WO1997045549A1 - Sequences d'adn codant pour des laccases, et leurs applications dans le domaine de la regulation des teneurs en lignines des plantes - Google Patents

Sequences d'adn codant pour des laccases, et leurs applications dans le domaine de la regulation des teneurs en lignines des plantes Download PDF

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WO1997045549A1
WO1997045549A1 PCT/FR1997/000948 FR9700948W WO9745549A1 WO 1997045549 A1 WO1997045549 A1 WO 1997045549A1 FR 9700948 W FR9700948 W FR 9700948W WO 9745549 A1 WO9745549 A1 WO 9745549A1
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mrna
sequence
seq
laccase
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Application number
PCT/FR1997/000948
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Loïc FAYE
Véronique-Martine GOMORD
Marie-Christine Kiefer-Meyer
Ann O'connel
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of DNA sequences coding for laccases in plants, or of any fragment of these sequences, or of any sequence derived from the latter, or of their complementary sequences, in the context of the implementation of methods for regulating the level of lignin in plants.
  • Laccases p. Diphenol: O2 oxidoreductase, EC 1.10.3.2 oxidize phenolic substrates using oxygen as an electron acceptor. These are glycoproteins that bind four copper ions, which together with ascorbate oxidase and ceruloplasmin, constitute a group of metallo-enzymes called "blue copper oxidases" (Messerschmidt and
  • laccases In plants, the only function attributed to laccases is that of their probable involvement in the oxidative polymerization of phenolic compounds within the framework of lignin biosynthesis. Although the involvement of laccases in lignification has been questioned for years, several recent studies have led to reconsider their role in this process (Driouich et al., 1992; O'Malley et al., 1993; Dean and Eriksson, 1994).
  • O-methyl transferase O-methyl transferase
  • CAD cinnamyl alcohol dehydrogenase
  • CCR cinnamoyl CoA reductase
  • Lignins are polymers of monolignols, and the three enzymes mentioned above are involved in the biosynthesis of monolignols.
  • Laccases act on the subsequent extracellular stages of assembly of these monolignols.
  • One of the aims of the present invention is that of providing a process making it possible to modify the lignins of plants, this modification occurring at the level of the composition and / or of the quantity of lignins produced.
  • the object of the present invention is more particularly to provide a process making it possible to effectively regulate the lignin contents in plants, either in the direction of a significant reduction in these contents compared to the normal contents in plants, or in the direction of 'an increase in these contents.
  • Another object of the present invention is to provide the tools for the implementation of such a method, and more particularly constructions usable for the transformation of plants.
  • Another object of the present invention is to provide genetically transformed plants, in particular fodder plants capable of being better digested than unprocessed plants, or plants or trees transformed for the production of paper pulp, and of which lignin extraction would be easier and less polluting than in the case of unprocessed trees.
  • Another object of the present invention is that of providing transformed plants which are more resistant to attacks from the environment, in particular to parasitic attacks, than are unprocessed plants, or even larger transformed plants, or smaller in size (than that of unprocessed plants).
  • SEQ ID NO 1 namely from a complete cDNA sequence coding for a tobacco laccase (coding sequence and 5 'and 3' non-coding ends of the cDNA),
  • FIG. 2 representation of the construction of the plasmid pMBKTL corresponding to the plasmid pBKTL8 presented in FIG. 1 in which the Ncol restriction site located upstream of the sequence coding for tobacco laccase, has been eliminated,
  • FIG. 3 representation of the construction of the plasmid pNKTL designed to over-express a gene coding for a laccase; it was produced from the cDNA sequence coding for a tobacco laccase delimited by the nucleotides located at positions 82 and 1755 of SEQ ID NO 1 (cloning of the coding region only).
  • FIG. 4 representation of the construction of plasmids pHSl and pHSl ⁇ designed to decrease the expression of the gene (s) coding for (the) laccase (s); they were produced from a partial cDNA sequence encoding a tobacco laccase, namely the sequence delimited by the nucleotides located at positions 292 and 1766, which was cloned in sense orientation in the case of the plasmid pHS16 and in antisense orientation in the case of the plasmid pHS1.
  • FIG. 5 representation of the construction of the plasmid pES22 designed to decrease the expression of the gene (s) coding for the laccase (s); it was produced from SEQ ID NO 1, namely from a complete cDNA sequence coding for a tobacco laccase (coding sequence and 5 'and 3' non-coding ends of the cDNA) which was cloned in antisense orientation.
  • the subject of the present invention is the use of recombinant nucleotide sequences containing one (or more) coding region (s), this (these) coding region (s) being made up:
  • derived protein in the above and what follows, is meant any protein having at least about 50% (and more particularly at least about 70%) of amino acids homologous to those of the protein from which it is derived.
  • nucleotide sequences which may be contained in the above-mentioned recombinant nucleotide sequences, there may be mentioned mainly:
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 1 coding for an mRNA, this mRNA itself coding for the tobacco laccase represented by SEQ ID NO 2, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 3, coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a tobacco laccase, this fragment being represented by SEQ ID NO 4,
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 5 coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a tobacco laccase, this fragment being represented by SEQ ID NO 6,
  • this complementary sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, and more particularly with the mRNA encoded by the sequences SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, and SEQ ID NO 5 respectively,
  • the present invention more particularly relates to any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 1 coding for an mRNA, this mRNA itself coding for the laccase represented by SEQ ID NO 2, or
  • the present invention more particularly relates to any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 3 coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a tobacco laccase, this fragment being represented by SEQ ID NO 4, or
  • the present invention more particularly relates to any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 5 coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a tobacco laccase, this fragment being represented by SEQ ID NO 6, or
  • nucleotide sequence derived from the sequence represented by SEQ ID NO 5, mentioned above, or from a fragment as described above of this sequence, in particular by mutation and / or addition, and / or deletion, and / or substitution d '' one or more nucleotides, this derived sequence coding for an mRNA coding itself for the laccase fragment represented by
  • SEQ ID NO 6 or for a protein derived therefrom.
  • laccase fragments or "derived proteins” in the foregoing and what follows, is meant any protein having a polymerization activity of monolignols in the absence of hydrogen peroxide as measured according to the method of Sterjiades et al. (1992) published in Plant
  • the subject of the invention is also any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • this complementary sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with mRNA coding itself for the laccase represented by SEQ ID NO 2, namely with the mRNA coded by the sequence represented by SEQ ID NO 1, or coded by a sequence derived from the latter, as defined above, or
  • this sequence fragment coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with the mRNA coding itself even for the laccase represented by SEQ ID NO 2, as defined above, or
  • the present invention more particularly relates to any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • this complementary sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with mRNA itself coding for the laccase represented by SEQ ID NO 4, namely the mRNA coded by the sequence represented by SEQ ID NO 3, or coded by a sequence derived from the latter, as defined above, or
  • this sequence fragment coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with the mRNA coding itself for the laccase represented by SEQ ID NO 4, as defined above, or
  • the present invention more particularly relates to any DNA sequence, characterized in that it comprises:
  • this complementary sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with mRNA itself coding for the laccase represented by SEQ ID NO 6, namely the mRNA coded by the sequence represented by SEQ ID NO 5, or coded by a sequence derived from the latter, as defined above, or
  • this sequence fragment coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular in tobacco, and more particularly with the mRNA coding itself for the laccase represented by SEQ ID NO 6, as defined above, or - any nucleotide sequence derived from the above-mentioned complementary sequence, or from the fragment of this complementary sequence as described above, in particular by mutation and / or addition , and / or deletion, and / or substitution of one or more nucleotides, this derived sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with the abovementioned mRNA. It goes without saying that the sequences represented by SEQ ID NO 1,
  • 5 ' ⁇ 3' as described above, is the complement of the last nucleotide of the sequence in the 5 '-> 3' direction coding for a laccase (or fragment of laccase or protein derived), the second nucleotide of this sequence complementary is the complement of the penultimate nucleotide of the sequence coding for a laccase, and so on, up to the last nucleotide of said complementary sequence which is the complement of the first nucleotide of the sequence coding for a laccase.
  • the mRNA encoded by the above-mentioned complementary sequence is such that, when this mRNA is represented in the 5 ' ⁇ 3' direction, its first nucleotide corresponds to the last nucleotide of the sequence coding for a laccase, and therefore hybridizes with the last nucleotide of the mRNA coded by the latter, while its last nucleotide corresponds to the first nucleotide of the sequence coding for a laccase, and therefore hybridizes with the first nucleotide of the mRNA coded by the latter.
  • antisense mRNA is meant in the above and what follows, any mRNA coded by the aforementioned complementary sequence and represented in the reverse direction (3 '->5') from the direction in which the mRNA coded by the sequence coding for a laccase (or fragment of laccase or protein derived), the latter mRNA being also designated sense mRNA (5 '->3').
  • antisense RNA therefore addresses an RNA sequence complementary to the base sequence of messenger RNA, the complementary term to be understood in the sense that each base (or a majority of bases) of the sequence antisense (read in the 3 ' ⁇ 5' direction) is capable of pairing with the corresponding bases (G with C, A with U) of the messenger RNA (sequence read in the 5 '- ⁇ 3' direction).
  • Antisense RNA is an RNA produced by the transcription of the non-coding DNA strand (nonsense strand).
  • the invention also relates to any mRNA encoded by a DNA sequence according to the invention, and more particularly: - the mRNA encoded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1, or encoded by a fragment or a derived sequence as defined above, said mRNA being capable of encoding in turn for the laccase present in tobacco, as represented by SEQ ID NO 2, or for a fragment of this laccase or a derived protein as defined above , - the mRNA coded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 3, or coded by a fragment or a derived sequence as defined above, said mRNA being capable in turn of coding for the fragment of a the laccase present in tobacco, as represented by SEQ ID NO 4, or for a fragment of the latter or a derived protein as defined above,
  • mRNA coded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 5, or coded by a fragment or a derived sequence as defined above, said mRNA being capable in turn of coding for the fragment of a laccase present in tobacco, as represented by SEQ ID NO 6, or for a fragment of the latter or a derivative protein as defined above.
  • the subject of the invention is also any antisense mRNA, as defined above, characterized in that it comprises nucleotides complementary to all or only part of the nucleotides constituting an mRNA as described above according to the invention.
  • said antisense mRNA being capable of hybridizing (or of pairing) with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular with an mRNA as described above.
  • the invention relates more particularly to the antisense mRNAs encoded by DNA sequences according to the invention, comprising at least one region of 100 bases homologous to those of a region of the sequences complementary to the above-mentioned DNA sequences of the invention.
  • DNA sequences coding for an antisense RNA there is no upper size limit for the DNA sequences coding for an antisense RNA according to the invention; they can be as long as that of the messenger normally produced in cells, or even as long as the genomic DNA sequence coding for the mRNA of a laccase.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • any antisense mRNA as described above, characterized in that it is coded by the nucleotide sequence complementary to that represented by
  • said antisense mRNA being capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular the mRNA coded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 1,
  • any antisense mRNA as described above, characterized in that it is coded by the nucleotide sequence complementary to that represented by
  • said antisense mRNA being capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular the mRNA coded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 3,
  • any antisense mRNA as described above, characterized in that it is coded by the nucleotide sequence complementary to that represented by
  • said antisense mRNA being capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, in particular the mRNA coded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO 5.
  • the invention also relates to the recombinant polypeptides encoded by the DNA sequences of the invention, said recombinant polypeptides having, where appropriate, a polymerization activity of monolignols in plants, and more particularly the recombinant polypeptides represented by SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, and SEQ ID NO 6, coded respectively by the sequences represented by SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, and SEQ ID NO 5, or by sequences derived from the latter according to the invention.
  • a more particular subject of the invention is the recombinant polypeptides, and in particular the recombinant laccases, as obtained by transformation of plant cells by stably integrating into their genome, a recombinant nucleotide sequence as defined below, containing a sequence DNA according to the invention, in particular using a vector as described below.
  • recombinant polypeptides should be understood to mean any molecule having a polypeptide chain capable of being produced by genetic engineering, through a phase of transcription of the DNA of the corresponding gene, which leads to obtaining RNA which is subsequently transformed into mRNA (by deletion of introns), the latter then being translated by ribosomes, in the form of proteins, the whole being carried out under control of appropriate regulatory elements within a host cell. Consequently, the expression "recombinant polypeptides” used does not exclude the possibility that said polypeptides include other groups, such as glycosylated groups.
  • the term “recombinant” indicates that the polypeptide was produced by genetic engineering, because it results from the expression, in an appropriate cellular host, of the corresponding nucleotide sequence which was previously introduced into an expression vector used to transform said cell host.
  • this term “recombinant” does not exclude the possibility that the polypeptide is produced by a different process, for example by conventional chemical synthesis according to the known methods used for the synthesis of proteins, or by proteolytic cleavage of larger molecules. .
  • the invention relates more particularly to tobacco laccases as obtained in essentially pure form by extraction and purification from tobacco, and more particularly the laccase represented by SEQ ID NO 2, or that comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO 4 , or else that comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO 6, or any protein derived from the latter, in particular by addition, and / or deletion, and / or substitution of one or more amino acids, or any fragment derived from said laccases or of their derived sequences.
  • the subject of the invention is also the nucleotide sequences coding for the laccase represented by SEQ ID NO 2, or for the polypeptides represented by SEQ ID NO 4, and SEQ ID NO 6, or any derived sequence or fragment thereof, such as defined above, said nucleotide sequences being characterized in that they correspond to all or part of the sequences represented by SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, or SEQ ID NO
  • the invention also relates to the complexes formed between the antisense mRNAs, as described above, and the mRNAs according to the invention, capable of coding for all or part of a laccase in plants.
  • a more particular subject of the invention is the complex formed between the mRNA coded by the sequence SEQ ID NO 1 and the antisense mRNA coded by the sequence complementary to the sequence SEQ ID NO 1, that formed between the mRNA coded by the sequence SEQ ID NO 3 and the antisense mRNA coded by the sequence complementary to the sequence SEQ ID NO 3, as well as that formed between the mRNA coded by the sequence SEQ ID NO 5 and the antisense mRNA coded by the sequence complementary to the sequence SEQ ID NO 5.
  • the subject of the invention is also any recombinant nucleotide sequence containing one (or more) coding region (s), this (these) coding region (s) being made up:
  • antisense nucleotide sequence also called antisense mRNA
  • the subject of the invention is more particularly any recombinant nucleotide sequence (or recombinant DNA), characterized in that it comprises at least one DNA sequence according to the invention, chosen from those described above, said DNA sequence being inserted into a heterologous sequence.
  • the invention relates more particularly to any recombinant nucleotide sequence as described above, comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO 1, or by SEQ ID NO 3, or by SEQ ID NO 5, or any fragment or derived nucleotide sequence of the latter, as defined above, said nucleotide sequences or said fragment being inserted into a heterologous sequence, and being capable of coding for the polypeptide represented by SEQ ID NO 2, or by SEQ ID NO 4, or by SEQ ID NO 6, respectively, or for a fragment of these polypeptides, or for a protein derived from the latter, as defined above.
  • the invention relates more particularly still, any recombinant nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence complementary to that represented by SEQ ID NO 1, or by SEQ ID NO 3, or by SEQ ID NO 5, or any fragment or any nucleotide sequence derived from this complementary sequence, as defined above, said complementary sequences or said fragment being inserted into a heterologous sequence, and being capable of coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with all or part of the mRNA coding for a laccase in plants, and more particularly with all or part of the mRNA coding for the laccase represented by SEQ ID NO 2, or for the laccase fragments represented by SEQ ID NO 4, or by SEQ ID NO 6, respectively.
  • the recombinant DNAs according to the invention are further characterized in that they comprise the elements necessary for regulating the expression of the nucleotide sequence coding for all or part of a laccase according to the invention, or of its complementary sequence coding for a Antisense mRNA according to the invention, in particular a promoter and a terminator for the transcription of these sequences.
