CN1222233A - 大豆种子蛋白基因特异种类的抑制 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因大豆品系的构建,其中编码种子贮存蛋白的基因的表达被调节,使转基因植物种子贮存蛋白的组成发生改变。种子贮存蛋白组成的改变可以产生具有独特和有价值功能特征的新型大豆蛋白产品。

Description

大豆种子蛋白基因特异种类的抑制

                      发明领域

本发明涉及转基因大豆系的构建，其中编码种子贮存蛋白基因的表达被改变，在转基因植物种子贮存蛋白组成上产生变化。这种改变的转基因大豆系被用在具独特和有价值功能特征的新大豆蛋白产品的生产中。

                      发明背景

根据干重，大豆种子含35％至55％蛋白。这种蛋白主要是贮存蛋白，在发芽期间可被水解，提供发育芽苗所需的能量和代谢中间物。当被收获和用作家禽饲料时，大豆种子贮存蛋白是一种重要的营养源。此外，现在普遍认识到大豆是人类消耗蛋白的最经济来源。大豆蛋白或蛋白分离物在世界各地已被广泛地用做食品。许多精力已投入到提高大豆种子贮存蛋白的数量和质量的工作中。

大多数植物种类的种子包含本领域所知道的种子贮存蛋白。它们根据大小和可溶性被分类(Higgins,T.J.(1984)植物生理学年评35:191-221)。尽管在每种植物中不能发现每种类型蛋白，但是大多数植物种类的种子包含不只一种类型的蛋白。特定溶解性或大小类型中的蛋白在结构上与其它种类相同类型蛋白比与相同种类内不同类型蛋白更为相关。在许多种类中，已知类型的种子蛋白通常由多基因家族编码，有时是如此复杂使得家族依据序列同源性被划分为亚类。

有两种主要的大豆种子贮存蛋白：大豆球蛋白(也称为11S球蛋白)和β-conglycinin(也称为7S球蛋白)。它们一起构成种子总蛋白的70～80％，或种子干重的25～35％。大豆球蛋白是分子量约为360 kDa的大蛋白。它是一个六聚体，由定义为G1,G2,G3,G4和G5的5种主要同种型(通常称为亚基)的不同组合构成。每个亚基依次由一个酸性多肽和一个碱性多肽通过二硫键相连构成。单个亚基的酸性多肽和碱性多肽都是由单基因编码。所以，有编码5个大豆球蛋白亚基的5个非等位基因。这些基因被叫做Gy1,Gy2,Gy3,Gy4和Gy5，分别对应亚基G1,G2,G3,G4和G5(Nielsen,N.C.等(1989)植物细胞1:313-328)。

大豆球蛋白亚基基因的基因组克隆和cDNA克隆已经被测序，并以核苷酸和氨基酸的相似性为基础划为两组。组Ⅰ包含Gy1,Gy2和Gy3，而组Ⅱ包含Gy4和Gy5。一个组中基因之间超过85％的相似性(即，至少85％的Gy1,Gy2和Gy3核苷酸是相同的，和至少85％的Gy4和Gy5的核苷酸是相同的)，但在组Ⅰ和组Ⅱ的基因之间仅有42％至46％的相似性。

β-conglycinin(7S球蛋白)是分子量为150至240kDa的异质糖蛋白。它由定义为α,α′和β的3个带高负电荷亚基的不同组合构成。表示编码α和α′亚基的基因编码区的cDNA克隆已被测序并且大小相似；序列相同接近85％。然而，表示β亚基编码区的cDNA序列比α和α′cDNA几乎小0.5kb。除这段缺失外，与α和α′亚基的序列相同是75-80％。3类β-conglycinin亚基是由大豆基因组中几个区内成串排列的总共15个亚单位基因编码(Harada,J.J.等(1989)植物细胞1:415-425)。

新的大豆基产品如蛋白浓缩物，分离物和特殊质地的蛋白产品在不必需接受传统东方大豆食品的国家中被越来越多地利用。但是，这些新产品在食品应用中的用途依赖于地区口味和与食谱需要有关的蛋白产品的功能特征。在过去10年中，花了许多精力，一直想弄清大豆蛋白的功能特征。功能特征的实例包括水吸收参数，可湿性，膨胀，持水性，可溶性，稠度，粘性，凝固，胶凝作用特征和乳化作用特征。这项研究工作的大部分集中在β-conglycinin和大豆球蛋白各自的研究，以及这些蛋白中的每一种是如何影响作为整体的大豆蛋白系统(Kinsella,J.E等(1985)新蛋白食品5:107-179；Morr,C.V.(1987)JAOCS 67:265-271；Peng,L.C.等(1984)谷物化学61:480-489)。因为功能特征是与蛋白的理化特征直接相关的，所以β-conglycinin和大豆球蛋白结构差异导致这两种蛋白具有明显不同的功能特征。热凝聚，乳化特征和持水能力中的差异已被报导。此外，凝胶特征也变化，大豆球蛋白形成凝胶，具有更强的拉伸张力，压力和剪切强度，更好的保持溶剂能力，以及较低的混浊度。但是，今天生产的大豆蛋白产品是大豆球蛋白和β-conglycinin的混合物，因此具有依赖于大豆球蛋白和β-conglycinin各自特征的功能特征。例如，当大豆球蛋白被加热至100℃时，大约50％的蛋白迅速转变为可溶的凝聚物。进一步加热导致凝聚物的膨大和沉淀。沉淀物包含大豆球蛋白的碱性多肽；酸性多肽仍然是可溶的。β-conglycinin通过与碱性多肽形成可溶的复合物，抑制碱性多肽的沉淀。是否需要热变性取决于预期的用途。如果有人生产含仅仅一种或另外一种贮存蛋白的大豆蛋白产品，需要特定大豆蛋白的特定物理特征的产品就可以得到或生产更为经济。

在过去20年，缺少1个或多个不同贮存蛋白亚基(无效突变)的大豆系在大豆种质中已被鉴定，或用突变育种技术已被生产。结合突变的育种已产生其种子包含约正常量一半β-conglycinin的大豆系(Takashashi,K.等(1994)育种科学44:65-66；Kitamura,J.(1995)JARQ29:1-8)。β-conglycinin的减少是由3个独立的隐性突变控制。重组大豆球蛋白亚基无效突变产生其种子具有明显减少量的大豆球蛋白的品系(Kitamura,J.(1995)JARQ 29:1-8)。减少也是由3个独立隐性突变控制。从上述品系开发农业可生存的大豆品种，其种子仅含大豆球蛋白或β-conglycinin，将是费时费钱的。每个杂交将产生3个突变的独立分离。此外，每个突变需要处于纯合状态。高产量农业优级大豆系的开发将需要在许多代后筛选和分析大量子代。

反义技术已被用来减少种子中的特异贮存蛋白。在蔓菁中，napin(2S白蛋白)和cruciferin(11S球蛋白)是两种主要的贮存蛋白，分别构成整个种子蛋白的约25％和60％。Napin蛋白是由多达16个基因的大多基因家族编码；几个cDNA和基因组克隆已被测序(Josefsson,L-G等(1987)生物与化学杂志262:12196-12201；Schofield,S.和Crouch,M.L.(1987)生物与化学杂志262:12202-12208)。基因显示在编码区和侧翼区超过90％序列相同。cruciferin基因家族同样复杂，包括8个基因分属3个亚族(Rodin,J.等(1992)植物分子生物学20:559-563)。Kohno-Murase等((1994)植物分子生物学26:1115-1124)证明用napA启动子驱动napA基因，napin反义基因可被用来构建转基因植物，其种子含少量或没有napin。

同一研究组(Kohno-Murase等(1995)Theoret.Applied Genetics 91:627-631)尝试通过表达napA启动子控制下的cruciferin基因(cruA，编码α-2/3同型)的反义形式，减少蔓菁中cruciferin(11S球蛋白)表达。在这种情况中，结果更加复杂。依据序列相同cruciferin被划为3个亚类(α1,2/3，和4)；每类之间有60-75％的序列相同(Rodin,J.等(1992)植物分子生物学20:559-563)。编码α2/3同型的反义基因表达产生较低水平的α1和2/3形式。但是，α4类的表达没有减少。

反义技术被用来减少水稻中种子贮存蛋白，谷蛋白水平。与全长反义谷蛋白编码区操纵连接的种子特异谷蛋白启动子的表达导致谷蛋白水平约25％的减少(美国专利号5,516,668)。

                      发明概述

本发明提供一种减少大豆中种子贮存蛋白大豆球蛋白或β-conglycinin(分别是11S或7S球蛋白)数量的方法。在一个实施方案中，共同抑制技术被用来抑制编码种子蛋白基因7S球蛋白类的基因表达。编码7S球蛋白的2个(α和α′)或所有3个亚类(α,α′和β)的基因被编码β-conglycinin的单个亚类(α)基因的表达抑制，产生了具有改变的种子贮存蛋白组成的大豆系。在另一个实施方案中，提供了抑制2个完全不同基因的方法，其中仅有一个是种子蛋白基因，使得种子组成发生多种变化。令人惊奇的是，包含与大豆基因编码区操纵连接的大豆种子贮存蛋白启动子区的嵌合基因表达可产生两种不同表型特征的同时改变：种子贮存蛋白组成和种子油组成，所述大豆基因表达可以改变转基因大豆种子的脂肪酸组成。

在此，减少大豆种子贮存蛋白数量的方法包括下列步骤：(a)构建一个嵌合基因，包括(ⅰ)编码大豆种子细胞中起作用的启动子的一个核酸片段，(ⅱ)编码大豆种子贮存蛋白全部或部分的一个核酸片段，其相对(ⅰ)中启动子为有义或反义方向，以及(ⅲ)一个转录终止区；(b)通过导入(a)的嵌合基因进入大豆细胞，形成一种转基因大豆细胞；和(c)在导致步骤(a)嵌合基因表达的条件下，使步骤(b)的转基因大豆细胞生长其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个成分的数量被减少了。

                      发明详述

                    序列说明简述

从下面的详述和序列说明中，可以更全面地理解本发明，详述和序列说明为本申请部分。序列说明包含氨基酸的3字符，如37 C.F.R 1.822所限定的，在此引入作为参考。

SEQ ID NO:1表示编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α亚基的5′至3′的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2表示编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α′亚基的5′至3′核苷酸序列。

SEQ ID NO:3表示编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白β亚基的5′至3′核苷酸序列。

SEQ ID NOS:4和5分别表示被用来分离编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α和α′亚基的核酸片段的PCR引物ConS和Con1.4a的核苷酸序列。

SEQ ID NOS:6和7分别表示PCR引物Con.09和Con.8的核苷酸序列，这些引物被用来区分编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α和α′亚基的核酸片段。

SEQ ID NOS:8和9分别表示PCR引物ConSa和Con1.9a的核苷酸序列，这些引物被用来分离编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α和α′亚基的全长cDNAs。

SEQ ID NO:10表示PCR引物Con.1.0的核苷酸序列，此引物被用来证实编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α和α′亚基的全长cDNA。

SEQ ID NOS:11,12和13分别表示编码组Ⅰ大豆球蛋白大豆种子贮存蛋白Gy1,Gy2和Gy3亚基的5′至3′核苷酸序列。

SEQ ID NOS:14和15分别表示编码组Ⅱ大豆球蛋白大豆种子贮存蛋白Gy4和Gy5亚基的5′至3′核苷酸序列。

SEQ ID NOS:16,17和1 8分别表示PCR引物G1-1,G1-1039和G1-1475的核苷酸序列，这些引物被用来分离编码组Ⅰ大豆球蛋白大豆种子贮存蛋白亚基的cDNAs。

SEQ ID NOS:19,20和21分别表示PCR引物G4-7,G4-1251和G4-1670的核苷酸序列，这些引物被用来分离编码组Ⅱ大豆球蛋白大豆种子贮存蛋白亚基的cDNA。

