KR20150041788A - 식물에서의 트랜스진 발현을 위한 옥수수 비번역 영역의 용도 - Google Patents

식물에서의 트랜스진 발현을 위한 옥수수 비번역 영역의 용도 Download PDF

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Abstract

트랜스제닉 식물 및 식물 조직에서의 재조합 핵산 서열의 발현을 강화하기 위한 방법, 벡터 및 유전자 구축물이 제공된다. 본 발명에 따르면, 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 비번역 영역으로부터 핵산 서열이 수득 및/또는 유래되고, 벡터의 선택된 코딩 영역의 각각의 부분에 플랭킹되도록 조작된다. 이러한 벡터 구축물이 통상적인 절차 또는 유전자 표적화 절차를 통해 식물 및/또는 식물 조직 내로 도입되어, 선택된 코딩 영역의 발현 강화를 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 코딩 영역은 트랜스제닉 식물 및/또는 식물 조직에 일정 수준의 살충 활성을 부여하는 것으로 공지된 하나 이상의 단백질을 발현하는 키메라 유전자 또는 유전자 단편이다.
[대표도]
도 1a, 도 1b, 도 1c

Description

식물에서의 트랜스진 발현을 위한 옥수수 비번역 영역의 용도 {USE OF A MAIZE UNTRANSLATED REGION FOR TRANSGENE EXPRESSION IN PLANTS}
본 발명은 일반적으로 유전 공학 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 식물에서의 트랜스진 발현에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술 및 유전 공학은 원하는 DNA 서열을 식물 세포 내로 도입하여 관심 단백질의 발현을 허용하는 것을 일상적으로 가능하게 하였다. 그러나, 상업적으로 생육성인 형질전환 사건에 대해, 중요한 작물들에서 원하는 수준의 안정적이고 예측가능한 발현을 수득하는 것은 여전히 난제이다.
작물에서 원하는 수준으로 이종 유전자를 발현시키는 한 방법은 식물에서의 발현을 지배하는 조절 메카니즘의 조작을 수반한다. 조절은 전사 조절 또는 전사-후 조절일 수 있고, 예를 들어, DNA의 전사를 강화하거나, 제한하거나, 방지하는 메카니즘, 뿐만 아니라 mRNA가 생산된 후 이의 수명을 제한하거나 증가시키는 메카니즘을 포함할 수 있다. 이러한 조절 프로세스에서 수반되는 DNA 서열은 유전자의 단백질 생성물을 코딩하는 구조 DNA 서열에 대해 상류에, 하류에, 또는 심지어 이의 내부에 위치할 수 있다.
트랜스제닉 식물에서의 전사를 조절하기 위해, 다양한 유형의 프로모터들을 사용할 수 있다. 프로모터는 이러한 프로모터가 원래 유래된 유전자의 발현 패턴과 유사한 방식으로 트랜스제닉 식물에서 외래 유전자의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 2가지 카테고리로 분류된다: "구성적" 프로모터는 대부분의 조직에서 대부분의 시간에 발현되는 반면, "조절형" 프로모터는 전형적으로 특정 조직 유형에서만 발현되거나 (조직 특이적 프로모터), 또는 발생 동안의 특정 시간에 발현된다 (일시적 프로모터). 구성적 프로모터로부터의 발현은 전형적으로 발생 전반에 걸쳐 다소 정상 상태 수준이다. 하우스키핑 기능이 있는 단백질을 코딩하는 유전자들이 종종 구성적 프로모터에 의해 구동된다. 옥수수에서의 구성적으로 발현되는 유전자의 예는 액틴 및 유비퀴틴 (Ubi)을 포함한다.
"인핸서" 서열을 프로모터의 상류 (5')에 배치함으로써 트랜스제닉 식물에서 전사에서의 추가적인 개선이 수득될 수 있다. 인핸서 요소는 시스-작용성이고, 인핸서의 상류 위치 및 배향과 비교적 독립적인 방식으로 인접한 유전자의 이의 프로모터로부터의 전사 수준을 증가시킨다. 이러한 서열들이 바이러스, 박테리아 및 식물 유전자를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되었다. 잘 특성화된 인핸서 서열의 한 예는 미국 특허 번호 5,837,849, 5,710,267 및 5,573,932에 기술된 바와 같은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 옥토핀 신타제 (ocs) 인핸서이다. 이러한 짧은 (40 bp) 서열은 쌍자엽 식물 및 옥수수가 포함되는 단자엽 식물 둘 다에서 유전자 발현을 유의한 수준만큼 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 인핸서의 직렬 반복물은 옥수수에서 GUS 유전자의 발현을 8배 증가시키는 것으로 나타났다. 어떻게 이러한 인핸서 서열이 기능하는지는 여전히 불명확하다. 아마도, 인핸서가 활성화제 단백질에 결합하고, 이에 의해 RNA 폴리머라제 II가 TATA 박스에 결합하는 것을 용이하게 할 것이다. WO95/14098에는 ocs 인핸서 및 mas (만노핀 신타제) 인핸서의 다양한 다중 조합을 테스트하는 것이 기술되어 있고, 이는 트랜스제닉 담배 캘러스(callus)에서의 GUS 유전자의 유전자 발현의 수백 배 증가를 초래하였다.
그러나, 하나 이상의 인핸서와 함께 또는 인핸서 없이 특정 프로모터를 사용하는 것은 식물에서의 원하는 수준의 유전자 발현을 반드시 보장하지는 않는다. 원하는 전사 수준에 더하여, 부적절한 스플라이싱, 폴리아데닐화 및 핵 수송과 같은 기타 요인들이 mRNA 및 관심 단백질 둘 다의 축적에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 전사-후 조절 메카니즘을 통해 RNA 안정성 및 번역 효율을 증가시키는 방법이 관련 기술분야에서 요구된다.
전사-후 조절과 관련하여, 진핵생물 mRNA의 특정 5' 및 3' 비번역 영역 (UTR)이 번역 효율 및 RNA 안정성 각각에서 주요 역할을 한다는 것이 실연되었다. 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 및 알팔파 모자이크 바이러스 (AMV) 코트 단백질 mRNA의 5' 및 3' UTR은 담배 식물에서의 유전자 발현을 강화하는 것으로 공지되어 있다. 옥수수 알콜 데히드로게나제-1 (adh1) 유전자의 5' 및 3' UTR은 저산소성 원형질체에서의 효율적인 번역에서 수반되는 것으로 공지되어 있다.
다양한 5' UTR 리더 서열을 사용한 실험에서 5' UTR의 다양한 구조적 특색이 번역 효율 수준과 상호관련될 수 있다는 것이 실연되었다. 특정 5' UTR은 개시 부위에서 AUG 코돈을 스캐닝할 때 40S 리보솜 서브유닛과 상호작용할 수 있는 AUG 코돈을 함유하고, 따라서 번역 속도를 감소시키는 것으로 확인되었다. (문헌 [Kozak, Mol. Cell. Biol. 7:3438 (1987)]; [Kozak, J. Cell Biol. 108, 209 (1989)]). 게다가, mRNA 상의 AUG 개시 부위에 플랭킹된 5' UTR 뉴클레오티드 서열이 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다. 플랭킹된 5' UTR의 정황이 유리하지 않으면, 40S 리보솜 서브유닛의 일부가 번역 시작 부위를 인식하지 못할 수 있어, 폴리펩티드 합성 속도가 느려질 것이다. (문헌 [Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)]; [Pain, Eur. J. Biochem. 236, 747-771 (1996)]). 5' UTR의 이차 구조 (예를 들어, 헤어핀 형성)가 스캐닝 프로세스 동안 40S 리보솜 서브유닛의 이동을 방해할 수도 있고, 따라서 번역 효율에 음성적으로 영향을 미친다. (문헌 [Sonenberg et al., Nature 334:320 (1988)]; [Kozak, Cell 44:283-292, (1986)]). 5' UTR 서열의 상대 GC 함량이 잠재적인 이차 구조의 안정성의 지표물인 것으로 나타났고, 이때 더 높은 GC 수준은 불안정성을 가리킨다. (문헌 [Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)]). 더 긴 5' UTR은 더 높은 개수의 억제성 이차 구조를 나타낼 수 있다. 따라서, 임의의 소정의 5' UTR의 번역 효율은 이의 특정 구조에 고도로 의존적이고, 리더 서열의 최적화는 번역 개시 효율 개선의 직접적인 결과로서 유전자 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 식물 바이러스 또는 열 충격 유전자로부터의 리더 서열의 부가에 의해 유전자 발현의 유의한 증가가 야기되었다. (문헌 [Raju et al., Plant Science 94: 139-149 (1993)]).
5' UTR 서열에 더하여, mRNA의 3' UTR (트레일러) 서열이 유전자 발현에서 또한 수반된다. 3' UTR (폴리아데닐화 요소 또는 아데닐화 제어 요소로 또한 공지됨)은 핵 수송, 폴리아데닐닐화 상태, 세포하 표적화, 및 RNase로부터의 mRNA의 번역 및 분해 속도를 제어하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 3' UTR은 스템-루프 구조로 폴딩될 수 있는 하나 이상의 역전 반복물을 함유할 수 있고, 이는 엑소리보뉴클레아제에 대한 배리어로서 작용할 뿐만 아니라, RNA 안정성을 촉진하는 것으로 공지된 단백질 (예를 들어, RNA 결합 단백질)과 상호작용한다. (문헌 [Barkan et al., A Look Beyond Transcription: Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md., pp. 162-213 (1998)]). 그러나, 3' UTR 내에서 발견되는 특정 요소는 RNA 탈안정화 요소일 수 있다. 식물에서 발생하는 한 이러한 예는 DST 요소이고, 이는 소형 옥신 업 RNA (SAUR)에서 발견될 수 있다. (문헌 [Gil et al., EMBO J. 15, 1678-1686 (1996)]). 일부 3' UTR의 추가적인 탈안정화 특색은 AUUUA 5량체의 존재이다. (문헌 [Ohme-Takagi et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA 90 11811-11815 (1993)]).
3' UTR은 여러 옥수수 유전자의 유전자 발현에서 유의한 역할을 하는 것으로 실연되었다. 구체적으로, 염기쌍 200개의 3' 서열이 엽육 세포에서의 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제 유전자의 옥수수 소형 m3 서브유닛 (rbc/m3)의 광 유도의 억제를 담당하는 것으로 나타났다. (문헌 [Viret et al., Proc Natl Acad Sci USA. 91 (18):8577-81 (1994)]). 식물, 특히 옥수수에서, 이러한 서열은 그리 잘 보존되지 않는다. 식물의 유전 공학에서 빈번하게 사용되는 한 3' UTR은 노팔린 신타제 유전자 (3' nos)로부터 유래된다 (문헌 [Wyatt et al., Plant Mol Biol 22(5):731-49 (1993)]).
특정 식물 바이러스, 예컨대 알팔파 모자이크 바이러스 (AMV) 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에서, 그의 고도로 구조화된 3' UTR이 복제에 필수적이고, 여러 고-친화력 코트 단백질 결합 부위를 함유하는 스템-루프 구조의 선형 어레이, 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제가 인식하는 tRNA-유사 부위로 폴딩될 수 있다. (문헌 [Olsthoorn et al., EMBO J 1; 18(17):4856-64 (1999)]; [Zeyenko et al., 1994)]).
