ES2326305T3 - Plantas con contenido aminoacido modificado y procedimiento para su elaboracion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la elaboración de una planta con un contenido incrementado de aminoácidos, con lo que un vector que contiene un gen del translocador de ATP/ADP es transferido a una planta o a tejido o células de la misma a través de métodos de ingeniería genética.
Description
Plantas con contenido aminoácido modificado y
procedimiento para su elaboración.
La presente invención describe plantas
transformadas y sus retoños, que se encuentran modificadas en sus
secuencias regulativas y/o en el numero de copias de genes del gen
del translocador de ATP/ADP de manera tal que, frente a una planta
no transformada, presentan simultáneamente uno o varios aminoácidos
en cantidades modificadas. Además, la presente invención hace
referencia a un procedimiento para la elaboración de estos
vegetales, así como su utilización como planta útil o en áreas de
la industria de alimentos para animales.
Los humanos y los animales sólo pueden
sintetizar 11 de los 20 aminoácidos necesarios y por ello dependen
de una ingestión a través de la alimentación de los 9, así llamados,
aminoácidos esenciales. La alimentación de los humanos y el ganado
se basa en gran parte en componentes vegetales. Lisina, triptófano,
valina, leucina, isoleucina, metionina, treonina, fenilalanina e
histidina pertenecen a los aminoácidos esenciales.
Una dificultad reside, muchas veces, en la poca
concentración de estos aminoácidos en las plantas alimenticias. Por
este motivo, a menudo los alimentos basados en mezclas de granos y
en vegetales se suplementan con aminoácidos elaborados de manera
sintética, para aumentar el valor alimenticio de este alimento.
En el pasado se investigaron numerosas formas de
aumentar la cantidad de aminoácidos libres, es decir, no proteicos.
Sin embargo, estos ensayos se concentraban fundamentalmente en el
cultivo clásico, así como en la selección de mutantes.
En un pasado reciente se intentó cada vez con
más insistencia, aumentar la cantidad de aminoácidos esenciales
mediante la utilización de técnicas de genética molecular. La WO 97
28247, WO 98 13506 y WO 9735023 describen los primeros ensayos que
se refieren a la expresión heterológica de una proteína de reserva
específica de una semilla, que es rica en lisina y metionina. En
este caso, la desventaja es el almacenamiento de los aminoácidos en
proteínas, es decir que también aquí se trata de un aumento de
aminoácidos proteicos.
Además se conocen numerosos ensayos para
influenciar directamente sobre la biosíntesis de los aminoácidos.
En ellos se sobreexpresaron algunos genes, en forma de código, para
determinadas enzimas se biosíntesis de aminoácidos en plantas,
resultando en un aumento del producto final de biosíntesis
respectivo.
De manera alternativa, también se intentó
influenciar la cinética de reacción de las enzimas. En este punto
representa especialmente un problema la, así llamada, inhibición del
producto de las enzimas. Por ejemplo Shaul y Galili (1993); Plant
Mol Biol 23: 759-768) o Falco et al (1995;
Bio/Technology 13: 577-582) describen plantas, que
sobreproducen lisina libre, simultáneamente con una disminución de
treonina libre. La responsable de ello es la aspartato quinasa, la
primera enzima de la biosíntesis del aminoácido que proviene del
aspartato, que es inhibida alostéricamente por la lisina. Para
evitar esta retroinhibición se sobreexpresaron genes modificados
técnicamente de la aspartato quinasa en plantas (WO 94 25605). Esta
aspartato quinasa modificada dispone de una retroinhibición muy
disminuida mediante lisina y treonina, lo que conduce a un aumento
de la lisina. Estas aspartato quinasas, insensibles a la
retroinhibición a través de lisina, se sobreexpresaron además junto
con otras enzimas de biosíntesis. Ensayos correspondientes se
realizaron en bacterias corynebacterium (1991, Applied an
Environmental Microbiology 57: 1746-1752). Sin
embargo, en estas bacterias, además de un aumento de lisina también
se produce una fuerte reducción de la velocidad de crecimiento, lo
que a su vez posee un efecto negativo en el propio balance final de
lisina.
