BRPI0209437B1 - Dna recombinante codificando uma antranilato sintase monomérica, vetor, métodos para alterar o teor de triptofano em uma planta e para produzir uma planta com teor de triptofano aumentado, e, ração animal ou alimento humano - Google Patents

Dna recombinante codificando uma antranilato sintase monomérica, vetor, métodos para alterar o teor de triptofano em uma planta e para produzir uma planta com teor de triptofano aumentado, e, ração animal ou alimento humano Download PDF

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Abstract

dna isolado codificando uma antranilato sintase monomérica, vetor, semente, célula de planta transgênica, métodos para alterar o teor de triptofano em uma planta e para produzir uma planta com teor de triptofano aumentado, e, ração animal ou alimento humano. a presente invenção provê um método para conferir tolerância a um análogo de aminoácidos de triptofano para uma planta e/ou alterar o teor de triptofano de uma planta por introdução e expressão de um segmento de dna isolado codificando uma antranilato sintase nas células da planta. as plantas transgênicas transformadas com um segmento de dna isolado codificando uma antranilato sintase, assim como um alimento humano ou animal, sementes e progênie derivada destas plantas, são também providos.

Description

“DNA RECOMBINANTE CODIFICANDO UMA ANTRANILATO SINTASE MONOMÉRICA, VETOR, MÉTODOS PARA ALTERAR O TEOR DE TRIPTOFANO EM UMA PLANTA E PARA PRODUZIR UMA PLANTA COM TEOR DE TRIPTOFANO AUMENTADO, E, RAÇÃO ANIMAL OU ALIMENTO HUMANO”
Fundamentos da Invenção
As sementes de várias culturas importantes, incluindo soja e milho, não contém quantidades suficientes de vários aminoácidos para serem consideradas nutricionalmente completas. Estes aminoácidos incluem, mas não são limitados a: triptofano, isoleucina, valina, arginina, lisina, metionina e treonina. Assim, as vias biossintéticas para estes aminoácidos e/ou vias biossintéticas para metabólitos que se alimentam nestas vias, são alvos potenciais para manipulação a fim de aumentar o teor de aminoácidos destas plantas.
Antranilato sintase (AS, EC 4.1.3.27) catalisa a primeira reação se ramificando a partir da via de aminoácido aromático para a biossíntese de triptofano em plantas, fungos e bactérias.
(^) Corismato ' Antranilato
I ; Sintase i u
I ; Antranilato
I i Fosforibosilantranilato íJ ; l-(O-carboxifenilamino)-l ! -deoxiribulose-5-fosfato i!
i Fosfato de indol-3-glicerol l
;Indol iI
L................ Triptofano
Petição 870180059605, de 10/07/2018, pág. 11/14 » < ♦ · * »· • »· • 9· • 99
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A forma mais comum de antranilato sintase (por exemplo a antranilato sintase de milho) é uma enzima heterotetramérica consistindo de duas subunidades, a subunidade α ou TrpE e a subunidade β ou TrpG. Duas a subunidades e duas β subunidades se reúnem para formar as antranilato • 5 sintases heterotetraméricas. As formas monoméricas de AS também foram descobertas que compreendem uma única cadeia de polipeptídeo tendo as atividades tanto de subunidades TrpE como de TrpG (por exemplo Rhizobium
meliloti). Apesar de antranilato sintases monoméricas compreenderem apenas um tipo de polipeptídeo, a forma enzimaticamente ativa de uma antranilato sintase monomérica é tipicamente um homodímero consistindo de dois destes polipeptídeos monoméricos. Tanto a antranilato sintase monomérica como a heterotetramérica catalisam a formação de antranilato em uma reação usando glutamina e corismato. O domínio verificado na subunidade α (referido aqui como α-domínio liga corismato e elimina a cadeia lateral de envolpiruvato, 15 e o domínio encontrado na β-subunidade (referido aqui como β-domínio) transfere um grupo amino de glutamina para a posição sobre o anel de corismato fenila que reside entre as porções carboxilato e enolpiruvato.
A próxima reação na síntese de triptofano é a transferência de porção fosforibosila de fosforibosil pirofosfato para antranilato. O anel indol é φ20 formado em duas etapas envolvendo uma isomerização convertendo o grupo ribose para uma ribulose seguido por uma reação de ciclização para dar indol glicerol fosfato. A reação final na via é catalisada por uma única enzima que pode conter uma ou duas subunidades. A reação obtém a divagem de indol gliceraldeído-3-fosfato e condensação de grupo indol com serina (Umbarger, 25 Ann. Rev. Biochem, 47, 555(1978)).
O fluxo metabólito na via triptofano em plantas superiores e microorganismos é aparentemente regulado através da inibição de feedback de antranilato sintase por triptofano. O triptofano pode bloquear o rearranjo conformacional que é requerido para ativar o β-domínio e para criar um canal
• 4 • ·» «··
para passagem de amônio através do sítio ativo do α-domínio. Esta inibição de feedback por triptofano diminui, como se acredita, a produção de triptofano por antranilato sintase. Ver Li J. & Last, R. L. The Arabidopsis thaliana trp5 mutant has a feedback-resistant anthranilate synthase and - - 5 elevated soluble tryptophan. Plant Physiol. 110, 51 - 59 (1996).
Vários resíduos de aminoácidos foram identificados como estando envolvidos na regulagem de feedback do complexo de antranilato sintase de Salmonella typhimurium. Esta informação provê evidência de um sítio regulatório amino-terminal. J. Biol. Chem. 266, 8328 - 8335 (1991).
Niyogi et al ainda caracterizaram a antranilato sintase de algumas plantas empregando uma abordagem molecular. Ver Niyogi e Fink (Plant CelL 4,721 (1992)) e Niyogi et al. (Plant Cell, 5, 1011 (1993)). Eles verificaram que as asubunidades de antranilato sintase de Arabidopsis são codificadas por dois genes não alélicos, intimamente relacionados, que são regulados *15 diferencialmente. Um destes genes de α-subunidade, ASAI, é induzido por lesões e infiltração de patógeno bacteriano, implicando seu envolvimento em uma resposta de defesa, enquanto o outro gene de α-subunidade, ASA2, é expresso em níveis basais constitutivos. Ambas as proteínas previstas compartilham regiões de homologia com proteínas de antranilato sintase |βθ bacterianas e fungicas, e contém resíduos de aminoácidos conservados em posições que demonstraram estar envolvidas em inibição de feedback de triptofano em bactérias (Caligiuri et al., J. Biol. Chem., 266, 8328 (1991)).
Os análogos de aminoácidos de triptofano e análogos dos intermediários na via biossíntese de triptofano (por exemplo, 525 metiltriptofano, 4-metiltriptofano, 5-fluorotriptofano, 5-hidroxitriptofano, 7azatriptofano, ácido 3^-indolacrílico, ácido 3-metilantranílico), foram mostrados como inibindo o crescimento de organismos tanto procarióticos como eucarióticos. As culturas de células de plantas podem ser selecionadas para resistência a estes análogos de aminoácidos. Por exemplo, linhagens de
células de Datura innoxia, tabaco, cenoura, batata, milho cultivados foram selecionadas que são resistentes à inibição de crescimento por 5-metiltriptofano (5-MT), um análogo aminoácido de triptofano, devido à expressão de uma antranilato . -5 sintase alterada.
Ranch et al. (Plant Physiol.. 71, 136 (1983)) selecionou para ' resistência a 5-MT em culturas de célula de Datura innoxia, uma erva daninha dicotiledônea, e relatou que as culturas de células resistentes continham níveis aumentados de triptofano (8 a 30 vezes maiores do que o nível de tipo selvagem) e uma antranilato sintase com menor sensibilidade ® para inibição de feedback de triptofano. As plantas regeneradas foram também resistentes a 5-MT, continham uma antranilato sintase alterada,, e tinham maiores concentrações de triptofano livre (4 a 44 vezes) nas folhas do que as folhas das plantas de controle. Em contraste com os estudos com N.
tabacum, onde a enzima alterada não foi expressa em plantas regeneradas a partir de linhagens de células resistentes, estes resultados indicaram que o fenótipo de super-produção de aminoácido pode ser selecionado no nível celular e expresso em plantas completas regeneradas a partir das células selecionadas em Datura innoxia.
Hibberd et al. (patente U.S. número 4.581.847, expedida em de abril de 1986) descreveram linhagens de célula de milho resistentes a 5MT que continham uma antranilato sintase que era menos sensível à inibição por feedback do que a antranilato sintase de tipo selvagem. Uma linhagem de célula resistente a 5-MT acumulou triptofano livre em níveis quase vinte vezes maiores do que os das linhagens de células não transformadas.
P. C. Anderson et al. (patente U.S. número 6.118.047) descreve o uso de um α-domínio insensível a triptofano de antranilato sintase de milho C28 em um transgene para preparar plantas transgênicas de milho (Zea mays) demonstrando elevados níveis de triptofano livre na(s) semente (s).
Apesar de ser possível selecionar para resistência a 5-MT em algumas culturas e plantas de células, esta característica não está necessariamente correlacionada com a super-produção de triptofano livre em plantas completas. Adicionalmente, as plantas regeneradas a partir das . -5 linhagens resistentes a 5-MT não expressam com frequência uma forma alterada da enzima. Nem é previsível que esta característica será estável em - um período de tempo e será passada adiante como um traço herdável.
A antranilato sintase também foi parcialmente purificada a partir de extratos brutos de culturas de células de plantas superiores (Hankins et al., Plant Physiol., 57, 101 (1976); Widholm, Biochím. Biophys. Acta, 320, ® 217 (1973)). No entanto, verificou-se que era muito instável. Assim, existe a necessidade de prover plantas com uma fonte de antranilato sintase que pode aumentar o teor de triptofano das plantas.
Sumário da Invenção
A presente invenção provê ácidos nucleicos codificando uma antranilato sintase (AS) que pode ser usada para gerar plantas transgênicas. Quando estes ácidos nucleicos de antranilato sintase são expressos em uma planta transgênica, níveis elevados de triptofano podem ser obtidos dentro da células da planta. Em uma forma de realização, a invenção é dirigida a moléculas de DNA que codificam uma antranilato sintase monomérica, onde tal antranilato sintase monomérica é uma fusão natural ou quimérica geneticamente engenheirada de α e β-domínios de uma antranilato sintase. O gene de antranilato sintase de uma nova espécie (por exemplo alguma bactéria e outros micróbios) dá lugar naturalmente a uma antranilato sintase monomérica que constitui uma cadeia polipeptídeo única. No entanto, a maior parte das espécies tem uma antranilato sintase heterotetramérica composta de dois α e dois β-domínios encontrados em subunidades separadas. A invenção também contempla a formação de proteínas de fusão de antranilato sintase
quimérica compreendendo qualquer α-domínio de antranilato sintase ligado a qualquer β-domínio.
Geralmente, a identidade de seqüência de antranilato sintases monoméricas de ocorrência natural com a maior parte de antranilato sintases - - 5 de plantas é bastante baixa. No entanto, de acordo com a invenção, estas de antranilato sintases monoméricas podem prover níveis elevados de triptofano quando expressas em uma planta, apesar da baixa identidade de seqüência da enzima antranilato sintase endógena da planta. Conseqüentemente, a invenção provê de antranilato sintases monoméricas que podem ter seqüências ^10 divergentes e que são capazes de prover eficientemente altos níveis de triptofano em um hospedeiro de planta. Por exemplo, plantas de soja transgênica contendo a antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies podem produzir até cerca de 10.000 a cerca de 12.000 ppm de triptofano em sementes, com níveis de trp médios na faixa até cerca de 7.000 15 a cerca de 8.000 ppm. Em contraste, as plantas de soja não transgênicas normalmente tem até somente cerca de 100 a cerca de 200 ppm de triptofano em sementes.
Conseqüentemente, a invenção provê uma seqüência de DNA isolado codificando uma antranilato sintase monomérica, em que antranilato sintase monomérica tem um α-domínio de antranilato e um β-domínio de antranilato e em que a antranilato sintase monomérica é expressa em uma planta. Esta expressão pode elevar o nível de L-triptofano na planta.
A antranilato sintase monomérica pode ser naturalmente monomérica. Exemplos de organismos dos quais ácidos nucleicos de 25 antranilato sintase monomérica naturalmente podem ser isolados, incluem, mas não são limitados a organismos como Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 95177), Mesorhizobium loti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 13472468), Brucella melitensis (por exemplo, número de acesso do Genbank
GI 17982357), Nostoc sp. PCC7120 (por exemplo, número de acesso do
Genbanks GI 17227910 ou GI 17230725), Azospirillum brasilense (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 1174156) e Anabaena M22983 (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 152445). Em algumas . · 5 formas de realização, o DNA isolado codifica antranilato sintase de
Agrobacterium tumefacies tendo, por exemplo, uma sequência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência de nucleotídeos tendo qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 75.
Altemativamente, a antranilato sintase monomérica pode ser
uma fusão de qualquer a e β-domínio de antranilato sintase disponível. Estes α e β-domínios podem ser derivados de Zea mays, Ruta graveolens,
Sulfolobus solfataricus, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, Arabidopsis thaliana,
Rhizobium meliloti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 95177), ’15 Mesorhizobium loti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI
13472468), Brucella melitensis (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 17982357), Nostoc sp. PCC7120 (por exemplo, número de acesso do Genbanks GI 17227910 ou GI 17230725), Azospirillum brasilense (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 1174156) e Anabaena M22983 Ό (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 152445)), soja, arroz, algodão, trigo, tabaco ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato sintase. Por exemplo, ácidos nucleicos codificando esta α ou β-domínio pode ser obtido por uso de informação de seqüência em qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-70, 75-103.
Em outra forma de realização, a invenção provê um DNA isolado codificando um α-domínio de antranilato sintase de Zea mays que compreende SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 66. Este DNA isolado pode ter seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 2, 67 ou 68. O DNA isolado pode ser ligado de modo operativo a um promotor, e quando expresso em uma planta
pode prover níveis elevados de L-triptofano na planta.
O DNA isolado também pode codificar uma antranilato sintase mutante, ou um domínio de antranilato sintase mutante. Esta antranilato sintase mutante, ou domínio da mesma, pode ter uma ou mais mutações. . 5 Como é conhecido dos versados na arte, mutações podem ser silentes, podem dar lugar a produtos de genes variantes tendo atividade enzimática similar ao tipo selvagem ou podem dar lugar a produtos de genes derivativos que tem atividade enzimática alterada. A invenção contempla estas mutações.
O DNA isolado mudado pode ser gerado de um ácido nucleico de antranilato sintase de tipo selvagem ou in vitro ou in vivo e pode codificar, por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções ou inserções. Os DNAs isolados mutantes que geram uma antranilato sintase mutante tendo atividade aumentada, maior estabilidade, ou menos sensibilidade para inibição de feedback por triptofano ou análogos de '15 triptofano são desejáveis. Em uma forma de realização, a antranilato sintase ou domínio da mesma, é resistente à inibição por L-triptofano endógeno ou por análogos de triptofano. Por exemplo, a antranilato sintase pode ter uma ou mais mutações na bolsa de ligação de triptofano ou em outro ponto que reduz a sensibilidade da antranilato sintase ou o domínio da mesma, para inibição de ^0 triptofano. Dentre os resíduos de aminoácidos contemplados para mutação estão os resíduos, por exemplo, em cerca de posições 48, 51, 52, 293 e 298. Por exemplo, a mutação pode ser:
(a) em cerca de posição 48, substituir Vai por Phe;
(b) em cerca de posição 48, substituir Vai por Tyr;
(c) em cerca de posição 51, substituir Ser por Phe;
(d) em cerca de posição 51, substituir Ser por Cys;
(e) em cerca de posição 52, substituir Asn por Phe;
(f) em cerca de posição 293, substituir Pro por Ala;
(g) em cerca de posição 293, substituir Pro por Gly, ou
• · · · · ·
Ία (h) em cerca de posição 298, substituir Phe por Trp; e em que a posição da mutação é determinada pelo alinhamento da sequência de aminoácido de antranilato sintase com uma seqüência de aminoácido de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies. Exemplos de antranilato . 5 sintases tendo estas mutações incluem as com SEQ ID NO: 58- 65, 69, 70, 84-94.
O DNA isolado pode codificar outros elementos e funções.
Qualquer elemento ou função contemplado pelo versado na arte pode ser incluído. Por exemplo, o DNA isolado pode incluir um promotor que pode 10 funcionar em uma célula de planta que é ligada de modo operativo ao DNA codificando a antranilato sintase. O DNA isolado pode ainda codificar um peptídeo de trânsito de plastídeo. O DNA isolado pode também codificar um marcador selecionável ou um gene repórter. Este gene marcador selecionável pode conferir resistência a herbicida às células da referida planta, elevado teor 15 de proteína, elevado teor de óleo, elevado teor de lisina, elevado teor de isoleucina, elevado teor de tocoferol, e outros. A seqüência de DNA também pode compreender uma seqüência codificando uma ou mais das proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis.
A invenção ainda provê vetores compreendendo um DNA
isolado da invenção. Estes vetores podem ser usados para expressar polipeptídeos de antranilato sintase em células procarióticas e eucarióticas, para transformar células de planta e para gerar plantas transgênicas.
A invenção também provê uma planta transgênica compreendendo um DNA isolado da invenção. A expressão destes DNAs 25 isolados na planta transgênica pode resultar em um nível elevado de Ltriptofano, preferivelmente L-triptofano livre, na planta transgênica, por exemplo nas sementes ou outras partes da planta. O nível é aumentado acima do nível de L-triptofano nas células da planta que diferem das células de planta transgênica de soja pela ausência do DNA, por exemplo, as células não
2-/
transformadas correspondentes ou uma planta não transformada com o mesmo antecedente genético. O DNA é preferivelmente herdável em que ele é preferivelmente transmitido através de um ciclo sexual normal completo da planta fértil para sua progênie e para outras gerações.
As plantas transgênicas que podem ter este DNA isolado incluem plantas dicotiledôneas (dicot) por exemplo soja, ou canola.
> Altemativamente, as plantas transgênicas podem ser monocotiledôneas (monocot) por exemplo milho, arroz, trigo, cevada ou sorgo.
A invenção também provê uma semente de qualquer uma das plantas transgênicas contendo qualquer um dos DNA isolados, polipeptídeo de antranilato sintase, transgenes ou vetores da invenção.
A invenção ainda provê uma ração animal ou alimento humano que contém, pelo menos, uma porção de uma planta tendo um DNA isolado da invenção. As porções das plantas que podem ser incluídas na ração '15 animal ou alimento humano incluem, por exemplo, sementes, folhas, caules, raízes, tubérculos ou frutos. As porções desejáveis de plantas tem níveis aumentados de triptofano providos por expressão de uma antranilato sintase codificada pelo DNA isolado da invenção.
A invenção ainda provê um método para alterar, ^0 preferivelmente aumentar, o teor de triptofano de uma planta (dicotiledônea ou monocotiledônea) por introdução de um DNA isolado da invenção em células regeneráveis da planta. A seqüência de DNA é preferivelmente ligada de modo operativo a pelo menos um promotor operável nas células de plantas. As células transformadas são identificadas ou selecionadas, e então 25 regeneradas para dar uma planta compreendendo células que podem expressar um polipeptídeo de antranilato sintase funcional. Em algumas formas de realização, o DNA codificando a antranilato sintase, ou domínio da mesma, é um DNA mutante. O DNA introduzido é preferivelmente herdável e a planta é preferivelmente uma planta fértil. Por exemplo, o DNA introduzido
preferivelmente pode ser passado por um ciclo sexual completo para plantas de progênie, e pode conferir o fenótipo de teor elevado de triptofano a subseqüentes gerações de progênie.
Os DNAs codificando antranilato sintase são preferivelmente
incorporados em vetores ou transgenes” que também podem incluir seqüências de DNA codificando peptídeos de trânsito, como peptídeos de trânsito de plastídeo, e genes repórter ou marcador selecionável, ligados de modo operativo a um ou mais promotores que são funcionais em células da planta alvo. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor indutível, um promotor específico para tecido, um promotor forte ou um promotor fraco. Outros elementos regulatórios de transcrição ou tradução, por exemplo melhoradores ou terminadores, também podem ser ligados de modo operativo ao segmento de DNA codificando antranilato sintase.
As células em cultura em suspensão ou como embriões, tecidos intactos ou órgãos podem ser transformados por uma ampla variedade de técnicas de transformação, por exemplo por bombardeio de microprojéteis, eletroporação e transformação mediada por Agrobacterium tumefacies e outros procedimentos da arte.
Assim, as células da planta transformada compreendem um gene nativo de antranilato sintase e um transgene ou outro segmento de DNA codificando uma antranilato sintase exógena. A expressão de antranilato sintase exógena nas células da planta pode levar a níveis aumentados de triptofano e seus metabólitos secundários. Em algumas formas de realização, esta expressão confere tolerância a uma quantidade de análogo de Ltriptofano endógeno, por exemplo, de modo que pelo menos cerca de 10% mais atividade de antranilato sintase está presente do que em uma célula de planta tendo uma antranilato sintase sensível a triptofano ou tipo selvagem.
A invenção também provê um método para alterar o teor de triptofano em uma planta compreendendo (a) introduzir em células
regeneráveis de uma planta um transgene compreendendo um DNA isolado codificando um domínio de antranilato sintase e um peptídeo de trânsito de plastídeo, ligado de modo operativo a um promotor funcional na célula de * planta para dar células transformadas; e (b) regenerar uma planta F 5 transformada de referidas células de plantas transformadas em que as células da planta expressam o domínio de antranilato sintase codificado pelo DNA isolado em uma quantidade efetiva para aumentar o teor de triptofano na referida planta com relação ao teor de triptofano em uma planta não transformada do mesmo antecedente genético. O domínio pode ser um a10 domínio de antranilato sintase. O domínio de antranilato sintase pode ter uma ® ou mais mutações, por exemplo mutações que reduzem a sensibilidade do domínio à inibição por triptofano. Estas mutações podem ser, por exemplo, na bolsa de ligação de triptofano. Este domínio pode ser, por exemplo, um domínio de antranilato sintase de Agrobacterium tumefaciens, Anabaena
M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis,
Escherichia coli, Euglena gracilis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti, Ruta graveolens, Rhodopseudomonas palustris, Salmonella typhimurium, Serratia marees cens, Sulfolobus solfataricus, soja, arroz, algodão ou Zea mays. Ruta graveolens tem sua própria seqüência de transporte de cloroplastos que pode ser usada com o transgene de antranilato sintase. Consequentemente, um versado na arte não precisa adicionar uma seqüência de transporte de plastídeo quando usando um DNA de Ruta graveolens.
A presente invenção também provê novas moléculas de DNA isolado e purificado compreendendo um DNA codificando uma antranilato sintase monomérica ou um domínio da mesma. Este DNA de antranilato sintase pode prover níveis elevados de triptofano quando expresso dentro da planta. Em algumas formas de realização, a antranilato sintase é substancialmente resistente à inibição por L-triptofano livre ou um análogo do
«·· * ·*>· · ·*» · · · mesmo. Exemplos de novas seqüências de DNA contempladas pela invenção incluem, mas não são limitados a moléculas de DNA isoladas de Agrobacterium tumefaciens, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Escherichia coli, Euglena . - 5 gracilis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti, Ruta graveolens, Rhodopseudomonas palustris, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Sulfolobus solfataricus, ou Zea mays (milho) ou outra de tais antranilato sintases.
Estas seqüências de DNA incluem formas monoméricas sintéticas ou de ocorrência natural de antranilato sintase que tem o a-domínio »
de antranilato sintase ligado a pelo menos um outro domínio de antranilato sintase em uma única cadeia de polipeptídeo. A antranilato sintase monomérica pode, por exemplo, ser uma fusão de um α ou β-domínio de antranilato sintase. Este α ou β-domínio de antranilato sintase pode ser derivado de Agrobacterium tumefaciens, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Escherichia coli, Euglena gracilis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti, Ruta graveolens, Rhodopseudomonas palustris, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Sulfolobus solfataricus, soja, arroz, φθ algodão, trigo, tabaco ou Zea mays (milho) ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato sintase. Estas antranilato sintases e domínios das mesmas são também aqui exemplificados pelos ácidos nucleicos de antranilato sintase isolados de Agrobacterium tumefaciens, (SEQ ID NO:
1, 75, 84 - 94), Zea mays, (SEQ ID NO: 2, 67, 68, 96), Ruta graveolens (SEQ
ID NO: 3), Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 45), Azospirillum brasilense (SEQ ID NO: 78), Brucella melitensis (SEQ ID NO: 79), Mesorhizobium loti (SEQ ID NO: 77), Nostoc sp. PCC7120 (SEQ ID NO: 80 ou 81), Rhizobium meliloti (SEQ ID NO: 7), Rhodopseudomonas palustris (SEQ ID NO: 57), Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO: 8), arroz
• * « ♦ IT · · • • • « « • • · • • 0 • • • 00 • • *
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(SEQ ID NO: 94 ou 95), trigo (SEQ ID NO: 97), ou tabaco (SEQ ID NO: 98). Estas seqüências de nucleotídeos codificam antranilato sintases ou adomínios da mesma de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO: 4, 58 - 65,
69, 70,); Zea mays (SEQ ID NO: 5, 66 ou 101) e Ruta graveolens (SEQ ID . - 5 NO: 6), Anabaena M22983, Azospirillum brasilense (SEQ ID NO: 78),
Brucella melitensis (SEQ ID NO: 79), Mesorhizobium loti (SEQ ID NO: 77),
Nostoc sp. PCC7120 (SEQ ID NO: 80 ou 81), Rhizobium meliloti (SEQ ID NO: 7 ou 43), Rhodopseudomonas palustris (SEQ ID NO: 57 ou 82), Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO: 8 ou 44), arroz (SEQ ID NO: 99 ou 100), trigo (SEQ ID NO: 102), ou tabaco (SEQ ID NO: 103).
A invenção também provê uma molécula de DNA isolado compreendendo uma seqüência de DNA codificando uma antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies ou um domínio da mesma tendo atividade enzimática. Esta molécula de DNA pode codificar uma antranilato sintase tendo SEQ ID NO: 4, 58 - 65, 69 ou 70, um domínio ou variante da mesma tendo atividade de antranilato sintase. A molécula de DNA também pode ter uma seqüência compreendendo SEQ ID NO: 1, 75, 84 - 94, ou um domínio ou variante da mesma. As regiões de codificação de qualquer molécula de DNA providas aqui também podem ser otimizadas para expressão em um organismos selecionado, por exemplo, uma planta selecionada ou micróbio. Um exemplo de uma molécula de DNA tendo uso de códon otimizado para um planta selecionada é uma molécula de DNA de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies tendo SEQ ID NO: 75.
