CN1852982A - 用于调节玉米中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂样多肽的物质和方法 - Google Patents
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- CN1852982A CN1852982A CNA2004800264536A CN200480026453A CN1852982A CN 1852982 A CN1852982 A CN 1852982A CN A2004800264536 A CNA2004800264536 A CN A2004800264536A CN 200480026453 A CN200480026453 A CN 200480026453A CN 1852982 A CN1852982 A CN 1852982A
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Abstract
编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的多肽的分离或纯化核酸分子；载体；宿主细胞；具有CDK抑制剂样活性的多肽；抑制CDK抑制剂样活性的核酸构建体；抑制和上调一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、组织、器官或植物中表达的方法；其中CDK抑制剂样基因的表达已经按照这种方法被抑制或上调的玉米细胞、组织、器官或植物；以及从其中一个或多个CDK抑制剂样基因已经被抑制或上调的植物获得的种子(及其油和粗粉)。
Description
本申请要求2003年7月14日提交的美国临时申请号No.60/486/935的权益，其全部引入此处作为参考。
发明的技术领域
本发明涉及编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的多肽的分离或纯化核酸分子，互补和反义核酸分子，载体，宿主细胞，具有CDK抑制剂样活性的多肽以及用于抑制和上调一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米中表达的物质和方法。
发明背景
细胞周期蛋白所致的CDK的激活/灭活可驱动细胞周期不同阶段之间的转变。CDK活性也可被称作KRP(Kip-相关蛋白，其中“Kip”是“激酶抑制剂蛋白”的缩写)的CDK抑制剂调节。来源于植物和动物系统的其它CDK抑制剂也称作CKI、ICK、Cip和Ink(De Veylder，2001，Plant Cell，13：1653-1667)和KIS(Jasinski等人，J.Cell.Sci.，115：973-982(2002))。已经在植物，包括鼠耳芥属和烟草中鉴定出了CDK抑制剂。植物的CDK抑制剂在羧基末端具有与p21Cip1/p27Kip1/p57Kip2型动物CDK抑制剂的氨基末端细胞周期蛋白/CDK-结合域同源的约35个氨基酸。在羧基-末端区外，迄今鉴定出来的植物CDK抑制剂在结构上是不同的。
发明简述
CDK抑制剂样基因表达的抑制可导致细胞增殖增加和/或有丝分裂指数增加。CDK抑制剂样基因表达的抑制还可导致油增多和产量增加。
本发明提供来源于玉米的、编码CDK抑制剂样多肽的分离或纯化核酸分子。在其中一个实施方案中，该分子包含(i)SEQ ID NO：1的核苷酸序列[ZmKRP1；“Zm”表示玉米；“KRP”表示Kip相关蛋白；数字是为特定基因指定的标号，(ii)编码SEQ ID NO：2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：2[ZMKRP1]的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约35个连续核苷酸。
在另一实施方案中，该分子包含(i)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]的核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约35个连续核苷酸。
在另一实施方案中，该分子基本上由(i)SEQ ID NO：7[ZmKRP4]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，或(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列组成。
在另一实施方案中，该分子包含(i)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约120个连续核苷酸。
在另一实施方案中，该分子基本上由(i)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约390个连续核苷酸组成。
鉴于上面所述，本发明还提供包含上述核酸分子的载体。还提供包含任选为载体形式的该分离或纯化核酸分子的宿主细胞。
鉴于上面所述，本发明还提供由上述核酸分子编码的分离或纯化多肽。还提供任选为载体形式的分离或纯化核酸分子，其包含与上述某些分子，SEQ ID NOS：13、15、和17互补且反义的序列，和编码SEQID NOS：6、14、16、和18的氨基酸序列的核苷酸序列或基本上由所述核苷酸序列组成。当该序列是SEQ ID NO：1时，编码SEQ ID NO：2，是SEQ ID NO：3时，或编码SEQ ID NO：4，该互补或反义序列包含至少35个连续核苷酸。
还提供包含至少一个可转录核苷酸序列的核酸，其表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：
SEQ ID NO：1[ZmKRPl]，编码SEQ ID NO：2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：3[ZmKRP2]，和编码SEQ IDNO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
上述可转录核苷酸序列是单独的或与至少一个其它核苷酸序列进一步组合，所述至少一个其它核苷酸的表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：SEQ ID NO：5[ZmKRP3]，编码SEQ IDNO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：7[ZmKRP4]，编码SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：9[ZmKRP5]，编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：11[ZmKRP6]，编码SEQ IDNO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：13[ZmKRP7]，编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：15[ZmKRP8]，编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：17[ZmKRP9]，和编码SEQ IDNO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，
其中，当该核酸构建体包含两个或多个可转录核苷酸序列时，该核苷酸序列可以任何顺序存在于该核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录的核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
在另一实施方案中，该核酸构建体包含至少一个可转录核苷酸序列，其表达导致选自SEQ ID NO：7[ZmKRP4]和/或SEQ IDNO：17[ZmKRP9]的内源性核酸序列的抑制，其中一个或两个可转录核苷酸序列与至少一个其它可转录核苷酸序列进一步组合，其表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZmKRPl]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：13的核苷酸335-718不完全对应，和
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，
其中可转录核苷酸序列可以任何顺序存在于该核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
在另一实施方案中，该核酸构建体包含至少一个可转录核苷酸序列，其表达导致选自下组的内源性核苷酸的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZMKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是SEQ ID NO：11的可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：13的核苷酸335-718不完全对应，
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，和
(viii)SEQ ID NO：17[ZmKRP9]或编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：17的核苷酸1-183不完全对应，
其中该可转录核苷酸序列可以任何顺序存在于核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
还提供一种抑制一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、玉米组织、玉米器官、或玉米植物中表达的方法。该方法包括使所述玉米细胞、玉米组织、玉米器官或玉米植物与上述核酸构建体接触。
在这点上，还提供一种玉米细胞、玉米组织、玉米器官或玉米植物，其中CDK抑制剂样基因的表达已经按照这种方法被抑制。还提供一种从其中一个或多个CDK抑制剂样基因的表达已被抑制的植物获得的种子。
附图简述
图1是本发明多肽与鼠耳芥属CDK抑制剂公开序列的氨基酸序列比对。鼠耳芥属的序列在实施例1中表示。
图2是pMON71270的构建图。
图3是pMON71279的构建图。
图4是表示引物区和方向(A)及组装过程(B)的dsRNA中间构建体的简图。
图5是表示引物区和方向(A)及组装过程(B)的dsRNA中间构建体的简图。
序列简述
SEQ ID NO：1是ZmKRP1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是ZMKRP1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是ZmKRP2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是ZmKRP2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是ZmKRP3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是ZmKRP3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是ZmKRP4的核苷酸序列。
SEQ ID N0：8是ZmKRP4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是ZmKRP5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是ZmKRP5的氨基酸序列。
SEQ D) NO：11是ZmKRP6的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是ZmKRP6的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是ZmKRP7的核苷酸序列。
SEQ ID NO：14是ZmKRP7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是ZmKRP8的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是ZmKRP8的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是ZmKRP9的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是ZmKRP9的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是来源于ZmKRP1(F1)3’末端的200个碱基对(bp)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是来源于ZmKRP2(F2)近3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是来源于ZmKRP3(F3)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ IID NO：22是来源于ZmKRP4(F4)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23是来源于ZmKRP5(F5)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24是来源于ZmKRP6和ZmKRP7(F6)近3’末端的200bp核苷酸序列。
SEQ ID NO：25是来源于ZmKRP8(F7)近3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是来源于ZmKRP8(F8)3’末端的183bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO：27是ZmDnaK内含子片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是引物Pl-StuI的核苷酸序列。
SEQ ID NO：29是引物P1-2R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是引物P2-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是引物P4-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是引物P3-4的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是引物P5-Bam的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是引物P5-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO：35是引物Pl-SseBam的核苷酸序列。
SEQ ID NO：36是引物Pi-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37是引物Pi-Bam的核苷酸序列。
SEQ ID NO：38是引物P5-Nco的核苷酸序列。
SEQ ID NO：39是引物P5-6的核苷酸序列。
SEQ ID NO：40是引物P6-7的核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是引物P8-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42是引物P7-8的核苷酸序列。
SEQ ID NO：43是引物P8-i的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44是ZmKRP1的5’非翻译区(UTR)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：45是ZmKRP1的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：46是ZmKRP2的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：47是ZmKRP2的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48是ZmKRP3的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：49是ZmKRP4的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：50是ZmKRP4的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：51是ZmKRP5的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：52是ZmKRP5的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：53是ZmKRP6的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：54是ZmKRP6的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：55是ZmKRP7的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56是ZmKRP7的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：57是ZmKRP8的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：58是ZmKRP9的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO：59是来源于特定多肽C-末端区的保守序列。
发明详述
CDK抑制剂样基因表达的抑制可导致细胞增殖增加和/或有丝分裂指数增加。例如，细胞增殖增加可导致胚大小增加和油量增多。
CDK抑制剂样基因表达的抑制还可导致产量增加。很多农学性状均可影响“产量”。例如，这些可能包括，但不限于，植物高度、荚果数、荚果在植物上的位置、节间数、荚果掉落的发生率、谷粒大小、生节和氮固定的效率、营养吸收的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳的同化、植物结构、抗倒伏、种子发芽的百分比、幼苗活力、和幼苗性状。例如，这些还可包括，但不限于，发芽效率(包括在胁迫状况下发芽)、生长速度(包括在胁迫状况下的生长速度)、抽穗数、每穗的种子数、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白)、种子饱满的特征。“产量”可以很多方式测量，这些可包括测试重量、种子重量、每株植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数(即，每英亩的种子、或种子重量)、每英亩的蒲式耳数、每英亩的公吨数、每英亩的吨数、每公顷的千克数。在其中一个实施方案中，本发明的植物可表现出产量部分特征的提高。提高的特征是植物的特征或表型，与基因型相同或非常相似的非-转基因植物相比，其在某种程度上的改变被看作是农学改进。
本发明提供编码具有CDK抑制剂样活性的玉米的多肽的分离或纯化核酸分子等。“CDK抑制剂样活性”是指在组蛋白H1激酶测定法中降低CDK活性的能力(见，实施例14)。优选，CDK活性降低至少约10％、更优选至少约20％、甚至更优选至少约30％、甚至更优选至少约40％、50％、60％、70％或80％，且最优选至少约90％或更多。“分离的”是指已被从其自然环境中除去。如果是核酸，分离的是指核酸与其它核酸分子的分离，如果是通过重组技术产生，是指与其它细胞物质和培养基的基本分离，或者如果是合成的，是指与化学前体的基本分离。“纯化的”是指纯度增加，其中“纯度”是相对术语，不能被解释为绝对纯度。“核酸分子”包括DNA(例如，cDNA或基因组DNA)或RNA(例如，mRNA)的聚合物，即，多核苷酸，其可以是单链或双链的，可包含嵌合DNA/RNA寡核苷酸，且其可包含非-天然或改变的核苷酸。
在其中一个实施方案中，提供一种分离或纯化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO：1[ZmKRP1]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ IDNO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列具有至少约70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约35个(或40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)连续核苷酸。
在另一实施方案中，提供一种分离或纯化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ IDNO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列具有至少约70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约35个(或40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)连续核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离或纯化的核酸分子，它基本上由(i)SEQ ID NO：7[ZmKRP4]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ IDNO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，或(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列具有至少约70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列组成。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离或纯化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ IDNO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列具有至少约70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约120个(或125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或更多)连续核苷酸。
还提供一种分离或纯化的核酸分子，它包含(i)SEQ IDNO：11[ZmKRP6]的核苷酸序列，(ii)编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列具有至少约70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一个的片段，其中该片段包含至少约390个(或400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500或更多)连续核苷酸。
这种核酸分子可按照标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板以及适宜的寡核苷酸引物扩增。可选择性地，可使用标准合成技术，如自动化DNA合成仪合成。
上述分离或纯化的核酸分子的特征部分根据“序列同一性百分比”表征。关于这一点，可通过在比较窗进行核酸序列的最佳比对而将给定核酸分子与上述核酸分子(即，参考序列)进行比较，其中比较窗中的多核苷酸序列的部分可包含与参考序列相比而言的添加或缺失(即，空位)，参考序列不包含添加或缺失，用于两个序列的最佳比对。序列同一性百分比是通过确定在两个序列中出现的相同核酸碱基的位置数，即，相匹配的位置数，用相匹配的位置数除以比较窗中的位置总数，并将所得结果乘以100得到序列同一性百分比。用于比较的序列最佳比对可通过已知算法的计算机化执行而进行。序列比对和同一性百分比的计算可通过Clustal算法(Higgins等人，CABIOS，5(2)：151-153(1989))进行，其中使用LASARGENE生物信息学计算程序组的Megalign程序的缺省参数(DNASTAR Inc.，Madison，WI)，此后称作“Clustal W算法”。其它计算机化执行包括GCG Wisconsin软件包(Accelrys，San Diego，CA)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA或National Center for Biotechnology Information，Bethesda，MD的BlastN和BlastX。此外，序列比对可通过目测进行。通常使用具有缺省参数的BESTFIT或BlastN对序列进行比较。确定同一性的优选方法是Clustal W算法，其中参考实施例1给出的参数。
然而，本领域普通技术人员应认识到，两个多核苷酸序列在核酸水平上可显著不同，但由于遗传密码的简并性，仍然编码基本相似(如果不同)的氨基酸序列。本发明的目的在于包括这种多核苷酸序列。关于这一点，应注意上述核酸分子的片段可被用作探针而鉴定其它多核苷酸序列。
还提供一种分离或纯化的核酸分子，它包含与上述分离或纯化的核酸分子，以及SEQ ID NOS：13、15、和17互补或反义的序列(或其片段，如包含至少约35个连续核苷酸的片段)，以及编码SEQ IDNOS：6、14、16、和18的氨基酸序列的核苷酸序列或基本由所述序列组成。该分离或纯化的核酸分子任选为载体形式。
如果需要，上述分离或纯化的核酸分子可与启动子可操作性连接。启动子包括，但不限于，在细菌、噬菌体、质体或植物细胞中发挥作用的启动子，包括优先在雄性生殖组织中表达的启动子。如下所述，可使用任何适宜的启动子。这种启动子的例子包括，但不限于，玉米的SILKY1启动子(Ambrose等人，Molec.Cell，5(3)：569-579(2000))、烟草的NTM19启动子(Oldenhof等人，Plant Molec.Biol.，31：213-225(1996)；美国专利US6,407,314；和WO97/30166)、烟草的NPG1启动子(见，例如，美国申请公开号US 2003/0061635)、玉米的PCA55启动子(见，例如，WO 92/13957)、鼠耳芥属的AP3启动子(Zhou等人，Planta，215：248-257(2002))、和芸苔属的Bgpl启动子(Zhou等人，(2002)，下文)。其它例子包括花药-优选的启动子，如来源于LAT52(Twell等人，Molec.Gen.Genet.，217(2-3)：240-245(1989)；和Twell等人，Genes Dev.，5(3)：496-507(1991))或稻的RA8(Jeon等人，Plant Mol.Biol.，39(1)：35-44(1999))、花粉-优选的启动子，如来源于玉米Zm13(Guerrero等人，Molec.Gen.Genet.，224：161-168(1993))或稻PS1(Zou等人，Amer.J.Bot.，81(5)：552-561(1994)、和小孢子-优选的启动子，如来源于apg(花药-特异性的；Twell等人，Sex.Plant.Repro.，6：217-224(1993))。在某些情况下，优先在玉米雄性生殖组织中表达的启动子可能是理想的(见，例如，实施例5)。
如果需要，上述分离或纯化的核酸分子可与启动子可操作性连接。本发明的启动子通常包括，但不限于，在细菌、噬菌体、或植物细胞中发挥作用的启动子。用于细菌表达的有效启动子是lacZ、Sp6、T7、T5、或大肠杆菌glg C启动子。用于植物细胞的有效启动子包括球蛋白启动子(见，例如，Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872(1991))、γ玉米醇溶蛋白Z27启动子(见，例如，Lopes等人，Mol.Gen.Genet.，247：603-613(1995))、L3油质蛋白启动子(美国专利US6,433,252)、大麦PER1启动子(Stacey等人，Plant Mol.Biol.，31：1205-1216(1996))、胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CP214tr1、P-Zm.CPC214tr2或P-Os.CPC214(美国临时申请号No.60/531/483)，其引入此处作为参考，USP启动子(美国申请公开号No.2003/229918)，其引入此处作为参考，7Sα启动子、7Sα’启动子(见，例如，Beaachy等人，EMBO J.，4：3047(1985)或Schuler等人，NucleicAcid Res.，10(24)：8225-8244(1982))、CaMV 35S启动子(Odell等人，Nature，313：810(1985))、CaMV 19S(Lawton等人，Plant Mol. Biol.，9：31F(1987))、nos(Ebert等人，PNAS U.S.A.，84：5745(1987))、Adh(Walker等人，PNAS U.S.A.，84：6624(1987))、蔗糖合酶(Yang等人，PNAS U.S.A.87：4144(1990))、微管蛋白、肌动蛋白(Wang等人，Mol. Cell.Biol，12：3399(1992))、cab(Sullivan等人，Mol.Gen.Genet.，215：431(1989))、PEPCase启动子(Hudspeth等人，Plant Mol. Biol.，12：579(1989))、或与R基因复合物有关的那些(Chandler等人，The PlantCell，1：1175(1989))。元参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等人，NucleicAcids Res.，20：8451(1987))、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白质、甘露氨酸合酶(mas)、大豆种子蛋白大豆球蛋白(Gly)、和大豆植物性贮藏蛋白(vsp)启动子是有效启动子的其它例子。
在其中一个优选实施方案中，所用启动子在胚芽和/或糊粉组织中高水平表达。已知在玉米和其它植物中发挥作用的优选启动子包括油质蛋白的启动子(例如，L3启动子，美国专利US6,433,252)、球蛋白启动子(见，例如，Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872，1991)、大麦过氧化物氧还蛋白启动子(Perl、Stacy等人，Plant Mol.Biol.，31：1205-1216，登记号#X96551)、胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214trl、P-Zm.CPC214tr2、或P-Os.CPC214(美国临时申请号US60/531,483)，引入此处作为参考，或玉米的MIP合酶启动子(WO01/40440 A2).
