CN1674778A - 用于生产具有改变的多不饱和脂肪酸的植物的核酸序列和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸分子和核酸构建体，以及与脂肪酸合成相关的其他试剂，特别是饱和脂肪和不饱和脂肪的比例。另外，本发明涉及掺入了所述试剂的植物，其中，所述植物具有改变的饱和脂肪与不饱和脂肪的比例。具体地讲，本发明涉及掺入了所述试剂的植物，其中，所述植物具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的比例。

Description

用于生产具有改变的多不饱和脂肪酸的植物的核酸序列和方法
发明领域
本发明涉及核酸分子和核酸构建体，以及与脂肪酸合成相关的其他试剂，特别是饱和脂肪和不饱和脂肪的比例。另外，本发明涉及掺入了所述试剂的植物，其中，所述植物具有改变的饱和脂肪与不饱和脂肪的比例。具体地讲，本发明涉及掺入了所述试剂的植物，其中，所述植物具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的比例。
背景
植物油具有多种用途。需要从生物合成的或天然植物来源中获得新型植物油组成以及获得油组成的改进的方法。根据希望的油用途，需要各种不同的脂肪酸组成。
高等植物似乎是通过共同的代谢途径--脂肪酸合成酶(FAS)途径合成脂肪酸。在发育中的种子中，脂肪酸连接在甘油主链上，形成三酰甘油酯，作为能量来源而储存，以便进一步萌发。FAS途径位于质体中。第一个关键步骤是通过乙酰-CoA:ACP转酰酶(ATA)的催化由乙酰-CoA和ACP形成乙酰-ACP(酰基载体蛋白)。乙酰-ACP延长成16-和18-碳脂肪酸，包括以下反应顺序的循环作用：与来自丙二酰-ACP的二碳单位缩合，形成β-酮酰-ACP(β-酮酰-ACP合成酶)，酮-官能团还原成醇(β-酮酰-ACP还原酶)，脱水形成烯酰-ACP(β-酮酰-ACP脱水酶)，以及最终还原烯酰-ACP，以便形成延长的饱和酰基-ACP(烯酰-ACP还原酶)。β-酮酰-ACP合成酶I能催化从C4:0延长到棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮酰-ACP合成酶II能催化最终延长至硬脂酰-ACP(C18:0)。常见的植物不饱和脂肪酸，如油酸，亚油酸和亚麻酸存在于储存的三酰甘油酯中，它是在由可溶性质体Δ-9去饱和酶(通常又被称为“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化的反应中通过硬脂酰-ACP的去饱和作用形成油酰-ACP(C18:1)形成的。分子氧是去饱和作用所必须的，其中，还原的铁氧还蛋白起着电子共同供体的作用。其他去饱和作用是通过膜结合的Δ-12去饱和酶和Δ-15去饱和酶的顺序作用实现的。因此，所述“去饱和酶”产生了多不饱和脂肪酸。
获得能够产生导致FAS的表型的核酸序列、将脂肪酸去饱和、和/或将脂肪酸掺入甘油主链上以便产生油的过程遇到了各种障碍，包括，但不局限于感兴趣的代谢因子的鉴定，具有有用的动力学特征的酶来源的选择和表征，将感兴趣的蛋白纯化到可以对它进行氨基酸测序的水平，利用氨基酸序列数据获得能够用作探针的核酸序列，以便回收需要的DNA序列，以及制备构建体，并且转化并且分析所得到的植物。
因此，需要用于改变脂肪酸组成的其他核酸目标和方法。具体地讲，需要生产多种不同的脂肪酸组成的构建体和方法。
发明概述
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，它包括与选自下组的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：4，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明还提供了包括具有SEQ ID NO：12的序列的核酸分子的至少15个连续的核苷酸的核酸分子；包括具有SEQ ID NO：13的序列的核酸分子的至少15个连续的核苷酸的核酸分子；包括具有SEQ ID NO：14的序列的核酸分子的至少15个连续的核苷酸的核酸分子；和包括具有SEQ ID NO：4的序列的核酸分子的至少15个连续的核苷酸的核酸分子。
本发明还提供了重组核酸分子，它包括作为可操作地连接的成分的以下成分：(a)启动子，它能在植物细胞中发挥作用，以便导致mRNA分子的产生；和(b)能在高严格条件下与选自下组的核酸序列杂交的核酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：4，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明还提供了转化的大豆植物，它具有包括以下成分的核酸分子：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与多顺反子构型的第一启动子连接或与第二启动子连接。
本发明还提供了包括双链RNAi构建体的转化的大豆植物，其中，第一启动子可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中具有第二种核酸序列的第二种核酸分子可操作地与第一种核酸分子连接，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明还提供了包括双链RNAi构建体的转化的大豆植物，其中，第一启动子可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，具有第二种核酸序列的第二种核酸分子可操作地与dsRNAi构型的第二启动子连接，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明还提供了具有两种或两种以上核酸分子的转化的大豆植物，其中，每一种核酸分子可操作地与启动子连接，并且，其中，每一种核酸分子具有这样的核酸序列，它与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明提供了转化的大豆植物，其中，选择性地降低了由选自下组的基因编码的转录物的水平：FAD2-1A，FAD2-1B，FAD2-2B，FAD3-1A，FAD3-1B，FAD3-1C，而保持由选自下组的不同基因编码的转录物的水平至少部分不受影响：FAD2-1A，FAD2-1B，FAD2-2B，FAD3-1A，FAD3-1B，FAD3-1C。
本发明还提供了生产具有降低的亚麻酸含量的种子的大豆植物的方法，包括：用包括以下成分的核酸分子转化大豆植物：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ IDNOs：1，2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与第一启动子或第二启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子的亚麻酸比具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物少。
本发明还提供了生产具有提高的油酸含量的种子的大豆植物的方法，包括：用包括以下成分的核酸分子转化大豆植物：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与第一启动子或第二启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子的油酸比具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物多。
本发明还提供了生产具有改变的油组成的种子的植物的方法，包括：用包括作为可选择地连接的部分的以下成分的核酸分子转化植物：第一启动子和具有第一种核酸序列的第一种核酸分子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子与具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物相比具有改变的油组成。
本发明还提供了生产具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸比例的种子的植物的方法，包括：用包括作为可选择地连接的部分的以下成分的构建体转化植物：两种或两种以上核酸分子，每一种都具有与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性的核酸序列：SEQ IDNOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，每一种核酸分子可操作地与启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子与具有类似的遗传背景但缺少所述两种或两种以上核酸分子的植物相比具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸比例。
附图简述
图1是构建体pCGN5468的示意图。
图2是构建体pCGN5469的示意图。
图3是构建体pCGN5471的示意图。
图4是构建体pCGN5485的示意图。
图5是构建体pCGN5486的示意图。
图6是构建体pCGN5462的示意图。
图7是构建体pCGN5466的示意图。
图8是构建体pCGN5464的示意图。
图9是构建体pCGN5473的示意图。
图10是构建体pMON68521的示意图。
图11是构建体pMON68519的示意图。
图12是构建体pCGN5455的示意图。
图13是构建体pCGN5459的示意图。
发明详述
核酸序列的说明
SEQ ID NO：1表示FAD2-1A内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO：2表示FAD2-1B内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO：3表示部分FAD2-2基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NO：4表示FAD2-2B内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO：5表示FAD3-1A内含子1的核酸序列。
SEQ ID NO：6表示FAD3-1A内含子2的核酸序列。
SEQ ID NO：7表示FAD3-1A内含子3A的核酸序列。
SEQ ID NO：8表示FAD3-1A内含子4的核酸序列。
SEQ ID NO：9表示FAD3-1A内含子5的核酸序列。
SEQ ID NO：10表示FAD3-1A内含子3B的核酸序列。
SEQ ID NO：11表示FAD3-1A内含子3C的核酸序列。
SEQ ID NO：12表示FAD3-1B内含子3C的核酸序列。
SEQ ID NO：13表示FAD3-1B内含子4的核酸序列。
SEQ ID NO：14表示FAD3-1C内含子4的核酸序列。
SEQ ID NO：15表示FAD2-1A基因序列的cDNA序列。
SEQ ID NOs：16和17表示FAD2-1A PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：18表示部分FAD2-1A基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NO：19表示部分FAD2-1B基因组克隆核酸序列。
SEQ ID NOs：20和21表示FAD3-1A PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：22表示FAD2-1B启动子的核酸序列。
SEQ ID NO：23表示部分FAD3-1A基因组克隆的核酸序列。
SEQ ID NOs：24-39表示PCR引物的核酸序列。
定义
在本文中，术语“基因”被用于表示核酸序列，它包括5’非翻译区，包括与所述基因产物的表达相关的启动子区，与所述基因产物表达相关的任何内含子和外显子区以及5’或3’非翻译区。
在本文中，“FAD2”，“Δ12去饱和酶”或“ω-6去饱和酶”基因是编码一种酶的基因，这种酶能够催化将双键插入脂肪酰基部分的从羧基末端开始计算的第十二号位置。
本文在提到蛋白和核酸时，普通大写字母的使用，例如，“FAD2”表示酶，蛋白，多肽，或肽，而斜体大写字母的使用，例如，“FAD2”表示核酸，包括，但不局限于基因，cDNAs，和mRNAs。
在本文中，术语“FAD2-1”被用于表示在种子组织中以特异性方式天然表达的FAD2基因。
在本文中，术语“FAD2-2”被用于表示这样的FAD2基因：(a)它是与FAD2-1基因不同的基因，和(b)它是在包括种子在内的多种组织中天然表达的。
在本文中，“FAD3”，“Δ15去饱和酶”或“ω-3去饱和酶”基因是编码一种酶的基因，这种酶能够催化将双键插入脂肪酰基部分的从羧基末端开始计算的第十五号位置。
在本文中，术语“FAD3-1”被用于表示FAD3基因，它能在包括种子在内的多种组织中天然表达。
在本文中，基因名词后面的大写字母(A，B，C)被用于表示家族的成员，即FAD2-1A是与FAD2-1B不同的基因家族成员。
在本文中，“中等油大豆种子”是种子的油组成中具有50％-75％的油酸的种子。
在本文中，“高油大豆种子”是种子的油组成中具有超过75％的油酸的种子。
术语“非编码”表示不编码被表达的蛋白的部分或全部的核酸分子序列。非编码序列包括，但不局限于内含子，启动子区，3’非翻译区，和5’非翻译区。
在本文中，术语“内含子”表示该术语的通常含义，它表示一段核酸分子，通常是DNA，它不编码被表达蛋白的部分或全部，并且，在内源条件下，被转录成RNA分子，不过，它在所述RNA被翻译成蛋白之前被从内源RNA中剪接掉。
在本文中，术语“外显子”表示该术语的正常含义，它表示一段核酸分子，通常是DNA，它编码表达的蛋白的一部分或全部。
在本文中，“可操作地连接”于一个或多个核酸序列的启动子能够驱动一个或多个核酸序列的表达，包括以多顺反子构型排列的多个编码或非编码核酸序列。
“多顺反子基因”或“多顺反子mRNA”是任何基因或mRNA，它包括转录的核酸序列，该序列相当于一个以上要定向表达的基因的核酸序列的。应当理解的是，所述多顺反子基因或mRNAs可以包括相当于内含子，5’UTRs，3’UTRs的序列，或它们的组合，并且重组多顺反子基因或mRNA可以，例如，但不局限于，包括相当于来自一个基因的一个或多个UTRs和来自第二个基因的一个或多个内含子的序列。
在本文中，术语核酸序列的互补序列表示沿所述序列整个长度的互补序列。
在本文中，所提出的任何范围都包括该范围的终点，除非另有说明。
试剂
本发明的试剂优选是在任意一种结构特征方面是“生活学活性的”，如核酸分子与另一种核酸分子杂交的能力方面，或蛋白被抗体结合的能力(或与另一种分子竞争这种结合)。另外，所述特征可能是催化性的，因此，包括所述试剂介导化学反应或应答的能力。所述试剂优选是“基本上纯化的”。在本文中，术语“基本上纯化的”表示基本上与在它的天然环境条件下与它正常相关的所有其他分子分离的分子。更优选，基本上纯化的分子是制剂中主要类型的分子。基本上纯化的分子可能是超过60％不含，超过75％不含，优选超过90％不含，更优选超过95％不含存在于天然混合物中的其他分子(溶剂除外)。术语“基本上纯化的”并不是要包括存在于它们的天然环境条件下的分子。
本发明的试剂还可以是重组体。在本文中，术语“重组体”表示任何试剂(例如，包括，但不局限于DNA，肽)，它是对核酸分子进行人工操作的结果，或间接产生的结果。
应当理解的是，本发明的试剂可以用有利于检测所述试剂的试剂标记(例如，荧光标记，Prober等，Science 238：336-340(1987)；Albare11a等，EP 144914；化学标记，Sheldon等，美国专利4,582,789；Albarella等，美国专利4,563,417；修饰过的标记，Miyoshi等，EP 119448)。
核酸分子
本发明的试剂包括核酸分子，在本发明的一个方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被导入细胞或生物体之后，能够选择性地降低由FAD2或FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由第二种FAD2或FAD3编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响。在本发明的一个优选方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被导入细胞或生物体之后，能够选择性地降低由FAD2或FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由第二种FAD2或FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平基本上不受影响。在本发明的一个高度优选的方面，所述核酸分子包括核酸序列，在所述核酸序列被导入细胞或生物体之后，能够选择性地降低由FAD2或FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由第二种FAD2或FAD3编码的蛋白和/或转录物的水平实质上不受影响。
在一个优选方面，核酸分子选择性地降低一个基因相对于另一个基因的水平的能力，是通过比较mRNA转录物的水平进行的。在本发明的另一个优选方面，本发明的核酸分子包括选自下组的核酸序列：SEQID NOs：1-15，18，19，22，23，它们的互补序列，和任意一个的片段。在本发明的另一个优选方面，本发明的核酸分子包括选自下组的核酸序列：SEQ ID NOs：16，17，20，21，24-39，它们的互补序列，和任意一个的片段。
在本发明的一个方面，本发明的核酸被称为导入的核酸分子。如果核酸分子在通过人工操作，无论是如何间接操作插入细胞或生物体，该核酸分子就被称为“导入的”。导入的核酸分子的例子包括，但不局限于，通过转化，转染，注射，和投射导入细胞的核酸，以及通过包括，但不局限于接合，胞吞作用，和吞噬作用导入生物体的核酸。所述细胞或生物体可以是，或可以来自植物，植物细胞，藻类细胞，藻类，真菌细胞，真菌，或细菌细胞。
在本文中，“实质上不受影响”表示诸如蛋白或mRNA转录物的试剂的水平没有因为特定的事件而改变，或所改变的程度不会影响所述试剂的生理学功能。在一个优选方面，所述实质上不受影响的试剂的水平为缺少能选择性地降低另一种试剂的核酸分子的细胞或生物体中的水平的20％以内，更优选10％以内，更优选5％以内。
在本文中，“基本上不受影响”表示诸如蛋白或mRNA转录物的试剂的水平，其中，所述试剂的基本上不受影响的水平为缺少能够选择性地降低另一种试剂的水平的核酸分子的细胞或生物体中的水平的49％以内，更优选35％以内，更优选24％以内。
在本文中，“部分不受影响”表示诸如蛋白或mRNA转录物的试剂的水平，其中，所述试剂的部分不受影响的水平是在缺少能够选择性地降低另一种试剂的水平的核酸分子的细胞或生物体中的水平的80％以内，更优选65％以内，甚至更优选50％以内。
在本文中，诸如蛋白或mRNA的试剂的“选择性降低”是相对缺少能够选择性地降低所述试剂水平的核酸分子的细胞或生物体而言的。在一个优选方面，所述试剂的水平选择性地降低了至少50％，优选超过75％，更优选至少超过90％或95％。
在对试剂的水平进行比较时，这种比较优选是在具有类似遗传背景的生物体之间进行。在一个优选方面，类似的遗传背景是这样的遗传背景，其中，被比较的生物体的核遗传物质具有50％或以上是相同的。在一个更优选的方面，类似的遗传背景是这样的遗传背景，其中，被比较的生物体的核遗传物质75％或以上，甚至更优选90％或以上是相同的。在另一个甚至更优选的方面，类似的遗传背景是这样的遗传背景，其中，被比较的生物体是植物，并且所述植物是同基因的，利用植物转化技术原始导入的任何遗传物质除外。
在本发明的实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD2基因编码的蛋白和/或转录物的水平，同时保持由第二个FAD2基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在一个优选方面，核酸分子选择性地降低选择一个基因相对另一个基因的水平的能力是通过比较mRNA转录物的水平进行的。在本文中，mRNA转录物包括加工过的和未加工过的mRNA转录物。
在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD2-1基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD2-2基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在一种不同的实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD2-2基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD2-1基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后能选择性地降低由FAD2基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在优选实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD2-1基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
在一种不同的实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由另一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1B基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1A基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
在一种不同的实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1B基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在一种不同的实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1B基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1A基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1A基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1B基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。在另一种实施方案中，一种核酸分子在导入细胞或生物体之后，能选择性地降低由FAD3-1A基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响，或实质上不受影响。