  • the various promoters capable of being used in the recombinant DNA constructs according to the invention there may be mentioned: - the endogenous promoter controlling the expression of laccase in a plant, in particular the promoter located upstream of the sequence shown by SEQ ID NO 1, or SEQ ID NO 3, or SEQ ID NO 5 in tobacco, or
  • promoters of the constitutive type with high expression such as, for example, the promoter 35S of CAMV (described in Benfey et al. (1990), EMBO J., 9 (6), 1677-1684),
  • the invention also relates to any recombinant nucleotide sequence as described above, and also comprising at least one nucleotide sequence coding for all or part of an mRNA itself coding for a different enzyme than laccase, which is found to be involved.
  • mRNA coding for cinnamyl alcohol dehydrogenase CAD
  • CCR cinnamoyl CoA reductase
  • OMT O-methyltransferase
  • the subject of the invention is also any recombinant vector, usable for the transformation of plants, characterized in that it comprises a recombinant nucleotide sequence chosen from those described above, according to the invention, integrated into one of the sites of its genome not essential for its replication.
  • the present invention also relates to a process for regulating the biosynthesis of lignins in plants, either by decreasing or by increasing the quantities of lignins produced, relative to the normal quantities of lignins produced in these plants, said process comprising a step transformation of cells of these plants using a vector containing:
  • cleotide coding for said mRNA, or a fragment of the latter, stte complementary sequence coding for a sequence .. antisense nucleotide also designated antisense mRNA capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, said transformation being carried out in particular using a vector as described above.
  • a more particular subject of the present invention is a method of reducing the amounts of lignin produced in plants, compared to the normal amounts of lignins produced in these plants, said method comprising a step of transforming cells of these plants using 'a vector containing:
  • a more particular subject of the present invention is a method for reducing the quantities of lignins produced in plants, compared to the normal quantities of lignins produced in these plants, said method comprising a step of transforming cells of these plants using '' a vector containing a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence coding for an mRNA coding itself for a laccase in plants, or complementary to a fragment of a nucleotide sequence coding for said mRNA, or complementary to a sequence nucleotide derived either from a nucleotide sequence coding for said mRNA, or from a fragment of the latter, this complementary sequence coding for an antisense nucleotide sequence (also called antisense mRNA) capable of hybridizing with an mRNA coding for a laccase in plants, said transformation being carried out in particular using a vector t as described above.
  • the invention more particularly relates to a process for reducing the amount of lignins produced by bio
  • Antisense mRNA capable of hybridizing to an mRNA coding for a different enzyme than laccase, which is found to be involved in a stage of lignin biosynthesis in plants, in particular the mRNA coding for CAD, CCR or f OMT , said transformation being carried out:
  • recombinant vectors either using several recombinant vectors, at least one of which contains a DNA sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing with the mRNA coding for a laccase or for a derived protein, as defined above above, while the other recombinant vector (s) contain (s) a DNA sequence coding for an antisense mRNA capable of hybridizing to an mRNA coding for another enzyme as laccase, as defined above.
  • Another process for reducing the quantity of lignins produced by biosynthesis in plants is that carried out by transformation of the genome of these plants, by incorporating therein a nucleotide sequence coding for a messenger RNA RNA (m), this RNA (m) coding itself for a laccase in plants, or a fragment of the above-mentioned nucleotide sequence, this fragment coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a laccase, or a nucleotide sequence derived from the above-mentioned nucleotide sequence , or derived from the above-mentioned fragment, in particular by mutation and / or addition, and / or deletion, and / or substitution of one or more nucleotides, this derived sequence coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a protein derived from 'a laccase.
  • the latter method uses the co-suppression mechanism. Co-suppression was observed when copies of the endogenous gene were introduced into the genome. Although the mechanism of co-suppression is currently unknown, one of the most frequently accepted hypotheses is that the downregulation of gene expression comes from the production of a small proportion of antisense RNA derived from a transgene to through a reading of the "bad" strand of the transgene (Grierson et al., Trends Biotech., 9: 122-123).
  • the subject of the invention is more particularly a process for reducing the quantity of lignins produced by biosynthesis in plants, this process being carried out by transformation of the genome of these plants, by incorporating therein: - at least one sequence of DNA according to the invention represented by
  • SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3, or SEQ ID NO 5, or a fragment or sequence derived therefrom, as defined above,
  • At least one DNA sequence coding for all or part of an enzyme other than laccase which is found to be involved in a stage of the biosynthesis of lignins in plants, in particular a sequence of DNA coding for all or part of the CAD, or the CCR, or the OMT, said transformation being carried out:
  • the reduction in lignin content resulting from the processing of one of the abovementioned methods is advantageously such that the plants thus transformed have an average lignin content reduced by at least about 2 to 3% compared to the normal average lignin content of an unprocessed plant.
  • the lignin content of a plant can be measured according to the methods described by Effland (1977) in Tappi, 60, 143-144, or by Iiyama and Wallis (1990) in J. Sci. Food Agric, 51, 145-161.
  • the invention relates more particularly to the application of the abovementioned methods of reducing the lignin contents in plants, to obtaining genetically transformed fodder plants having reduced lignin contents compared to the normal lignin contents in these plants, and whose digestibility is thus improved compared to these same unprocessed plants.
  • main fodder plants capable of being transformed in the context of the present invention there may be mentioned: alfalfa, fescue, corn intended for silage, etc.
  • the invention also relates to the application of the abovementioned methods of reducing the lignin contents in plants, to obtaining plants, and more particularly trees, genetically transformed, having reduced lignin contents compared to the normal contents. lignins in these plants, these plants or trees being particularly advantageous to use in the context of the production of paper pulp.
  • a third potential area of application of the above-mentioned methods of downregulating the expression of the laccase gene relates to the stimulation of the growth of transformed plants. It seems that early and rapid lignification is a brake on cell growth and therefore on plant growth. Thus the implementation of the abovementioned processes is likely to allow for the plants thus transformed with reduced lignification better growth and therefore better yields.
  • the invention also relates to a method of increasing the quantity of lignins produced by biosynthesis in plants, this method being carried out by transformation of the genome of these plants, by incorporating therein a nucleotide sequence coding for a messenger RNA (mRNA), MRNA itself coding for a laccase in plants, or a fragment of the above-mentioned nucleotide sequence, this fragment coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a fragment of a laccase, or a nucleotide sequence derived from the sequence aforementioned nucleotide, or derived from the aforementioned fragment, in particular by mutation and / or addition, and / or deletion, and / or substitution of one or more nucleotides, this derived sequence coding for an mRNA, this mRNA itself coding for a protein derived from a laccase.
  • mRNA messenger RNA
  • MRNA messenger RNA
  • the invention relates more particularly to a process for increasing the quantity of lignins produced by biosynthesis in plants, this process being carried out by transformation of the genome of these plants, by incorporating therein: - at least one sequence of DNA according to the invention represented by
  • SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 3, or SEQ ID NO 5, or a fragment or sequence derived therefrom, as defined above,
  • At least one DNA sequence coding for all or part of another enzyme than laccase which happens to be involved in a step of the biosynthesis of lignins in plants, in particular a sequence of DNA coding for all or part of the CAD, and / or the CCR, and / or the OMT, said transformation being carried out:
  • the invention relates more particularly to the application of the aforementioned method of increasing the lignin contents in plants (also known as the overexpression process of the laccase gene), in obtaining genetically transformed plants having increased lignin contents. compared to the normal lignin contents in these plants, and whose properties of resistance to environmental attacks, in particular to parasitic attacks, are found to be thus improved compared to these same unprocessed plants. It is particularly advantageous in this last case, to use in association with the laccase gene, or a derived sequence, in the above-mentioned vectors, specific promoters particularly expressed in surface tissues and / or in response to injury.
  • the invention also relates to the application of the aforementioned method of overexpression of the laccase gene, to improving the growth of plants thus genetically transformed, in particular in certain fields such as horticulture or arboriculture, where it is desirable to obtain plants of reduced size.
  • the benzene cycles of lignin have greater intrinsic energy than the aliphatic chains of the glucose residues of cellulose.
  • the present invention also relates to a process for modifying the composition, and therefore the physicochemical characteristics, of the lignins produced by the transformed plants, compared to the lignins normally produced in these plants, said process comprising a step of transforming cells of these plants using a vector containing:
  • This technique involves the association of the recombinant DNA according to the invention with microparticles of gold or tungsten which are propelled using a particle gun on the tissue to be transformed. It will be particularly applied to the transformation of species refractory to agrobacteria.
  • the verification of the presence of the recombinant DNA according to the invention will be carried out by hybridization experiments of the Southern type and of gene amplification (polymerase chain reaction), using probes and d oligonucleotide primers originating in particular from the sequence SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, or SEQ ID NO 5.
  • the invention also relates to plant cells transformed with a vector according to the invention, in particular by the techniques described above, and comprising a DNA sequence according to the invention integrated in a stable manner into their genome.
  • the invention also relates to the transformed plants as obtained by culturing the above-mentioned transformed cells.
  • the transformed plants can then be propagated sexually or vegetatively in vitro or in natura.
  • the subject of the invention is also the plant fragments, in particular fruit, seeds, pollen, transformed by incorporating into their genome a DNA sequence according to the invention, using the above-mentioned recombinant vectors.
  • the invention also relates to the antibodies directed against the recombinant polypeptides of the invention, and more particularly those directed against the recombinant laccases, or fragments of laccases, mentioned above.
  • Such antibodies can be obtained by immunization of an animal with these polypeptides followed by the recovery of the antibodies formed.
  • this production is not limited to polyclonal antibodies. It also applies to any monoclonal antibody produced by any hybridoma capable of being formed, by conventional methods, from the spleen cells of an animal, in particular mouse or rat, immunized against one of the purified polypeptides of the invention on the one hand, and cells of a suitable myeloma on the other hand, and to be selected, by its capacity to produce monoclonal antibodies recognizing the above-mentioned polypeptide initially used for the immunization of animals.
  • the invention also relates to the use of the abovementioned antibodies directed against the recombinant polypeptides of the invention, for the implementation of a method for detecting or assaying laccases in plants, from samples taken from the latter. .
  • a cDNA library from tobacco stems (Nicoliana tabacum cv Samsun), constructed in the EcoRI site of the vector ⁇ ZAPII (Stratagene, Cambridge, UK), was screened using a heterologous sycamore laccase probe .
  • This probe corresponds to the sequence of a cDNA of 435 base pairs (bp) published by Delaunay et al. (1994), coding for part of the aforementioned laccase and covering the 3 ′ end of the cDNA sequence (comprising a zone coding for a protein with two conserved regions of copper fixation) published by La Fayette et al. (1995).
  • the approximate size of the insert of the four clones ranges from about 700 bp to 2000 bp.
  • the three clones pTL2, pTL3 and pTL4 were further characterized by sequencing.
  • the one with the larger insert, namely pTL3 contains a cDNA coding for a complete laccase.
  • the PTL3 insert is 1984 bp long (SEQ ID NO 1) and consists of an untranslated region of 81 bp in 5 ′, an open reading phase coding for a laccase of 1674 bp, and a 229 bp 3 'non-coding region.
  • the two other cDNAs of the clones pTL2 and pTL4 are 1512 bp (SEQ ID NO 2) and 630 (SEQ ID NO 3) respectively, and correspond to partial sequences not containing the region coding for the N-terminal part of the laccase.
  • clones pTL2, -3 and -4 contain cDNA sequences encoding different laccases, since their sequences are different in the overlapping regions.
  • the deduced amino acid sequence of the nucleotide sequence of the pTL3 insert is 89% identical to the amino acid sequences derived from pTL2 and pTL4 which have 95% identity between them.
  • the three cDNA sequences also have different 3 'non-coding regions.
  • the pTL3 cDNA insert codes for a polypeptide of 557 amino acids (61.9 kDa) with an isoelectric point (pi) of 10.08.
  • the deduced protein has twelve possible N-glycosylation sites (Asn-Xaa-Ser / Thr).
  • the N-terminal hydrophobic region of 22 amino acids likely represents the signal peptide, as suggested by comparison with the sycamore laccase sequence.
  • the cleavage of this signal peptide must take place between the Lys residues at position 22 and Arg at position 23 according to the rules of Von Heijne (Von Heijne, 1986).
  • the mature protein contains 535 amino acids (59.4 kDa).
  • the tobacco laccase sequence has also been compared with other copper oxidases found in databases. Among these proteins, those showing the greatest homology are the cucumber and tobacco ascorbate oxidases with 36% and 34% identity respectively, using the BESTFIT program (Genetics Computer Group, Wisconsin Package, Version 8).
  • the plasmid pBKTL8 (see FIG. 1) was designed to over-express a gene coding for a laccase; it was produced from SEQ ID NO 1, namely from a complete cDNA sequence coding for tobacco laccase (coding sequence and 5 'and 3' non-coding ends of the cDNA).
  • the plasmid pMBKTL corresponds to the plasmid pBKTL8 presented in FIG. 1 in which the Ncol restriction site located upstream of the sequence coding for tobacco laccase, has been eliminated.
  • the plasmid pNKTL (see FIG. 3) was designed to overexpress a gene coding for a laccase; it was produced from the cDNA sequence coding for a tobacco laccase delimited by the nucleotides located at positions 82 and 1755 of SEQ ID NO 1 (cloning of the coding region only).
  • the plasmids pHS1 and pHS16 were designed to decrease the expression of the gene (s) coding for the laccase (s); they were produced from a partial cDNA sequence encoding a tobacco laccase, namely the sequence delimited by the nucleotides located at positions 292 and 1766, which was cloned in sense orientation in the case of the plasmid pHS16 and in antisense orientation in the case of the plasmid pHS1.
  • the plasmid pES22 (see FIG. 5) was designed to decrease the expression of the gene (s) coding for the laccase (s); it was produced from SEQ ID NO 1, namely from a complete cDNA sequence coding for a tobacco laccase (coding sequence and 5 'and 3' non-coding ends of the cDNA) which was cloned in antisense orientation.
  • CaMV 35S sequences increasing transcription ("enhancer") and promoter of 35S RNA of cauliflower mosaic virus (CaMV); ⁇ : omega element of the tobacco mosaic virus (TMV); nos3 ': termination region of the gene coding for nopaline synthase; the multiclonagc site is marked in black.
  • the plasmid pBKl was obtained by cloning of the Smal-Kpnl cDNA fragment originating from pTL3 (see a) in the plasmid pMJBx (see b) digested with the BamHI restriction enzymes (digestion followed by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I to generate a blunt end) and Kpnl. d) Schematic representation of the restriction fragments from the plasmid pBK1 and used for cloning in the binary vector
  • the transformation vector pBKTL8 was obtained by cloning the expression cassette contained in the plasmid pBKl (see c) in the binary vector pBinl9i (see e). This cloning was carried out in two stages: the fragment HindIII-Xbal from pBKl (see d) was first inserted into the plasmid pBinl9i digested with the enzymes HindIII and Xbal then the resulting plasmid was then linearized by digestion with the enzyme Xbal in order to clone in a second step the Xbal-Xbal fragment (see d).
  • Plasmid pBKl was obtained by cloning the Smal-Kpnl cDNA fragment from pTL3 into plasmid pMJBx (see Figure 1c). The unwanted Ncol restriction site is reported.
  • Plasmid pMBK41 is derived from plasmid pBK1 which has been modified to remove the NcoI restriction site. To obtain the plasmid pMBK41, the plasmid pBK1 was linearized by digestion with the enzyme Ncol then the restriction site Ncol was destroyed by digestion with the nucleus Mung Bean and the plasmid was closed on itself. The position of the eliminated Ncol site is indicated. c) Schematic representation of the expression cassette contained in the plasmid pBMK41
  • the plasmid pMBK41 was digested with the restriction enzyme Xhol in order to release a fragment corresponding to the omega sequences and of the cDNA coding for tobacco laccase (see d). Xhol sites are reported.