그러나, 모든 용도에 이용가능한 최적의 UTR 서열이 없기 때문에, 트랜스제닉 식물에서의 재조합 핵산의 발현을 제어하는 것에서 사용하기 위한 추가적인 5' 및 3' UTR을 확인하는 것이 여전히 요구된다.
트랜스제닉 식물 및 식물 조직에서의 재조합 핵산 서열의 발현을 강화하기 위한 방법, 벡터 및 유전자 구축물이 제공된다. 본 발명에 따르면, 유비퀴틴 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 비번역 영역으로부터 핵산 서열이 수득 및/또는 유래되고, 벡터의 선택된 코딩 영역의 각각의 부분에 플랭킹되도록 조작된다. 이러한 벡터 구축물이 통상적인 절차 또는 유전자 표적화 절차를 통해 식물 및/또는 식물 조직 내로 도입되어, 선택된 코딩 영역의 발현 강화를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 코딩 영역은 트랜스제닉 식물 및/또는 식물 조직에 일정 수준의 살충 활성을 부여하는 것으로 공지된 하나 이상의 단백질을 발현하는 키메라 유전자 또는 유전자 단편이다.
한 측면에서, 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 관심 구조 유전자를 포함하는 핵산 구축물이 제공된다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 관심 구조 유전자는 식물에서 비-천연 표현형을 부여한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 관심 구조 유전자는 식물에서 곤충 내성 또는 제초제 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 프로모터는 바이러스 프로모터를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 식물 프로모터를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 바이러스 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 식물 프로모터를 포함한다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일성을 갖는다. 추가적인 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능하다.
한 실시양태에서, 핵산 구축물은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환을 위한 이원 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 트랜스제닉 식물 내로 안정하게 형질전환된다. 추가적인 실시양태에서, 식물은 단자엽 식물이다. 또 다른 추가적인 실시양태에서, 식물은 쌍자엽 식물이다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 단자엽 식물이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 쌍자엽 식물이 아니다. 한 실시양태에서, 핵산 구축물은 선택가능한 마커를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 선택가능한 마커는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제는 AAD-1 또는 AAD-12이다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 핵산 구축물을 포함하는 벡터가 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 핵산 구축물로 형질전환된 식물 또는 식물 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 식물 또는 식물 세포는 적어도 하나의 관심 유전자와 스태킹된 추가의 관심 구조 유전자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것을 포함하는, 펩티드 또는 단백질을 재조합적으로 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 유전자 발현을 증가시키는 방법이 제공된다.
제공된 방법의 한 실시양태에서, 이종 프로모터는 바이러스 프로모터를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 식물 프로모터를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 바이러스 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 프로모터는 식물 프로모터를 포함한다. 제공된 방법의 한 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 동일성을 갖는다. 추가적인 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 제어 서열은 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능하다.
또 다른 측면에서, 식물에서의 트랜스진의 발현을 위한, 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제어 서열의 용도가 제공된다. 또 다른 측면에서, 식물에서의 트랜스진의 발현을 위한, 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능한 하나 이상의 제어 서열의 용도가 제공된다.
도 1a는 본 발명의 예시적인 제어 서열인 제아 마이스(Zea mays) Ubi1 3' UTR (서열 1)을 나타낸다. 도 1b는 또 다른 본 발명의 예시적인 제어 서열인 ZMEXP9396.1 (서열 2)를 나타낸다. 도 1c는 또 다른 본 발명의 예시적인 제어 서열인 ZMEXP9707.1 (서열 3)을 나타낸다.
도 2a는 pDAB112330 및 pDAB112323의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다. 도 2b는 pDAB112332의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 3은 St PinII 3' UTR (pDAB112332) 및 제아 마이스 Ubi1 3' UTR (pDAB112330)을 포함하는 여러 핵산 구축물, 뿐만 아니라 음성 대조군으로부터의 예시적인 발현 결과를 나타낸다.
도 4는 pDAB112357 (ZMEXP9396.1) 및 pDAB112354 (ZMEXP9707.1)의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 5는 pDAB112357 (ZMEXP9396.1), pDAB112354 (ZMEXP9707.1), 및 pDAB112332 (St PinII 3' UTR)을 포함하는 여러 핵산 구축물로부터의 예시적인 발현 결과를 나타내고, 이때 3개의 구축물 모두가 유사한 양호한 발현 수준을 제공한다. Cry34 발현 수준이 ng/ml 단위로 제시된다.
도 6은 pDAB108744 및 pDAB108746의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다. 도 7은 pDAB112396 및 pDAB112397의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 8은 pDAB108744 및 pDAB108746 구축물로의 Zm Ubi1 3' UTR에 관련된 대표적인 T1 발현 데이터 (V4 잎)를 나타낸다. 도 9는 pDAB108744 및 pDAB108746 구축물로의 Zm Ubi1 3' UTR에 관련된 대표적인 T1 발현 데이터 (V12 잎)를 나타낸다.
도 10은 pDAB112396 및 pDAB112397 구축물로의 Ubi1 이외의 옥수수 3' UTR에 관련된 대표적인 T0 발현 데이터 (V4 잎)를 나타낸다.
제아 마이스 유비퀴틴 유전자로부터 단리 또는 유래된 5' 및/또는 3' UTR 영역을 사용하여 세포, 조직 또는 유기체를 유전적으로 변형시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 5' 및/또는 3' UTR 영역/제어 서열은, 관심 구조 핵산에 플랭킹되도록 조작되었을 때, 전사 종결, mRNA 안정성을 개선하고/하거나 트랜스제닉 식물에서의 관심 구조 유전자의 번역 효율을 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 경제적 또는 연구 가치가 있는 표현형을 발현하도록 식물의 유전 공학을 용이하게 할 것이다.
제아 마이스 유비퀴틴 유전자로부터 단리 또는 유래된 5' 및 3' UTR 영역/제어 서열 중 하나 또는 둘 다가 식물, 식물 세포 또는 식물 조직에서 재조합적으로 발현되는 단백질을 코딩하는 관심 구조 유전자에 플랭킹되도록 유전적으로 조작된다. 기술된 옥수수 Ubi1 3' UTR은 단일 또는 다중 유전자를 함유하는 트랜스진 구축물을 제조하는 것에서의 이의 용도에 대해 특히 흥미롭다.
트랜스제닉 생성물의 개발은 트랜스진의 안정적인 장기 발현을 요구한다. 프로모터 및 종결인자와 같은 조절 요소가 트랜스진이 올바르게 발현되기 위한 적합한 조합 및 구성에서 요구된다. 각각의 트랜스진은 전사를 위한 독점적인 프로모터를 요구한다. 또한, 3' 비번역 영역 (3' UTR) 또는 종결인자가 전사 종결 및 폴리아데닐화에 필요하다. 올바른 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화가 트랜스진의 안정적인 발현에 중요하다. 전사 종결은 다중유전자 스택이 다음 트랜스진으로의 전사 판독-진행을 피하는데 보다 중요해진다. 유사하게, 비-폴리아데닐화 이상 RNA (aRNA)는 aRNA를 이중 가닥 RNA (dsRNA)로 전환시켜 소형 RNA 생산 및 트랜스진 침묵에 이르는 식물 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 대한 기질이다. 따라서, 강한 전사 종결인자가 단일 유전자 및 다중 유전자 스택 둘 다에 대해 매우 유용하다. 옥수수 Ubi1 (유비퀴틴1) 3' UTR 및 트랜스진 구축물을 제조하기 위한 이의 용도가 제공된다.
식물 프로모터 및 3' UTR은 기능성 트랜스진 발현 또는 식물 전사 단위를 만드는데 필요한 2가지 기본적인 발현 요소이다. 프로모터는 전사를 구동시키는데 요구되는 한편, 3' UTR은 전사 종결 및 전사물의 폴리아데닐화에 필요하다. mRNA 3' UTR은 RNA 전사물 종결 및 폴리아데닐화를 위해 유전자 발현에서 요구된다. 3' UTR은 mRNA 프로세싱, 국소화, 안정성 및 번역에서 또한 주된 역할을 한다.
식물에서의 트랜스진 발현을 위한 제어 서열로서의 옥수수 Ubi1 5' 및 3' UTR의 확인 및 특성화가 제공된다. 본원에서 제공되는 Ubi1 3' UTR은 벡터 구축을 위해 다른 식물 또는 바이러스 프로모터와 함께 사용될 수 있고, 옥수수 Ubi1 프로모터에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 어구 "벡터"는 외래 DNA의 조각이 내부에 삽입되어 있을 수 있는 DNA 조각을 지칭하고, 이는 전형적으로는 이중 가닥이다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 기원일 수 있고, 이는 전형적으로 선택가능한 또는 스크리닝성 마커 또는 트랜스진을 코딩한다. 벡터는 외래 또는 이종 DNA를 적절한 숙주 세포 내로 운송하는데 사용된다. 숙주 세포 내에 있으면, 벡터는 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 또는 동반적으로 복제될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 염색체 내로의 외래 또는 이종 DNA의 삽입을 표적화할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "트랜스진 벡터"는 삽입된 DNA 절편인, 숙주 세포 내에서 mRNA로 전사되거나 또는 RNA로서 복제되는 "트랜스진"을 함유하는 벡터를 지칭한다. 어구 "트랜스진"은 RNA로 전환되는 삽입된 DNA의 부분뿐만 아니라, 이러한 RNA의 전사 또는 복제에 필요한 벡터의 부분을 또한 지칭한다. 트랜스진은 전형적으로 관심 유전자를 포함하지만, 단백질을 생산할 수 있는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 반드시 포함할 필요는 없다.
본원에 사용된 어구 "형질전환된" 또는 "형질전환"은 세포 내로의 DNA의 도입을 지칭한다. 어구 "형질전환체" 또는 "트랜스제닉"은 형질전환되었거나 형질전환 절차가 진행된 식물 세포, 식물 등을 지칭한다. 일반적으로, 도입된 DNA는 삽입된 DNA 조각을 함유하는 벡터의 형태이다.
본원에 사용된 어구 "선택가능한 마커" 또는 "선택가능한 마커 유전자"는, 예를 들어, 선택제로부터 식물 세포를 보호하거나 또는 선택제에 대한 내성/저항성을 제공하도록 식물 형질전환에서 임의적으로 사용되는 유전자를 지칭한다. 기능성 선택가능한 마커가 수여된 세포 또는 식물만이 선택제가 있는 조건 하에 분열 또는 성장할 수 있다. 선택제의 예는, 예를 들어, 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 젠타마이신 및 히그로마이신이 포함되는 항생제를 포함할 수 있다. 이러한 선택가능한 마커들은 카나마이신 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II)에 대한 유전자, 및 관련 항생제인 네오마이신, 파로모마이신, 젠타마이신, 및 G418에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 기타 선택가능한 마커 유전자는 Bar (BASTA® (글루포시네이트 암모늄), 또는 포스피노트리신 (PPT)에 대한 내성), 아세토락테이트 신타제 (ALS; 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논 (분지쇄 아미노산 합성의 제1 단계를 방지함)과 같은 억제제에 대한 내성), 글리포세이트, 2,4-D, 및 금속 내성 또는 감수성을 포함하는 제초제 내성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 어구 "마커-양성"은 선택가능한 마커 유전자를 포함하도록 형질전환된 식물을 지칭한다.
