CN107099532A - 甘蓝型油菜胚胎特异性启动子pBnaA09g21960D及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜胚胎特异性启动子pBnaA09g21960D及其应用，从甘蓝型油菜中克隆了基因BnaA09g21960D的启动子，构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体DX2181‑pBnaA09g21960D，采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，对筛选的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色，结果表明，pBnaA09g21960D具有驱动下游基因在胚胎中的特异表达，而在其他组织器官不表达的功能。该启动子在油菜转基因提高作物品质方面和人工创建种质资源等方面，具有良好的应用潜力。

Description

甘蓝型油菜胚胎特异性启动子pBnaA09g21960D及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜BnaA09g21960D基因的启动子，命名为pBnaA09g21960D(以下相同)，该启动子可用于拟南芥胚胎特异性表达。

背景技术

植物基因启动子在基因的表达调控中起着关键作用，位于结构基因5’端上游区域，含有顺式作用元件的一段DNA序列，决定着下游基因转录的特异性、方向和效率。此外，启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因表达的时空顺序、表达强度、转录效率和基因的表达水平。所以，研究启动子的功能对于基因表达调控机制和日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的科学意义。

通过对多种植物基因启动子区的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式，一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20～-30bp处的TATA box为启动子的核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATA box上游的保守序列称为启动子上游元件，包括-75bp处的CAAT box和-80～-110bp附近的GC box等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸类物质应答元件(JRE)、乙烯响应元件(ERE)等元件(张春晓,王文棋,蒋湘宁,等.植物基因启动子研究进展[J].遗传学报,2004,31(12):1455-1464；路静,赵华燕,何奕昆,等.高等植物启动子及其应用研究进展[J].自然科学进展,2004,8:002.)。其中，CAAT box是比较保守的序列，与RNA(核糖核酸)聚合酶的识别和结合有关，对基因转录具有较强的激活作用。只要具有了这些保守的结构框，那么就可以具有响应的启动下游基因表达的功能。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。

组成型启动子驱动的外源基因在转基因植物中的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用来自花椰菜病毒(CaMV)的35S启动子或来自细菌的胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英,刘祥林,印莉萍.转基因植物中外源基因的有效表达及其安全性评价[J].首都师范大学学报:自然科学版,2002,23(2):52-56)。

但是很多时候外源基因在受体植物中的高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且所有组织中的表达可能对植物本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(ShirongJ.Environment and Food Biosafety Assessment of Transgenic Plants[J].PROGRESSIN BIOTECHNOLOGY,1997,6)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子主要包括非生物胁迫诱导型启动子、生物胁迫诱导型启动子和激素诱导型启动子等(聂丽娜,夏兰琴,徐兆师,等.植物基因启动子的克隆及其功能研究进展[J].植物遗传资源学报,2008,9(3):385-391)。但是诱导型启动子的应用也具有一定的限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反映而不利于植株的正常生长。此外，化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇、雌二醇和四环素都对生态环境有害，不宜用于生产实践。

使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题，外源基因的组织特异性表达将有效提高转基因作物的生物安全性(宋扬,周军会,张永强.植物组织特异性启动子研究[J].生物技術通報,2007,2007(6):21-24)。近些年来，关于组织特异性启动子的研究取得了很大的进步，包括叶片、韧皮部、维管束、根等器官特异性表达启动子和花粉、雄蕊、雌蕊、果实、种子等生殖器官特异表达启动子(宋扬,周军会,张永强.植物组织特异性启动子研究[J].生物技術通報,2007,2007(6):21-24)。如Ariizumi等利用GUS染色转基因拟南芥分离到了3个花药特异性表达启动子(Ariizumi T,Amagai M,Shibata D,etal.Comparative study of promoter activity of three anther-specific genesencoding lipid transfer protein,xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase andpolygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Reports,2002,21(1):90-96)。Kim等同样通过转基因拟南芥检测GUS基因的表达，筛选得到芝麻中线粒体油酸脱氢酶基因FAD2的启动子为种子特异表达启动子，其中的E box和G box元件与三酰甘油的生物合成有关(Kim M J,Kim H,Shin J S,et al.Seed-specific expression ofsesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorialproperties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoterand enhancers in the 5′-UTR intron[J].Molecular Genetics and Genomics,2006,276(4):351-368)。耿安奇等从白菜型油菜、甘蓝型油菜、菜苔和橄榄中分离了4个启动子并转化烟草，GUS染色分析其为花器官特异表达的启动子(Geng A Q,Zhao Z J,Nie X L,etal.Expression analysis of four flower-specific promoters of Brassica spp.inthe heterogeneous host tobacco[J].African Journal of Biotechnology,2009,8(20))。此外，Mariani等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29与核酸酶基因Barnase、RnaseT1融合后转化植物，核酸酶基因在花药中特异表达，并破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和油菜(Marian C,De Beuckeleer M,Truettner J,et al.Induction of malesterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene[J].Nature,1990,347:737-741)。目前TA29启动子已经在烟草、玉米、油菜、拟南芥、水稻等植物上应用并获得成功(宋扬,周军会,张永强.植物组织特异性启动子研究[J].生物技術通報,2007,2007(6):21-24)。由此可见，即使不同的植物物种之间的体内环境不同以及基因间存在互作差异，只要启动子具有保守的核心启动区域和相应保守的调控元件，就可以在其他不同植物中发挥启动下游基因表达的生物学功能。