在胚乳中高水平表达的启动子的例子包括来源于编码玉米醇溶蛋白的基因的启动子，它们是在玉米胚乳中发现的一组贮藏蛋白。可使用已经分离出的玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆(Pedersen等人，Cell，29：1015-1026(1982)和Russell等人，Transgenic Res.，6(2)：157-168(1997))和来源于这些克隆的启动子，包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD基因。已知在玉米和其它植物中发挥作用的其它优选启动子包括下列基因的启动子：蜡质(颗粒结合淀粉合酶)、Brittle和Shrunken 2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken 1(蔗糖合醇)、I型和II型分支酶、淀粉合酶、脱支酶、油质蛋白、谷蛋白、蔗糖合酶(Yang等人，PNAS U.S.A.，87：4144-4148(1990))、Betll(基底胚乳转移层)和球蛋白1.本发明还涉及本领域技术人员已知的用于本发明实践中的其它启动子。
此外，转录增强子或增强子的复制可用于增加自特定启动子的表达。这种增强子的例子包括，但不限于Adh内含子1(Callis等人，GenesDevelop.，1：1183(1987))、稻肌动蛋白内含子(MeElroy等人，Mol.Gen.Genet.，231(1)：150-160(1991))(美国专利US5,641,876)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，Plant Physiol.，91：5175(1 989))、玉米HSP70内含子(Rochester等人，EMBO J.，5：451-458(1986))、TMV ω元件(Gallie等人，The Plant Cell，1：301(1999))、CaMV 35S增强子或章鱼碱合酶增强子(Last等人，美国专利US5,290,924)。因为转录起始位点和编码序列起始位点之间的DNA序列，即，未翻译的前导序列，可影响基因表达，因此还希望使用特定的前导序列。可使用适用于本领域的任何前导序列。优选的前导序列可通过增加或维持mRNA稳定性和/或通过防止翻译的不适当起始而指导相连基因的最佳表达水平(Joshi，Nucl.AcidRes.，15：6643(1987))。这种序列的选择可由本领域技术人员进行。考虑了来源于在高等植物，和大豆、玉米、稻，且特别是canola中高水平表达的基因的序列。
利用外部加入的试剂可打开或关闭诱导型启动子，这样一来就可打开或关闭可操作性连接核酸的表达。例如，细菌启动子，如Ptac启动子可被诱导，从而使基因表达水平发生改变，这取决于加入到转化的细菌细胞中的异硫丙基半乳糖苷水平。在植物中，诱导型启动子可用于下列情况：其中在宿主植物成熟后，给定基因的表达达到理想水平。这种诱导型启动子包括热激启动子、胁迫反应启动子、和化学诱导型启动子。
本发明的表达盒还包括靠近盒3’末端的序列，其发挥信号的作用，终止自异源核酸转录并指导所得mRNA的聚腺苷酸化。这些通常被称作3’非翻译区或3’UTR。可发挥转录终止信号作用的一些3’元件包括来源于根癌土壤杆菌的胭脂氨酸合酶基因的那些(Bevan等人，Nucl.Acid Res.，11：369(1983))、油菜籽蛋白3’非翻译区(Kridl等人，Seed Sci Res.，1：209-219(1991))、球蛋白3’非翻译区(Belanger和Kriz，Genetics，129：863-872(1991))、或来源于玉米醇溶蛋白基因的，如Z27(Lopes等人，Mol Gen Genet.，247：603-613(1995))。本领域技术人员已知的其它3’元件还可用于本发明的载体中。
本发明还提供一种包含上述分离或纯化核酸分子的载体。上述核酸分子可被克隆到任何适宜的载体中并可用于转化或转染任何适宜的宿主。载体的选择和构建它们的方法是本领域普通技术人员已知的并在综合性技术参考文献中描述(通常见“Recombinant DNA Part D，”Methods in Enzymology，Vol.153，Wu和Grossman，eds.，AcademicPress(1987))。理想地，该载体包含调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，它们对引入该载体的宿主类型(例如，细菌、真菌、或植物)是特异性的，这要视情况而定并考虑该载体是DNA还是RNA。
可将环状或线性的载体的构建体制备成含有上述完整的核酸序列或其与在原核生物或真核生物宿主细胞中发挥作用的复制系统连接的一部分。复制系统可来源于ColEl、2mμ质粒、λ噬菌体、fl丝状噬菌体、土壤杆菌物种(例如，根癌土壤杆菌和发根病土壤杆菌)等。
除了可复制系统和插入的核酸外，该构建体可包括一个或多个标记基因，其使得能够选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀虫剂抗性，例如，对抗生素、重金属、除草剂等的抗性，补充在营养缺陷型宿主中以提供原养等。
适宜的载体包括被设计用于增殖或表达或两者皆可的那些。优选的克隆载体选自pUC系列、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clonetech，Palo Alto，CA)。也可使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的例子包括pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBINl9(Clonetech，Palo Alto，CA)。酵母表达载体的例子包括pYES2.1、pYES2、和其它pYES衍生物(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
植物表达载体可包含与上述核酸分子可操作性连接的天然或非天然启动子。启动子的选择，例如，强、弱、诱导型、组织-特异性(即，在组织中特异性或优先表达)、器官-特异性(即，在器官中特异性或优先表达)和发育-特异性(即，在发育的特定阶段过程中特异性或优先表达)，落在本领域范围之内。同样，上述核酸分子与启动子的组合也落在本领域范围之内(见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))。
如果希望上调CDK抑制剂样基因的表达，即，通过任何方式，例如通过在mRNA水平或蛋白水平上，增加CDK抑制剂样基因的表达约2倍、10倍、100倍、或更多，优选通过引入此处提供的编码CDK抑制剂样多肽的基因进行。优选利用载体引入基因。优选许多抑制剂均在目标组织中表达。可将基因的多个额外拷贝引入到植物细胞、植物组织、植物器官、或植物中，或将含有强启动子，如优先或特异性在雄性生殖组织中表达的启动子引入到植物细胞、植物组织、植物器官、或植物中，这样一来基因以较高的速度表达，由此产生更多mRNA，其随后被翻译成更多编码蛋白。
此处所用“抑制”是指用于抑制来源于基因的转录物或蛋白的任何一种熟知的方法，包括转录后的基因抑制和转录抑制。转录后的基因抑制是通过与要抑制的靶基因具有同源性的转录RNA介导的。从抑制性转基因转录的RNA优选具有双链组分，从而进行所谓的RNA干扰(RNAi)。转录抑制是通过与启动子DNA序列具有同源性的转录的双链RNA介导的，从而进行所谓的启动子反式-抑制。
更具体而言，由双链RNA介导的转录后基因抑制可由具有Shewmaker等人公开的反义DNA构建体的植物转化产生(美国专利US5,107,065和5,759,829)、由具有Jorgensen等人公开的有义-定向的DNA构建体的植物转化产生(美国专利US 5,283,184和5,231,020)、或由具有Redenbaugh等人(Safety Assessment of Genetically Engineered FlavrSavrTM Tomato，CRC Press，Inc.，1992)、Goldbach等人(EP0426195A1,1991)、Sijen等人(The Plant Cell，8：2277-2294，1996)、Waterhouse等人(WO 99/53050)、Graham等人(WO 99/49029)、Lowe等人(美国申请公开号US2003/0175965A1)、Fillatti(美国专利申请号USNo.10/465,800)、Plaetinck等人(美国申请公开号No.2003/0061626A1)、Liu等人(美国专利US6,326,193)、Agrawal等人(WO 94/01550)、Werner等人(WO 98/05770)、Oeller(美国申请公开号No.2002/0048814A1)、Gutterson等人(美国申请公开号、No.2003/0018993A1)、和Glassman等人(美国申请公开号No.2003/0036197A1)公开的RNAi构建体的植物转化产生。公开了用于植物中的转录后基因抑制的材料和方法的所有上述专利、申请、和国际出版物均引入此处作为参考。
转录抑制如启动子反式-抑制可通过表达DNA构建体进行，其中该DNA构建体包含与靶基因启动子DNA的反向重复序列可操作性连接的启动子。通过启动子反式-抑制介导的、用于这种基因抑制的构建体由Mette等人，The EMBO Journal，18(1)：241-148，1999和Mette等人，The EMBO Journal，19(19)：5194-5201，2000公开，两篇文献均引入此处作为参考。
植物的转录后基因抑制的优选方法使用有义-定向或反义-定向的转录RNA，其是稳定的，例如，用末端发夹结构稳定。将用于进行转录后基因抑制的优选DNA构建体转录到与要抑制的靶基因具有同源性的反义定向RNA的片段中，其中该反义RNA片段通过RNA的连续、互补、较短片段而以有义方向接在3’末端。自我稳定的反义RNA寡核苷酸在植物中的使用在WO 94/01550(Agrawal等人)中公开。还可见WO98/05770(Werner等人)，其中反义RNA是通过形成聚(CG)核苷酸重复序列的发夹稳定化的。还可见美国申请公开号No.2002/0048814A1(Oeller)，其中有义或反义RNA是通过聚(T)-聚(A)尾稳定的。还可见美国申请公开号No.2003/0018993 A1(Gutterson等人)，其中有义或反义RNA是通过NOS基因亚序列的反向重复序列稳定的。还可见美国申请公开号No.2003/0036197 A1(Glassman等人)，其中与靶具有同源性的RNA是通过2个互补RNA区稳定的。公开了使用稳定化RNA的材料和方法及其在植物基因抑制中的用途的所有上述专利、申请、和国际出版物均引入此处作为参考。
转录抑制如启动子反式-抑制可通过表达DNA构建体进行，其中该DNA构建体包含与靶基因的启动子DNA的反向重复序列可操作性连接的启动子.用于由启动子反式-抑制介导的这种基因抑制的构建体由Mette等人在The EMBO Journal，18(1)：241-148,1999 and Mette etal.，The EMBO Journal，19(19)：5194-5201，2000中公开，两篇文献均引入此处作为参考。
另一种方法是显性失活突变体的使用。例如，上述具有CDK抑制剂样活性的多肽的显性失活突变体可通过使C-末端编码序列，特别是C-末端编码序列的全部或一部分完全或部分缺失而产生，该C-末端编码序列在此处所述多肽中是高度保守的。所得突变体可与启动子，如来源于玉米的胚-特异性启动子可操作性连接，例如，并被克隆到载体中，用于引入到玉米植物或其一部分中。见，例如，Jasinski等人，PlantPhysiol.，130：1871-1882(2002)。
已经报道过核酶具有抑制内源性植物基因表达的用途(见，例如，Merlo等人，Plant Cell，10(10)：1603-1622(1998))。可将核酶设计为特异性与几乎任何靶RNA配对并裂解特定位置上的磷酸二酯主链，由此功能性灭活靶RNA。在进行该裂解时，核酶自身并不改变且，因此，能够再循环并裂解其它分子，使它成为一种真正的酶。在反义RNA内包含核酶序列可赋予它们RNA-裂解活性，由此增加该构建体的活性。靶RNA-特异性核酶的设计和使用在Haseloff等人，Nature，334：585-591(1988)中描述。优选，该核酶在核酶活性位点的每一侧均包含与靶序列互补的至少约20个连续核苷酸。
可选择性地，本领域熟知的反向遗传学系统可用于产生并分离被抑制的或无效的突变体。其中一个这类系统，玉米的性状用途系统(Trait Utility System for Corn)，即，TUSC，是以来源于其它生物的成功系统为基础的(Ballinger等人，PNAS U.S.A.，86：9402-9406(1989)；Kaiser等人，PNAS U.S.A.87：1686-1690(1990)；和Rushforth等人，Mol.Cell.Biol.，13：902-910(1993))。该系统的重要特征是鉴定目标DNA序列内的Mu转座子插入，预期这些插入等位基因中至少有一些是突变体。为了开发玉米中的该系统，自一大群增变基因转座子原种中收集DNA，然后自我授粉产生F2种子。为了在规定DNA序列内找到Mu转座子插入，DNA样品的收集是使用基因-特异性引物和退火于Mu转座子反向重复序列的引物，经由PCR筛选的。只有当模板DNA来源于在靶基因内含Mu转座子插入的植物时，PCR产物才是所预期的。一旦鉴定了这种DNA样品，即筛选来源于相应植物的F2种子的转座子插入等位基因。通过TUSC过程已经获得了anl基因的转座子插入突变(Bensen等人，Plant Cell，7：75-84(1995))。该系统也可用于其它植物物种，有时根据本领域技术人员的知识，按照需要进行改变。
T-DNA插入性诱变可用于在上述其中一个基因中产生插入性突变，从而不利地影响特定基因的表达。T-DNA标记的植物株系可使用PCR进行筛选。例如，其中一个引物可被设计为用于T-DNA的一个末端，另一个引物可被设计为用于目标基因，且两个引物均可用于PCR中。如果没有获得PCR产物，那么目标基因中没有插入。相反，如果获得了PCR产物，那么目标基因中有插入。然而，插入性突变常常产生无效等位基因，其可能是致死的。可选择性地，如果存在不止一个编码特定酶的基因，那么其中一个基因的突变可能不会导致由该基因编码的酶的表达水平降低。
降低特定基因表达水平的另一选择性方法是使用抑制上述其中一个基因表达水平的化合物或抑制由上述其中一个基因编码的蛋白活性的化合物。关于这一点，x-射线或γ辐射可用作化学诱变剂，如乙基甲基磺酸酯(EMS)或二甲基丁酸(DMB)。
除上述外，基因替代技术可用于增加或降低特定基因的表达。基因替代技术是以同源重组为基础的(见，Schnable等人，Curr.OpinionsPlant Biol.，1：123(1998))。目标酶的核酸可通过诱变(例如，插入、缺失、复制、或替代)操作，从而增加或降低酶功能。可将改变的序列引入到基因组中，从而经由同源重组替代现有的，例如，野生型基因(Puchta和Hohn，Trends Plant Sci.，1：340(1996)；Kempin等人，Nature，389：802(1997))。
特定CDK抑制剂样多肽的活性可体外测量。例如，可测量特定CDK抑制剂样多肽防止CDK将H1组蛋白磷酸化的能力(见，例如，
实施例14)。
例如，特定CDK抑制剂样多肽是否影响其它基因的表达可使用转基因植物测定。随着微阵列芯片技术的建立和使用(DeRisi等人，Science，278：680-686(1997))，特定遗传改变对所有已鉴定的玉米基因的作用可使用微阵列芯片测定。可进行代谢放射性示踪研究，以体内测量不同产物集合的产生。在这类研究中，提供放射性标记的前体给完整组织，并随代谢的前体监测放射性标记。通过对野生型植物和其中一个CDK抑制剂样多肽基因的活性降低的植物进行比较，可测定特定CDK抑制剂样多肽的降低的作用。
鉴于上面所述，本发明提供一种宿主细胞，它包含任选为载体形式的上述分离或纯化核酸分子。适宜的宿主包括细菌、酵母和植物细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、根癌土壤杆菌、啤酒糖酵母、和N.crassa。大肠杆菌宿主包括TB-1、TG-2、DH5α、XL-BlueMRF’(Stratagene，Austin，TX)、SA2821、Y1090、和TG02。植物细胞包括玉米细胞。
鉴于上面所述，本发明提供由上述分离或纯化核酸分子编码的分离或纯化多肽。该多肽优选包含氨基末端和羧基末端。该多肽可包含D-氨基酸、L-氨基酸、或D-和L-氨基酸的混合物。然而，氨基酸的D-形式是特别优选的，因为预期由D-氨基酸组成的蛋白的生物学活性在体内保留时间更长，因为D-氨基酸不能由天然存在的蛋白酶识别。
天然氨基酸序列发生改变从而产生变体多肽可通过本领域普通技术人员已知的各种方式进行。例如，可在合成时，方便地将氨基酸取代引入到多肽中。可选择性地，位点-特异性突变可通过将含修饰位点的合成寡核苷酸连接到表达载体中而被引入。可选择性地，可使用寡核苷酸-定向的、位点-特异性诱变过程，如在Walder等人Gene，42：133(1986)；Bauer等人，Gene，37：73(1985)；和美国专利US 4,518,584和4,737,462中公开的。
选择进行用于任何特定天然存在的氨基酸的保守或中性取代的合成及天然存在的氨基酸落在本领域普通技术人员的能力范围之内。本领域普通技术人员应认识到在提到进行任何特定氨基酸取代的内容中，除了考虑侧链的疏水性或极性外，还要考虑侧链的普遍大小和具有酸性或碱性特征的侧链在生理条件下的pK值。例如，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸常适于互相取代，且精氨酸和组氨酸更常互相取代。正如本领域已知的，这是因为这三个氨基酸全部具有碱性侧链，而赖氨酸和精氨酸侧链的pK值(约10和12)较之组氨酸(约6)彼此更加接近。同样，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸常适于彼此互相取代，条件是甘氨酸常不适于取代该组的其它成员。这是因为当掺入到多肽中时，各氨基酸相对疏水，但甘氨酸缺少α-碳，允许(围绕α-碳)进行phi和psi角度旋转，产生较多构象自由度，甘氨酰残基可引发构象或二级结构的改变，但当其它氨基酸彼此互相取代时则常不会发生。常适于彼此互相取代的其它氨基酸组包括，担不限于，谷氨酸和天门冬氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；及丝氨酸、苏氨酸、和任选的酪氨酸。此外，本领域普通技术人员可很容易地将合成氨基酸与天然存在的氨基酸分类。
如果需要，可对该多肽进行修饰，例如，通过糖基化、酰胺化、羧化、或磷酸化，或通过产生本发明多肽的酸加成盐、酰胺、酯，特别是C-末端酯、和N-酰基衍生物。按照本领域已知的方法，还可通过与其它部分形成共价或非共价复合物来产生蛋白衍生物而对该多肽进行修饰。共价键合的复合物可通过将化学部分与含该多肽的氨基酸侧链上的官能团，在N-或C-末端上连接而制备。理想地，这种修饰和结合不会不利地影响多肽(及其变体)的活性。尽管这种修饰和结合具有更高或更低的活性，理想地，该活性不会消失且是未改变多肽的特征。
该多肽(及其片段、变体、和融合蛋白)可通过任何一种常规技术制备。该多肽可以是从天然存在的来源或从重组来源分离出来的或纯化的。例如，在重组蛋白的情况下，可使用熟知的分子遗传技术(见，例如，Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)和此处下面“实施例”中引证的其它参考文献)将编码所需蛋白的DNA片段亚克隆到适宜载体中。该片段可被转录且随后该蛋白被体外翻译。还可使用市售的试剂盒(例如，由Clontech，Palo Alto，CA；Amersham Life Sciences，Inc.，ArlingtonHeights，IL；InVitrogen，San Diego，CA等制造)。聚合酶链反应任选可用于核酸的操作。
这类多肽还可按照本领域已知的方法，使用自动化肽合成仪合成。可选择性地，可使用本领域普通技术人员熟知的标准肽合成技术(例如，在Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，(Springer-Verlag，Heidelberg：1984)中概述)合成该多肽(和片段、变体、及融合蛋白)。具体而言，可使用固相合成过程合成该多肽(见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-54(1963)；Barany等人，Int.J.Peptide Protein Res.，30：705-739(1987)；和美国专利US5,424,398)。如果需要，可使用自动化肽合成仪进行。叔-丁氧基羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸封端基团的除去以及蛋白自树脂的分离可通过，例如，在降低的温度下进行酸处理而完成。然后，例如，用二乙醚萃取含多肽的混合物，除去非肽有机化合物，并将合成蛋白自树脂粉末上萃取下来(例如，用约25％w/v乙酸)。合成多肽后，可任选进行进一步的纯化(例如，使用HPLC)，从而除去所有不完全的蛋白、多肽、肽、或游离氨基酸。可在合成多肽上进行氨基酸和/或HPLC分析，从而验证它的身份。就本发明其它应用而言，可优选产生作为较大融合蛋白一部分的多肽，这是通过如本领域普通技术人员已知的化学结合，或者通过遗传方式。关于这一点，本发明还提供一种融合蛋白，它包含分离或纯化的多肽(或其片段)或其变体及一个或多个具有任何所需性质或效应物功能的其它多肽/蛋白。
该核酸分子、载体、和多肽可用于农业方法和各种筛选测定法中(见，例如，WO02/28893和美国专利US6,215,048)。例如，核酸分子可，例如，经由载体，在宿主细胞中表达CDK抑制剂样多肽，检测生物样品中的编码CDK抑制剂样多肽的mRNA，如通过DNA印迹检测编码CDK抑制剂样多肽的基因中的遗传改变，抑制CDK抑制剂样多肽，或上调CDK抑制剂样多肽，从而使植物雄性不育或矮小，或例如抑制某些器官形成。该多肽可用于补偿CDK抑制剂样多肽的缺陷或具有较低活性或没有活性的突变CDK抑制剂样多肽在玉米植物中的存在，或就玉米植物中的CDK抑制剂样多肽而言，处理过量水平的底物，无论是直接还是间接处理。可选择性地，该多肽可用于筛选具有调节它们活性能力的试剂。
鉴于上面所述，本发明提供各种核酸构建体，其可用于抑制CDK抑制剂样多肽。在其中一个实施方案中，该核酸构建体包含至少一个可转录核苷酸序列，其表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：
SEQ ID NO：1[ZmKRP1]，编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：3[ZmKRP2]，和编码SEQ IDNO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
上述序列单独或与至少一个其它可转录核苷酸序列进一步组合，所述其它可转录核苷酸序列的表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：SEQ ID NO：5[ZmKRP3]，编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：7[ZmKRP4]，编码SEQ IDNO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：9[ZmKRP5]，编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：11[ZmKRP6]，编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：13[ZmKRP7]，编码SEQ IDNO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：15[ZmKRP8]，编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：17[ZmKRP9]，和编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，
其中，当该核酸构建体包含两个或多个可转录核苷酸序列时，该核苷酸序列可以任何顺序存在于该核酸构建体上且可以是多顺反子的，其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100(或125、150、175、200、225、250、275、300、325、375、400、425、450、500、750、1,000、1,500、2,000、或更多)个连续核苷酸，且其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。“任选地”是指每个可转录的核苷酸序列，独立于任何及全部存在于该构建体上的其它核苷酸序列，或者诱导基因抑制，或者不诱导基因抑制。
可选择性地，该核酸构建体包含可转录核苷酸序列，其表达导致以下内源性核苷酸序列的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZmKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iv)SEQ ID NO：7[ZmKRP4]或编码SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(v)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRPS]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(vi)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(vii)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(viii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，和
(ix)SEQ ID NO：17[ZmKRP9]或编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一实施方案中，该核酸构建体包含至少一个可转录核苷酸序列，其表达导致SEQ ID NO：7[ZmKRP4]和/或SEQ ID NO：17[ZmKRP9]的内源性核苷酸序列的抑制，其中一个或两个与至少一个其它可转录核苷酸序列进一步组合，所述其它可转录核苷酸序列的表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZmKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：13的核苷酸335-718不完全对应，和
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，
其中该可转录核苷酸序列可以任何顺序存在于该核酸构建体上且可以是多顺反子的，其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100(或125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、750、1,000、1,500、2,000、或更多)个连续核苷酸，且其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。此处所用基因抑制是指通过各种技术降低基因表达，包括，但不限于，有义抑制、反义、dsRNA、及核酶技术。
