CN104178511A - 制备具有更快生长和/或更高产量的生物 - Google Patents

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Abstract

用于制备与参考生物比较具有更快生长和/或提高的产量的非人生物的方法，该方法包括与参考生物比较提高所述生物或其一个或多个部分中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性。

Description

制备具有更快生长和/或更高产量的生物
本申请是中国专利申请200580025987.1的分案申请，原申请的申请日是2005年7月21日，发明名称是“制备具有更快生长和/或更高产量的生物”。
发明描述
本发明涉及用于制备与参考生物比较具有更快生长和/或更高产量的非人生物的方法，该方法包括与所述参考生物比较提高所述非人生物或其一个或多个部分中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性，例如基于提高SEQ ID NO：1、106、124、128或136RNA的量和/或SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的量，有利地基于提高的SEQ ID NO：1、106、124、128或136的表达。在其它实施方案中，本发明涉及用于制备生长更快和/或产生更高产量的植物、微生物或有用动物的方法，该方法包括所述生物中提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，并涉及其SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性得以提高的植物、微生物和有用动物并且涉及其产量或生物质(biomass)。此外，本发明还涉及SEQID NO：2、107、125、129或137多肽，涉及其编码的多核苷酸，涉及以这些多核苷酸所转化的细胞、植物、微生物和有用动物并涉及通过使用本发明的所述实施方案制备精细化学品的方法。
自从最早栽培有用植物以来，在培育新植物品种时除了提高抗生物性胁迫和抗非生物性胁迫外，提高作物产量一直是最重要的目标。将如此多样的措施，如耕作、施肥、灌溉、栽培或作物保护制度用于改善产量，所提到只是其中一部分。因此，在例如通过改进结籽环境增加作物上的栽培成功和在降低因例如不良天气即太干燥、太潮湿、过热或过冷的天气或者因寄生物如昆虫、真菌或细菌的侵染所致作物损失方面的那些栽培成功相互补充。鉴于世界人口快速增长，迫切需要产量的大幅度提高而不扩展经济可耕面积，以便在提供足量食物的同时保护其它现存的自然空间。
用于开发具有更佳产量的新品种的经典遗传学和栽培的方法正日益为遗传方法所补充。因此已经鉴定了负责特定特性如抗非生物性胁迫或抗生物性胁迫或者生长速率控制的基因。有意义的基因或其基因产物可以通过突变、(过量)表达或降低或抑制此类基因或它们的产物在所需要的有用植物中适宜地调节，以便实现所需要提高的产量或更高的抗胁迫性。
这也适用于微生物和有用动物，其培育除更高的抗生物性胁迫或抗非生物性胁迫外主要并且类似特别涉及更迅速地实现特定的生物质或特定的重量。
引起更好或更快植物生长的策略的一个实例是提高植物的光合能力(US 6,239,332和DE 19940270)。然而，这种方法仅当所述植物的光合性能为生长限制时才有前景。另一种方法是通过影响细胞周期控制而调控植物生长的调节(WO 01/31041，CA 2263067，WO 00/56905，WO 00/37645)。然而植物结构上的变化可能是广泛介入控制植物生长(WO 01/31041；CA 2263067)的不良副作用。其它方法可能涉及如在WO 02/079403或US2003/013228中已提出权利要求的推定转录调节蛋白。这类转录调节蛋白常常在其家族成员可能表现明显交叉控制和/或拮抗性控制的基因家族中出现。此外，转录因子的功能依赖于靶生物中确切存在它们的识别序列。这个事实可能使得将来自模式种的结果转移至靶生物复杂化。即便仅有几种有前景的方法，仍旧迫切需要提供用于产生具有更快生长和更高产量的生物、尤其植物和微生物的方法，并且迫切需要提供此类生物尤其植物和微生物。
本发明的一个目标就是提供这种类型用于提高生物尤其植物的产量和生长的方法。
我们发现这个目标通过本文中所述的新方法和权利要求书中所表征的实施方案实现。
因此，本发明涉及用于产生与参考生物比较具有提高的生长速率即具有更快生长和/或提高产量的非人生物的方法，该方法包括与所述参考生物比较提高所述非人生物或其一个或多个部分中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性，例如基于提高SEQ ID NO：1、106、124、128或136RNA的量和/或SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的量。
已经发现拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中SEQ ID NO：1、106、124、128或136提高的表达导致植物加速的生长并导致提高的终重量和提高的种子量。
已将SEQ ID NO：2描述为来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)未证实功能的蛋白质(YMR095C的GenBank登录号：PIR|S55081)，其可能参与吡哆醇代谢并且其表达在稳定期诱导。因此，明确的功能在ORF的注释中未提及。然而，在标准条件下Blastp比较YMR095C(SEQ ID：2)序列揭示了对SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、133和135的显著同源性。
尤其惊讶的是发现表达进化较远的酿酒酵母的SEQ ID NO：1提高拟南芥菜的生长。也可以推定SEQ ID NO：1是功能保守的基因并且提高SEQID NO：2的活性或特定同系物4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、133或135的活性也以根据本发明对SEQ ID NO：2和在拟南芥菜属(Arabidopsis)中所观察到的相同方式导致生物中更快的生长或提高的产量。因此，推测生物中其它亲缘较远的SEQ ID NO：1同系物的转基因表达也导致所观察到的更快生长和更高产量。
已经将SEQ ID NO：107描述为来自酿酒酵母的液泡形态发生蛋白VAM7(YGL212W的GenBank登录号：PIR|S312637。其它功能未在ORF的注释中提及。然而，在标准条件下Blastp比较YGL212W序列揭示了对SEQ ID NO：109、111、113、115、117、119和121的显著同源性。
尤其惊讶的是发现表达进化较远的酿酒酵母的SEQ ID NO：106提高拟南芥菜的生长。也可以推定SEQ ID NO：106是功能保守的基因并且提高SEQ ID NO：107的活性或特定同系物SEQ ID NO：109、111、113、115、117、119或121的活性也以根据本发明对拟南芥菜属中SEQ ID NO：106所观察到的相同方式导致生物中更快的生长或提高的产量。因此，推测其它亲缘较远的SEQ ID NO：106同系物在生物中的转基因表达也导致所观察到的更快生长和更高产量。
早先将SEQ ID NO：125描述为来自酿酒酵母的假定蛋白质并且目前注释为稳定期期间在较高温度存活所需要的蛋白质(GenBank登录号：SWISSPROT|YMZ7_酵母YMR107w)。明确的功能未在ORF的注释中提及。
尤其惊讶的是发现表达进化上较远的酿酒酵母的SEQ ID NO：124提高拟南芥菜的生长。也可以推定SEQ ID NO：124是功能保守的基因并且提高SEQ ID NO：125的活性或特定同系物的活性也以根据本发明对拟南芥菜属中SEQ ID NO：125所观察到的相同方式导致生物中更快的生长或提高的产量。因此，推测SEQ ID NO：124同系物在生物中的转基因表达也导致所观察到的更快生长和更高产量。
已将SEQ ID NO：129描述为来自酿酒酵母的假定蛋白质(YDL057W的GenBank登录号SPTREMBL|Q07379)。
尤其惊讶的是发现表达进化较远的酿酒酵母的SEQ ID NO：128提高拟南芥菜的生长。也可以推定SEQ ID NO：128是功能保守的基因并且提高SEQ ID NO：129的活性或特定同系物的活性也以如根据本发明对拟南芥菜属中SEQ ID NO：128所观察到的相同方式导致生物中更快的生长或提高的产量。因此，推测SEQ ID NO：128同系物在生物中的转基因表达也导致所观察到的更快生长和更高产量。
已将SEQ ID NO：137描述为来自酿酒酵母的未知蛋白质(YGL217C的GenBank登录号：NP_011298.1)，其类似于小鼠驱动蛋白相关蛋白KIF3。
尤其惊讶的是发现表达进化较远的酿酒酵母的SEQ ID NO：136在拟南芥菜中提高生长。也可以推定SEQ ID NO：136是功能保守的基因并且提高SEQ ID NO：136的活性或特定同系物的活性也以如根据本发明在拟南芥菜属中对SEQ ID NO：136所观察到的相同方式导致生物中更快的生长或提高的产量。因此，推测SEQ ID NO：136同系物在生物中的转基因表达也导致所观察到的更快生长和更高产量。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于产生具有提高的生长速率即具有更快生长和/或提高产量的生物、细胞、组织，例如动物、微生物或植物的方法，该方法包括提高所述生物或其一个或多个部分中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性，例如基于提高SEQ ID NO：1、106、124、128或136RNA的量和/或SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的量。
“生物”本文中意指不是人类的任意生物。因此，该术语涉及原核细胞和真核细胞、微生物、高等植物和低等植物，包括藓类和藻类，并涉及非人动物或非人细胞。在一个实施方案中，生物是单细胞生物或多细胞生物。
“提高的生长”、“更快的生长”或“提高的生长速率”本文中意指重量例如鲜重或每单位时间生物质的提高高于参考，尤其高于自其中制备本发明非人生物的起始生物。更快的生长优选导致所述非人生物更高的终重量。因此，例如更快的生长有可能更早地达到特定发育阶段或延长特定发育阶段中的生长。优选获得更高的终重量。
术语“野生型”、“对照”或“参考”可交换使用并且可以是根据本发明未受本文中所述方法修饰或处理的细胞或生物的部分如细胞器或组织，或生物尤其微生物或植物。因此用作野生型、对照或参考的细胞或生物的部分如细胞器或组织、或生物尤其是微生物或植物对应于尽可能多的细胞、生物或其部分，并且在除本发明方法的结果以外的任何其它特性方面尽可能与本发明主题完全相同。因此，野生型、对照或参考完全相同或尽可能完全相同地受到处理，也即仅仅不额外影响所测试特性的品质的条件或特性可能不同。
优选地，任意比较在相似条件下进行。术语“相似条件”意指所有条件例如培养条件或生长条件、测定法条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验间保持完全相同。
“参考”、“对照”或“野生型”优选是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其根据本发明未受本文中所述方法修饰或处理并且在任何其它特性上尽可能与本发明主题相似。参考、对照或野生型在基因组、转录组、蛋白质组或代谢组上尽可能与本发明主题相似。优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”的细胞器、-细胞、-组织或-生物尤其植物或微生物涉及这样的细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其几乎，优选地95％，更优选地98％、甚至更优选地99.00％、尤其99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多地遗传同一于本发明的细胞器、细胞、组织或生物尤其微生物或植物。最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”优选是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其除核酸分子或由它们编码的基因产物根据所发明的方法改变外遗传同一于本发明方法所用的生物、细胞器。
优选地，参考、对照或野生型仅在本发明多肽的细胞活性上不同于本发明的对象，例如作为本发明核酸分子水平升高的结果，或者作为发明多肽的特异活性升高的结果，例如因为或由于具有所述活性的蛋白质的表达水平或活性和它的生物化学原因或遗传原因。
当不能提供仅因不是本发明方法的对象不同于本发明对象的对照、参考或野生型，对照、参考或野生型可以是这样的生物，在其中调节如本文中所述赋予本发明产量或生长或核酸分子表达升高的活性的原因已经恢复或撤除，例如通过敲除负责的基因产物的表达，例如通过反义抑制、通过失活激活剂或激动剂、通过活化抑制剂或拮抗剂、通过添加抑制性抗体的抑制、通过添加活性化合物如激素、通过导入负显性突变体等。例如通过导入引起酶活性抑制或结合至辅因子的能力去稳定化或者抑制等的失活性点突变敲除基因。
因此，优选的参考对象是本发明中本方法的起始对象。优选地，将该参考和本发明主题在标准化和归一化后与总RNA、DNA或蛋白质的量或者参考基因如持家基因例如遍在蛋白的活性或表达相比较。
存在一系列籍此本发明多肽中的修饰可直接或间接影响产量的机制。例如，可以提高本发明多肽或本发明核酸分子的分子数或特异活性。例如目的生物质的增加可通过提高编码所发明的蛋白质的基因拷贝数实现。然而，还有可能例如通过修饰基因的调节作用或通过提高本发明核酸分子所编码mRNA或基因产物的稳定性提高生物中天然存在基因的表达。
因此，优选的参考对象是本发明方法的起始对象。优选地，在标准化后将该参考对象和本发明对象比较总RNA、DNA或蛋白质的量或如持家基因或实施例中所示参考基因的活性或表达。
本发明的增加、减少或调节可以是组成型的，例如因为稳定表达或者是瞬时的，例如因为瞬时转染或临时添加作为激动剂或拮抗剂的调节物，或者是可诱导的，例如在以携带本发明序列的可诱导构建体转化并添加诱导物后。
术语在细胞、组织、生物例如植物或微生物中活性的“提高”或“降低”意指所述区室内总活性得到提高或降低，例如作为基因产物提高或降低的表达、添加或减少激动剂或拮抗剂、酶的抑制或活化、或例如作为突变结果的对基因产物特异活性的调节的结果。本发明酶催化中心内的突变可以调节酶的周转率，例如敲除必需氨基酸可以导致降低的或完全敲除的酶活性。本发明中酶的特异活性可以得到提高以至提高周转率(turn over rate)或改善对辅因子的结合。改善编码性mRNA或蛋白质的稳定性也可以提高基因产物的活性。活性的激发也在本发明术语“提高的活性”范围内。本发明蛋白质或者由本发明多核苷酸或表达盒所编码蛋白质的特异活性可如实施例中所述测试。特别地，在细胞例如植物细胞或微生物中表达所述蛋白质并与对照比较检测鲜重、干重、种子数和/或种子重量的增加是容易的试验。
因此术语“提高”或“降低”意指化合物例如本发明的蛋白质、mRNA或DNA的特异活性和量可以得到提高或降低。
术语“提高”还意指将化合物或活性从头(de novo)导入细胞，或意指该化合物或该活性已经不可检测到。因此如下，术语“提高”还包含术语“生成”或“激发”。
通常，在生物尤其植物细胞、植物或者植物组织或其部分中基因产物的活性可以通过提高所述生物或其部分中特定编码性mRNA或者相应蛋白质的量得以提高。将“蛋白质或mRNA的量”理解为意指生物、组织、细胞或细胞区室中本发明多肽分子或本发明mRNA分子的分子数。本发明蛋白质的量“提高”意指例如通过本文以下所述方法之一与野生型、对照或参考的分子数比较定量性提高生物、组织、细胞或细胞区室或其部分中该蛋白质的分子数。
分子数的提高优选地总计为至少1％、优选地大于10％、更优选地30％或更多、特别优选地50％、100％或更多、非常特别优选地500％、最优选地1000％或更多。然而，将从头表达也视作本发明的对象。
修饰即提高或降低可以由内源因子或外源因子引起。例如生物或其部分中活性的提高可通过将基因产物或前体或激活剂或激动剂添加至培养基或营养基引起，或通过将所述对象瞬时地或稳定地导入生物引起。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或多个如下步骤；
a)稳定本发明蛋白质；
b)稳定编码本发明蛋白质的mRNA；
c)提高本发明蛋白质的特异活性；
d)表达或提高表达用于本发明蛋白质表达的同源或人工的转录因子；
e)通过外源性诱导因子激发本发明蛋白质的活性；
f)表达编码转基因本发明蛋白质的基因；和/或
g)提高编码本发明蛋白质的基因拷贝数；
h)例如通过位点定向诱变和其它技术操纵基因的内源性调节而提高编码本发明蛋白质的基因的表达。
通常，细胞或生物区室内mRNA或多肽的量与所述空间内已编码的蛋白质或酶的活性相关。该相关不总呈线性，空间内的活性取决于分子的稳定性或存在活化或抑制性辅因子。此外，产物和离析物对酶的抑制众所周知。然而在一个实施方案中，本发明多肽的活性通过提高编码基因、尤其包含本发明多核苷酸序列的核酸分子的表达得以提高，这通常导致本发明多肽的量提高。
在一个实施方案中，鲜重、干重、种子重量和/或种子数的提高通过提高本发明蛋白质的内源性水平实现。本发明蛋白质的内源性水平可例如通过调整多肽的转录性或翻译性调节作用提高。调节序列有效地连接至内源性蛋白质的编码区并控制此内源性蛋白质的转录和翻译或者编码性mRNA或已表达蛋白质的稳定性或降解。为调整和控制表达，可改变或修正启动子、UTR、剪接位点、加工位点、聚腺苷酸化位点、终止子、增强子、转录后或翻译后的修饰位点。例如内源性蛋白质的表达水平可通过将内源性启动子替换为更强的转基因启动子，或通过将内源性3’UTR替换为提供更好稳定性的3’UTR而不修正编码区。此外，转录性调节可以通过导入如以下实例中所述的人工转录因子进行调节。备选的启动子、终止子和UTR描述如下。
在本发明方法关于SEQ ID NO：2的同系物的一个有利实施方案中，提高包含如下共有序列或由此共有序列组成的多肽的活性：
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXGVXXXQGXXXEHXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXLXXXXXXXXPGGESTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTCAGXIXLXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXVXRNXXGXQXXSFXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXFIRAPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXXXXXXXXXFHPELTXXDXXXHXXFXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
其中20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选地5或4个、甚至更优选的是3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换。
在一个实施方案中，不超过5个、优选地4个、甚至更优选地3或2个、最优选地一个通过大写字母所示的氨基酸位置或没有氨基酸位置由X替换。
在一个实施方案中，将20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个氨基酸插入共有序列。
在一个实施方案中，将20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个由X所示的氨基酸自共有序列删除。
共有序列衍生自如图1中所示的以下物种序列的多重比对：Aeropyrum pernix、拟南芥菜(鼠耳芥(Mouse-ear cress))、闪烁古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棉阿舒囊霉(酵母)(Ashbya gossypii)(阿舒假囊酵母Eremothecium gossypii)、蜡状芽孢杆菌ATCC 10987(Bacilluscereus ATCC 10987)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)、欧洲油菜(Brassica napus)、烟草尾孢菌(Cercospora nicotianae)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)(黄短杆菌(Brevibacterium flavum))、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、构巢裸胞壳(Emericella nidulans)(构巢曲霉(Aspergillus nidulans))、大豆(Glycine max)、杜氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、盐杆菌NRC-1(Halobacterium sp.NRC-1)、大麦(Hordeum vulgare)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)、坎氏甲烷嗜高热菌(Methanopyrus kandleri)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、马泽氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)(弗里西亚甲烷八叠球菌(Methanosarcina frisia))、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)、稻(Oryza sativa)(日本栽培变种组(japonica cultivar-group))、副衣原体UWE25(Parachlamydia sp.UWE25)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、需氧热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、Pyrococcus abyssi、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcushorikoshii、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、亲和素链霉菌(Streptomyces avermitilis)、寄居蟹皮海绵(Suberites domuncula)(海绵(Sponge))、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、Sulfolobus tokodaii、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、嗜热栖热菌HB27(Thermus thermophilus HB27)、Tropheryma whipplei(菌株TW08/27)(惠普尔氏芽孢杆菌(Whipple′s bacillus))、玉蜀黍(Zeamays)。X表示任意给定的氨基酸。在共有序列中标出那些在至少80％比对的蛋白质序列(80％共有)中保守的氨基酸。
在本发明方法关于SEQ ID NO：2的同系物的一个有利实施方案中，提高如下多肽的活性，其中所示多肽包含基于植物同源序列比对的如下共有序列或由此共有序组成：
X(2-4)VGVLALQGSXNEHXXALRRXGXXGXEXRKXXQLXXXXSLIIPGGEXTTMAKLAXYXNLFPALREFVXXGXPVWGTCAGLIFLAXXAX(2- 5)GGQXLXGGLDCTVHRNFFGSQXQSFEXXXXVPXLXXXEGGXXTXRGXFIRAPAXLXXGXXVXXLAXXXVPX(11-23)VIVAVXQXNXLATAFHPELTXDXRWHXXFXXMXXEXXXXAX(10-29)
其中20个或更少、优选地15或10个或更少、优选地7个、优选的4或3个、优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换。优选地，不超过1个通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换。
共有序列衍生自如图2中所示的拟南芥菜、卡诺拉油菜(Canola)、大豆、大麦、稻、谷物的植物序列多重比对。X表示任意给定的氨基酸。在此例子中，共有序列中标出了在几乎100％比对的植物蛋白质序列(100％共有)中保守的那些氨基酸。
因此，在本发明方法的一个实施方案中，提高了包含一种或两种所述核心共有序列的多肽的活性，其中10个或更少、优选地7个、优选的4或3个、更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换。优选地，不超过1个通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换。
全部生物的SEQ ID NO：2的同系物的核心共有序列如下代表共有序列的必需部分：(P/S)GGE(S/T)T或(G/A)(T/S)CAGX(I/V)或(V/A/I/C)XRNX(F/Y)GXQXXS(F/S)或FIR(A/S/G)P或FHPE(L/M/E)
因此，在本发明方法的一个实施方案中，提高了包含一个或多个所述核心共有序列的多肽的活性。
植物SEQ ID NO：2的同系物的核心共有序列如下代表共有序列的必需部分：
VGVLALQGSXNEHXXALRRXGXXGXEXRKXXQLXXXXSLIIPGGEXTTMAKLAXYXNLFPALREFVXXGXPVWGTCAGLIFLA
或
GGQXLXGGLDCTVHRNFFGSQXQSFE
或
EGGXXTXRGXFIRAPA
或
VIVAVXQXNXLATAFHPELTXDXRWH
因此在本发明方法的一个实施方案中，提高了包含植物同系物的一个或多个所述核心共有序列的多肽的活性。
在本发明方法关于SEQ ID NO：107的同系物的另一个有利实施方案中，提高了包含或由如下共有序列多肽组成的多肽的活性：
(L/S)XXXXXXXXXXXXXXXXXXX(E/Q)XXX(K/R)
或
(Q/Y)XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX(E/A)XXX(Q/A)
因此在本发明方法的一个实施方案中，提高了包含植物同系物的一种或两种所述核心共有序列的多肽的活性。
用Software GenoMax版本3.4、InforMaxTM、InvitrogenTM生命科学软件，U.S.Main Office，7305Executive Way，Frederick，MD 21704，USA开展多重比对，设置如下：缺口开口罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；缺口分离罚分范围：8％；用于比对延迟的同一性％：40；残基替换矩阵：blosum；亲水残基：G P S N D Q E K R；转换权重：0.5；共有区计算选项：用于共有区的残基比例：0.5。
全部所述变异中的以上共有序列、核心序列、植物共有序列、植物核心共有序列按照术语“共有序列”进行理解。
因此，在本发明方法的一个实施方案中，提高了包含一个或两个所述核心共有序列的多肽的活性，其中10个或更少、优选地7个、优选的4或3个、更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换。优选地，不超过1个通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换。
参考生物优选地意指实施本发明方法前的起始生物(野生型)或者对照生物。
如果该生物是植物并且不能确定作为参考的起源株系，可以接受申请时已由欧洲和德国植物品种办公室批准并具有对待研究植物的最高遗传同源性的品种作为用于测定提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的参考。因此，申请时已经批准的植物品种随后类似地作为对参考细胞器、参考细胞、参考组织或参考器官合适的参考或来源。遗传同源性可以通过技术人员众所周知的方法测定，例如通过指纹分析，如Roldan-Ruiz，Theor.Appl.Genet.，2001，1138-1150中所述。因此，可以如本文中所述根据需要与遗传完全相同的植物相比较，将具有提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性和提高的产量或更快生长的植物或品种视为本发明的植物。根据需要，特异的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性可以如本文中所述由SEQ ID NO：1、106、124、128或136mRNA的量或SEQID NO：2、107、125、129和137蛋白质的量替换。测定动物和微生物的遗传关系的类似方法对技术人员尤其分类学家为充分已知。
根据需要，生物并且尤其实施例中所提及的株系充当参考生物。尤其当不能提供如上所述参考的少数情况下，那里所提及的植物株系充当特定植物物种的参考生物。
已经用于实施本发明方法的起源株系是优选的参考。
物种的多个株系或品种可以具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137的不同量或不同活性。可以发现细胞区室、细胞器、细胞、组织、器官或完整植物中的SEQ ID NO：2、107、125、129或137的量或活性在不同株系或品种间不同。然而，由于本发明以之为基础的观察，可以推定生物总提取物优选地植物总提取物与相应起始株系或相应起始品种或以上所述参考比较的提高引起更快生长和/或更高产量。然而，还可以想到甚至特定器官中例如归因于过量表达的提高的活性可以引起目的效果，即更快生长和更高产量。
以下，术语“提高”包含特性的生成和激发。
为测定“量的提高”、“表达的提高”、“活性的提高”或“质量的提高”，例如将该特性与参考或起始生物的特性比较，但是对已定义的值进行归一化。例如，比较转基因非人生物和参考(野生型)间的表达，例如对总RNA、总DNA或蛋白质的量或对特定基因(或基因产物)如持家基因mRNA的量或活性归一化。提高质量或产量类似地涉及修饰生物和起始生物的比较，但是对单个植物或对每公顷产量等进行归一化。
SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性比参考生物的活性高优选地至少5％、更优选地10％、甚至更优选地20％、30％、50％或100％。最优选地，此活性比参考生物的活性高200％、500％或1000％或更多。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高、优选地因为从10％至100％的提高，生长优选地5％、优选地10％、20％或30％更快。更优选地，与参考生物比较，生长快50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至100％以及10％、20％、30％或50％更快的生长。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高、优选地因为从10％至100％的提高，产量优选地5％、优选地10％、20％或30％更高。更优选地，与参考生物比较，产量更高50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至100％及10％、20％、30％或50％更高的产量。
植物中“加速的生长”、“更快的生长”或“提高的生长速率”意指更快的“植物生长”，即营养阶段中鲜重的提高高于参考植物中的营养阶段、尤其从其中制备本发明植物的初始植物鲜重的提高。优选地，所述植物的终重量也比参考植物的终重量高。
对于微生物或细胞，更快的生长指生物质的更高产生。
“终重量”意指在特定阶段末尾通常所达到的重量或生物产生的生物质。对于植物，“提高的终重量”优选地意指生长阶段末尾的鲜重与参考生物的鲜重比较达到更高。更具体地，更高的终重量可能归因于如以下讨论的更高产量。对于微生物或细胞，“提高的终重量”意指指数期内由所述微生物或细胞产生的生物质的量。
根据本发明，术语“产量”意指适合进一步加工的生物质或生物原料已经提高。术语“进一步加工”指工业加工或立即用作饲料。如果该方法涉及植物，则此术语包括植物细胞和植物组织、器官和处于所有物理形态的植物部分如种子、叶、纤维、根、茎、胚芽、愈伤组织、收获材料、原木，或植物组织、繁殖组织以及衍生自实际植物和/或可用于产生本发明植物的细胞培养物。优选地是植物的任意部分或器官，如叶、茎、枝条、花、根、块茎、果、茎皮、种子、原木等，或者完整植物。种子包含种子任意部分，如种子外壳、表皮细胞和种子细胞或胚芽组织。特别优选农产品或收获的产物，尤其果、种子、块茎、果、根、茎皮或叶或者其部分。
因此，具有提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137表达的拟南芥菜属植物不仅比参考植物显著地更早达到定义的重量，而且还获得更高的最大鲜重、干重、种子重量和/或更高的产量。
因此，例如具有提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137表达的拟南芥菜的鲜重在筛选实验(实验1.1和1.2)中与野生型比较提高15至53％，并且在证明实验(证明部分1或2)中与相同实验的生长于完全相同条件下的野生型植物比较提高26％-56％。细节可以自表1得到。
如果本方法涉及有用动物，“产量”意指有用动物的适合于进一步加工的生物质或生物原料尤其肉、脂肪、骨、器官、皮、毛、卵或奶的量。