                      附图简述

图1是质粒pML70的限制性酶切图谱，质粒用作本发明嵌合基因构建中的中间克隆载体。

图2是质粒pCW109的限制性酶切图谱，质粒用作本发明嵌合基因构建中的中间克隆载体。

图3是质粒pKS18HH的限制性酶切图谱，质粒用作本发明嵌合基因构建中的中间克隆载体。

图4是质粒pJo1的限制性酶切图谱，此质粒是通过将植物转录单位KTi启动子/截断的β-conglycinin的α亚基/KTi3′端克隆到pKS18HHBamHⅠ位点而得到的。

图5是用pJo1转化的体细胞胚胎提取的蛋白的SDS-PAGE凝胶。

图6是质粒pBS43的限制性酶切图谱，此质粒包含在大豆β-conglycinin启动子转录控制下编码大豆微粒体δ-12脱氢酶的核酸序列。

图7是从用pBS43转化的植物所得大豆种子中提取蛋白的SDS-PAGE凝胶。

图8是质粒pJo3的限制性酶切图谱。此质粒是通过将植物转录单位KTi启动子/β-conglycininα亚基的全长cDNA/KTi3′端克隆到pKS18HH HindⅢ位点而得到的。

图9是质粒pRB20的限制性酶切图谱。此质粒是通过将β-conglycinin启动子转录单位/菜豆蛋白3′端克隆到pKS18HHHindⅢ位点得到的。它可以用作本发明嵌合基因构建中的中间克隆载体。

                      生物保藏

下列质粒根据布达佩斯条约已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852，保藏号如下：

    质粒      保藏号         保藏日

    pJo1    ATCC 97614     1996年6月15日

    pBS43   ATCC 97619     1996年6月19日

    pJo3    ATCC 97615     1996年6月15日

                      定义

在此公开内容的上下文中，一些术语将被使用。术语“核酸”指可以是单链或双链的大分子，由含糖，磷酸和嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)构成。一个“核酸片段”是已知核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质而核糖核酸(RNA)参与DNA到蛋白的信息转移。“基因组”是一个个体的每个细胞中所包含遗传物质的整体。术语“核苷酸序列”指DNA或RNA聚合物的序列，可以是单链或双链，可选择地包含能够掺入到DNA或RNA聚合物中的人工合成的非自然或已改变的核苷酸碱基。

如在此所用，术语“同源”指两个核酸分子核苷酸序列间相关度或两个蛋白分子氨基酸序列间相关度。如本领域技术人员所理解的(Hames和Higgins,Eds.(1985)核酸杂交，IRL Press,Oxford,U.K.)，在严格条件下通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交，或通过两个核酸或蛋白序列相似性的比较，例如通过Needleman等的方法((1970)分子生物学杂志48:443-453)，可以提供这种同源的评估。

如在此所用，“基本上相似”指包括如下碱基变化的DNA序列，此变化不造成编码的氨基酸的变化，或改变1个或多个氨基酸，但不影响DNA序列编码蛋白的功能特征。所以，应当理解本发明不只包括具体实例序列。也包括序列的改变，例如序列中的缺失，插入或替换，产生沉默变化，基本上不影响产生的蛋白分子的功能特征。例如，包括反映遗传密码简并或在给定位点产生化学相同氨基酸的基因序列变化；因此，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一个疏水氨基酸残基如甘氨酸，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸的密码子替代。相似地，预期一些变化也产生生物等同产物，这些变化是一种负电荷残基替代另一种残基，例如天冬氨酸替代谷氨酸，或一种正电荷残基替代另一种残基，例如赖氨酸替代精氨酸。导致蛋白分子N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化预期也不会改变蛋白活性。在一些情况中，为了研究变化对蛋白生物活性的作用，实际上需要做序列突变型。像确定编码产物的生物活性保留一样，每个建议的修饰是在本领域常规技术内。此外，技术人员认识到本发明所包括的“基本上相似”的序列也被它们在严格条件(0.1×SSC,0.1％SDS,65℃)下与示例序列杂交能力限定。

“基因”指表达特异蛋白的核酸片段，包括编码区前(5′非编码)后(3′非编码)的调控序列。“天然”基因指像自然发现的具自身调控序列的已分离基因。“嵌合基因”指包含非天然存在的外源调控和编码序列的基因。“内源”基因指在基因组自然位置正常发现的天然基因并未分离出来。“外源”基因指不是在宿主中正常存在的基因而是通过基因转移导入。

“编码序列”或“编码区”指编码特异蛋白的DNA序列，不包括非编码序列。它可能组成一个“不中断编码序列”，例如，缺少内含子或包括1个内含子或由合适剪接点相连的多个内含子。“内含子”是初级转录物中被转录的核苷酸序列，但经过细胞内RNA的剪切和重新连接产生可翻译成蛋白的成熟mRNA时被去除了。

“起始密码”和“终止密码”指编码区上3个相邻的核苷酸单位，分别表明蛋白合成(mRNA翻译)的起始和链终止。“开放读框”指编码氨基酸序列的起始和终止密码子间未被内含子中断的编码序列。

“RNA转录物”指RNA聚合酶催化DNA序列转录所得到的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补拷贝时，它是指初级转录物或初级转录物转录后加工所得的RNA序列以及指成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指无内含子并能被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并从mRNA衍生的双链DNA。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分目标初级转录物或mRNA互补并抑制目标基因的表达的RNA转录物。反义RNA可与特异基因转录物的任何一部分，即，5′非编码序列，3′非编码序列，内含子或编码序列互补。

如在此所用的，“合适的调控序列”指位于本发明核酸片段的上游(5′)，内部或下游(3′)的天然或嵌合基因的核苷酸序列，它控制本发明核酸片段的表达。在此所用的术语“表达”指本发明核酸片段衍生的有义(mRNA)或反义RNA的转录和与细胞蛋白合成机构稳定聚集，导致表型性状的改变。基因表达涉及基因转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“反义抑制”指能够阻止目标蛋白表达的反义RNA转录物的生产。“超表达”指超过正常或非转化个体生产水平的转基因个体中基因产物的生产。“共同抑制”指与内源基因基本同源的外源基因的表达，导致外源和内源基因表达的抑制。“改变的水平”指在数量或比例上不同于正常或非转化个体的转基因个体的基因产物的生产。技术人员将认识到，本发明所考虑的表型特征可通过转基因个体相对于正常或非转化个体所生产的基因产物水平的改变而得到，即通过反义抑制或共同抑制介导的基因表达的减少而得到。

“启动子”指通常基因中位于编码序列上游(5′)的DNA序列，可通过向RNA聚合酶提供识别位点和正确转录所需的其它因子来控制编码序列的表达。在人工合成的DNA构建体中，启动子也可被用作转录反义RNA。启动子也包含参与蛋白因子结合的DNA序列，这些蛋白因子根据生理或发育状况控制转录起始。它也可以包含增强子元件。“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列。它可以是启动子的原有元件或插入的提高启动子水平或组织特异性的异源元件。“组成型启动子”指在所有组织和任何时间指导基因表达的启动子。此处所指的“组织特异的”或“发育特异的”启动子是那些几乎仅在特异组织如叶或种子，或组织内特异发育阶段如分别在胚胎发生的早期或晚期指导基因表达的启动子。

“3′非编码序列”指包含能影响mRNA加工或基因表达的聚腺苷酸化信号和任何其它信号的基因的DNA序列部分。聚腺苷酸化信号的特征是影响mRNA前体3′末端的聚腺苷酸序列的加入。

术语“可操纵连接的”指单个核酸分子上的核酸序列，它们相互关联使得一个序列的作用受到其他序列影响。例如，当启动子能够影响结构基因(即，结构基因是在启动子转录控制下)的表达时，启动子是与结构基因操纵连接。

“转化”指核酸片段转移进入宿主个体基因组，产生稳定遗传。包含转化的核酸片段的宿主个体被称为“转基因”个体。

本发明涉及转基因大豆系的构建，其中编码种子贮存蛋白基因的表达被改变，在转基因植物种子贮存蛋白组成上产生变化。这种大豆种子贮存蛋白组成的改变会产生具独特和有价值功能特征的新大豆蛋白产品。

植物中基因表达使用在这些植物中起作用的调控序列。植物中外源基因的表达已很成熟(De Blaere等(1987)酶学方法153:277-291)。只要通过减少目标种子贮存蛋白基因表达，具有足够转录活性完成本发明，那么所选的驱动本发明片段表达的启动子来源就不是关键了。优选的启动子包括强组成型植物启动子，例如在花椰菜花叶病毒中指导19S和35S转录物的那些启动子(Odell,J.T.等(1985)自然313:810-812；Hull等(1987)病毒学86:482-493)。特别优选的启动子是那些允许种子特异表达的启动子。种子特异启动子的实例包括，但不限于种子贮存蛋白启动子，在许多植物中此蛋白占整个种子蛋白的90％。种子贮存蛋白被严格调控，几乎仅在种子中以高度组织特异和阶段特异方式表达(Higgins等(1984)植物生理学年评35:191-221；Goldberg等(1989)细胞56:149-160)。此外，不同的种子贮存蛋白可能在种子发育的不同阶段被表达。

种子特异基因表达已被详细研究(见Goldberg等(1989)细胞56:149-160和Higgins等(1984)植物生理学年评35:191-221评论)。目前，在转基因双子叶植物中有许多种子贮存蛋白基因(天然或嵌合)的种子特异表达实例；通常，时空表达方式被保留。这些实例所用的启动子能潜在地被用来影响本发明。这些实例包括双子叶植物基因，其编码豆β-phaseolin(Sengupta-Gopalan等(1985)美国国家科学院进展82:3320-3324,Hoffman等(1988)植物分子生物学11:717-729)，豆凝血素(Voelker等(1987)EMBO J.6:3571-3577)，大豆凝血素(Okamuro等(1986)美国国家科学院进展83:8240-8244)，大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Perez-Grau等(1989)植物细胞1:095-1109)，大豆β-conglycinin(Beachy等(1985)EMBO J.4:3047-3053)；豌豆球蛋白(Higgins等(1988)植物分子生物学11:683-695)，豌豆convicilin(Newbigin等(1990)Planta 180:461-470)，豌豆豆球蛋白(Shirsat等(1989)分子遗传学215:326-331)，油菜籽napin(Radke等(1988)Theor.Appl.Genet.75:685-694)和拟南芥2S白蛋白(Vandekerckhove等(1989)生物/工程学7:929-932)。

本发明核酸片段表达中具特别用途的是几种大豆种子贮存蛋白基因的异源启动子，例如Kunitz胰蛋白酶抑制因子(KTi；Jofuku等(1989)植物细胞1:1079-1093)；大豆球蛋白(Nielson等(1989)植物细胞1:313-328和β-conglycinin(Harada等(1989)植物细胞1:415-425)启动子。技术人员将认识到，必需注意不同种子启动子所产生时间调控中的差异。例如，α-亚基基因启动子在β-亚基基因启动子前几天表达(Beachy等(1985)EMBO J.4:3047-3053)，以致β-亚基基因对抑制α-亚基表达可能不太起作用。

可能可以使用但不是优选的是涉及种子代谢的其它方面如脂肪或碳水化合物生物合成的基因的启动子。总之，技术人员将毫无困难地认识到足够强度和合适时间表达方式的任何启动子可潜在地被用来实施本发明。相似地，本发明天然或嵌合核酸片段的启动子区内增强子或增强子样元件的导入将产生增强表达来实现本发明。这将包括病毒增强子如35S启动子中所发现的(Odell等(1988)植物分子生物学10:263-272)，冠瘿氨基酸基因增强子(Fromm等(1989)植物细胞1:977-984)或任何其它来源的增强子，当将它们放入与本发明核酸片段操纵连接的启动子时，它们产生增强转录。

