CN1551916A - 用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能在种子中转录异源核酸序列的启动子，以及修饰和应用该启动子的方法。

Description

用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子

本发明涉及植物遗传学领域。更具体地，本发明涉及种子特异性基因表达。

种子为人类和牲畜提供食用蛋白的重要来源。但植物和种子的蛋白营养通常不全面。例如，很多种子蛋白缺少一或多种必需氨基酸。这种缺陷可通过遗传手段修饰天然或非天然蛋白以使它们具有营养更全面的氨基酸组成(或其它一些所需特征)并在转基因植物中过表达该修饰的蛋白来得以克服。或者，可将一个或多个基因导入植物以调控其代谢途径并修饰游离氨基酸的含量。这些方法可用于生产显示重要的农业性状、营养特性和药用特性的农作物。

尽管目前已有多种分子工具，但由于基因工程蛋白的积累量不足，致使对种子的遗传修饰仍常常受到限制。多种细胞内过程可能影响总蛋白的积累，所述过程包括转录、翻译、蛋白装配和折叠、甲基化、磷酸化、转运、以及蛋白酶解。对一或多种这样的过程进行干预可增加遗传工程改造的种子中所产生的蛋白的量。

引入基因可以对植物生长和发育带来有害影响。在这种环境下，基因的表达必需限制在所希望的靶组织中。例如，可能必需以种子特异性方式表达一种氨基酸下调基因，以便避免可能影响产量或其它农艺性状。

基因的启动子部分在控制基因表达方面起关键作用。沿启动子区，可集合转录元件并启动转录。在启动子位置发生的转录起始可通过多种途径调节。例如，在有特定化合物存在的情况下诱导启动子，仅在特定组织中表达基因，或对整个植物进行的组成型表达。因此，可将编码序列与具有不同调节特性的启动子可操作连接，以此修饰编码序列的转录。

发明简述

本发明包括能产生种子特异性转录的启动子，和修饰、制备并应用该启动子的方法。本发明还提供含有高表达启动子的组合物、转化宿主细胞、转基因植物、和种子，以及它们的制备方法和应用方法。

本发明包括并提供一种转化的植物，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子。本发明包括并提供了一种转化的植物，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向包含：具有与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链的核酸序列有约90％以上同一性的核酸序列的启动子，该启动子与一种结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明包括并提供了一种转化大豆植物的方法，所述方法包括：提供一种核酸分子并用所述核酸分子来转化所述植物，其中所述核酸分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连。

本发明包括并提供了一种转化大豆植物的方法，所述方法包括：提供一种核酸分子，其沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其约90％以上互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明提供了一种在种子中表达结构核酸序列的方法，所述方法包括：培养一种转化的植物，它包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸分子可操作相连，所述转化的植物产生种子，所述结构核酸分子在种子中转录；并分离所述种子。

本发明提供了一种获得种子的方法，所述种子的一种结构基因的产物增加，所述方法包括：培养一种转化的植物，它包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸分子可操作相连，所述转化的植物产生种子，所述结构核酸分子在种子中转录；从所述转化的植物分离所述种子。

本发明提供了一种获得粗粉(meal)的方法，所述粗粉的一种结构基因的产物增加，所述方法包括：培养一种转化的植物，它包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸分子可操作相连，所述转化的植物产生种子，所述结构核酸分子在种子中转录；制备包含所述转化的植物或其一部分的粗粉。

本发明提供了一种获得原料(feedstock)的方法，所述原料中一种结构基因的产物增加，所述方法包括：培养一种转化的植物，它包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有在严谨条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链的核酸序列杂交的核酸序列的启动子，其与结构核酸分子可操作相连，所述转化的植物产生种子，所述结构核酸分子在种子中转录；制备包含所述转化的植物或其一部分的粗粉。

本发明提供了一种获得油的方法，所述油的一种结构基因的产物增加，所述方法包括：培养一种转化的植物，它包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有在严谨条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链的核酸序列杂交的核酸序列的启动子，其与结构核酸分子可操作相连，所述转化的植物产生种子，所述结构核酸分子在种子中转录；分离所述油。

本发明包括并提供了一种基本纯的核酸分子，该核酸分子包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列。

本发明包括并提供了一种载体，该载体包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列。

本发明包括并提供了一种细胞，该细胞包含一种载体，该载体包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列。

本发明包括并提供了一种能在严谨条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸分子特异性杂交的核酸分子。

本发明包括并提供了一种载体，该载体包含能在严谨条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸分子特异性杂交的核酸分子。

本发明包括并提供了一种细胞，该细胞包含一种载体，该载体包含能在严谨条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸分子特异性杂交的核酸分子。

本发明包括并提供了一种基本纯的核酸序列，该核酸序列与选自SEQID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列有约90％以上的同一性。

本发明包括并提供了一种核酸片段，该片段包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列的至少20个连续核苷酸。

本发明包括并提供了一种核酸片段，该片段包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列的至少30个连续核苷酸。

本发明包括并提供了一种核酸片段，该片段包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列的至少50个连续核苷酸。

本发明包括并提供了从转化的植物的一或多种种子中制备得到的油，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供了从转化的植物的一或多种种子中制备得到的油，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其约90％以上的互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明包括并提供了由转化的植物产生的种子，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供了由转化的植物产生的种子，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其约90％以上的互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明包括并提供了包含转化的植物或其一部分的原料，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供了包含转化的植物或其一部分的原料，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其约90％以上的互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明包括并提供了包含来自经转化植物的植物材料的粗粉，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子。

本发明包括并提供了包含来自经转化植物的植物材料的粗粉，其包含一种核酸分子，该分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其约90％以上的互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

本发明包括并提供了装种子的容器(a container of seeds)，其中至少约25％的种子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其约90％以上的互补链，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交，的核酸序列的启动子，其与结构核酸序列可操作相连，所述启动子与所述结构核酸序列是异源的。

附图说明

图1显示两种7SαcDNA序列的对比排列。

图2显示p-GEM-T 1T的序列。

图2a是载体pMON55548的质粒图谱。

图3是载体pMON8677的质粒图谱。

图3a是载体pMON55546的质粒图谱。

图4是pMON55547的质粒图谱。

图5是载体pMON55554的质粒图谱。

图6是载体pMON55542的质粒图谱。

图7是7Sα启动子和tARC5启动子的比较。

图8是载体pMON55553的质粒图谱。

图9是载体pMON55541的质粒图谱。

序列简述

SEQ ID NO：1是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：2是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：3是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：4是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：5是用于扩增大豆GIcA基因的衔接子引物(HindIII-PstI)。

SEQ ID NO：6是用于扩增大豆GIcA基因的7Sα初级引物(primaryprimer)。

SEQ ID NO：7是用于扩增大豆GIcA基因的7Sα嵌套(BglII/NcoI)引物。

SEQ ID NO：8是设计用于扩增大豆GIcA基因的引物区的7Sα引物(NcoI/BglII)。

SEQ ID NO：9是7Sα基因衔接子引物。

SEQ ID NO：10是7Sα基因特异性引物。

SEQ ID NO：11是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：12是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：13是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

SEQ ID NO：14是大豆(Glycine max L.)的7Sα启动子序列。

定义

以下定义有助于理解发明详述。

术语“编码序列”，“结构序列”以及“结构核酸序列”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述核酸以一组核酸三联体的形式排列，其中每一个三联体形成一个密码子。每一密码子编码一种具体的氨基酸。因此，编码序列、结构序列和结构核酸序列编码一系列氨基酸，这些氨基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。编码序列，结构序列，和结构核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。

术语“DNA序列”，“核酸序列”和“核酸分子”是指一种包含有序排列的核酸的物理结构。所述DNA序列或核酸序列可以包含在较大的核酸分子、载体等结构中。此外，这些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附图、附表、电子媒介等形式进行描述。

术语“表达”是指基因转录，产生相应的mRNA，并翻译该mRNA以产生相应的基因产物(即，肽，多肽，或蛋白)。

术语“反义RNA的表达”是指对DNA进行转录，从而产生第一种RNA分子，后者能与第二种RNA分子杂交。RNA-RNA杂合体的形成可抑制第二种RNA分子翻译出基因产物。

“同源性”是指两个或多个核酸序列或氨基酸序列之间以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。同源性还指不同的核酸或蛋白之间相似的功能特性的概念。

术语“异源”是指两个或更多个不同来源的核酸序列或蛋白序列之间的关系。例如，启动子如果在自然界通常的情况中不与编码序列组合在一起，那么该启动子相对于该编码序列是异源的。此外，一个具体序列可以相对于它插入至其中的细胞或生物为“异源”的(即，并非该具体细胞或生物所天然具有的)。

“杂交”是指一条核酸链与一条互补链通过碱基配对来相连的能力。当两条核酸链中的互补核酸序列在适当条件下彼此相遇，就可发生杂交。

术语“可操作相连”是指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区相对于核酸序列的位置可以使该核酸序列在该启动子区的指导下进行转录。此时，该启动子区与该核酸序列“可操作相连”。

术语“启动子”或“启动子区”是指通常发现于编码序列上游(5’)的、能指导该核酸序列转录为mRNA的一种核酸序列。启动子或启动子区通常提供RNA聚合酶的识别位点以及转录的合适起始所需的其它因子。本文中，启动子或启动子区包括通过插入或缺失调节区，对启动子进行随机或定点诱变等方式而进行改变的启动子。启动子的活性或强度如下测量：将其在细胞或组织中产生的RNA的量，或积累的蛋白的量，与已经评估过转录活性的启动子进行比较。

术语“重组载体”是指诸如质粒、粘粒、病毒、自我复制序列、噬菌体、线性或环状单链，或线性或环状双链DNA或RNA核苷酸序列等任何物质。重组载体可以来自任何来源，它能进行基因组整合或自我复制。

“调节序列”是指位于编码序列上游(5’)、内部或下游(3’)的核苷酸序列。编码序列的转录和表达通常受到调节序列存在与否的影响。

术语“充分同源(substantially homologous)”是指，根据本文所述BestFit程序(版本10；genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)以默认参数测定，序列同一性至少约90％的两个序列。

术语“转化”是指核酸引入受体宿主的过程。术语“宿主”是指细菌细胞，真菌，动物或动物细胞，植物或种子，或任何植物部分或组织，其包括植物细胞，原生质体，愈伤组织，根，块茎，种子，茎，叶，幼苗，胚和花粉。

本文中术语“转基因植物”是指一种植物，其中所引入的核酸已经稳定引入该植物的基因组，例如，核基因组或质体基因组中。

本文中术语“基本纯”是指一种分子，它与自然状态下通常与它相伴的基本上所有其它分子分开。更优选基本纯的分子是制剂中的优势种类。基本纯的分子可以是约60％以上，优选约75％以上，更优选约90％以上，最优选约95％以上与天然混合物中其它分子(除了溶剂以外)脱离。术语“基本纯”并不想涵盖处于天然状态的分子。

优选实施方案详述

本发明提供能在种子中转录异源结构核酸序列的启动子，以及修饰、制备和应用该启动子的方法。本发明还提供含有该种子特异性启动子的组合物，转化的宿主细胞和植物，以及它们的制备和应用方法。

核酸分子

本发明提供一种核酸分子，它与具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列的核酸分子杂交。本发明还包括是所述核酸分子片段的核酸分子。

核酸杂交是DNA操作领域技术人员已知的技术。一对具体核酸的杂交特性可指示它们的相似性或同一性。

可用低严谨度条件选出与靶核酸序列同一性较低的核酸序列。可在如下条件下实施，约0.15M-约0.9M氯化钠，温度约20℃-约55℃。

可用高严谨度条件选出与已公开的核酸序列同一性较高的核酸序列(Sambrook等，1989)(注意：所有参考文献都全文引入本文作参考)。

高严谨度条件通常包括：在约2X-约10X SSC(由含有3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠的20X SSC原液，pH7.0用蒸馏水稀释而成)，约2.5X-约5X Denhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X原液用蒸馏水稀释而成)，约10mg/mL-约100mg/mL鱼精DNA，以及约0.02％(w/v)-约0.1％(w/v)SDS中进行核酸杂交，于大约50℃-大约70℃保温数小时到过夜。优选高严谨度条件为6X SSC，5X Denhardt溶液，100mg/mL鱼精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保温数小时。