如果本发明的方法涉及微生物、术语“产量”意指由所述微生物产生的生物质，例如发酵肉汤和细胞本身。如果微生物产生适合进一步加工或直接应用的特定产物，如以下所述精细化学品，则本发明方法优选地提高每个微生物中或单位时间内所述产物的产生。“提高量”、”提高表达”、”提高活性”或”提高质量”在任何情况下意涉及相同生长条件下与野生型或参考比较提高特定的特性。就本文所提及的特性而言，野生型或参考可以是这样的细胞区室、细胞器、细胞、组织或器官或者非人生物，优选地是植物，其未受本发明方法处理但是在尽可能完全相同的条件下培育并且随后就与根据本发明所制备的产物比较。
“提高”还可以涉及作为参考的细胞区室、细胞器、细胞、组织或器官或者非人生物，优选地是植物，其已经以如此方式得到修饰、改变和/或操作以至有可能测量其中提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性(SEQ ID NO：2、107、125、129或137产物的量以及其相对活性)或SEQ ID NO：2、107、125、129或137的量(每一区室、细胞器、细胞、组织、器官和/或非人生物的量)。
提高还可以受内源因子或外源因子影响，例如通过将SEQ ID NO：2、107、125、129或137或其前体或激活剂添加至营养基或动物饲料。提高还可以通过提高编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137或前体或激活剂的基因的内源性表达或转基因表达，或通过提高以上提及因子的稳定性实施。因子的表型性作用尤其它的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性可以例如在拟南芥中通过组成型表达如实施例中所述测定。SEQ IDNO：2、107、125、129或137活性本文中意指如下所述的活性。
优选提高细胞中的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，并且更优选在一个或多个组织或一个或多个器官中已提高的活性。通常，非人生物中的提高意味非人生物一个或多个组织或一个或多个器官中的提高，并且这又常常需要细胞中的提高，除非蛋白质被分泌。细胞中更高的SEQID NO：2、107、125、129或137活性可由如下所列细胞区室之一中更高的活性引起。
“提高量”、”提高表达”、“提高活性”或”提高质量”在任何情况下意指以组成型或可诱导方式、稳定或瞬时方式提高。例如，提高还可以是细胞或组织内仅在特定时间与参考比较提高，例如仅在特定发育阶段或仅在细胞周期的特定期内。术语“提高”还涉及归因于不同量的提高，该提高可能通过对不同诱导剂如激素或生物性信号或非生物性信号的反应引起。然而，活性还可以通过与以抑制或活化方式相互作用于外源性或内源性调节物的SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽得到提高。
多肽的“SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性”本文中优选地意指所述多肽或如SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、109、111、113、115、117、119、121、133和135中所述同源多肽提高的表达或活性导致更高鲜重、干重、种子重量和/或产量，并且这特别优选地引起众多所述特性，甚至更优选地引起全部所述特性。最优选地，多肽的“SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性”本文中意指所述多肽包含如上所定义的多肽共有区或共有核心序列，或由这样的核酸分子编码，该核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(a)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，或者编码优选地至少成熟形式的SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所述多肽的核酸分子；
(b)包含根据SEQ ID NO：1、106、124、128或136的编码序列，优选至少成熟的多核苷酸的核酸分子；
(c)其序列因遗传密码简并性衍生自根据(a)或(b)的核酸序列所编码的多肽序列的核酸分子；
(d)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，其序列至少20％、优选地35％、更优选地45％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、80％、90％、95％、97％、98％和99％同一于根据(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列；
(e)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加根据(a)至(d)核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生自根据(a)至(d)核酸分子所编码的多肽；
(f)核酸分子，其编码根据(a)至(e)任意核酸分子所编码的SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的片段或表位或共有基序；
(g)包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包含这样的核酸分子的序列，所述核酸分子使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127和/或130和131或其组合中的引物通过扩增优选的微生物cDNA库或植物cDNA库或使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139中的引物通过扩增优选的微生物基因组库或植物基因组库得到；
(h)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽已经借助抗根据(a)至(g)任意核酸分子所编码的多肽的单克隆抗体分离；和
(i)核酸分子，其通过严格条件下使用探针筛选适宜文库可得到，所述探针包含根据(a)至(h)任意序列或者在(a)至(h)中所示核酸的至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段，并且其编码SEQ IDNO：2、107、125、129或137多肽；
(j)编码提高生长或产量的多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所示的序列，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列或SEQ ID NO：2、107、125或129中所示序列或从其中缺失，其中10个或更少、优选地7个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列或从其中缺失；
并且如上所述，该多肽在非人生物、优选地植物中提高的活性导致与参考生物比较更快的生长和/或提高的产量。多核苷酸优选地来自植物或源于原核微生物或真核微生物，例如酵母属(Saccharomyces sp.)。如下所述，植物和微生物优选地生长更快或更强壮和/或具有更高产量。
“提高细胞区室、细胞器、细胞、组织、器官或非人生物，优选地植物中SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性”优选地意指“提高绝对的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性”，即不取决于这是否因为细胞区室、细胞器、细胞、组织、器官或非人生物中的更多蛋白质或更多具有活性的蛋白质。
特异活性可以例如通过突变多肽得以提高，突变的结果是更高的周转率或更好地结合于辅因子，例如提高多肽的稳定性增加例如每单位例如每体积活性或每细胞的活性，即阻止活性因所述多肽的降解随时间丧失。技术人员仍不知道用于测定SEQ ID NO：2、107、125、129或137的特异活性的体外(in-vitro)测定法。
多肽的特异活性可以如以下实施例中所述测定。例如，有可能在模式生物中表达潜在的SEQ ID NO：1、106、124、128或136并在完全相同条件下将模式生物的生长曲线与参考的生长曲线比较。优选地，生长的增加已经能够在细胞水平检测，但是可能需要观察整个营养期。这里优选地使用用于此目的的植物表达和试验系统。因此惊讶地发现植物中酵母蛋白质SEQ ID NO：2、107、125、129或137的组成型表达也引起更快的生长。
术语“提高”既意指物质或活性，本文中指SEQ ID NO：2、107、125、129或137RNA或者SEQ ID NO：2、107、125、129或137DNA或者SEQID NO：2、107、125、129或137蛋白质或者SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性例如首次导入特定环境或以前在所述环境中不可检测到的环境中，例如通过在SEQ ID NO：2、107、125、129或137缺损的非人生物中转基因表达SEQ ID NO：1、106、124、128或136核酸，并且与原初状态比较，特定环境中物质的量或活性得到提高，例如通过在表达SEQ IDNO：2、107、125、129或137的生物中转基因性共表达SEQ ID NO：1、106、124、128或136基因或通过摄取来自环境的SEQ ID NO：2、107、125、129或137。术语“提高”因此还包含从头表达。
植物细胞、植物细胞器、植物组织、植物或其部分的“干重”意指减去包含于植物细胞、植物细胞器、植物组织、植物或其部分中的水量的植物细胞、植物细胞器、植物组织、植物或其部分中的有机物重量。
在本发明的一个实施方案中，(过量)表达核酸序列SEQ ID NO：1、106、124、128或136或其同系物中任一核酸序列的植物细胞、植物细胞器、植物组织、植物或其部分的干重与保藏于德国植物遗传学与农作物研究所(IPK)，Corrensstraβe 3，D-06466Gatersleben最早保藏日期在2005年6月2日前的品种比较提高1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％或更多。
在本发明的另一个实施方案中，(过量)表达核酸序列SEQ ID NO：1、106、124、128或136或其同系物中任一核酸序列的植物细胞、植物细胞器、植物组织、植物或其部分的干重与选自如下的品种比较提高1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％或更多：
(a)陆地棉(G.hirsutum)IPK登录号GOS 6(D 120)、GOS 7(ST 446)、GOS 10(D 1635)、GOS 17(D 4302)或GOS 21(D 5553)，或者亚雷西亚棉(G.areysianum Deflers)，或者G.incanum(Schwartz)Hillc.、或者雷蒙德氏棉(G.raimondii Ulbr.)、或者阿拉伯棉(G.stocksii Masters)、或者瑟伯氏棉(G.thurberi Tod.)、或者毛棉(G.tomentosum Nutt.)、或者三叶棉(G.triphyllum Hochr.)、或者钝叶树棉(Gossypium arboreum)IPK登录号GOS 13(D 1634)、GOS 16(D 4240)、GOS 18(D 4505)、GOS 19(D 4506)、GOS 20(D 4750)或GOS 12(D 1329)、或者海岛棉(Gossypium barbadense)或者草棉(Gossypium herbaceum)；和
(b)欧洲油菜Mika品种、欧洲油菜Digger品种、欧洲油菜Artus品种、欧洲油菜Terra品种、欧洲油菜Smart品种、欧洲油菜Olivine品种、欧洲油菜Libretto品种、欧洲油菜Wotan品种、欧洲油菜Panther品种、欧洲油菜Express品种、欧洲油菜Oase品种、欧洲油菜Elan品种、欧洲油菜Ability品种、欧洲油菜Mohican品种；和
(c)亚麻(Linum usitatissimum)Librina品种、亚麻Flanders品种、亚麻Scorpion品种、亚麻Livia品种、亚麻Lola品种、亚麻Taurus品种、亚麻Golda品种、亚麻Lirima品种；和
(d)玉蜀黍Articat品种、玉蜀黍NK Dilitop品种、玉蜀黍Total品种、玉蜀黍Oldham品种、玉蜀黍Adenzo品种、玉蜀黍NK Lugan品种、玉蜀黍Liberal品种、玉蜀黍Peso品种；和
(e)大豆Oligata品种、大豆Lotus品种、大豆Primus品种、大豆AlmaAta品种、大豆OAC Vision品种、大豆Jutro品种；和
(f)向日葵Helena品种、向日葵Flavia品种、向日葵Rigasol品种、向日葵Flores品种、向葵Jazzy品种、向日葵Pegaso品种、向日葵Heliaroc品种、向日葵Salut RM品种；和
(g)亚麻荠Dolly品种、亚麻荠Sonny品种、亚麻荠Ligena品种、亚麻荠Calinka品种；和
(h)白芥Martigena品种、白芥Silenda品种、白芥Sirola品种、白芥Sito品种、白芥Semper品种、白芥Seco品种；和
(i)红花(Carthamus tinctorius)Sabina品种、红花HUS-305品种、红花landrace品种、红花Thori-78品种、红花CR-34品种、红花CR-81品种；和
(j)芥菜(Brassica juncea)Vittasso品种、芥菜Muscon M-973品种、芥菜RAPD品种、芥菜Co.J.86品种、芥菜IAC 1-2品种、芥菜Pacific Gold品种；和
(k)椰子(Cocos nucifera L.)Maypan、Ceylon Tall、Indian Tall、Jamaica Tall、Malayan Tall、Java Tall、Laguna、KingCRIC 60、CRIC 65、CRISL 98、Moorock tall、Plus palm tall、San Ramon、Typica、Nana或Aurantiaca品种；和
(l)普通小麦(Triticum aestivum L.)Altos品种，德国品种局登记号2646、普通小麦Bussard品种，德国品种局登记号1641、或普通小麦Centrum品种，德国品种局登记号2710；和
(m)甜菜(Beta vulgaris)Dieck 13品种，CPVO登记号19991828、甜菜FD 007品种，CPCO登记号20000506或甜菜HI 0169品种，CPVO登记号20010315；和
(n)大麦Dorothea品种，CPVO登记号20031457、大麦Colibri品种，CPVO登记号20040122、大麦Brazil品种，CPVO登记号20010274或大麦Christina品种，CPVO登记号20030277；和
(o)黑麦(Secale cereale)Esprit品种，CPVO登记号19950246、黑麦Resonanz品种，CPVO登记号20040651或黑麦Ursus品种，CPVO登记号19970714；和
(p)稻Gemini品种，CPVO登记号20010284、稻Tanaro品种，CPVO登记号20020177或稻Zeus品种，CPVO登记号19980388；和
(q)马铃薯(Solanum tuberosum L.)Linda、Nicola、Solara、Agria、Sieglinde或Russet Burbank品种；和
(r)落花生(Arachis hypogaea)疏枝(fastigiata)亚种瓦伦西亚栽培变种；和
(s)落花生密枝(hypogaea)亚种弗吉尼亚栽培变种′Holland Jumbo′、′弗吉尼亚A23-7′或′佛罗里达-416′品种；和
(t)落花生茸毛(hirsuta)亚种Peruvian runner栽培变种′SoutheasternRunner 56-15′、′Dixie Runner′、或′Early Runner′品种；和
(u)落花生珠豆(vulgaris)亚种西班牙栽培变种′Dixie Spanish′、′改良西班牙2B′、或′GFA西班牙′品种。
根据技术人员的知识，细胞、区室等中RNA或多肽的量总是与空间内蛋白质的活性相关。所述相关不总呈线性，例如活性还取决于分子的稳定性或存在活化性或抑制性辅因子。同样地，产物和反应物的抑制众所周知。然而在一个实施方案中，本发明多肽的活性通过提高编码基因尤其包含新多核苷酸中序列的核酸分子的表达得以提高，导致对本发明多肽的量增加的调节。本申请以之为基础的本发明揭示了SEQ ID NO：2、107、125、129或137RNA的量与生物原料的量、尤其鲜重、叶数目以及产量间的依赖性。通常基因提高的表达导致所述基因的mRNA量和所编码多肽量的增加，如也在本文实施例中显示。因此，可以预期细胞器、细胞、组织、器官或植物内提高的活性为当其中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的量提高时。当以不同的方式提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137的量时，相同结果也可以预期。
在一个实施方案中，非人生物或所提到的部分例如器官、细胞、组织或细胞器中SEQ ID NO：2、107、125、129或137mRNA的量或SEQ ID NO：2、107、125、129或137蛋白质的量因此提高。此量还可以例如通过在非人生物细胞中从头表达或增强表达、通过提高的稳定性、降低的降解作用或自外界(提高的)摄取提高。
在一个实施方案中，本发明方法涉及植物更快生长和/或更高的产量。因此在优选的实施方案中，本发明方法包括提高植物中多核苷酸所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的活性，其中所述多核苷酸包含任意的以上所提及的核酸分子(a)至(i)。更优选地，该多核苷酸包含任意的以上所提及核酸分子(a)至(c)。甚至更优选地是提高多核苷酸所编码多肽的活性，其中该多核苷酸包含任意的SEQ ID NO：1、106、124、128或136中所描述序列或包含编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所描述的多肽或其同系物的核酸。
以下描述优选的同系物。因此，特别优选的同系物在氨基酸水平至少20％、优选地40％、更优选地50％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％并且最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于SEQ ID NO：1、106、124、128或136所编码或者SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所描述的多肽，并且再次优选SEQ ID NO：1、106、124、128或136所编码的氨基酸序列和SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所描述的氨基酸序列的同系物。如果本发明涉及植物或涉及用于提高植物中生长或产量的方法，植物中SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性与参考生物比较提高5％或更多，更优选地10％、甚至更优选地20％、30％、50％或100％。最优选地，活性与参考生物比较提高200％、500％或1000％或更多。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性、尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高，优选地因为从10％至100％的提高，植物的生长更快优选地5％、优选地10％、20％或30％。更优选地，生长与参考生物比较更快50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至1000％并还优选10％、20％、30％或50％更快的生长。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性、尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高，优选地因为从10％至100％的提高，植物的产量高优选地5％、优选地10％、20％或30％。更优选地，产量与参考生物比较更高50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至100％并还优选10％、20％、30％或50％更高的产量。
在另一个实施方案中，本发明的方法涉及微生物中更快的生长和/或更高的产量。令人惊讶的是表达酿酒酵母的SEQ ID NO：1、106、124、128或136引起拟南芥菜属中更快的生长并可以引起更高的产量。由于SEQ IDNO：2、107、125、129或137的高度保守特性，也可以预期微生物或动物中SEQ ID NO：2、107、125、129或137提高的活性将引起更快的生长，即分裂的更高速率和更高的生长速率或归因于更大的细胞。因此，在一个优选的实施方案中，本发明方法包括提高微生物、动物或细胞中多核苷酸所编码多肽SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性，其中该多核苷酸包含任意的以上提及的核酸(a)至(i)。更优选地，该多核苷酸包含任意的以上提及的核酸(a)至(i)或其任意所述同系物。如下描述优选的同系物。例如，特别优选的同系物在氨基酸水平至少30％、优选地40％、更优选地50％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、并且最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于根据SEQ ID NO：2、107、125、129或137的多肽。
在一个实施方案中，核酸分子编码包含SEQ ID NO：1、106、124、128或136中所示序列的SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列内，其中10个或更少、优选地7个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列或从其中缺失。
在一个实施方案中，核酸分子编码了包含或由含有以上所定义来自不同生物的共有序列或共有核心序列的多肽组成的多肽SEQ ID NO：2，并且如图1中显示，其中20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个图1中通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换和/或不超过5个、优选地4个、甚至更优选的3或2个、最优选的一个或没有图1中通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换和/或将20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个氨基酸插入共有序列或从其中缺失。
在一个实施方案中，核酸分子编码了包含或由含有以上所定义来自不同植物种的共有序列或共有核心序列的多肽组成的多肽SEQ ID NO：2，例如在图2中所示，其中20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个图2中通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换和/或不超过5个、优选地4个、甚至更优选的3或2个、最优选的一个或没有图2中通过大写字母所示的氨基酸位置由X替换和/或将20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3个、甚至更优选的2个、甚至更优选的1个、最优选的0个氨基酸插入共有序列或从其中缺失。
如果本发明涉及微生物或涉及用于提高微生物中生长或产量的方法，SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性与参考生物比较高至少5％，更优选地10％、甚至更优选地20％、30％、50％或100％。最优选地，该活性与参考生物比较高200％、500％或1000％或更多。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性、尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高，优选地因为从10％至100％的提高，微生物的生长更快优选地5％、优选地10％、20％或30％。更优选地，生长与参考生物比较更快50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至100％并还优选10％、20％、30％或50％更快的生长。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高，优选地因为从10％至100％的提高，微生物的产量尤其生物质更高优选地5％、优选地10％、20％或30％。更优选地，产量与参考生物比较更高50％、100％、200％或500％或更多。还优选地是提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性10％、20％、30％或从50％至100％并还优选10％、20％、30％或50％更高的产量。
在又一实施方案中，本发明的方法涉及有用动物中更快的生长和/或更高的产量。因此，在一个优选的实施方案中，本发明方法包括提高有用动物中由包含任意以上所提及核酸的多核苷酸所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的活性。更优选地，该多核苷酸包含任意的以上提及的核酸(a)至(c)。
如果本发明涉及有用动物或涉及用于与参考动物比较提高有用动物生长或产量的方法，SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性比参考生物的活性优选地高至少5％、更优选地10％、甚至更优选地20％、30％、50％或100％。最优选地，该活性比参考生物中的活性高200％、500％或1000％或更多。
因为较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性，尤其因为SEQID NO：2、107、125、129或137活性从5％至1000％的提高，优选地因为从10％至100％的提高，通过比较，有用动物的生长更快优选地5％、优选地10％、20％或30％。更优选地，生长与参考生物比较更快50％、100％、200％或500％或更多。还优选提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽活性10％、20％、30％或从50％至100％并且还优选10％、20％、30％或50％更快的生长。
核酸序列SEQ ID NO：124、128或136和本发明中所用的核酸序列是编码其活性至今仍不确切了解的多肽的核酸序列。
由于SEQ ID NO：2与参与维生素B6生物合成中蛋白质的同源性，可以推断SEQ ID NO：2是直接或间接参与维生素B6代谢中的相应蛋白质。因此，有可能通过测量维生素B6的生物合成性活性测定细胞、细胞器、区室、组织、器官或非人生物、尤其植物中SEQ ID NO：2蛋白质提高的活性。
由于SEQ ID NO：107对相关于液泡形态发生蛋白VAM 7的蛋白质的同源性，可以推断SEQ ID NO：107是直接或间接参与液泡膜生理的相应蛋白质。因此，有可能通过测量该蛋白质在液泡膜内的存在而测定细胞、细胞器、区室、组织、器官或非人生物、尤其植物中SEQ ID NO：107蛋白质提高的活性。
除此之外，SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性可以通过测量SEQ ID NO：2、107、125、129或137RNA的量或SEQ ID NO：2、107、125、129或137蛋白质的量间接地测定。因此，本文中所述本发明多核苷酸的定量RNA印迹或定量PCR可以测定例如细胞中或总提取物中的mRNA量，并且蛋白质印迹可用于将例如细胞中或总提取物中蛋白质的量与参考中蛋白质的量相比较。这类方法对技术人员为已知并且已广泛描述，例如在Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989或在Current Protocols，1989and updates，John Wiley&Sons，N.Y.或其它以下引用的来源中。
用于本发明方法中制备的合适非人生物(宿主生物)原则上是如以下所列的任意非人生物，它的更快生长有用并是想要得到的，例如微生物如酵母、真菌或细菌、单子叶植物或双子叶植物、藓类、藻类并且还是有用动物。术语“非人生物、宿主生物或有用动物”还包括人类来源的活材料，例如人细胞系，但是不包括人类生物。
术语“植物”，如本文中所用，可以包括高等植物、低等植物、藓类和藻类；然而，在本发明方法的优选实施方案中，术语“植物”指高等植物。
有利地，本发明的方法使用如以下所列属于有用植物的植物。除了产生动物饲料或食物外，根据本发明所产生的植物尤其可以还用于制备精细化学品。
在一个实施方案中，本发明的方法包括通过提高所述生物或其一个或多个部分中至少一个由核酸分子所编码多肽的活性而增加SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的活性，其中所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(aa)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，或者编码优选至少成熟形式的SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所述多肽的核酸分子；
(bb)包含根据SEQ ID NO：1、106、124、128或136的编码序列，优选地至少成熟的多核苷酸的核酸分子；
(cc)其序列因遗传密码简并性衍生自根据(aa)或(bb)的核酸序列所编码的多肽序列的核酸分子；
(dd)编码多肽的核酸分子，所述多肽的序列至少20％、优选地35％、更优选地45％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、80％、90％、95％、97％、98％和99％同一于根据(aa)至(cc)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列；
(ee)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加根据(aa)至(dd)、优选地根据(aa)至(dd)核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生自根据(aa)至(dd)、优选地根据(aa)至(cc)核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽；
(ff)核酸分子，其编码由根据(aa)至(ee)、优选地(aa)至(cc)任意核酸分子所编码的SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的片段或表位或共有基序；
(gg)包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包含这样的核酸分子的序列，所述核酸分子使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139或其组合中的引物通过扩增优选的微生物cDNA库或植物cDNA库或使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139中的引物通过扩增优选的微生物基因组库或植物基因组库得到；
(hh)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽已经借助抗根据(aa)至(gg)、优选地(aa)至(cc)任意核酸分子所编码的多肽的单克隆抗体分离和
(ii)核酸分子，其通过严格条件下使用探针筛选适宜文库可得到，其中所述探针包含根据(aa)至(hh)、优选地(aa)至(cc)的任意序列或者在(aa)至(hh)、优选地在(aa)至(cc)中所表征核酸的至少15nt、优选地20nt、30nt、50个核苷酸、100nt、200nt或500nt的片段；并且其编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，或
(jj)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：1、106、125或128中所示序列，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列，或其中10个或更少、优选地7个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列。
或包含其互补序列。
在一个实施方案中，SEQ ID NO：2、107、125、129或137蛋白质的活性通过如下方式提高：
(a)提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的表达；
(b)提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137RNA或者SEQ ID NO：2、107、125、129或137蛋白质，优选地(a)中所述多肽或多核苷酸的稳定性；
(c)提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137蛋白质，优选地(a)中所述多肽或由(a)中所述多核苷酸编码的多肽的特异活性；
(d)表达能够提高内源性SEQ ID NO：2、107、125、129或137基因功能的表达的天然或人工转录因子，优选地包含(a)中所述多核苷酸的序列；或
