ES2588991T3

ES2588991T3 - Variantes de HPPD y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2588991T3
Application number: ES13164702.6T
Authority: ES
Inventors: Gudrun Lange; Fabien Poree; Bernd Laber; Jörg Freigang; Arno Schulz
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2016-11-08
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: EP2453012B1; EP2669372B1; EP2669370B1; EP2669373B1; ES2588918T3; EP2669369A1; EP2669372A1; ES2594284T3; EP2669371A1; EP2669373A1; EP2453012A1; ES2588802T3; EP2669370A1

Abstract

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPPD mutada, en donde dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD y en donde en dicha proteína de HPPD mutada el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2 ha sido reemplazado de tal modo que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición correspondiente a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2:

Description

imagen1

Variantes de HPPD y procedimientos de uso

La presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPPD mutada, en donde dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD, en 5 donde en dicha proteína de HPPD mutada un aminoácido ha sido reemplazado de modo tal que la secuencia de aminoácidos resultante comprende al menos un aminoácido seleccionado de ciertos aminoácidos en una posición específica importante por conferir una mayor tolerancia al inhibidor de HPPD. La presente invención también se refiere a proteínas codificadas por el ácido nucleico de la invención, a genes quiméricos, células vegetales que comprenden el ácido nucleico de la invención operativamente ligado a un promotor que se puede expresar en

10 plantas y opcionalmente una región de terminación de la transcripción y poliadenilación, plantas que consisten esencialmente en las células vegetales de la invención y procedimientos para obtener plantas transgénicas.

En esta memoria descriptiva, se cita una cantidad de documentos que incluyen solicitudes de patentes y manuales de fabricantes. La divulgación de estos documentos, aunque no se consideren relevantes para la patentabilidad de esta invención, se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Más específicamente, todos los documentos

15 mencionados se incorporan por referencia como si cada documento individual se indicara específica e individualmente como incorporado por referencia.

Las proteínas de HPPD (hidroxifenilpiruvato dioxigenasa) son enzimas que catalizan la reacción en la que se transforma el para-hidroxifenilpiruvato (abreviado en el presente documento como HPP), un producto de degradación de la tirosina, en homogentisato (abreviado en el presente documento como HG), el precursor en

20 plantas de tocoferol y plastoquinona (Crouch N.P. et al. (1997) Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al., (2004), Plant Physiology 134: 1388-1400). El tocoferol actúa como un antioxidante asociado a membrana. La plastoquinona actúa primeramente como un vehículo de electrones entre PSII y el complejo de citocromo b6/f y secundariamente, es un cofactor redox para la fitoeno desaturasa, que está implicada en la biosíntesis de los carotenoides.

Hasta ahora, más de 700 secuencias de ácidos nucleicos de diversos organismos presentes en la base de datos

25 NCBI se anotaron como codificadores de una proteína teórica que tiene un dominio de HPPD. Pero para la mayoría de estas secuencias, no se probó que la proteína tuviera una actividad enzimática de HPPD ya sea en un ensayo in vitro o en un enfoque in planta, ni que tal proteína de HPPD pudiera conferir una tolerancia a herbicidas para los herbicidas inhibidores de HPPD cuando se expresa en una planta. Varias proteínas de HPPD y sus secuencias primarias fueron descritas en el estado de la técnica, en particular las HPPD de bacterias tales como Pseudomonas

30 (Rüetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantas tales como Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834), zanahoria (WO 96/38567, Genebank 87257), Avena sativa (WO 02/046387), trigo (WO 02/046387), Brachiaria platyphylla (WO 02/046387), Cenchrus echinatus (WO 02/046387), Lolium rigidum (WO 02/046387), Festuca arundinacea (WO 02/046387), Setaria faberi (WO 02/046387), Eleusine indica (WO 02/046387), Sorghum (WO 02/046387), Coccicoides (Genebank COITRP), Coptis japonica (WO 06/132270),

35 Chlamydomonas reinhardtii (ES 2275365), o de mamíferos tales como ratón o cerdo.

La mayoría de las plantas sintetizan tirosina por medio de arrogenato (Abou-Zeid et al. (1995), Applied Env Microb

41: 1298-1302; Bonner et al., (1995), Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022; Byng et al., (1981), Phytochemistry 6: 1289-1292; Connely y Conn (1986), Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines et al., (1982), Plants 156: 233-240). En estas plantas, el HPP se deriva solo de la degradación de tirosina. Por otro lado, en organismos tales como la levadura 40 Sacharomyces cerevisiae o la bacteria Escherichia coli, el HPP es un precursor de tirosina y se sintetiza por la acción de una enzima, prefenato deshidrogenasa (de ahora en adelante referida como PDH), que convierte prefenato en HPP (Lingens et al., (1967) European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar y Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701: 204-211). En estos organismos en consecuencia la producción de HPP está conectada directamente con la vía de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (vía de shikimato) y no con la vía de degradación

45 de la tirosina.