杂交之后通常进行数个洗涤步骤。洗涤组合物通常包含约0.5X-约10X SSC，以及0.01％(w/v)-约0.5％(w/v)SDS，约20℃-约70℃保温15分钟。优选地，当在0.1X SSC中65℃洗涤至少一次以后，核酸片段仍保持杂交。

核酸分子优选在低或高严谨度条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列杂交。最优选，核酸分子在高严谨度条件下与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列杂交。核酸分子实例包括具有核酸序列SEQ ID NOs：11，12，13或14，其互补链，或其任何片段的启动子。

在另一实施方案中，核酸分子包含与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或其任何片段的核酸序列有约85％以上同一性的核酸序列，更优选约86，约87，约88，约89，约90，约91，约92，约93，约94，约95，约96，约97，约98，或约99％以上同一性。

序列同一性百分比优选用序列分析软件包^TM(版本10；genetic ComputerGroup，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”是利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch，1970)来找出两个序列的对比排列，它使匹配数最大并使缺口(gap)数最小。“BestFit”是对两个序列之间的最相似片段进行最佳对比排列，它还插入缺口以便使匹配数最大，它利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith and Waterman，1981；Smith等，1983)。同一性百分比最优选用“Best Fit”程序使用默认参数来确定。

本发明还提供了在低或高严谨度条件下与具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列的核酸分子，或核酸分片段杂交的核酸分子片段，与选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列有约80，约85，约90，或约99％以上序列同一性的核酸分子片段，或上述任一种分子的片段。

在一实施方案中，所述片段是本发明核酸分子中约3000-约1000，约1800-约150，约1500-约500，约1300-约250，约1000-约200，约800-约150，约500-约100，约300-约75，约100-约50，约50-约25，或，约20-约10个连续核苷酸。

在另一实施方案中，所述片段是本发明核酸序列中约20，约30，约40，约50，约60，约70，约80，约90，约100，约150，约200，约250，约500，或约750个连续核苷酸。

启动子

在一个优选实施方案中，本文所公开的任何一种核酸分子可以是启动子。在一个特别优选的实施方案中，启动子是7Sα启动子。在一个实施方案中，启动子具有组织或器官特异性，优选种子特异性。在一个特别优选的实施方案中，启动子在胚乳或胚中优先表达与其相连的结构基因。

在一个方面，如果mRNA在一种组织或器官中的表达水平比在另一种组织或器官中的表达水平高出至少10倍，优选至少约100倍或至少约1,000倍，则认为该启动子是特异于该组织或器官的。mRNA的水平可以在单个时间点测量，也可以在多个时间点测量，从而倍数增加可以是平均倍数增加，或者是从实验测量值外推得到的值。由于这是水平的比较，因此可以使用任何测量mRNA的方法。在一个优选方面，进行比较的组织或器官是种子或带有叶片或叶片组织的种子组织。在另一个优选方面，对多个组织或器官进行比较。优选的多重比较是将种子或种子组织与选自下组的二、三、四或更多组织或器官进行比较：花组织，花原端，花粉，叶，胚，苗，叶原基，苗端，根，根尖，维管组织和子叶。本文中植物器官的例子是，种子，叶，根等，组织的例子是叶原基，苗端，维管组织等。

启动子的活性或强度可用mRNA的量或该RNA所特别产生的蛋白积累量相对于mRNA或蛋白的总量来定量。所述启动子优选表达可操作连接的核酸序列，其水平占总mRNA的约2.5％以上；更优选占约5，约6，约7，约8，或约9％以上；还更优选占约10，约11，约12，约13，约14，约15，约16，约17，约18，或约19％以上；最优选占约20％以上。

或者，启动子的活性或强度可表示为已鉴定特征的启动子(其转录活性已经过评估)的相对量。例如，可将目标启动子与报道序列(例如，GUS)可操作相连，并将其引入特定类型的细胞。用类似方法制备已知启动子，将其引入相同的细胞内环境(cortext)中。通过比较相对于已知启动子而言的报告基因表达量，可确定目标启动子的转录活性。细胞内环境优选大豆。

结构核酸序列

本发明的启动子可与相对于该启动子的核酸序列而言异源的第二种核酸序列可操作相连。该第二种核酸序列通常是希望提高转录水平的任何核酸序列。优选该第二种核酸序列编码一种适于掺入人或动物膳食之中或者提供其它一些农业重要性状的多肽。

适当的第二种核酸序列包括，但不限于，编码下列蛋白的那些：种子贮藏蛋白，脂肪酸途径的酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或淀粉分支酶。

优选的种子贮藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(美国专利4,886,878，4,885,357，5,215,912，5,589,616，5,508,468，5,939,599，5,633,436和5,990,384；WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO 93/08682，WO 94/20628，WO97/28247，WO 98/26064和WO 99/40209)，7S蛋白(美国专利5,003,045和5,576,203)，巴西坚果蛋白(美国专利5,850,024)，不含苯丙氨酸(phenylalaninefree)的蛋白(WO 96/17064)，清蛋白(albumin)(WO 97/35023)，β-伴大豆球蛋白(conglycinin)(WO00/19839)，11S(美国专利6,107,051)，α-hordothionin(美国专利5,885,802和5,885,801)arcelin种子贮藏蛋白(美国专利5,270,200)凝集素(美国专利6,110,891)和麦谷蛋白(美国专利5,990,389和5,914,450)。

优选的脂肪酸途径酶包括硫酯酶(美国专利5,512,482，5,530,186，5,945,585，5,639,790，5,807,893，5,955,650，5,955,329，5,759,829，5,147,792，5,304,481，5,298,421，5,344,771和5,760,206)，和去饱和酶(美国专利5,689,050、5,663,068、5,614,393、5,856,157、6,117,677、6,043,411、6,194,167、5,705,391、5,663,068、5,552,306、6,075,183、6,051,754、5,689,050、5,789,220、5,057,419、5,654,402、5,659,645、6,100,091、5,760,206、6,172,106、5,952,544、5,866,789、5,443,974和5,093,249)。优选的维生素E生物合成途径酶包括tyrA，slr173，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，AANT1，slr 1737，和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992)；Cyanobase http：//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norris etal.，Plant Physicol 117：1317-1323(1998)；Bartley and Scolnik，Plant Physicol 104：1469-1470(1994)，Smith等，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily，等，Plant Physicol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。

优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸合酶(美国专利5,965,727，WO 97/26366，WO 99/11800，WO 99/49058)色氨酸脱羧酶(WO 99/06581)和苏氨酸脱羧酶(美国专利5,534,421、5,942,660和WO 95/19442)，苏氨酸脱氨酶(WO 99/02656和WO 98/55601)，二氢二吡啶甲酸(dihydrodipicolinate)合酶(美国专利5,367,110)，赖氨酸酮戊二酸还原酶(WO 98/42831)和天冬氨酸激酶(美国专利5,367,110、5,858,749和6,040,160)。

优选的淀粉分支酶包括美国专利6,232,122和6,147,279，以及WO97/22703中提到的那些。

或者，可通过设计启动子和第二种核酸序列来下调特定的核酸序列。这通常通过将启动子与反义取向的第二种核酸序列相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。任何核酸序列可以通过这种方式进行负调节。

本领域普通技术人员还将认识到，本发明的启动子还可以被设计成通过共抑制表型来下调具体的核酸序列。用全长和部分长度的cDNA序列对内源基因进行的共抑制作用已有文献(Napoli等The Plant Cell 2：279-289(1990))。

另外，具体核酸序列的表达也可以通过所述核酸序列的非编码区来下调。本领域技术人员可以轻易分离基因组DNA，其包含侧接该核酸序列编码区的序列，或该编码区的内含子，并应用该非编码区实施反义作用或共抑制作用。

这种调节作用的目标包括含有较少量的必需氨基酸、但在特定组织中以相对较高的水平表达的多肽。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都能在种子中大量表达，但在营养方面欠缺必需氨基酸。这种反义方法也可以用于有效除去植物性食品中的其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原，或者使参与所需化合物(如必需氨基酸)的降解的分解代谢酶下调。

修饰的结构核酸序列

本发明的启动子还可与异源的修饰型结构核酸序列相连。可以对结构核酸序列进行修饰，以便提供各种所需特性。例如，可以对结构核酸序列进行修饰以增加必需氨基酸的含量，促进对氨基酸序列的翻译，改变翻译后修饰(例如，磷酸化位点)，将翻译出的产物转运至细胞的内侧或外侧的空间中，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号基序，等等。

在一优选实施方案中，结构核酸序列被强化，使得能编码如下的多肽，该多肽中至少1种，更优选约2，约3，或约4种选自下组的必需氨基酸的含量增加：组氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸。必要时，也可以添加非必需氨基酸以强化多肽的结构和营养性。特别适于这类强化作用的结构核酸序列包括，编码表达水平相对较高和/或必需氨基酸的含量特别低的天然多肽的那些。实例如种子贮藏蛋白，如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。其它合适的目标包括arcelin，菜豆蛋白，凝集素，玉米醇溶蛋白和清蛋白。

结构核酸序列中的密码子应用特点

由于遗传密码的简并性，可以用不同的核苷酸密码子编码给定的氨基酸。宿主细胞常常表现出优选的密码子应用模式。优选结构核酸序列经过构建能利用具体宿主细胞的密码子应用模式。这通常能增强该结构核酸序列在转化的宿主细胞中的表达。可对上述任一种核酸或氨基酸序列进行修饰，以反映容纳它们的宿主细胞或生物优选的密码子应用特性。在植物中修饰结构核酸序列，使密码子应用最优化的方法可参见美国专利5,689,052。

对结构核酸序列的其它修饰

上述结构核酸序列中的其它变化可编码出与改造前的蛋白相比等效或具有更优秀特征的蛋白。突变包括对基序序列进行缺失，插入，截短，取代，融合，改组等。

对结构核酸序列的突变可通过特定方式或随机方式引入，这两种方式都是分子生物学领域技术人员已知的。定点诱变技术有很多种，它们通常利用寡核苷酸将突变引入结构核酸序列中的特定位置。实例包括单链拯救(Kunkel等，1985)，唯一位点的消除(Deng和Nickloff，1992)，切口(nick)保护(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。随机或非特异性突变可通过化学试剂产生(综述参见，Singer和Kusmierek，1982)，如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通过生物学方法产生，如由突变株传代(Greener等，1997)。其它产生上述改变的方法可参见Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)。

修饰可以在氨基酸序列中导致保守或非保守的改变。保守改变不改变蛋白的最终氨基酸序列。在一个优选实施方案中，蛋白包含约5-约500个保守改变，更优选约10-约300个保守改变，还更优选约25-约150个保守改变，最优选约5-约25个保守改变或约1-约5个保守改变。

非保守改变包括能导致氨基酸序列发生改变的那些添加、缺失和取代。在一优选实施方案中，所述蛋白具有约5-约500非保守氨基酸改变，更优选约10-约300个非保守氨基酸改变，还更优选约25-约150个非保守氨基酸改变，最优选约5-约25个非保守氨基酸改变或约1-约5个非保守改变。

可以对本发明的蛋白序列以及编码它们的核酸序列进行修饰但保留所述分子的所需特性。以下是关于对蛋白的氨基酸序列进行改变来产生等效，或者可能更优良的第二代分子的讨论。氨基酸改变可以通过改变结构核酸序列的密码子来实现，密码子参见表1。

           表1：氨基酸的密码子简并性

氨基酸	单字母	三字母	密码子
				丙氨酸	A	Ala	GCA GCC GCG GCT
半胱氨酸	C	Cys	TGC TGT
				天冬氨酸	D	Asp	GAC GAT
谷氨酸	E	Glu	GAA GAG
				苯丙氨酸	F	Phe	TTC TTT
甘氨酸	G	Gly	GGA GGC GGG GGT
				组氨酸	H	His	CAC CAT
异亮氨酸	I	Ile	ATA ATC ATT
				赖氨酸	K	Lys	AAA AAG
亮氨酸	L	Leu	TTA TTG CTA CTC CTG CTT
				甲硫氨酸	M	Met	ATG
天冬酰胺	N	Asn	AAC AAT

脯氨酸	P	Pro	CCA CCC CCG CCT
				谷氨酰胺	Q	Gln	CAA CAG
精氨酸	R	Arg	AGA AGG CGA CGC CGG CGT
				丝氨酸	S	Ser	AGC AGT TCA TCC TCG TCT
苏氨酸	T	Thr	ACA ACC ACG ACT
				缬氨酸	V	Val	GTA GTC GTG GTT
色氨酸	W	Trp	TGG
				酪氨酸	Y	Tyr	TAC TAT

