FR2779737A1 - Gene de reponse aux nematodes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne la mise en évidence de l'implication du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) dans les stades précoces de développement de cellules nourricières induites par les nématodes.

Description

L'invention concerne la mise en évidence de l'implication du gène de la

D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) dans les stades précoces de

développement de cellules nourricières induites par les nématodes.

Parmi les pathogènes des plantes, les nématodes endoparasites sédentaires interagissent avec leurs hôtes d'une manière tout à fait fascinante. Ils sont capables d'induire la redifférenciation des cellules de racines en sites nourriciers de nématodes (NFS). La croissance et la reproduction de nématodes dépend de l'établissement de ces NFS. Les nématodes puisent leur nourriture des NFS jusqu'à la fin de leur cycle vital, entraînant une grande menace pour la production de cultures dans le monde entier (Sasser et Freckman, 1987). On ne comprend pas encore comment ces nématodes provoquent ces altérations, mais on soupçonne que les sécrétions salivaires irnjectées dans les cellules végétales interagissent directement ou indirectement avec le génome nucléaire des plantes (Hussey, 1989). Les observations cytologiques ont indiqué que les NFS sont multinucléés avec un accroissement de la taille du noyau et du nucléole. Par rapport aux cellules normales, les NFS présentent également un accroissement de la densité cytoplasmique, une perte de vacuolisation normale, et une prolifération des organites cellulaires. Une autre particularité de ces structures est le développement d'invaginations du plasmalemme, ce qui est caractéristique des cellules de transfert (Jones, 1981). Ces invaginations augmentent la surface membranaire et facilitent

ainsi l'importation de photosynthétats élaborés, de minéraux et d'autres métabolites.

2 5 Selon l'espèce de nématodes, la cellule nourricière d'origine se développe soit en un syncytium (pour les nématodes à kystes tels que Heterodera spp. et Globodera spp.), soit en un système de cellules géantes (pour les nématodes à galles tels que Meloidogyne spp.) (Jones, 1981). Les syncytia proviennent de fusions cellulaires après la dissolution de parois cellulaires entre la cellule d'origine dans laquelle le

nématode commence à se nourrir et un nombre croissant de cellules avoisinantes.

Jusqu'à 200 cellules peuvent être incorporées dans un grand syncytium. Par contre, la formation de cellules géantes est le résultat de divisions nucléaires répétées de la cellule nourricière d'origine sans cytokinèse (Huang, 1985). Chaque nématode à galles déclenche le développement de 5 à 7 cellules géantes, contenant chacune jusqu'à 100 noyaux, qui ont subi une importante endoréduplication (Wiggers et al., 1990). Dans la mesure o les espèces de Meloidogyne peuvent induire des cellules géantes analogues chez plusieurs milliers d'espèces hôtes, elles interagissent probablement avec certaines étapes clef fondamentales du cycle cellulaire de la plante (Niebel et al., 1996). En outre, le développement des nématodes à galles s'accompagne de divisions des cellules corticales autour des NFS, ce qui conduit à la formation d'une galle typique. Ces changements morphologiques et physiologiques complexes au cours de l'établissement des NFS se traduisent par une modification de l'expression des gènes dans les cellules de racines affectées (Gheysen et al., 1996; Williamson et Hussey, 1996). Des approches basées sur l'expression différentielle de gènes entre des racines saines et infectées ont permis l'identification de clones d'ADNc présentant une homologie vis-à-vis de plusieurs gènes de défense de plantes connus (Niebel et al., 1993; Niebel et al., 1995; Lambert, 1995). Dans les cellules parasitées, l'analyse des ADNc différentiellement exprimés a mis en évidence une surexpression d'ADNc homologues à un composant clef de la voie d'ubiquitination des protéines (enzyme E2), une grande sous-unité de l'ARN polymérase II, un facteur de transcription de type Myb, et une ATPase H de la membrane plasmique (Bird et Wilson, 1994). Il existe également une surexpression d'une protéine abondante dans l'embryogénèse tardive (Van der Eycken et al., 1996). Le séquençage de gènes exprimés de manière différentielle et la recherche informatique dans les banques de données moléculaires peuvent indiquer une fonction putative pour les produits pour lesquels ils codent. Cette approche doit toutefois être combinée avec des études biochimiques et physiologiques pour mettre en évidence leur vraie fonction. Une preuve plus directe du rôle de gènes végétaux connus dans l'établissement ou le maintien des NFS est venue d'une variété de constructions de fusion promoteur-gusA introduites dans Arabidopsis et le tabac (Goddijn et al., 1993; Niebel et al., 1996). On a ainsi montré que le promoteur spécifique de racines TobRB7 (Conkling et al., 1990), qui code potentiellement pour un canal à eau exprimé dans les méristèmes racinaires et les régions immatures des cylindres vasculaires, est réactivé dans les cellules géantes de tabac induites par M incognita (Yamamoto et al., 1991; Opperman et al., 1994a). De même, l'activation

transcriptionnelle de marqueurs du cycle cellulaire tels que la kinase cycline-

dépendante CDC2a et la cycline mitotique CYCJAt est observée au cours des stades précoces de la formation des NFS (Niebel et al., 1996), Par ailleurs, de nombreux autres gènes sont soumis à une inhibition dans les NFS. Par exemple, les promoteurs constitutifs les plus forts, tels que 35S de CaMV, actuellement disponibles pour l'expression de gènes dans les racines, sont rendus silencieux en quelques jours après

l'infection par des nématodes (Goddijn et al., 1993).

Pour identifier de nouveaux gênes et obtenir une vue plus complète des mécanismes moléculaires à la base de l'induction et du maintien des NFS, une

stratégie de piégeage de promoteurs a été développée avec une construction 3-

glucuronidase (GUS) dépourvue de promoteur. Cette construction est introduite au hasard dans le génome d'Arabidopsis grâce à la transformation par l'ADN-T d'Agrobacterium (Kerbundit et al., 1991; Topping et al., 1991; Goddijn et al., 1993). Cette approche "d'étiquetage" est utilisée dans plusieurs laboratoires, et des lignées étiquetées ont récemment été identifiées. Toutefois, en dépit des modes d'expression intéressants dans les NFS, aucune de ces régions d'ADN-T fManquantes

n'a présenté d'homologie avec des gènes connus (Barthels et al., 1997).

La présente invention a pour objet la mise en évidence d'un gène de réponse aux nématodes soumis à une forte activation dans les stades précoces de la formation de cellules géantes induite par M. incognita chez Arabidopsis. Ce gène code pour la D-ribulose-5-phosphate 3- épimérase (RPE), une enzyme impliquée dans la voie des pentoses phosphate. Cette activation est également observée dans les syncytia induits par H. schachtii, mais à un moindre degré et plus tard après l'infection par les nématodes. Par ailleurs, les inventeurs ont démontré que ce gène est régulé de manière similaire dans la pomme de terre après infection aussi bien par les nématodes à kystes que par les nématodes à galles. Enfin, l'implication de cette enzyme dans les sites d'initiation des racines latérales indique que le contrôle génétique des NFS et les premiers stades de formations des ces organes ont des étapes communes et confirme que les cellules de racines subissent une

redifférenciation lors de la transformation en NFS.

Ce gène RPE est vraisemblablement directement impliqué dans la constitution biochinmique des cellules géantes. Le gène RPE a été cloné après étiquetage à l'aide d'un ADN-T portant le gène gusA sans promoteur en utilisant une méthode de transformation in planta (Bechtold et al., 1993). I s'agit de la première fois que l'on décrit l'isolement d'un gène activé dans les NFS par une

stratégie d'étiquetage.

L'ADNc complet du gène RPE d'Arabidopsis thaliana est représenté par SEQ ID N 1. Par la technique d'amplification des ADNc (RACE PCR), les inventeurs ont également mis en évidence le gène RPE chez le riz. SEQ ID N 2

correspond à l'ADNc complet du gène RPE d'Oryza sativa.

Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie: a) d'une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 40 % d'identité et de

préférence au moins 70 % d'identité avec a) ou b).

2 5 Les pourcentages d'identité mentionnés tiennent notamment compte de la dégénérescence du code génétique et d'éventuelles mutations n'affectant pas

l'activité du produit de la séquence de référence.

Par rapport à la transformation classique in vitro (Koncz et al., 1989; Kertbundit et al., 1991); Topping et al., 1991), les lignées étiquetées obtenues par une transformation in planta ont présenté une plus faible fréquence d'activité GUS (7 %). Cependant, cette fréquence semble être en meilleur accord avec un événement aléatoire d'insertion d'ADN-T à proximité d'un promoteur végétal. Cette différence serait due à la structure du vecteur lui-même, à des différences spécifiques dans le processus de transformation ou dans le nombre de copies d'inserts d'ADNT. En particulier, la sélection précoce dans les protocoles classiques de transformation peut introduire un biais pour l'insertion dans les régions "actives" du génome. Dans la transformation in planta, la sélection pour les transformants est appliquée au

niveau de la graine, vraisemblablement bien longtemps après la transformation elle-

1 0 même (Bouchez et al. 1993).

Le criblage ou l'expression GUS après l'infection M. incognita a montré que l'expression de plusieurs gènes normalement exprimés à différents moments de développement ou dans différents types cellulaires est soumise à une activation dans les cellules géantes. Ces résultats chez Arabidopsis sont conformes aux observations précédentes chez la tomate (Bird et Wilson, 1994) et confirment les changements morphologiques et physiologiques complexes dans les cellules lors de leur modification en sites nourriciers de nématodes (Jones, 1981; pour revue voir

Atkinson et al., 1994; Niebel et al., 1994).