本发明的其他优选的实施方案是在整个长度上与本发明的核酸分子的同一性至少为50％，60％，或70％的核酸分子，以及与所述核酸分子互补的核酸分子。更优选的是包括这样一个区域的核酸分子，该区域在它的整个长度上与本发明的核酸分子的同一性为至少80％或85％，以及与所述核酸分子互补的核酸分子。就此而言，在整个长度上至少90％同一的核酸分子是特别优选的，至少95％同一的核酸分子是尤其优选的。另外，具有至少97％同一性的核酸分子是高度优选的，而具有至少98％和99％同一性的核酸分子是特别高度优选的，具有至少99％同一性的核酸分子是最高度优选的。
本发明还提供了包括可以通过以下方法获得的核酸分子序列的核酸分子：在严格杂交条件下，用具有所述核酸分子序列或它的片段的探针筛选含有序列表中所示出的核酸分子序列的完整基因的合适文库；并且分离所述核酸分子序列。例如，可用于获得所述核酸分子的片段包括本文所披露的探针和引物。
可以将本发明的核酸分子用作RNA，cDNA，或基因组DNA的杂交探针，用于分离全长cDNAs或基因组克隆，以及分离与序列表中所示出的核酸分子的序列具有高度序列相似性的其他基因的cDNA或基因组克隆。
本发明的核酸分子可以通过利用本文所披露的核酸分子或它们的片段筛选从植物物种或其他合适的生物体中获得的cDNA或基因组文库方便地获得。所述方法与用于制备所述文库的方法一样为本领域技术人员所公知。在一种实施方案中，所述序列是通过以下方法获得的：将本发明的核酸分子与基因文库的成员一起温育，并且回收能与所述核酸分子杂交的克隆。在第二种实施方案中，可以利用染色体步移或反向PCR的方法获得所述序列。在第三种实施方案中，可以将本发明的核酸分子的序列用于筛选文库或数据库，使用本领域所公知的生物信息技术。例如，参见Bioinformatics，Baxevanis & Ouellette，eds.，Wiley-Interscience(1998)。
可以将多种方法中的任意一种用于获得一种或多种本发明的核酸分子。可以将自动化核酸合成仪用于这一目的，并且制备具有同样存在于细胞或生物体中的序列的核酸分子。作为所述合成方法的替代，可以将所披露的核酸分子用于确定一对引物，可以将所述引物用于聚合酶链反应，以便扩增并且获得任何需要的核酸分子或片段。
正如本领域所充分了解的，“同一性”是两种或两种以上多肽序列或两种或两种以上核酸分子序列之间的关系，正如通过比较所述序列所确定的。在本领域中，“同一性”还表示多肽或核酸分子序列之间的序列相关程度，它是通过所述序列串之间的匹配确定的。“同一性”可以通过已知方法方便地计算，这些方法包括，但不局限于披露于以下文献中的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York (1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，Stockton Press，New York(1991)；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.AppliedMath，48：1073(1988)。确定同一性的方法被设计成能够提供测试序列之间的最大程度的匹配。另外，确定同一性的方法被编辑成公开提供的程序。可用于确定两种序列之间的同一性的计算机程序包括，但不局限于GCG(Devereux，J.，等，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984)；包括五种BLASTX程序的软件包，三种被设计用于核苷酸序列查询(BLASTN，BLASTX，和TBLASTX)，两种被设计用于蛋白序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology，12：76-80(1994)；Birren等，Genome Analysis，1：543-559(1997))。BLASTX程序可以从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。还可将众所周知的Smith Waterman算法用于确定同一性。
用于多肽序列比较的参数通常包括以下参数：
算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)
比较矩阵：BLOSSUM62，来自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919(1992)
空位罚分：12
空位长度罚分：4
一种可以使用上述参数的程序是可以从Genetics ComputerGroup，Madison，Wisconsin公开获得的“空位”程序。末端空位的上述参数以及无罚分是用于肽比较的默认参数。
用于核酸分子序列比较的参数包括以下参数：
算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.，48：443-453(1970)
比较矩阵：匹配-+10；错配＝0
空位罚分：50
空位长度罚分：3
在本文中，“％同一性”是利用上述参数作为核酸分子序列比较的默认参数和来自GCG的“空位”程序10.2版确定的。
本发明还涉及能与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。具体地讲，本发明涉及能在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。在本文中，术语“严格条件”和“严格杂交条件”表示杂交通常是在序列之间存在至少95％，优选至少97％的同一性时发生的。严格杂交条件的一种例子是在42℃下，在包括50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸三钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/毫升变性的，剪切过的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜温育，然后在大约65℃下，在0.1×SSC中洗涤所述杂交支持物。其他杂交和洗涤条件是众所周知的，并且披露于以下文献中：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，NY(1989)，特别是第11章。
在核酸序列的表达能够选择性地降低植物中由FAD2-1基因编码的蛋白和/或转录物的水平，和由至少一种FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD2-2基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分、基本上或实质上不受影响的实施方案中，优选的FAD2-1核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和它们的片段，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸分子杂交；(2)包括同样存在于大豆FAD2-1基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列的表达能够选择性地降低植物中由FAD2-2基因编码的蛋白和/或转录物的水平，和由至少一种FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的水平，而保持由FAD2-1基因编码的蛋白和/或转录物的水平部分、基本上或实质上不受影响的实施方案中，优选的FAD2-2核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与SEQ ID NO：4和它的片段的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子杂交：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；(2)包括同样存在于大豆FAD2-2基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列表达时能够选择性地减少FAD3基因的实施方案中，优选的FAD3核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NOs：5-14，和它们的片段，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子杂交：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：4；(2)包括同样存在于大豆FAD3基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
本发明的核酸分子的一种亚型包括片段核酸分子。片段核酸分子可以由本发明的核酸分子的主要部分，或实际上是它的大部分组成，正如所专门披露的。另外，所述片段可以包括更小的寡核苷酸(具有大约15-大约400个连续的核苷酸残基，更优选，大约15-大约30个连续的核苷酸残基，或大约50-大约100个连续的核苷酸残基，或大约100-大约200个连续的核苷酸残基，或大约200-大约400个连续的核苷酸残基，或大约275-大约350个连续的核苷酸残基)。
在另一方面，片段核酸分子具有这样的核酸序列，它是本发明核酸分子的至少15，25，50，或100个连续的核苷酸。在优选实施方案中，所述核酸分子的核酸序列是具有选自下组的核酸序列的核酸分子的至少15，25，50，或100个连续的核苷酸：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：14和它们的互补序列。
一种或多种本发明的核酸分子的片段可以是探针，并且特别是PCR探针。PCR探针是能够启动聚合酶活性，同时，与另一个核酸分子形成双链结构的核酸分子。本领域存在各种用于确定PCR探针结构的方法和PCR技术。计算机进行的检索使用以下程序(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer 3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，BioTechniques 25：112-123(1998))，例如，可用于鉴定可能的PCR引物。
本发明的核酸分子或它们的片段在某些场合下能够特异性地与其他核酸分子杂交。本发明的核酸分子包括能特异性地与具有选自下组的核酸序列的核酸分子杂交的核酸分子：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
在本文中，如果两种核酸分子能够形成反向平行的，双链核酸结构，就将这两种核酸分子说成是能够彼此特异性杂交。
本发明的核酸分子还可以编码同源物核酸分子。在本文中，同源物核酸分子或它的片段是第二个物种中的对应的核酸分子或它的片段(例如，玉米FAD2-1内含子核酸分子是拟南芥FAD2-1内含子核酸分子的同源物)。同源物还可以通过分子进化或DNA混排技术制备，以便所述分子保留了原始多肽的至少一种功能或结构特征(例如，参见美国专利5,811,238)。
在另一种实施方案中，所述同源物是从选自下组的植物中获得的：苜蓿，拟南芥，大麦，芸薹，油菜，花椰菜，甘蓝，canola，柑桔，棉花，大蒜，燕麦葱属，亚麻，观赏植物，加州希蒙得木，玉米，花生，胡椒，马铃薯，油菜籽，水稻，黑麦，高粱，草莓，甘蔗，甜菜，番茄，小麦，白杨，松树，冷杉，桉树，苹果树莴苣，小扁豆，葡萄，香蕉，茶，草坪草，向日葵，菜豆属，海甘蓝，芥菜，蓖麻，芝麻，棉籽，亚麻籽，红花，和油棕。更具体地讲，优选的同源物是从选自下组的植物中获得的：canola，玉米，芸薹，油菜，大豆，海甘蓝，芥菜，蓖麻，花生，芝麻，棉籽，亚麻籽，油菜籽，红花，油棕，亚麻，和向日葵。在一种更优选的实施方案中，所述同源物是从选自下组的植物中获得的：canola，油菜籽，玉米，芸薹，油菜，大豆，向日葵，红花，油棕，和花生。
植物构建体和植物转化体
可以将一种或多种本发明的核酸分子用于植物转化或转染。可以将外源遗传物质转入植物细胞，并且让所述植物细胞再生成完整的可育或不育的植物或植物部分。外源遗传物质是任何遗传物质，它可以是天然存在的或从能够插入任何生物体中的任何来源获得的。
植物可以具有一个以上FAD2或FAD3基因的家族(即，编码具有特殊活性的酶的基因，这些基因存在于所述植物基因组内的不同位点上)。在本文中，“FAD2基因家族成员”是存在于所述植物的遗传物质中的任何FAD2基因。在本文中，“FAD3基因家族成员”是存在于所述植物的遗传物质中的任何FAD3基因。在一种实施方案中，还可以根据所述核酸序列的相似性对所述基因家族成员进行额外的分类。在本实施方案的一个优选方面，基因家族成员在所述基因的编码序列部分具有至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％的核酸序列同一性。
在本发明的一方面，植物包括双链RNAi构建体，其中，第一启动子可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有至少大约85％的同一性：SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，和任意一个的片段，具有第二种核酸序列的第二种核酸分子可操作地与所述第一种核酸分子连接，所述二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有至少大约85％的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
本发明还提供了包括双链RNAi构建体的植物，其中，第一启动子可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有至少大约85％的同一性：SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，，和任意一个的片段，其中具有第二种核酸序列的第二种核酸分子可操作地与dsRNAi构型的第二启动子连接，所述二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有至少大约85％的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
在本发明的一种实施方案中，选择性地降低了所述基因的一个家族成员的蛋白或转录物的表达水平，同时保持第二个家族成员的蛋白或转录物的水平部分不受影响。在本发明的优选实施方案中，选择性地降低了所述基因的一个家族成员的蛋白或转录物的表达水平，同时保持第二个家族成员的蛋白或转录物的水平基本上不受影响。在本发明的高度优选的实施方案中，选择性地降低了所述基因的一个家族成员的蛋白或转录物的表达水平，同时保持第二个家族成员的蛋白或转录物的水平实质性不受影响。
在特别优选的实施方案中，本发明的植物包括核酸序列，在所述序列表达时能够选择性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持至少一个其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响。在特别优选的实施方案中，本发明的植物包括核酸序列，在所述序列表达时能够选择性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持至少一个其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或转录物的水平基本上不受影响。在特别优选的实施方案中，本发明的植物包括核酸序列，在所述序列表达时能够选择性地降低所述植物中由某些FAD2和FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持至少一个其他FAD2或FAD3基因的蛋白和/或转录物的水平实质上不受影响。
在更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响。在更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平基本上不受影响。在更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平实质上不受影响。
在另一种更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少两个，三个或三个以上FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响。在另一种更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少两个，三个或三个以上FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平基本上不受影响。在另一种更特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在其表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少两个，三个或三个以上FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平实质上不受影响。
在优选实施方案中，本发明的大豆植物包括选自下组的外源核酸序列：FAD3内含子或它的片段，更优选选自下组的核酸分子：SEQ IDNOs：5-14，或它们的片段。
在特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在它表达时能够选降低所述植物中由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD3-1B基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响。在特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在它表达时能够降低所述植物中由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD3-1B基因的蛋白和/或转录物的水平基本上不受影响。在特别优选的实施方案中，本发明的大豆植物包括核酸序列，在它表达时能够降低所述植物中由FAD3-1C基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD3-1B基因的蛋白和/或转录物的水平实质上不受影响。
在核酸序列表达时能够选择性地降低植物中由FAD2-1基因和至少一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响、基本上不受影响、或实质上不受影响的实施方案中，优选的FAD2-1核酸序列选自下组：(1)在所述核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和它们的片段，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸分子杂交；(2)包括同样存在于大豆FAD2-1基因内含子中的序列的核酸分子，和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在核酸序列表达时能够选择性地降低植物中由FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平的实施方案中，优选的FAD3核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NOs：5-14，和它们的片段，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子杂交：SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，和SEQ ID NO：4；(2)包括同样存在于大豆FAD3基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子。
在优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：50％或以上的油酸，10％或以下的亚麻酸。在更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：60％或以上的油酸，7％或以下的亚麻酸。在特别优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：65％或以上的油酸，5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。在本文中，在植物或诸如种子的植物部分中的所有油的％组成是通过相对摩尔百分比确定的。
在另一种优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：50％-90％的油酸，和10％或以下的亚麻酸。在更优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：60％-80％的油酸，和7％或以下的亚麻酸。在特别优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：65％-75％的油酸，和5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。
在另一种优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：50％-90％的油酸，8％-16％的棕榈酸和10％或以下的亚麻酸。在一种更优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：60％-80％的油酸，6％-12％的棕榈酸和7％或以下的亚麻酸。在一种特别优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：65％-75％的油酸，8％-11％的棕榈酸和5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。
在一种特别优选的实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：65％-75％的油酸，和5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸，其中，在核酸序列表达时能够选择性地降低所述植物中由FAD2-1基因和至少一个FAD3基因编码的蛋白和/或转录物的表达水平，同时保持FAD2-2基因的蛋白和/或转录物的水平部分不受影响、基本上不受影响、或实质上不受影响，FAD2-1核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和它们的片段，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的核酸分子杂交；(2)包含同样存在于大豆FAD2-1基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸分子；并且所述FAD3核酸序列选自下组：(1)在核酸分子的整个长度上与选自下组的核苷酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％的序列同一性核酸序列：SEQ ID NOs：5-14，其中，所述核酸序列在严格条件下不能与具有选自下组的核苷酸序列的核酸分子杂交：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；(2)包含同样存在于大豆FAD3基因内含子中的序列的核酸分子；和(3)在核酸分子的整个长度上与(2)的核酸分子具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，98％，99％或100％的序列同一性核酸分子。