可以在不明显损失所需活性的前题下，将蛋白序列中特定的氨基酸取代为其它氨基酸。从这一点上来看，可以在所公开的肽序列或蛋白序列，或它们的相应核酸序列中进行多种改变而不明显损失生物活性。

在制造这类改变时，可考虑氨基酸亲水性指数。氨基酸的亲水性指数在赋于蛋白质以交互式生物功能方面的重要性已为领域内广泛理解(Kyte和Doolittle，1982)。可以接受的是，氨基酸的相对亲水性决定所得蛋白的二级结构，而后者又限定了该蛋白与其它分子，如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等的相互作用。

每种氨基酸基于其疏水性和荷电特性而分配了亲水性指数。具体是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。

本领域已知，特定氨基酸可以被具有相似亲水性指数或得分(score)的其它氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，亲水性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。

本领域也能理解，可以在亲水性的基础上有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(Hopp，T.P.，1985年11月19日授权)称，一种蛋白质上受其邻接氨基酸的亲水性控制的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。氨基酸的亲水值如下：精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

可理解，一种氨基酸可以被具有相似的亲水得分值的另一种氨基酸取代，所得蛋白质仍具有相似的生物活性，即，仍能获得生物功能性蛋白。在制造这类改变时，亲水性指数在±2以内的氨基酸的取代为优选，在±1以内的为更优选，在±0.5以内的为最优选。

综上所述，氨基酸取代因此是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性，亲水性，电荷，大小，等等。涉及上述多种特性的取代实例为本领域众所周知，它们包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸。对于不能预计有利的那些改变，如果能使所得的蛋白质与原始未经改造的多肽相比，瘤胃抗性增强和/或对蛋白裂解性降解作用的抗性增强，则也可以使用。或者，可以生成能改进代谢酶的动力学的改变。

在一个优选方面，被修饰的蛋白选自种子贮藏蛋白，脂肪酸途径酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶。

重组载体

上述任何启动子和结构核酸序列都可提供在重组载体中。重组载体通常按5’至3’方向包含：能指导结构核酸序列转录的启动子，以及结构核酸序列。适当的启动子和结构核酸序列包括本文中公开的那些。重组载体还可根据需要而包含：3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位(transit)及靶向核酸序列，选择标记，增强子，和操纵子。

制备重组载体的方式为本领域已知。制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。对这些类型的载体已有综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。

用于在高等植物中进行核酸表达的典型载体为本领域已知，包括来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体，包括pCaMVCN转移控制载体，也已有记载(Fromm等，1985)。

在一个实施方案中，将多个7Sα启动子与任意组合的结构基因可操作连接在单构建体中。在一个优选实施方案中，将SEQ ID NOs：11，12，13和14中1，2，3，4，5，或6或更多个的任意组合与结构基因的任意组合可操作连接在单构建体中。

重组载体中的附加启动子

重组载体中还可提供一个或更多个附加启动子。这些启动子可以，例如，但不限于，与上述任何结构核酸序列可操作相连。或者，所述启动子可与其它核酸序列，如编码转位肽、选择标记蛋白的那些序列、或反义序列，可操作相连。

这些附加启动子可根据载体所要插入的细胞的类型来选择。在细菌、酵母和植物中具有功能的启动子为本领域已知。附加的启动子还可以根据它们的调节特性来选择。这些特性的实例包括对转录活性、诱导能力、组织特异性、以及发育阶段特异性的强化作用。已有文献描述了植物中的诱导型启动子，病毒来源的或合成的启动子，组成型启动子，时间调节型启动子，以及空间调节型启动子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。

常用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell，J.T.等，1985)，增强型CaMV 35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子。

有用的诱导型启动子包括由水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由于应用安全剂而诱导的启动子(安全剂如取代的苯磺酰胺除草剂；Hershey，H.P.and Stoner，T.D.，1991)，热休克启动子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，来源于菠菜亚硝酸根还原酶结构核酸序列的硝酸根诱导型启动子(Back等，1991)，激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，与RuBP羧化酶和LHCP家族的小亚单位结合的光诱导型启动子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum，R.L.等，1991；Weisshaar，B.等，1991；Lam，E.and Chua，N.H.，1990；Castresana，C.等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。

有用的组织特异性或器官特异性启动子的实例包括β-伴大豆球蛋白7Sα’启动子(Doyle，J.J.等，1986；Slighton and Beachy，1987)，和其它种子-特异性启动子(Knutzon，D.S.等，1992；Bustos，M.M.等，1991；Lam and Chua，1991；Stayton等，1991)。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子，包括来自植物贮藏蛋白的启动子，以及来自与含油种子中脂肪酸生物合成有关的蛋白的启动子。这类启动子的实例包括下列结构核酸序列的5’调节区：napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP去饱和酶，和油质蛋白。对种子-特异性调节作用的描述可参见EP 0 255 378。

另一例种子特异性启动子是凝集素启动子。大豆种子中的凝集素蛋白由单结构核酸序列(Lel)编码，该序列仅在种子成熟期表达。凝集素结构核酸序列和种子特异性启动子已被鉴定出，并用于指导转基因烟草植物中的种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。

重组载体中特别优选的附加启动子包括携带在根癌土壤杆菌肿瘤诱导质粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，以及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强型CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒(FMV)35S启动子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚单位的光诱导型启动子；烟草EIF4A启动子(Mandel等，1995)；谷物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脱氢酶1(Vogel等，1989)；谷物光收获复合物(Simpson，1986)；谷物热休克蛋白(Odell等，1985)；拟南芥壳多糖酶启动子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂转移蛋白)启动子(Pyee等，1995)；矮牵牛查耳酮异构酶(Van Tunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；马铃薯patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白启动子(Christensen等，1992)；以及水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)。

附加启动子优选具有种子选择性，组织选择性，为组成型或诱导型。最优选的启动子为胭脂氨酸合成酶(nos)，章鱼氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增强型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄参花叶病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，烟草RB7，小麦POX1，烟草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的启动子。

带有附加的结构核酸序列的重组载体

重组载体还可包含一或多个附加的结构核酸序列。这些附加结构核酸序列通常为适于在重组载体中使用的任何序列。这样的结构核酸序列包括，但不限于，上述任一种结构核酸序列及其修饰形式。附加结构核酸序列还可与上述任一种启动子可操作相连。所述一或多个结构核酸序列可分别与不同(separate)启动子可操作相连。或者，多个结构核酸序列可与单个启动子可操作相连(即，单操纵子)。

所述附加结构核酸序列包括，但不限于，编码下列蛋白的那些：种子贮藏蛋白，脂肪酸途径的酶，维生素E生物合成酶，氨基酸生物合成酶，或淀粉分支酶。

优选的种子贮藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(美国专利4,886,878，4,885,357，5,215,912，5,589,616，5,508,468，5,939,599，5,633,436和5,990,384；WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO 93/08682，WO 94/20628，WO97/28247，WO 98/26064和WO 99/40209)，7S蛋白(美国专利5,003,045和5,576,203)，巴西坚果蛋白(美国专利5,850,024)，不含苯丙氨酸的蛋白(WO96/17064)，清蛋白(WO 97/35023)，β-伴大豆球蛋白(WO00/19839)，11S(美国专利6,107,051)，α-hordothionin(美国专利5,885,802和5,885,801)arcelin种子贮藏蛋白(美国专利5,270,200)凝集素(美国专利6,110,891)和麦谷蛋白(美国专利5,990,389和5,914,450)。

优选的脂肪酸途径酶包括硫酯酶(美国专利5,512,482，5,530,186，5,945,585，5,639,790，5,807,893，5,955,650，5,955,329，5,759,829，5,147,792，5,304,481，5,298,421，5,344,771和5,760,206)，和去饱和酶(美国专利5,689,050、5,663,068、5,614,393、5,856,157、6,117,677、6,043,411、6,194,167、5,705,391、5,663,068、5,552,306、6,075,183、6,051,754、5,689,050、5,789,220、5,057,419、5,654,402、5,659,645、6,100,091、5,760,206、6,172,106、5,952,544、5,866,789、5,443,974和5,093,249)。

优选的维生素E生物合成途径酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，AANT1，slr 1737，和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992)；Cyanobase http：//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norrisetal.，Plant Physicol 117：1317-1323(1998)；Bartley and Scolnik，PlantPhysicol 104：1469-1470(1994)，Smith等，Plant J.11：83-92(1997)；WO00/32757；WO 00/10380；Saint Guily，等，Plant Physicol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。

优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸合酶(美国专利5,965,727，WO 97/26366，WO 99/11800，WO 99/49058)色氨酸脱羧酶(WO 99/06581)和苏氨酸脱羧酶(美国专利5,534,421、5,942,660和WO 95/19442)，苏氨酸脱氨酶(WO 99/02656和WO 98/55601)和天冬氨酸激酶(美国专利5,367,110、5,858,749和6,040,160)。

优选的淀粉分支酶包括美国专利6,232,122和6,147,279，以及WO97/22703中提到的那些。

或者，可将第二种结构核酸序列设计成能下调特定的核酸序列。这通常通过将第二种结构氨基酸按照反义方向与启动子可操作相连来实现。本领域技术人员很熟悉这类反义技术。任何核酸序列都可能以这种方式进行负调节。优选的目标核酸序列包含低含量的必需氨基酸、但在特定组织中以相对较高水平表达。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都在种子中大量表达，但在营养方面缺少必需氨基酸。这种反义方法也可用于有效除去植物来源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食剂(例如，凝集素)，清蛋白，和变应原，或者使参与所需化合物(如必需氨基酸)的降解的分解代谢酶下调。

选择标记

载体或构建体还可包含选择标记。选择标记可用于筛选出包含外源遗传物质的植物或植物细胞。选择标记的实例包括，但不限于：neo基因(Potrykus等，1985)，它编码卡那霉素抗性基因，可用卡那霉素，RptII，G418，hpt等进行筛选；bar基因，它编码bialaphos抗性；突变的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988)，aadA(Jones等，1987)，它编码草甘膦(glyphosate)抗性；腈水解酶基因，它赋予对溴苯腈(bromoxynil)的抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮(imidazolinone)或磺脲(sulphonylurea)的抗性(欧洲专利申请154,204，1985)，ALS(D’Halluin等，1992)，以及氨甲喋呤(metho trexate)抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。选择标记优选为GUS，绿色荧光蛋白(GFP)，新霉素磷酸转移酶II(nptII)，萤光素酶(LUX)，抗生素抗性编码序列，或除草剂(例如，草甘膦)抗性编码序列。选择标记最优选卡那霉素，潮霉素，或除草剂抗性标记。

载体或构建体还可以包括筛选标记，筛选标记可用于监控表达。筛选标记的其它实例包括：β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(Jefferson，1987)；一种R-座基因，它编码一种产物，该产物调节植物组织中花色素苷(红色)的产生(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它编码一种酶，该酶的多种显色底物是已知的(例如，PADAC，一种显色的头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等，1986)；xy1E基因(Zukowsky等，1983)，它编码一种儿茶酚双加氧酶，此酶可转化显色型儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它编码一种能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone，进一步缩合为黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使显色性α-半乳糖底物发生转变。

术语“选择或筛选标记基因”还包括编码可分泌的标记的基因，所述可分泌的标记是指其分泌可作为鉴定或筛选转化细胞的手段的那些。实例包括编码可通过抗体相互作用予以鉴定的分泌型抗原的标记物，或甚至可通过催化检测的分泌型酶。分泌型蛋白可分为数类，包括可通过(例如，ELISA)检测的小分子可扩散型蛋白，可在胞外溶液中检测到的小分子活性酶(例如，α-淀粉酶，β-内酰胺酶，膦丝菌素转移酶)，或者插入或陷落在细胞壁中的蛋白(如包含前导序列的蛋白，如发现于延伸的表达单元中的蛋白，或烟草PR-S)。其它可能的选择和/或筛选标记基因对本领域技术人员而言是显而易见的。

重组载体中的其它元件

各种具有顺式作用的非翻译5’和3’调节序列也可以包括在重组核酸载体中。任何这类调节序列可在重组载体中伴有其它调节序列。可通过设计或改变这类组合来产生所需的调节特征。