在另一实施方案中，该核酸构建体包含至少一个可转录核苷酸序列，其表达导致选自下组的内源性核苷酸序列的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZmKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该SEQ ID NO：11的可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：13的核苷酸335-718不完全对应，和
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，
(viii)SEQ ID NO：17[ZmKRP9]或编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录的核苷酸序列与SEQ IDNO：17的核苷酸1-183不完全对应，
其中该可转录的核苷酸序列可以任何顺序存在于该核酸构建体上且可以是多顺反子的，其中每个可转录的核苷酸序列包含至少约100(或125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、750、1,000、1,500、2,000、或更多)个连续核苷酸，且其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因沉默。“不完全对应”是指至少1个，优选至少约3个核苷酸与核苷酸指定范围之外的核苷酸相对应。
关于上述核酸构建体，其中至少一个可转录核苷酸序列的表达导致抑制，所述可转录核苷酸序列可来源于非编码序列。例如，该非编码序列可以是内含子、来源于启动子区的核苷酸序列、来源于5’非翻译区的核苷酸序列、来源于3’非翻译区的核苷酸序列、或上述任何一个的片段。这种序列的例子包括SEQ ID NOS：44-58的那些。
上述构建体是举例性的而不是限制于此。在抑制构建体中，例如，ZmKRP1或ZmKRP2可被单独抑制或共同抑制。关于这一点，ZmKRP1或ZmKRP2可被单独抑制或共同抑制，进一步与ZmKRP3、ZmKRP4、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、ZmKRP8、和ZmKRP9的任何一个组合。为简便起见，省去了下列组合列表中的缩写词“ZmKRP”。例如，1、2和3；1、2和4；1、2和5；1、2和6；1、2和7；1、2和8；1、2和9；1和3；1和4；1和5；1和6；1和7；1和8；1和9；2和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和8；2和9；1、3和4；1、3和5；1、3和6；1、3和7；1、3和8；1、3和9；2、3和4；2、3和5；2、3和6；2、3和7；2、3和8；2、3和9；1、4和5；1、4和6；1、4和7；1、4和8；1、4和9；1、5和6；1、5和7；1、5和8；1、5和9；2、4和5；2、4和6；2、4和7；2、4和8；2、4和9；1、5和6；1、5和7；1、5和8；1、5和9；2、5和6；2、5和7；2、5和8；2、5和9；1、6和7；1、6和8；1、6和9；2、6和7；2、6和8；2、6和9；1、7和8；1、7和9；2、7和8；2、7和9；1、8和9；2、8和9；1、3、4、和5；1、3、4、和6；1、3、4、和7；1、3、4、和8；1、3、4、和9；2、3、4、和5；2、3、4、和6；2、3、4、和7；2、3、4、和8；2、3、4、和9；1、4、5、和6；1、4、5、和7；1、4、5、和8；1、4、5、和9；2、4、5、和7；2、4、5、和8；2、4、5、和9；1、5、6、和7；1、5、6、和8；1、5、6、和9；2、5、6、和7；2、5、6、和8；2、5、6、和9；1、6、7、和8；1、6、7、和9；2、6、7、和8；2、6、7、和9；1、7、8、和9；2、7、8、和9；1、3、4、5、和6；1、3、4、5、和7；1、3、4、5、和8；1、3、4、5、和9；2、3、4、5、和6；2、3、4、5和7；2、3、4、5、和8；2、3、4、5、和9；1、3、4、5、6、和7；1、3、4、5、6、和8；1、3、4、5、6、和9；2、3、4、5、6、和7；2、3、4、5、6、和8；2、3、4、5、6、和9；1、3、4、5、6、7、和8；1、3、4、5、6、7、和9；2、3、4、5、6、7、和8；2、3、4、5、6、7、和9；1、3、4、5、6、7、8、和9；2、3、4、5、6、7、8、和9；1、2、3、和4；1、2、3、和5；1、2、3、和6；1、2、3、和7；1、2、3、和8；1、2、3、和9；1、2、4、和5；1、2、4、和6；1、2、4、和7；1、2、4、和8；1、2、4、和9；1、2、5、和6；1、2、5、和7；1、2、5、和8；1、2、5、和9；1、2、6、和7；1、2、6、和8；1、2、6、和9；1、2、7、和8；1、2、7、和9；1、2、8、和9；1、2、3、4、和5；1、2、3、4、和6；1、2、3、4、和7；1、2、3、4、和8；1、2、3、4、和9；1、2、4、5、和6；1、2、4、5、和7；1、2、4、5、和8；1、2、4、5、和9；1、2、5、6、和7；1、2、5、6、和8；1、2、5、6、和9；1、2、6、7、和8；1、2、6、7、和9；1、2、7、8、和9；1、2、3、4、5、和6；1、2、3、4、5、和7；1、2、3、4、5、和8；1、2、3、4、5、和9；1、2、3、4、5、6、和7；1、2、3、4、5、6、和8；1、2、3、4、5、6、和9；1、2、3、4、5、6、7、和8；1、2、3、4、5、6、7、和9；或1、2、3、4、5、6、7、8、和9可被抑制。此外，该构建体可包含任何顺序的核苷酸序列。该核苷酸序列的长度也可改变。
在抑制构建体中，ZmKRP4或ZmKRP9可被单独抑制或共同抑制。关于这一点，ZmKRP4或ZmKRP9可被单独抑制或共同抑制，与ZmKRP1、ZmKRP2、ZmKRP3、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、和ZmKRP8中的任何一个进一步组合。例如，4和1；4和2；4和3；4和5；4和6；4和7；4和8；4、1和2；4、1和3；4、1和5；4、1和6；4、1和7；4、1和8；4、1、2和3；4、1、2、和5；4、1、2、和6；4、1、2、和7；4、1、2、和8；4、1、2、3、和5；4、1、2、3、和6；4、1、2、3、和7；4、1、2、3、和8；4、1、2、3、5、和6；4、1、2、3、5、和7；4、1、2、3、5、和8；4、1、2、3、5、6、和7；4、1、2、3、5、6、和8；4、1、2、3、5、6、7、和8；4、2和3；4、2和5；4、2和6；4、2和7；4、2和8；4、3和5；4、3和6；4、3和7；4、3和8；4、5和6；4、5和7；4、5和8；4、6和7；4、6和8；4、7和8；4、2、3、和5；4、2、3、和6；4、2、3、和7；4、2、3、和8；4、3、5、和6；4、3、5、和7；4、3、5、和8；4、3、6、和7；4、3、6、和8；4、5、6、和7；4、5、6、和8；4、6、7、和8；4、2、3、5、和6；4、2、3、5、和7；4、2、3、5、和8；4、2、3、5、6、和7；4、2、3、5、6、和8；4、2、3、5、6、7、和8；9和1；9和2；9和3；6；9、5、和7；9、5、和8；9、6和7；9、6和8；9、7和8；9、2、3、和5；9、2、3、和6；9、2、3、和7；9、2、3、和8；9、3、5、和6；9、3、5、和7；9、3、5、和8；9、3、6、和7；9、3、6、和8；9、5、6、和7；9、5、6、和8；9、6、7、和8；9、2、3、5、和6；9、2、3、5、和7；9、2、3、5、和8；9、2、3、5、6、和7；9、2、3、5、6、和8；9、2、3、5、6、7、和8；4、9和1；4、9和2；4、9和3；4、9和S；4、9和6；4、9和7；4、9和8；4、9、1、和2；4、9、1、和3；4、9、1、和5；4、9、1、和6；4、9、1、和7；4、9、1、和8；4、9、1、2、和3；4、9、1、2、和5；4、9、1、2、和6；4、9、1、2、和7；4、9、1、2、和8；4、9、1、2、3、和5；4、9、1、2、3、和6；4、9、1、2、3、和7；4、9、1、2、3、和8；4、9、1、2、3、5、和6；4、9、1、2、3、5、和7；4、9、1、2、3、5、和8；4、9、1、2、3、5、6、和7；4、9、1、2、3、5、6、和8；4、9、1、2、3、5、6、7、和8；4、9、2、和3；4、9、2、和5；4、9、2、和6；4、9、2、和7；4、9、2、和8；4、9、3、和5；4、9、3、和6；4、9、3、和7；4、9、3、和8；4、9、5、和6；4、9、5、和7；4、9、5、和8；4、9、6、和7；4、9、6、和8；4、9、7、和8；4、9、2、3、和5；4、9、2、3、和6；4、9、2、3、和7；4、9、2、3、和8；4、9、3、5、和6；4、9、3、5、和7；4、9、3、5、和8；4、9、3、6、和7；4、9、3、6、和8；4、9、5、6、和7；4、9、5、6、和8；4、9、6、7、和8；4、9、2、3、5、和6；4、9、2、3、5、和7；4、9、2、3、5、和8；4、9、2、3、5、6、和7；4、9、2、3、5、6、和8；或4、9、2、3、5、6、7、和8可被抑制。此外，该构建体可包含任何顺序的核苷酸序列。该核苷酸序列的长度也可改变。
上述任何一个构建体还可进一步包含启动子，其优先或特异性在玉米谷粒的胚芽和/或糊粉中表达，且该启动子与至少一个核苷酸序列可操作性连接。该启动子可以是油质蛋白启动子，如L3、球蛋白启动子、或例如Perl启动子。在上述抑制构建体中，至少一个可转录的核苷酸序列的表达导致抑制，该可转录的核苷酸序列可以是非编码序列。该非编码序列可以是内含子、来源于启动子区的核苷酸序列、来源于5’非翻译区的核苷酸序列、来源于3’非翻译区的核苷酸序列、或上述任何一个的片段。这种序列的例子包括SEQ ID NOS：44-58的那些。
上述构建体可按照本领域已知的方法制备(通常见，“RecombinantDNA PartD，”Methods in Enzymology，Vol.153，Wu和Grossman，eds.，Academic Press(1987)和在此处“实施例”下引用的参考文献)。构建的适宜方法在此处给出的实施例中举例说明。
用于使植物细胞、植物组织、植物器官或植物与核酸构建体，如载体接触，从而使核酸构建体被单独或作为植物组织的一部分的植物细胞、植物器官、或植物摄取，并在其中表达的技术是本领域已知的。这种方法例如包括植物组织培养技术。此处的“接触”是指使细胞、物质、器官、或植物与核酸构建体或载体以这种方式接触，如此，载体进入细胞并在其中表达。
所述植物细胞、植物组织、植物器官、或植物可通过本领域已知的任何适宜方式与载体接触。优选，产生表达所需蛋白的转基因植物。用于将编码所需蛋白的所需多核苷酸序列引入到植物细胞中的各种方法包括，但不限于：(1)物理方法如微量注射(Capecchi，Cell，22(2)：479-488(1980))、电穿孔(Fromm等人，PNAS U.S.A.，82(17)：5824-5828(1985)；美国专利US5,384,253)和微粒介导的送递(biolistics或基因枪技术)(Christou等人，Bio/Technology，9：957(1991)；Fynan等人，PNASU.S.A.90(24)：11478-11482(1993))；(2)病毒介导的送递方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168(1993)；Lu等人，J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614(1988)；和(3)土壤杆菌-介导的转化方法；(Fraley等人，PNAS U.S.A.，80：4803(1983))。
用于转化植物细胞的最普遍使用的方法是土壤杆菌-介导的DNA转移方法和biolistics或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)。土壤杆菌介导的转化是通过使用属于土壤杆菌属的基因工程化土壤细菌而实现的。一些土壤杆菌物种可介导被称作“T-DNA”的特异性DNA的转移，其可被基因工程化，从而将任何所需DNA片段携带进许多植物物种中。标记T-DNA介导的发病过程的主要事件是：毒性基因的诱导，T-DNA的加工和转移。该方法是许多评论文章的主题(Ream，Ann.Rev.Phytopathol.，27：583-618(1989)；Howard和Citovsky，Bioassays，12：103-108(1990)；Kado，Crit.Rev.Plant Sci.，10：1-32(1991)；Zambryski，Annual Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，43：465-490(1992)；Gelvin，In Transgenic Plants，Kung和Wu，eds.，Academic Press，San Diego，pp.49-87(1993)：Binns和Howitz，In Bacterial Pathogenesis of Plants andAnimals(Dang，ed.).Berlin：Springer Verlag，pp.119-138(1994)；Hooykaas和Beijersbergen，Ann.Rev.Phytopathol.，32：157-179(1994)；Lessl和Lanka，Cell，77：321-324(1994)；和Zupan和Zambryski，AnnualRev.Phytopathol.，27：583-618(1995))。
土壤杆菌-介导的植物基因转化包括若干步骤。第一步，首先使有毒的土壤杆菌与植物细胞彼此接触，这通常被称作“接种”。然后通过引流或吸入而除去与外植体接触的含土壤杆菌的溶液。接种后，使土壤杆菌和植物细胞/组织在适于生长和T-DNA转移的条件下共同生长若干小时至若干天或更长时间。该步骤被称作“共-培养”。共-培养和T-DNA送递后，用杀菌或制菌剂处理植物细胞，从而杀死存留的、与外植体接触的和/或存留于含外植体的容器中的土壤杆菌。如果是在没有任何促进转基因对非-转基因植物细胞的优先生长的选择剂存在的条件下进行的，那么这通常被称作“延迟”步骤。如果是在有利于转基因植物细胞的选择压力的条件下进行的，那么被称作“选择”步骤。当使用“延迟”步骤时，通常随后还有一个或多个“选择”步骤。”延迟”和“选择”步骤通常均包括杀菌或制菌剂，从而杀死所有存留的土壤杆菌细胞，这是因为在感染(接种和共-培养)过程后，土壤杆菌细胞的生长是不利的。
许多带有Ti或Ri质粒的根癌土壤杆菌和发根病土壤杆菌的野生和disarmed菌株均可用于基因向植物的转移。土壤杆菌宿主所含的disarmed Ti和Ri质粒不含可用作载体的分别引起肿瘤发生或生根的致癌基因，但含有随后被接种到植物中的目标基因。优选菌株包括，但不限于，根癌土壤杆菌株C58、用于介导DNA向植物细胞中转移的胭脂氨酸-型菌株、章鱼碱-型菌株如LBA4404或succinamopine-型菌株，例如EHA101或EHA105。将制备成DNA组分的核酸分子体外引入到适宜的宿主如大肠杆菌中并接合到土壤杆菌中，或直接转化到感受态土壤杆菌中。这些技术是本领域技术人员熟知的。
土壤杆菌可通过接种直接来源于甘油原液的Luria Burtani(LB)培养基，或用土壤杆菌在来源于甘油原液的固化培养基上划线，然后使细菌在适宜的选择性条件下，通常是约26℃-30℃，或约28℃下生长，并采集平板上土壤杆菌的单一菌落或小环并接种含选择剂的液体培养物而制备的。本领域技术人员知晓土壤杆菌的生长和适宜培养条件，以及随后的接种过程。用于接种的土壤杆菌培养物的密度及土壤杆菌细胞与外植体的比率可根据系统不同而变化，且，因此，预期了用于任何转化方法的这些参数的最佳化。
通常，将土壤杆菌培养物接种在划线平板或甘油原液中，并生长过夜，洗涤细菌细胞并将其重混悬于适合外植体接种的培养基中。
关于微粒轰击(美国专利US5,550,318；5,538,880；5,610,042；和WO95/06128；每一篇均全部引入此处作为参考)，用核酸包被粒子并通过推进力送递到细胞中。举例性的粒子包括由钨、铂，且优选金组成的那些。预期，在某些情况下，沉淀在金属粒子上的DNA对于使用微粒轰击将DNA送递给受体细胞而言不是必需的。然而，考虑了粒子可含DNA，而不是被DNA包被。因此，提出包被了DNA的粒子可通过粒子轰击而增加DNA送递水平，但不是必需和本身拥有的。
就轰击而言，在滤器或固体培养基上浓缩细胞混悬液。可选择性地，可在固体培养基上排列不成熟的胚或其它靶细胞。所轰击的细胞低于微粒终止平板以下的一段适当距离。
通过加速将DNA送递到植物细胞中的举例性方法是BiolisticsParticle Delivery System(BioRad，Hercules，CA)，其可用于将包被DNA的粒子或细胞，通过筛网，如不锈钢或Nytex筛网，推进到用在混悬液中培养的单子叶植物细胞覆盖的滤器表面上。该筛网可将粒子分散开来，这样就不用以较大聚集体的形式将它们送递给受体细胞。据信在发射器和所要轰击细胞之间插入的筛网可减少发射聚集物的大小并可通过降低由过大发射施加于受体细胞上的损害而产生较高的转化频率。
微粒轰击技术可广泛使用，并可用于转化任何植物物种。已经通过微粒轰击转化的物种的例子包括单子叶物种，如玉米(WO95/06128)、大麦、小麦(美国专利US5,563,055，其全部引入此处作为参考)、稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及很多双子叶植物包括烟草、大豆(美国专利US5,322,783，其全部引入此处作为参考)、向日葵、花生、棉花、番茄和豆类(美国专利US5,563,055，其全部引入此处作为参考)。
为了选择或评价转化的植物细胞，与转化方法无关，引入到细胞中的DNA含有在可再生植物组织中发挥作用的基因，从而产生赋予植物组织对其它有毒化合物的抗性的化合物。用作可选择、可筛选或可评价标记的目标基因包括，但不限于，GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、和博莱霉素)；甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。
用于本发明中的特别优选的选择标记基因包括赋予对化合物如抗生素，像卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)、和庆大霉素(aac3和aacC4)(Dekeyser等人，Plant Physiol.，90：217-223(1989))、和除草剂，像草甘膦(Della-Cioppa等人，Biol Technology，5：579-584(1987))的抗性的基因。也可使用其它选择装置，包括，但不限于，对膦丝菌素的耐受性、bialaphos、和阳性选择机理(Joersbo等人，Mol.Breed.，4：111-117(1998))且被认为落在本发明的范围内。
转化的植物细胞，其可通过上述任何一种转化技术送递，可被培养成再生具有所需转化表型的全植株。可使用任何适宜的植物培养基。适宜培养基的例子包括但不限于基于MS的培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15：473-497,1962)或基于N6的培养基(Chu等人，Scientia Sinica，18：659，1975)，其中补充了其它植物生长调节剂，包括但不限于茁长素、细胞激动素、ABA、和赤霉素。本领域技术人员知晓各种组织培养基，适当补充时，可支持植物组织生长和发育并适于植物转化和再生。这些组织培养基可作为商业制品购买，或常规制备和改良。本领域技术人员了解培养基和培养基添加物，如用于转化和再生的营养物和生长调节剂以及其它培养条件如相对于各具体目标而言最佳的、培养过程中的光强度、pH、和培养温度。
本领域普通技术人员应认识到在将表达盒稳定掺入到转基因植物中并被证实可操作性时，可通过性-杂交将它引入到其它植物中。可使用众多标准繁殖技术中的任意一种，这取决于所要杂交的物种。
鉴于上面所述，本发明提供一种抑制一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、玉米组织、玉米器官、或玉米植物中表达的方法。该方法包括使所述玉米细胞、玉米组织、玉米器官、或玉米植物与上述核酸构建体接触。
因此，本发明还提供一种玉米细胞、玉米组织、玉米器官或玉米植物，其中CDK抑制剂样基因的表达已按照这类方法被抑制。还提供一种从这类植物获得的种子以及从这类种子获得的油及粗粉。
本发明还提供一种超过约10,000，更优选约20,000，且甚至更优选约40,000个种子的容器，其中超过约10％、更优选约25％、更优选约50％、且甚至更优选约75％或更优选约90％的种子是来源于本发明植物的种子。
本发明还提供一种超过约10kg、更优选约25kg、且甚至更优选约50kg种子的容器， 其中超过约10％、更优选约25％、更优选约50％、且甚至更优选约75％或更优选约90％的种子是来源于本发明植物的种子。
可对本发明任何一种植物或其一部分进行加工，生产饲料、粗粉、蛋白、或油类制品。用于该目的的特别优选的植物部分是种子。在优选实施方案中，饲料、粗粉、蛋白、或油类制品被设计用于反刍动物。生产饲料、粗粉、蛋白、和油类制品的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利US4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在优选实施方案中，所述蛋白制品是高蛋白制品。这种高蛋白制品优选具有超过5％w/v、更优选10％w/v、且更优选15％w/v的蛋白含量。
在另一实施方案中，可将本发明的粗粉与其它粗粉混合。在优选实施方案中，由本发明植物生产或通过本发明方法生产的粗粉构成任意产品中超过约0.5％、约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、或约90％体积或重量的粗粉部分。在另一实施方案中，可将该粗粉制品混合且可构成混合物的约10％、约25％、约35％、约50％、或约75％体积。
本发明还提供一种上调一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、玉米组织、玉米器官、或玉米植物中表达的方法。该方法包括使玉米细胞、组织、器官或植物与至少一种核酸构建体接触，该核酸构建体包含选自下组的至少一个核苷酸序列：SEQ ID NO：1[ZmKRP1]，编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：3[ZmKRP2]，编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：7[ZmKRP4]，编码SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：9[ZmKRP5]编码SEQ IDNO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：11[ZmKRP6]，和编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，其中，当细胞、组织、或器官与该核酸构建体接触时，该方法进一步包括在一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、组织、器官或植物中的表达被上调后，自该细胞、组织或器官产生植物。该方法可包括使细胞、组织、器官或植物与不止一个核酸构建体接触，且每个核酸构建体均包含不同的核苷酸序列。该核酸可包含优先在玉米雄性生殖组织中表达的启动子，其中该启动子与至少一个核苷酸序列可操作性连接。这类启动子的例子是玉米的SILKY1启动子和此处上面所述的其它启动子。在玉米雄性生殖组织中优先表达可产生雄性-不育玉米植物。
实施例
在下列实施例中进一步描述本发明。这些实施例用于举例说明本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1
本实施例描述来源于玉米的CDK抑制剂的鉴定。
最初Monsanto私有EST数据库的tBLASTn检索(Altschul等人，Nuc.Acid Res.，25：3389-3402(1997))是使用可公开得到的鼠耳芥属CDK抑制剂样基因AtKRP1(“At”表示鼠耳芥；KRP1是如上面所定义的；GenBank#AAC49698)、AtKRP2(GenBank#CAB76424)、AtKRP3(GenBank#CAC41617)、AtKRP4(GenBank#CAC41618)、AtKRP5(GenBank#CAC41619)、AtKRP6(GenBank#CAC41620)、和AtKRP7(GenBank#CAC41621)的序列进行的。此外，来源于上述多肽C-末端区的下列保守序列用于tBLASTn研究中：(PTTAEIEDFFSEAEEQQQKQFIEKYNFDIVNDEPLEGRYEWVKLKP)[SEQ ID NO：59]。
由BLAST研究可知，鉴定出7个玉米序列簇，其与上述鼠耳芥属CDK抑制剂样基因具有同源性。此处所用“序列簇”是指具有同源性重叠区的一组EST序列。各簇的代表性克隆是全长双链测序的，并用于对Monsanto私有EST数据库的BLAST检索。从该第二个BLAST检索中鉴定了另外2个簇，且代表性克隆是全长双链测序的。DNA序列分析表明，在玉米中存在至少9个不同的CDK抑制剂样簇。这9个簇和它们的代表性克隆(命名为ZmKRP1-ZmKRP9)在表1中概述。
表1.玉米CDK抑制剂样簇和代表性EST克隆及ORF SEQ ID NO：
| 簇ID | 所选克隆ID | 名称 | ORF SEQID NO： |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER89801_1 | LIB3732-047-Q1-N6-G6 | ZmKRP1 | 1 |
| ZEAMA-04OCT00-CLUSTER67903_1 | LIB3279-047-P1-K1-A7 | ZmKRP2 | 3 |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER115879_1 | LIB3606-029-Q1-K6-B4 | ZmKRP3 | 5 |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER31652_2 | LIB4759-013-R1-K1-B5 | ZmKRP4 | 7 |
| ZEAMA-06JUN02-CLUSTER620952_1 | LIB3898-003-Q1-N6-D10 | ZmKRP5 | 9 |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER301_55 | LIB143-038-Q1-E1-G6 | ZmKRP6 | 11 |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER301_41 | 700088048H1 | ZmKRP7 | 13 |
| ZEAMA-21JUN01-CLUSTER301_46 | LIB3587-222-Q1-K6-H9 | ZmKRP8 | 15 |