Comme décrit dans les exemples ci-après, les inventeurs ont également

mis en évidence le promoteur du gène RPE d'Arabidopsis thaliana représenté ci-

après par SEQ ID N 3. Par conséquent, la présente invention concerne également une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie: a) de SEQ ID N 3, b) d'une séquence s'hybridant à SEQ ID N 3, ou c) d'une séquence présentant au moins 40 % d'identité et de

préférence au moins 70 % d'identité avec a) ou b).

Les pourcentages d'identité mentionnés tiennent notamment compte

d'éventuelles mutations n'affectant pas l'activité de la séquence de référence.

Ce produit du gène RPE (ou D-ribulose-5-phosphate 3-épimérase (EC 5.1.3. 1), appelée également pentose-5-phosphate 3-épimérase) catalyse l'interconversion réversible de ribulose-5-phosphate en xylulose-5phosphate. Chez les plantes, l'enzyme RPE fait partie intégrante aussi bien de la voie oxydative des pentoses phosphate (OPPP) que du cycle réducteur de Calvin (Dennis et Turpin, 1990; Schnarrenberger et al., 1995). Arabidopsis semble posséder une seule enzyme RPE à localisation plastidiale, codée dans le noyau, comme chez la pomme de terre (Teige el al., 1995) et l'épinard (Schnarrenberger et al., 1995; Nowitzki et al., 1995). L'expression de la RPE dans les tissus photosynthétiques et le phénotype de mutant vert pâle sauvé sur milieu contenant du saccharose sont en accord avec l'implication de cette enzyme dans le recyclage de sucre-phosphate dans le cycle de Calvin. Néanmoins, la RPE n'est pas exprimée uniquement dans les tissus verts contenant des chloroplastes, comme précédemment décrit (Teige et al., 1995), mais également dans certaines zones racinaires. Le transcript de RPE a été détecté dans les cellules en prolifération des extrémités des racines et dans le petit sous-ensemble de cellules impliquées dans l'initiation des racines latérales. Les racines latérales sont produites lorsque les méristèmes se développent de novo à partir d'une ou de quelques cellules au sein du péricycle, un tissu différencié entourant le cylindre vasculaire (Peterson et Peterson, 1984). Par contre, on n'observe jamais d'expression dans la coiffe et dans la zone de spécialisation des racines, o les cellules ont acquis leurs caractères différenciés (Schiefelbein et Benfey, 1991). Le mode d'expression de RPE dans les racines est très similaire, sinon identique, à ceux observés chez Arabidopsis pour d'autres gènes impliqués dans la compétence à la division cellulaire ou dans la croissance, tels que la cycline de type mitotique CYCIAt (Ferreira et al., 1994) et la kinase cycline-dépendante CDC2a (Hemerly et al., 1993). L'expression de la RPE dans les cotylédons d'embryons matures peut être corrélée à l'endoréduplication de l'ADN au cours de la polyploidisation des cellules (Brown et al., 1991). Ces résultats confirment que l'activation de la voie de l'OPPP permet un taux de biosynthèse élevé dans les cellules en forte croissance. L'OPPP joue un rôle critique dans les cellules en produisant le NADPH nécessaire à de nombreuses réactions de biosynthèse (par exemple des acides gras et des composés isoprénoides tels que les stérols) et en générant des intermédiaires glucidiques pour la synthèse de nucléotides et de polymères de la paroi cellulaire (figure 6) (Wood,

1986).

Le degré de conservation entre les séquences de A. thaliana et d'épinard suggère que RPE code également pour une enzyme fonctionnelle. La RPE des plantes est plus proche des homologues des cyanobactéries et eubactéries que de la séquence de levure. L'analyse phylogénique de ces séquences supporte l'hypothèse que les plantes supérieures ont obtenu leur gène RPE à partir des 1 0 eubactéries (peut-être des cyanobactéries) par l'intermédiaire d'un transfert endosymbiotique (de l'organite au noyau) des gènes (Nowitzki et al., 1995), semblable au scénario observé pour le GADPH chloroplastique (Martin et al., 1993)

et la 3-phosphoglycérate kinase chloroplastique (Brinkmann et Martin, 1996).

Comme indiqué précédemment, la RPE est soumise à une activation au cours des stades précoces de la formation de cellules nourricières induite par Meloidogyne spp. mais non par les nématodes à kystes (H. schachtii et G rostochiensis). Ultérieurement, la RPE s'accumule dans les deux types de NFS en développement et durant tout le cycle vital des nématodes. Ceci est en accord avec l'hypothèse admise selon laquelle les cellules géantes et les syncytia, en dépit d'une ultrastructure analogue, different complètement dans leur processus de formation (Jones, 1981). Les cellules géantes se développent par mitose répétée sans cytokinèse suivie d'une expansion cellulaire. L'état multinucléé des syncytia résulte

de la dissolution de la paroi cellulaire et de la coalescence des cellules adjacentes.

Dans ce cas, on n'a jamais rapporté de division cellulaire et de chromosomes en

métaphase.

Toutefois, chez A. thaliana, les régulateurs clef du cycle cellulaire CDC2a et CYC1At sont induits de manière précoce au cours des stades initiaux de la formation des deux NFS (Niebel et al., 1996). L'expression tardive de RPE dans

les syncytia est en accord avec les expériences précédentes d'incorporation de 3H-

thymidine, qui indique que les syncytia sont relativement quiescents en terme de synthèse d'ADN contrairement aux cellules géantes qui nécessite une synthèse

importante au cours des stades précoces de l'induction (Gheysen et al., 1997).

Le mode d'expression de RPE indique que le contrôle génétique et les événements moléculaires de la formation des cellules géantes et les premiers stades de la formation des méristèmes ont des étapes en commun. Ce résultat confirme que les cellules des racines subissent une redifférentiation lorsqu'elles se tranforment en NFS. Certains parasites animaux tels que Trichinella spiralis provoquent des changements analogues dans les cellules musculaires de mammifères différenciées (Jasmer, 1995). La voie des pentoses phosphate joue un rôle clef dans la relation hôte-parasite protozoaire. Elle maintient un pool de NADPH qui sert à la protection contre les stress oxydants et qui génère les intermédiaires glucidiques utilisés dans les voies de biosynthèses des nucléotides et d'autres voies biosynthétiques (Barett,

1997).

Le parasite humain Plasmodiumfalciparum stimule également l'activité de cellules hôtes (Atamna et al., 1994) et la déficience dans la première enzyme de la voie, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, protège les érythrocytes humains d'une infection (Ruwende et al., 1995). Des activités prononcées d'autres enzymes de l'OPPP, les glucose-6-phosphate et 6-phospho-gluconate déshydrogénases, ont été trouvées dans des préparations histochimiques des cellules géantes (Endo et Veech, 1969). L'activation de l'OPPP et d'autres enzymes clef du métabolisme cellulaire, telles que la HMGCoA réductase (Bleve-Zacheo et Melillo, 1997), dans les cellules géantes est en accord avec l'établissement d'un puits métabolique actif qui fournit de la nourriture au nématode en cours de développement. Ces résultats supportent l'hypothèse selon laquelle les fonctions biochimiques "normales" ont été recrutées pour jouer des rôles clef dans l'arrêt de la croissance des pathogènes

(Opperman et al., 1994b).

Les mécanismes par lesquels les nématodes influent sur le métabolisme des cellules végétales doivent avoir en commun des caractéristiques régulatrices chez différentes espèces végétales dans la mesure o un ensemble d'espèces de nématodes sédentaires est capable de développer des NFS chez de nombreux hôtes végétaux (Goddijn et al., 1993). Nous avons démontré que le gène RPE est régulé de manière analogue chez la pomme de terre après infection par des nématodes parasites sédentaires (G. rostochiensis et M. chitwoodi). Ces résultats confirment qu'Arabidopsis, en plus d'être idéalement adaptée à la dissection génétique du développement (Meyerowitz, 1989), est également un bon modèle de plante hôte pour étudier les interactions moléculaires avec les nématodes parasites (Sijmons et al., 1991; Niebel et al., 1994). L'identification et le clonage de gènes et de promoteurs végétaux répondant aux nématodes constituent un objectif majeur pour la compréhension de l'interaction plante-nématode et le développement de nouvelles approches pour créer de nouvelles normes de résistance des plantes (pour revue voir

Gheysen etal., 1996; Grundler, 1996).

Dans le cadre de la présente invention, la séquence protéique du gène RPE d'Arabidopsis thaliana et celle du gène RPE d'Oryza sativa ont également été

déterminées; elles correspondent respectivement à SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5.

Par conséquent, la présente invention a également pour objet une séquence protéique correspondant à tout ou partie: a) d'une séquence choisie parmi SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5, ou b) d'une séquence codée par une séquence telle que définie dans la revendication 1

c) d'une séquence dérivant d'une séquence selon a) ou b).

Par l'expression "séquence dérivant d'une séquence", on entend toute séquence présentant la même activité que la séquence de référence et pouvant

comprendre des mutations.

Au vu de ce qui précède, il apparaît clairement que les inventeurs ont mis en évidence tout un arsenal de moyens susceptibles d'être utilisés dans la lutte

contre les nématodes.

En effet, la présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de plantes résistantes aux nématodes ou au moins présentant une susceptibilité à ceux-ci amoindrie par rapport à la plante sauvage. Le procédé en question comprend au moins une étape de transformation de cellules de plantes de façon à y introduire des éléments perturbateurs de l'action des nématodes au niveau des cellules de racines desdites plantes redifférenciées en sites nourriciers multi- nucléés. La transformation en question peut se faire soit directement, soit indirectement au moyen d'un vecteur comprenant les susdits éléments dits "perturbateurs". Par transformation directe, on entend toute transformation d'une cellule de plante réalisée directement par un vecteur selon des techniques connues de l'homme du métier telles qu'au moyen d'une micropipette pour assurer le transfert mécanique de l'ADN, à l'aide de polyéthylène glycol, par pénétration balistique à haute vitesse au moyen de petites particules contenant soit à l'intérieur soit à leur surface l'acide nucléique à faire pénétrer dans la cellule de plante, par fusion de protoplastes avec d'autres entités, cellules, lysosomes ou autres corps de surfaces lipidiques susceptibles de fusionner, ou par électroporation. La transformation de cellules de plantes peut également être réalisée par l'insertion de la séquence nucléique d'intérêt au sein d'un plasmide recombinant par exemple d'origine 2 0 bactérienne dans lequel a été préalablement inséré le génome d'un ADN viral tel que celui du virus de la mosaique du choux- fleur, le plasmide résultant étant utilisé pour

transformer les cellules de plantes.