En Shaul y Galili (1993; Plant Mol Biol 23:
759-768) se describen ensayos con plantas que poseen
tanto una aspartato quinasa insensible a la retroacción, como
también una sintasa de dihidropicolinato insensible a la
retroacción. Ambas enzimas ocupan una posición clave en la
biosíntesis de aminoácidos. Sin embargo, la sobreexpresión de estas
enzimas "cuello de botella" no provocó el esperado aumento de
ambos aminoácidos, lisina y treonina. Más bien se pudo aumentar
sólo el contenido de lisina libre, con lo cual simultáneamente
disminuyó de manera drástica el contenido en treonina libre.
Además de la sobreexpresión de uno o dos genes
de biosíntesis de aminoácidos, la WO 98 56935, EP 0 854 189 y EP 0
485 970 describen enfoques multi genéticos con el objetivo de
influenciar simultáneamente las cantidades de uno o más aminoácidos
en una planta. Esto presupone la modificación genética de una planta
en relación a uno o más genes. Es decir, que sería necesario
elaborar una planta transgénica en cuanto a múltiples genes. Sin
embargo, estos procedimientos son muy costosos. Además, estas
intervenciones masivas en el material hereditario de la planta
entrañan muchos riesgos y reacciones secundarias imprevisibles.
Por ello es tarea de la presente invención,
poner a disposición un procedimiento para la elaboración de plantas
transgénicas, que no presenten las desventajas antes
mencionadas.
De manera sorprendente, conforme a la invención
esto se logra poniendo a disposición un procedimiento para la
elaboración de una planta transformada, que se encuentra modificada
en las secuencias regulativas y/o en el numero de copia de genes de
un gen del translocador de ATP/ADP, de manera tal que frente a una
planta semejante no transformada, presenta uno o varios aminoácidos
en cantidades modificadas.
Las plantas transformadas se caracterizan porque
generalmente presentan uno o más aminoácidos esenciales en
cantidades modificadas.
Las plantas presentan especialmente uno o más
aminoácidos esenciales, cuyo contenido se encuentra aumentado
respecto a las plantas no transformadas.
En el caso de las plantas transformadas se
trata, conforme a la invención, de plantas útiles, preferentemente
plantas con relevancia económica, como por ejemplo patatas o maíz.
Sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada a estas
especies.
Para ello, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la elaboración de las plantas transformadas
antes mencionadas, a sus semillas y retoños y también al tejido, las
células o material capaz de reproducirse derivado de estas plantas
transformadas.
En una variante de ejecución de la presente
invención, en la que conforme a la invención se sobreexpresa el gen
que codifica al translocador de ATP/ADP en patatas, se logra un
aumento de aminoácidos relevantes en cuanto a la fisiología
alimenticia y a la economía, como por ejemplo lisina, metionina,
valina, triptófano, histidina, isoleucina y leucina.
En la planta transformada identificada con la
línea 98 se encuentra aumentada la cantidad de lisina libre en un
28%, en la planta transgénica identificada con la línea 62 el
aumento de la cantidad de lisina libre asciende a un 25,75%. De
manera sorpresiva se logra un aumento de al menos un 25% del
contenido de lisina con sólo un aumento del 50% de la actividad del
translocador de ATP/ADP en las plantas. Además, en la línea 98 la
cantidad de metionina se encuentra aumentada en un 11%. Además de
cantidades aumentadas de lisina y metionina también se presentan
cantidades aumentadas de los aminoácidos esenciales valina (12% en
línea 98), triptófano (50% en línea 98), treonina (12,5% en línea
98), histidina (23,5% en línea 98 y 20% en línea 62), isoleucina
(25% en línea 98) y leucina (40% en línea 98).
Una sobreexpresión del translocador de ATP/ADP
en orientación antisentido conduce, en consecuencia, a una
disminución de las cantidades de aminoácidos en las plantas
transformadas respectivas, que se encuentran identificadas con las
líneas 594 y 595. Para lisina se encuentra aquí aproximadamente un
cuarto de la cantidad de lisina en la forma normal, en el caso de
metionina es aproximadamente, como máximo, un octavo de la cantidad
de metionina en la forma normal.
