte de una planta en al menos el 5% en comparación con la planta de control.

El método o el uso de acuerdo con la presente invención, en donde el agente es o se deriva de ADN NtTS, un gen NtTS quimérico, una construcción de polinucleótido que comprende un polinucleótido NtTS, un ARN antisentido, un ARN de hebra doble, un cADN, un conjugado que comprende polinucleótido NtTS y al menos una porción sin nucleótido o sin polinucleótido adherida covalentemente a la misma, una ribozima, un mutagen, un dedo de zinc, una molécula pequeña o meganucleasa.

En otra modalidad, el fragmento(s) de polinucleótido codifica un ácido nucleico antisentido, una ribozima, un ARN que efectúa la transdivisión transmitida por spliceosoma, un ARN de interferencia (ARNi), un ARN de guía, u otro ARN no traducido y similares. En otra modalidad, el fragmento(s) de polinucleótido codifica un ARNi.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto de tabaco, en donde el método comprende los pasos de: (a) obtener una semilla de la planta de tabaco mutante, de existencia no naturalo transgénica; (b) plantar y crecer la semilla en una planta; (c) recolectar la planta; y (d) preparar un producto de tabaco de la planta recolectada.

Las modalidades antes mencionadas se describen como modalidades de cada uno de los aspectos anteriores.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1, ilustra los perfiles LC-MS de las hojas curadas de VC-4, TN90-4, NtTS1-3, NtTS2-3, NtTS3-2, después de la extracción con metanol y la separación en una columna WatersXBridge Shield RP18. VC-4 es una planta de control únicamente de vector; TN90 es una planta de tabaco no modificada que proporciona el antecedente; NtTS1-3, NtTS2-3 y NtTS3-2 son plantas de Nicotiana tabacum que tienen un gen de treonina sintasa silenciado mediante ARNi. Las flechas indican los picos de aproximadamente 5, 9 17 y 19 minutos.

DEFINICIONES Los términos y expresiones técnicas utilizadas dentro del alcance de la presente solicitud, son generalmente para proporcionar el significado comúnmente aplicado a los mismos en la técnica pertinente de la biología de plantas y molecular. Todas de las siguientes definiciones de término se aplican al contenido total de esta solicitud. La palabra "que comprende" no excluye otros elementos o pasos, y el artículo indefinido "un" o "uno, una", no excluyen una pluralidad. Un paso simple puede cumplir con las funciones de varias características mencionadas en las reivindicaciones. Los términos "aproximadamente", "esencialmente" y "aproximadamente" dentro del contexto de un valor o rango numérico determinado, se refiere a un valor o rango que está dentro del 20%, dentro del 10%, o dentro del 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del valor o rango determinado.

El término "aislado" se refiere a cualquier entidad que se toma de su medio natural, aunque el término no indica algún grado de purificación.

Un "vector" se refiere a un vehículo de ácido nucleico que comprende una combinación de componentes de ácido nucleico para permitir el transporte de ácido nucleico, construcciones de ácido nucleico y conjugados de ácido nucleico y similares. Los vectores adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extracromosomal tal como plásmidos de ácido nucleico circular, de hebra doble; plásmidos de ácido nucleico de hebra doble linealizados; y otros vectores de cualquier origen.

Un "vector de expresión" es un vehículo de ácido nucleico que comprende una combinación de componentes de ácido nucleico para permitir la expresión de ácido nucleico, construcciones de ácido nucleico y conjugados de ácido nucleico y similares. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extracromosomal tal como plásmidos de ácido nucleico de hebra doble, circular; plásmidos de ácido nucleico de hebra doble linealizados; y otros vectores de expresión de funcionalidad equivalente de cualquier origen. Un vector de expresión comprende al menos un promotor colocado en la corriente ascendente y enlazados en forma operable a un ácido nucleico, construcciones de ácido nucleico o un conjugado de ácido nucleico, tal como se define más adelante.

El término "construcción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico recombinante, de hebra doble que comprende uno o más polinucleótidos. La construcción comprende una base de "hebra de plantilla" emparejada con un "sentido o hebra de codificación" complementaria. Se puede insertar una construcción determinada en un vector en dos posibles orientaciones, ya sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación inversa (o antisentido) con respecto a la orientación de un promotor colocado dentro un vector - tal como un vector de expresión. Se establece una construcción de ejemplo en la SEC ID NO: 9.

Un "promotor" se refiere a un elemento/secuencia de ácido nucleico, colocado normalmente en la corriente descendente y enlazado en forma operable a un fragmento de ácido nucleico de hebra doble. Los promotores se pueden derivar completamente de regiones próximas a un gen nativo de interés, o pueden componerse de diferentes elementos derivados de diferentes promotores nativos o segmentos de ácido nucleico sintéticos. Se establece un promotor de ejemplo en la SEC ID NO: 8.

Los términos "homología, identidad y similitud" se refieren al grado de similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico comparadas mediante alineación de secuencia. El grado de homología entre dos secuencias de ácido nucleico separadas que están siendo comparadas es una función del número de nucleótidos idénticos, o que coinciden en posiciones comparables. El porcentaje de identidad puede determinarse a través de inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse comparando la información de secuencia utilizando un programa de computadora tal como - ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA o Smith-Waterman.

El término "planta" se refiere a cualquier planta o cualquier etapa del ciclo de vida o desarrollo, y sus progenies. En una modalidad, la planta es una planta de tabaco, que se refiere a una planta que pertenece al género Nicotiana. Las especies, cultivos, híbridos y variedades preferidas de la planta de tabaco se describen en la presente invención.

Una "célula de planta" se refiere a una unidad estructural y fisiológica de una planta. La célula de planta puede estar en la forma de un protoplasto sin una pared celular, una célula simple aislada o una célula cultivada, o como parte de una unidad organizada superior tal como pero sin limitarse a, tejido de planta, órgano de una planta o una planta completa.

El término "material de planta" se refiere a cualquier composición sólida, líquida o gaseosa, o una combinación de la misma, que se puede obtener de una planta, incluyendo biomasa, hojas, lámina de la hoja, nervadura central, tallos, raíces, flores o parte de las flores, frutos, polen, células de huevesillos, cigotos, semillas, esquejes, secreciones y extractos, cultivos de célula o tejidos o cualquier otra parte o producto de una planta. En una modalidad, el material de la planta comprende o consiste de biomasa, semilla u hojas. En otra modalidad, el material de la planta comprende o consiste de hojas.

El término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. Aunque poseen uno o más rasgos distintivos, una variedad está caracterizada en forma adicional por una variación general muy pequeña entre individuos dentro de dicha variedad, con frecuencia una variedad se vende comercialmente.

El término "línea" o "línea de cultivo" tal como se utiliza en la presente invención, indica un grupo de plantas que son utilizadas durante el cultivo de la planta. Una línea se puede distinguir de una variedad, ya que muestra una pequeña variación entre los individuos en cuanto a uno o más rasgos de interés, aunque puede haber cierta variación entre individuos con respecto a otros rasgos.

El término "reducir" o "reducido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una reducción de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 99%, o una reducción de al menos10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 100% o más de una cantidad de actividad, tal como pero sin limitarse a actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.

El término "inhibir" o "inhibido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una reducción de aproximadamente 98% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 98%, al menos 99%, aunque particularmente del 100%, de una cantidad o actividad, tal como pero sin limitarse a actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.

El término "incremento" o "incrementado" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un incremento de aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 99%, o un incremento de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 100%, al menos el 150%, o al menos el 200% o más de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.

El término "control" dentro del contexto de una planta de control o células de planta de control, significa una planta o células de planta en donde no se ha modificado (por ejemplo, incrementado o reducido) la expresión o actividad de la treonina sintasa, y por lo tanto puede proporcionar una comparación con una planta en la cual se ha modificado la expresión o actividad de la treonina sintasa. La planta de control puede comprender un vector vacío. La planta de control puede corresponder a una planta tipo silvestre.

Descripción Detallada de la Invención En un aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste o que consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido y que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia aquí descrita, incluyendo cualquiera de los polinucleótidos mostrados en el listado de secuencias. En forma adecuada, los polinucleótidos aislados comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, .94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la misma.

En una modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2 y/o SEC ID No. 3. En forma adecuada, los polín ucleótidos aislados comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 1 , SEC ID No. 2 o SEC ID No. 3. La SEC ID NO: 1 es una secuencia de ADN de treonina sintasa de N. tabacum. La SEC ID NO.2 es una secuencia de ADN de treonina sintasa amplificada mediante PCR de transcriptasa inversa (RT) de ARN aislado de N. tabacum (variedad de Hicks de Hoja Ancha) y secuenciada. Esta secuencia está presente en uno de los ancestros de N. tabacum, Nicotiana silvestris, tal como se demuestra mediante análisis RT-PCR. La SEC ID NO: 3 es una secuencia de ADN de treonina sintasa amplificada mediante RT-PCR del ARN aislado de N. tabacum (variedad de Hicks de Hoja Ancha).

En otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 4 o SEC ID No. 5. La SEC ID NO: 4 corresponde a la secuencia de ADN genómico de SEC ID NO: 3. En comparación con la SEC ID NO: 1, el intrón de 137 pb se localiza en la posición 234 del codón de inicio ATG. La SEC ID NO: 5 corresponde a la secuencia de ADN genómico de treonina sintasa de N. tomentosiformis.

En otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polinucleótido que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%o, 88%., 89% o 90% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 20. En forma adecuada, los polinucleótidos aislados comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 20. La SEC ID NO: 20 es una secuencia de ADN de treonina sintasa de N. tabacum y que tiene el 85% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 1, 86% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 2, y 86% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 3.

El término "polinucleótido NtTS" se refiere a polinucleótidos que codifican la treonina sintasa de Nicotiana tabacum que comprenden, consisten o consisten esencialmente de polinucleótidos con homología sustancial (esto es similitud de secuencia) o identidad sustancial con la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20; fragmentos del polinucleótido NtTS que incluyen fragmentos de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20; y fragmentos de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20 con homología sustancial (esto es, similitud de secuencia) o con identidad sustancial con la misma que tiene al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, o 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de las SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5 o SEC ID NO:20. Los fragmentos de ejemplo se establecen en las SEC ID Nos 9 a 19. Tal como aquí se describe, la variante puede tener al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5 o SEC ID NO:20. El polinucleótido NtTS también incluye secuencias que comprenden un grado de identidad suficiente o sustancial o similitud con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20 para codificar un polipéptido que funciona como una treonina sintasa. En una modalidad, el término "polinucleótido NtTS" se refiere a un polímero de nucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de un polinucleótido designado en la presente invención como SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20.

El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos, que puede ser ácido desoxiribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) no modificado o modificado. Por consiguiente, un polinucleótido puede ser sin limitación un ADN genómico, ADN complementario (cADN), mARN, o ARN antisentido o un fragmento(s) de los mismos. Además, un polinucleótido puede ser ADN de hebra simple o hebra doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra simple y hebra doble, una molécula híbrida que comprende ADN y ARN, o una molécula híbrida con una mezcla de regiones de hebra simple y de hebra doble o un fragmento(s) de los mismos.

Un polinucleótido tal como aquí se describe generalmente contendrá enlaces de fosfodiéster, aunque en algunos casos, se incluyen análogos de polinucleótido que pueden tener esqueletos alternativos, que comprenden por ejemplo, ligaduras de fosforamidata, fosforotioato, fosforoditioato, o O-metilfosforoamidita; y esqueletos y ligaduras de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen esqueletos positivos, esqueletos no iónicos y esqueletos sin ribosa. Las modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato se pueden llevar a cabo por una variedad de razones, por ejemplo, para incrementar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Las mezclas de polinucleótidos y análogos de existencia naturalpueden ser elaboradas; alternativamente, se pueden elaborar mezclas de análogos de polinucleótido diferentes y mezclas de polinucleótidos y análogos de origen natural.

Se conoce una variedad de análogos de polinucleótido, incluyendo, por ejemplo, ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfosforoamidita y esqueletos y ligaduras de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen esqueletos positivos, esqueletos no iónicos y esqueletos sin ribosa. También están incluidos polinucleótidos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos.

Otros análogos incluyen polinucleótidos de péptido (PNA) que son análogos de polinucleótido de péptido. Estos esqueletos son sustancialmente no iónicos bajo condiciones neutrales, en contraste con el esqueleto de fosfodiéster altamente cargado de polinucleótidos de origen natural. Esto puede dar como resultado ventajas. Primero, el esqueleto de PNA puede presentar cinéticas de hibridación mejoradas. Los PNAs tienen cambios más grandes en la temperatura de fusión (Tm) para pares base desacoplados versus completamente acoplados. El ADN y ARN normalmente presentan una caída en Tm de 2 a 4°C para un desacoplamíento interno. Con el esqueleto de PNA no ¡nónico, la caída es cercana a 7 a 9°C. En forma similar, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases adheridas a estos esqueletos es relativamente insensible a la concentración de sal. Además, los PNAs pueden no ser degradados o degradados en un menor grado por enzimas celulares, y de esta forma pueden ser más estables.

Entre los usos de los polinucleótidos descritos, y combinaciones de fragmentos de los mismos, se encuentra el uso de fragmentos como sondas en ensayos de hibridación de ácido nucleico o cebadores en ensayos de amplificación de ácido nucleico. Dichos fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN que comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Por lo tanto, en un aspecto, también se proporciona un método para seleccionar polinucleótidos NtTS, en donde el método comprende el uso de las sondas y/o los cebadores. Los cebadores de ejemplo se establecen en las SEC ID NOs: 10 a 14. Opcionalmente, los cebadores se pueden utilizar como sondas. Los cebadores o sondas de ejemplo pueden hibridar a regiones que son homólogas entre SEC ID NOs: 1, 2 y 3 o SEC ID NO: 20. Los cebadores o sondas de ejemplo pueden hibridar para los nucleótidos 1 a 46 de las SEC ID NOs: 1, 2 y 3; para nucleótidos 1 a 52 de la SEC ID NO:20; para nucleótidos 99 a 141 de la SEC ID NO. 1; para nucleótidos 102 a 144 de la SEC ID NO. 2 y SEC ID NO: 3; para nucleótidos 102 a 153 de la SEC ID NO:20¡ para nucleótidos 325 a 1362 de las SEC ID NOs: 1, 2 y 3; o para los nucleótidos 1334 a 1371 de la SEC ID NO:20.

Los parámetros básicos que afectan la elección de condiciones de hibridación y guía para considerar condiciones adecuadas se describen en las Publicaciones de Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con secuencias de aminoácido aquí descritas, se pueden preparar grupos de oligonucleótidos de degeneración. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en PCR, mediante lo cual los fragmentos de ADN se aislan y purifican. En ciertas modalidades, se pueden utilizar cebadores de degeneración como sondas para bibliotecas genéticas. Dichas bibliotecas pueden incluir pero no se limitan a bibliotecas de cADN, bibliotecas genómicas e incluso una etiqueta de secuencia express electrónica o bibliotecas de ADN. Las secuencias homólogas identificadas a través de este método, posteriormente se pueden utilizar con sondas para identificar homólogos de las secuencias aquí identificadas.

Asimismo, son de uso potencial polinucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas) que hibridan bajo condiciones de rigurosidad reducida, normalmente condiciones moderadamente rigurosas, y condiciones comúnmente altamente estrictas para los polinucleótido(s) tal como aquí se describen. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridización y la guía para considerar condiciones adecuadas se establecen en las Publicaciones de Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y.), y pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica con base, por ejemplo, en la longitud o composición base del polinucleótido.

Una forma de lograr condiciones moderadamente estrictas implica el uso de una solución de prelavado que contiene Citrato de Sodio estándar 5x, Sulfato Dodecilo de Sodio al 0.5%, Ácido Etilenodiaminotetraacético (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, Citrato de Sodio Estándar 6x, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene aproximadamente el 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42°C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60°C, en Citrato de Sodio estándar 5x, Sulfato Dodecilo de Sodio al 0.5%. Generalmente las condiciones altamente estrictas están definidas como condiciones de hibridación tal como se indicó anteriormente, pero con temperatura de lavado de aproximadamente 68°C, Citrato de Sodio estándar 5x, Sulfato Dodecilo de Sodio al 0.1%. SSPE (1x SSPE es cloruro de sodio 0.15M, fosfato de sodio 10 mM, y Ácido Etilenodiaminotetraacético 1.25 m , pH 7.4) pueden substituirse por Citrato de Sodio Estándar (el Citrato de Sodio Estándar 1x es cloruro de sodio 0.15M y citrato de sodio 15 mM) en la hibridación y los amortiguadores de lavado; los lavados se llevaron a cabo durante 15 minutos después de que se termina la hibridación. Deberá quedar entendido que las temperaturas de lavado y la concentración de sal de lavado se pueden ajustar según sea necesario para lograr un grado deseado de rigurosidad, aplicando los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad dúplex, tal como lo saben los expertos en la técnica, y tal como se describe con mayor detalle más adelante (ver por ejemplo la Publicación de Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Cuando se híbrida un polinucleótido para un polinucleótido objetivo de secuencia desconocida, se asume la longitud de híbrido como la del polinucleótido de hibridación. Cuando los polinucleótidos de secuencia conocida son hibridados, se puede determinar la longitud del híbrido alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima. La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipan como menor a 50 pares de longitud, debe ser de 5 a 10°C menos que la temperatura de fusión del híbrido, en donde la temperatura de fusión se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores a 18 pares base de longitud, la temperatura de fusión (°C) = 2(número de bases A+T) + 4(número de bases G + C). Para híbridos con longitud superior a 18 pares base, la temperatura de fusión es (°C) = 81.5+16.6(log10 [Na + ]) + 0.41 (% G + C)-(600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na + ] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ([Na+] para un Citrato de Sodio Estándar 1x=0.165 ). Normalmente, cada uno de dichos polinucleótidos de hibridación tiene una longitud que es al menos del 25% (comúnmente al menos 50%, 60% o 70%, y más comúnmente al menos 80%) de longitud de un polinucleótido para el cual híbrida, y tiene una identidad de secuencia de al menos el 60% (por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) con un polinucleótido para el cual híbrida. Tal como lo comprenderán los expertos en la técnica, un ADN lineal tiene dos posibles orientaciones: la dirección 5'-a-3' y la dirección 3'-a-5'. Por ejemplo, si se coloca una secuencia de referencia en la dirección 5'-a-3', y si la segunda secuencia se coloca en la dirección 5'-a-3' dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Normalmente, se colocan en la misma orientación una secuencia promotora y un gen de interés bajo la regulación del promotor determinado. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia colocada en la dirección 5'-a-3', si se coloca una segunda secuencia en la dirección 3'-a-5' con la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la dirección antisentido, o tienen una orientación antisentido. Dos secuencias que tienen orientaciones antisentido con respecto una a la otra, pueden ser descritas alternativamente como teniendo la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección (5'-a-3') y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia (secuencia de referencia colocada en 5'-a-3') se colocan dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido. Las secuencias establecidas en la presente invención, se muestran en la dirección 5'-a-3'.