在另一种实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：80％或以上，更优选90％或以上的油酸，5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。
在优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：80％或以上，更优选90％或以上的油酸，5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸，其中，所述核酸序列能够减少FAD2-1，FAD2-2和至少一个FAD3基因的表达。在这一方面的特别优选的实施方案中，所述核酸序列选自下组：SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
在本发明的优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：50％或以上的油酸，更优选60％或以上，70％或以上，80％或以上，或90％或以上的油酸。
在本发明的另一种优选实施方案中，本发明大豆种子的油组成为：10％或以下的亚麻酸，更优选5％或以下，4％或以下，或3％或以下的亚麻酸。
还可以从诸如单子叶植物或双子叶植物的其他物种中获得类似的遗传物质，所述植物包括，但不局限于canola，玉米，大豆，拟南芥，菜豆，花生，苜蓿，小麦，水稻，燕麦，高粱，油菜籽，黑麦，大麦，粟，羊茅，多年生黑麦草，甘蔗，酸果蔓，番木瓜，香蕉，红花，油棕，亚麻，香瓜，苹果，黄瓜，石槲兰，剑兰，菊花，百合，棉花，桉树，向日葵，芸薹，油菜，草坪草，甜菜，咖啡和薯蓣(Christou，INO：Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants，Biotechnology Intelligence Unit.Academic Press，San Diego，California(1996))，优选canola，玉米，芸薹，油菜，油菜籽，大豆，海甘蓝，芥菜，蓖麻，花生，芝麻，棉籽，亚麻籽，红花，油棕，亚麻，和向日葵，更优选canola，油菜籽，玉米，芸薹，油菜，大豆，向日葵，红花，油棕，和花生。在更优选的实施方案中，将所述遗传物质转入canola.在另一种更优选的实施方案中，将所述遗传物质转入油菜。在另一种特别优选的实施方案中，将所述遗传物质转入大豆。
可以在诸如植物的整个生物体中提高或降低诸如转录物或蛋白的产物的含量，或局限在所述生物体的一个或多个特定的器官或组织。例如，可以提高或降低植物的一个或多个组织和器官中的产物的含量，包括，但不局限于根，块茎，干，叶，茎，果实，浆果，坚果，树皮，豆荚，种子和花。优选的器官是种子。
可以通过利用为此而设计的DNA载体或构建体将外源遗传物质转入宿主细胞。所述载体的设计属于本领域的公知技术(参见，PlantMolecular Biology：A Laboratory Manual，Clark(ed.)，Springer，New York(1997))。
构建体或载体可以包括植物启动子，以便表达所选择的核酸分子。在优选实施方案中，本文所披露的任何核酸分子都能可操作地连接在启动子区上，该启动子区能在植物细胞中起作用，导致mRNA分子的生产。例如，可以使用能够在植物细胞中起作用以导致mRNA分子生产的任何启动子，如，但不局限于本文所披露的启动子。在优选实施方案中，所述启动子是植物启动子。
在文献中业已披露了在植物细胞中有活性的多种启动子。这些启动子包括，但不局限于，胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：5745-5749(1987))，章鱼碱合成酶(OCS)启动子(它被携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上)，花椰菜花叶病毒启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9：315-324(1987))和CaMV 35S启动子(Odell等，Nature 313：810-812(1985))，玄参花叶病毒35S-启动子(美国专利号5,378,619)，来自核糖-1，5-二-磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子，Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628(1987))，蔗糖合成酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：4144-4148(1990))，R基因复合体启动子(Chandler等，The Plant Cell 1：1175-1183(1989))以及叶绿素a/b结合蛋白基因启动子。业已将所述启动子用于制备在植物中得到表达的DNA构建体；例如，参见，PCT公开号WO 84/02913。优选将CaMV 35S启动子用于植物。可以将已知的或发现能导致DNA在植物细胞中转录的启动子用于本发明。
特别优选的启动子还可用于在种子或果实中表达本发明的核酸分子。实际上，在优选实施方案中，所使用的启动子是种子特异型启动子。所述启动子的例子包括来自诸如以下基因的5′调控区，如napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991))，菜豆蛋白(Bustos等，Plant Cell，1(9)：839-853(1989))，大豆胰蛋白酶抑剂(Riggs等，Plant Cell 1(6)：609-621(1989))，ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.，22(2)：255-267(1993))，硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4)：167-176(1994))，大豆b-conglycinin的a′亚基(soy 7s，(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：8560-8564(1986)))，和油质蛋白(例如，参见Hong等，Plant Mol.Biol.，34(3)：549-555(1997))。其他例子包括β-conglycinin的启动子(Chen等，Dev.Genet.10：112-122(1989))和FAE启动子(PCT公开号WO 01/11061)。用于在种子中表达的优选启动子是7S和napin启动子。
可以使用的其他启动子披露于以下文献中，例如，美国专利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436。另外，可以使用组织特异性增强子(Fromm等，The Plant Cell1：977-984(1989))。
构建体或载体还可以在感兴趣的区域包括核酸序列，它能全面或部分起作用，以便终止所述区域的转录。业已分离了多种这样的序列，包括Tr7 3’序列和NOS 3’序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell1：671-680(1989)；Bevan等，Nucleic Acids Res.11：369-385(1983))。还可以在本发明的植物表达构建体上提供调控转录终止区。所述转录终止区可以由编码感兴趣的基因的DNA序列提供或者是源于不同基因来源的常见的转录终止区，例如，与所述转录起始区天然相关的转录终止区。本领域技术人员可以理解的是，能够终止植物细胞中的转录的任何常见的转录终止区都可用于本发明的构建体中。
载体或构建体还可以包括调控因子。调控因子的例子包括Adh内含子1(Callis等，Genes and Develop.1：1183-1200(1987))，蔗糖合成酶内含子(Vasil等，Plant Physiol.91：1575-1579(1989))和TMV ω因子(Gallie等，The Plant Cell1：301-311(1989))。如果需要，可以包括这些和其他调控因子。
载体或构建体还可以包括选择标记。还可以将选择标记用于选择包含所述外源遗传物质的植物或植物细胞。所述标记的例子包括，但不局限于：neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188(1985))，它编码卡那霉素抗性，并且可以利用卡那霉素，RptII，G418，hpt进行选择；bar基因，它编码bialaphos抗性；突变型EPSP合成酶基因(Hinchee等，Bio/Technology 6：915-922(1988)；Reynaerts等，Selectable and Screenable Markers.In Gelvin andSchilperoort.Plant Molecular Biology Manual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaerts等，Selectable and screenablemarkers.In Gelvin and Schilperoort.Plant Molecular BiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988))，aadA(Jones等，Mol.Gen.Genet.(1987))，)它编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，它能产生对溴苯腈的抗性(Stalker等，J.Biol.Chem.263：6310-6314(1988))；突变型乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它能赋予咪唑啉酮或磺脲抗性(欧洲专利申请54,204(Sept.11，1985))，ALS(D′Halluin等，Bio/Technology 10：309-314(1992))，和氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.263：12500-12508(1988))。
载体或构建体还可以包括筛选标记。可以用筛选标记监测表达。典型的筛选标记包括：β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，它们所编码的酶的各种生色底物是已知的(Jefferson，Plant Mol.Biol，Rep.5：387-405(1987)；Jefferson等，EMBO J.6：3901-3907(1987))；R-基因座基因，它编码的产物能调节花青甙色素(红色)在植物组织中的生产(Dellaporta等，Stadler Symposium 11：263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)75：3737-3741(1978))，编码它的各种生色底物是已知的酶的基因(例如，PADAC，生色的头孢菌素)；荧光素酶基因(Ow等，Science234：856-859(1986))；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：1101-1105(1983))，它编码邻苯二酚双加氧酶，它能转化生色的邻苯二酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，Bio/Technol.8：241-242(1990))；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714(1983))，它编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，后者又缩合成黑色素；α-半乳糖苷酶，它能转化生色的α-半乳糖底物。
术语“选择标记基因或筛选标记基因”还包括编码这样的可分泌标记的基因，它的分泌可以作为鉴定或选择转化的细胞的手段而进行检测。其例子包括编码可分泌的抗原的标记，所述抗原可以通过抗体相互作用鉴定，或者甚至是可分泌的酶，它可以通过催化方式检测。可分泌的蛋白可分成多种类型，包括小的，可扩散的蛋白，这些蛋白是可以检测的(例如，通过ELISA)，可以在细胞外溶液中检测的小的活性酶(例如，α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)，或被插入或限制在细胞壁中的蛋白(例如，包括前导序列的蛋白，如存在于延伸或烟草PR-S的表达单位中的蛋白)。其他可能的选择和/或筛选标记基因对本领域技术人员来说是显而易见的。
应当理解的是，可以用单个构建体将本发明的两种或两种以上核酸分子导入植物，并且，所述构建体可以包括一个以上启动子。在构建体被设计成表达两种核酸分子的实施方案中，优选的是，这两种启动子是(i)两种组成型启动子，(ii)两种种子特异性启动子，或(iii)一种组成型启动子和一种种子特异性启动子。优选的种子特异性和组成型启动子分别是napin和CaMV启动子。在实施例8中提供了典型的组合。应当理解的是，两种或两种以上的核酸分子可以利用单个启动子，优选种子特异性或组成型启动子物理连接和表达。
还应当理解的是，可以利用两种或两种以上不同的构建体将本发明的两种或两种以上的核酸导入植物。另外，可以将本发明的两种或两种以上的核酸导入两种不同的植物，并且可以让所述植物杂交，以便产生能表达两种或两种以上核酸的单一植物。在RNAi实施方案中，可以理解的是，可以利用一种构建体或两种构建体将有义和反义链导入同一种植物。另外，可以将所述有义和反义链导入两种不同的植物中，并且让两种植物杂交，以便产生能同时表达有义和反义链的单一植物。
能够以永久或瞬时方式将本发明的任意一种核酸分子和构建体导入植物或植物细胞。本发明的优选的核酸分子和构建体在上面的详细说明和实施例中进行了披露。本发明的另一种实施方案涉及生产转基因植物的方法，该方法总体上包括以下步骤：选择合适的植物或植物细胞，用重组载体转化所述植物或植物细胞，和获得转化过的宿主细胞。
在优选实施方案中，所述植物或植物细胞是或源于与生产用于食用和工业用途的植物油相关的植物。特别优选的是温带油籽作物。感兴趣的植物包括，但不局限于，油菜籽(canola和高芥酸品种)，玉米，大豆，海甘蓝，芥菜，蓖麻，花生，芝麻，棉花，亚麻籽，红花，油棕，亚麻，向日葵，和椰子。本发明同样可应用于单子叶或双子叶植物，并且可方便地应用于新的和/或改良的转化和调控技术。
用于将DNA导入植物细胞的方法和技术为本领域技术人员所熟知，并且，实际上可以将核酸分子导入细胞的任何方法都适用于本发明。合适方法的非限定性例子包括：化学方法，物理方法，如显微注射，电穿孔，基因枪，微粒轰击，和真空渗入；病毒载体；和受体介导的机制。还可以使用其他细胞转化方法，并且包括，但不局限于通过直接将DNA转入花粉，通过将DNA直接注射到植物的生殖器官，或通过将DNA直接注射到未成熟胚胎的细胞中然后使脱水的胚胎再水化等方法将DNA导入植物。
农杆菌介导的转移是用于将基因导入植物细胞的广泛采用的系统。例如，参见Fraley等，Bio/Technology 3：629-635(1985)；Rogers等，Methods Enzymol.153：253-277(1987)。要转移的DNA区域是通过边缘序列限定的，并且通常将干预DNA插入植物基因组。Spielmann等，Mol.Gen.Genet.205：34(1986)。现代的农杆菌转化载体是能够在大肠杆菌和农杆菌中复制的，可以进行方便的操作。Klee等，In：Plant DNA Infectious Agents，Hohn和Schell(eds.)，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)。
来自单一植物原生质体转化体或来自各种转化过的外植体的植物的再生，发育和培养为本领域所熟知。一般参见Maliga等，Methods inPlant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995)；Weissbach和Weissbach，In：Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，San Diego，CA(1988)。本发明的植物可以是育种程序的一部分或通过育种程序产生，并且还可以通过单性生殖繁殖。用于生产单性生殖的植物的方法为本领域所公知，例如，参见，美国专利5,811,636。
共抑制是表达水平的降低，通常是特定内源基因或基因家族的RNA水平上的降低，这是通过表达能转录与内源基因转录物具有相同链型的mRNA的同源有义构建体而完成的(Napoli等，Plant Cell 2：279-289(1990)；van der Krol等，Plant Cell 2：291-299(1990))。共抑制可以来自用单个拷贝的核酸分子进行的稳定转化，该核酸分子与存在于所述细胞中的核酸序列同源(Prolls and Meyer，Plant J.2：465-475(1992))或用多个拷贝的核酸分子转化所导致的，这些核酸分子与存在于细胞中的核酸序列同源(Mittlesten等，Mol.Gen.Genet.244：325-330(1994))。与同源启动子连接的多个基因，即使它们不同也能导致所连接基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III316：1471-1483(1993)；Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91：3490-3496(1994))；van Blokland等，Plant J.6：861-877(1994)；Jorgensen，Trends Biotechnol.8：340-344(1990)；Meins和Kunz，In：Gene Inactivation and Homologous Recombination inPlants，Paszkowski(ed.)，pp.335-348，Kluwer Academic，Netherlands(1994))(Kinney，Induced Mutations and MolecularTechniques for Crop Improvement，Proceedings of a Symposium19-23 June 1995(由IAEA和FA共同主办))，pages 101-113(IAEA-SM340-49)。
应当理解的是，可以将本发明的一种或多种核酸分子导入植物细胞，并且用合适的启动子转录，通过这种转录导致了内源蛋白的共抑制。所述核酸分子可操作地连接在多顺顺反子构型的相同启动子上或连接在不同启动子上。
反义方法是通过靶定所述遗传物质抑制或减弱基因功能的方法(Mol等，FEBS Lett.268：427-430(1990))。反义方法的目的是利用与靶基因互补的序列以阻断其表达，并且产生突变细胞系或生物体，其中，选择性地降低或消除了单一的所选择蛋白的水平。与其他‘反向遗传’方法相比，反义技术具有若干优点。可以通过选择反义基因的启动子或通过外部施加或显微注射定时操作失活的位点以及它的发展效果。反义可以操作其特异性，这是通过选择靶基因的独特区或与其他相关基因拥有同源性的区而实现的(Hiatt等，In：GeneticEngineering，Setlow(ed.)，Vol.11，New York：Plenum 49-63(1989))。
反义RNA技术包括将与目标mRNA互补的RNA导入细胞，由此产生了特殊的RNA：RNA双链体，它是通过反义底物和目标mRNA之间的碱基配对形成的(Green等，Annu.Rev.Biochem.55：569-597(1986))。在一种实施方案中，该方法包括反义基因序列的导入和表达。所述序列是这样的序列，其中，部分或所有正常基因序列受反向取向的启动子的控制，以便将‘错误的’或互补链转录成非编码反义RNA，该RNA能够与目标mRNA杂交，并且干扰它的表达(Takayama和Inouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25：155-184(1990))。通过标准方法构建反义载体，并且通过包括，但不局限于以下方法的方法导入细胞：转化，转染，电穿孔，显微注射，和感染。转化的类型和载体的选择决定了转染是瞬时的或稳定的。用于反义基因的启动子可以影响反义抑制的水平，时序，组织，特异性，或诱导性。
业已报导了还可以通过将双链RNA导入细胞而破坏内源基因的功能(Fire等，Nature 391：806-81(1998))。例如，业已在秀丽新杆线虫中证实了这种破坏，并且通常被称为RNA干扰，或RNAi(Fire等，Nature 391：806-811(1998))。业已报导了在秀丽新杆线虫通过双链RNA破坏基因表达能诱导通过转录后机制实现的抑制作用(Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：15502-15507(1998))。业已报导了有关植物的通过双链RNA实现基因沉默的证据(Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：13959-13964(1998))。
还报导了可以将内含子-剪接的发夹结构用于实现转录后基因抑制(Smith等，Nature 407：319-320(2000))。报导表明，转录后基因沉默可以用具有发卡结构的内含子-剪接的RNA以几乎100％的效率诱导(Smith等，Nature 407：319-320(2000))。
应当理解的是，本发明的一种或多种核酸可以修饰，以便实现RNAi或另一种模式的转录后基因抑制。
本发明还提供了植物的部分，特别是生殖或储存部分。植物部分包括，但不局限于种子，胚乳，胚珠，花粉，根，块茎，干，叶，茎，果实，浆果，坚果，树皮，豆荚，种子和花。在本发明的特别优选的实施方案中，所述植物部分是种子。
本发明还提供了超过10,000，更优选20,000，甚至更优选40,000粒种子的容器，其中，超过10％，更优选25％，更优选50％，甚至更优选75％或90％的种子是来自本发明植物的种子。
本发明还提供了超过10kg，更优选25kg，甚至更优选50kg种子的容器，其中，超过10％，更优选25％，更优选50％，甚至更优选75％或90％的种子是来自本发明植物的种子。