(e)将提高或诱导SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性或SEQ IDNO：2、107、125、129或137表达的外源因子加入食物或培养基，优选地是(a)中所述的多核苷酸或多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的方法包括通过将多核苷酸导入至生物，优选地至植物，或至其一个或多个部分而提高SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的活性，该多核苷酸编码由这样的核酸分子所编码的SEQID NO：2、107、125、129或137多肽，其中所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(a)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，或者编码优选地至少成熟形式的SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所述多肽的核酸分子；
(b)包含根据SEQ ID NO：1、106、124、128或136编码序列，至少优选成熟的多核苷酸的核酸分子；
(c)其序列因遗传密码简并性衍生自根据(a)或(b)的核酸序列所编码的多肽序列的核酸分子；
(d)编码多肽的核酸分子，所述多肽的序列至少20％、优选地35％、更优选地45％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、80％、90％、95％、97％、98％和99％同一于根据(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列；
(e)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加根据(a)至(d)、优选地(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生自根据(a)至(d)、优选地(a)至(c)核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的氨基酸序列；
(f)核酸分子，其编码根据(a)至(e)的任意核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的片段或表位或共有基序；
(g)包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包含这样的核酸分子的序列，所述核酸分子使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127或130和131或其组合中的引物扩增通过优选的微生物cDNA库或植物cDNA库或使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139中的引物通过扩增优选的微生物基因组库或植物基因组库得到；
(h)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽已经借助抗根据(a)至(g)、优选地(a)至(c)任意核酸分子所编码的多肽的单克隆抗体分离；和
(i)核酸分子，其通过严格条件下使用探针筛选适宜文库可得到其中所述探针包含(a)至(h)、优选地(a)至(c)的任意序列或者在(a)至(h)、优选地(a)至(c)中所表征核酸的至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段，并且其编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽。
(j)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：1、106、125或128中所示序列，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列，或其中10个或更少、优选地7个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或因而将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列；
或包含其互补序列。
生物优选地是微生物，或更优选地是植物。
术语“编码”序列或“编码”根据本发明意指编码的序列和互补序列或这些序列的参考，即DNA和RNA序列均视为可编码。例如，结构基因通过转录编码mRNA，通过翻译编码蛋白质，并且编码性mRNA翻译为蛋白质。两种分子均含有引起编码的多肽的序列信息，即它们均编码所述多肽。RNA和多肽的转录后修饰和翻译后修饰为技术人员充分所知并且类似地包含。
根据本发明，“生物或其一个或多个部分”意指生物或非人生物的细胞、细胞区室、细胞器、组织或器官。
根据本发明，“植物或其一个或多个部分”意指细胞、细胞区室、细胞器、组织、器官或植物。
术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”以及“多肽”和“蛋白质”在本文中同义使用。
在本发明的方法中，“核酸”或“多核苷酸”意指可以是单链或双链或根据需要可以具有掺入DNA或RNA的合成性、非天然或修饰的核苷酸碱基的DNA或RNA序列。
因此，本发明还涉及这样的多核苷酸，其包含选自如下的核酸分子：
(a)编码，优选地至少成熟形式的，如SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所述多肽，或包含在1、106、124、128或136中所述，优选至少成熟形式的，多核苷酸的核酸分子；
(b)其序列因遗传密码简并性衍生自根据(a)的核酸分子所编码的多肽序列的核酸分子；
(c)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，其序列至少30％、优选地35％、更优选地45％、甚至更优选地60％、甚至更优选地70％、80％、90％、95％、97％、98％和99％同一于SEQ ID NO：1、106、124、128或136中所述序列编码的多肽的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：1、106、124、128或136中所述序列的核酸分子；
(d)编码多肽，其通过替换、缺失和/或添加根据(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生自根据(a)至(c)核酸分子所编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，和编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子。
(e)编码由根据(a)至(d)、优选地(a)至(c)任意核酸分子所编码SEQ IDNO：2、107、125、129或137多肽的片段或表位，和编码具有SEQ IDNO：2、107、125129或137活性的蛋白质的核酸分子；
(f)包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包含这样的核酸分子的序列，所述核酸分子使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127和/或130和131或其组合中的引物通过扩增植物cDNA库或使用SEQ IDNO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139中的引物通过扩增优选的微生物基因组库或植物基因组库得到；
(g)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽，其已经借助抗根据(a)至(f)、优选地(a)至(c)任意核酸分子所编码的多肽的单克隆抗体分离，和编码具有SEQ ID NO：2，107，125或129活性的蛋白质的核酸分子；
(h)核酸分子，其通过使用探针在严格条件下筛选适宜文库可得到，其中所述探针包含根据(a)至(g)的任意序列或者在(a)至(g)、优选地(a)至(c)中所表征核酸的至少15nt、优选选地20nt、30nt、50个核苷酸、100nt、200nt或500nt的片段，并且其编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽；
(i)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：1，106，124或128中所示序列，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列，或其中10个或更少、优选地7个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或因而将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列或从其中缺失；
或其互补链，根据(a)至(i)的所述多核苷酸或所述核酸分子不含SEQ IDNO：1、106、124、128或136中所述序列。
优选地，本发明的多核苷酸与本文中所示先前公开的的多核苷酸，例如与SEQ ID NO：NO 1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或108、110、112、114、116、118、120或106、124或128或136至少一个核苷酸不同。优选地，编码的多肽与先前公开的多肽，例如与SEQ ID NO：2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95或107、109、111、113、115、117、119、121或125或129、137至少一个氨基酸不同。
SEQ ID NO：1和2描述了酿酒酵母基因座YMR095C的多肽(SEQID NO：2)和核酸序列(SEQ ID NO：1)，例如公开于登录号PIR|S55081下的YMR095c蛋白质和登录号GENESEQ_DNA|AAA14857下的YMR095C核酸序列。
SEQ ID NO：106和107描述了酿酒酵母基因座YGL212w的多肽(SEQ ID NO：107)和核酸序列(SEQ ID NO：106)，例如公开于登录号PIR|S31263下的YGL212W蛋白质和登录号Z72734下的YGL212w核酸序列。
SEQ ID NO：124和125描述了酿酒酵母基因座YMR107w的多肽(SEQ ID NO：125)和核酸序列(SEQ ID NO：124)，例如公开于登录号SWISSPROT|YMZ7_酵母下的YMR107w蛋白质和登录号植物|AY558405下的YMR107W核酸序列。
SEQ ID NO：128和129描述了酿酒酵母基因座YDL057w的多肽(SEQ ID NO：129)和核酸序列(SEQ ID NO：128)，例如公开于登录号SPTREMBL|Q07379下的YDL057W蛋白质和登录号植物|Z74105下的YDL057w核酸序列。
SEQ ID NO：136和137描述了酿酒酵母基因座YGL217C的多肽(SEQ ID NO：137)和核酸序列(SEQ ID NO：136)，例如公开于登录号NP_011298.1下的YGL217C蛋白质和登录号AY693253下的YGL217C核酸序列。
在一个实施方案中，本发明还涉及编码如来自植物的多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含编码多肽的核酸分子，该核酸分子包含SEQ ID NO：52、78、90、98、100、102、104、108、118、132或134中或选自如下的任一核酸分子：
(a)核酸分子，其编码，优选地至少成熟形式的，如53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所述的多肽，或者其包含SEQ IDNO：52、78、90、98、100、102、104、108、118、132或134中所述的，优选至少成熟形式的，多核苷酸；
(b)其序列因遗传密码简并性衍生自根据(a)的核酸分子的核酸所编码的多肽序列的核酸分子；
(c)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少55％、优选地60％、更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、最优选地95％、97％、98％和99％同一于在SEQ ID NO：52、78、90、98、100、102、104、108、118、132或134中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ ID NO：52、78、90、98、100、102、104、108、118、132或134中所描述的序列；
(d)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少90％、优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列；
(e)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少65％、更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ IDNO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所描述的序列；
(f)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少55％、更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ IDNO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所描述的序列；
(g)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少35％、更优选地50％、60％或70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所描述的序列；
(h)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少55％、优选地60％、更优选地70％、甚至更优选地80％、甚至更优选地90％、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所描述的序列；
(i)核酸分子，其编码这样的多肽，它的序列至少90％、优选地95％、96％、97％、98％或99％同一于在SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中描述的序列所编码多肽的氨基酸序列；或其包含SEQ ID NO：53、79、91、99、101、103、105、109、119、133或135中所描述的序列；
(j)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加根据(a)至(i)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生自根据(a)至(i)的多核苷酸所编码的多肽；
(k)编码通过根据(a)至(j)任意核酸分子所编码多肽的片段和表位的核酸分子；
(l)包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包含这样的核酸分子的序列，所述核酸分子使用SEQ ID NO：96和97、122和123、126和127、130和131和/或138和139或其组合中的引物通过扩增微生物cDNA文库或植物cDNA文库或扩增优选的微生物基因组文库或植物基因组文库得到；
(m)编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子，其中所述多肽已经借助抗根据(a)至(l)任意核酸分子所编码的多肽的单克隆抗体分离；
(n)通过使用探针在严格条件下筛选适宜文库可得到并编码多肽的核酸分子，其中所述探针包含根据(a)至(m)任意序列或者在(a)至(m)中所表征核酸的至少15nt、优选选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段；
(o)编码包含SEQ ID No：2、107、125、129或137中所示序列的多肽的核酸分子，其中20个或更少、优选地15或10个所示的氨基酸位置可以由X替换和/或其中将20个或更少、优选地15或10个氨基酸插入所示序列或SEQ ID NO：2、107、125、129或137中所示序列或从其中缺失和/或因而将10个或更少、优选地7个氨基酸插入所示序列或从其中缺失；
或其互补链，优选地，根据(a)至(o)的所述多核苷酸或所述核酸分子不包含SEQ ID NO：1、106、124、128或136中所描述的序列或其互补序列。根据本发明，多核苷酸可以是DNA或RNA。
原则上，编码具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的多肽的任意核酸可以在本发明的方法中使用。在产生具有更多生物质或更高产量的植物时，核酸有利地来自植物如藻类、藓类或高等植物。
在本发明的方法中，核酸序列有利地选自编码仍具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137生物学活性的多肽的序列SEQ ID NO：52，78，90、98，100、102，104，108，118，132，134或其以上所述衍生物或同系物。将这些序列，包括其它基因分别地或组合地克隆至表达构建体。
特定供体生物的编码具有SEQ ID NO：2、107、125、129或13活性的多肽的核酸序列通常可以获得。本文中必须特别提到的常用基因数据库是例如EMBL数据库(Stoesser G.等，Nucleic acids Res.2001，第29卷，17-21)、GenBank数据库(Benson D.A.等，Nucleic acids Res.2000.卷28，15-18)或PIR数据库(Barker W.C.等，Nucleic acids Res.1999.第27卷，39-43)。还可以使用生物特异性基因数据库，例如有利地是SGD酵母数据库(Cherry J.M.等，Nucleic acids Res.1998，第26卷，73-80)或MIPS酵母数据库(Mewes H.W.等，Nucleic acids Res.1999.第27卷，44-48)、GenProtE大肠杆菌数据库(http：//web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)和TAIR拟南芥数据库(Huala，E.等，Nucleic acids Res.2001第29卷(1)，102-5)或MIPS拟南芥数据库。
有利地，本发明方法中所用的SEQ ID NO：2、107、125、129或137和所用的非人生物来自相同起源或来自尽可能遗传接近的来源，例如来自相同或亲缘关系非常接近的型或种。然而也可以在非人生物中使用合成性SEQ ID NO：2、107、125、129或137。
在另一个实施方案中，使用编码本发明蛋白质的不自非人生物衍生的基因可能有利，在其中应当实施本发明以避免当基因在衍生该基因的生物内过量表达时有时出现的共抑制问题。
根据本发明，术语“基因”意指包含编码的基因部分和调节元件的核酸序列。“编码的基因部分”根据本发明意指连续的核酸序列(“可读框”，缩写ORF)。所述ORF可能不含、含有一个或多个通过合适剪接位点与ORF内存在的外显子连接的内含子。ORF及其调节元件编码了例如翻译为酶、转运蛋白、离子通道等的结构基因，例如翻译为Rho或Sigma蛋白的非结构基因例如调节基因。然而，还可以编码不翻译为蛋白质的基因。为了在非人生物中表达，将编码的基因部分与特定调节元件如启动子、终止子、UTR等一起表达。调节元件可以为同源或异源。以下术语“核酸”和“多核苷酸”包括了基因、编码的基因部分(ORF)、调节序列。
术语“表达”意指转录和/或翻译编码的基因部分或基因。得到的产物通常是mRNA或蛋白质。然而表达产物还包括RNA例如调节性RNA或核酶。表达可以呈全身性或局部性，例如限制于特定细胞类型、组织或器官。表达包括转录区域内特别涉及转录rRNA、tRNA和mRNA、涉及RNA转运和涉及转录物加工的过程。在蛋白质生物合成的区域内，特别包括核糖体生物发生、翻译、翻译性控制和氨酰基-tRNA合成酶。蛋白质加工区域内的功能特别地涉及折叠和稳定化、涉及定向、分选和转位并且涉及蛋白质修饰、蛋白质复合物组装和蛋白质的蛋白水解性降解。
编码的基因部分(ORF)和其调节元件的表达产物可以通过它们的功能表征。这些功能的实例是如下领域内的功能：代谢、能量、转录、蛋白质合成、蛋白质加工、细胞转运和转运机制、细胞通信和信号转导、细胞拯救、细胞防御和细胞毒力、调节细胞环境和细胞与环境的相互作用、细胞命运、转座元件、病毒蛋白质和质粒蛋白质、控制细胞组织化、亚细胞定位、调节蛋白质活性、具有结合功能或需要辅因子的蛋白质和易化运输。将具有相同功能的基因共同划归于“功能基因家族”。根据本发明，SEQ IDNO：1、106、124、128或136的表达引起提高的生长速率。
多核苷酸通常包括用于表达的位于编码基因区3’末端和5’末端的非翻译序列：例如编码区5’末端上游序列的500至100nt和/或例如编码基因区3’末端下游序列的200至20nt。将“分离”的核酸分子自该核酸天然来源内存在的其它核酸分子中取出。“分离”的核酸优选不含在自其中起源所述核酸的生物的基因组DNA中天然分布于此核酸两侧的序列(例如位于该核酸5’末端和3’末端的序列)。在多个实施方案中，分离的核酸分子SEQ ID NO：1、106、124、128或136可以包含例如5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5、0.1kb或0kb的在其中起源所述核酸的细胞的基因组DNA中天然分布于此核酸分子两侧的核苷酸序列。
可以使用分子生物学标准技术和本文中所提供的序列信息分离本方法中所用的核酸分子，例如具有本发明方法中所用核酸分子或其部分的核苷酸序列的核酸分子。还可借助于比较性算法在DNA水平或氨基酸水平鉴定例如同源序列或同源的、保守的序列区域。这些序列区域可以作为杂交探针通过如Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor、NY、1989中所述的标准杂交技术分离本方法中有用的其它核酸序列。此外，包含本发明方法中所用SEQ ID NO：1、106、124、128或136或SEQ ID NO：3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118、120、132或134或其它核酸分子的完整序列或其部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应(PCR)分离并根据已知方法制备。可使用逆转录制备的cDNA或备选地用基因组DNA作为模板及合适的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸。以这种方式所扩增的核酸可以克隆至合适载体并通过DNA序列分析进行表征。
本发明方法中所用核酸分子的同系物的实例是等位变体，其至少30％、优选地40％、更优选地50％、60％、70％、80％或90％以及甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％或更多同一于SEQ ID NO：3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118、120、132或134中所述的任意核苷酸序列。等位变体尤其包括功能性变体，其可通过自/向/在如SEQ ID NO：3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118、120、132或134所述的序列中缺失、插入或替换核苷酸得到，但旨在保留或提高自其衍生的所合成蛋白质的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性。仍保留SEQ ID NO：2、107、125、129或137的生物学活性或酶活性的蛋白质还包括活性基本未降低的那些蛋白质，即与SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135所编码的蛋白质比较具有5％、优选地20％、特别优选地30％、非常特别优选地40％或更多的原初生物学活性。
但是优选地与SEQ ID NO：1、106、124、128或136的异源性表达相比，同源活性在特定非人生物中提高。
本发明方法中所用的核酸分子SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118、120或106、124或128或132、134或136的同系物还意指例如原核或真核即例如细菌、动物、真菌和植物的同系物、截短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。
本发明方法中所用的核酸分子SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118、120或106、124或128或132、134或136的同系物还包括衍生物，例如编码序列的变体或调节序列例如启动子、UTR、增强子、剪接信号、加工信号、多腺苷酸化信号等的变体。所示核苷酸序列的衍生物可以通过替换一个或多个核苷酸、通过插入和/或缺失修饰，而不破坏功能性或活性。衍生物的活性还有可能通过修饰衍生物的序列提高或将所述衍生物彻底替换为更活跃的元件，甚至来自异源生物的那些元件。
为测定两种氨基酸序列(例如任意SEQ ID NO：2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或107或109、111、113、115、117、119、121或125、或129、133、135或137的序列)或两种核酸(例如任意的SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118或120或106、124或128或132、134或136的序列)同源性(＝同一性)百分数，将序列相互比较，例如通过比对所述序列，或借助计算机程序分析两种序列。可以将缺口导入一种蛋白质序列或一种核酸序列以产生与另一种蛋白质或另一种核酸的优化比对。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当一个序列中的某位置被来自另一个序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在此位置同一(即本文中所用的氨基酸和核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列间的同源性百分数是两个序列间共有相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。因此本文中将术语同源性和同一性作同义词使用。
两种蛋白质或两种核酸序列间的“同一性”意指遍及全长的同一性，尤其如实施例中描述而实施的同一性。
使用NCBI标准设置氨基酸序列的blastp比较，即使用如下参数：“基于成分的统计”和“低复杂性滤器”，“预期”：10，“字大小”：3，“矩阵”：Blosum62和“缺口成本”：存在：11延伸：1。
如下通过图3中SEQ ID NO 2的实例和图4中SEQ ID NO 107的实例显示多种氨基酸序列对SEQ ID NO：2和对SEQ ID NO：107的氨基酸序列的同一性。
然而，为测定两种或多种氨基酸序列或两种或多种核苷酸序列的同源性百分数(＝同一性)，已经开发了几种其它计算机软件程序。可以使用例如其目前已经在fasta 3版本所用的软件fasta计算两种或多种序列的同源性(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，Improved Tools for BiologicalSequence Comparison.PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)Rapidand Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA，Methods inEnzymology 183：63-98；W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)ImprovedTools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)；Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTAMethods in Enzymology 183：63-98)。用于计算不同序列同源性的另一种有用程序是Biomax pedant software(Biomax，Munich，联邦德国)中所包含的标准blast程序。不过因为并不总是包括主题和询问的完整序列，该程序有时候产生次优结果。然而由于这个程序极为高效，故可以用它比较为数众多的序列。一般使用如下设置进行序列比较：
-p程序名称[String]；-d数据库[String]；默认＝nr；-i询问文件[File In]；默认＝标准输入；-e预期值(E)[Real]；默认＝10.0；-m比对视野选项(view options)：0＝配对；1＝显示同一性的query-anchored同一性；2＝无同一性的query-anchored；3＝flat query-anchored，显示同一性；4＝flat query-anchored，无同一性；5＝query-anchored无同一性且平末端的；6＝flat query-anchored，无同一性且平末端；7＝XML Blast输出；8＝tabular；9＝tabular with comment lines[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]选项；默认＝标准输出；-F滤器询问序列(DUST以blastn，SEG以其它)[String]；默认＝T；-G引入空位的成本(零引发默认行为)[整数]；默认＝0；-E延伸空位的成本(零引发默认行为)[整数]；默认＝0；-X对于已经导入空位的比对的X扣除值(in bits)(零引发默认行为)；blastn 30.megablast 20.tblastx 0.所有其它15[整数]；默认＝0；-I显示GI′s in deflines[开启/关闭]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配加分(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v显示对(V)在线描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b显示对(B)比对的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f扩展配对命中的阈值，若为零则默认；blastp 11，blastn 0.blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g开展带空位的比对(对于tblastx不可用)[开启/关闭]；默认＝开启；-Q询问所用遗传密码子[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码子(仅对于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a所用处理器数[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[File Out]选项；-J信任询问Believe the querydefline[开启/关闭]；默认＝关闭；-M Matrix[String]；默认＝BLOSUM62；-W字大小，若为零则默认(blastn 11，megablast 28，所有其它3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(对真实大小使用零)[Real]；默认＝0；-K来自一个区的最佳命中数(默认关闭，若使用，推荐值100)[整数]；默认＝0；-P对多命中是0，单命中是1[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度(对真实大小使用零)[Real]；默认＝0；-S Query strands to search针对数据库搜索的询问链(对于blast[nx]，和tblastx)；3为两个，1为顶部，2为底部[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[开启/关闭]；默认＝F；-l将数据库搜索限家在GI列表[String]任选；-U Use lower case fltering of FASTA序列[开启/关闭]任选；默认＝F；-y非空位延伸X扣除值(0引发默认行为)；blastn 20.megablast 10.所有其它7[Real]；默认＝0.0；-Z最终空位比对X扣除值(0.0引起默认动作)；blastn/megablast 50.tblastx 0.其余25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN checkpoint file[File In]任选；-nMegaBlast search[开启/关闭]；默认＝F；-L在查询序列上的定位[串]任选；-A多命中窗口大小，若为零则默认(blastn/megablast 0.所有其它40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(用于blastx的OOF算法)[整数]；默认＝0；-t连接HSP的tblastn中所允许的最大内含子长度(0不能连接)[整数]；默认＝0.