以上这些报道都是利用转基因技术在不同的植物间进行启动子功能分析的例子，这些实例表明利用模式植物拟南芥、烟草等作为载体，通过转基因植物的表达分析证实来自其他植物的启动子的功能是被广泛认可和接受的。

油菜是重要的食用油来源，通过转基因来提高油菜的产量和含油量等种子相关性状，是科研工作者炙手可热的课题，那么筛选种子特异性表达的启动子就很有必要。本发明通过实验分析，发现启动子pBnaA09g21960D呈现出很强的种子胚胎特异性表达特性，在pBnaA09g21960D转基因拟南芥中，其所驱动的报告基因GUS只在转基因拟南芥的种子胚胎中都表现出很强的表达水平，这些数据充分表明pBnaA09g21960D是一个很强的种子胚胎特异性表达启动子，在植物转基因育种中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是在于提供一种甘蓝型油菜胚胎特异性启动子pBnaA09g21960D，其优点在于两个方面：首先，来源于油菜内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费；其次，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。因此，该启动子可应用于植物的基因工程研究和种质资源改良研究。

本发明的目的之二是在于提供了甘蓝型油菜pBnaA09g21960D启动子的扩增引物。以甘蓝型油菜基因组DNA为模板，采用所述的特异性引物进行PCR扩增，获得甘蓝型油菜启动子pBnaA09g21960D序列，操作简单，产物特异，结果稳定可靠。

本发明的目的之三是在于提供了一种含有植物高效表达启动子pBnaA09g21960D的重组载体DX2181-pBnaA09g21960D。该载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测，通过这个载体转化拟南芥可获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

本发明的目的之四是在于提供了甘蓝型油菜启动子pBnaA09g21960D在种子胚胎中特异性表达的应用。在该启动自的驱动下，目的基因主要在植物的胚胎中特异表达，而在其他部位不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在创建优良种质资源等基因工程和转基因安全中具有良好的应用价值。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

启动子pBnaA09g21960D的克隆：以甘蓝型油菜基因组DNA为模板进行PCR扩增，正向引物pBnaA09g21960D-F为5'-GAGATCTACAGCGCTAAGCTTaaccgtctttgctcgaatttc-3'，反向引物pBnaA09g21960D-R为5'-GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa-3'(引物pBnaA09g21960D-F中，序列GAGATCTACAGCGCT为载体DX2181融合位点的上游序列，序列AAGCTT为Hind III的酶切位点；引物pBnaA09g21960D-R中，序列GGACTGACCACCCGG为载体DX2181融合位点的下游游序列，序列GGATCC为BamH I的酶切位点)，获得甘蓝型油菜pBnaA09g21960D的序列，如SEQ ID NO:1所示。

重组载体DX2181-pBnaA09g21960D的构建方法，其步骤是：

用Hind III和BamH I双酶切植物表达载体DX2181，并经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收；将启动子pBnaA09g21960D与回收的酶切质粒按一步克隆试剂盒(EntryOne Step Cloning Kit)说明书进行操作，37℃水浴30min后转化大肠杆菌感受态DH5α；长出的单克隆以载体上游引物DX2181-F：TACGTCGCCGTCCAGCTCGA和目的序列特异引物pBnaA09g21960D-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa进行阳性克隆检测，提取阳性克隆的表达载体质粒，该质粒即为重组载体DX2181-pBnaA09g21960D。