可以对本发明的任意的植物或其部分进行处理，以便进行加工，以便生产饲料，粗粉，蛋白，或油制剂。用于这一目的的特别优选的植物部分是种子。在优选实施方案中，所述饲料，粗粉，蛋白，或油制剂被设计成用于家畜动物或人类，或这两者。生产饲料，粗粉，蛋白，或油制剂的方法为本领域所公知。例如，参见美国专利4,957,748，5,100,679，5,219,596，5,936,069，6,005,076，6,146,669，和6,156,227。在优选实施方案中，所述蛋白制剂是高蛋白制剂。所述高蛋白制剂的蛋白含量优选大于5％w/v，更优选大于10％w/v，更优选大于15％w/v。在优选的油制剂中，所述油制剂是高油制剂，来自本发明植物或植物部分的含油量大于5％w/v，更优选大于10％w/v，更优选大于15％w/v。在优选实施方案中，所述油制剂是液体，并且它的体积大于1，5，10或50升。本发明提供了用本发明的植物生产的油或通过本发明的方法制备的油。这样的油可具有增强的氧化稳定性。另外，这样的油可以是所得到的任何产物的次要或主要成分。另外，所述油可以与其他油混合。在优选实施方案中，由本发明的植物生产的油或通过本发明的方法制备的油占任何产品的油成分体积或重量的0.5％，1％，5％，10％，25％，50％，75％或90％以上。在另一种实施方案中，所述油制剂可以是混合的，并且可以占该混合物体积的10％，25％，35％，50％或75％以上。用本发明植物生产的油可以与一种或多种有机溶剂或石油馏出物混合。
在一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：50％或以上的油酸，10％或以下的亚麻酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：60％或以上的油酸，7％或以下的亚麻酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：65％或以上的油酸，5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。
在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：50％-90％油酸，和10％或以下的亚麻酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：60％-80％油酸，和7％或以下的亚麻酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：65％-75％油酸，和5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。
在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：80％或以上，更优选90％或以上的油酸，5％或以下的亚麻酸，优选4％或以下的亚麻酸，更优选3％或以下的亚麻酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：50％或以上的油酸，更优选60％或以上，70％或以上，80％或以上，或90％或以上的油酸。在另一种实施方案中，本发明的油具有这样的油组成：10％或以下的亚麻酸，优选5％或以下，4％或以下，或3％或以下的亚麻酸。
本发明的植物可以是育种程序的一部分或通过育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖方式，要改良的性状的遗传力，以及商业应用的栽培品种的类型(例如F1杂交栽培品种，纯系栽培品种等)。下面提供了用于培育本发明植物的特定的，非限定性方法。可以利用有助于任何杂交后代选择的标记改善育种程序。还应当理解的是，任何商业或非商业的栽培品种都可以在育种程序中使用。本发明的植物可以是育种程序的一部分或通过育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖方式，要改良的性状的遗传力，以及商业应用的栽培品种的类型(例如F1杂交栽培品种，纯系栽培品种等)。下面提供了用于培育本发明植物的特定的，非限定性方法。可以利用有助于任何杂交后代选择的标记改善育种程序。还应当理解的是，任何商业或非商业的栽培品种都可以在育种程序中使用。
在育种的一种非限定例子中，可以将大豆FAD2-1A内含子抑制系用于对低亚麻酸大豆FAD3突变系授粉，该突变系来自自发突变，或来自，但不局限于以下方法，如基因组中定向诱导的局部损伤(TILLING)(McCallum等，Nature Biotech，18：455-457(2000))，通过RNA/DNA嵌合寡核苷酸进行的基因取代，同源重组，T-DNA或转座子诱变。来自包括一个或多个表达的FAD2内含子区和FAD3突变(包括剔除)的大豆种子的RNA可以用Northern印迹筛选(如实施例5所述)，以便确定FAD2-1，FAD2-2，FAD3-1A，FAD3-1C和FAD3-1B转录物的水平。预计所得到的植物具有两个亲本的性状。可以筛选具有不可检测的或低水平的FAD2或FAD3转录物的大豆植物的脂肪酸组成。
本发明的植物可以是育种程序的部分或通过育种程序产生。例如，将大豆FAD3-1A，FAD3-1B，和/或FAD3-1C内含子抑制系用于对具有较高含量的油酸的大豆植物授粉，该大豆植物包括FAD2突变系，该突变系来自自发突变，或来自非限定性方法，例如，TILLING，通过RNA/DNA嵌合寡核苷酸进行的基因取代，同源重组，T-DNA或转座子诱变。来自包括一个或多个表达的FAD3内含子区和FAD2突变(包括剔除)的大豆种子的RNA可以通过Northern印迹筛选(如实施例5所述)，以便确定FAD2-1，FAD2-2，FAD3-1A，FAD3-1B，和FAD3-1C转录物的水平。可以筛选具有不可检测的或低水平的FAD2或FAD3转录物的大豆植物的脂肪酸组成。预计所得到的植物具有两个亲本的性状。
新的栽培品种的培育需要品种的发育和选择，所述品种的杂交，以及优良杂交体的选择。杂交种子可以通过特定雄性可育亲本之间的手工杂交生产或通过使用雄性不育系统生产。针对某些单一的基因性状选择杂交体，如豆荚颜色，花的颜色，种子产量，柔毛颜色，或除草剂抗性，这些性状表明了所述种子确实是杂交体。有关亲本系的其他资料以及杂交体的表型影响育种者做出是否继续进行特定杂交的决定。例如，所述杂交体生产中的亲本可以是大豆FAD2-1A内含子抑制系，大豆FAD3-1A，FAD3-1B和/或FAD3-1C内含子抑制系或包括FAD2-1A，FAD3-1A，FAD3-1B和/或FAD3-1C的任意所需组合的内含子抑制系。例如，上述亲本中的任意一个可以与具有提高的油酸水平和/或降低的亚麻酸水平的任何天然存在的或人工产生的突变系杂交。
业已利用回交育种将诸如转基因的编码简单遗传的，高度可遗传性状的基因转入作为轮回亲本的理想的纯合栽培品种或自交系。被转移的性状来源被称为供体亲本。预计所得到的植物具有轮回亲本(例如栽培品种)的性状和从供体亲本转移来的需要的性状。在所述初步杂交之后，选择具有所述供体亲本性状的个体，并且与所述轮回亲本重复杂交(回交)。预计所得到的亲本具有轮回亲本(例如栽培品种)的性状和从供体亲本中转移来的需要的性状。在所述回交生产中的供体亲本可以是，例如，大豆FAD2-1A内含子抑制系或大豆FAD3-1A，FAD3-1B和/或FAD3-1C内含子抑制系或包括以任意所需方式组合的FAD2-1A，FAD3-1A，FAD3-1B和/或FAD3-1C的内含子抑制系。例如，所述轮回亲本可以是具有提高的油酸和/或降低的亚麻酸水平的天然存在的或人工生产的突变系。
计算机可读的介质
在SEQ ID NO：1-15，18，19，22，23中提供的核苷酸序列，或它们的片段或它们的互补序列，或与在SEQ ID NO：1-15，18，19，22，23中提供的核苷酸序列，或它们的片段或它们的互补序列至少50％，60％，或70％相同，优选80％，85％相同，或特别优选90％，或95％相同，或特别高度优选97％，98％，或99％相同的核苷酸序列，可以在多种介质中“提供”以便于利用。所述介质还能够以允许技术人员检查所述序列的形式的亚型提供。
在本实施方案的一种用途中，本发明的核苷酸序列可以记录在计算机可读的介质上。在本文中，“计算机可读的介质”表示可以通过计算机直接读取或进入的任何介质。所述介质包括，但不局限于磁存储介质，如软盘，硬盘，存储介质，和磁带；光存储介质，如CD-ROM；电储存介质，如RAM和ROM；以及上述储存类型的组合，如磁/光存储介质。技术人员能够很容易理解如何将目前已知的计算机可读的介质用于生产在它上面记录了包含本发明的核苷酸序列的计算机可读介质的制品。
在本文中，“记录”表示将信息储存在计算机可读的介质上的过程。技术人员可以对任何目前已知的用于将信息记录在计算机可读介质上的方法进行改良，以便生产包括本发明的核苷酸信息的介质。技术人员可以获得多种数据保存结构，用于生产在它上面记录了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质。数据保存结构的选择通常基于被选择用于获取保存的信息的方式。另外，可以将多种数据处理程序和格式用于将本发明的核苷酸序列信息保存在计算机可读的介质中。所述序列信息能够以word处理的文本文件形式存在，以商业化的软件形式格式化，如WordPerfect和Microsoft Word，或以ASCII文件形式存在，保存在数据库应用中，如DB2，Sybase或Oracle等。技术人员可以方便地改良多种数据处理结构格式中的任意一种(例如文本文件或数据库)以便获得在它上面记录了本发明核苷酸序列信息的计算机可读的介质。
通过提供本发明的一种或多种核苷酸序列，技术人员可以正常获得所述序列信息，用于多种目的。计算机软件可通过公开渠道获得，这使得技术人员能够获取在计算机可读的介质上提供的序列信息。在Sybase系统上采用了实施BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和BLAZE(Brutlag等，Comp.Chem.17：203-207(1993))检索算法的软件可用于鉴定基因组中的非编码区和其他本发明的核酸分子，该基因组包括与来自其他生物体的非-编码区的同源性。可以将所述非编码区用于影响在商业上有重要价值的蛋白的表达，如用于氨基酸生物合成，代谢，转录，翻译，RNA加工，核酸和蛋白降解，蛋白修饰，和DNA复制，限制，修饰，重组，和修复的酶。
本发明还提供了系统，特别是基于计算机的系统，所述系统包括本文所披露的序列信息。将所述系统设计成能鉴定有重要商业价值的本发明的核酸分子的片段。在本文中，“基于计算机的系统”表示硬件装置，软件装置，以及用于分析本发明的核苷酸序列信息的数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最低硬件装置包括中央处理器(CPU)，输入装置，输出装置，和数据存储装置。技术人员很容易理解的是，现有的基于计算机的系统中的任意一种都适用于本发明。
正如本文所指出的是，本发明的基于计算机的系统包括在它上面保存了本发明的核苷酸序列的数据存储装置，以及必需的硬件装置和用于支持和执行检索装置的软件装置。在本文中，“数据存储工具”表示可以保存本发明的核苷酸序列信息的存储器，或存储器存取工具，它可以存取在它上面记录了本发明的核苷酸序列信息的产品。在本文中，“检索工具”表示在基于计算机的系统上执行，以便将目标序列或目标结构基序与保存在所述数据存储工具上的序列信息进行比较的一种或多种程序。利用检索工具鉴定与特定的目标序列或目标基序匹配的本发明序列的片段或区。公开了多种已知的算法，并且有多种商业化的用于执行检索工具的软件可以获得，并且可用于本发明的基于计算机的系统中。所述软件的例子包括，但不局限于，Macpattern(EMBL)，BLASTIN，和BLASTIX(NCBIA)。可以对用于进行同源性检索的算法或执行软件包之一进行改进，以便用于本发明的基于计算机的系统。
靶序列的最优选的序列长度为大约10-100个氨基酸，或大约30-300个核苷酸残基。不过，众所周知的是，在检索商业上具有重要价值的本发明的核酸分子的片段，如与基因表达和蛋白加工相关的序列片段期间，所述目标序列可以具有更短的长度。
在本文中，“目标结构基序”或“目标基序”表示任何合理选择的序列或序列的组合，其中，所述序列是根据在目标基序折叠时形成的三维构型选择的。本领域有多种已知的目标基序。蛋白目标基序包括，但不局限于酶活性位点和信号序列。核酸目标基序包括，但不局限于启动子序列，顺式因子，发卡结构，以及诱导型表达因子(蛋白结合序列)。
因此，本发明还提供了用于接收目标序列的输入装置，用于保存按上述方法用检索工具鉴定的本发明序列的目标序列的数据存储装置，以及用于输出鉴定的同源序列的输出装置。所述输入和输出装置的多种结构格式可用于在本发明的基于计算机的系统中输入和输出信息。输出装置的优选格式通过改变与目标序列或目标基序的同源性程度对本发明的序列片段进行分级。这种方法为技术人员提供了序列分级，这些序列包括各种数量的目标序列或目标基序，并且鉴定在所鉴定的片段中所包含的同源性程度。
可以将多种比较工具用于比较目标序列或目标基序和数据存储装置，以便鉴定本发明的序列片段序列。例如，可以使用采用了BLAST和BLAZE算法的执行软件(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))，以便鉴定本发明的核酸分子内的非编码区。技术人员很好理解的是可以将能公开获得的同源检索程序中的任意一种用作本发明基于计算机的系统的检索工具。
以下实施例是说明性质的，并非要以任何方式限定本发明。
实施例
实施例1 去饱和酶基因组序列克隆
1A.大豆Δ12去饱和酶(FAD2-1)
通过利用大豆FAD2-1 cDNA探针筛选大豆基因组文库，鉴定大豆FAD2-1A序列。鉴定了三个推测的大豆FAD2-1克隆，并且进行噬斑纯化。将这三个大豆FAD2-1克隆中的两个连接到pBluescript II KS+(Stratagene)上，并且测序。两个基因组克隆(14-1和11-12)是相同的，并且与大豆FAD2-1 cDNA中的相应的序列完全匹配。在SEQ ID NO：15中提供了完整的FAD2-1A克隆的序列。
在获得全长的克隆之前，使用根据5’非翻译序列(引物12506，5’-ATACAA GCCACTAGGCAT-3’，SEQ ID NO：16)和cDNA内(引物11698：5’-GATTGGCCATGCAATGAGGGAAAAGG-3’，SEQ ID NO：17)设计的PCR引物对FAD2-1A基因组克隆的一部分进行PCR扩增。将所得到的PCR产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA.)中，并且测序。通过使用Macvector中的Pustell比较程序与大豆cDNA序列进行比较，鉴定具有内含子区(SEQ ID NO：1)的大豆FAD2-1A部分基因组克隆(SEQ ID NO：18)。所述FAD2-1A内含子序列(SEQ ID NO：1)始于ATG起始密码子之后，并且具有420个碱基的长度。
同样鉴定并且克隆了第二个FAD2-1基因家族成员，并且在本文中被称为FAD2-1B。通过利用Macvector中的Pustell比较程序与大豆cDNA序列进行比较，鉴定了编码区(碱基对1783-1785和2191-2463)和内含子区(碱基对1786-2190)的大豆FAD2-1B部分基因组克隆(SEQ ID NO：19)。FAD2-1B内含子序列(SEQ ID NO：2)始于ATG起始密码子之后，并且具有405个碱基的长度。FAD2-1B部分基因组克隆(SEQ ID NO：19)上的其他区包括启动子(碱基对1-1704)(SEQ ID NO：22)和5’UTR(碱基对1705-1782)。
1B.大豆Δ15去饱和酶(FAD3)
部分大豆FAD3-1A基因组序列是利用大豆DNA进行PCR扩增的，使用了引物10632，5’-CUACUACUACUACTCGAGACAAAGCCTTTAGCCTATG-3’(SEQ ID NO：20)，和10633：5’-CAUCAUCAUCAUGGATCCCATGTCTCTCTATGCAAG-3’(SEQ ID NO：21)。按照生产商的指导使用了Expand Long Template PCR系统(Roche AppliedSciences，Indianapolis)。将所得到的PCR产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen)中，并且测序。通过利用Macvector中的Pustell程序与大豆FAD3-1A cDNA序列进行比较，证实了大豆FAD3-1A部分基因组克隆序列(SEQ ID NO：23)和内含子区。
从鉴定的部分基因组大豆FAD3-1A序列(SEQ ID NO：23)中鉴定了七个内含子：FAD3-1A内含子#1(SEQ ID NO：5)，FAD3-1A内含子#2(SEQID NO：6)，FAD3-1A内含子#3A(SEQ ID NO：7)，FAD3-1A内含子#4(SEQID NO：8)，FAD3-1A内含子#5(SEQ ID NO：9)，FAD3-1A内含子#3B(SEQID NO：10)，和FAD3-1A内含子#3C(SEQ ID NO：11)。FAD3-1A内含子#1的长度为191个碱基对，并且位于294和484号位置之间，FAD3-1A内含子#2的长度为346个碱基对，并且位于577和922号位置之间，FAD3-1A内含子#3A的长度为142个碱基对，并且位于991和1132号位置之间，FAD3-1A内含子#3B的长度为98个碱基对，并且位于1224和1321号位置之间，FAD3-1A内含子#3C的长度为115个碱基对，并且位于1509和1623号位置之间，FAD3-1A内含子#4的长度为1228个碱基对，并且位于1707和2934号位置之间，而FAD3-1A内含子#5的长度为625个碱基对，并且位于3075和3699号位置之间。
用大豆DNA对部分大豆FAD3-1B基因组序列进行PCR扩增，使用了引物19386，5’-GGTAACAGAGAAAGAAACATTTGAGC-3’和19369：5’-GCATGCTAACAAAAGTAAGTGC-3’。按照生产商的指导使用了Expand LongTemplate PCR系统(Roche Applied Sciences，Indianapolis)。将所得到的PCR产物克隆到载体pCR 2.1 TOPO(Invitrogen)上，并且测序。通过利用Sequencher中的Pustell程序与大豆FAD3-1B cDNA序列进行比较，证实了大豆FAD3-1B部分基因组克隆序列和内含子区。从所鉴定的部分基因组大豆FAD3-1B序列中，鉴定了七个内含子：FAD3-1B内含子#1，FAD3-1B内含子#2，FAD3-1B内含子#3A，FAD3-1B内含子#4(SEQ ID NO：13)，FAD3-1B内含子#5，FAD3-1B内含子#3B，和FAD3-1B内含子#3C(SEQ ID NO：12)。
实施例2 表达构建体
2A.pCGN5468，pCGN5469，pCGN5471，pCGN5485和pCGN5486的构建
通过PCR扩增FAD2-1A内含子序列(SEQ ID NO：1)，用FAD2-1A部分基因组克隆(SEQ ID NO：18)作模板，并且使用了引物12701(5’-ACGAATTCCTCGAGGTAAA TTAAATTGTGCCTGC-3’(SEQ ID NO：24))和12702(5’-GCGAGATCTATCG  ATCTGTGTCAAAGTATAAAC-3’(SEQ IDNO：25))。将所得到的扩增产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen)上，并且测序。然后将FAD2-1A内含子沿有义和反义方向克隆到表达盒pCGN3892。载体pCGN3892包括大豆7S启动子和豌豆rbcS 3’。然后将两种基因融合体分别连接到pCGN9372上，它是一种包括由FMV启动子调控的CP4基因的载体。将所得到的表达构建体(pCGN5469有义(图2)和pCGN5471反义(图3))用于转化大豆，使用下面所披露的biolistic方法。
通过PCR扩增FAD2-1B内含子序列(SEQ ID NO：2)，用FAD2-1B部分基因组克隆(SEQ ID NO：19)作模板，并且使用引物13883(5’-GCGATCGATGTATGATGCTAAATTAAATTGTGCCTG-3’(SEQ ID NO：28))和13876(5’-GCGGAATTCCTGTGTCAAAGTATAAAGAAG-3’(SEQ ID NO：29))。将所得到的扩增产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen)上，并且测序。将FAD2-1B内含子分别沿有义或反义方向融合到质粒pCGN5468(图1)(包括与FAD2-1A内含子(有义)融合的大豆7S启动子和豌豆rbcS 3’)或pCGN5470(包括与FAD2-1A内含子(反义)融合的大豆7S启动子和豌豆RBCS 3’)中的FAD2-1A内含子的3’末端。然后将所得到的内含子组合融合体分别连接到pCGN9372上，它是一种包括受FMV启动子调控的CP4基因的载体。将所得到的表达构建体(pCGN5485(图4)，FAD2-1A & FAD2-1B内含子有义；和pCGN5486(图5)，FAD2-1A & FAD2-1B内含子反义)用于转化大豆，使用下文所披露的biolistic方法。
2B.FAD3-1A内含子的PCR扩增
对从大豆FAD3-1A基因组克隆中鉴定的七个内含子中的四个进行PCR扩增，用FAD3-1A部分基因组克隆作模板，并且使用以下引物：FAD3-1A内含子#1，引物12568：5’-GATCGATGCCCGGGGTAATAATTTTTGTGT-3’(SEQ ID NO：30)和12569：5’-CACGCCTCGAGTGTTCAATTCAATCAATG-3’(SEQ ID NO：31)；FAD3-1A内含子#2，引物12514：5’-CACTCGAGTTAGTTCATACTGGCT-3’(SEQ IDNO：32)和12515：5’-CGCATCGATTGCAAAATCCATCAAA-3’(SEQ IDNO：33)；FAD3-1A内含子#4，引物10926：5’-CUACUACUACUACTCGAGCGTAAATAGTGGGTGAACAC-3’(SEQ ID NO：34)和10927：5’-CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3’(SEQID  NO：35)；FAD3-1A内含子#5，引物10928：5’-CUACUACUACUACTCGAGGCGCGT ACATTTTATTGCTTA-3’(SEQ ID NO：36)和10929：5’-CAUCAUCAUCAUCT CGAGGAATTCTGCAGTGAATCCAAATG-3’(SEQ ID NO：37)。将所得到的每一个内含子的PCR产物克隆到载体pCR2.1(Invitrogen)中，并且测序。
2C.pCGN5455，pCGN5459，pCGN5456，pCGN5460，pCGN5466，和pCGN5473的构建
分别沿有义或反义方向将FAD3-1A内含子#1，#2，#4和#5连接到pCGN3892上。pCGN3892包括大豆7S启动子和豌豆RBCS 3’。将所述融合体连接到pCGN9372中，它是一种包括受FMV启动子调控的CP4基因的载体，用于转入大豆。将所得到的表达构建体(pCGN5455(图12)，FAD3-1A内含子#4有义；pCGN5459(图13)，包括FAD3-1A内含子#4反义；pCGN5456，FAD3内含子#5有义；pCGN5460，FAD3-1A内含子#5反义；pCGN5466(图7)，包括FAD3-1A内含子#2反义；pCGN5473(图9)，包括FAD3-1A内含子#1反义)用于转化大豆，使用下文所披露的biolistic方法。
