CN109207510A - 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，要解决传统STTM系统中常用的35S启动子仅在双子叶植物组织中高效表达,在单子叶植物的表达则较弱，不适用于单子叶植物的miRNA沉默的问题。本发明公开了一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其包括以下步骤：S1,针对单子叶植物的目标miRNA,制备与之对应的STTM；S2,将S1所述STTM克隆至克隆载体，以获得启动子‑STTM‑终止子结构；S3,通过双酶切的方式将S2所述启动子‑STTM‑终止子结构克隆至双元载体。本发明的构建方法连接效率高，简便可靠，并可避免引入不必要的转基因成分，所构建的单子叶植株STTM载体可高效地沉默单子叶植物miRNA的表达，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法。
背景技术
植物microRNA(miRNA)是一类长度约为20～24nt的內源性非编码小RNA(smallnon-coding RNA)，可与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RISC复合体(RNA-inducedsilencing complex)，通过直接切割靶基因的mRNA或抑制靶基因的翻译，以及通过切割来源于PHAS位点的转录本产生的大量phasiRNA间接作用于靶基因mRNA，实现对靶基因表达的抑制，进而影响植物生长发育过程，主要包括根的形成、茎和叶的发育、花器官的形成、果实的发育等以及生物和非生物胁迫的响应。
抑制植物miRNA基因的表达是研究其功能的重要策略之一。miRNA模拟靶标(Target mimicry，TM)和小串联模拟靶标(Short tandem target mimic，STTM)是目前应用最为广泛的两种miRNA沉默方法。与传统TM方法相比，STTM对miRNA的抑制效果更加明显，所获得的转化体表型更加明显，因此受到了越来越多研究者的青睐。
STTM是一段由48-nt linker连接的2个TM组成的序列，在2个TM的miRNA切割位点有3个额外增加的碱基形成一个bulge结构，使其可以结合miRNA但不会被其切割，该序列在35S启动子驱动下转录并发挥其沉默相应miRNA的功能。然而，大量研究表明35S启动子仅在双子叶植物组织中高效表达,在单子叶植物中的表达则较弱，传统STTM实施时，还存在单酶切连接效率低、操作难度大且容易引入不必要的转基因成分的不足。因此有必要对以上不足加以改进。
发明内容
为克服现有STTM方法在单子叶植物中表现欠佳的问题，发明人发现玉米Ubi启动子在单子叶植物组织中高效表达，在双子叶植物中则较弱，基于此提出了一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其包括以下步骤：
S1,针对单子叶植物的目标miRNA,制备与之对应的STTM；
S2,将S1所述STTM克隆至克隆载体，以获得启动子-STTM-终止子结构；
S3,通过双酶切的方式将S2所述启动子-STTM-终止子结构克隆至双元载体。
优选的，在所述启动子-STTM-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。
优选的，在S2中，所述启动子-STTM-终止子结构的两端均连接有酶切位点。
优选的，所述酶切位点包括PacI酶切位点和MluI酶切位点。
优选的，在S3中，所述启动子-STTM-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
优选的，在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S3中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。
优选的，在S3中，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。
本发明的构建方法连接效率高，简便可靠，并可避免引入不必要的转基因成分，所构建的单子叶植株STTM载体可高效地沉默单子叶植物miRNA的表达，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例克隆载体pOT2-polycis-UN的构建流程图。
图2为本发明实施例克隆载体pOT2-polycis-UN的图谱。
图3为本发明实施例双元载体pCAMBIA1390-PM的构建流程图。
图4为本发明实施例双元载体pFGC5941-PM的构建流程图。
图5为本发明实施例植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM的图谱。
图6为本发明实施例植物转化用双元载体pFGC5941-PM的图谱。
图7为本发明实施例单子叶植物miRNA沉默载体的构建流程。
图8为本发明实施例双元载体pFGC5941-STTMZmmiR444、pFGC5941-STTMZmmiR529和pFGC5941-STTMZmmiR1432的酶切鉴定结果。
图9为本发明实施例pFGC5941-STTMZmmiR444的STTM结构测序比对结果。
图10为本发明实施例pFGC5941-STTMZmmiR529的STTM结构测序比对结果。
图11为本发明实施例pFGC5941-STTMZmmiR1432的STTM结构测序比对结果。
图12为本发明实施例玉米miR444在野生型植株(WT)以及T0代转基因单株SZM444-7、SZM444-28和SZM444-41中的表达量(n＝2-3)。
图13为本发明实施例玉米miR529在野生型(WT)植株以及T0代转基因单株SZM529-4、SZM529-5和SZM529-7中的表达量(n＝2-3)。
图14为本发明实施例玉米miR1432在野生型植株(WT)以及T0代转基因单株SZM1432-2、SZM1432-3、SZM1432-4、SZM1432-6和SZM1432-8中的表达量(n＝2-3)。
具体实施方式
下面结合具体构建方法对本发明进行进一步的描述：
作为一种示例，本示例的单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)载体的准备
1.1、克隆载体pOT2-polycis-UN：参照图1所示流程，构建单子叶植物STTM所需中间载体pOT2-polycis-UN，导入PacI-Ubi启动子以及Nos终止子-MluI这一结构，构建成功的pOT2-polycis-UN的图谱如图2所示。
构建所需引物的序列为：
SmaI-PacI-Ubi-F(TCCCCCGGGTTAATTAAGCATGCCTGCAGTGCAGTGCAGC)(SEQ IDNo.2)/HindIII-Ubi-R(CCCAAGCTTGAACTACCGGGCCCTAACCATGG)(SEQ ID No.3)；
EcoRI-NOS-F(TCGGATCCCTGCTAGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG)(SEQ IDNo.4)/SpeI-MluI-Nos-R(GGACTAGTCGACGCGTGATCTAGTAACATAGATGACACCG)(SEQ ID No.5)。
上述引物由Invitrogen公司合成，PCR采用Thermo PHUSION高保真酶及其推荐的反应体系和程序；内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。改造后的克隆载体pOT2-polycis-UN两酶切位点PacI/MluI间的序列信息(包括酶切位点)如SEQ ID No.1所示。