3’非翻译区通常提供转录终止信号，聚腺苷酸化信号，后者在植物中能导致腺苷酸添加在mRNA的3’末端。这可通过下述序列的3’区实现：胭脂氨酸合成酶(nos)编码序列，大豆7Sα’贮藏蛋白编码序列，Arcelin-5编码序列，清蛋白编码序列，以及豌豆ssRUBISCO E9编码序列。位于距聚腺苷酸化位点数百个碱基对的下游处的核酸序列通常可终止转录。这些区是转录的mRNA进行有效聚腺苷酸化所必需的。

重组载体中还可掺入翻译增强子。因此，重组载体优选包含一或多个5’非翻译前导序列，以便增强核酸序列的表达。这类增强子序列预计能增强或改变所得mRNA的翻译效力。优选的5’核酸序列包括dSSU 5’，PetHSP705’，和GmHSP17.95’(美国专利5,362,865)。

重组载体还可包含编码转位肽的核酸序列。这种肽可用于将蛋白引到胞外空间，质体，或细胞内侧或外侧的其它空间中(参见，例如EP 0 218 571，美国专利4,940,835，5,88,624，5,610,041，5,618,988和6,107,060)。

重组载体中的结构核酸序列可包含内含子。这些内含子可以与结构核酸序列有不同来源。优选的内含子包括水稻肌动蛋白内含子和谷物HSP70内含子。

融合蛋白

上述任一种结构核酸序列及其修饰形式可与附加的核酸序列相连，以编码融合蛋白。所述附加的核酸序列优选编码至少一个氨基酸，肽，或蛋白。有多种可能的融合组合。

例如，融合蛋白可提供便于检测该融合蛋白的“标记”表位，如GST，GFP，FLAG，或polyHIS。这类融合优选编码约1-约50个氨基酸，更优选约5-约30个附加的氨基酸，还更优选约5-约20个氨基酸。

或者，所述融合可提供调节功能、酶活性、细胞信号传递功能、或细胞内转运功能。例如，可添加编码质体转运肽的序列，以便将融合蛋白引向种子内部的叶绿体。这类融合配对物优选编码约1-约1000个附加的氨基酸，更优选约5-约500个附加的氨基酸，还更优选约10-约250个氨基酸。

序列分析

本发明中，序列相似性或同一性优选用序列Analysis Software Package(Version 10；genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)中的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)寻找两个序列之间能使匹配数最大而使缺口数最小的对比排列。“BestFit”程序是对两个序列之间相似性的最佳节段进行最佳对比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通过插入缺口，使匹配数最大化，可找出最佳对比排列。

上述序列Analysis Software Package还包含数个另外的序列分析工具，它们可用于鉴定本发明核苷酸和氨基酸序列的同源性。例如，“BLAST”程序(Altschul等，1990)在特定的数据库(例如，National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的数据库)中搜索与查询(query)序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；see alsoPearson and Lipman，1988；Pearson等，1990)对查询序列与一组相同类型的序列(核酸或蛋白)之间的相似性进行Pearson和Lipman搜索；“TfastA”对查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson和Lipman搜索(它先翻译出所有6个读码框中的核苷酸序列，然后进行比较)；“FastX”对核苷酸查询序列与一组蛋白序列之间的相似性进行Pearson和Lipman搜索，它考虑了移码效应；“TfastX”对蛋白查询序列与任意组核苷酸序列之间的相似性进行Pearson和Lipman搜索，它考虑了移码效应(它先对核酸序列的两条链都进行翻译，然后进行比较)。

探针和引物

本发明中，可制备并利用能与互补核酸序列特异性杂交的短核酸序列。这些短核酸分子可作为探针用于鉴定给定的样品中互补核酸序列的存在。因此，通过构建与特定核酸序列的一小部分互补的核酸探针，可检测和评估该核酸序列的存在。

或者，可用上述短核酸序列作为寡核苷酸引物，利用PCR技术使互补核酸序列扩增或突变。这些引物还可促进对相关互补核酸序列的扩增(例如来自其它物种的相关核酸序列)。

短核酸序列可用作引物，尤其是作为PCR引物。PCR探针是在与另一核酸所形成的双链结构中能启动聚合酶活性的核酸分子。确定PCR引物的结构的各种方法以及PCR技术都是本领域已知的。例如，可用诸如Primer3(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等计算机搜索程序来鉴定潜在的PCR引物。

本文公开的任何核酸序列都可以用作引物或探针。这些探针或引物的应用，可以大大促进，对包含本文公开的启动子和结构核酸序列的转基因植物的鉴定。所述探针或引物还可以用于筛选cDNA或基因组文库中，与本文公开的启动子和结构核酸序列相关或共享同源性的其它核酸序列。

引物或探针通常与将要被鉴定、扩增、或突变的核酸序列的一部分互补，引物或探针的长度应足以与其互补体形成稳定的序列特异性双链分子。引物或探针的长度优选为约10-约200个核苷酸，更优选为约10-约100个核苷酸，还更优选为约10-约50个核苷酸，最优选为约14-约30个核苷酸。

引物或探针可以，例如，但不限于，直接化学合成，通过PCR(美国专利4,683,195和4,683,202)制备，或通过从较大的核酸分子中切出特异性核酸片段而制备。

转基因植物和经过转化的植物宿主细胞

本发明还涉及转基因植物和转化的植物细胞，它们按照5’至3’方向包含启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。其它核酸序列也可与上述启动子和结构核酸序列一起引入植物或宿主细胞中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，和操纵子。本发明优选的核酸序列包括重组载体，结构核酸序列，启动子，及其它调节元件，都已在上文中描述。

制备这样的重组载体的方法是本领域已知的。例如，制备特别适于植物转化的重组载体的方法可参见美国专利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。这些载体已有相关综述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。

可用于在细胞和高等植物中表达的典型载体是本领域已知的，如衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)根瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。其它可用于植物转化的重组载体也已有描述(Fromm等，1985)。这类重组载体的元件包括，但不限于上文所述。

转化的宿主细胞一般可以是与本发明相容的任何细胞。转化的宿主植物或细胞可以来源于单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于，canola，两节荠属(crambe)，玉米(maize)，白芥(mustard)，蓖麻子，芝麻，棉籽，亚麻子(linseed)，大豆，拟南芥属(Arabidopsis)，菜豆属(Phaseolus)，花生，苜蓿(alfalfa)，小麦，稻，燕麦，高梁，油菜籽(rapeseed)，黑麦，tritordeum，millet，羊茅(fescue)，多年生麦草(perennial ryegrass)，甘蔗，红莓苔子(cranberry)，番木瓜(papaya)，香蕉，红花，油棕(oil palm)，亚麻(flax)，香瓜(muskmelon)，苹果，黄瓜，石斛(dendrobium)，剑兰(gladiolus)，菊花(chrysanthemum)，百合科(liliacea)，棉花，桉(eucalyptus)，向日葵，芸苔(Brassica campestris)，欧洲油菜(Brassica napus)，turfgrass，甜菜(sugarbeet)，咖啡和薯蓣(dioscorea)(Christou，In：Particle Bornbardnme for genetic Engineering of Plants，Biotechnology Intelligence Unit，Academic Press，San Diego，California(1996))，其中优选canola，玉米，芸苔，欧洲油菜，油菜籽，大豆，红花，小麦，稻和向日葵，更优选canola，油菜籽，玉米，芸苔，欧洲油菜，大豆，向日葵，红花，油棕和花生。在一个特别优选的实施方案中，所述植物或细胞是canola或者来源于canola。在另一特别优选实施方案中，所述植物或细胞是欧洲油菜或者来源于欧洲油菜。在另一特别优选实施方案中，所述植物或细胞是大豆或者来源于大豆。

大豆细胞或植物优选大豆优良细胞品系。“优良品系”是经过育种和筛选而得到的具有出色的农艺表现的任何品系。优良品系的实例有面向农民或大豆种植者出售的品系，如HARTZ^TM品种H4994，HARTZ^TM品种H5218，HARTZ^TM品种H5350，HARTZ^TM品种H5545，HARTZ^TM品种H5050，HARTZ^TM品种H5454，HARTZ^TM品种H5233，HARTZ^TM品种H5488，HARTZ^TM品种HLA572，HARTZ^TM品种H6200，HARTZ^TM品种H6104，HARTZ^TM品种H6255，HARTZ^TM品种H6586，HARTZ^TM品种H6191，HARTZ^TM品种H7440，HARTZ^TM品种H4452 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H4994 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H4988 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5000 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5147 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5247 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5350Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5545 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5855 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5088 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5164 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5361 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5566 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5181 RoundupReady^TM，HARTZ^TM品种H5889 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H5999Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6013 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6255 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6454 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H6686 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H7152 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H7550 Roundup Ready^TM，HARTZ^TM品种H8001 RoundupReady^TM(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045 AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，Des Moines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品种CX445(DeKalb，Illinois)。

本发明还涉及制备转化的植物的方法，所述植物包含按照5’至3’方向排列的启动子以及与其可操作相连的异源结构核酸序列。还可将其它序列与启动子和结构核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3’转录终止子，3’聚腺苷酸化信号，其它非翻译序列，转位或靶向序列，选择标记，增强子，以及操纵子。优选的重组载体，结构核酸序列，启动子，和其它调节元件，包括但不限于本文中公开的那些。

所述方法通常包括选择适当的植物，用重组载体转化该植物，和获得转化的宿主细胞等步骤。

有多种方法可将核酸引入植物。适当的方法包括细菌感染(例如土壤杆菌)，二元细菌人工染色体载体，核酸的直接运送(例如经由PEG-介导的转化，干燥(desiccation)/抑制作用-介导的核酸摄入，电穿孔，用碳化(carbide)硅纤维进行的搅拌，以及对核酸包被的粒子进行加速，等等(见Potrykus等，1991的综述)。

将核酸引入细胞的技术为本领域技术人员所熟知。这些方法通常被归类为4类：(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美国专利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受体-介导的机制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。或者，可以直接将核酸引入花粉，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以将核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。

从转化植物的原生质体或外植体再生、发育和培养植物的方法为本领域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，通常在能选择成功转化的细胞并诱导植物苗枝再生的选择培养基存在的条件下培养转化体(Fraley等，1983)。这些苗枝通常在2-4个月内获得。

然后将苗枝转移至合适的根-诱导培养基中，该培养基中包含选择试剂以及阻止细菌生长的抗生素。大多数苗枝将发育出根。然后将它们移植到土壤或其它基质中，以使根继续发育。以上概述的方法常常根据所用具体植物株系的不同而有变动。

优选再生的转基因植物能自花授粉，从而提供纯合型转基因植物。或者，可将所述再生转基因植物的花粉与非-转基因植物杂交，优选与农艺上重要的物种的近交系杂交。反过来，可用非-转基因植物的花粉对所述再生转基因植物授粉。

转基因植物可将编码增强型基因表达的核酸序列传给它的后代。转基因植物优选为编码增强型基因表达的核酸的纯合型，能通过有性繁殖将该序列传递给它的所有后代。后代可以从转基因植物所产生的种子发育而成。这些另外的植物然后可通过自花授粉产生真正的植物育种系。

可对这些植物的后代进行评估，例如，评估其基因表达。基因表达可通过多种常用方法来检测，如western印迹，northern印迹，免疫沉淀，和ELISA。

本发明的植物或制剂可以用于多种方法中，所述方法例如而非限制于：获得表达结构核酸分子的种子，获得增加了结构基因的产物的种子，获得增加了结构基因的产物的粗粉，获得增加了结构基因的产物的原料，以及获得增加了结构基因的产物的油。

在所述方法中用到的植物可以进行加工。可以将植物或植物的一部分与其它植物部分分隔或分离。为此目的而优选的植物部分是种子。可以理解，即使是与其它植物部分分隔或分离后，所分离或分隔出的植物部分仍可能混有其它植物部分。在一个优选方面，所分隔的植物部分占所分隔的物质的约50％(w/w)以上，更优选约75％(w/w)以上，还更优选约90％(w/w)以上。本发明中由所述方法产生的植物或植物部分可以用已知技术加工成产物。优选的产物是粗粉，原料和油。