还利用第二个FAD3基因家族成员(FAD3-1B)对内含子#3C和#4进行了PCR扩增。用大豆DNA对大豆FAD3-1B内含子#3C和#4进行PCR扩增，使用了以下引物，5’CATGCTTTCTGTGCTTCTC 3’(SEQ ID NO：26)和5’GTTGATCCAACCATAGTCG 3’(SEQ ID NO：27)。将所得到的PCR产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen)中，并且测序。在SEQ ID NOs：12和13分别提供了FAD3-1B内含子#3C和#4的序列。
对来自三个大豆FAD3基因家族成员FAD3-1A，FAD3-1B和FAD3-1C的内含子#4进行PCR扩增。对来自FAD3-1A基因的内含子#4进行PCR扩增，用FAD3-1A部分基因组克隆作模板，并且使用引物10926：5’-CUACUACUACUACTCGAGCGTAAATAGTGGGTGAACAC-3’(SEQ ID NO：34)和10927：5’-CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3’(SEQ ID NO：35)。对来自FAD3-1B基因的内含子#4进行PCR扩增，用大豆基因组DNA作模板，并且使用引物#17823：GTATCCCATTTAACAC和#17824：CTGTGAAATTACATATAG。对来自FAD3-1C基因的内含子#4进行PCR扩增，用大豆基因组DNA作模板，并且使用引物#17826：GCGCCGCTCGAGCTGTCCATTTTTGTACAC和#17825：CCGGCGCTCGAGGTAACAAAAATAAATAGAAAATAGTGAGTG。将所得到的每一个内含子的PCR产物克隆到载体pCR 2.1(Invitrogen)中，并且测序。将FAD3-1A内含子，#4沿有义方向连接到pCGN3892中。所得到的表达盒pCGN5453包括与FAD3-1A内含子#4融合的7Sα’启动子和豌豆RBCS3’。
2D.pMON68521的构建
为了构建pMON68521(图10)，用EcoRI消化pCGN5453(与FAD3-1A内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)和KWHIT 032858(包括FAD3-1B内含子#4的PCR2.1)，并且连接在一起，以便形成KWHIT03004(与FAD3-1A内含子#4和FAD3-1B内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)。用XhoI消化KWHIT03004，并且用EcoRI消化KAWHIT032980(PCR2.1中的FAD3-1C内含子#4)，并且将这两种消化质粒的末端补平，并且随后连接。所得到的质粒是KAWHIT030005(与FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，和FAD3-1B内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)。用SacI消化KAWHIT030005，并且用T4聚合酶的Klenow片段将它的末端补平，以便产生平端。用EcoRI消化pCGN5468(图1，包括与FAD2-1A内含子融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)，并且用T4聚合酶的Klenow片段补平它的末端，以便形成平端。将KAWHIT030005和pCGN5468的平端连接在一起，以便形成KWHIT03001(与FAD2-1A内含子，FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，FAD3-1C内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS3’)。用NotI消化KWHIT03001和pMON70276(FMV-EF-1/CP4)，将它们连接在一起，形成pMON68521(图10，与FAD2-1A内含子，FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，FAD3-1C内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’和FMV-EF-1/CP4，具有豌豆RBCS 3’)。将pMON68521转化入根癌土壤杆菌的ABI菌株，并且共培养到大豆中。
2E.pMON68519的构建
在构建质粒pMON68519(图11)时，用EcoRI消化pCGN5453(包括与FAD3-1A内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)和KWHIT032858(包括FAD1B内含子#4的pCR2.1)，并且连接在一起，以便形成KWHIT03004(包括与FAD3-1A内含子#4和FAD3-1B内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)。用XhoI消化KWHIT03004，并且用EcoRI消化KAWHIT032980(包括PCR2.1中的FAD3-1C内含子#4)。将这两种消化过的质粒的末端补平，并且随后将所述质粒连接在一起。所得到的质粒被称为KAWHIT030005(包括与FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，和FAD3-1B内含子#4融合的7Sα’启动子，具有豌豆RBCS 3’)。用SacI消化KAWHIT030005，然后用T4聚合酶的Klenow片段处理所述DNA，以便产生平端。用XhoI消化pCGN7770(包括Napin启动子和Napin 3’)，并且用T4聚合酶的Klenow片段补平末端。将质粒KAWHIT030005和pCGN7770的平端连接在一起，以便形成KWHIT03007(包括与FAD2-1A内含子，the FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，FAD3-1C内含子#4融合的Napin启动子，具有Napin 3’)。
然后用NotI消化KWHIT03007，并且用T4聚合酶的Klenow片段补平末端，形成平端。将与FAD2-1A内含子，FAD3-1A内含子#4，FAD3-1B内含子#4，FAD3-1C内含子#4融合的具有Napin 3’的Napin启动子(KWHIT03007)的平端连接于用EcoRV消化过的pMON68504。pMON68504包括与2 tDNA载体pMON41162内的7s A’启动子融合的大豆FAD2-1A内含子，所述载体包括受FMV启动子调控的CP4基因，具有豌豆RBCS3’。KWHIT03007和pMON6850之间的平端连接得到了质粒pMON68519。将pMON68519转化入根癌土壤杆菌的ABI菌株，并且共培养到大豆中。
实施例3 植物转化和分析
将包括用于有义和反义抑制Δ12和Δ15去饱和酶基因的表达构建体的线性DNA片段稳定地导入大豆(Asgrow品种A3244或A4922A32)，这是通过使用McCabe等的粒子轰击方法(1988)，Bio/Technology，6：923-926，或通过与根癌土壤杆菌菌株ABI(Martinell，美国专利号6,384,310)共培养而完成的。通过在含有草甘膦的培养基上选择而鉴定转化的大豆植物。
通过气相层析分析来自用所述内含子表达构建体转化的大豆品系的种子的脂肪酸组成。R1合并种子和R1单种子的油组成表明了与来自非转化大豆的种子相比，来自转基因大豆品系的种子的油的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的组成发生了改变。表I，II，和III提供了用所述构建体获得的结果的概况。以上数据表明，去饱和酶基因的非-编码区的有义和反义表达导致了脂肪酸组成的改变。所述数据还表明，可以将内含子用于获得多种具有改变了的脂肪酸组成的品系。可以根据需要的相对脂肪酸组成用所述品系进行选择。由于每一个内含子能够以不同的程度改变每一种脂肪酸的含量，可以理解的是，能够根据需要的组成使用内含子的组合。
                                             表I
油酸 亚油酸 亚麻酸
FAD2 取向 事件
野生型(对照) 5469-5 null R1合并物10粒种子的平均值5469-27 null R1合并物A49225471-13 null R1合并物10粒种子的平均值A4922 18.15％13.89％19.15％15.75％17.02％13.86％14.95％ 55.59％55.89％54.62％56.1％56.49％56.14％55.95％ 7.97％9.067％9.32％8.75％9.08％9.49％9.07％
全长cDNA(对照) 有义 5462-133 R1合并物最佳5462-133 R1种子 84％84％ 2.17％0.59％ 1.55％1.76％
油酸 亚油酸 亚麻酸
FAD2 取向 事件
内含子1 有义 5469-6 R1合并物5469-8 R1合并物最佳5469-6 R1种子最佳5469-8 R1种子5469-14 R1合并物5469-20 R1合并物5469-22 R1合并物最佳5469-14 R1种子5485-3 R1合并物5485-53 R1合并物 29.93％36.5％44.41％41.26％61.06％48.89％80％62.21％63.54％47.58％ 46.53％42.11％29.34％33.16％16.42％31.61％2.97％11.97％14.09％27.64％ 5.98％6.68％5.74％7.75％4.89％4.78％8.81％7.32％7.81％
反义 5471-8 R1合并物5471-2 R1合并物5471-26 R1合并物最佳5471-8 R1种子最佳5471-2 R1种子最佳5471-26 R1种子5486-33 R1合并物5486-12 R1合并物5486-40 R1合并物 31.05％27.98％32.66％57.4％28.08％43.3％32.37％27.32％26.79％ 43.62％48.88％44.54％23.37％46.14％34.15％43.66％46.97％48.72％ 7.07％6.83％6.76％5.73％6.52％5.6％6.87％6.4％6.55％
FAD3
野生型(对照) 5473-7null R1合并物A4922 R1合并物 15.65％19.84％ 56.74％56.79％ 9.55％7.48％
全长cDNA(对照) 有义 5464-50 R1合并物最佳5464-50 R1种子 18.06％17.08％ 62.03％62.44％ 2.75％1.72％
内含子1 反义 5473-8 R1合并物5473-1 R1合并物 33.47％33.34％ 45.97％42.67％ 5.54％7.59％
内含子2 反义 5466-20 R1合并物5466-16 R1合并物 28.43％27.61％ 48.83％49.92％ 6.37％5.96％
内含子4 有义 5455-19 R1合并物5455-10 R1合并物5455-57 R1合并物5455-76 R1合并物5455-107 R1合并物最佳5455-57 R1种子最佳5455-76 R1种子最佳5455-107 R1种子 40.35％35.14％38.04％37.24％36.44％45.36％35.3％45.56％ 39.97％43.59％42.44％42.42％42.72％35.55％43.54％34.85％ 4.61％5.53％5.24％5.37％5.62％4.92％5.53％5.12％
反义 5459-2 R1合并物5459-6 R1合并物5459-20 R1合并物最佳5459-2 R1种子最佳5459-6 R1种子最佳5459-20 R1种子 34.5％33.78％28.26％61.45％53.51％30％ 43.87％44.12％49.48％23.45％29.68％50.55％ 5.59％5.62％5.5％3.38％3.53％4.15％
内含子5 有义 5456-38 R1合并物5456-62 R1合并物最佳5456-62 R1种子 28.23％28.94％29.5％ 49.59％48.66％43.69％ 6.74％6.25％5.4％
反义 5460-9 R1合并物5460-21 R1合并物最佳5460-21 R1种子 29.78％28.37％35.18％ 48.57％49.79％40.52％ 5.54％5.54％5.33％
表II 含有pMON68521的种子的油组成数据
R1单种子数据
构建体             菌株ID       16:0  18:0   18:1 18:2    18:3
PMON68521          GM_A32162    12.0  3.4    42.8 35.5    5.3
PMON68521          GM_A32162    11.5  2.6    39.4 40.0    5.2
PMON68521          GM_A31619    10.4  2.8    39.1 40.4    5.8
PMON68521          GM_A32162    11.9  2.6    36.7 41.9    5.8
PMON68521          GM_A32162    12.2  2.5    34.9 43.0    6.3
PMON68521          GM_A32162    13.0  2.8    30.4 46.6    6.0
PMON68521          GM_A31610    12.4  1.9    28.3 49.8    7.1
PMON68521          GM_A32162    11.9  2.9    26.5 51.6    6.1
PMON68521          GM_A31792    13.2  3.3    25.3 50.2    7.2
PMON68521          GM_A31395    12.5  3.7    25.1 50.2    6.7
PMON68521          GM_A31393    13.1  3.5    24.1 51.9    5.6
PMON68521          GM_A31615    14.0  2.2    24.0 52.5    6.7
PMON68521          GM_A32209    12.5  3.5    23.7 51.5    7.6
PMON68521          GM_A31612    11.8  3.0    23.7 51.1    9.5
PMON68521          GM_A32209    12.6  3.3    23.6 52.2    7.2
PMON68521          GM_A32209    12.4  3.2    23.0 53.1    7.2
PMON68521          GM_A31489    12.3  3.2    22.5 54.0    6.9
PMON68521          GM_A32252    12.7  4.4    22.3 52.4    7.1
PMON68521          GM_A32162    12.6  3.1    22.2 54.9    6.2
PMON68521          GM_A32089    13.5  3.2    22.2 52.4    7.9
PMON68521          GM_A31393    12.6  4.3    22.2 53.0    5.7
PMON68521          GM_A31610    12.5  2.7    21.8 55.5    6.9
PMON68521          GM_A31610    12.6  2.4    21.7 55.8    6.9
PMON68521          GM_A31656    12.7  3.6    21.6 53.2    8.0
PMON68521          GM_A31612    12.3  3.6    21.6 54.0    7.2
PMON68521          GM_A31610    13.2  2.6    21.0 56.2    6.5
PMON68521          GM_A31604    13.5  3.1    20.4 55.3    7.0
PMON68521          GM_A31610    13.2  2.6    20.4 56.7    6.4
PMON68521          GM_A31489    12.8  3.1    20.1 55.5    7.1
PMON68521          GM_A31525    12.2  3.0    20.1 57.2    6.3
A3244                           13.9  4.1    15.8 56.3    9.0
A3244                           13.7  4.1    14.2 57.6    9.3
A3244                           13.6  4.3    14.1 57.4    9.7
A3244                           13.9  4.1    14.1 56.9    10.0
A3244                           13.8  4.4    13.6 57.6    9.8
A3244                           14.2  4.8    13.6 56.8    9.5
A3244                           14.2  4.3    13.2 56.5    10.8
A3244                           14.0  4.2    13.1 57.0    10.6
A3244                           14.0  4.5    12.9 57.3    10.3
表III 含有pMON68519种子的油组成数据
R1单种子数据
构建体         菌株ID       16:0 18:0  18:1 18:2 18:3
PMON68519      GM_A29911    13.0 4.8   40.7 34.4 5.2
PMON68519      GM_A29911    12.3 3.8   38.8 37.5 5.8
PMON68519      GM_A29911    12.3 3.3   34.0 42.6 6.5
PMON68519      GM_A32856    12.9 3.5   33.6 42.2 6.5
PMON68519      GM_A32856    12.6 3.1   33.3 43.4 6.4
PMON68519      GM_A32856    13.0 3.1   31.3 45.4 6.1
PMON68519      GM_A32856    12.7 3.2   28.9 47.3 6.6
PMON68519      GM_A29911    12.9 4.0   28.7 46.5 6.7
PMON68519      GM_A29911    12.2 3.1   28.1 47.4 6.8
PMON68519      GM_A32856    13.3 3.2   26.5 48.7 7.1
PMON68519      GM_A32856    13.2 3.2   26.5 49.3 6.8
PMON68519      GM_A29911    13.1 3.2   26.1 49.4 7.1
PMON68519      GM_A32856    13.2 3.6   25.9 48.9 7.1
PMON68519      GM_A32857    13.3 3.1   23.3 52.2 7.4
PMON68519      GM_A29911    12.8 3.5   23.3 52.5 6.6
PMON68519      GM_A29911    12.6 3.1   21.4 51.9 9.0
PMON68519      GM_A29911    13.4 3.6   20.1 53.6 7.9
A3244                       13.2 4.3   16.5 55.7 9.7
A3244                       13.5 3.2   16.3 56.8 9.2
A3244                       13.7 3.4   15.4 57.7 9.2
A3244                       13.9 3.3   15.1 57.9 9.1
A3244                       13.8 3.6   14.3 58.3 9.2
A3244                       13.5 3.4   13.6 58.2 10.4
A3244                       13.5 3.9   12.5 58.4 11.2
A3244                       14.6 3.8   12.1 58.2 10.8
A3244                       14.5 3.9   11.8 57.8 11.4
实施例4
通过与根癌土壤杆菌菌株ABI共培养(Martinell，美国专利号6,384,301)或通过McCabe等的粒子轰击方法(1988)，Bio/Technology，6：923-926将包括抑制Δ12和Δ15去饱和酶基因的dsRNAi构建体的线性DNA片段稳定地导入大豆(Asgrow品种A3244或A4922A32)。导入的构建体包括：(1)7S启动子-FAD2-1A有义内含子-FAD3-1A有义内含子-FAD3-1B有义内含子-可剪接的FAD3内含子#5-FAD3-1B反义内含子-FAD3-1A反义内含子-FAD2-1A反义内含子-豌豆rbcS；(2)7S启动子-FAD3-1A有义内含子-FAD3-1B有义内含子-可剪接的FAD3内含子#5-FAD3-1B反义内含子-FAD3-1A反义内含子-豌豆rbcS；(3)7S启动子-FAD2-1A有义内含子-FAD3-1A有义内含子-可剪接的FAD3内含子#5-FAD3-1A反义内含子-FAD2-1A反义内含子-豌豆rbcS。FAD2-1A，FAD2-1B，FAD2-2B，FAD3-1A，FAD3-1B和FAD3-1C内含子的典型序列可以从以下文献中查阅到，但不局限于这些文献：美国专利申请流水号10/176,149，申请日为2002年6月21日，和美国专利申请流水号09/638,508，申请日为2000年8月11日，和美国临时申请流水号60/151,224，申请日为1999年8月26日，和美国临时申请流水号60/172,128，申请日为1999年12月17日。通过在含有草甘膦的培养基上选择鉴定转化的大豆植物。
分析来自包括内含子RNAi抑制构建体的转化过的大豆种子的脂肪酸组成。根据所需相对脂肪酸组成选择特定的品系。
实施例5
5A.