A invenção também provê uma molécula de DNA isolado e purificado compreendendo uma seqüência de DNA codificando um domínio de antranilato sintase de Zea mays. Esta molécula de DNA pode codificar um domínio de antranilato sintase tendo SEQ ID NO: 5, 66 ou uma variante ou derivado da mesma tendo atividade de antranilato sintase. A molécula de
DNA também pode ter uma seqüência compreendendo SEQ ID NO: 2, 67 ou ·· ··· · · · r ♦ ··· ··· • ο · ·«···«··· ·· • · <· « · ······· · · ·· ··«·*··· ···* · • ·«·· ·· » · » · · • ··· r ··· · ·· · ··
68, ou um domínio ou variante da mesma.
A invenção ainda provê uma molécula de DNA isolada de pelo menos 8 nucleotídeos que hibridiza para o complemento de uma molécula de DNA compreendendo qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1, 75 ou 84-94 sob . - 5 condições estringentes. Esta molécula de DNA pode ser uma sonda ou *
iniciador, por exemplo um ácido nucleico tendo qualquer uma dentre SEQ ID NO: 9-42, ou 47-56. Altemativamente, o DNA pode incluir até uma região de codificação completa para uma antranilato sintase selecionada, ou um domínio da mesma. Este DNA também pode incluir uma seqüência de DNA
codificando um promotor operável em células de planta e/ou uma seqüência de DNA codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo. A invenção ainda contempla vetores para transformação e expressão destes tipos de moléculas de DNA em plantas e/ou micróbios.
As seqüências de DNA de antranilato sintase funcionais e ’15 polipeptídeos de antranilato sintase funcionais que demonstram 50%, preferivelmente 60%, mais preferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 80%, mais preferivelmente 90%, por exemplo, 95% a 99%, de identidade de seqüência para as seqüências de DNA e seqüências de aminoácidos explicitamente aqui descritos também estão no escopo da invenção. Por Ό exemplo, 85% de identidade significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas seqüências são alinhadas para emparelhamento máximo. Falhas (em uma das duas seqüências sendo emparelhadas) são permitidos na maximização do emparelhamento; comprimentos de falhas de 5 ou menos são preferidos com 2 ou menos sendo mais preferidos.
Altemativamente e preferivelmente, duas seqüências de polipeptídeos são homólogas, como este termo é usado aqui, se elas tem um escore de alinhamento maior que 5 (em unidades de desvio padrão) usando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de falha de 6 ou mais. Ver Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and
Structure, 1972, volume 5, National Biomedical Research Foundation, pp. 101 - 110, e suplemento 2 a este volume, pp. 1 - 10. As duas seqüências ou partes da mesma são mais preferivelmente homólogas se seus aminoácidos são mais do que ou iguais a 50% idênticos quando otimamente alinhados . · 5 usando o programa ALIGN.
A invenção ainda provê vetores de expressão para gerar uma
planta transgênica com elevados níveis de triptofano na semente compreendendo um DNA isolado codificando uma antranilato sintase monomérica compreendendo um oc-domínio de antranilato sintase ligado a um β-domínio de antranilato sintase e um peptídeo de trânsito de plastídeo, ligados de modo operativo a um promotor funcional em uma célula de planta. Esta antranilato sintase monomérica pode ser, por exemplo, uma antranilato sintase de Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Brucella melitensis, Nostoc sp. PCC7120, Azospirillum brasilense ou Anabaena M22983. A antranilato sintase monomérica também pode ser uma fusão de a e β-domínios de antranilato sintase derivados de Agrobacterium turnefaciens, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas palustris, Ruta graveolens, Sulfolobus solfataricus, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, soja, arroz, algodão, trigo, tabaco Zea mays, ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato sintase.
A transmissão de DNA de antranilato sintase isolado e purificado provendo níveis aumentados de triptofano pode ser avaliada em um nível molecular, por exemplo análise Southem ou Northem blot, metodologias com base em PCR, a detecção bioquímica ou imunológica de antranilato sintase ou por análise fenotípicas, isto é se as células da progênie transformada podem crescer na presença de uma quantidade de análogo de aminoácidos de triptofano que inibe o crescimento de células de planta não transformadas.
A invenção também provê um método para produzir antranilato sintase em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, como levedura, célula de inseto, o bactéria, que podem ser cultivadas, - - 5 preferivelmente em uma escala comercial. O método inclui as etapas de *
introduzir um transgene compreendendo um segmento de DNA codificando uma antranilato sintase, ou um domínio da mesma, como uma antranilato sintase monomérica, compreendendo pelo menos os a- e β-domínios de antranilato sintase ou variante funcional dos mesmos, em uma célula
hospedeira e expressando a antranilato sintase na célula hospedeira de modo a dar antranilato sintase funcional ou domínio da mesma. Um transgene geralmente inclui elementos regulatórios de transcrição e tradução, por exemplo um promotor, funcional em célula hospedeira, ou de origem eucariótica ou procariótica. Preferivelmente, o transgene é introduzido em 15 uma célula procariótica, como Escherichia coli, ou uma célula eucariótica, como célula de levedura ou inseto, que é conhecida como sendo utilizável para a produção de proteínas recombinantes. O cultivo de células transformadas pode levar à melhora produção de triptofano e seus derivados, que podem ser recuperados das células ou do meio de cultura. O acúmulo de
Ό triptofano também pode levar à produção aumentada de metabólitos secundários em micróbios e plantas, por exemplo metabólitos contendo indol como indóis simples, conjugados de indol, alcalóides de indol, fitoalexinas de indol e glucosinalatos de indol em plantas.
As antranilato sintases insensíveis a triptofano tem o potencial de aumentar uma variedade de metabólitos derivados de corismato, incluindo os derivados de fenilalanina devido ao estímulo de síntese de fenilalanina por triptofano via corismato mutase. Ver Siehl, D. The biosynthesis of tryptophan, tyrosine, and phenylalanine írom chorismate in Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology, ed, BK Singh, pp 171 - 204. Outros
• · · · · «···· * · • · · ·· · »·*· • · ··· * ·· · « « metabólitos derivados de corismato que podem aumentar quando antranilato sintases insensíveis ao feedback estão presente incluem fenilpropanóides, flavonóides, e isoflavonóides, assim como os derivados de antranilato como indol, alcalóide indol, e indol glucosinolatos. Muitos destes compostos são
hormônios de plantas importantes, compostos de defesa da planta, agentes quimio-preventivos, de várias condições de saúde, e/ou compostos farmacologicamente ativos. A faixa destes compostos cuja síntese pode ser aumentada por expressão de antranilato sintase depende do organismo em que a antranilato sintase é expressa. A invenção contempla a síntese de triptofano e outros compostos utilizáveis em uma variedade de células procarióticas e eucarióticas ou organismos, incluindo células de plantas, micróbios, fungos, leveduras, bactérias, células de insetos e células de mamíferos.
Assim a invenção provê um método de produção de triptofano compreendendo: cultivar uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compreendendo um DNA isolado sob condições suficientes para expressar uma antranilato sintase monomérica codificada pelo DNA isolado, em que a antranilato sintase monomérica compreende um α-domínio de antranilato sintase e um β-domínio de antranilato sintase, e em que as condições suficientes para expressar uma antranilato sintase monomérica compreendem nutrientes e precursores suficientes para a célula hospedeira sintetizar triptofano usando a antranilato sintase monomérica.
Exemplos de compostos utilizáveis que podem ser gerados quando da expressão em uma variedade de células hospedeiras e/ou organismos incluem ácido indol acético e outras auxinas, compostos isoflavonóides, importantes para a saúde cardiovascular encontrados em soja, compostos indol voláteis que atuam como sinais para inimigos naturais de insetos herbívoros em milho, anticarcinogenes como indol glucosinolatos (indol-3- carbinol) encontrado na família de plantas crucíferas, assim como indol alcalóides como compostos de ergotina produzidos por algumas
espécies de fungos. (Bames et al., Adv Exp Med Biol, 40 1, 87 (1996); Frey et al., Proc Natl Acad Sei, 97, 14801 (2000); Muller et al., Biol Chem, 381, 679 (2000); Mantegani et al., Farmaco, 54, 288 (1999); Zeligs, J Med Food, 1, 67 (1998); Mash et al., Ann NY Acad Sei, 844, 274 (1998); Melanson et al., Proc . 5 Natl Acad Sei, 94, 13345 (1997); Broadbent et al., Curr Med Chem, 5, 469
(1998)).
A presente invenção também provê uma molécula de DNA isolada e purificada de pelo menos sete bases de nucleotídeos que hibridiza sob condições moderadas e, preferivelmente, condições de alta estringência para o complemento de uma molécula de DNA codificando antranilato sintase. Estas moléculas de DNA isolado e purificado compreendem novos segmentos de DNA codificando antranilato sintase ou um domínio ou mutante do mesmo. O DNA mutante pode codificar uma antranilato sintase que é substancialmente resistente à inibição por L-triptofano livre ou um análogo de 15 aminoácido de triptofano. Estas moléculas de DNA de antranilato sintase podem hibridizar, por exemplo, para Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas palustris ou Ruta graveolens, ou um α-domínio dos mesmos, incluindo mutantes funcionais dos mesmos. Quando estas moléculas de DNA codificam uma antranilato sintase funcional ou um domínio de
Ό antranilato sintase, elas são chamadas ^variantes” das moléculas de DNA primárias codificando antranilato sintase, domínios de antranilato sintase ou mutantes dos mesmos. As moléculas de DNA mais curtas ou oligonucleotídeos podem ser empregados como iniciadores para amplificação de seqüências de DNA de marcação por PCR, ou como intermediários na 25 síntese de genes de comprimento completo.
Também é provida uma sonda de hibridização compreendendo um novo segmento de DNA isolado e purificado de pelo menos sete bases de nucleotídeos que é rotulado de modo detectável ou que pode ligar a um rótulo detectável, cujo segmento de DNA hibridiza sob condições de estringência
moderada, ou preferivelmente elevada, para o filamento de não codificação de uma molécula de DNA compreendendo um segmento de DNA codificando uma antranilato sintase como uma antranilato sintase monomérica, ou domínio da mesma, como α-domínio, incluindo mutantes funcionais dos mesmos, que são substancialmente resistentes à inibição por um análogo aminoácido de triptofano. As condições de hibridização moderadas e estringentes são bem conhecidas na arte, ver por exemplo seções 0.47 - 9.51 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989); ver também, Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (15 de janeiro de 2001). Por exemplo, as condições estringentes são as que (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrato de sódio (SSC); 0,1% de lauril sulfato de sódio (SDS) a 50°C, ou (2) empregam um agente desnaturante como formamida durante hibridização, por exemplo, 50% de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% Ficoll/0,1 % de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio a 42°C. Outro exemplo é o uso de 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC e 0,1% de SDS.00
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 é uma mapa de restrição de pMON61600.
Figura 2 mostra a seqüência traduzida da seqüência de DNA de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies (seqüência superior) (SEQ ID NO: 4) e a seqüência traduzida de seqüência de DNA de antranilato sintase de Rhizobium meliloti (seqüência inferior) (SEQ ID NO: 7).
Figura 3 é um mapa de restrição de pMON34692.
• · · · · · • ·· ··*···· · · • ·· · ·· ·«··« * · • · · · ·· · ·«·* ··· ♦ ··· ♦ ·· · · *
Figura 4 é um mapa de restrição de pMON34697.
Figura 5 é um mapa de restrição de pMON34705.
Figura 6 (A-B) mostra um alinhamento de seqüência de aminoácido de antranilato sintase comparando a seqüência de ct-domínio de • 5 Agrobacterium tumefaçies (SEQ ID NO: 4) e a seqüência de α-domínio de
Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO: 8).
Figura 7 (A-B) mostra as seqüências dos iniciadores 34 (SEQ
ID NOS 9 - 42) usados para mudar SEQ ID NO: 1. Os códons mudados são
sublinhados e as bases mudadas estão em caixa baixa.
M10 Figura 8 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
• pMON13773.
Figura 9 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58044.
Figura 10 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
' ’15 pMON53084.
- ' Figura 11 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58045.
Figura 12 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58046.
Figura 13 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON38207.
Figura 14 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58030.
Figura 15 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
25 pMON58006.
Figura 16 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58041.
Figura 17 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58028.
Figura 18 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58042. Figura 19 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
pMON58029.
• 5 Figura 20 mostra um mapa de restrição de plasmídeo
ρΜΘΝ58043.
Figura 21 (A-D) mostra um alinhamento de sequência múltipla de antranilato sintases monoméricas TrpEG tendo SEQ ID NO: 4 e 43
(derivadas de Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium meliloti, respectivamente) com os domínios (a) TrpE e (β) TrpG de antranilato sintases heterotetraméricas de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO: 44) e
Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 45). Regiões de ligador são sublinhadas. Figura 22 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON52214. Figura 23 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON53901. 15 Figura 24 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON39324.
Figura 25 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON39322.
Figura 26 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON39325.
Figura 27 é um gráfico mostrando os níveis de triptofano livres em sementes de soja transformadas com pMON39325. Foram obtidas cinco |£0 observações para cada evento. NT representa uma semente de soja não transgênica.
Figura 28 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON25997. Figura 29 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON62000.
Figura 30 mostra a sequência de gene trpE truncado de 25 Escherichia coli EMG2 (K-12 wt F+) (SEQ ID NO: 46). Os primeiros 30 bp e os últimos 150 bp deste ácido nucleico trpE são conectados por um sítio de restrição de EcoRl. O começo do gene trpG segue o códon de parada trpE.
Figura 31 esquematicamente mostra a construção de deleção em quadro em gene trpE de E. coli.
Figura 32 (A-C) mostra as seqüências DNA (SEQ ID NO: 1) e aminoácido (SEQ ID NO: 4) do α-domínio de gene antranilato sintase isolado de Agrobacterium tumefacies.
Figura 33 (A-C) mostra a seqüência de DNA (SEQ ID NO: 2)
- ' 5 de α-domínio de gene de antranilato sintase isolado de Zea mays. Figura 33 (D) mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 5) de α-domínio do gene antranilato sintase de Zea mays.
Figura 34 é um mapa de restrição de plasmídeo pMON58120.
Figura 35 (A-E) provê uma comparação de seqüência de seqüências de aminoácido de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies (ArgTu^l 5889565) (SEQ ID NO: 4), Rhizobium meliloti (RhiMe_136328) (SEQ ID NO; 7), Mesorhizobium Loti (MesLo_l 3472468) (SEQ ID NO: 77), Azospirillum brasilense (AzoBr_1717765) (SEQ ID NO: 78), Brucella melitensis (BruMeJ 7986732) (SEQ ID NO: 79), Nostoc sp.
(NostocJ 7227910) (SEQ ID NO: 80), Nostoc sp. (Nostoc J 7230725) (SEQ
ID NO: 81), e Rhodopseudomonas palustris (RhoPa_TrpEG) (SEQ ID NO:
82).
Figura 36 (A-B) provê uma seqüência de nucleotídeos otimizada para antranilato sintase de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID φο NO: 75).
Figura 37 (A-C) provê um alinhamento de seqüências de nucleotídeos de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies de tipo selvagem (filamento de topo) e otimizada (filamento de fundo), (SEQ ID NO: 1 e 75). Estas duas seqüências são 94% idênticas.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção provê DNAs isolados, vetores, células hospedeiras e plantas transgênicas compreendendo uma ácido nucleico isolado codificando uma antranilato sintase capaz de prover níveis elevados de triptofano quando da expressão dentro da planta. Em uma forma de realização, o ácido nucleico isolado codifica uma antranilato sintase monomérica (AS). Em outras formas de realização, o ácido nucleico isolado codifica uma antranilato sintase, ou um domínio da mesma, que é substancialmente resistente a inibição por L-triptofano livre ou um análogo de • * 5 aminoácido de triptofano. A expressão de antranilato sintase ou domínio da mesma, eleva o nível de triptofano, por exemplo triptofano livre na semente, sobre o nível presente na planta ausente desta expressão.
Os métodos são também providos para produzir plantas
transgênicas tendo ácidos nucleicos associados com aumentada atividade de antranilato sintase, e produzindo células cultivadas, tecidos de plantas, plantas, partes de plantas e sementes que produzem níveis elevados de triptofano. Estas plantas transgênicas podem preferivelmente transmitir sexualmente a capacidade de produzir níveis elevados de triptofano para sua progênie. Também são descritos métodos para a produção de DNAs isolados * 15 codificando antranilato sintases, e técnicas de seleção de cultura de célula
- para selecionar novos genótipos que superproduzem triptofano e/ou são resistentes a análogos de triptofano. Por exemplo, para produzir linhagens de soja capazes de produzir níveis elevados de triptofano, células de soja transgênicas que contém pelo menos um dos DNAs da invenção, são φ20 preparadas e caracterizadas, então regeneradas em plantas. Alguns dos DNAs isolados são resistentes à inibição de crescimento pelo análogo de triptofano. Os métodos providos na presente invenção também podem ser usados para produzir níveis aumentados de triptofano livre em plantas dicotiledôneas, como outras leguminosas, assim como em monocotiledôneas como grãos de cereais.
Definições
Como usado aqui, níveis “alterados” de triptofano em uma planta transformada, tecido de planta, parte de planta ou célula de planta são níveis que são maiores ou menores do que os níveis encontrados na planta não transformada correspondente, tecido de planta, parte de planta ou célula de planta.
Como usado aqui, um α-domínio é uma porção de uma enzima ou complexo enzimático que liga corismato e elimina a cadeia lateral - · 5 enolpiruvato. Esta α-domínio pode ser codificado por um gene TrpE. Em alguns casos, o α-domínio é um único polipeptídeo que funciona somente para ligar corismato e para eliminar a cadeia lateral de enolpiruvato de corismato. Em outros casos, o α-domínio é parte de um polipeptídeo maior
φ20 que pode ter outras funções enzimáticas além de ligação de corismato e eliminação da cadeia lateral de enolpiruvato de corismato.
O termo β-domínio” refere-se a uma porção de uma enzima ou complexo enzimático que transfere um grupo amino de glutamina para a posição no anel corismato e reside entre as porções carboxilato e enolpiruvato. Este β-domínio pode ser codificado por um gene TrpG. Em alguns casos, o β-domínio é um polipeptídeo único que funciona somente para transferir um grupo amino de glutamina para a posição no anel corismato que reside entre as porções carboxilato e enol piruvato. Em outros casos, ο βdomínio é parte de um polipeptídeo maior que pode transportar outras funções enzimáticas além de transferir um grupo amino de glutamina para a posição no anel corismato que reside entre as porções carboxilato e enolpiruvato.
Como usado aqui, um análogo de aminoácido de triptofano é um aminoácido que está estruturalmente relacionado com triptofano e que pode ligar ao sítio de ligação de triptofano em uma antranilato sintase de tipo selvagem. Estes análogos incluem mas não são limitados a 6-metilantranilato, 25 5-metiltriptofano, 4-metiltriptofano, 5-fluorotriptofano, 5-hidroxitriptofano, 7azatriptofano, ácido 3β-πκ1ο^οπ1ίοο, ácido 3-metilantranílico, e outros.
O termo “consiste essencialmente de” como usado com relação às presentes moléculas de DNA, seqüências ou segmentos é definido para significar que uma porção principal da molécula de DNA, seqüência ou segmento codifica uma antranilato sintase. Salvo indicado em contrário, a molécula de DNA, seqüência ou segmento geralmente não codifica proteínas diferente de uma antranilato sintase.
O termo complementar a é usado aqui para significar que a > > 5 seqüência de um filamento de ácido nucleico pode hibridizar para toda, ou uma porção, de uma seqüência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a seqüência de nucleotídeo TATAC tem 100% de identidade para uma seqüência de referência 5'-TATAC-3' mas é 100% complementar a uma seqüência de referência 5*-GTATA-3'.
Como usado aqui, uma antranilato sintase exógena é uma antranilato sintase que é codificada por uma DNA isolado que foi introduzido em uma célula hospedeira e que é preferivelmente não idêntico a qualquer seqüência de DNA presente na célula em seu estado nativo, não transformado.
Uma antranilato sintase endógena ou nativa é uma antranilato sintase que *15 está naturalmente presente em uma célula hospedeira ou organismo.
Como usado aqui, níveis aumentados ou elevados de Ltriptofano livre em uma célula de planta, tecido de planta, parte de planta ou planta são níveis que são cerca de 2 a 200 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 150 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10-100 vezes, os níveis Ό encontrados em uma célula de planta, tecido de planta, parte de planta ou planta não transformadas, isto é, uma em que o genoma não foi alterado pela presença de um ácido nucleico de antranilato sintase exógeno ou domínio do mesmo. Por exemplo, os níveis de L-triptofano livre em uma semente de planta transformada são comparados com os em uma semente de planta não transformada (o material de partida).
As moléculas de DNA codificando uma antranilato sintase, e moléculas de DNA codificando um peptídeo de trânsito ou gene marcador /repórter são isoladas em que elas foram tomadas de sua fonte natural e não estão mais dentro da célula onde elas existem normalmente. Estas moléculas • · · · ·«
» ·· · « · de DNA isolado podem ter sido pelo menos parcialmente preparadas ou manipuladas in vitro, por exemplo isoladas de uma célula em que foram normalmente encontradas, purificadas e amplificadas. Estas moléculas de DNA isolado podem ser também recombinante em que elas foram 5 combinadas com moléculas ou segmentos de DNA exógeno. Por exemplo, um
DNA recombinante pode ser um DNA isolado que é ligado de modo operativo a um promotor exógeno, ou a um promotor que é endógeno para a célula hospedeira.
Como usado aqui com relação a antranilato sintase, o termo monomérico significa que dois ou mais domínios de antranilato sintase são incorporados em um modo funcional em uma cadeia de polipeptídeo única. A antranilato sintase monomérica pode ser montada in vivo em uma forma dimérica. Os ácidos nucleicos de antranilato sintase monoméricos e polipeptídeos podem ser isolados de vários organismos como Agrobacterium tumefacien, Anabaena M22983, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Euglena gracilis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120 ou Rhizobium meliloti. Altemativamente, os ácidos nucleicos de antranilato sintase monoméricos e polipeptídeos podem ser construídos de uma combinação de domínios selecionados dentre qualquer gene de antranilato sintase |20 monomérico ou multimérico conveniente. Estes organismos incluem, por exemplo, Agrobacterium tumefacien, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas palustris, Ruta graveolens, Sulfolobus solfataricus, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, soja, arroz, algodão Zea mays, ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato sintase. Os ácidos nucleicos codificando os domínios selecionados podem ser ligados de modo recombinante. Por exemplo, um ácido nucleico codificando o C-término de um α-domínio pode ser ligado a um ácido nucleico codificando o N-término
• *·· · « · · · ··· ··· * · ········· * · • · ·· ···«·«· · · • ·····»·· ··· · · • ··· · · « ···« ··· * ··· · ·· · · · do β-domínio, ou vice-versa, por formação de uma ligação fosfodiéster. Como alternativa, o α-domínio pode ser ligado via seu C-término ao Ntérmino de β-domínio, ou vice versa, por formação de uma ligação peptídeo.
Como usado aqui, um gene nativo significa um gene que não - - 5 foi mudado in vitro, isto é, um gene tipo selvagem que não foi mudado in vitro.
O termo plastídeo refere-se à classe de organelas de células
de plantas que inclui amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, elaioplastos, eoplastos, etioplastos, leucoplastos e proplastídeos. Estas organelas são autoreplicantes, e contém o que é comumente referido como um genoma de cloroplasto, uma molécula de DNA circular, que está na faixa de tamanho de cerca de 120 a cerca de 217 kg, dependendo da espécie de planta, e que geralmente contém uma região de repetição invertida.
Como usado aqui, polipeptídeo significa uma cadeia * 15 contínua de aminoácidos que são todos ligados juntos por ligações peptídeo, exceto pelos aminoácidos N-terminais e C-terminais que tem grupos amino e carboxilato, respectivamente, e que não são liados em ligações peptídeo. Os polipeptídeos podem ter qualquer comprimento e podem ser modificados póstranslacionalmente, por exemplo por glicosilação ou fosforilação.
p0 Como usado aqui, uma célula de planta, tecido de planta ou planta que resistente ou tolerante à inibição por um análogo de aminoácido de triptofano é uma célula de planta, tecido de planta ou planta que retém pelo menos cerca de 10% mais atividade de antranilato sintase na presença de um análogo de L-triptofano que uma antranilato sintase tipo selvagem 25 correspondente. Geralmente, uma célula de planta, tecido de planta ou planta que é resistente ou tolerante à inibição por um análogo de aminoácido de triptofano pode crescer em uma quantidade de um análogo de aminoácido de triptofano que normalmente inibe o crescimento da, célula de planta, tecido de planta ou planta não transformadas, como determinado por metodologias
conhecidas na arte. Por exemplo, um retro-cruzamento homozigótico converteu planta endogâmica convertida transformada com uma molécula de DNA que codifica uma antranilato sintase que é substancialmente resistente ou tolerante à inibição por um análogo de aminoácido de triptofano cresce em uma quantidade de um análogo de aminoácido de triptofano que inibe o crescimento da planta endogâmica recorrente correspondente, isto é, substancialmente isogênica.
Como usado aqui, uma antranilato sintase que é resistente ou tolerante à inibição por triptofano ou um análogo de aminoácido de triptofano é uma antranilato sintase que retém mais do que cerca de 10% mais atividade do que uma antranilato sintase susceptível nativa ou tipo selvagem correspondente, quando as antranilato sintases tolerantes/resistentes e de tipo selvagem são expostas a quantidades equivalentes de triptofano ou análogo de aminoácido de triptofano. Preferivelmente, a antranilato sintase resistente ou tolerante retém mais do que cerca de 20% mais atividade do que uma antranilato sintase susceptível tipo selvagem ou nativa correspondente.