Las construcciones recombinantes aquí proporcionadas se pueden utilizar para transformar plantas o células de planta con el objeto de modular los niveles de expresión de proteína NtTS. Una construcción de polinucleótido recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica para un polinucleótido NtTS tal como aquí se describe, enlazado en forma operable a una región reguladora adecuada para expresar el polipéptido NtTS en la planta o célula. Por lo tanto, un polinucleótido puede comprender una secuencia de codificación que codifica el polipéptido NtTS tal como aquí se describe.

El polipéptido NtTS codificado por un polinucleótido recombinante puede ser un polipéptido NtTS, o puede ser heterólogo para la célula. En algunos casos, la construcción recombinante contiene un polinucleótido que reduce o inhibe la expresión del polipéptido de modulación NtTS, enlazado en forma operable a una región reguladora. Los ejemplos de regiones reguladoras adecuadas se describen en la presente invención.

También se proporcionan vectores que contienen construcciones de polinucleótido recombinante, tal como los aquí descritos. Los esqueletos de vector adecuados incluyen por ejemplo, los utilizados en forma rutinaria en la técnica tal como plásmidos, virus, cromosomas artificiales BACs, YACs o PACs. Los vectores de expresión adecuada incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus y retrovirus. Numerosos vectores y sistemas de expresión están comercialmente disponibles.

Los vectores también incluyen, por ejemplo, orígenes de réplica, regiones de adhesión de andamio o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable en una célula planta. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocida, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, canamicina, G418, bleomicina o higromicina), o un herbicida (por ejemplo, glifosato, clorosulfurón o fosfinotricina) . Además, un vector de expresión puede incluir una secuencia de etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias Tag, tal como luciferasa, beta-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), S-transferasa de glutationa (GST), polihistidina, c-myc o secuencias de hemaglutinina normalmente se expresan como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas se pueden insertar en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo ya sea el término carboxilo o amino.

Se puede transformar una planta o célula de planta teniendo el polinucleótido recombinante integrado en el genoma para quedar transformado en forma estable. Las células transformadas en forma estable normalmente retienen el polinucleótido introducido con cada división celular. Una planta o célula de planta también puede ser transformada temporalmente de modo que el polinucleótido recombinante no se integre en su genoma.

Normalmente las células transformadas temporalmente pierden toda o cierta parte del polinucleótido recombinante con cada división celular, de modo que el polinucleótido recombinante introducido no puede ser detectado en células hija después de un número suficiente de divisiones celulares.

Están disponibles un número de métodos en la técnica para transformar una célula de planta, los cuales todos están comprendidos en la presente invención, incluyendo técnicas biolísticas, de pistola genética, transformación transmitida por Agrobacterium, transformación transmitida por vector viral y electroporación . El sistema de Agrobacterium para integración del ácido nucleico extraño en los cromosomas de planta, ha sido estudiado, modificado y explotado en forma extensa para diseño genético de plantas. Las moléculas de ácido nucleico recombinante descubiertas que comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden a la proteína de tabaco purificada en cuestión enlazadas a secuencias reguladoras en forma operable en la orientación de sentido o antisentido, se unen a secuencias de T ADN adecuadas a través de métodos convencionales. Estos se introducen en protoplastos de tabaco mediante técnicas de polietilenglicol o mediante técnicas de electroporación, la cuales, ambas, son estándar. Alternativamente, dichas moléculas de ácido nucleico recombinante que comprenden vectores que codifican la proteína purificada en cuestión, se introducen en las células Agrobacterium , las cuales posteriormente transfieren el ácido nucleico en las células de planta. La transformación mediante ADN descubierto sin las secuencias de vector de T ADN que las acompañan, se puede lograr mediante la fusión de protoplastos de tabaco con liposomas que contienen ácido nucleico o mediante electroporación. Ei ADN descubierto que no está acompañado por secuencias de vector de ADN, también se puede utilizar para transformar células de tabaco mediante microproyectiles de alta velocidad, inertes.

Si se utiliza una célula o tejido cultivado como el tejido receptor para transformación, las plantas pueden ser regeneradas si se desea, de cultivos transformados, mediante técnicas conocidas para los expertos en el arte.

La elección de las regiones reguladoras que serán incluidos en una construcción recombinante, depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, capacidad de selección, capacidad de inducción, nivel de expresión deseado y expresión preferencial de célula o tejido. Es un asunto de rutina para un experto en la técnica, modular la expresión de una secuencia de codificación seleccionando y colocando en forma adecuada regiones reguladoras relativas a la secuencia de codificación. La transcripción de un polinucleótido puede modularse en una forma similar. Algunas regiones reguladoras adecuadas inician únicamente la transcripción, o predominantemente, en ciertos tipos de células. Los métodos para identificar y caracterizar las regiones reguladoras en ADN genómico de plantas, son conocidos en la técnica.

Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido reconocidos por factores específicos de tejido presentes en diferentes tejidos o tipos celulares (por ejemplo, promotores específicos de raíz, promotores específicos de botón, promotores específicos de xilema) o presentes durante diferentes etapas de desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos que pueden activarse en la mayor parte de los tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción de polipéptido ARNi de treonina sintasa, incluyen el virus de mosaico de coliflor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, o promotores de ubiquitina o faseolina. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de generar múltiples variaciones de promotores recombinantes.

Los promotores específicos de tejido son elementos de control de transcripción que únicamente están activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductores. Puede ser conveniente la expresión específica de tejido, por ejemplo, cuando se prefiere la expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control de desarrollo, incluyen promotores que pueden iniciar únicamente la transcripción (o sólo principalmente) en ciertos tejidos, tal como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o tejidos reproductivos tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embriónico. Los promotores específicos de tejido reproductivo pueden ser, por ejemplo, específicos de antera, específicos de óvulo, específico de embrión, específico de endosperma, específico de tegumento, específicos de semilla y recubrimiento de semilla, específico de polen, específico de pétalos, específico de sépalo, o combinaciones de los mismos.

Los promotores específicos de hoja adecuados incluyen piruvato, promotor de diquinasa de ortofosfato (PPDK) de la planta C4 (maíz,), promotor cab-m1Ca + 2 de maíz, el promotor de gen relacionado myb Arabidopsis thaliana (Atmyb5), los promotores de carboxilasa de bifosfato de ribulosa (RBCS) (por ejemplo, los genes de tomate RBCS1, RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y sembradíos de crecimiento con luz, RBCS1 y RBCS2 expresado en frutas de tomate en desarrollo o promotor de carboxilasa de bifosfato de ribulosa expresado casi exclusivamente en células de mesofilo en cuchillas de las hojas forros de las hojas en altos niveles).

Los promotores específicos de senectud adecuados incluyen un promotor de tomate activo durante la maduración de la fruta, senectud y abscisión de las hojas, un promotor de maíz del gen que codifica una proteasa de cisteína. Se pueden utilizar promotores específicos de antera adecuados. Los promotores preferidos de raíz adecuados conocidos para los expertos en la técnica pueden ser seleccionados. Los promotores preferidos de semilla adecuados incluyen tanto promotores específicos de semilla (los promotores activos durante el desarrollo de semilla tal como promotores de proteínas de almacenamiento de semilla) como promotores de germinación de semilla (los promotores activos durante la germinación de semilla). Dichos promotores preferidos de la semilla incluyen pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); CZ19B1 (zeína de maíz 19 kDa); milpas (sintasa de mio-inositol-1 -fosfato); mZE40-2, también conocida como Zm-40; nuclc; y celA (sintasa de celulosa). La gamma-zeína es un promotor específico de endosperma. Glob-1 es un promotor específico de embrión. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no se limitan a beta-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina, lectina de frijol de soya, cruciferina, y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen pero no se limitan a promotor de zeína de maíz 15 kDa, un promotor de zeína 22 kDa, un promotor de zeína 27 kDa, un promotor de gamma-zeína, un promotor de ?-zeína 27 kDa (tal como promotor gzw64A, consultar el número de Acceso Genbank S78780), un promotor ceroso, un promotor de encogimiento 1, un promotor de encogimiento 2, un promotor de globulina 1 (consultar el número de Acceso Genbank L22344), un promotor Itp2, un promotor cim1, promotores end1 y end2 de maíz, promotor nucí, promotor Zm40, eepl y eep2; led , promotor de tiorredoxina H, promotor mlip15, promotor PCNA2 y el promotor de encogimiento-2.

Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores que responden a ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, luz, SECuía, temperatura fría o alta concentración de sal. Los promotores inducibles con patógeno incluyen los procedentes de proteína relacionadas con patogénesis (proteínas PR) las cuales son inducidas después de infección a través de un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 ,3-glucanasa, quitinasa).

Además de los productores de plantas, otros promotores adecuados pueden ser derivados de origen bacteriano por ejemplo, el promotor de sintasa octopina, el promotor de sintasa nopalina y los promotores derivados de plásmidos Ti), o se pueden derivar de promotores virales (por ejemplo, promotores de ARN 35S y 19S del virus de mosaico de coliflor (Ca V), promotores constitutivos de virus de mosaico de tabaco, promotores 19S y 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), o virus de mosaico de escrofularia 35S).

El término "polipéptido NtTS" se refiere a un polipéptido que codifica treonina sintasa de Nicotiana tabacum e incluye polipéptidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia de aminoácido codificada por un polinucleótido con al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, o SEC ID NO; 3, o un polinucleótido con al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20; fragmentos del polinucleótido NtTS de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20; y fragmentos de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20 que tienen al menos aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 25 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con los fragmentos correspondientes de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 20. Los fragmentos de ejemplo se establecen en las SEC ID Nos 9 a 19. Los polipéptidos NtTS también incluyen secuencias que comprenden un grado suficiente o sustancial de identidad o similitud con la SEC ID NO: 6, SEC ID NO; 7, o SEC ID NO: 8 para funcionar como una treonina sintasa e incluyen secuencias con al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 21. La SEC ID NO: 6 es la secuencia traducida de SEC ID NO: 1. SEC ID NO: 7 es la secuencia traducida de SEC ID NO: 2. SEC ID NO: 8 es la secuencia traducida de SEC ID NO. 3. SEC ID NO: 21 es la secuencia traducida de SEC ID NO: 20 y tiene el 89% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9.

En una modalidad, los fragmentos de los polipéptidos NtTS retienen la actividad de treonina sintasa. Los polipéptidos NtTS también incluyen variantes y mutantes producidos introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación; cambios que afectan el plegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), que pueden ser diseñados deliberadamente o proporcionados aislados en forma natural, ya que aún funcionan como una treonina sintasa. Los polipéptidos NtTS pueden estar en forma lineal o ciclada utilizando métodos conocidos. El término "polipéptido NtTS" puede referirse a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente de la secuencia establecida en la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 21.

En otro aspecto, se proporciona un polipéptido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polipéptido que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias aquí descritas, incluyendo cualquiera de los polipéptidos mostrados en el listado de secuencias. En forma adecuada, los polipéptidos aislados comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la misma.

Los polipéptidos NtTS incluyen variantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación; cambios que afectan el plegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación) que pueden ser diseñados deliberadamente o aislados en forma natural. La variante puede tener alteraciones que producen un cambio silente y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácido deliberadas se pueden elaborar sobre las bases de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o naturaleza anfipática de los residuos, siempre que se retenga la actividad de enlace secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados en forma negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos cargados en forma positiva incluyen Usina y arginina; y aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina. Se pueden realizar sustituciones conservadoras, por ejemplo de acuerdo con la tabla que se encuentra a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna, pueden ser sustituidos entre sí.

El polipéptido NtTS puede ser una proteína madura o proteína inmadura o una proteína derivada de proteína inmadura. Los polipéptidos NtTS pueden ser de forma lineal o ciclados utilizando métodos conocidos. Los polipéptidos NtTS comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.

En una modalidad, se proporciona un polipéptido aislado codificado por cualquiera de los polinucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 1, SEC ID No. 2 o SEC ID No. 3 o a través de cualquiera de los polinucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID No. 4, SEC ID No. 5 o SEC ID NO:20.

En otra modalidad, se proporciona un polipéptido aislado que codifica una treonina sintasa y que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia de polipéptido que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:21.

En otra modalidad, se proporciona un polipéptido aislado que codifica una treonina sintasa y que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia establecida en la SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:21.

Los fragmentos de las secuencias de polipéptido también se describen en la presente invención, en forma adecuada, dichos fragmentos retienen la actividad de treonina sintasa.

Las variantes de polipéptido mutante se pueden utilizar para crear plantas mutantes, plantas de origen no natural, y plantas transgénicas que comprenden el polipéptido NtTS mutante. En forma adecuada, el polipéptido NtTS mutante retiene la actividad de treonina sintasa.

Un polipéptido puede prepararse cultivando células huésped transformadas o recombinantes bajo condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido. El polipéptido expresado resultante posteriormente puede purificarse a partir de dicho cultivo utilizando procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes que enlazaran al polipéptido; uno o más pasos de columna sobre dichas resinas de afinidad; uno o más pasos que implican cromatografía de interacción hidrofóbica; o cromatografía de inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido también puede ser expresado en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de fusión, tal como los de polipéptido de enlace de maltosa (MBP), glutationa-5-transferasa (GST) o tioredoxina (TRX). Los equipos para expresión y purificación de polipéptidos de fusión están comercialmente disponibles. El polipéptido puede etiquetarse con un epítope y purificarse subsecuentemente utilizando un anticuerpo específico dirigido a dicho epítope. Se pueden emplear uno o más pasos de cromatografía - tal como cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa para purificar en forma adicional el polipéptido. Algunos o todos de los pasos de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se pueden emplear para proporcionar un polipéptido recombinante sustancialmente homogéneo. El polipéptido purificado de esta forma puede estar sustancialmente libre de otros polipéptidos y se define en la presente invención como un "polipéptido sustancialmente purificado"; dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptidos, fragmentos, variantes, y similares. La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos se puede lograr a través de cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse a los métodos aquí descritos.

También es posible utilizar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos, para polipéptidos expresados mediante purificación - afinidad. Estos polipéptidos pueden ser eliminados de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elución de sal de alto nivel y posteriormente díalizarse en un amortiguador de sal inferior para utilizarse, o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o pueden eliminarse en forma competitiva utilizando el substrato de existencia natural de la porción de afinidad.

También se puede producir un polipéptido a través de síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos o fragmentos de los mismos a través de medios sintéticos son conocidos para los expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptido construidos en forma sintética, en virtud de que comparten características de conformación o estructurales primarias, secundarias o terciarias con un poiipéptido nativo, pueden poseer propiedades biológicas en común entre sí, incluyendo actividad biológica.

El término "de existencia no natural" tal como se utiliza en la presente invención, describe una entidad (por ejemplo, un polinucleótido, una mutación genética, un poiipéptido, una planta, una célula de planta o material de planta) que no se forma en la naturaleza o que no existe en la naturaleza. Dichas entidades o entidades artificiales que no existen en la naturaleza se pueden elaborar, sintetizar, iniciar, modificar, intervenir o manipular a través de los métodos aquí descritos, o que son conocidos en la técnica. Por lo tanto, a manera de ejemplo, se puede elaborar una planta de existencia no natural, una célula de planta de existencia no natural o un material de planta de existencia no natural utilizando técnicas de cultivos de planta tradicionales - tal como retrocruce, o mediante tecnologías de manipulación genética - tal como ARN antisentido, ARN de interferencia, meganucleasa y similares. A manera de ejemplo adicional, una célula de planta de existencia no natural o un material de planta de existencia no natural, mediante introgresión de o transferencia de una o más mutaciones genéticas (por ejemplo uno o más polimorfismos) de una primera planta o célula de planta en una segunda planta o célula de planta (la cual por sí misma puede ser de origen natural), de modo que la planta, célula de planta o material de planta resultante o la progenie de la misma comprenda una constitución genética (por ejemplo, un genoma, un cromosoma o un segmento del mismo) que no es de existencia naturalo que no existe en la naturaleza. Por lo tanto la planta, célula de planta o material de planta resultante es artificial y de existencia no natural. Por consiguiente, se puede elaborar una planta o célula de planta artificial o de existencia no natural, modificando una secuencia genética en la primera planta o célula de planta artificial o de existencia natural, dando como resultado una secuencia genética modificada (i) que es artificial; o (i¡) de existencia naturales una segunda planta o célula de planta, siempre que la segunda planta o célula de planta comprenda un diferente antecedente genético al de la primera planta o célula de planta. Las diferencias en antecedente genético de una planta o célula de planta, pueden ser detectadas mediante diferencias fenotípicas o mediante técnicas de biología molecular conocidas en la técnica - tal como secuenciación de ácido nucleico, en presencia o ausencia de marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores de ARN de microsatélite).

En otra modalidad, se proporcionan anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos NtTS. Los polipéptidos NtTS, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, tal como aquí se establecen, se pueden emplear como "inmunogenes" en la producción de anticuerpos inmunoreactivos con los mismos. Dichos anticuerpos pueden enlazar específicamente a los polipéptidos NtTS a través de los sitios de enlace de antígeno del anticuerpo. Específicamente los anticuerpos de enlace son aquellos que reconocerán en forma específica y enlazaran con los polipéptidos de la familia NtTS, homólogos y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido NtTS tal como se establece en la presente invención, y no reaccionan en forma cruzada con otros polipéptidos.

Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicas o epítopes que generan la formación de anticuerpos. Estas determinantes antigénicas o epítopes pueden ser ya sea lineales o conformacionales (discontinuas). Los epítopes lineales están compuestos de una sección simple de aminoácidos del polipéptido, en tanto que los epítopes de conformación o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena de polipéptido que se ponen en proximidad cercana al momento del pliegue de polipéptido. Los epítopes pueden ser identificados a través de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Además, los epítopes de los polipéptidos pueden ser utilizados como reactivos de investigación, en ensayos y para purificar anticuerpos de enlace específico de sustancias tales como suero policlonal o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Dichos epítopes o variantes de los mismos se pueden producir utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como síntesis de fase sólida, disociación química o enzimática de un polipéptido, o utilizando tecnología de ADN recombinante.

Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales para los polipéptidos, se pueden preparar a través de técnicas convencionales. Las líneas de célula de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos, también están contemplados en la presente invención. Dichos hibridomas pueden ser producidos o identificados mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar varios animales huésped mediante inyección con un polipéptido NtTS, fragmento, variante o mutante de los mismos. Dichos animales huésped pueden incluir, pero no se limitan a conejos, ratones y ratas, por nombrar algunos, se pueden utilizar varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Dependiendo de la especie huésped, dichos adyuvantes incluyen pero no se limitan a geles minerales de Freund (completos o incompletos), tal como hidróxido de aluminio, sustancias activas en la superficie tal como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de penetración magnética, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar mediante técnicas convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, I g E , IgA, IgD, y cualquier subclase de los mismos.

Los anticuerpos se pueden utilizar en ensayos para detectar la presencia de poiipéptidos o fragmentos, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear en purificar poiipéptidos o fragmentos mediante cromatografía por afinidad.

Las composiciones que pueden reducir la expresión o actividad de la treonina sintasa incluyen pero no se limitan a, polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más genes de sintasa(s) endógeno; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de transcripciones de ARN de treonina sintasa (por ejemplo, ARNs de hebra doble, siARNs, ribozimas); poiipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de proteínas de treonina sintasa; polinucleótidos específicos de secuencia que puede interferir con la actividad enzimática de proteína de treonina sintasa o la actividad de enlace de proteína de treonina sintasa con respecto a los substratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben especificidad para proteína de treonina sintasa; compuestos de molécula pequeña que pueden interferir con la estabilidad de proteína de treonina sintasa o la actividad enzimática de proteína de treonina sintasa o la actividad de enlace de proteína de treonina sintasa; proteínas de dedo de zinc que enlazan al polinucleótido de treonina sintasa; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido de treonina sintasa.

La tecnología antisentido es un método bien conocido que puede ser utilizado para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtTS. Se clona un polinucleótido del gen NtTs que será reprimido y se enlaza en forma operativa a una región reguladora y una secuencia de terminación de transcripción de modo que se transcriba la hebra antisentido de ARN. Posteriormente la reconstrucción recombinante se transforma en plantas y se produce la hebra antisentido de ARN. El polinucleótido no necesita ser toda la secuencia del gen que será reprimido, aunque normalmente será sustancialmente complementaria al menos a una parte de la hebra de sentido del gen que será reprimido.

Se puede transcribir un polinucleótido en una ribozima, un ARN catalítico, que afecta la expresión de un mARN. Las ribozimas se pueden diseñar para emparejarse en forma específica virtualmente con cualquier ARN objetivo y disociar el esqueleto de fosfodiéster en una ubicación específica, desactivando funcionalmente de esta forma el ARN objetivo. Los polinucleótidos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para disociar transcripciones de mARN particulares, evitando de esta forma la expresión de un polipéptido. Las ribozimas cabeza de martillo son útiles para destruir los mARNs particulares, aunque se pueden utilizar diversas ribozimas que disocian el mARN en secuencias de reconocimiento específicas del sitio. Las ribozimas cabeza de martillo disocian mARNs en las ubicaciones dictadas mediante regiones de flanqueo que forman pares base complementarios con el mARN objetivo. El único requerimiento es que el ARN objetivo contenga una secuencia de nucleótido 5'-UG-3'. La construcción y producción de las ribozimas cabeza de martillo es conocida en la técnica. Las secuencias de ribozima cabeza de martillo se pueden incrustar en un nucleótido ARN estable, tal como un ARN de transferencia para incrementar la eficiencia de disociación ¡n vivo.

En una modalidad, los polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de las transcriptores de ARN, son ARN de interferencia. La interferencia de ARN o la silenciación de ARN es un proceso conservado en forma evolutiva a través del cual los mARNs específicos pueden ser dirigidos para degradación enzimática. Un ARN de hebra doble debe ser introducido o producido por una célula (por ejemplo, un virus de ARN de hebra doble, o polinucleótidos de ARN de interferencia) para iniciar la trayectoria de ARN de interferencia. El ARN de hebra doble puede convertirse en múltiples dúplex ARN de interferencias pequeños de 21 a 23 pares bases de longitud RNasas III, que son endonucleasas específicas de ARN de hebra doble. Los ARNs de interferencia pequeños se pueden reconocer subsecuentemente mediante complejos de silenclación inducida por ARN que promueven el desenrollado del ARN de interferencia pequeño a través del proceso dependiente ATP. La hebra antisentido desenrollada del ARN de interferencia pequeño, guía los complejos de señalización inducidos por ARN activados para el mARN objetivo que comprende una secuencia complementaria para la hebra antisentido ARN de interferencia pequeño. El mARN dirigido y la hebra antisentido pueden formar una hélice en forma de A, y la ranura mayor de la hélice con forma de A puede ser reconocida por los complejos de señalización inducidos por ARN activado. El mARN objetivo puede ser disociado mediante complejos de señalización inducidos por ARN activado en un solo sitio definido por el sitio de enlace del extremo 5' de la hebra de ARN de interferencia pequeña ARN. Los complejos de señalización inducidos por ARN activados pueden ser reciclados para catalizar otros eventos de disociación.

Los vectores de expresión ARNi NtTS pueden comprender construcciones ARNi NtTS que codifican polinucleótidos ARNi NtTS que exhibe actividad de interferencia ARN, mediante la reducción del nivel de expresión de los mARNs NtTS, pre- mARNs NtTS, o variantes ARN NtTS, relacionados. Los vectores de expresión pueden comprender un promotor colocado en la corriente ascendente y enlazado en forma operable a la construcción ARNi NtTS, tal como se describe en forma adicional en la presente invención. Los vectores de expresión ARNi NtTS pueden comprender un promotor de centro mínimo adecuado, una construcción ARNi NtTS de interés, una región reguladora de corriente ascendente (5'), una región reguladora de corriente descendente (3') incluyendo las señales de poliadenilación y terminación y transcripción, y otras secuencias conocidas por los expertos en la técnica, tal como diversos marcadores de selección.

Los polinucleótidos NtTS pueden ser producidos en varias formas, incluyendo como estructuras de hebra doble (esto es, una molécula de ARN de hebra doble que comprende una hebra antisentido y una hebra de sentido complementaria), estructuras tipo horquilla de hebra doble ("dsARNi"), o estructuras de hebra simple (esto es, una molécula ssARN que comprende sólo una hebra antisentido). Las estructuras pueden comprender un dúplex, dúplex asimétrico, una estructura secundaria de horquilla u horquilla asimétrica que tiene hebras de sentido y antisentido autocomplementarias. Los dsARNi NtTS pueden ser convertidos en forma enzimática a siARNs NtTS de hebra doble. Una de las hebras del dúplex siARN NtTS pueden endurecerse hasta obtener una secuencia complementaria dentro del mARN NtTS objetivo y las variantes ARN NtTS relacionadas. Los dúplex siARN/mARN son reconocidos mediante RISC que disocian ARNs NtTS en múltiples sitios en una forma dependiente de la secuencia, dando como resultado la degradación de los mARN NtTS objetivo y las variantes ARN NtTS relacionadas.

Las moléculas de ARN de hebra doble pueden incluir moléculas de siARN ensambladas de un oligonucleótido simple en una estructura de horquilla, en donde las regiones de sentido y antisentido autocomplementarias de la molécula siARN están enlazadas por medio de un enlazador(s) a base de polinucleótido o sin polinucleótido, así como un ARN de hebra simple circular que tiene dos o más estructuras de lazo y un tronco que comprende hebras de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde el ARN circular puede procesarse ya sea in vivo o in vitro para generar una molécula de siARN activa con la capacidad de transmitir ARNi.

El uso de las moléculas de ARN de horquilla pequeñas (shARN) también está contemplado en la presente invención y comprenden una secuencia antisentido específica además de la secuencia de complemento inversa (sentido) normalmente separada por una secuencia espaciadora o de lazo. La disociación del espaciador o lazo proporciona una molécula de ARN de hebra simple y su complemento inverso, de modo que se puedan endurecer para formar una molécula de ARN de hebra doble (opcionalmente con pasos de procesamiento adicionales que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos del extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera o ambas hebras). La secuencia espaciadora normalmente es una secuencia de nucleótido no relacionada que está adaptada entre dos regiones de secuencia de nucleótido complementaria las cuales, cuando se endurecen en un polinucleótido de hebra doble, comprenden un shARN. La secuencia espaciadora generalmente comprende entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleótidos.

Cualquier polinucleótido ARN NtTS de interés puede ser producido seleccionando una composición de secuencia adecuada, tamaño de lazo, y longitud de tronco para producir el dúplex de horquilla NtTS. Un rango adecuado para designar longitudes de tronco de un dúplex de horquilla, incluyen longitudes de tronco de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos - tal como de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos, de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, de aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, de aproximadamente 200 a 300 nucleótidos, de aproximadamente 300 a 400 nucleótidos, de aproximadamente 400 a 500 nucleótidos, de aproximadamente 500 a 600 nucleótidos, y de aproximadamente 600 a 700 nucleótidos. Un rango adecuado para diseñar longitudes de lazo del dúplex de horquilla, incluyen longitudes de lazo de aproximadamente 4 a 25 nucleótidos, de aproximadamente 25 a 50 nucleótidos, o más largas si es substancial la longitud del tronco del dúplex de horquilla. En ciertas modalidades, una molécula de ARN de hebra doble ARN (dsARN) o de ARN de hebra simple (ssARN) tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de dsARN o ssARN de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de dsARN o ssARN de entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de dsARN o ssARN de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de dsARN o ssARN de entre aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades, las estructuras de horquilla con regiones dúplex más largas a 21 nucleótidos pueden promover la silenciación dirigida por siARN efectiva, sin importar la secuencia y longitud del lazo.

La secuencia de mARN objetivo normalmente tiene entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. La mARN objetivo, por consiguiente puede ser escaneada para regiones de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que cumplen preferentemente con uno o más de los siguientes criterios y una secuencia objetivo: una proporción A + T/G + C de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2; un dinucleótido AA o un dinucleótido CA en el extremo 5' de la secuencia objetivo; una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos únicos para el mARN objetivo (esto es, la secuencia no está presente en las otras secuencias mARN para la misma planta); y sin "corridas" de más de tres nucleótidos de guanina consecutivos (G) o más de tres nucleótidos de citocina consecutivos (C). Estos criterios pueden ser evaluados utilizando varias técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, programas de cómputo tales como BLAST pueden ser utilizados para buscar bases de datos públicamente disponibles para determinar si la secuencia objetivo seleccionada es única para el mARN. Alternativamente, se puede seleccionar una secuencia objetivo (y diseñarse una secuencia siARN) utilizando un software de computadora comercialmente disponible (por ejemplo, OligoEngine, Target Finder y the siARN Design Tool que están comercialmente disponibles.

En una modalidad, las secuencias mARN objetivo se seleccionan de manera que tengan entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, la secuencia objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 16 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, las secuencias objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que cumplan uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, las secuencias objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud que cumplan con uno o más de los criterios anteriores.

En una modalidad de ejemplo, las moléculas utilizadas para modular la expresión comprenden una secuencia específica (por ejemplo, secuencia antisentido) que es complementaria para al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de polinucleótido NtTS aquí descritas - tal como SEC ID NOs: 1 a 5 o 20.

En una modalidad de ejemplo adicional, las moléculas utilizadas para modular la expresión comprenden una secuencia (por ejemplo, una secuencia antisentido) que es complementaria para al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1 a 46 de la SEC ID NOs: 1, 2 y 3; los nucleótidos 1 a 52 de la SEC ID NO:20; los nucleótidos 99 a 141 de la SEC ID NO:1; los nucleótidos 102 a 144 de la SEC ID NO: 2 y SEC ID NO:3; los nucleótidos 102 a 153 de la SEC ID NO:20; los nucleótidos 1325 a 1362 de la SEC ID NOs: 1, 2 y 3; o los nucleótidos 1334 a 1371 de la SEC ID NO:20.

En una modalidad de ejemplo adicional, las moléculas utilizadas para modular la expresión comprenden una secuencia (por ejemplo, una secuencia antisentido) que es complementaria para al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos contiguos de los nucleótidos 454 a 805 de la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, o SEC ID NO:3 o los nucleótidos 463 a 814 de la SEC ID NO: 20.

La secuencia antisentido específica comprendida por la molécula siARN, puede ser idéntica o sustancialmente idéntica al complemento de la secuencia objetivo. En una modalidad, la secuencia antisentido específica comprendida por la molécula de siARN es al menos aproximadamente el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica al complemento de la secuencia mARN objetivo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia son conocidos en la técnica, y se pueden determinar, por ejemplo, utilizando el programa BLASTN del software de la Unlversity of Winconsin Computer Group (Grupo de Cómputo de la Universidad de Wisconsin) (GCG) o proporcionadas en el sitio web NCBI.

Las secuencias antisentido específicas de las moléculas siARN pueden presentar variabilidad difiriendo (por ejemplo, mediante sustitución de nucleótido, incluyendo transición o transversión) en uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos de la secuencia del mARN objetivo. Cuando dichas sustituciones de nucleótido están presentes en la hebra antisentido de una molécula de ARN de hebra doble, el nucleótido complementario en la hebra sentido, con el cual el nucleótido sustituto normalmente podría formar un emparejamiento base de enlace de hidrógeno, puede o no ser sustituido en forma correspondiente. Las moléculas de ARN de hebra doble en donde ocurren una o más sustituciones de núcleo en la secuencia de sentido, pero no en la hebra antisentido, también están contempladas. Cuando la secuencia antisentido de una molécula siARN comprende una o más desacoplamientos entre la secuencia de nucleótido del siARN y la secuencia de nucleótido objetivo, tal como se describe anteriormente, los desacoplamientos pueden encontrarse en el término 3', el término 5' o en la parte central de la secuencia de sentido.

En otra modalidad, las moléculas de siARN comprenden secuencias antisentido específicas que tienen la capacidad de hibridar selectivamente bajo condiciones estrictas a una parte del gen objetivo de existencia naturalo un gen mARN objetivo. Tal como lo saben los expertos en la técnica, se pueden lograr variaciones en la rigurosidad de las condiciones de hibridación alterando el tiempo, la temperatura o concentración de las soluciones utilizadas para los pasos de hibridación y lavado. Las condiciones adecuadas también pueden depender en parte de las secuencias de nucleótido particulares utilizadas, por ejemplo la secuencia del gen mARN objetivo.

Un método para inducir silenciación de ARN de hebra doble en plantas, es la transformación con una construcción de gen que produce ARN de horquilla (ver la Publicación de Smit et al. (2000) Nature, 407, 319-320). Dichas construcciones comprenden regiones invertidas de la secuencia de gen objetivo, separadas por un espaciador adecuado. La inserción de una región de intrón de la planta funcional como fragmento espaciador, incrementa adicionalmente la eficacia de la inducción de silenciación de gen, debido a la generación de un ARN de horquilla dividido (Wesley ef al. (2001) Plant J., 27, 581-590). En forma adecuada, la longitud del tronco tiene aproximadamente 50 nucleótidos hasta aproximadamente 1 kilobases de longitud. Los métodos para producir el ARN de horquilla dividido por intrón son bien descritos en la técnica (ver por ejemplo, la Publicación de Bioscience, Biotechnology, y Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617).

Las moléculas de ARNi que tienen una estructura de hebra dúplex o de hebra doble, por ejemplo, ARN o shARN de hebra doble, pueden tener extremos romos o pueden tener salientes 3' o 5'. Tal como aquí se utiliza, el término "saliente" se refiere al nucleótido o nucleótidos no emparejados que sobresalen de la estructura dúplex cuando un término 3' de la hebra de ARN se extiende más allá del término 5' de la otra hebra (saliente 3'), o viceversa (5' saliente). Los nucleótidos que comprenden la saliente ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos o versiones modificadas de los mismos. En una modalidad, al menos una hebra de la molécula de ARNi tiene una saliente 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, la saliente 3' tiene de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 nucleótidos, de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos y de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud .

Cuando la molécula de ARNi comprende una saliente 3' en un extremo de la molécula, el otro extremo puede ser un extremo romo o tener también una saliente (5' o 3'). Cuando la molécula de ARNi comprende una saliente en ambos extremos de la molécula, la longitud de las salientes pueden ser las mismas o diferentes. En una modalidad, la molécula de ARNi comprende salientes 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En una modalidad adicional, la molécula de ARNi es un ARN de hebra doble que tiene una saliente 3' de 2 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la saliente del ARNi son dinucleótidos TT o dinucleótidos UU.

Cuando se determina la identidad de porcentaje de la molécula ARNi que comprende una o más salientes con la secuencia de mARN objetivo, la saliente(s) puede o no tomarse en cuenta. Por ejemplo, los nucleótidos de una saliente 3' y hasta 2 nucleótidos del término 5' o 3' de la hebra doble pueden ser modificados sin pérdida significativa de actividad de la molécula de siARN.

Las moléculas de ARNi pueden comprender una o más estructuras de tapa 5' o 3'. La molécula de ARNi puede comprender una estructura de tapa en el extremo 3' de la hebra sentido, la hebra antisentido o las hebras tanto de sentido como antisentido; o en el extremo 5' de la hebra sentido, la hebra antisentido, o tanto la hebra de sentido como antisentido de la molécula de ARNi. Alternativamente, la molécula de ARNi puede comprender una estructura de tapa tanto del extremo 3' como el extremo 5' de la molécula de ARNi. El término "estructura de tapa" puede referirse a una modificación química incorporada en cualquier término de un oligonucleótido, que protege la molécula de la degradación de exonucleasa y también puede facilitar el suministro o localización dentro de una célula.

Otra modificación aplicable a las moléculas de ARNi es la ligadura química a la molécula de ARNi de una o más porciones o conjugados que incrementan la actividad, distribución celular, captación celular, biodisponibilidad o estabilidad de la molécula de ARNi. Los polinucleótidos pueden ser sintetizados o modificados a través de métodos bien establecidos en la técnica. Las modificaciones químicas pueden incluir pero no se limitan a modificaciones 2', introducción de las bases no naturales, adhesión covalente a un ligando, y reemplazo de las ligaduras de fosfato con ligaduras de tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de estructura dúplex se refuerza mediante al menos una y normalmente dos ligaduras químicas. La ligadura química puede lograrse a través de cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo, introduciendo enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilamiento o de van der Waals; por medio de coordinación de metal-ión, o a través del uso de análogos puros.

Aún en otra modalidad, los nucleótidos en una o ambas de las dos hebras simples pueden modificarse para reducir o inhibir la activación de las enzimas celulares tal como, por ejemplo sin limitación, ciertas nucleasas. Las técnicas para reducir o inhibir la activación de enzimas celulares son conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-fluoro, modificaciones 2'-alquilo, modificaciones de esqueleto no cargado, modificaciones de morfolino, modificaciones 2'-0-metilo y fosforamidato. Por lo tanto, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos o un ARN de hebra doble se reemplaza por un grupo químico. Asimismo, al menos un nucleótido puede ser modificado para formar un nucleótido bloqueado. Dicho nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el 2'-oxígeno de ribosa con el 4'- carbono de ribosa. La introducción del nucleótido bloqueado en un oligon ucleótido mejora la afinidad de las secuencias complementarias e incrementa la temperatura de fusión en varios grados.