  • pBKTL ⁇ was digested with the Xhol enzyme in order to eliminate a region corresponding to the omega sequences and cDNA of tobacco laccase to replace it with the equivalent region but no longer containing the Ncol restriction site and originating from pMBK41 (see c and d).
  • (f) presents the new plasmid obtained.
  • f) Schematic representation of the T-DNA region of the transformation vector pMBKTL
  • the transformation vector pMBKTL was obtained by replacing an Xhol-Xhol restriction fragment containing a region corresponding to the omega sequences and cDNA coding for the tobacco laccase of the plasmid pBKTL ⁇ (see e) with an equivalent fragment originating from the plasmid pMBK41 (see c and d).
  • pMBKTL differs from pBKTL ⁇ only in the absence of an Ncol restriction site.
  • the cDNA sequence encoding a tobacco laccase is shown in white.
  • the non-coding 5 'and 3' ends of the cDNA are marked in black.
  • the position of the primers used to amplify by PCR the region corresponding to the sequence encoding tobacco laccase is indicated.
  • These primers were defined in such a way that they make it possible to introduce Ncol (at the ATG codon at the start of translation) and KpnI restriction sites at the 5 'and 3' ends respectively of the PCR amplification product.
  • CaMV 35S “enhancer” and promoter sequences of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S RNA; ⁇ : omega element of the tobacco mosaic virus (TMV); nos3 ': termination region of the gene coding for nopaline synthase; the multicloning site is marked in black.
  • the plasmid pNK ⁇ comes from the cloning of the PCR amplification product obtained from pTL3, digested with the restriction enzymes Ncol and Kpnl
  • the plasmid pBX3 was obtained from the plasmid pNK ⁇ by replacing a region delimited by the restriction sites Bsml and Xbal by the equivalent region originating from the original plasmid pTL3.
  • the regions resulting from the PCR amplification are indicated in black and have been verified by sequencing while the sequences originating from the original cDNA are represented in white.
  • pBX3 was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI generating two restriction fragments: HindlII-
  • LB left border region of T-DNA
  • nos3 ' termination sequence of the gene coding for nopaline synthase
  • CaMV 35S "enhancer” and promoter sequences of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S RNA
  • nptll CDS coding sequence for the kanamycin resistance gene
  • nos promoter promoter sequence of the gene coding for nopaline synthase
  • RB T-DNA right border region.
  • the transformation vector pNKTL was obtained by cloning the expression cassette contained in the plasmid pBX3 (see g) in the binary vector pJRIRi (see h). This cloning was carried out in two stages: the fragment
  • HindIII-EcoRI from pBX3 was first inserted into the plasmid pJRIRi digested with the enzymes HindIII and EcoRI and then the resulting plasmid was was then linearized by digestion with the EcoRI enzyme in order to clone the EcoRI-EcoRI fragment in a second step (see g).
  • the cDNA sequence encoding a tobacco laccase is shown in white. The non-coding 5 'and 3' ends of the cDNA are marked in black.
  • a cDNA fragment corresponding to a partial cDNA sequence coding for a tobacco laccase was obtained by digestion of the plasmid pTL3 with the restriction enzymes HindIII and Stul. The position of these restriction sites is indicated.
  • RB right border region of T-DNA (right border); nos promoter: promoter sequence of the gene coding for nopaline synthase; nptll CDS: coding sequence for the kanamycin resistance gene; nos3 ': termination sequence of the gene coding for nopaline synthase; CaMV 35S: "enhancer” and promoter sequences of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S RNA; LB: left border region of T-DNA; the multicloning site is marked in black.
  • d Schematic representation of the T-DNA region of the pHSl ⁇ transformation vector
  • the transformation vector pHS16 was obtained by cloning the HindII-StuI cDNA fragment originating from pTL3 (see a and b) into the binary vector pJRIRi (see c) linearized by digestion with the restriction enzyme SmaI. The cDNA sequence is inserted in sense orientation. e) Schematic representation of the T-DNA region of the pHS1 transformation vector
  • the transformation vector pHS1 was obtained by cloning the HindII-StuI cDNA fragment originating from pTL3 (see a and b) into the binary vector pJRIRi (see c) linearized by digestion with the restriction enzyme SmaI.
  • the cDNA sequence is inserted in antisense orientation.
  • Figure 5 Preparation of the plasmid pES22 a) Schematic representation of the cDNA fragment contained in the plasmid pTL3
  • the cDNA sequence encoding a tobacco laccase is shown in white.
  • the non-coding 5 'and 3' ends of the cDNA are marked in black.
  • cDNA insertion was released by digestion with the restriction enzymes SmaI and EcoRV.
  • the transformation vector pES22 was obtained by cloning of the Smal-EcoRV cDNA fragment originating from pTL3 (see a) into the binary vector pJRIRi (see b) linearized by digestion with the restriction enzyme Smal.
  • the cDNA sequence is inserted in antisense orientation.

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Abstract

La présente invention concerne toute séquence d'ADN comprenant à titre de région codante, tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant pour une laccase, ou tout ou partie de la séquence nucléotidique complémentaire de cette dernière et codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné. L'invention vise également l'utilisation des séquences susmentionnées pour la mise en oeuvre de procédés de régulation de la biosynthèse de lignines chez les plantes.

Description

SEQUENCES D'ADN CODANT POUR DES LACCASES, ET LEURS APPLICATIONS DANS LE DOMAINE DE LA REGULATION DES TENEURS EN LIGNINES DES PLANTES.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences d'ADN codant pour des laccases chez les plantes, ou de tout fragment de ces séquences, ou encore de toute séquence dérivée de ces dernières, ou de leurs séquences complémentaires, dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de régulation du taux de lignine chez les plantes.
Les laccases (p. diphénol : O2 oxydoreductase, EC 1.10.3.2) oxydent des substrats phenoliques en utilisant l'oxygène en tant qu'accepteur d'électron. Ce sont des glycoprotéines fixant quatre ions cuivre, qui constituent avec l'ascorbate oxydase et la céruloplasmine, un groupe de métallo-enzymes appelé les "oxydases bleues, à cuivre" (Messerschmidt and
Huber, 1990 ; Ryden and Hunt, 1993).
Tout d'abord identifiées dans l'arbre à laque du Japon {Rhus vernicifera) , il a ensuite été montré que les laccases sont réparties dans de nombreux organismes (champignons, plantes supérieures, insectes et bactéries), et beaucoup de fonctions différentes leur ont été attribuées (Dean and Eriksson, 1994).
Chez les plantes, l'unique fonction attribuée aux laccases est celle de leur probable implication dans la polymérisation oxydative de composés phenoliques dans le cadre de la biosynthèse de lignine. Bien que l'implication des laccases dans la lignification a été remise en question pendant des années, plusieurs études récentes ont abouti à reconsidérer leur rôle dans ce processus (Driouich et al. , 1992 ; O'Malley et al. , 1993 ; Dean and Eriksson, 1994).
A l'heure actuelle, le mécanisme enzymatique exact de la polymérisation des monolignols lors de la formation des lignines, demeure inconnu. Une approche possible permettant de clarifier le rôle de ces enzymes est de réguler (soit dans le sens d'une diminution, soit dans le sens d'une augmentation), l'expression des gènes correspondants dans des plantes transgéniques et de rechercher les différences résultantes en teneur et/ou en composition des lignines chez ces plantes transformées par rapport à des plantes non transformées.
Une telle approche a déjà été expérimentée avec le gène d'une peroxydase anionique et avec différents gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse des lignines (Boudet et al. , 1995). Ces enzymes susmentionnées impliquées dans la biosynthèse des lignines, sont principalement l'O-méthyl transférase (OMT), la cinnamyl alcool deshydrogénase (CAD) et la cinnamoyl CoA réductase (CCR).
Les lignines sont des polymères de monolignols, et les trois enzymes citées ci-dessus sont impliquées dans la biosynthèse des monolignols.
Ces approches ont été réalisées au cours des dernières années dans la perspective de modifier qualitativement et/ou quantitativement les lignines dans les plantes fourragères et les espèces ligneuses utilisées pour la production de pâte à papier. Les objectifs principaux de ces études étaient respectivement d'améliorer la digestibilité des fourrages et de réduire les pollutions liées au blanchiment des pâtes à papier.
Les laccases quant à elles, agissent sur les étapes ultérieures extracellulaires d'assemblage de ces monolignols.
Toutefois, aucune approche tentant de vérifier l'influence que pourrait avoir un procédé de diminution ou d'augmentation de l'expression de gènes codant pour des laccases sur la quantité et la qualité des lignines produites par des plantes transformées, n'a été effectuée jusqu'à maintenant.
Seuls des ADNc codant pour des laccases ont été isolés à partir de sycomore (Delaunay et al. , 1994 ; La Fayette et al. , 1995). Mais la transformation génétique du sycomore n'étant pas encore réalisable, aucune conclusion n'a pu être apportée par ces travaux sur l 'influence possible de la régulation de l'expression du gène de ces laccases sur la teneur et la qualité des lignines produites.
L'un des buts de la présente invention est celui de fournir un procédé permettant de modifier les lignines des plantes, cette modification intervenant au niveau de la composition et/ ou de la quantité des lignines produites.
La présente invention a plus particulièrement pour but de fournir un procédé permettant de réguler efficacement les teneurs en lignines dans les plantes, soit dans le sens d'une diminution sensible de ces teneurs par rapport aux teneurs normales dans les plantes, soit dans le sens d'une augmentation de ces teneurs.
Un autre but de la présente invention est de fournir les outils pour la mise en oeuvre d'un tel procédé, et plus particulièrement des constructions utilisables pour la transformation de plantes. Un autre but de la présente invention est de fournir des plantes transformées génétiquement, notamment des plantes fourragères susceptibles d'être mieux digérées que les plantes non transformées, ou encore des plantes ou arbres transformés pour la production de la pâte à papier, et dont l'extraction des lignines serait facilitée et moins polluante que dans le cas d'arbres non transformés.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir des plantes transformées davantage résistantes à des attaques de l'environnement, notamment à des attaques parasitaires, que ne le sont les plantes non transformées, ou encore des plantes transformées de plus grande taille, ou de taille plus réduite (que celle des plantes non transformées).
L'invention est illustrée à l'aide des figures 1 à 5 suivantes :
- figure 1 : représentation de la construction du plasmide pBKTL8 conçu pour sur-exprimer un gène codant pour une laccase; il a été réalisé à partir de
SEQ ID NO 1 , à savoir à partir d'une séquence complète d'ADNc codant une laccase de tabac (séquence codante et extrémités 5 ' et 3 ' non codantes de l'ADNc),
- figure 2 : représentation de la construction du plasmide pMBKTL correspondant au plasmide pBKTL8 présenté dans la figure 1 dans lequel le site de restriction Ncol situé en amont de la séquence codant la laccase de tabac, a été éliminé,
- figure 3 : représentation de la construction du plasmide pNKTL conçu pour sur-exprimer un gène codant pour une laccase; il a été réalisé à partir de la séquence d'ADNc codant une laccase de tabac délimitée par les nucleotides situés aux positions 82 et 1755 de SEQ ID NO 1 (clonage de la région codante uniquement).
- figure 4 : représentation de la construction des plasmides pHSl et pHSlό conçus pour diminuer l'expression du (des) gène(s) codant pour la (les) laccase(s); ils ont été réalisés à partir d'une séquence partielle d'ADNc codant une laccase de tabac, à savoir la séquence délimitée par les nucleotides situés aux positions 292 et 1766, qui a été clonée en orientation sens dans le cas du plasmide pHS16 et en orientation antisens dans le cas du plasmide pHSl .
- figure 5 : représentation de la construction du plasmide pES22 conçu pour diminuer l'expression du (des) gène(s) codant pour la (les) laccase(s); il a été réalisé à partir de SEQ ID NO 1 , à savoir à partir d'une séquence complète d'ADNc codant une laccase de tabac (séquence codante et extrémités 5 ' et 3 ' non codantes de l'ADNc) qui a été clonée en orientation antisens.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes contenant une (ou plusieurs) région(s) codante(s), cette (ces) région(s) codante(s) étant constituée(s) :
- d'une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou d'un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou d'une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou
- d'une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, pour la transformation de cellules végétales en vue de l'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles la biosynthèse des lignines est régulée soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution des teneurs en lignines produites, par rapport aux teneurs normales en lignines produites chez les plantes non transformées, et/ou dans le sens d'une modification de la composition (et donc des caractéristiques physicochimiques de ces dernières, telles que l'extraction par les solvants habituellement utilisés dans l'industrie papetière) des lignines produites par lesdites plantes transgéniques par rapport aux lignines produites chez les plantes non transformées. Par l'expression "séquence nucléotidique dérivée" , dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute séquence présentant au moins environ 60 % (et plus particulièrement au moins environ 80 %) de nucleotides identiques à ceux de la séquence dont elle dérive.
Par "protéine dérivée" dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute protéine présentant au moins environ 50 % (et plus particulièrement au moins environ 70 %) d'acides aminés homologues à ceux de la protéine dont elle dérive.
Parmi les séquences nucléotidiques susceptibles d'être contenues dans les séquences nucléotidiques recombinantes susmentionnées, on peut citer principalement:
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 1 , codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour la laccase de tabac représentée par SEQ ID NO 2, - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 3, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 4,
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 5, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 6,
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s 'hy brider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, et plus particulièrement avec l 'ARNm codé par les séquences SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, et SEQ ID NO 5 respectivement,
- la séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5 , notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant soit pour un ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour les fragments de laccase représentés par SEQ ID NO 4, ou SEQ ID NO 6, soit pour une protéine dérivée de la laccase ou fragments de laccase susmentionnés, - la séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique complémentaire susmentionnée, par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, et plus particulièrement avec un des ARNm susmentionnés.
La présente invention a plus particulièrement pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 1 , codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour une protéine dérivée de cette dernière. La présente invention a plus particulièrement pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 3, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 4, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 4, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 3, susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour le fragment de laccase représenté par SEQ ID NO 4, ou pour une protéine dérivée de ce dernier.
La présente invention a plus particulièrement pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 5, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 6, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 6, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour le fragment de laccase représenté par
SEQ ID NO 6, ou pour une protéine dérivée de ce dernier.
Par les expressions "fragments de laccase" ou "protéines dérivées" dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute protéine possédant une activité de polymérisation des monolignols en l'absence de peroxyde d'hydrogène telle que mesurée selon la méthode de Sterjiades et al. (1992) publiée dans Plant
Physiology, 99 ; 1162 - 1168.
L'invention a également pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 1 , cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, à savoir avec l 'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou
- un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s 'hy brider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l 'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, tel que défini ci-dessus, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné.
La présente invention a plus particulièrement pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 3, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l 'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 4, à savoir l 'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 3, ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou
- un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 4, telle que définie ci- dessus, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné.
La présente invention a plus particulièrement pour objet toute séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 5, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 6, à savoir l'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 5, ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou
- un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 6, telle que définie ci- dessus, ou - toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné. II va de soi que les séquences représentées par SEQ ID NO 1 ,
SEQ ID NO 3, et SEQ ID NO 5, les séquences complémentaires, les séquences dérivées et les fragments de séquences de l'invention mentionnées ci-dessus, doivent être pris en considération comme étant représentées dans le sens 5' → 3' . Ainsi, le premier nucleotide d'une séquence complémentaire dans le sens
5' → 3' telle que décrite ci-dessus, est le complément du dernier nucleotide de la séquence dans le sens 5' — > 3' codant pour une laccase (ou fragment de laccase ou protéine dérivée), le second nucleotide de cette séquence complémentaire est le complément de l' avant-dernier nucleotide de la séquence codant pour une laccase, et ainsi de suite, jusqu'au dernier nucleotide de ladite séquence complémentaire qui est le complément du premier nucleotide de la séquence codant pour une laccase.