Como usado aqui com relação a antranilato sintase, o termo um domínio do mesmo inclui um segmento estrutural ou funcional de uma antranilato sintase de comprimento completo. Um domínio estrutural inclui uma estrutura identificável dentro da antranilato sintase. Um exemplo de um domínio estrutural inclui uma hélice alfa, uma folha beta, um sítio ativo, um substrato ou sítio de ligação de inibidor e outros. Um domínio funcional inclui um segmento de uma antranilato sintase que realiza uma função identificável como uma bolsa de ligação de triptofano, um sítio ativo ou um substrato ou sítio de ligação de inibidor. Domínios funcionais de antranilato sintase incluem as porções de antranilato sintase que podem catalisar uma etapa na via biossintética de triptofano. Por exemplo, um α-domínio é um domínio que pode ser codificado por trpE e que pode transferir NH3 para corismato e
formar antranilato. Um β-domínio pode ser codificado por trpQ e pode remover um grupo amino de glutamina para formar amônio. Assim, um domínio funcional inclui fragmento enzimaticamente ativos e domínios de uma antranilato sintase. Os domínios mutantes de antranilato sintase são também contemplados. Os ácidos nucleicos de antranilato sintase de tipo selvagem utilizados para fazer domínios mutantes incluem, por exemplo, qualquer ácido nucleico codificando um domínio de Agrobacterium tumefacien, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120,
Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas palustris, Ruta graveolens, Sulfolobus solfataricus, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, soja, arroz, algodão, trigo, tabaco Zea mays, ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato sintase que pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácidos na região de codificação do mesmo. 15 Os domínios que são mudados ou unidos para formar uma antranilato sintase monomérica tendo atividade biossintética de triptofano, maior estabilidade, reduzida sensibilidade para triptofano ou um análogo do mesmo, e outros, são de interesse particular.
Conceitos Gerais
Ό A presente invenção refere-se a novos ácidos nucleicos e métodos para obter plantas que produzem níveis elevados de L-triptofano livre. A super-produção resulta da introdução e expressão de um ácido nucleico codificando antranilato sintase ou domínio da mesma. Estes ácidos nucleicos de antranilato sintase incluem α-domínios de tipo selvagem ou 25 mutante, ou formas monoméricas de antranilato sintase. Uma forma monomérica de antranilato sintase compreende pelo menos dois domínios de antranilato sintase em uma única cadeia de polipeptídeo, por exemplo um adomínio ligado a um β-domínio.
As antranilato sintases de plantas nativas são geralmente bem • · · · · ·
sensíveis para inibir o feedback por L-triptofano e análogos dos mesmos. Esta inibição constitui um mecanismo chave para regular a via sintética de triptofano. Assim, uma antranilato sintase ou domínio da mesma que é altamente ativo, mais eficiente ou é inibido em uma menor extensão por • * 5 triptofano ou um análogo do mesmo irá provavelmente produzir níveis elevados de triptofano. De acordo com a invenção, a antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies é particularmente utilizável para a produção de níveis elevados de triptofano.
Para gerar níveis elevados de triptofano em uma planta ou
célula hospedeira selecionada, o ácido nucleico de antranilato sintase selecionado é isolado e pode ser manipulado in vitro para incluir sinais regulatórios requeridos para expressão de genes em células de plantas ou outros tipos de células. Porque a via biossintética de triptofano em plantas é relatada como estando presente dentro dos plastídeos, os ácidos nucleicos de antranilato sintase exógenos são ou introduzidos em plastídeos ou são modificados por adição de um segmento de ácido nucleico codificando um peptídeo de trânsito de plastídeo amino-terminal. Este peptídeo de trânsito de plastídeo pode dirigir o produto de gene antranilato sintase em plastídeos. Em alguns casos, a antranilato sintase já pode conter uma seqüência de transporte Ό de plastídeos, em cujo caso não se tem necessidade de adicionar uma.
A fim de alterar a biossíntese de triptofano, o ácido nucleico codificando uma atividade de antranilato sintase deve ser introduzido em células de plantas ou outras células hospedeiras e estas células transformadas identificadas, ou diretamente ou indiretamente. Uma antranilato sintase 25 completa ou uma porção utilizável ou domínio da mesma pode ser usada. A antranilato sintase é incorporada de modo estável no genoma da célula de planta. Os sinais transcripcionais controlando a expressão de antranilato sintase devem ser reconhecidos e ser funcionais dentro das células de plantas ou outras células hospedeiras. Isto é, a antranilato sintase deve ser transcrita em RNA mensageiro, e o mRNA deve ser estável no núcleo da célula de planta e ser transportado intacto para o citoplasma para tradução. O mRNA de antranilato sintase deve ter sinais de tradução apropriados para serem reconhecidos e traduzidos de modo apropriado por ribossomas de células de - ' 5 plantas. O produto de gene de polipeptídeo deve substancialmente escapar ao ataque proteolítico no citoplasma, ser transportado no compartimento celular correto (por exemplo um plastídeo) e ser capaz de assumir uma conformação tri-dimensional que irá conferir atividade enzimática. A antranilato sintase deve ser ainda capaz de funcionar na biossíntese de triptofano e seus ^10 derivados, isto é, deve estar localizado próximo das enzimas de plantas nativas catalisando as etapas de flanco em biossíntese (provavelmente em um plastídeo) a fim de obter os substratos requeridos e para passar para o produto apropriado.
Mesmo se todas estas condições foram atendidas, a super15 produção com sucesso de triptofano não é um evento previsível. A expressão de alguns transgenes pode ser afetada negativamente por elementos cromossômicos próximos. Se o nível elevado de triptofano for obtido por mutação para reduzir a inibição de feedback, pode-se ter outros mecanismos de controle compensando a regulagem reduzida na etapa de antranilato Ό sintase. Pode-se ter mecanismos que aumentam a taxa de ruptura dos aminoácidos acumulados. O triptofano e aminoácidos relacionados também podem ser super-produzidos em níveis que não são tóxicos para a planta.
Finalmente, o traço introduzido deve ser estável e herdável a fim de permitir o desenvolvimento comercial e uso.
Isolamento e identificação de DNA codificando para uma antranilato sintase
Os ácidos nucleicos codificando uma antranilato sintase podem ser identificados e isolados por métodos padrões, por exemplo, como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, • ·* ·« ·
segunda edição (1989); Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (15 de janeiro de 2001). Por exemplo, uma seqüência de DNA codificando uma antranilato sintase ou um domínio da mesma pode ser identificada por triagem de uma biblioteca de DNA ou • - 5 cDNA gerada a partir do ácido nucleico derivado de um tipo de célula particular, linhagem de células, células primárias ou tecido. Exemplos de bibliotecas utilizáveis para a identificação e isolamento de uma antranilato sintase incluem, mas não são limitados a, uma biblioteca de cDNA derivada
de Agrobacterium tumefacies cepa A348, linhagem endogâmica de milho B73 (Stratagene, La Jolla, Califórnia, Cat. #937005, Clontech, Paio Alto, Califórnia, Cat. # FL1032a, #FL1032b, e FL1032n), biblioteca genômica de linhagem endogâmica de milho Mo 17 (Stratagene, Cat. #946102), biblioteca genômica de linhagem endogâmica de milho B73 (Clontech, Cat. # FL1032d), DNA genômico de Anabaena M22983 (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 152445), Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 1174156), Brucella melitensis (GI 17982357), Escherichia coli, Euglena gracilis,
Mesorhizobium loti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI
13472468), Nostoc sp. PCC7120 (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 17227910 ou GI 17230725), Rhizobium meliloti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 95177), Ruta graveolens, Rhodopseudomonas palustris, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Sulfolobus solfataricus, soja, arroz, algodão, trigo, tabaco Zea mays (milho) ou outras espécies. Além disso, os ácidos nucleicos de antranilato sintase 25 podem ser isolados por procedimentos de amplificação de ácido nucleico usando DNA genômico, mRNA ou cDNA isolados de qualquer uma destas espécies.
A tiragem para fragmentos de DNA que codificam toda ou uma porção da seqüência codificando uma antranilato sintase pode ser obtida • ·· ** * por placas de triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA para hibridização para uma sonda de um gene de antranilato sintase de outros organismos ou por triagem de placas de uma biblioteca de expressão de cDNA para ligação a anticorpos que especifícamente reconhecem antranilato • 5 sintase. Os fragmentos de DNA que hibridizam para sondas de antranilato sintase de outros organismos e/ou placas contendo fragmentos de DNA que são imuno-reativos com anticorpos para antranilato sintase podem ser subclonados em um vetor e seqüenciados e/ou usados como sondas para identificar outras sequências de cDNA ou genômicas codificando toda ou uma 10 porção do gene antranilato sintase desejado. As sondas de cDNA preferidas “ para triagem de uma biblioteca de milho ou planta podem ser obtidas de clones de plasmídeos pDPGóOO ou pDPG602.
Uma biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, por iniciação oligo aleatória ou iniciação dT oligo. As placas contendo 15 fragmentos de DNA podem ser tríadas com sondas ou anticorpos específicos para antranilato sintase. Os fragmentos de DNA codificando uma porção de um gene de antranilato sintase podem ser subclonados e seqüenciados e usados como sondas para identificar um gene de antranilato sintase genômico. Os fragmentos de DNA codificando uma porção de uma antranilato sintase p>0 bacteriana ou de planta podem ser verificados por determinação da homologia de seqüência com outros genes de antranilato sintase conhecidos ou por hibridização em RNA mensageiro específico para antranilato sintase. Uma vez que fragmentos de cDNA codificando porções das extremidades 5', meio e 3' de um antranilato sintase são obtidos, eles podem ser usados como sondas 25 para identificar e clonar uma cópia genômica completa do gene de antranilato sintase de uma biblioteca genômica.
As porções de cópia ou cópias genômicas de um gene de antranilato sintase podem ser seqüenciadas e a extremidade 5’ do gene identificada por métodos padrões incluindo ou pela homologia de seqüência
de DNA para outros genes de antranilato sintase ou por análise de proteção RNAse, por exemplo como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989); Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (15 de janeiro de • - 5 2001). As extremidades 3’ e 5' do gene de marcação também podem ser localizadas por buscas em computador de bases de dados de seqüência genômica usando regiões de codificação de AS conhecidas. Uma vez que porções da extremidade 5’ do gene são identificadas, cópias completas do gene de antranilato sintase podem ser obtidas por métodos padrões, incluindo 10 a clonagem ou síntese de reação de cadeia polimerase (PCR) usando ® iniciadores de oligonucleotídeos complementares à seqüência de DNA na extremidade 5' do gene. A presença de uma cópia de comprimento completo isolada do gene de antranilato sintase pode ser verificada por hibridização, análise de seqüência parcial, ou por expressão de uma enzima de antranilato ’15 sintase de milho.
DNAs isolados exemplares da invenção incluem DNAs tendo a seguinte SEQ ID NO: de nucleotídeos:
SEQ ID NO: 1 - Agrobacterium tumefaciens (tipo selvagem)
SEQ ID NO: 2 -- Zea mays (tipo selvagem)
SEQ ID NO: 3 - Ruía graveolens
SEQ ID NO: 46 -- gene TrpE truncado de E. coli EMG2 (K-12 wt F+)
SEQ ID NO: 67 -- Zea mays (C28 mutante)
SEQ ID NO: 68 - Zea mays (C28 + terminador)
SEQ ID NO: 71 - Peptídeo de marcação de cloroplasto (g)
SEQ ID NO: 73 - Peptídeo de marcação de cloroplasto (a)
SEQ IDNO: 75 —Agrobacterium tumefaciens (otimizado)
SEQ ID NO: 76 -- Rhodopseudomonas palustris
SEQ ID NO: 83 - Rhodopseudomonas palustris • · · · · ······ *······· φ 9 • *«····· , » • · «* · ·«·· • ·· ·* « φ e >0 (RhoPa_TrpEG)
SEQ ID NO: 84 - mutante V48F de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 85 - mutante V48Y Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 86 — mutante S51F Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 87 - mutante S51C Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 88 - mutante N52F Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 89 - mutante P293A Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 90 -- mutante V293Q Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 91 - mutante F298W Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 92 - mutante Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 93 - mutante F298A Agrobacterium tumefaciens SEQ ID NO: 94 - arroz
SEQ ID NO: 95 - isozima de arroz
SEQ ID NO: 96 - milho (patente U.S. número 6.118.047 para Anderson)
SEQ ID NO: 97 - trigo
SEQ ID NO: 98 - tabaco
Alguns iniciadores são também utilizáveis para a prática da invenção, por exemplo iniciadores tendo SEQ ID NO: 9-42,47-56.
A invenção também contempla qualquer ácido nucleico isolado codificando uma antranilato sintase tendo, por exemplo, qualquer uma das seguintes seqüências de aminoácidos
SEQ ID NO: 4 Agrobacterium tumefaciens (tipo selvagem)
SEQ ID NO: 5 Zea mays (tipo selvagem)
SEQ ID NO: 6 Ruta graveolens
SEQ ID NO: 7 Rhizobium meliloti
SEQ ID NO: 8 Sulfolobus solfataricus • ·· ·· ·
•· * ········ ♦ · · ·· ♦ « · · · __ ·· ·····♦«· Q7 · · · · ♦ · * «
SEQ ID NO: 43 Rhizobium meliloti
SEQ ID NO: 44 Sulfolobus solfataricus
SEQ ID NO: 45 Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO: 57 Rhodopseudomonas palustris
SEQ ID NO: 58 mutante V48F de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 59 mutante V48Y de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 60 mutante S51F de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 61 mutante S51C de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 62 mutante N52F de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 63 mutante P293A de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 64 mutante P293G de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 65 mutante F298W de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 66 mutante C28 de Zea mays
SEQ ID NO: 69 mutante S50K de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 70 mutante F298A de Agrobacterium tumefaciens
SEQ ID NO: 74 Peptídeo de marcação de cloroplasto (a)
SEQ ID NO: 72 Peptídeo de marcação de cloroplasto (g)
SEQ ID NO: 77 Mesorhizobium loti (MesLo_l 3472468)
SEQ ID NO: 78 Azospirillum brasilense (AzoBr_1717765)
SEQ ID NO: 79 Brucella melitensis (BruMeJ 7986732)
SEQ ID NO: 80 Nostoc sp. (NostocJ 7227910)
SEQ ID NO: 81 Nostoc sp. (NostocJ7230725)
SEQ ID NO: 82 Rhodopseudomonaspalustris RhoPaJrpEG
SEQ ID NO: 99 - arroz
SEQ ID NO: 100 - isozima de arroz
- -5
SEQ ID NO: 101 — milho (patente U.S. número 6.118.047 a
Anderson)
SEQIDNO: 102 -trigo
SEQ ID NO: 103 - tabaco
Qualquer um destes ácidos nucleicos e polipeptídeos pode ser usado na prática da invenção, assim como qualquer mutante, variante ou derivado do mesmo.
Antranilato sintases monoméricas
De acordo com a invenção, as antranilato sintases monoméricas de espécies de plantas e não plantas são funcionais em plantas e provêem altos níveis de triptofano. Surpreendentemente, as antranilato sintases monoméricas de espécies não planta funcionam muito bem em plantas mesmo se as seqüências destas antranilato sintases monoméricas tiverem baixa homologia com a maior parte das antranilato sintases de 15 plantas. Por exemplo, antranilato sintases monoméricas de espécies tão diversas como bactérias, protistas, e micróbios podem ser usadas com sucesso. Particularmente, as antranilato sintases monoméricas de espécies bacterianas como Agrobacterium tumefacies, Rhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Brucella melitensis, Nostoc sp. PCC7120, Azospirillum £0 brasilense e Anabaena M22983 são funcionais em plantas e podem prover níveis elevados de triptofano, apesar da identidade de seqüência bastante baixa destas antranilato sintases monoméricas com a maior partes das antranilato sintases de plantas.
As plantas transgênicas contendo, por exemplo, a antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies tipo selvagem pode produzir até cerca de 10.000 a cerca de 12.000 ppm triptofano em sementes, com níveis de trp médios na faixa de até cerca de 7.000 a cerca de 8.000 ppm. As plantas de soja não transgênicas normalmente tem até somente cerca de 100 a cerca de 200 ppm de triptofano em sementes. Por comparação, plantas • ·· ·« ·
transgênicas contendo um mutante adicionado de α-domínio de Zea mays produzem níveis um pouco menores de triptofano (por exemplo médias de até cerca de 3.000 a cerca de 4.000 ppm).
As enzimas monoméricas podem ter algumas vantagens sobre • “ 5 enzimas multiméricas. Por exemplo, apesar da invenção não ser limitada a um mecanismo específico, uma enzima monomérica pode prover maior estabilidade, expressão coordenada e outros. Quando domínios ou subunidades de uma antranilato sintase heterotetramérica são sintetizados in vivo, estes domínios /subunidades devem se reunir de modo apropriado em 10 uma forma heterotetramérica antes da enzima se tomar ativa. A adição de um único domínio de antranilato sintase por meios transgênicos a uma planta pode não prover super-produção de toda a enzima heterotetramérica porque podem não ter quantidades endógenas suficientes de domínios não transgênicos para aumentar substancialmente os níveis do tetrâmetro funcional. Assim, ácidos nucleicos, vetores, e enzimas codificando uma antranilato sintase monomérica podem ser usados com vantagem para superproduzir todas as funções enzimáticas de antranilato sintase.
De acordo com a invenção, os domínios de antranilato sintase de espécies que naturalmente produzem antranilato sintase heterotetramérica |R0 podem ser fundidos ou ligados para prover antranilato sintases monoméricas que podem gerar elevados níveis de triptofano quando expressos em uma célula de planta, tecido de planta ou semente. Por exemplo, uma antranilato sintase monomérica pode ser feita por fusão ou ligação dos α e β-domínios de antranilato sintase de modo que a seqüência de a- β fusão geralmente se 25 alinha com uma antranilato sintase que é naturalmente monomérica.
Exemplos de alinhamentos de seqüência de antranilato sintases monoméricas e heterotetraméricas são mostrados nas figuras 21 e 35. Usando estes alinhamentos de seqüência, o espaçamento e orientação de domínios de antranilato sintase podem ser ajustados ou modificados para gerar uma • ♦· ··♦
construção de antranilato monomérica de domínios heterotetraméricos que otimamente se alinham com as antranilato sintases naturalmente monoméricas. Esta proteína de fusão pode ser usada para aumentar os níveis de triptofano nos tecidos de uma planta.
- ' 5 As antranilato sintases heterotetraméricas, como antranilato «I sintase de Sulfolobus solfataricus (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 1004323), compartilham entre cerca de 30% a cerca de 87% de
homologia de seqüência com antranilato sintases heterotetraméricas de outras espécies de plantas e microbianas. As antranilato sintases monoméricas como antranilato sintase de A. tumefaciencs, tem entre cerca de 83% e cerca de 52% de identidade para as outras enzimas monoméricas como Rhizobium meliloti (número de acesso do Genbank GI 15966140) e Azospirillum brasilense (número de acesso do Genbank 1717765), respectivamente. Bae et al.,
Rhizobium meliloti anthranilate synthase gene: cloning, seqüence and *15 expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 3471 - 3478 (1989); De - Troch et al., Isolation and characíerization of the Azospirillum brasilense trpE(G) gene, encoding anthranilate synthase. Curr. Microbiol. 34, 27 - 32 (1997).
No entanto, a identidade de seqüência global compartilhada Ό entre as antranilato sintases naturalmente monoméricas e naturalmente heterotetraméricas pode ser menor que 30%. Assim, o alinhamento visual em vez de alinhamento gerado por computador, pode ser necessário para alinhar otimamente as antranilato sintases monoméricas e heterotetraméricas. As estruturas e seqüências de marco de referência dentro da antranilato sintases 25 podem facilitar os alinhamentos de seqüência. Por exemplo, o motivo ”LLES” é parte de uma β-folha de β-sanduíche que forma a bolsa de ligação de triptofano de antranilato sintases. Estas seqüências de marco de referência podem ser usadas para alinhar, com maior confiança, seqüências divergentes de antranilato sintase, e são especialmente utilizáveis para a determinação de • ♦ · -»«♦ resíduos chave envolvidos na ligação de triptofano.
Para alcançar a fusão ou ligação de domínios de antranilato sintase, o C-término de TrpE selecionado ou α-domínio é ligado ao Ntérmino de domínio TrpG ou β-domínio. Em alguns casos, um peptídeo - 5 ligador pode ser usado entre os domínios para prover o espaçamento e/ou flexibilidade apropriados. As sequências de ligador apropriadas podem ser identificadas por alinhamento de seqüência de antranilato sintases monoméricas e heterotetraméricas.
Os β-domínios selecionados podem ser clonados, por exemplo, por hibridização, amplificação PCR ou como descrito em Anderson et al., patente U.S. número 6.118.047. Uma seqüência de peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser também ligada à região de codificação de antranilato sintase usando métodos padrões. Por exemplo, um peptídeo de marcação de cloroplasto de subunidade pequena (SSU) de Arabidopsis (CTP, SEQ ID NO: 71 - 74) pode ser usado para este propósito. Ver também, Stark et al., (1992) Science 258: 287. O gene fundido pode então ser inserido em um vetor apropriado para transformação de planta como aqui descrito.
Mutantes de antranilato sintase
As antranilato sintases mutantes contempladas pela invenção φ20 pode ter qualquer tipo de mutação incluindo, por exemplo, substituições de aminoácidos, deleções, inserções e/ou re-arranjos. Estes mutantes podem ser derivados ou variantes de ácidos nucleicos de antranilato sintase e polipeptídeos especificamente identificados aqui. Altemativamente, as antranilato sintases mutantes podem ser obtidas de qualquer uma espécie 25 disponível, incluindo as não explicitamente identificadas aqui. Os mutantes, derivados e variantes podem ter identidade com pelo menos cerca de 30% das posições de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 - 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem uma atividade de antranilato sintase. Em uma forma de realização preferida, os derivados de polipeptídeo e
• ·* ·· · • · • · • · *
variantes tem identidade com pelo menos cerca de 50% das posições de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem uma atividade de antranilato sintase. Em uma forma de realização mais preferida, os derivados de polipeptídeos e variantes ' 5 tem identidade com pelo menos cerca de 60% das posições de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 - 70, 77 - 82, 99 103 e tem atividade de antranilato sintase. Em uma forma de realização mais preferida, os derivados de polipeptídeos e variantes tem uma identidade com pelo menos cerca de 70% das posições de aminoácidos de qualquer uma das 10 SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 - 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem atividade de antranilato sintase. Em uma ainda mais preferida forma de realização, os derivados de polipeptídeos e variantes tem identidade com pelo menos cerca de 80% das posições de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID NO: 4 8, 43 _ 45s 57 _ 66, 69 - 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem atividade de antranilato ’ 15 sintase. Em uma ainda mais preferida forma de realização, os derivados de polipeptídeos e variantes tem identidade com pelo menos cerca de 90% das posições de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 - 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem atividade de antranilato sintase. Em uma ainda mais preferida forma de realização, os derivados de polipeptídeos e ^20 variantes tem identidade com pelo menos cerca de 95% das posições de aminoácidos de qualquer um dentre SEQ ID NO: 4 - 8, 43 - 45, 57 - 66, 69 70, 77 - 82, 99 - 103 e tem uma atividade de antranilato sintase.
Em uma forma de realização, os mutantes, variantes e derivados de antranilato sintase podem ser identificados por hibridização de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 - 3, 9 - 42, 46, 47 - 56, 67 - 68, 75 - 76,
- 98, ou um fragmento ou iniciador do mesmo sob condições moderadas ou, preferivelmente de alta estringência para uma fonte selecionada de ácidos nucleicos. As condições de hibridização moderadas e estringentes são bem conhecidas na arte, ver, por exemplo, seções 0,47 - 9,51 de Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989); ver também, Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (15 de janeiro de 2001). Por exemplo, condições estringentes ►
são as que (1) empregam baixa potência iônica e alta temperatura para ' - 5 lavagem, por exemplo, 0,015 M de NaCl/0,0015 M de citrato de sódio (SSC);
0,1% de lauril sulfato de sódio (SDS) a 50°C, ou (2) empregam um agente desnaturante como formamida durante hibridização, por exemplo, 50% de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% Ficoll/0,1% de poli vinil pirrolidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio a 42°C. Outro exemplo é o uso de
50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), e 10% de sulfato dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC e 0,1% de SDS.
A invenção ainda provê sondas e iniciadores de hibridização compreendendo um novo segmento de DNA isolado e purificado de pelo menos sete bases de nucleotídeos, que podem ser rotulados de modo detectável ou ligam a um rótulo detectável. Esta sonda de hibridização ou φ20 iniciador pode hibridizar sob condições de estringência moderada ou elevada para ou filamento de uma molécula de DNA que codifica uma antranilato sintase. Exemplos destas sondas de hibridização e iniciadores incluem qualquer uma dentre SEQ ID NO: 9 - 42, 47 - 56.
A antranilato sintase pode ser qualquer antranilato sintase, ou um mutante ou domínio da mesma, como o α-domínio. A antranilato sintase pode ser uma antranilato sintase monomérica. Os mutantes funcionais são preferidos, particularmente os que podem gerar altos níveis de triptofano em uma planta, por exemplo, os mutantes que são substancialmente resistentes a inibição por um análogo de aminoácido de triptofano.
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Os ácidos nucleicos codificando antranilato sintases também podem ser gerados de qualquer espécie conveniente, por exemplo, de ácidos nucleicos codificando qualquer domínio de Agrobacterium tumefaciens, Anabaena M22983 (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 152445), ' 5 Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 1174156), Brucella melitensis (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 17982357), Escherichia coli, Euglena gracilis, Mesorhizobium loti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 13472468), Nostoc sp. PCC7120 (por exemplo, número de acesso do 10 Genbank GI 17227910 ou GI 17230725), Rhizobium meliloti (por exemplo, número de acesso do Genbank GI 95177), Ruta graveolens, Rhodopseudomonas palustris, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Sulfolobus solfataricus, soja, arroz, algodão, trigo, tabaco Zea mays (milho) ou qualquer gene codificando uma subunidade ou domínio de antranilato 15 sintase.
Os mutantes tendo aumentada atividade de antranilato sintase, reduzida sensibilidade para inibição de feedback por triptofano ou análogos do mesmo, e/ou a capacidade de gerar quantidades aumentadas de triptofano em uma planta são desejáveis. Estes mutantes tem de fato uma mudança φ20 funcional no nível ou tipo de atividade que eles demonstram e são às vezes referidos como derivados de ácidos nucleicos de antranilato sintase e polipeptídeos aqui providos.