启动子pBnaA09g21960D的功能分析及其在拟南芥胚胎表达中的应用：

通过启动子功能元件预测软件PlantCARE对该启动子顺式作用元件进行了在线预测分析，结果表明所克隆的启动子序列含有TATA box核心启动子序列，CAAT box等上游启动子元件和胚乳特异表达元件；在此基础上构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体DX2181-pBnaA09g21960D；采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，经潮霉素和PCR双重筛选获得转基因阳性植株；对阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色，结果表明，该启动子驱动的GUS基因仅在拟南芥的胚胎中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在胚胎中的表达，其他组织器官等不表达的功能；这一具有组织特异性表达的启动子在人工创建优良种质资源、植物基因工程等方面具有很好的应用价值；如利用该启动子驱动油脂合成相关基因，首先构建pBnaA09g21960D驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在pBnaA09g21960D启动子的驱动下，可以提高目的基因在上述组织中部位中的表达量以达到提高种子相关品质的目的。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1.该启动子可特异性驱动下游目的基因在植物胚胎中的表达，而不在其他组织、器官中表达，具有时空表达特异性。

2.种子是植物的重要器官，育种专家可利用其特异性表达目的基因来改变植物种子的性状，如含油量、产量、营养成分等，对于现代农业具有良好的应用潜力。pBnaA09g21960D启动子在油菜利用转基因改良作物品质，人工创建优良种质资源等方面具有良好的应用潜力。

附图说明

图1为甘蓝型油菜BnaA09g21960D基因启动子片段电泳图

泳道1为DL2000的核酸Marker；泳道2为以基因组DNA为模板的PCR扩增的启动子片段结果。

图2为pBnaA09g21960D启动子序列分析结果图

TATA-box：启动子核心元件；CAAT-box：启动子、增强子核心元件；ABRE：脱落酸响应顺式作用元件；G-Box：光响应调控元件；GCN4_motif：胚乳表达顺式作用元件；LAMP-element：光响应调控元件；MBS：参与干旱诱导的MYB结合位点；MRE：参与光响应的MYB结合位点；Skn-1_motif：胚乳表达顺式作用元件；TCT-motif：光响应元件的一部分；TGACG-motif：茉莉酸甲酯响应顺式作用元件。

图3为植物表达载体DX2181的结构示意图。

图4为构建载体DX2181-pBnaA09g21960D的T-DNA区示意图。

图5为DX2181-pBnaA09g21960D的转基因植株PCR鉴定结果图。

泳道1为DL2000的核酸Marker；泳道2为DX2181-pBnaA09g21960D阳性质粒对照；泳道3-9为转基因拟南芥；泳道10为野生型拟南芥。

图6为pBnaA09g21960D启动子转基因拟南芥GUS组织化学染色结果图

A：成熟种子；B：成熟种子的胚胎；C：成熟种子的种皮；D：15天幼苗；E：25天幼苗；F：花；G：茎和角果；H：角果；I：幼嫩胚珠；J：幼嫩胚胎；K：幼嫩种皮。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由武汉擎科生物科技有限公司合成，测序由武汉擎科生物科技有限公司完成，Entry OneStep Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，快速内切酶购自Thermo FisherScientific，DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marker等购自大连宝生物公司，实验中所用的甘蓝型油菜品种Darmor为中国农业科学院油料作物研究所刘胜毅老师惠赠；哥伦比亚野生型拟南芥Arabidopsis Thaliana、大肠杆菌感受态菌株DH5α、农杆菌感受态菌株GV3101和改造后的植物遗传表达载体DX2181等，均为本实验室保存。