高品质结果通过使用Needleman和Wunsch算法或Smith和Waterman算法得到。因此优选基于所述算法的程序。序列比较有利地可用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360.1987，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)或优选地可用分别基于Needleman和Wunsch算法[J.Mol.Biol.48；443-453(1970)]或Smith和Waterman算法[Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)]的程序Gap和BestFi完成。两种程序都是软件包GCG[Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)；Altschul等(1997)Nucleic acids Res.25：3389et SEQ]的部分。因此，测定序列同源性百分数的计算优选地用Gap程序在全序列范围内完成。可以使用如下用于比较核酸序列的标准调整值：缺口权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。
有利于本发明方法的核酸分子可以基于该核酸分子对本文中所公开和本发明方法中所用核酸的同源性，通过使用这些核酸的序列或其部分作为探针，还根据例如US 2002/0023281中所述的标准杂交技术在严格杂交条件下分离，这里明确将此文献引用作为参考。本文中有可能使用例如分离的核酸分子，其长度是至少10个、优选地至少15个核苷酸并且在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118或120或106、124或128或132、134或136的核苷酸序列的核酸分子杂交。如本文中所用，术语“在优选地严格条件下杂交”将描述使彼此至少20％同一的核苷酸序列相互杂交的杂交条件和洗涤条件。如本文中所用，术语“在严格条件下杂交”将描述彼此30％、但优选地50％或更多同一的核苷酸序列相互杂交的杂交条件和洗涤条件。优选地，该条件是彼此60％、更优选地75％并且甚至更优选地至少接近85％或更多同一的核苷酸序列通常维持相互杂交的条件。两种聚核酸或聚氨基酸的同一性可以如本文中所述测定。这些严格条件对技术人员为已知并可以在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.或在Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989中找到。严格杂交条件的优选非限制性的实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在大约45℃杂交，随后是在50至65℃在0.2×SSC，0.1％SDS中一个或多个洗涤步骤。技术人员知道根据核酸类型、尤其根据AT或GC含量、或根据是否存在有机溶剂这些杂交条件在温度、洗涤时间和杂交溶液和洗涤溶液的盐浓度上变化。在“标准杂交条件”下，例如在具有0.1至5×SSC(pH 7.2)浓度的含水缓冲液内，温度在42℃和58℃间变动，这取决于核酸类型。如果在以上提及的缓冲液中存在有机溶剂如50％甲酰胺，则标准条件下的温度是大约42℃。例如对于DNA：DNA杂交体，杂交条件是0.1×SSC和从20℃至45℃，优选地在30℃和45℃间。例如对于DNA：RNA杂交体，杂交条件优选地是0.1×SSC和从30℃至55℃，优选地在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度是例如对长大约100bp(＝碱基对)并具有50％G+C含量的核酸在甲酰胺不存在时测定。基于如上提及的教材或如下教材：Sambrook，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编辑)1985，“Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach”，IRL Press atOxford University Press，Oxford；Brown(编辑)1991，“Essential MolecularBiology：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford或“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)技术人员知道如何确定所需要的杂交条件。
DNA杂交(DNA印迹分析法)条件和洗涤步骤的某些实例显示如下：
(1)可例如从如下条件中选择杂交条件：
a)在65℃4×SSC，
b)在45℃6×SSC，
c)在68℃6×SSC、100mg/ml变性的片段化鱼精DNA，
d)在68℃6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的鲑鱼精DNA，
e)在42℃6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的片段化鲑鱼精DNA、50％甲酰胺，
f)在42℃50％甲酰胺、4×SSC，
g)在42℃50％(vol/vol)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5、750mM NaCl、75mM柠檬酸钠，
h)在50℃2×或4×SSC(低严格条件)，或
i)在42℃30至40％甲酰胺、2×或4×SSC(低严格条件)。
(2)可例如从如下条件中选择洗涤步骤：
a)在50℃0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS。
b)在65℃0.1×SSC。
c)在68℃0.1×SSC、0.5％SDS。
d)在42℃0.1×SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺。
e)在42℃0.2×SSC、0.1％SDS。
f)在65℃2×SSC(低严格条件)。
此外，有可能通过比较与SEQ ID NO：2、107、125、129或137同源的蛋白质序列或来自多种生物的蛋白质鉴定自其中随后衍生简并引物的保守区域。这些简并引物随后可通过PCR手段用于扩增来自其它生物的同源性新基因的片段。这些片段随后可以作为探针使用以便分离完整基因序列。备选地，所丢失的5’序列和3’序列可通过RACE-PCR分离。此方面可明确参考US2002/0023281内的公开和以上提及的关于分子生物学方法的文献，尤其Sambrook，“Molecular Cloning”和“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley&Sons。
可通过如下方式产生编码本发明方法中所用蛋白质的分离的核酸分子，其中该蛋白质尤其同源于SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135或2、107、125、129或137的蛋白质序列，例如通过将一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失导入SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118或120或106、124或128或132、134或136的核苷酸序列以至将一个或多个氨基酸的替换、添加或缺失导入所编码蛋白质。可以通过标准技术如位点特异性诱变或PCR介导的诱变在本发明方法中使用的核酸分子的任意序列中导入突变。优选地是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上产生保守性氨基酸替换。在“保守性氨基酸替换”中，将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此将预测的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一种基酸残基。优选地是实施“保守性”替换，其中用于替换的氨基酸具有类似原始氨基酸的特性，例如用Asp替换Glu、用Asn替换Gln、用Ile替换Val、用Ile替换Leu、用Thr替换Ser。
在另一个实施方案中，突变备选地可以沿全部编码序列或其部分随机导入，例如通过饱和诱变，并且可为本文中所述活性筛选得到的突变体以鉴定产生例如具有提高的生长速率、优选地更快生长和/或更高产量的植物的突变。诱变后，可以重组地表达所编码的蛋白质，并且可以使用本文中所述定法测定该蛋白质的活性。
本发明方法中所用的核酸分子编码蛋白质或其部分。所述蛋白质或单个蛋白质或其部分优选地包含如上所示的共有序列或核心共有序列之一，例如图1或图2中所示的氨基酸序列，其中20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选的3、甚至更优选的2、甚至更优选的1、最优选的0个图1或图2中通过大写字母所示的氨基酸位置可以由X替换和/或不超过5个、优选地4个、甚至更优选的3或2个、最优选的1个或没有图1或图2中通过大写字母所示氨基酸位置由X替换和/或将20个或更少、优选地15或10个、优选地9、8、7或6个、更优选的5或4个、甚至更优选地3、甚至更优选地2、甚至更优选的1、最优选地0氨基酸插入共有序列或从其中缺失，或者所述序列与序列SEQ ID NO：2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或107、109、111、113、115、117、119、121、133或135或137中的氨基酸序列足够同源以至所述蛋白质或其所述部分保留EQ ID NO：2或107活性。
优选地，核酸分子所编码的蛋白质或其部分具有它的实质性生物学活性，其尤其引起靶生物优选地靶植物表现更高生长速率或更快生长并且因此引起更高的生物质产生和提高的产量。蛋白质的保守区域可以通过蛋白质同系物和衍生物或蛋白质家族中各成员的序列比较确定。此外，因蛋白质序列和其它特性而预测该蛋白质结构的计算机程序对技术人员为已知。抗体结合研究和对蛋白质结构域就蛋白酶消化的敏感性和超敏感性的研究可类似地用于研究多肽的结构或其在特定环境例如细胞中的位置。这类用于表征蛋白质的其它方法对技术人员为已知并且在本文所述文献例如还在US 2002/0023281中公开。
优选地，蛋白质或结构域的所用部分在本文所述序列间，例如在植物序列或动物序列间、优选地在全部序列间高度保守。
有利地，核酸分子所编码的蛋白质至少20％、优选地40％并且更优选地50％、60％、70％、80％或90％以及最优选地95％、96％、97％、98％、99％或更多同源于序列SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135的氨基酸序列。所述蛋白质优选地是全长蛋白质，其基本部分地同源于SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135的完整氨基酸序列并且优选地衍生自SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135中所述的可读框。然而，维持了如以上所述的核心共有序列或共有序列，例如在图1和图2中所示。
如以上所讨论，所用蛋白质或多肽的“实质生物学活性”意指所述蛋白质或多肽拥有SEQ ID NO：2、107、125、129或137的生物学活性。”SEQID NO：2、107、125、129或137的生物学活性”意指非人生物中多肽的表达引起与不表达或较低程度表达所述多肽的非人生物比较5％或更多的加速生长或提高的产量，更优选地是加速10％、甚至更优选地是20％、最优选地是50％、100％或200％或更多。用于测定可以研究的与SEQ ID NO：2、107、125、129或137同源的序列的生物学活性的测试系统是在拟南芥菜中表型的表达，或根据需要也可以是自其中衍生同源核酸的生物中的(过量)表达。
如上所述，SEQ ID NO：2、107、125、129或137和其同系物的细胞活性或细胞功能至今仍然未知，因此同样不可能得到体外测定法系统。然而假设对技术人员而言有可能通过在细胞、优选地在缺损细胞内(过量)表达蛋白质或多肽并且将其与缺损细胞的表型比较测量所述蛋白质或多肽的特异SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性。
本方法中可以有利使用的蛋白质衍生自植物生物，如藻类或藓类或，特别来自高等植物。
因此，本发明方法的一个实施方案包括将编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的多核苷酸导入非人生物尤其植物、有用动物或微生物或者其一个或多个部分。该多核苷酸优选地包含本文中所表征的多核苷酸，尤其这样的多核苷酸，其编码具有根据SEQ ID NO：4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103或105或109、111、113、115、117、119、121、133或135或2、106、124、128或137的序列的蛋白质或者编码了由本文中表征的核酸分子所编码的多肽，尤其根据SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102或104或108、110、112、114、116、118或120或106、124或128或132、134或136，或包含任意的这些序列以至得到具有更快生长、更高产量和/或对胁迫更高耐受的转基因植物。优选表达本文中所提及任意植物序列或其植物同系物的植物、表达本文中所提及任意动物序列或其动物同系物的动物和表达本文中所提及任意微生物序列或其微生物同系物的微生物。然而如所提及，酵母SEQ ID NO：1、106、124、128或136核酸还可以在植物中表现SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性。
在一个实施方案中，本发明涉及由本发明核酸分子编码的多肽，优选地是提供以上提及活性的多肽。
本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，该多肽在本发明的宿主细胞、优选地在转基因微生物或转基因植物细胞内表达。
在一个实施方案中，用于产生多肽的方法中所用的核酸分子衍生自微生物，以真核生物作为宿主细胞。在一个实施方案中，在具有自原核生物或真菌或藻类或另一种微生物而不自植物衍生的核酸的植物细胞或植物中产生多肽。
技术人员知道不同生物内所表达的蛋白质和DNA即使具有相同编码序列，仍在众多方面和特性上不同，如甲基化、降解和翻译后加工修饰如糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、ADP核糖基化、法尼基化、羧化、硫酸盐化、遍在蛋白化等。优选地，相应蛋白质的细胞表达控制因此不同于控制内源性蛋白质或其它真核蛋白质活性和表达的控制机制。
本发明的多肽优选地通过重组DNA技术产生，例如将编码蛋白质的核酸分子克隆至(如上所述的)载体，该载体导入(如上所述的)宿主细胞并且所述多肽表达于该宿主细胞。随后所述多肽可以通过合适的纯化方案使用标准蛋白质纯化技术自细胞分离。作为重组表达的备选，本发明的多肽或肽可以使用标准肽合成技术化学合成。此外，天然多肽可以如所描述例如使用本发明抗体自细胞(例如内皮细胞)分离，该抗体可以通过标准技术利用本发明的多肽或其片段，即本发明多肽产生。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO：2中所示或其同系物中所示的多肽序列的50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.5％或更多或者由其组成，但不是SEQ ID NO：2中所示的序列，优选地不由其组成。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质不包含SEQ ID NO：2中所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及液泡形态发生蛋白VAM7。在一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO：107中所示或其同系物中所示的多肽序列的50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.5％或更多或由其组成，但不是SEQ ID NO：107中所示的序列，优选地不由其组成。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质不包含SEQ ID NO：107中所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO：125或其同系物中所示的多肽序列的50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.5％或更多或由其组成，但不是SEQ ID NO：125中所示的序列，优选地不由其组成。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质不包含SEQ ID NO：125中所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO：129中所示或其同系物中所示的多肽序列的50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.5％或更多或由其组成，但不是SEQ ID NO：129中所示的序列，优选地不由其组成。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质不包含SEQ ID NO：129中所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及这样的多肽，其包含SEQ ID NO：137中所示或其同系物中所示的多肽序列的50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.5％或更多或由其组成，但不是SEQ ID NO：137中所示的序列，优选地不由其组成。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质不包含SEQ ID NO：137中所示的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及具有由本发明核酸分子所编码的氨基酸序列或通过本发明方法可得到的多肽。所述多肽优选地赋予以上提及的活性，尤其该多肽在提高细胞活性后如本文中所述赋予细胞或生物或其部分中产量或生长的提高，例如通过提高所述多肽的表达或特异性活性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID No：2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、107、109、111、113、115、117、119、121、125或129中所述的序列通过一个或多个氨基酸区别。在另一个实施方案中，本发明的所述多肽不由SEQ ID NO：2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、107、109、111、113、115、117、119、121、125或129中所示序列组成。在一个实施方案中，所述多肽不由SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或108、110、112、114、116、118或120或106、124或128中所示核酸分子编码的序列组成。在一个实施方案中，本发明的多肽源自非植物细胞，尤其来自微生物，并且在植物细胞中表达。本申请中所用的术语“蛋白质”和“多肽”可以互换。“多肽”是指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不涉及分子的具体长度。因此多肽的定义包含肽和寡肽。本术语也不涉及或不包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰基化、磷酸化等。该定义包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代键以及本领域内已知其它修饰的多肽，无论其天然存在还是非天然存在。
优选地，多肽是分离的。“分离的”或“纯化的”蛋白质或多核苷酸或其生物活性蛋白质通过重组DNA技术产生时基本不含细胞材料，或通过化学合成时基本不含化学前体或其它化学品。
词组“基本不含细胞材料”包括本发明多肽的制品，在其中蛋白质与从其中天然或重组产生蛋白质的细胞的细胞成分呈分离。在一个实施方案中，词组“基本不含细胞材料”包括具有少于大约30％(干重)的杂质蛋白质、优选地少于大约20％的杂质蛋白质、仍更优选地少于大约10％的杂质蛋白质并且最优选地少于大约5％的杂质蛋白质的制品。术语“杂质蛋白质”涉及非本发明多肽的多肽。当本发明多肽或其生物学活性部分重组产生时，它优选地还基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20％、更优选地少于大约10％并且最优选地少于大约5％。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括在其中蛋白质与参与合成蛋白质的化学前体或其它化学品呈分离的制品。
本发明的多肽可参与至本发明的方法中。
此外，多肽可以具有由与本发明多核苷酸的核苷酸序列杂交、优选在如上所述严格条件下杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。因此，多肽具有由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中该核苷酸序列至少大约35％、50％或60％、优选地至少大约70％、更优选地至少大约80％、90％、95％以及甚至更优选地至少大约96％、97％、98％、99％或更多与本发明和本文中所示多肽的氨基酸序列之一同源。本发明的优选多肽优选地具有至少一种根据本发明和本文中所述的活性。本发明的优选多肽包括由以上所定义杂交、优选地在严格条件下杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
本发明还提供了嵌合蛋白或融合蛋白。
如本文中所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含多肽，其有效地连接至不赋予以上所提及活性的多肽。
在融合蛋白中，术语“有效地连接”意指本发明的多肽与非本发明的多肽相互融合以至两种序列充分行使对所用的序列预期的功能。非本发明的多肽可以融合于本发明多肽的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合蛋白是在其中本发明多肽的序列融合至GST序列C末端的GST-LMRP融合蛋白。此类融合蛋白可促进本发明重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白是在N末端含有异源信号序列的本发明多肽。在某些宿主细胞内(例如哺乳类宿主细胞)，可通过使用异源信号序列提高表达和/或分泌。将基因产物引导至特定细胞区室需要导向序列(综述见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423和其中所引用参考文献)，例如至细胞的液泡、细胞核、所有类型的质体如造粉体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油质体、过氧化物体、酵解酶体以及其它区室或至细胞外。
优选地，本发明的嵌合蛋白或融合蛋白通过标准重组DNA技术产生。例如，将编码不同多肽的DNA片段根据常规技术按阅读框架连接在一起，例如通过使用用于连接的平末端或交错末端、提供合适末端的限制性酶消化、根据需要填补粘性末端、旨在避免不需要连接的碱性磷酸酶处理以及酶连接作用。融合基因可通过常规技术合成，包括自动化DNA合成仪。备选地，基因片段的PCR扩增可使用锚式引物实施，其中所述锚式引物产生两个连续基因片段间的互补突出端，随后所述连续基因片段可复性并再次得到扩增以产生嵌合基因序列(见例如，Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons：1992)。此外可商业地获得编码融合部分(例如GST多肽)的众多表达载体。可将本发明的多核苷酸克隆至此类表达载体以至融合部分按照阅读框架连接至所编码的蛋白质。
此外，本发明蛋白质的结构性基序折叠模拟和计算机再设计可使用适宜的计算机程序开展(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机建模可用于详细的肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf， Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。适宜的程序可用于通过计算机辅助搜索互补性肽序列鉴定本发明多肽与其底物或结合因子或其它相互作用的蛋白质间的相互作用位点(Fassina，Immunomethods(1994)，114-120)。现有技术中描述了其它用于设计蛋白质和多肽的合适的计算机系统，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991。自以上所述计算机分析所得到的结果可用于例如制备本发明蛋白质或其片段的模拟肽。蛋白质天然氨基酸序列的此类假肽模拟物可以极高效地模拟亲代蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，将易于得到的非手性Q-氨基酸残基掺入本发明蛋白质或其片段引起脂肪族链的聚甲撑单元取代酰胺键，因此为构建模拟肽提供方便的策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。
现有技术中描述了其它系统中的小肽激素超级活性的模拟肽类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。本发明蛋白质的适宜模拟肽还可以通过连续酰胺烷基化作用合成模拟肽组合文库并且例如对结合和免疫特性测试得到化合物进行鉴定。生成和使用模拟肽组合文库的方法在现有技术中描述，例如在Ostresh，Methods in Enzymology267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715。
此外，本发明蛋白质的立体结构和/或结晶学结构可用于设计本发明蛋白质生物学活性的模拟肽抑制物(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
此外，本发明蛋白质的立体结构和/或结晶学结构以及本发明多肽与其底物或结合因子间相互作用位点的鉴定可用于设计具有调变的结合或周转活性的突变体。例如，可以将本发明多肽的活性中心建模并且调整参与催化反应的氨基酸残基以提高或降低底物对非活性多肽的结合。鉴定活性中心和参与催化反应的氨基酸促进筛选具有提高活性的突变体。尤其关于共有序列中保守氨基酸的信息可有助于调整活性。
然而根据需要，亲缘较远的非人生物中编码液泡形态发生蛋白VAM7的多核苷酸的表达可以根据技术人员的知识引起本发明特别强的效果，即生长和/或产量特别巨大的提高，因为已编码的多肽可能不受内源性调节影响。
根据本发明例如就核酸序列而言，“转基因”或“重组”意指表达盒(＝基因构建体)或指包含本发明核酸序列的载体，或指以本发明的核酸分子序列、表达盒或载体、以通过遗传方法所产生的全部构建体转化的非人生物，在其中
a)本发明方法中所用的核酸序列或
b)功能性连接至本发明方法中所用核酸序列的遗传控制序列或调节序列，例如启动子，或
c)(a)和(b)
不在这些序列的天然遗传环境中存在或已经通过遗传方法进行修饰，例如，所述修饰可能是替换、添加、缺失、倒置或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境意指在来源生物中的天然基因组或染色体位点或者存在于基因组文库中。当是基因组文库时，核酸序列的天然遗传环境优选地至少仍然部分保留。该环境至少分布在核酸序列的一侧并且其序列长度是从0或更多bp，优选地是50bp、更优选地从100至500bp、特别优选地1000bp或更多，虽然5000或更多bp序列也已经描述。天然存在的表达盒，例如液泡形态发生蛋白VAM7核酸序列的天然启动子的天然存在组合通过非天然、合成性(“人工”)方法例如诱变改变后变成转基因表达盒。相应方法例如在US 5,565,350或WO 00/15815中描述。
天然表达盒及人工表达盒的调节功能可以通过改变调节所述表达盒的因子间接地或以反式方式改动。这尤其包括影响同源的、异源的和人工转录因子的调节。
可以将如现有技术以及也在本文中详细所述的克隆载体用于转化。适用于转化植物的载体和方法已经公开或在例如Plant Molecular Biologyand Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniques for GeneTransfer，在Transgenic Plants，第卷1，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中引用。
众多教材中描述了微生物和高等真核生物的转化，例如Sambrook，Molecular Cloning，1989，Cold Spring Harbor Laboratory and in“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)。
有可能表达同源性或异源性核酸，即受体生物和供体生物属于相同种，根据需要属于相同品种，或属于不同种，根据需要属于不同品种。然而，转基因还意指本发明的核酸位于它们在生物基因组内的天然位置上，但是序列与天然序列和/或天然序列的调节序列相比较已经改变。转基因优选地意指本发明核酸在基因组内非天然位点上的表达，即存在所述核酸的同源或优选地异源表达。
术语“调节序列”还包括控制核苷酸序列在众多种宿主细胞内组成型表达的那些序列和控制核苷酸序列仅在特定宿主细胞内特定条件下直接表达的那些序列。技术人员理解设计表达载体可能取决于这样的因素，例如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白质表达的程度等。转录可以例如通过使用强转录信号例如启动子和/或增强子或mRNA稳定物例如通过特定的5’UTR和/或3’UTR加以提高。因此，例如导致更高转录速率或更稳定mRNA的信号可以替换内源性信号。然而，还有可能通过改善核糖体结合的稳定性或mRNA稳定性而增强翻译。原则上可以使用生物如微生物、植物或动物中能够刺激基因转录的那些启动子。在所述生物中发挥功能的合适启动子众所周知。它们可以是组成型启动子或诱导型启动子。合适启动子可以在多细胞真核生物中导致发育和/或组织特异性表达，因此有可能有利地在植物中使用叶、根、花、种子、防卫细胞或果特异性启动子。其它调节序列如上和如下所述。
本发明所用的术语“转基因”还涉及转基因的非人生物例如植物的子代，例如T1、T2、T3和后续植物世代或者BC1、BC2、BC3和后续植物世代。因此本发明的转基因植物可以生长并与自身或与其它个体杂交以得到本发明的其它转基因植物。有可能通过营养繁殖转基因植物细胞得到转基因植物。
在一个优选的实施方案中，通过提高内源性液泡形态发生蛋白VAM7表达实现更快的生长和/或更高的产量。
因此，有可能在本发明方法中通过将编码内源性液泡形态发生蛋白VAM7的多核苷酸功能性地连接至引起所述液泡形态发生蛋白VAM7多肽提高的量的调节序列提高液泡形态发生蛋白VAM7的量。
基因的表达量在转录水平或翻译水平或在基因产物稳定性和降解方面调节。
通常将调节序列安置在相对特定核酸或特定编码的基因部分的上游(5’)、其中和/或下游(3’)。调节序列尤其控制编码的基因部分转录和/或翻译以及还控制其转录物的稳定性，根据需要与细胞的其它固有功能性系统如细胞中蛋白质生物合成装置协作。因此，有可能根据技术人员的知识影响启动子、UTR、剪接位点、多腺苷酸化信号、终止子、增强子、加工信号、转录后修饰和/或翻译后修饰等以提高内源性蛋白质表达而不影响所述蛋白质自身的序列。因此，当操纵分布于编码序列侧翼的液泡形态发生蛋白VAM7区域时，还可以根据本发明提高液泡形态发生蛋白VAM7的量。于是，例如介导更高和更特异表达的外源性启动子可以替换内源的液泡形态发生蛋白VAM7启动子并因此引起蛋白质的更高表达。例如还有可能通过替换内源性5’UTR或3’UTR提高mRNA产物的稳定性而不影响蛋白质的内源性序列。此类提高生物中蛋白质表达的其它方法对技术人为已知。因此，例如有可能通过缺失蛋白质中的降解控制元件提高液泡形态发生蛋白VAM7的稳定性，因而提高细胞中该蛋白质的量并因此提高活性。本文中描述了以有可能产生更大量或根据需要更高活性的那些序列所替换的其它功能性或调节性序列。
此外，可以通过导入人工转录因子特异地改变转录性调节，如以下和实施例中所述。