No entanto, a invenção também contempla variantes de antranilato sintase assim como ácidos nucleicos de antranilato sintase com 25 mutações silentes. Como usado aqui, uma mutação silente é uma mutação que muda a seqüência de nucleotídeo da antranilato sintase mas que não muda a seqüência de aminoácido da antranilato sintase codificada. Uma antranilato sintase variante é codificada por um ácido nucleico mutante e a variante tem uma ou mais mudanças de aminoácidos que não mudam substancialmente sua
6b atividade quando comparados com a antranilato sintase tipo selvagem correspondente. A invenção é dirigida a todos estes derivados, variantes e ácidos nucleicos de antranilato sintase com mutações silentes.
O DNA codificando uma antranilato sintase mudada que é
- - 5 resistente e/ou tolerante a L-triptofano ou análogos de aminoácidos de triptofano pode ser obtido por vários métodos. Os métodos incluem, mas não são limitados a:
1. Variação espontânea e seleção de mutante direta em culturas;
2. procedimentos de mutagênese direta ou indireta em culturas de tecido de qualquer tipo de células ou tecido, sementes ou plantas,
3. Mutação de gene antranilato sintase clonado por métodos como por mutagênese química, mutagênese dirigida ao sítio ou específica para sítio, Sambrook et al., citado supra), mutagênese mediada por transposon *15 (Berg et al., Biotechnology, 1, 417 (1983)), e mutagênese por deleção (Mitra et al., Molec. Gen. Genetic., 215,294 (1989));
4. projeto racional de mutações em resíduos chave, e
5. embaralhamento de DNA para incorporar mutações de
interesse em vários ácidos nucleicos de antranilato sintase.
Por exemplo, a informação estrutural de proteína de proteínas de antranilato sintase disponíveis pode ser usada para projetar racionalmente mutantes de antranilato sintase que tem uma elevada probabilidade de ter aumentada atividade ou reduzida sensibilidade para triptofano ou análogos de triptofano. Esta informação estrutural de proteína é disponível, por exemplo 25 em antranilato sintase de Solfulobus solfataricus (Knochel et. al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 96, 9479 - 9484 (1999)). O projeto racional de mutações pode ser obtido por alinhamento de seqüência de aminoácido de antranilato sintase selecionada com seqüência de aminoácido de antranilato sintase a partir de uma antranilato sintase de estrutura conhecida, por exemplo,
Solfulobus solfataricus, ver figuras 6,21 e 35. As regiões de catálise e ligação de triptofano previstas de proteína de antranilato sintase podem ser designadas por combinação do conhecimento da informação estrutural com a homologia de seqüência. Por exemplo, resíduos na bolsa de ligação de triptofano podem ♦ - 5 ser identificadas como candidatos potenciais para mutação para alterar a resistência da enzima para inibição de feedback por triptofano. Usando informação estrutural, vários mutantes de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies foram projetados racionalmente no sítio ou domínio envolvido na ligação de triptofano.
Usando esta seqüência e análise estrutural, regiões análogas à antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies em aproximadamente posições 25 - 60 ou 200 - 225 ou 290 - 300 ou 370 - 375 foram identificadas na antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies como sendo resíduos potencialmente utilizáveis para mutação para *15 produzir antranilato sintases ativas que podem ter menor sensibilidade para inibição de feedback de triptofano. Mais especificamente, os aminoácidos análogos a P29, E30, S31,132, S42, V43, V48, S50, S51, N52, N204, P205, M209, F210, G221, N292, P293, F298 e A373 na antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies estão sendo resíduos potencialmente utilizáveis para produzir antranilato sintases ativas que podem ter menor sensibilidade para inibição de feedback de triptofano. A invenção contempla qualquer substituição ou inserção de aminoácidos em qualquer uma destas posições. Altemativamente, o aminoácido em qualquer uma destas posições pode ser deletado.
A mutagênese dirigida ao sítio pode ser usada para gerar substituições de aminoácidos, deleções e inserções em vários sítios. Exemplos de mutações específicas feitas dentro da região de codificação de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies incluem as seguintes:
em cerca de posição 48, substituir Vai por Phe; (ver, por
* ··· · · · * · ··· ··· • · ···«····· · · exemplo, SEQ ID NO: 58), em cerca de posição 48, substituir Vai por Tyr; (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 59), em cerca de posição 51, substituir Ser por Phe; (ver, por • - 5 exemplo, SEQ ID NO: 60), em cerca de posição 51, substituir Ser por Cys; (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 61), em cerca de posição 52, substituir Asn por Phe; (ver, por exemplo, SEQ ID NO; 62), em cerca de posição 293, substituir Pro por Ala; (ver, por ® exemplo, SEQ ID NO: 63), em cerca de posição 293, substituir Pro por Gly, (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 64), ou em cerca de posição 298, substituir Phe por Trp; (ver, por '15 exemplo, SEQ ID NO: 65). Mutações similares podem ser feitas em posições análogas de qualquer antranilato sintase por alinhamento da seqüência de aminoácido de antranilato sintase para ser mudada com uma seqüência de aminoácido de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies. Um exemplo de uma seqüência de aminoácido de antranilato sintase de Agrobacterium 0pO tumefacies que pode ser usada para o alinhamento é SEQ ID NO: 4.
Os mutantes utilizáveis também podem ser identificados por mutagênese clássica e seleção genética. Uma mudança funcional pode ser detectada na atividade de enzima codificada pelo gene por exposição do gene a L-triptofano livre ou análogos de aminoácidos de triptofano, ou por 25 detecção de uma mudança na molécula de DNA usando mapeamento de enzima de restrição ou análise de seqüência de DNA.
Por exemplo, um gene codificando uma antranilato sintase substancialmente tolerante a 5-metil triptofano pode ser isolado de uma linhagem de células tolerante a 5-metil triptofano. Ver patente U.S. número • · · · · ♦
4.581.847, expedida em 15 de abril de 1986, cuja descrição é incorporada aqui por referência. Brevemente, as culturas de célula de planta parcialmente diferenciadas são cultivadas e sub-cultivadas com exposições contínuas a baixos níveis de 5-metil triptofano. As concentrações de 5-metil triptofano - - 5 são então gradualmente aumentadas por vários intervalos de sub-cultura. As células ou tecidos crescendo na presença de níveis de 5-metil triptofano normalmente tóxicos são sub-cultivados repetidas vezes na presença de 5metil- triptofano e caracterizados. A estabilidade do traço de tolerância a 5metil triptofano das células cultivadas pode ser avaliada por crescimento das
linhagens de células selecionadas na ausência de 5-metil triptofano durante vários períodos de tempo e então analisando o crescimento após exposição do tecido a 5-metil triptofano. As linhagens de células que são tolerantes devido a terem uma enzima de antranilato sintase alterada podem ser selecionadas por identificação de linhagens de células tendo atividade de enzima na 15 presença de níveis normalmente tóxicos, isto é inibidor de crescimento, de 5metil triptofano.
O gene de antranilato sintase clonado a partir de uma linhagem de células resistente a 5-MT ou 6-MA podem ser validados para tolerância a 5-MT, 6-MA, ou outros análogos de aminoácidos de triptofano por métodos |g0 padrões, como descrito na patente U.S. número 4.581.847, expedida em 15 de abril de 1986, cuja descrição é incorporada aqui por referência.
As linhagens de células com uma antranilato sintase de reduzida sensibilidade a inibição de 5-metil triptofano podem ser usadas para isolar uma antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano. Uma biblioteca 25 de DNA de uma linhagem de células tolerante a 5-metil triptofano pode ser gerada e fragmentos de DNA codificando toda ou uma porção de um gene de antranilato sintase pode ser identificada por hibridização para uma sonda de cDNA codificando uma porção de um gene de antranilato sintase. Uma cópia completa de gene alterado pode ser obtida ou por clonagem e ligação por
síntese de PCR usando iniciadores apropriados. O isolamento do gene alterado codificando para antranilato sintase pode ser confirmado em células de plantas transformadas por determinação de se a antranilato sintase sendo expressa retém atividade de enzima quando exposta a níveis normalmente ~ - 5 tóxicos de 5-metil triptofano. Ver, Anderson et al., patente U.S. número 6.118.047.
As regiões de codificando de qualquer molécula de DNA provida aqui também podem ser otimizadas para expressão em um organismo selecionado, por exemplo uma planta selecionada ou outro tipo de célula
hospedeira. Um exemplo de uma molécula de DNA tendo uso de códon otimizado para uma planta selecionada é uma molécula de DNA de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies tendo SEQ ID NO: 75. Este
DNA de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies otimizado (SEQ ID
NO: 75) tem 94% de identidade com SEQ ID NO: 1.
Transgenes e vetores
Uma vez obtido e amplificado um ácido nucleico codificando antranilato sintase ou um domínio da mesma, ele é combinado de modo operável com um promotor e, opcionalmente, com outros elementos para formar um transgene.
|>0 A maior parte dos genes tem regiões de seqüência de DNA que são conhecidas como promotores, e que regulam a expressão do gene. As regiões de promotores são tipicamente encontradas na seqüência de DNA de flanco a montante da seqüência de codificação em células procarióticas e eucarióticas. Uma seqüência de promotor provê a regulagem de transcrição de 25 seqüência de gene a jusante e tipicamente inclui de cerca de 50 a cerca de 2.00 pares de bases de nucleotídeos. As seqüências de promotor podem conter seqüências regulatórias como seqüências de melhorador que podem influenciar o nível de expressão de gene. Algumas seqüências de promotor isoladas podem prover por expressão de genes de genes heterólogos, isto é,
um gene diferente de gene nativo ou homólogo. As seqüências de promotor são também conhecidas como sendo fortes ou fracas ou indutíveis. Um forte promotor provê um nível elevado de expressão de gene, enquanto um promotor fraco prove um nível muito baixo de expressão de gene. Um - 5 promotor indutível é um promotor que provê o ligamento e o desligamento de uma expressão de gene em resposta a um agente adicionado exogenamente ou a um estímulo do ambiente ou de desenvolvimento. Os promotores também podem prover uma regulagem específica para tecido ou desenvolvimento. Uma seqüência de promotor isolado que é um promotor forte para genes heterólogos é vantajosa porque provê um nível suficiente de expressão de ~ gene para permitir uma fácil detecção e seleção de células transformadas para um nível elevado de expressão de genes, quando desejado.
O promotor em um transgene da invenção pode prover expressão de antranilato sintase de uma seqüência de DNA codificando 15 antranilato sintase. Preferivelmente, a seqüência de codificação é expressa de
- modo a resultar em um aumento nos níveis de triptofano dentro dos tecidos da planta, por exemplo, dentro das sementes da planta. Em outra forma de realização, a seqüência de codificação é expressa de modo a resultar em tolerância aumentada das células de planta a inibição de feedback ou à inibição de crescimento por um análogo de aminoácido de triptofano ou de modo a resultar em um aumento no teor de triptofano total das células. O promotor também pode ser indutível de modo que a expressão de gene pode ser ligada ou desligada por um agente adicionado exogenamente; Por exemplo, um promotor bacteriano como o promotor Ptac pode ser induzido em 25 níveis variados de expressão de genes dependendo do nível de isotiopropil galactosídeo adicionado às células bacterianas transformadas. Também pode ser preferível combinar o gene com um promotor que provê expressão específica para tecido ou expressão de gene regulada de modo de desenvolvimento em plantas. Muitos promotores utilizáveis na prática da
invenção são disponíveis na arte.
Os promotores preferidos irão geralmente incluir, mas não são limitados a, promotores que funcionam em bactérias, bacteriofagos, plastídeos ou células de plantas. Os promotores utilizáveis incluem o promotor CaMV 5 35S (Odell et al., Nature, 313, 810 (1985)), the CaMV 19S (Lawton et al.,
Plant Mol. Biol., 9, 31F (1987)), nos (Ebert et al., PNAS USA, 84, 5745 ’ (1987)), Adh (Walker et al, PNAS USA, 84, 6624 (1987)), sintase sacarose (Yang et al, PNAS USA, 87, 4144 (1990)), α-tubulina, napin, actina (Wang et al, Mol. Cell. Biol., 12, 3399 (1992)), cab (Sullivan et al, Mol. Gen.
Genet., 215, 431 (1989)), promotor PEPCase (Hudspeth et al, Plant Mol. Biol., 12, 579 (1989)), o promotor 7S-alfa'-conglicinina (Beachy et al, EMBO J, 4, 3047 (1985)) ou os associados com o complexo gene R (Chandler et al, The Plant Cell, 1, 1175 (1989)). Outros promotores utilizáveis incluem os promotores bacteriófago SP6, T3 e T7.
Os promotores de plastídeos também podem ser usados. A maior parte dos genes de plastídeos contém um promotor para a RNA polimerase codificada por plastídeo de múltiplas subunidades (PEP), assim como a RNA polimerase codificada nuclear de subunidade única. Uma seqüência de consenso para os promotores (NEP) de polimerase codificada ^20 nuclear e listagem de seqüências de promotores específicas para vários genes de plastídeos nativos pode ser encontrada em Hajdukiewicz et al, 1997, EMBO J. vol. 16 pp. 4041 - 4048, que se incorpora aqui por referência em sua totalidade.
Os exemplos de promotores de plastídeos que podem ser usados incluem o promotor (ZMRRN) de plastídeo RRN de Zea mays. O promotor ZMRRN pode acionar a expressão de um gene quando a RNA polimerase de plastídeo de Arabiâopsis thaliana está presente. Os promotores similares que podem ser usados na presente invenção são os promotores RRN plastídeo de Glycine Max (SOYRRN), e o RRN de plastídeo de Nicotiana
tabacum (NTRRN). Todos os três promotores podem ser reconhecidos pela RN A polimerase de plastídeo de Arabidopsis. Os aspectos gerais de promotores de RRN são descritos por Hajdukiewicz et al. e patente U.S. número 6.218.145.
Além disso, os melhoradores de transcrição ou duplicações de melhoradores podem ser usados para aumentar a expressão de um promotor particular. Exemplos destes melhoradores incluem, mas não são limitados a elementos do promotor CaMV 35S e genes de octopina sintase (Last et al., patente U.S. número 5.290.924, expedida em 1 de março de 1994). Por 10 exemplo, contempla-se que vetores para uso de acordo com a presente invenção podem ser construídos para incluir o elemento melhorador ocs. Este elemento foi primeiro identificado como um melhorador palindrômico de 16 bp de gene octopina sintase (ocs) de Agrobacterium (Ellis et al., EMBO J., 6, 3203 (1987)), e está presente em pelo menos 10 outros promotores (Bouchez *15 et al., EMBO JL 8, 4197 (1989)). Foi proposto que o uso de um elemento melhorador como o elemento ocs e particularmente cópias múltiplas do elemento, irão atuar para aumentar o nível de transcrição de promotores adjacentes quando aplicados no contexto de transformação de monocotiledôneas. Os promotores específicos para tecido, incluindo mas não JpO são limitados a promotores de células de raiz (Conkling et al., Plant Physiol.,
93, 1203 (1990)), e melhoradores específicos para tecido (Fromm et al., The Plant Cell, 1, 977 (1989)) também são contemplados como sendo particularmente utilizáveis, como são os promotores indutíveis como ABA - e promotores indutíveis de turgescência e outros.
Como a seqüência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o início da seqüência de codificação, isto é, a seqüência líder não traduzida, pode influenciar a expressão do gene, também será desejado empregar uma seqüência líder em particular. Qualquer seqüência líder disponível na arte pode ser empregada. As seqüências líder preferidas dirigem
• · · · « ·······*« ·« · níveis ótimos de expressão do gene fixado, por exemplo, por aumento ou manutenção de estabilidade de mRNA e/ou prevenção de iniciação inapropriada de tradução (Joshi, Nucl. Acid Res., 15, 6643 (1987)). A escolha destas sequências é feita pelos versados. As seqüências que são derivadas de - 5 genes que são altamente expressos em dicotiledôneas, e soja particularmente, são contempladas.
Em alguns casos, expressão extremamente elevada de antranilato sintase ou um domínio da mesma, não é necessária. Por exemplo, usando os métodos da invenção, este níveis elevados de antranilato sintase 10 podem ser gerados com a disponibilidade de substrato, em vez de enzima, pode limitar os níveis de triptofano gerados. Em tais casos, níveis mais moderados ou regulados de expressão podem ser selecionados pelos versados. Este versado na arte pode prontamente modular ou regular os níveis de expressão, por exemplo pelo uso de um promotor mais fraco ou por uso de T5 um promotor específico para tecido ou regulado no desenvolvimento.
Os ácidos nucleicos codificando a antranilato sintase de interesse também podem incluir um peptídeo de trânsito de plastídeo (por exemplo SEQ ID NO: 72 ou 74) para facilitar o transporte de polipeptídeo de antranilato sintase em plastídeo, por exemplo em cloroplastos. Um ácido ^0 nucleico codificando o peptídeo de trânsito de plastídeo selecionado (por exemplo SEQ ID NO: 71 ou 73) é geralmente ligado em quadro com a seqüência de codificação de antranilato sintase. No entanto o peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser colocado na extremidade N-terminal ou Cterminal da antranilato sintase.
As construções que incluem o ácido nucleico de interesse (por exemplo DNA codificando uma antranilato sintase) junto com uma seqüência de ácido nucleico que atua como um sinal de terminação de transcrição e que permite a poliadenilação do mRNA resultante. Estes sinais de terminação de transcrição são colocados 3’ ou a jusante da região de codificação de interesse.
Os sinais de terminação de transcrição preferidos contemplados incluem o
sinal de terminação de transcrição de gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., Nucl. Acid Res,, 11, 369 (1983)), o terminador do gene octopina sintase de Agrobacterium tumefacies e a extremidade 3* dos genes codificando o inibidor de protease I ou II de batata ou tomate, apesar de outros sinais de terminação de transcrição conhecidos na arte serem também contemplados. Os elementos regulatórios como Adh intron ’ (Callis et al., Genes Develop., 1, 1183 (1987)), sacarose sintase (Vasil et al., Plant PhysioL 91, 5175 (1989)) ou elemento ômega TMV (Gallie et al., The Plant Cell, 1, 301 (1989)) podem ser ainda incluídos onde desejado. Estas seqüências regulatórias não traduzidas 3' podem ser obtidas como descrito em An, Methods in Enzymology, 153, 292 (1987) ou já estão presentes em plasmídeos disponíveis de fontes comerciais como Clontech, Paio Alto, Califórnia. As seqüências regulatórias não traduzidas 3’ podem ser ligadas de 15 modo operativo ao término 3 de um gene de antranilato sintase por métodos padrões. Outros destes elementos regulatórios utilizáveis na prática da invenção são conhecidos dos versados.
Os genes marcadores ou genes repórter selecionáveis são também utilizáveis na presente invenção. Estes genes podem conferir um )£0 fenótipo distinto a células expressando o gene marcador e assim permitir que estas células transformadas sejam distintas de células que não tem o marcador. Os genes marcadores selecionáveis conferem um traço que se pode selecionar por meios químicos, isto é, através de uso de um agente seletivo (por exemplo um herbicida, antibiótico, ou outro). Os genes repórter, genes 25 triáveis, conferem um traço que se pode identificar através de observação ou teste, isto é, por triagem (por exemplo o traço R-local). Como evidente, muitos exemplos de genes marcadores apropriados são conhecidos na arte e podem ser empregados na prática da invenção.
Os marcadores selecionáveis possíveis para uso em conexão ·· :
• · · * · ♦ ··· · *
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com a presente invenção incluem, mas não são limitados a gene neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199, 183 (1985)) que codifica para resistência a neomicina e pode ser selecionado por uso de canamicina, G418, e outros, um gene bar que codifica para resistência a bialafos; um gene que codifica uma - - 5 proteína EPSP sintase alterada (Hinchee et al., Biotech.. 6, 915 (1988)) assim conferindo resistência a glifosato; um gene nitrilase como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência a bromoxinila (Stalker et al., Science, 242.
419 (1988)); um gene de acetolacto sintase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfoniluréia ou outros químicos inibindo ALS (pedido de patente européia número 154.204, 1985); um gene DHFR ™ resistente a metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem.. 263. 12500 (1988)); um gene de dalapon desalogenase que confere resistência a herbicida dalapon, ou um gene de antranilato sintase mudado que confere resistência a 5-metil triptofano. Onde se emprega um gene de EPSP sintase mutante, benefício adicional pode ser realizado através da incorporação de um peptídeo de trânsito de plastídeo apropriado (CTP).
Uma forma de realização ilustrativa de um gene marcador selecionável capaz de ser usado em sistemas para selecionar transformantes inclui os genes que codificam a enzima fosfínotricina acetiltransferase, como |βθ o gene bar de Streptomyces hygroscopicus ou o gene pat de Streptomyces viridochromogenes (patente U.S. número 5.550.318, que é incorporada aqui por referência). A enzima fosfínotricina acetiltransferase (PAT) inativa o ingrediente ativo no herbicida bialafos, fosfínotricina (PPT). PPT inibe a glutamina sintase, (Murakami et al., Mol. Gen. Genet.. 205, 42 (1986); Twell 25 et al., Plant Physiol., 91, 1270 (1989)) causando rápido acúmulo de amônia e morte de células.
Os marcadores triáveis que podem ser empregados incluem, mas não são limitados a, um gene β- glucuronidase ou uidK (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são • · · · · ·
conhecidos, um gene R-local, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, pp. 263 - 282 (1988)); um gene /Mactamase (Sutcliffe, PNAS USA, 75, 3737 (1978)), que codifica uma w 5 enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo PADAC uma cefalosporina cromogênica, um gene xylE (Zukowsky et al., PNAS USA, 80, 1101 (1983)) que codifica um catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene α-amilase (Ikuta et al.,
Biotech., 8, 241 (1990)); um gene tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol.,
129, 2703 (1983)) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa para formar o composto facilmente detectável melanina; um gene β-galactosidase, que codifica uma enzima para a qual se tem substratos cromogênicos; um gene luciferase (lux) (Ow et al., Science, 234, 856 (1986)), que permite a detecção de bioluminescência, ou mesmo um gene aequorina (Prasher et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm., 126, 1259 (1985)), que pode ser empregado em detecção de bioluminescência sensível a cálcio, ou gene de proteína fluorescente verde (Niedz et al., Plant Cell Reports, 14, 403 (1995)). A presença de gene lux em células transformadas pode ser detectada usando, por φ20 exemplo, filme de raios-X, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo com pouca luz, câmeras de contagem de fótons, ou luminometria em multipoços. Também se visa que o sistema pode ser desenvolvimento para a triagem populacional para bioluminescência, como em placas de cultura de tecido ou mesmo para triagem de plantas completas.
Além disso, transgenes podem ser construídos e empregados para prover a marcação do produto genético para um compartimento intracelular dentro das células de plantas ou na direção de uma proteína para o meio extracelular. Isto será geralmente obtido por união de uma seqüência de
DNA codificando uma seqüência de peptídeo de trânsito ou sinal para a
seqüência de codificação de um gene particular. O peptídeo de trânsito, ou sinal, resultante irá transportar a proteína para um destino intracelular ou extracelular particular, respectivamente, e pode então ser removido póstranslacionalmente. Os peptídeos de trânsito ou sinal atuam ao facilitarem o transporte de proteínas através das membranas intracelulares, por exemplo vacúolo, vesícula, plastídeo, e membranas mitocondriais, enquanto os peptídeos de sinal dirigem proteínas através da membrana extracelular. Ao facilitar o transporte da proteína em compartimentos dentro ou fora da célula, estas seqüências podem aumentar o acúmulo de produto de genes.
Um exemplo particular deste uso se refere à direção de uma antranilato sintase para uma organela particular, como o plastídeo, em vez de para o citoplasma. Isto é exemplificado pelo uso de peptídeo de trânsito
Arabidopsis SSU1A que confere marcação específica para plastídeo de '15 proteínas. Altemativamente, o transgene pode compreender uma seqüência de
DNA codificando peptídeo de trânsito de plastídeo ou uma seqüência de DNA codificando o peptídeo de trânsito rbcS (RuBISCO) ligado de modo operativo entre um promotor e a seqüência de DNA codificando uma antranilato sintase (para estudo de peptídeos de marcação de plastídeos, ver Heijne et al., Eur. J.
Ό Biochem., 180, 535 (1989); Keegstra et al., Ann. Rev. Plant Physiol, Plant
Mol. Biol., 40, 471 (1989)). Se o transgene for para ser introduzido em uma célula de planta, o transgene também pode conter terminação transcripcional de planta e sinais de poliadenilação e sinais translacionais ligados ao término 3* de um gene de antranilato sintase de planta.
Um peptídeo de trânsito de plastídeo exógeno pode ser usado que não é codificado dentro de um gene de antranilato sintase de planta nativa. Um peptídeo de trânsito de plastídeo tem tipicamente 40 a 70 aminoácidos de comprimento e funciona pós-translacionalmente para dirigir uma proteína para o plastídeo. O peptídeo de trânsito é clivado ou durante ou
logo após a importação do plastídeo para dar a proteína madura. A cópia completa de um gene codificando uma antranilato sintase de planta pode conter uma seqüência de peptídeo de trânsito de plastídeo. Neste caso, pode não ser necessário combinar uma seqüência de peptídeo de trânsito de
plastídeo obtida exogenamente no transgene.
As seqüências codificando o peptídeo de trânsito de plastídeo exógenas podem ser obtidas de vários genes nucleares de planta, desde que os produtos dos genes sejam expressos como pré-proteínas compreendendo um peptídeo de trânsito amino-terminal e transportado em plastídeo. Os exemplos de produtos de genes de plantas conhecidos como incluindo estas seqüências de peptídeo de trânsito incluem, mas não são limitados à subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase, proteína de ligação a /b de clorofila, proteínas ribossômicas de plastídeos, codificadas por genes nucleares, algumas proteínas de choque térmico, enzimas biossintéticas de aminoácido, '15 como acetolactato ácido sintase, 3-enolpiruvilfosfoshiquimato sintase, dihidrodipicolinato sintase, antranilato sintase e outros. Em alguns casos, uma proteína de transporte de plastídeo já pode ter sido codificada no gene de antranilato sintase de interesse, neste caso não é necessário adicionar estas seqüências de trânsito de plastídeo. Altemativamente, o fragmento de DNA Ό codificando para o peptídeo de trânsito pode ser quimicamente sintetizado ou totalmente ou em parte a partir de seqüências conhecidas de peptídeos de trânsito como os listados acima.