实施例1：油菜启动子pBnaA09g21960D的引物序列设计：

根据油菜全基因组测序获得的BnaA09g21960D基因(Sequence ID:XM_009109941.1)上游的基因间隔序列990bp设计一对引物进行PCR扩增，扩增获得油菜BnaA09g21960D的5’上游启动子序列，所用引物为pBnaA09g21960D-F：5'-GAGATCTACAGCGCTAAGCTTaaccgtctttgctcgaatttc-3'和pBnaA09g21960D-R：5'-GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa-3'。引物pBnaA09g21960D-F中，序列GAGATCTACAGCGCT为载体DX2181融合位点的上游序列，序列AAGCTT为Hind III的酶切位点；引物pBnaA09g21960D-R中，序列GGACTGACCACCCGG为载体DX2181融合位点的下游游序列，序列GGATCC为BamH I的酶切位点。

实施例2：油菜启动子pBnaA09g21960D的制备：

本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)Darmor(中国农业科学院油料作物研究所刘胜毅研究员提供，以下相同)，油菜播种于大田，正常田间管理。利用CTAB法提取油菜叶片基因组DNA，以提取的油菜全基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应PCR(Polymerase chain reaction)。PCR体系为：2×Mix buffer 25μL，pBnaA09g21960D-F：1μL，pBnaA09g21960D-R：1μL，DNA 1μL，ddH₂O 22μL。PCR程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃∞。PCR产物大小为990bp(见图1)，经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定并按试剂盒说明书进行纯化回收、检测浓度。

DX2181载体质粒经Hind III和BamH I双酶切完全，并经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。回收的PCR产物与酶切质粒按一步克隆试剂盒(EntryOne StepCloning Kit)说明书进行操作(5×CE II Buffer 4μL，线性化克隆载体50～200ng，插入片段扩增产物20～200ng，II 2μL，ddH₂O补充至20μL)，37℃水浴30min后转化大肠杆菌感受态DH5α。长出的单克隆以载体上游引物DX2181-F：TACGTCGCCGTCCAGCTCGA和目的序列特异引物pBnaA09g21960D-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa进行阳性克隆检测，经PCR检测为阳性单克隆的送武汉擎科生物科技有限公司进行测序，分析结果显示，获得了油菜BnaA09g21960D基因全长启动子，其序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，命名为pBnaA09g21960D。

实施例3：油菜启动子pBnaA09g21960D的序列分析及功能预测：

将所克隆并测序得到的pBnaA09g21960D序列用启动子核心元件预测软件PLACE中的PlantCARE(Lescot M,Déhais P,Thijs G,et al.PlantCARE,a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysisof promoter sequences[J].Nucleic acids research,2002,30(1):325-327.http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线进行功能元件的预测分析。结果表明，如图2所示，pBnaA09g21960D含有真核生物启动子必需的核心元件TATA box和CAAT box。进一步分析该启动子序列发现，除了必须的核心元件之外，pBnaA09g21960D序列中还存在多种启动子功能元件：ABRE(TACGTG):cis-acting element involved in theabscisic acid responsiveness，脱落酸响应顺式作用元件；G-Box(CACGTA/CACGTT/TACGTG):regulatory element involved in light responsiveness光响应调控元件；GCN4_motif(TGTGTCA):cis-regulatory element involved in endosperm expression胚乳表达顺式作用元件；LAMP-element(CTTTATCA):part of a light responsive element光响应调控元件；MBS(CAACTG):MYB binding site involved in drought-inducibility参与干旱诱导的MYB结合位点；MRE(AACCTAA):MYB binding site involved in lightresponsiveness参与光响应的MYB结合位点；Skn-1_motif(GTCAT):cis-actingregulatory element required for endosperm expression胚乳表达顺式作用元件；TCT-motif(TCTTAC):part of a light responsive element光响应元件的一部分；TGACG-motif(TGACG):cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness茉莉酸甲酯响应顺式作用元件。由此申请人预测pBnaA09g21960D可能是一个胚珠(种子)特异性启动子，而且由于多个胚乳特异元件的存在，它可能在胚珠的胚乳细胞中表达量最高。

实施例4：植物表达载体DX2181-pBnaA09g21960D的构建及根癌农杆菌菌株GV3101转化

重组载体DX2181-pBnaA09g21960D的构建方法，采用的是目的片段和酶切好的载体一步无缝克隆法(II One Step Cloning Kit)：一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体酶切进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在Exnase的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。构建的重组载体是将质粒DX2181上GUS基因上游的多克隆酶切位点用克隆得到的pBnaA09g21960D片段重组替换而来。其步骤是：