다양한 선택가능한 또는 검출가능한 마커가 선택된 발현 벡터 내로 혼입되어 형질전환된 식물 또는 형질전환체의 확인 및 선택을 허용할 수 있다. 예를 들어 DNA 서열결정 및 PCR (폴리머라제 연쇄 반응), 서던 블롯팅, RNA 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예를 들어, 포스피노트리신 내성을 매개하는 침전된 단백질 또는 리포터 유전자인 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등과 같은 기타 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법을 포함하여, 다수의 방법이 형질전환된 식물에서의 선택 마커의 발현을 확증하는데 이용가능하다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001]을 참조하고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다).
선택가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택에 이용된다. 선택가능한 마커 유전자는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 것, 뿐만 아니라 제초제 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 일반적으로 제초제 내성 유전자는 제초제에 대해 불감성인 변형된 표적 단백질을 코딩하거나 또는 제초제가 작용할 수 있기 전에 식물에서 제초제를 분해하거나 해독하는 효소를 코딩한다. 문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518]; [DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704]; [Fromm et al. (1990) 8:833-839]; [Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618]을 참조한다. 예를 들어, 글리포세이트 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 내성이 돌연변이체 표적 효소인 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 수득되었다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성은 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 니트릴라제, 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제 (각각의 제초제를 해독함)를 코딩하는 박테리아 유전자를 사용함으로써 수득되었다. 2,4-D 내성에 대한 효소/유전자가 기존에 US 2009/0093366 및 WO 2007/053482에서 개시되었고, 그의 내용은 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 포함하는 기타 제초제가 성장점 또는 분열 조직을 억제할 수 있다. 이러한 카테고리 내의 예시적인 유전자는, 예를 들어, 문헌 [Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)]; 및 [Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990)]에 각각 기술된 바와 같이, 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩한다.
글리포세이트 내성 유전자는 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발에 의함), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자를 각각 포함한다. 기타 포스포노 화합물에 대한 내성 유전자는 글루포시네이트 (스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함하는 스트렙토미세스(Streptomyces) 종으로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 예를 들어, 식물에게 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,940,835 (샤(Shah) 등) 및 미국 특허 번호 6,248,876 (배리(Barry) 등)을 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자를 ATCC 등록 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 이러한 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열이 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는, 미국 특허 번호 4,769,061 (코마이(Comai)), 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 (쿠마다(Kumada) 등), 및 미국 특허 번호 4,975,374 (굿맨(Goodman) 등)에 개시되어 있다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열이 유럽 출원 번호 0 242 246 (리만스(Leemans) 등)에서 제공된다. 또한, 문헌 [DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)]에는 PAT 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기술되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (세톡시딤 및 할록시폽 포함)에 대한 내성을 부여하는 유전자의 예는 문헌 [Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)]에 기술된 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자이다. 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 GAT 유전자가 WO 2005012515 (캐슬(Castle) 등)에 기술되어 있다. 2,4-D, fop 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자가 WO 2005107437 및 미국 특허 출원 일련 번호 11/587,893에 기술되어 있다.
트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)를 포함하여 기타 제초제가 광합성을 억제할 수 있다. 문헌 [Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)]에는 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드에 의한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환이 기술되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열이 미국 특허 번호 4,810,648 (스토커(Stalker))에 개시되어 있고, 이러한 유전자들을 함유하는 DNA 분자들이 ATCC 등록 번호 53435, 67441, 및 67442 하에 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현이 문헌 [Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에 기술되어 있다.
본 발명의 목적을 위해, 선택가능한 마커 유전자는 하기를 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (문헌 [Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25]); 시아나미드 히드라타제 (문헌 [Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264]); 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 (문헌 [Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718]); 트립토판 데카르복실라제 (문헌 [Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912]); 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감작화 아스파르테이트 키나제 (문헌 [Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718]); bar 유전자 (문헌 [Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100:1503-1507] 및 [Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36:1367]); 트립토판 데카르복실라제 (문헌 [Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912]); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO) (문헌 [Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327]); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG) (문헌 [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074]); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (문헌 [Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552]); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513]); 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제 (문헌 [Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330]); 아세토히드록시산 신타제 (앤더슨(Anderson) 등, 미국 특허 번호 4,761,373; 문헌 [Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266]); 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제 (aroA) (문헌 [Comai et al. (1985) Nature 317:741]); 할로아릴니트릴라제 (스토커(Stalker) 등, PCT 출원 공보 WO87/04181); 아세틸-조효소 A 카르복실라제 (문헌 [Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220]); 디히드로프테로에이트 신타제 (sul I) (문헌 [Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127]); 및 32 kD 광시스템 II 폴리펩티드 (psbA) (문헌 [Hirschberg et al. (1983) Science, 222:1346]).
클로람페니콜 (문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992]); 메토트렉세이트 (문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213]; [Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)]); 히그로마이신 (문헌 [Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108]; [Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227] 및 [Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820]); 스트렙토마이신 (문헌 [Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91]); 스펙티노마이신 (문헌 [Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5:131-137]); 블레오마이신 (문헌 [Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176]); 술폰아미드 (문헌 [Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136]); 브로목시닐 (문헌 [Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423]); 2,4-D (문헌 [Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816]); 글리포세이트 (문헌 [Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481]); 및 포스피노트리신 (문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518])에 대한 내성을 코딩하는 유전자들이 또한 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, 명세서에서 열거된 모든 참고문헌은 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
선택가능한 마커 및 리포터 유전자의 상기 목록은 한정적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 리포터 또는 선택가능한 마커 유전자가 본 발명에 포함된다. 필요하다면, 이러한 유전자들은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 서열이 결정될 수 있다.
식물에서의 최적의 발현을 위해 리포터 및 선택가능한 마커 유전자가 합성된다. 즉, 유전자의 코딩 서열이 식물에서의 발현을 강화하도록 변형되었다. 식물에서 더 높은 수준으로 발현되어 더 높은 형질전환 효율을 초래하도록 합성 마커 유전자가 디자인된다. 유전자의 합성 최적화 방법이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 실제로, 여러 유전자가 식물에서의 유전자 생성물의 발현을 증가시키도록 최적화되었다.
마커 유전자 서열은 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 대안적으로 여러 식물 과에서의 최적 발현을 위해 변형될 수 있다. 특정한 관심 식물 종에서 최대량으로 발현되는 단백질 내의 빈도가 가장 높은 코돈으로부터 식물이 선호하는 코돈이 결정될 수 있다. 예를 들어, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; 문헌 [Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328]; 및 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498]; 미국 특허 번호 5,380,831; 및 미국 특허 번호 5,436,391 (본원에 참고로 포함됨)을 참조한다. 이러한 방식으로, 임의의 식물에서의 발현을 위해 뉴클레오티드 서열이 최적화될 수 있다. 유전자 서열의 모든 부분 또는 임의의 부분이 최적화되거나 또는 합성일 수 있는 것으로 인지된다. 즉, 완전히 최적화된 또는 부분적으로 최적화된 서열이 또한 사용될 수 있다.
또한, 아그로박테리움-매개 형질전환 시스템을 이용하는 여러 형질전환 전략이 개발되었다. 예를 들어, 이원 벡터 전략은 T-DNA가 나머지 Ti 플라스미드와 상이한 플라스미드 내에 있는 2-플라스미드 시스템을 기초로 한다. 공동-통합 전략에서, 소량의 T-DNA가 외래 유전자와 동일한 벡터 내에 놓이고, 이어서 이러한 벡터가 Ti 플라스미드와 재조합된다.
본원에 사용된 어구 "외식편"은 대상의 하나 이상의 조직 또는 장기로부터의 살아 있는 조직 또는 장기의 제거된 절편을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "식물"은 쌍자엽 식물 및 단자엽 식물을 포함한다. 쌍자엽 식물의 예는 담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 대두, 토마토, 파파야, 캐놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도나무, 비둘기 콩, 완두콩, 브라시카(Brassica), 병아리콩, 사탕무, 평지, 수박, 멜론, 고추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 스쿼시, 브로콜리, 양배추, 당근, 컬리플라워, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 상추를 포함한다. 단자엽 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장 및 라이밀을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "키메라 유전자 구축물"은 하나를 초과하는 생물로부터의 유전자 또는 이의 일부분을 포함하는 재조합 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "결실"은 각각 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 부재하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 지칭한다.
본 발명의 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)은 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)이 관심 구조 핵산 서열의 mRNA 안정성, 전사 생성물의 번역 효율에 영향을 미치도록 이러한 요소들이 서로 관련되어 놓인다면 관심 구조 핵산 서열에 "기능적으로 연결"될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "이종 유전자"는 이의 정확한 아미노산 서열이 일반적으로는 숙주 세포에서 발견되지 않지만 표준 유전자 전달 기술에 의해 도입된, 단백질, 폴리펩티드, RNA, 또는 이들 중 임의의 것의 일부분을 코딩하는 유전자를 지칭한다
본원에 사용된 어구 "동일성" 및 "유사성"은 서열들을 비교함으로써 결정되는 바와 같은 2개의 폴리펩티드 서열 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계를 지칭한다. 관련 기술분야에서, 동일성은 이러한 서열들의 2개의 줄 간의 매치에 의해 결정되는 바와 같은 2개의 폴리펩티드 서열 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 또한 의미한다. 동일성 및 유사성 둘 다 쉽게 계산할 수 있다 (문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press. New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987)]; 및 [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)]). 2개의 서열 간의 동일성 또는 유사성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 문헌 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48 : 1073 (1988)]에 개시된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 동일성을 결정하기 위한 공지된 방법은 2개의 테스트 서열 간의 최대 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 컴퓨터 프로그램에서 집대성된다. 2개의 서열 간의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 전형적인 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)]), BLASTP, BLASTN, FASTA 및 TFASTA (문헌 [Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)])를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "삽입" 또는 "부가"는 천연 발생 분자와 비교하여 각각 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 부가를 초래하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "변형된 발현"은 1) 천연 버전의 식물, 또는 2) 관심 구조 유전자를 보유하지만, 5' 및 3' Ubi1 UTR(들) 중 하나 또는 둘 다를 이의 플랭킹 영역(들)으로서 포함하지 않는 트랜스제닉 식물과 비교하여 관심 구조 유전자의 mRNA 수준, 단백질 수준 또는 효소 특이적 활성이 변경된, 본 발명의 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들) 중 하나 또는 둘 다가 관심 이종 구조 유전자의 각각의 영역에 플랭킹되도록 유전자 조작된 트랜스제닉 식물에서의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "비-천연 표현형"은 식물에서의 재조합 DNA의 발현 시에 발생하거나 이러한 발현에 영향을 받는 형질을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "재조합 핵산"은 임의의 공급원으로부터 유래 또는 단리되었고, 이어서 화학적으로 변경될 수 있으며, 추후에 트랜스제닉 식물 내로 도입될 수 있는 핵산을 지칭한다. 공급원으로부터 "유래"된 재조합 핵산의 예는 소정의 생물 내에서 유용한 단편으로서 확인된 후 본질적으로 순수한 형태로 화학적으로 합성된 DNA 또는 RNA 서열일 것이다. 공급원으로부터 "단리"된 이러한 DNA의 예는 유전 공학의 방법에 의해 본 발명에서 사용하기 위해 추가로 조작, 예를 들어 증폭될 수 있도록 화학적 수단에 의해, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제의 사용에 의해 상기 공급원으로부터 절단 또는 제거된 유용한 DNA 서열일 것이다.