特别重要的是从编码β-conglycinin α亚基基因分离的DNA序列元件，它能使组成型启动子具有40倍种子特异增强作用(Chen等(1989)Dev.Genet.10:112-122)。为了在转基因植物中用启动子实现种子特异增强表达，本领域技术人员很容易分离这个元件并将它插入任何基因的启动子区内。此元件插入在正常表达时间不同于β-conglycinin基因的任何种子特异基因中将导致种子发育期间转基因植物内此基因表达维持更长的时间。

任何一个能够提供本发明核酸片段正确表达所需的聚腺苷酸化信号和其它调控序列的3′非编码区都可被用来完成本发明。这包括天然脂肪酸脱氢酶的3′端，病毒基因例如来自35S或19S花椰菜花叶病毒转录物的3′端，冠瘿氨基酸合成基因，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶，或叶绿素a/b结合蛋白的3′端。在本领域中有许多实例介绍了不同3′非编码区的用处。

根据本发明，本领域技术人员可以有多种转化高等植物的方法(见欧洲专利出版物EP-A-295,959和EP-A-318,341)。这些方法包括以利用农杆菌种类Ti和Ri质粒的转化载体为基础的方法。特别优选使用这些载体的穿梭载体。Ti-衍生载体转化许多种高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物(Sukhapinda等(1987)植物分子生物学8:209-216；Potrykus(1985)分子和普通遗传学199:183)。本领域技术人员可以得到其它转化方法，例如外源DNA构建体的直接摄入(见欧洲专利出版物EP-A-295,959)，电穿孔技术(Fromm等(1986)自然(伦敦)319:791)或包裹了核酸构建体的金属颗粒的高速弹道轰击(Klein等(1987)自然(伦敦)327:70)。一旦被转化，这些细胞可通过本领域技术人员得到再生。特别相关的是最近所述转化大豆的方法，包括McCabe等((1988)生物/工程学6:923-926),Finer等((1991)体外细胞发育生物学27:175-182)和Hinchee,M.A.W.((1988)生物/工程学6:915-922)。

一旦通过上述方法之一获得转基因植物，就有必要筛选最有效地表现所需表型的单个转基因植物。本领域技术人员众所周知，携带相同构建体的单个转基因植物可能在表达水平上不同；这种现象通常被称为“位置效应”。因此，在本发明中不同单个转化体可能在目标种子蛋白抑制作用上有所不同。本领域技术人员知道为了减少特定基因表达，需要特别考虑反义或共同抑制技术的使用。美国专利号5,190,931,5,107,065和5,283,323已讲述了这些技术的可行性，但是，众所周知其作用效果是不可能预测的。因为本领域没有传授一种预测哪种构建体对特别基因最有效的方法，于是本领域技术人员生产多个遗传构建体，其包含将被抑制基因的一个或多个不同部分。此外，甚至最有效的构建体将仅仅对所分离的单个转基因系的部分产生有效抑制表型。例如，国际专利出版物WO93/11245和WO94/11516讲述，当试图在canola中抑制脂肪酸脱氢酶表达时，在不到1％的所测植物系中可获得实际抑制作用。在其它种类中百分率略微高一些，但百分率也不会达到100。这将不被视为对本发明的一种限制，而是本领域技术人员了解和预计的实际情况。于是，本领域技术人员将开发筛选大量转化体的方法。这些筛选的性质通常按实际需要选择，并不是发明固有的一部分。因为预期大量样品是阴性的，所以优选方法将是一种允许大量样品能快速筛选的方法。

共同抑制机理仍不清楚(见Flavell,R(1994)美国国家科学院进展91:3490-3496)，所以需要时诱导它的确切要求也不清楚。文献中发现的大多数实例涉及整个或大部分基因转录区域将被共同抑制以产生所需反应。但是，至少在一种情况下(Brusslan等(1993)植物细胞5:667-677；Brusslan和Tobin(1995)植物分子生物学27:809-813)，在拟南芥的cab140基因的情况下，使用启动子(1.3kb片段)和与完全不相关基因融合的14bp转录区就足以产生内源cab140基因和导入的嵌合基因的共同抑制。这一结果是不同寻常的并且显然不可预测，因为许多启动子-先导(5′非翻译先导被定义为转录起始和翻译起始密码子间的区域)单位已被成功地用来驱动嵌合基因。Flavell设想一些或许多基因(包括多基因家族成员例如编码种子蛋白的基因)可能已经演化以便避免共同抑制作用，而其它的基因没有演化，提供了一种潜在的像基因组演化一样的更高水平的调控。所以，本观察研究是独特的，即conglycinin基因的启动子和先导序列可被用来抑制内源conglycinin表达，而转基因(在起始密码子后)的其它部分被用来抑制完全不相关的基因。

                      实施例

本发明由以下实施例进一步限定。应当理解为，实施例仅用作例证，本发明不限于实施例所述用途。本发明可被用来生产具有改变的多种种子贮存蛋白水平的转基因大豆植物。从上述讨论和以下实施例中，本领域技术人员能明确，在不偏离本发明的主旨和范围的情况下，能对本发明进行多种变化和修改使之适应多种用法和条件。所有这些修改将落入本发明权利要求书范围内。

在Sambrook等(1989)分子克隆，实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社(以后称“Maniatis”)中描述了DNA操作的详细步骤，例如限制性内切酶，其它修饰酶，琼脂糖凝胶电泳，核酸杂交，质粒DNA转化大肠杆菌的方法。可从Gibco BRL(Gaithersburg,MD)获得所有限制性内切酶和其它修饰酶。

                      实施例1

为确定在发育的大豆子叶中β-conglycinin的表达是否成为共同抑制目标，用逆转录酶聚合酶链反应试剂盒(Geneamp^TM RNA PCRKit；Perkin Elmer Cetus)制备β-conglycininα和α′亚基的截断的cDNA片段。上游引物ConS与从EMBL/GenBank/DDBJ数据库所得α和α′亚基cDNA序列的核苷酸5-19同源。为了便于克隆，在5′端加入附加核苷酸来编码NcoⅠ限制性酶切位点。下游引物Con1.4a与SEQ IDNo:1的1370-1354和SEQ ID No:2的1472-1456核苷酸互补，分别代表α和α′cDNAs序列。为了便于克隆，在5′端加入附加核苷酸，引入一个KpnⅠ限制性酶切位点。PCR引物ConS和Con1.4a的核苷酸序列如下所示。

按照生产商的说明书，使用试剂盒提供的随机六聚体或Con1.4a，逆转录从发育大豆种子所分离的RNA。用ConS和Con1.4a混合物在PCR(聚合酶链反应)反应中扩增产生的cDNA片段。反应物浓度如生产商说明书中所述。使用下列程序：a)95℃2分钟1个循环；b)50℃(退火)1.5分钟，70℃(延伸)5分钟，95℃(变性)1.5分钟，共35个循环；和c)50℃2分钟1个循环，接着是68℃10分钟。每个PCR反应混合物15微升通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。反应产生预期大小的PCR产物：α′的1.47kb和α′的1.37kb。剩余反应混合物中的截断的cDNA片段通过WizardTMPCR Preps DNA纯化系统试剂盒(Promega)进行纯化。

包含α和α′片段的纯化的反应混合物被KpnⅠ和NcoⅠ限制性内切酶消化，因为所用引物在片段5′端有NcoⅠ限制性位点以及在3′端有KpnⅠ限制性位点。αcDNA片断通过凝胶电泳后回收，称为片段F8，并且用两个质粒上的NcoⅠ至KpnⅠ位点定向克隆(有义方向)到pCW109(图1)和pML70(图2)中。用ConS和Con1.4a内部嵌套引物(Con.09和Con.8)通过PCR证实F8为α，并且用HindⅢ，NcoⅠ,KpnⅠ，和PstⅠ消化区分pCW 109/F8质粒使之与α′(α不包含PstⅠ位点而α′包含)区分。

Con.09 5′-TCGTCCATGGAGCGCGGTTCCCATTAC-3′(SEQ ID NO:6)

Con.8 5′-TCTCGGTCGTCGTTGTT-3′           (SEQ ID NO:7)

经过BamHⅠ限制性消化，胶分离从质粒pML70/F8中释放出转录单位KTi启动子/截断的α/KTi 3′端，并标记为F11。F11在BamHⅠ位点再次被克隆进入pKS18HH(图3)。pKS18HH是包含下列遗传元件的质粒构建体：(ⅰ)T7启动子/潮霉素B磷酸转移酶(HPT)/T7终止子序列；(ⅱ)花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子/潮霉素B磷酸转移酶(HPT)/根瘤农杆菌T-DNA的胭脂碱合酶(NOS)3′；以及(ⅲ)具有已去除的β-内酰胺酶编码区的pSP72质粒载体(Promega)。分子生物学领域的技术人员能够按已知的方法(Maniatis)将上述3种成份连接到单个质粒载体中。

通过PCR扩增从含克雷伯氏菌衍生质粒pJR 225的大肠杆菌株W677中分离潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因(Gritz.L.,和Davies J.(1983)基因25:179-188)。pKS18HH包含用于在植物如大豆中HPT酶组成型表达的CaMV 35S/HPT/NOS盒。pKS18HH也包含大肠杆菌特定菌株例如NovaBlue^TM中HPT酶表达的T7启动子/HPT/T7终止子盒，NovaBlue^TM(DE3)(Novagen)对于λDE3是溶源性的(λDE3携带在lacUV5控制下的T7 RNA聚合酶基因)。pKS18HH也包含适于基因克隆进入此载体的3个单一限制性内切酶位点。因此，pKS18HH质粒载体允许潮霉素B用于大肠杆菌和植物中的筛选。通过HindⅢ的消化作用完成F11片断的插入和定向。具有顺时针方向的F11片段的1个克隆被挑选出并被标为pJo1(图4)。

            体细胞胚胎培养物的转化

下列贮存液和培养基被用在大豆体细胞胚胎的转化和繁殖中。

贮存液                            培养基

100×MS硫酸贮存液    (g/L)       SB55(每升)

MgSO₄     7H₂O      37.0    每10mL MS贮存液

MnSO₄     H₂O       1.69    1mL B5维生素贮存液

ZnSO₄     7H₂O      0.86    0.8gN₄NO₃

CuSO₄     5H₂O      0.0025  3.033gKNO₃

                              1mL 2,4-D(10mg/mL贮存液)

100×MS卤素贮存液

CaCl₂    2H₂O   44.0     0.667g天冬酰胺

KI                0.083    pH5.7

CoCl₂    6H₂O   0.00125

KH₂PO₄          17.0     SB103(每升)

H₃BO₃           0.62     1pk.Murashige & Skoog

                           盐混合液(Gibco BRL)

Na₂MoO₄ 2H₂O   0.025    60g麦芽糖

Na₂EDTA          3.724    2g gelrite

FeSO₄    7H₂O   2.784    pH5.7

                           对SB103加碳，加5g碳

B5维生素贮存液             SB148(每升)

肌醇              100.0    1pk.Murashige & Skoog

                           盐混合液(Gibco BRL)

烟酸              1.0      60g麦芽糖

吡哆醇盐酸        1.0      1mL B5维生素贮存液

硫胺素            10.0     7g琼脂糖

                           pH5.7

大豆胚胎悬浮培养物被放入35ml液体培养基中，放在28℃具有提供16/8小时白天/夜晚的荧光灯和白炽灯混合照明的旋转振荡器(150rpm)上。通过将约35mg组织接种到35ml液体培养基中，每2至3周对培养物进行传代培养。

通过粒子枪轰击方法，用pJo1转化大豆胚胎悬浮培养物(见Klein等(1987)自然327:70)。这些转化使用了杜邦Biolistic^TM PDS 1000/He仪器。