饲料(feed)，粗粉，蛋白和油制品

本发明的任何植物或其部分可以经过加工制成饲料，粗粉，蛋白或油制品。为此目的的一个特别优选的植物部分是种子。在一个优选实施方案中，饲料，粗粉，蛋白或油制品是设计用于反刍动物的。制备饲料，粗粉，蛋白和油制品的方法是已知的。参见，例如，美国专利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选实施方案中，所述蛋白制品是高蛋白制品。这种高蛋白制品优选蛋白含量约5％w/v以上，更优选约10％w/v，还更优选约15％w/v。在优选的油制品中，油制品可以是高油制品，其中来源于本发明植物或其一部分的油的含量为约5％w/v以上，更优选约10％w/v以上，还更优选约15％w/v以上。在一个优选实施方案中，油制品是液体，体积超过约1升，约5升，约10升，或约50升。本发明提供从本发明的植物制备的油或者是通过本发明的方法制备的油。所述油可以是任何所得产物的次要或主要组分。而且，所述油可以与其它多种油混合。在一个优选实施方案中，从本发明的植物制备的油或者是通过本发明的方法制备的油，在任何产物的油组分中占体积或重量的约0.5以上，约1以上，约5以上，约10以上，约25以上，约50以上，约75以上，或约90％以上。在另一实施方案中，所述油制品可以是混合物，并且可以在该混合物总体积中占约10以上，约25以上，约35以上，约50以上，或约75％以上。由本发明的植物制备的油可以与一或多种有机溶剂或石油蒸馏物混合。

种子容器

可以将植物的种子放置在容器中。本文中，容器是指任何能够容纳所述种子的物体。容器优选包含约500，约1,000，约5,000，或约25,000个以上的种子，其中至少约10，约25，约50，约75或约100％的种子来自本发明的植物。

育种计划

本发明的植物可以是育种计划的一部分或者是从该计划中产生的。对育种方法的选择取决于植物繁殖的模式，待改进的性状的遗传率，市场上所用的品种的类型(例如，F₁杂交品种，纯系品种，等)。选出用于培育本发明植物的非限制性方法如下。育种计划可以利用对任何杂交后代的标记物辅助性选择来强化。还应理解，任何商业和非商业品种可以在一个育种计划中应用。因素包括，例如，应急活力(emergence vigor)，营养势，逆境耐性，疾病抗性，分支，开花，种子set，种子大小，种子密度，站立能力(standability)，以及脱粒能力(threshability)等通常决定了上述选择。

对于高度可遗传的性状而言，选择在单一地区进化而成的较高等的单个植株是有效的，而对于具有低遗传率的特性而言，选择应该基于从相关植物家族的重复评价中得出的平均值。群体选择方法常常包括谱系选择，改良的谱系选择，混合选择和轮回选择。在一个优选实施方案中，采取回交或轮回育种计划。

遗传的复杂性影响了对育种方法的选择。回交育种可用于将高度可遗传性状的一或多个有利(favorable)基因转移到所需的品种中。该方法已经广泛用于培育抗病品种。各种轮回选择技术已用于从量上改进受多个基因控制的遗传特性。轮回选择中自花授粉作物中的应用取决于授粉是否简便(ease)，每次授粉得到成功杂种的频率，以及每次成功杂交的杂种后代的数目。

可以对育种品系进行测试，并将它们与适当的标准在代表商业目标地区的环境中比较两代或更多代。最好的品系将有可能成为新的商业化品种；那些仍然在性状上有特性缺陷的品系可作为亲本，用于产生新的群体，以备进一步选择。

鉴定优势(superior)植物的一种方法是，观察它相对于其它实验植物以及相对于广泛培养标准品种的表现。如果一次观察得不出结论，可以进行多次观察，以便较好地评估其遗传价值。培育者可以选择并杂交两种或更多种亲本品系，然后反复自交和选择，产生很多新遗传组合。

新品种的开发必需有变种的开发和选择，这些变种的杂交以及优势杂交种的选择。杂种的种子可以通过，用手工操作使选出的雄性能育亲本杂交，或通过利用雄性不育体系，来产生。在杂种中选择特定的单基因特性，如荚果的颜色，花的颜色，种子的产量，短柔毛的颜色，或对除草剂的抗性，它们可指示该种子确实是真正的杂种。关于亲本品系的其它信息，以及杂种的表型，影响了培育者关于是否继续用该具体杂种进行杂交的决定。

谱系选择和轮回选择育种方法可用于从培育群体中开发品种。育种计划将来自两或多个品种或者各种广泛来源的所需特性组合成育种库(pool)，在该库中，通过自交并选择所需表型来开发品种。可以评价多个新品种，以便确定哪一个新品种具有商业潜力。

谱系育种常用于改良自花授粉的作物。使两个具有有利的互补特性的亲本杂交，产生F1。通过一或多个F1的自交产生F2群体。从最佳家族选出最佳个体单株。在F4代中开始反复测试各个家族，改善对低遗传率特性进行选择的有效性。在育种的更先进阶段(即F6和F7代)，测试最佳品系或者表型相似品系的混合体，以便能选出可能作为新品种的品系。

回交育种已用于将简单遗传的高度可遗传性状转移到所需纯合子品种或近交系(inbred line)中，后者是回归亲本。需要转移的性状的来源可称为供体亲本。预计所得植物具有回归亲本(例如，载培品种(cultivar))的特征，以及供体亲本的所需性状。最初的杂交后，选出具有供体亲本表型的个体，反复与回归亲本杂交(回交)。所得植物预计具有回归亲本(例如，载培品种)的特征，以及供体亲本的所需特性。

单-种子世代(descent)方法在严格意义上是指，种植分离群体，每一植株收获一个种子的样品，用该一种子(one-seed)样品培育下一代。当该群体从F2代发展到所需的培育阶段时，对衍生出品系的那些植物追踪到不同的F2代个体。群体中植物的数量代代递减，原因是一些种子不能发芽，或者一些植物不能产生哪怕是一粒种子。结果，并非该群体中最初采样的所有F2代植物在传代结束时都有相应子代。

在多-种子方法中，培育者常常从群体中的每一植株收获一或多个荚果，使它们脱粒，共同形成一个混合群(bulk)。用该混合群的一部分培育下一代，将另外的部分储备起来。该方法被称为改良的单-种子世代技术或荚-群(pod-bulk)技术。

多-种子方法已用于减少收获所需劳动。用机器使荚果脱粒要比单-种子方法中用手工取出每个种子快得多。多-种子方法还使得有可能在每一次近交时培育群体中相同数量的种子。

对其它常用于不同特性和作物的育种方法的描述可参见多篇参考书之一(例如，Fehr，Principles of Cultivar Development Vol.1，pp.2-3(1987))。

本发明的转基因植物还可利用无融合生殖来繁殖。无融合生殖是植物繁殖的遗传控制方法，该方法中的胚是在没有卵与精子结合的情况下形成的。无融合生殖有三种基本类型：(1)无孢子生殖，其中的胚由源自核的胚囊中染色体未减少的卵发育而成，(2)二倍性孢子形成，其中的胚由源自大孢子母细胞的胚囊中未缩小的卵发育而成，和(3)不定胚生殖，其中的胚直接由体细胞发育而成。在无融合生殖的大多数形式中，极核假受精或受精产生胚乳是种子活力所必需的。在无孢子生殖中，可以用滋养品种作为种子中胚乳形成的花粉源。所述滋养品种并不影响无孢子无融合生殖品种的遗传(因为该品种的未缩小(unreduced)的卵是通过孤雌生殖发育而成的)，却为胚乳的产生提供了可能。无融合生殖具有经济重要性，尤其是在转基因植物中，因为它使得任何基因型(无论是否杂合)都可以被真正地培育出来。因此，有了无融合生殖以后，杂合型转基因植物可以在反复的生命周期中维持它们的遗传忠实性。制备无融合生殖植物的方法是本领域已知的。参见，美国专利5,811,636。

其它生物

可将本发明核酸序列引入任何细胞或生物，如哺乳动物细胞，哺乳动物，鱼的细胞，鱼，鸟的细胞，鸟，藻类的细胞，藻类，真菌的细胞，真菌，或细菌的细胞。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞如曲霉属细胞，酵母，哺乳动物(尤其牛和猪)，昆虫，细菌和藻类。优选的细菌是大肠杆菌和根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

转化这类细胞或生物的方法是本领域已知的(EP 0 238 023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；Becker and Guarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；Bennett and LaSure，1991)。从这类生物体产生本发明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，1990；Jarai and Buxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；Gethingand Sambrook，1992；Puig and Gilbert，1994；Wang and Tsou，1993；Robinson等，1994；Enderlin and Ogrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；andJulius等，1983)。

实施例

提供以下实施例，不应以任何方式将它们解释为限制本发明的范围。

实施例1-制备大豆(Glycine max L.)7Sα启动子的克隆

用Universal Genome Walker Kit(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California)，按照说明书，从大豆基因组DNA(Asgrow A3244)获得7Sα启动子。该过程由两个PCR扩增组成，每一扩增反应利用了一种衔接子引物和一种基因-特异性引物。为了鉴定适合作为模板DNA的具有最小同源性的区域，将7Sα和7Sα’(GlcX(7Sα’)和GIcA(7Sα))基因的编码区序列对比排列，鉴定出两个非同源区(图1)。基于所鉴定的非同源区，制备以下基因特异性引物：

在初步PCR扩增中，使用GlcA-GW-初级：3’末端(互补于图1中的下划线序列)

5’-CTTCTGATGAGGTGGGCGTGGGAATGGGAA-3’[SEQ ID NO：6]

在第二步PCR扩增中，使用GIcA-GW-巢式(在该引物5’末端添加了克隆位点BglII和NcoI)：3’末端(互补于图1中的粗体序列)

5’-CCATGGAGATCTATCTTGTTCTCATCCTCATCCTCATC-3’[SEQID NO：7]

该方法中用到以下衔接子引物：

5’末端初级(Primary)：API seq：

5’-GTATACGACTCACTATAGGGC-3’[SEQ ID NO：9]

AP5(在该引物5’末端添加了克隆位点HindIII和PstI)巢式5’末端

5’-AAGCTTCTGCAGGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’[SEQ ID NO：5]

该过程中分离出三个克隆，并对它们测序。序列比对表明，所有这三个克隆代表了相同的7Sα基因，其中克隆8A最长。这些克隆分别为8A(2.3Kb)，7C(1.5Kb)和9C(1.3Kb)。这些初始克隆包含与7Sα基因(β-伴大豆球蛋白(conglycinin)的亚单位之一)编码区的一部分以及启动子相连的序列。为了证实8A克隆是7Sα基因，将8A克隆的3’序列与公开的cDNA序列(GenBank登录号X17698)进行比对。该比对证实，所述PCR产物与7Sα而不是7Sα’基因的上游区同源。

然后对7C，8A，和9C进行亚克隆，以便提供仅含有7Sα基因的5’UTR区和启动子的小片段。以7C，8A，和9C这几个克隆为模板，进行上述PCR扩增反应。AP5引物是衔接子引物，基因特异性引物是：5’-CCATGGAGATCTAAGGAGGTTGCAACGAGCGTGGCAT-3’[SEQ ID NO：10]。

这种基因特异性引物被设计成，可以将BglII和NcoI限制位点引入3’末端，从而有利于后续克隆。所得克隆用标准方法测序，并再克隆到新的pGEM-T easy载体(Promega，Madison，WI，U.S.；美国专利4,766,072)中，产生以下载体：

p-GEM-T 1A.1.7Kb插入子源自初始克隆8A，

p-GEM-T 2A.1.3Kb插入子源自初始克隆7C，和

p-GEM-T 3A.1.1Kb插入子源自初始克隆9C。

用p-GEM-T 1A，p-GEM-T 2A，和p-GEM-T 3A的核苷酸序列预测相应的氨基酸序列。然后，将预测的氨基酸序列与7Sα基因产物(GIcA)(GenBank登录号X17698和SWISS-PROT登录号P13916)的蛋白翻译序列进行比对，以便鉴定出起始密码子。序列比对采用GCG软件(Genetics ComputerGroup，Oxford Molecular Group，Inc.)的序列比对功能进行。然后，用1A，2A，和3A克隆作模板进行另一次PCR反应，其中使用AP5作衔接子引物，使用以下序列作为基因特异性引物：

5’-CCATGGAGATCTAGTATCTTAATTATTTATTAAGGTAT-3’[SEQ IDNO：8]

另外，在该引物的5’末端添加NcoI和BglII位点(用斜体表示)。将该反应的PCR产物纯化，并再次克隆到pGEM-T easy载体中，得到：p-GEM-T1T，1724个碱基对的插入子源自克隆1A；p-GEM-T“new”2A，1135个碱基对的插入子源自克隆2A；p-GEM-T“new”3A，918个碱基对的插入子源自克隆3A。p-GEM-T 1T的序列见图2。