La inhibición de HPPD lleva a desacoplamiento de la fotosíntesis, deficiencia en pigmentos recolectores de luz accesorios y lo más importante, a la destrucción de la clorofila por radiación UV y especies reactivas de oxígeno (blanqueo) debido a la falta de fotoprotección normalmente proporcionada por los carotenoides (Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). El blanqueo de los tejidos fotosintéticamente activos lleva a la inhibición del crecimiento y

50 la muerte de las plantas.

En la actualidad, los herbicidas inhibidores de HPPD más disponibles comercialmente pertenecen a una de estas cuatro familias químicas:

1) las tricetonas, por ejemplo sulcotriona [es decir 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclohexandiona], mesotriona [es decir 2-[4-(metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclohexandiona]; tembotriona [es decir 2-[2-cloro-4

55 (metilsulfonil)-3-[(2,2,2,-trifluoroetoxi)metil]benzoil]-1,3-ciclo-hexandiona]; tefuriltriona [es decir 2-[2-cloro-4(metilsulfonil)-3-[[(tetrahidro-2-furanil)metoxi]metil]benzoil]-1,3-ciclohexandiona]]; biciclopirona [es decir 4-hidroxi-3[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; benzobiciclona [es decir 3(2-cloro-4-mesilbenzoil)-2-feniltiobiciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona]

imagen2

3) los isoxazoles, por ejemplo isoxaflutol [es decir (5-ciclopropil-4-isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4(trifluorometil)fenil]metanona]. En plantas, el isoxaflutol se metaboliza rápidamente en DKN, un compuesto de 5 dicetonitrilo que exhibe la propiedad de inhibidor de HPPD; y

4) los pirazolinatos, por ejemplo topramezona [es decir [3-(4,5-dihidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)metanona] y pirasulfotol [(5-hidroxi-1,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4trifluorometilfenil)metanona]; pirazofeno [2-[4-(2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetilpirazol-5-iloxi]acetofenona].

Estos herbicidas inhibidores de HPPD se pueden usar contra pasto y/o malas hierbas de hoja ancha en plantas de

10 cultivo que muestran tolerancia metabólica, como maíz (Zea mays) en las que se degradan rápidamente (Schulz et al., (1993). FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al., (2001) Pest Management Science, vol. 57, 120-128; García et al., (2000) Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al., (2001) Pest Management Science, vol. 57, 133-142). A fin de extender el alcance de estos herbicidas inhibidores de HPPD, se han desarrollado varios esfuerzos a fin de conferirles a las plantas, en particular plantas sin o con una tolerancia metabólica de bajo rendimiento, un nivel de

15 tolerancia aceptable en condiciones de campo agronómicas.

Además del intento de desviar la protección mediada por HPPD del homogentisato (documento US 6.812.010), se realizó una sobreexpresión de la enzima sensible tal como para producir cantidades de la enzima objetivo en la planta que son suficientes en relación con el herbicida (documento WO 96/38567). La sobreexpresión de HPPD dio como resultado una mejor tolerancia pre-germinación al derivado de dicetonitrilo (DKN) de isoxaflutol (IFT), pero la

20 tolerancia no era suficiente para la tolerancia al tratamiento pre-germinación (Matringe et al., (2005), Pest Management Science 61: 269-276).

En el documento WO 04/024928, los autores de la invención han tratado de aumentar la biosíntesis de la prenilquinona (por ejemplo, síntesis de plastoquinonas, tocoferoles) en las células vegetales aumentando el flujo del precursor de HPP en las células de estas plantas. Esto se ha realizado conectando la síntesis de dicho precursor

25 con la vía de “shikimato” por sobreexpresión de una enzima de PDH. También se ha observado que la transformación de plantas con un gen que codifica una enzima de PDH hace posible aumentar la tolerancia de dichas plantas a los inhibidores de HPPD.

Otra estrategia fue mutar la HPPD a fin de obtener una enzima objetivo que, mientras que retiene sus propiedades de catalizar la transformación de HPP en homogentisato, es menos sensible a los inhibidores de HPPD que la HPPD

30 nativa antes de la mutación.

Esta estrategia se ha aplicado exitosamente para la producción de plantas tolerantes a 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona y a 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1metilciclopropil)propan-1,3-diona (documento EP496630), dos herbicidas inhibidores de HPPD que pertenecen a la familia de los dicetonitrilos (documento WO 99/24585). Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile y más en particular

35 Gly336Trp (las posiciones del aminoácido mutado se indican con referencia a la HPPD de Pseudomonas) se identificaron como mutaciones que son responsables de una mayor tolerancia al tratamiento de pre-germinación con estos herbicidas de dicetonitrilo sin causar una alteración de la actividad de la enzima.