En la tabla 1 se presenta un resumen del
espectro de aminoácidos en la forma normal de la patata solanum
tuberosum y en la planta de patata transformada. En esta variante
de ejecución de la invención, la cantidad total de aminoácidos
libres en las plantas de patatas transformadas se encuentra
aumentada aproximadamente en un 7% frente a la forma normal.
Una ventaja especial de la presente invención es
que debido a la expresión aumentada de un único gen, más
precisamente del translocador de ATP/ADP, se puede lograr
simultáneamente un aumento de varios aminoácidos, en su mayoría
esenciales.
La planta modificada se caracteriza porque
presenta una capacidad de transporte aumentada de ATP hacia la
membrana envolvente de los cloroplastos.
También es objeto de la invención un gen del
translocador de ATP/ADP para la implementación en una de las
plantas antes descritas con una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la fig. 1 de
arabidopsis thaliana (EMBL Accession Nr. Z49227).
Conforme a la invención se podría pensar aquí en
la implementación de cualquier gen del translocador de ATP/ADP de
organismos que poseen cloroplastos. Se prefieren plantas en general,
algas verdes o musgos.
El gen del translocador de ATP/ADP normalmente
se encuentra localizado en la membrana envolvente interna de los
cloroplastos. Allí es responsable del antiporte, es decir el
transporte de ATP y ADP en dirección contraria, que se realiza
exportando al citosol ADP del cloroplasto en lugar de ATP. Debido a
la actividad aumentada de este translocador de ATP/ADP, se aumenta
la cantidad de ATP en el cloroplasto (Neuhaus 2 et al., 1997,
The Plant Journal 11: 73-82). Tjaden et al,
1998, Plant Journal 16:531-540 pudo demostrar, que
la recepción de ATP en los cloroplastos de patatas debido a la
sobreexpresión del translocador de ATP/ADP se encuentra en promedio
un 50% por encima de la capacidad de recepción de la forma normal.
Estas moléculas de ATP, ricas en energía, que se encuentran a
disposición de manera multiplicada, pueden ser utilizadas para una
biosíntesis aumentada de almidón y ácidos grasos, como se describe
en Möhlmann et al., 1994, Planta, 194:
492-497; Neuhaus et al. 1993, Plant
Physiology 101: 573-578; Tjaden et al, 1998,
Plant Journal 16: 531-540; WO 99/58654.
Conforme a la invención se puede implementar
también un gen del translocador de ATP/ADP con una secuencia
nucleótida natural, sintetizada químicamente, modificada o generada
artificialmente que esencialmente posee el mismo efecto o con
secuencias nucleótidas heterológicas que codifiquen un translocador
de ATP/ADP o variaciones de alelos o isoformas de los mismos, o con
mezclas de los mismos.
Secuencias de igual efecto, que codifican para
conformar un gen del translocador de ATP/ADP, son aquellas
secuencias, que a pesar de una secuencia nucleótida diferente poseen
las funciones deseadas. De esta manera, los equivalentes de igual
efecto abarcan por supuesto a las variantes existentes de las
secuencias descritas, así como a secuencias de nucleótidos
artificiales obtenidas por ejemplo a través de síntesis artificial,
adaptadas al reconocimiento de codones de una planta.
Bajo una secuencia de nucleótidos de igual
efecto se entiende especialmente también a mutaciones naturales o
artificiales de una secuencia originalmente aislada que codifica un
translocador de ATP/ADP, que sigue presentando la función deseada.
Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, deleción,
intercambios o inserciones de uno o varios restos nucleótidos. De
esta manera, la presente invención abarca por ejemplo también
aquellas secuencias que se obtienen a través de la modificación de
la secuencia de nucleótidos del translocador de ATP/ADP. El
objetivo de una modificación de este tipo puede ser, por ejemplo, la
limitación de la secuencia allí incluida o también, por ejemplo, la
inserción de otros sitios de enzimas restrictivas.