1.2、植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM和pFGC5941-PM：参照图3的流程，通过酶切连接的方法替换pCAMBIA1390-OsNLSCas9载体中的Ubi-OsNLSCas9结构，保留PacI和MluI酶切位点及两酶切位点间的序列(如SEQ ID No.6所示)，以构建pCAMBIA1390-PM双元载体；参照图4的流程，删除多余元件并将包含PacI和MluI酶切位点的序列SEQ ID No.6导入pFGC5941以构建pFGC5941-PM。
改造后的pCAMBIA1390-PM以及pFGC5941-PM载体图谱如图5和图6所示，两个载体分别含有潮霉素和除草剂Basta抗性基因，可分别用于相关作物的转化。构建所需内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。
(2)基于Ubi启动子的单子叶植物STTM的构建(图7)
2.1、确定目标miRNA并列出其成熟序列，同时列出该目标miRNA的反向互补序列。
如：成熟miRNA1为NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID No.7)，
其反向互补序列(p-miRNA1)为nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(SEQ ID No.8)；
2.2、找到p-miRNA1上与miRNA1第10和第11核苷酸对应位置，然后在这两个碱基之间插入一个三核苷酸(cua)的凸起：nnnnnnnnnncuannnnnnnnnnn(SEQ ID No.9)；
2.3、将序列nnnnnnnnnncuannnnnnnnnnn(SEQ ID No.9)进一步转换为其对应的DNA格式nnnnnnnnnnctannnnnnnnnnn(SEQ ID No.10)，并进一步列出其反向互补序列：NNNNNNNNNNNtagNNNNNNNNNN(SEQ ID No.11)；
2.4、设计STTM引物：
STTM-PF1(GCCATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATnnnnnnnnnnctannnnnnnnnnnGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGC)(SEQ ID No.12)/STTM-PR1(GCCATTTAAATTAGACCATAACAACAACAACNNNNNNNNNNNtagNNNNNNNNNNAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCG)(SEQ ID No.13)；
2.5、通过高保真DNA聚合酶(如NEB PHUSION-HF DNA聚合酶)的PCR扩增将STTM结构克隆至pOT2-polycic-UN的Ubi启动子和Nos终止子之间；
PCR反应程序：
2.6、将上述PCR产物利用QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化回收；
2.7、纯化后PCR产物以SwaI(NEB)酶切，酶切体系如下：
2.8、QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化回收酶切产物，通过电泳检查纯化的产物的质量，并估算其浓度；
2.9、用NEB T4连接酶连接第(2)-8步的产物，连接体系如下：
2.10、将第2.9步的连接产物转化E coli Trans1-T1；
2.11、选择2-3个单克隆测序验证，测序引物如下：PF-2(CGACTCTAGAGGATCCAAGCTT)(SEQ ID No.14)/PR-2(GCCAAATGTTTGAACGATCGAATTC)(SEQ IDNo.15)；
2.12、将第2.11步的质粒和pCAMBIA1390-PM/pFGC5941-PM用PacI(NEB)和MluI-HF(NEB)双酶切，双酶切体系如下：
2.13、用QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化第2.12步得到的酶切产物，通过电泳检查纯化的产物质量并估算浓度；
2.14、用NEB T4连接酶连接第2.11步的产物，连接体系如下：
2.15、将第2.14步得到的连接产物转化E coli Trans1-T1；
2.16、将第2.15步得到的菌进行酶切检测，选取阳性克隆测序验证，测序引物为PF-3(GGCATATGCAGCAGCTATATGTGG)(SEQ ID No.16)。
注意事项
1、PCR的条件和体系因所用高保真酶、个人的操作习惯以及其他实验条件的差异，可能会略有差异，因此有必要先通过预实验进行初步的摸索和熟悉。
2、整个构建过程中的酶切步骤中，内切酶用量及酶切时间要充足。
3、PCR及酶切产物要纯化。
4、连接反应中载体和片段的摩尔比要适宜。
下面应用上述方法结合具体实施例对本发明进行进一步的描述：
设计用于沉默玉米miR444、miR529和miR1432的STTM引物如下：
STTMZmmiR444-PF(GCCATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATAAGCTTGAGACCTAAACAACTGCAGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGC)(SEQ ID No.17)/PR(GCCATTTAAATTAGACCATAACAACAACAACTGCAGTTGTTTAGGTCTCAAGCTTGCTTGGATCCTCTAGAGTCG)(SEQ ID No.18)；
STTMZmmiR529-PF(GCCATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATAGGCTGTACTCCTATCTCTCTTCTGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGC)(SEQ ID No.19)/PR(GCCATTTAAATTAGACCATAACAACAACAACAGAAGAGAGATAGGAGTACAGCCTAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCG)(SEQ ID No.20)；
STTMZmmiR1432-PF(GCCATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATGTCGGTGTCATCTACTCTCCTGAGGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGC)(SEQ ID No.21)/PR(GCCATTTAAATTAGACCATAACAACAACAACCTCAGGAGAGTAGATGACACCGACAAGCTTGGATCCTCTAGAGTCG)(SEQ ID No.22)。
以上述流程构建pOT2-polycis-UN质粒为模板、采用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物经纯化、SwaI酶切、纯化和T4连接，转入大肠杆菌扩繁，筛选阳性克隆测序。选择测序正确的克隆扩繁并提取质粒pOT2-UN-STTMZmmiR444、pOT2-UN-STTMZmmiR444、pOT2-UN-STTMZmmiR444和预先准备好的双元载体pFGC5941-PM，分别以PacI/MluI进行双酶切，酶切产物经纯化后，以T4连接酶连接、转入大肠杆菌，挑选阳性克隆2-3个提取质粒，然后以PacI和MluI酶切，酶切产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，均切出一条约2.2kb条带，与目的条带的大小基本一致(如图8所示)。
进一步测序验证，测序结果如图9至图11，正确的克隆pFGC5941-STTMZmmiR444、pFGC5941-STTMZmmiR529和pFGC5941-STTMZmmiR1432保留用于随后的农杆菌转化以及玉米的侵染。