将50μL pJo1质粒DNA(1μg/μL),50μL CaCl₂(2.5M)，和20μL精氨酸(0.1M)加到50μL的60mg/mL 1mm金颗粒悬浮液中。搅拌金颗粒制备液3分钟，放入微量离心管中离心10秒并除去上清液。用400μL 70％乙醇冲洗DNA-包裹的颗粒并重新悬浮在40μL无水乙醇中。DNA/颗粒悬浮液经超声处理3次，每次1秒钟。5μLDNA-包裹的金颗粒再被加到每个大托盘上。

将大约300至400mg的两周悬浮培养物放入空的60mm×15mm培养皿中，用吸管从组织中吸去剩余液体。将组织放在距滞留屏幕3.5英寸远并被轰击两次。膜破压力定为1000psi，并且室内抽真空至-28英寸Hg。每个构建体每次实验轰击两个平板。轰击后，组织被一分为二并重新放入液体培养基中，并按上面所述进行培养。

轰击后15天，用含50mg/mL潮霉素的新鲜SB55替换液体培养基。选择性培养基每周换成新鲜的。轰击后六周，分离绿色转化组织并将其接种到瓶中，产生新的已转化的胚胎悬浮培养物。

从液体培养基中除去转化的胚胎群，并使之放在加了0.5％碳的固体琼脂糖培养基上开始成熟。1周后，胚胎转移到无碳SB103培养基中。在SB103培养基上放置3周后，分离成熟的胚胎并使之放在SB148培养基上。胚胎成熟的条件是26℃，提供具有16/8小时白天/夜晚的荧光灯和白炽灯混合照明。在SB148培养基上放置6周后，胚胎被用来分析β-conglycinin亚基蛋白的表达。每个胚胎群产生5至20个体细胞胚胎。

            转化体细胞胚胎的分析

最初的实验是通过SDS-PAGE凝胶电泳确定什么时候可看见体细胞胚胎成熟期间的β-conglycininα,α′和β亚基。在开始成熟后6,8,10,12周，非转化胚胎子叶(它们不经历轰击，其余同上)从胚胎分离，并在分析前一直-80℃冷冻保存。子叶组织被称重，加入10μL/mg组织提取缓冲液，在Pellet Pestle一次性混合器(Kimble/Kontes)中研磨组织。提取缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH7.5),10mM β-巯基乙醇(BME)，和0.1％SDS。样品在12,000rpm离心10分钟，并用吸管将上清液移到一个新的离心管中。在使用前将提取物在-20℃冷冻保存。

为了SDS-PAGE分析，将8μL的(2×)上样缓冲液加到8μL样品提取物中。(2×)上样缓冲液包含100mM Tris-HCl(pH7.5),4％SDS,0.2％溴酚蓝，15％甘油和200mM BME。混合物在95℃加热4分钟。再次离心(12,000rpm 20秒)样品混合物，并上样到10％预先铺好的Ready Gel^TM(Bio-Rad)上，此胶可聚集成微-蛋白Ⅱ电泳室(Bio-Rad)。Bio-Rad Tris/甘氨酸/SDS缓冲液用作电泳缓冲液，电压是恒压125V。除样品提取物外，每个凝胶包含1个标准分子量(Bio-radSDS-PAGE标准，低范围)泳道和1个泳道具有从商业脱脂大豆粉提取的大豆种子总蛋白。电泳结束后，用考马斯亮蓝染胶，为了显示蛋白进行脱色(Maniatis)。胶被拍照，放入有水的封闭袋子中并在冰箱中保存。结果表明在成熟开始后8和10周间体细胞胚胎子叶中可见β-conglycinin的α,α′和β亚基。

通过上面所描述的方法，在成熟开始后10周做转化胚胎的分析。开始分析每个克隆两个胚胎。如果在两个胚胎中观察到β-conglycinin亚基的抑制作用，就要分析其余的胚胎。表1表示这种分析结果，其中每个β-conglycinin亚基的存在或缺失分别表示为(+)或(-)。

               表1克隆      胚胎    α    α′     βJo1-1      1       -     -       +

       2       -     -       +

       3       +     +       +

       4       -     -       +

       5       +     +       +Jo1-2      1       +     +       +

       2       +     +       +Jo1-3      1       +     +       +

       2       +     +       +Jo1-4      1       -     -       -

       2       -     -       -

       3       -     -       -

       4       +     +       +

       5       -     -       -Jo1-5b     1       +     +       +

       2       +     +       +Jo1-5c     1       -     -       +

       2       -     -       +Jo1-5d    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-6a    1     -    -    +

      2     -    -    +

      3     -    -    +

      4     -    -    +

      5     +    +    +Jo1-6b    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-6c    1     +    +    +Jo1-6d    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-6d    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-6e    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-7a    1     -    -    +

      2     +    +    +Jo1-7b    1     -    -    +Jo1-8a    1     +    +    +Jo1-8b    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-9a    1     +    +    +

      2     +    +    +Jo1-9b    1     +    +    +

      2     -    -    +Jo1-9c    1     +    +    +Jo1-10    1     -    -    +

      2     +    +    +

七种转基因克隆产生的胚胎，其中α和α′表达被抑制。此外，一个克隆(Jol-4)产生的胚胎，其中所有3个β-conglycinin亚基被抑制。这一结果是令人吃惊的，因为截断的α转基因序列仅覆盖了整个1.32kbβ亚基cDNA的0.75kb部分。总之，在截断的α转基因和β亚基cDNA间仅有52％的相似性。据现有知识来看，截断的β转基因不具有足够多的结构相似性来“共同抑制”β-conglycinin基因的β亚基。

图5中表示了一个SDS-PAGE分析实例。泳道1-3是从克隆Jol-1产生胚胎所分离的3个子叶提取物。泳道4和5分别为标准分子量蛋白和种子来源的标准大豆蛋白。泳道6-8是从克隆Jol-4产生胚胎所分离的子叶提取物。泳道2的蛋白图谱是α和α′被共同抑制的胚胎实例。泳道6和8的蛋白图谱是所有组成β-conglycinin的亚基被抑制的胚胎实例。

                      实施例2

为了确定通过用β-conglycinin启动子区共抑制在发育子叶中是否可抑制β-conglycinin的表达，构建一个命名为pBS43的质粒，其包含在大豆β-conglycinin启动子调控下(Beachy等(1985)EMBO J.4:3047-3053)的1个大豆微粒体δ-12脱氢酶cDNA(GmFad 2-1)序列(Heppard等(1996)植物生理学110:311-319；GenBank Acc.No.L43920)。使用下列质粒：pMH40,pCST2和pBS13进行这种载体的构建。质粒构建的细节在美国专利申请号，USSN 08/262,401和国际专利公开号，WO 94/11516被部分描述，这两个专利号在此引入作为参考。

通过插入与大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因偶联的CaMV(Odell等(1985)自然303:810-812；Harpster等(1988)Mol.Gen.Genet 212:182-190)的1.4kb 35S启动子区，从一种商业用克隆载体(Promega Biotech)质粒pGEM9z衍生pMH40载体。这是编码β-葡糖苷酸酶(Jefferson等(1986)PNAS USA 83:8447-8451)的1.85kb片段和含根瘤土壤杆菌(Fraley等(1983)PNAS USA 80:4803-4807)Ti质粒胭脂碱合酶基因转录终止子的0.3kb DNA片段。

从载体pML18和pCW109A中衍生载体pCST2。质粒pCW109A包含大豆β-conglycinin启动子序列和菜豆蛋白3′非翻译区，并且是载体pCW109的修改版，pCW109是从商业用质粒pUC18(Gibeo-BRL)衍化的。通过向克隆载体pUC18 HindⅢ位点插入β-conglycinin基因的555bp 5′非编码区(含启动子区)，接着是插入含NcoⅠ,SmaⅠ,KpnⅠ和XbaⅠ限制性内切酶位点的多克隆序列，然后是向HindⅢ位点插入普通大豆菜豆蛋白3′非翻译区的1174bp，可得到载体pCW109。由于在第27个核苷酸位置的差异，所用β-conglycinin启动子区是已发表的β-conglycinin基因的等位基因(Doyle等，(1986)生物与化学杂志261:9228-9238)。在国际专利出版物WO91/13993中可以发现更多的此基因序列描述。

为了便于用在反义构建体中，用NcoⅠ消化，绿豆外切核酸酶消化和与平端位点重新连接破坏质粒pCW109中NcoⅠ位点和潜在翻译起始位点，产生修改的质粒pCW109A。

载体pML18包含非组织特异性和组成型花椰菜花叶病毒(35S)启动子(Odell等(1985)自然313:810-812；Hull等(1987)病毒学86:482-493)，驱动新霉素磷酸转移酶基因(Beck等(1982)基因19:327-336)表达，接着此基因的是含核苷酸848至1550的胭脂碱合酶基因的3′末端(Depicker等(1982)应用遗传学杂志1:561-574)。将此转录单位插入商业克隆载体pGEM9z(Gibco-BRL)，在35S启动子的5′端依次邻近限制性酶切位点SalⅠ,XbaⅠ,BamHⅠ和SmaⅠ。另一个SalⅠ位点在NOS3′序列3′端，XbaⅠ,BamHⅠ和SalⅠ位点是单一的。为了除去XbaⅠ位点，用XbaⅠ消化质粒pML18，用聚合酶Ⅰ的Klenow片段补平单链末端，并将产物连接上。产生的质粒被命名为pBS16。

用HindⅢ消化质粒pCW109A，并用凝胶分离所产生的1.84kb片段，该片段含β-conglycinin/反义δ-12脱氢酶cDNA/菜豆蛋白3′非翻译区。将这个1.84Kb片段连接到pBS16的HindⅢ位点。当用KpnⅠ消化时，含所需方向插入片段的质粒产生3.53kb和4.41kb片段，这种质粒被命名为pCST2。

载体pBS13被用作GmFad2-1cDNA的来源，该cDNA编码大豆微粒体δ12-脱氢酶并具有GenBank Acc.No.L43920所公开的序列。载体pBS13是从载体pML70(图1)衍化而来的，pML70包含KTi3启动子和KTi3 3′非翻译区并通过中间质粒pML51,pML55,pML64和pML65从商业用载体pTZ18R(Pharmacia)衍化而来的。将完整大豆KTi3基因的2.4kb BstBⅠ/EcoRⅠ片段(Jofuku和Goldberg(1989)植物细胞1:1079-1093)连接到pTZ18R的AccⅠ/EcoRⅠ位点产生质粒pML51，该2.4kb BstBⅠ/EcoRⅠ片段包含5′非翻译区的所有2039个核苷酸和KTi基因编码序列的390个碱基，其末端在相对应于Jofuku(上文)所描述序列的碱基755-761的EcoRⅠ位点。为了破坏KTi3插入片段5′非翻译区中间的NcoⅠ位点，用NcoⅠ切割质粒pML51，用DNA聚合酶ⅠKlenow片段补平单链末端，产物重新连接产生质粒pML55。用XmnⅠ/EcoRⅠ部分消化质粒pML55，产生一个0.42kb片段，相应于上面所引序列已被丢弃的碱基732至755。通过制作包含与部分EcoRⅠ位点(5′-GAAGG-3′)直接相连的NcoⅠ位点(5′-CCATGGG-3′)和XmnⅠ位点(5′-TCTTCC-3′)编码序列互补的合成寡核苷酸双体，构建一个人工合成的含NcoⅠ位点的XmnⅠ/EcoRⅠ接头。XmnⅠ和NcoⅠ/EcoRⅠ位点通过短插入序列(5′-ATAGCCCCCCAA-3′)相连。将这种人工合成的接头连接到4.94kb片段的XmnⅠ/EcoRⅠ位点，产生质粒pML64。用引物ML51和ML52，按标准PCR方法(Perkin Elmer Cetus,GeneAmp PCR试剂盒)从Jofuku(supra)所述序列中扩增KTi3基因的3′非翻译区。引物ML51包含相应上面所引序列碱基1072至1091的20个核苷酸，在引物5′端加入相应EcoRⅤ(5-′GATATC-3′),NcoⅠ(5′-CCATGG-3′),XbaⅠ(5′-TCTAGA-3′),SmaⅠ(5′-CCCGGG-3′)和KpnⅠ(5′-GGTACC-3′)位点的核苷酸。引物ML52包含对应上面所引序列碱基1242至1259核苷酸的精确的互补体，在引物5′端加入对应SmaⅠ(5′-CCCGGG-3′),EcoRⅠ(5′-GAATTC-3′),BamHⅠ(5′-GGATCC-3′)和SalⅠ(5′-GTCGAC-3′)位点的核苷酸。PCR扩增的KTi3基因的3′端连接到pML64的NcoⅠ/EcoRⅠ位点，产生质粒pML65。通过制作一个包含PstⅠ(5′-CTGCA-3′),SalⅠ(5′-GTCGAC-3′),BamHⅠ(5′-GGATCC-3′)和PstⅠ(5′-CTGCA-3′)位点编码序列的互补合成寡核苷酸双体，构建人工合成的多克隆位点接头。接头连接到pML65的PstⅠ位点(与KTi3启动子区5′端直接相连)，产生质粒pML70。