L'ARNm codé par la séquence complémentaire susmentionnée est tel que, lorsque cet ARNm est représenté dans le sens 5' → 3' , son premier nucleotide correspond au dernier nucleotide de la séquence codant pour une laccase, et donc s 'hybride avec le dernier nucleotide de l'ARNm codé par cette dernière, tandis que son dernier nucleotide correspond au premier nucleotide de la séquence codant pour une laccase, et donc s'hybride avec le premier nucleotide de l'ARNm codé par cette dernière. Ainsi, on entend par ARNm antisens dans ce qui précède et ce qui suit, tout ARNm codé par la susdite séquence complémentaire et représenté dans le sens inverse (3' -> 5') du sens dans lequel est représenté l'ARNm codé par la séquence codant pour une laccase (ou fragment de laccase ou protéine dérivée), ce dernier ARNm étant encore désigné ARNm sens (5' — > 3'). Le terme d'ARN antisens s'adresse donc à une séquence d'ARN complémentaire de la séquence en bases de l'ARN messager, le terme complémentaire devant être compris en ce sens que chaque base (ou une majorité de bases) de la séquence antisens (lue dans le sens 3' → 5') est capable de s'apparier avec les bases correspondantes (G avec C, A avec U) de l'ARN messager (séquence lue dans le sens 5' -→ 3 ').
La stratégie des ARN antisens, dans le cadre de la présente invention, est une approche moléculaire particulièrement adaptée à l 'objectif d'une modulation des taux de lignines des plantes. L'ARN antisens est un ARN produit par la transcription du brin d'ADN non codant (brin non-sens).
Cette stratégie antisens est plus particulièrement décrite dans le brevet européen n° 240 208.
L' invention concerne également tout ARNm codé par une séquence d'ADN selon l' invention, et plus particulièrement: - l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour la laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 2, ou pour un fragment de cette laccase ou une protéine dérivée tels que définis ci-dessus, - l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 3, ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour le fragment d'une laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 4, ou pour un fragment de ce dernier ou une protéine dérivée tels que définis ci- dessus,
- l 'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 5, ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour le fragment d'une laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 6, ou pour un fragment de ce dernier ou une protéine dérivée tels que définis ci- dessus.
L'invention a également pour objet tout ARNm antisens, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend des nucleotides complémentaires de la totalité ou d'une partie seulement des nucleotides constituant un ARNm tel que décrit ci-dessus selon l'invention, ledit ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider (ou de s'apparier) avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment avec un ARNm tel que décrit ci-dessus.
A ce titre, l'invention vise plus particulièrement les ARNm antisens codés par des séquences d'ADN selon l'invention, comprenant au moins une région de 100 bases homologues à celles d'une région des séquences complémentaires des séquences d'ADN susmentionnées de l'invention.
Il n'y a pas de limite supérieure de taille pour les séquences d'ADN codant pour un ARN antisens selon l'invention; elles peuvent être aussi longues que celles du messager normalement produit dans les cellules, voire aussi longues que la séquence d'ADN génomique codant pour l'ARNm d'une laccase.
L'invention a plus particulièrement pour objet:
- tout ARNm antisens, tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par
SEQ ID NO 1 , ledit ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 ,
- tout ARNm antisens, tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par
SEQ ID NO 3, ledit ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 3,
- tout ARNm antisens, tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par
SEQ ID NO 5, ledit ARNm antisens étant susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 5.
L' invention concerne également les polypeptides recombinants codés par les séquences d'ADN de l'invention, lesdits polypeptides recombinants présentant, le cas échéant, une activité de polymérisation des monolignols chez les plantes, et plus particulièrement les polypeptides recombinants représentés par SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, et SEQ ID NO 6, codés respectivement par les séquences représentées par SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, et SEQ ID NO 5 , ou par des séquences dérivées de ces dernières selon l' invention.
L'invention a plus particulièrement pour objet les polypeptides recombinants, et notamment les laccases recombinantes, tels qu'obtenus par transformation de cellules végétales en intégrant de façon stable dans leur génome, une séquence nucléotidique recombinante telle que définie ci-après, contenant une séquence d'ADN selon l' invention, notamment à l'aide d'un vecteur tel que décrit ci-après.
Par l'expression "polypeptides recombinants" , on doit entendre toute molécule possédant une chaîne polypeptidique susceptible d'être produite par génie génétique, par l' intermédiaire d'une phase de transcription de l'ADN du gène correspondant, ce qui conduit à l'obtention d'ARN qui est par la suite transformé en ARNm (par suppression des introns), ce dernier étant ensuite traduit par les ribosomes, sous forme de protéines, le tout étant effectué sous contrôle d'éléments de régulation appropriés à l' intérieur d'une cellule hôte. Par conséquent, l'expression "polypeptides recombinants" utilisée n'exclut pas la possibilité que lesdits polypeptides comprennent d'autres groupements, tels que les groupements glycosylés.
Bien entendu, le terme "recombinant" indique que le polypeptide a été produit par génie génétique, car il résulte de l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, de la séquence nucléotidique correspondante qui a été auparavant introduite dans un vecteur d'expression utilisé pour transformer ledit hôte cellulaire. Toutefois, ce terme "recombinant" n'exclut pas la possibilité que le polypeptide soit produit par un procédé différent, par exemple par synthèse chimique classique selon les méthodes connues utilisées pour la synthèse de protéines, ou par clivage protéolytique de molécules de plus grande taille.
L'invention concerne plus particulièrement les laccases de tabac telles qu'obtenues sous forme essentiellement pure par extraction et purification à partir de tabac, et plus particulièrement la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou celle comprenant le polypeptide représenté par SEQ ID NO 4, ou encore celle comprenant le polypeptide représenté par SEQ ID NO 6, ou toute protéine dérivée de ces dernières, notamment par addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou tout fragment issu desdites laccases ou de leurs séquences dérivées. L' invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour les polypeptides représentés par SEQ ID NO 4, et SEQ ID NO 6, ou toute séquence dérivée ou fragment de ces derniers, tels que définis ci-dessus, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles correspondent à tout ou partie des séquences représentées par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3 , ou SEQ ID NO
5, respectivement, ou à toute séquence dérivée de ces dernières par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins susceptibles de coder pour les laccases ou séquence dérivée ou fragment de ces dernières, tels que définis ci-dessus. L' invention vise également les complexes formés entre les ARNm antisens, tels que décrits ci-dessus, et les ARNm selon l' invention, susceptibles de coder pour tout ou partie d'une laccase chez les plantes.
L'invention a plus particulièrement pour objet le complexe formé entre l ' ARNm codé par la séquence SEQ ID NO 1 et l'ARNm antisens codé par la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO 1 , celui formé entre l'ARNm codé par la séquence SEQ ID NO 3 et l'ARNm antisens codé par la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO 3 , ainsi que celui formé entre l 'ARNm codé par la séquence SEQ ID NO 5 et l'ARNm antisens codé par la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO 5.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique recombinante contenant une (ou plusieurs) région(s) codante(s), cette (ces) région(s) codante(s) étant constituée(s):
- d'une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou d'un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase chez les plantes, ou d'une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée de la laccase, ou
- d'une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes.
L' invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique recombinante (ou ADN recombinant), caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN selon l'invention, choisie parmi celles décrites ci-dessus, ladite séquence d'ADN étant insérée dans une séquence hétérologue.
L'invention concerne plus particulièrement toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, comprenant la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 1 , ou par SEQ ID NO 3, ou par SEQ ID NO 5, ou tout fragment ou une séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, tels que définis ci-dessus, lesdites séquences nucléotidiques ou ledit fragment étant insérés dans une séquence hétérologue, et étant susceptibles de coder pour le polypeptide représentée par SEQ ID NO 2, ou par SEQ ID NO 4, ou par SEQ ID NO 6, respectivement, ou pour un fragment de ces polypeptides, ou pour une protéine dérivée de ces derniers, tels que définis ci-dessus. L'invention concerne plus particulièrement encore, toute séquence nucléotidique recombinante comprenant une séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 1 , ou par SEQ ID NO 3, ou par SEQ ID NO 5, ou tout fragment ou toute séquence nucléotidique dérivée de cette séquence complémentaire, tels que définis ci-dessus, lesdites séquences complémentaires ou ledit fragment étant insérés dans une séquence hétérologue, et étant susceptibles de coder pour un ARNm antisens capable de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codant pour une laccase chez les plantes, et plus particulièrement avec tout ou partie de l'ARNm codant pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour les fragments de laccase représentés par SEQ ID NO 4, ou par SEQ ID NO 6, respectivement.
Les ADN recombinants selon l'invention sont davantage caractérisés en ce qu' ils comprennent les éléments nécessaires pour réguler l'expression de la séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'une laccase selon l ' invention, ou de sa séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens selon l' invention, notamment un promoteur et un terminateur de la transcription de ces séquences.
Parmi les différents promoteurs susceptibles d'être utilisés dans les constructions d'ADN recombinants selon l'invention, on peut citer: - le promoteur endogène contrôlant l'expression de la laccase chez une plante, notamment le promoteur situé en amont de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , ou SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5 chez le tabac, ou
- des promoteurs de type constitutif à forte expression, tels que, par exemple, le promoteur 35S du CAMV (décrit dans Benfey et al. (1990), EMBO J. , 9 (6), 1677-1684),
- des promoteurs de type spécifique à expression particulière dans des tissus individuels.
L' invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, et comprenant également au moins une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'un ARNm codant lui- même pour une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment l'ARNm codant pour l'alcool cinnamylique deshydrogénase (CAD), et/ou l 'ARNm codant pour la cinnamoyl CoA réductase (CCR), et/ou l'ARNm codant pour l 'O-méthyltransférase (OMT), ou comprenant également au moins une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné, notamment avec l 'ARNm codant pour la CAD, la CCR ou l'OMT. L' invention a également pour objet tout vecteur recombinant, utilisable pour la transformation de plantes, caractérisé en ce qu' il comprend une séquence nucléotidique recombinante choisie parmi celles décrites ci-dessus, selon l ' invention, intégrée dans l'un des sites de son génome non essentiels pour sa réplication.
La présente invention a également pour objet un procédé de régulation de la biosynthèse des lignines chez les plantes, soit par diminution, soit par augmentation des quantités de lignines produites, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez ces plantes, ledit procédé comprenant une étape de transformation de cellules de ces plantes à l'aide d'un vecteur contenant:
- une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou
- une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, c i: complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence . cléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, stte séquence complémentaire codant pour une séque.. ' nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s' h rider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, ladite transformation étant effectuée notamment à l'aide d'un vecteur tel que décrit ci-dessus.
La présente invention a plus Darticulièrement pour objet un procédé de diminution des quantités de lignine produites chez les plantes, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez ces plantes, ledit procédé comprenant une étape de transformation de cellules de ces plantes à l'aide d'un vecteur contenant :
- une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation, et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, ladite transformation étant effectuée notamment à l 'aide d 'un vecteur tel que décrit ci-dessus.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de diminution des quantités de lignines produites chez les plantes, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez ces plantes, ledit procédé comprenant une étape de transformation de cellules de ces plantes à l'aide d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, ladite transformation étant effectuée notamment à l'aide d'un vecteur tel que décrit ci-dessus. A ce titre, invention a plus particulièrement pour objet un procédé de diminution de la quantité de lignines produite par biosynthèse chez les plantes, ce procédé étant effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant:
- au moins une séquence d'ADN selon l'invention telle que décrite ci- dessus, codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec tout ou partie de l'ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour un fragment de laccase représenté par SEQ ID NO 4, ou SEQ ID NO 6, ou pour une protéine dérivée de ces derniers telle que définie ci-dessus, - et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour un
ARNm antisens capable de s'hybrider à un ARNm codant pour une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment l 'ARNm codant pour la CAD, la CCR ou f OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, contenant une séquence d'ADN codant pour un ARNm antisens capable de s' hybrider avec l'ARNm codant pour une laccase ou pour une protéine dérivée, telle que définie ci-dessus, et, le cas échéant, contenant une ou plusieurs séquence(s) d'ADN codant pour un ARNm antisens capable de s'hybrider à un ARNm codant pour une autre enzyme que la laccase telle que définie ci-dessus,
- soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence d'ADN codant pour un ARNm antisens capable de s'hybrider avec l'ARNm codant pour une laccase ou pour une protéine dérivée, telle que définie ci-dessus, tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour un ARNm antisens capable de s'hybrider à un ARNm codant pour une autre enzyme que la laccase, telle que définie ci-dessus.
Un autre procédé de diminution de la quantité de lignines produites par biosynthèse chez les plantes, est celui réalisé par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager ARN(m), cet ARN(m) codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase.
Cette dernière méthode fait appel au mécanisme de co-suppression. La co-suppression a été observée quand des copies du gène endogène ont été introduites dans le génome. Bien que le mécanisme de la co-suppression soit actuellement inconnu, une des hypothèses les plus fréquemment retenue est que la régulation négative de l'expression du gène viendrait de la production d'une faible proportion d'ARN antisens dérivée d'un transgène à travers une lecture du "mauvais" brin du transgène (Grierson et al. , Trends Biotech. , 9: 122-123). A ce titre, l' invention a plus particulièrement pour objet un procédé de diminution de la quantité de lignines produites par biosynthèse chez les plantes, ce procédé étant effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant : - au moins une séquence d'ADN selon l' invention représentée par
SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus,
- et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment une séquence d'ADN codant pour tout ou partie de la CAD, ou de la CCR, ou de l 'OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, contenant la séquence d'ADN selon l'invention susmentionnée, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, et, le cas échéant, contenant une ou plusieurs séquence(s) d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus,
- soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence d'ADN selon l'invention susmentionnée, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus. II est important de noter que les méthodes susmentionnées permettent d'aboutir à des plantes transformées présentant des niveaux différents de réduction de l'activité des laccases (selon le niveau d'insertion de la séquence d'ADN codant pour l'ARNm antisens, le nombre de copies de cette séquence d'ADN intégrée dans le génome...), et donc des teneurs en lignines. Le choix des transformants permettra donc une modulation contrôlée des teneurs en lignines compatible avec un développement normal de la plante.
D'une manière générale, si l'on considère que la teneur moyenne normale en lignines d'une plante varie entre environ 15 % et environ 35 % en poids de matière sèche, la réduction de la teneur en lignines résultant de la mise en oeuvre d'un des procédés susmentionnés, est avantageusement telle que les plantes ainsi transformées présentent une teneur moyenne en lignines réduite d'au moins environ 2 à 3 % par rapport à la teneur moyenne normale en lignines d'une plante non transformée. A titre d' illustration, la teneur en lignines d'une plante peut être mesurée selon les méthodes décrites par Effland (1977) dans Tappi, 60, 143-144, ou par Iiyama et Wallis (1990) dans J. Sci. Food Agric , 51 , 145-161 .
L'invention vise plus particulièrement l'application des procédés susmentionnés de diminution des teneurs en lignines dans les plantes, à l'obtention de plantes fourragères transformées génétiquement, présentant des teneurs en lignines réduites par rapport aux teneurs normales en lignines chez ces plantes, et dont la digestibilité se trouve être ainsi améliorée par rapport à ces mêmes plantes non transformées. Parmi les principales plantes fourragères susceptibles d'être transformées dans le cadre de la présente invention, on peut citer: la luzerne, la fétuque, le maïs destiné à l'ensilage, etc ..