본원에 사용된 어구 "관심 구조 핵산 서열"은 단백질을 코딩하는 DNA, RNA 또는 합성 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 용어 "관심 구조 핵산"은 본원에서 용어 "관심 구조 유전자"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "트랜스제닉 식물"은 이의 핵 게놈 또는 소기관 게놈 내로 삽입된 외래 뉴클레오티드 서열을 함유하는 식물을 지칭한다.
본 발명의 교시 내용에 따라 대상 5' 및/또는 3' UTR 서열(들)을 변형시키기 위해, 예시적인 기술은 폴리뉴클레오티드-매개, 부위-지정 돌연변이유발을 위한 것들, 뿐만 아니라 기존의 핵산 분자를 변형 및/또는 연결시키기 위한 제한 효소, PCR 증폭 및 리가제의 사용을 위한 공지된 기술을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Zoller et al., DNA, 3:479-488 (1984)]; [Higuchi et al., Nucl. Acids Res., 16:7351-7367 (1988)]; [Ho et al., Gene, 77:51-59 (1989)]; [Horton et al., Gene, 77:61 (1989)]; [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)]; 및 발명의 영문 명칭이 "Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors"인 메츠(Metz) 등의 미국 특허 번호 6,271,360 (2001년 8월 7일 허여) 참조). 본 발명의 바람직한 실시양태에서, mRNA 분해에 대한 추가적인 보호를 제공하도록 하나 이상의 스템-루프 구조가 부가된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 추가적인 스템-루프 구조는 PCR 증폭을 통해 유래된다. 본 발명의 추가적인 실시양태에서, 예를 들어, 통상의 기술자에게 공지된 부위-특이적 제한 효소의 사용에 의해, 하나 이상의 기존의 스템-루프 구조가 결실된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)은 하나 이상의 관심 구조 유전자의 적합한 영역에 플랭킹되는 것과 관련하여 서로 함께 사용된다. 그러나, 본 발명은 이렇게 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 5' 또는 3' Ubi1 UTR(들) 중 하나 또는 둘 다가, 예를 들어, 관심 구조 유전자(들)에 대해 천연인 UTR, 관심 구조 유전자(들) 및 Ubi1 유전자에 대해 이종성인 UTR과 함께, 또는 이러한 천연 또는 이종 UTR에 더하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)은, 예를 들어 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분을 혼성화 프로브로서 사용하여, 관련 기술분야에 공지된 핵산 혼성화 기술에 의해 단리될 수 있다. 이러한 프로브는 전체 Ubi1 유전자 또는 이의 일부분 (본원에 개시된 5' 및 3' UTR 포함)으로 이루어질 수 있다. 대상 Ubi1 5' 및/또는 3' UTR(들)은 또한 합성일 수 있고, 상기 기술된 서열 및 관련 기술분야에 공지된 핵산 합성 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
관심 구조 핵산 서열은 공지된 클로닝 기술에 의해 Ubi1 유전자로부터 단리 또는 유래된 5' 및/또는 3' UTR 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 관심 구조 핵산 서열은 수용자 식물, 식물 세포(들), 또는 식물 조직에 천연적으로 존재하는 유전자에 대해 이종성 또는 동종성일 수 있다. 어느 경우든, 본 발명의 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)은 관심 핵산 서열의 번역 효율을 조절하여, 전사된 mRNA의 반감기를 증가시키고/시키거나, 관심 구조 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질을 본 발명의 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)을 사용하지 않고 발현되는 것보다 식물 조직에서 더 풍부하게 발현시키는데 유용하다. 관심 구조 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질이 식물의 특정한 바람직한 조직, 예컨대 뿌리, 잎 또는 줄기에서만 발현되고 종자에서는 발현되지 않도록 조작된 유전자 구축물에서 본 발명이 사용되는 것이 본원에서 추가로 구체적으로 구상된다.
본 발명은 단자엽 및 쌍자엽 식물 둘 다에서의 관심 구조 유전자의 발현에 일반적으로 적용가능하다. 따라서 본 발명은 옥수수, 벼, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 얌, 양파, 바나나, 코코넛 및 대추야자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단자엽 식물 과의 임의의 구성원에 적절하다. 본 발명의 바람직한 용도는 트랜스제닉 옥수수 식물의 생산에서의 용도이다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 쌍자엽 종은 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 사탕무, 감자, 상추, 멜론, 대두 및 캐놀라 (평지)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 구축물에서 사용되는 관심 구조 핵산 서열은 생성된 트랜스제닉 식물의 이로운 특색을 제공하거나 또는 이를 강화하는 임의의 핵산 서열일 수 있다. 특히 유용한 핵산 서열은 증가된 영양가, 더 높은 수율, 제초제, 곤충 또는 질병에 대한 저항성 등을 촉진하기 위해 단백질 또는 안티센스 RNA 전사물을 코딩하는 것들이다. 보다 바람직하게는, 핵산 서열은 유전자를 물리적, 화학적 또는 효소적 분해에 대해 보다 감수성이게 하는 것으로 공지된 비교적 큰 크기 (4-5 kb 이상의 길이)로 인해 본질적으로 불안정한 유용한 유전자일 것이다. 크기로 인해 본질적으로 불안정한 유전자는 크세노랍두스(Xenorhabdus) (미국 특허 번호 6,048,838 참조) 및 포토랍두스(Photorabdus) (예를 들어, 독소 A)로부터의 살충 유전자를 포함한다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 특정 작물 품종에서 서로에 대해 "스태킹"된 하나 이상의 관심 구조 핵산에 하나 이상의 본 발명의 Ubi1 UTR/제어 서열이 플랭킹된다. 어구 "스태킹된" 또는 "스태킹"은 다중 관심 구조 유전자 (바람직하게는 각각의 관심 구조 유전자가 상업적으로 바람직한 형질을 부여함)가 단일 작물 품종 (근교배 또는 잡종) 내로 트랜스제닉하게 도입되었음을 본원에서 의미한다. 예를 들어, 유전자들이 스태킹된 옥수수 잡종은 곤충 내성에 대한 유전자 (예를 들어, Cry1F B.t. 유전자), 뿐만 아니라 제초제 내성 유전자 (예를 들어, 글리포세이트 내성 유전자)를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 Ubi1 UTR(들)/제어 서열(들) 중 하나 이상이 포토랍두스로부터의 독소 A 유전자에 기능적으로 연결되고, 그 후 이는 단일 작물 품종에서 하나 이상의 살충제 및/또는 제초제 내성 유전자와 스태킹된다. 일부 실시양태에서, 살충제 유전자(들)은 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 또는 크세노랍두스 종으로부터 유래될 것이고, 제초제 유전자(들)는 글루포시네이트, 글리포세이트, 이미다졸리논, 또는 2.4-D 또는 술포닐 우레아 내성 유전자 중 하나 이상일 것이다. 물론, "스태킹"된 살충제 또는 제초제 유전자 중 임의의 것이 본 발명의 Ubi1 UTR에 기능적으로 연결될 수 있다.
관심 구조 핵산 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 박테리아 게놈 또는 에피솜, 진핵생물 게놈, 미토콘드리아 또는 색소체 DNA, cDNA, 바이러스 핵산, 또는 화학적으로 합성된 핵산으로부터 유래될 수 있다. 관심 구조 핵산 서열이 발현 생성물의 생물학적 활성 또는 화학 구조, 발현 속도, 또는 발현 제어 방식에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 변형을 어느 한쪽 코딩 영역 내에 함유할 수 있는 것으로 구상된다. 이러한 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 삽입, 결실, 재배열 및 치환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 관심 구조 핵산 서열은 중단되지 않은 코딩 서열을 구성할 수 있거나, 또는 적합한 식물-기능성 스플라이스 연결부로 구획된 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 관심 구조 핵산 서열은 다수의 공급원으로부터 유래된 천연 발생 또는 합성 분절들의 복합물일 수 있다. 실험 조작이 코딩 서열들의 연결에서 기능성을 유지하는 한, 관심 구조 핵산 서열은 융합 단백질을 코딩할 수도 있다.
본 발명의 수행에서, 원하는 숙주 세포 내로의 후속 도입을 위한 관심 구조 유전자에 플랭킹된 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)을 함유하는 벡터를 수득하도록 클로닝 기술이 사용된다. 따라서, 관련 기술분야의 표준 클로닝 절차, 예컨대 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d ed., 1989)], 및 [Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.] (둘 다 이에 의해 참고로 포함됨)에 기술된 것들을 사용하여 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들), 관심 구조 핵산 서열, 및 임의의 원하는 프로모터, 인핸서, 선택가능한 마커 등이 단리되어 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
광범위한 클로닝 벡터가 입수가능하거나 또는 제조될 수 있고, 이때 클로닝 벡터는 원하는 식물 종에서 기능성인 유전자 구축물을 포함한다. 예시적인 벡터는, 예를 들어, pBR322, pUC 시리즈, pACYC184, 블루스크립트(Bluescript) 시리즈 (스트라타진(Stratagene)) 등을 포함한다. 따라서 이러한 벡터들은 시판되거나 또는 식물 세포의 형질 전환을 위해 쉽게 제조될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 소정의 숙주에서의 이종성 DNA 서열의 유지 및 발현 둘 다에 필요한 핵산 서열을 함유할 것이다. 임의의 특정 종에서의 발현을 최적화하기 위한 적합한 요소의 선택은 본 개시내용의 교시를 사용하는 통상의 기술자의 문제이다. 적절한 DNA 성분, 선택가능한 마커 유전자, 리포터 유전자, 인핸서, 인트론 등이 문헌 [K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)]에 기술되어 있다.
전형적으로, 관심 구조 유전자가 원하는 프로모터에 작동가능하게 연결되고 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)이 관심 구조 핵산 서열에 기능적으로 연결되도록, 관심 구조 핵산 서열 및 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들)이 적합한 제한 부위(들)에서 적합한 클로닝 벡터 내로 삽입된다. 본 발명의 유전자 구축물의 제조에서, 올바른 배향, 그리고 적합하다면 올바른 판독틀 내의 핵산 서열을 제공하도록 다양한 핵산 단편이 조작될 수 있다. 물론, 핵산 단편들을 연결하기 위해 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있거나, 또는 편리한 제한 부위, 과잉 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공하도록 기타 조작이 수반될 수 있다.