调节序列在Goeddel：Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)包括其中参考文献，或在Gruber；Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy，CRC Press，Boca Raton，Florida，编者Glick和Thompson，第7章，89-108中公开。
还有可能鉴定正调节物和负调节物，其对液泡形态发生蛋白VAM7的表达或活性(变构效应)有抑制性或活化性影响并且随后被关闭或增强。此类机制在多种代谢途径中为技术人员充分已知。
在一个本发明方法的实施方案中，泡形态发生蛋白VAM7蛋白质的表达因非人生物中或其一个或多个部分中提高转录的转录因子量的增加得以提高。
通常有可能例如通过启动子分析鉴定参与内源性SEQ ID NO：1、106、124、128或136基因转录性调节的内源性转录因子。正调节物提高的活性或负调节物降低的活性可以提高内源性SEQ ID NO：1、106、124、128或136基因的转录。
此外，用于通过人工转录因子改变基因表达的方法对技术人员为已知。
因此，例如表达基因，尤其表达SEQ ID NO：2、107、125、129或137的基因上的改变可以通过修饰或合成特殊的特异性DNA结合因子例如锌指转录因子实现。这些因子结合至内源性靶基因的特定基因组区域，优选地结合至调节序列，并且可以引起所述基因活化或抑制。此类方法的使用使内源性基因表达的活化或降低成为可能，避免重组操作所述基因的序列。相应方法例如在Dreier B[(2001)J.Biol.Chem.276(31)：29466-78和(2000)J.Mol.Biol.303(4)：489-502]；Beerli RR(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(25)：14628-14633；(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)：1495-1500和(2000)J.Biol.Chem.275(42)：32617-32627)，Segal DJ和Barbas CF(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4(1)：34-39，Kang JS和Kim JS(2000)J.Biol.Chem.275(12)：8742-8748，Kim JS，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(8)：3616-3620.Klug A(1999)J.Mol.Biol.293(2)：215-218，Tsai SY，(1998)Adv.Drug Deliv.Rev.30(1-3)：23-31]，Mapp AK(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(8)：3930-3935，Sharrocks AD(1997)Int.J.Biochem.Cell Biol..29(12)：1371-1387和Zhang L(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860中描述。
例如，应用用于调节植物中基因表达的方法的实例在WO 01/52620.Ordiz MI，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(20)：13290-13295)或Guan(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(20)：13296-13301)及以下提及的实施例中描述。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在植物中提高本发明方法中所用并在本文中所表征多核苷酸的基因拷贝数。
有利地，本文中所述方法提高了其中SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性提高的植物中叶的数目和大小、果实的数目和/或果实大小，果实意指植物中任意的被收获产物，例如种子、块茎、叶、花、茎皮、果实和根。
本发明方法中所制备的植物优选地具有提高5％、更优选地10％、甚至更优选地多于15％、20％或30％的鲜重。甚至更优选产量提高50％或更多，例如75％、100％或200％或更多。
本发明方法中所制备的植物优选地具有提高5％、更优选地多于10％、甚至更优选地多于15％、20％或30％的产量。甚至更优选产量提高多于50％或更多，例如75％、100％或200％或更多。
在又一实施方案中，本发明方法中所制备的植物更加耐受非生物性或生物性胁迫。
在一个优选的实施方案中，本发明还涉及用于制备精细化学品的方法。该方法包括提供具有提高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的细胞、组织或生物以及在允许此细胞、此组织或此生物中产生所需要精细化学品的条件下培养该细胞、该组织或该生物。优选地是提供本方法中的本发明植物、本发明微生物或本发明有用动物。
如上所述，提高非人生物尤其植物中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的活性引起产量提高和更快的生长。然而截至目前，使用了多种生物产生精细化学品。没有产生价廉和特异的分子、甚至其化学合成包括众多加工阶段和纯化步骤的复杂分子的微生物，当今精细化学品的产生难以想象。因此，以如相同于复杂药用活性化合物如生长因子、抗体等的方式大规模工业产生了精细化学品如维生素和氨基酸并且术语“精细化学品”还将包括如下这些活性化合物。类似地，已经使用植物产生多种精细化学品，如聚合物例如polyhydroxyalkanoids、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸尤其多不饱和脂肪酸等。甚至有用动物已经用于产生精细化学品。因此已经描述了在山羊和奶牛的奶中产生抗体或其它药用活性化合物。
在一个特别优选的实施方案中，本发明方法因此涉及一种方法，在其中提高非人生物优选地植物或微生物中的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性并且以如此方式调节一个或多个代谢途径以至提高一种或多种精细化学品产生的产量和/或效率。
术语“产生”或“生产率”对技术人员为已知并且包含提高特定时间内和特定体积内(例如公斤/小时/升)目的产品的浓度(例如脂肪酸、类胡萝卜素、(多)糖、维生素、类异戊二烯、脂类、脂肪酸(酯)和/或聚合物如polyhydroxyalkanoids和/或它们的代谢产物或其它如本文中描述的所需要精细化学品)。
术语“精细化学品”本领域内为已知并包括非人生物所产生的分子并且用于众多工业领域，例如但不限于，制药工业、农用工业和化妆品工业。这类化合物包括有机酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、聚合物或大分子如多肽例如酶、抗体、生长因子或其片段、核酸包括聚核酸、蛋白原性(proteinogenic)氨基酸和非蛋白原性氨基酸、嘌呤碱基和嘧啶碱基、核苷和核苷酸(例如在Rehm等编辑Biotechnology卷6，VCH：Weinheim中第561-612页Kuninaka，A.(1996)Nucleotide and related compounds及其中参考中所述)、脂类、饱和及不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇(例如丙二醇和丁二醇)、糖类(例如戊糖、己糖、透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛和靛蓝)、类异戊二烯、前列腺素、三酰基甘油、胆固醇、polyhydroxyalkanoids、维生素和辅因子(如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第卷A27，“Vitamines”，第443-613页(1996)VCH：Weinheim及其参考中所述；以及1994年9月1-3日在亚洲马来西亚槟城举行的联合国教科文组织/马来西亚科学技术协会与自由基研究协会联盟年会AOCS Press(1995)，Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”)、酶和由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086及其引用参考文献中所描述全部其它化学品。如本文中所用，术语“精细化学品”因此还包括可在生物中产生的药用化合物，如抗体、生长因子等或其片段。
术语“氨基酸”在本领域内为已知。氨基酸包含所有蛋白质的基础结构单元并且因此对正常细胞功能为必需。术语“氨基酸”本领域内为已知。20种蛋白原性氨基酸充当蛋白质的结构单元，在其中这些氨基酸彼此通过肽键连接，与此同时非蛋白原性(non-proteinogenic)氨基酸(已知有数百种)通常在蛋白质中不存在(见Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry第A2卷，第57-97页VCH：Weinheim(1985))。氨基酸可以以D或L构型存在，虽然L-氨基酸是通常在天然存在的蛋白质中所发现的仅有类型。已经在原核细胞和真核细胞中充分表征20种蛋白原性氨基酸中每种氨基酸的生物合成途径和降解途径(见例如，Stryer，L. Biochemistry，第三版第578-590页(1988))。除在蛋白质生物合成中发挥作用外，这些氨基酸本身是有意义的化学品，并且已经发现许多氨基酸在人类食品工业、动物饲料工业、化学工业、化妆品工业、农业工业和制药工业中具有多种应用。赖氨酸不仅是对人营养重要的氨基酸，也是对单胃动物如家禽和猪重要的氨基酸。谷氨酸最经常作为调味品(谷氨酸单钠，MSG)使用并常常用于食品工业其它地方，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也同样如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于制药工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于制药工业和化妆品工业。广泛使用苏氨酸、色氨酸和D-/L-甲硫氨酸作为饲料添加物(Leuchtenberger，W.(1996)Amino acids-technical production and use，第466-502页，在Rehm等，(编辑)Biotechnology第6卷，第14a章，VCH：Weinheim)。已经发现这些氨基酸还适合作为前体用于合成合成性氨基酸和蛋白质，如N-乙酰基半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨酸和其它如Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷第57-97页，VCH，Weinheim，1985中所述的物质。
术语“维生素”本领域内为已知并且包含为生物的正常功能所需但是不能通过生物自身合成的营养素。维生素组可以包含辅因子和医疗滋养品化合物。
术语“辅因子”包含正常酶活性发生所需要的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机物或无机物；本发明的辅因子优选地是有机物。
术语“医疗滋养品”包含促进植物和动物尤其人的健康的食品添加剂。此类分子的实例是维生素、抗氧剂和某些脂类(例如多不饱和脂肪酸)。
因此，维生素、辅因子和医疗滋养品包含一组这样的分子，其不能由高等动物合成并且高等动物因此不得不摄入它们，虽然这些分子可轻易由其它生物如细菌合成。这些分子要么本身是生物学活性分子，要么是在众多代谢途径中充当电子载体或中间产物的生物学活性物质的前体。除了营养价值以外，这些化合物还具有重要工业价值，如作为染料、抗氧剂和催化剂或其它加工助剂(关于这些化合物结构、活性和工业应用的综述参见例如，Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613页，VCH：Weinheim，1996)。多不饱和脂肪酸尤其在Simopoulos 1999.Am.J.Clin.Nutr.，70(3Suppl)：560-569，Takahata等，Biosc.Biotechnol.Biochem，1998，62(11)：2079-2085，Willich and Winther，1995，Deutsche Medizinische Wochenschrift，120(7)：229ff和其中参考描述。
术语“嘌呤”或“嘧啶”包含形成核酸、辅酶和核苷酸的部分的含氮碱基。术语“核苷酸”包含核酸分子的重要结构单元，其包含含氮碱基、戊糖(糖在RNA中是核糖，在DNA中是D-脱氧核糖)以及磷酸。术语“核苷”包含作为核苷酸前体但不含磷酸单元的分子，这与核苷酸不同。有可能通过抑制这些分子生物的合成或它们为形成核酸分子的转移作用以抑制RNA和DNA合成；定向抑制癌细胞中这种活性允许抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。此外，存在不形成核酸分子但是充当能量储备(即AMP)或作为辅酶(即FAD和NAD)的核苷酸。然而，嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸还具有其它可能用途：作为多种精细化学品生物合成途径中的中间产物(例如硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸盐或核黄素)、作为用于细胞(例如ATP或GTP)和用于化学品自身的能量载体；广泛地使用它们作增味剂(例如IMP或GMP)或用于众多医药用途(见例如Rehm等编辑的Biotechnology第6卷，VCH：Weinheim，第561-612页中的Kuninaka，A.，(1996)“Nucleotides and Related Compounds”)。参与嘌呤、吡啶、核苷或核苷酸代谢中的酶目前也持续地充当用于开发作物保护化学品的靶，包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
细胞含有也在术语“精细化学品”中包括的不同碳源，例如糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素、醇(例如甲醇或乙醇)、烃、脂肪酸尤其多不饱和脂肪酸以及有机酸如乙酸或乳酸。糖可以通过多种机制经过细胞膜转运至细胞内。细胞在培养中快速生长和分裂的能力很大程度取决于该细胞吸收和利用富含能量分子如葡萄糖和其它糖的能力。海藻糖由两个通过α，α-1，1键连接在一起的葡萄糖分子组成。它通常在食品工业中用作增甜剂、作为用于脱水食物或冷冻食物以及啤酒中的添加剂。然而它还用于制药工业、化妆品工业和生物技术工业(见例如Nishimoto等，(1998)美国专利号5 759 610；Singer，M.A.和Lindquist，S.Trends Biotech.16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.Biotech Ann.Rev.2(1996)293-314；以及Shiosaka，M.J.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖为多种微生物的酶所用并且以自然方式释放至周围培养基，可以从中通过本领域内已知的方法分离海藻糖。
生物中所述分子的生物合成已经在Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，VCH：Weinheim，1996，例如“维生素”章，第A27卷，第443-613页；Michal，G.(1999)Biochemical Pathways：An Atlas ofBiochemistry and Molecular Biology，John Wiley&Sons；1994年9月1-3日在亚洲马来西亚槟城举行的联合国教科文组织/马来西亚科学技术委员会和自由基研究学会联盟年会Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)中充分表征。
因此，本发明的一个实施方案涉及用于提高植物产生油的方法。
植物可以有利地用于例如产生脂肪酸。例如，高等植物种子中贮藏脂类自主要具有16至18碳的脂肪酸合成。所述脂肪酸位于多种植物种的种子油内。拟南芥菜属中SEQ ID NO：2、107、125、129或137的提高已证实提高种子产生大约30％。植物中所述油的产生可以例如通过表达本文中的多核苷酸提高。随后植物油可以作为例如燃料或作为多种产品如塑料、药等的原料使用。多不饱和脂肪酸可以特别有利地在营养品和饲料中使用。
在一个实施方案中，本发明所述的方法包括通过以一个或多个核苷酸转化非人生物制备精细化学品，所述多核苷酸的基因产物是以上所提及代谢途径的一个代谢途径的部分或参与对这些代谢途径的一个代谢途径调节以至此非人生物产生所需要的精细化学品或提高所需要精细化学品的产生。有利地，本方法中所用基因的共表达连同SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的提高有利地提高所述精细化学品的产生。充当产生所述精细化学品的基因对技术人员为已知并且以众多不同方式已在文献中描述。
植物中所述精细化学品如脂肪酸、类胡萝卜素、多糖、维生素、类异戊二烯、脂类、脂肪酯或polyhydroxyalkanoids和以上提及代谢产物的的生物合成常在特殊细胞器的特定代谢途径内进行。因此，其基因产物在这些生物合成途径中起作用并因此位于所述特殊细胞器内的多核苷酸包括编码相应信号肽的序列。
可以将其它多核苷酸与本文中所述的基因构建体、表达盒、载体等一起导入宿主细胞、优选地导入植物细胞。可通过同时转化多个独立的基因构建体、表达盒、载体等或优选地通过在一个构建体组合多个基因或表达盒导入此类的基因构建体、表达盒、载体等。还有可能使用在任何情况下具有多个用于表达的表达盒的多个表达载体并且将它们导入宿主细胞。
因此，以上所述用于本发明方法的基因构建体、表达盒、载体除了提高SEQ ID NO：1、106、124、128或136表达以外，还可以根据本发明介导其它基因的提高或减少。
因此将因其活性而干预生物合成途径一个或多个基因的调节的调节物基因如诱导物、抑制物或酶基因导入宿主生物并因此表达是有利的。这些基因可以为同源或异源。此外，还额外有可能导入用于产生精细化学品的生物合成基因以至所述精细化学品的产生因加速的生长而特别高效。
为此目的，在已将它们克隆至本发明的表达盒，例如与编码其它多肽的核酸分子组合后，前述核酸可以用于转化植物，例如借助农杆菌属(Agrobacterium)。还可以将编码“其它多肽”或“调节物”的基因在独立转化中导入所需要的非人生物。这可以在提高所述非人生物中的SEQ IDNO：2、107、125、129或137活性之前或之后进行。也有可能以第二表达构建体或载体共转化并且随后根据适宜标志选择。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本文中所述一个或多个核酸分子或多核苷酸的基因构建体、表达盒或载体。表达盒、构建体或载体优选地适合于本发明中的用途并且包含例如以上所提及编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的多核苷酸，优选地功能性连接至一个或多个用于介导或提高植物中基因表达的调节信号。
包括了功能性连接至一个或多个调节信号或调节序列，有利地用于提高基因表达的同系物、衍生物或类似物。
调节序列用于使基因定向表达和编码的蛋白质定向合成成为可能。术语“调节序列”如上定义并且包括例如所述的终止子、加工信号、转录后修饰、翻译后修饰、启动子、增强子、UTR、剪接位点、多腺苷酸化信号和技术人员所知并在本文中所提及的其它表达控制元件。
例如，这可能意指仅在诱导后基因才表达或基因立即表达和/或过量表达，其取决于宿主生物。这些调节序列的实例是诱导物或阻抑物与之结合并因而调节核酸表达的序列。除了这些新调节序列以外或作为这些序列的替代，所述序列的天然调节作用仍然在实际结构基因上游存在，并且根据需要已受到遗传修饰以至关闭天然调节作用并提高基因的表达。然而，表达盒(＝表达构建体＝基因构建体)还可以具有更简单的结构，即没有额外调节序列插入核酸序列及其衍生物的上游并且具有自身调节作用的天然启动子未缺失。或者，将天然调节序列突变以至调节作用不再发生和/或基因表达提高。还可以将这些修饰的启动子以部分序列(＝具有本发明核酸序列的部分的启动子)的形式单独安置在天然基因的上游以提高活性。此外，基因构建体还可以有利地包含功能性连接至启动子的有可能提高核酸序列表达的一个或多个“增强子”序列。还可以将其它有利的序列如其它调节元件或终止子插入DNA序列3’末端。本发明中优选地编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的核酸序列可以以一个或多个拷贝方式存在于表达盒(＝基因构建体)内。一个或多个基因的拷贝可以存在于表达盒内。该基因构建体或诸基因构建体可以在宿主生物中一起表达。有可能将该基因构建体或诸基因构建体插入一个或多个载体并以游离形式在细胞内存在或者在基因组内插入。当是植物时，可以进行整合至质体基因组或至细胞基因组。克隆载体在现有技术中广泛描述并于本文中用于转化。
优选将本方法中所用核酸序列导入能够使此核酸在非人生物、优选地在植物中表达的表达盒。
该表达盒原则上可以直接用于导入植物或被导入载体。
在另一个实施方案中，本发明还涉及本发明所述多核苷酸的互补序列并涉及反义聚核酸。反义核酸分子包含例如与编码蛋白质的“有义”核酸分子的核苷酸序列互补，例如与双链cDNA分子中编码链的核苷酸序列互补或与mRNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义分子”还应当包含RNA干扰分子，具体地还包含具有或没有互补序列间的间隔区或接头序列的RNAi发夹分子。
因此，反义核酸分子能够与有义核酸分子形成氢键。反义核酸分子可以与本文中所描述的任意编码链互补或仅与其部分互补。反义寡核苷酸可以长例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nt。反义核酸分子可以根据技术人员已知的方法通过化学合成和酶连接作用制备。反义核酸分子可以使用天然存在的核苷酸或以各种方式所修饰的核苷酸化学合成以至提高分子的生物学稳定性或增强反义核酸和有义核酸间所形成的双链体物理稳定性；例如有可能使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。备选地，有可能通过使用其中已克隆其方向呈反义的多核苷酸的载体而生物地制备反义核酸分子。反义核酸分子还可以是“α-异头”核酸分子。“α-异头”核酸分子与互补的RNA形成在其中两条链与常规的β-单元相反而互相平行延伸的特异性双链杂交体。反义核酸分子还包含2-O-甲基核糖核苷酸或嵌合的RNA-DNA类似物。反义核酸分子还可以是核酶。核酶是具有核酸酶活性的催化性RNA分子并且能够切割具有与它们互补的区域的单链核酸，如mRNA。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及本发明多核苷所编码的多肽并涉及抗所述多肽的多克隆抗体或单克隆抗体，优选地是单克隆抗体。
“抗体”意指例如多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体或人源化抗体或重组抗体或其片段、单链抗体和合成性抗体。本发明的抗体或其片段原则上意指所有免疫球蛋白类别如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其亚类如IgG亚类，或其混合物。优选IgG及其亚类，例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgGM。特别优选IgG的亚型IgG1和IgG2b。可能提到的片段是具有一个或两个与抗原互补的结合位点的任意截短或修饰的抗体片段，如与抗体对应的具有结合位点并且由轻链和重链构成的抗体部分，如Fv、Fab或F(ab’)2片段或者单链片段。优选地是截短的双链片段，如Fv、Fab或F(ab’)2。这些片段可以例如通过使用酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切下抗体Fc部分以酶方式、借助于化学氧化手段或借助抗体基因的遗传操作手段得到。也可以有利地使用遗传操作的未截短片段。抗体或片段可以单独使用和以混合物使用。抗体还可以是融合蛋白的部分。
在其它实施方案中，本发明涉及用于制备载体的方法，其包括将本发明的多核苷酸或表达盒插入载体，并涉及包含本发明的或根据本发明所制备的多核苷酸的载体。
在一个优选的实施方案中，将多核苷酸功能性地连接至允许在原核宿主或真核宿主中表达的调节序列。
术语“载体”如本文中所用，意指能够转运与之连接的另一种核酸的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，即环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其在本文中有可能将其它DNA节段连接至病毒基因组。特定载体，例如具有复制起点的载体可以在导入这些载体的宿主细胞内自主复制。其它优选的载体有利地整合至导入这些载体的宿主细胞的基因组并因此随宿主基因组一起复制。此外，特定载体可控制与载体功能性连接的基因的表达。将这些载体本文中称为“表达载体”。如以上所提及，这些载体可以自主复制或整合至宿主基因组。适用于DNA重组技术的表达载体通常处于质粒形式。“质粒”和“载体”可在本描述中作同义词使用。因此，本发明还包含噬菌体、病毒例如SV40、CMV或TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、线性DNA或环状DNA或技术人员所知的其它表达载体。
本方法中所用的重组表达载体有利地包含了处于适用于在宿主细胞内表达所用核酸的形式的本发明核酸或本发明基因构建体，这意味重组表达载体包含根据待用于表达的宿主细胞选择并功能性连接至待表达核酸序列的一个或多个调节序列。
在重组表达载体中，“功能性连接”意指目的核苷酸序列以如此方式与调节序列结合以至有可能表达所述核苷酸序列并且它们以如此方式互相结合以至(例如在体外(in-vitro)转录/翻译系统或在宿主细胞内当将载体导入所述宿主细胞时)两种序列均充分行使赋予序列的预期功能。
所用的重组表达载体可以特别地设计用于在原核细胞和/或真核细胞中、优选地在植物中表达。例如可以将编码SEQ ID NO：1、106、124、128或136的基因表达于细菌细胞、昆虫细胞，例如通过使用杆状病毒表达载体、酵母细胞或其它真菌细胞[例如根据Romanos，(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.，(1991)，在J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑第396-428页：Academic Press：San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.，(1991)在Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]、例如根据Falciatore，1999.Marine Biotechnology.1，3：239-251在藻类、在纤毛虫，例如使用根据如WO 98/01572中所述转化方法的载体在全毛亚纲(Holotrichia)、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋毛亚纲(Spirotrichia)、吸管亚纲(Suctoria)、四膜虫(Tetrahymena)、草履虫属(Paramecium)、豆形虫属(Colpidium)、瞬目虫属(Glaucoma)、匙口虫属(Platyophrya)、Potomacus、Desaturaseudocohnilembus、游仆虫属(Euplotes)、Engelmaniella、尾棘虫属(Stylonychia)或在浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)中，并且优选地表达于多细胞植物的细胞内[见Schmidt，R.，(1988)Plant Cell Rep.：583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，B.Jenes，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225和本文所提及文件中的参考文献]。合适的宿主细胞还在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中讨论。备选地，重组表达载体可以使用例如T7-启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。
植物表达盒或相应的载体优选地包含能够控制植物细胞中基因表达并功能性地连接至ORF以至每一序列均发挥其作用的调节序列。
表达盒优选地连接至在正确时间并以细胞或组织特异性方式实施基因表达的合适启动子。因此，对新方法有利的调节序列存在于植物启动子CaMV/35S[Franck，Cell 21(1980)285-294，US 5,352,605]、PRP1[Ward，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、PGEL1、OCS[Leisner，(1988)Proc NatlAcad Sci USA 85：2553]、lib4、usp、mas[Comai(1990)Plant.Mol.Biol.15：373]、STLS1、ScBV[Schenk(1999)Plant.Mol.Biol.39：1221，B33]、SAD1和SAD2(flax启动子)[Jain，(1999)Crop Science，39：1696]以及nos[Shaw(1984)Nucleic acids Res.12：7831]中。拟南芥属[Callis(1990)J BiolChem 265：12486；Holtorf(1995)Plant.Mol.Biol.29：637]、松属(Pinus)、玉米[(Ubi1和Ubi2)，US 5,510,474；US 6,020,190和US 6,054,574]或欧芹[Kawalleck(1993)Plant Molecular Biology，21：673]的多种遍在蛋白启动子或菜豆球蛋白启动子可以有利地使用。诱导型启动子如EP-A-0 388 186(苄氨磺酰可诱导)、Gatz，(1992)Plant J.2：397(四环素可诱导)、EP-A-0335 528(水杨酸可诱导)或WO 93/21334(乙醇或环己醇可诱导)中所述的启动子在本上下文中类似地有利。其它有利的植物启动子是胞质FBP酶的启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus，1989，EMBO J.8，2445)、大豆磷酸核糖基-焦磷酸转酰胺酶启动子(GenBank登录号U87999)或EP-A-0249 676中所述的结瘤特异性启动子。特定组织内有可能表达或在某些组织内显示优先表达的启动子也可能适合。种子特异性启动子如USP启动子以及其它启动子如LeB4、DC3、SAD1、菜豆球蛋白或油菜籽蛋白启动子也是有利的。叶特异性启动子如DE-A 19644478中所述以及受光调节的启动子如petE启动子也可以得到用于在植物中表达基因。其它有利的启动子是可用于单子叶或双子叶植物的种子特异性启动子，并且在US 5,608,152(欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(拟南芥油质蛋白启动子)、US 5,504,200(菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆球蛋白启动子)、WO 91/13980(芥Bce4启动子)和von Baeumlein，1992，Plant J.，2：233(豆科植物LeB4启动子)中描述，这些启动子适用于双子叶植物。适用于单子叶植物的启动子实例如下：大麦lpt-2启动子或lpt-1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、在WO 99/16890中所述的大麦醇溶蛋白启动子、玉米遍在蛋白启动子和其它合适启动子。
为尽可能在多种组织尤其在叶中表达异源序列，除以上所提及启动子外，优选使用植物肌动蛋白或遍在蛋白基因的启动子，例如水稻肌动蛋白1启动子。组成型植物启动的另一个实例是甜菜V-ATP酶启动子(WO01/14572)。
原则上有可能对新方法使用具有自身调节序列的所有天然启动子，如以上提及的那些启动子。也有可能并且有利地额外或单独使用合成性启动子，尤其如果它们介导组成型表达。合成性启动子的实例是超级启动子(WO 95/14098)和自G盒衍生的启动子(WO 94/12015)。
植物基因还可以通过化学诱导型启动子表达(见综述Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。当基因需要以时间特异性方式表达时，化学诱导型启动子特别适合。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)、乙醇诱导型启动子以及EP-A 0 388 186，EP-A 0 335 528，WO 97/06268。原则上裸子植物或被子植物中的特异性表达也为可能的。