Sem levar em conta a fonte do fragmento de DNA codificando para o peptídeo de trânsito, deve-se incluir um códon de iniciação de 25 tradução, por exemplo um códon ATG, e ser expresso como uma seqüência de aminoácido que é reconhecida por e irá funcionar de modo apropriado em plastídeos da planta hospedeira. Atenção também deve ser dada para a seqüência de aminoácido na junção entre o peptídeo de trânsito e a enzima de antranilato sintase onde é clivada para dar a enzima madura. Algumas
» · · ··· »·* seqüências de aminoácido conservadas foram identificadas e podem servir como um guia. A fusão precisa de seqüência de codificação de peptídeo de trânsito com a seqüência de codificação de antranilato sintase pode requerer manipulação de uma ou ambas as seqüências de DNA para introduzir, por * - 5 exemplo, um sítio de restrição conveniente. Isto pode ser obtido por métodos incluindo mutagênese dirigida ao sítio, inserção de ligadores de ~ oligonucleotídeos quimicamente sintetizados e outros.
A fusão precisa dos ácidos nucleicos codificando a proteína de transporte de plastídeos pode não ser necessária desde que a seqüência de 10 codificação da proteína de transporte de plastídeo esteja em quadro com a da antranilato sintase. Por exemplo, aminoácidos ou peptidila adicionais podem, com freqüência, ser incluídos sem afetar adversamente a expressão ou localização da proteína de interesse.
Uma vez obtida, a seqüência de peptídeo de transito de plastídeos pode ser ligada de modo apropriado ao promotor e uma região de codificação de antranilato sintase em um transgene usando métodos padrões. Um plasmídeo contendo um promotor funcional em células de planta e tendo sítios de clonagem múltiplos a jusante pode ser construído ou obtido de fontes comerciais. A seqüência de peptídeo de trânsito de plastídeo pode ser inserida Z0 a jusante do promotor usando enzima de restrição. Uma região de codificação de antranilato sintase pode então ser fundida de modo translacional ou inserida imediatamente a jusante de e em quadro com o término 3' da seqüência de peptídeo de trânsito de plastídeo. Assim, o peptídeo de trânsito de plastídeo é preferivelmente ligado ao término amino da antranilato sintase.
Uma vez formado, o transgene pode ser subclonado em outros plasmídeos ou vetores.
Além da transformação de planta nuclear, a presente invenção também se estende à transformação direta do genoma plastídeo das plantas.
Assim, a marcação do produto de gene para um compartimento intracelular
·· ··· · · • · · · · dentro das célula de planta pode também ser obtida por liberação direta de um gene no compartimento intracelular. A transformação direta do genoma do plastídeo pode prover benefícios adicionais sobre transformação nuclear. Por exemplo, a transformação de plastídeo direta de antranilato sintase elimina a ~ - 5 exigência para um peptídeo de trânsito de plastídeo e transporte póstranslacional e processamento da pré-proteína derivada dos transformantes nucleares correspondentes. A transformação de plastídeo de plantas foi descrita por P. Maliga. Current Opinion in Plant Biology 5, 164 - 172 (2002), P. B. Heifetz. Biochimie vol. 82, 655 - 666 (2000), R. Bock. J. Mol. Biol.
312, 425 - 438 (2001), e H. Daniell et al., Trends in Plant Science 7, 84 - 91 (2002) e referências nos mesmos.
Após construção de um transgene contendo um gene de antranilato sintase, o cassete pode então ser introduzido em uma célula de planta. Dependendo do tipo de célula de planta, o nível de expressão de gene, * 15 e a atividade da enzima codificada pelo gene, introdução de DNA codificando ' · uma antranilato sintase na célula de planta pode levar à super-produção de triptofano, conferir tolerância a um análogo de aminoácido de triptofano, como 5-metil triptofano ou 6-metil antranilato e/ou de outra forma alterar o teor de triptofano da célula de planta.
020 Transformação de células hospedeiras
Um transgene compreendendo um gene de antranilato sintase pode ser subclonado em um vetor de expressão conhecido, e expressão de AS pode ser detectada e/ou quantificada. Este método de triagem é utilizável para identificar transgenes provendo uma expressão de um gene de antranilato 25 sintase, e expressão de uma antranilato sintase no plastídeo de uma célula de planta transformada.
Os vetores de plasmídeo incluem seqüências de DNA adicionais que provêem uma fácil seleção, amplificação, e transformação do transgene em células procarióticas e eucarióticas, por exemplo vetores
derivados de pUC, vetores derivados de pSK, vetores derivados de pGEM, vetores derivados de pSP, ou vetores derivados de pBS. As seqüências de DNA adicionais incluem origens de replicação para prover replicação autônoma do vetor, genes de marcador selecionável, preferivelmente * * 5 codificando resistência a antibiótico ou herbicida, sítios de clonagem múltiplos únicos provendo sítios múltiplos para inserir seqüências de DNA ou genes codificados no transgene, e seqüências que melhoram a transformação de células procarióticas e eucarióticas.
Outro vetor que é utilizável para expressão tanto em plantas
como células procarióticas é o plasmídeo Ti binário (como descrito em Schilperoort et al., patente U.S. número 4.940.838, expedida em 10 de julho de 1990) como exemplificado pelo vetor pGA582. Este vetor de plasmídeo Ti binário foi previamente caracterizado por An, acima. Este vetor Ti binário pode ser replicado em bactérias procarióticas como E. coli e Agrobacterium.
Os vetores de plasmídeo de Agrobacterium também podem ser usados para transferir o transgene para células de plantas. Os vetores de Ti binários preferivelmente incluem as bordas direita e esquerda de DNA T nopalina para prover uma transformação de célula de planta eficiente, um gene marcador selecionável, sítios de clonagem múltiplos únicos nas regiões de borda, a Ό replicação de origem colE' de um replicon de faixa ampla de hospedeiro. Os vetores Ti binários contendo um transgene da invenção podem ser usados para transformar ambas as células procarióticas e eucarióticas, mas são preferivelmente usados para transformar células de plantas. Ver, por exemplo, Glassman et al., patente U.S. número 5.258.300.
O vetor de expressão pode então ser introduzido em células procarióticas e eucarióticas por métodos disponíveis. Os métodos de transformação especialmente efetivos para monocotiledôneas e dicotiledôneas incluem, mas não são limitados a, bombardeio de microprojéteis de embriões imaturos (patente U.S. número 5.990.390) ou células de calo embriogênico
tipo II como descrito por W. J. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell, 2, 603 (1990)), Μ. E. Fromm et al. (Bio/Technology, 8, 833 (1990)) e D. A. Walters et al. (Plant Molecular Biology, 18, 189 (1992)), ou por eletroporação de calos embriogênicos tipo I descrita por D’Halluin et al. (The Plant Cell, 4, * - 5 1495 (1992)), ou por Krzyzek (patente U.S. número 5.384.253, expedida em de janeiro de 1995). Transformação de células de plantas por vórtice com fios de tungstênio revestidos com DNA (Coffee et al, patente U.S. número
5.302.523, expedida em 12 de abril de 1994) e transformação por exposição de célula a lipossomas contendo DNA também podem ser usados.
Após transformação da construção selecionada de antranilato sintase em uma célula hospedeira, a célula hospedeira pode ser usada para produção de produtos utilizáveis gerados pela antranilato sintase transgênica em combinação com o maquinário enzimático de célula hospedeira. O cultivo de células transformadas pode levar a melhorada produção de triptofano e *15 outros compostos utilizáveis, que podem ser recuperados de células ou do meio de cultura. Exemplos de compostos utilizáveis que podem ser gerados quando de expressão em várias células hospedeiras e/ou organismos incluem triptofano, ácido indol acético e outras auxinas, compostos isoflavonóides, importantes para a saúde cardiovascular encontrados em soja, compostos Ό indol voláteis que atuam como sinais para inimigos naturais de insetos herbívoros em milho, anticarcinogenes como indol glucosinolatos (indol-3carbinol) encontrado na família de plantas crucíferas, assim como indol alcalóides como compostos de ergotina produzidos por algumas espécies de fungos (Bames et al, Adv Exp Med Biol, 401, 87 (1996); Frey et al, Proc 25 Natl Acad Sei, 97, 14801 (2000); Muller et al, Biol Chem, 381, 679 (2000);
Mantegani et al, Farmaco, 54, 288 (1999); Zeligs, J Med Food, 1, 67 (1998);
Mash et al, Ann NY Acad Sei, 844, 274 (1998); Melanson et al, Proc Natl
Acad Sei, 94, 13345 (1997); Broadbent et al, Curr Med Chem, 5, 469 (1998)).
O acúmulo de triptofano também pode levar à aumentada produção de metabólitos secundários em micróbios e plantas, por exemplo, metabólitos contendo incol, como indóis simples, conjugados de indol, alcalóides de indol, fitoalexinas de indol, e glucosinalatos de indol em plantas.
* - 5 As antranilato sintases insensíveis a triptofano tem o potencial de aumentar os vários metabólitos derivados de corismato, incluindo os derivados de fenilalanina devido ao estímulo de síntese de fenilalanina por
triptofano via corismato mutase. Ver Siehl, D. The biosynthesis of tryptophan, tyrosine, and phenylalanine ffom chorismate in Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology, ed, BK Singh, pp 171 - 204. Outros metabólitos derivados de corismato que podem aumentar quando antranilato sintases insensíveis ao feedback estão presente incluem fenilpropanóides, flavonóides, e isoflavonóides, assim como os derivados de antranilato como indol, alcalóide indol, e indol glucosinolatos. Muitos destes compostos são 15 hormônios de plantas importantes, compostos de defesa da planta, agentes quimio-preventivos, de várias condições de saúde, e/ou compostos farmacologicamente ativos.
A faixa destes compostos cuja síntese pode ser aumentada por expressão de antranilato sintase depende do organismo em que a antranilato ►20 sintase é expressa. Um versado na arte pode prontamente avaliar quais organismos e células hospedeiras devem ser usados e/ou testar a fim de gerar os compostos desejados. A invenção contempla a síntese de triptofano e outros compostos em vários organismos, incluindo plantas, micróbios, fungos, leveduras, bactérias, células de insetos e células de mamíferos.
Estratégia para seleção de linhagens de células superprodutoras de triptofano
A seleção eficiente de uma variante de superprodutor de triptofano resistente a análogo de triptofano desejado usando técnicas de cultura de tecido requer a determinação cuidadosa de condições de seleção.
• < ♦ · · *
Estas condições são otimizadas para permitir o crescimento e acúmulo de células de superprodutor de triptofano resistente a análogo de triptofano na cultura enquanto inibindo o crescimento da maior parte da população de células. A situação é complicada pelo fato de que a vitalidade das células * ' 5 individuais em uma população pode ser altamente dependente da vitalidade de células vizinhas.
As condições sob as quais as culturas de células são expostas a análogo de triptofano são determinadas pelas características da interação do composto com o tecido. Estes fatores como o grau de toxicidade e a taxa de
inibição devem ser considerados. O acúmulo dos compostos pelas células em cultura e a persistência e estabilidade dos compostos, tanto no meio como nas células, também precisa ser considerado junto com a extensão de absorção e transmissão para o compartimento celular desejado. Adicionalmente, é ; importante determinar se os efeitos dos compostos podem ser prontamente !Í * 15 invertidos pela adição de triptofano.
Os efeitos do análogo em viabilidade da cultura e morfologia são cuidadosamente avaliados. É especialmente importante escolher condições de exposição de análogo que não tem impacto sobre a capacidade de regeneração de plantas de culturas. A escolha de condições de exposição φ20 de análogo é também influenciada por se o análogo mata as células ou simplesmente inibe as divisões celulares.
A escolha de um protocolo de seleção é dependente das considerações descritas acima. Os protocolos brevemente descritos abaixo podem ser usados no procedimento de seleção. Por exemplo, para selecionar 25 células que são resistentes à inibição do crescimento por um análogo de triptofano, células finamente divididas em cultura de suspensão de líquido podem ser expostas a níveis de análogo de triptofano elevados durante breves períodos de tempo. As células sobreviventes são então deixadas se recuperar e acumular e são então re-expostas durante períodos de tempo
subseqüentemente mais longos. Altemativamente, as culturas de células organizadas parcialmente diferenciadas são cultivadas e sub-cultivadas com exposição contínua a níveis inicialmente baixos de análogo de triptofano. As concentrações são então gradualmente aumentadas em vários intervalos de sub-cultura. Apesar destes protocolos poderem ser usados em um procedimento de seleção, a presente invenção não é limitada a estes procedimentos.
Genes para modificação de plantas
Como descrito acima, os genes que funcionam como genes marcadores selecionáveis e genes repórter podem ser combinados de modo operativo com a seqüência de DNA codificando a antranilato sintase, ou domínio da mesma, em transgenes, vetores e plantas da presente invenção. Adicionalmente, outros traços agronômicos podem ser adicionados aos transgenes, vetores e plantas da presente invenção. Estes traços incluem, mas não são limitados a resistência ou tolerância a insetos, resistência ou tolerância a doenças (viral, bacteriana, fungicas, por nematódeos), resistência ou tolerância a estresse, como exemplificado por resistência ou tolerância a seca, calor, resfriamento, congelamento, umidade excessiva, estresse de sal, estresse oxidativo, produções aumentadas; teor e complementação da φ 20 alimentação, aparência física, esterilidade masculina; definhamento por seca, capacidade de ficar em pé, fertilidade, propriedades de amido, quantidade e qualidade de óleo; e outros. Pode-se incorporar um ou mais genes conferindo estes traços nas plantas da invenção.
Resistência ou tolerância a insetos
As bactérias Bacillus thuringiensis (ou Bt) incluem quase 20 subespécies conhecidas de bactérias que produzem polipeptídeos de endotoxina que são tóxicos quando ingeridos por uma variedade de espécies de insetos. A biologia e biologia molecular da proteínas de endotoxina (proteínas Bt) e genes correspondentes (genes Bt) foram revistas por H. R.
Whitely et al., Ann. Rev. Microbiol., 40, 549 (1986) e por H. Hofte et al., Microbiol. Rev., 53,242 (1989). Os genes codificando para uma variedade de proteínas Bt foram clonados e seqüenciados. Um segmento do polipeptídeo Bt é essencial para toxicidade para uma variedade de pragas de Lepidoptera e * ” 5 está contido dentro de aproximadamente os primeiros 50% da molécula de polipeptídeo Bt. Conseqüentemente, um polipeptídeo Bt truncado codificado por um gene Bt truncado irá, em muitos casos, reter sua toxicidade para várias pragas de insetos Lepidoptera. Por exemplo, os polipeptídeos de Bt HD73 e
HD1 foram mostrados como sendo tóxicos para as larvas das pragas de
insetos Lepidoptera importantes de plantas nos Estados Unidos como a broca do milho europeu, bicha-amarela, gramiola, e larvas da espiga. Os genes codificando para polipeptídeos HD1 e HD73 foram clonados e seqüenciados por M. Geiser et al., Gene, 48, 109 (1986) e M. J. Adang et al., Gene, 36, 289 (1985), respectivamente, e podem ser clonados de cepas HD1 e HD73 obtidas de coleções de cultura (por exemplo, Bacillus Genetic Stock Center,
Columbus, Ohio ou USDA Bt Stock Collection Peoria, III.) usando protocolos padrões. Exemplos de genes Bt e polipeptídeos são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. números 6.329.574, 6.303.364, 6.320.100 e
6.331.655.
DNA codificando para novas toxinas BT previamente não caracterizadas pode ser clonado a partir de organismo Bacillus hospedeiro usando protocolos que foram previamente usados para clonar genes Bt, e novas formas sintéticas de toxinas Bt podem ser também produzidas.
Um gene Bt utilizável na presente invenção pode incluir uma seqüência de DNA 5' incluindo uma seqüência de DNA que irá permitir a iniciação de transcrição e tradução de uma seqüência Bt localizada a jusante em uma planta. O gene Bt pode também compreender uma seqüência de DNA 3' que inclui uma seqüência derivada de região não codificação 3’ de um gene que pode ser expresso na planta de interesse. O gene Bt também deve incluir • · · · · · uma seqüência de DNA codificando para um polipeptídeo Bt tóxico produzido por Bacillus thuringiensis ou porções tóxicas dos mesmos ou tendo homologia de seqüência amino substancial. A estrutura de codificação de Bt pode incluir: (i) seqüências de DNA que codificam para proteínas inseticidas • ' 5 que tem homologia substancial para endotoxinas Bt que são ativas contra pragas de insetos da planta de interesse, por exemplo as seqüências de Bt HD73 ou HD1, (ii) seqüências codificando para segmentos inseticidamente ativos do polipeptídeo de endotoxina Bt, por exemplo polipeptídeos HD73 ou HD1 inseticidamente ativos truncados dos términos carbóxi e/ou amino; e/ou
(i ii) seqüência Bt truncada fundida em quadro com uma seqüência(s) que codifica para um polipeptídeo que provê alguma vantagem adicional, como (a) genes que são selecionáveis, por exemplo genes que conferem resistência a antibióticos ou herbicidas, (b) genes repórter cujos produtos são fáceis de detectar ou testar, por exemplo luciferase ou beta-glucuronidase, (c) seqüências de DNA que codificam para seqüências de polipeptídeo que tem algum uso adicional na estabilização da proteína Bt contra degradação ou melhoram a eficácia da proteína Bt contra insetos, por exemplo inibidores de protease e (d) seqüências que ajudam a dirigir a proteína Bt para um compartimento específico dentro ou fora da célula de planta por exemplo uma φ 20 seqüência de sinal.
Para obter síntese ótima da proteína Bt na planta, também pode ser apropriado ajustar a seqüência de DNA do gene Bt para se parece mais com os genes que são eficazmente expressos na planta de interesse. Porque o uso de códon de genes Bt pode ser dissimilar ao usado por genes que são 25 expressos na planta de interesse, a expressão do gene Bt em células de planta pode ser melhorada pela substituição dos códons com os que são expressos de modo mais eficiente em plantas, por exemplo são usados com maior ffeqüência nas plantas de interesse (Ver E. Murray et al., Nucl. Acids Res.,
17, 477 (1989)). Esta substituição de códons pode requerer a substituição de
bases sem mudar a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo Bt resultante. O polipeptídeo Bt pode ser idêntico em seqüência para o gene bacteriano ou segmentos do mesmo. A seqüência de codificação Bt completa, ou seções da mesma, contendo uma maior proporção de códons preferidos do que o gene 5 bacteriano original pode ser sintetizada usando protocolos padrões de síntese química, e introduzida ou montada no gene Bt usando protocolos padrões, como mutagênese dirigida ao sítio ou polimerização de DNA e ligação e outros.
Os inibidores de protease também podem prover resistência a
insetos. Por exemplo, uso de um gene II inibidor de protease, pinll, de tomate ou batata pode ser utilizável. Também é vantajoso o uso de um gene pinll em combinação com um gene de toxina Bt. Outros genes que codificam inibidores do sistema digestivo do inseto, ou os que codificam enzimas ou cofatores que facilitam a produção de inibidores, podem ser também utilizáveis.
„ 15 Este grupo inclui inibidores de orizacistatina e amilase, como os de trigo e cevada.
Os genes codificando lectinas podem conferir propriedades inseticidas adicionais ou alternativas. (Murdock et al., Phytochemistry, 29 85 (1990); Czapla & Lang, J. Econ. Entomol., 83, 2480 (1990). Os genes de |20 lectina contemplados como sendo utilizáveis incluem, por exemplo aglutinina de cevada e germe de trigo (WGA) e lectinas de arroz. (Gatehouse et al., J Sei FoodAgric, 35, 373 (1984)).
Os genes controlando a produção de polipeptídeos grandes ou pequenos contra insetos quando introduzidos nas pragas de insetos como 25 peptídeos líticos, hormônios de peptídeo e toxinas e venenos, também podem ser utilizáveis. Por exemplo, a expressão de hormônio juvenil esterase, dirigida contra pragas de insetos específicas, também pode resultar em atividade inseticida ou talvez devido ao cessar da metamorfose (Hammock et al., Nature, 344, 458 (1990)).
Plantas transgênicas expressando genes codificando enzimas que afetam a integridade da cutícula do inseto também podem ser utilizáveis. Estes genes incluem os codificando, por exemplo, quitinase, proteases, lipases e também genes para a produção de nikkomicina. Os genes que codificam “ 5 para atividades que afetam a muda de insetos, como os afetando a produção de ecdiesteróide UDP-glucosil transferase, também podem ser utilizáveis.
Genes que codificam para enzimas que facilitam a produção de compostos que reduzem a qualidade nutricional da planta para pragas de
insetos podem também ser utilizáveis. Pode ser possível, por exemplo, conferir atividade inseticida a uma planta por alteração em composição esterol. Outras formas de realização da invenção se referem a plantas transgênicas com melhorada atividade lipoxigenase.
A presente invenção também provê métodos e composições utilizáveis na alteração de metabólitos secundários de plantas. Um exemplo refere-se a alteração de plantas para produzir DIMBOA, que irá, como contemplado, conferir resistência a broca do milho europeu, vermes de raiz e várias outras pragas de insetos. Ver, por exemplo, patente U.S. número
6.331.880. DIMBOA é derivado de compostos relacionados com indol. A presente invenção provê métodos para aumentar o teor de compostos >20 relacionados com indol como triptofano dentro de tecidos e células de plantas.
Assim, de acordo com a invenção, os métodos providos aqui também podem aumentar os níveis de DIMBOA, e assim aumentar a resistência de plantas a insetos.
A introdução de genes que podem regular a produção de maisina, e genes envolvidos na produção de dhurrina em sorgo, é também contemplada para ser de uso na facilitação da resistência a larvas de espiga e verme de raiz, respectivamente.
Outros genes codificando proteínas caracterizadas como tendo atividade inseticida potencial também podem ser usados. Estes genes incluem,
por exemplo, o inibidor de tripsina de feijão-de-vaca (CpTI; Hilder et al., Nature, 330, 160 (1987)) que pode ser usado como um meio de impedimento de verme de raiz, genes codificando avermectina (Avermectin e Abamectin., Campbell, W. C., ed., 1989; Ikeda et al., J Bacteriol, 169, 5615 1987) que 5 pode demonstrar ser utilizável como um meio de impedimento de verme de raiz de milho, genes de proteína inativando ribossoma, e genes que regulam as estruturas de planta. As plantas transgênicas incluindo genes de anticorpos anti-insetos e genes que codificam para enzimas que podem converter um inseticida não tóxico (pro-inseticida) aplicado no exterior da planta em um
inseticida dentro da planta são também contemplados.
Resistência ou tolerância ambiental ou ao estresse
A melhora de uma capacidade da planta de tolerar vários estresses ambientais pode ser efetuada através da expressão de genes. Por exemplo, aumentada resistência a temperaturas de congelamento pode ser 15 conferida através da introdução de uma proteína ”anti-congelamento como de Winter Flounder (Cutler et al., J Plant Physiol, 135, 351 1989) ou derivados de genes sintéticos das mesmas. A melhorada tolerância também pode ser conferida através de aumentada expressão de glicerol-3- fosfato acetil transferase em plastídeos (Wolter et al., The EMBO J„ 11, 4685 )20 (1992)). A resistência a estresse oxidativo pode ser conferida por expressão de superóxido dismutase (Gupta et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90, 1629 (1993)), e pode ser melhorada por glutationa reduetase (Bowler et al., Ann Rev. Plant Physiol., 43, 83 (1992)).
Contempla-se que a expressão de genes que afetam de modo 25 favorável o teor d' água da planta, potencial de água total, potencial osmótico, e turgescência irão melhorar a capacidade da planta de tolerar seca e serão, assim, utilizáveis. Propõe-se, por exemplo, que a expressão de genes codificando para a biossíntese de solutos osmoticamente ativos pode conferir proteção contra seca. Nesta classe, estão genes codificando manitol
desidrogenase (Lee e Saier, J. Bacteríol., 258, 10761 (1982)) e trehalose 6fosfato sintase (Kaasen et al., J. Bacteriology, 174, 889 (1992)).
Similarmente, outros metabólitos podem proteger ou função de enzima ou integridade da membrana (Loomis et al., J. Expt. Zoology, 252, 9 * - 5 (1989)), e assim expressão de genes codificando a biossíntese destes compostos pode conferir resistência a seca em um modo similar a ou “ complementar a manitol. Outros exemplos de metabólitos de ocorrência natural que são osmoticamente ativos e/ou provêem algum efeito protetor direto durante a seca e/ou dessecação incluem fructose, eritritol, sorbitol,
dulcitol, glucosilglicerol, sacarose, estaquiose, raffinose, prolina, glicina, betaína, ononitol e pinitol. Ver, por exemplo, patente U.S. número 6.281.411.
Três classes de proteínas embriogênicas tardias foram designadas com base em similaridades estruturais (ver Dure et al., Plant Molecular Biology, 12, 475 (1989)). Expressão de genes estruturais de todos _ 15 os três grupos LEA pode conferir tolerância a seca. Outros tipos de proteínas induzidas durante o estresse com água, que podem ser utilizáveis incluem tiol proteases, aldolases e transportadores de transmembrana, que podem conferir várias funções de tipo protetor e/ou de reparo durante o estresse da seca. Ver, por exemplo, PCT/CA99/00219 (genes de polipeptídeo trocador Na+/H+). Os :0 genes que efetuam a biossíntese de lipídeos podem ser também utilizáveis para conferir resistência à seca.
A expressão de genes envolvidos com traços morfológicos específicos que permitem aumentadas extrações de água da secagem do solo também podem ser utilizáveis. A expressão de genes que melhora a reprodução durante os momentos de estresse pode ser também utilizável. Foi também proposto que a expressão de genes que minimizam o aborto de grãos ou sementes durante momentos de estresse devem aumentar a quantidade de grão a ser coletada e, assim, de valor comercial.
Ao permitir que as plantas utilizam água de modo mais <3 eficiente, através da introdução e expressão de genes, pode-se melhorar o desempenho global ainda quando a disponibilidade de água no solo não é limitada. Ao introduzir genes que melhoram a capacidade de água de maximizar o uso de água através de uma ampla faixa de estresses com relação • 5 a disponibilidade de água, estabilidade do rendimento ou consistência do desempenho da produção pode ser obtida.
Resistência ou tolerância a doenças
A resistência a vírus pode ser produzida através da expressão de genes. Por exemplo, a expressão de genes anti-sentido marcados em
funções virais essenciais ou expressão de genes codificando proteínas de capa virais pode melhorar a resistência ao vírus.