Los ligandos pueden conjugarse por una molécula, ARNi, por ejemplo, para incrementar su absorción celular. En ciertas modalidades, un ligando hidrofóbico se conjuga a la molécula para facilitar la permeación directa de la membrana celular. En ciertos casos, la conjugación de un ligando para oligonucleótidos con frecuencia da como resultado resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de los ligandos catiónicos incluyen propilamonio y dimetilpropilamonio. Los oligonucleótidos antisentido pueden retener su alta afinidad de enlace al mARN, cuando el ligando catiónico se dispersa a través del oligonucleótido.

Las moléculas y nucleótidos aquí descritos pueden prepararse utilizando técnicas bien conocidas de síntesis de fase sólida. Se puede emplear en forma adicional o alternativa cualquiera de otros medios para dicha síntesis conocida en la técnica.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión NtTS que comprenden uno o más polinucleótidos NtTS o construcciones ARNi NtTS que comprenden uno o más polinucleótidos NtTS. Varias modalidades están dirigidas a vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos NtTS o una o más construcciones ARNi NtTS.

Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos NtTS o una o más construcciones ARNi NtTS que codifican uno o más polinucleótidos ARNi NtTS con la capacidad de autoendurecimiento para formar una estructura de horquilla, en donde la construcción comprende (a) uno o más polinucleótidos NtTS; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador que forma un lazo de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, colocada en la primera orientación a la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se enlaza en forma operable a la primera secuencia y a la tercera secuencia.

Las secuencias descritas pueden ser utilizadas para construir diversos polinucleótidos NtTS que no forman estructuras de horquilla. Por ejemplo, se puede formar un ARN de hebra doble NtTS mediante (1) transcribir una primera hebra del ADN NtTS, enlazando en forma operable a un primer promotor, y (2) transcribir la secuencia complementaria inversa de la primera hebra del fragmento de ADN NtTS mediante enlace en forma operable a un segundo promotor. Cada hebra del polinucleótido NtTS puede ser transcrita del mismo vector de expresión, o de diferentes vectores de expresión. El dúplex ARN NtTS que tiene la actividad de interferencia ARN, puede ser convertido en forma enzimática a siARNs para reducir los niveles ARN NtTS.

Por lo tanto, diversas modalidades se dirigen a vectores de expresión NtTS que comprenden un polinucleótido NtTS o una construcción ARNi NtTS que codifica polinucleótidos ARNi NtTS con la capacidad de autoendurecimiento, en donde la construcción comprende (a) uno o más polinucleótidos NtTS aquí descritos; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementaria inversa) de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia.

Se proporcionan varias composiciones y métodos para reducir los niveles de expresión endógena NtTS promoviendo la cosupresión de la expresión de gen NtTS. El fenómeno de cosupresión ocurre como resultado de introducir múltiples copias de un transgen en un huésped de célula de planta. La integración de múltiples copias de un transgen puede dar como resultado la expresión reducida del transgen y el gen endógeno dirigido. El grado de co-supresión depende del grado de identidad de secuencia entre el transgen y el gen endógeno objetivo. La silenciación tanto del gen endógeno como del transgen, puede ocurrir mediante metilación extensiva del lugar silenciado (esto es, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que pueden excluir la transcripción. Alternativamente, en algunos casos, la cosupresion del gen endógeno y el transgen puede ocurrir mediante silenciación de gen postranscripción ("PTGS"), en donde las transcripciones pueden ser producidas aunque los rangos incrementados de degradación excluyen la acumulación de transcripciones. El mecanismo para cosupresión mediante PTGS se considera que se asemeja a la interferencia de ARN, ya que ARN parece ser tanto un iniciador importante como un objetivo en estos procesos, y puede ser transmitido al menos en parte por la misma maquinaria molecular, posiblemente a través de la degradación guiada por ARN de los mARNs.

La cosupresión del ácido nucleico NtTS puede lograrse integrando múltiples copias del ácido nucleico NtTS o fragmentos de los mismos, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La planta huésped puede ser transformada con un vector de expresión que comprende un promotor enlazado en forma operable al ácido nucleico NtTS o fragmentos de los mismos. Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de NtTS que comprenden un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido NtTS.

Se dirigen varias modalidades a métodos para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) el nivel de expresión de ADN NtTS mediante la integración de múltiples copias de un polinucleótido NtTS en un genoma de planta (tabaco), que comprende: transformar un huésped de célula de planta con un vector de expresión que comprende un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido NtTS.

Se proporcionan varias composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión de gen endógeno de NtTS, reduciendo o inhibiendo la traducción de mARN NtTS. Una célula de planta huésped (tabaco) puede ser transformada con un vector de expresión que comprende: un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido NtTS, colocado en una orientación anti-sentido con respecto al promotor para permitir la expresión de los polinucleótidos de ARN que tienen una secuencia complementaria para una parte del mARN NtTS.

Varios vectores de expresión para reducir o inhibir la traducción de mARN NtTS pueden comprender: un promotor enlazado en forma operable a un polinucleótido NtTS en donde la secuencia se coloca en la orientación anti-sentido con respecto al promotor. La longitud de los polinucleótidos ARN NtTS anti-sentido puede variar, y puede ser de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos, aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 a 75 nucleótidos, aproximadamente 75 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, y de aproximadamente 200 a 300 nucleótidos.

Los métodos para obtener polinucleótidos NtTS mutantes y polipéptidos también son proporcionados. Cualquier planta de interés, incluyendo una célula de planta o material de planta puede ser modificada genéticamente a través de diversos métodos conocidos por inducir mutagénesis, incluyendo mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente, mutagénesis inducida por irradiación, mutagénesis que utiliza bases modificadas, mutagénesis que utiliza ADN dúplex espaciada, mutagénesis de rompimiento de hebra doble, mutagénesis que utiliza cepas huésped con deficiencia de reparación, mutagénesis mediante síntesis de gen total, revoltura de ADN y otros métodos equivalentes.

Alternativamente, los genes NtTS pueden ser dirigidos para desactivación mediante introducción de ribosimas derivadas de un número de ARNs circulares pequeños que tienen la capacidad de autodisociación y réplica en plantas. Estos ARNs pueden replicarse ya sea solos (ARNs viroide) o con un virus auxiliar (ARNs de satélite). Los ejemplos de ARNs adecuados incluyen los derivados de un viroide de aguacate con manchas y ARNs de satélite derivados de un virus de mancha anular del tabaco, virus de rayado temporal de alfalfa, virus de tabaco terciopelo moteado, virus solanum nodiflorum moteado y virus del trébol subterráneo moteado. Varios ribosomas específicos de ARN objetivo son conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, la expresión de polipéptido NtTS de treonina sintasa puede modularse a través de medios no transgénicos, tal como crear una mutación en un gen NtTS. Los métodos que introducen una mutación en forma aleatoria en una secuencia de gen pueden incluir mutagénesis química, mutagénesis EMS y mutagénesis de radiación. Los métodos que introducen una o más mutaciones dirigidas a una célula, incluyen pero no se limitan a tecnología de edición de genoma, particularmente mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc, labrado (dirección inducida por lesiones locales en los genomas), recombinación homóloga, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, y mutagénesis transmitida por meganucleasa.

Algunos ejemplos no limitantes de mutaciones son eliminaciones, inserciones, y mutaciones sin sentido de al menos un nucleótido, polimorfismos de nucleótidos simple (SNPs) y una repetición de secuencia simple. Después de la mutación, se puede llevar a cabo la clasificación para identificar eliminacines que crean codones de detención prematuros o genes NtTS de otra manera no funcionales. Después de la mutación, se puede llevar a cabo la clasificación para identificar mutaciones que crean genes NtTS funcionales que tienen la capacidad de ser expresados en niveles elevados. La clasificación de mutantes se puede llevar a cabo mediante secuenciación , o mediante el uso de sondas o cebadores específicos para gen o proteína. Las mutaciones específicas en polinucleótidos NtTS también pueden ser creadas de modo que den como resultado expresión de gen NtTS introducida o incrementada, estabilidad de mARN reducida o incrementada o estabilidad de proteína NtTS reducida o incrementada. Dichas plantas son referidas en la presente invención como plantas mutantes.

Las plantas mutantes pueden tener cualquier combinación de una o más mutaciones que dan como resultado niveles de polipéptido NtTS modulados. Por ejemplo, las plantas mutantes pueden tener una sola mutación en un solo gen NtTS; múltiples mutaciones en un solo gen NtTS; una sola mutación en dos o más o tres o más genes NtTS; o mutaciones múltiples en dos o más o tres o más genes. Por consiguiente, se describen las plantas mutantes que comprenden las variantes de polipéptido NtTS mutante.

En una modalidad, las semillas de plantas son mutagenizadas y posteriormente se crecen en plantas mutantes de primera generación. Las plantas de primera generación posteriormente se dejan autopolinizar y las semillas de las plantas de primera generación se crecen en plantas de segunda generación, las cuales posteriormente se clasifican para mutaciones en su lugar NtTS. Aunque el material de planta mutagenizada puede ser clasificado para mutaciones, una ventaja de clasificar las plantas de segunda generación, es que todas las mutaciones somáticas corresponden a las mutaciones de línea germinal. Un experto en la técnica podrá comprender que se pueden mutagenizar una variedad de materiales de planta, incluyendo pero sin limitarse a semillas, polen, tejidos de plantas, células de plantas, con el objeto de crear las plantas mutantes NtTS. Sin embargo, el tipo de material de planta mutagenizada puede verse afectado cuando el ácido nucleico de la planta se clasifica para mutaciones. Por ejemplo, cuando el polen se somete a mutagénesis antes de la polinización de una planta no mutagenizada, las semillas que resultan de dicha polinización se crecen en plantas de primera generación. Cada una de las plantas de primera generación contendrán mutaciones claras en el polen; por lo tanto estas plantas de primera generación pueden ser clasificadas para mutaciones NtTS en lugar de esperar hasta la segunda generación.

Se puede utilizar la mutagénesis que crea mutaciones de punta, eliminaciones cortas, inserciones, transversiones o transiciones, incluyendo mutagenes químicos o radiación, para crear mutaciones. Los mutagenes incluyen, pero no se limitan a, metanosulfonato de etilo (EMS), sulfonato de metilmetano (MMS), N-etil-N-nitrosurea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucilo, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalan, mostaza de nitrógeno, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2- aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida , bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano(DEO), diepoxibutano (BEB), y similares), diclorhidrato de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina y formaldehído. Las mutaciones espontáneas en el lugar NtTS que pueden no haber sido originadas directamente por el mutagen, también están contempladas siempre que den como resultado el fenotipo deseado. Los agentes mutagénicos adecuados incluyen, por ejemplo, radiación por ionización - tal como rayos X, rayos gamma, radiación de neutrones rápida y radiación UV. Cualquier método de preparación de ácido nucleico de planta conocido por los expertos en la técnica puede ser utilizado para preparar el ácido nucleico de planta para clasificación de mutación NtTS.

El ácido nucleico preparado de plantas individuales, células de plantas o material de planta, puede ser reunido opcionalmente con el objeto de agilizar la clasificación para mutaciones en el gen NtTS de la población de plantas que se originan del tejido, células o material de planta mutagenizado. Se pueden clasificar una o más generaciones de plantas subsecuentes, células de plantas o material de planta. El tamaño del grupo recolectado opcionalmente depende de la sensibilidad del método de clasificación utilizado.

Después de que se recolectan opcionalmente las muestras de ácido nucleico, pueden someterse a técnicas de amplificación específica de polinucleótido NtTS tal como, Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR). Cualquiera de los cebadores o sondas específicos para el gen NtTS o las secuencias inmediatamente adyacentes al gen NtTS pueden ser utilizadas para amplificar las secuencias NtTS dentro de la muestra de ácido nucleico recolectada en forma opcional. Preferentemente, el uno o más cebadores se diseñan para amplificar las regiones del locus NtTS en donde es más probable que surjan mutaciones útiles. Más preferentemente, el cebador se diseña para detectar mutaciones dentro de las regiones del polinucleótido NtTS. Adicionalmente, es preferible que el cebador(s) evite los sitios polimórficos conocidos con el objeto de facilitar la clasificación para mutaciones de punta. Para facilitar la detección de los productos de amplificación, el uno o más cebadores o sondas pueden ser etiquetados utilizando cualquier método etiquetado convencional. El cebador(s) o sondas pueden diseñarse con base en las secuencias NtTS aquí descritas utilizando métodos que son bien comprendidos en la técnica. Los polimorfismos pueden ser identificados por medios conocidos en la técnica.

En un aspecto adicional se proporciona un método para preparar una planta mutante. El método implica proporcionar al menos una célula de una planta que comprende un gen que codifica un polipéptido NtTS funcional. Posteriormente, la al menos una célula de la planta se trata bajo condiciones efectivas para modular la actividad del gen NtTS. La al menos una célula de planta mutante posteriormente se propaga en una planta mutante, en donde la planta mutante tiene un nivel modulado de polipéptido NtTS en comparación con el de la planta de control. En una modalidad de este método para elaborar una planta mutante, el paso de tratamiento implica someter la al menos una célula a un agente de mutagenización química tal como se describió anteriormente, y bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. En otra modalidad de este método, el paso de tratamiento implica someter la al menos una célula a una fuente de radiación bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. El término "planta mutante" incluye plantas mutantes en las cuales el genotipo se modifica en comparación con una planta de control, en forma adecuada por medio de otra modificación genética o diseño genético.

En ciertas modalidades, la planta mutante, la célula de planta mutante o el material de planta mutante pueden comprender una o más mutaciones que han ocurrido naturalmente en otra planta, célula de planta o material de planta y confieren un rasgo deseado. Esta mutación puede incorporarse, (por ejemplo, introgresarse) en otra planta, célula de planta o material de planta (por ejemplo, una planta, célula de planta o un material de planta con diferente antecedente genético al de la planta de la cual se derivó la mutación) para conferir el rasgo a la misma. Por lo tanto, a manera de ejemplo, una mutación de existencia naturalen una primera planta puede ser introducida en una segunda planta - tal como una segunda planta con un diferente antecedente genético al de la primera planta. Los expertos en la técnica tienen la capacidad por consiguiente de buscar e identificar una planta que lleve naturalmente en su genoma, uno o más alelos mutantes del gen de treonina sintasa que confiere un rasgo deseado. El alelo(s) mutante que tiene origen natural puede transferirse a la segunda planta a través de diversos métodos que incluyen cultivo, retrocruce e introgresión para producir una línea, variedades o híbridos que tienen una o más mutaciones en el gen de treonina sintasa. Las plantas que muestran un rasgo deseado puede clasificarse de un conjunto de plantas mutantes. En forma adecuada, la selección se lleva a cabo utilizando el conocimiento de las secuencias de nucleótido de treonina sintasa tal como aquí se describe. En consecuencia, es posible clasificar un rasgo genético que indica los cambios en la composición de éster de sucrosa en comparación con un control. Dicho material de clasificación puede implicar la aplicación de técnicas convencionales de amplificación y/o hibridación de ácido nucleico tal como aquí se describe. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para identificar una planta mutante que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido NtTS de una planta; y (b) determinar la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido NtTS , en donde la diferencia en la secuencia del polinucleótido NtTS en comparación con el polinucleótido NtTS de una planta de control, indica que la planta es una planta mutante de treonina sintasa. En otro aspecto se proporciona un método para identificar una planta mutante que tiene un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en comparación con una planta de control que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una planta que será clasificada; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtTS ; y (c) determinar la composición de los ésteres de sucrosa en la planta; en donde si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtTS que modula la expresión o la actividad de la proteína codificada, comparada con una planta de control y una parte de planta tiene un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en comparación con una planta de control en donde la expresión o la actividad de treonina sintasa no ha sido reducida, indica una planta mutante que tiene un cambio en la composición de los ésteres de sucrosa. En otro aspecto, se proporciona un método para preparar una planta mutante que tiene un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en comparación con una planta de control que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtTS que da como resultado un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en el mismo; y (c) transferir la una o más mutaciones en una segunda planta. La mutación(s) es transferida en la segunda planta utilizando varios métodos, que son conocidos en la técnica - tal como ingeniería genética, manipulación genética, introgresión, cultivo de plantas, retrocruces y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta de origen natural. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente antecedente genético con la primera planta. En otro aspecto se proporciona un método para preparar una planta mutante que tiene un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en comparación con una planta de control que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtTS que de como resultado un cambio en la composición de ésteres de sucrosa en la misma; y (c) introgresar la una o más mutaciones de la primera planta en la segunda planta. En una modalidad, el paso de introgresión comprende cultivo de planta, incluyendo opcionalmente retrocruce y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta de existencia natural. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente antecedente genético al de la primera planta. En una modalidad, la primera planta no es un cultivo o un cultivo élite. En una modalidad, la segunda planta es un cultivo o cultivo élite. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante (incluyendo una planta mutante de cultivo o cultivo élite) obtenido o que se puede obtener a través de métodos aquí descritos. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas únicamente en una región específica de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtTS . De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante será la sustancialmente a la misma planta antes de la mutagénesis .

En ciertas modalidades, la planta mutante puede tener una o más mutaciones localizadas en más de una región de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtTS - y en una o más regiones adicionales del genoma. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante no será la misma o no será sustancialmente la misma que la planta anterior a la mutagénesis. En ciertas modalidades, la planta mutante no tiene una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más exones del polinucleótido NtTS; o en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más intrones del polinucleótido NtTS ; en un promotor del polinucleótido NtTS ; en la región no traducida 3' del polinucleótido NtTS ; en la región no traducida de 5' del polín ucleótido NtTS ; en la región de codificación del polinucleótido NtTS ; o en la región sin codificación del polinucleótido NtTS ; o cualquier combinación de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más; o seis o más partes de la misma.

En una modalidad, para modular la expresión se utiliza una secuencia (por ejemplo, una secuencia complementaria) que tiene al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1 a 46 de las SEC ID NOs: 1, 2 y 3; los nucleótidos 1 a 52 de la SEC ID NO: 20; los nucleótidos 99 a 141 de la SEC ID NO:1; los nucleótidos 102 a 144 de la SEC ID NO: 2 y SEC ID NO:3; los nucleótidos 102 a 153 de la SEC ID NO:20; los nucleótidos 1325 a 1362 de la SEC ID NOs: 1, 2 y 3; o los nucleótidos 1334 a 1371 de la SEC ID NO:20.