响应于生物或非生物性胁迫条件的启动子也是适合的启动子，例如植物中病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward，Plant.Mol.Biol.22(1993)361)、番茄的热诱导型hsp80启动子(US 5,187,267)、马铃薯的冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)或创伤诱导型pinII启动子(EP-A-0 375091)。
优选的多腺苷酸化信号已充分为技术人员所知，例如对于植物，它们衍生自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA，如基因3也称作Ti质粒pTiACH5的章鱼碱合酶(ocs基因)(Gielen，EMBO J.3(1984)835)、nos基因或其功能性等同物。植物中具有功能活性的其它已知终止子也适合。
根据需要，有利的其它调节序列还包括控制表达产物的运输和/或定位的序列。在本上下文中，应当特别提到的是本身已知的编码信号肽和引导肽的序列。例如，有可能借助编码质体引导肽的序列将表达产物导入植物细胞质体。因此，特别优选将引导基因产物至它的适宜细胞区室内例如至液泡、细胞核、任何类型的质体如淀粉体、叶绿体、色质体、细胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物体和植物细胞其它区室所需的引导序列用于植物基因表达盒中的功能性连接(见综述Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)285和其中参考文献)。因此，尤其已经描述了过氧化物体引导信号，例如在Olsen LJ，Plant.Mol.Biol.1998，38：163-189)。
根据本发明，基因构建体、载体、表达盒等有利地以如此方式构建以至启动子后续了用于例如将待表达核酸插入多接头的切割位点，以及根据需要将终止子置于该多接头或插入物下游。该顺序可重复数次例如三、四或五次，以至多个基因组合在一个构建体内并且以此方式导入用于表达的转基因植物。有利地，每一核酸序列具有自身的启动子并根据需要具有自己的终止子。当是能够加工多顺反子RNA的微生物时，有可能将多个核酸序列插入启动子下游和根据需要插入终止子上游。使用表达盒中的不同启动子有可能有利。还可以有利地对每一基因使用不同终止子。
植物表达盒优选地包含其它功能性连接的序列如翻译增强子，例如包含提高蛋白质/RNA比的烟草花叶病毒(tobaco mosaic virus)5’非翻译引导序列的过度驱动序列(Gallie，1987，Nucl.Acids Research 15：8693)。
可以将待导入的载体、表达盒、核酸分子等通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞。
如本文中所用，术语“转化”和“转染”、接合和转导将包括现有技术中已知的用于将外来核酸(例如DNA)导入宿主细胞的多种方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体法、天然感受态法、化学介导的转移、电穿孔法或粒子轰击法。可在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室手册如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，编者Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到适用于转化或转染宿主细胞包括植物细胞的方法。
因此在导入植物细胞或植物后，核酸、基因构建体、表达盒、载体有可能整合至宿主细胞质体基因组或优选地整合至宿主细胞核基因组。整合至基因组可以为随机或可以以如此方式通过重组进行以至所导入拷贝替换了天然基因，从而对细胞产生目的化合物进行调节，或通过反式方式使用基因以至使所述基因功能性连接至功能性表达单元，其包含至少一种确保表达基因的序列和至少一种确保将已功能性转录的基因聚腺苷酸化的序列。根据需要，将核酸通过多重表达盒或构建体转移至用于多重平行表达基因的植物内。在另一个实施方案中，将核酸序列不随其它的不同核酸序列导入植物。
如上所述，将外源基因转移至植物基因组称作转化。此时，将所述用于转化和自植物组织或细胞再生植物的方法用于瞬时转化或稳定转化。合适的方法是通过聚乙二醇介导DNA摄取的原生质体转化法、使用基因枪的生物射弹法-粒子轰击”法、电穿孔法、在含有DNA的溶液中孵育干燥胚、微量注射和农杆菌介导性基因转移法。所述方法例如在S.D.Kung和R.Wu编辑Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press(1993)128-143的B.Jenes，Techniques for Gene Transfer以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。
将待表达的构建体优选地克隆至例如本文中所述适用于转化根瘤农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。以此载体所转化的农杆菌随后可以以已知方式例如通过在农杆菌溶液中浸泡受伤的叶或叶条并且在合适培养基上培育所述叶或叶条，用于转化植物尤其作物植物，如烟草植物。以根瘤农杆菌转化植物由例如Nucl.Acid Res.(1988)16，9877描述或尤其在S.D.Kung和R.Wu编辑的TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press(1993)第15-38页F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plant中公开。
检查本方法中所用的核酸、基因构建体、表达盒、载体等，根据需要，以及随后用于转化植物。为此目的，可能首先需要自中间宿主得到构建体、质粒、载体等。例如，构建体可以作为质粒自细菌性宿主分离，随后进行常规的质粒分离。用于转化植物的多种方法为已知。尽管根据本发明将异源DNA稳定整合至在植物基因组内有利，然而已经证明T-DNA介导性转化特别有利并且可以以本身已知的方式进行。例如，可以将根据以上所述已生成的质粒构建体通过电穿孔或热休克转化至感受态农杆菌。原则上，在本文中对形成共整合的载体和以双元载体转化进行区分。在第一个备选中，包含编码基因部分的载体构建体不包含任何T-DNA序列，而共整合的载体通过载体构建体与T-DNA同源重组在农杆菌中形成。T-DNA在农杆菌中以Ti或Ri质粒形式存在，在该质粒中已将癌基因方便地替换为外源DNA。当使用双元载体时，将这些质粒借助于细菌接合作用或直接转移至农杆菌。所述农杆菌方便地已经包含携带vir基因的载体(经常称作辅助Ti(Ri)质粒)。可以方便地使用一个或多个标志，基于所述标志有可能选择转化的农杆菌和转化的植物细胞。多种标志对技术人员为所知。
对于核酸的稳定整合或瞬时整合，已知仅小部分细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和所用转染技术。为鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标志(例如抗生素抗性)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。
标志基因有利地用于选择本发明核酸对宿主生物尤其至植物的成功导入。这些标志基因通过众多不同原理使得鉴定本发明核酸的成功导入可能，例如通过借助荧光、冷光或处于人可见的波长范围的视觉识别，或通过除草剂或抗生素抗性、通过“营养”(自养型)标志、通过酶测定法或通过植物激素。此类可能提到的标志实例是GFP(＝绿色荧光蛋白)；萤光素/萤光素酶系统；β-半乳糖苷酶及其生色底物例如X-Gal；除草剂例如咪唑啉酮草甘膦、草丁膦或磺酰脲；抗生素抗性例如博莱霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素，这里仅提及数种；营养标志如对甘露糖或木糖的利用或抗营养标志如2-脱氧葡萄糖抗性。该名单代表了一小部分可能的标志。这类标志对技术人员为众所周知。
优选不同标志，这取决于生物和选择方法。优选的选择标志包括植物中赋予除草剂如草甘膦或草铵膦抗性的选择标志。其它合适的选择标志是编码参与例如糖或氨基酸生物合成途径中基因的标志，如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因例如萤光素酶、GFP的或其它荧光基因的标志同样也适合。这些标志可以在其中所述基因不起作用的突变体中使用，例如这些标志已经通过常规方法缺失。此外，还可以将标志和编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子或本文所述另一种本发明核酸分子在同一载体上导入宿主，或它们可以在分别的载体上导入。
因为在核酸成功导入后标志基因尤其抗生素基因或抗除草剂基因通常在转基因宿主细胞中不再需要或是不想要的，在本发明用于导入核酸的方法中有利地使用了可以缺失这些标志基因的技术。此类方法之一是“共转化”。共转化包括同时使用用于转化的两种载体，一种载体携带本发明核酸而第二种载体携带标志基因。在植物的情况下，大比例的转化体获得或者含有两种载体(达到40％的转化体或更多)。随后有可能通过杂交作用自转化的植物除去标志基因。另一种方法使用整合至转座子的与所需核酸共同用于转化的标志基因(“Ac/Ds技术)。在某些情况下(大约10％)，成功转化后，转座子自宿主细胞基因组跳出并丢失。在另一类多数情况下，转座子跳至另一个位点。在这些情况下，需要再次使标志基因异型杂交。已经开发了能够或促进检测此类事件的微生物学技术。一种更有利的方法使用重组系统，该系统具有的有利之处是有可能用异型杂交进行分配。此类系统中最著名的是“Cre/lox”系统。Cre1是删除loxP序列间序列的重组酶。如果标志基因整合在loxP序列间，该标志基因在成功转化后通过Cre1重组酶删除。其它重组酶系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000：553-566)。还有可能将本发明的核酸序列定向整合至植物基因组，但迄今为止因为涉及大量工作而为次优选。当然，这些方法还可应用于微生物，如酵母、真菌或细菌。
以本发明表达载体转化的农杆菌可以同样地以已知方式，例如通过在农杆菌溶液内浸泡受伤的叶或叶条并且在合适的培养基上培育所述叶或叶条用于转化植物如试验植物，例如拟南芥，或作物植物例如谷类(cereal)、玉米(corn)、燕麦(oat)、黑麦(rye)、大麦(barley)、小麦(wheat)、大豆(soybean)、稻(rice)、棉花(cotton)、甜菜(sugar beet)、卡诺拉油菜、向日葵(sunflower)、亚麻(flax)、大麻(hemp)、马铃薯、烟草(tabacco)、番茄、胡萝卜(carrot)、红椒(paprika)、油菜、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、木薯(arrow root)、万寿菊(tagete)、苜蓿(alfalfa)、莴苣(lettuce)和各种树、坚果和葡萄种、含油作物植物如大豆、花生、蓖麻(castor oil plant)、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油椰(oil palm)、红花(carthamustictorius)或可可豆(cocoa bean)或以下提到的其它植物。
可以通过术人员所知任何方法再生遗传修饰的植物细胞。在以上所提及S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或者和Willmitzer的公开中可以找到适宜方法。
根据需要，质粒构建体可以在转化至农杆菌前就均一性和/或完整性通过PCR分析或DNA印迹分析再次检查。通常需要质粒构建体中具有连接的调节序列的编码基因部分在一侧或两侧分布着T-DNA。在使用根瘤农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)种细菌转化时，这特别有用。转化的农杆菌可以以本身已知的方式培养并且因此可方便地用于转化植物。将待转化的植物或植物部分培养并以常规方式提供。农杆菌可以以不同方式作用于植物或植物的部分。因此，例如有可能使用形态发生性植物细胞或组织的培养物。转移T-DNA后，通常通过抗生素消灭细菌并且诱导植物组织再生。为此目的，特别使用合适的植物激素以便在最初愈伤组织形成后促进枝条形成。根据本发明，优选实施整株活体转化。为此目的，有可能将植物种子暴露于例如农杆菌或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明已经证实将完整植物或至少花原基暴露于已转化农杆菌的混悬液特别方便。随后生长完整植物直至得到已处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735)。为选择转化的植物，将从转化所得到的植物材料通常经过选择条件作用以至可以区分已转化植物与未转化植物，例如可以将以如上方式所得到的种子再次播种，并且在生长后，接受合适的喷雾选择。另一种可能是根据需要在灭菌后，使用合适选择剂在琼脂培养基上以如此方式培养种子以至仅转化的种子能够长成植物。
本发明还涉及已经用本发明的多核苷酸稳定或瞬时转化或转染的宿主细胞。因此在一个实施方案中，本发明还涉及其SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性例如因(过量)表达本文中所表征的聚核酸得到提高的微生物。
在一个实施方案中，宿主细胞或微生物是细菌细胞或真核细胞，优选地是单细胞微生物或植物细胞。
在另一实施方案中，本发明还涉及含有本发明多核苷酸或本发明载体的动物细胞或植物细胞。在一个优选的实施方案，本发明尤其涉及具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137提高的量和/或含有本发明植物细胞的植物组织或植物。在一个实施方案中，本发明还涉及具有提高的SEQ IDNO：2、107、125、129或137活性或提高量的SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的植物区室、植物细胞器、植物细胞、植物组织或植物。
原则上适用于摄取本发明核酸、本发明基因产物或本发明载体的宿主细胞是任意原核生物或真核生物的细胞。适用于本发明核酸、表达盒或载体的生物或宿主生物原则上是它的更快生长和更高产量受到欢迎的任意生物，优选地是如所提及的作物植物。
因此，本发明的又一个方面涉及用至少一种本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的转基因生物并涉及自此类生物衍生的细胞、细胞培养物、组织、部分或繁殖材料。
术语“宿主生物”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物”、“重组(宿主)细胞”、“转基因(宿主)生物”和“转基因(宿主)细胞”在本文中可互换使用。当然，这些术语不仅涉及特定的宿主生物或特定的靶细胞，而且还涉及所述生物或细胞的子代或潜在的子代。尽管某些修饰可以因突变或环境影响在后续世代中出现，这些子代实际与亲代细胞不完全相同，但是它们在本发明所用的术语范围内包括。
这里应当提及的实例是微生物如真菌，例如被孢霉属(Mortierella)、水霉属(Saprolegnia)或腐霉属(Pythium)、细菌例如埃西氏菌属(Escherichia)、酵母例如酵母属(Saccharomyces)、藻青菌(cynobacteria)、纤毛虫、藻类或原虫，例如沟鞭藻类(dinoflagellate)如隐甲藻属(Crypthecodinium)。
微生物提高的生长速率与合成有价值的产物组合后在本发明例如用于制备精细化学品的方法中特别有利。因此一个有利的实施方案是例如(天然)合成相对大量的维生素、糖、聚合物、油等的微生物。这里可以提到的实例是真菌例如高山被孢霉(Mortierella alpina)、Pythium insidiosum、酵母例如酿酒酵母和酿酒酵母属微生物、藻青菌、纤毛虫、藻类或原虫，例如沟鞭藻类如隐甲藻属。
可用的宿主细胞还在Goeddel，Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中提及。可用的表达菌株，例如具有相对低的蛋白酶活性的那些表达菌株，在Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California(1990)119-128中描述。
蛋白质通常在原核生物中通过使用含有控制融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型启动子或诱导型启动子的载体表达。常见的融合表达载体尤其是pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例尤其是pTrc(Amann等(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d[Studier，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California(1990)60]。
其它原核生物中合适的载体对技术人员为已知并且是例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI、链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214、棒杆菌属中的pSA77或pAJ667。
然而，优选真核表达系统。在又一实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体实例包括pYeDesaturasec1(Baldari(1987)Embo J.6：229)、pMFa(Kurjan(1982)Cell 30：933)、pJRY88(Schultz(1987)Gene 54：113)、2micron、pAG-1、YEp6、YEp13、pEMBLYe23和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。构建适用于其它真菌例如丝状真菌的载体和方法包括Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge或在：J.W.Bennet，ed.，p.396：Academic Press：San Diego]中详细描述的那些载体和方法。真菌中载体的实例是pALS1、pIL2或pBB116或者植物中载体的实例是pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。
备选地，有价值产物例如所提及的精细化学品可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞表达。可获得用于培养的昆虫细胞(Sf9)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith(1983)Mol.Cell Biol..3：2156)和pVL系列(Lucklow(1989)Virology 170：31)。
以上提及的载体仅仅提供可能适合的载体的概述。其它质粒为技术人员所知并且例如在Cloning Vector(编者Pouwels，P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444904018)中描述。对于其它适合于原核细胞和真核细胞的表达载体，见Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16章和第17章或Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989).
微生物优选地用包含以上所述适合于本发明方法的核酸分子的多核苷酸瞬时转化或稳定转化。
在另一个优选的本发明实施方案中，例如有价值产物或精细化学品还可能在单细胞植物细胞(如藻类)中表达，见Falciatore，1999.MarineBiotechnology 1(3)：239和其中参考文献，以及在高等植物的植物细胞中表达以至所述植物具有较高的SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性并且因此具有较高生长速率。植物表达载体的实例包括以上详述的或来自Becker，(1992)，Plant Mol.Biol.20：1195和Bevan，(1984)，Nucl.Acids Res.12：8711；Vectors for Gene Transfer in Higher Plant；in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15页中的那些植物表达载体。可在Hellens，2000.Trends in PlantScience，第5卷，446中找到农杆菌双元载体的最近综述。
有利使用的宿主生物是细菌、真菌、酵母或植物，优选地是作物植物或其部分。优选地是使用真菌、酵母或植物，特别优选地是植物，并且可能特别提到的是农业有用的植物，如谷类和牧草，例如小麦属(Triticumspp.)、玉米、大麦、燕麦、黑麦、稻、御谷(Pennisetum glaucum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、小黑麦(Triticale)、剪股颖属(Agrostis spp.)、纤毛蒺藜草(Cenchrus ciliaris)、鸭茅(Dactylis glomerata)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、黑麦草属(Lolium spp.)、苜蓿属(Medicago spp.)、苜蓿和甘蔗属(Saccharum spp.)、豆科植物和油籽作物，例如芥菜、欧洲油菜、黑芥(Brassica nigra)、白芥(Sinapes alba)、大豆、落花生、卡诺拉油菜、蓖麻、椰子、油椰、可可豆、椰枣(date palm)、陆地棉、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、向日葵、兵豆(Lens culinaris)、亚麻、白芥、白三叶(Trifolium repens)T、红花和Vicia narbonensis、大麻、蔬菜、莴苣和果例如香蕉、葡萄、番茄(Lycopersicon esculentum)、芦笋、甘蓝、西瓜、奇异果(kiwis)、马铃薯、Solanum lypersicum、胡萝卜、红辣椒、木薯(tapioca)、木薯(manioc)、甜菜、木薯(cassava)和菊芋(chicory)、木薯(arrow root)、坚果和葡萄种、树，例如咖啡、柑橘属(Citrus spp.)、桉树属(Eucalyptus spp.)、云杉属(Piceaspp.)、松属(Pinus spp.)和杨属(Populus spp.)、烟草、药用植物和树及花，例如万寿菊(Tagetes)。
如果选择植物作为供体生物，该植物原则上可以具有对于受体植物的任何系统发育关系。因此供体植物和受体植物可以属于相同科、属、种、品种或系，这导致待整合的核酸和受体植物基因组的相应部分间提高的同源性。
根据特定的本发明实施方案，供体生物是真菌，优选地是酵母科(Saccharomycetaceae)、尤其酵母属(Saccharomyce)，特别优选地是酿酒酵母。
优选的受体植物尤其是能够受到适宜转化的植物。包括单子叶植物和双子叶植物。尤其应当提到的是农业有用的植物，如谷类和牧草，例如小麦属、玉米、大麦、燕麦、黑麦、稻、陆地棉、鹰嘴豆、向日葵、兵豆、亚麻、白芥、白三叶和Vicia narbonensis、蔬菜和果，例如香蕉、葡萄、番茄、芦笋、甘蓝、西瓜、奇异果、马铃薯、甜菜和菊芋、树例如咖啡树、柑橘属、云杉属、松属和杨属、药用植物和树、和花。根据特定实施方案，本发明涉及拟南芥菜属例如拟南芥菜和稻属的转基因植物。
转化后，首先如上所述将得到的植物再生并且随后如同常规培育和生长。
本发明的植物区室、植物细胞器、植物细胞、植物组织或植物优选地根据本发明的方法产生并且含有本文中所述的基因构建体或所述的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明植物或本发明有用动物的产量或繁殖材料，涉及微生物的生物质，即根据本发明的方法所制备的非人生物的生物材料。
本发明还涉及可自转基因植物的发明群体衍生的转基因植物材料。所述材料包括植物细胞和某些组织、器官和其处于任何表型形式的植物部分，如种子、叶、花药、纤维、根、根毛、茎、胚芽、愈伤组织(kalli)、子叶、叶柄、收获的材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，其已自实际的转基因植物衍生和/或可以用于产生转基因植物。
优选任何植物部分或植物器官，如叶、茎、枝条、花、根、块茎、果、茎皮、原木、种子等或完整植物。种子在本上下文中包括种子的所有部分，如种子外壳、表皮细胞和种子细胞、胚乳或胚芽组织。特别优选收获的产物，尤其果实、种子、块茎、果、根、茎皮或叶或其部分。在本发明方法中，转基因植物还意指视作农用产物的植物细胞、植物组织或植物器官。
本方法中所产生的生物材料，尤其已通过本发明方法修饰的植物的生物材料可以直接上市出售。
在一个实施方案中，本发明还涉及根据本发明的方法所产生植物的繁殖材料。繁殖材料意指可以起到播种或培植植物的任何材料，甚至它可以具有例如另一种功能，例如作为食物。
“生长”还意指例如在营养培养基上培育转基因的植物细胞、植物组织或植物器官或在基质上如在水培养物中或田间培育转基因完整植物。
本发明还涉及本发明方法中使用并在本文中表征的多核苷酸的用途、基因构建体、载体、植物细胞或植物或植物组织或植物材料的用途，用于制备具有提高产量的植物。
除以上提及的转基因生物外，合适宿主生物原则上还是转基因非人有用动物，例如猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鹅、鸭、火鸡、马、驴等，其优选地已经以包含编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的核酸分子或在本文中表征为适用于本发明方法的核酸分子的多核苷酸瞬时转化或稳定转化。
在另一个优选的实施方案中，本发明尤其涉及具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137提高的量和/或含有本发明有用动物细胞的有用动物或动物器官。有用动物包含SEQ ID NO：2、107、125、129或137提高的量，尤其表达或活性的提高，并且因此提高的生长速率，即更快的生长和提高的重量或如上所列农用产物提高的产生。
优选有用动物为牛、猪、绵羊、鸡或山羊。
在一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：2、107、125、129或137多肽的用途或本发明多核苷酸或多肽的用途，用来提高与起始生物比较非人生物的产量和/或生长。
本发明的又一实施方案是通过所述方法得到的产物例如生物材料、尤其如所提及的植物材料在食物产品、动物饲料产品、营养品、化妆品或药物中的用途。还有可能自通过本发明方法所得到植物或植物部分中分离商业可利用的物质，如精细化学品。
如下不应视作限制性的实施例和附图进一步说明了本发明。
在又一实施方案中，本发明涉及用于产生微生物的方法，包括将本发明的表达构建体或本发明的载体或本发明的多核苷酸导入微生物或其部分。
在另一个实施方案中，本发明还涉及包含本发明多核苷酸、本发明表达构建体或本发明载体的转基因微生物。适宜微生物已经在本文中如前所述，优选地是以上特别提及的适用于产生精细化学品的菌株。
本方法中得到的精细化学品适合作为合成其它有价值产物的起始材料。例如，它们可相互组合或独立地用于产生药物、食品、动物饲料或化妆品。因此，本发明涉及用于产生药物、食品、动物饲料、营养物或化妆品的方法，包括本发明方法中的步骤，包括分离精细化学品、尤其氨基酸组合物，例如根据需要所产生的甲硫氨酸，和将产物与可药用的载体配制或将产物配制为可以农业应用的形式。根据本发明的又一个实施方案是本方法中所产生的或转基因生物的精细化学品在动物饲料、食品、药品、食物补充物、化妆品或药物中的用途。
本发明方法中使用如下转基因微生物有利：真菌如麦角属(Claviceps)或曲霉属(Aspergillus)或革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、乳酪杆菌属(Caseobacter)或节杆菌属(Arthrobacter)或者革兰氏阴性细菌如埃希氏菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)或沙门氏菌属(Salmonella)或者酵母如红酵母属(Rhodotorula)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。尤其有利的生物选自棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、红酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、麦角属或黄杆菌属。极为特别地有利在本发明方法中使用选自如下属和种的微生物：异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、芽孢杆菌属中的种(Bacillus sp.)、白色短杆菌(Brevibacterium albidum)，Brevibacteriumalbum、柠檬色短杆菌(Brevibacterium cerinum)、黄色短杆菌、产谷氨酸短杆菌(Brevibacterium glutamigenes)、碘短杆菌(Brevibacteriumiodinum)、Brevibacterium ketoglutamicum、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、Brevibacterium linens、粉红短杆菌(Brevibacterium roseum)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、短杆菌属中的种(Brevibacterium sp.)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(＝谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicum))、蜜栖棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola)、棒杆菌属中的种(Corynebacterium sp.)或大肠杆菌，尤其大肠杆菌K12及其已描述菌株。