A resistência a doenças causadas por bactérias ou vírus pode ser conferida através da introdução de genes. Por exemplo, genes codificando os assim chamados antibióticos de peptídeos, proteína relacionadas com . 15 patogenese (PR), resistência a toxina, e proteínas afetando as interações hospedeiro-patógeno, como características morfológicas, podem ser utilizáveis.
Redução/eliminação de micotoxinas
A produção de micotoxinas, incluindo aflotoxina e fumonisina,
Ό por fungos associados com plantas é um fator significante para tomar o grão não utilizável. A inibição do crescimento destes fungos pode reduzir a síntese destas substâncias tóxicas e, assim, reduzir as perdas de grão devido a contaminação por micotoxinas. Pode ser possível introduzir genes em plantas que iriam inibir a síntese da micotoxina sem interferir com o crescimento de 25 fungos. Além disso, a expressão de um novo gene que codifica uma enzima capaz de tomar a micotoxina não tóxica seria utilizável a fim de obter reduzida contaminação por micotoxina.
Composição ou qualidade da planta
A composição da planta pode ser alterada, por exemplo, para
melhorar o equilíbrio de aminoácidos em vários modos incluindo a elevação da expressão de proteínas nativas, diminuindo a expressão das com composição fraca, mudando a composição de proteínas nativas, ou introduzindo genes codificando proteínas completamente novas possuindo composição superior. Ver, por exemplo, patente U.S. número 6.160.208 (alteração de da expressão de proteína no armazenamento de sementes). A introdução de genes que alteram o teor de óleo da planta pode ser valiosa. Ver, por exemplo, patente U.S. números 6.069.289 e 6.268.550 (gene ACCase). Genes podem ser introduzidos os quais melhoram o valor nutritivo do componente de amido da planta, por exemplo por aumento do grau de ramificação, resultando em melhorada utilização do amido em vacas por retardo de seu metabolismo.
Características agronômicas da planta
Dois dos fatores determinando onde as plantas podem ser . 15 cultivadas são a temperatura diária média durante a estação de crescimento e a extensão de tempo entre as geadas. A expressão de genes que estão envolvidos na regulagem de desenvolvimento de plantas pode ser utilizável, por exemplo, os genes de bainha inacabada e sem lígula que foram identificados em milho.
φ20 Os genes podem ser introduzidos em milho que iriam melhorar a capacidade de ficar de pé e outras características de crescimento da planta. A expressão de genes que conferem hastes mais fortes, melhorados sistemas de raízes, ou evitam ou reduzem o desprendimento de espigas, deve ser valiosa para os fazendeiros.
Utilização de nutrientes
A capacidade de usar os nutrientes disponíveis pode ser um fator limitativo no crescimento de plantas. Pode ser possível alterar a absorção de nutrientes, tolerar extremos de pH, mobilização através da planta, poças de armazenamento, e disponibilidade de atividades metabólicas pela introdução
dos genes. Estas modificações devem permitir que uma planta utilize com maior eficiência os nutrientes disponíveis. Por exemplo, um aumento na atividade de uma enzima que está normalmente presente na planta e envolvida em utilização de nutrientes pode aumentar a disponibilidade de um nutriente.
• - 5 Um exemplo desta enzima deve ser fitase.
Esterilidade masculina
A esterilidade masculina é utilizável na produção de semente híbrida, e esterilidade masculina pode ser produzida através da expressão de genes. Pode ser possível através da introdução de TURF-13 via transformação
para separar a esterilidade masculina de sensibilidade à doença. Ver Levings, Science, 250: 942 - 947, 1990. Como pode ser necessário restaurar a esterilidade masculina para fins de procriação e para produção de grãos, os genes codificando a esterilidade masculina também podem ser introduzidos.
Seleção e caracterização de linhagens de células resistentes
As seleções são realizadas até as células ou tecido serem recuperados que são observados como estando crescendo bem na presença de níveis normalmente inibidores de um análogo de triptofano do mesmo. Estas linhagens de células são subcultivadas várias vezes adicionais na presença de um análogo de triptofano para remover as células não resistentes e então pO caracterizadas. A quantidade de resistência que foi obtida é determinada por comparação do crescimento destas linhagens de células com o crescimento de células não selecionadas ou tecido na presença de vários análogos de triptofano em várias concentrações. A estabilidade do traço de resistência das células cultivadas pode ser avaliada por simples crescimento das linhagens de 25 células selecionadas na ausência do análogo de triptofano durante vários períodos de tempo e então analisando o crescimento após re-exposição do tecido ao análogo. As linhagens de células resistentes também podem ser avaliadas usando estudos químicos in vitro para verificar que o sítio de ação do análogo é alterado para uma forma que é menos sensível a inibição por
análogos de triptofano.
A expressão transiente de um gene de antranilato sintase pode ser detectada e quantificada nas células transformadas. A expressão de gene pode ser quantificada por análise RT-PCR, um Western blot quantitativo • ' 5 usando anticorpos específicos para a antranilato sintase clonada ou por detecção da atividade de enzima na presença de triptofano ou um análogo de aminoácido de triptofano. O tecido e local subcelular da antranilato sintase clonada podem ser determinados por métodos de coloração imunoquímica usando anticorpos específicos para a antranilato sintase clonada ou
fracionamento subcelular e subseqüentes análises bioquímicas e/ou imunológicas. A sensibilidade da antranilato sintase clonada para agentes também pode ser avaliada. Os transgenes provendo para expressão de uma antranilato sintase para antranilato sintase tolerante à inibição por um análogo de aminoácido de triptofano ou L-triptofano livre também podem ser usados para transformar células de tecido de plantas monocotiledôneas e/ou dicotiledôneas e para regenerar plantas transformadas e sementes. As células transformadas podem ser selecionadas por detecção da presença de um gene de marcador selecionável ou um gene repórter, por exemplo, por detecção de um marcador de resistência a herbicida selecionável. A expressão transiente i20 de um gene de antranilato sintase pode ser detectada nos calos embriogênicos transgênicos usando anticorpos específicos para a antranilato sintase clonada, ou por análises RT-PCR.
Regeneração de planta e produção de sementes
Os calos embriogênicos transformados, tecido meristemato, embriões, discos de folhas e outros podem ser então usados para gerar plantas transgênicas que demonstram herança estável do gene antranilato sintase transformado. As linhagens de células de plantas demonstrando níveis satisfatórios de tolerância a um análogo de aminoácido de triptofano são passadas por um protocolo de regeneração de plantas para obter plantas
··· ··« maduras e sementes expressando os traços de tolerância por métodos bem conhecidos na arte (por exemplo, ver patente U.S. números 5.990.390, 5.489.520; e Laursen et al., Plant Mol. Bíol., 24, 51 (1994)). O protocolo de regeneração de planta permite o desenvolvimento de embriões somáticos e o • ' 5 subseqüente crescimento de raízes e brotos. Para determinar que o traço de tolerância é expresso em órgãos diferenciados da planta, e não apenas em cultura de célula não diferenciada, as plantas regeneradas podem ser testados pelos níveis de triptofano presente em várias porções da planta com relação a plantas regeneradas, não transformadas. As plantas transgênicas e sementes
podem ser geradas a partir de células transformadas e tecidos mostrando uma mudança no teor de triptofano ou na resistência a um análogo de triptofano usando métodos padrões. É especialmente preferido que o teor de triptofano das folhas ou sementes seja aumentado. Uma mudança na atividade específica da enzima na presença de quantidades inibidoras de triptofano ou um análogo . 15 do mesmo pode ser detectada por medida da atividade de enzima nas células transformadas como descrito por Widholm, Biochimica et Biophysica Acta,
279, 48 (1972). Uma mudança em teor de triptofano total também pode ser examinada por métodos padrões como descrito por Jones et al., Analyst, 106, 968 (1981).
)20 As plantas maduras são então obtidas a partir de linhagens de células que são conhecidas como expressando o traço. Se possível, as plantas regeneradas são auto-polinizadas. Além disso, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado para plantas cultivadas a partir de sementes de linhagens endogâmicas agronomicamente importantes. Em alguns casos, o pólen de 25 plantas destas linhagens endogâmicas é usado para polinizar plantas regeneradas.
O traço é geneticamente caracterizado por avaliação da segregação do traço na primeira e última progênie da geração. A herança e a expressão em plantas de traços selecionados em cultura de tecido são de importância particular se os traços se destinarem a ser comercialmente utilizáveis.
• · · · « ·
O valor comercial de sojas, cereais e outras plantas superprodutoras de triptofano é maior se muitas combinações híbridas diferentes estiverem disponíveis para venda. O fazendeiro tipicamente cultiva mais de um tipo de híbrido com base em tais diferenças como maturidade, • 5 permanência em pé e outros traços agronômicos. Adicionalmente, os híbridos adaptados para uma parte do país não são adaptados para outra parte devido a * ' diferenças em tais traços como maturidade, doença e resistência a insetos.
Devido a isto, é necessário criar a superprodução de triptofano em um grande número de linhagens endogâmicas parentais de modo que possam ser
produzidas muitas combinações de híbridos.
Um processo de conversão (retro-cruzamento) é realizado por cruzamento da linhagem superprodutora original para linhagens de elite normais e cruzamento da progênie de volta ao parental normal. A progênie deste cruzamento irá segregar de modo que algumas plantas transportam o gene , 15 responsável para a superprodução enquanto outras não transportam. As plantas transportando estes genes seriam cruzadas novamente para o parental normal resultando em progênie que segrega para superprodução e produção normal mais uma vez. Isto é repetido até que o parental normal original foi convertido em uma linhagem de superprodução, ainda possuindo todos os outros atributos Ό importantes como originalmente encontrados no parental normal. Um programa de retro-cruzamento separado é implementado para cada linhagem de elite que deve ser convertida em linhagem superprodutora de triptofano.
Subseqüente ao retro-cruzamento, as novas linhagens superprodutoras e as combinações apropriadas de linhagens que fazem bons híbridos comerciais são avaliadas para superprodução assim como uma batería de importantes traços agronômicos. As linhagens e híbridos superprodutores são produzidos que são verdadeiros para tipificar as linhagens e híbridos normais originais. Isto requer avaliação em uma faixa de condições ambientais onde as linhagens ou híbridos serão geralmente cultivados comercialmente. Para produção de sojas com elevado teor de triptofano, pode ser necessário que ambos os parentais da semente híbrida sejam homogizóticos para o aspecto de alto teor de triptofano. As linhagens parentais de híbridos que tem desempenho satisfatório são aumentadas e usadas para produção de híbridos usando práticas “ - 5 de produção de semente híbrida padrão.
As plantas transgênicas aqui produzidas são esperadas como * sendo utilizáveis para vários fins comerciais e de pesquisa. As plantas transgênicas podem ser criadas para uso em agricultura tradicional para
possuir traços benéficos ao consumidor do grão coletado da planta (por exemplo, teor nutritivo aumentado em alimento humano ou ração animal). Em tais usos, as plantas são geralmente cultivadas para o uso de seu grão em alimentos humanos e animais. No entanto, outras partes das plantas, incluindo hastes e talos, cascas, partes vegetativas, e outros, também podem ter utilidade, incluindo uso como parte da silagem animal, alimentos para fermentação, biocatálise, ou para fins ornamentais.
As plantas transgênicas também podem encontrar uso na fabricação comercial de proteínas ou outras moléculas, onde a molécula de interesse é extraída ou purificada a partir de partes das plantas, sementes e outros. As células ou tecido das plantas podem ser também cultivadas, |20 cultivadas in vitro, ou fermentadas para a fabricação de tais moléculas.
As plantas transgênicas também podem ser usadas em programas de criação comerciais, ou podem ser cruzadas ou criadas em plantas de espécies de cultura relacionadas. As melhoras codificadas pelo DNA recombinante podem ser transferidas, por exemplo, de célula de soja 25 para células de outras espécies, por exemplo por fusão de protoplasto.
Em uma forma de realização, um transgene composto de adomínio de antranilato de milho isolado de uma linhagem de células de milho tolerante a 5-MT e ligado ao promotor 35 S CaMV é introduzido em um tecido de monocotiledônea ou dicotiledônea sensível a 5-MT usando • · · · · · bombardeio de microprojéteis. Os embriões ou meristemas transformados são selecionados e usados para gerar plantas transgênicas. Os calos e plantas transgênicas transformados podem ser avaliados para tolerância a 5-MT ou 6MA e para herança estável do traço de tolerância.
Os seguintes exemplos ainda ilustram a invenção e não se destinam a ser limitativos da mesma.
Exemplo 1 - Isolamento e expressão de E. coli de antranilato sintase de
Agrobacterium tumefacies
Este exemplo descreve o isolamento de antranilato sintase de
Agrobacterium tumefacies e sua expressão em E. coli.
Clonagem de AS de Agrobacterium tumefacies
As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de região de codificação de antranilato sintase de Rhizobium meliloti (número de acesso do Genbank: PI5395) foram usadas para pesquisar uma base de dados de seqüência genômica C58 de Agrobacterium tumefacies (Goodner et al.
Science 294, 2323 - 2328 (2001)). A pesquisa consistiu de tblastn usando matriz blosum62, (Altschul et. al., Nucleic Acid Res., 25, 3389 - 3402 (1997)).
O homólogo de AS identificado na base de dados de seqüência 020 genômica C58 de Agrobacterium tumefacies foi clonado por PCR usando DNA genômico de Agrobacterium tumefacies cepa C58 (ATCC número 33970) como o gabarito. A reação PCR primária foi realizada usando os seguintes iniciadores :
5’-TTATGCCGCCTGTCATCG-3’ (SEQ ID NO: 47) e
5 ’-ATAGGCTTAATGGTAACCG-3 ’ (SEQ ID NO: 48).
Os parâmetros de amplificação de genes foram os seguintes: (a) desnaturar a 95°C durante 30 s, (b) recombinar a 50°C durante 30 s e (c) estender a 72°C durante 2 min, usando PCR de alta fidelidade Expand (Roche Biochemicals), de acordo com as instruções dos fabricantes.
• * ♦ * • · ♦
Um ciclo adicional de amplificação de PCR, dando um produto de aproximadamente 2,3 Kb de comprimento foi realizado usando o gabarito amplificado de acima e os seguintes iniciadores abrigados: 5’-CTGAACAACAGAAGTACG-3’ (SEQ ID NO: 49)
5’-TAACCGTGTCATCGAGCG-3’ (SEQ ID NO: 50).
O produto PCR purificado foi ligado em pGEM-T easy (Promega Biotech) resultando no plasmídeo pMON61600 (figura 1). pMON61600 foi seqüenciado usando metodologia de seqüenciamento padrão.
A confirmação da seqüência correta foi obtida por comparação da seqüência
de seqüência de antranilato sintase de Rhizobium meliloti (figura 2). A seqüência de aminoácidos traduzida de clone isolado (SEQ ID NO: 4) compartilhou 88% de identidade com a enzima Rhizobium meliloti (SEQ ID
NO: 7) (figura 2).
A abreviatura “AgroAS” ou AS de A. tumefaciens é às vezes usada aqui para se referir a antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies.
Expressão de£. coli de AS de Agrobacterium tumefacies
Os seguintes vetores foram construídos para facilitar a subclonagem de gene AS de Agrobacterium tumefacies em um vetor de expressão apropriado.
φ20 Um fragmento PCR de 2215 pares de bases foi gerado usando pMON61600 como o gabarito e os seguintes iniciadores :
’ - AAAAAGATCTCC ATGG TAACGATC ATTCAGG-3 ’ (SEQ ID NO: 51)
5’-AAAAGAA
TTCTTATCACGCGGCCTTGGTCTTCGCC-3’ (SEQ ID NO: 52).
O plasmídeo pMON61600 foi digerido com enzimas de restrição Ncol e RsII. Além disso, um fragmento de 409bp (derivado por digestão do produto PCR de 2215 pares de bases com Ncol e Rsrll) foi então ligado no plasmídeo pMON61600 digerido, assim substituindo o fragmento ii • · «· · • · · ·« • · · ·· · * ·« ···« • · · *· φ20
Ncol /Rsrll e resultando em um sítio Ncol em quadro com o códon de iniciação de tradução (ATG) de AS de Agrobacterium tumefacies para dar pMON34692 (figura 3).
O plasmídeo de expressão de E. coli de base T7, pMON34697 (figura 4), foi gerado por digestão de restrição de pET30a (Novogen Inc) com Sphl e BamHI. O fragmento de 4.969 resultante foi purificado e subclonado com um fragmento Sphl e BamHI de 338 bp de pETl ld (Novogen Inc.)
O plasmídeo pMON34705 (figura 5) foi gerado por digestão de restrição de pMON34697 com Ncol e Saci. O fragmento de 5 263 bp resultante foi então purificado e ligado com um fragmento Ncol e Saci de 2 256 bp de pMON34692 contendo AS de Agrobacterium tumefacies.
O plasmídeo pMON34705 foi transformado em E. coli BL21 (DE3) (f-ompTHsdStf^va^gal dem (DE3)) de acordo com as instruções do fabricante (Novogen Inc). DE3 é um lisogênio hospedeiro de ÀDE3 contendo cópia cromossômica de polimerase de RNA T7 sob o controle de um lacUV5 indutível por isopropil-l-tio-d-galactopiranosídeo (IPTG).
As células transformadas foram selecionadas em placas de canamicina que tinham sido incubadas a 37°C durante a noite (10 h). As colônias únicas foram transferidas para 2 ml de LB (caldo Luria, por litro, 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g NaCl, e 1 g glucose (opcionalO ou caldo 2X-YT (por litro, 16 g triptona, 10 g extrato de levedura, 5 g NaCl) e então colocadas em um incubador a 37°C e agitadas a 225 rpm durante 3 h. As células foram removidas e 4 pL de 100 mM IPTG foram adicionados à cultura e retomadas ao incubador a 37°C durante mais 2 a 3 h. Uma alíquota de 1 mL das células foi removida e sonicada em tampão de sonicação (50 mM de fosfato de potássio (pH 7,3), 10% de glicerol, 10 mM de 2-mercaptoetanol e lOmMde MgCl2).
O extrato de célula lisada resultante foi o material de fonte para o teste de AS padrão descrito abaixo. Os resultados estabeleceram que o
sistema de expressão com base em plasmídeo pMON34705 foi capaz de produzir proteína AS de Agrobacterium tumefacies solúvel e enzimaticamente ativa que chega a aproximadamente 50% da proteína extraída solúvel total.
EXEMPLO 2 - Níveis elevados de trp na semente são obtidos por transformação de plantas com antranilato sintase de Agrobacterium tipo selvagem
Vetor de expressão pMON58120
O vetor pMON58120 (figura 34) codifica uma fusão entre um
peptídeo de marcação de cloroplasto de subnidade pequena (SSU) de Arabidopsis de 264 pares de base (CTP, SEQ ID NO: 71), e uma matriz de leitura aberta de antranilato sintase de Agrobacterium (AgroAS) de tipo selvagem de 2187 pares de bases (SEQ ID NO: 1). Ver, Stark et al, (1992) Science 258: 287. A expressão desta matriz de leitura aberta é acionada pelo promotor alfa prime (7S a’) 7S de soja.
, 15 Quando da tradução em ribossomas citoplásmicos, a fusão (proteína imatura) é importada no cloroplasto onde a seqüência de marcação de cloroplasto é removida. Existem dois sítios de divagem em CTP1. O primeiro sítio é 30 pares de base a montante do início CDS (C /M), e o outro está na metionina inicial (C /Μ). O segundo sítio de divagem não parece ser |2O processado de modo eficiente. A divagem é prevista para dar uma proteína madura de cerca de 70 Kd e tem atividade AS, como mostrado pelos dados de atividade de enzimas e dados da eficácia de trp.
O gene AS foi transformado com o gene CP4 sintético que confere resistência a glifosato, no entanto, o gene CP4 é processado 25 separadamente do gene AS. A expressão do gene CP4 foi acionada pelo promotor FMV, que é um promotor 35S de vírus do mosaico da betônica da água. A resistência a glifosato permite a seleção das plantas transformadas.
Análise Western de proteína AS
Trinta e cinco eventos de transformação de pMON58120 foram analisados para presença de proteína AgroAS. A proteína AgroAS foi detectada com um anticorpo policlonal criado em coelhos contra AgroAS rotulado com His. O polipeptídeo Agro-AS de comprimento completo rotulado com His foi 5 usado como um antígeno para gerar uma população de anticorpos policlonais em coelhos por CoCalico Biological INC. O DNA de Agro-AS rotulado com His recombinante foi colocado em um vetor de expressão pMON58120 (pet30a-agroAS). A proteína de fusão His-AgroAS foi expressa em E. coli B121 (DE3) e purificada por sistema de resina Ni-NTA (protocolo Qiagen). Para
análise western, anticorpos anti-AgroAS de coelho, primários, foram usados a uma diluição de 1: 5.000. Os anticorpos conjugados a fosfatase alcalina anticoelho de cabra, secundários, foram usados a uma diluição de 1:5.000. Em linhagens transgênicas transportando os genes AgroAS 7Salfa', análise de western blot revelou consistentemente a presença de uma única banda que 15 especificamente reagiu cruzado com anticorpos anti-AgroAS. Esta banda não foi detectada na linhagem de controle não transgênica.
Análise de aminoácidos livre de semente de soja e Arabidopsis
Extração de aminoácidos: Cerca de 50 mg de material de semente de soja triturada (5 mg de Arabidopsis ) foram colocados em cada 020 frasco de centrífuga. Um mililitro de 5% de ácido tricloroacético foi adicionado a cada amostra (100 μΐ para Arabidopsis). As amostras foram submetidas a vórtice, e deixadas assentar, com agitação, em temperatura ambiente durante 15 min. Elas foram então microcentrifugadas durante 15 min a 14.000 rpm. Algum do sobrenadante foi então removido, colocado em um frasco de HPLC e selado. As amostras foram mantidas a 4°C na fila de análise.
Análise de aminoácidos: Os reagentes usados para análise de aminoácidos incluíram o reagente OPA (o-ftalaldeído e ácido 3mercaptopropiônico em tampão borato (Hewlett-Packard, PN 5061- 3335))
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onde o tampão borato (0,4 N em água, pH 10,2). A análise foi realizada usando o sistema HPLC série 1100 Agilent como descrito na publicação técnica Agilent Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC. 17 de março de 2000. Primeiro, 0,5 μΐ de amostra foi derivado com 2,5 pl de reagente OPA em 10 pl de tampão borato. Segundo, o derivado é injetado em uma coluna Eclipse XDB- cl8 5 pm, 4,6 x 150 mm, usando uma taxa de fluxo de 1,2 ml /min. As concentrações de aminoácidos foram medidas usando fluorescência : excitação a 340 nm, emissão 450 nm. A eluição foi com um gradiente de tampões A e B de HPLC de acordo com a tabela, onde o tampão HPLC A foi 40 mM Na2HPO4, pH = 7,8 e tampão B HPLC foi 9 : 9 : 2 :: metanol:: acetonitrila : água.
Tabela A: Eluição deaminoácidos
Tempo 0 20 21 26 27
% Tampão B 5 65 100 100 100
Os padrões de aminoácidos foram preparados de produtos químicos secos, usando todos os aminoácidos de interesse. A análise de prolina requereu uma etapa de derivação adicional com 9-fluorenilmetilcloroformato (FMOC). Os padrões de aminoácidos foram também às vezes adquiridos em concentrações na faixa de 0 a 100 pg /ml. As amostras foram registradas em pg/g de pó de semente. Os cálculos foram realizados usando um gabarito MS Excel encontrado em Mynabird TMBROW > Public > Calculators > Externai Standard.xls.
Expressão de antranilato sintase de Agrobacterium tipo selvagem em Arabidopsis
O vetor pMON58120 foi transformado em plantas de Arabidopsis por infiltração a vácuo das inflorescências secundárias e as plantas foram deixadas dar semente transgênica. A semente foi coletada e tríada pela presença de um marcador selecionável (resistência a glifosato). As plantas resistentes a glifosato foram cultivadas em maturidade e a semente de cada planta, que foi designado um evento de transformação, e analisada para teor em triptofano (Tabela B). Os • « ·
•·· »·«
eventos de transformação selecionados foram também analisados pela presença de proteína de antranilato sintase de Agrobacterium expressa na semente madura por análise Western blot, como mostrado na Tabela B.
Tabela B: Análise de transformantes
Evento de transformação Trp (ppm) Proteína presente
7317 2547 4~
7315 2960 +
7319 3628 +
7313 3979 +
Expressão de antranilato sintase de Agrobacterium tipo selvagem em soja (Glycine Max) dentre 35 eventos de transformação de soja analisados tinham um aumento nos níveis de trp na semente, por exemplo de acima de 500 ppm e até 12. 000 ppm. Em sementes de soja não transgênicas, o nível trp 10 é menor que 200 ppm. Todas as sementes que continham elevadas quantidades de trp demonstraram expressão de proteína de antranilato sintase por análise Western blot. A tabela C apresenta dados para dezenove eventos de soja que contém níveis de trp elevados e também são positivos para proteína de antranilato sintase por análise Western blot.
Tabela C - Correlação entre a presença de proteína Agro AS e
Níveis de triptofano em 19 eventos transgênicos de soja contendo pMON5812Q
Estirpe Trp máx. (PPm) Trp médio (ppm) Proteína presente?
A3244 (ctr) 306 96 NAO
GM A2O38O:@. 6444 2246,4 SIM
GM A20532:@. 6055 2556,6 SIM
GM A22043:@. 10422 2557,2 SIM
GM A20598:®. 8861 2859,9 SIM
GM A20744:®. 7121 3373,3 SIM
GM A20381:®. 6391 3572,9 SIM
GM A20536:@. 9951 3581,5 SIM
GM A20510:®. 8916 3592,7 SIM
GM A2O459:(3J. 8043 3900,4 SIM
GM A20337:(aJ. 7674 4088,6 SIM
GM A20533:@. 9666 4183,2 SIM
GM A20577:®. 6276 4434,1 SIM
GM A20339:®. 9028 4687,8 SIM
GM A20386:®. 8487 5285,3 SIM
GM A20457:©y. 11007 5888,9 SIM
GM A20379:@. 7672 6416,1 SIM
« · ·
• · · ···
GM A20537:@. 9163 6695,8 SIM
GM A20534:@. 12676 7618,2 SIM
GM A20576:@. 10814 7870,1 SIM
O teste de enzima Agro AS
A atividade específica de antranilato sintase foi medida em onze eventos de transformação contendo a construção pMON58120. As sementes imaturas de feijão de soja individuais foram analisadas usando um teste de ponto final com base em HPLC com base no método descrito por C. Paulsen (J. Chromatogr. 547, 1991, 155-160). Brevemente, os extratos dessalinizados foram gerados de sementes individuais em tampão de trituração (100 mM, Tris pH 7,5, 10% glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) e incubados durante 30 min com tampão de reação (100 mM Tris pH 7,5, 1 mM corismato, 20 mM glutamina, e 10 mM MgCl2). A atividade Agro AS foi medida na presença ou ausência de 25 mM trp. A reação foi parada com ácido fosfórico e a quantidade de antranilato formada foi quantificada por HPLC usando um detector de fluorescência fixado a 340 nm/excitação e 410 nm/emissão.