从纯合的R2种子中分离RNA，所述R2种子来自两个FAD2-1内含子抑制系(5469-14和5469-22)，来自两个FADD2-1 cDNA抑制系(正对照)(5462-87和5462-133)，以及来自阴性对照(野生型种子和来自每一个内含子抑制事件的非分离体(null segregant)的种子)。用FAD2-1 cDNA探测含有所述RNA样品的Northern凝胶。与阴性对照相比，在内含子抑制系和cDNA抑制系中FAD2-1A转录物水平显著降低。用组成型FAD2-2 cDNA探测相同的Northern印迹，并且在FAD2-1内含子抑制系和对照之间没有发现FAD2-2转录物水平的显著差异。相反，cDNA抑制系中的FAD2-2转录物显著减少。以上Northern数据表明，FAD2-1A内含子能特异性地抑制FAD2-1转录物的积累，而不能抑制FAD2-2转录物的积累。对部分FAD2-2基因组克隆(SEQ ID NO：3)进行PCR扩增，并且序列分析发现了位于该基因5’非翻译区中的4.7KB内含子。FAD2-2内含子的序列(SEQ ID NO：4)与FAD2-1内含子没有同源性。
5B.
从纯合的R2种子中分离RNA，所述R2种子来自四个FAD3-1A内含子#4抑制系，来自三个FAD3-1B内含子#4抑制系，来自阴性对照种子(未转化过的野生型种子)和来自每一个内含子抑制事件的非分离体)。用FAD3-1A 3’UTR区探测包括所述RNA样品的Northern凝胶。与野生型或零对照相比，FAD3-1A内含子#4抑制系中的内源FAD3-1A转录物水平显著降低。用FAD3-1B 3’UTR区探测相同的Northern印迹，并且与FAD3-1A内含子#4抑制系，野生型或零对照相比，在内源FAD3-1B转录物水平方面没有显著差异。FAD3-1A内含子#4(SEQ ID NO：8)的序列与FAD3-1B内含子#4(SEQ ID NO：13)的序列没有同源性。
实施例6
Southern印迹数据表明，至少存在两个FAD3基因家族成员。为了确定其他FAD3基因家族成员的序列，并且确定是否存在其他成员，将FAD3-1A基因序列用于对Monsanto大豆DNA序列数据库进行查询BLAST检索。将来自不同的FAD3基因家族成员的候选ESTs用于设计引物。利用这种方法，设计了基于推测的FAD3序列的两套引物。分离了来自两个其他FAD3基因家族成员的内含子#4区。所述引物是根据相当于FAD3-1A基因的内含子#4的位置的区域中的211565_1.r1040EST(被称为FAD3-1B)，(5’引物#15024：5’-CATGCTTTCTGTGCTTCTC-3’(SEQ ID NO：26)和3’引物#15027：5’-GTTGATCCAACCATAGTCG-3’(SEQID NO：27))设计的。将所述引物用于PCR，扩增FAD3-1B内含子#4(SEQID NO：13)，在测序时，它与FAD3-1A内含子#4(SEQ ID NO：8)没有序列同源性。FAD3-1B基因还包括内含子#3C(SEQ ID NO：12)，它同样与FAD3-1A内含子#3C(SEQ ID NO：11)没有任何同源性。
另一个额外的内含子#4是用第二个EST，gsv701051989.H1(被命名为FAD3-1C)通过PCR扩增的，使用了以下引物对：5’引物#16241：5’-CACCATGGTCATCATCAGAAAC(SEQ ID NO：38)和3’引物#16242：TCACGATCCACAGTTGTGAGAC(SEQ ID NO：39)。FAD3-1C内含子#4(SEQID NO：14)与FAD3-1A内含子#4(SEQ ID NO：8)具有50％的同源性，并且与FAD3-1B内含子#4(SEQ ID NO：13)没有同源性。FAD3-1C EST与FAD3-1B EST类似，也包括位于所述基因的相同区域的内含子#4剪接位点。
实施例7 FAD2-1A/FAD3-1A转化的植物
7A.
将大豆FAD2-1A内含子抑制系用于对大豆FAD3-1A内含子抑制系授粉，后者是按照实施例3中提供的方法制备的。通过Northern印迹(如实施例5所述)从含有表达的FAD2-1A内含子区和FAD3-1A内含子区的大豆种子中筛选RNA，以便确定FAD2-1，FAD2-2，FAD3-1A和FAD3-1B转录物的水平。筛选具有不可检测的或低水平的FAD2-1和FAD3-1A转录物的大豆植物的脂肪酸组成，如实施例3所述。
7B.
同样将大豆FAD2-1A内含子抑制系用于对通过突变产生的低亚麻酸大豆FAD3突变系进行授粉。通过Northern印迹筛选来自包括一个或多个表达的FAD2内含子区和FAD3突变(包括剔除)的大豆种子的RNA(如实施例5所述)，以便确定FAD2-1，FAD2-2，FAD3-1A，FAD3-1C和FAD3-1B转录物的水平。筛选具有不可检测的或低水平的FAD2和FAD3转录物的大豆植物的脂肪酸组成，如实施例3所述。
7C.
将具有FAD3-1A，FAD3-1B，和FAD3-1C内含子抑制的大豆系用于对具有升高水平的油酸的，含有来自自发突变的FAD2突变系的大豆植物授粉。将具有FAD3-1A和FAD3-1B内含子抑制的大豆品系，具有FAD3-1A和FAD3-1C内含子抑制的品系，具有FAD3-1B和FAD3-1C内含子抑制的品系，具有FAD3-1A内含子抑制的品系，具有FAD3-1B内含子抑制的品系，和具有FAD3-1C内含子抑制品系分别用于对具有升高含量油酸的，含有来自自发突变的FAD2突变系的大豆植物授粉。通过实施例5所述的Northern印迹筛选来自包括一个或多个表达的FAD3内含子区和FAD2突变的大豆种子的RNA，以便确定FAD2-1，FAD2-2，FAD3-1A，FAD3-1B和FAD3-1C转录物的水平。筛选具有不可检测的或低水平的FAD2或FAD3转录物的大豆植物的脂肪酸组成，如实施例3所述。
实施例8 单一的FAD2/FAD3构建体
构建了如表IV所示出的包括有义和反义FAD2和FAD3内含子以及能够产生dsRNA的FAD2和FAD3内含子的线性DNA片段。
                                 表IV
构建体编号 启动子1 结构核酸1(有义，反义，dsRNA) 启动子2 结构核酸2(有义，反义，dsRNA)
12345678910 CaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMV FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1 CaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMV FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子4FAD3-1A内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1C内含子4FAD3-1C内含子4FAD2-2B内含子1FAD2-2B内含子1
11121314151617181920 napinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapin FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1 napinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapinnapin FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子4FAD3-1A内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1C内含子4FAD3-1C内含子4FAD2-2B内含子1FAD2-2B内含子1
21222324252627282930 7S7S7S7S7S7S7S7S7S7S FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1 CaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMV FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子4FAD3-1A内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1C内含子4FAD3-1C内含子4FAD2-2B内含子1FAD2-2B内含子1
31323334353637383940 CaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMVCaMV FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1FAD2-1A内含子1FAD2-1B内含子1 7S7S7S7S7S7S7S7S7S7S FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子1FAD3-1A内含子4FAD3-1A内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1B内含子4FAD3-1C内含子4FAD3-1C内含子4FAD2-2B内含子1FAD2-2B内含子1
正如表中所示出的，在表中所列出的每一种构建体根据该构建体中结构核酸的性质和取向可能具有若干种构型。例如，构建体30可以具有如下构型：(1)7S启动子-FAD2-1B内含子1(有义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(有义)；(2)7S启动子-FAD2-1B内含子1(有义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(反义)；(3)7S启动子-FAD2-1B内含子1(有义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(dsRNA)；(4)7S启动子-FAD2-1B内含子1(反义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(有义)；(5)7S启动子-FAD2-1B内含子1(反义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(反义)；(6)7S启动子-FAD2-1B内含子1(反义)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(dsRNA)；(7)7S启动子-FAD2-1B内含子1(dsRNA)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(有义)；(8)7S启动子-FAD2-1B内含子1(dsRNA)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(反义)；或(9)7S启动子-FAD2-1B内含子1(dsRNA)-CaMV启动子-FAD2-2B内含子1(dsRNA)。
可以通过前面所披露的方法，包括McCabe等的粒子轰击方法(1988)Bio/Technology，6：923-926或农杆菌介导的转化(Martinell，美国专利号6,384,301)将所述结构导入大豆(例如，Asgrow品种A4922或Asgrow品种A3244)。通过在含有草甘膦的培养基上选择，鉴定转化过的大豆植物。通过气相层析，分析来自用所述构建体转化过的大豆品系的种子的脂肪酸组成。
实施例9
通过前面所披露的方法，包括McCabe等的粒子轰击方法(1988)Bio/Technology，6：923-926或农杆菌介导的转化(Martinell，美国专利号6,384,301)将包括用于FAD2-1和FAD2-2内含子的有义和反义表达的表达构建体的线性DNA片段稳定地导入大豆(例如，Asgrow品种A4922或Asgrow品种A3244)。导入了以下构建体：(1)FAD2-1A内含子(有义)-FAD2-2内含子(反义)；(2)FAD2-1A内含子(有义)-FAD2-2内含子(有义)；(3)FAD2-1A内含子(反义)-FAD2-2内含子(反义)；(4)FAD2-1A内含子(反义)-FAD2-2内含子(有义)；(5)FAD2-1B内含子(有义)-FAD2-2内含子(反义)；(6)FAD2-1B内含子(有义)-FAD2-2内含子(有义)；(7)FAD2-1B内含子(反义)-FAD2-2内含子(反义)；和(8)FAD2-1B内含子(反义)-FAD2-2内含子(有义)。通过在含有草甘膦的培养基上选择，鉴定转化过的大豆植物。通过气相层析，分析来自用所述构建体转化过的大豆品系的种子的脂肪酸组成。转化过的植物的种子具有高水平的油酸(超过80％)。
通过McCabe等的方法(1988)Bio/Technology，6：923-926将含有用于FAD2-1，FAD2-2，和FAD3内含子的有义和反义表达的表达构建体的其他线性DNA片段稳定地导入大豆(Asgrow品种A4922)。典型的构建体包括：(1)FAD2-1A内含子(有义或反义)-FAD2-2内含子(有义或反义)-FAD3-1A内含子1(有义或反义)；(2)FAD2-1A内含子(有义或反义)-FAD2-2内含子(有义或反义)-FAD3-1A内含子4(有义或反义)；(3)FAD2-1A内含子(有义或反义)-FAD2-2内含子(有义或反义)-FAD3-1B内含子4(有义或反义)；和(4)FAD2-1A内含子(有义或反义)-FAD2-2内含子(有义或反义)-FAD3-1C内含子4(有义或反义)。通过在含有草甘膦的培养基上选择，鉴定转化过的大豆植物。通过气相层析，分析来自用所述构建体转化过的大豆品系的种子的脂肪酸组成。转化过的植物的种子具有高含量的油酸(超过80％)。
                                序列表
<110>Calgene LLC
<120>用于生产具有改变的多不饱和脂肪酸的植物的核酸序列和方法
<130>16518.129
<160>39
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>420
<212>DNA
<213>大豆
<400>1
gtaaattaaa ttgtgcctgc acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga     60
ggaaaagaaa ctcccgaaat tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt    120
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tttttgtttt atggtcatga tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc    300
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<210>2
<211>405
<212>DNA
<213>大豆
<400>2
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catatttttc acttcctggt tgaaaattgt agttctcttg gtacatacta gtattagaca    360
ttcagcaaca acaactgaac tgaacttctt tatactttga cacag                    405
<210>3
<211>6220
<212>DNA
<213>大豆
<400>3
agcttggtac cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attcggcttc     60
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ttcatttcat agatttcgtc tgattttggc taacttggtt tctgttgcgg ccgattctta    360
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tcacgcatct ctttcggatc taaggatgaa tctcctattt cctccgtatt atttctcgta    480
tctcttgttc tgtgctaatg ctccagaaaa tggcagcatt gtcttcttct ttgctgtata    540
agtgtttgtg ttgtgaatct ggaagcgatt ttgcgtgagg taacttgcga cttcaactat    600
tatctttcag atctcgttaa tttattagct gctattaatt tgtgtgtgca gtgtcaaact    660
gaagcacacg actgcttaga agttagaatt tgactgactg ttcctctttg atttttttct    720
ttcttttctt tgctwactcg gcctatttaa tgatctttat aaatagatta gtggaccact    780
tggttagttg gtgagttatg aatattcgaa ttttctacca caagttgggt taaaaaaatc    840
tctgcaacta cacgaggatt ttttatttta tttagaggaa actattctgt catccttttt    900
ccgattacac ttttctatca gttgttttga aatatacacc ttaggaatat aatattaccc    960
ctttcggtct taatataaat atattttaat tatttatatt ttatttaatg aaattatttt   1020
taaaatactt tcatttaata gaatttttaa taaagttaaa gacttttatt gtgtagagtt   1080
taacgaagtt aattagtttt cttagtaaat gtaaaatatg ccttttttgt tgtttataat    1140
ggagattgga aaaaatatac tttaattttt ttcaagtgat gaataattat ggatgttttg    1200
tcaatatttt tgtcttgcta tacaactttc agtcttgcca ttaaataatt ttgaatgtgt    1260
tattgatatc tctgaacaat atttagagac gaacataaat tttatatatt ttatataatt    1320
tctttttatt acccttttat tatcaatttt gaaatttggt taatatctgt gtttcatttt    1380
gaggtctcaa atttgatata aggaggttca aaatgcgttg ctagccattt taaagattag    1440
caggagagga aatgtttctg gacttaaatt taaaatatgc ttatttgttt ttcaagagag    1500
agagatcaat atttatataa tacacttgaa ttaatataca ccattgttgc aaaaaaaaaa    1560
aaatattagt tgattgtgtg acaatatttt atattaaata taattagtta atttagttca    1620
agttgagtta catttttaca taccattctt agccgccact tttttatatt tatttgtagg    1680
aataactttt catctgtatc aattttcccc gtctaataaa aagggtttga ctttttctta    1740
taatagagtt tttttttttt tgctttaagt tattgtaaaa taattatttt attttttttg    1800
cctttgtaaa ttatgtatat ttaatgtttt aataggaaaa aaatgttatc aaaagcacta    1860
aaagactaaa attaaacaac cataatttgc aaagatgaaa ataaaaaaat aattttgtaa    1920
agataaaaaa tgaaataaaa tagttaaatt ataggaattt aaaagctatt taaatcaaca    1980
aaagttaaag tttctgtaaa aaaagttcaa tttttttttt tattattgaa aaagttaaag    2040
ctaatgagcg ttcgatttgg gttagtatgt agtatttatt attttcaaga ttttggattt    2100
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aaaaaaaaag gtacagaaaa aatcaagcgc tttttttatt tcaattagtg gaggtttcac    2220
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ggaacaaaat tcctttcgta aatatacgga gaggaatcta ttttgacttg ttgaatttat    2340
ggtaaagtag aatttagaat ttaattatga gttgaagtaa ttttgaataa tttatatgtt    2400
aaatataaaa ttttgtacta agttttattc ataactttga ttctataata caaacataca    2460
taagttcaaa aataatttta attaaaatta attttatcaa tttttattca aacacgagtc    2520
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aaataaagaa tgttttttta tttgaaaatt gaaaatttct gggtcatgtt aagatcttgt    3480
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ttttaatttt tacttatgtt gaaaacaaat ttattgctaa aaaaacattt attctttttt    3900
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aattaatgca ttttttttgc tttgatgaga acgcacattg ttcattctga ttcggtgagt    4500
ttagaaacta ttgctgataa tccttgattt aagattttag tcttgttcat gttcattaaa    4560
agtgttgtaa aaaaatgcac tgatatgtca tgtgcag                             4597
<210>5
<211>191
<212>DNA
<213>大豆
<400>5
gtaataattt ttgtgtttct tactcttttt tttttttttt tgtttatgat atgaatctca     60
cacattgttc tgttatgtca tttcttcttc atttggcttt agacaactta aatttgagat    120
ctttattatg tttttgctta tatggtaaag tgattcttca ttatttcatt cttcattgat    180
tgaattgaac a                                                         191
<210>6
<211>346
<212>DNA
<213>大豆
<400>6
ttagttcata ctggcttttt tgtttgttca tttgtcattg aaaaaaaatc ttttgttgat     60
tcaattattt ttatagtgtg tttggaagcc cgtttgagaa aataagaaat cgcatctgga    120
atgtgaaagt tataactatt tagcttcatc tgtcgttgca agttctttta ttggttaaat    180
ttttatagcg tgctaggaaa cccattcgag aaaataagaa atcacatctg gaatgtgaaa    240
gttataactg ttagcttctg agtaaacgtg gaaaaaccac attttggatt tggaaccaaa    300
ttttatttga taaatgacaa ccaaattgat tttgatggat tttgca                   346
<210>7
<211>142
<212>DNA
<213>大豆
<400>7
gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg ttcttgattc aattacattt tatttatttg     60
gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg cttcctgagg ctgttcttga acatggctct    120
tttttatgtg tcattatctt ag                                             142
<210>8
<211>1228
<212>DNA
<213>大豆
<400>8
taacaaaaat aaatagaaaa tagtgggtga acacttaaat gcgagatagt aatacctaaa     60
aaaagaaaaa aatataggta taataaataa tataactttc aaaataaaaa gaaatcatag    120
agtctagcgt agtgtttgga gtgaaatgat gttcacctac cattactcaa agattttgtt    180
gtgtccctta gttcattctt attattttac atatcttact tgaaaagact ttttaattat    240
tcattgagat cttaaagtga ctgttaaatt aaaataaaaa acaagtttgt taaaacttca    300
aataaataag agtgaaggga gtgtcatttg tcttctttct tttattgcgt tattaatcac    360
gtttctcttc tctttttttt ttttcttctc tgctttccac ccattatcaa gttcatgtga    420
agcagtggcg gatctatgta aatgagtggg gggcaattgc acccacaaga ttttattttt    480
tatttgtaca ggaataataa aataaaactt tgcccccata aaaaataaat attttttctt    540
aaaataatgc aaaataaata taagaaataa aaagagaata aattattatt aattttatta    600
ttttgtactt tttatttagt ttttttagcg gttagatttt tttttcatga cattatgtaa    660
tcttttaaaa gcatgtaata tttttatttt gtgaaaataa atataaatga tcatattagt    720
ctcagaatgt ataaactaat aataatttta tcactaaaag aaattctaat ttagtccata    780
aataagtaaa acaagtgaca attatatttt atatttactt aatgtgaaat aatacttgaa    840
cattataata aaacttaatg acaggagata ttacatagtg ccataaagat attttaaaaa    900