Secuencias de nucleótidos de igual efecto
también son aquellas variantes, cuya función se encuentra debilitada
o reforzada en comparación con el gen de partida o el fragmento de
gen.
Además son adecuadas secuencias de ADN, siempre
que transmitan las propiedades deseadas, como se describe arriba.
Estas secuencias artificiales de ADN pueden ser determinadas, por
ejemplo, a través de proteínas construidas a través de una
retrotraducción mediante modelización molecular, que presenten la
actividad de un translocador de ATP/ADP o por selección in
vitro. Especialmente adecuadas son las secuencias codificadoras
de ADN que se obtuvieron a través de retrotraducción de una
secuencia polipeptídica, conforme al reconocimiento de un condón
específico para la planta huésped. Un especialista que conozca de
métodos genéticos para vegetales puede determinar fácilmente a
través de evaluaciones por computadora de genes conocidos,
diferentes a los de la planta a transformar, el reconocimiento de
un condón específico.
Bajo un enlace funcional se entiende la
disposición secuencial de, por ejemplo, un promotor, secuencia
codificadora, terminador y eventualmente otros elementos
reguladores de manera tal, que cada uno de los elementos reguladores
pueda cumplir correctamente su función en la expresión de la
secuencia codificadora. Como promotor es adecuado todo promotor,
que pueda controlar la expresión de genes extraños en plantas.
Preferentemente se utiliza un promotor vegetal o un promotor, que
provenga de un virus vegetal. Se prefiere especialmente el promotor
CAMV 35S del virus del mosaico de la coliflor (Franck et
al., Cell 21 (1980), 285-294). Como es sabido,
este promotor contiene diferentes secuencias de reconocimiento para
efectores transcripcionales, que en su totalidad conducen a una
expresión permanente y constitutiva del gen introducido (Benfey
et al., EMBO J, 8 (1989), 2195-2202). Otras
secuencias preferidas para los enlaces funcionales, pero no
limitadas a ello, son los terminadores de transcripción y
reforzadores de la translación, como la secuencia de conducción de
5' del virus del mosaico del tabaco (Gallie et al., Nucl.
Acids Res. 15 (1987), 8693-871 1).
Para el enlace de los fragmentos de ADN entre sí
se pueden colocar adaptadores o enlazadores en los fragmentos.
Preferentemente las regiones de los promotores y de los terminadores
se pueden proveer, en dirección de la transcripción, con un
enlazador o poli-enlazador que contenga una o más
posiciones de restricción para la inserción de esta secuencia.
Generalmente el enlazador posee 1 a 10, preferentemente 1 a 8, de
manera especialmente preferida 2 a 6 posiciones de restricción. En
general el enlazador dentro de las áreas de regulación posee un
tamaño menor a 100 bp, a menudo menor a 60 bp, sin embargo por lo
menos menor a 5 bp. El promotor puede ser tanto nativo u homólogo,
como también extraño o heterólogo respecto a la planta huésped.
Objeto de la invención es además una estructura
genética que contenga un gen del translocador de ATP/ADP, así como
secuencias reguladoras enlazadas funcionalmente con este gen, así
como un vector que contenga un gen del translocador de ATP/ADP o
una estructura genética como se describió. Para ello el vector puede
contener secuencias nucleótidas reguladoras adicionales,
preferentemente del grupo de los promotores, terminadores o
reforzadores de la translación, así como secuencias de nucleótidos
para la replicación en una célula huésped correspondiente o para la
integración en el genoma.
Utilizando las técnicas de recombinación y
clonación, en si conocidas, las estructuras genéticas pueden ser
clonadas en vectores adecuados, que posibiliten su multiplicación en
células huésped, como por ejemplo vegetales, tejidos o células
vegetales. Vectores adecuados se describen, ente otros en "Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Cap.
6/7, S. 71-119 (1993).