A atividade específica de AS em sementes transgênicas segregando imaturas na faixa de 1,5 vezes até 70 vezes de aumento comparado com um controle não transgênico, alcançando um nível elevado como 6.000 pmoles/mg/min. Como mostrado na última tabela da Tabela D, a atividade de antranilato sintase em plantas transgênicas é resistente a inibição por triptofano (ver tabela D).
Tabela D: Atividade de enzima Agro AS em evento transgênico 20576
Evento Semente n~ Atividade específica (pmoles/mg/min) Atividade específica/mg/min) (+25 micromolar TRP)
Controle 3244-1 95,4 42,4
Controle 3244-3 85,5 40,6
20576 20576-1 6060,2 4407,1
20576 20576-2 3783,8 1709,4
20576 20576-3 2768,3 2431,7
20576 20576-4 4244,08 2125,2
EXEMPLO 3 - Transformação de soja com um vetor contendo um gene de α-subunidade de antranilato sintase de milho
A seqüência de codificação para uma α-subunidade de antranilato sintase de milho foi isolada de pMON52214 (figura 22) por
• · « · ♦ ··· ··· ········ φ• ·*···· φ φφ ·····♦ ···· φ .· · · · · · · ·
φ20 digestão com Xbal em combinação com um digerido de Ncol parcial (ver Anderson, et al, patente US 6 118 047). O fragmento de DNA de 1952 bp resultante representando a região de α-codifícação de antranilato sintase foi purificado com gel, e as extremidades tomadas obtusas. O plasmídeo pMON53901 (figura 23) foi digerido com BglII e EcoRI, para gerar um fragmento de 6,8 Kb. Após isolamento, as extremidades de fragmento de 6,8 Kb foram tomadas obtusas e desfosforiladas. O fragmento de 1952 Kb contendo o gene AS oc foi então ligado no fragmento de pMON53901 de 6,8 kb terminado de modo obtuso para gerar pMON39324, um vetor de expressão 7SP-ASoc -NOS de milho (figura 24).
Este pMON39324, um cassete 7SP- ASa-NOS de milho foi subseqüentemente digerido com BamHI resultando em um fragmento de DNA de 2,84 Kb, contendo o promotor 7S e seqüência de codificação de AS oc de milho. O plasmídeo pMON39322 (figura 25) foi digerido com BamHI resultando em um fragmento de DNA de 5,88 kb. Estes dois fragmentos foram então ligados juntos para criar pMON39325 (figura 26), um vetor de transformação contendo cassete de terminador AS α-NOS de milho- promotor 7S subclonado com pMON39322.
Usando procedimentos similares, a seqüência de codificação para uma α-subunidade de antranilato sintase de milho foi clonada a jusante do promotor USP para gerar um vetor de expressão pMON58130, a jusante do promotor Arc5 para gerar um vetor de expressão de pMON69651. Uma lista com estes vetores de expressão é apresentada na Tabela E.
Tabela E: Construções de antranilato sintase de milho C-28
Geração de Semente Cassete de expressão Nome do vetor
R4 7Sa’ -milho- Asa PMON39325
R2 Napin-milho-Asa PMON58023
RI USP-milho-Asa PMON58130
RI Arc5-milho-Asa PMON69662
RI Lea9-milho-Asa PMON69650
RI Perl-milho-Asa PMON69651
Estes vetores foram usados para experiências de transformação
« · ·♦·
e propagação de plantas. As plantas de soja foram transformadas com os vetores contendo AS de milho usando a tecnologia de bombardeio de microprojéteis como aqui descrito. Várias linhagens de soja transgênica foram estabelecidas para cada tipo de vetor e propagadas através de várias gerações indicadas na tabela E.
Por exemplo, três linhagens homozigóticas foram estabelecidas que transportam o transgente 7Salfa'-milho-AS de pMON39325. Estas três linhagens foram cultivadas em um projeto aleatório de bloco em dois locais diferentes. A semente madura foi produzida e analisada para teor de aminoácido livre. Os controles foram incluídos para estabelecer os níveis de trp de linha base, isto é, as três isolinas negativas correspondentes e os controles não transgênicos.
A tabela F provê triptofano na semente R4 em ppm para transformante pMON39325 e linhas de controle, mostrando que as sojas não transgênicas médias contém cerca de 100-200 pg triptofano /g pó de semente enquanto os transformantes pMON39325 contém substancialmente mais Trp. Ver também figura 27.
Tabela F: Níveis de Trp em sementes de plantas de soja transformadas com o mutante de Zea mays C28 (pMON39325)
Número de isolina positiva Trpm médio de isolina positiva (PPm) Desvio padrão Trp médio da isolina negativa correspondente (ppm) Desvio padrão
39325-1 3467 377 226 55
39325-2 2623 307 164 20
39325-3 3715 152 184 64
39325-4 2833 165 202 146
39325-5 3315 161 173 34
39325-6 2394 318 144 22
Controle não transgênico 7 191 24
Controle não transgênico 8 118 23
Cinco outras construções, expressando o antranilato sintase de milho C28 sob o controle de cinco diferentes promotores (Tabela E) foram transformados em soja e plantas transgênicas foram obtidas. Cada construção gerou níveis elevados em trp. Um exemplo ilustrando eventos gerados por • ·
• · · «· · antranilato sintase de milho Perl-C28 é mostrado nas tabelas G e H.
Tabela G: Expressão de proteína AS de milho C28 está correlacionada com níveis Trp aumentados em três eventos transgênicos contendo PerlC28 milho AS (pMON69651)
Estirpe Trp médio (ppm) Proteína presente?
Controle 96 Não
22689 2375 Sim
22787 1707 Sim
22631 1116 Sim
A tabela H ilustra a atividade enzimática de C28 milho AS em
sementes RI de plantas de soja transformadas com o vetor de expressão pMON69651.
Tabela H: Atividade específica de C28 milho AS em sementes RI de transformantes pMON69651
Evento Número da semente Atividade específica (pmoles/mg/min) Atividade específica (pmoles/mg/min) (+25 triptofano micromolar)
Controle 51,6 2,6
22689 22689-1 130,9 64,7
22689-2 115,3
22689-3 148,5 61,1
22689-4 149,5
22689-5 133,8 60,3
Estes resultados indicam que se tem um aumento substancial em triptofano quando os tecidos de plantas de soja são transformados com o gene C28 milho AS. Os níveis elevados de trp na Tabela G estão correlacionados com a presença de proteína AS e com aumentada atividade específica (2,5 vezes maior do que em controles não transgênicos) para a enzima transgênica (Tabela H). Como mostrado na tabela H, e como previsto pelas propriedades bioquímicas de enzima C28 milho AS - a atividade específica do eventos transgênicos é resistente a triptofano.
EXEMPLO 4 - Projeto racional de mutantes insensíveis a feedback de ♦ · · · · ·
triptofano em antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies
Este exemplo descreve vetores contendo enzimas antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies mutante que tem vários graus de sensibilidade ou insensibilidade para inibição de feedback por triptofano ou 5 análogos de triptofano.
Geração de genes de antranilato sintase mutante de Agrobacterium tumefacies
Usando informação estrutural de proteína de antranilato sintase de Solfulobus solfataricus como um guia (Knochel et al, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 96, 9479- 9484 (1999)) vários mutantes de antranilato sintase de • Agrobacterium tumefacies foram projetados de modo racional usando informática de proteína para designar com confiança vários resíduos envolvidos na ligação de triptofano. Isto foi obtido por alinhamento do gene de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies com a seqüência de .15 aminoácidos de antranilato sintase de Sulfolobus solfataricus (figura 6). As regiões de catálise e ligação de triptofano putativa de Agrobacterium tumefacies foram designadas por combinação do conhecimento da informação estrutural com a homologia de seqüência. Os resíduos na bolsa de ligação foram identificados como candidatos em potencial para alterar para prover φθ resistência à inibição de feedback por triptofano.
Com base em análise estrutural de enzima antranilato sintase de Sulfolobus solfataricus, foi sugerido que os aminoácidos E30, S31, 132, S42, V43, N204, P205, M209, F210, G221 e A373 estavam envolvidos em ligação de triptofano. Com base no alinhamento à feição de pares, N204,
P205, e F210 de Sulfolobus solfataricus também foram conservados na antranilato sintase monomérica de Agrobacterium tumefacies como resíduos N292, P293 e F298, respectivamente.
No entanto, devido às inserções e deleções múltiplas, as regiões N-terminais de enzimas Sulfolobus solfataricus e Agrobacterium t ·
91:
* ♦♦
tumefacies foram altamente divergentes. Por esta razão, foi necessário designar manualmente resíduos na região N-terminal de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies envolvido na regulagem de triptofano (figura 6). A análise estrutural indicou que o motivo LLES formou uma β folha na bolsa 5 de ligação de triptofano. Esta estrutura pareceu ser altamente conservada dentre as enzimas heterotetraméricas. As enzimas monoméricas conhecidas foram então manualmente alinhadas para a seqüência de Sulfolobus solfataricus usando o motivo LLES” como um marco (figura 21). Com base nesta análise informatizada de proteína, os resíduos de aminoácidos V48, S50,
S51 e N52 em AS de Agrobacterium tumefacies também estavam provavelmente envolvidos na ligação de triptofano.
Com os resíduos de ligação de triptofano putativos designados na enzima monomérica de Agrobacterium tumefacies, várias estratégias distintas foram elaboradas para reduzir a sensibilidade da enzima à inibição /15 de triptofano. Estas substituições incluíram, por exemplo, aumentar a bolsa de ligação de triptofano (F298A), estreitar a bolsa de ligação (V48F V48Y,
S51F, S51C, N52F, F298W), aumentar a polaridade da bolsa de ligação (S50K) ou distorcer a forma da bolsa de ligação por mudança da conformação da cadeia principal da proteína (P293A, P29G).
:0 Mutagênese dirigida ao sítio AS de A. tumefacies
A mutagênese dirigida ao sítio foi usada para gerar seis sítios de dez substituições de aminoácidos únicas. As mutações foram introduzidas em AS de Agrobacterium tumefacies em pMON34705 usando o kit de mutagênese dirigida ao sítio QuikChange® (Stratagene) Os iniciadores 25 usados para a mutagênese dirigida ao sítio foram SEQ ID NO: 9-42 (figura 7,
F = dianteiro, R = reverso). Cada seqüência de iniciador é específica para alteração do ácido nucleico em um local específico na seqüência e assim mudando o códon codificado para codificar para um novo aminoácido. Por exemplo, S51C designa uma mudança de serina para cisteína em posição de
• * « « • *······ • · ·*>·«· • * · · · ·· •, · · · · · -*·· · ·· •·· «·« ♦ · ···
aminoácido 51 na seqüência de peptídeo AS de Agrobacterium tumefacies.
Após mutagênese, a seqüência do gene completo foi reconfirmada e as variantes expressas e purificadas de E. coli como descrito abaixo para a enzima tipo selvagem. Os plasmídeos resultantes 5 compreendendo AS de Agrobacterium tumefacies mutante são clonados de modo apropriado em um plasmídeo para super-produção de proteína usando o sistema de expressão T7 como descrito no exemplo 1.
Expressão e purificação de proteína As de Agrobacterium tumefacies
As enzimas mutante e de tipo selvagem AS de Agrobacterium
tumefacies foram expressas em E. coli como descrito no exemplo 1. A purificação de todas as enzimas AS de Agrobacterium tumefacies, incluindo mutantes e tipo selvagem das mesmas, foi realizada a 4°C. As células (peso úmido aproximado de 1 g) foram colocadas em suspensão em tampão de purificação (50 mM fosfato de potássio, pH 7,3, 10 mM MgCh, 10 mM 215 mercaptoetanol, 10% glicerol) e lisadas por ultra-sonicação (disruptor de célula Branson W185). O sobrenadante foi coletado após centrifugação do homogenado a 20.000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi submetido a ffacionamento de sulfato de amônio (30 a 65% saturação). O precipitado foi coleado após centrifugação a 20.000 x g durante 15 min e dissolvido em 3 Ό ml de tampão de purificação e então carregado como um todo em uma coluna de dessalinificação 10DG Econo-Pac, pré-equilibrada com o mesmo tampão. As frações contendo a enzima foram detectadas pelo teste desenvolvido e reunidas. A enzima reunida (4,3 ml) foi carregada em uma coluna de 10 ml DEAE Sephacel (Pharmacia Biotech) (1,5 x 7,5 cm) equilibrada com o mesmo tampão. A coluna foi lavada com 30 ml de tampão de purificação e a enzima eluída com 30 ml de 50 mM NaCl no mesmo tampão. As frações contendo alta atividade AS foram reunidas e precipitadas por 65% saturação de sulfato de amônio e isoladas e dessalificadas como acima. As frações contendo a enzima foram reunidas e armazenadas a
··· ···
80°C.
Teste de enzima antranilato sintase e análise cinética
O teste padrão para AS de Agrobacterium tumefacies foi realizado a 25°C em um tampão de teste contendo 100 mM fosfato de 5 potássio, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 200 μΜ corismato e 10 mM L-glutamina. A reação foi parada por adição de 30 μΐ de enzima à mistura de reação e misturação. A formação de antranilato foi diretamente monitorada pelo aumento de absorbância a 320 m durante 3 min. A taxa inicial de reação foi calculada como aumento de absorbância unitária por
segundo com base na inclinação da mudança de absorbância sobre o tempo de reação. Á?mpara corismato (Km cho) foi determinado no volume total de 1 ml de tampão de teste contendo 100 mM fosfato de potássio, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, com 10 mM L-glutamina e variando a concentração de corismato entre 2,5 - 100 μΜ corismato. O Km para glutamina (Km Gln) foi / 15 determinado no volume total de tampão de teste 1 ml contendo 100 mM fosfato de potássio, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol com 200 μΜ corismato e variando a concentração de L-glutamina entre 0,1-2 mM Lglutamina. IC50 para triptofano (IC5oTrp ) foi determinado com o volume total de 1 ml de tampão de teste contendo 100 mM fosfato de potássio, pH 7,0, 10 φ>0 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 10 mM L-glutamina, 200 μΜ corismato e variando a concentração de L-triptofano entre 0,1 - 10 mM L-triptofano. Os parâmetros cinéticos e IC50 de AS foram calculados após fixar os dados em um programa de regressão não linear (GraFit).
Vários mutantes demonstraram reduzida sensibilidade a inibição de triptofano enquanto ainda mantendo uma atividade enzimática comparável à enzima de tipo selvagem (Tabela I). Estes resultados demonstram que a extensão de sensibilidade para inibição de triptofano pode ser diminuída, por exemplo, por mutação de aminoácidos na bolsa de ligação de triptofano de antranilato sintase e por otimização de mutações
demonstrando insensibilidade de feedback.
Tabela I: Atividade de antranilato sintase e efeito de triptofano em
Mutantes AS te Agrobacterium tumefacies
Mutação Códon «z Cbo (μΜ) (μΜ) (S-) k^/k^0 IC5oirp (μΜ)
WT 8,0 0,11 0,43 5,37x1o2 5
V48F TTT 4,5 0,08 0,24 5.33X10’2 150
V48Y TAT 4,2 0,10 0,18 4,28xl0’2 650
S50K AAG 13 0,01 0,13 Ι,ΟΟχΙΟ2 0,1
S51F TTC 10 0,06 0,08 0,80xl0’2 >32.000
S51C TGC 2,8 0,08 0,15 5,36xl0'2 1.500
N52F TTC 5,5 0,04 0,21 3,82xl0'2 41
P293A GCG 24 0,16 0,35 l,46xl0'2 14
P293G GGG 33 0,07 0,48 1,45x10’2 17
F298A GCC 9,2 0,10 0,46 5,00xl0'2 5,5
F298W TGG 18 0,14 0,44 2,44xl0'2 450
EXEMPLO 5 - Mutagênese aleatória de AS de Agrobacterium tumefacies para gerar mutantes insensíveis a feedback de triptofano
Além das abordagens de desenho racional descritas no exemplo 4, outras estratégias para gerar mutantes insensíveis a feedback de antranilato sintase incluem, mas não são limitados a mutagênese aleatória. A mutagênese aleatória de AS de Agrobacterium tumefacies pode ser obtida, por exemplo, por mutagênese química (DNA isolado ou organismo total), PCR passível de erro, e embaralhamento de DNA. Este exemplo descreve o uso de mutagênese química seguida por seleção genética. A abordagem de seleção genética é também utilizável para seleção de mutantes desejáveis derivados de outras técnicas de mutagênese.
Geração de plasmídeo de expressão de E. coli contendo AS de A. tumefacies
A matriz de leitura aberta de clone AS de Agrobacterium tumefacies pMONólóOO (SEQ ID NO: 1, descrito no exemplo 1) foi amplificada por PCR usando iniciadores que contém um sítio Nco 1 na extremidade 5' do iniciador dianteiro e um sítio Xbal na extremidade 3' do iniciador reverso.
5’-CATCCCATGGATGGTAACGATCATT CAGGAT-3’ (SEQ ID NO:55) e
5’-GATGTCTAGAGACAC TATAGAATACTCAAGC-3’ (SEQ ID NO: 56)
O produto PCR resultante foi ligado em pMON25997 (figura 28), que tinha a matriz de leitura aberta bktB (Slater et al, J. Bact. 180, p. 1979- 1987 pMON 62000 (figura 29). PMON62000 é o plasmídeo de base usado para mutagênese e complementação de auxotrofo de triptofano 5 (EMG2AtrpE).
Geração de um auxotrofo de triptofano de E. coli EMG2AtrpE
Cepa de E. coli Ec-8 (EMG2AtrpE) foi construída usando o vetor suicida pKO3 para deletar 1.383 pares de bases de gene trpE cromossômico de E. coli cepa EMG2 (K-12 wtF+) (E. coli Genetic Stock 10 Center). Dois amplicons de DNA genômico de E. coli foram amplificados por • PCR. O primeiro amplicon tinha aproximadamente 1,5 kb e continha os primeiros 30 bp de ORF de trpE na extremidade 3'. Este amplicon contém um sítio BamHI na extremidade 5' e um sítio EcoR’ na extremidade 3'. O segundo amplicon tinha aproximadamente 1 kb e continha o último 150 bp de ORF de /15 trpE na extremidade 5'. Este amplicon contém um sítio CeoR’ na extremidade 5' e um sítio Sall na extremidade 3'. Os dois amplicons foram digeridos com as enzimas apropriadas e ligados juntos no sítio EcoRl para criar uma deleção no quadro de trpE. A figura 30 mostra a seqüência resultante do gene truncado (SEQ ID NO: 46). O amplicon de deleção trpE foi ligado em pKO3 nos sítios BamHI e Sall. A ruptura de gene foi realizada como descrito em A.J. Link et al, J. Bacteriol. 179, 6228 (1997).
Complementação de auxotrofo de triptofano de E. coli EMG2AtrpE com pMON62000
Cepa de E. coli Ec-8 (EMG2AtrpE) foi transformada com 25 pMON62000 e colocada em meio mínimo M9 para determinar se a deleção foi complementada pela adição de ρΜΘΝ62000. Um controle de plasmídeo (menos o inserto AS de Agrobacterium tumefacies ) e um controle de cepa Ec-8 foram também colocados sobre meio mínimo M9 e sobre meio mínimo M9 com 40 pg /ml triptofano. O crescimento de cepa Ec-8 transformada com
ρΜΘΝ62000 foi observado em M9 sem triptofano, não foi observado crescimento de ambos os controles, indicando complementação de deleção de trpE na cepa Ec-8 por ρΜΘΝ62000.
Mutagênese de hidroxilamina de pMON62000 e seleção genética de mutantes
Para gerar mutantes de antranilato sintase, pMON62000 foi mudado com o mutagene químico hidroxilamina. Os seguintes ingredientes foram combinados em um tubo eppendorf: 20 pg de DNA plasmídeo pMON62000 e 40 μΐ de 2,5 M hidroxilamina, pH 6,0. O volume foi levado a
200 μΐ com 0,lM NaH2PO4, pH 6,0 + 5 mL EDTA, pH 6,0. O tubo foi incubado a 70°C. Após 1,5 h, 100 μΐ de mistura de reação foram dialisados em um filtro de nitrocelulose que estava flutuando em aproximadamente 500 ml H2O. Após 15 min, o DNA foi concentrado usando kit de purificação Qiagen PCR. Após 3 h, os restantes 100 μΐ da mistura de reação foram / 15 removidos e purificados do mesmo modo.
Cepa Ec-8 de E. coli foi então transformada por eletroporação com 100 ng de pMON62000 que tinham sido mutageneizados durante ou 1,5 ou 3 horas com hidroxilamina. Dois procedimentos de transformação foram realizados para cada ponto de tempo. As células transformadas foram
Ό deixadas recuperar durante 4 ou 6 h em meio SOC, (20 g /L Bacto-Tryptone, g /L extrato de levedura Bacto, 10 ml /L 1M NaCl, 2,5 ml /L 1M KC1, 18 g glucose).
Duas placas de bio ensaio quadradas de 245 mm foram preparadas contendo meio mínimo M9, mais 2% agar, e 50 pg /ml 5-metil-Dl25 triptofano (5-MT). Uma alíquota de 900 μΐ de mistura de transformação mutageneizada de 1,5 h foi colocada sobre uma placa 5-MT de 50 pg /ml. Os restantes 100 μΐ foram colocados sobre a placa de controle M9. O mesmo procedimento foi realizado para a mistura de transformação contendo o plasmídeo mutageneizado 3,0 horas.
As placas foram então incubadas a 37°C durante
aproximadamente 2,5 dias. As colônias resistentes foram isoladas das placas 5-MT e foram riscadas sobre placas de LB- canamicina (50 pg /ml) para confirmar a presença do plasmídeo. Todas as colônias selecionadas cresceram nestas placas. As colônias individuais de cada um dos clones resistentes foram preparadas em duplicata para isolar o plasmídeo. Os digeridos de restrição e PCR foram realizados e confirmaram que todos os clones continham o desejado inserto de AS de Agrobacterium tumefacies.
Os plasmídeos recuperados foram então transformados de volta na cepa Ec-8. Uma colônia de cada transformação foi purificada por riscamento sobre novas placas de LB-canamicina. Para confirmar resistência a 5-MT, as colônias purificadas individuais foram riscadas sobre placas contendo M9 mais 50 pg/ml 5-MT e 2% agar, e então cultivadas a 37°C durante 3 dias. A resistência foi confirmada para a maior parte dos clones. Para determinar se os mutantes resistentes iriam permanecer resistentes em uma concentração ainda maior de 5-MT, eles foram colocados sobre M9 mais 300 pg /m 1 5-MT e 2% Agar. A maior parte dos clones demonstrou resistência nesta concentração elevada também.
Os plasmídeos de todos os clones resistentes foram isolados e seqüenciados em ambos os filamentos. Algumas das mutações desta experiência foram diagramadas na tabela J.
Tabela J: Variações de seqüência trpEG de A. tumefaciens em clones resistentes a 5-MT
Base de dados do clone # Clone original # Variação da seqüência determinada T/· Cho (μΜ) ICs.,r|> (μΜ)
Wt 8,0 5,0
Ec-12 1 G4 Val2Ile
Ec-18 8 C35T Thr2Ill 15 2,5
Ec-19 9 C2068T Pro690Ser 5,0 3,4
Ec-20 11 G1066A Glu356Lys & C1779T Ile593Ile
Como indicado pelos dados na tabela J, vários mutantes • ♦· ·· ♦ tinham pouco efeito sobre Km e IC50 de enzima mutante, indicando que estas mutações não são provavelmente a fonte de resistência à inibição de feedback de triptofano. Por exemplo, a mutação de C em T em nucleotídeo 35, que muda um resíduo treonina para isoleucina em posição de aminoácido 12 5 (Thrl2Ile) dá lugar a uma mudança menor em valores de ÃTm cho e IC50 trp.
Similarmente, uma mudança de C em T em posição de nucleotídeo 2068, que w muda uma prolina para uma serina também dá lugar a uma mudança menor em valores de Xm cho e IC5Qtrp. Estas mutações podem assim ser mutações silentes que dão lugar a produtos de gene variantes tendo propriedades
enzimáticas como as de tipo selvagem.
EXEMPLO 6 - Plantas de soja transgênica com elevado teor de triptofano
Este exemplo especifica a preparação de plantas de soja transgênica tendo elevados níveis de triptofano resultante da transformação J 15 com mutantes insensíveis a feedback de triptofano de antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies.
Construção do vetor
O plasmídeo pMON34711, que abriga o clone antranilato sintase de Agrobacterium tumefacies contendo a mutação F298W descrita no ^0 exemplo 4, foi digerido com enzima de restrição Notl. As extremidades do fragmento resultante foram terminadas de modo obtuso e então digeridas com Ncol. O plasmídeo pMON13773 (figura 8) foi então digerido com enzima de restrição EcoRI, as extremidades tomadas obtusas e então digeridas com Ncol. Os fragmentos resultantes foram ligados resultando em plasmídeo 25 pMON58044, que continha 0 gene AS sob o controle de promotor 7S e 0 terminador NOS3' (figura 9).
O plasmídeo pMON58044 foi então cortado com enzima de restrição BglII e Ncol e ligado com um fragmento que foi gerado por digestão de pMON53084 (figura 10) com BglII e Ncol. O fragmento «·· **· resultante foi chamado pMON58045 (figura 11) e continha a seqüência para o peptídeo de trânsito SSU1A de Arabidopsis.
Finalmente, o plasmídeo pMON58046 (figura 12) foi construído por ligação de fragmentos gerados por digestão de pMON58045 5 (figura 11) e pMON38207 (figura 13) com enzima de restrição NotL Isto resultou no vetor pMON58046 (figura 12) que foi usado para transformação de soja.