En otra modalidad, se utiliza una secuencia (por ejemplo, una secuencia complementaria que tiene al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos contiguos de los nucleótidos 454 a 805 de la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, o SEC ID NO:3 o los nucleótidos 463 a 814 de la SEC ID NO:20 para modular la expresión. En un aspecto adicional se proporciona un método para identificar una planta, célula de planta o material de planta que comprende una mutación en un gen que codifica NtTS que comprende: (a) someter una planta, una célula de planta o material de planta a mutagénesis; (b) obtener una muestra de ácido nucleico de la planta, célula de planta o material de planta o descendientes de la misma; y (c) determinar la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica NtTS o una variante o fragmento del mismo, en donde una diferencia en la secuencia es indicativa de una o más mutaciones en la misma.

Las proteínas de dedo de zinc se pueden utilizar para modular la expresión o la actividad de treonina sintasa. En varias modalidades, la secuencia de ADN genómica que comprende parte o toda la secuencia de codificación de una secuencia de un polinucleótido NtTSse modifica mediante una mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. La secuencia de ADN genómica se busca para un sitio único para el enlace de proteína de dedo de zinc. Alternativamente, la secuencia de ADN genómica se busca para dos sitios únicos para el enlace de proteína de dedo de zinc, en donde ambos sitios están en hebras opuestas o casi juntas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares base de separación. Por consiguiente, se proporcionan las proteínas de dedo de zinc que enlazan a los polinucleótidos aquí descritos.

Una proteína de dedo de zinc puede ser diseñada para reconocer un sitio objetivo seleccionado en el gen NtTS de treonina sintasa. Una proteína de dedo de zinc puede comprender cualquier combinación de motivos derivados de dominios de enlace de ADN de dedo de zinc natural y dominios de enlace de ADN de dedo de zinc no naturales mediante truncado o expansión o un proceso de mutagénesis dirigido al sitio acoplado a un método seleccionado tal como, pero sin limitarse a, selección de despliegue de fago, selección de dos híbridos bacterianos o selección de un híbrido bacteriano. El término "dominio de enlace de ADN de dedo de zinc no natural" se refiere a un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc que enlaza a tres secuencias de pares base dentro del ADN objetivo y no ocurre en la célula u organismo que comprende el ADN para el cual se modifica. Los métodos para diseñar la proteína de dedo de zinc que enlaza a secuencias de nucleótido específicas que son únicas para el gen NtTSobjetivo, son conocidos en la técnica.

Una nucleasa de dedo de zinc puede construirse elaborando una fusión de un primer polinucleótido NtTSque codifica una proteína de dedo de zinc que enlaza a un polinucleótido, y un segundo polinucleótido NtTSque codifica para una endonucleasa no específica tal como, pero sin limitarse a la endonucleasa Tipo US. Una proteína de fusión dentro de una proteína de dedo de zinc y la nucleasa puede comprender un espaciador que consiste en dos pares base, o alternativamente, el espaciador puede consistir en tres, cuatro, cinco, seis o siete o más pares base. En varías modalidades, la nucleasa de dedo de zinc que introduce un rompimiento de hebra doble en una región regular, una región de codificación, o una región sin codificación de una secuencia de ADN genómica de un polinucleótido NtTSy conduce a una reducción del nivel de expresión de un polinucleótido, o una reducción en la actividad de la proteína codificada de esta forma. La disociación mediante nucleasa de dedo de zinc frecuentemente da como resultado la eliminación de ADN en el sitio de disociación después de la reparación de ADN mediante unión de extremo no homologa.

En otras modalidades, se puede seleccionar una proteína de dedo de zinc para enlazar a una secuencia reguladora de un polinucleótido NtTS de treonina sintasa. Más específicamente, la secuencia reguladora puede comprender un sitio de inicio de transcripción, un codón de inicio, un región de exón, un límite de un exón-intrón un terminador, o un codón de detención. Por consiguiente, la descripción proporciona una planta mutante, de existencia no natural o transgénica o células de planta, producidas mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc en los alrededores de o dentro de gen NtTS de treonina sintasa, y métodos para elaborar dicha planta o célula de planta mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. Los métodos para suministrar la proteína de dedo de zinc, la nucleasa de dedo de zinc para una planta, son similares a los descritos más adelante para suministrar la meganucleasa.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para producir plantas recombinantes, mutantes, de existencia no natural o transgénicas, o de otra forma genéticamente modificadas utilizando meganucleasas - tal como meganucleasa l-Crel. Las meganucleasas de origen NtTS natural, así como las meganucleasas recombinantes pueden ser utilizadas para originar en forma específica un rompimiento de hebra doble en un solo sitio o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una planta para interrumpir la interrupción de un polinucleótido NtTS Las meganuclease pueden ser una meganucleasa diseñada con propiedades de recubrimiento ADN alteradas. Las proteínas de meganucleasa pueden ser suministradas en células de plantas a través de una variedad de diferentes mecanismos conocidos en la técnica.

La descripción comprende el uso de meganucleasas para desactivar uno o más de los polinucleótidos aquí descritos en una célula de planta o una planta. Los aspectos también se refieren a un método para desactivar un polinucleótido NtTSen una planta utilizando meganucleasa que comprenderá) proporcionar una célula de planta que comprende uno o más polinucleótidos aquí descritos; (b) introducir una meganucleasa o una construcción que codifica una meganucleasa en una célula de planta; y (c) permitir que la meganucleasa desactive sustancialmente el polinucleótido.

Las meganucleasas pueden ser utilizadas para disociar sitios de reconocimiento de meganucleasa dentro de las regiones de codificación de un polinucleótido. Dicha disociación frecuentemente da como resultado la eliminación del ADN en el sitio de reconocimiento de meganucleasa después de la reparación de ADN mutagénico mediante unión de extremo no homologa. Dichas mutaciones en la secuencia de codificación de gen NtTSnormalmente son suficientes para desactivar el gen. El método para modificar una célula de planta implica, primero, el suministro de un cartucho de expresión de meganucleasa a una célula de planta utilizando un método de transformación adecuado. Para mayor eficiencia, es recomendable enlazar el cartucho de expresión de meganucleasa a un marcador seleccionable y seleccionar las células transformadas en forma exitosa en la presencia de un agente de selección. Este método dará como resultado la integración del cartucho de expresión de meganucleasa en el genoma, sin embargo, lo cual no puede ser deseable si la planta es probable que requiera la aprobación reguladora. En dichos casos, el cartucho de expresión de meganucleasa (y el gen NtTSmarcador seleccionable enlazado) pueden ser segregados fuera en generaciones de plantas subsecuentes utilizando técnicas de cultivo convencionales. Alternativamente, las células de plantas pueden ser transformadas inicialmente con un cartucho de expresión de meganucleasa que carece de un marcador seleccionable y puede crecerse en un medio que carece de un agente de selección. Bajo dichas condiciones, una fracción de las células tratadas adquirirá el cartucho de expresión de meganucleasa y expresará la meganucleasa diseñada temporalmente sin integrar el cartucho de expresión del meganucleasa en el genoma. Debido a que no se toma en cuenta la eficiencia de transformación, este ultimo procedimiento de transformación requiere que se clasifique un mayor número de células tratadas para obtener la modificación de genoma deseado. El método anterior también puede aplicarse para modificar una célula de planta que utiliza una proteína de dedo de zinc o nucleasa de dedo de zinc.

Después del suministro del cartucho de expresión de meganucleasa, se crecen células de planta, inicialmente, bajo condiciones que son típicas para el procedimiento de transformación particular que fue utilizado. Esto puede significar crecer células transformadas en un medio a temperaturas debajo de 26°C, frecuentemente en la oscuridad. Dichas condiciones estándar pueden ser utilizadas durante un período de tiempo, preferentemente 1 a 4 días, para permitir que la célula de la planta se recupere del proceso de transformación. En cualquier punto después de este período de recuperación inicial, la temperatura de crecimiento puede ser elevada para estimular la actividad de la meganucleasa diseñada para disociar y mutar el sitio de reconocimiento de meganucleasa.

Para ciertas aplicaciones, puede ser recomendable eliminar precisamente el polín ucleótido NtTS de I genoma de la planta. Dichas aplicaciones son posibles utilizando un par de meganucleasas diseñadas, cada una de las cuales disocia un sitio de reconocimiento de meganucleasa en cualquier lado de la eliminación proyectada.

Las plantas adecuadas para utilizarse en modificación genética incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y sistemas de células de plantas, incluyendo especies de una de las siguientes familias: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae , Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae o Vitaceae.

Las especies adecuadas pueden incluir miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberís, Beta, Bixa, Brassica, Caléndula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucúrbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Sécale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Unióla, Veratrum, Vinca, Vitis y Zea.

Las especies adecuadas pueden incluir especie Panicum, especie Sorghum, especie Miscanthus, especie Saccharum, especie Erianthus, especie Populus, Andropogon gerardii (big bluestem), Pennisetum purpureum (pasto de elefanta), Phalaris arundinacea (alpiste de caña), Cynodon dactylon (pasto de bermuda), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (pasto de praderas), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (carrizo), Sécale cereale (sorgo), especie Salix (sauce), especie Eucalyptus (eucalipto), Triticosecale, bambú, Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius — (cártamo), Jatropha curcas (jatrofa), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linaza), Brassica júncea, Beta vulgaris (remolacha), Manihot esculenta (cassaya), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (papa), Brassica olerácea (brócoli, coliflor, coles de Brusela), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cocoa), Coffea arábica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (pimienta picante y pimiento dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis meló (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucúrbita máxima (calabaza), Cucúrbita moschata (calabaza), Spinacea olerácea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (gombo), Solanum melongena (berenjena), especie Rosa (rosa), Dianthus caryophyllus (clavel), especie Petunia (petunia), Poinsettia pulcherrima (noche buena), Lupinus albus (altramus), Unióla paniculata (avena), bentgrass (especie Agrostis), Populus tremuloides (álamo), especie Pinus (pino), especie Abies (abeto), especie Acer (maple), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (prado bluegrass), especie Lolium (ryegrass) y Phleum pratense (fleo), Panicum virgatum (hierbas de mijo), Sorghum bicolor (sorgo, pasto del sudan), Miscanthus giganteus (miscanthus), especie Saccharum (caña energética), Populus balsamifera (álamo, Zea mays (maíz), Glycine max (frijol de soya), Brassica napus (cánola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Heliahthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha), o Pennisetum glaucum (mijo).

Varias de las modalidades están dirigidas a plantas mutantes, plantas de existencia no natural o plantas transgénicas modificadas para reducir los niveles de expresión del gen NtTS de treonina sintasa, para producir de esta forma plantas - tal como plantas de tabaco - en las cuales se reduce el nivel de expresión NtTS con los tejidos de planta de interés en comparación con una planta de control. Las composiciones y métodos descritos se pueden aplicar a cualquier especie del género Nicotiana, incluyendo N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, K326, Hicks Hoja ancha y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuate, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. marítima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctíflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbagini folia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbrática, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides y N. x sanderae.

Por consiguiente, la planta transgénica, de existencia no natural o mutante puede ser una variedad de tabaco o un cultivo de tabaco élite que comprende uno o más transgenes, o una o más mutaciones genéticas o combinaciones de las mismas. La mutación(s) genética (por ejemplo, uno o más polimorfismos) puede ser mutaciones que no existen naturalmente en la variedad de tabaco individual o en el cultivo de tabaco (por ejemplo, cultivo de tabaco) o pueden ser mutaciones genéticas que son de existencianatural siempre que la mutación no ocurra naturalmente en la variedad de tabaco individual o en el cultivo de tabaco (por ejemplo, cultivo de tabaco élite). Las variedades de Nicotiana tabacum particularmente útiles incluyen el tipo Burley, tipo obscuro, tipo curado al aire caliente y tipo Oriental. Los ejemplos no limitantes de variedades o cultivos son: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF91, DT 538 LC Galpao tobáceo, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf adole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291 , NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, 'Perique' tobáceo, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número number2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, P03, RG11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1 , Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Hoja ancha, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Ruso Rojo, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Las subvariedades convertidores de bajo nivel de las anteriores, incluso si no se identifican específicamente en la presente invención, también están contempladas.

Las modalidades también se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas híbridas, o plantas transgénicas, que han sido modificadas para reducir la expresión o actividad de treonina de sintasa lo cual da como resultado un incremento en la concentración de metionina libre en una o más partes (por ejemplo, las hojas) en comparación con una planta de control. En forma conveniente, las plantas mutantes, plantas de origen no natural, plantas híbridas, o plantas transgénicas, que son obtenidas son similares o substancialmente iguales en apariencia general a las plantas. Se pueden evaluar mediante observaciones de campo diversas características fenotípicas como grado de madurez, número de hojas por planta, altura de tallo, ángulo de inserción de hoja, tamaño de hoja (ancho y largo), distancia internado, y proporción de lámina-nervadura.

Un aspecto es una semilla de una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida, una planta transgénica, de la presente descripción. Preferentemente, la semilla es una semilla de tabaco. Un aspecto adicional de la presente descripción es polen o un óvulo de una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida, una planta transgénica, de la presente descripción. Además se proporciona una planta mutante, una planta de origen no natural, una planta híbrida, una planta transgénica, tal como aquí se describe la cual comprende además un ácido nucleico que confiere esterilidad masculina.

La descripción también proporciona un tejido de cultivo de células regenerables de la planta mutante, planta de origen no natural, planta híbrida, o planta transgénica, o una parte de la misma, en donde el cultivo regenera plantas con capacidad de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas del progenitor. Las células regenerables de la descripción incluyen pero no se limitan a células de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiles, raíces, puntas de raíz, anteras, flores y partes de las mismas, óvulos, brotes, tallos, varas, médula y cápsulas o callos o protoplastos derivados de los mismos.

En una modalidad, la altura del tallo de plantas mutantes, de origen no natural, o transgénicas son substancialmente igual a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. Por ejemplo, la altura del tallo de las plantas mutantes, de origen no natural, o transgénicas, no es menor a la altura del tallo de las plantas control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otra modalidad, la altura del tallo de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es aproximadamente el 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% mayor o menor a las plantas de control en de tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otra modalidad, el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente igual a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. Por ejemplo, el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de origen no natural, o transgénicas no es menor al contenido de clorofila de las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otra modalidad, el contenido de clorofila de las plantas mutante, de existencia no naturalo transgénicas es aproximadamente el 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% mayor o menor a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otra modalidad, la altura del tallo de las plantas del mutante, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente la misma a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche y el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente el mismo a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. Por ejemplo, la altura del tallo de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas no es mayor a la altura de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche y el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas no es menor al contenido de clorofila de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otra modalidad, la altura del tallo de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es aproximadamente el 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% mayor o menor a las plantas de control a los tres meses del transplante en campo o 36 días después del desmoche y el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es aproximadamente el 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% mayor o menor a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En otras modalidades, cualquiera de una o más de las siguientes características: grado de madurez, número de hojas por planta, altura de tallo, ángulo de inserción de la hoja, tamaño de la hoja (ancho, longitud), distancia internodo, proporción de lámina-nervadura, y coloración de las hojas de las plantas, mutantes, de origen no natural, o transgénicas es substancialmente igual a las plantas de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche.

En otro aspecto, se proporciona un método para incrementar la concentración de metionina libre en al menos una parte de una planta (por ejemplo, las hojas), en donde el método comprende los pasos de: (i) de reducir la expresión o actividad de treonina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la treonina sintasa comprende la secuencia de polinucleótido aquí descrita o la secuencia de polipéptido aquí descrita; (ii) medir la concentración de metionina libre en al menos una parte (por ejemplo, las hojas) de la planta muíante o de existencia no naturalo planta transgénica obtenida en el paso (i); y (iii) identifica una planta mutante, o de existencia no naturalo transgénica en donde la concentración de metionina libre en la misma ha incrementado en comparación con una planta de control. En forma adecuada la apariencia de una planta mutante, de existencia no naturalo transgénica es substancialmente igual a la planta de control a los tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche. En forma adecuada, la concentración de treonina libre en parte de la planta, - tal como las hojas - se incrementa en comparación con la planta de control.

La reducción en expresión de la treonina sintasa en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 99%, o menos, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95%, o menos, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 90% o menos, o una reducción de al menos el 10%, de al menos el 20%, de al menos el 25%, de al menos el 30%, de al menos el 40%, de al menos el 50%, de al menos el 60%, de al menos el 70%, de al menos el 75%, de al menos el 80%, de al menos el 90%, de al menos el 95%, de al menos el 98% o 100%, lo cual incluye una reducción en la actividad de transcripción y/o expresión de proteína. En una modalidad, la reducción en expresión de la treonina de sintasa es una reducción parcial en la expresión, la cual incluye una reducción en la actividad de transcripción y/o expresión de proteína. En una modalidad, la reducción parcial en la expresión permite a la planta mutante, de existencia no naturalo transgénica o célula de la planta, mantener niveles residuales de treonina de sintasa.

La reducción en la actividad de la treonina sintasa en comparación con la planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 99%, o menos, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 95%, o menos, de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 90% o menos, o una reducción de al menos el 10%, de al menos el 20%, de al menos el 25%, de al menos el 30%, de al menos el 40%, de al menos el 50%, de al menos el 60%, de al menos el 70%, de al menos el 75%, de al menos el 80%, de al menos el 90%, de al menos el 95%, de al menos el 98% o 100% o más. En una modalidad, la reducción en la actividad de la treonina de sintasa es una reducción parcial en la actividad. En una modalidad, la reducción parcial en la actividad permite a la planta mutante, de existencia no naturalo transgénica o célula de la planta, mantener niveles residuales de treonina de sintasa.

El incremento en la concentración de treonina libre en comparación con una planta de control puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o un incremento de al menos 10%, de al menos 20%, de al menos 25%, de al menos 30%, de al menos 40%, de al menos 50%, de al menos 60%, de al menos 70%, de al menos 75%, de al menos 80%, de al menos 90%, de al menos 95%, de al menos 98%, o hasta el 100%..

En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo, se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3 o SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 y SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3 y SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3 y SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3 o SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1 , SEC ID NO:3 y SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 y SEC ID NO:20 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 y SEC ID NO:3 o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce (por ejemplo se silencia o inhibe). En ciertas modalidades, la expresión de cada una de SEC ID NO:1, SEC ID NO:2, o SEC ID NO:3 o la actividad de cada una de las proteínas codificadas de esta forma, en forma individual, o en combinación, se reduce hasta un mayor grado que la expresión de SEC ID NO:20. En una modalidad, la adición de ingredientes exógenos - tal como aminoácidos - por ejemplo, treonina y/o isoleucina no se requiere con el objeto de obtener plantas de apariencia visual aceptable.