当宿主生物是微生物时，本发明方法有利地在0℃和95℃间、优选地在10℃和85℃间、特别优选地在15℃和75℃间、非常特别优选地在15℃和45℃间实施。实施期间，pH有利地维持在pH 4至12间，优选地在pH 6至9间、特别优选地在pH 7和8间。本发明方法可分批、半分批或连续地操作。已知培养方法的总结在教材Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或在教材Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中找到。待使用的培养基必需以合适的方式满足菌株的要求。在美国微生物学会的手册″Manual ofMethods for General Bacteriology″(Washington D.C.，USA，1981)中存在用于各种微生物的培养基的描述。根据本发明可以应用的如上所述这些培养基通常包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。优良碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖还可以通过将复杂化合物如糖蜜或糖精制中的其它副产物添加至培养基而加入。添加多种碳源的混合物也可能是有利的。其他可能的碳源是油类和脂类，如大豆油、向日葵油、花生油和可可脂、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇如甘油、甲醇和/或乙醇和/或有机酸、如乙酸或乳酸。氮源通常是有机氮化合物或无机氮化合物或包含这些化合物的原料。氮源的实例包含处于液体或气体形式的氨或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸，或者复杂氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其它。氮源可以单独或作为混合物使用。可存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。为产生精细化学品，尤其甲硫氨酸，作为硫源可使用无机硫化合物，如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，或有机硫化物，如硫醇和硫醇类。有可能使用磷酸、磷酸二氢钠或者磷酸氢二钾或相应含钠的盐作为磷源。可将螯合剂添加至培养基以维持溶液中的金属离子。特别适合的螯合剂包含二羟苯酚如邻苯二酚或原儿茶酸盐，或有机酸如柠檬酸。根据本发明用于培养微生物的发酵培养基通常还包含其它生长因子如维生素或生长促进剂，其包含例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐常常源自复杂的培养基成分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。还可以将合适前体添加至培养基。培养基中化合物的确切组成基本取决于特定实验并且对于每个特定的情形将单独选择。关于优化培养基的信息可自教材“Applied Microbiol.Physiology，A PracticalApproach”(编者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0 19 9635773)得到。生长培养基还可以自供应商处购买，如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。所有培养基成分通过加热(20分钟121℃和1.5巴)或除菌过滤灭菌。各成分可以一起消毒，或根据需要分别消毒。所有培养基成分可以在培养开始时出现或任选地连续添加或分批添加。培养基的温度通常在15℃至45℃间，优选地在25℃至40℃间，并且在发酵期间维持恒定或得以改变。培养基的pH应当在5-8.5的范围、优选地在7.0附近，培养期间用于培养的pH可以通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸控制。起泡可通过施加消泡剂如脂肪酸聚乙二醇控制。质粒的稳定性可以通过将具有选择效应的物质如抗生素添加至培养基维持。需氧条件可以通过将氧气或含氧的气体混合物如空气导入培养基维持。培养基的温度通常是20℃至45℃。持续培养直至目的产物的形成达到最大。此目标通常在10小时至160小时内达到。以此方式得到的，尤其含有精细化学品的发酵肉汤通常具有7.5至25％重量间的干物质含量。额外有利的是至少在结束阶段，尤其在30％发酵时间阶段将发酵在糖限制下运行。这意味在此期间将发酵培养基中可利用糖浓度维持在或降低至≥0至3g/l。随后，进一步加工发酵肉汤。取决于所需，生物质可以完全或部分地自发酵肉汤通过分离方法如离心法、过滤法、倾析法或这些方法的组合分离，或者完全留在发酵肉汤内。随后发酵肉汤可以借助旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器通过已知方法如反向渗透法或纳米过滤法浓缩。随后，这种浓缩的发酵肉汤可以通过冷冻干燥法、喷喷雾干燥法、喷雾造粒法或其它方法制成。
然而，还有可能进一步纯化所产生的精细化学品。为此目的，将含有产物的组合物在合适树脂上经过层析，在此时所需要产物或杂质完全或部分地滞留在层析树脂上。这些层析步骤可根据需要重复，使用相同或不同层析树脂。技术人员可熟练地选择合适的层析树脂以及它们的最高效用途。纯化的产物可以经过滤或超滤浓缩并且贮存在该产物稳定性达到最大的温度。
所分离化合物的均一性和纯度可通过现有技术确定。这些技术包括高效液相层析法(HPLC)、光谱法、质谱法(MS)、染色法、薄层层析法、NIRS法、酶测定法和微生物测定法。这些分析性方法总结于：Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70；Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCH：Weinheim，第89-90页、第521-540页、第540-547页、第559-566页、第575-581页和第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷中Fallon，A.等(1987)Applications of HPLC in Biochemistry。
在另一方面，本发明还涉及本发明转基因植物的可收获部分并涉及本发明转基因植物的繁殖材料，其含有表达本发明核酸分子的转基因植物细胞或其含有显示本发明多肽的提高活性的细胞，例如所述蛋白质提高的表达水平或更高的活性。
可收获部分原则上可以是植物的任意有用部分，例如花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果、种子、根等。繁殖材料包括例如种子、果实、插条、幼苗、块茎、根状茎等。
本发明还涉及根据本发明的转基因生物和自其衍生的细胞、细胞培养物、部分，例如在转基因植物生物例子中如以上所提及的根、叶等，并涉及转基因繁殖材料，例如以上所提及的种子或果实等，用于产生食品或饲料、药物或精细化学品的用途。
因此在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的多核苷酸、生物例如微生物、植物、植物细胞或植物组织、载体、或多肽的用途，用于制造产生脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、蜡酯、多糖和/或polyhydroxyalkanoates和/或其代谢产物、尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰基甘油、胆汁酸和/或酮体的细胞、组织和/或植物。存在多种这样的机制，籍此可以影响脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、蜡酯、多糖和/或polyhydroxyalkanoates和/或其代谢产物、尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰基甘油、胆汁酸和/或酮体或以上所定义的其它精细化学品包括改变的蛋白质的产量、产生或生产效率。当是植物时，通过例如提高细胞中作为众多产物例如脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、脂类、蜡酯、多糖和/或polyhydroxyalkanoates和/或其代谢产物、尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰基甘油、胆汁酸和/或酮体基础的乙酰辅酶A表达，有可能提高已产生所述化合物的量，因此允许更容易地收获和纯化或当是植物时更高效地分隔。此外，可能需要一种或多种所述代谢产物，提高量的辅因子、前体分子和中间体化合物用于适宜的生物合成途径。因此，通过提高参与输入营养物如碳源(即糖)、氮源(即氨基酸、铵盐)、磷酸盐和硫的运输蛋白的量和/或活性，有可能因消除对生物合成过程的营养供应限制而改善乙酰辅酶A及其如以上所提及代谢产物的产生。特别地，有可能提高植物中所述化合物例如脂肪酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、维生素、蜡酯、脂类、多糖和/或polyhydroxyalkanoates和/或其代谢产物，尤其类固醇激素、胆固醇、前列腺素、三酰基甘油、胆汁酸和/或酮体分子等的产量、产生和/或生产效率。
进一步优选用于在宿主生物中重组产生药物或精细化学品的方法，其中宿主生物以包含一个或多个编码目的精细化学品或催化生物合成目的精细化学品的结构基因的以上所述表达构建体之一转化，将转化的宿主生物培养以及将目的精细化学品自培养基分离。这种方法可广泛应用于精细化学品，如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸以及天然香料和合成香料、芳香物质和色料或包含它们的组合物。特别优选额外地产生氨基酸、生育酚和生育三烯酚类和类胡萝卜素或包含所述化合物的组合物。将转化的宿主生物培养并且通过技术人员已知的方法自该宿主生物或培养基回收产物，或生物本身就充当食物或饲料补充物。药物如抗体、疫苗的产生由Hood EE，Jilka JM.Curr Opin Biotechnol.1999Aug；10(4)：382-6；Ma JK，Vine ND.Curr Top Microbiol Immunol.1999；236：275-92描述。
在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定赋予生物中提高的生长或产量的基因产物的方法，包括如下步骤：
a)将样品例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库的核酸分子与本发明多核苷酸接触例如杂交，其中所述核酸分子可含有编码上述在表达后赋予产量或生长的基因产物的候选基因；
b)鉴定与本发明多核苷酸在放松的严格条件(relaxed stringentconditions)下杂交的核酸分子，并且任选地分离全长cDNA克隆或完整基因组克隆；
c)将候选核酸分子导入宿主细胞，优选地是植物细胞或微生物：
d)在宿主细胞中表达已鉴定的核酸分子；
e)获得转基因生物并分析在宿主细胞中的生长速率或产量；和
f)鉴定在表达后与野生型比较赋予表达提高的核酸分子及其基因产物；
放松的杂交条件是：在标准杂交过程后，洗涤步骤可以与例如具有0.1％SDS和0.1×SSC的60°-68℃严格洗涤条件比较在通常具有40°-55℃和具有0.1％SDS的2×SSC至0.2×SSC之间盐条件的低严格至中等严格条件下实施。严格杂交条件的其它实例可在如上所列参考文献中找到。通常洗涤步骤随严格度和长度的提高而重复直至探测到有用的信噪比，并且取决于多种因素，如靶、其纯度、GC含量、大小、探针如探针的大小、其是否为RNA或DNA探针、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定赋予生物中提高的生长或产量的基因产物的方法，包括如下步骤：
a)鉴定生物的核酸分子；该核酸分子可以含有编码在表达后赋予生长速率和/或产量提高的基因产物的候选基因，至少20％、优选地25％、更优选地30％、甚至更优选的是35％、40％或50％、甚至更优选的是60％、70％或80％、最优选的是90％或95％或更多同源于本发明的核酸分子，例如通过数据库内同源性搜索；
b)将所述候选核酸分子导入适用于产生饲料或食品或精细化学品的宿主生物，优选地是植物细胞或微生物；
c)在宿主细胞中表达已鉴定的核酸分子；
d)获得生物并测试该生物的产量或生长；
e)以及鉴定核酸分子及其基因产物，所述核酸分子表达赋予表达后的宿主细胞与野生型相比较产量或生长的提高。
随后已鉴定的核酸分子可以按照如同本发明多核苷酸的相同方式利用。
此外，在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定刺激所述植物的生长或产量的化合物的方法，包括：
a)将表达本发明多肽或其mRNA的细胞与候选化合物在细胞培养条件下接触；
b)测定在所述多肽或所述mRNA表达上的提高；
c)将表达水平与不存在所述候选化合物时产生的标准反应比较，其中超过该标准的提高表达说明该化合物刺激产量或生长。
此外在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选本发明多肽活性的激动剂的方法：
a)将表达本发明多肽的细胞、组织、植物或微生物与候选化合物或包含多种化合物的样品在允许表达本发明多肽的条件下接触；
b)测定细胞、组织、植物或微生物中或培养或维持细胞、组织、植物或微生物的培养基中的生长、产量或多肽表达水平；和
c)通过将已测量的生长或产量或多肽表达水平与在所述候选化合物或包含所述多种化合物的样品不存在时所测量的标准生长、产量或多肽表达水平相比较而鉴定激动剂或拮抗剂，其中高于标准的提高水平表明该化合物或包含所述多种化合物的样品是激动剂，并且低于标准的降低水平表明该化合物或包含所述多种化合物的样品是拮抗剂。
此外在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定赋予植物或微生物中提高的生长和/或产量产生的化合物的方法，包括步骤：
a)培养表达本发明多肽的细胞或组织或微生物或维持表达本发明多肽的植物或编码所述多肽的核酸分子以及读出系统，其中所述读出系统能够在化合物或包含多种化合物的样品存在时于允许所述多肽与所述读出系统相互作用的合适条件下与所述多肽相互作用并且在允许所述读出系统和本发明多肽表达的条件下能够提供响应于化合物与所述多肽结合的可检测信号；和
b)通过检测由该读出系统所产生信号的存在或不存在或提高而鉴定该化合物是否为有效激动剂。
所述化合物可以化学合成或由微生物产生和/或包含于样品内，例如来自如植物、动物或微生物，例如病原菌的细胞提取物内。此外，所述化合物可以是在本领域内已知，但迄今尚不知道其能够抑制或活化本发明多肽。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞培养物或组织培养物。用于本发明方法的合适设置对本领域内技术人员为已知并且例如通常在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，尤其第17章中描述。例如可以将化合物添加至反应混合物、培养基、注射至细胞或喷洒在植物上。
如果包含化合物的样品在本发明的方法中得到鉴定，则有可能从已鉴定为含有能够起活化或提高作用的化合物的原初样品中分离化合物，或可进一步划分此原初样品，例如它是否由多种不同化合物组成，以便减少每一样品中不同物质的数目并且对原初样品的部分重复该方法。根据样品的复杂度，可以实施数次以上所述步骤，优选地直至根据本发明方法鉴定的样品仅包含有限数目的物质或仅包含一种物质。优选地，所述样品包含化学和物理特性相似的物质，并且最优选地所述物质为均一。优选地，将根据以上方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制为适合在植物育种或植物细胞和组织培养中应用的形式。
可根据本发明方法测试并鉴定的化合物可以是表达文库例如cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小分子有机化合物、激素、模拟肽、PNA或其它(Milner，Nature Medicine 1(1995)，879-880；Hupp，Cell 83(1995)，237-245；Gibbs，Cell 79(1994)，193-198和其中所引用参考文献)。所述化合物还可以为已知的抑制物或激活物的功能性衍生物或类似物。用于制备化学衍生物或类似物的方法对本领域技术人员为已知并且在例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New YorkInc.，175Fifth Avenue，New York，N.Y.10010U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA.中描述。此外，可据本领域内已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，例如可以根据以上所述的方法使用适宜衍生物和类似物的模拟肽(peptidominetics)和/或计算机辅助设计。可在本发明方法中应用的细胞或组织优选地是此前实施方案中所描述的本发明的宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因此，在又一实施方案中，本发明涉及根据用于鉴定本发明激动剂的方法得到或鉴定的化合物，该化合物是本发明多肽的激动剂。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过用于鉴定本发明化合物的方法鉴定的化合物。
所述化合物是例如本发明多肽的同系物。本发明多肽的同系物可通过本发明多肽的诱变例如离散点突变或截短产生。如这里所用，术语“同系物”指作为本发明多肽活性的激动剂起作用的蛋白质的变体形式。所述蛋白质的激动剂可保留基本相同或部分的本发明多肽的生物活性。特别地，所述激动剂赋予本发明多肽表达水平的提高和/或所述激动剂或其部分在生物中的表达赋予生长和/或产量的提高。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或激动剂的抗体。
本发明还涉及包含以上所提及的至少一种本发明的多核苷酸、核酸分子、载体、蛋白质、抗体或化合物的诊断组合物和任选地涉及用于检测的合适手段。
本发明的诊断组合物适用于自细胞分离mRNA并将如此得到的mRNA与包含如上所述核酸探针的探针在杂交条件下接触，检测与该探针杂交的mRNA的存在，并且因此检测细胞中蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在的其它方法包括本领域内众所周知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定法。
此外，在关联作图或植物育种尤其标志辅助育种中使用本发明的核酸分子作为分子标志或引物是有用的。在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子可用于对直接或间接与植物生长或产量相关的特性的关联作图或植物育种，尤其标志辅助育种。例如本发明的核酸可能与生长和产量的定量特性位点共定位。在这种情况下，共分配具有生长和产量差异的本发明核酸的不同变体可能允许通过测试杂交后代中存在或不存在想要或不想要的本发明核酸的变体对这些特性高级育种。用于检测的合适手段对本领域技术人员为众所周知，例如，用于杂交测定法的缓冲液和溶液例如以上提及的溶液和缓冲液，以及用于Southern、Western、Northern等印迹的其它方法如Sambrook等所述是已知的。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明方法所鉴定的核酸分子、载体、宿主细胞、多肽、反义核酸、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或化合物或激动剂的试剂盒。
可以将本发明试剂盒的化合物包装于容器例如小瓶内，任选地与缓冲液和/或溶液放在一起或在其中。根据需要，可以将一种或多种所述成分包装于一个相同的容器内。额外地或备选地，可以将一种或多种所述成分吸附至固体支持物，如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或尼龙膜或在微量滴定平板孔内。可将该试剂盒在本文所述的任意方法和实施方案中使用，用于例如产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗剂或激动剂、作为食物或饲料或作为其补充物、作为用于处理植物的补充物等。
此外，试剂盒可包含对该试剂盒用于任意的所述实施方案、尤其用于产生生物或其部分的使用说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种以上所提及蛋白质的核酸分子和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。
在又一实施方案中，本发明涉及用于产生农用组合物的方法，其提供本发明的核酸分子、载体或多肽或者包括用于鉴定所述化合物、激动剂或拮抗剂的本发明方法的步骤；以及将本发明的核酸分子、载体或多肽或根据本发明方法所鉴定的激动剂或化合物或利用本发明的主题配制成可接受作为植物农用组合物应用的形式。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生赋予植物提高的生长或产量的农用组合物的方法，其包括用于鉴定化合物的本发明方法的步骤；并且将所鉴定的化合物配制成可接受作为农用组合物的形式。
以下，将“作为农用组合物可接受的”理解为此组合物符合规范杀真菌剂、植物营养物、除草剂等内容的法规。优选地，此组合物对所保护的植物和用该植物饲养的动物(包括人)没有任何危害。
本发明还涉及关于其它用途和方法的几个实施方案。如本文中所述的多核苷酸、多肽、蛋白质同系物、融合蛋白、引物、载体、宿主细胞可在一个或多个如下方法中使用：鉴定如所提及的用于促进氨基酸产生的植物和相关生物；基因组作图；鉴定和定位目的序列；进化研究、确定为功能所需的区域；调节活性。
有利地，以类似于鉴定激动剂的方式鉴定的本发明多肽的抑制剂可用作除草剂。本发明多肽的抑制剂可降低植物生长。例如假如过量表达本发明多肽的有用植物能够存活，田间施用该抑制剂总是抑制不受欢迎的植物生长。
因此，本发明的多核苷酸具有众多用途。首先，它们可以用于鉴定生物或其亲缘较近的亲属。此外，它们可以用于鉴定微生物或植物的混合群体中该生物或其亲属的存在。通过严格条件下用覆盖对该基因为独特的本发明基因的区域的探针探测自植物独特群体或混合群体的培养物提取的基因组DNA，可以确定混合群体中是否存在独特生物。
此外，本发明的多核苷酸可以与相关种的序列足够同源以至这些核酸分子可在构建相关生物的基因组图中充当标志。
本发明的多核苷酸还用于进化和蛋白质结构研究。通过将本发明多核苷酸的序列与来自其它生物的编码相似酶的多核苷酸序列比较，可评估生物的进化相关性。类似地，这种比较允许评估序列中哪些区域保守以及哪些区域非保守，这可能有助于确定蛋白质中对酶发挥作用关键的区域。这类型的确定对蛋白质工程研究有价值并且可以提供蛋白质可能耐受何种诱变而不丧失功能的提示。
此外，本发明的多核苷酸、本发明的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、根据本发明方法鉴定的拮抗剂或激动剂、本发明的抗体、本发明的反义分子或根据本发明方法鉴定的核酸分子可用于制备农用组合物。
本发明的多核苷酸、本发明的多肽、本发明的核酸构建体、本发明的生物、宿主细胞、微生物、植物、植物组织、植物细胞或其部分、本发明的载体、根据本发明方法所鉴定的拮抗剂或激动剂、本发明的抗体、本发明的反义分子或根据本发明方法鉴定的核酸分子可用于鉴定和产生能够引起调节生物或其部分中产量和生长水平的化合物，优选地用于鉴定和产生引起生物或其部分中生长和产量水平或速率提高的化合物，如果将已鉴定的所述化合物应用于生物或其部分即作为其食物的部分，或应用于生长培养基或培养基中。
通过本发明的描述和实施例公开并包含了这些实施方案和其它实施方案。可以从公共图书馆内获取关于根据本发明待应用的任一方法、用途和化合物的其它文献，例如使用电子设备。例如可以利用可在互联网例如hftp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html网址下获得的公共数据库“Medline”。其它数据库和网址，如hftp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/、hftp：//www.infobiogen.fr/、hftp：//www.fmi.ch/biology/research-tools.html、hftp：//www.tigr.org/对本领域技术人员为已知，并且还可以使用例如hftp：//www.lycos.com得到。在Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出生物技术专利信息综述以及用于前瞻性检索和了解现状的专利信息的相关资源调查。
将本专利申请中所引用的全部参考文献、专利申请、专利和已公开专利申请的内容此处引用作为参考。
实施例
实施例1：
酵母ORFs YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W和YGL217C的扩增和克隆
除非另外声明，使用根据Sambrook等，Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold Spring HarborLaboratory Press的标准方法。根据Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)的说明书开展ORFs YMR095C，YGL212W、YMR107W、YDL057和YGL217C的PCR扩增。组成如下：1×PCR缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mM MgSO4、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％TritonX-100、0.1mg/ml BSA]、0.2mM d-硫代-dNTP和dNTP(1∶125)、酿酒酵母(S288C株；Research Genetics，Inc.现在的Invitrogen)基因组DNA 100ng、50pmol正向引物、50pmol反向引物、2.5单位Pfu Turbo DNA聚合酶。扩增循环如下：
95℃3分钟一个循环，随后每个循环中95℃1分钟、50℃45秒、72℃210秒共36循环，随后72℃8分钟一个循环，随后4℃。
为扩增根据SEQ ID NO：1、106、124、128和136的酿酒酵母基因，选择如下引物序列：
YMR095C的正向引物(SEQ ID NO：96)：
5′-atgcacaaaa cccacagtac aatgt-3′
YMR095C的反向引物(SEQ ID NO：97)：
5′-ttaattagaa acaaactgtc tgataaac-3′
YGL212W的正向引物(SEQ ID NO：122)：
5′-atggcagcta attctgtagg gaaaa-3′
YGL212W的反向引物(SEQ ID NO：123)：
5′-tcaagcactg ttgttaaaat gtctag-3′
YMR107W的正向引物(SEQ ID NO：126)：
5′-atgggtagtt tttgggacgc attc-3′
YMR107W的反向引物(SEQ ID NO：127)：
5′-ttatctattt actttattgt cgggttc-3′
YDL057W的正向引物(SEQ ID NO：130)：
5′-atggaaaaaa aacatgtcac tgtgc-3′
YDL057W的反向引物(SEQ ID NO：131)：
5′-ctatgtatct tgcaggtatt ccata-3′
YGL217C的正向引物(SEQ ID NO：138)：
5′-ATGAGCATTCTATCATCCACACAAT-3′
YGL217C的反向引物(SEQ ID NO：139)：
5′-TTAACTACTTGAGTTTTCTTTCCAGC-3′
随后将扩增子根据标准方法(Qiagen)通过QIAquick柱纯化。
载体DNA(30ng)的限制性切割根据标准方法用EcoRI和SmaI实施，根据标准方法(MBI-Fermentas)填补EcoRI切割位点并且通过添加高盐缓冲液终止反应。将切割的载体片段根据标准方法通过Nucleobond柱(Machery-Nagel)纯化。使用含有选择盒(启动子、选择标志例如bar基因或AHAS基因、终止子)和包含组成型启动子如Super启动子(ocs3mas)(Ni等，The Plant Journal 1995，7，661-676)的表达盒、克隆盒以及位于T-DNA边界序列间终止子序列的双元载体。除在克隆盒之外，该载体没有EcoRI和SmaI切割位点。可使用的双元载体对技术人员为已知，并且关于双元载体及其用途的综述可在Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)”Aguide to Agrobacterium binary vectors”，Trends in Plant Science，第5卷NO 10.446-451中找到。根据所用的载体，还有利地使用其它限制性酶实施克隆。相应的有利切割位点可以通过使用用于PCR扩增的相应引物添加至ORF。
混合并通过添加连接酶连接大约30ng已制备的载体和已确定量的已制备扩增子。将已连接的载体通过添加感受态大肠杆菌(DH5α株)细胞并在1℃温育20分钟，随后在42℃热休克90秒并冷却至4℃在相同反应管内转化。随后添加完全培养基(SOC)并在37℃温育45分钟。随后将全部混合物在含有(根据所用双元载体选择的)抗生素琼脂平板上涂布并在37℃温育过夜。
借助结合至限制性切割位点上游和下游并因此可能扩增插入物的引物通过扩增检验成功的克隆。扩增根据Taq DNA聚合酶操作手册(Gibco-BRL)实施。组成如下：1×PCR缓冲液[20mM Tris-HCL(pH 8.4)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.2mM dNTP、5pmol正向引物、5pmol反向引物、0.625单位Taq DNA聚合酶]。
扩增循环如下：94℃5分钟一循环，随后每循环94℃15秒、66℃15秒、72℃5分钟共35循环，随后72℃10分钟一循环，随后4℃。
将数个菌落通过限制性消化和测序进一步检验，并且仅随后使用预期大小已鉴定的PCR产物处于正确方向的一个菌落。
将该阳性菌落的一部分转移至完全培养基(LB)充满的反应管并在37℃温育过夜。LB培养基含有用于选择克隆的抗生素，根据所用双元载体和其所含抗性基因而选择。
质粒制备根据Qiaprep标准方法(Qiagen)指南实施。
实施例2：
通用的植物转化
通过用农杆菌转染的植物转化和植物再生可以根据例如本文中所述或Gelvin，Stanton B.；Schilperoort，Robert A，“Plant Molecular BiologyManual”，第二版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-在Sect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，BernardR.；Thompson，John E.，“Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology”，Boca Raton：CRC Press，1993.-360S.，ISBN0-8493-5164-2中的标准方法实施。
油籽油菜可以通过子叶转化作用，例如根据Moloney等，Plant CellReport 8(1989)，238-242；De Block等，Plant Physiol.91(1989，694-701)转化。
大豆可以例如根据EP 0424 047、US 5,322,783或EP 0397 687、US5,376,543、US 5,169,770中所述方法转化。
备选地，除农杆菌介导性植物转化外，还可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导或通过“碳化硅纤维(silicon carbide fiber)”技术实现DNA摄取和转化植物，见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”(1993)ISBN3-540-97826-7，Springer Verlag New York。
实施例3：
制备过量表达ORFs YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W和YGL217C的植物。
将分别的质粒构建体借助电穿孔手段转化至含有pMP90质粒的农杆菌菌株pGV3101，并且将菌落涂布于含有选择标志卡那霉素、庆大霉素和利福平的TB培养基(QBiogen，德国)并在28℃温育2天。抗生素或选择剂将根据所用质粒和根据匹配的农杆菌菌株选择。关于双元质粒和农杆菌菌株的综述可在Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)”A guide toAgrobacterium binary vectors”，Trends in Plant Science，第5卷NO 10.446-451中找到。
借助牙签自琼脂平板挑取菌落并在含有以上所提及抗生素的3ml TB培养基上生长。
将预培养物在28℃并且每分钟120转的振荡培养器内生长48小时。对于主培养，使用400ml含有适宜抗生素的LB培养基。将预培养物转移至主培养，在28℃每分钟120转生长18小时。每分钟4000转离心后，将沉淀重悬于浸润培养基(含10％蔗糖的M&S培养基)。将培养碟(PikiSaat 80、绿色、带筛选底，30×20×4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststofftechnik，德国)用GS 90基质(标准土壤，Werkverband E.V.，德国)半充满。培养碟用0.05％Previcur溶液(Previcur N，Aventis CropScience)过夜灌溉。拟南芥菜的转化根据Bechtold N.和Pelletier G.(1998)In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsisthaliana plants by vacuum infiltration.Methods in Molecular Biology.82：259-66以及Clough和Bent Clough，JC和Bent，AF.1998Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana，Plant J.16：735-743所述实施。