实施例2

该实施例表明，新克隆的7Sα变体的启动子活性在瞬时转化的大豆子叶中得到证实。

将实施例1的三个克隆(1T，新2A，和新3A)通过凝胶电泳纯化(QIAquick kit，产品目录编号28704，Qiagen Company，Valencia，California)，再克隆到pMON8677(图3)中原来由e35S启动子占据的位置，在GUS报告基因的上游。所得质粒图谱见图2a的pMON55548(1T)，图3a的pMON55546(新2A)和图4的pMON55547(新3A)。用其中两个质粒pMON55546和pMON55548进行大豆子叶的瞬时试验。

在大豆植株(Asgrow A3244)开花的25-28天后，收获其种子，在添加了50mM谷氨酰胺，111mM麦芽糖，125mM棉籽糖，125mM甘露醇和3g/l纯琼脂的GAMBORG培养基(G5893，Sigma Company，St.Louis，Missouri)，pH5.6中25℃渗透处理过夜。得到125个子叶，将它们都切为两半，用来自pMON55546和pMON55548的7Sα启动子构建体的纯化超螺旋DNA进行轰击，采用的是粒子枪技术(Maliga等，1995，“Methods in Plant MolecularBiology，A Laboratory Course Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，第47页)。试验中还包括另一种受分离的(separate)e35S驱动的萤光素酶构建体作为低表达对照，它与上述每一种启动子构建体的摩尔比为1∶1。经过轰击的组织随后在25℃孵育48小时。

用1ml提取缓冲液从6份经过轰击的大豆子叶中提取蛋白，所述提取液中包含0.1M磷酸钾(pH7.8)，10mM DTT，1mM EDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制剂(1片/50ml，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。用100μl等份试样的蛋白提取物按照Promega的“Steady-Glo”方案(目录号E2510，Promega Corporation Madison，WI)进行萤光素酶试验。用50μl等份试样的蛋白提取物进行标准的GUS试验，但试验方案略有调整(Maliga等，1995，“Methods in Plant Molecular Biology，A Laboratory Course Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第29页)。每份样品分析双份，取平均值进行数据分析。将GUS活性用萤光素酶活性校准，结果表明，7Sα启动子的所有变体都在大豆子叶组织中具有功能。

实施例3-生成包含7Sα启动子的大豆植物

将pMON55548中的表达盒(7Sα-1T-GUS-NOS-3′)亚克隆，得到载体pMON55554，它是一种土壤杆菌转化载体，能证实7Sα启动子在大豆植物中的效力(图5)。pMON55554中还包含一种草甘膦抗性选择标记(CP4)。将该载体引入ABI根瘤土壤杆菌菌株中，用所得转化细胞感染大豆(AsgrowA3244)的子叶。作为对照，用截短的Arcelin 5启动子替代7Sα-1T，得到pMON55542(图6)。将该载体引入ABI根瘤土壤杆菌菌株中，用所得转化细胞感染大豆(Asgrow A3244)的子叶。

从受到根瘤土壤杆菌感染的组织再生得到植物，选出草甘膦抗性植物，从中得到成熟的种子，分析它们的GUS活性。为了分析GUS活性，将来自每一转基因事件(品系)的8个种子分别磨碎。约20mg磨碎的种子组织用200μl提取缓冲液进行提取，所述提取液含有0.1M磷酸钾(pH7.8)，10mMDTT，1mM EDTA，5％甘油，以及蛋白酶抑制剂(1片/50ml，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)。提取物的蛋白含量用Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad，#61234A)测定，GUS活性用略经调整的标准GUS试验方案测定(Maliga等，1995，“Methods in Plant Molecular Biology，A Laboratory CourseManual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第29页)。将GUS活性用蛋白浓度校准。每份样品分析双份，取平均值进行数据分析。

如果一个事件(品系)的8个种子无一测出GUS活性，就将该事件排除。在显示GUS活性的每一事件中，选出具有最强活性的种子，对其重复GUS活性试验，结果见图7。pMON55554的28个阳性事件以及pMON55542的11个阳性事件表明，7Sα启动子最起码与截短的Arcelin 5启动子效力一样(图7)。

实施例4制备含有7Sα启动子或Arcelin 5启动子的转基因拟南芥属植物(Arabidopsis)

受pMON55553(图8)中的7Sα1T启动子驱动或者受pMON55541(图9)中的tArc5驱动而进行的GUS表达，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中进行检查。pMON55553(7Sα1T-GUS-NOS)GUS和pMON55541(tArc5-GUS-NOS)GUS的表达在1周龄幼苗以及在成熟植株中检查。表达pMON55553质粒的植株和幼苗显示，当使用7Sα1T启动子时，GUS不出现在根或成熟的叶中。在下胚轴和子叶中发现活性，这是由胚发育期间合成的残留GUS所致。表达pMON55541的植株和幼苗显示，当使用tArc5启动子时，除了在下胚轴和子叶中检测到GUS信号以外，GUS还出现在根或成熟的叶中。这些信息表明，7Sα启动子比tArc5启动子具有改善的种子特异性。

参考文献

Ainley等，Plant Mol.Biol.，14：949，1990.

Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons，Inc.，1995.

Bartley and Scolnik，Plant Physiol.，104：1469-1470，1994.

Back等，Plant Mol.Biol.，17：9，1991.

Bauer等，Gene，37：73，1985.

Becker and Guarente，In：Abelson and Simon(eds.)，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods Enzynlol.，Vol.194，pp.182-187，Academic Press，Inc.，New York.

Bennettand LaSure(eds.)，More Gene Manipulations in Fungi，AcademicPress，CA，1991.

Bergeron等，TIBS，19：124-128，1994.

Bustos等，EMBO J.，10：1469-1479，1991.

Castresana等，EMBO J.，7：1929-1936，1988.

Capecchi，Cell，22(2)：479-488，1980.

Cerda-Olnedo等，J.Mol.Biol.，33：705-719，1968.

Chau等，Science，244：174-181.1989.

Christensen等，Plant Mol.Biol.，18：675，689，1992.

Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168，1993.

Costa等Methods Mol.Biol.，57：31-44，1996.

Craik，BioTechniques，3：12-19，1985.

Craig，Science，260：1902-1903，1993.

Curiel等，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154，1992.

Cyanobase，http：//www.kazusa.or.jp/cyanobase.

Dellaporta等，Stadler Symposium，11：263-282，1988.

Demolder等，J.Biotechnology，32：179-189，1994.

Deng and Nickloff，Anal.Biochem.，200：81，1992.

D′Halluin等，Bio/Technology 10：309-314，1992.

Doyle等，J.Biol.Chem.，261：9228-9238，1986.

Eglitis and Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614，1988.

Enderlin and Ogrydziak，Yeast，10：67-79，1994.

Feinbaum等，Mol.Gen.Genet.，226：449-456，1991.

Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803，1983.

Frits Eckstein等，Nucleic Acids Research，10：6487-6497，1982.

Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985.

Fromm等，Bio/Technology，8：833，1990.

Fuller等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，86：1434-1438，1989.

Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)：11478-11482，1993.

Gething and Sambrook，Nature，355：33-45，1992.

Glick等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRCPress，Boca Raton，Fla.，1993.

Graham and Van der Eb，Virology，54(2)：536-539，1973.

Greener等，Mol.Biotechnol.，7：189-195，1997.

Hartl等，TIBS，19：20-25，1994.

Hershey and Stoner，Plant Mol.Biol.，17：679-690，1991.

Hess，Intern Rev.Cytol.，107：367，1987.

Hinchee等，Bio/Technology，6：915-922，1988.

Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，75：1920，1978.

Horsch等，Science，227：1229-1231，1985.

Ikatu等，Bio/Technol.，8：241-242，1990.

Jarai and Buxton，Current Genetics，26：2238-2244，1994.

Jefferson(I)，Plant Mol.Biol，Rep.，5：387-405，1987.

Jefferson(II)等，EMBO J.，6：3901-3907，1987.

Johnston and Tang，Methods Cell Biol.，43(A)：353-365，1994.

Jones等，Science，266：789-793，1994.

Jones等，Mol.Gen.Genet.，1987.

Julius等，Cell，32：839-852，1983.

Julius等，Cell，37：1075-10-89，1984.

Kares等，Plant Mol.Biol.，15：905，1990.

Katz等，J.Gen.Microbiol.，129：2703-2714，1983.

Keegstra，Cell，56(2)：247-253，1989.

Keller等，EMBO L.，8：1309-1314，1989.

Knutzon等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，89：2624-2628，1992.

Kridl等，Seed Sci.Res.，1：209，1991.

Kudla等，EMBO，9：1355-1364，1990.

Kuhlemeier等，Seeds，1：471，1989.

Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：488-492，1985.

Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132，1982.

Lam and Chua，J.Biol. Chem.，266：17131-17135，1990.

Lam and Chua，Science，248：471，1991.

Lipman and Pearson，Science，227：1435-1441，1985.

Lindstrom等，Developmental Genetics，11：160，1990.

Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95(5)：2105-2110，1998.

Lu等，J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096，1993.

Luo等，Plant Mol Biol.Reporter，6：165，1988.

MacKenzie等，Journal of Gen.Microbiol.，139：2295-2307，1993.

Malardier等，Gene，78：147-156，1989.

Mandel等，Plant Mol.Biol，29：995-1004，1995.

McElroy等，Seeds，2：163-171，1990.

Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：12760-12764，1994.

Needleman and Wunsch，Journal of Molecular Biology，48：443-453，1970.

Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.，75：30，1987.

Odell等，Nature，313：810，1985.

Osuna等，Critical Reviews In Microbiology，20：107-116，1994.

Ou-Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，83：6815，1986.

Ow等，Science，234：856-859，1986.

Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，85：2444-2448，1988.

Pearson，＂Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA.＂In Methods in Enzymology，(R.Doolittle，ed.)，183，63-98，AcademicPress，San Diego，California，USA，1990.

Pearson，Protein Science，4：1145-1160，1995.

Pena等，Nature，325：274，1987.

Poszkowski等，EMBO J.，3：2719，1989.

Potrykus等，Ann.Rev.Plant Plzysiol.Plant Mol.Biol.，42：205，1991.

Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188，1985.

Puig and Gilbert，J.Biol.Chem.，269：7764-7771，1994.

Pyee等，Plant J.，7：49-59，1995.

Reynaerts等，＂Selectable and  Screenable Markers.＂In Plant MolecularBiology Manual，(Gelvin and Schilperoort，eds.)，Kluwer，Dordrecht，1988.

Richins等，Nucleic Acids Res.，20：8451，1987.

Robinson等，Bio/Technology，1：381-384，1994.

Rodriguez等，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses，Butterworths，Boston，1988.

Rogan and Bessman，J.Bacteriol.，103：622-633，1970.

Rogers等，Meth.In En2 ymolX 153：253-277，1987.

SaintGuily等，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071，1992.

Samac等，Seeds，3：1063-1072，1991.

Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989.

Sato等，J.DNA Res.，7(1)：31-63，2000.

Schulze-Lefert等，EMBO J.，8：651，1989.

Simpson，Science，233：34，1986.

Singer and Kusmierek，Ann.Rev.Biochem.，52：655-693，1982.

Slighton and Beachy，Planta，172：356，1987.

Smith等，In Genetic Engineering：Principles and Methods，(Setlow等，ed.)，Plenum Press，NY，1-32，1981.

Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics，2：482-489，1981.

Smith等，Nucleic Acids Research，11：2205-2220，1983.

Smith等，Plant J.，11：83-92，1997.

Stalker等，J.Biol.Chem.，263：6310-6314，1988.

Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，75：3737-3741，1978.

Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，951(17)：9879-9884，1998.

Thillet等，J.Biol.Chem.，263：12500-12508，1988.

Vandeyar等，Gene，65：129-133，1988

Van Tunen等，EMBO J.，7：1257，1988.

Verdier，Yeast，6：271-297，1990.

Vodkin等，Cell，34：1023，1983.

Vogel等，J.Cell Biochem.，(Suppl)13D：312，1989.

Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992.

Wang and Tsou，FASEB Journal，7：1515-1517，1993.

Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1988.

Weisshaar等，EMBO J.，10：1777-1786，1991.

Wenzler等，Plant Mol.Biol.，12：41-50，1989.

Williams等，Biotechnology，10：540-543，1992.

Wong and Neumann，Biochim.Biophys.Res.Conzrmun.，107(2)：584-587，1982.

Xia等，J.Gen.Microbiol.，138：1309-1316，1992.

Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA？87：4144-48，1990.

Yamaguchi-Shinozaki等，Plant Mol.Biol.，15：905，1990.

Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，81：1470-1474，1984.

Zhou等，Methods in Enzymology，101：433，1983.

Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)，80：1101-1105，1983.

美国专利4,683,195；4,683,202；4,757,011；4,769,061；4,885,357；4,886,878；4,940,835；4,957,748；4,971,908；5,057,419；5,093,249；5,100,679；5,147,792；5,215,912；5,219,596；5,270,200；5,298,421；5,304,481；5,344,771；5,362,865；5,576,203；5,508,468；5,003,045；5,955,329；5,367,110；5,858,749；6,040,160；5,610,041；5,618,988；6,107,060；5,811,636；4,766,072；5,003,045；5,576,203；5,384,253；5,443,974；5,512,482；5,530,186；5,534,421；5,552,306；5,589,616；5,508,468；5,614,393；5,663,068；5,663,068；5,633,436；5,639,790；5,654,402；5,659,645；5,689,050；5,689,050；5,689,052；5,705,391；5,760,206；5,759,829；5,789,220；5,807,893；5,850,024；5,856,157；5,866,789；5,885,802；5,885,801；5,914,450；5,942,660；5,945,585；5,952,544；5,955,650；5,965,727；5,995,329；5,990,384；5,990,389；5,936,069；5,939,599；6,005,076；6,051,754；6,075,183；6,043,411；6,100,091；6,107,051；6,110,891；6,117,677；6,194,167；6,146,669；6,147,279；6,156,227；6,172,106；6,232,122.

欧洲申请0 154 204；0 238 023；0 255 378.

PCT申请：WO 90/01869；WO 91/13993；WO 92/14822；WO 93/08682；WO 94/20628；WO 95/19442；WO 97/26366；WO 97/28247；WO 97/22703；WO 98/55601；WO 98/26064；WO 96/17064；WO 97/35023；WO 00/19839；WO 99/06581；WO 99/02656；WO 99/40209；WO 99/11800；WO 99/49058；WO 00/32757；WO 00/10380。

                               序列表

<110>Renessen LLC

     Wang，Qi

     Dubois，Patrice

<120>用于植物中基因表达的种子特异性7Sα启动子

<130>60/316,975

<150>60/316,975

<151>2001-09-05

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1318

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>1

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtaaaaacaa aaacaaaatt tctcttttat      60

tgattaatta aaataatttt ataactacat ttattttcta ttattatcaa ttttcttctg     120

tttttttatt tggcatatat acctagacaa gtcaaaaaat gactattctt taataatcaa     180

tcattattct tacatattgt tcgaactacg agttatgaag tgtcaattgc accttagtgt     240

tttgataggc ctccatttgc cgctcattaa ttaatttgat aacagccgta ccgatcaatt     300

acttatgctt cttccatcgt aattatatgc atgtcggttc ttttaatctt ggtactctcg     360

aatgccacca caacactgac tagtctcttg gatcatgaga aaaagccaaa gaacaaaaaa     420

gacaacataa agagtatcct ttgcaaaaaa atgtctaagt tcataaaata caaacaaaaa     480

cgcaatcaca cacagtggac ccaaaagcca tgcacaacaa cgcgtactca ccaaggtgca     540

atcgtgctgc ccaaaaacat tcaccaactc aatccatgat gagcccacac atttgttgtt     600

tgtaaccaaa tctcaaacgc ggtgttctct ttggaaagca accatatcag catatcacac     660

tatctagtct cttggatcac gcatgcgcaa ccaaaagaca acacataaag tatcctttcg     720

aaagcaatgt ccaagtccat caaataaaat tgagacaaaa tgcaacctca ccccacttca     780

ctatccatgg ctgatcaaga tcgccgcgtc catgtaggtc taaatgccat gcacatcaac     840

acgtactcaa catgcagccc aaattgctca ccatcgctca acacatttct tgttaatttc     900

taagtacact gcctatgcga ctctaactcg atcacaacca tcttccgtca catcaatttt     960

gttcaattca acacccgtca acttgcatgc caccccatgc atgcaagtta acaagagcta    1020

tatctcttct atgactataa atgcccgcaa tctcggtcca ggttttcatc atcgagaact    1080

agttcaatat cctagtatac cttaataaat aatttaagat actatgatga gagcacggtt    1140

cccattactg ttgctgggac ttgttttcct ggcttcagtt tctgtctcat ttggcattgc    1200

ttactgggaa aaagagaacc ccaaacacaa caagtgtctc cagagttgca atagcgagag    1260

agactcgtac aggaaccaag catgccacgc tcgttgcaac ctccttagat ctccatgg      1318

<210>2

<211>1724

<212>DNA

<213>大豆

<400>2

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtctgtcttt tcaatttttt tggccacata      60

ttattcgggt tctgtgacct tttcaaaatg actgctatta cctcctgacc ttgctattac     120

atcttgacca tcactaggca tttaaaagta ttagtcatag tcacatatta ctacaaagcg     180

agattgatct ctctaatcta atgggtggga aaacacttat aatatatgat tcaagaaaag     240

aaagtaaata aaacaatttt attatataaa gactattagg ataaaaaaaa ccttaaaagt     300

gcttggattt ggaccagact tgaattttaa tttaatgata ttataatatg tgaatatatt     360

tttgagacaa ttgtaaattt cagataaaaa aataatgtaa ttaaaattgt aataactata     420

tcgtatacct aattaattat taaatgtgac aaaaaagata tacatcaaaa cttaatgttt     480

catgactttt ttttttaatg tgtgtcctaa atagaaatta aaaataaaaa ttattatatc     540

caaatgaaaa aaacatttaa tacgtattat ttaagaaata acaatatatt tatattttaa     600

tatgtattca catgtaaatt taaaaacaaa aacaaaattt ctcttttatt gattaattaa     660

aataatttta taactacatt tattttctat tattatcaat tttcttctgt ttttttattt     720

ggcatatata cctagacaag tcaaaaaatg actattcttt aataatcaat cattattctc     780

acatattgtt cgaactacga gttagtaagt gtcaattgca ccttagtgtt ttgataggcc     840

tccatttgcc gctcattaat taatttgata acagccgtac cgatcaatta cttatgcttc     900

ttccatcgta attatatgca tgtcggttct tttaatcttg gtactctcga atgccaccac     960

aacactgact agtctcttgg atcatgagaa aaagccaaag aacaaaaaag acaacataaa    1020

gagtatcctt tgcaaaaaaa tgtctaagtt cataaaatac aaacaaaaac gcaatcacac    1080

acagtggacc caaaagccat gcacaacaac acgtactcac caaggtgcaa tcgtgctgcc    1140

caaaaacatt caccaactca atccatgatg agcccacaca tttgttgttt gtaaccaaat    1200

ctaaaacgcg gtgttctctt tggaaagcaa ccatatcagc atatcacact atctagtctc    1260

ttggatcatg catgcgcaac caaaagacaa cacataaagt atcctttcga aagcaatgtc    1320

caagtccatc aaataaaatt gagacaaaat gcaacctcac cccacttcac tatccatggc    1380

tgatcaagat cgccgcgtcc atgtaggtct aaatgccatg cacatcaaca cgtactcaac    1440

atgcagccca aattgctcac catcgctcaa cacatttctt gttaatttct aagtacactg    1500

cctatgcgac tctaactcga tcacaaccat cttccgtcac atcaattttg ttcaattcaa    1560

cacccgtcaa cttgcatgcc accccatgca tgcaagttaa caagagctat atctcttcta    1620

tgactataaa tacccgcaat ctcggtccag gttttcatca tcgagaacta gttcaatatc    1680

ctagtatacc ttaataaata atttaagata ctagatctcc atgg                     1724

<210>3

<211>1135

<212>DNA

<213>大豆

<400>3

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtaaaaacaa aaacaaaatt tctcttttat      60

tgattaatta aaataatttt ataactacat ttattttcta ttattatcaa ttttcttctg     120

tttttttatt tggcatatat acctagacaa gtcaaaaaat gactattctt taataatcaa     180

tcattattct tacatattgt tcgaactacg agttatgaag tgtcaattgc accttagtgt     240

tttgataggc ctccatttgc cgctcattaa ttaatttgat aacagccgta ccgatcaatt     300

cattatgctt cttccatcgt aattatatgc atgtcggttc ttttaatctt ggtactctca     360

aatgccacca caacactgac tagtctcttg gatcatgaga aaaagccaaa gaacaaaaaa     420

gacaacataa agagtatcct ttgcaaaaaa atgtctaagt tcataaaata caaacaaaaa     480

cgcaatcaca cacagtggac ccaaaagcca tgcacaacaa cgcgtactca ccaaggtgca     540

atcgtgctgc ccaaaaacat tcaccaactc aatccatgat gagcccacac atttgttgtt     600

tgtaaccaaa tctcaaacgc ggtgttctct ttggaaagca accatatcag catatcacac     660

tatctagtct cttggatcac gcatgcgcaa ccaaaagaca acacataaag tatcctttcg     720

aaagcaatgt ccaagtccat caaataaaat tgagacaaaa tgcaacctca ccccacttca     780

ctatccatgg ctgatcaaga tcgccgcgtc catgtaggtc taaatgccat gcacatcaac     840

acgtactcaa catgcagccc aaattgctca ccatcgctca acacatttct tgttaatttc     900

taagtacact gcctatgcga ctctaactcg atcacaacca tcttccgtca catcaatttt     960

gttcaattca acacccgtca acttgcatgc caccccatgc atgcaagtta acaagagcta    1020

tatctcttct atgactataa atgcccgcaa tctcggtcca ggttttcatc atcgagaact    1080

agttcaatat cctagtatac cttaataaat aatttaagat actagatctc catgg         1135

<210>4

<211>918

<212>DNA

<213>大豆

<400>4

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtcctccatt tgccgctcat taattaattt     60

gataacagcc gtaccgatca attacttatg cttcttccat cgtaattata tgcatgtcgg    120

ttcttttaat cttggtactc tcgaatgcca ccacaacact gactagtctc ttggatcatg    180

agaaaaagcc aaagaacaaa aaagacaaca taaagagtat cctttgcaaa aaaatgtcta    240

agttcataaa atacaaacaa aaacgcaatc acacacagtg gacccaaaag ccatgcacaa    300

caacacgtac tcaccaaggt gcaatcgtgc tgcccaaaaa cattcaccaa ctcaatccat    360

gatgagccca cacatttgtt gtttgtaacc aaatctcaaa cgcggtgttc tctttggaaa    420

gcaaccatat cagcatatca cactatctag tctcttggat catgcatgcg caaccaaaag    480

acaacacata aagtatcctt tcgaaagcaa tgtccaagtc catcaaataa aattgagaca    540

aaatgcaacc tcaccccact tcactatcca tggctgatca agatcgccgc gtccatgtag    600

gtctaaatgc catgcacatc aacacgtact caacatgcag cccaaattgc tcaccatcgc    660

tcaacacatt tcttgttaat ttctaagtac actgcctatg cgactctaac tcgatcacaa    720

ccatcttccg tcacatcaat tttgttcaat tcaacacccg tcaacttgca tgccacccca    780

tgcatgcaag ttaacaagag ctatatctct tctatgacta taaatacccg caatctcggt    840

ccaggttttc atcatcgaga actagttcaa tatcctagta taccttaata aataatttaa    900

gatactagat ctccatgg                                                  918

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>合成的构建体

<400>5

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gt                                  32

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>合成的构建体

<400>6

cttctgatga ggtgggcgtg ggaatgggaa                                     30

<210>7

<211>38

<212>DNA

<213>合成的构建体

<400>7

ccatggagat ctatcttgtt ctcatcctca tcctcatc                            38

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>合成的构建体(synthetic construct)