다수의 프로모터에 의해 본 발명에서 사용되는 구조 유전자의 발현이 구동될 수 있다. 관심 구조 유전자의 내인성 프로모터가 유전자의 전사 조절을 위해 본원에서 이용될 수 있지만, 일부 실시양태에서는, 프로모터가 외래 조절 서열이다. 식물 발현 벡터에 대해, 적절한 바이러스 프로모터는 카사바 베인(Cassava Vein) 모자이크 바이러스 프로모터 (문헌 [Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 31(6):1129-39 (1996)]); 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 (문헌 [Brisson et al., Nature 310:511 (1984)]; [Odell et al., Nature, 313:810 (1985)]); 강화 및 이중 강화 CaMV35S 프로모터 (문헌 [Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)]); 현삼 모자이크 바이러스 (FMV)의 전장 전사물 프로모터 (문헌 [Gowda et al., J. Cell Biochem., 13D: 301, 1989]) 및 TMV로부터의 코트 단백질 프로모터 (문헌 [Takamatsu et al., EMBO J. 6:307, 1987])를 포함한다. 기타 유용한 프로모터는 소형 서브유닛 리불로스 1,5-비포스페이트 카르복실라제 옥시게나제 (ssRUBISCO)로부터의 광-유도성 프로모터 (문헌 [Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671 (1984)]; [Broglie, et al., Science 224:838 (1984)]); 벼 액틴 프로모터 (문헌 [McElroy et al., Plant Cell. 2(2):163-71 (1990)]); 및 Adh1 프로모터 (문헌 [Dennis et al., Nucleic Acids Res. 12(9):3983-4000 (1984)]); 만노핀 신타제 프로모터 (문헌 [Velten et al., EMBO J., 3:2723, 1984)]); 노팔린 신타제 (NOS) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도 플라스미드 상에 보유됨), 또는 열 충격 프로모터, 예를 들어, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B (문헌 [Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559 (1986)]; [Severin et al., Plant Mol. Biol. 15:827, (1990)])를 포함한다.
클로닝 단계의 분석이 전형적으로 수행될 수 있고, 서열 분석, 제한 분석, 전기영동 등을 수반할 수 있다. 각각의 조작 후, 최종 구축물에서 사용될 DNA 서열을 제한하고, 다음 서열에 연결시킬 수 있으며, 이때 각각의 부분적인 구축물들이 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드 내에 클로닝될 수 있다.
클로닝 단계가 완료되었으면, 도입, 식물 재생, 안정적인 통합, 및 식물 세포에서의 관심 이종 유전자를 함유하는 외래 재조합 벡터의 발현을 허용하는 다양한 기술이 존재한다. 한 이러한 기술은 유전 물질로 코팅된 마이크로입자를 식물 세포 내로 직접적으로 가속화하는 것을 수반한다 (미국 특허 번호 4,945,050 (코넬(Cornell)); 미국 특허 번호 5,141,131 (다우엘란코(DowElanco)); 및 미국 특허 번호 5,538,877 및 5,538,880 (둘 다 데칼브(Dekalb)). 이러한 기술은 통상적으로 "마이크로입자 포격" 또는 "바이오리스틱스(biolistics)"로 지칭된다. 아그로박테리움 기술을 사용하여 식물이 형질전환될 수도 있다 (미국 특허 번호 5,177,010 (유니버시티 오브 톨레도(University of Toledo)), 미국 특허 번호 5,104,310 (텍사스 에이엔엠(Texas A&M)), 유럽 특허 출원 0131624B1, 유럽 특허 출원 120516, 159418B1 및 176,112 (스킬페로트(Schilperoot)), 미국 특허 번호 5,149,645, 5,469,976, 5,464,763 및 4,940,838 및 4,693,976 (스킬페로트), 유럽 특허 출원 116718, 290799, 320500 (모두 맥스 플랭크(Max Planck)), 유럽 특허 출원 604662, 627752 및 미국 특허 번호 5,591,616 (재팬 타바코(Japan Tobacco)), 유럽 특허 출원 0267159, 및 0292435 및 미국 특허 번호 5,231,019 (모두 시바-게이지(Ciba-Geigy)), 미국 특허 번호 5,463,174 및 4,762,785 (둘 다 칼젠(Calgene)), 및 미국 특허 번호 5,004,863 및 5,159,135 (둘 다 아그라세투스(Agracetus))). 또 다른 형질전환 방법은 신장된 바늘형 미세섬유 또는 "위스커(whisker)"를 사용하여 옥수수 세포 현탁 배양물을 형질전환시키는 것을 수반한다 (미국 특허 번호 5,302,523 및 5,464,765 (둘 다 제네카(Zeneca))). 또한, 전기천공 기술이 식물 세포를 형질전환시키는데 사용되었고, 이로부터 수정 능력이 있는 식물이 수득되었다 (WO 87/06614 (보이스 톰슨 인스티튜트(Boyce Thompson Institute)); 미국 특허 번호 5,472,869 및 5,384,253 (둘 다 데칼브(Dekalb)); 미국 특허 번호 5,679,558, 5,641,664, WO9209696 및 WO9321335 (플랜트 제네틱 시스템즈(Plant Genetic Systems))).
식물 세포의 형질전환을 위한 추가적인 기술은 직접적인 DNA 흡수 메카니즘 (문헌 [Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53:159-162 (1972)]; [Dityatkin et al., Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323 (1972)]; [Wigler et al., Cell, 16:77 (1979)]; 및 [Uchimiya et al., Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (ed.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, pp. 507-508 (1982)] 참조); 융합 메카니즘 (문헌 [Uchidaz et al., In: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga et al. (eds.) Wistar Symposium Series, 1:169-185 (1980)] 참조); 부위 특이적 재조합 (WO/9109957 참조), 및 다양한 감염제 (문헌 [Fraley et al., CRC Crit Rev. Plant Sci., 4: 1-46 (1986)]; 및 [Anderson, Science, 226:401-409 (1984)] 참조)를 포함한다.
선택된 식물 세포를 형질전환시키기 위한 적합한 절차는 사용된 식물 세포에 따라 선택될 수 있다. 현재까지의 경험을 기초로, 일단 세포 내로 삽입되면, 형질전환 방법 자체에 기인하는 유전자 발현의 차이는 거의 없는 것으로 보인다. 그보다는, 식물 세포 내로 삽입된 외래 유전자의 활성은 삽입물에 인접한 내인성 식물 DNA의 영향에 좌우된다. 일반적으로, 임의의 형질전환 기술을 사용하여 이종 유전자의 삽입은 무작위인 것으로 보인다; 그러나, 식물 세포 내로의 DNA의 부위 특이적 재조합적으로 식물을 생산하기 위한 기술이 현재 존재한다 (WO91/09957 참조).
식물 세포를 형질전환시키는데 사용된 특정 방법은 본 발명, 또는 후속 단계, 예컨대 이러한 식물 세포의 재생 (필요한 경우)에 결정적이지 않다. 대상 5' 및/또는 3' Ubi1 UTR(들) 중 하나 이상의 조절 제어 하에서의 원하는 서열 또는 서열들의 발현을 초래하는 임의의 방법 또는 방법들의 조합이 허용가능하다.
식물 조직 내로 도입되면, 구조 유전자의 발현을 일시적인 발현 시스템에서 검정할 수 있거나, 또는 식물 게놈 내로의 안정적인 통합에 대한 선택 후에 이를 결정할 수 있다.
형질전환된 세포주를 다수의 선택 시스템을 사용하여 회수할 수 있다. 이는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)]) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Lowy et al., Cell 22:817 (1980)]) 유전자 (각각 tk- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있음)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항대사물질, 항생제, 또는 제초제 내성이 선택을 위한 기초로서 사용될 수 있다; 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (문헌 [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567 (1980)]); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt (문헌 [Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1)(1981)]); 및 각각 클로르술푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼랒에 대한 내성을 부여하는 ALS (미국 특허 번호 5,378,824 (베드브룩(Bedbrook)) 또는 PAT (문헌 [Wehrmann et al., Nat Biotechnol 14(10):1274-8 (1996)]). 추가적인 선택가능한 유전자, 예를 들어, 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용하게 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용하게 하는 hisD (문헌 [Hartman and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047 (1988)])가 기술되었다. 보다 최근에는, 가시성 마커, 예컨대 GFP, 안토시아닌, α-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS, 루시퍼라제 및 이의 기질 루시페린과 같은 마커가 인기를 끌고, 이들은 형질전환체의 확인뿐만 아니라, 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적 또는 안정적 단백질 발현의 양의 정량을 위해 광범위하게 사용된다 (문헌 [Rhodes et al., Methods Mol. Biol., 55:121 (1995)]).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 관심 유전자가 또한 존재한다는 것을 시사하지만, 이의 존재 및 발현이 확증될 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입된 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 재조합 세포를 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인할 수 있다. 대안적으로, 마커 유전자가 단일 프로모터의 제어 하에 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 일렬로 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 응답하여 마커 유전자가 발현되는 것은 일반적으로 일렬 유전자의 발현을 또한 지시한다.
대안적으로, 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 본 발명의 핵산이 코딩하는 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 통상의 기술자에게 공지된 다양한 절차에 의해 확인할 수 있다. 이러한 절차는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막, 용액, 또는 칩 기반 기술을 포함하는, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및 단백질 바이오어세이 또는 면역검정법 기술을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
관심 폴리펩티드 (예를 들어, 본 발명의 핵산이 코딩하는 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부분 또는 단편 또는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 또는 증폭에 의해 검출할 수 있다. 핵산 증폭 기반 검정법은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 함유하는 형질전환체를 검출하기 위해 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 기초로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고머를 사용하는 것을 수반한다. 본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 프로브 또는 앰플리머로서 사용될 수 있는, 뉴클레오티드 약 10개 이상, 많게는 뉴클레오티드 약 60개, 바람직하게는 뉴클레오티드 약 15 내지 30개, 보다 바람직하게는 뉴클레오티드 약 20-25개의 핵산 서열을 지칭한다.
단백질에 대해 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드 (예를 들어, 본 발명의 핵산이 코딩하는 폴리펩티드)의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예로는 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사성 면역검정법 (RIA), 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)가 포함된다. 폴리펩티드 상의 2개의 비-간섭 에피토프에 대해 반응성인 모노클로날 항체를 이용하는 2-부위, 모노클로날-기반 면역검정법이 바람직하지만, 경쟁적 결합 검정법을 사용할 수 있다. 이러한 검정법 및 기타 검정법이 특히 문헌 [Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn. (1990)], 및 [Maddox et al., J. Exp. Med., 158:1211 (1983)]에 기술되어 있다.