| ZEAMA-08NOV01-CLUSTER33142_4 | LIB4574-012-Q1-K1-H11 | ZmKRP9 | 17 |
这9个簇的代表性克隆的编码区和推断氨基酸序列在序列表中表示为SEQ ID NOs：1-18。鉴定了ZmKRP1、2、4、5、和6的全长可读框(ORF)及ZmKRP3、7、8、和9的部分ORF。
蛋白序列比对表明玉米KRP与鼠耳芥属ICK/KRP共有小的保守区，特别是在C-末端区(图1)。此外，某些玉米KRP彼此具有较高的序列同一性。例如，ZmKRP6和ZmKRP7具有90％同一性，而ZmKRPl和ZmKRP2具有84％同一性。其它ZmKRP成员仅共有16-50％同一性。
序列比对和同一性百分比计算是通过Clustal W算法进行的。
实施例2
本实施例描述用于在玉米胚中抑制的CDK抑制剂的鉴定。
Monsanto私有玉米cDNA数据库是使用CDK BLASTn方案，以及来源于实施例1中鉴定的玉米KRP编码区的DNA序列(SEQ IDNOs：1、3、5、7、9、11、13、15、和17)查询的。这样做以确定哪些序列在来源于正在发育的谷粒/胚组织以及各种非-谷粒组织的cDNA文库中找到。在谷粒或胚cDNA文库中鉴定了与ZmKRPl、ZmKRP2、ZmKRP4、ZmKRP6、ZmKRP7、和ZmKRP9(SEQ ID NOs：1、2、4、6、7、和9)相对应的cDNA序列。仅在从非-谷粒文库产生的文库中找到了与ZmKRP3、ZmKRP5、和ZmKRP8相对应的cDNA序列。这些结果表明至少由在谷粒或胚cDNA文库中找到的序列所代表的基因组需要被抑制。然而，鉴定与谷粒库中特定基因相对应的cDNA序列失败不会排除谷粒表达的可能性，因为不能在已知文库中找到序列。因为所有这9个基因均可在胚中表达，因此所有均使用dsRNA抑制构建体抑制。
实施例3
本实施例描述用于ZmKRP基因的组织-特异性抑制的载体的构建以及用这些载体转化玉米植物。
为了抑制在实施例1中鉴定的9个玉米CDK抑制剂样基因，使用了dsRNA策略。为了建立dsRNA构建体从而抑制全部9个ZmKRP基因(ZmKRP1-9)，从每个基因的3’末端区选择200个碱基对的片段(F)(F1-F7，SEQ ID NOs：19-25)，除了ZmKRP9之外，其中选择了183个碱基对(SEQ ID NO：26)且以多顺反子方式连接。因为ZmKRP6和ZmKRP7在该3’200个碱基对区中是相同的，因此一个片段用于两个基因的抑制(F6)。为了制造最终的玉米表达构建体，首先生产了两个中间构建体。构建2个中间dsRNA构建体的过程在图4和5中示意。
每个中间dsRNA构建体在由间插内含子区隔开的有义和反义方向均含有4个3’末端片段。第一个中间构建体含有F1-F4序列，第二个含序列F5-F8。具有各自的启动子和3’UTR的两个茎-环结构，在其中一个玉米表达载体中组合(图2)并使用实施例10描述的土壤杆菌转化方法进行玉米转化。
为了建立含F1-F4序列的中间dsRNA构建体，通过PCR分别产生F1-F4的有义连接、F1-F4的反义连接、和ZmDnaK(编码HSP70的基因)内含子片段(SEQ ID NO：27)(见，例如，美国专利US5,424,412；Rochester等人，EMBO J.，5：451-458(1986))并使用BamHI/BglII定向克隆方法组装(图4)。除非另有说明，按照制造商(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)提出的标准方案进行PCR方法，并加入5％DMSO。加入DMSO是由于玉米DNA的GC含量较高。
F1片段是使用引物P1-StuI(SEQ ID NO：28)和P1-2R(SEQ IDNO：29)从ZmKRP1 EST克隆的DNA扩增的。引物在表2中列出并在图5中表示。然后使用本领域熟知的标准方法学纯化F1片段。F1-2片段是使用与等量ZmKRP2 EST克隆的DNA混合的纯化F1 PCR产物作为模板，使用P1-StuI(SEQ ID NO：28)和P2-3(SEQ ID NO：30)作为引物，通过PCR扩增产生的。PCR产物F1-2是使用标准方法凝胶纯化的。同样，F3和F4是使用引物P4-Bgl(SEQ ID NO：31)、P3-4(SEQ IDNO：32)、和P5-Bam(SEQ ID NO：33)PCR连接的，得到PCR产物F3-4。随后使用引物P1-StuI、P2-3和P5-Bam(SEQ ID NO：33)将F1-2和F3-4产物PCR连接。纯化所得PCR产物F1-4，并使用Topo-TA克隆系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)将其克隆到载体中。所得克隆，即F14B3-有义，是全长双链测序的。然后使用引物P5-Bgl(SEQ ID NO：34)和Pl-SseBam(SEQ ID NO：35)，从F14B3-有义克隆，对F1-4片段进行PCR扩增，产生反义片段。使用Topo-A克隆系统将所得PCR产物再次克隆，形成F14B3-反义克隆。该克隆是使用标准方法通过测序加以证实的。
表2.用于构建ZmKRP dsRNA载体的引物
| PCR/连接 | 引物 | SEQ ID NO |
| F1和F2 | P1-StuI | 28 |
| P1-2R | 29 | |
| P2-3 | 30 | |
| F3和F4 | P4-Bgl | 31 |
| P3-4 | 32 | |
| P5-Bam | 33 | |
| F1-2和F3-4 | P1-StuI | 28 |
| P2-3 | 30 | |
| P5-Bam | 33 | |
| F1-4反义 | P5-Bgl | 34 |
| P1-SseBam | 35 | |
| ZmDnaK内含子 | Pi-Bgl | 36 |
| Pi-Bam | 37 | |
| F5和F6 | P5-Nco | 38 |
| P5-6 | 39 | |
| P6-7 | 40 | |
| F7和F8 | P8-Bgl | 41 |
| P7-8 | 42 | |
| P8-i | 43 | |
| F5-6和F7-8 | P5-Nco | 38 |
| P6-7 | 40 | |
| P8-i | 43 | |
| F5-8和ZmDnaK内含子 | P5-Nco | 38 |
| P8-i | 43 | |
| Pi-Bam | 37 |
ZmDnaK-内含子(见，例如，美国专利US5,424,412)是从植物表达载体pMON70091进行PCR扩增的，其含有Z27玉米醇溶蛋白启动子(Lopes等人，Mol. Gen.Genet.，247：603-613(1995)和ZmDnaK内含子，其中使用引物Pi-Bgl(SEQ ID NO：36)和Pi-Bam(SEQ ID NO：37)。PCR产物DnaK-l是使用Topo-TA克隆系统克隆的。该克隆经全长双链测序加以证实。F1-4有义，ZmDnaK内含子，和F1-4反义片段是以逐步方式组装的。首先，使用BglII和BamHI切除DnaK-1构建体中的ZmDnaK内含子。然后使该内含子与F14B3-有义构建体的BamHI位点连接，这样一来，ZmDnaK-内含子/BamHI-BglII的BglII位点与BamHI位点(由引物P5-Bam引入)在F1-4的3’末端连接。该连接反应产生构建体F14In2。第二，用BglII和BamHI切除克隆F14B3-反义中的F1-4片段，并使F1-4/BglII-BamHI片段与F14In2的BamHI位点连接，这样一来，F1-4/BglII-BamHI的BglII位点与BamHI位点(由引物Pi-Bam引入)在ZmDnaK内含子的3’末端连接。该连接反应产生构建体F142cl。
最后，使用StuI和Sse8387I将含F1-4有义；ZmDnaK内含子；F1-4反义片段的整个DNA片段从克隆F142cl中切除下来并克隆到pMON80611中。pMON80611是用于植物土壤杆菌转化的二元载体。它含有用于T-DNA转移的左缘和右缘，和由增强的35s启动子::草甘膦抗性标记基因::nos 3′UTR组成的植物选择标记盒(美国专利US5,627,061)和植物表达盒序列，其包括油质蛋白L3启动子(美国专利US6,433,252)和玉米球蛋白3′UTR(见，例如，Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872，(1991))，其具有用于目标基因表达的克隆位点。所得表达盒被命名为WWZHEN03.0024。
然后生产含F5-F8片段的中间dsRNA构建体。分别通过PCR生产F5-F8的有义连接、F5-F8的反义连接、和ZmDnaK内含子(SEQ IDNO：27)并使用上面所述和图5所示的PCR或BamHI/BglII定向克隆方法组装。那些PCR连接中所用的引物在表2和图5中列出。然后将含F5-8有义；ZmDnaK内含子；F5-8反义的组装片段克隆到载体pMON80611中，产生第二个表达盒WWZHEN03.0023。为了使WWZHEN03.0023与WWZHEN03.0024组合，凝胶(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化来源于含有F5-8有义；ZmDnaK内含子；F5-8反义的WWZHEN03.0023的4528bp AscI-FseI，并与用MluI和FseI消化的WWZHEN03.0024连接，产生最终的玉米转化构建体pMON71270(图2)。
Perl启动子-驱动的ZmKRP抑制构建体是由两个中间dsRNA构建体WWZHEN03.0023和WWZHDN03.0024制造的(上面所述)。首先，通过SfiI和Sse83871消化切除WWZHDN03.0024的片段，该片段含F1-4有义；ZmDnaK内含子；F1-4反义，然后克隆到含Per1的载体pMON68290的SfiI和Sse8387I位点中，产生WWZHEN03.0041。同样，通过SfiI和Sse8387I消化切除WWZHEN03.0023的片段，该片段含F5-8有义；ZmDnaK内含子；F5-8反义，然后克隆到含Per1的载体pMON68290的SfiI和Sse8387I位点中，产生WWZHEN03.0042。为了使WWZHEN03.0041和WWZHEN03.0042组合，凝胶纯化来源于含有F5-8有义；ZmDnaK内含子；F5-8反义的WWZHEN03.0042的4481bp AscI片段(Qiagen Inc.，Valencia，CA)并与用MluI消化的WWZHEN03.0041连接，产生最终的玉米转化构建体pMON71279(图3)。
实施例4
本实施例提供用于抑制玉米中一个或多个ZmKRP基因的植物转化载体的构建。
其它种子-特异性抑制构建体是使用可选择大小的片段，大小为50个碱基对到全长基因，单独或以各种方式组合产生的。作为举例，使用与玉米L3(油质蛋白)启动子可操作性连接的ZmKRP1的200个碱基对片段生产dsRNA构建体。按照上面实施例3所述生产F1片段和ZmDnaK-内含子。将这两个片段连接，产生中间体F1；ZmDnaK-内含子片段。然后将分离和纯化F1片段的等分试样PCR扩增，产生F1-反义。然后将F1-反义与中间体F1；ZmDnaK-内含子片段连接；产生dsRNA构建体F1；ZmDnaK-内含子；F1-反义。然后将该构建体克隆到玉米L3(油质蛋白)启动子的载体下游中。可选择性地，将该构建体克隆到启动子，如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、P-Zm.CPC214tr2、P-Os.CPC214、和P-Hv.PER1以及本领域技术人员已知的其它胚-优选的启动子的载体下游。相似的构建体使用ZmKRP2、ZmKRP3、ZmKRP4、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、ZmKRP8、和ZmKRP9产生。生产转基因玉米植物。如下面实施例所述，根据这些构建体对转基因种子进行分析，从而鉴定胚芽重量、谷粒重量、细胞增殖、整个谷粒的含油水平、整个谷粒的蛋白水平(％干重)、整个谷粒的氨基酸组成、游离氨基酸水平、和微量营养素的组成。然后取决于所需转化植物的表型，将用于dsRNA构建体中的ZmKRP基因片段(其导致上述任何一种性质的改变)在单一的多顺反子dsRNA构建体中组合，然后利用土壤杆菌转化将其转化到玉米中；如实施例10中所述生产转基因植物。
实施例5
本实施例描述如何通过使用反义技术抑制内源CDK抑制剂样基因表达。
玉米植物细胞中产生的ZmKRP1水平可通过将表达ZmKRP1多肽的反义RNA的转基因引入到基因组中而降低。例如，将ZmKRPIcDNA或其至少100bp长的片段以反义方向克隆到植物表达载体pMON80611中，其在L3启动子的控制下驱动表达并含有球蛋白3′UTR(Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872(1991))。然后如实施例10中所述将所得载体转化到玉米植物的基因组中。可将反义基因的多个拷贝引入到基因组中。其它CDK抑制剂样基因，例如ZmKRP2，可被制成反义构建体并分开或结合表达，正如上面ZmKRP1所述。
实施例6
本实施例描述如何通过使用核酶技术抑制内源性CDK抑制剂样基因在植物中表达。
在玉米植物细胞中产生的ZmKRP1 mRNA水平可通过将转基因引入到基因组中而降低，该转基因表达针对编码ZmKRP1多肽的mRNA的核酶。该核酶构建体是通过用与内源性基因的靶AUG相邻的核酶序列将至少24bp ZmKRP1 cDNA克隆到(Merlo等人，Plant Cell，10(10)：1603-1622(1998))pMON80611中，其驱动自L3启动子的表达并含有球蛋白3′UTR(Belanger和Kriz，Genet.，129：863-872(1991))而产生的。如实施例10中所述将所得构建体转化到玉米植物中。可按照实施例10中所述将含ZmKRP基因的核酶的多个拷贝引入到基因组中。可按照上面对ZmKRP1所述，将针对其它ZmKRP多肽(如此处上面所述)的组合的含核酶基因引入到基因组中，这样就可同时抑制多个ZmKRP基因。
实施例7
本实施例描述如何通过使用同源重组技术抑制内源性CDK抑制剂样基因在植物中表达。
在玉米植物细胞中产生的ZmKRP1水平可经由同源重组通过基因替代方法而降低。在该方法中，内源性ZmKRP1基因被诱变过的ZmKRP1基因替代。该诱变过的基因编码ZmKRP1，与由内源性替代基因编码的那些相比，其在抑制CDK方面不太有效，或完全无效。产生ZmKRP1的基因是通过一个或多个核苷酸的缺失、插入、复制或替代而被诱变的。如实施例10中所述，诱变过的基因与选择标记基因融合并转化到玉米植物细胞中。可导致基因替代的同源重组事件是以选择标记基因为基础进行选择的(Puchta等人，Trends Plant Sci.，1：340(1996)；Kempin等人，Nature，389：802(1997))。基因替代是通过DNA印迹分析或PCR和DNA测序加以证实的。
按照与上面所述相似的方式，可独立或组合地抑制其它CDK抑制剂基因。
实施例8
本实施例描述如何通过使用有义抑制技术抑制内源性CDK抑制剂基因在植物中表达。
在植物细胞中产生的ZmKRPI多肽水平可通过有义抑制而降低。正如实施例10中所述，例如，编码ZmKRP1多肽的cDNA与上游(5′)如Perl，和/或下游(3′)转录或翻译调节序列融合，嵌合基因被克隆到携带选择标记基因的适宜转化载体中，载体被转化到玉米植物细胞中。转化体是以标记基因的存在为基础选择的(例如草甘膦抗性)。转化体是通过推断转化体的DNA的DNA印迹分析加以证实的。来源于该实验过程的绝大多数转基因生物将表达不会影响内源性表达的转基因。然而，在少数情况下，转基因和内源性基因均被抑制。为了鉴定这些有义-抑制的植物，将分别分析来源于至少60种转基因植物的RNA或蛋白提取物中是否存在ZmKRP mRNA或多肽。可单独或以各种组合使用其它CDK抑制剂样基因。
实施例9
本实施例提供一种通过在雄性生殖组织中表达玉米CDK抑制剂而产生雄性不育玉米植物的方法。
玉米SILKY1启动子与ZmKRP1、ZmKRP2、ZmKRP4、ZmKRP5、和ZmKRP6在独立的表达构建体中可操作性连接，该构建体含nos3′UTR(Bevan等人，Nucl.Acid Res.，11：369(1983))(存在其它可能)和草甘膦抗性选择标记(见美国专利US5,627,061)。使用实施例10中提供的土壤杆菌转化方案将一个或多个所得表达盒转化到玉米中，并产生转基因植物。
如果有花粉，雄性不育是通过进行花粉发芽测定(Walden，D.B.(1994)，In vitro Pollen Germination(pp 723-724)，The MaizeHandbook，Freeing，M.和Walbot，V.eds，Springer-Verlag，New York，Inc.)测定的。此外，花粉的活力是通过转基因花粉使非-转基因植物的胚珠受精并产生含转基因的有活力种子的能力加以测定的。不育转基因植物可通过用非-转基因供体花粉使转基因植物受精而维持。
实施例10
本实施例描述用含玉米CDK抑制剂样序列的构建体转化玉米植物。
上述转化载体用于使用下列过程转化玉米植物。玉米植物在标准实践条件下的温室中生长。进行可控授粉。用甘油原液中的含载体的土壤杆菌ABI在固体LB培养基上划线，该固体LB培养基补充有抗生素卡那霉素(50mg/L)、壮观霉素(50mg/L)、链霉素(50mg/L)、和氯霉素(25mg/L)，并在28℃下温育2天。在进行玉米不成熟胚的土壤杆菌接种前2天，取出土壤杆菌平板中的一个菌落或一个小环的土壤杆菌，并接种在250-mL烧瓶中的补充了100mg/L壮观霉素和50mg/L卡那霉素的25mL液体LB培养基中。将烧瓶放在约150rpm的振荡器上，26℃过夜。然后在相同的液体培养基中稀释(1∶5)土壤杆菌培养物，并放回到振荡器上。若干小时后，接种前1天，使土壤杆菌细胞以3500rpm旋转15分钟。将细菌细胞沉淀重混悬于含200μM acetosyringone和50mg/L壮观霉素和25mg/L卡那霉素的诱导培养液中，并将细胞密度调节为O.D.60下0.2。然后将细菌细胞培养物(每个250-mL烧瓶中50mL)放回到振荡器上并生长过夜。在接种当天的早晨，使细菌细胞旋转并用补充了200μM acetosyringone的液体1/2MS VI培养基(表3)洗涤。再次旋转后，将该细菌细胞颗粒重悬浮于含200μM acetosyringone(表3)的1/2MS PL培养基(表3)中，并将细胞密度调整到O.D 660下1.0进行接种。
试剂可商业获得，并可从许多供应商处购买(见，例如，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。
表3.所用培养基1
| 组分 | MSVI | MSPL | 共培养的培养基 | 诱导MS | MSW50 | MS/6BA | MSOD |
| MS盐蔗糖麦芽糖葡萄糖1-脯氨酸酪蛋氨基酸甘氨酸1-天门冬酰胺肌醇烟酸吡哆辛·HCl硫胺·HClCa泛酸盐2，4-D毒莠定硝酸银BAP | 68.5g/l20g/l--10g/l115mg/l-2mg/l-100mg/l0.5mg/l0.5mg/l0.1mg/l---------- | 68.5g/l68.6g/l--36g/l115mg/l-2mg/l-100mg/l0.5 mg/l0.5mg/l0.1mg/l---------- | 2.2g/l20g/l--10g/l115mg/l-2mg/l-100mg/l0.5mg/l0.5mg/l0.6mg/l--3mg/l--1.7mg/l-- | 4.4g/l30g/l----1.36g/l50mg/l---1.3mg/l0.25mg/l0.25mg/l0.25mg/l0.5mg/l2.2mg/l1.7mg/l-- | 4.4g/l30g/l----1.38g/l500mg/l2mg/l-100mg/l0.5mg/l0.5mg/l0.6mg/l--0.5mg/l------ | 4.4g/l30g/l----1.36g/l50mg/l------1.3mg/l0.25mg/l0.25mg/l0.25mg/l------3.5mg/l | 4.4g/l--20g/l10g/l------150mg/l100mg/l1.3mg/l0.25mg/l0.25mg/l0.25mg/l------ |
1培养基1/2MSVI和1/2MSPL作为液体使用。共-培养基是用5.5mg/l低EEO琼脂糖固化的。所有其它培养基是用进行NPTII选择的7g/lPhytagar和进行草甘膦选择的3g/l phytagel固化的。
精选玉米株系(LH244)用于与本发明有关的转化。在授粉后约10天采集含不成熟胚的穗并在4℃下冷冻直到使用(直到采集后5天)。用于该转化方法的优选胚大小为约1.0-2.0mm。该大小通常是在温室内授粉后10天获得，生长条件为：平均温度87，由GE 1000瓦高压钠灯提供补充光照14小时。
从表面不育的穗中分离出不成熟的胚并直接滴到1.5-mL微量离心试管中的制备的土壤杆菌细胞混悬液中。分离持续15分钟。然后放置该试管5分钟，使各胚的接种时间为5-20分钟。使用尖端较细的移液管除去土壤杆菌细胞混悬液后，将不成熟的胚转移到共-培养的培养基上(表3)。将胚放在具有面朝上的盾侧的培养基上。在黑暗的培养箱(23℃)中培养该胚约24小时。
然后将该胚转移到补充了0.1或0.25mM草甘膦和250mg/L羧苄青霉素的修饰MS培养基(MSW50，表3)上，抑制陪替氏皿(100mm×25mm)中的土壤杆菌。27℃下在黑暗的培养室中温育该培养物2-3周。然后将所有愈伤组织片段单独转移到补充了相同水平草甘膦的第一再生培养基上(MS/6BA，表3)。培养物在该培养基上生长，培养室的光周期为16小时光照/8小时黑暗，温度为27℃，培养5-7天。然后将它们转移到陪替氏皿(100mm×25mm)中的第二再生培养基(MSOD，表3)上约2周。将所有具有再生芽的愈伤组织片段及活组织转移到包含在phytatrays中的相同培养基上用于发芽，从而在转移到土壤中前进一步生长。这需要花费2-4周时间。再生培养基(MS6BA和MSOD)全部补充了250mg/L羧苄青霉素和0.1或0.25mM草甘膦。
然后将这些正在发育的植物转移到土壤中，使幼苗受冷而变得耐寒，生长室条件为27℃、80％湿度、光照强度较低，时间约1周，然后转移到温室中并在标准温室条件下生长。
然后分析在温室中生长的植物的表达水平以及油和蛋白的水平。
实施例11
本实施例描述转基因植物的表达分析。
RNA表达分析用于证实转基因植物中CDK抑制剂的错误表达或抑制。本申请所用“错误表达”是指除了内源表达外的空间或时间表达，例如过量表达和异位表达。通过标准方案提取RNA(Wadsworth等人，Analytical Biochemistry，172(1)：279-283(1988))。为了测定ZmKRP基因在玉米胚组织中的错误表达或抑制，使用TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents试剂盒和方案进行TaqMan分析(#4310299 rev.C)(Applied Biosystems，Foster City CA)。使用基因-特异性引物，通过标准PCR合成cDNA，并通过琼脂糖-凝胶电泳观察PCR产物。
实施例12
本实施例提供测定转基因玉米植物的油和蛋白含量、质量差异、氨基酸组成、游离氨基酸水平和微量营养素含量的分析过程。
通过低分辨率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等人，JAOCS，51：104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))测定第一代单一玉米谷粒、解剖胚芽和胚乳的油含量水平(以质量为基础，并以组织重量百分比表示)，由此测量单一谷粒样品的NMR弛豫时间，并使用标准曲线，以回归分析为基础计算油水平，所述标准曲线是在加速溶剂提取后，重量分析测定具有不同油水平的玉米谷粒产生的。进行单向方差分析和Student′s T检验(JMP，4.04版，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)，以通过转基因-特异性PCR鉴定转基因和非-转基因谷粒之间的显著性差异。
第二代种子的油水平和蛋白水平是通过NIT分光术测定的，由此测量从各植物采集的混合种子样品的NIT光谱，并使用标准曲线，以回归分析为基础计算油和蛋白水平，所述标准曲线是在分别加速溶剂提取或元素(％N)分析后，重量分析测定具有不同油或蛋白水平的玉米谷粒产生的。进行单向方差分析和Student′s T-检验，以鉴定来源于标记阳性植物和标记阴性植物的种子之间油(％谷粒重量)和蛋白(％谷粒重量)的显著性差异。
使用下列过程分析各转基因事件的游离氨基酸水平。将各转基因植物的种子单独碾碎成细粉，并将约50mg所得粉末转移到预先称重的离心试管中。记录下准确的样品重量并将1.0ml 5％三氯乙酸加入到各样品试管中。室温下旋转混合样品，然后在Eppendorf微量离心机(Model 5415C，Brinkmann Instrument，Westbury，NY)上以14,000rpm离心15分钟。除去上清液部分，并使用Agilent Technical Publication“Amino Acid Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and theAgilent 1100 HPLC，”2000年3月17日提供的过程，通过HPLC(Agilent1100)进行分析。
通过下列方法进行玉米中总氨基酸的定量测定。研磨谷粒并将约60mg所得粗粉使用6N HCl，100℃回流24小时而酸水解。干燥样品并在0.1N HCl中重构，接着用α-苯二醛进行预柱衍生(用于HPLC分析的OPAO)。利用反相Zorbax Eclipse XDB-C18 HPLC柱在Agilent 1100HPLC(Agilent，Palo Alto，CA)上分离氨基酸。利用荧光检测氨基酸。半胱氨酸、脯氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺和色氨酸未包括在该氨基酸筛选中(Henderson等人，“Rapid，Accurate，Sensitive and ReproducibleHPLC Analysis of Amino acids，Amino Acid Analysis Using ZorbaxEclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC，” AgilentPublication(2000)；还见，“Measurement of Acid-Stable Amino Acids，”AACC Method 07-01(American Association of Cereal Chemists，Approved Methods，9th edition(LCCC#95-75308))。使用所述碱水解方法测量玉米谷粒中的总色氨酸(Approved Methods of the AmericanAssociation of Cereal Chemists-10th edition，AACC ed，(2000)07-20Measurement of Tryptophan-Alakline Hydrolysis)。