Para E. coli como célula huésped se
prefieren como vectores de clonación sobre todo pBR332, series pUC,
series M13mp y pACYC1 84. Especialmente se prefieren vectores
binarios, que pueden duplicarse tanto en E. coli como por
ejemplo también en agrobacterias. Un ejemplo de ello es el llamado
pBIN19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 871 1). La
estructura genética conforme a la invención también se puede
insertar, de manera ejemplar, en el vector de transformación del
tabaco pBIN-AR-TP.
Además, la presente invención hace referencia a
un procedimiento para la elaboración de una planta transformada de
la manera antes descrita, con lo que a través de métodos de
ingeniería genética se transfiere un gen del translocador de
ATP/ADP, una estructura genética o un vector del tipo antes descrito
a la planta o al tejido o células de la misma. De manera general,
bajo la transferencia de ADN se debe entender la transformación de
vegetales, tejido vegetal o células vegetales.
Métodos adecuados para la transformación y la
regeneración de vegetales a partir de tejidos vegetales o células
vegetales para la transformación transitoria o estable son la
transformación de protoplastos a través de recepción de ADN
inducida por polietilenglicol, el procedimiento biolístico con el
cañón de genes (el así llamado método de bombardeo de partículas),
la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que
contenga ADN, la microinyección y la transferencia de genes mediada
por la bacteria agrobacterium. Los procedimientos mencionados se
encuentra descritos, por ejemplo, en B. Jenes et al.,
Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1,
Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung y R. Wu,
Academic Press (1993), 128143, así como en Potrykus, Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205225).
De esta manera, a través de la presente
invención es posible elaborar plantas de alto valor económico, que
se caracterizan por un contenido considerablemente aumentado de
aminoácidos, especialmente de aminoácidos esenciales.
La presente invención describe la utilización de
la planta transformada como planta útil o alimenticia. Como en las
plantas útiles conforme a la invención se puede aumentar
especialmente el contenido de varios aminoácidos esenciales de
manera simultánea, preferentemente se suprime una suplementación
costosa de los alimentos para animales con aminoácidos, que de
acuerdo a métodos convencionales hasta ahora se elaboran o extraen
por separado y se agregan externamente al alimento.
Además, la planta transformada, sus semillas y
retoños, así como el tejido o las células o extractos de la misma
se utilizan en la agricultura, la industria de alimentos para
animales y la industria farmacéutica o en el área de la salud.
A continuación la presente invención es
explicada en detalle mediante ejemplos de ejecución, que sin embargo
no son limitadores en el sentido de la invención:
Los procedimientos de clonación, como por
ejemplo divisiones de restricción, electroforesis en gel de agarosa,
limpieza de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a
nitrocelulosa y membranas de nylon, enlace de fragmentos de ADN,
transformación de células de E. coli, cultivo de bacterias,
multiplicación de ADN recombinante por fago y análisis de
secuencia, se ejecutaron como se describe en Sambrook et al
(1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN
0-87969-309-6).
Las cepas bacterianas utilizadas (E.
coli, XLI Blue) fueron adquiridas a las empresas Stratagene
(Heidelberg) o Qiagen (Hilden). La cepa agrobacteriana utilizada
para la transformación de plantas (agrobacterium tumefaciens, C58C1
con el plásmido pGV2260 o pGV3850kan) fue descrito por Deblaere
et al. en Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777. De manera
alternativa también se puede utilizar la cepa agrobacteriana LBA4404
(Clontech) u otras cepas adecuadas.
Para la clonación se pueden utilizar los
vectores pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985),
103-119) pBluescript SK (Stratagene),
pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen) pBin19 (Bevan
et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984),
8711-8720) y pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant
Science 66 (1990), 221-230.
La transformación de agrobacterium tumefaciens
se realizó de acuerdo al método de Höfgen y Willmitzer (Nucl. Acid
Res. (1988) 16, 9877). El cultivo de las agrobacterias se realizó en
YEB medio (Vervliet et al., J. Gen. Virol. (1975) 26,
33).
La secuenciación de moléculas de ADN
recombinante se realizó con un secuenciador de fluorescencia láser
de ADN de la empresa Licor (distribuida por MWG Biotech.,
Ebersbach) de acuerdo al método de Sanger (Sanger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977),
5463-5467).