ataaaatcat taatacactg tactactata taatattcga tatatatttt taacatgatt    960
ctcaatagaa aaattgtatt gattatattt tattagacat gaatttacaa gccccgtttt   1020
tcatttatag ctcttacctg tgatctattg ttttgcttcg ctgtttttgt tggtcaaggg   1080
acttagatgt cacaatatta atactagaag taaatattta tgaaaacatg taccttacct   1140
caacaaagaa agtgtggtaa gtggcaacac acgtgttgca tttttggccc agcaataaca   1200
cgtgtttttg tggtgtacta aaatggac                                      1228
<210>9
<211>625
<212>DNA
<213>大豆
<400>9
gtacatttta ttgcttattc acctaaaaac aatacaatta gtacatttgt tttatctctt     60
ggaagttagt cattttcagt tgcatgattc taatgctctc tccattctta aatcatgttt    120
tcacacccac ttcatttaaa ataagaacgt gggtgttatt ttaatttcta ttcactaaca    180
tgagaaatta acttatttca agtaataatt ttaaaatatt tttatgctat tattttatta    240
caaataatta tgtatattaa gtttattgat tttataataa ttatattaaa attatatcga    300
tattaatttt tgattcactg atagtgtttt atattgttag tactgtgcat ttattttaaa    360
attggcataa ataatatatg taaccagctc actatactat actgggagct tggtggtgaa    420
aggggttccc aaccctcctt tctaggtgta catgctttga tacttctggt accttcttat    480
atcaatataa attatatttt gctgataaaa aaacatggtt aaccattaaa ttcttttttt    540
aaaaaaaaaa ctgtatctaa actttgtatt attaaaaaga agtctgagat taacaataaa    600
ctaacactca tttggattca ctgca                                          625
<210>10
<211>98
<212>DNA
<213>大豆
<400>10
ggtgagtgat tttttgactt ggaagacaac aacacattat tattataata tggttcaaaa     60
caatgacttt ttctttatga tgtgaactcc atttttta                             98
<210>11
<211>115
<212>DNA
<213>大豆
<400>11
ggtaactaaa ttactcctac attgttactt tttcctcctt ttttttatta tttcaattct      60
ccaattggaa atttgaaata gttaccataa ttatgtaatt gtttgatcat gtgca          115
<210>12
<211>148
<212>DNA
<213>大豆
<220>
<223>FAD3-1B内含子3c
<400>12
gtaatctcac tctcacactt tctttataca tcgcacgcca gtgtgggtta tttgcaacct     60
acaccgaagt aatgccctat aattaatgag gttaacacat gtccaagtcc aatattttgt    120
tcacttattt gaacttgaac atgtgtag                                       148
<210>13
<211>361
<212>DNA
<213>大豆
<220>
<223>FAD3-1B内含子4
<400>13
gtatcccatt taacacaatt tgtttcatta acattttaag agaatttttt tttcaaaata     60
gttttcgaaa ttaagcaaat accaagcaaa ttgttagatc tacgcttgta cttgttttaa    120
agtcaaattc atgaccaaat tgtcctcaca agtccaaacc gtccactatt ttattttcac    180
ctactttata gcccaatttg ccatttggtt acttcagaaa agagaacccc atttgtagta    240
aatatattat ttatgaatta tggtagtttc aacataaaac atacttatgt gcagttttgc    300
catccttcaa aagaaggtag aaacttactc catgttactc tgtctatatg taatttcaca    360
g                                                                    361
<210>14
<211>1037
<212>DNA
<213>大豆
<400>14
gtaacaaaaa taaatagaaa atagtgagtg aacacttaaa tgttagatac taccttcttc    60
ttcttttttt tttttttttt gaggttaatg ctagataata gctagaaaga gaaagaaaga    120
caaatatagg taaaaataaa taatataacc tgggaagaag aaaacataaa aaaagaaata    180
atagagtcta cgtaatgttt ggatttttga gtgaaatggt gttcacctac cattactcaa    240
agattctgtt gtctacgtag tgtttggact ttggagtgaa atggtgttca cctaccatta    300
ctcagattct gttgtgtccc ttagttactg tcttatattc ttagggtata ttctttattt    360
tacatccttt tcacatctta cttgaaaaga ttttaattat tcattgaaat attaacgtga    420
cagttaaatt aaaataataa aaaattcgtt aaaacttcaa ataaataaga gtgaaaggat    480
catcattttt cttctttctt ttattgcgtt attaatcatg cttctcttct tttttttctt    540
cgctttccac ccatatcaaa ttcatgtgaa gtatgagaaa atcacgattc aatggaaagc    600
tacaggaacy ttttttgttt tgtttttata atcggaatta atttatactc cattttttca    660
caataaatgt tacttagtgc cttaaagata atatttgaaa aattaaaaaa attattaata    720
cactgtacta ctatataata tttgacatat atttaacatg attttctatt gaaaatttgt    780
atttattatt ttttaatcaa aacccataag gcattaattt acaagaccca tttttcattt    840
atagctttac ctgtgatcat ttatagcttt aagggactta gatgttacaa tcttaattac    900
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gtgataagtg gcaacacacg tgttgctttt ttggcccagc aataacacgt gtttttgtgg   1020
tgtacaaaaa tggacag                                                  1037
<210>15
<211>4497
<212>DNA
<213>大豆
<400>15
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ttattttgtt ccaagtatgt catattttga tccatcttga caagtagatt gtcatgtagg    120
aataggaata tcactttaaa ttttaaagca ttgattagtc tgtaggcaat attgtcttct    180
tcttcctcct tattaatatt ttttattctg ccttcaatca ccagttatgg gagatggatg    240
taatactaaa taccatagtt gttctgcttg aagtttagtt gtatagttgt tctgcttgaa    300
gtttagttgt gtgtaatgtt tcagcgttgg cttcccctgt aactgctaca atggtactga    360
atatatattt tttgcattgt tcattttttt cttttactta atcttcattg ctttgaaatt    420
aataaaacaa aaagaaggac cgaatagttt gaagtttgaa ctattgccta ttcatgtaac    480
ttattcaccc aatcttatat agtttttctg gtagagatca ttttaaattg aaggatataa    540
attaagagga aatacttgta tgtgatgtgt ggcaatttgg aagatcatgc gtagagagtt    600
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tgtgcctttt tgttgtcgct gtgtttggtt ctgcatgtta gcctcacaca gatatttagt    720
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gccttacacc tattgagtga aattaatgaa cagtgcatgt gagtatgtga ctgtgacaca    840
acccccggtt ttcatattgc aatgtgctac tgtggtgatt aaccttgcta cactgtcgtc    900
cttgtttgtt tccttatgta tattgatacc ataaattatt actagtatat cattttatat    960
tgtccatacc attacgtgtt tatagtctct ttatgacatg taattgaatt ttttaattat   1020
aaaaaataat aaaacttaat tacgtactat aaagagatgc tcttgactag aattgtgatc   1080
tcctagtttc ctaaccatat actaatattt gcttgtattg atagcccctc cgttcccaag   1140
agtataaaac tgcatcgaat aatacaagcc actaggcatg gtaaattaaa ttgtgcctgc   1200
acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga ggaaaagaaa ctcccgaaat   1260
tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt cctgaaggct taggtgtagg   1320
cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt gataaacaat tggctgtaat   1380
gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac tttttgtttt atggtcatga   1440
tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc attatcttta gatttttcac   1500
tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac atattacaca ttcagcaaaa   1560
caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag ggtctagcaa aggaaacaac   1620
aatgggaggt agaggtcgtg tggcaaagtg gaagttcaag ggaagaagcc tctctcaagg    1680
gttccaaaca caaagccacc attcactgtt ggccaactca agaaagcaat tccaccacac    1740
tgctttcagc gctccctcct cacttcattc tcctatgttg tttatgacct ttcatttgcc    1800
ttcattttct acattgccac cacctacttc cacctccttc ctcaaccctt ttccctcatt    1860
gcatggccaa tctattgggt tctccaaggt tgccttctca ctggtgtgtg ggtgattgct    1920
cacgagtgtg gtcaccatgc cttcagcaag taccaatggg ttgatgatgt tgtgggtttg    1980
acccttcact caacactttt agtcccttat ttctcatgga aaataagcca tcgccgccat    2040
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acactcacaa tagggtggcc tatgtattta gccttcaatg tctctggtag accctatgat    2220
agttttgcaa gccactacca cccttatgct cccatatatt ctaaccgtga gaggcttctg    2280
atctatgtct ctgatgttgc tttgttttct gtgacttact ctctctaccg tgttgcaacc    2340
ctgaaagggt tggtttggct gctatgtgtt tatggggtgc ctttgctcat tgtgaacggt    2400
tttcttgtga ctatcacata tttgcagcac acacactttg ccttgcctca ttacgattca    2460
tcagaatggg actggctgaa gggagctttg gcaactatgg acagagatta tgggattctg    2520
aacaaggtgt ttcatcacat aactgatact catgtggctc accatctctt ctctacaatg    2580
ccacattacc atgcaatgga ggcaaccaat gcaatcaagc caatattggg tgagtactac    2640
caatttgatg acacaccatt ttacaaggca ctgtggagag aagcgagaga gtgcctctat    2700
gtggagccag atgaaggaac atccgagaag ggcgtgtatt ggtacaggaa caagtattga    2760
tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa    2820
ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa    2880
cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa    2940
agtgttctgc ttatagcttt ctgcctaaaa tgcacgctgc acgggacaat atcattggta    3000
atttttttaa aatctgaatt gaggctactc ataatactat ccataggaca tcaaagacat    3060
gttgcattga ctttaagcag aggttcatct agaggattac tgcataggct tgaactacaa    3120
gtaatttaag ggacgagagc aactttagct ctaccacgtc gttttacaag gttattaaaa    3180
tcaaattgat cttattaaaa ctgaaaattt gtaataaaat gctattgaaa aattaaaata    3240
tagcaaacac ctaaattgga ctgattttta gattcaaatt taataattaa tctaaattaa    3300
acttaaattt tataatatat gtcttgtaat atatcaagtt ttttttttta ttattgagtt    3360
tggaaacata taataaggaa cattagttaa tattgataat ccactaagat cgacttagta    3420
ttacagtatt tggatgattt gtatgagata ttcaaacttc actcttatca taatagagac    3480
aaaagttaat actgatggtg gagaaaaaaa aatgttattg ggagcatatg gtaagataag    3540
acggataaaa atatgctgca gcctggagag ctaatgtatt ttttggtgaa gttttcaagt    3600
gacaactatt catgatgaga acacaataat attttctact tacctatccc acataaaata    3660
ctgattttaa taatgatgat aaataatgat taaaatattt gattctttgt taagagaaat    3720
aaggaaaaca taaatattct catggaaaaa tcagcttgta ggagtagaaa ctttctgatt    3780
ataattttaa tcaagtttaa ttcattcttt taattttatt attagtacaa aatcattctc    3840
ttgaatttag agatgtatgt tgtagcttaa tagtaatttt ttatttttat aataaaattc    3900
aagcagtcaa atttcatcca aataatcgtg ttcgtgggtg taagtcagtt attccttctt    3960
atcttaatat acacgcaaag gaaaaaataa aaataaaatt cgaggaagcg cagcagcagc    4020
tgataccacg ttggttgacg aaactgataa aaagcgctgt cattgtgtct ttgtttgatc    4080
atcttcacaa tcacatctcc agaacacaaa gaagagtgac ccttcttctt gttattccac    4140
ttgcgttagg tttctacttt cttctctctc tctctctctc tcttcattcc tcatttttcc    4200
ctcaaacaat caatcaattt tcattcagat tcgtaaattt ctcgattaga tcacggggtt    4260
aggtctccca ctttatcttt tcccaagcct ttctctttcc ccctttccct gtctgcccca    4320
taaaattcag gatcggaaac gaactgggtt cttgaatttc actctagatt ttgacaaatt    4380
cgaagtgtgc atgcactgat gcgacccact cccccttttt tgcattaaac aattatgaat    4440
tgaggttttt cttgcgatca tcattgcttg aattgaatca tattaggttt agattct       4497
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>16
atacaagcca ctaggcat                                                 18
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>17
gattggccat gcaatgaggg aaaagg                                        26
<210>18
<211>778
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(778)
<223>在所有n位置不确定
<220>
<223>PCR引物
<400>18
atacaagcca ctaggcatgg taaattaaat tgtgcctgca cctcgggata tttcatgtgg     60
ggttcatcat atttgttgag gaaaagaaac tcccgaaatt gaattatgca tttatatatc    120
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atcagcactt ctctctattg ataaacaatt ggctgtaatg ccgcagtaga ggacgatcac    240
aacatttcgt gctggttact ttttgtttta tggtcatgat ttcactctct ctaatctctc    300
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attgtagttc tgttggtaca tattacacat tcagcaaaac aactgaaact caactgaact    420
tgtttatact ttgacacagg gtctagcaaa ggaaacaaca atgggaggta gaggtcgtgt    480
ggccaaagtg gaagttcaag ggaagaagcc tctctcaagg gttccaaaca caaagccacc    540
attcactgtt ggccaactca agaaagcaat tccaccacac tgctttcagc gctccctcct    600
cacttcattc tcctatgttg tttatgacct ttcatttgcc ttcattttct acattgccac    660
cacctacttc cacctccttc ctcaaccctt ttccctcatt gcatggccaa tcaagccgaa    720
ttctgcagat atccatcaca tggcggcggn tggngnaggn ntntanaggg cccaattc      778
<210>19
<211>2463
<212>DNA
<213>大豆
<400>19
actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc ggtgtgactc agccccaagt     60
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catataagag gagagtgagt ggagaagcac ttctcctttt tttttctctg ttgaaattga    180
aagtgttttc cgggaaataa ataaaataaa ttaaaatctt acacactcta ggtaggtact    240
tctaatttaa tccacacttt gactctatat atgttttaaa aataattata atgcgtactt    300
acttcctcat tatactaaat ttaacatcga tgattttatt ttctgtttct cttctttcca    360
cctacataca tcccaaaatt tagggtgcaa ttttaagttt attaacacat gtttttagct    420
gcatgctgcc tttgtgtgtg ctcaccaaat tgcattcttc tctttatatg ttgtatttga    480
attttcacac catatgtaaa caagattacg tacgtgtcca tgatcaaata caaatgctgt    540
cttatactgg caatttgata aacagccgtc cattttttct ttttctcttt aactatatat    600
gctctagaat ctctgaagat tcctctgcca tcgaatttct ttcttggtaa caacgtcgtc    660
gttatgttat tattttattc tatttttatt ttatcatata tatttcttat tttgttcgaa    720
gtatgtcata ttttgatcgt gacaattaga ttgtcatgta ggagtaggaa tatcacttta     780
aaacattgat tagtctgtag gcaatattgt cttctttttc ctcctttatt aatatatttt     840
gtcgaagttt taccacaagg ttgattcgct ttttttgtcc ctttctcttg ttctttttac     900
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taagcaccat agctgttctg cttgaattta tttgtgtgta aattgtaatg tttcagcgtt    1020
ggctttccct gtagctgcta caatggtact gtatatctat tttttgcatt gttttcattt    1080
tttcttttac ttaatcttca ttgctttgaa attaataaaa caatataata tagtttgaac    1140
tttgaactat tgcctattca tgtaattaac ttattcactg actcttattg tttttctggt    1200
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tcacacagat atttagtagt tgttctgcat acaagcctca cacgtatact aaaccagtgg    1380
acctcaaagt catggcctta cacctattgc atgcgagtct gtgacacaac ccctggtttc    1440
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tgtccctttt aaactcccga gagagtataa aactgcatcg aatattacaa gatgcactct    1740
tgtcaaatga agggggggaa atgatactac aagccactag gcatggtatg atgctaaatt    1800