种子中的生育酚和生育三烯酚水平通过本领域熟知的方法测定。简言之，将10mg种子组织加入到已经加入500μl 1％焦没食子酸(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)/乙醇的无菌微量离心试管中的1g微珠中(Biospec Product Inc，Barlesville，OK)。在微型Beadbeater(Biospec)中快速振荡该混合物3分钟，然后经由0.2μm滤器过滤到自动采样试管中。使用具有荧光检测、290nm激发波长、336nm发射波长、带通和狭缝的Zorbax二氧化硅HPLC柱(4.6mm×250mm)，通过HPLC分析过滤的提取物。溶剂组成和过柱条件在下面列出，溶剂A为己烷，溶剂B为甲基-叔-丁基醚。注射体积为20μl，流速为1.5ml/分钟，过柱时间为12分钟，40℃。溶剂梯度为90％溶剂A、10％溶剂B10分钟；25％溶剂A、75％溶剂B11分钟；和90％溶剂A、10％溶剂B12分钟。使溶于1％焦没食子酸/乙醇中的生育酚标准品过柱以进行比较(α-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚、和生育酚(母生育酚))。α-、β-、δ-、和γ-生育酚的标准曲线是使用Chemstation软件(HewlettPackard)计算的。使溶于1％焦没食子酸/乙醇中的生育三烯酚标准品过柱以进行比较(α-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、β-生育三烯酚、δ-生育三烯酚)。α-、β-、δ-、和γ-生育三烯酚的标准曲线是使用Chemstation软件(Hewlett Packard)计算的。
转基因玉米谷粒中的类胡萝卜素水平是通过标准方案测定的(Craft，Meth.Enzymol.，213：185-205(1992))。Plastiquinols和叶绿醌是通过标准方案测定的(Threlfall等人，Methods in Enzymology，XVIII，partC，369-396(1971)；和Ramadan等人，Eur.Food Res.Technol.，214(6)：521-527(2002))。
含pMON71270的结果在表4中表示。
| 表4 pMON71270第一代单谷粒分析 | |||||||||
| 种系 | 正GOI | 负GOI | Prob＞F | 显著 | Delta | ||||
| n | 平均值 | LSD | n | 平均值 | LSD | ||||
| LH244/ZM_S86489 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 2.600.019120.8111.270.18894.883.95 | 0.430.003263.691.250.01741.160.97 | 9999999 | 3.700.021227.5811.540.20307.595.74 | 0.520.004.441.510.02091.391.16 | 0.00010.25290.00250.68940.14100.00030.0023 | 0.0010.010.0010.01 | -1.10-0.0020-6.77-0.27-0.0141-2.71-1.79 |
| ZM_S86363/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 4.030.016431.1712.510.15166.105.14 | 0.410.00261.911.250.02231.161.00 | 9999999 | 3.790.013430.6512.090.15425.865.11 | 0.490.00312.301.510.02681.391.20 | 0.27720.99270.61690.53550.82550.69970.9554 | 0.240.00300.520.42-0.00260.240.03 | |
| ZM_S86474/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 11111111111111 | 2.920.013127.609.240.15544.703.61 | 0.620.00604.402.990.02831.521.35 | 13131313131313 | 2.870.015125.7010.560.15814.673.65 | 0.570.00554.052.750.02611.401.25 | 0.86890.48280.36130.35150.83460.96710.9503 | 0.05-0.00201.90-1.32-0.00280.03-0.04 | |
| ZM_S86481/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 10101010101010 | 3.980.018831.1010.830.19167.635.88 | 0.210.00364.961.790.01570.741.09 | 13131313131313 | 3.690.017432.7110.580.18506.835.53 | 0.190.00324.351.570.01370.650.96 | 0.00670.39010.47940.76370.36400.02540.4867 | 0.010.05 | 0.290.0014-1.610.250.00660.800.35 |
| ZM_S86483/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 1111111 | 3.520.010421.1511.110.10253.612.19 | 1.280.00888.383.550.07193.022.70 | 23232323232323 | 4.060.013731.4211.940.12865.214.30 | 0.270.00181.750.740.01500.630.56 | 0.24100.29200.00190.51010.30870.14340.0352 | 0.010.05 | -0.54-0.0033-10.27-0.83-0.0261-1.60-2.11 |
| ZM_S86484/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 3.850.018629.3311.760.17696.825.47 | 0.230.00221.560.730.01340.670.67 | 11111111111111 | 3.750.018729.4611.640.17866.705.48 | 0.250.00241.700.800.01460.730.72 | 0.40030.96400.86780.73580.80600.73710.9811 | 0.100.0000-0.130.13-0.00170.12-0.01 | |
| ZM_S86486/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 11111111111111 | 4.150.015932.6510.640.16576.875.19 | 0.260.00242.061.250.01420.500.69 | 13131313131313 | 4.100.015232.0510.370.16306.644.83 | 0.240.00221.891.150.01300.460.64 | 0.64380.50290.53570.64810.68410.33960.2764 | 0.060.00070.600.270.00270.230.36 | |
| ZM_S86487/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 10101010101010 | 3.930.018832.5410.800.19197.546.10 | 0.250.002662.421.390.01270.720.90 | 14141414141414 | 3.760.016732.359.720.19057.165.38 | 0.210.00232.041.180.01080.610.76 | 0.14760.09250.86140.09910.80700.24710.0884 | 0.10.10.1 | 0.170.00210.191.070.00140.380.72 |
| ZM_S86493/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g) | 99999 | 3.660.017728.3010.610.1813 | 0.690.00413.071.990.0207 | 1515151515 | 3.940.016130.9810.520.1699 | 0.530.00312.381.540.0160 | 0.35250.35930.05480.91960.2153 | 0.1 | -0.280.0016-2.680.090.0114 |
| 谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 99 | 6.805.21 | 1.591.29 | 1515 | 6.734.98 | 1.241.00 | 0.91960.6775 | 0.070.23 | |
| ZM_S86521/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 18181818181818 | 3.580.013430.8211.110.13744.934.09 | 0200.00211.911.060.01630.660.57 | 5555555 | 3.830.015528.4011.450.14305.424.40 | 0.380.00403.632.000.03091.251.08 | 0.09650.19350.09800.66530.63820.31950.4592 | 0.10.1 | -0.25-0.00212.42-0.34-0.0057-0.49-0.31 |
| ZM_886533/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 10101010101010 | 4.040.019629.1012.560.17326.995.69 | 0.490.00332.031.440.02101.251.05 | 14141414141414 | 4.090.018329.7912.100.16846.925.47 | 0.410.00281.711.220.01771.060.89 | 0.81450.42180.45540.48210.62030.90010.6410 | -0.050.0012-0.690.460.00470.070.22 | |
| ZM_S86541/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 7777777 | 3.730.015533.4611.720.15565.794.86 | 0.260.00447.102.370.02791.061.19 | 17171717171717 | 3.800.016229.4311.380.16196.154.78 | 0.170.00284.561.520.01790.680.76 | 0.55210.69800.17520.72090.58020.41670.8680 | -0.06-0.00074.030.35-0.0064-0.360.08 | |
| ZM_S86544/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 3.890.017930.4111.520.17356.755.41 | 0.210.00282.181.000.02251.010.81 | 10101010101010 | 4.010.017831.5310.900.18047.255.56 | 0.240.00322.491.140.02561.150.93 | 0.27880.96000.33050.24520.55620.34010.7318 | -0.120.0001-1.120.62-0.0069-0.51-0.15 | |
| ZM_S86548/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g) | 1111 | 4.940.0170 | 1.180.0027 | 1313 | 4.090.0172 | 1.090.0024 | 0.13440.8392 | 0.85-0.0003 | |
| 胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 1111111111 | 34.9012.540.16197.385.89 | 2.212.700.02610.810.90 | 1313131313 | 31.2410.700.18247.465.38 | 2.032.480.02400.740.83 | 0.00170.15490.10430.83490.2321 | 0.01 | 3.661.84-0.0204-0.080.52 |
| ZM_S86551/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 9999999 | 3.760.022330.4411.320.22008.266.78 | 0.250.00311.631.180.01800.861.04 | 15151515151515 | 3.880.021331.3710.800.22008.536.71 | 0.190.00241.260.910.01390.670.80 | 0.27310.45920.19690.32280.99570.47980.8741 | -0.120.0010-0.940.510.0000-0.270.07 | |
| ZM_S86571/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 17171717171717 | 3.810.021129.7611.000.21418.146.25 | 0.200.00252.161.000.01250.530.80 | 7777777 | 3.830.021630.2511.450.21148.096.56 | 0.310.00393.361.560.01950.821.24 | 0.86700.74920.71970.48740.73650.88070.5378 | -0.02-0.0005-0.49-0.450.00270.05-0.31 | |
| ZM_S86572/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 14141414141414 | 3.910.022029.6512.210.20217.906.53 | 0.250.00201.950.970.00950.570.79 | 10101010101010 | 3.780.021228.5211.330.20917.896.05 | 0.290.00242.311.150.01120.680.94 | 0.31100.42700.28920.10320.17930.96050.2713 | 0.140.00091.120.87-0.00690.020.47 | |
| ZM_S86578/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 16161616161616 | 3.760.019529.7811.660.18887.075.80 | 0.270.00131.510.810.01040.460.36 | 8888888 | 3.550.019327.8210.890.19997.085.34 | 0.370.00192.141.150.01460.660.51 | 0.19210.73500.03950.12460.08510.96400.0423 | 0.050.10.05 | 0.210.00031.960.76-0.0110-0.010.46 |
| ZM_S87124/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 2.550.014022.7710.640.14783.763.16 | 0.290.00113.420.880.01000.480.45 | 11111111111111 | 3.570.013930.4910.730.14415.154.22 | 0.310.00123.720.960.01080.520.49 | ＜.00010.84230.00020.83540.4684＜.00010.0001 | 0.0010.0010.0010.001 | -1.03-7.71-0.090.0037-1.39-1.07 |
油和器官大小增加的例子已在若干事件中被证实。在两个独立事件ZM_S86578(p＝0.05)和ZM_S86487(p＝0.1)中，每个胚芽的油含量(毫克)增多。在事件ZM_S86481中，每个谷粒的油毫克数(p＝0.05)和谷粒油含量占干重的百分比(p＝0.01)均增加了。在三个独立事件ZM_S86521(p＝0.1)、ZM_S86548(p＝0.01)和ZM_S86578(p＝0.05)中，胚芽油含量占干重的百分比增加。在事件ZM_S86487中，胚芽重量(干重克数)(p＝0.1)和胚芽重量占谷粒总重量的百分比(p＝0.1)增加。
含pMON71279的事件的结果在表5中表示。
| 表5 pMON71279第一代单谷粒分析 | ||||||||
| 变量 | 正GOI | 负GOI | Prob＞F显著 | Delta | ||||
| n | 平均值 | LSD | n | 平均值 | LSD | |||
| LH244/ZM_S106956 | ||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 20202020202020 | 3.900.022227.8011.760.18856.147.32 | 0.130.00191.130.510.01420.480.51 | 4444444 | 3.750.023527.9011.250.20786.497.78 | 0.280.00432.521.140.03181.081.14 | 0.18400.42420.92100.24630.11970.39520.2972 | 0.15-0.0013-0.090.51-0.0193-0.35-0.45 |
| LH244/ZM_S106984 | ||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg) | 141414141414 | 3.910.023028.8411.660.19696.61 | 0.170.00211.570.900.01140.59 | 888888 | 3.990.022629.2911.310.20066.61 | 0.220.00282.081.190.01510.79 | 0.40230.78970.61590.49170.57550.9996 | -0.080.0003-0.450.36-0.00370.00 |
| 胚芽油(mg) | 14 | 7.72 | 0.53 | 8 | 7.99 | 0.71 | 0.3879 | -0.26 | |
| LH244/ZM_S106985 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 12121212121212 | 3.560.021125.4210.800.199595.366.98 | 0.180.00251.901.060.01070.580.53 | 11111111111111 | 3.380.021425.1411.110.19245.356.48 | 0.190.00261.981.110.01110.600.55 | 0.06190.79010.76790.56770.51580.95740.0682 | 0.10.1 | 0.18-0.00030.28-0.300.00350.020.50 |
| LH244/ZM_S108558 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 14141414141414 | 3.600.022926.2011.900.19306.026.92 | 0.170.00121.480.660.01370.470.48 | 10101010101010 | 3.730.022926.7111.850.19466.117.28 | 0.200.00151.750.780.01630.560.56 | 0.16300.99830.54640.88350.82760.70280.1623 | -0.130.0000-0.520.05-0.0016-0.10-0.36 | |
| ZM_S105162/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 3.680.019328.7711.300.17065.506.22 | 0.380.00322.421.160.02260.830.84 | 11111111111111 | 3.740.017928.6410.500.17095.126.33 | 0.420.00352.631.260.02460.900.92 | 0.79190.40900.91740.18720.98200.37530.796 | -0.050.00140.130.80-0.00030.38-0.11 | |
| ZM_S105166/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 9999999 | 3.370.021626.5911.170.19335.716.49 | 0.190.00332.491.030.02050.920.79 | 15151515151515 | 3.400.018228.0410.480.17215.095.88 | 0.150.00261.930.800.01590.710.61 | 0.68610.02880.19210.13910.02550.13590.0924 | 0.050.050.1 | -0.030.0034- 1.450.680.02120.610.60 |
| ZM_S105183/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％) | 181818 | 3.300.021425.30 | 0.190.00111.53 | 666 | 3.280.019223.99 | 0.330.00182.64 | 0.89780.00590.2221 | 0.01 | 0.020.00221.31 |
| 胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 18181818 | 11.650.18425.416.06 | 0.580.00860.330.39 | 6666 | 10.950.17674.615.77 | 1.000.01490.570.67 | 0.08860.21230.00170.2789 | 0.10.01 | 0.700.00750.800.29 |
| ZM_S105185/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 19191919191919 | 3.360.020125.7711.550.17435.125.84 | 0.150.00181.810.800.00970.280.31 | 5555555 | 3.220.018824.7910.970.17144.675.54 | 0.290.00343.521.560.018 80.550.60 | 0.22330.34930.47690.34470.69050.04680.2058 | 0.05 | 0.140.00130.980.580.00290.450.30 |
| ZM_S105187/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 12121212121212 | 3.380.019626.0511.470.16955.035.73 | 0.160.00322.061.320.01340.660.56 | 12121212121212 | 3.460.019226.5810.910.17485.066.03 | 0.160.00322.061.320.01340.660.56 | 0.30520.80010.60100.38720.42120.92530.2684 | -0.080.0004-0.530.56-0.0053-0.03-0.31 | |
| ZM_S105198/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 3333333 | 3.270.020024.0911.250.17834.815.79 | 0.370.00273.681.070.02101.001.14 | 21212121212121 | 3.340.019925.9710.790.18455.176.18 | 0.140.00101.390.400.00790.370.43 | 0.60270.91500.17440.25100.42100.32440.3587 | -0.070.0001-1.880.46-0.0063-0.36-0.39 | |
| ZM_S106940/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 18181818181818 | 3.770.017429.5911.070.15635.135.88 | 0.170.00251.320.870.02000.730.74 | 5555555 | 3.620.015029.789.880.15444.465.58 | 0.32000472.501.650.03801.381.41 | 0.24360.19830.84760.07520.89790.21950.5874 | 0.1 | 0.150.0024-0.191.190.00190.670.30 |
| ZM_S106960/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 12121212121212 | 3.880.021829.1111.320.19256.327.48 | 0.200.00192.200.820.00910.580.45 | 12121212121212 | 3.780.021528.6410.860.19826.157.49 | 0.200.00192.200.820.00910.580.45 | 0.35050.76160.65960.26130.20800.55470.9759 | 0.090.00030.470.46-0.00570.17-0.01 | |
| ZM_S106965/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 14141414141414 | 3.860.021729.8711.390.19126.497.39 | 0.170.00201.650.690.01570.630.75 | 10101010101010 | 3.720.021929.1711.220.19486.367.24 | 0.210.00241.950.810.01860.740.88 | 0.15100.88030.42700.63910.67520.70670.7115 | 0.14-0.00020.710.17-0.00350.130.15 | |