Para la construcción de un vector para la
transformación de plantas se liga un fragmento de EcoRV/BamHI de
2230 bp de largo del AATP1-cADN de arabidopsis
thaliana (descripción de la clonación de AATP1 de arabidopsis
thaliana en Kampfenkel et al., FEBS Letters 374 (1995),
351-355 y Neuhaus et al., The Plant Journal
11: 73-82) en un vector pBinAR cortado con
Smal/EcoRV y BamHI (Höfgen y Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990),
223-230). Debido a la inserción del fragmento de
cADN se genera una construcción genética, que contiene al promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor (540bp) y la región que
codifica proteínas del translocador de ADP/ATP 1 de arabidopsis
thaliana (AATP1). El fragmento de cADN es fusionado en orientación
sentido con el promotor 35S en pBinAR. En dirección de 3' del
fragmento AATP1 insertado sigue la señal de poliadenilización del
gen de octopina sintasa de agrobacterium tumefaciens (215 bp).
El tamaño total del plásmido pBIN
AR-AATP1 (fig. 3) es de aprox. 14,2 kb.
El plásmido es transferido a plantas de patatas
con ayuda de agrobacterium tumefaciens, como se describe en
Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8 (1989),
23-29). Como control positivo de la transformación
sirven plantas de patatas transgénicas, que presentan un aumento
del mARN del translocador plástido de ADP/ATP 1. Esto es demostrado
por medio de un análisis Northern Blot. Para ello se aísla, de
acuerdo a protocolos estándar, ARN de tejidos de hojas y
tubérculos. 50 \mug ARN se separan en un gel de agarosa (1,5%
agarosa, tampón 1 x MEN, 16,6% formaldehído). Después de la
electroforesis el ARN es transferido, con 20 x SSC y a través de
transferencia capilar, a una membrana de nylon Hybond N (Amersham,
UK). El ARN es fijado en la membrana a través de radiación UV, la
membrana es pre-hibridizada por 2 horas en sustancia
tampón de hibridización de fosfato (Sambrook et al., a.a.O) y
a continuación hibridizada por 10 horas a través del agregado de una
sonda con marcación radioactiva.
Para la construcción de un vector para la
transformación de plantas se liga un fragmento de BamH/Ndel de 1265
bp de largo, en el que el sitio de Ndel es rellenado con polimerasa
T4 hacia el sitio blunt-end, de la región
codificadora de AATP1-cADN de S.tuberosum
(descripción de la clonación de AATP1 de patatas en Tjaden et
al., 1998, The Plant Journal 16: 531-540) en un
vector pBinAR cortado con Smal y BamHI (Höfgen y Willmitzer, Plant
Sci. 66 (1990), 221-230). El sitio Ndel se encuentra
en la AATP1 cADN, el sitio BamHI proviene del vector pTM1 (Tjaden
et al., 1998, The Plant Journal 16: 531-540).
Debido a la inserción del fragmento de cADN se genera una
construcción genética, que contiene al promotor 35S del virus del
mosaico de la coliflor (540bp) y una región de 1265 bp de largo de
un translocador de ADP/ATP 1 de S. tuberosum (AATP1 S.t.) en
orientación antisentido. El fragmento fue fusionado con el promotor
35S en pBinAR. En dirección de 3' del fragmento AATP1 insertado
sigue la señal de poliadenilización del gen de octopina sintasa de
agrobacterium tumefaciens (215 bp).
El tamaño total del plásmido pBIN
AR-AS-AATP1 (fig. 2) es de aprox.
13,3 kb.