Transformação de soja por bombardeio de microprojéteis
Para o método de transformação por bombardeio de microprojéteis, sementes de soja comercialmente disponíveis (isto é Asgrow A3244, A4922) foram germinadas durante a noite durante aproximadamente
18-24 horas e os explantes de meristema foram excisados. As folhas primárias foram removidas para expor os meristemas e os explantes foram colocados em meio de marcação com os meristemas posicionados perpendiculares à direção da liberação da partícula.
O vetor de transformação pMON58046 acima descrito foi precipitado sobre partículas de ouro microscópicas com CaCl2 e espermidina e subseqüentemente recolocadas em suspensão em etanol. A suspensão foi revestida sobre uma folha Mylar que foi então colocada sobre o dispositivo de descarga elétrica. As partículas foram aceleradas no tecido da planta por descarga elétrica em aproximadamente 60% de capacitância.
Após bombardeio, os explantes foram colocados em meio de seleção (VPM + 0,075 mM glifosato) (WPM = Woody Plant Médium (Mc Cown & Lloyd, Proc. Intemational Plant Propagation, Soc. 30: 421, 1981) 25 menos BAP)) durante 5-7 semanas para permitir seleção e crescimento de brotos transgênicos. Os brotos positivos para fenótipo foram coletados aproximadamente 5-7 semanas após bombardeio e colocados em meio de formação de raiz seletivo (BRM + 0,025 mM glifosato) (ver abaixo para
BRM) durante 2-3 semanas. Os brotos produzindo raízes foram transferidos ··· ···
para a estufa e colocados em vasos. Os brotos que permaneceram saudáveis em seleção, mas não produziram raízes, foram transferidos para um meio de formação de raiz não seletivo (BRM sem glifosato) durante mais duas semanas. As raízes de quaisquer brotos que produziram raízes fora da seleção 5 foram testadas para expressão do marcador selecionável de planta antes de transferir para a estufa e colocar em vasos em solo. As plantas foram mantidas sob condições de estufa padrões até a colheita da semente Rl.
A receita usada para meio de formação de raiz de feijão (BRM) é provida abaixo.
Composto
Sais MS ***
Myo-inositol (tipo cultura de célula) Carga vitamina SBRM * ** L-cisteína (10 mg /ml)
Sacarose (ultra pura)
Ajustar a pH a 5,8
Agar lavado
Adições após autoclave:
SBRM /TSG carga hormônio*
Quantidade para 4L
8,6 g
0,40 g
8,0 ml
40,0 ml
120 g g
20,0 ml
020 * SBRM/TSG carga hormônio (por iL de BRM), 3,0 ml IAA (0,033 mg /ml),
2,0 ml de água destilada estéril. Armazenar a carga no escuro a 4°C.
** SBRM carga vitamina (por 1L de carga), glicina (1,0 g), ácido nicotínico (0,25 g), piridoxina HCI (0,25 g), tiamina HCI (0,25 g) *** 3X sais MS menores (por 1L carga), H2BO3 (1,86 g), MnSO4 (5,07 g),
ZnSO4-H2O (2,58 g), Kl (0,249 g), 7,5 ul NaMoO-2H2O (1,0 mg /ml), 7,5 μΐ
CoSO4-5H2O (1,0 mg /ml), 7,5 μΐ CoCl2 -6 H2O (1,0 mg /ml).
Um ingrediente de cada vez foi adicionado e dissolvido, o volume foi levado a um litro com água destilada estéril, e a solução foi armazenada em uma garrafa coberta com folha no refrigerador durante mais • ·· · ·
de um mês.
Transformação de soja usando Agrobacterium tumefacies
Para o método de transformação de Agrobacterium, sementes de soja comercialmente disponíveis (Asgrow A3244, A4922) foram 5 germinadas durante a noite durante aproximadamente 10-12 horas) e os explantes de meristema foram excisados. As folhas primárias podem ou não ter sido removidas para expor os meristemas e os explantes foram colocados em um vaso para formar lesões.
A cepa ABI de Agrobacterium contendo o plasmídeo de
interesse foi cultivada na fase log. As células foram coletadas por centrifugação e recolocadas em suspensão em meio de inoculação contendo indutores. Os explantes de soja e a cultura de Agrobacterium induzida foram misturados por não mais que 14 horas deste a iniciação da germinação da semente e formadas as lesões usando sonicação.
Após a lesão, os explantes foram incubados em Agrobacterium durante um período de aproximadamente uma hora. Após esta etapa de inoculação, o Agrobacterium foi removido por pipeta e os explantes colocados em co-cultura durante 2-4 dias. Neste ponto, eles foram transferidos para um meio de seleção (WPM + 0,075 mM glifosato + 20 antibióticos para controlar o super-crescimento de Agrobacterium ) durante 57 semanas para permitir a seleção e crescimento de brotos transgênicos.
Os brotos positivos para fenótipos foram coletados aproximadamente 5-7 semanas após o bombardeio e colocados em meio de formação de raiz seletivo (BRM + 0,025 mM glifosato) durante 2-3 semanas. 25 Os brotos produzindo raízes foram transferidos para a estufa e colocados no solo. Os brotos que permaneceram saudáveis em seleção, mas não produziram raízes, foram transferidos para um meio de formação de raiz não seletivo (BRM sem glifosato) durante mais duas semanas. As raízes de quaisquer brotos que produziram raízes fora da seleção foram testadas para expressão do
marcador selecionável de planta de resistência a glifosato antes de transferir para a estufa e colocar em vasos em solo. As plantas foram mantidas sob condições de estufa padrões até a colheita da semente RI.
Análise de teor de aminoácido de semente RI
Semente RI madura é produzida e analisada para teor de aminoácidos livre usando detecção de fluorescência como descrito em Agilent Technologies Technical Bulletin REVI4. Cinco sementes são escolhidas para análise de semente única de cada evento. As sementes de soja expressando as proteínas mutantes AgroAS F298W ou AgroAS S51F geraram quantidades muito elevadas de triptofano. Os resultados são mostrados nas tabelas K e L.
Tabela K: Expressão de proteína em sementes transformadas com pMON58Q46
Estirpe Trp médio (ppm) Proteína presente?
Controle 96 Não
22S17 9922 Sim
22891 12955 Sim
23026’ 7968 Sim
Tabela L: Expressão de proteína AS correlacionada com transformação de pMON58123
Estirpe Trp médio (PPm) Proteína presente?
Controle 96 Não
23562 88 Não
23590 8795 Sim
23911 388 Não
Atividade de enzima AS em semente RI transformada com Agro AS
Semente RI madura é produzida e analisada para atividade de antranilato sintase. A atividade enzimática de antranilato sintase foi determinada em sementes de soja RI contendo alelos mutantes AgroAS F298W (SEQ ID NO: 65 ou 91) ou Agro AS S51F (SEQ ID NO: 60 ou 86). Níveis muito elevados de atividade antranilato sintase resistente a triptofano foram observados, consistentes com as altas quantidades de triptofano gerado
por estas sementes. Os resultados são mostrados nas tabelas M e N.
Tabela M: Atividade específica de AS em sementes RI transformadas com pMON58Q46
Evento Número da Semente Atividade específica (pmoles/mg/min) Atividade específica (pmoles/mg/min) (+ 25 Trp micromolar)
Controle 77,6
23076 23076-1 100,5 1,04
23076-2 4512,8
23076-3 9737,4 9290,4
23076-4 136,12
23076-5 8992,5 9749,9
Tabela N: Atividade específica de AS em sementes RI transformadas com pMON58123
Evento Número da Semente Atividade específica (pmoles/mg/min) Atividade específica (pmoles/mg/min) (+ 25 Trp micromolar)
Controle 83,7 32,7
23590 23590-1 891 692,3
23590-2 466,2 186,5
23590-3 71,7 38,3
23590-4 320,5 316,2
EXEMPLO 7 - Preparação de vetor de transformação contendo asubunidade de antranilato sintase de Ruta graveolens
O gene cc de antranilato sintase de Ruta graveolens (número de acesso do Genbank GI 960291) provê outro domínio de antranilato sintase utilizável na presente invenção (Bohlmann J. et al, Plant Phys 111 507-514 (1996)). Uma isoenzima de antranilato sintase presente no genoma de Ruta graveolens demonstra menor susceptibilidade à inibição de feedback por Ltriptofano. Este alelo também pode ser utilizável na presente invenção para elevar os níveis de L-triptofano livres em plantas transgênicas. O vetor pMON58030 (figura 14) contém a α-subunidade de antranilato sintase de Ruta graveolens que é menos sensível a inibição de triptofano. Ο α gene de antranilato sintase de Ruta graveolens foi amplificado por PCr de pMON58030 para prover um sítio BamHI na extremidade 5' e um sítio BglII na extremidade 3' de fragmento de cc gene de antranilato sintase de Ruta
graveolens por utilização de iniciadores PCR que continham estes dois sítios de enzima de restrição Ç
5’-CAAAAGCTGGATCCCCACC-3’ (SEQ ID NO: 53) e 5’-CCTATCCGAGATCTCTCAACTCC-3’ (SEQ ID NO: 54).
O fragmento de PCR foi purificado, digerido com enzima de restrição respectiva, para formar pMON58041, que contém a fusão transcripcional de ASa de Ruta graveolens para o promotor napin. O plasmídeo de transformação de planta mediado por Agrobacterium, pMON58043, foi criado compreendendo o promotor napin, AS de Ruta
graveolens, terminador NOS, marcador selecionável de resistência a glifosato (CP4) e bordas apropriadas para integração cromossômica apropriada do cassete como descrito. O vetor de transformação de planta resultante foi usado para transformar plantas usando técnicas de transformação de planta padrões como descrito nos exemplos 2, 3 e 6.
Exemplo 8 - Transformação de antranilato sintases de multipolipeptídeos em antranilato sintase monomérica de polipeptídeo único
A geração de uma antranilato sintase monomérica por fusão de enzimas de múltiplas subunidades selecionadas é desejável, por exemplo, para minimizar a eficiência catalítica, para estabilizar a enzima, para obter 20 expressão coordenada, por exemplo de subunidades compreendendo atividades de TrpE e TrpG e para comunicação efetiva entre as duas subunidades. Em alguns casos, pode ser utilizável para empregar TrpE ou asubunidades de fonte de planta ou microbiana que são desreguladas com relação a inibição de feedback por técnicas de mutagênese padrões ou por 25 projeto racional como descrito acima nos exemplos, por exemplo no exemplo 4. Em outros casos, TrpE de tipo selvagem ou α-subunidades de planta ou fonte microbiana são empregados.
O C-término de TrpE selecionado ou cc-subunidade é ligado ao N-término de subunidade TrpG ou β-subunidade, preferivelmente com um
··> ··♦
ligador de peptídeo. Um ligador pode se projetado de modo racional para prover espaçamento e flexibilidade apropriados para ambas as subunidades alinharem de modo apropriado. Altemativamente, um ligador pode ser identificado por alinhamento de seqüência de antranilato sintases 5 monoméricas e heterotetraméricas. Os exemplos de alinhamentos de seqüência de formas de antranilato sintases monoméricas e heterotetraméricas são mostrados nas figuras 21 e 35. Também é visado que pode ser necessário gerar antranilato sintases monoméricas compreendendo subunidade heteróloga a fim de maximizar os benefícios. Por exemplo, uma α -
subunidade pode ser obtida de uma fonte bacteriana, por exemplo E. coli e fundida em uma β-subunidade de uma fonte de planta, por exemplo,
Arabidopsis.
A nova proteína produzida pode ser introduzida em plantas, por exemplo, como nos exemplos 2, 3 ou 6. A invenção não é limitada aos 15 detalhes exatos mostrados e descritos, mas deve-se entender que muitas variações e modificações podem ser feitas enquanto ainda permanecendo no espírito e escopo da invenção definida pelas reivindicações.
Exemplo 9- Identificação de antranilato sintases a partir de bases de dados de seqüência genômica ^^20 As antranilato sintases monoméricas assim como α e βdomínios utilizáveis na invenção podem ser identificados por análise de bioinformática por pesquisa por exemplo, nas bases de dados genbank e/ou swissprot usando BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov /blast /). As seqüências de busca utilizáveis para a identificação de antranilato sintase monomérica 25 incluem, por exemplo, domínios de antranilato sintase como o α-domínio (GI
1004323) ou β-domínio (GI 1004324) de Sulfolobus solfataricus, ou antranilato sintase monomérica como AS de Agrobacterium tumefacies (GI 15889565). A antranilato sintase monomérica putativa estará entre 50% e
100% de homologia com a seqüência de busca e deve minimamente conter • · ***
Φ6 • · ···
700 aminoácidos. Se ο AS-α domínio for usado para pesquisar a base de dados genômica, além de identificar os genes de antranilato sintase putativa também é provável identificar genes envolvidos em síntese de PABA, por exemplo 4-amino-4-deoxicorismato (ADC) sintase. Os genes ADC sintase 5 monoméricos podem ser facilmente identificados foram de genes AS monoméricos putativos com base na observação de que o domínio amidotransferase (β-domínio) de ADC sintase reside no N-término de proteína enquanto o domínio amidotransferase (β-domínio ) de AS reside no C-término. As antranilato sintases monoméricas utilizáveis na presente
invenção identificadas por análise de bio-informática incluem, mas não são limitadas a por exemplo, Rhizobium meliloti (GI 95177), Mesorhizobium loti (GI 13472468), Brucella melitensis (GI 17982357), Nostoc sp. PCC7120 (GI
17227910, GI 17230725), Azospirillum brasilense (GI Ü74156), Rhodopseudomonas palustris, Anabaena M22983 (GI 152445). A figura 21 é um exemplo de alinhamento de seqüência de duas antranilato sintases monoméricas {Agrobacterium tumefacies e Rhizobium meliloti) com duas antranilato sintases heterotetraméricas (Sulfolobus solfataricus e Arabidopsis thaliana) utilizáveis na presente invenção. A figura 35 é um exemplo de φ20 alinhamento de seqüência de várias antranilato sintases monoméricas com a antranilato sintase heterotetramérica de Rhodopseudomonas palustris.
EXEMPLO 10 - USO DE CÓDON OTIMIZADO
Este exemplo especifica um método para melhorar a expressão de um gene de antranilato sintase na semente de uma planta por otimização do uso de códon.
A seqüência de nucleotídeos de gene antranilato sintase (AS) de
Agrobacterium tumefacies de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) foi inspeccionado pela presença de códons sub-expressados. Para identificar os códons subexpressados, seqüências de proteínas de semente altamente expressas de milho e soja foram examinadas para freqüência de códon relativa. As freqüências de uso
< · ·
de códon relativas são mostradas na tabela O representada em um formato de valor esperado. O formato de valor esperado pode ser exemplificado como a seguir. Considerar que se tem quatro códons que codificam um dado aminoácido, e considerado que eles são usados igualmente bem, então cada códon deve ser 5 esperado como chegando a 25% (0,25) da freqüência para este aminoácido. No entanto, devido a redundância, 0,25 foi normalizado a 1,0 para dar um escore relativo para cada códon como comparado com outros códons que codificam este aminoácido. Para esta análise, se um códon foi mais prevalecente do que outras escolhas para um dado aminoácido, ele recebeu um número que foi maior que 1,0.
Correspondentemente, se um códon foi menos prevalecente, ele recebeu um número menor que 1,0. Para este estudo, um códon particular foi considerado subrepresentado se sua freqüência de uso de códon relativa for menor que 0,5.
Usando os resultados da tabela O, um exame próximo da seqüência AS de Agrobacterium tipo selvagem revelou que 125 códons foram / 15 considerados sub-representados (abaixo do limiar de 0,5) em milho e soja (Tabela P). Estes códons sub-representados foram substituídos por códons mais prevalecentes como definido acima. A seqüência de nucleotídeos modificada é mostrada na figura 36. Usando ferramentas de bio-informática, a seqüência resultante foi montada e analisada para integridade por tradução e alinhamento 020 das seqüências de nucleotídeo e proteína com as seqüências de AS tipo selvagem correspondentes. Apesar da seqüência de proteína ficar inalterada, a seqüência de nucleotídeo da seqüência otimizada tinha 94% de identidade com a seqüência AS de Agrobacterium tipo selvagem (figura 37). A seqüência de nucleotídeo otimizada foi analisada para a ausência de sinais de poliadenilação crípticos (AATAAA, AATAAT) e íntrons crípticos usando Lasergene EditSeq (DNASTAR, Inc. Madison, WI) e Grail2 (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN), respectivamente. Não foram encontrados sinais crípticos.
A seqüência de nucleotídeo modificada é sintetizada usando técnicas bem conhecidas na arte ou por fornecedores comerciais como Egea
Biosciencesces, Inc. (San Diego, CA). O nucleotídeo resultante é clonado em um vetor de expressão apropriado e testado para eficácia em milho, soja e Agrobacterium usando procedimentos detalhados em exemplos anteriores deste relatório.
TABELA O: Frequências de uso de códon relativas em genes expressados
em semente de milho e soja 1
Códon AA Semente de milho Semente de soja Códon AA Semente de milho
TTT F 0.4211 0.7348 ATC I 1.7143
TTC F 1.5769 1.2652 ATA i 0.3673
TTA L 0.4557 0.3875 ATC M 1.0000
TTG L 0.9494 1.2060 ACT T 0.6153
TCT S 0.9624 1.4851 ACC T 1.2213
TCC s 1.3707 1.1249 ACA T 0.8372
TCA s 0.9107 1.0044 ACG T 1.3262
TCG s 0.7851 0.3266 AAT N 042885
TAT ,Y 0.2455 0.6861 AAC N 1.7115
TAC Y 1,7545 1.3139 AAA K 0.5333
TGT c 0.2778 0.7572 AAG K 1.4667
TCC c 1.7222 1.2428 AGT s 0.2679
TGG w 1.0000 1.0000 AGC s 1.7032
CTT L 0.7975 1.6298 AGA R 0.3913
CTC L 1.0610 1.6301 AGG R 2.9185
CTA L 0.8544 0.5905 ÔTT V 0.5714
CTG L 1.8820 0,5562 GTC V 1.0119
CCT P 0.6500 1.5622 GTA V 0.3810
ccc P 0.8520 0.7694 GTG V 2.0357
CCA P 1.2240 1,5838 GCT A 0.9876
CCG P 11740 0.0645 GCC A 1.1618
CAT H 0.8438 0.8068 CCA A 0-8011
CAC H 1.1563 1.3934 GCG A 1.0495
CAA Cl 0.8639 1.2162 GAT D 0.8500
GAG Q 1.1361 0.7838 CAC D 1.1500
CGT R 0.2582 0.5903 GAA E 0-6018
CGG R 1.0082 1.1159 GAG E 1.3182
CGA R 0.195? 0.6700 GGT G 1.1268
CGG R 1.2283 0.3692 GGC G 1.8758
ATT 1 0.9184 1.2783 GGA G 0.3085
ATC 1 1.7143 1.0563 GGG G 0.6ΒΘ9
Semente de soja
1.0563 0.6054 1.0000 1.MM 2.1020 0.7140 0.1826 0.5409 1.4591 0.9030 1.0970 0.9714 1.0876 1.9459 1.3087 1.2381 0.6864 0.3472 1.7284 1.3583 1.1283 12598 0-2235 0.9523 1.0477 1.0463 0.9537 1.1431 0.6577 1.2759 0.9233 1 As freqüências de códon relativas são representadas no formato de vapor esperado. Isto significa que se tem quatro códon que codificam um dado aminoácido, e que eles são usados igualmente bem, cada códon é esperado 10 como chegando a 25% (0,25). Devido a redundância, 0,25 foi normalizado a
1,0 para dar um escore relativo para cada códon como comparado com outros códons que codificam este aminoácido. Na vida real, se um códon for mais prevalecente do que outras escolhas para um dado aminoácido, ele deve ter um número > 1. E se for menos preferido do que outros códons para o 15 aminoácido, deve ter um número < 1.
Tabela P - Códons Agro AS sub-representados e modificações para melhorada expressão na semente
Subrep. na cult.2 rt σι O O ΙΛ « θ' Ο Ο Ο θ' O O O rt »P rt £ -P G rt ce ·Ρ »P cd rt cü jP cú rt rt G rt ’ο’Β ’ο’Β B G 'õ1 'õ1 'Õ1 ’6* G 'õ’*õ1‘õ1G ‘õ1 w z 2 2 z w z· 2 2 w z w w 2 w k w 2; w
Códon Modif. Ü<U HC OUÜ < < UUUUÜ ÜÜUOU 0<O<CO<Ü<H<0<H<UOHOU
Amino- Ácidos
Códon (P) O<ÍOH0ÜCO<<OOOuOUOUOu Ü<tJ<UUCC<H<Ü<H<CUhOU
Códon r ΙΓ) o> Tf X C r<G IT| Ό > T-ι Tf 'sO M OO c -^r oooooooooSTT^Tj-iomir) tf, ir, \o f' > co co Tf Tf Tf ir; ir, m Yi toi ir, υη Y) ir< ir, 7Ί γ·ι ιτι ιλ ir, ir,
Subrep. na , cult? rt 'θ’ UC O 00.0 0 o o o o rt «i ca «j yp .P --P <P cs «frt rtrt 'θ’ θ’G 'õ1 G G B G 'Õ1'θ’’ο’Β B B B ‘θ’'θ’'θ’'θ’'θ’ wz2z2222zzz2222zzzzz
Códon Modif. hoooohhoc<uoho<uhüoo
! Amino- 1 Ácidos M<tóp^p4lx,><p';hHHo-iQí;>lf*í£p-iCZ]<<!íXi
Códon (P)_______ OÜHOHhHHOÜÜHHHHÜCCQC o<jouüP<üuuoo<ü<uooou hocuchhd<<ouhc<chcjoo
o o ‘O O Γ^ο\©^ΐΛθ^θ\οοσ\οοττοοΌθ^(ΝΓοαοπ r-.r^ooooQooiOO—i^-m-çr^rr^oooooooocAOL
Subrep. na cult.2 03 03 O O W3 w> θ' O O O O <D Φ O O © O ;5 03 £ rt aí ctf « C3 43 *5 ^3 £ 4^ B ’ο’Β '©''o^B ’ο’Β ’ο’Β B ‘θ’‘θ’B B ’ο1 B B 'õ1 B 2 z 2 z z 2 z 2 z 2 2 z w 2 2 z 2 2 z 2
Códon Modif. CDHOOOÜCOUO^OÜUOOUCO hOOUU<hÜO<<0UhhU<<UÜ O<OO<<ÜOUH<OÜ0Phh^UO
Amino- Ácidos
p •s s§ <Ü<C>C<0<ÜHHOOHhOHHCJH ΗωθΟΟ<Ηϋϋ<<ΟΟΗΡθ<<Οϋ o<!Oü<<ouüH<ooohhhHcu
Códon omO^m^OO^ovor-oooLOmiA^ooo rm C\ ~ rw ro ro Tf Tf tí Tf τ, τ, in
··· ·*· !\2\
Subrep. na cult? rt T Ο Ο Ο Ο θ' rt rt « B rt rt rS « rt Λ rt rt rt rt rt Λ rt rt -S rt rt φ’·©1^ 'δ*'δ’Β ‘δ1 ‘θ’‘δ’ 'δ1 'δ*Β *<F'c?S 'δ1'©1 « ω ω 2 w w á ·κ ζ ζ ω w ω κ w ω ω 2: w ω
Códon Modif 0O<OO0OU<0O<<OOH0OOOO οοο<οοοοοοοοοοοοοο<οο <<OHH<OHOO<OOH<OOO<OO
Amino- Acidos HH|cu>4iziHPí!iziCLif«;HPL<P-itZ}HO<faííZ’<’<
Códon (P) ΟΟΟΗΟΟΗΟΟΗΟΟΟΟΟ<ΟΟΗΟΟ οοο<οοοοοοοοοοοοοο<οο <<OHH<OHOO<OOH<OOO<OO
Códon i/irsitMr-c^c^Lnoor-ooajOooomLnoo^m^ras ω σ> ο γ<, ιλ( ό ο ω φ ο ο ο ο ο - ri ν
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Todas as publicações e patentes são aqui incorporadas por referência, como se fosse incorporadas individualmente por referência. A invenção não é limitada aos detalhes exatos mostrados e descritos, mas devese entender que muitas variações e modificações podem ser feitas enquanto 5 permanecendo dentro do espírito e escopo da invenção definida pelas reivindicações.

Claims (6)

1. DNA recombinante codificando uma antranilato sintase monomérica operacionalmente ligada a um promotor heterólogo, caracterizado pelo fato de que o DNA recombinante compreende SEQ ID NO: 1, e em que a antranilato sintase monomérica é expressa em uma célula de planta.
2. DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão de antranilato sintase monomérica eleva o nível de L-triptofano na célula de planta em relação a uma segunda célula de planta de antecedente genético igual ou similar que não inclui o transgene.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o DNA recombinante como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Método para alterar o teor de triptofano em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender:
(a) introduzir, em células regeneráveis de uma planta, um transgene compreendendo o DNA recombinante como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o DNA recombinante é operavelmente ligado a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, para dar células de plantas transformadas, e (b) regenerar uma planta das referidas células de planta transformadas em que as células da planta expressam a antranilato sintase monomérica codificada pelo DNA recombinante em uma quantidade efetiva para aumentar o teor de triptofano na planta com relação ao teor de triptofano em uma planta não transformada do mesmo antecedente genético.
5. Método para produzir uma planta com teor de triptofano aumentado, caracterizado pelo fato de compreender:
(a) introduzir, em células regeneráveis de uma planta, um
Petição 870180059605, de 10/07/2018, pág. 12/14 transgene compreendendo o DNA recombinante como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o DNA recombinante é operavelmente ligado a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, para dar células de plantas transformadas, e (b) regenerar uma planta de referidas células de planta transformadas em que as células da planta expressam a antranilato sintase monomérica codificada pelo DNA recombinante em uma quantidade efetiva para aumentar o teor de triptofano na planta com relação ao teor de triptofano em uma planta não transformada do mesmo antecedente genético.
6. Ração animal ou alimento humano, caracterizada(o) pelo fato de compreender pelo menos uma porção de uma planta que compreende o DNA recombinante como definido na reivindicação 1 ou 2, em que as células da planta podem expressar a antranilato sintase monomérica codificada pelo DNA recombinante.
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