| ZM_S106971/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 12121212121212 | 3.730.021929.0211.000.19986.367.48 | 0.250.00171.490.780.01330.570.80 | 11111111111111 | 3.880.022928.3011.370.20206.487.88 | 0.260.00181.560.810.01390.590.83 | 0.24320.25630.33770.33510.74310.67360.3201 | -0.15-0.00100.72-0.38-0.0022-0.12-0.40 | |
| ZM_S106973/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 8888888 | 4.110.016928.4811.420.14484.886.03 | 0.460.00553.521.590.03971.821.94 | 16161616161616 | 4.160.017030.061 0.920.15325.136.40 | 0.330.00392.491.120.02811.291.37 | 0.82310.9720.29510.45930.61670.7460.6506 | -0.04-0.0001-1.570.50-0.0084-0.25-0.37 | |
| ZM_S106979/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g) | 77777 | 3.990.024430.9511.490.2139 | 0.230.00441.901.090.0382 | 1717171717 | 3.980.019031.5111.190.1702 | 0.150.00281.220.700.0245 | 0.97160.0060.47170.5110.0098 | 0.010.01 | 0.000.0054-0.560.300.0437 |
| 谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 77 | 7.528.53 | 1.321.60 | 1717 | 5.986.78 | 0.851.02 | 0.00880.013 | 0.010.05 | 1.541.75 |
| ZM_S106982/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 13131313131313 | 3.860.021728.0811.750.18416.097.08 | 0.210.00251.660.930.01700.760.61 | 11111111111111 | 3.960.021029.7011.410.18496.227.31 | 0.230.00271.801.010.01850.830.67 | 0.34650.58210.06440.47320.92440.72150.4652 | 0.1 | -0.100.0007-1.620.34-0.0008-0.14-0.23 |
| ZM_S106983/LH244 | |||||||||
| 谷粒油(％)胚芽重量(g)胚芽油(％)胚芽重量(％)谷粒重量(g)谷粒油(mg)胚芽油(mg) | 14141414141414 | 3.970.022530.3211.770.19116.837.61 | 0.150.00201.120.610.01400.640.61 | 8888888 | 4.030.021230.5411.930.17806.477.16 | 0.200.00261.490.800.01850.850.81 | 0.53230.23140.73290.64050.10930.33140.2031 | 0.1 | -0.050.0014-0.22-0.160.01320.360.45 |
油和器官大小增加的例子在若干事件中被证实。在三个独立事件ZM_S105183(p＝0.01)、ZM_S105166(p＝0.05)和ZM_S106973(p＝0.01)中，胚芽重量(干重克数)增加。在三个独立事件ZM_S105183(p＝0.01)、ZM_S105185(p＝0.05)和ZM_S106979(p＝0.01)中，每个胚芽中的油毫克数增加。在2个独立事件ZM_S105183(p＝0.1)和ZM_S106940(p＝0.1)中，胚芽重量占总谷粒重量的百分比增加。在2个独立事件ZM_S105166(p＝0.1)和ZM_S106979(p＝0.05)中，每个谷粒的油含量毫克数增加。在事件ZM_S106985(p＝0.1)中，谷粒油含量占干重的百分比增加。在2个独立事件ZM_S105166(p＝0.05)和ZM_S106979(p＝0.01)中，谷粒重量(干重克数)增加。
结果表明含pMON71270和实施例3和4中所述其它构建体的种子具有下列至少一个表型：胚芽量(占谷粒重量的百分比)增加、整个谷粒的油水平(占谷粒重量的百分比)增加、蛋白质量(例如，赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸提高)提高、游离氨基酸(向上或向下)或微量营养物含量，包括生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素、plastiquinol和叶绿醌增加。
实施例13
本实施例描述转基因玉米植物组织的组织学分析。
将新鲜或冷冻玉米的成熟或正在发育的谷粒矢向切片。在0.01％苯胺蓝C.I.42755(Baker，Phillipsburg，N.J.)溶于0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8.0.的溶液中将1mm或更薄的组织切片染色1-2分钟。在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8.0中冲洗样品，并使用精密的紫色立体闪光灯NikonV-4(EX 380-420nm，DM 430nm，BA 450nm)或紫外光源(EX330-380，DM400，BA420)，通过标准荧光显微镜检测。可选择性地，可使用氩-离子激光器(发射波长488nm和514nm)用共焦显微镜观察样品。苯胺蓝将植物的细胞壁及核染色(Smith和McCully，Stain Technology，53(2)：79-85(1978))。细胞大小是使用Nikon EZ C-1软件中的画图工具测定的。划出大约25-50个细胞，并记录细胞所占面积，计算平均面积中的细胞数。
含pMON71270事件的组织学分析得到3个事件，证实了在胚中单位面积上的细胞数明显增加(1.3x、1.7x、2.4x，p＝0.05)，而胚的质量没有减少。
含pMON71279事件的组织学分析得到3个有关每单位面积上野生型细胞数的事件(l.lx、0.97x、0.96x，p＝0.05)，但由于胚质量增加，每个胚的细胞总数也增加。
为了测定有丝分裂指数，将玉米组织固定，用荧光探针染色，使其清晰，并使用荧光显微镜或共焦扫描激光显微镜(CLSM)成像。有丝分裂指数是通过计算前期、中期或后期面积中的细胞数测定的，并以百分比表示。例如，可在福尔马林、丙酸和乙醇中固定玉米组织，用碘化丙锭染色并用二甲苯使其清晰(Running等人，ConfocalMicroscopy of the Shoot Apex，Methods in Cell Biology，49：217-229(1995))。
实施例14
本实施例描述如何测量CDK抑制剂活性。
来源于转基因和非-转基因植物组织的蛋白提取物富含CDK，其中使用p13Sucl树脂(Oncogene Sciences，Cambridge，MA)进行组蛋白H1激酶测定(Wang等人，Plant J.，15：501-510(1998))。CDK抑制剂活性增加的转基因植物组织的激酶活性降低，而CDK抑制剂活性降低的转基因植物组织的激酶活性增加。
下列参考文献特别引入此处作为参考：
Birren等人，Genorne Analysis：A Laboratry Manual Series，Volume 1，Analyzing DNA，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1997)，
Birren等人，Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，Volume 2，Detecting Genes，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1998)，
Birren等人，GenonnleAnalysis：A Laboratory Manual Series，Volunle 3，Cloning Systems，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1999)，
Birren等人，Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，Volume 4，Mapping Genomes，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1999)
Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988)
Harlow等人，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1999)
Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)
Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，Inc.，NY(1999)，和
Croy，Plant Molecular Biology Labfase，BIOS ScientificPublications，Ltd.(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)(1993)。
此处引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请、和专利引入此处作为参考，其程度就好像将每篇文献单独并特定引入此处作为参考并在此处整体提供。已经描述了本发明，其中重点在优选实施方案，可制备和使用的优选实施方案的改变对本领域普通技术人员而言是显而易见的，且可以用除此处特定描述的方案之外的方案实施本发明。本发明包括这种改变和可选择实施。因此，本发明包括由下列
权利要求限定的本发明精神和范围内的所有改变。
除非此处另有说明或明显与上下文相矛盾，描述本发明的上下文(特别是在下列权利要求)中，“一个”、“一种”和“该”以及相似指示物被解释为包括单数和双数。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即，是指“包括，但不限于，”)。除非另有说明，此处数值范围的描述仅用作单独提到落在该范围内的各独立值的概括方法，且各独立值被引入到说明书中，就好像在此处单独再次描述。除非在此处另外说明或很明显与上下文相矛盾，此处所述所有方法可以任何适宜的顺序进行。除非另有说明，此处提供的任何及所有实施例，或举例性文字(例如，“如”)的使用，仅用于更好地说明本发明且不会提出对本发明范围的限制。说明书中的所有文字都不应被解释为表示对本发明实践至关重要的任何未-要求保护的部分。
本发明的优选实施方案在此处描述，包括用于进行本发明的、本发明人已知的最佳方式。在阅读前述描述后，那些优选实施方案的改变对本领域普通技术人员而言是显而易见的。本发明人希望技术人员适当运用这种改变，且本发明人将要以除此处特定描述的方案之外的方案实施本发明。因此，本发明包括由适用法律所允许的、此处权利要求中再次描述的主题的所有改变和等同方案。此外，除此处说明或明显与上下文相矛盾外，上述其所有可能改变部分的任意组合也包括在本发明内。
序列表
<110>Savidge，Beth
Zheng，Wei
<120>用于调节玉米中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂样多肽的物质和方法
<130>REN-02-058
<150>US 60/486,935
<151>2003-07-14
<160>59
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>642
<212>DNA
<213>玉米
<400>1
atggggaagt acatgcgcaa gggcaaggtg tccggggagg tcgccgtcat ggaggtaccc 60
ggcggcgcgc tgctcggcgt ccgcacccgc tcccgcacgc tcgcgctgca gcgcgcgcag 120
aggccgctcg acaagggcga cgcggaggac gccgccgcgg agtacctcga gctcaggagc 180
cggaggctcg agaagccgca caaggagcat ccgtcgccgc ccgcgaccgc gaccaagagg 240
ggcgccggga ggaaggccgc cgccgccgcc gcggtgcagc acgtgctgat gcaggacgag 300
gtcgaggtcg aggtctcgtt cggggacaac gtgcttgact tggacaccat ggaaaggagt 360
accagagaga caacaccgtg cagcctgatt aggaacccag agatgataag caccccagga 420
tccacaacta aaagcaaaac cagcagcaac tcgacgactt cccgccgcag aacggaggaa 480
accccgagct gccggttcat accgagctcg ctcgagatgg aggagttctt ctcggcggcc 540
gagcaacagg agcagcatag cttcagggag aagtacaact tctgtcccgt gaacgactgt 600
cctctccctg gccggtacga atgggcgagg ctagactgct ag 642
<210>2
<211>213
<212>PRT
<213>玉米
<400>2
Met Gly Lys Tyr Met Arg Lys Gly Lys Val Ser Gly Glu Val Ala Val
1 5 10 15
Met Glu Val Pro Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Arg Thr Arg Ser Arg
20 25 30
Thr Leu Ala Leu Gln Arg Ala Gln Arg Pro Leu Asp Lys Gly Asp Ala
35 40 45
Glu Asp Ala Ala Ala Glu Tyr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Arg Leu Glu
50 55 60
Lys Pro His Lys Glu His Pro Ser Pro Pro Ala Thr Ala Thr Lys Arg
65 70 75 80
Gly Ala Gly Arg Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gln His Val Leu
85 90 95
Met Gln Asp Glu Val Glu Val Glu Val Ser Phe Gly Asp Asn Val Leu
100 105 110
Asp Leu Asp Thr Met Glu Arg Ser Thr Arg Glu Thr Thr Pro Cys Ser
115 120 125
Leu Ile Arg Asn Pro Glu Met Ile Ser Thr Pro Gly Ser Thr Thr Lys
130 135 140
Ser Lys Thr Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ser Arg Arg Arg Thr Glu Glu
145 150 155 160
Thr Pro Ser Cys Arg Phe Ile Pro Ser Ser Leu Glu Met Glu Glu Phe
165 170 175
Phe Ser Ala Ala Glu Gln Gln Glu Gln His Ser Phe Arg Glu Lys Tyr
180 185 190
Asn Phe Cys Pro Val Asn Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp
195 200 205
Ala Arg Leu Asp Cys
210
<210>3
<211>654
<212>DNA
<213>玉米
<400>3
atggggaagt acatgcgcaa gggcaagatg tccggggagg tggccgtcat ggaggtcccc 60
ggcggcgcgc tgctgggtgt ccgcacccgc tcccgcacgc tcgcgctgca gagggcgcag 120
aggccgctcg acaaggggga cgcggatgac gccgccggac agtacctcga gctcaggagc 180
cggaggctcg agaagcctca taaggaccat cagccgctgc cgctgccgct gccgccgccc 240
gcccccgcag ccaagagggg cgccgggagg aaggccgcct ccaccgccgc cgcgccaaac 300
gcgctggcgg aggacgaggt cgaggtcgag gtctccttcg gggagaacgt gcttgacttg 360
gacgccatgg aaaggagtac cagagagaca acaccgtgta gtttgatcag gaacccagag 420
atgataagca ccccaggatc cacaactaaa agtaaaacca gcaactcgac gacttcccgt 480
cgcaggatgg aaacctcagt ctgccgtttc ataccgagtt cgctcgagat ggaagagttc 540
ttctcggccg ctgaacaaca ggagcagcat aacttcaggg agaagtataa cttctgtcct 600
gtgaacgact gccctctccc gggtcgatat gagtgggcga ggctagactg ttag 654
<210>4
<211>217
<212>PRT
<213>玉米
<400>4
Met Gly Lys Tyr Met Arg Lys Gly Lys Met Ser Gly Glu Val Ala Val
1 5 10 15
Met Glu Val Pro Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Arg Thr Arg Ser Arg
20 25 30
Thr Leu Ala Leu Gln Arg Ala Gln Arg Pro Leu Asp Lys Gly Asp Ala
35 40 45
Asp Asp Ala Ala Gly Gln Tyr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Arg Leu Glu
50 55 60
Lys Pro His Lys Asp His Gln Pro Leu Pro Leu Pro Leu Pro Pro Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Lys Arg Gly Ala Gly Arg Lys Ala Ala Ser Thr Ala
85 90 95
Ala Ala Pro Asn Ala Leu Ala Glu Asp Glu Val Glu Val Glu Val Ser
100 105 110
Phe Gly Glu Asn Val Leu Asp Leu Asp Ala Met Glu Arg Ser Thr Arg
115 120 125
Glu Thr Thr Pro Cys Ser Leu Ile Arg Asn Pro Glu Met Ile Ser Thr
130 135 140
Pro Gly Ser Thr Thr Lys Ser Lys Thr Ser Asn Ser Thr Thr Ser Arg
145 150 155 160
Arg Arg Met Glu Thr Ser Val Cys Arg Phe Ile Pro Ser Ser Leu Glu
165 170 175
Met Glu Glu Phe Phe Ser Ala Ala Glu Gln Gln Glu Gln His Asn Phe
180 185 190
Arg Glu Lys Tyr Asn Phe Cys Pro Val Asn Asp Cys Pro Leu Pro Gly
195 200 205
Arg Tyr Glu Trp Ala Arg Leu Asp Cys
210 215
<210>5
<211>342
<212>DNA
<213>玉米
<400>5
ttatcagtca tcacctccca actcgcaacg cacccacagt ccctcaccgg ctcaccgccc 60
gcaccgcaca caggcgccac gaagcagaaa agtatggccg ctgccacagc gacggcggcg 120
gtgctgggat gcagcaggcg ccagagcgac attgcgggcg ccggcatacc gaagaaggga 180
aaggtgggga ggtcgccgcc ggcggaggag gtggaggcgt tcctcgccgc agcggagcgc 240
ggcatggcgc ggcgcttcgc ggtcaagtac aactatgacg tcgtcaagga cgctcccatg 300
gacggcggcc ggtacgagtg ggtccgagtg cggcccggtt aa 342
<210>6
<211>129
<212>PRT
<213>玉米
<400>6
Ala Cys Arg Tyr Arg Ser Gly Ile Pro Gly Ser Thr His Ala Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ser Val Ile Thr Ser Gln Leu Ala Thr His Pro Gln Ser Leu Thr
20 25 30
Gly Ser Pro Pro Ala Pro His Thr Gly Ala Thr Lys Gln Lys Ser Met
35 40 45
Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ala Val Leu Gly Cys Ser Arg Arg Gln
50 55 60
Ser Asp Ile Ala Gly Ala Gly Ile Pro Lys Lys Gly Lys Val Gly Arg
65 70 75 80
Ser Pro Pro Ala Glu Glu Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Glu Arg
85 90 95
Gly Met Ala Arg Arg Phe Ala Val Lys Tyr Asn Tyr Asp Val Val Lys
100 105 110
Asp Ala Pro Met Asp Gly Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg Val Arg Pro
115 120 125
Gly
<210>7
<211>573
<212>DNA
<213>玉米
<400>7
atgggcaagt acatgcgcaa ggccaaggct tccagcgagg ttgtcatcat ggatgtcgcc 60
gccgctccgc tcggagtccg cacccgagcg cgcgccctcg cgctgcagcg tctgcaggag 120
caacagacgc agtgggaaga aggtgctggc ggcgagtacc tggagctaag gaaccggagg 180
ctcgagaagc tgccgccgcc gccggcgacc actaggaggt cgggcgggag gaaagcggca 240
gccgaggccg ccgcaactaa ggaggctgag gcgtcgtacg gggagaacat gctcgagttg 300
gaggccatgg agaggattac cagggagacg acgccttgca gcttgattaa cacccagatg 360
actagcactc ctgggtccac gagatccagc cactcttgcc accgcagggt gaacgctcct 420
ccggtgcacg ccgtcccaag ttctagggag atgaatgagt acttcgctgc cgaacagcga 480
cggcaacagc aggatttcat tgacaagtac aacttcgatc ctgcaaacga ctgccctctc 540
ccaggcaggt ttgagtgggt gaagctagac tga 573
<210>8
<211>190
<212>PRT
<213>玉米
<400>8
Met Gly Lys Tyr Met Arg Lys Ala Lys Ala Ser Ser Glu Val Val Ile
1 5 10 15
Met Asp Val Ala Ala Ala Pro Leu Gly Val Arg Thr Arg Ala Arg Ala
20 25 30
Leu Ala Leu Gln Arg Leu Gln Glu Gln Gln Thr Gln Trp Glu Glu Gly
35 40 45
Ala Gly Gly Glu Tyr Leu Glu Leu Arg Asn Arg Arg Leu Glu Lys Leu
50 55 60
Pro Pro Pro Pro Ala Thr Thr Arg Arg Ser Gly Gly Arg Lys Ala Ala
65 70 75 80
Ala Glu Ala Ala Ala Thr Lys Glu Ala Glu Ala Ser Tyr Gly Glu Asn
85 90 95
Met Leu Glu Leu Glu Ala Met Glu Arg Ile Thr Arg Glu Thr Thr Pro
100 105 110
Cys Ser Leu Ile Ash Thr Gln Met Thr Ser Thr Pro Gly Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser His Ser Cys His Arg Arg Val Asn Ala Pro Pro Val His Ala
130 135 140
Val Pro Ser Ser Arg Glu Met Asn Glu Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Arg
145 150 155 160