매우 다양한 표지 및 접합 기술이 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 다양한 핵산 및 아미노산 검정법에서 사용될 수 있다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브를 생산하는 방법은 올리고뉴클레오티드 표지화, 닉 번역, 종단 표지화, 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭을 포함한다. 대안적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 이의 임의의 일부분을 mRNA 프로브의 생산을 위한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 시판되며, 적합한 RNA 폴리머라제 예컨대 T7, T3, 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용될 수 있다. 파마시아 & 업존(Pharmacia & Upjohn) (미시건주 캘러머주), 프로메가 코포레이션(Promega Corporation) (위스콘신주 매디슨) 및 유.에스. 바이오케미컬 코포레이션(U.S. Biochemical Corp.) (오하이오주 클리블랜드)로부터의 다양한 시판되는 키트를 사용하여 이러한 절차들을 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 리포터 분자 또는 표지는 방사성 핵종, 효소, 형광성, 화학발광성 또는 색원성 작용제, 뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
식물 조직의 시험관내 배양을 위해, 그리고 다수의 경우에, 전체 식물로의 재생을 위해, 기술들이 공지되어 있다. 사용된 식물 종에 따라, 성숙한 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 적합한 절차가 선택될 수 있다. 재생은 식물의 종마다 다양하다. 효율적인 재생은 배지, 유전자형, 및 배양물의 이력에 좌우될 것이다. 전체 식물이 수득되었으면, 서열의 적어도 하나의 카피가 자손의 세포 내에 존재하는 방식으로 이를 유성으로 또는 클론에 의해 번식시킬 수 있다. 재생 식물로부터의 종자를 추후 사용을 위해 수집할 수 있고, 이러한 종자로부터 식물이 성장될 수 있다. 도입된 유전자를 원래의 형질전환된 식물로부터 상업적으로 유용한 재배종 내로 전달하는 절차가 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명의 특정 실시양태들이 실시예에서 추가로 예시된다. 그러나, 통상의 기술자는 상술된 구체적인 실시양태들이 이후에 이어지는 청구항에서 보다 완전하게 기술된 바와 같은 본 발명을 설명할 뿐이라는 것을 쉽게 이해할 것이다.
실시예
실시예 1
옥수수 Ubi1 유전자 번역 정지 코돈의 바로 하류의 서열에 어닐링하는 정방향 프라이머를 사용하여 Ubi1 3' UTR 서열을 PCR 증폭시켰다. 정지 코돈의 910 bp 하류의 서열에 어닐링하는 역방향 프라이머가 디자인되었다. 이러한 910bp 서열은 3' UTR 및 하류의 비-전사 영역 (올바른 전사에 잠재적으로 요구됨)을 포함한다. 프라이머 서열이 표 1에서 제시된다. PCR 생성물을 인비트로젠(Invitrogen)의 토포(Topo) 키트를 사용하여 토포 벡터 내로 클로닝하였다. 옥수수 B73을 기준 게놈으로서 사용하여 3' UTR 삽입물의 서열을 결정하여 확인하였다.
Figure pct00001
~15 nt 오버행이 끝부분에 부가되도록 3' UTR을 추가로 PCR 증폭시켜, 심리스 클로닝 (인비트로젠, 카탈로그 번호 A13288)에 상용성인 서열을 수득하였다. 심리스 클로닝 반응을 사용하여 벡터 pDAB112330 (ZmUbi1 프로모터 v8/Cry34Ab1 v2/옥수수Ubi1 3' UTR v1, 도 2a)을 생성시켰다. Ubi1 3' UTR의 발현을 감자 PinII 3' UTR의 발현과 비교하기 위해 제아 마이스 (Zm) 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터 v8/Cry34Ab1 v2/St PinII 3' UTR v2를 함유하는 또 다른 벡터 (pDAB112332, 도 2b)를 또한 만들었다.
일시적인 발현 테스트: 수분 10-12일 후에 수확된 미성숙 옥수수 (B104) 배아의 입자 포격을 사용하여 일시적인 발현을 테스트하였다. 처리 당 20개의 배아가 사용되었고, 3회 복제가 사용되었다. 입자 포격에 이어서 배아를 밤새 인큐베이션한 후 ELISA를 수행하였다. 도 3은 감자 PinII 또는 옥수수 Ubi1 3' UTR과의 조합을 포함하는 핵산 구축물들로부터 양호한 단백질 발현 수준이 수득되었음을 나타내고, 이때 옥수수 Ubi1 3' UTR이 더 양호한 발현을 제공하였다. Neg는 비-포격 대조군이다.
실시예 2
제어 서열 ZMEXP9396.1, ZMEXP9707.1, 및 St PinII 3' UTR 사이에서 실시예 1과 유사한 발현 비교를 수행하였다.
도 4는 pDAB112357 (ZMEXP9396.1) 및 pDAB112354 (ZMEXP9707.1)의 대표적인 플라스미드 맵을 나타낸다. Cry34Ab1 유전자가 트랜스진의 발현을 테스트하는데 사용되었다. 관련 기술분야에 공지된 방법으로 Cry34Ab1의 발현 수준을 측정할 수 있다.
도 5는 pDAB112357 (ZMEXP9396.1), pDAB112354 (ZMEXP9707.1), 및 pDAB112332 (St PinII 3' UTR)을 포함하는 여러 핵산 구축물로부터의 예시적인 발현 결과를 나타낸다. 3개의 구축물 모두가 Cry34Ab1에 대해 대등한 양호한 발현을 제공하였다.
표 2는 제어 서열 ZMEXP9396.1, ZMEXP9707.1, 및 제아 마이스 Ubi1 3' UTR을 증폭시키는데 사용된 프라이머들을 열거한다.
Figure pct00002
실시예 3
벡터 구축: 상응하는 옥수수 유전자 번역 정지 코돈의 바로 하류의 서열에 어닐링하는 정방향 프라이머를 사용하여 3' UTR 서열을 PCR 증폭시켰다. 정지 코돈의 약 900-1000 bp 하류의 서열에 어닐링하는 역방향 프라이머가 디자인되었다. 이러한 대략 1000 bp 서열은 3' UTR 및 하류의 비-전사 영역 (올바른 전사에 잠재적으로 요구됨)을 포함한다. PCR 생성물을 인비트로젠의 토포 키트를 사용하여 토포 벡터 내로 클로닝하였다. 옥수수 B73을 기준 게놈으로서 사용하여 3' UTR 삽입물의 서열을 결정하여 확인하였다.
약 15 nt 오버행이 끝부분에 부가되도록 3' UTR을 추가로 PCR 증폭시켜, 심리스 클로닝 (인비트로젠, 카탈로그 번호 A13288)에 상용성인 서열을 수득하였다. 심리스 클로닝 반응을 사용하여 게이트웨이(Gateway)® (인비트로젠) 진입 벡터들인 pDAB112330 (ZmUbi1 프로모터 v8/Cry34Ab1 v2/ZmUbi1 3' UTR v1; 도 2a 참조), pDAB112354 (ZmUbi v8/Cry34Abi v2/ZMEXP9707.1 3' UTR; 도 4 참조), 및 pDAB112357 (ZmUbi v8/Cry34Abi v2/ ZMEXP9396.1 3' UTR; 또한 도 4 참조)을 생성시켰다. Ubi1 3' UTR의 발현을 감자 PinII 3' UTR의 발현과 비교하기 위해 제아 마이스 (Zm) 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터 v8/Cry34Ab1 v2/St PinII 3' UTR v2를 함유하는 또 다른 벡터 (pDAB112332, 도 2b)를 또한 만들었다.
전형적인 데스티네이션 이원 벡터 (pDAB104153) 및 상기 기술된 바와 같은 진입 벡터를 사용하는 게이트웨이® 재조합 반응 및 표준 클로닝 방법의 사용을 통해 아그로박테리움-매개 옥수수 배아 형질전환을 위한 형질전환/발현 벡터를 구축하였다. 이원 데스티네이션 벡터 pDAB104153은 제아 마이스 (Zm) 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터의 발현 제어 하의 제초제 저항성 유전자 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD-1); 미국 특허 번호 7,838,733, 및 문헌 [Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245])를 포함하였다. 옥수수 리파제 유전자로부터의 3' UTR (ZmLip 3' UTR, 미국 특허 번호 7,179,902)을 포함하는 단편이 PAT mRNA의 전사를 종결시키는데 사용되었다. T-DNA 경계와 AAD-1 발현 카세트의 상류 사이에서, 상기 4개의 진입 벡터에서 기술된 바와 같이, ZmUbi1v8/Cry34Abi v2/ 3' UTR 발현 카세트에 대해 게이트웨이® 재조합 반응이 사용되었다. 4개의 최종 발현 벡터인 pDAB108744, pDAB108746, pDAB112396 및 pDAB112397이 도 6 및 7에서 제시된다.
아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환: 이러한 이원 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 3원체 (WO 2012/016222 국제 PCT 출원에서 공개됨) 내로 형질전환시켰다. 이원 플라스미드 DNA를 박테리아 콜로니로부터 단리하고, 제한 효소 소화를 사용하여 확인하였다.
옥수수 형질전환: 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 (RecA 마이너스 삼원성 균주) 숙주 내의 프로젝트 벡터의 글리세롤 원액을 DAS 리컴비넌트 컬쳐 콜렉션(Recombinant Culture Collection) (RCC)에서 수득하였다. 아그로박테리움 배양물을 글리세롤 원액으로부터 AB 최소 배지 (배지 ID: AT00002247) 상에 스트리킹하고, 20℃의 암실에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 아그로박테리움 배양물을 YEP 배지 (배지 ID: AT00002245)의 플레이트 상에 스트리킹하고, 20℃의 암실에서 1일 동안 인큐베이션하였다.
Figure pct00003
접종 배지 (배지 ID: ZM00002914) 및 아세토시린곤의 혼합물을 실험에서의 구축물의 번호에 적합한 부피로 제조하였다. 접종 배지를 무균성 1회용 250 ml 플라스크 내로 피펫팅하였다. 100% 디메틸 술폭시드 내의 아세토시린곤의 1 M 원액 (원액 레시피 ID: EPS000400)을 접종 배지를 함유하는 플라스크에 200 μM의 최종 아세토시린곤 농도를 만드는데 적합한 부피로 첨가하였다. 접종 배지 및 1 M 아세토시린곤 원액의 예시적인 부피가 표 3에서 열거된다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 1-2 루프의 아그로박테리움을 무균성 1회용 50 ml 원심분리 튜브 내의 15 ml의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물에 현탁시키고, 600 nm에서의 용액의 광학 밀도 (O.D.600)를 분광광도계에서 측정하였다. 그 후, 현탁액을 추가적인 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 0.25 - 0.35 O.D.600으로 희석하였다. 그 후, 사용하기 전에 1 내지 4시간 동안 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기 상에 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 수직으로 놓았다.
이삭 멸균 및 배아 단리: 제아 마이스 재배종 B104로부터의 이삭을 인디애나폴리스 온실 설비에서 생산하고, 수분 10-12일 후에 수확하였다. 수확된 이삭의 껍질을 벗기고, 시판 표백제 (울트라 클로록스(Ultra Clorox)® 살균 표백제, 6.15% 하이포아염소산나트륨)의 20% 용액 및 2방울의 트윈(Tween) 20에서 20분 동안 표면-멸균시킨 후, 층류 후드 내부에서 무균성 탈이온수에서 3회 헹궜다. 미성숙 접합 배아 (1.8 - 2.2 mm 길이)를 각각의 이삭으로부터 무균 상태로 절단하고, 2.0 ml의 아그로박테리움 현탁액을 함유하는 하나 이상의 미세-원심분리 튜브 내로 분배하고, 여기에 2 μl의 10% 브레이크-스루(Break-Thru)® S233 계면활성제를 첨가하였다.