Más recientemente, la introducción de un gen HPPD de Pseudomonas en el genoma de plástido de tabaco y soja se mostró más efectiva que la transformación nuclear, confiriendo incluso tolerancia a la aplicación post-germinación de

40 isoxaflutol (Dufourmantel et al., 2007, Plant Biotechnol J.5(1):118-33).

En la solicitud de patente WO 2009/144079, se describe una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (HPPD) en la posición 336 de la proteína de HPPD de Pseudomonas fluorescens y su uso para obtener plantas que sean tolerantes a herbicidas del inhibidor de HPPD.

En el documento WO 2002/046387, se han identificado varios dominios de las proteínas de HPPD originados de

45 plantas que pueden ser relevantes para conferir tolerancia a diversos herbicidas inhibidores de HPPD pero ni los datos in planta ni bioquímicos han estado mostrando confirmar el impacto de las funciones del dominio tal como se describen.

En el documento WO 2008/150473, la combinación de dos mecanismos distintos de tolerancia –un gen modificado de Avena sativa que codifica una enzima de HPPD mutante y una CYP450 monooxigenasa de maíz (gen nsf1)– se

50 ejemplificó a fin de obtener una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de HPPD, pero no se divulgaron datos que demuestren los efectos sinérgicos a base de la combinación de ambas proteínas.

El documento US 2010/0197503 sugiere una cantidad de mutaciones en diferentes posiciones dentro o cerca del sitio activo de la HPPD de Avena sativa y examinó alguna de ellas respecto de su inhibición por determinados inhibidores de HPPD como sulcotriona in vitro e in planta.

55 A pesar de estos éxitos obtenidos para el desarrollo de plantas que muestran tolerancia a varios herbicidas

imagen3

5 Conforme a ello, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPPD mutada, en la que dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD,

en la que en dicha proteína de HPPD mutada un aminoácido ha sido reemplazado de modo tal que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido seleccionado Ala en una posición en la proteína HPPD que

10 corresponde a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

A menos que se indique otra cosa, las definiciones específicas o características específicas de determinadas formas de realización se pueden introducir en cualquier otra forma de realización de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, un “ácido nucleico” se entiende como una secuencia de nucleótidos que puede ser del tipo ADN o ARN, con preferencia, del tipo ADN y en particular bicatenario, ya sea de origen natural o de origen sintético,

15 en particular una secuencia de ADN en la que los codones que codifican la HPPD de acuerdo con la invención se han optimizado de acuerdo con el organismo huésped en el que se ha de expresar (por ejemplo, sustituyendo los codones con aquellos codones de mayor preferencia o de máxima preferencia en tablas de uso de codones de tal organismo huésped o del grupo al que dicho organismo huésped pertenece, en comparación con el organismo original o fuente).

20 Un “ácido nucleico aislado/ADN/proteína”, tal como se usa en la presente solicitud, se refiere a un ácido nucleico/ADN/proteína que no se da en la naturaleza (tal como un ADN artificial o sintético con una secuencia de nucleótidos diferentes que el ADN que se da en la naturaleza, o una proteína modificada) o que ya no está en el ambiente natural en el que estaba originalmente presente, por ejemplo una secuencia que codifica el ADN asociada con un elemento de regulación heterólogo (tal como una secuencia codificadora bacteriana operativamente ligada a

25 un promotor expresable en plantas) en un gen quimérico, un ADN transferido a otra célula huésped, tal como una célula de una planta transgénica.

La terminología relacionada con ácido nucleico o proteína “que comprende” determinada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, tal como se usa en todo el texto, se refiere a un ácido nucleico o proteína que incluye o contiene al menos la secuencia descrita, de modo que se pueda incluir otra secuencia de nucleótidos o aminoácidos 30 en el extremo 5’ (o N-terminal) y/o 3’ (o C-terminal), por ejemplo (la secuencia de nucleótidos de) una proteína marcadora seleccionable, (la secuencia de nucleótidos de) un péptido de tránsito y/o una secuencia líder 5' o una secuencia remolque 3'. De modo similar, se debe entender que el uso del término “comprender”, “que comprende” o “comprende” a lo largo de todo el texto y las reivindicaciones de esta solicitud implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número

35 entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. La expresión “que comprende” también incluye la expresión “que consiste en”.