Par "transformation indirecte", on entend une formation consistant par exemple à transformer un microorganisme tel qu'Agrobacterium tumefaciens au moyen de la susdite séquence nucléique, ledit microorganisme étant ensuite utilisé

pour transformer les cellules de plantes.

Ainsi, la présente invention a également pour objet un vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie: l1 a) d'une séquence choisie parmi SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 40 % d'identité et de préférence au moins 70 % d'identité avec a) ou b), placée sous le contrôle d'éléments nécessaires à son expression. Par "éléments nécessaires à son expression", on désigne les éléments génétiques permettant la transcription d'un gène d'intérêt ou d'une partie de ce gène en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Dans le cas présent, il peut s'agir du promoteur naturel du gêne en question. De faç,on préférentielle, le promoteur ou partie de promoteur mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est spécifique des sites nourriciers et en particulier correspond à tout ou partie de SEQ ID N 3, d'une séquence s'hybridant à SEQ ID N 3, ou d'une séquence présentant au moins 40 %

d'identité et de préférence au moins 70 % d'identité avec a) ou b).

Avantageusement, la séquence comprise dans le vecteur tel que ci-

dessus définie est dans une orientation antisens. Ainsi, l'introduction dans des plantes transgéniques de telles séquences devrait interférer avec le fonctionnement

du gêne RPE endogène.

De plus, à l'instar du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase, la présente invention peut comprendre la mise en oeuvre de toute autre enzyme de la voie des pentoses phosphate susceptibles de présenter une activité similaire voire identique o celle du gène RPE dans le parasitisme des plantes par les nématodes ou

autres parasites.

Une autre approche de la lutte contre les nématodes consiste à faire exprimer dans les cellules de plantes un gêne codant pour un composé toxique pour ceux-ci. Ce composé peut avoir pour effet direct la mort des nématodes (il s'agit alors par exemple de toxines nématocides, de lectines, de collagénases, d'inhibiteurs de protéases, d'anticorps...) ou avoir pour premier effet de rendre incapable les nématodes d'effectuer une étape importante dans leur développement ou leur

fécondité, provoquant à terme leur mort.

La présente invention a donc également pour objet un vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence promotrice telle que définie précédemment placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un composé toxique pour les nématodes. Il faut souligner que les composés toxiques peuvent également être dirigés non pas vers les nématodes mais vers les sites nourriciers des nématodes et provoquer la mort de la cellule végétale ayant subi une redifférentiation en site nourricier multinucléé. Dans ce cas, les composés toxiques peuvent être choisis parmi les DNAses, les RNAses, les inducteurs de mort cellulaire, les associations de

produits d'un gène de résistance et d'un gène d'avirulence, les ARN antisens...

Dans le cadre de la mise en oeuvre de ces types de composés toxiques, la formation et/ou le fonctionnement des structures nourricières induits par les nématodes sont fortement pertubé(s) voir bloqué(s) en agissant sur l'un et/ou sur l'autre des

protagonistes conduisant sinon à la mort de la plante.

La présente invention a donc également pour objet un vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence promotrice telle que définie précédemment placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un composé

toxique pour les sites nourriciers de nématodes.

Une autre voie de lutte contre le parasitisme des plantes par les nématodes consiste à faire exprimer au sein de cellules de plantes, une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un anticorps dirigé contre le produit du gène RPE, à savoir l'enzyme D-ribulose-5-phosphate-3- épimérase et plus particulièrement contre une séquence protéique correspondant à tout ou partie: a) d'une séquence choisie parmi SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5, ou b) d'une séquence codée par une séquence telle que définie dans la revendication 1, ou

c) d'une séquence dérivant d'une séquence selon a) ou b).

La présente invention a donc également pour objet un vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence promotrice telle que définie précédemment placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour tout ou partie

d'un anticorps dirigé contre une protéine dont la séquence est définie ci-dessus.

La présente invention a de plus pour objet des cellules de plantes transformées directement ou indirectement par un vecteur tel que cidessus défini ainsi que les plantes comprenant lesdites cellules. Elle concerne également un procédé d'obtention de plantes transgéniques comprenant les étapes de transformation de cellules de plantes directement par un vecteur conforme à la présente invention ou indirectement par un microorganisme apte à transformer des cellules de plantes et lui-même préalablement transformé par un vecteur conforme à l'invention, et de régénération de ladite plante transgénique. De plus, la présente invention a pour objet les plantes susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre

du procédé ci-dessus décrit.

Ces plantes sont choisies dans le groupe comprenant les pommes de

terre, les tomates, les betteraves, le colza et le riz.

Enfin, il est à souligner que les inventeurs ont pu constater que le

mutant d'Arabidopsis thaliana déficient de façon homozygote en Dribulose-5-

phosphate 3-épimérase, obtenu par mutagénèse insertionnelle, ne germe pas en terre mais peut être "sauver" in vitro sur un milieu de culture contenant du saccharose à 2 %. Il présente alors un phénotype nain avec une coloration vert clair des feuilles. Sur cette base, les inventeurs ont établi une analogie avec les souches de la bactérie Bacillus spp.déficient en D-ribulose-5-phosphate 3-épimérase qui sont utilisés en biotechnologie pour la production de D-ribose. Les applications du D-ribose et de ses dérivés sont très nombreuses en pharmacie, médecine, cosmétique, alimentation

humain et animale (De Wulf et Vandamme, 1997).

La figure I représente la carte de restriction partielle du gène RPE muté par l'insertion de l'ADN-T. Les flèches indiquent les séquences codantes et les boîtes noires les régions promotrices et terminales. RB et LB correspondent respectivement aux bordures droite et gauche de l'ADN-T. uidA, région codante de la 3-glucuronidase (gène rapporteur) de E. coli; 3'nos et P nos, région 3' et région promotrice du gène de la nopaline synthase; 3'ocs, région 3' du gène de l'octopine synthase; nptII, néomycine phosphotransférase I; P 35S, région promotrice du virus de la mosaïque de chou-fleur; bar, région codante du gène de résistance au basta de Streptomyces hygroscopus; 3'g7, région 3' du gène 7 de l'ADN- T de pTi15955 (Bouchez et al., 1993). Les positions des sondes correspondant à uidA4 (GUS) et la bordure gauche (LB) de l'ADN-T sont indiquées par des barres épaisses. La boîte

hachurée désigne la délétion d'ADN génomique après l'intégration de l'ADN-T.

Les oligonucléotides T4 et T5 utilisés pour l'IPCR, Ul, RA2, LA2 et LAI sont

indiqués par de petites flèches.

La figure 2 représente l'organisation du gène de RPE et en particulier la structure du gène RPE et de son transcript. Les traits noirs pleins désignent les introns; les boîtes vides désignent les exons (I à X, déterminés à partir de l'ADNc; les boîtes en gris désignent les séquences non traduites; la boîte en gris désigne le peptide signal putatif; et la boîte hachurée désigne la délétion d'ADN génomique après l'intégration de l'ADN-T. L'ADN-T est inséré dans le troisième intron. ATG et TGA, codon d'initiation et codon d'arrêt de la Met respectivement. EST (Etiquettes de Séquences Exprimées) d'Arabidopsis montrant de fortes homologies avec le gène ont été obtenues après une recherche par BlastN sur la base de données

d'Arabidopsis de Stanford (Altschul et al., 1990).

La figure 3 représente l'alignement de la séquence d'acides aminés déduite de RPE d'Arabidopsis (RPE_ATH) avec des séquences protéiques apparentées à la ribulose-5-phosphate 3-épimérase. Les sources de séquences sont Solanum tuberosum, STPPEPIMR (Z50098, Teige et al., 1995); Spinacia oleracea, SPIR5P3E (L42328, Nowitzki et al., 1995); Oryza sativa, RPE_RICE; Synechocystis sp., RPE SYN (D90911, Keneko et al., 1996); Serratia marcescens, RPE_SERMA (P45455); Haemophilus influenza, RPE_HAEIN (P44756, Fleischmann et al., 1995); Alcaligenes eutrophus, RPEP_ALCEU (Q04539) et RPECALCEU (P40117, Kusian et al., 1992); E. coli, RPE_ECOLI (P32661, Lyngstadaas et al., 1995), YJCU_ECOLI (P32719) et YLHK_ECOLI (P39362, Blattner et al., 1993); Rhodobacter capsulatus, RPERHOCA (P51012, Larimer et ai., 1995); Rhodospirillum rubrum, RPE_RHORU (P51013, Falcone et Tabita, 1993); Mycobacterium tuberculosis, RPE_MYCOB (Z80108); Saccharomyces cerevisiae, RPEYEAST (P46969, Miosga et Zimmermann, 1996). Les résidus strictement conservés sont indiqués par un astérisque. Le peptide-signal putatif et les

deux régions conservées choisies comme signatures de la ribulosephosphate 3-

épimérase (PDOC00833, Prosite PS01085 et PSO1086) sont indiqués dans des boites. Le dodécapeptide en dessous de la séquence de levure a été écarté de l'alignement car ce fragment d'ADN inséré est suspecté d'être un intron (Nowitski et al., 1995). L'ensemble de la séquence de l'ADNc de RPE d'Arabidopsis et de riz seront disponibles à partir de GenBank/EMBL/DDBJ sous les numéros respectifs

d'accession AF015274 et AF047444.