Un objeto es proporcionar plantas mutantes, plantas transgénicas, o plantas de existencia no naturalque exhiban un nivel incrementado de metionina libre, manteniendo al mismo tiempo substancialmente la misma apariencia visual y una o más características agrónomas en comparación con una planta de control. Por consiguiente, en la presente invención se describen plantas mutantes, plantas transgénicas, o plantas de existencia no naturalo células genéticamente modificadas que tienen un nivel incrementado de metionina libre y una actividad o expresión de treonina de sintasa reducida, en comparación con células de tabaco de control o plantas de control. Las plantas o células mutantes, transgénicas o de existencia no naturalhan sido modificadas para reducir la síntesis de treonina de sintasa reduciendo la expresión de uno o más polipéptidos que codifican las secuencias de polinucleótido aquí descritas, preferentemente codificadas a través de uno o más polinucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que codifica una treonina de sintasa y que tiene al menos el 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100% identidad de secuencia con la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 y/o SEC ID NO:3 o a través de uno o más polinucleótidos que comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6 o SEC ID NO:20.

Un aspecto adicional se refiere a plantas mutantes, plantas de origen no natural, o plantas transgénicas, en donde la expresión de treonina de sintasa o la actividad de proteína codificada de esta forma, se reduce y una parte de la planta (por ejemplo, las hojas) tienen un incremento en contenido de metionina de al menos 5% en comparación con una planta de control en la cual la expresión o la actividad de treonina de sintasa no ha sido reducida. Preferentemente, la concentración metional en el humo y aerosol de productos de tabaco se incrementa en al menos el 5% en comparación con el humo o aerosol del producto de tabaco elaborado de la planta de control .

El incremento en el contenido de metionina en comparación con la planta de control puede ser de al menos aproximadamente 5%, de al menos aproximadamente 10%, de al menos aproximadamente 20%, de al menos aproximadamente 25%, de al menos aproximadamente 30%, de al menos aproximadamente 40%, de al menos aproximadamente 50%, de al menos aproximadamente 60%, de al menos aproximadamente 70%, de al menos aproximadamente 75%, de al menos aproximadamente 80%, de al menos aproximadamente 90%, de al menos aproximadamente 95%, de al menos aproximadamente 96%, de al menos aproximadamente 97%, de al menos aproximadamente 98%, de al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% o más.

El incremento en la concentración metional en el humo o aerosol preparado del producto de tabaco en comparación con la planta de control puede ser de al menos aproximadamente 5%, de al menos aproximadamente 10%, de al menos aproximadamente 20%, de al menos aproximadamente 25%, de al menos aproximadamente 30%, de al menos aproximadamente 40%, de al menos aproximadamente 50%, de al menos aproximadamente 60%, de al menos aproximadamente 70%, de al menos aproximadamente 75%, de al menos aproximadamente 80%, de al menos aproximadamente 90%, de al menos aproximadamente 95%, de al menos aproximadamente 96% , de al menos aproximadamente 97%, de al menos aproximadamente 98%), de al menos aproximadamente 99%, o aproximadamente 100% o más.

En forma adecuada, la apariencia visual o una o más características agrónomas de la planta es substancialmente igual a la de la planta de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche, preferentemente, en donde la altura del tallo o plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente igual a la altura del tallo de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche y/o el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente igual al contenido de clorofila de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche.

En forma adecuada, la concentración de metionina libre en una parte de la planta (por ejemplo, las hojas) se incrementa en comparación con la planta de control.

En forma adecuada, (i) la concentración de metionina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 0.026 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.027 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.028 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.029 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.03 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.031 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.032 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.032 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.033 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.034 mg/g, (ii) la concentración de treonina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 0.5 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.52 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.54 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.56 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.58 mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 0.6 m . y (¡¡¡) 'a concentración metional en aerosol al momento de i calentar la parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de a I menos aproximadamente 2000 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 2100 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 2200 Mg/g. en forma adecuada de al menos aproximadamente 2500 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 2750 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 3000 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 3250 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 3500 Mg/g, en forma adecuada de al menos aproximadamente 3750 Mg/g. en forma adecuada de al menos aproximadamente 3800 pg/g, o mayor.

En forma adecuada (i) la concentración de metionina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 0.03 mg/g, (M) la concentración de treonina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es entre aproximadamente 0.5 mg/g hasta 0.65 mg/g; y (iii) la concentración metional en aerosol al momento del calentamiento de parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 2200 Mg/g.

En forma adecuada (i) la concentración de metionina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 0.03 mg/g, (ii) la concentración de treonina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es entre aproximadamente 0.5 mg/g hasta 0.65 mg/g; y (iii) la concentración metional en aerosol al momento del calentamiento de parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 2200 Mg/g y aproximadamente 4000 Mg/g, en forma adecuada de aproximadamente 2200 ig/g y aproximadamente 3850 [ig/g.

La planta puede calentarse a una temperatura de aproximadamente 100°C o superior - tal como de al menos 125°C, de al menos 150°C, de al menos 175°C o de al menos 200°C - para liberar el aerosol.

Aún en un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, una planta de origen no natural, o una planta transgénica, en donde la expresión de treonina de sintasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce e (i) la concentración de metionina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de aproximadamente 0.03 mg/g; (ii) la concentración de treonina libre en parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 0.7 mg/g; e (iii) la concentración metional en aerosol al momento del calentamiento parte de la planta (por ejemplo, las hojas) es de al menos aproximadamente 2000 Mg/g, y de una forma adecuada en donde la apariencia visual o una o más características agrónomas de la planta es substancialmente la misma a las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche, preferentemente, en donde la altura del tallo de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente igual a la altura del tallo de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche y/o el contenido de clorofila de las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas es substancialmente igual al contenido de clorofila de las plantas de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche.

De acuerdo con la descripción, una planta que lleva un alelo de treonina sintasa modificado se puede utilizar en un programa de cultivos de plantas para crear líneas, variedades e híbridos útiles. Un alelo modificado puede ser un alelo mutante. En particular, el alelo de treonina sintasa modificado se introgresa en las variedades comercialmente importantes, tal como se describió anteriormente. De esta forma, se proporcionan métodos para cultivar plantas, que comprenden el cruce de una planta mutante, una planta de origen no natural, o una planta transgénica tal como aquí se describe con una planta que comprende una identidad genética diferente. El método puede comprender además cruzar la planta de la progenie con otra planta, y repetir opcionalmente el cruce hasta que se obtenga una progenie con los rasgos genéticos o antecedentes genéticos deseables. Un propósito cumplido por dichos métodos de cultivo, es introducir un rasgo genético deseable en otras variedades, líneas de alimentación, híbridos o cultivos, particularmente aquellos que son de interés comercial. Otro propósito es facilitar el apilamiento de modificaciones genéticas de diferentes genes en una sola variedad de planta, líneas, híbridos o cultivos. Se contemplan las reproducciones intraespecíficas así como interespecíficas. Las plantas de progenia que surgen de dichos cruces, también referidos como líneas de reproducción, son ejemplos de plantas de existencia no naturalde la presente descripción.

En una modalidad, se proporciona un método para producir una planta de existencia no naturalque comprende: (a), el cruce de una planta mutante o transgénica con una segunda planta para reproducir una semilla de tabaco de progenia; (b) crecimiento de la semilla de tabaco de progenia, bajo condiciones del crecimiento de planta, para producir la planta de origen no natural. El método puede comprender además: (c) cruzar la generación previa de la planta de existencia no naturalcon si misma u otra planta para producir la semilla de tabaco de progenie; (d) crecer la semilla de tabaco de la progenie del paso (c) bajo condiciones de crecimiento de plantas, para producir plantas de existencia no naturaladicionales; y (e) repetir los pasos de cruce y crecimiento de (c) y (d) para generar generaciones adicionales de plantas de origen no natural. El método puede comprender opcionalmente antes del paso (a), un paso, para proporcionar una planta progenitora que comprende una identidad genética que está caracterizada y que no es idéntica a la planta mutante o transgénica. En algunas modalidades, dependiendo del programa de cultivo, los pasos de cruce y crecimiento se repiten de 0 a 2 veces, de 0 a 3 veces, de 0 a 4 veces, de 0 a 5 veces, de 0 a 6 veces, de 0 a 7 veces, de 0 a 8 veces, de 0 a 9 veces, de 0 a 10 veces, con el objeto de generar generaciones de plantas de origen no natural. El retrocruce es un ejemplo de dicho método en donde la progenie se cruza con uno de sus progenitores u otra planta genéticamente similar a su progenitor, con el objeto de obtener una planta de progenie en la siguiente generación que tiene una identidad genética que está más cercana a la de uno de los progenitores. Las técnicas para el cultivo de plantas particularmente, reproducción de una planta de tabaco, son conocidas y se pueden utilizar en métodos de la presente descripción. La descripción proporciona además plantas de existencia no naturalproducidas a través de estos métodos.

En algunas modalidades de los métodos aquí descritos, se evalúan en el campo las líneas que resultan de la reproducción y clasificación de genes de treonina sintasa variantes utilizando procedimientos de campo estándar. Los genotipos de control, incluyendo el progenitor no mutagenizado original están incluidos, y se distribuyen en las entradas en el campo en un diseño de bloque completamente aleatorizado u otro diseño de campo adecuado. Para tabaco, se utilizan prácticas agrónomas estándar, por ejemplo, la planta se recolecta, se pesa y se muestrea, para pruebas químicas, y otras pruebas comunes antes y durante la curación. Se llevan a acabo los análisis estadísticos de los datos para confirmar la solicitud de las líneas seleccionadas con la línea progenitora. Se llevan a cabo análisis citogenéticos de las plantas seleccionadas para confirmar las relaciones de complemento de cromosoma y emparejamiento de cromosoma.

Se pueden utilizar huellas de ADN, polimorfismo de nucleótido simple, marcadores microsatelitales, o tecnologías similares en un programa de reproducción de selección asistida por marcador (MAS) para transferir o reproducir alelos modificados o mutantes del gen de treonina sintasa en otros tabacos, tal como aquí se describe. Por ejemplo, un reproductor puede crear poblaciones de segregación de las hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo mutante con un genotipo agrónomamente deseable. Las plantas en el F2 o generaciones de retrocruce pueden ser clasificadas utilizando un marcador desarrollado de una secuencia genómica de treonina sintasa o fragmento de la misma, utilizando una de las técnicas aquí descritas. Las plantas identificadas como poseyendo el alelo mutante pueden ser retrocruzadas o auto-polinizadas para crear una segunda población que será clasificada. Dependiendo del patrón de herencia esperado o la tecnología MAS utilizada, puede ser necesario auto-polinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruce para ayudar a la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruce u otro procedimiento de reproducción pueden repetirse hasta que se recupera el fenotipo deseado del progenitor recurrente.

De acuerdo con la descripción, en un programa de reproducción, los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles. Las plantas F1 seleccionadas pueden ser cruzadas con uno de los progenitores, y las plantas de la primera generación de retrocruce son auto-polinizadas para producir una población que nuevamente es clasificada para expresión de gen de treonina sintasa variante (por ejemplo, la versión nula del gen de treonina sintasa). El proceso de retrocruce, auto-polinización, y clasificación se repite, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que la clasificación final produce una planta que es fértil y razonablemente similar al progenitor recurrente. Esta planta, si se desea, es auto-polinizada, y la progenie es subsecuentemente clasificada nuevamente para confirmar que la planta exhibe una expresión de gen de treonina sintasa. En algunas modalidades, se clasifica una población de plantas en la generación F2 para una expresión de gen de treonina sintasa variante, por ejemplo, se identifica una planta que falla en expresar treonina sintasa debido a la ausencia de un gen de treonina sintasa de acuerdo con los métodos estándar, por ejemplo, utilizando un método PCR con cebadores basados en la información de secuencia de nucleótido para la treonina sintasa aquí descrita.

Se pueden producir variedades híbridas evitando la auto-polinización de plantas progenitoras femeninas (esto es, progenitores de semillas), de una primera variedad, permitiendo que el polen de las plantas progenitoras masculinas de una segunda variedad fertilicen las plantas progenitoras femeninas, y permitiendo que las semillas híbridas F1 se formen en las plantas femeninas. La auto-polinización de las plantas femeninas puede evitarse, mutilando las flores de una etapa temprana del desarrollo de la flor. Alternativamente, se puede evitar la formación de polen en las plantas de progenitor femenino utilizando una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina puede producirse mediante esterilidad masculina citoplásmica (CMS), o esterilidad masculina transgénica en donde un transgen inhibe la microsporogénesis y/o formación de polen, o auto-incompatibilidad. Las plantas progenitoras femeninas que contienen CMS son particularmente útiles. En modalidades en las cuales las plantas progenitoras femeninas son CMS, se recolecta el polen de las plantas fértiles masculinas y se aplican manualmente a los estigmas de las plantas progenitoras femeninas CMS, y se recolecta la semilla F1 resultante.

Las variedades y líneas aquí descritas se pueden utilizar para formar híbridos F1 de un solo cruce. En dichas modalidades, las plantas de las variedades progenitoras pueden crecerse como poblaciones de unión substancialmente homogéneas para facilitar el cruce-polinización natural de las plantas de progenie masculina a plantas de progenie femenina. La semilla F1 formada en las plantas de progenie femenina se recolecta selectivamente a través de medios convencionales. También pueden crecer las dos variedades de plantas progenitoras en volumen y recolectar una combinación de semilla híbrida F1 formada en la planta femenina y la semilla formada en el progenitor masculino como resultado de la auto-polinización. Alternativamente, se llevan a cabo cruces de tres vías, en donde se utiliza un híbrido de un solo cruce, como el progenitor femenino y se cruza con un diferente progenitor masculino. Como otra alternativa, se pueden crear híbridos de doble cruce en donde la progenie F1 de dos cruces simples diferentes se cruza consigo misma.

Se puede clasificar una población de plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas o seleccionarse para los miembros de la población que tengan un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede clasificar una población de progenie de un solo evento de transformación para las plantas que tienen un nivel de expresión de polipéptido o polinucleótido NtTS deseado. Los métodos físicos y bioquímicos se pueden utilizar para identificar niveles de expresión. Éstos incluyen análisis Southern o amplificación PCR para detección de un polinucleótido; manchados Northern, protección S1 RNase, extensión de cebador, o amplificación RT-PCR para detectar transcripciones ARN; ensayos enzimáticos para detectar actividad de enzima o ribozima de los polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteína, manchados Western, inmunoprecipitación e inmunoensayos enlazados por enzimas para detectar polipéptidos. También se pueden utilizar otras técnicas tales como hibridación in situ, manchado de enzimas e inmunomanchado para detectar la presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.

Las células de planta mutante, de existencia no naturalo transgénicas y plantas se describen en la presente invención comprendiendo uno o más polinucleótidos recombinantes - tal como uno o más polinucleótidos NtTS aislados, o una o más construcciones de polinucleótido, uno o más RNAs de hebra-doble, uno o más conjugados o uno o más vectores/vectores de expresión.

En algunas modalidades, una planta en la cual se reduce la expresión de un polinucleótido NtTS puede tener un incremento en la concentración de metionina libre, especialmente en las hojas. La concentración de metionina libre puede incrementarse en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% o más en comparación con la concentración de metionina libre en una planta de control correspondiente, en donde no se ha reducido la expresión del polinucleótido NtTS.

En algunas modalidades, una planta en la cual se reduce la expresión de un polinucleótido NtTS puede tener una disminución en la concentración de treonina libre, especialmente en las hojas. La concentración de treonina libre puede disminuirse en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% o más en comparación con la concentración de treonina libre en una planta de control correspondiente, en donde no se ha reducido la expresión del polinucleótido NtTS. En una modalidad, la concentración de treonina libre puede ser disminuida por al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, u 80%, o más en comparación con la concentración de treonina libre en una planta de control correspondiente en donde aún no se ha reducido la expresión del polinucleótido NtTS.

La expresión de NtTS puede evaluarse utilizando métodos que incluyen, por ejemplo, RT-PCR, manchado Northern, protección RNase, extensiones de cebador, manchados Western, electroforesis de gel de proteína, inmunoprecipitación, inmunoensayos enlazados por enzima, ensayos de chip, y espectrometría de masa. Deberá quedar entendido que si se expresa un polipéptido bajo el control de un promotor de expresión amplia o preferencial de tejido, se puede evaluar la expresión en toda la planta o en un tejido seleccionado. Similarmente, si se expresa un polipéptido en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular en el desarrollo o al momento de la inducción, se puede evaluar la expresión selectivamente en un período de tiempo deseado.

Sin limitación, las plantas aquí descritas pueden ser modificadas para otros propósitos ya sea antes o después de que se ha modulado la expresión o actividad de la treonina de sintasa. Una o más de las siguientes modificaciones genéticas adicionales pueden estar presentes en las plantas mutantes, de existencia no naturalo transgénicas de la presente descripción. En una modalidad, uno o más genes que están implicados en la captación de metales pesados o en el transporte de metales pesados, se modifican dando como resultado plantas o partes de las plantas (tal como hojas) que tiene menor contenido de metales pesados que las plantas de control o partes de la misma, sin la modificación(es). Los ejemplos no limitantes incluyen genes que pertenecen a la familia de facilitadores de difusión de catión (CDF), la familia de Zrt-, proteínas tipo Irt (ZIP), la familia de intercambiadores de catión (CAX), la familia de transportadores de cobre (COPT), la familia de ATPases tipo P de metal pesado (HMAs, tal como se describe en la publicación de patente WO2009074325) , la familia de homólogos de proteínas de macrófago asociadas con resistencia natural (NRAMP), y la familia de transportadores de cartucho de enlace ATP (ABC), que participan en el transporte de metales pesados. El término metal pesado tal como aquí se utiliza incluye metales de transición. En otra modalidad, uno o más genes que están implicados en la conversión de intermediarios metabólicos nitrógenos, se modifica dando como resultado plantas o partes de plantas (tales como hojas) que cuando se calientan, producen niveles inferiores de al menos una nitrosamina específica de tabaco (por ejemplo, 4-(metilnitrosamino)-l -(3-piridil)-1 -butanona, N-nitrosonornicotina, N-nitrosoanatabina, y N-nitrosoanabasina) que las plantas de control o partes de las mismas. Los ejemplos no limitantes de genes que pueden ser modificados incluyen genes que codifican una demetilasa de nicotina; tal como CYP82E4, CYP82E5 y CYP82E10 que participa en la conversión de nicotina a nornicotina y se describen en las Publicaciones Internacionales WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 y PCT/US2011/021088.