将大豆δ-12脱氢酶cDNA,GmFad 2-1(GenBank Acc.No.L43920)的1.46kb SmaⅠ/KpnⅠ片段连接到pML70的相应位点，产生质粒pBS10。相对于pBS10中KTi3启动子，脱氢酶cDNA片段处于相反(反义)方向。用BamHⅠ消化质粒pBS10，用琼脂糖凝胶电泳分离一个3.47kb片段，该片段代表KTi3启动子/反义脱氢酶cDNA/KTi3 3′端转录单位。载体pML18包含非组织特异和组成型花椰菜花叶病毒(35S)启动子(Odell等(1985)自然313:810-812；Hull等(1987)病毒学86:482-493)，驱动紧随胭脂碱合酶基因3′端的新霉素磷酸转移酶的表达(Beck等(1982)基因19:327-336)，胭脂碱合成酶基因包含核苷酸848至1550(Depicker等(1982)应用与普通遗传学杂志1:561-574)。将这个转录单位插入商业克隆载体pGEM9z(Gibco-BRL)，在35S启动子的5′端依次为限制性位点SalⅠ,XbaⅠ,BamHⅠ和SmaⅠ。另外一个Sal位点在NOS3′序列的3′端，XbaⅠ,BamHⅠ和SalⅠ位点是独一无二的。从pBS10所产生的3.47kb转录单位连接到载体pML18的BamHⅠ位点。当用SmaⅠ和KpnⅠ消化所产生的质粒，含所需方向插入片段的质粒产生5.74,2.69和1.46kb的3个片段。挑选具有正确方向转录单位的质粒并命名为pBS13。

pBS13(上面所述)的1.46kb XbaⅠ/EcoRⅤ片段被定向克隆到载体pCST2(上面所述)的SmaⅠ/XbaⅠ位点，产生一个质粒，命名为pBS39。质粒pBS39的3.3kb HindⅢ片段被克隆到质粒pMH40(上面所述)的HindⅢ位点产生植物表达载体pBS43(图6)。

              用载体pBS43转化大豆及

            转基因“transwitch”系的鉴定

用大豆分生组织的粒子轰击方法(Christou等(1990)生物工程趋势8:145-151)，将载体pBS43转化到大豆分生组织中。根据脂肪酸组分筛选转化植物种子(即，从鉴定为GUS活性阳性的植物中筛选)。从小(约10mg)的种子碎片(Browse等(1986)分析生物化学152:141-145)己烷提取物中制备脂肪酸甲酯。分析10个不同转基因系的种子碎片，这些系中一个系的命名为260-05 R1的种子总油酸含量为80-85％，而对照种子为约20％。这种表型是内源Fad 2-1基因的共抑制造成的，这是2个pBS43拷贝插入命名为“Transwitch基因座”的大豆基因组基因座的结果(Kinney,A,J,(1995)“庄稼改良的诱发突变和分子技术”，国际原子能机构，维也纳)。含Transwitch基因座的系260-05的高油酸含量种子自交，并且挑选Transwitch基因座纯合的R2种子。挑选2个R2纯合种子(G94-1,G94-19)以及G94-1和G94-19的后代所衍生的种子(R3,R4,R5)作进一步分析。

将Iowa和Puerto Rico所生长的G94-1和G94-19植物的R5种子研磨成粉末，5mL己烷大约提取1g。离心后，倒掉己烷，薄片空气干燥。按上述方法提取约10mg去脂粉末，并通过SDS-PAGE分析。在这两个地区所得的转基因系中，相对于对照大豆系和标准大豆粉，β-conglycinin的α′和α亚基表达被抑制(图7)。

                      实施例3

为测试用反义技术能否抑制β-conglycinin表达，用上面所描述的逆转录酶聚合酶链反应生成α和α′的全长cDNAs。上游引物ConSa与α和α′cDNA序列的4-19区同源，在5′端加入另外的核苷酸来编码KpnⅠ限制性位点。所用下游引物Con1.9a，与代表α同型的SEQ ID NO:11818-1801区和代表α′同型的SEQ ID NO:2 1920-1903同源。为了便于后面的克隆步骤，在5′端加入另外的核苷酸来编码NcoⅠ限制性位点。

如上所述进行逆转录和随后的PCR反应。用随机六聚体或Con1.9a逆转录发育大豆种子所分离的RNA(如上述方法)。按上述方法，用ConSa和Con1.9a在PCR反应中扩增cDNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析15μLPCR反应混合物。观察到相当于α预测分子量的一条1.8kb带。用Wizard^TMPCR Preps DNA纯化系统试剂盒(Promega)纯化剩余的反应混合物。因为所用引物，所以αcDNA包括5′端的KpnⅠ位点和3′端的NcoⅠ位点，用NcoⅠ和KpnⅠ限制性内切酶消化αcDNA。凝胶分离所产生的αcDNA，标记为F10，并用质粒中NcoⅠ和KpnⅠ位点将其定向克隆(反义方向)到pCW109中。用嵌套引物通过PCR证实F10是α(上游：Con.09(SEQ ID NO:6)；下游：Con1.4a(SEQ ID NO:5)和Con1.0(SEQ ID NO:10))。

Con 1.0 5′-CGGGTATGGCGAGTGTT-3′(SEQ ID NO:10)

用HindⅢ部分消化从pCW109/F10中产生转录单位β-conglycinin启动子/αcDNA反义物/菜豆蛋白3′端。部分消化条件的选择使得产生6个片段(5.1kb,3.8kb,3.6kb,2.6kb,2.4kb和1.2kb)。用凝胶分离含转录单位的3.6kb片段并标记为F14。再将F14克隆到pKS18HH的HindⅢ位点。在用HindⅢ消化由转化细胞制备的质粒DNA制品证实插入后，用KpnⅠ消化阳性培养物的质粒DNA，以确认它们包含3.6kb F14片段，而不包含以HindⅢ部分消化pCW109/F10所得的3.8kb片段。F14包含1个KpnⅠ位点，而3.8kb片段没有。确认后，pKS18HH/F14标记为pJo3(图8)。如上所述用pJo3转化大豆胚胎悬浮培养物。转化产生5个转化克隆；成熟后，每个克隆产生4至8个体细胞胚胎。

如前所述用SDS-PAGE分析转化体细胞胚胎蛋白提取物。结果见表2。转基因克隆产生至少一个体细胞胚胎，其中α和α′表达被抑制。

            表2克隆    胚胎    α    α′    βJo3-1     1      -     -      +

      2      +     +      +Jo3-2     1      -     -      +

      2      -     -      +Jo3-2b    1      -     -      +

      2      -     -      +Jo3-3     1      -     -      +

      2      -     -      +Jo3-4     1      -     -      +

      2      -     -      +实施例4

有5个编码大豆球蛋白亚基的非等位基因。对基因组克隆和cDNA′s测序，使亚基基因按照序列相似性分成两组。组Ⅰ包含Gy1(SEQ ID NO:11),Gy2(SEQ ID NO:12)和Gy3(SEQ ID NO:13)，而组Ⅱ包含Gy4(SEQ ID NO:14)和Gy5(SEQ ID NO:15)。在一组内基因间相似性大于85％，但是不同组基因间仅有42％至46％的相似性。为确定应用共抑制技术能否在发育子叶中抑制大豆球蛋白表达，如上所述，用逆转录酶聚合酶链反应制备组Ⅰ和组Ⅱ的cDNA′s。

用于组Ⅰ反应(G1-1)的上游引物与所有组ⅠcDNA’s的1-19区同源。所用2个下游引物：G1-1039与Gy1的1038-1022区，Gy2的1008-992，和Gy3的996-980同源；或G1-1475，它与Gy1的1475-1460区，Gy2的1445-1430，和Gy3的1433-1418区同源。为了方便后面的克隆，所有引物包含编码5′端NotⅠ限制性位点的附加核苷酸。

用随机六聚体，或G1-1475或G1-1039作为反应中的下游引物，逆转录发育大豆种子所分离的RNA。用G1-1与G1-1039或G1-1475的混合物扩增cDNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳分析15μL PCR反应混合物。PCR反应产生预期分子量的产物，分别对应引物组G1-1/G1-1039和G1-1/G1-1475的约1kb和1.4-1.5kb。用Wizard^TM PCR PrepsDNA纯化系统试剂盒(Promega)纯化剩余反应混合物中的cDNA片段。然后用NotⅠ消化纯化的cDNA’s并通过琼脂糖凝胶纯化分离。

组Ⅱ(G4-7)RT-PCR反应所用的上游引物与组Ⅱ两个cDNA′s的7-22区同源。所用两个下游引物：G4-1251，是与Gy4的1251-1234区和Gy5的1153-1135同源；或G4-1670，是与Gy4的1668-1653区同源。在Gy5中没有此相似区域。为了有助于将来克隆，所有引物包含编码5′端NotⅠ限制性位点的附加核苷酸。

用随机六聚体，或G4-1251或G4-1670作为反应中下游引物，逆转录发育大豆种子所分离的RNA。用G4-7与G4-1251或G4-1670的混合物扩增cDNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳分析15μLPCR反应混合物。PCR反应产生预期分子量的产物，分别对应于引物组G4-7/G4-1251和G4-7/G4-16.70的约1.25kb和1.7kb。用Wizard^TMPCR Preps DNA纯化系统试剂盒(Promega)纯化剩余反应混合物中的cDNA片段。然后用NotⅠ消化纯化的cDNA′s并从凝胶中分离。

所分离的组ⅠcDNA在NotⅠ位点(有义方向)克隆到pRB20(图9)中。在NotⅠ部分限制性消化和分离单切割pRB20/组Ⅰ线性片段后，加入组ⅡcDNA产生最终的转录单位β-conglycinin启动子/组ⅠcDNA(有义方向)/菜豆蛋白3′端和β-conglycinin启动子/组ⅡcDNA(有义方向)/菜豆蛋白3′端。然后按上面所描述的方法，将产生的质粒用来转化体细胞胚胎悬浮液。

                        序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

    (A)姓名：E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

    (B)街道：1007 MARET STREET

    (C)城市：WILMINGTON

    (D)州：  DELAWARE

    (E)国家：美国

    (F)邮政编号：19898

    (G)电话：302-992-5481

    (H)电传：302-773-0164

    (I)电报：6717325

(ⅱ)发明题目：大豆种子蛋白基因特异种类的抑制

(ⅲ)序列数目：21

(ⅳ)计算机可读形式：

    (A)媒介类型：3.5英寸软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：Win 95的Microsoft Word.