L' invention concerne également l'application des procédés susmentionnés de diminution des teneurs en lignines chez les plantes, à l'obtention de plantes, et plus particulièrement d'arbres, transformés génétiquement, présentant des teneurs en lignines réduites par rapport aux teneurs normales en lignines chez ces plantes, ces plantes ou arbres étant particulièrement avantageux à utiliser dans le cadre de la production de la pâte à papier. Un troisième domaine potentiel d'application des procédés susmentionnés de régulation négative de l'expression du gène de la laccase, concerne la stimulation de la croissance des plantes transformées. Il semble en effet qu'une lignification précoce et rapide soit un frein au grandissement cellulaire et donc à la croissance des végétaux. Ainsi la mise en oeuvre des procédés susmentionnés est susceptible de permettre pour les plantes ainsi transformées à lignification réduite une meilleure croissance et donc de meilleurs rendements.
L'invention concerne également un procédé d'augmentation de la quantité de lignines produites par biosynthèse chez les plantes, ce procédé étant effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement un procédé d'augmentation de la quantité de lignines produites par biosynthèse chez les plantes, ce procédé étant effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant : - au moins une séquence d'ADN selon l' invention représentée par
SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus,
- et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d 'une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment une séquence d'ADN codant pour tout ou partie de la CAD, et/ou de la CCR, et/ou de l'OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, contenant la séquence d'ADN selon l'invention susmentionnée, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, et, le cas échéant, contenant une ou plusieurs séquence(s) d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus,
- soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence d'ADN selon l'invention susmentionnée, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette dernière, tels que définis ci-dessus, tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus. D'une manière générale, toujours si l'on considère que la teneur moyenne normale en lignines d'une plante varie entre environ 15% et environ 35 % en poids de matière sèche, l'augmentation de la teneur en lignines résultant de la mise en oeuvre du procédé susmentionné, est avantageusement telle que les plantes ainsi transformées présentent une teneur moyenne en lignines augmentée d'au moins environ 2 à 5 % par rapport à la teneur moyenne normale d'une plante non transformée.
L'invention vise plus particulièrement l'application du procédé susmentionné d'augmentation des teneurs en lignines dans les plantes (encore désigné procédé de surexpression du gène de la laccase), à l'obtention de plantes transformées génétiquement, présentant des teneurs en lignines augmentées par rapport aux teneurs normales en lignines chez ces plantes, et dont les propriétés de résistance à des attaques de l'environnement, notamment à des attaques parasitaires, se trouvent être ainsi améliorées par rapport à ces mêmes plantes non transformées. Il est particulièrement avantageux dans ce dernier cas, d'utiliser en association avec le gène de la laccase, ou une séquence dérivée, dans les vecteurs susmentionnés, des promoteurs spécifiques particulièrement exprimés dans les tissus de surface et/ou en réponse à la blessure. Par ailleurs, l'invention concerne également l'application du procédé susmentionné de surexpression du gène de la laccase, à l'amélioration de la croissance des plantes ainsi transformées génétiquement, notamment dans certains domaines tels que l'horticulture ou l'arboriculture, où il est souhaitable d'obtenir des plantes de dimension réduite. Enfin, les cycles benzéniques de la lignine ont une plus grande énergie intrinsèque que les chaînes aliphatiques des résidus glucose de la cellulose. Ainsi, l'augmentation de la proportion de lignines chez les végétaux utilisés comme combustibles, selon le procédé susmentionné de l'invention, permet d'améliorer le potentiel énergétique de ces végétaux combustibles ainsi transformés.
La présente invention a également pour objet un procédé de modification de la composition, et donc des caractéristiques physicochimiques, des lignines produites par les plantes transformées, par rapport aux lignines normalement produites chez ces plantes, ledit procédé comprenant une étape de transformation de cellules de ces plantes à l'aide d'un vecteur contenant :
- une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou - une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, ladite transformation étant effectuée notamment à l'aide d'un vecteur tel que décrit ci-dessus. S 'agissant des techniques de transformation utilisées pour la mise en oeuvre d'un des procédés décrits ci-dessus de l'invention, on aura avantageusement recours aux techniques suivantes:
A) La technologie de transformation par l'intermédiaire du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens décrite par Bevan (1984) Nucleic Acid Research,
12: 871 1-8721. Elle fait appel essentiellement à la méthode de co-culture, et fait intervenir une co-transformation avec un gène de sélection pour pouvoir repérer les transformants.
Elle est particulièrement applicable aux dicotylédones, ex. : tabac, luzerne, colza.
B) La technique de transfert direct de gènes par biolistique décrite en détail par (Zumbrum et al., 1989, Technique 1, 204-216; Sanford et al. , 1991 , Technique 3, 3-16).
Cette technique implique l'association de l'ADN recombinant selon l'invention à des microparticules d'or ou de tungstène qui sont propulsées à l'aide d'un canon à particules sur le tissu à transformer. Elle sera particulièrement appliquée à la transformation d'espèces réfractaires aux agrobactéries.
Dans les deux cas susmentionnés, la vérification de la présence de l'ADN recombinant selon l'invention sera réalisée par des expériences d'hybridation de type Southern et d'amplification génique (polymerase chain reaction), à l'aide de sondes et d'amorces oligonucléotidiques issues notamment de la séquence SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5.
L'invention concerne également les cellules de plantes transformées par un vecteur selon l'invention, notamment par les techniques décrites ci-dessus, et comprenant une séquence d'ADN selon l'invention intégrée de façon stable dans leur génome.
L'invention vise également les plantes transformées telles qu'obtenues par culture des cellules transformées susmentionnées. Les plantes transformées peuvent être ensuite propagées par voie sexuelle ou par voie végétative in vitro ou in natura.
L'invention a également pour objet les fragments de plantes, notamment fruits, semences, pollen, transformés par incorporation dans leur génome d'une séquence d'ADN selon l'invention, à l'aide des vecteurs recombinants susmentionnés.
L'invention concerne également les anticorps dirigés contre les polypeptides recombinants de l'invention, et plus particulièrement ceux dirigés contre les laccases recombinantes, ou fragments de laccases, susmentionnés. De tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec ces polypeptides suivie de la récupération des anticorps formés.
Il va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux. Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide susmentionné initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention vise également l'utilisation des anticorps susmentionnés dirigés contre les polypeptides recombinants de l'invention, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection ou de dosage des laccases chez les plantes, à partir d'échantillons prélevés chez ces dernières.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit du clonage de l'ADNc codant pour la laccase de tabac, et de la construction de plasmides contenant des séquences nucléotidiques de l'invention. 1) Clonage de l'ADNc codant pour la laccase de tabac
Une banque d'ADNc provenant de tiges de tabac (Nicoliana tabacum cv Samsun), construite dans le site EcoRI du vecteur λ ZAPII (Stratagene, Cambridge, U.K.), a été criblée à l'aide d'une sonde hétérologue de laccase de sycomore. Cette sonde correspond à la séquence d'un ADNc de 435 paires de base (pb) publiée par Delaunay et al. (1994), codant pour une partie de la laccase susmentionnée et recouvrant l'extrémité 3' de la séquence d'ADNc (comprenant une zone codant pour une protéine avec deux régions conservées de fixation du cuivre) publiée par La Fayette et al. (1995).
Environ 400.000 plages de lyse ont été criblées et quatre clones positifs ont été détectés. Après excision du phage λZAPII dans le plasmide pBluescript
(SK-) in vivo, ces clones ont été examinés.
La taille approximative de l' insert des quatre clones (pTLl-4) varie d'environ 700 pb à 2000 pb.
Une analyse préliminaire à l'aide d'enzymes de restriction de ces clones, a permis de montrer que deux d'entre eux (pTLl et pTL3) contiennent le même insert (également confirmé par séquençage partiel de ces clones).
Les trois clones pTL2, pTL3 et pTL4 ont été davantage caractérisés par séquençage. Parmi les trois clones analysés, celui possédant l' insert de plus grande taille, à savoir pTL3, contient un ADNc codant pour une laccase complète. L' insert PTL3 est long de 1984 pb (SEQ ID NO 1 ) et est constitué d'une région non traduite de 81 pb en 5' , d'une phase de lecture ouverte codant pour une laccase de 1674 pb, et d'une région non codante de 229 pb en 3 ' .
Les deux autres ADNc des clones pTL2 et pTL4 sont longs de 1512 pb (SEQ ID NO 2) et 630 (SEQ ID NO 3) respectivement, et correspondent à des séquences partielles ne contenant pas la région codant pour la partie N- terminale de la laccase. Toutefois, les clones pTL2, -3 et -4 contiennent des séquences d'ADNc codant des laccases différentes, puisque leurs séquences sont différentes dans les régions se chevauchant. La séquence déduite en acides aminés de la séquence nucléotidique de l'insert de pTL3 est identique à 89 % aux séquences en acides aminés dérivées de pTL2 et pTL4 qui présentent 95 % d'identité entre elles. Les trois séquences d'ADNc ont également des régions non codantes en 3 ' différentes.
L' insert d'ADNc de pTL3 code pour un polypeptide de 557 acides aminés (61 ,9 kDa) avec un point isoélectrique (pi) de 10,08.
La protéine déduite possède douze sites de N-glycosylation possibles (Asn-Xaa-Ser/Thr). La région hydrophobe N-terminale de 22 acides aminés représente vraisemblablement le peptide signal, comme le laisse suggérer la comparaison avec la séquence de la laccase de sycomore. La scission de ce peptide signal doit avoir lieu entre les résidus Lys en position 22 et Arg en position 23 selon les règles de Von Heijne (Von Heijne, 1986). En conséquence, la protéine mature contient 535 acides aminés (59,4 kDa). La comparaison de la séquence entière en acides aminés déduite de la séquence de pTL3 avec la séquence en acides aminés déduite de la laccase de sycomore (Acer pseudoplatanus) (La Fayette et al. , 1995) indique que ces deux protéines ont 48 % d'identité, cette identité étant même supérieure (60 %) lorsque les 100 acides aminés C-terminaux sont considérés. Cette région C-terminale contient deux sites potentiels de fixation du cuivre.
La séquence de la laccase de tabac a également été comparée avec d'autres oxydases à cuivre trouvées dans les banques de données. Parmi ces protéines, celles ayant présenté la plus grande homologie sont les ascorbate oxydases de concombre et de tabac avec 36 % et 34 % d' identité respectivement, par utilisation du programme BESTFIT (Genetics Computer Group, Wisconsin Package, Version 8).
Des comparaisons similaires ont été effectuées avec les laccases fongiques; 31 % et 28 % d' identité en acides aminés ont été trouvés avec les séquences déduites respectivement de Crγptococcus neoformans et Neurospora crassa.
Dans chaque cas, des régions conservées dans la séquence peptidique de la laccase du tabac ont été identifiées, ces régions étant très similaires aux sites de fixation du cuivre conservées parmi les oxydases à cuivre (Ohkawa et al. ,
1989 ; Messerschmidt and Huber, 1990).
2) Construction de plasmides contenant des séquences nucléotidiques de l' invention Le plasmide pBKTL8 (voir figure 1) a été conçu pour sur-exprimer un gène codant pour une laccase; il a été réalisé à partir de SEQ ID NO 1 , à savoir à partir d'une séquence complète d'ADNc codant une laccase de tabac (séquence codante et extrémités 5' et 3' non codantes de l'ADNc).
Le plasmide pMBKTL (voir figure 2) correspond au plasmide pBKTL8 présenté dans la figure 1 dans lequel le site de restriction Ncol situé en amont de la séquence codant la laccase de tabac, a été éliminé.
Le plasmide pNKTL (voir figure 3) a été conçu pour sur-exprimer un gène codant pour une laccase; il a été réalisé à partir de la séquence d'ADNc codant une laccase de tabac délimitée par les nucleotides situés aux positions 82 et 1755 de SEQ ID NO 1 (clonage de la région codante uniquement).
Les plasmides pHSl et pHS16 (voir figure 4) ont été conçus pour diminuer l'expression du (des) gène(s) codant pour la (les) laccase(s); ils ont été réalisés à partir d'une séquence partielle d'ADNc codant une laccase de tabac, à savoir la séquence délimitée par les nucleotides situés aux positions 292 et 1766, qui a été clonée en orientation sens dans le cas du plasmide pHS16 et en orientation antisens dans le cas du plasmide pHSl .
Le plasmide pES22 (voir figure 5) a été conçu pour diminuer l'expression du (des) gène(s) codant pour la (les) laccase(s); il a été réalisé à partir de SEQ ID NO 1, à savoir à partir d'une séquence complète d'ADNc codant une laccase de tabac (séquence codante et extrémités 5' et 3' non codantes de l'ADNc) qui a été clonée en orientation antisens.
Le détail pour la construction de ces plasmides est indiqué dans les légendes des figures 1 à 5 qui suivent. LÉGENDE DES FIGURES
- Figure 1 : Préparation du plasmide pBKTLδ a) Représentation schématique du fragment d'ADNc contenu dans le plasmide pTL3
La séquence d'ADNc codant pour une laccase de tabac est indiquée en blanc. Les extrémités 5' et 3 ' non codantes de l'ADNc sont signalées en noir. L' insertion d'ADNc a été libérée par digestion par les enzymes de restriction Smal et Kpnl. b) Représentation schématique de la cassette d'expression du vecteur de clonage pMJBx
CaMV 35S : séquences augmentant la transcription ("enhancer") et promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV); Ω : élément oméga du virus de la mosaïque du tabac (TMV); nos3 ' : région de terminaison du gène codant la nopaline synthase; le site de multiclonagc est signalé en noir. c) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBKl
Le plasmide pBKl a été obtenu par clonage du fragment d'ADNc Smal- Kpnl provenant de pTL3 (voir a) dans le plasmide pMJBx (voir b) digéré par les enzymes de restriction BamHI (digestion suivie d'un traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymerase I afin de générer une extrémité à bouts francs) et Kpnl. d) Représentation schématique des fragments de restriction issus du plasmide pBKl et utilisés pour le clonage dans le vecteur binaire
- après digestion par les enzymes HindIII et Xbal (en haut)
- après digestion par l'enzyme Xbal (en bas) e) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur binaire pBinl9i RB : région de bordure droite du T-DNA (right border); nos promoter : séquence promoteur du gène codant la nopaline synthase; nptll CDS : séquence codante du gène de résistance à la kanamycine; nos3 ' : séquence de terminaison du gène codant la nopaline synthase; LB : région de bordure gauche du T-DNA (left border); le site de multiclonage est signalé en noir. f) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pBKTLδ
Le vecteur de transformation pBKTL8 a été obtenu par clonage de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBKl (voir c) dans le vecteur binaire pBinl9i (voir e). Ce clonage a été réalisé en deux étapes : le fragment HindIII-Xbal issu de pBKl (voir d) a tout d'abord été inséré dans le plasmide pBinl9i digéré par les enzymes HindIII et Xbal puis le plasmide résultant a été ensuite linéarisé par digestion par l'enzyme Xbal afin de cloner dans un second temps le fragment Xbal-Xbal (voir d).