La figure 4 représente un dendrogramme non enraciné de "neighbor-

joining" des relations entre les protéines apparentées à la ribulose-5phosphate 3-

épimnérase de plante, de levure, et de bactéries. La barre d'échelle représente une distance génétique de 0,073 comme la fréquence de substitutions d'acides aminés en comparaison par paire de deux séquences selon la méthode de Kimura à deux paramètres (1980). Le support bootstrap (données échantillonnées 1 000 fois) pour les groupements apparents est donné. Les sources de base de données de séquences sont données dans la légende de la figure 3. La figure 5 rend compte de la mise en oeuvre de la PCR compétitive

pour la quantification de l'ARNm de RPE chez Arabidopsis et la pomme de terre.

(A) Tracé du rapport de la matrice compétitrice en fonction de l'ADNc cible après

amplification. L'encart montre un agrandissement de la gamme de 104 ng à 104 ng.

Le point d'équivalence (c'est-à-dire o il y a un rapport de 1:1) représente la concentration d'ADNc dans l'échantillon (flèche). (B) Quantification des transcripts

de RPE par PCR compétitive chez Arabidopsis et la pomme de terre.

La figure 6 représente le métabolisme du glucose par la voie des pentoses phosphate et la relation avec la glycolyse. Les fonctions cellulaires principales des voies sont indiquées, et les rôles de la NADPH sont inclus. G6PDH, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; PGDH, la 6-phosphogluconate

déshydrogénase; RPE, la ribulose-5-phosphate-3-épimérase; RPI, la ribose5-

phosphate isomérase; TKL, la transcétolase.

La présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. Elle

2 0 sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne sont donnés qu'à titre illustratif.

EXEMPLES

Exemple 1: Matériel et Méthodes 1.1. Matières végétales et infection par les nématodes Une collection de graines de A. thaliana (L.) Heyn mutagénisées par l'ADN-T (3 000 lignées) a été obtenue et caractérisée précédemment à l'INRA de Versailles (Bechtold et al., 1993). Le vecteur de transformation des plantes pGKB5, conçu pour le piégeage de promoteurs et l'étiquetage de gènes (Bouchez et al., 1993), a été utilisé pour transformer A. thaliana sauvage, écotype Wassilewskija (WS), par infiltration sous vide. Les plantes ont été cultivées en serre sur sable à C avec 16 h de lumière et 8 h d'obscurité. Les semrnis ont été incubées à 4 C pendant 2 jours à l'obscurité pour synchroniser la levée. Les semis T3 étiquetés par I'ADN-T ont été sélectionnés avec l'herbicide Basta. Des lignées âgées de trois

semaines ont été inoculées avec cent larves de M. incognita de deuxième stade (J2).

Une et deux semaines après l'inoculation, les plantes ont été récoltées avec précaution par rinçage dans de l'eau et soumises au test de détection GUS comme décrit ci-dessous. Pour les analyses in vitro des plants, les graines ont été stérilisées en surface et cultivées sur milieu Gamborg B5 (Sigma) contenant 1 % de saccharose, 0,8 % de gélose ("cell culture tested", Sigma) et 50 pg/ml de kanamycine. La résistance à la kanamycine a été notée chez les plants âgés de 2 semaines. Pour l'infection in vitro par les nématodes, cent J2 de M. incognita ou H. schachtii nouvellement éclos, stérilisés en surface, ont été ajoutés sur chaque plant âgé de 2 semaines comme décrit précédemment (Sijmons et al., 1991). Les plaques ont été stockées à 200C avec un cycle de 16 h de luminière/8 h d'obscurité. Des expériences d'induction de GUS en fonction du temps ont été effectuées chaque jour après l'infection par des nématodes. Les plantes de pomme de terre Solanum tuberosum L. cv Désirée ont été cultivées en serre et inoculées avec des J2 de M.

chiitwoodi ou avec des kystes de G. rostochiensis dans les mêmes conditions.

1.2. Localisation histochirnique de l'activité GUS L'activité de la P3glucuronidase (GUS) a été dosée par voie histochimique avec du X-Glu selon la méthode de Jefferson et al. (1987), modifiée par l'utilisation de tampons K3Fe(CN)6 0,5 mM et K4Fe(CN)6 0,5 mM dans du NaH2PO4 0,1 M, pH 7 pour empêcher d'éventuels artefacts de marquage (De Block et Debrouwer, 1992). Pour les analyses microscopiques, des galles de plantes colorées à X-Glu ont été excisées, fixées pendant 30 s dans un four à micro-ondes (température 50 C fixe) dans du formaldéhyde à 2 %/glutaraldéhyde à 4 % préparé extemporanément dans du tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2 (PBS), lavées dans du PBS, incluses dans du Composé OCT (BDH Laboratory Supplies) et congelées dans de l'isopropane refroidi par l'azote. Le matériel inclus congelé a été

sectionné à 6 pn (à -20 C) en utilisant un cryomicrotome Leica JUNG CM 1800.

Les plantes entières et les cryocoupes ont été observés sous un microscope Zeiss

Axioplan 2 en fond noir pour augmenter la sensibilité de la détection.

1.3. Analyse de Southemrn-Blot et d'ARN Pour l'analyse en "SouthernBlot", l'ADN génomique a été isolé à partir de plantes âgées de 4 semaines cultivées in vitro, comme décrit par Doyle et Doyle (1990). Des Southern-blot ont été réalisés comme décrit par Sambrook et al. (1989), en utilisant 5!g d'ADN génomique. Pour l'analyse d'ARN de RPE sur l'Arabidopsis sauvage et la pomme de terre, des galles et des syncytia ont été excisés après infection par des nématodes. A titre de comparaison, des tissus de racines (fragments de racines non méristématiques, des extrémités de racines, des sites

d'initiation de racines latérales) ont été obtenus à partir de plantes non infectées.

Tous les tissus ont été rapidement récoltés et avec un minimum de manipulation, congelés immédiatement dans de l'azote liquide et stockés à -80 C jusqu'à l'utilisation. L'ARN total a été isolé comme décrit par Chomczynski et Sacchi (1987). L'ARN poly(A) a été isolé avec le kit Quickprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia P-L Biochemicals Inc.) selon les instructions du fabricant. Les échantillons d'ARN ont été séparés sur un gel d'agarose contenant du formaldéhyde,

soumis à un transfert et hybridé comme décrit par Samrnbrook et al. (1989).

1.4. Isolement de séquences flanquantes d'ADN-T La récupération de plasmide ("Kanamycin Plasmid Rescue") comportant la séquence flanquante de la bordure droite d'ADN-T, a été réalisé comme décrit par Bouchez et al. (1996). L'ADN génomique de plantes transgéniques a été digéré par PstI (site unique au début du gène nptll) et ligaturé dans le vecteur pResc 38. Des cellules d'Escherichia coli DH12S (Gibco-BRL) ont été transformées avec le mélange de ligation. La sélection par l'ampicilline et la kanamycine a permis de sélectionner des clones contenant la région complémentaire de l'ADN-T plus une région d'ADN génomique flanquante. L'amplification par PCR inverse (IPCR) des séquences flanquantes de la bordure gauche de l'ADN-T a été réalisée comme décrit par Earp et al. (1990). L'ADN génomique des plantes transgéniques a été digéré par BglII et ligaturé avec la T4 ADN ligase. La réaction

de PCR a été effectuée avec les oligonucléotides de l'ADN-T T4 (5'-GTACAT-

TGC-CGT-AGA-TGA-AAG-ACT-3' correspondant à SEQ ID N 6) et T5 (5'-

CTA-CAA-ATT-GCC-TTT-TCT-TAT-CGA-C-3' correspondant à SEQ ID N 7) comme représenté à la figure 3C. Les oligonucléotides T4 et T5 s'hybrident

respectivement à 500 pb et à 300 pb de la bordure gauche de l'ADN-T 3'.

L'amplification a été effectuée avec un cycle de 1 min de dénaturation à 94 C, 1 min d'hybridation à 58 C, et 2 min d'élongation par la polymérase à 72 C, répétée 35

fois avec une élongation finale de 10 min à 72 C dans un cycleur MJ Research PTC-

Peltier Thermal Cycler. Le fragment amplifié a été cloné et séquencé avec le kit

de séquençage utilisant la T7 polymérase (Pharmacia).

1.5. RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) 2 0 L'extrémité 5' de l'ADNc de RPE a été clonée par le kit 5!RACE (Gibco BRL) avec de l'ARN poly(A)4 provenant de A. thaliana sauvage écotype WS (Frohman et al., 1988). Des ADNc premiers brins ont été réalisés en utilisant

l'amorce anti-sens spécifique de RPE LA1 (5' -CCT-TGA-ACG-CAT-TCG-CTG-

GAG-TGA-C-3' correspondant à SEQ ID N 8). Après l'addition d'une queue

polyC, l'amplification par PCR a été réalisée avec une amorce d'ancrage (5'-CTA-

CTA-CTA-CTA-CTA-GGC-CAC-GCG-TCG-ACT-AGT-ACG-GGI-IGG-GII-

GGG-IIG-3' correspondant à SEQ ID N 9) et une amorce anti-sens interne spécifique de RPE LA2 (5'-GAT-ACC-TTC-TCT-GCA-CAC-ATT-TTC-C-3' correspondant à SEQ ID N 10). Le cycle PCR était à 94 C pendant 1 min, à 55 C pendant 2 min, à 72 C pendant 2 min, répété 35 fois, avec une élongation finale de min à 72 C. L'extrémité 3' de l'ADNc de RPE a été clonée en utilisant les ADNc

premiers brins réalisés avec une amorce oligo (dT) (5'-TGA-AGG-TTC-CAT-

GAA-TCG-ATA-GGA-ATT-CTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TVN-3'

correspondant à SEQ ID N 11). La réaction de PCR a été réalisée avec l'amorce 3RACE (5'-TGA-AGG-TTC-CAT-GAA-TCG-ATA-G-3' correspondant à SEQ ID

N 12) et l'amorce spécifique RA2 (5'-CAG-AAG-GAG-AAC-TCA-TGG-AAT-

TG-3' correspondant à SEQ ID N 13). Les produits de PCR ont été clonés dans

pUAg (Ingenius) et séquencés.