    (D)软件：Microsoft Word 7.0

(ⅴ)目前申请数据：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

    (C)分类：

(ⅵ)先申请数据：

    (A)申请号：60/019,940

    (B)申请日：JUNE 14,1996

(ⅶ)代理人/代理信息：

    (A)姓名：LYNNEM.CHRISTENBURY

    (B)注册号：30,971

    (C)参考/文件指示号：BB-1071(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1818碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATGATGAGAG CACGGTTCCC ATTACTGTTG CTGGGACTTG TTTTCCTGGC TTCAGTTTCT    60GTCTCATTTG GCATTGCTTA CTGGGAAAAA GAGAACCCCA AACACAACAA GTGTCTCCAG    120AGTTGCAATA GCGAGAGAGA CTCGTACAGG AACCAAGCAT GCCACGCTCG TTGCAACCTC    180CTTAAGGTGG AGAAAGAAGA ATGTGAAGAA GGTGAAATTC CACGACCACG ACCACGACCA    240CAACACCCGG AGAGGGAACC TCAGCAACCC GGTGAGAAGG AGGAAGACGA AGATGAGCAA    300CCACGTCCAA TCCCATTCCC ACGCCCACAA CCTCGTCAAG AAGAAGAGCA CGAGCAGAGA    360GAGGAACAGG AATGGCCTCG CAAGGAGGAA AAACGCGGAG AAAAGGGAAG TGAAGAGGAA    420GATGAGGATG AGGATGAGGA ACAAGATGAA CGTCAATTCC CATTCCCACG CCCACCTCAT    480CAGAAGGAAG AGCGAAACGA AGAGGAAGAT GAGGATGAGG AGCAGCAGCG AGAGAGCGAA    540GAAAGTGAAG ATTCTGAGTT ACGAAGACAT AAGAATAAGA ACCCTTTTCT CTTCGGCTCT    600AACAGGTTCG AAACTCTCTT CAAAAACCAA TATGGTCGCA TTCGCGTCCT CCAGAGGTTC    660AACCAACGCT CCCCACAACT TCAGAATCTC CGAGACTACC GCATTTTGGA GTTCAACTCC    720AAACCCAACA CCCTCCTTCT CCCCAACCAT GCTGACGCTG ATTACCTCAT CGTTATCCTT    780AACGGGACTG CCATTCTTTC CTTGGTGAAC AACGACGACA GAGACTCCTA CAGACTTCAA    840TCTGGTGATG CCCTGAGAGT CCCCTCAGGA ACCACATACT ATGTGGTCAA CCCTGACAAC    900AACGAAAATC TCAGATTAAT AACACTCGCC ATACCCGTTA ACAAGCCTGG TAGATTTGAG    960AGTTTCTTCC TATCTAGCAC TGAAGCTCAA CAATCCTACT TGCAAGGATT CAGCAGGAAC    1020ATTTTAGAGG CCTCCTACGA TACCAAATTC GAGGAGATAA ACAAGGTTCT GTTTAGTAGA    1080GAGGAAGGGC AGCAGCAAGG GGAGCAGAGG CTGCAAGAGA GCGTGATTGT GGAAATCTCG    1140AAGGAACAGA TTCGGGCACT GAGCAAACGT GCCAAATCTA GTTCAAGGAA AACCATTTCT    1200TCTGAAGATA AACCTTTTAA CTTGAGAAGC CGCGACCCCA TCTACTCCAA CAAGCTTGGC    1260AAGTTCTTTG AGATCACCCC AGAGAAAAAC CCCCAGCTTC GGGACTTGGA TATCTTCCTC    1320AGTATTGTGG ATATGAACGA GGGAGCTCTT CTTCTACCAC ACTTCAATTC AAAGGCGATA    1380GTGATACTGG TAATTAATGA AGGAGATGCA AACATTGAAC TTGTTGGCCT AAAAGAACAA   1440CAACAGGAGC AGCAACAGGA AGAGCAACCT TTGGAAGTGC GGAAATATAG AGCCGAATTG   1500TCTGAACAAG ATATATTTGT AATCCCAGCA GGTTATCCAG TTGTGGTCAA CGCTACCTCA   1560AATCTGAATT TCTTTGCTAT TGGTATTAAT GCCGAGAACA ACCAGAGGAA CTTCCTCGCA   1620GGTTCGCAAG ACAATGTGAT AAGCCAGATA CCTAGTCAAG TGCAGGAGCT TGCATTCCCT   1680GGGTCTGCAC AAGCTGTTGA GAAGCTATTA AAGAACCAAA GAGAATCCTA CTTTGTGGAT   1740GCTCAGCCTA AGAAGAAAGA GGAGGGGAAT AAGGGAAGAA AGGGTCCTTT GTCTTCAATT   1800TTGAGGGCTT TTTACTGA                                                 1818(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：1920碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:ATGATGAGAG CGCGGTTCCC ATTACTGTTG CTGGGAGTTG TTTTCCTAGC ATCAGTTTCT   60GTCTCATTTG GCATTGCGTA TTGGGAAAAG CAGAACCCCA GTCACAACAA GTGCCTCCGA  120AGTTGCAATA GCGAGAAAGA CTCCTACAGG AACCAAGCAT GCCACGCTCG TTGCAACCTC  180CTTAAGGTGG AGGAAGAAGA AGAATGCGAA GAAGGTCAAA TTCCACGACC ACGACCACAA  240CACCCGGAGA GGGAACGTCA GCAACACGGT GAGAAGGAGG AAGACGAAGG TGAGCAGCCA  300CGTCCATTCC CATTCCCACG CCCACGCCAA CCTCATCAAG AGGAAGAGCA CGAGCAGAAG  360GAGGAACACG AATGGCATCG CAAGGAGGAA AAACACGGAG GAAAGGGAAG TGAAGAGGAA  420CAAGATGAAC GTGAACACCC ACGCCCACAC CAACCTCATC AAAAGGAAGA GGAAAAGCAC  480GAATGGCAAC ACAAGCAGGA AAAGCACCAA GGAAAGGAAA GTGAAGAAGA AGAAGAAGAC  540CAAGACGAGG ATGAGGAGCA AGACAAAGAG AGCCAAGAAA GTGAAGGTTC TGAGTCTCAA  600AGAGAACCAC GAAGACATAA GAATAAGAAC CCTTTTCACT TCAACTCTAA AAGGTTCCAA  660ACTCTCTTCA AAAACCAATA TGGCCACGTT CGCGTCCTCC AGAGGTTCAA CAAACGCTCC  720CAACAGCTTC AGAATCTCCG AGACTACCGC ATTTTGGAGT TCAACTCCAA ACCCAACACC  780CTTCTTCTCC CCCACCATGC TGACGCTGAT TACCTCATCG TTATCCTTAA CGGGACTGCC  840ATTCTTACCT TGGTGAACAA CGACGACCGA GACTCTTACA ACCTTCAATC TGGCGATGCC  900CTAAGAGTCC CTGCAGGAAC CACATTCTAT GTGGTTAACC CTGACAACGA CGAGAATCTC   960AGAATGATAG CAGGAACCAC ATTCTATGTG GTTAACCCTG ACAACGACGA GAATCTCAGA  1020ATGATAACAC TCGCCATACC CGTTAACAAA CCCGGTAGAT TTGAGAGTTT CTTCCTATCT  1080AGCACTCAAG CTCAACAGTC CTACTTGCAA GGGTTCAGCA AGAATATTCT AGAGGCCTCA  1140TACGACACCA AATTCGAGGA GATAAACAAG GTTCTGTTTG GTAGAGAGGA GGGGCAGCAA  1200CAAGGGGAGG AGAGGCTGCA AGAGAGTGTG ATTGTGGAAA TCTCAAAGAA ACAAATTCGG  1260GAACTGAGCA AACATGCCAA ATCTAGTTCA AGGAAAACCA TTTCTTCTGA AGATAAACCT  1320TTCAACTTGG GAAGCCGCGA CCCCATCTAT TCCAACAAGC TTGGCAAGTT GTTTGAGATT  1380ACCCAGAGAA ACCCTCAGCT TCGGGACTTG GATGTCTTCC TCAGTGTTGT GGATATGAAC  1440GAGGGAGCTC TTTTTCTACC ACACTTCAAT TCAAAGGCCA TAGTGGTACT AGTGATTAAT  1500GAAGGAGAAG CAAACATTGA ACTTGTTGGC ATTAAAGAAC AACAACAGAG GCAGCAACAG  1560GAAGAGCAAC CTTTGGAAGT GCGGAAATAT AGAGCTGAAT TGTCTGAACA AGATATATTT  1620GTAATCCCAG CAGGTTATCC AGTTATGGTC AACGCTACCT CAGATCTGAA TTTCTTTGCT  1680TTTGGTATCA ATGCCGAGAA CAACCAGAGG AACTTCCTTG CAGGTTCGAA AGACAATGTG  1740ATAAGCCAGA TACCTAGTCA AGTGCAGGAG CTTGCGTTCC CTAGGTCTGC AAAAGATATT  1800GAGAACCTAA TAAAGAGCCA AAGTGAGTCC TACTTTGTGG ATGCTCAGCC TCAGCAGAAA  1860GAGGAGGGGA ACAAGGGAAG AAAGGGTCCT TTGTCTTCAA TTTTGAGGGC TTTTTACTGA  1920(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：1320碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATGATGAGAG TGCGGTTTCC TTTGTTGGTG TTGCTGGGAA CTGTTTTCCT GGCATCAGTT    60TGTGTCTCAT TAAAGGTGAG AGAGGATGAG AATAACCCTT TCTACTTTAG AAGCTCTAAC   120AGCTTCCAAA CTCTCTTTGA GAACCAAAAC GTTCGCATTC GTCTCCTCCA GAGATTCAAC   180AAACGCTCCC CACAACTTGA GAACCTTCGA GACTACCGGA TTGTCCAGTT TCAGTCAAAA   240CCCAACACAA TCCTTCTCCC CCACCATGCT GACGCCGATT TCCTCCTCTT TGTCCTTAGC   300GGGAGAGCCA TACTTACCTT GGTGAACAAC GACGACAGAG ACTCCTACAA CCTTCACCCT   360GGCGATGCCC AGAGAATCCC AGCTGGAACC ACTTACTATT TGGTTAACCC TCACGACCAC   420CAGAATCTCA AAATAATCAA ACTTGCCATA CCCGTCAACA AACCTGGCAG ATATGATGAT   480TTCTTCTTAT CTAGCACTCA AGCCCAACAG TCCTACTTGC AAGGCTTCAG CCATAATATT   540CTAGAGACCT CCTTCCATAG CGAATTCGAG GAGATAAACA GGGTTTTGTT TGGAGAGGAA   600GAGGAGCAGA GGCAGCAAGA GGGAGTGATC GTGGAACTCT CAAAGGAACA AATTCGGCAA   660CTGAGCAGAC GTGCCAAATC TAGTTCAAGG AAAACCATTT CCTCCGAAGA TGAACCATTC   720AACTTGAGAA GCCGCAACCC CATCTATTCC AACAACTTTG GAAAGTTCTT TGAGATCACC   780CCTGAGAAAA ACCCACAGCT TCGGGACTTG GATATCTTCC TCAGTTCTGT GGATATCAAC   840GAAGGAGCTC TTCTTCTACC ACACTTCAAT TCAAAGGCCA TAGTGATACT AGTGATTAAT   900GAAGGAGATG CAAACATTGA ACTTGTTGGC ATTAAAGAAC AACAACAGAA GCAGAAACAG   960GAAGAGGAAC CTTTGGAAGT GCAAAGGTAC AGAGCTGAAT TGTCTGAAGA CGATGTATTT  1020GTAATTCCAG CAGCTTATCC ATTTGTCGTC AACGCTACCT CAAACCTCAA TTTCCTTGCT  1080TTTGGTATCA ATGCTGAGAA CAACCAGAGG AACTTCCTTG CAGGCGAGAA AGACAATGTG  1140GTAAGGCAGA TAGAAAGACA AGTGCAGGAG CTTGCGTTCC CTGGGTCTGC ACAAGATGTT  1200GAGAGGCTAT TAAAGAAGCA GAGGGAATCC TACTTTGTTG ATGCTCAGCC TCAGCAGAAG  1260GAGGAGGGGA GTAAGGGAAG AAAGGGTCCT TTTCCTTCAA TCTTAGGTGC TCTCTACTGA  1320(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：25碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CGTACCATGG TGAGAGCGCG GTTCC                               25(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CGGTACCGAA TTGAAGTGTG GTAG                                24(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:TCGTCCATGG AGCGCGGTTC CCATTAC                             27(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：17碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:TCTCGGTCGT CGTTGTT                                        17(2)SEQ ID NO:8的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:ACGGTACCGA TGAGAGCGCG GTTCC                               25(2)SEQ ID NO:9的信息：