1)用Hind III和BamH I双酶切植物表达载体DX2181，并经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收；

2)回收的PCR产物pBnaA09g21960D与上述回收的酶切质粒按一步克隆试剂盒(Entry One Step Cloning Kit)说明书进行操作(5×CE II Buffer 4μL，线性化克隆载体50～200ng，插入片段扩增产物20～200ng，II 2μL，ddH₂O直至终体积20μL)，37℃水浴30min后转化大肠杆菌感受态DH5α；

3)长出的单克隆以载体上游引物DX2181-F：TACGTCGCCGTCCAGCTCGA和目的序列特异引物pBnaA09g21960D-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa进行阳性克隆检测，经PCR检测为阳性单克隆的送武汉擎科生物科技有限公司进行测序，分析结果显示，获得了油菜BnaA09g21960D基因全长启动子，其序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，提取的重组质粒命名为DX2181-pBnaA09g21960D。

利用冻融法转化农杆菌感受态细胞GV3101，步骤如下：

1)将保存于-80℃的农杆菌感受态细胞GV3101置于冰上融化；

2)用移液枪取3μL(100ng)表达载体质粒DX2181-pBnaA09g21960D，浸没枪头加入到感受态细胞中，置于冰上静止30min，液氮中急冻1min，然后在37℃恒温水浴锅中水浴5min；

3)加入600μL LB液体培养基(胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g)，28℃，200rpm，振荡培养4h；

4)涂布于附加50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素和50μg/mL利福平的固体LB培养基((胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；Agar 1.5％))上，28℃倒置培养36-48h；

5)长出的单克隆以植物表达载体上游引物DX2181-F：TACGTCGCCGTCCAGCTCGA和目的序列特异引物pBnaA09g21960D-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa进行阳性克隆检测，经PCR检测为阳性的单克隆摇菌至OD600＝1.8-2.0(紫外分光光度计检测)，用等体积的50％甘油保菌于-80℃超低温冰箱，以备后续研究使用。

实施例5：植物表达载体DX2181-pBnaA09g21960D在拟南芥中的遗传转化及转基因植物筛选

1、浸花法转化拟南芥：

1)拟南芥抽薹后剪去主花絮顶端，待侧枝生长一致且处于花蕾期时，准备材料进行转化；

2)用200mL含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素和100μg/mL利福平的LB液体培养基，接种携带目的基因的农杆菌DX2181-pBnaA09g21960D，28℃，200rpm，培养12-18h；

3)菌液装于离心瓶中，5000rpm，离心15min，用移液枪将上清吸走并弃之；

4)用100mL重悬液(5％的蔗糖，0.02％的表面活性剂)，重悬农杆菌；将拟南芥花絮浸入菌液中30s，并轻柔搅动；

5)浸染完后，用塑料薄膜覆盖过夜，提高转化效率，可在5-7d后再转化一次；

6)大约一个月后，种子成熟，收获后置于37℃烘箱7d，脱粒后于4℃春化3d，标注为T0代种子。

2、筛选阳性转基因植株：

1)取适量(不超过EP管的1/5)脱粒干净的拟南芥种子于1.5mL EP管中；

2)加1mL 75％酒精，震荡洗涤1min，8000rpm离心30s，用移液枪将上清吸走并弃之；

3)加1mL 10％的次氯酸钠，震荡洗涤5min，8 000rpm离心30s，用移液枪将上清吸走并弃之；

4)加1mL dd H₂O，震荡洗涤1min，8 000rpm离心30s，用移液枪将上清吸走并弃之；

5)重复步骤4三次，加1mL ddH₂O，于黑暗条件下，4℃，春化3d；

6)铺板种植于1/2MS培养基(MS粉2.15g；蔗糖10g；琼脂0.8％；pH5.8)上，含25mg/L的潮霉素，培养箱暗培养5d左右，转换为正常光照培养；

7)等长出两片真叶时，将下胚轴伸长、真叶生长正常的移苗于温室培养钵中(营养土:蛭石:珍珠岩＝3:1:1)；

8)活下来正常生长的植株待抽薹前取叶片抽提基因组DNA，以植物表达载体上游引物DX2181-F：TACGTCGCCGTCCAGCTCGA和目的序列特异引物pBnaA09g21960D-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa筛选阳性转基因植株，经PCR检测为阳性的转基因材料为T1代(见图5)，单株收获，并依次编号保存。同样将T1代转基因材料经抗潮霉素筛选与PCR鉴定为T2代，单株收获，并依次编号保存。之后再次将T2代筛选，得到纯合的转基因株系。