- Figure 2 : Préparation du plasmide pMBKTL a) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBKl
Le plasmide pBKl a été obtenu par clonage du fragment d'ADNc Smal- Kpnl provenant de pTL3 dans le plasmide pMJBx (voir figure le). Le site de restriction Ncol indésirable est signalé. b) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pMBK41
Le plasmide pMBK41 dérive du plasmide pBKl qui a été modifié afin d'éliminer le site de restriction Ncol. Pour obtenir le plasmide pMBK41 , le plasmide pBKl a été linéarisé par digestion par l'enzyme Ncol puis le site de restriction Ncol a été détruit par une digestion par la nucléase Mung Bean et le plasmide a été refermé sur lui-même. La position du site Ncol éliminé est indiquée. c) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBMK41
Le plasmide pMBK41 a été digéré par l'enzyme de restriction Xhol afin de libérer un fragment correspondant aux séquences oméga et de l'ADNc codant la laccase de tabac (voir d). Les sites Xhol sont signalés. d) Représentation schématique du fragment de restriction généré par digestion du plasmide pMBK41 par l'enzyme Xhol et utilisé pour le clonage dans le vecteur binaire e) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pBKTL8 La construction du plasmide pBKTLδ a été décrite dans la figure 1. Les sites de restriction Xhol présents dans ce plasmide sont indiqués. Le site Ncol est également signalé. pBKTLδ a été digéré par l'enzyme Xhol afin d'éliminer une région correspondant aux séquences oméga et de l'ADNc de laccase de tabac pour la remplacer par la région équivalente mais ne contenant plus le site de restriction Ncol et provenant de pMBK41 (voir c et d). Le schéma suivant
(f) présente le nouveau plasmide obtenu. f) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pMBKTL Le vecteur de transformation pMBKTL a été obtenu par le remplacement d'un fragment de restriction Xhol-Xhol contenant une région correspondant aux séquences oméga et de l'ADNc codant la laccase de tabac du plasmide pBKTLδ (voir e) par un fragment équivalent provenant du plasmide pMBK41 (voir c et d). pMBKTL diffère de pBKTLδ uniquement par l'absence d'un site de restriction Ncol.
- Figure 3 : Préparation du plasmide pNKTL a) Représentation schématique du fragment d'ADNc contenu dans le plasmide pTL3 et des amorces utilisées pour l'amplification par PCR de la séquence codante
La séquence d'ADNc codant pour une laccase de tabac est indiquée en blanc. Les extrémités 5' et 3' non codantes de l'ADNc sont signalées en noir. La position des amorces utilisées pour amplifier par PCR la région correspondant à la séquence codant la laccase de tabac est indiquée. Ces amorces ont été définies de telle sorte qu'elles permettent d' introduire des sites de restriction Ncol (au niveau du codon ATG de début de traduction) et Kpnl aux extrémités 5' et 3' respectivement, du produit d'amplification PCR. b) Représentation schématique du produit d'amplification PCR obtenu à partir du plasmide pTL3 c) Représentation schématique de la cassette d'expression du vecteur de clonage pMJBl
CaMV 35S : séquences "enhancer" et promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV); Ω : élément oméga du virus de la mosaïque du tabac (TMV); nos3' : région de terminaison du gène codant la nopaline synthase; le site de multiclonage est signalé en noir. d) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pNKδ
Le plasmide pNKδ provient du clonage du produit d'amplification PCR obtenu à partir de pTL3, digéré par les enzymes de restriction Ncol et Kpnl
(voir a et b) et inséré dans le plasmide pMJBl (voir c) digéré par les mêmes enzymes.
La majeure partie des séquences provenant de l'amplification PCR a ensuite été éliminée du plasmide pNKδ afin d'éviter la présence d'éventuelles erreurs de séquence. Ceci a été réalisé par le remplacement de la région correspondant au fragment de restriction obtenu par digestion par les enzymes
Bsml et Xbal par la région équivalente provenant du plasmide pTL3 d'origine
(voir e). e) Représentation schématique du fragment d'ADNc contenu dans le plasmide pTL3
La séquence d'ADNc codant pour une laccase de tabac est indiquée en blanc. Les extrémités 5' et 3' non codantes de l'ADNc sont signalées en noir. La position des sites de restriction Bsml et Xbal est indiquée. f) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBX3
Le plasmide pBX3 a été obtenu à partir du plasmide pNKδ par le remplacement d'une région délimitée par les sites de restriction Bsml et Xbal par la région équivalente provenant du plasmide pTL3 d'origine. Les régions issues de l'amplification PCR sont indiquées en noir et ont été vérifiées par séquençage alors que les séquences provenant de l'ADNc d'origine sont représentées en blanc. g) Représentation schématique de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBX3 et des fragments de restriction utilisés pour le clonage dans le vecteur binaire
Les régions issues de l'amplification PCR sont indiquées en noir alors que les séquences provenant de l'ADNc d'origine sont représentées en blanc.
Afin de cloner la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBX3 dans le vecteur binaire pJRIRi, pBX3 a été digéré par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI générant deux fragments de restriction : HindlII-
EcoRI et EcoRI-EcoRI qui ont été clones en deux étapes dans le vecteur binaire. h) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur binaire pJRIRi
LB : région de bordure gauche du T-DNA (left border); nos3' : séquence de terminaison du gène codant la nopaline synthase; CaMV 35S : séquences "enhancer" et promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV); nptll CDS : séquence codante du gène de résistance à la kanamycine; nos promoter : séquence promoteur du gène codant la nopaline synthase; RB : région de bordure droite du T-DNA (right border). i) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pNKTL
Le vecteur de transformation pNKTL a été obtenu par clonage de la cassette d'expression contenue dans le plasmide pBX3 (voir g) dans le vecteur binaire pJRIRi (voir h). Ce clonage a été réalisé en deux étapes : le fragment
HindIII-EcoRI issu de pBX3 (voir g) a tout d'abord été inséré dans le plasmide pJRIRi digéré par les enzymes HindIII et EcoRI puis le plasmide résultant a été ensuite linéarisé par digestion par l'enzyme EcoRI afin de cloner dans un second temps le fragment EcoRI-EcoRI (voir g).
- Figure 4 : Préparation des plasmides pHSl et pHS16 a) Représentation schématique du fragment d'ADNc contenu dans le plasmide pTL3
La séquence d'ADNc codant pour une laccase de tabac est indiquée en blanc. Les extrémités 5 ' et 3' non codantes de l'ADNc sont signalées en noir. Un fragment d'ADNc correspondant à une séquence partielle d'ADNc codant pour une laccase de tabac a été obtenu par digestion du plasmide pTL3 par les enzymes de restriction Hindll et Stul. La position de ces sites de restriction est indiquée. b) Représentation schématique du fragment de restriction généré par digestion du plasmide pTL3 par les enzymes Hindll et Stul et utilisé pour le clonage dans le vecteur binaire c) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur binaire pJRIRi
RB : région de bordure droite du T-DNA (right border); nos promoter : séquence promoteur du gène codant la nopaline synthase; nptll CDS : séquence codante du gène de résistance à la kanamycine; nos3' : séquence de terminaison du gène codant la nopaline synthase; CaMV 35S : séquences "enhancer" et promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV); LB : région de bordure gauche du T-DNA (left border); le site de multiclonage est signalé en noir. d) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pHSlό
Le vecteur de transformation pHS16 a été obtenu par clonage du fragment d'ADNc HindII-StuI provenant de pTL3 (voir a et b) dans le vecteur binaire pJRIRi (voir c) linéarisé par digestion par l'enzyme de restriction Smal. La séquence d'ADNc est insérée en orientation sens. e) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pHSl
Le vecteur de transformation pHSl a été obtenu par clonage du fragment d'ADNc HindII-StuI provenant de pTL3 (voir a et b) dans le vecteur binaire pJRIRi (voir c) linéarisé par digestion par l'enzyme de restriction Smal. La séquence d'ADNc est insérée en orientation antisens. - Figure 5 : Préparation du plasmide pES22 a) Représentation schématique du fragment d'ADNc contenu dans le plasmide pTL3
La séquence d'ADNc codant pour une laccase de tabac est indiquée en blanc. Les extrémités 5' et 3' non codantes de l'ADNc sont signalées en noir.
L' insertion d'ADNc a été libérée par digestion par les enzymes de restriction Smal et EcoRV. b) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur binaire pJRIRi RB : région de bordure droite du T-DNA (right border); nos promoter : séquence promoteur du gène codant la nopaline synthase; nptll CDS : séquence codante du gène de résistance à la kanamycine; nos3' : séquence de terminaison du gène codant la nopaline synthase; CaMV 35S : séquences "enhancer" et promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV); LB : région de bordure gauche du T-DNA (left border); le site de multiclonage est signalé en noir. c) Représentation schématique de la région T-DNA du vecteur de transformation pES22
Le vecteur de transformation pES22 a été obtenu par clonage du fragment d'ADNc Smal-EcoRV provenant de pTL3 (voir a) dans le vecteur binaire pJRIRi (voir b) linéarisé par digestion par l'enzyme de restriction Smal. La séquence d'ADNc est insérée en orientation antisens.
BIBLIOGRAPHIE
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- Dean and Erikson, Holzforschung 48 (1994) Suppl.21-33 ;
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Netherlands, June 19-24, 1994 ;
- Driouich et al. , Plant J., 2(1992), 13-24 ;
- La Fayette et al. , Plant Physiol., 107 (1995), 667-668 ;
- Messerschmidt and Huber, Eur. J. Biochem., 187 (1990), 341-352 ;
- Ohkawa et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), 1239-1243 ;
- O'Malley a al., Plant J.4 (1993), 751-757 ;
- Ryden and Hunt, J. Mol. Evol., 36 (1993), 41-66 ;
- Van Heijne, Nucleic Acides Res., 14 (1986), 46δ3-4690.
LISTE DE SEQUENCES
( 1 ) INFORMATION GENERALE :
(ι)
(A) NOM: CC :EENNTTRREE N1ATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTI FIQUE
(B) RUE: 3: 5,, rruuee M1 ichel -Ange
(C) VILLE • PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75016 PARIS
(il) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES D'ADN CODANT POUR DES LACCASES, ET LEURS APPLICATIONS DANS LE DOMAINE DE LA REGULATION DES TENEURS EN LIGNINES DES PLANTES
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(îv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D1 EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1
(î) JCARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1984 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(îx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 82..1752
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CAGAAAATCA TTTCAATTCG TTCTCTATAG CACAATTGTA AATAGAAGTC CAATTGCAGA 60
AATTTCAAGA AAGAGACAAA A ATG AAC TCT TGG ATT CGT CTT TTC ATA GTA 111
Met Asn Ser Trp Ile Arg Leu Phe Ile Val 1 5 10 TTG GCA GCT TGT CTT TTT CCT CTT GTC GTT GAA TGC AGG ATT CGA CAT 159 Leu Ala Ala Cys Leu Phe Pro Leu Val Val Glu Cys Arg Ile Arg His 15 20 25
TAC AAG TTC AAT GTG GTA ATG AAG AAC ACG ACT CGC CTT TGT TCA TCC 207 Tyr Lys Phe Asn Val Val Met Lys Asn Thr Thr Arg Leu Cys Ser Ser
30 35 40 AAG CCC ATT GTT ACT GTT AAT GGA AAA TTT CCA GGA CCT ACA ATC TAT 255 Lys Pro Ile Val Thr Val Asn Gly Lys Phe Pro Gly Pro Thr Ile Tyr 45 50 55 GCT CGG GAA GGT GAC ACA GTA CTT GTC AAA GTT GTT AAC CAT GTC AAG 303 Ala Arg Glu Gly Asp Thr Val Leu Val Lys Val Val Asn His Val Lys 60 65 70
TAT AAT CTC TCT ATC CAT TGG CAT GGT ATT AGA CAA CTT AGA ACA GGT 351 Tyr Asn Leu Ser Ile His Trp His Gly Ile Arg Gin Leu Arg Thr Gly 75 80 85 90
TGG GCA GAT GGA CCA GCA TAC ATC ACA CAA TGT CCA ATT CAG CCA GGG 399 Trp Ala Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Thr Gin Cys Pro Ile Gin Pro Gly 95 100 105
CAA AAC TAT GTG TAT AAC TTC ACT ATT ACA GGC CAA AGG GGT ACA CTA 447
Gin Asn Tyr Val Tyr Asn Phe Thr Ile Thr Gly Gin Arg Gly Thr Leu
110 115 120
TTT TGG CAT GCT CAT ATT TTG TGG CTA AGG GCC ACT GTT CAT GGT GCA 495
Phe Trp His Ala His Ile Leu Trp Leu Arg Ala Thr Val His Gly Ala
125 130 135 ATT GTT ATC TTG CCT AAC CTT GGA GTG CCT TAT CCA TTC CCT AAA CCC 543 Ile Val Ile Leu Pro Asn Leu Gly Val Pro Tyr Pro Phe Pro Lys Pro 140 145 150
AAC CAC GAA GCT GTC GTG ATC CTA GCT GAA TGG TGG AAA TCT GAT ACC 591 Asn His Glu Ala Val Val Ile Leu Ala Glu Trp Trp Lys Ser Asp Thr 155 160 165 170
GAA GCT GTG ATT AAT GAA GCC ATA AAA TCA GGA TTA GCC CCT AAT GTT 639 Glu Ala Val Ile Asn Glu Ala Ile Lys Ser Gly Leu Ala Pro Asn Val 175 180 185
TCT GAT GCT CAC ACT ATT AAT GGT CAT CCG GGA CCC GTC TCA AAT TGC 687
Ser Asp Ala His Thr Ile Asn Gly His Pro Gly Pro Val Ser Asn Cys
190 195 200
GCA TCA CAA GGT GGA TAC AAA TTG AAC GTT GAT CCA GGA AAA ACC TAC 73b
Ala Ser Gin Gly Gly Tyr Lys Leu Asn Val Asp Pro Gly Lys Thr Tyr
205 210 215 ATG TTA CGA GTC ATC AAC GCT GCG CTC AAT GAA GAA CTC TTT TTC AAA 783 Met Leu Arg Val Ile Asn Ala Ala Leu Asn Glu Glu Leu Phe Phe Lys 220 225 230
ATT GCT GGC CAT AAA ATG ACA GTA GTT GAA GTT GAT GCC ACT TAC ATT 831 Ile Ala Gly His Lys Met Thr Val Val Glu Val Asp Ala Thr Tyr Ile 235 240 245 250
AAA CCT TTC AAA ACA GAC ACA ATT GTA ATT GCT CCT GGC CAA ACA ACA 879 Lys Pro Phe Lys Thr Asp Thr Ile Val Ile Ala Pro Gly Gin Thr Thr 255 260 265 AAT GTA ATT GTC ACT GCC AAT CAA GGT TCT GGA AAA TAC ATG GTT GCT 927 Asn Val Ile Val Thr Ala Asn Gin Gly Ser Gly Lys Tyr Met Val Ala 270 275 280
GCT TCA CCT TTT ATG GAT GCA CCA ATT GCT GTT GAT AAT GTT ACA GCA 975 Ala Ser Pro Phe Met Asp Ala Pro Ile Ala Val Asp Asn Val Thr Ala 285 290 295
ATA GCC ACT TTA CAT TAT TCT GGC ACA CAA GGA AAT AGC CAC ATT TCA 1023 Ile Ala Thr Leu His Tyr Ser Gly Thr Gin Gly Asn Ser His Ile Ser 300 305 310
CTT ACT AGT ACA CCA CCT AAA AAT GCC ACC CCT GTA GCC AAC ACT TTT 1071 Leu Thr Ser Thr Pro Pro Lys Asn Ala Thr Pro Val Ala Asn Thr Phe 315 320 325 330
CTT GAT TCT TTA AGA AGC CTG AAT TCC AAA AAA TAC CCT GCT AAA GTT 1119 Leu Asp Ser Leu Arg Ser Leu Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Ala Lys Val 335 340 345