La transferencia del plásmido se realiza
conforme al punto 5. Como resultado de la transformación las plantas
de patatas transgénicas mostraron una disminución del mARN de un
translocador plástido de ADP/ATP. Esto es demostrado por medio de
un análisis Northern Blot. Para ello se aísla, de acuerdo a
protocolos estándar, ARN de tejidos de hojas y tubérculos. 50
\mug ARN se separaron en un gel de agarosa (1,5% agarosa, tampón 1
x MEN, 16,6% formaldehído). Después de la electroforesis el ARN se
transfirió, con 20 x SSC y a través de transferencia capilar, a una
membrana de nylon Hybond N (Amersham, UK). El ARN se fija a la
membrana a través de radiación UV. La membrana es
pre-hibridizada por 2 horas en sustancia tampón de
hibridización de fosfato (Sambrook et al., a.a.O) y a
continuación hibridizada por 10 horas a través del agregado de la
sonda con marcación radioactiva.
Los aminoácidos (a excepción de prolina) son
medidos en extractos etanólicos a través de separación de HPLC
(según Geigenberger et al., 1996, Plant Cell & Environ
19: 43-55).
Se hace un extracto de dos rodajas de patatas
(en total aprox. 0.2 g de peso en estado fresco) en dos pasos
consecutivos con, en cada caso, 7 ml 80% (v/v) etanol y 7 ml 50%
etanol por un lapso de 30 min. a 80ºC. El extracto total (volumen
aprox. 14 ml) sirve para la determinación de los aminoácidos.
La comprobación de los aminoácidos se realiza de
manera flurométrica después de derivatización precolumna del grupo
amino primario con dialdehido o-ftálico (OPA). Para
ello un probador (Autosampler 465, Kontron, Eching) inyectó, a 4ºC
y en 35 \mul de extracto presentado, 35 \mul de reactivo OPA,
consistente en una mezcla de un 5% (g/v) de OPA en metanol, 0.8 M
de borato tampón (pH 10.4 con KOH) y 3 ácido mercaptopropionato
(10:90:1; v:v:v). Después de 108 segundos se inyectaron 20 \mul de
la muestra derivatizada.
Eluyente A es una mezcla de 1000 ml 12 mM de
fosfato de Na (pH 6.8) y 1.6 ml de tetrahidrofurano. Eluyente B se
compone de una mezcla de 250 ml 12 mM de fosfato de Na (pH 6.8), 175
ml de metanol y 110 ml de nitrilo de acetona. Las condiciones de
separación son las siguientes: 0-2 min, fase
isocrática con 0% B, 2-11 min., gradiente lineal de
0 a 10% B, 11-17 min., 10% B, 17-27
min., gradiente lineal de 10 a 50% B, 27-38 min.,
gradiente lineal de 50 a 60% B, 38-44 min.,
gradiente lineal de 60 a 100% B, 44-46 min., 100% B,
46-48 min., 100 a 0% B, 48-60 min.,
0% B. Para la separación se utiliza una columna Hypersil ODS (3
\muM de tamaño de partícula, 150 mm de largo, 4.6 mm de diámetro,
Knauer GmbH, Berlín). Las señales detectadas por el fluorómetro
(SFM25, Kontron, Eching) (longitud de onda de excitación = 330 nm,
longitud de onda de emisión = 450 nm) son integradas y valoradas
por el sistema de datos 450-MT (Kontron,
Eching).
La determinación del contenido de prolina se
realiza conforme a Bates et al., 1973, Plant Soil 39:
205-207.
A 200 \mul de extracto se agregan 500 \mul
de una mezcla de 2 partes 6 M H3PO4 y 3 partes de 75% ácido
acético, así como 500 \mul de solución de ninhidrina (600 mg cada
20 ml 75% de ácido acético). Después de 45 min de incubación a
95-100ºC, la mezcla de prueba es colocada en hielo y
mezclada con 300 \mul de tolueno. Después de que se hayan
separado las fases, la fase superior es transferida a una
microcubeta y la OD es medida en 515 nm. El contenido de prolina es
determinado comparándolo con una recta de calibración
(1-50 \muM prolina).
Claims (2)
1. Procedimiento para la elaboración de una
planta con un contenido incrementado de aminoácidos, con lo que un
vector que contiene un gen del translocador de ATP/ADP es
transferido a una planta o a tejido o células de la misma a través
de métodos de ingeniería genética.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque el translocador de ATP/ADP presenta una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
indicada en la fig. 1.
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