实施例6：甘蓝型油菜pBnaA09g21960D启动子的功能分析

采用组织化学染色法检测GUS在植株组织细胞中的表达。取实施例5制备的T2代转基因拟南芥不同部位，具体如：成熟种子、成熟种子的胚胎、成熟种子的种皮、15天幼苗、25天幼苗、花、茎、角果、幼嫩胚珠、幼嫩胚胎、幼嫩种皮。取样后至小离心管或培养皿中，加入适量GUS染色液(50mmol/L PBS,pH 7.0；0.5mol/L X-Gluc；50mmol/L potassiumferricyanide；50mmol/L potassium ferrocyanide；10mmol/L EDTA、0.001％Triton X-100以及20％甲醇)。于37℃保温反应1h以上或过夜；然后转入70％乙醇中脱色后，利用体视镜(Olympus SZX7)进行观察拍照。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位，通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索pBnaA09g21960D的时空表达模式。

结果表明(图6)，该启动子驱动的GUS基因仅在拟南芥的种子胚胎中高效表达，在其他组织和器官中均不表达。因此，该启动子局域驱动下游基因在植物种子胚胎中高效表达，而在其他部位不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程中具有良好的应用价值。如可以通过构建含有该启动子驱动提高种子含油量基因的载体，转化受体植株，人工创造优质高产高油材料，应用于农业生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 甘蓝型油菜胚胎特异性启动子pBnaA09g21960D及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 1

aaccgtcttt gctcgaattt ccttattcag ccatccttca gccctttccg tggccatata 60

tcaccatttt tccttcgaat atttgttggc tttgttcacg tacttattcc tattcaaagt 120

tattacagta cctatcacca ttggaaagta tcacaatgag atcacttgtg atgtcttacc 180

catagaggat aggcacatta tgcattatga caagaaagct gtacatgatg gcttcaccaa 240

ctggtatact tttggtgaag aagatcatta tggttccttc aactctagaa gaagtgtgtc 300

aagatcagtt gcaattctta agattttcaa catataccac aaactgggat gttacataag 360

ttgaatttaa ttttgtgctg agctacactc acgttattct gacgaaccta agacgcattt 420

gcatagcggt ttctgacctc catatacaac atgatgtcaa gtcatcgagg ggcaattgaa 480

acgctgttaa tcactccata atctgccatt ctattcacca gaaaagtgac tcccactact 540

tcgccaaatt tggttataat catatacttt ctctatagtc gactcatctt gttccttgtt 600

ctctttatca tcttatttgg gaccattaaa ctcatctttg tggcactcga tctgcaatgg 660

atcgctcagt agtaccagaa tctgagactg gggcgtcttg ttgtggcaag aacagtaagc 720

taaacaacaa tctccattaa aacaatgaat atcgttagtt gaaccattaa aacatttttc 780

cattaaaaca aatgatactt gaacatgatc ttatctctta aaatcatatt gaaatccact 840

gattttttgg cactctagct ggggaagaga taaagggaca tcaacaaaca aactctctct 900

caaatccatt tttacatttt aaagaaaaga gacaaaaaca cgtgaattgt atgtatataa 960

atacggtttt aaaagctgtc tacgtgttca 990

Claims (4)

1.甘蓝型油菜基因BnaA09g21960D的启动子pBnaA09g21960D，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述的启动子pBnaA09g21960D的重组载体DX2181-pBnaA09g21960D。

3.权利要求1所述的启动子pBnaA09g21960D的扩增引物，其特征在于：正向引物pBnaA09g21960D-F为5'-GAGATCTACAGCGCTAAGCTTaaccgtctttgctcgaatttc-3'，反向引物pBnaA09g21960D-R为5'-GGACTGACCACCCGGGGATCCtgaacacgtagacagcttttaa-3'。

4.权利要求1中所述的启动子pBnaA09g21960D在拟南芥胚胎中特异表达的应用。