<400>8

ccatggagat ctagtatctt aattatttat taaggtat                              38

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>合成的构建体

<400>9

gtatacgact cactataggg c                                                21

<210>10

<211>37

<212>DNA

<213>合成的构建体

<400>10

ccatggagat ctaaggaggt tgcaacgagc gtggcat                               37

<210>11

<211>1318

<212>DNA

<213>大豆

<400>11

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtaaaaacaa aaacaaaatt tctcttttat      60

tgattaatta aaataatttt ataactacat ttattttcta ttattatcaa ttttcttctg     120

tttttttatt tggcatatat acctagacaa gtcaaaaaat gactattctt taataatcaa     180

tcattattct tacatattgt tcgaactacg agttatgaag tgtcaattgc accttagtgt     240

tttgataggc ctccatttgc cgctcattaa ttaatttgat aacagccgta ccgatcaatt     300

acttatgctt cttccatcgt aattatatgc atgtcggttc ttttaatctt ggtactctcg     360

aatgccacca caacactgac tagtctcttg gatcatgaga aaaagccaaa gaacaaaaaa     420

gacaacataa agagtatcct ttgcaaaaaa atgtctaagt tcataaaata caaacaaaaa     480

cgcaatcaca cacagtggac ccaaaagcca tgcacaacaa cacgtactca ccaaggtgca     540

atcgtgctgc ccaaaaacat tcaccaactc aatccatgat gagcccacac atttgttgtt     600

tgtaaccaaa tctcaaacgc ggtgttctct ttggaaagca accatatcag catatcacac     660

tatctagtct cttggatcat gcatgcgcaa ccaaaagaca acacataaag tatcctttcg     720

aaagcaatgt ccaagtccat caaataaaat tgagacaaaa tgcaacctca ccccacttca     780

ctatccatgg ctgatcaaga tcgccgcgtc catgtaggtc taaatgccat gcacatcaac     840

acgtactcaa catgcagccc aaattgctca ccatcgctca acacatttct tgttaatttc     900

taagtacact gcctatgcga ctctaactcg atcacaacca tcttccgtca catcaatttt     960

gttcaattca acacccgtca acttgcatgc caccccatgc atgcaagtta acaagagcta    1020

tatctcttct atgactataa atacccgcaa tctcggtcca ggttttcatc atcgagaact    1080

agttcaatat cctagtatac cttaataaat aatttaagat actatgatga gagcacggtt    1140

cccattactg ttgctgggac ttgttttcct ggcttcagtt tctgtctcat ttggcattgc    1200

ttactgggaa aaagagaacc ccaaacacaa caagtgtctc cagagttgca atagcgagag    1260

agactcgtac aggaaccaag catgccacgc tcgttgcaac ctccttagat ctccatgg      1318

<210>12

<211>1724

<212>DNA

<213>大豆

<400>12

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtctgtcttt tcaatttttt tggccacata      60

ttattcgggt tctgtgacct tttcaaaatg actgctatta cctcctgacc ttgctattac     120

atcttgacca tcactaggca tttaaaagta ttagtcatag tcacatatta ctacaaagcg     180

agattgatct ctctaatcta atgggtggga aaacacttat aatatatgat tcaagaaaag     240

aaagtaaata aaacaatttt attatataaa gactattagg ataaaaaaaa ccttaaaagt     300

gcttggattt ggaccagact tgaattttaa tttaatgata ttataatatg tgaatatatt     360

tttgagacaa ttgtaaattt cagataaaaa aataatgtaa ttaaaattgt aataactata     420

tcgtatactt aattaattat taaatgtgac aaaaaagata tacatcaaaa cttaatgttt     480

catgactttt ttttttaatg tgtgtcctaa atagaaatta aaaataaaaa ttattatatc     540

caaatgaaaa aaacatttaa tacgtattat ttaagaaata acaatatatt tatattttaa     600

tatgtattca catgtaaatt taaaaacaaa aacaaaattt ctcttttatt gattaattaa     660

aataatttta taactacatt tattttctat tattatcaat tttcttctgt ttttttattt     720

ggcatatata cctagacaag tcaaaaaatg actattcttt aataatcaat cattattctt     780

acatattgtt cgaactacga gttatgaagt gtcaattgca ccttagtgtt ttgataggcc     840

tccatttgcc gctcattaat taatttgata acagccgtac cgatcaatta cttatgcttc     900

ttccatcgta attatatgca tgtcggttct tttaatcttg gtactctcga atgccaccac     960

aacactgact agtctcttgg atcatgagaa aaagccaaag aacaaaaaag acaacataaa    1020

gagtatcctt tgcaaaaaaa tgtctaagtt cataaaatac aaacaaaaac gcaatcacac    1080

acagtggacc caaaagccat gcacaacaac acgtactcac caaggtgcaa tcgtgctgcc    1140

caaaaacatt caccaactca atccatgatg agcccacaca tttgttgttt gtaaccaaat    1200

ctcaaacgcg gtgttctctt tggaaagcaa ccatatcagc atatcacact atctagtctc    1260

ttggatcatg catgcgcaac caaaagacaa cacataaagt atcctttcga aagcaatgtc    1320

caagtccatc aaataaaatt gagacaaaat gcaacctcac cccacttcac tatccatggc    1380

tgatcaagat cgccgcgtcc atgtaggtct aaatgccatg cacatcaaca cgtactcaac    1440

atgcagccca aattgctcac catcgctcaa cacatttctt gttaatttct aagtacactg    1500

cctatgcgac tctaactcga tcacaaccat cttccgtcac atcaattttg ttcaattcaa    1560

cacccgtcaa cttgcatgcc accccatgca tgcaagttaa caagagctat atctcttcta    1620

tgactataaa tacccgcaat ctcggtccag gttttcatca tcgagaacta gttcaatatc    1680

ctagtatacc ttaataaata atttaagata ctagatctcc atgg                     1724

<210>13

<211>1135

<212>DNA

<213>大豆

<400>13

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtaaaaacaa aaacaaaatt tctcttttat      60

tgattaatta aaataatttt ataactacat ttattttcta ttattatcaa ttttcttctg     120

tttttttatt tggcatatat acctagacaa gtcaaaaaat gactattctt taataatcaa     180

tcattattct tacatattgt tcgaactacg agttatgaag tgtcaattgc accttagtgt     240

tttgataggc ctccatttgc cgctcattaa ttaatttgat aacagccgta ccgatcaatt     300

acttatgctt cttccatcgt aattatatgc atgtcggttc ttttaatctt ggtactctcg     360

aatgccacca caacactgac tagtctcttg gatcatgaga aaaagccaaa gaacaaaaaa     420

gacaacataa agagtatcct ttgcaaaaaa atgtctaagt tcataaaata caaacaaaaa     480

cgcaatcaca cacagtggac ccaaaagcca tgcacaacaa cacgtactca ccaaggtgca     540

atcgtgctgc ccaaaaacat tcaccaactc aatccatgat gagcccacac atttgttgtt     600

tgtaaccaaa tctcaaacgc ggtgttctct ttggaaagca accatatcag catatcacac     660

tatctagtct cttggatcat gcatgcgcaa ccaaaagaca acacataaag tatcctttcg     720

aaagcaatgt ccaagtccat caaataaaat tgagacaaaa tgcaacctca ccccacttca     780

ctatccatgg ctgatcaaga tcgccgcgtc catgtaggtc taaatgccat gcacatcaac     840

acgtactcaa catgcagccc aaattgctca ccatcgctca acacatttct tgttaatttc     900

taagtacact gcctatgcga ctctaactcg atcacaacca tcttccgtca catcaatttt     960

gttcaattca acacccgtca acttgcatgc caccccatgc atgcaagtta acaagagcta    1020

tatctcttct atgactataa atacccgcaa tctcggtcca ggttttcatc atcgagaact    1080

agttcaatat cctagtatac cttaataaat aatttaagat actagatctc catgg         1135

<210>14

<211>918

<212>DNA

<213>大豆

<400>14

aagcttctgc agggtcgacg gcccgggctg gtcctccatt tgccgctcat taattaattt     60

gataacagcc gtaccgatca attacttatg cttcttccat cgtaattata tgcatgtcgg    120

ttcttttaat cttggtactc tcgaatgcca ccacaacact gactagtctc ttggatcatg    180

agaaaaagcc aaagaacaaa aaagacaaca taaagagtat cctttgcaaa aaaatgtcta    240

agttcataaa atacaaacaa aaacgcaatc acacacagtg gacccaaaag ccatgcacaa    300

caacacgtac tcaccaaggt gcaatcgtgc tgcccaaaaa cattcaccaa ctcaatccat    360

gatgagccca cacatttgtt gtttgtaacc aaatctcaaa cgcggtgttc tctttggaaa    420

gcaaccatat cagcatatca cactatctag tctcttggat catgcatgcg caaccaaaag    480

acaacacata aagtatcctt tcgaaagcaa tgtccaagtc catcaaataa aattgagaca    540

aaatgcaacc tcaccccact tcactatcca tggctgatca agatcgccgc gtccatgtag    600

gtctaaatgc catgcacatc aacacgtact caacatgcag cccaaattgc tcaccatcgc    660

tcaacacatt tcttgttaat ttctaagtac actgcctatg cgactctaac tcgatcacaa    720

ccatcttccg tcacatcaat tttgttcaat tcaacacccg tcaacttgca tgccacccca    780

tgcatgcaag ttaacaagag ctatatctct tctatgacta taaatacccg caatctcggt    840

ccaggttttc atcatcgaga actagttcaa tatcctagta taccttaata aataatttaa    900

gatactagat ctccatgg                                                  918

Claims (20)

1.转化的植物，它含有一种核酸分子，所述分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列，或在严谨条件下与SEQ ID NOs：11，12，13或14或其互补链杂交的核酸序列的启动子。

2.权利要求1所述转化的植物，其中所述启动子与第二种核酸序列可操作相连。

3.权利要求2所述转化的植物，其中所述第二种核酸序列编码选自玉米醇溶蛋白，7S蛋白，巴西坚果蛋白，不含苯丙氨酸的蛋白，β-伴大豆球蛋白，11S蛋白，α-hordothionin，arcelin种子贮藏蛋白，凝集素或麦谷蛋白的蛋白。

4.权利要求2所述转化的植物，其中所述第二种核酸序列编码选自tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，AANT1，slr 1737，或尿黑酸双加氧酶的蛋白。

5.权利要求2所述转化的植物，其中所述第二种核酸序列编码选自邻氨基苯甲酸合酶，色氨酸脱羧酶，苏氨酸脱氨酶，二氢二吡啶甲酸合酶，赖氨酸酮戊二酸还原酶，或天冬氨酸激酶的蛋白。

6.权利要求2所述转化的植物，其中所述第二种核酸序列的至少一个片段以抑制所述第二种核酸表达的方式被表达。

7.权利要求6所述转化的植物，其中所述第二种核酸序列采取表达反义RNA分子的方向。

8.权利要求1所述转化的植物，其中所述转化的植物选自canola，两节荠属，白芥，蓖麻子，芝麻，棉籽，亚麻子，玉米，大豆，拟南芥属，菜豆属，花生，苜蓿，小麦，稻，燕麦，高梁，油菜籽，黑麦，tritordeum，millet，羊茅，多年生麦草，甘蔗，红莓苔子，番木瓜，香蕉，红花，油棕，亚麻，香瓜，苹果，黄瓜，石斛，剑兰，菊花，百合科，棉花，桉，向日葵，芸苔，欧洲油菜，turfgrass，甜菜，咖啡或薯蓣。

9.权利要求8所述转化的植物，其中所述转化的植物是大豆。

10.权利要求2所述转化的植物，其中由所述结构核酸序列编码的mRNA或蛋白的浓度在该转化植物的种子中约为2％(w/w)。

11.权利要求2所述转化的植物，其中所述结构核酸序列在种子中表达。

12.一种转化植物的方法，包括：提供一种核酸分子并用所述核酸分子来转化所述植物，其中所述核酸分子沿5’-3’方向包含：具有选自SEQ IDNOs：11，12，13或14，或其互补链的核酸序列，或在严谨条件下与SEQ IDNOs：11，12，13或14或其互补链杂交的核酸序列，的启动子，其与结构核酸序列可操作相连。

13.权利要求12的方法，其中所述转化的植物产生种子，所述核酸序列在所述种子中转录；将所述种子从所述转化的植物中分离出来。

14.一种基本纯的核酸分子，包含选自SEQ ID NOs：11，12，13或14，或其互补链，或那些与其有至少90％同一性的核酸序列的核酸序列。

15.权利要求14的基本纯的核酸分子，其中所述核酸序列选自SEQ IDNOs：11，12，13或14，或其互补链。

16.一种载体，它含有权利要求14所述基本纯的核酸。

17.一种细胞，它包含权利要求16的载体。

18.权利要求17的细胞，其中所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或真菌细胞。

19.权利要求18的细胞，其中所述细菌细胞选自根癌土壤杆菌或大肠杆菌。

20.权利要求18的细胞，其中所述植物细胞为大豆细胞。

Images