Arg Gln Gln Gln Asp Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Ala Asn
165 170 175
Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Val Lys Leu Asp
180 185 190
<210>9
<211>651
<212>DNA
<213>玉米
<400>9
atgggcaagt gcgtgaggat ccgcggcagc agcaagccgc gcgccgccgc cgccgcggcg 60
gcgtcgtgcc tcacgctgtg cagcgggcgc cgcgtgccgc cgtcggaggc gtcggcggcg 120
tgcagcccga ggacgagaag caggccgcgg cgccaccgcg gggcaggcct ccggcggtgg 180
tgcggcgcca aggagagcgc gtacggcggc agcccccggc gccacagggg cgagggcgag 240
gccgacgcgc ggagcccccg tggccgggtg ctcggtgtcg gtgcccgcca gcagcagctc 300
tgcgccgacg acgggctcgg ccagcagcac gaggaggagg cgtctgcgac gatggccggc 360
gactgcgacg acggcgcggg cgtggcgaaa gtgaataagg cgaataaaca cgagaacgac 420
gagtgcggct gccgcgtcgt cggcggcgtc gccagccaga cgccgtcgcc gtcgccgtcg 480
ccgccaccgc cgccgacgga aaccgagata gaggccttct tcgcggacgc ggagctggcc 540
gagcgccggc gattcgcaga ggcgtacaat tacgacgtcg ccctcgaccg cccgctggag 600
gggcgcttcg agtgggtgcc gctgccgctg acggggggtc ggaggtggta a 651
<210> 10
<211>216
<212>PRT
<213>玉米
<400>10
Met Gly Lys Cys Val Arg Ile Arg Gly Ser Ser Lys Pro Arg Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Ser Cys Leu Thr Leu Cys Ser Gly Arg Arg Val
20 25 30
Pro Pro Ser Glu Ala Ser Ala Ala Cys Ser Pro Arg Thr Arg Ser Arg
35 40 45
Pro Arg Arg His Arg Gly Ala Gly Leu Arg Arg Trp Cys Gly Ala Lys
50 55 60
Glu Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Pro Arg Arg His Arg Gly Glu Gly Glu
65 70 75 80
Ala Asp Ala Arg Ser Pro Arg Gly Arg Val Leu Gly Val Gly Ala Arg
85 90 95
Gln Gln Gln Leu Cys Ala Asp Asp Gly Leu Gly Gln Gln His Glu Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Ala Thr Met Ala Gly Asp Cys Asp Asp Gly Ala Gly Val
115 120 125
Ala Lys Val Asn Lys Ala Asn Lys His Glu Asn Asp Glu Cys Gly Cys
130 135 140
Arg Val Val Gly Gly Val Ala Ser Gln Thr Pro Ser Pro Ser Pro Ser
145 150 155 160
Pro Pro Pro Pro Pro Thr Glu Thr Glu Ile G1u Ala Phe Phe Ala Asp
165 170 175
Ala Glu Leu Ala Glu Arg Arg Arg Phe Ala G1u Ala Tyr Asn Tyr Asp
180 185 190
Val Ala Leu Asp Arg Pro Leu Glu Gly Arg Phe Glu Trp Val Pro Leu
195 200 205
Pro Leu Thr Gly Gly Arg Arg Trp
210 215
<210>11
<211>765
<212>DNA
<213>玉米
<400>11
atggggaagt acatgogcaa gtgcaggggc gccgcaggcg cggaggtcge cgccgtcgag 60
gttacgcagg tcgtcggcgt ccggacgagg tccaggtccg cggcggcgac cggcggtgtc 120
gcgaaggtcg ccccgaggag gaagagggcg ccggcggggg arcctgctgc cgccgtgagc 180
gctggtgggg acggcggaag ctgctacatc cacctgcgta gccgcatgct gttcatggca 240
ccgcctcagc cgcagccgtc ggttccgacc ccggcggcgg aggctgctga tggcgctgca 300
ggacagcagg gcgcggtgct cgcggccggg ctctcgcgct gctccagcac ggcgtcgtcg 360
gtgaacttgg ggttgggggg tcagcgcggg agccacacct gccgctccga cgacgctgca 420
gaggctggcg gggatcacgt cctggtggtg gatgtctcgg cgagcaactc cgggagcggc 480
ccagaccgcg agaggagaga gacgacgcca tcgagccggg cgcacggcga gctcagcgat 540
ctggagtcgg atctggcggg gcacaagact ggcccgtcgc taccggcggc aacgccggct 600
gcggagctga tcgtgccgcc agcacacgag atccaggagt tcttcgccgc cgccgaggcg 660
gcccaggcca agcgctttgc ttccaagtac aacttcgact tcgtccgcgg cgtgcccctc 720
gacgccggcg gccggttcga gtgggcgccg gtggtcagca tctga 765
<210>12
<211>254
<212>PRT
<213>玉米
<400>12
Met Gly Lys Tyr Met Arg Lys Cys Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Val Glu Val Thr Gln Val Val Gly Val Arg Thr Arg Ser Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Ala Thr Gly Gly Val Ala Lys Val Ala Pro Arg Arg Lys
35 40 45
Arg Ala Pro Ala Gly Glu Pro Ala Ala Ala Val Ser Ala Gly Gly Asp
50 55 60
Gly Gly Ser Cys Tyr Ile His Leu Arg Ser Arg Met Leu Phe Met Ala
65 70 75 80
Pro Pro Gln Pro Gln Pro Ser Val Pro Thr Pro Ala Ala Glu Ala Ala
85 90 95
Asp Gly Ala Ala Gly Gln Gln Gly Ala Val Leu Ala Ala Gly Leu Ser
100 105 110
Arg Cys Ser Ser Thr Ala Ser Ser Val Asn Leu Gly Leu Gly Gly Gln
115 120 125
Arg Gly Ser His Thr Cys Arg Ser Asp Asp Ala Ala Glu Ala Gly Gly
130 135 140
Asp His Val Leu Val Val Asp Val Ser Ala Ser Asn Ser Gly Ser Gly
145 150 155 160
Pro Asp Arg Glu Arg Arg Glu Thr Thr Pro Ser Ser Arg Ala His Gly
165 170 175
Glu Leu Ser Asp Leu Glu Ser Asp Leu Ala Gly His Lys Thr Gly Pro
180 185 190
Ser Leu Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Leu Ile Val Pro Pro Ala
195 200 205
His Glu Ile Gln Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gln Ala Lys
210 215 220
Arg Phe Ala Ser Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Val Arg Gly Val Pro Leu
225 230 235 240
Asp Ala Gly Gly Arg Phe Glu Trp Ala Pro Val Val Ser Ile
245 250
<210>13
<211>717
<212>DNA
<213>玉米
<400>13
gtcgccgccg tcgaggttac gcaggtcgtc ggcgtccgca cgaggtccag gtccgcggcg 60
gcgaccggcg gtgtcgcgaa ggtcgtcgcc ccgaggagga agagggcgcc ggcgggggag 120
cctgctgcct ccgtgggcgc tggtggggac ggcggaagct gctacatcca cctgcgtagc 180
cgcatgctgt tcatggcacc gcctcagccg cagccgccgt cggttccgac cccggcggag 240
gctgctgatg gcgctgcagg acagcagggc gcggcgctcg cggccgggct ctcgcgttgc 300
tccagcacgg cgtcgtcggt gcacgtgggg ggtcagcgcg ggagccacac ctgccgctcc 360
gacgacgctg cagaggctgg cggggatcac gtcctggtgg atgtctcggc ggcgagcaac 420
tccgggagcg gcccagaccg cgagaggcga gagacgacgc catcgagccg ggcgcacggc 480
gagctcagcg atctggagtc ggatctggcg gggcacaaga ctggcccgtc gctaccggcg 540
gcaacgccgg ctgcggagct gatcgtgccg ccagcacacg agatccagga gttcttcgcc 600
gccgccgagg cggcccaggc caagcgcttt gcttccaagt acaacttcga cttcgtccgt 660
ggcgtgcccc tcgacgccgg cggccggttc gagtgggcgc cggtggtcag catctga 717
<210>14
<211>238
<212>PRT
<213>玉米
<400>14
Val Ala Ala Val Glu Val Thr Gln Val Val Gly Val Arg Thr Arg Ser
1 5 10 15
Arg Ser Ala Ala Ala Thr Gly Gly Val Ala Lys Val Val Ala Pro Arg
20 25 30
Arg Lys Arg Ala Pro Ala Gly Glu Pro Ala Ala Ser Val Gly Ala Gly
35 40 45
Gly Asp Gly Gly Ser Cys Tyr Ile His Leu Arg Ser Arg Met Leu Phe
50 55 60
Met Ala Pro Pro Gln Pro Gln Pro Pro Ser Val Pro Thr Pro Ala Glu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Gly Ala Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala Gly
85 90 95
Leu Ser Arg Cys Ser Ser Thr Ala Ser Ser Val His Val Gly Gly Gln
100 105 1l0
Arg Gly Ser His Thr Cys Arg Ser Asp Asp Ala Ala Glu Ala Gly Gly
115 120 125
Asp His Val Leu Val Asp Val Ser Ala Ala Ser Asn Ser Gly Ser Gly
130 135 140
Pro Asp Arg Glu Arg Arg Glu Thr Thr Pro Ser Ser Arg Ala His Gly
145 150 155 160
Glu Leu Ser Asp Leu Glu Ser Asp Leu Ala Gly His Lys Thr Gly Pro
165 170 175
Ser Leu Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Leu Ile Val Pro Pro Ala
180 185 190
His Glu Ile Gln Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gln Ala Lys
195 200 205
Arg Phe Ala Ser Lys Tyr Ash Phe Asp Phe Val Arg Gly Val Pro Leu
210 215 220
Asp Ala Gly Gly Arg Phe Glu Trp Ala Pro Val Val Ser Ile
225 230 235
<210>15
<211>699
<212>DNA
<213>玉米
<400>15
atggggaagt acatgcgcaa gcgcaggggg gccgcgggcg agggggtggc cgcagtcgag 60
gtctcgcagg tcgtcggcgt ccggacgagg tccaggtccg cggcggcgac cggcggcggt 120
gtcgcgaagg tcgctccgcc gaggaggaag aaggcgctgc tgcccgccgc gaacgagacg 180
gcgtcggggg agcctggtgc cgtgggcggt ggtggtgggg acggcggaag ctgctgctac 240
atccacctgc ggagccgcat gctgttcatg gcagcacctc agcagcaacc gtcggcggct 300
ccgacgcccg cggaggctgc tggtgcggca cagcagggcg gggtggtggc gctcgcggct 360
ggcctctcgc gttgctccag cacggcgtcg acggtggacg tcgggggcca gcagcccgcg 420
agcgggagcc acgcctgccg ctccgacgct gcggaggttg ccggggatca cgtcccggat 480
gtcgtcaccg cgagcaactc ggggagcgtc ccggaccgcg agaggagaga gacgacgcca 540
tcgtcgagcc gggcgcacgg cggcgagctc agcgatctgg agtcggatct ggtggggtgg 600
cagaagactg gctgctcgtc gtcgccggcg acaacaacgt cggctgcgga gctgatcgtg 660
ccgccagcac aggagatcca ggaattcttc gcggccgct 699
<210>16
<211>232
<212>PRT
<213>玉米
<400>16
Met Gly Lys Tyr Met Arg Lys Arg Arg Gly Ala Ala Gly Glu Gly Val
1 5 10 15
Ala Ala Val Glu Val Ser Gln Val Val Gly Val Arg Thr Arg Ser Arg
20 25 30
Ser Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly Val Ala Lys Val Ala Pro Pro Arg
35 40 45
Arg Lys Lys Ala Leu Leu Pro Ala Ala Asn Glu Thr Ala Ser Gly Glu
50 55 60
Pro Gly Ala Val Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Ser Cys Cys Tyr
65 70 75 80
lle His Leu Arg Ser Arg Met Leu Phe Met Ala Ala Pro Gln Gln Gln
85 90 95
Pro Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Glu Ala Ala Gly Ala Ala Gln Gln
100 105 110
Gly Gly Val Val Ala Leu Ala Ala Gly Leu Ser Arg Cys Ser Ser Thr
115 120 125
Ala Ser Thr Val Asp Val Gly Gly Gln Gln Pro Ala Ser Gly Ser His
130 135 140
Ala Cys Arg Ser Asp Ala Ala Glu Val Ala Gly Asp His Val Pro Asp
145 150 155 160
Val Val Thr Ala Ser Asn Ser Gly Ser Val Pro Asp Arg Glu Arg Arg
165 170 175
Glu Thr Thr Pro Ser Ser Ser Arg Ala His Gly Gly Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Leu Glu Ser Asp Leu Val Gly Trp Gln Lys Thr Gly Cys Ser Ser Ser
195 200 205
Pro Ala Thr Thr Thr Ser Ala Ala Glu Leu Ile Val Pro Pro Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Gln Glu Phe Phe Ala Ala
225 230
<210>17
<211>183
<212>DNA
<213>玉米
<400>17
cactcttccc accgcagggt gaaagctcct cctgtgcacg ccctcccaag ttcaacggag 60
atgaacgagt acttcgctgc tgaacagcga cgccaacaac aggctttcat tgacaagtac 120
aactttgatc ctgtaaatga ctgccctctc ccaggcaggt ttgaatgggt gaagctagac 180
tga 183
<210>18
<211>60
<212>PRT
<213>玉米
<400>18
His Ser Ser His Arg Arg Val Lys Ala Pro Pro Val His Ala Leu Pro
1 5 10 15
Ser Ser Thr Glu Met Asn Glu Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Arg Arg Gln
20 25 30
Gln Gln Ala Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn Asp Cys
35 40 45
Pro Leu Pro Gly Arg Phe Glu Trp Val Lys Leu Asp
50 55 60
<210>19
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>19
gcagcaactc gacgacttcc cgccgcagaa cggaggaaac cccgagctgc cggttcatac 60
cgagctcgct cgagatggag gagttcttct cggcggccga gcaacaggag cagcatagct 120
tcagggagaa gtacaacttc tgtcccgtga acgactgtcc tctccctggc cggtacgaat 180
gggcgaggct agactgctag 200
<210>20
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>20
aactaaaagt aaaaccagca actcgacgac ttcccgtcgc aggatggaaa cctcagtctg 60
ccgtttcata ccgagttcgc tcgagatgga agagttcttc tcggccgctg aacaacagga 120
gcagcataac ttcagggaga agtataactt ctgtcctgtg aacgactgcc ctctcccggg 180
tcgatatgag tgggcgaggc 200
<210>21
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>21
agagcgacat tgcgggcgcc ggcataccga agaagggaaa ggtggggagg tcgccgccgg 60
cggaggaggt ggaggcgttc ctcgccgcag cggagcgcgg catggcgcgg cgcttcgcgg 120
tcaagtacaa ctatgacgtc gtcaaggacg ctcccatgga cggcggccgg tacgagtggg 180
tccgagtgcg gcccggttaa 200
<210>22
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>22
ggtccacgag atccagccac tcttgccacc gcagggtgaa cgctcctccg gtgcacgccg 60
tcccaagttc tagggagatg aatgagtact tcgctgccga acagcgacgg caacagcagg 120
atttcattga caagtacaac ttcgatcctg caaacgactg ccctctccca ggcaggtttg 180
agtgggtgaa gctagactga 200
<210>23
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>23
ccagccagac gccgtcgccg tcgccgtcgc cgccaccgcc gccgacggaa accgagatag 60
aggccttctt cgcggacgcg gagctggccg agcgccggcg attcgcagag gcgtacaatt 120
acgacgtcgc cctcgaccgc ccgctggagg ggcgcttcga gtgggtgccg ctgccgctga 180
cggggggtcg gaggtggtaa 200
<210>24
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>24
ccatcgagcc gggcgcacgg cgagctcagc gatctggagt cggatctggc ggggcacaag 60
actggcccgt cgctaccggc ggcaacgccg gctgcggagc tgatcgtgcc gccagcacac 120
gagatccagg agttcttcgc cgccgccgag gcggcccagg ccaagcgctt tgcttccaag 180
tacaacttcg acttcgtccg 200
<210>25
<211>200
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>25
tcggggagcg tcccggaccg cgagaggaga gagacgacgc catcgtcgag ccgggcgcac 60
ggcggcgagc tcagcgatct ggagtcggat ctggtggggt ggcagaagac tggctgctcg 120
tcgtcgccgg cgacaacaac gtcggctgcg gagctgatcg tgccgccagc acaggagatc 180
caggaattct tcgcggccgc 200
<210>26
<211>183
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>26
cactcttccc accgcagggt gaaagctcct cctgtgcacg ccctcccaag ttcaacggag 60
atgaacgagt acttcgctgc tgaacagcga cgccaacaac aggctttcat tgacaagtac 120
aactttgatc ctgtaaatga ctgccctctc ccaggcaggt ttgaatgggt gaagctagac 180
tga 183
<210>27
<211>804
<212>DNA
<213>玉米
<400>27
accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60
tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120
atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180
ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240
tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300
gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360
gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420
tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480
acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540
cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600
tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660
ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720
cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780
cattgtaatg cagataccaa gcgg 804
<210>28
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>28
gcaaggcctg cagcaactcg acgacttccc gccgcagaac ggag 44
<210>29
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>29
cgtcgagttg ctggttttac ttttagttct agcagtctag cctcgcccat 50
<210>30
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>30
atgccggcgc ccgcaatgtc gctctgcctc gcccactcat atcga 45
<210>31
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>31
gctagatcta gagcgacatt gcgggcgccg gcat 34
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>32
ggctggatct cgtggacctt aaccgggccg cactcgga 38
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>33
gctggatcct cagtctagct tcacccact 29
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>34
gctagatctt cagtctagct tcacccact 29
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>35
gctggatcct gcagggcctc gcccactcat atcga 35
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>36
gctagatcta ccgtcttcgg tacgcgctca ctc 33
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>37
gctggatccc cgcttggtat ctgcattac 29
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>38
gcaccatggc cagccagacg ccgtcgccgt 30
<210>39
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>39
cgccgtgcgc ccggctcgat ggttaccacc tccgaccccc cgtc 44
<210>40
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>40
cgcggtccgg gacgctcccc gacggacgaa gtcgaagttg tac 43
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>41
gctagatctt cggggagcgt cccggaccgc g 31
<210>42
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>42
caccctgcgg tgggaagagt ggcggccgcg aagaattcct gga 43
<210>43
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>43
gagcgcgtac cgaagacggt tcagtctagc ttcacccatt c 41
<210>44
<211>105
<212>DNA
<213>玉米
<400>44
caggattccc cttgcgactg caccacgccc cacccaaacc cacctaccgc ctccgctccc 60
ctctccagcg agtcgggggc acggacggga ccagacgacc aggcc 105
<210>45
<211>363
<212>DNA
<213>玉米
<400>45
attccccacc cagcacaaga gcaccattga tctgattgat atgtgtctac cacaccacaa 60
tgtgactagc tccgccgccg ccgccgtgga ccgtggagga ggcgcaacca actgtggatc 120
tcgatcgcat tagctttgtt gtctgttgta aaaattagag tagttagctt tgtagccgga 180
tgaatgatct tgtgtaacca acaggcgtgg ttcacccctg gtcacacaac ctcactgtaa 240
cctgttaact gctcaagctg ctgtaaccga accaatctca tgtacgtagg cctagcgcag 300
tcttctcatc tgttcgtagc tctcgaaatt gattgaatgg aattagagtt aaaatttgca 360
tgg 363
<210>46
<211>115
<212>DNA
<213>玉米
<400>46
cccacaccca cctacctacc tacctaccac caacgcctcg gctcccctct ccagcgagcc 60
gcgaccgcgc ggcaggggaa gcttagcacg gacgggacca gctgacgacc aggcc 115
<210>47
<211>340
<212>DNA
<213>玉米
<400>47
attcctccaa gcacaagagc accatttatc tgatgtgtct accacatgac tagcgccgcc 60
gccgccgccg aggaggcgta atcaactgga tcgcattagc tttcttgcct gttgtaaaaa 120
ttagagtagt tagcctgtag ttgaatggtc ctgtgtaacg aaacaggcgt ggttctgagt 180
tacaccccga tccccaacct cactgtaacc gtttgactgc tcgctcaagc tgtagccgaa 240
ccatccatct caagtagcgt aggcctagcg tattcatctg ttcctagttc tagttcttga 300
atggattaat cgaatgagat cattgttaga atctgcatgg 340
<210>48
<211>196
<212>DNA
<213>玉米
<400>48
ctgccagatc caatccaaga ggtcgcctcg tgtcctctcc tgtctgtctc tacttctctt 60
gtaaaagtcg cttactaccc gtgtaacgct tcgcttagct gtaactaaat tatgctcacg 120
agatgggatt aatcatgtga aggcccaacc ttgtacgtta gtggtgtgcg gttaacgtgt 180
ccttccttag tccaga 196
<210>49
<211>217
<212>DNA
<213>玉米
<400>49
gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccct cgaggccggc cgggtctccc 60
tcgttatttc cgggctccct cctgtgtaca ccactcccgc cccgcccacc attttatccc 120
cgcctctcct ggcctctgcc gccccgtcgc acagaatcgc ttggtgcacc ctgcgagggc 180
ctcctcgaaa ccctagcttg cccagcccct ccgggcc 217
<210>50
<211>338
<212>DNA
<213>玉米
<400>50
tggattcaga gggacgagag agcagcaggc atggaatgga actcaccccc cgctccctcc 60
acaccacccc agcgttgtgg cagaggcgca taccgtcgtg ttagcttcgt ttctgctgta 120
aaaaaaaccc ttagtgtttt atttagcatg tagccttaac tggtcgtgtg ttacagtaca 180
gaactgatgc tgagttacaa caccctgatc tgatccctca actccaatgt aacccttaac 240
agctcattct gtaaggaacc tgtcaccctg ttacctgttg ctgaactaat gaagtagagc 300
tagataatga cgttttatcg tagttattat taataact 338
<210>51
<211>120
<212>DNA
<213>玉米
<400>51
tggtacgcct gcaggtaccg gtccggaatt cccgggtcga cccacgcgtc cggccacggc 60
accgcaccac acgcagagcg gcagaggcac accagcagcg caaccggccg cgcgtgatcg 120
<210>52
<211>201
<212>DNA
<213>玉米
<400>52
acccgtcaca gtccgttcgt taacctcaag gtcaagcagc tagcaatgct ctcctccgac 60
caccctcagc tggcaaactt caaactggag tcatcactca tcagtagtgc tgattattat 120
cctcccctga tgtcgtacgt tatttttttg tagactgtca ctcatccatc actacccctt 180
aattagcttt attattagcg t 201
<210>53
<211>191
<212>DNA
<213>玉米
<400>53
tgcaggtacc ggtccggaat tcccgggtcg acccacgcgt ccggtctgtg tgtttgtgat 60
agaatccaaa gacgcaagcg gctgcaggca gcagcgccgc gcaggcgttg tggcctgtgg 120
gagaggaaaa agagaaagag gaaccggcca agacaagcaa gcgagaggcc agggccgcgg 180
cgttgcgtca g 191
<210>54
<211>333
<212>DNA
<213>玉米
<400>54
agcgagcgtg cgtccggtgc aaggtgaagc tagaaagaga aaagatgccc ccaacaaaca 60
taacggagaa gagaaaaacc aaacaattaa gcagctttat agcctaagct aaccaccacc 120
attcatctcg tccaaatgcc ttgcttttct ctggagctag caggagcgcg tagttattta 180
gtactacttt acttattcag aggttatctt gaccccgata gatcaatccg cttactgtgt 240
aatttgtctc atgcatctct tagatggagt ttaatcgtct taatttactg tacagcagct 300
tgctggcttg caaagaaaga tctggtttgt ctc 333
<210>55
<211>191
<212>DNA
<213>玉米
<400>55
tgcaggtacc ggtccggaat tcccgggtcg acccacgcgt ccggtctgtg tgtttgtgat 60
agaatccaaa gacgcaagcg gctgcaggca gcagcgccgc gcaggcgttg tggcctgtgg 120
gagaggaaaa agagaaagag gaaccggcca agacaagcaa gcgagaggcc agggccgcgg 180
cgttgcgtca g 191
<210>56
<211>333
<212>DNA
<213>玉米
<400>56
agcgagcgtg cgtccggtgc aaggtgaagc tagaaagaga aaagatgccc ccaacaaaca 60
taacggagaa gagaaaaacc aaacaattaa gcagctttat agcctaagct aaccaccacc 120
attcatctcg tccaaatgcc ttgcttttct ctggagctag caggagcgcg tagttattta 180
gtactacttt acttattcag aggttatctt gaccccgata gatcaatccg cttactgtgt 240
aatttgtctc atgcatctct tagatggagt ttaatcgtct taatttactg tacagcagct 300
tgctggcttg caaagaaaga tctggtttgt ctc 333
<210>57
<211>182
<212>DNA
<213>玉米
<400>57
ggtaccggtc cggaattccc gggtcgaccc acgcgtccga gaatccaaag cgcaagcggc 60
tgcagcctgc aggcagcgcc gcgcaggcgt gggagtggcc gagtgggagt gggagtgaaa 120
aagaggaacc ggccaagaga agcaagcgag aagaaggcag tgctgcggcg gcgttccgta 180
ag 182
<210>58
<211>300
<212>DNA
<213>玉米
<400>58
tagattcaga ggacatgaga gcagcagcat ggaactcacc tccgctccct ccaccgccgc 60
agcgtcgtgg cagaggcgca taccatcgtg ttagctttgt ttctgttgta aaaacttagc 120
gttagcttgt agccttaatt gtcgcgtgtc acagtacaga actgatgctg agttacagca 180
ccctgatatg atctggtccc tcaactccaa tgtaaccctt aacagctcat tctgtaagga 240
acctatcatc ctgttaccag ttgccgaatt aatgaagtag agctagataa tgatgttctg 300
<210>59
<211>46
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>共有序列
<400>59
Pro Thr Thr Ala Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ser Glu Ala Glu Glu Gln
1 5 10 15
Gln Gln Lys Gln Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Asn Asp
20 25 30
Glu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu Lys Pro
35 40 45
Claims (31)
1.包含选自下组的DNA的分离或纯化核酸分子：
(i)SEQ ID NOs：1、3和9的核苷酸序列，以及与其具有至少约70％序列同一性的DNA，
(ii)编码选自SEQ ID NOs：2、4和10的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)所编码的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：2、4和10的氨基酸序列具有至少约70％同一性且具有CDK抑制剂样活性的核苷酸序列，和
(iv)(i)-(iii)任何一个的片段，其中所述片段包含SEQ ID NOs：1或3的至少35个连续核苷酸或SEQ ID NO：9的至少120个连续核苷酸。
2.权利要求1的分离或纯化核酸分子，与优先在玉米雄性生殖组织中表达的启动子可操作性连接。
3.权利要求2的分离或纯化核酸分子，其中该启动子是玉米的SILKY1启动子、烟草的NTM19启动子、玉米的PCAS5启动子、烟草的NPG1启动子、鼠耳芥属的AP3启动子、芸苔属的Bgpl启动子、花药-优选的启动子、花粉-优选的启动子、或小孢子-优选的启动子。
4.包含权利要求1-3任何一项的分离或纯化核酸分子的载体。
5.包含任选为载体形式的权利要求1-3任何一项的分离或纯化核酸分子的宿主细胞。
6.包含与权利要求1-3任何一项的分离或纯化核酸分子互补或反义的序列的分离或纯化核酸分子，且其中所述分离或纯化核酸分子任选为载体形式。
7.由权利要求1-3任何一项的分离或纯化核酸分子编码的分离或纯化多肽。
8.包含至少一个可转录核苷酸序列的核酸构建体，其表达导致选自下组的内源性核酸的抑制：
SEQ ID NO：1[ZmKRP1]，编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：3[ZmKRP2]，和编码SEQ IDNO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
其是单独的或与选自下组的至少一个其它核苷酸序列组合：SEQID NO：5[ZmKRP3]，编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：7[ZmKRP4]，编码SEQ ID NO：8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：9[ZmKRP5]，编码SEQ IDNO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：11[ZmKRP6]，编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：13[ZmKRP7]，编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO：15[ZmKRP8]，编码SEQ IDNO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO：17[ZmKRP9]，和编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，
其中，当该核酸构建体包含两个或多个可转录核苷酸序列时，该核苷酸序列可以任何顺序存在于核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
9.权利要求8的核酸构建体，其进一步包含优先在玉米谷粒的胚芽和/或糊粉中表达的启动子且该启动子与至少一个可转录核苷酸序列可操作性连接。
10.权利要求9的核酸构建体，其中该启动子是玉米的油质蛋白启动子、玉米的球蛋白启动子、玉米的MIP合酶启动子、大麦的Per1启动子、来源于稻的胚-优选的启动子如P-Os.CPC214或来源于玉米的胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1或P-Zm.CPC214tr2。
11.权利要求8的核酸构建体，其中至少一个可转录核苷酸序列是非编码序列。
12.权利要求11的核酸构建体，其中该非编码序列是内含子、来源于启动子区的核苷酸序列、来源于5’非翻译区的核苷酸序列、来源于3’非翻译区的核苷酸序列、或上述任何一个的片段。
13.包含至少一个可转录核苷酸序列的核酸构建体，其表达导致选自SEQ ID NO：7[ZmKRP4]和/或SEQ ID NO：17[ZmKRP9]的内源性核苷酸序列的抑制，其中一个或两个可转录核苷酸序列与至少一个其它可转录核苷酸序列进一步组合，其表达导致选自下组的内源性核酸的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZmKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ ID NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]，条件是该可转录核苷酸序列与SEQID NO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：13的核苷酸335-718不完全对应，和
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，
其中该可转录核苷酸序列可以任何顺序存在于核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
14.权利要求13的核酸构建体，其进一步包含优先在玉米谷粒的胚芽和/或糊粉中表达的启动子且该启动子与至少一个可转录核苷酸序列可操作性连接。
15.权利要求14的核酸构建体，其中该启动子是玉米的油质蛋白启动子、玉米的球蛋白启动子、玉米的MIP合酶启动子、大麦的Per1启动子、来源于稻的胚-优选的启动子如P-Os.CPC214或来源于玉米的胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1或P-Zm.CPC214tr2。
16.权利要求13-15任何一项的核酸构建体，其中至少一个可转录核苷酸序列是非编码序列。
17.权利要求16的核酸构建体，其中该非编码序列是内含子、来源于启动子区的核苷酸序列、来源于5’非翻译区的核苷酸序列、来源于3’非翻译区的核苷酸序列、或上述任何一个的片段。
18.包含至少一个可转录核苷酸序列的核酸构建体，其表达导致选自下组的内源性核酸的抑制：
(i)SEQ ID NO：1[ZMKRP1]或编码SEQ ID NO：2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(ii)SEQ ID NO：3[ZmKRP2]或编码SEQ NO：4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO：5[ZmKRP3]或编码SEQ ID NO：6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：5的核苷酸175-342不完全对应，
(iv)SEQ ID NO：9[ZmKRP5]或编码SEQ ID NO：10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：9的核苷酸450-570不完全对应，
(v)SEQ ID NO：11[ZmKRP6]或编码SEQ ID NO：12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是SEQ ID NO：11的可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：11的核苷酸380-765不完全对应，
(vi)SEQ ID NO：13[ZmKRP7]或编码SEQ ID NO：14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ ID NO：13的核苷酸335-718不完全对应，
(vii)SEQ ID NO：15[ZmKRP8]或编码SEQ ID NO：16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：15的核苷酸350-405或420-698不完全对应，和
(viii)SEQ ID NO：17[ZmKRP9]或编码SEQ ID NO：18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，条件是该可转录核苷酸序列与SEQ IDNO：17的核苷酸1-183不完全对应，
其中该可转录核苷酸序列可以任何顺序存在于核酸构建体上且可以是多顺反子的，
其中每个可转录核苷酸序列包含至少约100个连续核苷酸，且
其中每个可转录核苷酸序列的表达任选诱导基因抑制。
19.权利要求18的核酸构建体，其进一步包含优先在玉米谷粒的胚芽和/或糊粉中表达的启动子且该启动子与至少一个可转录核苷酸序列可操作性连接。
20.权利要求19的核酸构建体，其中该启动子是玉米的油质蛋白启动子、玉米的球蛋白启动子、玉米的MIP合酶启动子、大麦的Per1启动子、来源于稻的胚-优选的启动子如P-Os.CPC214或来源于玉米的胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1或PZm.CPC214tr2。
21.权利要求18-20任何一项的核酸构建体，其中至少一个可转录核苷酸序列是非编码序列。
22.权利要求21的核酸构建体，其中该非编码序列是内含子、来源于启动子区的核苷酸序列、来源于5’非翻译区的核苷酸序列、来源于3’非翻译区的核苷酸序列、或上述任何一个的片段。
23.抑制一个或多个CDK抑制剂样基因在玉米细胞、玉米组织、玉米器官或玉米植物中表达的方法，该方法包括使所述玉米细胞、玉米组织、玉米器官或玉米植物与权利要求8、14或18的核酸构建体接触。
24.权利要求23的方法，其中该抑制通过反义抑制、有义抑制、dsRNA、核酶、或其组合完成。
25.权利要求23的方法，其中该核酸构建体进一步包含优先在玉米谷粒的胚芽和/或糊粉中表达的启动子且该启动子与至少一个核苷酸序列可操作性连接。
26.权利要求25的方法，其中该启动子是玉米的油质蛋白启动子、玉米的球蛋白启动子、玉米的MIP合酶启动子、大麦的Per1启动子、来源于稻的胚-优选的启动子如P-Os.CPC214或来源于玉米的胚-优选的启动子如P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1或PZm.CPC214tr2。
27.一种玉米细胞、玉米组织、玉米器官、或玉米植物，其中CDK抑制剂样基因已经按照权利要求23的方法被抑制。
28.一种从权利要求27的植物获得的种子。
29.从权利要求28的种子获得的油。
30.从权利要求28的种子获得的粗粉。
31.权利要求23的方法，其中该抑制导致油增多。
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| CN111620935B (zh) * | 2019-02-27 | 2023-08-11 | 中国农业大学 | ZmCEP1基因在调控玉米籽粒发育中的应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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