CCC AAA AAA ATT GAT CAT TCC CTA TTT TTC ACG GTA GGT TTA GGG ATT 1167 Pro Lys Lys Ile Asp His Ser Leu Phe Phe Thr Val Gly Leu Gly Ile 350 355 360 AAT CCA TGC CCA ACT TGC AAA CAA GGT AAT GGA AGC AGA GTT GTG GCT 1215 Asn Pro Cys Pro Thr Cys Lys Gin Gly Asn Gly Ser Arg Val Val Ala 365 370 375
AGT GTA AAC AAT GTT ACA TTC GTT ATG CCA ACG GTT GCC CTT TTA CAA 1263 Ser Val Asn Asn Val Thr Phe Val Met Pro Thr Val Ala Leu Leu Gin 380 385 390
GCA CAT TTC TTT GGG ACT AAA GGA GTT TTC ACG ACA GAT TTT CCA GCA 1311 Ala His Phe Phe Gly Thr Lys Gly Val Phe Thr Thr Asp Phe Pro Ala 395 400 405 410
AAC CCG CCT TTT GCT TTC AAC TAT ACG GGA ACA GGA CCA ACT AAT TTG 1359
Asn Pro Pro Phe Ala Phe Asn Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Thr Asn Leu 415 420 425
GCG ACG ATG AAT GGG ACT AAG GTT TAT AGG CTG CGG TAT AAC GAT ACA 1407
Ala Thr Met Asn Gly Thr Lys Val Tyr Arg Leu Arg Tyr Asn Asp Thr 430 435 440 GTT CAA TTG GTT TTG CAG GAT ACT GGA ATT ATA GCC CCT GAG AAC CAT 1455 Val Gin Leu Val Leu Gin Asp Thr Gly Ile Ile Ala Pro Glu Asn His 445 450 455
CCA ATC CAT TTG CAT GGC TTC AAT TTT TTT CTA GTG GGT AAA GGC ATA 1503 Pro Ile His Leu His Gly Phe Asn Phe Phe Leu Val Gly Lys Gly Ile 460 465 470
GGA AAT TTT AAT CCA AAA ACA GAT CCT AAG AAT TTT AAT CTT GTG GAT 1551 Gly Asn Phe Asn Pro Lys Thr Asp Pro Lys Asn Phe Asn Leu Val Asp 475 480 485 490 CCT GTT GAG AGG AAT ACA GTT GGT GTT CCT GCT GGA GGA TGG GTT GCT 1599 Pro Val Glu Arg Asn Thr Val Gly Val Pro Ala Gly Gly Trp Val Ala 495 500 505 ATA AGA TTT CGT GCT GAC AAT CCA GGA GTT TGG TTT ATG CAT TGT CAT 1647 Ile Arg Phe Arg Ala Asp Asn Pro Gly Val Trp Phe Met His Cys His 510 515 520
CTA GAG ATA CAC ACA ACA TGG GGA TTG AAA ATG GCA TGG CTT GTA GAT 1695 Leu Glu Ile His Thr Thr Trp Gly Leu Lys Met Ala Trp Leu Val Asp 525 530 535
AAT GGC AAA GGC CCA AAT GAG TCC CTT TTG CCA CCT CCT AAG GAT CTT 1743 Asn Gly Lys Gly Pro Asn Glu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Lys Asp Leu 540 545 550
CCA AAA TGC TAAAATTGGA GAGGCCTTTT TTAAAGGAGT TAAATTTCAC 1792
Pro Lys Cys 555
ATACGAAGCA TAATGTAGGG AAAGCAGGCT GAAGACTGCA CCAAGAGAGA CAAAGAAGAA 1852
AGGCGAGTCA AAAAGCAATG TATTCATTTT TGAGTGAAAG AGAAAAAACA TTTTTTTTCC 1912 TCAGCCAAAT TTTAATAATT ATACGAGTAT TCAATGTATA CATTTTTTGA GATTGTTAAT 1972
GGAAGTTTGA AG 1984
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 557 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Asn Ser Trp Ile Arg Leu Phe Ile Val Leu Ala Ala Cys Leu Phe 1 5 10 15
Pro Leu Val Val Glu Cys Arg Ile Arg His Tyr Lys Phe Asn Val Val 20 25 30
Met Lys Asn Thr Thr Arg Leu Cys Ser Ser Lys Pro Ile Val Thr Val 35 40 45 Asn Gly Lys Phe Pro Gly Pro Thr Ile Tyr Ala Arg Glu Gly Asp Thr 50 55 60
Val Leu Val Lys Val Val Asn His Val Lys Tyr Asn Leu Ser Ile His 65 70 75 80
Trp His Gly Ile Arg Gin Leu Arg Thr Gly Trp Ala Asp Gly Pro Ala 85 90 95 Tyr Ile Thr Gin Cys Pro Ile Gin Pro Gly Gin Asn Tyr Val Tyr Asn 100 105 110
Phe Thr Ile Thr Gly Gin Arg Gly Thr Leu Phe Trp His Ala His Ile 115 120 125
Leu Trp Leu Arg Ala Thr Val His Gly Ala Ile Val Ile Leu Pro Asn 130 135 140 Leu Gly Val Pro Tyr Pro Phe Pro Lys Pro Asn His Glu Ala Val Val 145 150 155 160
Ile Leu Ala Glu Trp Trp Lys Ser Asp Thr Glu Ala Val Ile Asn Glu 165 170 175
Ala Ile Lys Ser Gly Leu Ala Pro Asn Val Ser Asp Ala His Thr Ile 180 185 190
Asn Gly His Pro Gly Pro Val Ser Asn Cys Ala Ser Gin Gly Gly Tyr 195 200 205
Lys Leu Asn Val Asp Pro Gly Lys Thr Tyr Met Leu Arg Val Ile Asn 210 215 220 Ala Ala Leu Asn Glu Glu Leu Phe Phe Lys Ile Ala Gly His Lys Met 225 230 235 240
Thr Val Val Glu Val Asp Ala Thr Tyr Ile Lys Pro Phe Lys Thr Asp 245 250 255
Thr Ile Val Ile Ala Pro Gly Gin Thr Thr Asn Val Ile Val Thr Ala 260 265 270
Asn Gin Gly Ser Gly Lys Tyr Met Val Ala Ala Ser Pro Phe Met Asp 275 280 285
Ala Pro Ile Ala Val Asp Asn Val Thr Ala Ile Ala Thr Leu His Tyr 290 295 300 Ser Gly Thr Gin Gly Asn Ser His Ile Ser Leu Thr Ser Thr Pro Pro 305 310 315 320
Lys Asn Ala Thr Pro Val Ala Asn Thr Phe Leu Asp Ser Leu Arg Ser 325 330 335
Leu Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Ala Lys Val Pro Lys Lys Ile Asp His 340 345 350
Ser Leu Phe Phe Thr Val Gly Leu Gly Ile Asn Pro Cys Pro Thr Cys 355 360 365
Lys Gin Gly Asn Gly Ser Arg Val Val Ala Ser Val Asn Asn Val Thr 370 375 380 Phe Val Met Pro Thr Val Ala Leu Leu Gin Ala His Phe Phe Gly Thr 385 390 395 400 Lys Gly Val Phe Thr Thr Asp Phe Pro Ala Asn Pro Pro Phe Ala Phe 405 410 415
Asn Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Thr Asn Leu Ala Thr Met Asn Gly Thr 420 425 430
Lys Val Tyr Arg Leu Arg Tyr Asn Asp Thr Val Gin Leu Val Leu Gin 435 440 445
Asp Thr Gly Ile Ile Ala Pro Glu Asn His Pro Ile His Leu His Gly 450 455 460
Phe Asn Phe Phe Leu Val Gly Lys Gly Ile Gly Asn Phe Asn Pro Lys 465 470 475 480
Thr Asp Pro Lys Asn Phe Asn Leu Val Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr 485 490 495
Val Gly Val Pro Ala Gly Gly Trp Val Ala Ile Arg Phe Arg Ala Asp 500 505 510
Asn Pro Gly Val Trp Phe Met His Cys His Leu Glu Ile His Thr Thr 515 520 525 Trp Gly Leu Lys Met Ala Trp Leu Val Asp Asn Gly Lys Gly Pro Asn 530 535 540
Glu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Lys Asp Leu Pro Lys Cys 545 550 555
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1512 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(îx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1227
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO- 3
CAT CCA TTC CCC AAA CCC AAC CAT GAA GCT GTC GTT GTT TTA GCT GAA 48 His Pro Phe Pro Lys Pro Asn His Glu Ala Val Val Val Leu Ala Glu 1 5 10 15
TGG TGG AAA TCG GAT ACT GAA GCT GTG ATT AAT GAA GCT CTA AAA TCA 96 Trp Trp Lys Ser Asp Thr Glu Ala Val Ile Asn Glu Ala Leu Lys Ser 20 25 30
GGT TTA GCC CCC AAT GTT TCC GAT GCT CAC ACA ATC AAT GGT CAT CCT 144 Gly Leu Ala Pro Asn Val Ser Asp Ala His Thr Ile Asn Gly His Pro 35 40 45 GGA CCA GTT TCC AAT TGT CCG ACC CAA GGT GGA TAC AGC TTG AGT GTT 192
Gly Pro Val Ser Asn Cys Pro Thr Gin Gly Gly Tyr Ser Leu Ser Val
50 55 60
GAA CCT GGA AAA ACA TAC ATG TTA CGA GTG ATC AAT GCT GCG CTC AAT 240
Glu Pro Gly Lys Thr Tyr Met Leu Arg Val Ile Asn Ala Ala Leu Asn
65 70 75 80 GAA GAA CTC TTC TTT AAG ATT GCT GGC CAC AAA ATG ACT GTA GTT GAA 288 Glu Glu Leu Phe Phe Lys Ile Ala Gly His Lys Met Thr Val Val Glu 85 90 95
GTG GAT GCC ACT TAC GTA AAA CCC TTC AAA ACA GAC ACA ATT GTA ATC 336 Val Asp Ala Thr Tyr Val Lys Pro Phe Lys Thr Asp Thr Ile Val Ile 100 105 110
GCC CCT GGC CAA ACA ACA AAT GTT ATA GTA ACT GCT GAT CAG AGT TTC 384 Ala Pro Gly Gin Thr Thr Asn Val Ile Val Thr Ala Asp Gin Ser Phe 115 120 125
GGA AAA TAT ATG GTT GCT GCT TCT CCC TTT ATG GAC GCT CCT ATC GCC 432
Gly Lys Tyr Met Val Ala Ala Ser Pro Phe Met Asp Ala Pro Ile Ala 130 135 140
GTC GAC AAT ATC ACG GCC ACC GCC ACG TTG CAT TAT TCC GGC GCA CTA 480
Val Asp Asn Ile Thr Ala Thr Ala Thr Leu His Tyr Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 GGC ACT TCT CCC ACA ACT CTC ACT AGT ACT CCG CCC CAA AAC GCC ACT 528 Gly Thr Ser Pro Thr Thr Leu Thr Ser Thr Pro Pro Gin Asn Ala Thr 165 170 175
TCA GTA GCC AAC AAT TTT CTT GAC GCT CTC AAA AGT CTT AAT TCA AAA 576 Ser Val Ala Asn Asn Phe Leu Asp Ala Leu Lys Ser Leu Asn Ser Lys 180 185 190
AAA TAC CCA GCT AAA GTT CCA CAA ACT GTG GAT CAT TCG TTG TTT TTC 624 Lys Tyr Pro Ala Lys Val Pro Gin Thr Val Asp His Ser Leu Phe Phe 195 200 205
ACT GCT GGA CTT GGA ATT AAT CCA TGT CCA ACG TGT AAA CAA GCT AAT 672
Thr Ala Gly Leu Gly Ile Asn Pro Cys Pro Thr Cys Lys Gin Ala Asn 210 215 220
GGC AGC AGA GTT GTC GCT AGT GTA AAT AAT GTT ACA TTT GTT ATG CCA 720
Gly Ser Arg Val Val Ala Ser Val Asn Asn Val Thr Phe Val Met Pro
225 230 235 240 ACC GTA GCG CTT TTA CAA GCG CAT TTC TTT GGC ATA AAT GGT GTT TTC 768 Thr Val Ala Leu Leu Gin Ala His Phe Phe Gly Ile Asn Gly Val Phe 245 250 255
ACA ACA GAT TTT CCA GCG AAT CCG CCA TTC GTT TTT AAC TAT ACT GGA 816 Thr Thr Asp Phe Pro Ala Asn Pro Pro Phe Val Phe Asn Tyr Thr Gly 260 265 270 ACA CCA CCA ACA AAC TTG GCT ACA ACG AAT GGG ACG AAG GTT TAT CGG 864 Thr Pro Pro Thr Asn Leu Ala Thr Thr Asn Gly Thr Lys Val Tyr Arg 275 280 285 TTG CCT TAT AAT GCA ACA GTT CAA TTA GTT TTG CAG GAT ACT GGA ATT 912 Leu Pro Tyr Asn Ala Thr Val Gin Leu Val Leu Gin Asp Thr Gly Ile 290 295 300
ATA GCC CCT GAA AAC CAT CCA ATC CAT TTG CAT GGT TTC AAT TTC TTT 960 Ile Ala Pro Glu Asn His Pro Ile His Leu His Gly Phe Asn Phe Phe 305 310 315 320
TTA GTG GGT AAA GGA CTA GGG AAT TTC AAT TCC AAA ACA GAC CCA AAG 1008 Leu Val Gly Lys Gly Leu Gly Asn Phe Asn Ser Lys Thr Asp Pro Lys 325 330 335
AAT TTT AAT CTT ATT GAT CCT GTT GAA AGG AAT ACA ATT GGA GTG CCT 1056
Asn Phe Asn Leu Ile Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr Ile Gly Val Pro
340 345 350
TCT GGA GGA TGG GTT GCC ATA AGA TGG CTT GCT GAC AAT CCA GGA GTT 1104
Ser Gly Gly Trp Val Ala Ile Arg Trp Leu Ala Asp Asn Pro Gly Val 355 360 365 TGG TTT ATG CAT TGT CAT CTA GAG GTG CAC ACA ACA TGG GGA TTG AAA 1152 Trp Phe Met His Cys His Leu Glu Val His Thr Thr Trp Gly Leu Lys 370 375 380
ATG GCA TTC CTT GTA GAT AAT GGC AAG GGT CCA AAG GAG TCA CTT CTG 1200 Met Ala Phe Leu Val Asp Asn Gly Lys Gly Pro Lys Glu Ser Leu Leu 385 390 395 400
CCA CCT CCA AAG GAT CTC CCA AAA TGC TAAAATAGTG GTGAAAATCC 1247
Pro Pro Pro Lys Asp Leu Pro Lys Cys 405
ATTTGTTTCT CCTCTCAACA AGTTCAGACA AATCTTCATC TGCAACATGT AAGAAAGCAG 1307
CAAAAGCTCG ACCATGCAAT GAGAGAAAGA AGAATTAGAG AGTCAATAAG CAATGTATTC 1367
ATTTTCTTGA GTGAAAAAAG AAAGGGAGAT TTTTGCTCAA GCAATCCTCA ATAATTATGT 1427
TTGTATGCAA ATATACATTT TTTTTGTCAT TGTTCATGGA AGTTTGAGAA ATGGATTGTT 1487 TCTTTTATCA AAAAAAAAAA AAAAG 1512
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 409 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: His Pro Phe Pro Lys Pro Asn His Glu Ala Val Val Val Leu Ala Glu
1 5 10 15 Trp Trp Lys Ser Asp Thr Glu Ala Val Ile Asn Glu Ala Leu Lys Ser 20 25 30
Gly Leu Ala Pro Asn Val Ser Asp Ala His Thr Ile Asn Gly His Pro 35 40 45
Gly Pro Val Ser Asn Cys Pro Thr Gin Gly Gly Tyr Ser Leu Ser Val 50 55 60
Glu Pro Gly Lys Thr Tyr Met Leu Arg Val Ile Asn Ala Ala Leu Asn 65 70 75 80
Glu Glu Leu Phe Phe Lys Ile Ala Gly His Lys Met Thr Val Val Glu 85 90 95 Val Asp Ala Thr Tyr Val Lys Pro Phe Lys Thr Asp Thr Ile Val Ile 100 105 110
Ala Pro Gly Gin Thr Thr Asn Val Ile Val Thr Ala Asp Gin Ser Phe 115 120 125
Gly Lys Tyr Met Val Ala Ala Ser Pro Phe Met Asp Ala Pro Ile Ala 130 135 140
Val Asp Asn Ile Thr Ala Thr Ala Thr Leu His Tyr Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160
Gly Thr Ser Pro Thr Thr Leu Thr Ser Thr Pro Pro Gin Asn Ala Thr 165 170 175 Ser Val Ala Asn Asn Phe Leu Asp Ala Leu Lys Ser Leu Asn Ser Lys 180 185 190
Lys Tyr Pro Ala Lys Val Pro Gin Thr Val Asp His Ser Leu Phe Phe 195 200 205
Thr Ala Gly Leu Gly Ile Asn Pro Cys Pro Thr Cys Lys Gin Ala Asn 210 215 220
Gly Ser Arg Val Val Ala Ser Val Asn Asn Val Thr Phe Val Met Pro 225 230 235 240
Thr Val Ala Leu Leu Gin Ala His Phe Phe Gly Ile Asn Gly Val Phe 245 250 255 Thr Thr Asp Phe Pro Ala Asn Pro Pro Phe Val Phe Asn Tyr Thr Gly 260 265 270
Thr Pro Pro Thr Asn Leu Ala Thr Thr Asn Gly Thr Lys Val Tyr Arg 275 280 285
Leu Pro Tyr Asn Ala Thr Val Gin Leu Val Leu Gin Asp Thr Gly Ile 290 295 300 Ile Ala Pro Glu Asn His Pro Ile His Leu His Gly Phe Asn Phe Phe 305 310 315 320
Leu Val Gly Lys Gly Leu Gly Asn Phe Asn Ser Lys Thr Asp Pro Lys 325 330 335
Asn Phe Asn Leu Ile Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr Ile Gly Val Pro 340 345 350 Ser Gly Gly Trp Val Ala Ile Arg Trp Leu Ala Asp Asn Pro Gly Val 355 360 365
Trp Phe Met His Cys His Leu Glu Val His Thr Thr Trp Gly Leu Lys 370 375 380
Met Ala Phe Leu Val Asp Asn Gly Lys Guy Pro Lys Glu Ser Leu Leu 385 390 395 400
Pro Pro Pro Lys Asp Leu Pro Lys Cys 405
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 630 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm
(îx) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT: 1..273
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CTT TTT TTA GTG GGT AAA GGA CTA GGA AAT TTC AAT TCC AAA ACA GAC 48
Leu Phe Leu Val Gly Lys Gly Leu Gly Asn Phe Asn Ser Lys Thr Asp 1 5 10 15
CCT AAG AAT TTT AAT CTT ATT GAT CCT GTT GAA AGG AAT ACA ATT GGA 96 Pro Lys Asn Phe Asn Leu Ile Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr Ile Gly 20 25 30
GTG CCT TCT GGA GGA TGG GTT GCC ATA AGA TGG CGT GCT GAC AAT CCA 144 Val Pro Ser Gly Gly Trp Val Ala Ile Arg Trp Arg Ala Asp Asn Pro 35 40 45
GGA GTT TGG TTT ATG CAT TGT CAT CTA GAG GTG CAC ACA ACA TGG GGA 192 Gly Val Trp Phe Met His Cys His Leu Glu Val His Thr Thr Trp Gly 50 55 60
TTG AAA ATG GCA TTC CTT GTA GAT AAT GGC AAG GGT TCT AAT GAG TCA 240 Leu Lys Met Ala Phe Leu Val Asp Asn Gly Lys Gly Ser Asn Glu Ser 65 70 75 80 CTT TTG CCA CCA CCA AAG GAT CTC CCA AAA TGC TAAAATAATG ATGGAAATCC 293 Leu Leu Pro Pro Pro Lys Asp Leu Pro Lys Cys 85 90
ATTTGTTTCT CCTCTCAACA AGTTCAGACA AATCTTAATT TGCAACAAAA GCTGCACCAA 353
GCAATGAGAG AAGAATTAGA GTCAATAAGC AATGTACTAT TCATTTTCTT GAGTGAAAAA 413 GACTAGGAGA ATTTTGCTCA AGCAATATTC AATAATTATG TTTGTATGCA TATATACATT 473
TTTTTTTGTC CTTGTTCAAG GAAGTTTGAG AGATGGATTG TACGTTTCTT TTACCTCTTA 533
TTATTGTCAC TCCCAAGTCA TACTTTCTGT TAAAAGTTTT CTGAATGTTT TAAATTTAGA 593
AATAACATTA CAGTAACAGA AAAAAAAAAA AAAAAAG 630
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 91 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: Leu Phe Leu Val Gly Lys Gly Leu Gly Asn Phe Asn Ser Lys Thr Asp 1 5 10 15
Pro Lys Asn Phe Asn Leu Ile Asp Pro Val Glu Arg Asn Thr Ile Gly 20 25 30
Val Pro Ser Gly Gly Trp Val Ala Ile Arg Trp Arg Ala Asp Asn Pro 35 40 45
Gly Val Trp Phe Met His Cys His Leu Glu Val His Thr Thr Trp Gly 50 55 60
Leu Lys Met Ala Phe Leu Val Asp Asn Gly Lys Gly Ser Asn Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Pro Pro Pro Lys Asp Leu Pro Lys Cys
85 90

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes contenant une (ou plusieurs) région(s) codante(s), cette (ces) région(s) codante(s) étant constituée(s) :
- d'une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou d'un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou d'une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou - d'une séquence nucléotidique complémentaire d 'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, pour la transformation de cellules végétales en vue de l'obtention de plantes transgéniques au sein desquelles la biosynthèse des lignines est régulée soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution des teneurs en lignines produites, par rapport aux teneurs normales en lignines produites chez les plantes non transformées, et/ou dans le sens d'une modification de la composition des lignines produites par lesdites plantes transgéniques par rapport aux lignines produites chez les plantes non transformées.