1.6. Cartographie Le gène de RPE a été cartographié par les inventeurs (données non montrées) sur la banque génomique de chromosome artificiel de levure (YAC) de A. thaliana (écotype Columbia) CEPH-INRA-CNRS (CIC) (Creusot et al., 1995). Le criblage par hybridation sur membrane a été réalisé avec l'ADNc de RPE comme sonde. 1.7. La RT-PCR compétitive pour la quantification de l'ARNm Des ARN poly(A)+ provenant de galles induites par M. incognita et de racines d'Arabidopsis WS ont été transcrits en utilisant le kit First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) avec l'amorce oligo(dT). Les ADNc premiers brins résultants ont été utilisés comme matrice pour l'amplification par PCR. Pour quantifier avec précision l'abondance de l'ADNc de RPE, une matrice compétitrice a été créée par délétion de 35 pb (fragment EcoRV/StuI) d'un fragment de l'ADNc de RPE (573 pb) amplifié par PCR à l'aide de RA2-LA2 (SEQ ID N 13 - SEQ ID N ). Une série de dilution précise a été préparée, allant de 1 i 10-7 ng de matrice compétitrice (538 pb). Une titration initiale par PCR a été effectué à l'aide d'une large gamme de dilutions en augmentations log. Une deuxième quantification plus précise a alors été réalisée sur une gamme de dilutions plus étroite. La précision de cette méthode est améliorée par l'utilisation de solutions mères. Une solution mère a été préparé contenant, par réaction, les oligonucléotides RA2 et LA2, 10 pmoles chacun, des dNTP 200 lg chacun, du tampon PCR X 1, 0,5 U de taq ADN polymérase (Appligene), et 1 Al d'ADNc premier brin. 90 pl de ce mélange ont été ajoutés à 10 ffl de matrice compétitrice préparée précédemment. Les réactions de PCR ont été effectuées dans les conditions suivantes (35 cycles): 94 C, 1 min; 55 C, 1 min; 72oC, 2 min. Dans la mesure o tout changement dans les variables influençant l'efficacité de la PCR affecte de la même manière le rendement de la PCR sur l'ADNc compétiteur et de la PCR sur l'ADNc cible, le rapport relatif des deux produits reste inchangé. Les quantités relatives de chaque produit de PCR ont été directement quantifiées à l'aide d'un densitomètre, sur gels d'agarose à 2 %, colorés au bromure d'éthidium. La quantité de compétiteur est multipliée par le rapport de taille ADNc cible sur compétiteurs pour corriger la coloration accrue à l'éthidium du fragment plus grand. Le produit compétiteur par produit cible a été porté en fonction de la concentration initiale de compétiteur. Au point o l'ADNc et les produits compétiteurs sont en équivalence, la concentration initiale d'ADNc de RPE ajouté à la réaction de PCR est égale à la concentration connue de l'ADNc

compétiteur délété.

Des RT-PCR compétitives ont également été réalisées sur de l'ARN poly(A)+ de galles induites par M. chitwoodi, de syncytia induits par G.

rostochiensis, et de tissus de racines de pommes de terre. Les amorces RP2 (5'-

CTT-TCA-CCA-GGA-GGA-GAA-TTC-A-3' correspondant à SEQ ID N 14) et LP2 (5'-CTC-AAG-TCC-GAG-ATT-TTC-TT-3' correspondant à SEQ ID N 15) étaient complémentaires respectivement des extrémités 5' et 3' de la séquence codant pour la RPE de S. tuberosum. Dans ce cas, la matrice compétitrice est un ADNc

délété de RPE de pomme de terre de 50 pb obtenu après restriction parMseI.

1.8. Analyse de la séquence d'ADN Le programme de recherche BLAST (Altschul et al., 1990) a été utilisé pour l'analyse de séquence et des comparaisons dans les bases de données de Genbank, EMBL, et swissProt au Centre National d'Informations sur la Biotechnologie (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/) et dans le projet de

base de données sur Arabidopsis (AtDB Arabidopsis Database) (http://genome-

www.stanford.edu/Arabidopsis/). Les alignements de séquences multiples et le dendrogramme de "neighbor-joining" non enraciné ont été réalisés par CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). La signification des résultats phylogénétiques a été

évaluée par analyse bootstrap (Felsenstein et al., 1985). PROSITE (http://expasy.

hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html) permet de scanner une séquence protéique pour les

profils de signature.

1.9. Numéro d'accession

Les données de séquences sur l'ADNc de ribulose-5-phosphate 3-

épimérase d'Arabidopsis thaliana et de riz ont été soumises aux banques de données de DDBJ/EMBJL/Genbank et seront disponibles respectivement sous le numéro

d'accession AF015274 et AF047444.

Exemple 2: Résultats 2.1. Caractérisation de la lignée étiquetée RPE 2 0 Pour isoler des lignées étiquetées montrant l'induction ou la répression de l'expression GUS dans les galles, nous avons criblé une collection de lignées d'Arabidopsis (écotype WS) étiquetées par l'ADN-T, obtenues par transformation inplanta (Bechtold et al., 1993, Bouchez et al., 1993). Les lignées ont été criblées par coloration GUS sept jours après l'infection avec M incognita. A partir de 3 000 lignées étiquetées par l'ADN-T qui ont été testées, 25 lignées transgéniques ont présenté une expression accrue de l'expression GUS, et trois lignées transgéniques ont présenté une expression réprimée GUS dans les galles. Dans les autres tissus, une activité de GUS a été détectée dans 7 % des transformants. Aucune des lignées

étiquetées n'a présenté une expression GUS limitée exclusivement aux galles.

L'expression a été observée dans d'autres parties des plantes et au moins toujours dans l'apex des racines. L'une de ces lignées, dénommée RPE, a présenté une expression précoce et forte de GUS dans les galles. Elle présentait une ségrégation anormale (2:1 au lieu de 3:1) du marqueur de résistance à la kanamycine porté par I'ADN-T, ce qui suggère un mutant altéré dans la germination (embryon létal, viabilité des graines ou germination). Des 435 graines T2 testées, 287 ont poussé sur un milieu contenant de la kanamycine et ont présenté un phénotype normal par rapport au type sauvage. Cette fréquence était bien conforme à l'hypothèse d'un rapport résistant à la kanamycine (Kt) sur sensible à la kanamycine (KS) de 2:1 (x2=0,09; P>0,05), ce qui suggère également que l'ADN-T a été inséré à un locus nucléaire. Pour analyser précisément à quel stade de l'interaction le gène GUS est activé, nous avons infecté la lignée RPE in vitro. La cinétique d'induction a indiqué la présence d'un promoteur végétal induit de manière précoce qui active le transgène dans des jeunes galles moins de 3 jours après l'infection (jai), c'est-à-dire 24-48 h après l'initiation de cellules géantes (Jones, 1981; Wyss et al., 1992). On n'a pas détecté d'expression de GUS au site de pénétration (dans la zone d'élongation) ni pendant la migration des nématodes. La lignée RPE a présenté une forte expression de GUS à 7 jai dans les galles induites par M. incognita, et cette expression a été 2 0 maintenue jusqu'à la maturité sexuelle des femelles. Pour déterminer la localisation de l'expression GUS, nous avons réalisé des cryocoupes minces de galles. Les coupes transversales des galles âgées de 10 jours ont clairement présenté une coloration GUS dans les cellules géantes de la galle. On n'a pas observé d'activité GUS significative dans les cellules corticales entourant les cellules nourricières. Des résultats analogues ont été obtenus avec d'autres espèces de Meloidogyne telles que M. javanica et M. hapla, et avec le nématode à kystes de la betterave Heterodera schachtii Schmidt (données non présentées). Néanmoins, H. schachtii induit une expression GUS ultérieurement dans les cellules nourricières (15 jai). Au cours du développement des plantes, le gène GUS est exprimé dans le méristème racinaire et dans une partie de la zone d'élongation o les cellules se divisent et subissent une expansion. L'activité GUS était également visible tôt dans les ébauches de racines latérales, avant l'apparition des racines. De fortes expressions ont également été observées dans les parties aériennes de la plante, telles que les fleurs. Dans l'embryon mature des graines sèches, l'activité GUS a été observée avec une coloration plus intense dans la zone correspondant au méristème apical des racines et dans les cotylédons, les jeunes tissus ayant une synthèse active d'ADN pour la

polyploidisation des cellules (Brown et al., 1991).

Pour vérifier si l'insertion d'ADN-T était étroitement liée à la mutation rpe, nous avons analysé la coségrégation du phénotype mutant avec l'insertion d'ADN-T. Les descendants T4 provenant de chacune des 40 plantes T3 Kr autofécondées ont ségrégé avec les rapports attendus de 1/4 de graines non germinatives (phénotype homozygote mutant) et de 3/4 de graines germinatives dont les 2/3 étaient Kr et 1/3 K8 (données non présentées, X2=O,10; P>0,05). Ainsi, il n'y a pas eu de recombinaison entre la mutation rpe et la cassette d'ADN-T. Ces résultats ont suggéré que la mutation rpe était récessive; elle empêchait la

germination lorsqu'elle était homozygote et réellement liée à l'ADN-T.