aaattgtgcc tgcaccccag gatatttcat gtgggattca tcatttattg aggaaaactc    1860
tccaaattga atcgtgcatt tatatttttt ttccatttct agatttcttg aaggcttatg    1920
gtataggcac ctacaattat cagcacttct ctctattgat aaacaattgg ctgtaatacc    1980
acagtagaga acgatcacaa cattttgtgc tggttacctt ttgttttatg gtcatgattt    2040
cactctctct aatctgtcac ttccctccat tcattttgta cttctcatat ttttcacttc    2100
ctggttgaaa attgtagttc tcttggtaca tactagtatt agacattcag caacaacaac    2160
tgaactgaac ttctttatac tttgacacag ggtctagcaa aggaaacaat aatgggaggt  2220
ggaggccgtg tggccaaagt tgaaattcag cagaagaagc ctctctcaag ggttccaaac  2280
acaaagccac cattcactgt tggccaactc aagaaagcca ttccaccgca ctgctttcag  2340
cgttccctcc tcacttcatt gtcctatgtt gtttatgacc tttcattggc tttcattttc  2400
tacattgcca ccacctactt ccacctcctc cctcacccct tttccctcat tgcatggcca  2460
atc                                                                2463
<210>20
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>20
cuacuacuac uactcgagac aaagccttta gcctttagcc tatg                     44
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>21
caucaucauc auggatccca tgtctctcta tgcaag                              36
<210>22
<211>1704
<212>DNA
<213>大豆
<400>22
actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc ggtgtgactc agccccaagt     60
gacgccaacc aaacgcgtcc taactaaggt gtagaagaaa cagatagtat ataagtatac    120
catataagag gagagtgagt ggagaagcac ttctcctttt tttttctctg ttgaaattga    180
aagtgttttc cgggaaataa ataaaataaa ttaaaatctt acacactcta ggtaggtact     240
tctaatttaa tccacacttt gactctatat atgttttaaa aataattata atgcgtactt     300
acttcctcat tatactaaat ttaacatcga tgattttatt ttctgtttct cttctttcca     360
cctacataca tcccaaaatt tagggtgcaa ttttaagttt attaacacat gtttttagct     420
gcatgctgcc tttgtgtgtg ctcaccaaat tgcattcttc tctttatatg ttgtatttga     480
attttcacac catatgtaaa caagattacg tacgtgtcca tgatcaaata caaatgctgt     540
cttatactgg caatttgata aacagccgtc cattttttct ttttctcttt aactatatat     600
gctctagaat ctctgaagat tcctctgcca tcgaatttct ttcttggtaa caacgtcgtc     660
gttatgttat tattttattc tatttttatt ttatcatata tatttcttat tttgttcgaa     720
gtatgtcata ttttgatcgt gacaattaga ttgtcatgta ggagtaggaa tatcacttta     780
aaacattgat tagtctgtag gcaatattgt cttctttttc ctcctttatt aatatatttt     840
gtcgaagttt taccacaagg ttgattcgct ttttttgtcc ctttctcttg ttctttttac     900
ctcaggtatt ttagtctttc atggattata agatcactga gaagtgtatg catgtaatac     960
taagcaccat agctgttctg cttgaattta tttgtgtgta aattgtaatg tttcagcgtt    1020
ggctttccct gtagctgcta caatggtact gtatatctat tttttgcatt gttttcattt    1080
tttcttttac ttaatcttca ttgctttgaa attaataaaa caatataata tagtttgaac    1140
tttgaactat tgcctattca tgtaattaac ttattcactg actcttattg tttttctggt    1200
agaattcatt ttaaattgaa ggataaatta agaggcaata cttgtaaatt gacctgtcat    1260
aattacacag gaccctgttt tgtgcctttt tgtctctgtc tttggttttg catgttagcc    1320
tcacacagat atttagtagt tgttctgcat acaagcctca cacgtatact aaaccagtgg    1380
acctcaaagt catggcctta cacctattgc atgcgagtct gtgacacaac ccctggtttc    1440
catattgcaa tgtgctacgc cgtcgtcctt gtttgtttcc atatgtatat tgataccatc    1500
aaattattat atcatttata tggtctggac cattacgtgt actctttatg acatgtaatt    1560
gagtttttta attaaaaaaa tcaatgaaat ttaactacgt agcatcatat agagataatt    1620
gactagaaat ttgatgactt attctttcct aatcatattt tcttgtattg atagccccgc   1680
tgtccctttt aaactcccga gaga                                          1704
<210>23
<211>4010
<212>DNA
<213>大豆
<400>23
acaaagcctt tagcctatgc tgccaataat ggataccaac aaaagggttc ttcttttgat      60
tttgatccta gcgctcctcc accgtttaag attgcagaaa tcagagcttc aataccaaaa     120
cattgctggg tcaagaatcc atggagatcc ctcagttatg ttctcaggga tgtgcttgta     180
attgctgcat tggtggctgc agcaattcac ttcgacaact ggcttctctg gctaatctat     240
tgccccattc aaggcacaat gttctgggct ctctttgttc ttggacatga ttggtaataa     300
tttttgtgtt tcttactctt tttttttttt ttttgtttat gatatgaatc tcacacattg     360
ttctgttatg tcatttcttc ttcatttggc tttagacaac ttaaatttga gatctttatt     420
atgtttttgc ttatatggta aagtgattct tcattatttc attcttcatt gattgaattg     480
aacagtggcc atggaagctt ttcagatagc cctttgctga atagcctggt gggacacatc     540
ttgcattcct caattcttgt gccataccat ggatggttag ttcatactgg cttttttgtt     600
tgttcatttg tcattgaaaa aaaatctttt gttgattcaa ttatttttat agtgtgtttg     660
gaagcccgtt tgagaaaata agaaatcgca tctggaatgt gaaagttata actatttagc     720
ttcatctgtc gttgcaagtt cttttattgg ttaaattttt atagcgtgct aggaaaccca     780
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attgattttg atggattttg caggagaatt agccacagaa ctcaccatga aaaccatgga     960
cacattgaga aggatgagtc atgggttcca gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg    1020
ttcttgattc aattacattt tatttatttg gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg    1080
cttcctgagg ctgttcttga acatggctct tttttatgtg tcattatctt agttaacaga    1140
gaagatttac aagaatctag acagcatgac aagactcatt agattcactg tgccatttcc    1200
atgtttgtgt atccaattta tttggtgagt gattttttga cttggaagac aacaacacat    1260
tattattata atatggttca aaacaatgac tttttcttta tgatgtgaac tccatttttt    1320
agttttcaag aagccccgga aaggaaggct ctcacttcaa tccctacagc aatctgtttc    1380
cacccagtga gagaaaagga atagcaatat caacactgtg ttgggctacc atgttttctc    1440
tgcttatcta tctctcattc attaactagt ccacttctag tgctcaagct ctatggaatt    1500
ccatattggg taactaaatt actcctacat tgttactttt tcctcctttt ttttattatt    1560
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gcagatgttt gttatgtggc tggactttgt cacatacttg catcaccatg gtcaccacca    1680
gaaactgcct tggtaccgcg gcaaggtaac aaaaataaat agaaaatagt gggtgaacac    1740
ttaaatgcga gatagtaata cctaaaaaaa gaaaaaaata taggtataat aaataatata    1800
actttcaaaa taaaaagaaa tcatagagtc tagcgtagtg tttggagtga aatgatgttc    1860
acctaccatt actcaaagat tttgttgtgt cccttagttc attcttatta ttttacatat    1920
cttacttgaa aagacttttt aattattcat tgagatctta aagtgactgt taaattaaaa    1980
taaaaaacaa gtttgttaaa acttcaaata aataagagtg aagggagtgt catttgtctt    2040
ctttctttta ttgcgttatt aatcacgttt ctcttctctt tttttttttt cttctctgct    2100
ttccacccat tatcaagttc atgtgaagca gtggcggatc tatgtaaatg agtggggggc    2160
aattgcaccc acaagatttt attttttatt tgtacaggaa taataaaata aaactttgcc    2220
cccataaaaa ataaatattt tttcttaaaa taatgcaaaa taaatataag aaataaaaag    2280
agaataaatt attattaatt ttattatttt gtacttttta tttagttttt ttagcggtta    2340
gatttttttt tcatgacatt atgtaatctt ttaaaagcat gtaatatttt tattttgtga    2400
aaataaatat aaatgatcat attagtctca gaatgtataa actaataata attttatcac    2460
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ttacttaatg tgaaataata cttgaacatt ataataaaac ttaatgacag gagatattac    2580
atagtgccat aaagatattt taaaaaataa aatcattaat acactgtact actatataat    2640
attcgatata tatttttaac atgattctca atagaaaaat tgtattgatt atattttatt    2700
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tctattcact aacatgagaa attaacttat ttcaagtaat aattttaaaa tatttttatg    3300
ctattatttt attacaaata attatgtata ttaagtttat tgattttata ataattatat    3360
taaaattata tcgatattaa tttttgattc actgatagtg ttttatattg ttagtactgt    3420
gcatttattt taaaattggc ataaataata tatgtaacca gctcactata ctatactggg    3480
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tggtaccttc ttatatcaat ataaattata ttttgctgat aaaaaaacat ggttaaccat    3600
taaattcttt ttttaaaaaa aaaactgtat ctaaactttg tattattaaa aagaagtctg    3660
agattaacaa taaactaaca ctcatttgga ttcactgcag acacaagcag caaaaccagt    3720
tcttggagat tactaccgtg agccagaaag atctgcgcca ttaccatttc atctaataaa    3780
gtatttaatt cagagtatga gacaagacca cttcgtaagt gacactggag atgttgttta    3840
ttatcagact gattctctgc tcctccactc gcaacgagac tgagtttcaa actttttggg    3900
ttattattta ttgattctag ctactcaaat tacttttttt ttaatgttat gttttttgga    3960
gtttaacgtt ttctgaacaa cttgcaaatt acttgcatag agagacatgg         4010
<210>24
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>24
acgaattcct cgaggtaaat taaattgtgc ctgc                         34
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>25
gcgagatcta tcgatctgtg tcaaagtata aac                          33
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>26
catgctttct gtgcttctc                                         19
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>27
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<210>28
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>28
gcgatcgatg tatgatgcta aattaaattg tgcctg                         36
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>29
gcggaattcc tgtgtcaaag tataaagaag                               30
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>30
gatcgatgcc cggggtaata atttttgtgt                              30
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>31
cacgcctcga gtgttcaatt caatcaatg                                  29
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>32
cactcgagtt agttcatact ggct                                       24
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>33
cgcatcgatt gcaaaatcca tcaaa                                      25
<210>34
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>34
cuacuacuac uactcgagcg taaatagtgg gtgaacac                        38
<210>35
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>35
caucaucauc auctcgagga attcgtccat tttagtacac c                 41
<210>36
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>36
cuacuacuac uactcgaggc gcgtacattt tattgctta                     39
<210>37
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>37
caucaucauc auctcgagga attctgcagt gaatccaaat g                 41
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>38
caccatggtc atcatcagaa ac                                      22
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>39
tcacgatcca cagttgtgag ac                                      22

Claims (19)

1.一种基本上纯化的核酸分子，包括与选自下组的序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：4，它们的互补序列，和任意一个的片段。
2.一种重组核酸分子，它包括作为可操作地连接的成分的以下成分：(a)启动子，它能在植物细胞中发挥作用，以便导致mRNA分子的产生；和(b)能在高严格条件下与选自下组的核酸序列杂交的核酸序列：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，和SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
3.一种转化的大豆植物，它具有包括以下成分的核酸分子：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1-SEQ ID NO：2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与多顺反子构型的第一启动子连接或与第二启动子连接。
4.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，单个启动子可操作地与所述第一和第二个核酸分子连接。
5.如权利要求4的转化的大豆植物，其中，所述单个启动子是种子特异性启动子。
6.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，所述第一启动子和所述第二启动子都是种子特异性启动子。
7.如权利要求6的转化的大豆植物，其中，所述第一启动子和所述第二启动子都是7S启动子。
8.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，所述第一启动子与所述第二启动子不同。
9.如权利要求8的转化的大豆植物，其中，所述第一启动子是7S启动子，而所述第二启动子是napin启动子。
10.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，所述第一种核酸分子是转录的，并且能够选择性地降低由FAD2-1基因编码的转录物的水平，同时保持由FAD2-2基因编码的转录物的水平部分不受影响。
11.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，所述第一种核酸分子是转录的，并且能够选择性地降低由FAD2-1基因编码的转录物的水平，同时保持由FAD2-2基因编码的转录物的水平基本上不受影响。
12.如权利要求3的转化的大豆植物，其中，所述第一种核酸分子是转录的，并且能够选择性地降低由FAD2-1基因编码的转录物的水平，同时保持由FAD2-2基因编码的转录物的水平实质上不受影响。
13.一种具有两种或两种以上核酸分子的转化的大豆植物，其中，每一个核酸分子可操作地与启动子连接，并且，其中，每一个核酸分子所具有的核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段。
14.如权利要求13的转化的大豆植物，其中，第一种核酸分子是转录的，并且能选择性地降低由第一FAD基因编码的转录物的水平，同时保持由第二FAD基因编码的转录物的水平部分不受影响，基本上不受影响或实质上不受影响。
15.一种转化的大豆植物，其中，选择性地降低了由选自下组的基因编码的转录物的水平：FAD2-1A，FAD2-1B，FAD2-2B，FAD3-1A，FAD3-1B，FAD3-1C，同时保持由选自下组的不同的基因编码的转录物的水平至少部分不受影响：FAD2-1A，FAD2-1B，FAD2-2B，FAD3-1A，FAD3-1B，FAD3-1C。
16.一种生产具有降低的亚麻酸含量的种子的大豆植物的方法，包括：用包括以下成分的核酸分子转化大豆植物：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4一SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与第一启动子或第二启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子的亚麻酸比具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物少。
17.一种生产具有提高的油酸含量的种子的大豆植物的方法，包括：用包括以下成分的核酸分子转化大豆植物：(a)可操作地与具有第一种核酸序列的第一种核酸分子连接的第一启动子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，它们的互补序列，和任意一个的片段，和(b)具有第二种核酸序列的第二种核酸分子，所述第二种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，所述第二种核酸分子可操作地与第一启动子或第二启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子的油酸比具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物多。
18.一种生产具有改变的油组成的种子的植物的方法，包括：用包括作为可选择地连接的部分的以下成分的核酸分子转化植物：第一启动子和具有第一种核酸序列的第一种核酸分子，所述第一种核酸序列与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性：SEQ ID NOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子与具有类似的遗传背景但缺少所述核酸分子的植物相比具有改变的油组成。
19.一种生产具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸比例的种子的植物的方法，包括：用包括作为可选择地连接的部分的以下成分的构建体转化植物：两种或两种以上核酸分子，每一种都具有与选自下组的核酸序列具有85％或更高的同一性的核酸序列：SEQ ID NOs：1，2，4-14，它们的互补序列，和任意一个的片段，其中，每一种核酸分子可操作地与启动子连接；并且生长所述植物，其中，所述植物产生的种子与具有类似的遗传背景但缺少所述两种或两种以上核酸分子的植物相比具有改变的单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸比例。
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