在培养碟内撒布拟南芥菜C24种子(英国诺丁汉姆拟南芥贮存中心；NASC Stock N906)，每碟大约1000粒种子。将培养碟用罩子盖住并放入层流设施(8小时110μE，5℃；16小时黑暗，6℃)。5天后，将培养碟放入短日人工气候箱(short-day phytotron)(8小时130μE，22℃，16小时黑暗，20℃)，在其中培养碟停留10天直至形成第一片真叶。将幼苗转移至含有相同基质的罐(直径10cm的Teku罐，LC系列，由德国GmbH&Co制造)内。将9株植物挑入每个罐内。随后将罐放回短日人工气候箱以便植物继续生长。10天后，将植物转移至温室箱，16小时340μE22℃和8小时黑暗20℃，在其中植物再生长10天。
将刚开始开花的7周龄拟南芥植物在事先已用10μl Silwett L77(Crompton S.A.，Osi Specialties，Switzerland)处理的以上所提及农杆菌混悬液内浸泡10秒。操作方法在Bechtold N.和Pelletier G.(1998)中描述。随后将植物放入湿润箱18小时并且随后将罐放回温室以便植物继续生长。植物在其中再维持10周直至收获种子。
根据用于选择已转化的植物的抗性标志，将已收获种子在温室播种并接受喷雾选择，或灭菌后在具有合适选择剂的琼脂平板上培养。对于-抗性，幼小植物用0.02％间隔2-3天喷洒4次。大约10-14天后，已转化的抗性植物与死亡野生型幼苗区分明显并且能够挑出植入6cm罐。将转化的植物允许结种。转基因的拟南芥菜植物的种子在(-20℃)冰箱贮存。
实施例4
通过测量鲜重分析过量表达SEQ ID NO：1、106、124、128或136的株系
选出过量表达SEQ ID NO：1、106、124、128或136RNA的株系。为此目的，将总RNA自三周龄拟南芥转基因植物提取用于SEQ ID NO：1、106、124或128。为了杂交，20μg RNA电泳分级，根据制造商说明书印迹至Hybond N膜(Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，德国)并与YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057或YGL217C特异性探针杂交。将Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe，德国)用于杂交并且根据制造商说明书使用Rediprime II DNA标记系统(AmershamBiosciences Europe GmbH Freiburg，德国)标记探针。用于这些探针的DNA片段借助拟南芥基因组DNA和如下引物进行标准PCR手段分别制备：
5′-atgcacaaaa cccacagtac aatgt-3′(SEQ ID NO：96)
和
5′-ttaattagaa acaaactgtc tgataaac-3′(SEQ ID NO：97)，
5′-atggcagcta attctgtagg gaaaa-3′(SEQ ID NO：122)
和
5′-tcaagcactg ttgttaaaat gtctag-3′(SEQ ID NO：123)，
5′-atgggtagtt tttgggacgc attc-3′(SEQ ID NO：126)
和
5′-ttatctattt actttattgt cgggttc-3′(SEQ ID NO：127)，
5′-atggaaaaaa aacatgtcac tgtgc-3′(SEQ ID NO：130)
和
5′-ctatgtatct tgcaggtatt ccata-3′(SEQ ID NO：131)或
5′-ATGAGCATTCTATCATCCACACAAT-3′(SEQ ID NO：138)
和
5′-TTAACTACTTGAGTTTTCTTTCCAGC-3′(SEQ ID NO：139)。
为了分析，将植物以如下条件在来自Weibull(Sweden)的人工气候室中培养。在分层后，将试验植物在16小时光照/8小时黑暗节奏在20℃、湿度60％和CO2浓度400ppm培养22-23天。光源是来自Osram的Powerstar HQI-T 250W/D日光灯，其产生具有光密度220μE/m2/s-1的类似于太阳光的色谱光。
播种后24天，即对应于发芽后第17天，研究每个例子中野生型(WT)和YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W和YGL217C过量表达株系(分别是株系3318、5194、3325、4803和9001)的大约40株个体植物。转基因系和野生型(WT)拟南芥植物的地上部分鲜重此后使用精确天平立即测量。将野生型植物和最重转基因株系间结果的差异通过T检验对每一株系检测显著性。
结果在表1显示。
表1：过量表达五种不同酵母基因的转基因拟南芥植物的生物质与MC24野生型比较的提高概览。生物质分析在不同实验(1.1或1.2)中开展并随后在证实部分(1或2)中证实。
文献：
Gibson，(1996)A novel methods for real time quantitativeRT-PCR.Genome Res.6，995-1001
Lie，(1998)Advances in quantitative PCR technology：5′nuclease assays
实施例5
烟草和卡诺拉油菜中SEQ ID NO：1、106、124、128或136的过量表达
为转化卡诺拉油菜(欧洲油菜)，使用5-6日龄幼苗的子叶柄和胚轴作为组织培养的外植体并且尤其如Babic等(1998，植物细胞Rep 17：183-188)中所述进行转化。商业品种Westar是用于转化的标准品种但是还可以利用其它品种。将编码SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的序列根据分子生物学标准方法克隆至含有选择盒的双元载体的表达盒。示例性克隆在实施例中其它地方描述并且对技术人员为已知。使用以双元载体转化的根瘤农杆菌LBA4404菌株转化。已经描述了多种用于植物转化的双元载体(尤其在An，G.Agrobacterium Protocols.Methods in MolecularBiology第44卷，第47-62页，Gartland KMA and Davey MR eds.HumanaPress，Totowa，New Jersey)。众多双元载体衍生自双元载体pBIN19，其中pBIN19已经由Bevan描述(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)并包含根瘤农杆菌Ti质粒左边界和右边界在两侧分布的用于植物的表达盒。植物表达盒包含至少两种成分：选择标志基因和能够以所需要方式调节植物细胞中cDNA或基因组DNA转录的合适启动子。可以使用多种选择标志基因如抗生素抗性或除草剂抗性基因，如编码突变的除草剂抗性AHAS酶的已突变拟南芥基因(US 5,767,366和US 6,225,105)。类似地，还可能使用不同启动子表达具有SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的基因。例如可能需要由如34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)介导的组成型表达或种子特异性表达。
卡诺拉油菜种子在70％乙醇中灭菌2分钟随后在含有一滴Tween-20的30％chlorox中灭菌10分钟，随后在无菌水中洗涤3次。
将种子在含有1％蔗糖、0.7％植物琼脂的不带激素的半浓缩MS培养基上在23℃并16/8小时昼/夜节律体外培养5天以便发芽。将子叶柄外植体随同幼苗子叶一起分离并通过将切开部分浸入细菌混悬液内以农杆菌接种。随后将该外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上在23℃以及16小时光照培养2天。与农杆菌共培养两天后，将此外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上7天并随后转移至含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)和选择剂的MSBAP-3培养基上直至枝条再生。当枝条长5-10mm时，将其切下并转移至枝条延伸培养基(含有0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)上。随后将长大约2cm的枝条转移至根培养基(MS0)以诱导根。
原代转基因植物的材料通过PCR研究以验证T-DNA掺入至基因组。随后阳性结果通过DNA印迹分析证实。
随后测试已证实的转基因植物的更快生长和更高产量。
烟草植物的无菌培养
无菌条件下培养的烟草植物通过将长大约1-2cm并任何情况下具有一个节间的茎块在无菌培养基(含有2％蔗糖和0.7％琼脂-琼脂的Murashige和Skoog培养基)(Murashige，T.和Skoog，F.(1962)Physiol.Plant.15：473-497)体外繁殖。植物在23℃，200μE生长并具有16小时/8小时光照/黑暗节律。
生长大约5-6周后，将所述植物的叶在无菌条件下切成大约1cm2的片。
细菌培养
借助无菌塑料尖自琼脂平板挑取用构建体转化的以表达SEQ ID NO：2、107、125、129或137活性的农杆菌菌落，随后将此灭菌塑料尖转移至含有相关抗生素的大约20ml液体YEB培养基(Sambrook等，MolecularCloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor 1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)内。选择所述YEB培养基的体积作为转化体数目的函数。通常20ml细菌培养物足够用于产生约80个转基因烟草植物。将细菌培养物在每分钟200转以及在28℃的振荡器内生长1天。次日，将细菌培养物通过每分钟4000转离心去除并且继续置于液体Murashige和Skoog培养基内培养。
转化
将叶片在细菌混悬液内短暂蘸一下并在Murashige和Skoog培养基(2％蔗糖和0.7％琼脂-琼脂)上黑暗培养2天。如Rocha-Sosa(Rocha-Sosa，M.，Sonnewald，U.，Frommer，W.，Stratmann，M.，Schell，J.和Willmitzer，L.1998，EMBO J.8：23-29)的方法中所述，将外植体转移至含有抗生素和相应激素的MS培养基。
转基因株系可随后通过RNA印迹分析法分析SEQ ID NO：2、107、125、129或137转基因的表达。然后可测定与野生型比较所选择株系鲜重和种子产量的提高。
实施例6
设计和表达结合接近于内源性SEQ ID NO：2、107、125、129或137同系物并活化其转录的合成性转录因子
SEQ ID NO：1、106、124、128或136的内源性ORF或其它植物种的同源ORF还可以通过导入合成的特异性激活剂活化。为此目的，构建了编码结合至SEQ ID NO：1、106、124、128或136ORF或其在其它植物中的同系物ORF的调节区域内特定区域的嵌合性锌指蛋白的基因。此人工锌指蛋白包含特异性DNA结合结构域以及活化结构域，如例如单纯疱疹病毒VP16结构域。然后，在植物中表达这种嵌合性激活剂引起本文中靶基因的特异性表达，例如，YGL212w的拟南芥同系物SEQ ID NO.118或SEQ ID 1(YMR095C)的玉米同系物SEQ ID 102或SEQ ID NO：1、106、124、128或136在其它植物种中的其它同系物。实验细节可以如WO 01/52620或Ordiz MI，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷第20期13290)或Guan，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷第20期13296)中所述实施。
实施例7
鉴定其中强启动子整合至植物中SEQ ID NO：1、106、124、128或136同系物的上游并因此使表达活化的株系。
还有可能将强启动子整合在所述ORF上游用于目的ORF的强异位表达。为此目的，产生了其中将含有双向mas启动子(Velten，1984，EMBOJ，3，2723)的载体整合至T-DNA左边界的转基因拟南芥植物群体。所述启动子能够通过它的2′启动子使来自T-DNA的转录越过左边界至邻近的基因组DNA。随后将基因组DNA自个体植物分离并根据特定计划汇集。这种对特定位点内T-DNA整合的反向筛选方法已经由Krysan等，(Krysan，1999.The Plant Cell，Vol 11，2283)详细描述并在本文中作为参考。鉴定其中T-DNA已整合在SEQ ID NO：1、106、124、128或136ORF的植物同系物上游的株系。与野生型比较，这些株系中SEQ ID NO：1、106、124或128的植物同系物增强的表达通过RNA印迹分析法检测。
实施例8
鉴定其它植物种中的同源基因
其它植物的同源序列通过特定数据库搜索工具，例如尤其是BLAST算法(基本局部比对搜索工具，Altschul，1990.J.Mol.Biol.，215，403和Altschul，1997，Nucl.Acid Res.，25，3389)鉴定。使用BLOSUM-62评分矩阵(scoring matrix)(Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10915)以标准方式开展blastn和blastp比较。研究了NCBI GenBank数据库及欧洲油菜栽培变种“AC Excel”、“Quantum”和“Cresor”(卡诺拉油菜)以及稻栽培变种Nippon-Barre(日本稻)的三个表达序列标签(EST)文库。搜索鉴定了与SEQ ID NO：2、107、125、129和137同源的来自多种生物的氨基酸序列和其相应核酸序列。
实施例9 工程化植物
实施例9a 工程化黑麦草植物
数个不同黑麦草品种的种子可以作为外植体来源用于转化，包括自Svalof Weibull种子公司可得到的商业品种Gunne或品种Affinity。种子依次用1％Tween-20持续1分钟、100％漂白粉持续60分钟，用去离子水和蒸馏水洗涤3次每次5分钟表面灭菌，并且随后在潮湿、灭菌滤纸上在黑暗中发芽3-4天。随后幼苗用1％Tween-20持续1分钟、75％漂白粉持续5分钟并用ddH2O漂洗三次，每次5分钟再次灭菌。
将表面灭菌的种子放在愈伤组织诱导培养基上，其中所述诱导培养基含有Murashige和Skoog基本盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l Phytagel、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏。平板在25℃黑暗培养4周以便种子发芽和诱导胚胎生成性愈伤组织。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，修剪幼苗的枝条和根，将愈伤组织转移至新鲜培养基，维持另外4周培养，然后转移至MSO培养基光照2周。将数条愈伤组织(11-17周龄)通过10目筛过滤并放在愈伤组织诱导培养基上，或将其在250ml烧瓶内100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与用于愈伤组织诱导相同的具有琼脂的培养基)中培养。该烧瓶用箔包裹并在23℃黑暗以每分钟175转振荡1周。用40目筛过滤液体培养物收集细胞。将由滤网收集的部分涂布于固体愈伤组织诱导培养基并在25℃黑暗培养1周。随后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基并培养2周。
可用农杆菌或粒子轰击方法完成转化。制备含有组成型植物启动子和pUC载体中基因的cDNA的表达载体。质粒DNA使用Qiagen试剂盒根据制造商说明书自大肠杆菌细胞制备。将大约2g胚胎生成性愈伤组织在培养皿内的无菌滤纸中央摊开。将一部分含10g/l蔗糖的液体MSO添加至滤纸。将金粒(大小1.0μm)根据Sanford等，1993的方法以质粒DNA包被并以如下参数递送至胚胎发生性愈伤组织：每次发射500μg粒子和2μg DNA、1300psi并且终止板至愈伤组织板的靶距离为8.5cm以及每个愈伤组织板发射1次。
轰击后，将愈伤组织重新转移至新鲜愈伤组织发育培养基并在室温于黑暗维持1周时间。随后将愈伤组织转移至25℃光照的生长条件以便用合适的选择剂启动胚芽分化，例如250nM Arsenal、5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素。耐受选择剂的枝条出现并且一旦生根即转移至土壤内。
原代转基因植物(To)的样本通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过DNA杂交证实，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至具有正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针并根据制造商建议使用。
转基因To黑麦草植物通过切下分蘖而营养繁殖。将移植的分蘖在温室维持2个月直至充分长成。将枝条脱叶并且允许生长2周。
实施例9b 工程化大豆植物
大豆可根据如下对Texas A&M专利US 5,164,310中所述方法的修改转化。数个商业大豆品种可适用于通过此方法的转化。通常将栽培变种Jack(可从Illinois种子基金获得)用于转化。种子通过浸泡在70％(v/v)乙醇中6分钟并且在补加0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)中20分钟，随后用无菌重蒸馏水淋洗4次灭菌。从每株幼苗除去胚根、下胚轴和一片子叶繁殖了7日龄的幼苗。随后，将具有一片子叶的上胚轴转移至培养皿中的新鲜发芽培养基并在25℃16小时光照期(大约100μE-m-2s-1)培育3周。将叶结节(大约4mm长)自3-4周龄植物切下。切下叶结节并在农杆菌LBA4404培养物中温育。
已经描述了用于植物转化的众多不同双元载体系统(例如An，G.，Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑.Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多系统基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)，其中载体pBIN19包含来自根瘤农杆菌Ti质粒的左边界和右边界在两侧分布的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两种基因组成-选择标志基因和调节特征基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。如上所述，可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(US 5,767,366和US 6,225,105)。类似地，还可能使用多种启动子调节特征基因以便提供如以上所述对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)提供特征基因的组成型表达。
共培养处理后，洗涤外植体并转移至补加500mg/L特美汀的选择培养基。将枝条切下并置于枝条延伸培养基内。移植至土壤前，将长超过1cm的枝条置于生根培养基两至四周。
原代转基因植物(To)的样本通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过DNA印迹杂交证实，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移到具有正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针并根据制造商建议使用。
实施例9c
工程化谷物植物
玉米(Zea Mays L.)的转化根据Ishida等(1996.Nature Biotech14745-50)所述方法转化。在玉米中转化呈基因型依赖并且仅可操作特定基因型以转化和再生。杂交系A188(Minnesota明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等1990Biotech 8：833-839)，不过还可以成功使用其它基因型。授粉后大约11天(DAP)当不成熟胚芽长大约1至1.2mm时自玉米植物收获谷穗。将不成熟胚芽与携带“超级二元”载体的根瘤农杆菌共培养并且通过器官发生恢复为转基因植物。日本烟草(Japan Tobacco)的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。可以如所述构建载体。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(US 6,025,541)。类似地，可以使用多种启动子调节特征基因以提供如以上所述对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)提供特征基因的组成型表达。
将切下的胚芽在愈伤组织诱导培养基上生长，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上生长。将培养板在25℃光照培养2-3周，或培养至枝条发育。将绿色枝条从每株胚芽转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周直至根发育。将生根的枝条转移至温室中的土壤内。T1种子自显示耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因呈PCR阳性的植物产生。
单位点插入T-DNA的T1世代可以对转基因以3∶1比率分离。这些含有一个或两个拷贝转基因的子代耐受咪唑啉酮除草剂。纯合T2植物可表现类似于T1植物的表型。纯合的转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1子代)也可以表现提高的类似表型。
实施例9d
工程化小麦植物
小麦的转化根据Ishida等(1996Nature Biotech.14745-50)所述方法开展。通常将栽培变种Bobwhite(可从CYMMIT，Mexico获得)用于转化。将不成熟胚芽与携带“超级二元”载体的根瘤农杆菌共培养并且通过器官发生恢复转基因植物。日本烟草(Japan Tobacco)的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。可以如所述构建载体。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(US 6,025,541)。类似地，可以使用多种启动子调节特征基因以如上所述提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)提供特征基因的组成型表达。
与农杆菌温育后，将胚芽在愈伤组织诱导培养基上生长，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的再生培养基上生长。将培养板在25℃光照培养2-3周，或培养至枝条发育。将生根的枝条转移至温室中土壤内。T1种子自显示耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因呈PCR阳性的植物产生。
单位点插入T-DNA的T1世代可对转基因以3∶1比率分离。这些含有一个或两个拷贝转基因的子代耐受咪唑啉酮除草剂。纯合T2植物表现出类似表型。
实施例9e
工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物
将5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。用于转化的标准品种是商业栽培变种Westar(Agriculture Canada)，但是还可以使用其它品种。
将含有双元载体的根瘤农杆菌LBA4404用于卡诺拉油菜转化。已经描述用于植物转化的众多不同双元载体系统(例如An，G.in AgrobacteriumProtocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，GartlandKMA和MR Davey编辑.Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多系统基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)，其中载体pBIN19包含来自根瘤农杆菌Ti质粒的左边界和右边界在两侧分布的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两种基因组成-选择标志基因和调节特征基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(US 5,767,366和US 6,225,105)。类似地，还可以使用多种启动子调节特征基因以提供如上所述对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)提供特征基因的组成型表达。
将卡诺拉油菜种子在70％乙醇浸泡2分钟并且在含一滴Tween-20的30％Clorox浸泡10分钟，随后用无菌蒸馏水漂洗三次灭菌。将种子在含有1％蔗糖、0.7％植物琼脂不含激素的半浓缩MS培养基上23℃光照16小时体外发芽5天。将附着子叶的子叶柄外植体自体外幼苗中切下，并通过将子叶柄外植体切开的尾部浸入细菌混悬液以农杆菌接种。随后将此外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上在23℃16小时光照培养2天。与农杆菌共培养两天后，将子叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上7天并随后转移至含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上直至枝条再生。当枝条长度是5-10mm时，将枝条切下并转移至枝条延伸培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将大约2cm长的枝条转移至生根培养基(MS0)以便诱导根。
原代转基因植物(To)的样本通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过DNA印迹杂交证实，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至具有正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针并根据制造商建议使用。
实施例9f
工程化苜蓿植物
将苜蓿(Medicago sativa)的再生性克隆使用(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)的方法转化。苜蓿的再生和转化呈基因型依赖性，因此需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培变种Rangelander(Agriculture Canada)或其它任何商业性苜蓿品种，如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell TissueCulture 4：111-112)所述。备选地，已经将RA3品种(威斯康星大学)选择用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。
将叶柄外植体与根瘤农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol 119：839-847)或含有双元载体的LBA4404的过夜培养物共培育。已经描述了用于植物转化的众多不同双元载体系统(例如An，G.inAgrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多系统基于Bevan所描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，其中载体pBIN19包含在两侧分布来自根瘤农杆菌Ti质粒的左边界和右边界的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两种基因组成-选择标志基因和调节特征基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(US 5,767,366和US 6,225,105)。类似地，还可以使用多种启动子以调节提供基因转录的组成型、发育性、组织或环境性调节的特征基因。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号：M59930和X16673)提供特征基因的组成型表达。
将外植体在含有288mg/L Prolin、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培育3天。将外植体在半浓缩的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平铺在不具有乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节物、抗生素并含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基内。随后体细胞胚在半浓缩Murashige-Skoog培养基上发芽。将生根的幼苗移植至罐内并在温室生长。
To转基因植物通过结节插条繁殖并在Turface生长培养基中生根。使植物脱叶并生长至高大约10cm(脱叶大约2周后)。
等同物：
通过使用简单的常规方法，技术人员知道或可以鉴定本发明的具体实施方案的大量等同物。这些等同物将包括在如下权利要求书中。

Claims (14)

1.用于制备与参考生物比较具有更快生长和/或提高的产量的非人生物的方法，其包括与参考生物比较提高所述生物中或其一个或多个部分中SEQ ID NO：125、129或137的活性，其中SEQ ID NO：125、129或137多肽的活性通过提高所述生物中或其一个或多个部分中至少一种由这样的核酸分子编码的多肽的活性而提高，所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(aa)编码SEQ ID NO：125、129或137中所述的提高生长或产量的多肽的核酸分子或编码多肽的至少成熟形式的核酸分子；
(bb)包含根据SEQ ID NO：124、128或136的编码序列的至少成熟多核苷酸的核酸分子；
(cc)其序列因遗传密码简并性可衍生自根据(aa)或(bb)的核酸分子所编码的多肽序列的核酸分子；
或包含其互补序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中生物是微生物或优选地是植物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中SEQ ID NO：125、129或137多肽的活性通过将多核苷酸导入至生物、优选地至植物、或至其一个或多个部分而提高，所述多核苷酸编码由选自如下的核酸分子所编码的SEQ IDNO：125、129或137多肽：
(a)编码SEQ ID NO：125、129或137多肽的核酸分子；
(b)包含根据SEQ ID NO：124、128或136的编码序列的至少成熟多核苷酸的核酸分子；
(c)其序列因遗传密码简并性而衍生自根据(a)或(b)的核酸分子所编码的多肽序列的核酸分子；
或包含其互补序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中编码内源性SEQ IDNO：125、129或137多肽或活性的多核苷酸功能性地连接至引起SEQ IDNO：125、129或137多肽提高的表达的调节序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中产量或生物质得到提高。
6.载体，其包含如权利要求1(aa)至(cc)所述的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的载体，其中将多核苷酸功能性地连接至允许在原核或真核宿主中表达的调节序列。
8.宿主细胞，其已经用如权利要求7所述的载体或稳定地或瞬时地转化或转染。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其是细菌细胞，优选地是单细胞微生物。
10.用于制备转基因植物、植物细胞、植物组织、有用动物的细胞、有用动物或转基因微生物的方法，该方法包括将如权利要求7所述的载体导入其基因组。
11.转基因微生物，其具有SEQ ID NO：125、129或137蛋白质或活性提高的量。
12.SEQ ID NO：125、129或137多肽或如权利要求1(aa)至(cc)所述的多核苷酸的用途，用于与起始生物比较提高非人生物的产量和/或提高生长。
13.如权利要求1(aa)至(cc)所述的核酸分子的用途，用于鉴定赋予提高的生长和/或产量的核酸分子。
14.如权利要求1(aa)至(cc)所述的核酸分子在作图和育种方法中的用途，用于鉴定具有提高的生长和/或产量的植物品种。
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