2.2. Clonage moléculaire du gène de RPE L'analyse par hybridation d'ADN de plantes mutées dans le gène RPE à l'aide des fragments internes de l'ADN-T, GUS et la bordure gauche (données non

présentées) ont confirmé que la lignée RPE porte un unique insert d'ADN- T intact.

Un fragment d'ADN génomique de 515 pb adjacent à la bordure droite de l'ADN-T a été isolé par récupération de plasmides (Karamnycin Plasmid Rescue) après digestion PstI (Bouchez et al., 1996) (figure 1). En utilisant une stratégie de PCR inverse (IPCR; Earp et al., 1990), nous avons cloné 657 pb d'ADN flanquant la bordure gauche (LB) de l'ADN-T (site BgIII en amont des amorces d'IPCR T4 et T5, SEQ ID N 6 et SEQ ID N 7 respectivement) (figure 1). Ces deux séquences flanquantes utilisées comme sondes sur un Southemrn-blot, ont indiqué que les fragments clones correspondent à un fragment génomique unique (données non présentées). Pour analyser le point d'insertion de l'ADN-T, nous avons conçu les oligonucléotides LA2 (SEQ ID N 10) et RA2 (SEQ ID N 13) (figure 1). Une comparaison des séquences nucléotidiques de la lignée transformée et de la séquence sauvage a mis en évidence une délétion de 77 pb et une insertion d'une séquence de remplissage de 5 pb à l'extrémité de la bordure droite, issue de l'insertion de l'ADN-T. En outre, on a observé des délétions typiques dans les répétitions de 24 pb des bordures gauche et droite conduisant à la présence d'un seul nucléotide de la bordure gauche à la jonction d'insertion (Gheysen et al. , 1987;

Mayerhofer et al., 1991).

2.3. Analyse de la séquence de l'ADNc de RPE L'ADNc de RPE a été cloné par amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE 5' et 3'; Frohman et al., 1988) en utilisant des ARN polyA+ de A. thaliana sauvage, écotype WS. On n'a détecté qu'une classe de transcrits. L'ADNc de RPE comporte 1 259 nucléotides avec un cadre ouvert de lecture (ORF) de 281 acides aminés (AA) et des régions non traduites en 5' et en 3' (UTR) de 106 et 311 (268 + 43) nucléotides respectivement (figure 2). On a supposé que la traduction commence au nucléotide 107, le premier codon ATG du cadre ouvert de lecture. Le contexte de cet ATG ne correspond pas à la séquence consensus végétale (TAAACAATGGCTA; Joshi, 1987). Cependant, le nucléotide 3 pb en amont du codon d'initiation est une purine, qui est hautement conservée dans les gènes eucaryotes (Kozak, 1986). LYUTR 3' contient deux séquences-signal putatives de polyadénylation, AATAAA et un ensemble G/T (GTGTTTTT) respectivement à 22 pb et 37 pb en amont du site de polyadénylation (Dean et al., 1986). Une recherche Blast (Altschul et al., 1990) sur les bases de données de A. thaliana de Stanford a mis en évidence une forte identité de séquence (98,6 % au niveau génomique nucléotidique) avec huit étiquettes de séquence exprimée (EST) de A. thaliana écotype Columbia (figure 2). L'alignement des séquences génomiques et de l'ADNc a mis en évidence que le gène RPE est interrompu par neuf introns, dont un dans IJTR 3'. L'ADN-T s'est inséré dans le troisième intron. Son intégration a provoqué une délétion de 77 pb et une insertion d'une séquence de remplissage de 5 pb a placé l'ATG du gène uidA en phase avec le gène RPE et permis une fusion traductionnelle fonctionnelle du gène de la 3- glucuronidase. Les introns et les exons ont été caractérisés; leurs tailles variaient de 71 à 286 et de 60 à 268 nucléotides respectivement. Les séquences consensus pour les sites d'épissage intron/exon correspondent à celles rapportées pour les plantes (White et al., 1992). Une analyse de Southem-blot de l'ADN génomique de WS a été réalisée à l'aide de l'ADNc cloné 1 0 comme sonde. Le gène apparaît comme une copie unique par génome haploïde de A. thaliana même dans des conditions d'hybridation et de lavage de faible stringence

(données non présentées).

La séquence d'acides aminés prédite de la protéine RPE a été comparée à la base de données NCBI par le service Blast. La protéine est étroitement apparentée à la D-ribulose-5-phosphate 3-épimérase (RPE, EC 5.1.3.1) chez toutes les espèces, avec deux régions conservées (figure 3). La RPE catalyse l'interconversion réversible de la ribulose- 5-phosphate et de la xylulose-5-phosphate dans la voie des pentoses phosphate. En particulier, 85 %, 81 %, et 80 % des acides aminés étaient identiques à ceux de la RPE chloroplastique de l'épinard (Nowitzki et al., 1995), de la pomme de terre (Teige et al., 1995) et la RPE du riz respectivement. Cette dernière a été déduite de la séquence d'un ADNc que nous avons clone par PCR à partir d'amorces provenant d'EST du riz. Ce degré élevé de conservation entre les séquences végétales des monocotylédones et des dicotylédones est typique des enzymes du métabolisme des sucres-phosphate (Nowitzki et al., 1995). La région d'homologie de la protéine d'Arabidopsis avec les protéines cytosoliques bactériennes et eucaryotes (figure 3) est précédée d'une séquence de 46 acides aminés présentant des propriétés typiques de peptides-signal chloroplastiques (Von Heijne et al., 1989; Gavel et Von Heijne, 1990). Cette région

est riche en acides aminés hydroxylés, la sérine (19,6 %) et la thréonine (8,7 %).

Ainsi, il est fort probable que la RPE soit une protéine à localisation plastidiale.

On a également trouvé des homologies avec la RPE des bactéries et de la levure. L'identité en acides aminés était de 65% avec son homologue descyanobactéries Synechocystis (Kaneko et al., 1996), de 50 % et de 48 % avec les enzymes correspondantes de Serratia marcescens et de Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., 1995). En outre, on a trouvé 42 % d'identité en acides aminés avec la RPE_LEVURE (Miosga et Zimmermann, 1996), et la RPE_MYCOB (figure 3). Pour déterminer la relation entre ces enzymes, une analyse phylogénétique a été réalisée à l'aide d'un programme de construction d'arbres heuristique. Les séquences de RPE végétale sont rassemblées et ont formé une lignée distincte de celles de la RPE de levure. Elles sont plus proches des homologues cyanobactériens et eubactériens que de l'autre séquence eucaryote,

RPE_LEVURE (figure 4).

Enfin, le gène de RPE a été cartographié sur la banque génomique de A. thaliana CIC (Creusot et al., 1995). Quatre clones YAC positifs portant le gène de RPE ont été identifiés par hybridation. Ces quatre clones (CIC3A3, CIC4D8, CIC9G7 et CIClOA10) ont été préalablement ancrés au chromosome 5 (contig 29)

près des marqueurs RFLP LFY3 ET SEP5A (Schmidt et al., 1997).

2 0 2.4. Expression des gènes de la RPE chez les plantes Pour étudier l'expression du gène RPE, les ARN totaux et les ARN poly(A)+ ont été isolés à partir des galles induites par M. incognita, et de tissus de racines non infectés (méristèmes racinaires, sites d'initiation des racines latérales et fragments de racines non méristématiques) de plantes d'Arabidopsis sauvages cultivées in vitro. Les empreintes d'ARN n'étaient pas suffisamment sensibles pour mesurer l'expression du gène de RPE car il était difficile d'isoler suffisamment de tissus et/ou en raison du faible taux d'expression d'ARNm de RPE, comme cela a été observé dans les racines (Teige et al., 1995). Comme un gène qui n'est ni activé ni réprimé dans les cellules nourricières n'était pas disponible comme témoin, la PCR compétitive a été utilisée pour amplifier et quantifier les copies d'ADNc provenant

des ARNm de RPE en faible abondance (Gilliland et al., 1990; Kaneko et al., 1992).

L'ADNc de RPE cible a été co-amplifié avec les amorces RA2 et LA2 en présence d'une série de dilution d'un ADN compétiteur de concentration connue, qui different de l'ADNc de RPE par une petite délétion de 35 pb. La quantification de l'expression de RPE dans l'échantillon de galle est présentée dans la figure 5A. On n'a pas détecté d'ARNm de RPE dans les fragments de racines non méristématiques, et on a détecté très peu d'ARNm dans les sites d'initiation des racines latérales. La plus grande quantité d'ARNm de RPE a été observée dans les méristèmes racinaires

et les cellules géantes des NFS induits parM. incognita (figure 5B).

Pour tester l'activation de RPE dans les NFS des plantes, des plants de pommes de terre ont été infectées avec M. chitwoodi et le nématode à kystes G.

rostochiensis, deux pathogènes très importants des cultures de pommes de terre.

Des galles et des syncytia âgés de deux semaines et des tissus de racines provenant de plantes non infectées ont été analysés pour l'expression de RPE. La PCR compétitive a été réalisée avec des amorces spécifiques de RPE de pomme de terre (stppepimr, Z50098) et un compétiteur issu de l'ADNc de pomme de terre. Il y avait autant d'ARNm de RPE de pomme de terre dans les galles que dans les méristèmes racinaires alors qu'il y en avait 30 % de moins dans les syncytia (figure 5B). Par 2 0 conséquent, la régulation de RPE chez la pomme de terre est analogue à celle que

l'on trouve chez Arabidopsis.