2. Utilisation de séquences nucléotidiques recombinantes selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elles contiennent tout ou partie d'une séquence nucléotidique choisie parmi les suivantes: - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 1 , codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour la laccase de tabac représentée par SEQ ID NO 2, - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 3, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 4,
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 5, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 6,
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, et plus particulièrement avec l'ARNm codé par les séquences SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, et SEQ ID NO 5 respectivement,
- la séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant soit pour un ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour les fragments de laccase représentés par SEQ ID NO 4, ou SEQ ID NO 6, soit pour une protéine dérivée de la laccase ou fragments de laccase susmentionnés, - la séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique complémentaire susmentionnée, par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, et plus particulièrement avec un des ARNm susmentionnés.
3. Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend l'une au moins des séquences suivantes :
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 1 , codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par
SEQ ID NO 2, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 1 susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour une protéine dérivée de cette dernière, - la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 3, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 4, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 3, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 4, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 3, susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour le fragment de laccase représenté par SEQ ID NO 4, ou pour une protéine dérivée de ce dernier,
- la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 5, codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase de tabac, ce fragment étant représenté par SEQ ID NO 6, ou
- un fragment de la séquence nucléotidique représentée par SEQ ID NO 5, ce fragment codant pour un fragment de la laccase représentée par SEQ ID NO 6, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence représentée par SEQ ID NO 5, susmentionnée, ou d'un fragment tel que décrit ci-dessus de cette séquence, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm codant lui-même pour le fragment de laccase représenté par SEQ ID NO 6, ou pour une protéine dérivée de ce dernier.
4. Séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend l'une au moins des séquences suivantes :
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 1 , cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, à savoir avec l'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 1 , ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou - un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, tel que défini ci-dessus, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné,
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 3, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 4, à savoir l'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 3, ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou - un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 4, telle que définie ci- dessus, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné,
- la séquence nucléotidique complémentaire de celle représentée par SEQ ID NO 5, cette séquence complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui-même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 6, à savoir l'ARNm codé par la séquence représentée par SEQ ID NO 5, ou codé par une séquence dérivée de cette dernière, telle que définie ci-dessus, ou
- un fragment de la séquence complémentaire susmentionnée, ce fragment de séquence codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, notamment chez le tabac, et plus particulièrement avec l'ARNm codant lui- même pour la laccase représentée par SEQ ID NO 6, telle que définie ci- dessus, ou - toute séquence nucléotidique dérivée de la séquence complémentaire susmentionnée, ou du fragment de cette séquence complémentaire tel que décrit ci-dessus, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné.
5. ARNm codé par une séquence d' ADN selon la revendication 3, et plus particulièrement :
- l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 1 , ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour la laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 2, ou pour un fragment de cette laccase ou une protéine dérivée tels que définis ci-dessus,
- l 'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 3 , ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour le fragment d'une laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 4, ou pour un fragment de ce dernier ou une protéine dérivée tels que définis ci- dessus, - l'ARNm codé par la séquence d'ADN représentée par SEQ ID NO 5, ou codé par un fragment ou une séquence dérivée tels que définis ci-dessus, ledit ARNm étant susceptible de coder à son tour pour le fragment d'une laccase présente chez le tabac, telle que représentée par SEQ ID NO 6, ou pour un fragment de ce dernier ou une protéine dérivée tels que définis ci- dessus.
6. ARNm antisens, caractérisé en ce qu' il comprend des nucleotides complémentaires de la totalité ou d'une partie seulement des nucleotides constituant un ARNm selon la revendication 5, et en ce qu' il est susceptible de s'hybrider avec ce dernier.
7. Laccases de tabac telles qu'obtenues sous forme essentiellement pure par extraction et purification à partir de tabac, et plus particulièrement la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou celle comprenant le polypeptide représenté par SEQ ID NO 4, ou encore celle comprenant le polypeptide représenté par SEQ ID NO 6, ou toute protéine dérivée de ces dernières, notamment par addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou tout fragment issu desdites laccases ou de leurs séquences dérivées.
8. Séquences nucléotidiques codant pour la laccase représentée par SEQ ID NO 2, ou pour les polypeptides représentés par SEQ ID NO 4, et SEQ ID NO 6, ou toute séquence dérivée ou fragment de ces derniers, tels que définis dans la revendication 7, lesdites séquences nucléotidiques étant caractérisées en ce qu'elles correspondent à tout ou partie des séquences représentées par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, ou SEQ ID NO 5, respectivement, ou à toute séquence dérivée de ces dernières par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins susceptibles de coder pour les laccases ou séquence dérivée ou fragment de ces dernières, tels que définis ci-dessus.
9. Complexes formés entre un ARNm antisens selon la revendication 6, et un ARNm selon la revendication 5.
10. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN selon la revendication 3, susceptible de coder pour un ARNm lui-même susceptible de coder pour une laccase ou toute séquence dérivée ou fragment de cette dernière, ladite séquence selon la revendication 3 étant insérée dans une séquence hétérologue.
11. Séquence nucléotidique recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN complémentaire selon la revendication 4, insérée dans une séquence hétérologue, ladite séquence d'ADN complémentaire codant pour un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm codant pour une laccase ou toute séquence dérivée ou fragment de cette dernière.
12. Séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé en ce qu'elle comprend les -éléments nécessaires pour réguler l'expression de la séquence nucléotidique selon la revendication 3, ou de sa séquence complémentaire selon la revendication 4, notamment un promoteur et un terminateur de la transcription de ces séquences, et le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment l'ARNm codant pour l'alcool cinnamylique deshydrogénase (CAD), et/ou l'ARNm codant pour la cinnamoyl CoA réductase (CCR), et/ou l'ARNm codant pour l'O-méthyltransférase (OMT), ou comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour tout ou partie d'un ARNm antisens susceptible de s'hybrider avec l'ARNm susmentionné, notamment avec l'ARNm codant pour la CAD, la CCR ou l'OMT.
13. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu' il comprend une séquence nucléotidique recombinante selon l'une des revendications 10 à 12, intégrée dans l'un de ses sites de son génome non essentiels pour sa réplication.
14. Procédé de régulation de la biosynthèse des lignines chez les plantes, soit par diminution, soit par augmentation des quantités de lignines produites, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez ces plantes, ledit procédé comprenant une étape de transformation de cellules de ces plantes à l'aide d'un vecteur contenant:
- une séquence nucléotidique codant pour un ARN messager (ARNm), cet ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou un fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ce fragment codant pour un
ARNm, cet ARNm codant lui-même pour un fragment d'une laccase, ou une séquence nucléotidique dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou dérivée du fragment susmentionné, notamment par mutation et/ou addition, et/ou suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, cette séquence dérivée codant pour un ARNm, cet ARNm codant lui-même pour une protéine dérivée d'une laccase, ou
- une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique codant pour un ARNm codant lui-même pour une laccase chez les plantes, ou complémentaire d'un fragment d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, ou complémentaire d'une séquence nucléotidique dérivée, soit d'une séquence nucléotidique codant pour ledit ARNm, soit d'un fragment de cette dernière, cette séquence complémentaire codant pour une séquence nucléotidique antisens (encore désignée ARNm antisens) susceptible de s'hybrider avec un ARNm codant pour une laccase chez les plantes, ladite transformation étant effectuée notamment à l'aide d'un vecteur selon la revendication 13.
15. Procédé de diminution de la biosynthèse de lignine chez les plantes, et donc de diminution des quantités de lignines produites, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez les plantes, caractérisé en ce qu' il est effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant:
- au moins une séquence d'ADN selon la revendication 4, - et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un ARNm antisens capable de s'hybrider à un ARNm codant pour une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment l'ARNm codant pour la CAD, la CCR ou l'OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant selon la revendication 13, contenant une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 1 1 ou la revendication 12, - soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 1 1 , tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour un ARNm antisens capable de s'hybrider à un ARNm codant pour une autre enzyme que la laccase, telle que définie ci- dessus.
16. Procédé de diminution de la biosynthèse de lignine chez les plantes, et donc de diminution des quantités de lignines produites, par rapport aux quantités normales de lignines produites chez les plantes, caractérisé en ce qu' il est effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant:
- au moins une séquence d'ADN selon la revendication 3,
- et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment une séquence d'ADN codant pour tout ou partie de la CAD, la CCR ou l'OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant selon la revendication 13, contenant la séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10 ou la revendication 12,
- soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10, tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus.
17. Procédé d'augmentation de la biosynthèse de lignine chez les plantes, et donc d'augmentation des quantités de lignines produites par rapport aux quantités normales de lignines produites chez les plantes, caractérisé en ce qu' il est effectué par transformation du génome de ces plantes, en y incorporant:
- au moins une séquence d'ADN selon la revendication 3,
- et, le cas échéant, au moins une séquence d'ADN codant pour une autre enzyme que la laccase, qui se trouve être impliquée dans une étape de la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment une séquence d'ADN codant pour la CAD, la CCR ou l'OMT, ladite transformation étant réalisée:
- soit à l'aide d'un vecteur recombinant selon la revendication 13, contenant la séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10 ou la revendication 12,
- soit à l'aide de plusieurs vecteurs recombinants dont l'un au moins contient une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 13, tandis que l' (ou les) autre(s) vecteur(s) recombinant(s) contien(nen)t une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'une enzyme autre que la laccase, telle que définie ci-dessus.
18. Plantes ou fragments de plantes, notamment cellules, fruits, semences, pollen, transformés par incorporation dans leur génome d'au moins une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 3 ou 4.
19. Polypeptides recombinants, notamment laccases recombinantes, représentés par SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, et SEQ ID NO 6, tels qu'obtenus par transformation de cellules végétales en intégrant de façon stable dans leur génome, une séquence nucléotidique recombinante selon la revendication 10, notamment à l'aide d'un vecteur selon la revendication 13.
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