以pFGC5941-STTMZmmiR444、pFGC5941-STTMZmmiR529和pFGC5941-STTMZmmiR1432分别转化玉米自交系，选取T0代阳性单株，通过stem-loop qPCR检测miRNA444、miR529和miR1432的表达量，与野生型相比，显著降低(如图12至图14所示)，表明通过上述方法所构建的单子叶植株STTM载体可高效地沉默miRNA的表达。
需要说明的是，上述的pCAMBIA1390是一个常用的商业化植物双元表达载体；本发明采用双酶切方式与常见的单酶切方式相比连接效率高，自连概率小，改变了单酶切大片段不易连和去磷酸化实验，简化操作。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
上面对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法
<130> WK18-LQF-CN1-1511
<141> 2018-09-19
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2868
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> PacI酶切位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2861)..(2868)
<223> MluI酶切位点
<400> 1
ttaattaagc atgcctgcag tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat 60
aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt 120
ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata 180
atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca 240
tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg 300
tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt 360
attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac 420
atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt 480
ttatttaata atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata 540
ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca 600
gcctgttaaa cgccgtcgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg 660
tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag 720
agttccgctc caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc 780
ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac 840
gggggattcc tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga 900
caccccctcc acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac 960
cagatctccc ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc 1020
cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 1080
gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 1140
gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 1200
tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 1260
tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 1320
tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 1380
tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 1440
gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 1500
atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 1560
catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 1620
ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 1680
ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 1740
atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 1800
atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 1860
atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 1920
gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 1980
cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccaagctt 2040
ctctcttctc tttctccata accctgtcta aagggattat tatgatagta gaaaaaatga 2100
ctctcgaacc cgttggcatg ggcccggcac cgtggtcgag aaataaaaaa atcagagtgg 2160
tagcccgagc catgcctagg agctccacat tttcatatga ctgtgagctg gtgccacgga 2220
tcggttgccc aagctgaata aaaaaaatga cactcctacg ggcacggatc ggtaccacgt 2280
ggagattttg atatcactgt gaggatgccc gtgccatgcc atggtgcacc cctaaaaaaa 2340
aaaagtctca ccatcgggct cggatgttta aatcggatcc tcgaggtgta aaaaaactcg 2400
taaatcctat cagatctgga agatttctac gcttctcctt ctttatattc gttttcttat 2460
gctttttatt tttgatataa cctagaaaaa ggttttttat atctttgaat ctgaaattgt 2520
ttgttttaga gtattgtata tctgattttt atcccttttt atatttgaac gttctttagt 2580