2.5. Sauvetage du mutant rpe

Dans la mesure o le mutant rpe homozygote est altéré dans le sucre-

phosphate et létal, on a étudié si l'addition de glucides exogènes conduirait au sauvetage du mutant rpe. Lors d'une culture in vitro sur un milieu fournissant 2 % de saccharose, des plantes naines résistantes à la kanamycine sont apparues avec un rapport de 1:2. Ces plantes présentaient une structure racinaire anormale, avec des racines latérales moins nombreuses et plus courtes, et dans leur partie aérienne des feuilles vert pâle. Ces plants se sont développées lentement et meurrent si ils sont transférés en terre. Un test PCR a été effectué pour vérifier la coségrégation des phénotypes sauvés avec la mutation rpe. Les PCR ont été effectuées avec deux amorces RPE (LA2 et RA2, SEQ ID N 10 Et SEQ ID N 13 respectivement), qui couvrent le site d'insertion d'ADN-T de rpe, et une troisième amorce (U1) spécifique de la séquence de la bordure droite de l'ADN-T (figure 1). Lorsque l'ADN génomique de plantes RPE a été utilisé comme matrice des bandes de 437 pb et de 914 pb ont été amplifiées, ce qui indique la présence des allèles mutant et sauvage. Par contre, lorsque l'ADN de plantes naines sauvée a été utilisé comme matrice, seul le produit de 437 pb a été obtenu à partir d'amplifications avec les trois amorces. Cette analyse a confirmé que les 200 plantes naines ont été homozygotes pour l'allèle rpe. L'inoculation de ces plantes par M. incognita in vitro a montré que les nématodes ne sont pas capables de produire des galles sur la plupart d'entre elles (90 %). Chez les rares plantes attaquées, le nombre de galles était limité à 1 ou 2, alors qu'on a généralement observé 10 à 20 galles sur les plantes hétérozygotes ou témoin. Par ailleurs, le développement des cellules nourricières a été extrêmement réduit.

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LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE

(INRA)

(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE

(C) VILLE: PARIS

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75007

(ii) TITRE DE L' INVENTION: GENE RPE IMPLIQUE DANS LES STADES PRECOCES DE

DEVELOPPEMENT DE CELLULES NOURRICIERES DE NEMATODES

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1259 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: ADNc complet du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-

épimérase (RPE) d'Arabidopsis thaliana

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

TTGAGAATTG GTGTAAGAGA AACGATTGAG GTTTTCTCTT ATTATCTAAA CCCACCAAGT 60

CTTTCAGGAT TTTAGCCAGA GAAGCTTGAG TCTTTGATTA GGGACATGTC AACCTCCGCC 120

GCTTCCTTGT GTTGTTCATC AACCCAGGTC AATGGGTTTG GTCTTAGGCC TGAAAGGTCG 180

CTTCTTTACC AACCCACTTC CTTTTCTTTC TCCAGAAGGA GAACTCATGG AATTGTCAAG 240

GCCTCATCTC GGGTTGATAG GTTTTCGAAA AGTGATATCA TTGTTTCTCC CTCTATTCTC 300

TCGGCTAATT TCGCCAAATT AGGCGAGCAG GTAAAAGCAG TGGAGTTGGC AGGTTGTGAT 360

TGGATTCATG TTGATGTCAT GGACGGTCGT TTTGTTCCCA ACATTACTAT CGGACCTCTC 420

GTGGTTGATG CTTTGCGGCC TGTGACAGAT CTTCCTTTGG ATGTTCATCT GATGATAGTG 480

GAACCCGAGC AGAGAGTACC GGATTTCATC AAAGCAGGTG CAGATATTGT TAGTGTACAT 540

TGTGAACAGC AATCCACCAT CCATTTGCAT CGTACCGTCA ATCAAATAAA AAGCTTAGGG 600

GCTAAAGCTG GAGTTGTTCT AAACCCTGGA ACCCCATTGA GTGCAATAGA ATATGTCTTG 660

GATATGGTGG ATCTGGTCTT GATCATGTCG GTCAACCCTG GTTTTGGTGG ACAGAGCTTT 720

ATTGAAAGCC AAGTAAAGAA AATCTCGGAC TTGAGGAAAA TGTGTGCAGA GAAGGGAGTA 780

AACCCATGGA TTGAAGTTGA TGGTGGTGTC ACTCCAGCGA ATGCGTACAA GGTTATTGAG 840

GCTGGAGCAA ATGCTCTAGT GGCTGGTTCA GCTGTATTTG GAGCTAAGGA CTACGCAGAA 900

GCTATAAAAG GAATTAAGGC CAGCAAACGA CCAGCAGCTG TAGCTGTGTA ATGTGAAGCA 960

ACAGCAAGCG AAAAGACTCT GTTAAACTTA GGAACAGTTA AAAAGTGAAT GACGATCACC 1020

AGAAGTCCCA GATGTTGTCG TTGTGTCTCC ATTCGCCATA ACATTCACAA GAATCAAACT 1080

CAATATCTTC AAAGTAGGCT CCTCTATACT ATTCTGTACC ATTGTCTTGT AAATTGAGGA 1140

TATGCAGATT CCATACATTT TGCAATGAAA CACTGTGATA AGAAATATGT TGTTACATAT 1200

GTGTTTTTGA CTTATAATAA AGCATTTCAT TTGTCTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1259

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1050 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: ADNc complet du gène de la D-ribulose-5-phosphate-3-

épimérase (RPE) d'Oryza sativa

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

GCGACGCCTC CTAGCCGCCA CCGCTTCACC AAATCAAAAG CTCTCGCTGC TCCTCGAGAG 60

GGAGTTGGTG GAGAGAGAAA GAGAGAGAGA GAGATGGCGT CGCCGTCGTC GTCGTCGTCG 120

CTGTGCTCGA CCTTCGCCTC GCCGCGCGCC GCCTCCCTCG GCCGCCGCCT CGCCTTCTCC 180

TCGCCCAGGA AAGCATTCCG AGTGAGGGCA TCATCCAGGG TTGACAAGTT CTCGAAGAAT 240

GACATCATCG TGTCCCCTTC CATTCTTTCT GCAAACTTTT CCAAGCTTGG CGAGCAGGTA 300

AAAGCTGTGG AGGTGGCAGG ATGTGACTGG ATTCATGTTG ATGTCATGGA TGGACGTTTT 360

GTGCCAAATA TCACAATCGG ACCTTTGGTT GTTGATGCTC TGCGGCCAGT CACTGATCTT 420

CCGTTGGATG TGCATCTGAT GATTGTGGAA CCTGAGCAAC GAGTTCCAGA TTTTATCAAG 480

GCAGGTGCTG ATATTGTTAG CGTTCACTGT GAGCAATCGT CAACCATCCA TCTACACCGA 540

ACAGTCAATC AGATCAAAAG TCTTGGAGCA AAGGCTGGAG TTGTTTTGAA TCCTGCAACC 600

CCTCTCACTG CGATAGATTA TGTACTTGAT GTTGTTGATC TAGTATTGAT TATGTCGGTG 660

AATCCTGGGT TTGGTGGGCA GAGCTTTATT GAAAGCCAAG TGAAGAAGAT TGCAGAGTTG 720

AGAAAGTATG TGGCAGAGAA GGGAGTAAAC CCTTGGATTG AGGTTGATGG TGGAGTTGGT 780

CCCAAAAACG CCTACAAGGT CATTGAAGCT GGGGCCAACG CCATTGTTGC TGGTTCAGCC 840

GTTTTCGGGG CTCCAGACTA TGCAGAAGCT ATCAAGGGAA TCAAGACCAG CAAAAGACCT 900

GTGGCTGTAC CAGCATGAGG ATCCTAAAGT AGTATGCTGT GTACGTNGTT TTGGTTTACC 960

AGTACCGCGG TTTGTACAGA TATGTGCCAA GCTGTACGGT ATATTTGGGG AATTNAAGGA 1020

AGAGGAAACG TNGAGGGCGC CCTTTTTAAA 1050

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1505 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: séquence du promoteur du gène de la D-ribulose-5-

phosphate-3-épimérase (RPE) d'Arabidopsis thaliana

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

AGATCTGCAT ATAAATAATT AGGCCTCATG CTAATGGGCT TTACTTAAAA TAAAGCCTAA 60

AATAGTATTG TGACGAATAT GGAGAGACGT TTTGGATTCT CATTCAAATT TCAACCCATT 120

AATGGCTAAT CACTTTGTAA ATGTAAGATT GTACTACTTA TATCTTTTAC GAGGTGATTT 180

GAATCAATTA AGTAATGCAG AGATTACGAT ATAATTTTGG GAAGCACAAC TTTTGACCAA 240

CACTCCGAAT CGGGTCTCTT TCTCTATAAA TAGCCATTTC CTAAACACAC AATTTTCATA 300

CTCTCTCAAA CCTCCAAAAT TCTTGATCAA TATCAGATAA GAAGAATGAG TGGAAAACGC 360

AGCAATGTCG GTGGAGGAAA GAGCGGTGGC GCTGGAGGTA AGAGTGGTGG TGGCGGACAA 420

AGCAGTGGCG GAGGAAAAAG CGGCGGCGGA GGAACAGGAA CAGGTAATAT GGTAGCACCA 480

GGGACAAATG GGGGTGCTAA CATCTCAAGA GGGGATTCGA GAGTAACCTT CAAGGTTACT 540

TTAGTAACTT GCATGGCAGT GGACAAAGCA AGAAGTGACT TGAGTGTTGT TGTTATACTA 600

CAACCATGAG CCATTTTCTT TGATCTATTC TCTATTTAAT AAAATGCTAT GAAGTACAAA 660

CAAGTATTGA ATAAATGAGA TTTTTATTTT TATGAGGTGT TTGTTGCTTT GTGCTTAACC 720

CACTCTTCTT ATTTCTTAAT CAATCTCGTT AGTCCTCGTG AACTATGTGC CTAATCCTAT 780

* GGATCATGGG CCTTCTTTTT TCAGTATGGC CCCATGATAT AAAAGCATCA TGTAAATAGA 840 TTACGAAATC TATCAAATGG GACTAAATTT GGTATTCTGT TTTTTTCTAT AAAATGACCT 900