아그로박테리움 공동-배양: 배아 단리 활동의 완료 시, 배아의 튜브를 닫고, 로커 플랫폼 상에 5분 동안 놓았다. 그 후, 튜브의 내용물을 공동-배양 배지 (배지 ID: ZM00003237)의 플레이트 상에 붓고, 액체 아그로박테리움 현탁액을 무균성 1회용 이동 피펫으로 제거하였다. 배아를 함유하는 공동-배양 플레이트를 30분 동안 뚜껑을 약간 열어 놓고 층류 후드의 뒤쪽에 놓았다; 이러한 시간 후, 현미경을 사용하여 배아를 소순판을 위쪽으로 하여 배향시켰다. 그 후, 배아가 있는 공동-배양 플레이트를 또 다른 15분 동안 뚜껑을 약간 열어 놓고 층류 후드의 뒤쪽으로 되돌렸다. 그 후, 플레이트를 닫고, 3M 마이크로포어(Micropore) 테이프로 밀봉하고, 약 60 μmol m-2 s-1 광 강도의 광이 24시간/일로 있는 25℃의 인큐베이터 내에 놓았다.
캘러스 선택 및 트랜스제닉 사건의 재생: 공동-배양 기간 후, 배아를 휴지 배지 (배지 ID: ZM00003262)로 옮겼다. 36개까지의 배아를 각각의 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 투명한 상자 내에 놓고, 7-10일 동안 약 50 μmol m-2 s-1 광 강도의 광을 24시간/일로 하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 캘러스화 배아를 선택 I 배지 (배지 ID: ZM00003233) 상으로 옮겼다. 18개까지의 캘러스화 배아를 각각의 선택 I 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 투명한 상자 내에 놓고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 광 강도의 광을 24시간/일로 하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 캘러스화 배아를 선택 II 배지 (배지 ID: ZM00003234)로 옮겼다. 12개까지의 캘러스화 배아를 각각의 선택 II 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 투명한 상자 내에 놓고, 14일 동안 약 50 μmol m-2 s-1 광 강도의 광을 24시간/일로 하여 27℃에서 인큐베이션하였다.
이러한 단계에서, 내성 캘러스를 예비-재생 배지 (배지 ID: ZM00003235)로 이동시켰다. 9개까지의 캘러스를 각각의 예비-재생 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 투명한 상자 내에 놓고, 7일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 광 강도의 광을 24시간/일로 하여 27℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 재생 캘러스를 피타트레이스(Phytatrays)™ 내의 재생 배지 (배지 ID: ZM00003236)로 옮기고, 7-14일 동안 또는 슈트가 발달될 때까지 약 150 μmol m-2 s-1 광 강도로 일 당 16시간 명/8시간 암으로 하여 28℃에서 인큐베이션하였다. 5개까지의 캘러스를 각각의 피타트레이스™ 내에 놓았다. 원뿌리가 있는 소형 슈트를 단리하고, 슈트 신장 배지 (배지 ID: ZM00003269)로 옮겼다. 약 6 cm 이상의 뿌리내린 묘목을 토양으로 이식하고, 추위에 길들게 하기 위한 성장 챔버로 이동시켰다.
운송 및 온실에서의 식물 확립: 트랜스제닉 식물에 TOPAZ 데이터베이스를 통해 독특한 식별자를 할당하고, 정기적으로 온실로 옮겼다. 식물을 피타트레이스™에서 성장 배지 (프리미어 테크 호티컬처(Premier Tech Horticulture), 프로믹스(ProMix) BX, 0581 P)가 채워진 소형 화분 (티. 오. 플라스틱스(T. O. Plastics), 3.5" SVD, 700022C)로 옮기고, 식물을 순응시키는 것을 돕도록 이를 휴미돔으로 덮었다. V3-V4 단계에 도달할 때까지 식물을 콘비론(Conviron) 성장 챔버 (28℃/24℃, 16시간 광주기, 50 - 70% RH, 200 μmol m-2 s-1 광 강도) 내에 놓았다. 이는 식물을 토양 및 더 가혹한 온도에 순응시키는 것을 도왔다. 그 후, 식물을 온실 (노광 유형: 광 또는 동화; 광 상한: 1200 μmol m-2 s-1 광합성 유효 방사 (PAR); 16시간의 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)로 이동시키고, 소형 화분에서 5.5 인치 화분으로 이식하였다. T0 식물을 B104에 역교배시켜 T1 반접합 종자를 수득하였다.
AAD-1 및 Cry34 단백질의 ELISA 정량: 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 옥수수 세포 또는 안정하게 형질전환된 조직에서의 AAD-1 및 Cry34 단백질의 생산을 측정하였다. 아카디아 바이오사이언시즈(ACADIA BIOSCIENCES) (카탈로그 # ABS-041) 및 아그디아 인크(Agdia, Inc) (카탈로그# 04500/4800)로부터의 키트를 각각 사용하여 AAD-1 단백질을 정량하였다. 식물 추출물의 다중 희석물을 사용하여, 그리고 공급자에 따른 시약 및 설명서를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
식물 단백질 추출: 4개의 잎 디스크 (총 1.3 ㎠) 또는 40개의 미성숙 배아 (일시적인 발현 연구용)로부터 0.5% BSA (AAD-1 추출용) 또는 1% PVP-40 (폴리비닐피롤리돈; Cy34용)을 함유하는 0.6 mL의 PBST (0.05 % 트윈 20을 함유하는 PBS 완충제) 내에 단백질을 추출하였다. 2 ㎜ 스틸 비드를 첨가하고, 튜브를 캡핑하고, 제노/그라인더(GENO/GRINDER) (서티프렙(CERTIPREP); 뉴저지주 메투첸)에서 고정시키고, 5분 동안 1500 rpm에서 진탕시켰다. 튜브를 4000 rpm에서 7분 동안 4℃에서 원심분리하고, 가용성 단백질을 함유하는 상청액을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 공급사의 설명서에 따라 피어스(PIERCE) 660 nm 단백질 검정법 키트 (써모 사이언티픽(THERMO SCIENTIFIC); 일리노이주 록포드)를 사용하여 총 단백질 농도를 결정하였다.
Figure pct00004
카피수 분석용 가수분해 프로브 qPCR: 다양한 유형의 분자성 분석을 사용하여 낮은 카피, 단순 사건을 스크리닝하였다. 토양으로 이식하기 전에, 뿌리내린 추정 트랜스제닉 식물로부터 잎 조직을 수집하였다. 써모 피셔(THERMO FISHER)의 킹피셔(KingFisher)™ 자기 입자 프로세서 및 공급사의 권장 프로토콜을 사용하여 퀴아젠(QIAGEN)의 마그어트랙트(MagAttract)™ 키트로 DNA를 추출하였다. AAD-1 및 Cry34 유전자에 대한 특이적인 가수분해 프로브 검정법을 사용하여 통합된 트랜스진 카피수 분석을 수행하였다. 또한, 이원 벡터 플라스미드 골격의 우발적인 통합에 의한 오염을 이원 벡터 골격 상에 보유된 스펙티노마이신 (Spec) 내성 유전자에 대해 특이적인 가수분해 프로브 검정법에 의해 검출하였다. 내인성 옥수수 유전자인 인버타제(Invertase); (진뱅크(GenBank)™ 등록 번호 U16123) 및 신장 인자 1α (EF1α) (진뱅크 등록 번호 AF136823.1)에 대한 가수분해 프로브 검정법이 내부 기준 표준물로서 개발되었다. 표 4는 가수분해 프로브 검정법 성분들 (인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) (아이오와주 코랄빌)에 의해 합성됨)의 올리고뉴클레오티드 서열을 열거한다.
Figure pct00005
약 10 ng의 DNA로 표 5에 따라 바이플렉스(Biplex) 가수분해 프로브 PCR 반응을 설정하였고, 검정법 조건이 표 6에서 제시된다.
Figure pct00006
증폭을 위해, 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 프로브 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스(ROCHE APPLIED SCIENCE), 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.1%의 PVP, 0.4 μM의 각각의 프라이머, 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피의 멀티플렉스 반응물에서 1× 최종 농도로 제조하였다. FAM (6-카르복시 플루오레세인 아미다이트) 형광 모이어티를 465 nm에서 여기시키고, 510 nm에서 형광을 측정하였다; HEX (헥사클로로플루오레세인) 형광 모이어티에 대한 상응하는 값은 533 nm 및 580 nm였고, VIC®에 대해서는 값이 538 nm 및 554 nm였다. 제조사의 권고에 따라 로슈 라이트사이클러®480 실시간 PCR 시스템을 사용하여 각각의 반응에 대해 생성된 형광 수준을 분석하였다. 미지의 샘플에 대한 표적/기준 유전자 값의 라이트사이클러®480 출력값을 카피수가 알려진 표준물의 표적/기준 유전자 값에 비교함으로서 트랜스진 카피수를 결정하였다 (1-카피는 반접합 식물을 나타내고, 2-카피는 동종접합 식물을 나타냄).
Cp 점수, 즉 형광 신호가 핏 포인트 알고리즘 (라이트사이클러® 소프트웨어 1.5 배포판), 및 상대 퀀트(Quant) 모듈 (ΔΔCt 방법을 기초로 함)을 사용하여 배경 역치와 교차하는 지점을 사용하여, 실시간 PCR 데이터의 분석을 수행하였다.
라이트사이클러® 피트 포인트 알고리즘 소프트웨어에서, 입력된 DNA 주형 농도의 로그값을 측정된 Cp 값에 대해 플롯팅하여 데이터의 그래프를 만들었다. 곡선의 기울기는 바람직한 비교 파라미터이다; 따라서, 초기 로그 입력 숫자는 곡선 상의 임의의 시작점일 수 있고, 단 입력된 DNA 주형에 사용된 임의의 농도 값은 사용된 실제의 단계 희석을 나타낸다. 예를 들어, 10배 연속 희석 시리즈에 대해, 실제 입력값 농도는 1000, 100, 10 등일 수 있고, 이러한 지점에 대해 LC480 피트 포인트 알고리즘 소프트웨어는 입력값의 로그로서 3, 2, 1 등을 플롯팅한다. 선형 회귀를 사용하여, 이러한 선 (입력 로그 대 Cp)의 생성된 베스트 핏이 y = mx+b 양식의 식으로부터 기울기 (m)를 추정하는데 사용된다. 출발 주형 양과 Cp 값 사이의 관계는 반비례이고, 따라서 기울기 (m)는 항상 음성이다.
완전한 (즉, 100% 효율적인) PCR 반응은 매 사이클마다 전체 주형을 배가시킨다. PCR 효율 (Eff)은 하기와 같이 계산된다: Eff = 10e(-1/m). 따라서, 로그 입력 대 Cp의 그래프의 기울기 (m)는 완전하게 효율적인 반응 (이의 효율은 2.00으로 정의됨)에 대해 -3.3219일 것이다. 달리 말하면, 100% 효율적인 PCR 반응은 2.0 = 10e(-1/-3.3219)로 정의된다. LC480 핏 포인트 알고리즘 소프트웨어는 제1 식에 의한 효율 값을 보고한다. 따라서 99% 효율적인 반응은 Eff 값이 0.99보다는 1.99이다. 이를 퍼센트 효율로서 표현하기 위해, 이러한 값으로부터 1을 차감하고, 100을 곱하거나, 또는 식 %Eff = [(10e(-1/m)-1)] × 100에 따른다.