ctccttttgt ttgcccaaat gttgaattcg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 2640
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 2700
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 2760
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 2820
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcacgcgt 2868
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
tcccccgggt taattaagca tgcctgcagt gcagtgcagc 40
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
cccaagcttg aactaccggg ccctaaccat gg 32
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
tcggatccct gctagaattc gatcgttcaa acatttggca ataaag 46
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ggactagtcg acgcgtgatc tagtaacata gatgacaccg 40
<210> 6
<211> 1912
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> PacI酶切位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (1905)..(1912)
<223> MluI酶切位点
<400> 6
ttaattaagg gatccaagga atctttaaac atacgaacag atcacttaaa gttcttctga 60
agcaacttaa agttatcagg catgcatgga tcttggagga atcagatgtg cagtcaggga 120
ccatagcaca agacaggcgt cttctactgg tgctaccagc aaatgctgga agccgggaac 180
actgggtacg ttggaaacca cgtgatgtga agaagtaaga taaactgtag gagaaaagca 240
tttcgtagtg ggccatgaag cctttcagga catgtattgc agtatgggcc ggcccattac 300
gcaattggac gacaacaaag actagtatta gtaccacctc ggctatccac atagatcaaa 360
gctgatttaa aagagttgtg cagatgatcc gtggcagttt tagagctaga aatagcaagt 420
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg 480
aagatccaag gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt 540
aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca 600
caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta 660
cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag 720
tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg 780
acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctgattt 840
aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 900
ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tgaagatcca 960
aggaatcttt aaacatacga acagatcact taaagttctt ctgaagcaac ttaaagttat 1020
caggcatgca tggatcttgg aggaatcaga tgtgcagtca gggaccatag cacaagacag 1080
gcgtcttcta ctggtgctac cagcaaatgc tggaagccgg gaacactggg tacgttggaa 1140
accacgtgat gtgaagaagt aagataaact gtaggagaaa agcatttcgt agtgggccat 1200
gaagcctttc aggacatgta ttgcagtatg ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac 1260
aaagactagt attagtacca cctcggctat ccacatagat caaagctgat ttaaaagagt 1320
tgtgcagatg atccgtggca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 1380
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttgaagatc caaggaatct 1440
ttaaacatac gaacagatca cttaaagttc ttctgaagca acttaaagtt atcaggcatg 1500
catggatctt ggaggaatca gatgtgcagt cagggaccat agcacaagac aggcgtcttc 1560
tactggtgct accagcaaat gctggaagcc gggaacactg ggtacgttgg aaaccacgtg 1620
atgtgaagaa gtaagataaa ctgtaggaga aaagcatttc gtagtgggcc atgaagcctt 1680
tcaggacatg tattgcagta tgggccggcc cattacgcaa ttggacgaca acaaagacta 1740
gtattagtac cacctcggct atccacatag atcaaagctg atttaaaaga gttgtgcaga 1800
tgatccgtgg cagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 1860
acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttgaaga tcttcgacgc gt 1912
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 7
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 8
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 9
<211> 24
<212> RNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(24)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 9