(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：27碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:AACCCATGGT CAGTAAAAAG CCCTCAA                             27(2)SEQ ID NO:10的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：17碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:CGGGTATGGC GAGTGTT                                        17(2)SEQ ID NO:11的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1488碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:ATGGCCAAGC TAGTTTTTTC CCTTTGTTTT CTGCTTTTCA GTGGCTGCTG CTTCGCTTTC    60AGTTCCAGAG AGCAGCCTCA GCAAAACGAG TGCCAGATCC AAAAACTCAA TGCCCTCAAA   120CCGGATAACC GTATAGAGTC AGAAGGAGGG CTCATTGAGA CATGGAACCC TAACAACAAG   180CCATTCCAGT GTGCCGGTGT TGCCCTCTCT CGCTGCACCC TCAACCGCAA CGCCCTTCGT   240AGACCTTCCT ACACCAACGG TCCCCAGGAA ATCTACATCC AACAAGGTAA GGGTATTTTT   300GGCATGATAT ACCCGGGTTG TCCTAGCACA TTTGAAGAGC CTCAACAACC TCAACAAAGA   360GGACAAAGCA GCAGACCACA AGACCGTCAC CAGAAGATCT ATAACTTCAG AGAGGGTGAT   420TTGATCGCAG TGCCTACTGG TGTTGCATGG TGGATGTACA ACAATGAAGA CACTCCTGTT   480GTTGCCGTTT CTATTATTGA CACCAACAGC TTGGAGAACC AGCTCGACCA GATGCCTAGG   540AGATTCTATC TTGCTGGGAA CCAAGAGCAA GAGTTTCTAA AATATCAGCA AGAGCAAGGA   600GGTCATCAAA GCCAGAAAGG AAAGCATCAG CAAGAAGAAG AAAACGAAGG AGGCAGCATA   660TTGAGTGGCT TCACCCTGGA ATTCTTGGAA CATGCATTCA GCGTGGACAA GCAGATAGCG   720AAAAACCTAC AAGGAGAGAA CGAAGGGGAA GACAAGGGAG CCATTGTGAC AGTGAAAGGA   780GGTCTGAGCG TGATAAAACC ACCCACGGAC GAGCAGCAAC AAAGACCCCA GGAAGAGGAA   840GAAGAAGAAG AGGATGAGAA GCCACAGTGC AAGGGTAAAG ACAAACACTG CCAACGCCCC   900CGAGGAAGCC AAAGCAAAAG CAGAAGAAAT GGCATTGACG AGACCATATG CACCATGAGA   960CTTCGCCACA ACATTGGCCA GACTTCATCA CCTGACATCT ACAACCCTCA AGCCGGTAGC  1020GTCACAACCG CCACCAGCCT TGACTTCCCA GCCCTCTCGT GGCTCAGACT CAGTGCTGAG  1080TTTGGATCTC TCCGCAAGAA TGCAATGTTC GTGCCACACT ACAACCTGAA CGCGAACAGC  1140ATAATATACG CATTGAATGG ACGGGCATTG ATACAAGTGG TGAATTGCAA CGGTGAGAGA  1200GTGTTTGATG GAGAGCTGCA AGAGGGACGG GTGCTGATCG TGCCACAAAA CTTTGTGGTG  1260GCTGCAAGAT CACAGAGTGA CAACTTCGAG TATGTGTCAT TCAAGACCAA TGATACACCC  1320ATGATCGGCA CTCTTGCAGG GGCAAACTCA TTGTTGAACG CATTACCAGA GGAAGTGATT  1380CAGCACACTT TCAACCTAAA AAGCCAGCAG GCCAGGCAGA TAAAGAACAA CAACCCTTTC  1440AAGTTCCTGG TTCCACCTCA GGAGTCTCAG AAGAGAGCTG TGGCTTAG               1488(2)SEQ ID NO:12的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1458碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:ATGGCCAAGC TTGTTCTTTC CCTTTGTTTC CTTCTTTTCA GTGGCTGCTT CGCTCTGAGA   60GAGCAGGCAC AGCAAAATGA GTGCCAGATC CAAAAGCTGA ATGCCCTCAA ACCGGATAAC  120CGTATAGAGT CGGAAGGTGG GTTCATTGAG ACATGGAACC CTAACAACAA GCCATTCCAG  180TGTGCCGGTG TTGCCCTCTC TCGCTGCACC CTTAACCGCA ATGCCCTTCG TAGACCTTCC  240TACACCAACG GTCCCCAGGA AATCTACATA CAACAAGGTA ATGGTATTTT TGGCATGATA  300TTCCCGGGTT GTCCTAGCAC TTATCAAGAG CCGCAAGAAT CTCAGCAACG AGGACGAAGC  360CAGAGGCCCC AAGACCGTCA CCAAAAGGTA CATCGCTTCA GAGAGGGTGA TTTGATCGCA  420GTGCCTACTG GTGTTGCATG GTGGATGTAC AACAATGAAG ACACTCCTGT TGTTGCCGTT  480TCTATTATTG ACACCAACAG CTTGGAGAAC CAGCTCGACC AGATGCCTAG GAGATTCTAT  540CTTGCTGGGA ACCAAGAGCA AGAGTTTCTA AAATATCAGC AGCAGCAGCA AGGAGGTTCC  600CAAAGCCAGA AAGGAAAGCA ACAAGAAGAA GAAAACGAAG GAAGCAACAT ATTGAGTGGC  660TTCGCCCCTG AATTCTTGAA AGAAGCGTTC GGCGTGAACA TGCAGATAGT GAGAAACCTA  720CAAGGTGAGA ACGAAGAGGA GGATAGTGGA GCCATTGTGA CAGTGAAAGG AGGTCTAAGA   780GTCACAGCTC CAGCCATGAG GAAGCCACAG CAAGAAGAAG ATGATGATGA TGAGGAAGAG   840CAGCCACAGT GCGTGGAGAC AGACAAAGGT TGCCAACGCC AAAGCAAAAG GAGCAGAAAT   900GGCATTGATG AGACCATTTG CACAATGAGA CTTCGCCAAA ACATTGGTCA GAATTCATCA   960CCTGACATCT ACAACCCTCA AGCTGGTAGC ATCACAACCG CCACCAGCCT TGACTTCCCA  1020GCCCTCTGGC TTCTCAAACT CAGTGCCCAG TATGGATCAC TCCGCAAGAA TGCTATGTTC  1080GTGCCACACT ACACCCTGAA CGCGAACAGC ATAATATACG CATTGAATGG GCGGGCATTG  1140GTACAAGTGG TGAATTGCAA TGGTGAGAGA GTGTTTGATG GAGAGCTGCA AGAGGGAGGG  1200GTGCTGATCG TTCCACAAAA CTTTGCGGTG GCTGCAAAAT CCCAGAGCGA TAACTTTGAG  1260TATGTGTCAT TCAAGACCAA TGATAGACCC TCGATCGGAA ACCTTGCAGG GGCAAACTCA  1320TTGTTGAACG CATTGCCAGA GGAAGTGATT CAGCACACTT TTAACCTAAA GAGCCAGCAG  1380GCCAGGCAGG TGAAGAACAA CAACCCTTTC AGCTTCCTTG TTCCACCTCA GGAGTCTCAG  1440AGGAGAGCTG TGGCTTAG                                                1458(2)SEQ ID NO:13的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1446碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:ATGGCTAAGC TTGTTCTTTC CCTTTGTTTT CTGCTTTTCA GTGGCTGCTG CTTCGCTTTC   60AGTTTCAGAG AGCAGCCACA GCAAAACGAG TGCCAGATCC AACGCCTCAA TGCCCTAAAA  120CCGGATAACC GTATAGAGTC AGAAGGTGGC TTCATTGAGA CATGGAACCC TAACAACAAG  180CCATTCCAGT GTGCCGGTGT TGCCCTCTCT CGCTGCACCC TCAACCGCAA CGCCCTTCGC  240AGACCTTCCT ACACCAACGC TCCCCAGGAG ATCTACATCC AACAAGGTAG TGGTATTTTT  300GGCATGATAT TCCCGGGTTG TCCTAGCACA TTTGAAGAGC CTCAACAAAA AGGACAAAGC  360AGCAGGCCCC AAGACCGTCA CCAGAAGATC TATCACTTCA GAGAGGGTGA TTTGATTGCA  420GTGCCAACCG GTTTTGCATA CTGGATGTAC AACAATGAAG ACACTCCTGT TGTTGCCGTT  480TCTCTTATTG ACACCAACAG CTTCCAGAAC CAGCTCGACC AGATGCCTAG GAGATTCTAT  540CTTGCTGGGA ACCAAGAGCA AGAGTTTCTA CAGTATCAGC CACAGAAGCA GCAAGGAGGT  600ACTCAAAGCC AGAAAGGAAA GCGTCAGCAA GAAGAAGAAA ACGAAGGAGG CAGCATATTG  660AGTGGCTTCG CCCCGGAATT CTTGGAACAT GCGTTCGTCG TGGACAGGCA GATAGTGAGA  720AAGCTACAAG GTGAGAACGA AGAGGAAGAG AAGGGTGCCA TTGTGACAGT GAAAGGAGGT  780CTCAGCGTGA TAAGCCCACC CACGGAAGAG CAGCAACAAA GACCCGAGGA AGAGGAGAAG  840CCAGATTGTG ACGAGAAAGA CAAACATTGC CAAAGCCAAA GCAGAAATGG CATTGACGAG  900ACCATTTGCA CAATGAGACT TCGCCACAAC ATTGGCCAGA CTTCATCACC TGACATCTTC  960AACCCTCAAG CTGGTAGCAT CACAACCGCT ACCAGCCTCG ACTTCCCAGC CCTCTCGTGG  1020CTCAAACTCA GTGCCCAGTT TGGATCACTC CGCAAGAATG CTATGTTCGT GCCACACTAC  1080AACCTGAACG CAAACAGCAT AATATACGCA TTGAATGGAC GGGCATTGGT ACAAGTGGTG  1140AATTGCAATG GTGAGAGAGT GTTTGATGGA GAGCTGCAAG AGGGACAGGT GTTAATTGTG  1200CCACAAAACT TTGCGGTGGC TGCAAGATCA CAGAGCGACA ACTTCGAGTA TGTTTCATTC  1260AAGACCAATG ATAGACCCTC GATCGGCAAC CTTGCAGGTG CAAACTCATT GTTGAACGCA  1320TTGCCGGAGG AAGTGATTCA GCAAACTTTT AACCTAAGGA GGCAGCAGGC CAGGCAGGTC  1380AAGAACAACA ACCCTTTCAG CTTCCTGGTT CCACCTAAGG AGTCTCAGAG GAGAGTTGTG  1440GCTTAG                                                             1446(2)SEQ ID NO:14的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1689碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:ATGGGGAAGC CCTTCACTCT CTCTCTTTCT TCCCTTTGCT TGCTACTCTT GTCGAGTGCA   60TGCTTTGCTA TTAGCTCCAG CAAGCTCAAC GAGTGCCAAC TCAACAACCT CAACGCGTTG  120GAACCCGACC ACCGCGTTGA GTTCGAAGGT GGTTTGATTC AAACATGGAA CTCTCAACAC  180CCTGAGCTGA AATGCGCCGG TGTCACTGTT TCCAAACTCA CCCTCAACCG CAATGGCCTC  240CACTTGCCAT CTTACTCACC TTATCCCCGG ATGATCATCA TCGCCCAAGG GAAAGGAGCA  300CTGCAGTGCA AGCCAGGATG TCCTGAGACG TTTGAGGAGC CACAAGAACA ATCAAACAGA  360AGAGGCTCAA GGTCGCAGAA GCAGCAGCTA CAGGACAGTC ACCAGAAGAT TCGTCACTTC  420AATGAAGGAG ACGTACTCGT GATTCCTCCT GGTGTTCCTT ACTGGACCTA TAACACTGGC  480GATGAACCAG TTGTTGCCAT CAGTCTTCTT GACACCTCTA ACTTCAATAA CCAGCTTGAT    540CAAACCCCTA GGGTATTTTA CCTTGCTGGG AACCCAGATA TAGAGTACCC AGAGACCATG    600CAACAACAAC AACAGCAGAA AAGTCATGGT GGACGCAAGC AGGGGCAACA CCAGCAGGAG    660GAAGAGGAAG AAGGTGGCAG CGTGCTCAGT GGCTTCAGCA AACACTTCTT GGCACAATCC    720TTCAACACCA ACGAGGACAT AGCTGAGAAA CTTCAGTCTC CAGACGACGA AAGGAAGCAG    780ATCGTGACAG TGGAAGGAGG TCTCAGCGTT ATCAGCCCCA AGTGGCAAGA ACAACAAGAT    840GAAGATGAAG ATGAAGACGA AGATGATGAA GATGAACAAA TTCCCTCTCA CCCTCCTCGC    900CGACCAAGCC ATGGAAAGCG TGAACAAGAC GAGGACGAGG ACGAAGATGA AGATAAACCT    960CGTCCTAGTC GACCAAGCCA AGGAAAGCGT GAACAAGACC AGGACCAGGA CGAGGACGAA    1020GATGAAGATG AAGATCAACC TCGCAAGAGC CGCGAATGGA GATCGAAAAA GACACAACCC    1080AGAAGACCTA GACAAGAAGA ACCACGTGAA AGAGGATGCG AGACAAGAAA CGGGGTTGAG    1140GAAAATATCT GCACCTTGAA GCTTCACGAG AACATTGCTC GCCCTTCACG CGCTGACTTC    1200TACAACCCTA AAGCTGGTCG CATTAGTACC CTCAACAGCC TCACCCTCCC AGCCCTCCGC    1260CAATTCCAAC TCAGTGCCCA ATATGTTGTC CTCTACAAGA ATGGAATTTA CTCTCCACAT    1320TGGAATCTGA ATGCAAACAG TGTGATCTAT GTGACTCGAG GACAAGGAAA GGTTAGAGTT    1380GTGAACTGCC AAGGGAATGC AGTGTTCGAC GGTGAGCTTA GGAGGGGACA ATTGCTGGTG    1440GTACCACAGA ACTTCGTGGT GGCGGAGCAA GCCGGAGAAC AAGGATTCGA ATACATAGTA    1500TTCAAGACAC ACCACAACGC AGTCACTAGC TACTTGAAGG ATGTGTTTAG GGCAATTCCC    1560TCAGAGGTTC TTGCCCATTC TTACAACCTT CGACAGAGTC AAGTGTCTGA GCTTAAGTAT    1620GAAGGAAATT GGGGTCCTTT GGTCAACCCT GAGTCTCAAC AAGGCTCACC CCGTGTTAAA    1680GTCGCATAA                                                            1689(2)SEQ ID NO:15的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1551碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:ATGGGGAAGC CCTTCTTCAC TCTCTCTCTT TCTTCCCTTT GCTTGCTACT CTTGTCGAGT   60GCATGCTTTG CTATTACCTC CAGCAAGTTC AACGAGTGCC AACTCAACAA CCTCAACGCG  120TTGGAACCCG ACCACCGCGT TGAGTCCGAA GGTGGTCTTA TTGAAACATG GAACTCTCAA   180CACCCTGAGC TGCAATGCGC CGGTGTCACT GTTTCCAAAC GCACCCTCAA CCGCAACGGC   240TCCCACTTGC CATCTTACTT ACCTTATCCC CAAATGATCA TTGTCGTTCA AGGGAAGGGA   300GCAATTGGAT TTGCATTTCC GGGATGTCCC GAGACGTTTG AGAAGCCACA ACAACAATCA   360AGCAGAAGAG GCTCAAGGTC ACAGCAGCAA CTACAAGACA GTCACCAGAA GATTCGTCAC   420TTCAATGAAG GAGACGTACT AGTGATTCCT CTTGGTGTTC CTTACTGGAC CTATAACACT   480GGCGATGAAC CAGTTGTTGC CATCAGTCCT CTTGACACCT CCAACTTCAA CAATCAGCTT   540GATCAAAACC CCAGAGTATT TTACCTTGCT GGGAACCCAG ATATAGAGCA TCCCGAGACC   600ATGCAACAAC AGCAGCAGCA GAAGAGTCAT GGTGGACGCA AGCAGGGGCA ACACCGACAG   660CAGGAGGAAG AAGGTGGCAG TGTGCTCAGT GGCTTCAGCA AACATTTCTT AGCACAATCC   720TTCAACACCA ACGAGGACAC AGCTGAGAAA CTTCGGTCTC CAGATGACGA AAGGAAGCAG   780ATCGTGACAG TGGAGGGAGG CCTCAGCGTT ATCAGCCCCA AGTGGCAAGA ACAAGAAGAC   840GAAGACGAAG ACGAAGACGA AGAATATGGA CGGACGCCCT CTTATCCTCC ACGACGACCA   900AGCCATGGAA AGCATGAAGA TGACGAGGAC GAGGACGAAG AAGAAGATCA ACCTCGTCCT   960GATCACCCTC CACAGCGACC AAGCAGGCCC GAACAACAAG AACCACGTGG AAGAGGATGT   1020CAGACTAGAA ATGGGGTTGA GGAAAATATT TGCACCATGA AGCTTCACGA GAACATTGCT   1080CGCCCTTCAC GTGCTGACTT CTACAACCCA AAAGCTGGTC GCATTAGCAC CCTCAACAGT   1140CTCACCCTCC CAGCCCTCCG CCAATTCGGA CTCAGTGCCC AATATGTTGT CCTCTACAGG   1200AATGGAATTT ACTCTCCAGA TTGGAACTTG AACGCGAACA GTGTGACGAT GACTCGAGGG   1260AAAGGAAGAG TTAGAGTGGT GAACTGCCAA GGGAATGCAG TGTTCGACGG TGAGCTAAGG   1320AGGGGACAAT TGCTAGTGGT GCCGCAGAAC CCCGCGGTGG CTGAGCAAGG GGGAGAACAA   1380GGATTGGAAT ATGTAGTGTT CAAGACACAC CACAACGCCG TGAGCAGCTA CATTAAGGAT   1440GTGTTTAGGG TAATCCCTTC GGAGGTTCTT TCCAATTCTT ACAACCTTGG CCAGAGTCAA   1500GTGCGTCAGC TCAAGTATCA AGGAAACTCC GGCCCTTTGG TCAACCCATA A            1551(2)SEQ ID NO:16的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:GCGGCCGCAT GGCCAAGCTA GTTTTTT                             27(2)SEQ ID NO:17的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：23碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:GCGGCCGCTG GTGGCGTTTG TGA                                 23(2)SEQ ID NO:18的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：23碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:GCGGCCGCTC TTCTGAGACT CCT                                 23(2)SEQ ID NO:19的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:GCGGCCGCAT GCCCTTCACT CTCT                                24(2)SEQ ID NO:20的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：26碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:GCGGCCGCTG GGAGGGTGAG GCTGTT                              26(2) SEQ ID NO:21的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线型