안정적인 트랜스제닉 식물의 단백질 분석: 안정적인 트랜스제닉 T0 식물 (트랜스진의 1 내지 2개의 카피)을 성숙한 식물 생산을 위해 온실로 옮겼다. 각각의 구축물에 대해, 8 내지 12개의 T0 식물을 Cry34 및 AAD-1 단백질의 잎 발현에 대해 테스트하였다. T1 분석을 위해, 사건 당 8-10개의 식물을 단백질 분석을 위해 식재하였다. 데이터를 수득하고, Zm Ubi1 3' UTR이 있는 구축물과 St PinII 3' UTR이 있는 구축물 간에 비교하였다. 결과는 옥수수 식물의 V4 및 V12 잎 단계 둘 다에서 St PinII 3' UTR (예를 들어 pDAB108746)과 비교하여 Zm Ubi1 3' UTR (예를 들어 pDAB108744)을 사용하여 Cry34 단백질 생산이 일관적으로 2.5배를 초과하여 증가하였음을 나타냈다. 따라서, 제공된 Zm Ubi1 3' UTR은 트랜스제닉 형질을 만드는데 유용하였다. 또한, ZMEXP9396.1 및 ZMEXP9707.1 3' UTR (예를 들어 pDAB112396 및 pDAB112397)로부터의 데이터는 Cry34 단백질의 강건한 발현을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Kumar, Sandeep Gupta, Manju Alabed, Diaa <120> USE OF A MAIZE UNTRANSLTED REGION FOR TRANSGENE EXPRESSION IN PLANTS <130> 72908 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 910 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 gtcatgggtc gtttaagctg ccgatgtgcc tgcgtcgtct ggtgccctct ctccatatgg 60 aggttgtcaa agtatctgct gttcgtgtca tgagtcgtgt cagtgttggt ttaataatgg 120 accggttgtg ttgtgtgtgc gtactaccca gaactatgac aaatcatgaa taagtttgat 180 gtttgaaatt aaagcctgtg ctcattatgt tctgtctttc agttgtctcc taatatttgc 240 ctgcaggtac tggctatcta ccgtttctta cttaggaggt gtttgaatgc actaaaacta 300 atagttagtg gctaaaatta gttaaaacat ccaaacacca tagctaatag ttgaactatt 360 agctattttt ggaaaattag ttaatagtga ggtagttatt tgttagctag ctaattcaac 420 taacaatttt tagccaacta acaattagtt tcagtgcatt caaacacccc cttaatgtta 480 acgtggttct atctaccgtc tcctaatata tggttgattg ttcggtttgt tgctatgcta 540 ttgggttctg attgctgcta gttcttgctg aatccagaag ttctcgtagt atagctcaga 600 ttcatattat ttatttgagt gataagtgat ccaggttatt actatgttag ctaggttttt 660 tttacaagga taaattatct gtgatcataa ttcttatgaa agctttatgt ttcctggagg 720 cagtggcatg caatgcatga cagcaacttg atcacaccag ctgaggtaga tacggtaaca 780 aggttcttaa atctgttcac caaatcattg gagaacacac atacacattc ttgccagtct 840 tggttagaga aatttcatga caaaatgcca aagctgtctt gactcttcac ttttggccat 900 gagtcgtgac 910 <210> 2 <211> 1037 <212> DNA <213> Zea mays <400> 2 agttctagca gcttgcctgc atgttccgct gtcactgcct cactaggcac gttcacaata 60 ccatcgatgg cttgcctgcc tctatagaat gctgatctac tcttcactgg aggccccctt 120 atatatagga caaaaatccc aattttgttt ggaaaaccac aagtagggat atatctgtcg 180 aattctcgta tgcaacggca acgccgttct acccctcaac tttttttttt cctttttcta 240 ctttgcaaca tgcaacaagg gctgtcattg atcgaaattc aaatatatgt tacattggga 300 attccatgcg actgcctaaa ctctaggaag tttcacttgt cctgtttcat atgtatgtat 360 gcattgtagc cttgttgtat ttcctcaatg tcttggttgc tttcatcggt tagagttctt 420 gacgactgtt gcagagattc tgtcggagta tattcagggt cgcctattac cagacatgct 480 gcccggacaa catgttgatt cgttcattgg cagcgcaaca tgcaattaga aattaacagc 540 tactctagaa caagcaaata acagctgtcg ctaaaattca atattccatc cctgttaaca 600 ttgaatttat tgtcttgttt atgaacccta tgtatctgac agcaccattg cctttttttt 660 acttaggcgg tccattattg tcacacccgg atttaaagag aaagttggat gcatcttata 720 catgcgacaa agaagaaaac atatatatgt atagagataa atgtcataat aacatcaaaa 780 tacttattac aatgcgtaag tcttacaaaa taaaagataa atataaatca aactaaaatc 840 tatctttggc gccaataagt caactgggag atgccaccta gatcagatca aattcctcgt 900 tgtgtggctc ctcttgaacc atctgttctt ctcctgtggg gagtgtgaga cagcaagggt 960 gagctcacac atgttcattg ttcaacaagt tgtggggaat aggagttcat gcgatttgta 1020 aggctaatca acaatag 1037 <210> 3 <211> 1061 <212> DNA <213> Zea mays <400> 3 gctcagcttc tccatttgca tggtctagta gcttgctttg tactgctagc gccggtcgat 60 ccgtcgcaat cgtcatggat catctctcta tcttgttgtt gcgctgttca taatttggta 120 tatttgccat tccgctattg tgtactcttt ggcatacata caataattaa aatggcgttg 180 cgtggctctc atataattaa ccttcacata acctgaagac tcaagtacgt atagtatggg 240 caactttatt gtagatacta tctggagtct cgaatatttg tcgtccgcta gttcatattt 300 aaactaaaca acgataaata aaaaagaact aagtgagtat atttttttgt gggagaaggg 360 ttatccatta atacatccac ggttctgtaa attccatttc atgacatgaa aaaaggaaaa 420 acgcatccaa tagcccatta tgtaaatatg tctaccgtct atccattgga caagttatat 480 attaatgact agtttggtaa cctcattttt ttaaggattt tcgtttttta agcgaaatta 540 gttcatttta ccttggcaaa tagaaatttt ttagaaaaaa atggtgttct caaactagcc 600 ttaaattttt ttagaaatga gaatattatt aatattccat cttccagggg cggatttggg 660 cctcgggcca cctgggccgt ggcccagggc gcagcccaaa aaccctctta tatataggtc 720 ttttttcaac caaaaaatct agaccaaaat acatttcagc ctaaaagatc tcctgctgca 780 ccgattgagt ctggtggcgc tggcggcctc cctcagtcgc tcaagccacg agaacacact 840 ctttcaatta tttcgcaaac atgcgcagct gcgtttccta tgttgccagc ggcgcggccg 900 cctccattca gtcctctatc gctctccacg ccttcaggct ctacgaatcc gataagggaa 960 caaggcagca acctctaagg cagccgggcg ggctctgact caggcatccg ccaccgccag 1020 tccgcctcca acgtccctgc gaacctgtag caatgacgcg t 1061 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ASP/ZM Ubi1-3'UTR/1-910 <400> 4 gtcacgactc atggccaaaa gt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence SP/ZM Ubi1-3'UTR/1-910 <400> 5 gtcatgggtc gtttaagctg cc 22 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence 3'ZM-Ubi1-3'UTR v1-seamless <400> 6 tagcttaatc acctagagct cgtcatgggt cgtttaagct gccga 45 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence 5'ZM-Ubi1-3'UTR v1-seamless <400> 7 aagctgggtc tagatgtcac gactcatggc caaaagtga 39 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence 5'ZM-Ubi1-3'UTR v1-seamless <400> 8 agttctagca gcttgcctgc atg 23 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9396.1R <400> 9 ctattgttga ttagccttac aaatcgc 27 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9396.1F-seamless <400> 10 tagcttaatc acctagagct cagttctagc agcttgcctg ca 42 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9396.1R-seamless <400> 11 aagctgggtc tagatctatt gttgattagc cttaca 36 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9707.1F <400> 12 gctcagcttc tccatttgca tggtc 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9707.1R <400> 13 acgcgtcatt gctacaggtt cgca 24 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9707.1F-seamless <400> 14 tagcttaatc acctagagct cgctcagctt ctccatttgc at 42 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence ZMEXP9707.1R-seamless <400> 15 aagctgggtc tagatacgcg tcattgctac aggttc 36 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence AAD1F <400> 16 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence AAD1R <400> 17 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence AAD1P <400> 18 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence TQ.8v6.1.F <400> 19 gccataccct ccagttg 17 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence TQ.8v6.1 <400> 20 ccgaatccaa cggcttca 18 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence TQ.8v6.1.R <400> 21 gccgttgatg gagtagtaga tgg 23 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence SPC1A <400> 22 cttagctgga taacgccac 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence SPC1S <400> 23 gaccgtaagg cttgatgaa 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence TQSPC <400> 24 cgagattctc cgcgctgtag a 21 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence InvertaseF <400> 25 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence InvertaseR <400> 26 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence InvertaseP <400> 27 cgagcagacc gccgtgtact t 21

Claims (22)

  1. 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 관심 구조 유전자를 포함하는 핵산 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 관심 구조 유전자가 식물에서 비-천연 표현형을 부여하는 유전자를 포함하는 것인 핵산 구축물.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 관심 구조 유전자가 식물에서 곤충 내성 또는 제초제 내성/저항성을 부여하는 유전자를 포함하는 것인 핵산 구축물.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제어 서열이 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 구축물.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제어 서열이 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능한 것인 핵산 구축물.
  6. 제1항에 있어서, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환을 위한 이원 벡터를 포함하는 핵산 구축물.
  7. 제1항에 있어서, 트랜스제닉 식물 내로 안정하게 형질전환되는 핵산 구축물.
  8. 제6항에 있어서, 식물이 단자엽 식물인 핵산 구축물.
  9. 제6항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 핵산 구축물.
  10. 제1항에 있어서, 선택가능한 마커를 포함하는 핵산 구축물.
  11. 제10항에 있어서, 선택가능한 마커가 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제를 포함하는 것인 핵산 구축물.
  12. 제11항에 있어서, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제가 AAD-1 또는 AAD-12인 핵산 구축물.
  13. 제1항의 핵산 구축물을 포함하는 벡터.
  14. 제1항의 핵산 구축물로 형질전환된 식물 또는 식물 세포.
  15. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 관심 유전자와 스태킹된 추가의 관심 구조 유전자를 추가로 포함하는 식물 또는 식물 세포.
  16. 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것을 포함하는, 펩티드 또는 단백질을 재조합적으로 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 하나 이상의 제어 서열이 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능한 것인 방법.
  18. 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 80% 동일성을 갖는 하나 이상의 제어 서열 및 이종 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 유전자 발현을 증가시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 제어 서열이 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 하나 이상의 제어 서열이 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능한 것인 방법.
  21. 식물에서의 트랜스진의 발현을 위한, 서열 1-3, 그의 상보체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제어 서열의 용도.
  22. 식물에서의 트랜스진의 발현을 위한, 서열 4-15로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭가능한 하나 이상의 제어 서열의 용도.
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