nnnnnnnnnn cuannnnnnn nnnn 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(24)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
nnnnnnnnnn ctannnnnnn nnnn 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Monocotyledons
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(24)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
nnnnnnnnnn ntagnnnnnn nnnn 24
<210> 12
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 12
gccatttaaa tatggtctaa agaagaagaa tnnnnnnnnn nctannnnnn nnnngaattc 60
gatcgttcaa acatttggc 79
<210> 13
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
gccatttaaa ttagaccata acaacaacaa cnnnnnnnnn ntagnnnnnn nnnnaagctt 60
ggatcctcta gagtcg 76
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
cgactctaga ggatccaagc tt 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
gccaaatgtt tgaacgatcg aattc 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
ggcatatgca gcagctatat gtgg 24
<210> 17
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
gccatttaaa tatggtctaa agaagaagaa taagcttgag acctaaacaa ctgcagaatt 60
cgatcgttca aacatttggc 80
<210> 18
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
gccatttaaa ttagaccata acaacaacaa ctgcagttgt ttaggtctca agcttgcttg 60
gatcctctag agtcg 75
<210> 19
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
gccatttaaa tatggtctaa agaagaagaa taggctgtac tcctatctct cttctgaatt 60
cgatcgttca aacatttggc 80
<210> 20
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
gccatttaaa ttagaccata acaacaacaa cagaagagag ataggagtac agcctaagct 60
tggatcctct agagtcg 77
<210> 21
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
gccatttaaa tatggtctaa agaagaagaa tgtcggtgtc atctactctc ctgaggaatt 60
cgatcgttca aacatttggc 80
<210> 22
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
gccatttaaa ttagaccata acaacaacaa cctcaggaga gtagatgaca ccgacaagct 60
tggatcctct agagtcg 77
Claims (7)
1.一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1,针对单子叶植物的目标miRNA,制备与之对应的STTM；
S2,将S1所述STTM克隆至克隆载体，以获得启动子-STTM-终止子结构；
S3,通过双酶切的方式将S2所述启动子-STTM-终止子结构克隆至双元载体。
2.根据权利要求1所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，在所述启动子-STTM-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。
3.根据权利要求1所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，在S2中，所述启动子-STTM-终止子结构的两端均连接有酶切位点。
4.根据权利要求3所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，所述酶切位点包括PacI酶切位点和MluI酶切位点。
5.根据权利要求1所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，在S3中，所述启动子-STTM-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。
6.根据权利要求1所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S3中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。
7.根据权利要求1所述的一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法，其特征在于，在S3中，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110295193A (zh) * | 2019-07-30 | 2019-10-01 | 玉林师范学院 | 番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103205458A (zh) * | 2013-03-31 | 2013-07-17 | 吉林省农业科学院 | 一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法 |
| CN105274135A (zh) * | 2015-08-24 | 2016-01-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体及其应用 |
-
2018
- 2018-09-19 CN CN201811094016.8A patent/CN109207510B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103205458A (zh) * | 2013-03-31 | 2013-07-17 | 吉林省农业科学院 | 一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法 |
| CN105274135A (zh) * | 2015-08-24 | 2016-01-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体及其应用 |
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