AAAACATTTT TTGTATATAT AATTGGTTGA CAAAATTATA AAATTTAAAA CGATGAGTTT 960

TTCATGTTAA TTAAAATTTT CTATCAATTG TTTTAGTCAT ACATCTCAAA TTGAATCTTG 1020

ATTTTAGTAT ATACATTCCT ATTATTTTTT ATTTATCAAA TATTTTGTAA AAATTATAAA 1080

TGACCTAAAA TTTTTTTTTT TATTAATTAA CTTTTTATTT AAACGACAAT TTATTTAGAA 1140

ATTATATGTT TTGTATCACT AGTAAAAATA GATTTATTAT TTGGCAAAAT TAGCATATTC 1200

CCACAAATGT ACAAGACCCG TCATCAAAAG AGAGCCAACC GTTTGAGATA GCGATAAGCC 1260

GCTGCATTGG ATCATCCGAA CAAGGAAGAC GTTACCCACG AGACCGTAAT CACACGTGGC 1320

GGATTCTCAG ATATTCTCTC TTTTTCTTCT TAACCCGGAA AAATAAAGTT TCTGTTCTTC 1380

TTTTTTCTTC TCTGGGTTTG AGAATTGGTG TAAGAGAAAC GATTGAGGTT TTCTCTTATT 1440

ATCTAAACCC ACCAAGTCTT TCAGGATTTT AGCCAGAGAA GCTTGAGTCT TTGATTAGGG 1500

ACATG 1505

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 281 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) d'Arabidopsis thaliana

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Met Ser Thr Ser Ala Ala Ser Leu Cys Cys Ser Ser Thr Gln Val Asn

1 5 10 15

Gly Phe Gly Leu Arg Pro Glu Arg Ser Leu Leu Tyr Gln Pro Thr Ser

25 30

Phe Ser Phe Ser Arg Arg Arg Thr His Gly Ile Val Lys Ala Ser Ser

40 45

Arg Val Asp Arg Phe Ser Lys Ser Asp Ile Ile Val Ser Pro Ser Ile

55 60

Leu Ser Ala Asn Phe Ala Lys Leu Gly Glu Gln Val Lys Ala Val Glu

70 75 80

Leu Ala Gly Cys Asp Trp Ile His Val Asp Val Met Asp Gly Arg Phe

90 95

Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly Pro Leu Val Val Asp Ala Leu Arg Pro

105 110

Val Thr Asp Leu Pro Leu Asp Val His Leu Met Ile Val Glu Pro Glu

120 125

Gln Arg Val Pro Asp Phe Ile Lys Ala Gly Ala Asp Ile Val Ser Val

135 140

His Cys Glu Gln Gln Ser Thr Ile His Leu His Arg Thr Val Asn Gln

150 155 160

Ile Lys Ser Leu Gly Ala Lys Ala Gly Val Val Leu Asn Pro Gly Thr

170 175

Pro Leu Ser Ala Ile Glu Tyr Val Leu Asp Met Val Asp Leu Val Leu

185 190

Ile Met Ser Val Asn Pro Gly Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Glu Ser

200 205

Gln Val Lys Lys Ile Ser Asp Leu Arg Lys Met Cys Ala Glu Lys Gly

210 215 220

Val Asn Pro Trp Ile Glu Val Asp Gly Gly Val Thr Pro Ala Asn Ala

225 230 235 240

Tyr Lys Val Ile Glu Ala Gly Ala Asn Ala Leu Val Ala Gly Ser Ala

245 250 255

Val Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Ala Glu Ala Ile Lys Gly Ile Lys Ala

260 265 270

Ser Lys Arg Pro Ala Ala Val Ala Val

275 280

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 274 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: D-ribulose-5-phosphate-3-épimérase (RPE) d'Oryza sativa

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Met Ala Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Leu Cys Ser Thr Phe Ala Ser

1 5 10 15

Pro Arg Ala Ala Ser Leu Gly Arg Arg Leu Ala Phe Ser Ser Pro Arg

25 30

Lys Ala Phe Arg Val Arg Ala Ser Ser Arg Val Asp Lys Phe Ser Lys

40 45

Asn Asp Ile Ile Val Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asn Phe Ser Lys

55 60

Leu Gly Glu Gln Val Lys Ala Val Glu Val Ala Gly Cys Asp Trp Ile

70 75 80

His Val Asp Val Met Asp Gly Arg Phe Val Pro Asn Ile Thr Ile Gly

90 95

Pro Leu Val Val Asp Ala Leu Arg Pro Val Thr Asp Leu Pro Leu Asp

105 110

Val His Leu Met Ile Val Glu Pro Glu Gln Arg Val Pro Asp Phe Ile

120 125

Lys Ala Gly Ala Asp Ile Val Ser Val His Cys Glu Gln Ser Ser Thr

135 140

Ile His Leu His Arg Thr Val Asn Gln Ile Lys Ser Leu Gly Ala Lys

150 155 160

Ala Gly Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Thr Ala Ile Asp Tyr

170 175

Val Leu Asp Val Val Asp Leu Val Leu Ile Met Ser Val Asn Pro Gly

185 190

Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Glu Ser Gln Val Lys Lys Ile Ala Glu

200 205

Leu Arg Lys Tyr Val Ala Glu Lys Gly Val Asn Pro Trp Ile Glu Val

210 215 220

Asp Gly Gly Val Gly Pro Lys Asn Ala Tyr Lys Val Ile Glu Ala Gly

225 230 235 240

Ala Asn Ala Ile Val Ala Gly Ser Ala Val Phe Gly Ala Pro Asp Tyr

245 250 255

Ala Glu Ala Ile Lys Gly Ile Lys Thr Ser Lys Arg Pro Val Ala Val

260 265 270

Pro Ala

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: T4

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

GTACATTGCC GTAGATGAAA GACT 24

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: T5

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

CTACAAATTG CCTTTTCTTA TCGAC 25

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: LA1

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CCTTGAACGC ATTCGCTGGA GTGAC 25

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 51 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce d'ancrage (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: caractéristique particulière

(B) EMPLACEMENT 39

(C) AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine (ix) CARACTERISTIQUE: (A)NOM/CLE: caractéristique particulière

(B)EMPLACEMENT 40

(C)AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine (ix) CARACTERISTIQUE: (A)NOM/CLE: caractéristique particulière

(B)EMPLACEMENT 44

(C)AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine (ix) CARACTERISTIQUE: (A)NOM/CLE: caractéristique particulière

(B)EMPLACEMENT 45

(C)AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine (ix) CARACTERISTIQUE: (A)NOM/CLE: caractéristique particulière

(B)EMPLACEMENT 49

(C)AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine (ix) CARACTERISTIQUE: (A)NOM/CLE: caractéristique particulière

(B)EMPLACEMENT 50

(C)AUTRES INFORMATIONS: N signifie Inosine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

CTACTACTAC TACTAGGCCA CGCGTCGACT AGTACGGGNN GGGNNGGGNN G 51

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: LA2

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

GATACCTTCT CTGCACACAT TTTCC 25

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 48 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: amorce oligo (dT)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

TGAAGGTTCC ATGAATCGAT AGGAATTCTT TTTTTTTTTT TTTTTTVN 48

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: 3RACE

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

TGAAGGTTCC ATGAATCGAT AG 22

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: RA2

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

CAGAAGGAGA ACTCATGGAA TTG 23

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: RP2

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

CTTTCACCAG GAGGAGAATT CA 22

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: LP2

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

CTCAAGTCCG AGATTTTCTT 20

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie: a) de la séquence représentée par SEQ ID N 1, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 40 % d'identité et de préférence au

moins 70 % d'identité avec a) ou b).

2. Séquence nucléotidique correspondant à tout ou partie: a) de SEQ ID N 3, b) d'une séquence s'hybridant à SEQ ID N 3, ou c) d'une séquence présentant au moins 40 % d'identité et de préférence au

moins 70 % d'identité avec a) ou b).

3. Séquence protéique correspondant à tout ou partie: a) de la séquence représentée par SEQ ID N 4, ou b) d'une séquence codée par une séquence telle que définie dans la revendication 1, ou

c) d'une séquence dérivant d'une séquence selon a) ou b).

4. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 1 placée sous le contrôle d'éléments nécessaires à son expression. 5. Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence est dans

une orientation anti-sens.

6. Vecteur selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que lesdits

éléments comprennent une séquence nucléotidique selon la revendication 2.

7. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 2, placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un

composé toxique pour les nématodes.

8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le composé toxique est choisi parmi les toxines nématocides, les lectines, les collagénases, les

inhibiteurs de protéases et les anticorps.

9. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 2, placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un

composé toxique pour les sites nourriciers de nématodes.

10. Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que le composé toxique est choisi parmi les DNAses, les RNAses, les inducteurs de mort cellulaire, les associations de produits d'un gène de résistance et d'un gène

d'avirulence et les ARN anti-sens.

I1. Vecteur d'expression cellulaire comprenant une séquence selon la revendication 2 placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour tout

ou partie d'une anticorps dirigé contre une protéine selon la revendication 3.

12. Cellules de plantes transformées directement ou indirectement par un

vecteur selon l'une des revendications 7 à 11.

13. Procédé d'obtention d'une plante transgénique comprenant les étapes suivantes: - transformation de cellules de plantes directement par un vecteur selon

l'une des revendications 7 à 11 ou indirectement par un microorganisme

apte à transformer des cellules de plantes et lui-même préalablement

transformé par un vecteur selon l'une des revendications 7 à 11,

- régénération de ladite plante transgénique.

14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que le microorganisme

est Agrobacterium tumefaciens.

15. Plantes comprenant des cellules selon la revendication 12.

16. Plantes susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon

la revendication 13.

17. Plantes selon la revendication 15 ou 16 choisies dans le groupe comprenant

les pommes de terre, les tomates, les betteraves, le colza et le riz.