Los ejemplos de otras modificaciones incluyen tolerancia a herbicida, por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Se han desarrollado plantas transgénicas resistentes a glifosato, transfiriendo el gen aroA (una sintetasa EPSP de glifosato de Salmonella typhimurium y Ecoli). Se han producido plantas resistentes a sulfonilurea transformando el gen ALS muíante (sintetasa de acetolactato) de Arabidopsis. Se ha transferido en plantas la proteína OB photosystem II de Amaranthus hybridus mutante, para producir plantas transgénicas resistentes a atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo incorporando el gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son resistentes a insectos. Las toxinas Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una forma efectiva para retardar el surgimiento de pestes resistentes a Bt, tal como se ilustró recientemente en brócoli, en donde los genes cryIAc y cryIC Bt piramidados controlaron las polillas lomo de diamante resistentes a proteína simple y retardaron significativamente la evolución de insectos resistentes. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son resistentes a patógenos (por ejemplo, virus, bacteria, hongos). Se han diseñado plantas que expresan el gen Xa21 (resistente a plaga bacteriana) con plantas que expresan tanto un gen de fusión Bt como un gen de quitinasa (resistencia a perforador de tallo amarillo y tolerancia a la vaina). Otra modificación de ejemplo da como resultado una capacidad reproductora alterada, tal como esterilidad masculina. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son tolerantes a tensión abiótica (por ejemplo, sequía, temperatura, salinidad), y se han producido plantas transgénicas tolerantes transfiriendo la enzima de fosfato de glicerol acilo de Arabidopsis; genes que codifican deshidrogenasa de manitol y deshidrogenasa de sorbitol que están implicados en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para utilizarse en humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar plantas con la capacidad de producir proteínas que carecen substancialmente de residuos de fucosa enlazados por -lack alpha-1,3, residuos enlazados por xilosa -beta-1,2, o ambos, en su N-glican. Otras modificaciones de ejemplo pueden dar como resultado plantas con proteínas de aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética incrementada, plantas con vida en anaquel prolongada, plantas con contenido de carbohidrato incrementado, plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides. También se contemplan plantas transgénicas en las cuales se ha modulado la expresión de S-adenosil-L-metionina (SAM) y/o cistationina gama-sintasa (CGS).

Uno o más de dichos rasgos pueden ser introgresados en las plantas de tabaco mutantes, de existencia no natural o transgénicas de la presente descripción de otros cultivos de tabaco o pueden ser transformadas directamente en las mismas. La ¡ntrogresión del rasgo(s) en las plantas mutantes, de existencia no natural o transgénicas de la presente descripción, se puede lograr a través de cualquier método de reproducción de plantas conocido en la técnica, por ejemplo, reproducción de linaje, retrocruce, reproducción de haploide duplicado y similares (ver, la Publicación de Wernsman, E. A, y Rufty, R. C. 1987. Capítulo Diecisiete. Tobacco. Páginas 669-698 En: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., Nueva York, N.Y página 761). Las técnicas a base de biología molecular descritas anteriormente, en particular RFLP y marcadores microsatélitales, se pueden utilizar en dichos retrocruces para identificar las progenies que tienen el más alto grado de identidad genética con el progenitor recurrente. Esto permite la aceleración de la producción de variedades que tiene al menos el 90%, preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos el 99% de identidad genética con el progenitor recurrente, aún más preferentemente genéticamente idénticas al progenitor recurrente, y que comprenden además el rasgo(s) introgresado del progenitor donador. Dicha determinación de identidad genética puede estar basada en marcadores moleculares conocidos en la técnica.

La última generación de retrocruce puede ser autosembrada para proporcionar una progenie de reproducción pura para el ácido(s) nucleico que está siendo transferido. Las plantas resultantes generalmente tienen esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas mutantes, de existencia no natural o transgénicas de la presente descripción, además del rasgo(s) transferido (por ejemplo, uno o más rasgos de gen simple). El protocolo de retrocruce exacto dependerá del rasgo que esté siendo alterado para determinar un protocolo de prueba adecuado. Aunque los métodos de retrocruce se simplifican cuando el rasgo está siendo transferido en un alelo dominante, también se puede transferir un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir una prueba de la progenie para determinar si el rasgo deseado ha sido transferido en forma exitosa.

Varias modalidades proporcionan plantas mutantes, plantas de existencia no natural o plantas transgénicas, así como biomasa en donde el nivel de expresión del polinucleótido NtTS se reduce para incrementar la concentración de metionina libre en las mismas - particularmente pero sin limitarse a las hojas.

Las partes de las plantas, particularmente, plantas de tabaco, y más particularmente la lámina y la nervadura de la hoja de las plantas de tabaco, se pueden incorporar en o utilizarse en diversos productos consumibles que incluyen pero no se limitan a materiales que forman aerosol, dispositivos que forman aerosol, artículos para fumar, artículos fumables, productos sin humo y productos de tabaco. Los ejemplos de materiales que forman aerosol, particularmente materiales que forman aerosol de nicotina incluyen pero no se limitan a composiciones de tabaco, tabacos, extracto de tabaco, tabaco de corte, rellenador de corte, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogenizado, tabaco reconstituido, y tabacos para pipa. Los artículos para fumar y los artículos fumables son tipos de dispositivos que forman aerosol, que incluyen dispositivos que forman aerosol de nicotina. Los ejemplos de artículos para fumar o artículos fumables incluyen pero no se limitan a cigarros, cigarrillos y puros. Los ejemplos de productos sin humo comprenden tabaco para masticar y tabaco en polvo. En ciertos dispositivos que forman aerosol, en lugar de combustión, se calienta una composición de tabaco u otro material que forma aerosol a través de uno o más elementos de calentamiento eléctrico para producir un aerosol. En otro tipo de dispositivo que forma aerosol calentado, se produce un aerosol a través de la transferencia de calor desde un elemento combustible o fuente de calor hasta un material que forma aerosol separado físicamente, que puede localizarse dentro, alrededor, en forma adyacente o en la corriente descendente de la fuente de calor. Los productos de tabaco sin humo y diversos materiales que forman aerosol que contienen tabaco, pueden contener tabaco en cualquier forma, incluyendo partículas secas, pizcas, gránulos, polvos, o una pasta, depositada en, mezclada en, rodeada por, o de otra forma combinada con otros ingredientes en cualquier formato, tales como hojuelas, películas, barras, espumas o gránulos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término 'humo' se utiliza para describir un tipo de aerosol que se produce mediante los artículos para fumar, tal como cigarros (por ejemplo, humo de cigarro), o mediante combustión de un material que forma aerosol.

En una modalidad, también se proporciona un material de planta curada que incluye hojas curadas o partes de la planta curadas de plantas de tabaco mutantes, transgénicas y de existencia no natural aquí descritas. Los procesos para curar hojas de tabaco verde son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen sin limitación, curado mediante aire, curado mediante fuego, curado al aire caliente y curado con sol. El proceso de curación de hoja de tabaco verde depende del tipo de tabaco recolectado. Por ejemplo, el tabaco curado de Virginia (brillante) normalmente es curado al aire caliente, y ciertas cepas obscuras normalmente son curadas al aire, y el tabaco para pipa, tabaco para masticar y tabaco en polvo, normalmente se curan con fuego.

En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen materiales que forman aerosol de nicotina o materiales que forman aerosol que contienen tabaco que comprenden hojas, preferentemente hojas curadas, elaboradas de hojas de plantas de tabaco mutantes, plantas de tabaco transgénicas, o plantas de tabaco de existencia no natural aquí descritas. Los productos de tabaco aquí descritos pueden ser un producto de tabaco combinado el cual puede comprender tabaco de una o más variedades de plantas de tabaco, incluyendo plantas de tabaco no modificadas.

El porcentaje de metionina libre en los materiales que forman aerosol o composiciones de tabaco de la presente descripción, es un valor de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, t, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% mayor, cuando se compara con materiales que forman aerosol o composiciones de tabaco derivadas de plantas de contraparte no mutantes, de existencia no natural o no transgénicas.

Las plantas mutantes, de existencia no natural o transgénicas pueden tener otros usos, por ejemplo, en la agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, de existencia no natural o transgénicas, aquí descritas se pueden utilizar para elaborar alimento para animal y productos alimenticios para humanos.

La descripción también proporciona métodos para producir semillas, en donde los métodos comprenden cultivar la planta mutante, la planta de existencia no natural, o la planta transgénica aquí descritas, y recolectar semillas de las plantas cultivadas. Las semillas de plantas aquí descritas pueden acondicionarse y embolsarse en material para empaque por medios conocidos en la técnica para formar un artículo de fabricación. El material de empaque tal como papel y trapo es bien conocido en la técnica. Un paquete de semillas puede tener una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta o inserto asegurado al material de empaque, una etiqueta impresa en el material de empaque, o una etiqueta insertada dentro del paquete que describe la naturaleza de las semillas ahí contenidas.

Un aspecto adicional se refiere a un método para producir metional, que comprende los pasos de: (a) proporcionar parte de una planta mutante, de existencia no natural, o transgénica; biomasa, semilla u hojas; o los materiales que forman aerosol tal como aquí se describe; y (b) proporcionar calor a las mismas.

Las composiciones, métodos y equipos para genotipificar plantas para la identificación, selección o cultivo están comprendidos en la descripción, y pueden comprender un medio para detectar la presencia de un polinucleótido NtTS en una muestra de polinucleótido. Por consiguiente, se describe una composición que comprende uno o más cebadores para amplificar en forma específica al menos una parte del polinucleótido NtTS y opcionalmente una o más sondas y opcionalmente una o más reactivos para llevar a cabo la amplificación o detección. Por consiguiente, se describen cebadores de oligonucleótidos específicos de gen o sondas que comprenden aproximadamente 10 o más polinucleótidos contiguos que corresponden al polinucleótido NtTS. Los cebadores o sondas que comprenden o consisten de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 o más polinucleótidos contiguos que hibridan (por ejemplo, hibridan específicamente) para el polinucleótido NtTS. En algunas modalidades los cebadores o sondas pueden comprender o consistir de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 40 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 30 nucleótidos contiguos o aproximadamente 15 a 30 nucleótidos contiguos que se pueden utilizar en métodos de identificación de gen que dependen de la secuencia (por ejemplo, hibridación Southerm) o aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago) o detección de gen (por ejemplo, como uno o más cebadores de amplificación en amplificación o detección de ácido nucleico). El uno o más cebadores o sondas específicos pueden diseñarse y utilizarse para amplificar o detectar una parte o todo del polinucleótido NtTS. A manera de ejemplo específico, se pueden utilizar dos cebadores en un protocolo de reacción de cadena de polimerasa para amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifica ácido nucleico NtTS - tal como ADN o ARN. La reacción de cadena de polimerasa también puede llevarse a cabo utilizando un cebador que se deriva de la secuencia de ácido nucleico NtTS y un segundo cebador que híbrida para una secuencia de corrientes ascendente o descendente de la secuencia de ácido nucleico NtTS - tal como una secuencia promotora NtTS, el extremo 3' del precursor mARN o una secuencia derivada de un vector. Los ejemplos de las técnicas térmicas e isotérmicas útiles para amplificación in vitro de los polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. La muestra puede ser derivada de una planta, una célula de planta o material de planta o de un producto de tabaco elaborado o derivado de la planta, la célula de la planta o el material de la planta, tal como aquí se describe.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, también se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtTS en una muestra que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se sospecha que comprende, un polinucleótido (b) contactar la muestra con uno o más cebadores o más sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido NtTS; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación es indicativa de la presencia del polinucleótido NtTS en la muestra. En un aspecto adicional, también se proporciona el uso de uno o más cebadores o sondas que detectan específicamente al menos una parte del polinucleótido NtTS. También se proporcionan equipos para detectar al menos una parte del polinucleótido NtTS, que comprenden uno de los cabadores o sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido NtTS. El equipo puede comprender reactivos para la amplificación del polinucleótido - tal como reacción de cadena de polimerasa (PCR) - o reactivos para tecnología de detección de hibridación de sonda de ácido nucleico - tal como Manchados Southern, Manchados Northern, hibridación in situ, o microformación. El equipo puede comprender reactivos para tecnología de detección de enlace de anticuerpo tal como Manchados Western, ELISAs, espectrometría de masa SEADI o tiras de prueba. El equipo puede comprender reactivos para secuenciación de ADN. El equipo puede comprender reactivos y/o instrucciones para determinar el contenido de metionina, treonina y/o metional. En algunas modalidades, un equipo puede comprender instrucciones para uno o más de los métodos descritos. Los equipos descritos pueden ser útiles para determinación de identidad genética, estudios filogenéticos, genotipificación, haplotipificación , análisis de linaje o reproducción de plantas particularmente con una calificación co-dominante.

La presente descripción también proporciona un método para genotipificar una planta, una célula de planta o material de planta que comprende un polinucleótido NtTS. La genotipificación proporciona un medio para distinguir homólogos de un par de cromosomas y se pueden utilizar para diferenciar segregadores en una población de plantas. Se pueden utilizar métodos de marcador molecular para estudios filogenéticos, caracterizar relaciones genéticas entre variedades de cosechas, identificar cruces o híbridos somáticos, localizar segmentos cromosomales que afectan rasgos monogénicos, clonación a base de mapa y el estudio de herencia cuantitativa. El método específico de genotipificación puede emplear cualquier número de técnicas analíticas de marcador molecular que incluyen polimorfismos de longitud de fragmento de amplificación (AFLPs). Los AFLPs son el producto de diferencias alélicas entre fragmentos de amplificación originados por variabilidad de secuencia de nucleótido. Por lo tanto, la presente descripción proporciona además un medio para seguir la segregación de un gen NtTS o un ácido nucleico así como las secuencias cromosomales genéticamente enlazadas a estos genes o ácidos nucleicos utilizando técnicas como análisis AFLP.

La correlación entre la metionina producida en plantas que resultan de la silenciación de treonina sintasa, y los compuestos químicos encontrados en tabaco curado, han sido monitoreados en hojas curadas utilizando espectrometría de masa. Los perfiles de espectrometría de masa de extractos de planta indican que la silenciación de treonina sintasa en plantas lleva cambios en las plantas ya que cuatro picos mostraron perfiles alterados en líneas silenciadas por treonina sintasa comparadas con extractos de plantas de control (ver figura 1).

Tres picos incrementan en abundancia, mientras que uno reduce en abundancia. Estos cambios en perfil se pueden utilizar para identificar plantas en las cuales los niveles de metional en aerosol probablemente incrementarán. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar material de tabaco que libera niveles elevados de metional en un aerosol al momento del calentamiento, en donde el método comprende los pasos de: (a) preparar una muestra de material de tabaco; (b) determinar el perfil de masa molecular de la muestra; y (c) comparar el perfil de masa molecular en uno o más de una proporción de masa:carga a la de la planta de control; en donde el cambio específico en la proporción de masa:carga en comparación con la planta de control, indica que los niveles de metional en el aerosol son elevados. De una forma adecuada, la masa molecular se mide mediante espectrometría de masa, preferentemente, espectrometría de masa de cromatografía líquida (LC-MS), espectrometría de masa de cromatografía de gas (GC-MS). En un aspecto adicional, se proporciona un material de tabaco identificado o identificable a través de este método.

La descripción se describe en forma adicional en los Ejemplos que se encuentran a continuación, los cuales se proporcionan para describir la presente invención, con más detalle. Estos ejemplos en los cuales se establece un modo preferido actualmente contemplado para llevar a cabo la presente invención, están proyectados para ilustrar y no limitar la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Identificación de treonina sintasa de tabaco El gen de treonina sintasa de tabaco se identifica utilizando las secuencias EST de tabaco encontradas en la Iniciativa de Genoma de Tabaco. Otro contig EST de tabaco (NCBI_45312-v2pep-fl) cercano a la treonina sintasa de tabaco, se ensambla de las secuencias EST NCBI. Esta secuencia de codificación tiene exactamente la misma longitud (1569pb) que la treonina sintasa de tabaco. Los datos utilizando chips Affymetrix de exón de microformación-ADN (sondas de secuencia de NtPMIal g193542e1 ) muestran que la treonina sintasa de tabaco se expresa igualmente en raíces, tricomas, hojas verdes y senescentes de N. tabacum. No se encontraron cambios importante en los niveles de expresión de gen entre la hoja de tabaco curado al aire caliente (K326, K399) y Burley (TN90, Bu64). Además, la tensión por frío y cadmio no afecta los niveles de expresión de treonina sintasa de tabaco, indicando de esta forma que esta treonina sintasa es muy probable que sea expresada constitutivamente en la hoja de tabaco.

Ejemplo 2: Sobreexpresión de cistationina gama-sintasa (CGS) Se introduce Arabidopsis thaliana CGS (MT01, Acceso TAIR AT3901120) bajo control de transcripción del promotor de virus de mosaico de coliflor 35S en tabaco Burley TN90 mediante Agrobacterium tumefasciens utilizando un procedimiento de disco de hoja clásico tal como se describe en la literatura. También se inserta el gen de selección de antibiótico de canamicina.

Ejemplo 3: Silenciación de expresión de treonina sintasa en plantas de tabaco Utilizando un fragmento de ADN de SEC ID NO:1, los cebadores se generaron para silenciar NtTS en tabaco utilizando un método de ARNi. Los cebadores utilizados son 5'-ctgaaatcgacagcgatgata-3' (SEC ID NO: 9) y 5'-caaccaatagctaacggagctt-3' (SEC ID NO: 10). La secuencia de ARNi correspondiente se amplifica a partir de cADN mediante reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) y posteriormente se insertan en el vector Gateway pB7GWIWG2(ll) a través de un vector de entrada, exactamente como lo describe el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para expresión constitutiva (el promotor de virus de mosaico de coliflor CaMV 35S) del transgen en todos los tejidos de la planta y el gen de canamicina para selección de antibiótico canamicina sobre placas de agar (100 mg/ml). La construcción se inserta posteriormente en el genoma del tabaco Burley TN90 mediante Agrobacterium tumefasciens utilizando un procedimiento de disco de hoja clásico. A partir de los callos, se regeneraron líneas individuales y se seleccionaron en canamicina. Las líneas TO de silenciación ARNi son monitoreadas mediante (i) RT-PCR y crecidas para producción de semillas en ADN genómico utilizando un cebador en el promotor 35S (5'-gagcatcgtggaaaaagaagac-3') y un cebador dentro del fragmento utilizado para silenciación (5'-aagctccgttagctattggttg -3') y mediante (ii) RT-PCR utilizando cebadores específicos que flanquean en inserto utilizado para silenciación (5'-ttgattcacgtgtcggtaagac-3') y crecido para producción de semillas. Las semillas T1 se recolectan, se vuelven a crecer sobre agar que contiene canamicina y se monitorean exactamente como plántulas TO. PCR en el gADN genómico muestra que el fragmento de ADN NtTS se inserta en el genoma y silencia efectivamente la treonina sintasa de tabaco.