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:GCGGCCGCTG AGCCTTGTTG AGAC                                24

Claims (21)

1．一种减少大豆种子中大豆种子贮存蛋白数量的方法，包括：

(a)构建一个嵌合基因，包含：

  (ⅰ)编码在大豆种子细胞中起作用的启动子的核酸片段；

  (ⅱ)相对(ⅰ)中启动子为有义或反义方向、编码全部或部分大豆种子贮存蛋白的核酸片段；和

  (ⅲ)转录终止区；

(b)通过向大豆细胞导入(a)的嵌合基因，产生一种转基因大豆细胞；和

(c)使步骤(b)的转基因大豆细胞生长在产生步骤(a)嵌合基因表达的条件下

其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个的数量被减少了。

2．权利要求1的方法，其中大豆种子贮存蛋白选自大豆球蛋白和β-conglycinin。

3．权利要求1的方法，其中编码全部或部分大豆种子贮存蛋白的核酸片段置于启动子区的有义方向上。

4．权利要求1的方法，其中编码全部或部分大豆种子贮存蛋白的核酸片段置于启动子区的反义方向上。

5．权利要求4的方法，其中核酸片段编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α亚基。

6．权利要求1的方法，其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的至少两个被减少。

7．同时减少两个大豆基因表达的方法，包括：

(a)构建一个嵌合基因，包含：

  (ⅰ)编码大豆种子贮存蛋白基因的启动子区的核酸片段；和

  (ⅱ)编码全部或部分大豆蛋白的核酸片段，此大豆蛋白不是(ⅰ)的大豆种子贮存蛋白，所说的核酸片段置于(ⅰ)中启动子的有义或反义方向上；和

  (ⅲ)一个转录终止区；

(b)通过向大豆种子导入(a)嵌合基因，产生一种转基因大豆种子；和

(c)在使步骤(a)嵌合基因表达的条件下种植步骤(b)的转基因大豆种子

其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个的数量和(a)(ⅱ)核酸片段编码蛋白的数量减少了。

8．权利要求7的方法，其中编码全部或部分大豆蛋白的核酸片段置于启动子区的有义方向上，所述大豆蛋白不是(a)(ⅰ)的大豆种子贮存蛋白。

9．权利要求7的方法，其中编码全部或部分大豆蛋白的核酸片段置于启动子区的反义方向上，所述大豆蛋白不是(a)(ⅰ)的大豆种子贮存蛋白。

10权利要求7的方法，其中启动子是从编码β-conglycinin大豆种子贮存蛋白α亚基的基因衍生而来的。

11．权利要求7的方法，其中编码全部或部分大豆蛋白的核酸片段编码一个涉及脂肪酸生物合成的基因，所述大豆蛋白不是(a)(ⅰ)的大豆种子贮存蛋白。

12．权利要求7的方法，其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个的数量和(a)(ⅱ)核酸片段编码蛋白的数量减少。

13．权利要求13的方法，其中，与不含步骤(a)嵌合基因的大豆种子相比，一类大豆种子贮存蛋白亚基的至少两个被减少，并且与不含步骤(a)嵌合基因的大豆种子相比，其中含步骤(a)嵌合基因的大豆种子脂肪酸组成被改变。

14．由权利要求1的方法所制备的一种转基因大豆植物。

15．由权利要求7的方法所制备的一种转基因大豆植物。

16．从权利要求14的植物所得的转基因种子。

17．从权利要求15的植物所得的转基因种子。

18．一种转基因大豆植物，其中，与非转基因大豆植物所得种子相比，在所说的植物种子中，一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个的数量减少。

19．从权利要求18的植物所得的转基因种子。

20．一种转基因大豆植物，其中

(ⅰ)一类大豆种子贮存蛋白亚基的一个或多个的数量减少；和

(ⅱ)与从非转基因大豆植物得到的种子相比，在所说植物的种子中，油酸含量相对其它脂肪酸含量增加。

21．从权利要求20的植物所得到的转基因种子。

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