Ejemplo 4: Cultivo de plantas de tabaco silenciadas mediante treonina sintasa Las plantas resistentes a canamicina se muestran en charolas flotantes antes del cultivo en el campo (Kentucky, EUA). Se cultivaron en cuatro réplicas de 20 plantas, veinte plantas de la línea de treonina sintasa silenciada (línea NtTS-ARNi; ejemplo 2), línea de cistationina gama-sintasa (Ejemplo 3), un control de vector (VC, pB7GWI WG2(II)) y un tabaco de antecedente TN90 US. Tres meses después del transplante en campo (36 días después del desmoche), se muestrea una hoja en la posición media del tallo en 10 plantas idénticas de las 20 para cada réplica. Las hojas ("hojas verdes") se almacenan inmediatamente en hielo seco y se liofilizan. Se seleccionaron diez plantas de las mejores dos líneas y posteriormente se curaron de acuerdo a las prácticas agrícolas de Burley. Después de curarse, se muestrearon tres hojas en la posición media del tallo. Para monitorear el efecto de silenciación, en las líneas de treonina sintasa silenciadas y para compararlas con las líneas de cistationina gama-sintasa, las "hojas verdes" de tres líneas se plantaron y sometieron a análisis de aminoácido libre.

Ejemplo 5: Análisis de Metional La correlación entre la metionina producida en hojas verdes, que resulta de la silenciación de treonina sintasa, y los compuestos químicos encontrados en tabaco curado se monitorean en hojas curadas utilizando LC-MS utilizando las líneas descritas anteriormente. La extracción se lleva acabo en metanol. El equipo utilizado es un sistema Waters Acquity UPLC acoplado a MS. La columna es una WatersXBridge Shield RP18 que utiliza una fase móvil A de agua:acetonitrilo (95:5 v/v) y una fase móvil B de metanol. Los perfiles LC-MS indican que la treonina de silenciación en hojas verdes conduce hacia una señal química en hojas curadas. De hecho, cuatro picos mostraron perfiles alterados en líneas silenciadas por treonina sintasa en comparación con controles (ver figura 1). Tres picos incrementan claramente en abundancia, mientras que uno tiene reducción. Esto sugiere que la metionina que se acumula en hojas verdes se convierte ya sea a degradación de productos de azufre o derivados de metionina en hojas curadas.

Ya que la metionina es un precursor de metional posible, analizamos el contenido de metional en el aerosol formado después de calentar el tabaco curado (réplicas presentadas seleccionadas de TN90, VC, NtTS-1, NtTS-1 y NtTS-3) y se sometieron a una trampa de frío. La plataforma de fumar utilizada es un simulador de fumar con una fuente de calentamiento tipo Macor (54W) que incluye un régimen de 12 Puff de 2S. Antes de fumar, se cortó la lámina curada de tabaco y se impregnó con 20% de glicerina. Los aerosoles producidos mediante calentamiento de tabacos curados impregnados (100mg, 3 réplicas completas) se condensaron utilizando un sistema criogénico desarrollado por Air Liquid y disuelto en diclorometano (2 veces 5 mL). Las hojas de metional en soluciones de aerosol se determinaron mediante GC-MS y después de la derivación. El ión que produce la señal más abundante se utilizó para adquirir datos cuantitativos en el modo de Monitoreo de Ión Simple (SIM).

La correlación entre metionina producida en hojas verdes, que resulta de la silenciación de treonina sintasa, y los compuestos químicos encontrados en tabaco curado ha sido monitoreada en hojas curadas utilizando LC-MS utilizando las líneas de réplica descritas anteriormente. La extracción se llevó a cabo en metanol. El equipo utilizado es un sistema Waters Acquity UPLC acoplado a MS. La columna fue WatersXBridge Shield RP18 que utiliza una fase móvil A agua:acetonitrilo (95:5 v/v) y una fase móvil B de metanol. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

Tal como se muestra en la Tabla 1, las plantas NtTS-ARNi no mostraron diferencias visuales algunas de las plantas de control. Por ejemplo, la altura de la planta y el contenido de clorofila en las plantas de tabaco silenciada de treonina sintasa casi fue idéntico a las plantas de control. La concentración de metionina libre en hojas verdes de las plantas de tabaco silenciadas por treonina sintasa fue mayor que en las plantas de control. La concentración metional en aerosol fue mucho mayor en las plantas de tabaco silenciadas por treonina sintasa que en las plantas de control. El contenido de treonina de hojas verdes presentó una reducción de más del 20% en las plantas de tabaco silenciadas por treonina sintasa en comparación con las plantas de control.

Ejemplo 6: Análisis de la expresión de treonina sintasa en líneas de tabaco NtTS-ARNi Las SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 20 se alinean en un consenso de 1587 bases desde el codón de inicio hasta el codón de detención. Las regiones de fragmento que son homólogas entre las SEC ID NOs: 1, 2 y 3 y diferentes de SEC ID NO:20 son los nucleótidos de 1 a 46 de SEC ID NOs: 1, 2 y 3 y los nucleótidos de 1 a 52 de SEC ID NO:20; los nucleótidos de 99 a 141 de SEC ID NO:1, los nucleótidos de 102 a 144 de SEC ID NO: 2 y SEC ID NO:3 y los nucleótidos de 102 a 153 de SEC ID NO:20; y los nucleótidos de 1325 a 1362 de SEC ID Nos: 1 , 2 y 3 y los nucleótidos de 1334 a 1371 de SEC ID NO:20. Estas secuencias se utilizan para designar cebadores específicos para SEC ID NOs: 1,2, 3. También se diseñó un conjunto de cebadores específicos para SEC ID NO: 20.

Las líneas de NtTS-ARNi se preparan utilizando regiones que corresponden a los nucleótidos 454 a 805 de SEC ID NO:1; los nucleótidos de 454 a 805 de SEC ID NO: 2: los nucleótidos de 456 a 805 de SEC ID NO:3 y los nucleótidos de 463 a 814 de SEC ID NO:20. 3 plantas individuales de 3 líneas NtTS-ARNi independientes (NtTS1, NtTS2 y NtTS3), que expresan positivamente el transgen(es) para silenciación ARNi (probada mediante PCR para la presencia del promotor 35S en gADN) se sometieron a RT-PCR semi-cuantitativo utilizando los cebadores específicos para las SEC ID NOs: 1, 2 y 3 y cebadores específicos para la SEC ID NO: 20. Se utilizó tubulina como un control para la expresión de genes de mantenimiento. Se utilizaron 3 plantas Burley TN90 como un control para la expresión de las transcripciones relacionadas con la SEC ID NOS: 1 , 2, 3 y 20.

Utilizando los cebadores específicos para la SEC ID NOS: 1, 2 y 3, o cebadores específicos para la SEC ID NO: 3 únicamente, o cebadores específicos para la SEC ID NOS: 1 y 2 únicamente en RT-PCR semi-cuantitativo se indica que una parte que silencia en la expresión de treonina sintasa ha ocurrido en cada una de las 3 líneas de NtTS-ARNi independientes en comparación con el control. Utilizando los cebadores específicos para SEC ID NO: 20 se indica que la silenciación parcial en las plantas NtTS-ARNi ha ocurrido y que el nivel de silenciación es menor que el logrado para SEC ID NOS: 1-3. Se observó la silenciación como más efectiva para la SEC ID NO:3 que para SEC ID NO:20, aunque el % de identidad de secuencia entre las secuencias es idéntico.

Cualquier publicación mencionada o aquí descrita proporciona información relevante descrita antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Las manifestaciones en la presente descripción no serán construidas como una admisión de que los inventores no están titulados para anteceder las descripciones. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior están incorporadas como referencia a la presente invención. Los expertos en la técnica podrán apreciar diversas modificaciones y variaciones, sin apartarse del alcance y esencia de la invención. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con las modalidades preferidas específicas, deberá quedar entendido que la invención tal como se reivindica, no estará limitada indebidamente a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención los cuales son obvios para los expertos en la técnica de biología celular, molecular y de plantas o campos relacionados, están proyectadas para estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

TABLA 1 SECUENCIAS SEC ID NO:1 ( S ecu e n ci a d e A D N d e tre o n i n a s i ntasa d e N. tab acum) atggcggcttctttcatgctcagatcttctttcctctctcctccttgttcccaactccatcaccaatccccttccaa atctaatcacattattcacttcattaatccaatcaaagccaccgcctctacaaatgaogcaattgtccctccccaaa 5 agcaccgccgccccgccgacgaaaacatccgcgaagaggcggcgcgccgccgcacctcctcccacaatttctccgcc aggtacgttcctttcaatgccgatcccagctccgacgaatggtattctctcgatgaaattatataccggagccgctc cggtggattacttgatgttcagcatgatatggacgctctgaagaaatttgatggccagtattggcggtcactgtttg attcacgtgtcggtaagaccacgtggccgtacggttcaggcgtttggtctaaaaaggaatgggtcctacctgaaatc gacagcgatgatattgttagtgcttttgaaggaaactctaatctgttttgggctgagcgttttggcaaacagtttct aggcatgagtgacttatgggtaaaacactgtggaatcagccatacgggtagttttaaggatctgggtatgaccgttt tggtgagtcaagtgaaccggttaaggaaaatgcataaaccagttgtaggtgtgggctgtgcttccactggtgacacg tcagctgcattgtcagcttactgtgcatctgcggggattccatccattgtatttttaccagcaaataagatatctat ggcgcagctggtacaaccaatagctaacggagcttttgtgttgagtattgacaccgattttgatggttgtatgcagt ?0 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MAASFMLRSSFLSPPSPQLHHQSPSKSNHTIHFINPIKATASTNDAIIPPQKHRRPADENIREEAARRPTSSHNFSA RYVPFNADPSSDEWYSLDEIIYRSRSGGLLDVQHDMDALKKFDGQYWRSLFDSRVGKTTWPYGSGVWSKKEWVLPEI DSDDIVSAFEGNSNLFWAERFGKQFLGMSDLWVKHCGISHTGSF DLGMTVLVSQVNRLRKMHKPWGVGCASTGDT SAALSAYCASAGIPSIVFLPANKISMAQLVQPIANGAFVLSIDTDFDGCMQLIREV AELPIYLANSLNSLRLEGQ TAAIEILQQFDWQVPDWVIVPGGNLGNIYAFYKGFMMCKELGLVDRIPRLVCAQAANANPLYLHYKSGWKDFQPVKA NTTFASAIQIGDPVSID^VFAL NCDGIVEELATEEELMDAMAQADSTGMFICPHTGVALTALFKLRNSGVIGPNDK TVWSTAHGLKFTQS IDYHSKEIKDMECRFANPPVEVKADFGSVMDVLKKYLLSKNAKH SEC ID NO:8 (Secuencia traducida de SEC ID NO:3) MAASFMLRSSFLSPPSPQLHHQSPPKSNPTIHFINPIKATASTNDAIIPPQKHRRPADENIREEAARRPTSSHNFSA RYVPFNADPSSDEWYSLDEIIYRSRSGGLLDVQHDMDALKKFDGQY RSLFDSRVGKTTWPYGSGVWS KEWVLPEI DSDDIVSAFEGNSNLFAERFGKQFLGMSDLWVKHCGISHTGSFKDLGMTVLVSQVNRLRKMHKPWGVGCASTGDT SAALSAYCASAGIPSIVFLPANKISMAQLVQPIANGAFVLSIDTDFDGCMQLIREVTAELPIYLANSLNSLRLEGQK TAAIEILQQFDWQVPD VIVPGGNLGNIYAFYKGFMMCKELGLVDRIPRLVCAQAANANPLYLHYKSGWKDFQPVKA 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gtgacacgtcagctgcattgtcagcttactgtgcatctgcggggattccatcgattgtatttttacctgcaaataag atatctatggcgcagctggtacaaccgatagctaacggagctt SEC ID NO:20 (Secuencia de ADN de treonina de sintasa adicional de N. tabacum) atggcggcttcttcaacttgcatg tcagatcctctttcttctctcccoatctccotccaaagcaacaatcccctgctaa atccaacggcgttcagttcttcactcctatcaaagccacagcttcttctacagatgatgcaatctccgcatctacacaac ctcaaaaacaccgecgccctgctgatgagaacatccgtgaggaagcccgccgccacatctcttcccacaatttctctgcc aggtatgtgcctttcaatgccgaccctaactccagtgagtggtattctctcgacgagatcatttaccgcagccgctccgg tggtctacttgatgtccagcatgatatggacgctct aagaagtttgatggccagtactggcgc ccctgtttgattccc gggtgggcaagaccacttggccttatggttctgg gtttggtccaagaaggaatgggtcctacctgaaactgacagcgat gatattg cagtgcttttgaaggaaattccaatcttttttgggctgagcgtttcggcaaacagttccttggcatgagtga tttgtgggtcaaacattg ggaatcagccacactggtagctttaaggatctcggeatgactg aetggtgagteaagtaa atcggtcgcggaaaacgcataaaccag cgtgggtgccggctgtgcctccaccggagacacgccagctgcactgtcggct tactgcgeatctgeaggcatcccatcaattgtattcttaectgcaaataagatttctatggcgcaactggtccaaccaat agccaatggggcttttgtgttgagtcttgacactgattttgatggatgcatgcagttgattcgcgaagccacagctgagt tgcccatttacttggcaaattecttgaatagtttgaggctagaagggcaaaagacggcagctatagagattctgcagcag tttgactgggaagrttcctgactgggtgataattcctggtggaaacctgggcaatatatatgcattttataaaggttctca aatgtgcaaggagccgggacttgtgatcgtatcccgagacttgtttgtgctcaagcagceaatgcaaatccgctttact tgcattataaatctggttggaaagaattcaaatctgtcaaggcaaatacaacactcgcacccgctatacsgattggcgac cctgtatctategatagggetg ttatgcactgaagaactccaacgggatagtggaggaggcaactgaggaagagttgat ggatgcgatggctcaggcagattcaactgggatgttcatatgcccccacactggcgtggcattgacagcactatccaagc tgagaaagacggggg tattaggccaaetgataggaccgfcggttgtgagtacagctcatgggttgaag ttactcaatcc aaggctgattatcattcaaaagaaataaagaacacggaatgccggtttgctaatccaccaggcaggtgaaagcagactt tggateagtcatggatgttcteaagaaatacetgttgagcaaaaattcaagctctaa SEC ID NO:21 (Secuencia de traducción de SEC ID NO:21) KAASST(_MFRSSFFSPNLHPKQQSPA1CSNCTQPFTPIK^ KVDYHSKBI KMECKFiWPPVQVK^

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de planta mutante, de existencia no natural o transgénica que comprende: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o al menos el 87% de identidad de secuencia para la SEC ID NO: 4, SEC ID NO:5; (ii) un polipéptido codificado por uno de los polinucleótidos establecidos en (i); o (iii) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO:6, SEC ID NO:7 o SEC ID NO:8; o (¡v) una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido establecido en (i).

2. Una planta mutante, de existencia no natural o transgénica que comprende la célula de planta, de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un método para incrementar la concentración de metionina libre en al menos parte de una planta, preferentemente una planta de tabaco, en donde el método comprende los pasos de: (a) reducir la expresión o actividad de la treonina sintasa en la planta, preferentemente, en donde la treonina sintasa comprende (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o al menos el 87% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 4, SEC ID NO:5; (ii) un polipéptido codificado por uno de los polinucleótidos establecidos en (i); o (iii) un polipéptido que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con SEC ID NO:6, SEC ID NO:7 o SEC ID NO:8; (b) medir la concentración de metionina libre en al menos parte de la planta mutante, de existencia no natural o transgénica obtenida en el paso (i); y (c) identificar la planta mutante, de existencia no natural o transgénica en donde la concentración de metionina libre es la misma incrementada en comparación con una planta de control en donde la expresión o actividad de treonina sintasa no ha sido reducida y en donde la apariencia visual de la planta mutante, de existencia no natural o transgénica es substancialmente igual a la de la planta de control tres meses después del transplante o 36 días después del desmoche.

4. Una planta o material de planta mutante, de existencia no natural o transgénica, preferentemente, una planta de tabaco, o material de planta, derivado o derivable de la misma obtenida o se puede obtener a través del método de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una planta mutante, de existencia no natural o transgénica, preferentemente una planta de tabaco, en donde la expresión de treonina sintasa o la actividad de la proteína codificada de esta forma se reduce y una parte de la planta tiene un incremento en el contenido de metionina de al menos el 5% en comparación con una planta de tabaco de control, en donde la expresión o la actividad de treonina sintasa no ha sido reducida y en donde la concentración metional en aerosol se incrementa en al menos el 5% en comparación con el aerosol de la planta de control, preferentemente, en donde la apariencia visual de la planta es substancialmente igual a la de la planta de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche, preferentemente, en donde la altura del tallo de las plantas mutantes, de existencia no natural o transgénicas es substancialmente igual a la altura del tallo de la planta de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche y/o el contenido de clorofila de la planta mutante, de existencia no natural o transgénica es substancialmente igual al contenido de clorofila de la planta de control tres meses después del transplante en campo o 36 días después del desmoche.

6. Una planta mutante, de existencia no natural o transgénica tal como se describe en la reivindicación 5, en donde la concentración de treonina libre en parte de la planta se incrementa en comparación con la planta de control; preferentemente en donde (i) la concentración de metionina libre en las hojas es de aproximadamente 0.03 mg/g; (ii) la concentración de treonina libre en las hojas es de aproximadamente 0.5 mg/g; y (iii) la concentración de metional en aerosol al momento del calentamiento es de al menos aproximadamente 2000 pg/g.

7. Una semilla que comprende células o tejido de la planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 y de la 4 a 6.

8. El material de la planta que incluye biomasa u hojas que comprenden células o tejido de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 2 y de la 4 a 6.

9. Un producto de tabaco que comprende una parte de la planta de acuerdo con las reivindicaciones 2 y de la 4 a 6 o un material de la planta de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Un método para producir metional que comprende los pasos de: (a) proporcionar parte de la planta mutante, de existencia no natural o transgénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 y de la 4 a la 6, el material de la planta de acuerdo con la reivindicación 8, o el producto de tabaco de acuerdo con la reivindicación 9; y (b) proporcionar calor al mismo.

11. Un método para detectar un polinucleótido NtTS en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se sospecha que comprende, un polinucleótido; (b) contactar la muestra con uno de los cebadores y una o más sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido NtTS; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido en la muestra NtTS.

12. Un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia que codifica una treonina sintasa y que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o que tiene al menos el 87% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 4, SEC ID NO:5;

13. Un polipéptido aislado codificado por cualquiera de uno de los polinucleótidos establecidos en la reivindicación 12.

14. Un polipéptido aislado que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia para la SEC ID NO:6, SEC ID NO:7 o SEC ID NO:8.

15. Una construcción, vector o vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12.