De acuerdo con la presente invención, la expresión “proteína de HPPD mutada” que se usa indistintamente con la expresión “proteína de HPPD mutante” denota una proteína de HPPD que tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. A diferencia término “aislado” referido con anterioridad, el término “mutado” no se 40 puede referir al ambiente de la secuencia (aminoacídica o proteica) en cuestión, como aislada de su ambiente natural o acoplada a una secuencia heteróloga (aminoacídica o proteica), sino que solo se refiere a la secuencia de aminoácidos que define dicha proteína de HPPD mutada que no se puede hallar en lugar alguno de la naturaleza sino que surgió de una secuencia de aminoácidos no mutada o inicial de tipo silvestre. En otras palabras, al llegar al ácido nucleico de la presente invención que codifica una proteína de HPPD mutada, se debe tomar una secuencia

45 de aminoácidos inicial de una proteína existente de forma natural y debe ser modificada por el hombre reemplazando al menos un aminoácido según se define en la presente solicitud.

La secuencia que codifica una HPPD no mutada original que será mutada de acuerdo con la invención puede tener cualquier origen. En particular, puede ser de origen bacteriano, vegetal o animal. Los ejemplos ventajosos que se pueden citar son bacterias de tipo Pseudomonas sp., por ejemplo, Pseudomonas fluorescens, o, de otro modo, 50 cianobacterias del género Synechocystis. La secuencia también puede ser de origen vegetal, en particular derivada de plantas dicotiledóneas, plantas umbelíferas o, si no, plantas monocotiledóneas. Los ejemplos ventajosos que se pueden citar son plantas tales como tabaco, Arabidopsis, Daucus carotta, Zea mays (maíz), trigo, cebada, Avena sativa, trigo, Brachiaria platyphylla, Cenchrus echinatus, Lolium rigidum, Festuca arundinacea, Setaria faberi, Eleusine indica y Sorghum. Las secuencias codificantes y el modo de aislarlas y clonarlas, se describen en las 55 referencias previamente citadas. En una forma de realización particular de la invención, la HPPD es de origen bacteriano, en particular de Pseudomonas sp., más en particular de Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus sp., Blepharisma japonicum, Synechococcus sp., Picrophilus torridus, Kordia algicida o de un origen vegetal, en particular de Arabidopsis thaliana o Avena sativa. La HPPD para preparar la(s) mutación/mutaciones para los fines de la invención puede ser cualquier HPPD natural o cualquiera de sus fragmentos activos o cualquiera de sus 60 variantes en los que algunos aminoácidos (1 a 10 aminoácidos) se han reemplazado, añadido o suprimido para fines La proteína de HPPD mutada de acuerdo con la presente invención tiene actividad de HPPD, es decir, tal como se describió con anterioridad, cataliza la reacción en la que el para-hidroxifenilpiruvato se transforma en homogentisato. 5 Con preferencia, la actividad catalítica de la HPPD mutada aislada de la presente invención, cuando se ensaya in vitro, no difiere de la de la proteína de HPPD de referencia no mutada en más del 70 %, con preferencia, más del 50 %, con mayor preferencia, más del 30 %, incluso con mayor preferencia, más del 20 % cuando se ensaya en idénticas condiciones y en ausencia de los herbicidas inhibidores de HPPD descritos con anterioridad. La actividad catalítica de una enzima de HPPD se puede definir por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. El

imagen4

10 documento WO 2009/144079 describe diversos procedimientos de cribado apropiados.

Las cribas iniciales se pueden llevar a cabo con el ácido nucleico que codifica la proteína de HPPD mutada de la invención que se expresa en las bacterias.

Ensayo de cribado colorimétrico para enzimas de HPPD activas:

Un medio de cultivo de tipo caldo de YT con agarosa al 1 %, L-tirosina 5 mM y succinato 42 mM, que contiene el

15 agente de selección para el vector pSE420 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se vierte en placas de pocillos profundos. El cultivo de E. coli en la fase de crecimiento exponencial que contiene el vector pSE420-HPPDx (HPPDx implica cualquier gen que codifica una enzima/proteína de HPPD teórica) se aplica a cada pocillo. Después de 16 horas a 37 °C, los pocillos que no contienen el medio de cultivo, aquellos que se sembraron con un cultivo de E. coli con el vector pSE420 vacío son transparentes, aquellos que se sembraron con un cultivo de E. coli conteniendo

20 un vector pSE420-HPPDx que contiene un gen que codifica una HPPD inactiva son transparentes, si bien los pocillos sembradas con un cultivo de E. coli con el vector pSE420-HPPDx que codifica una HPPD activa son marrones. Previamente se demostró que este ensayo refleja la actividad de HPPD, no importa cuál sea el origen de esta actividad y permite la identificación de las actividades de HPPD (documento US 6.768.044), es decir, a un nivel cualitativo.

25 Se pueden llevar a cabo otros cribados y más elaborados en células vegetales o plantas que expresan la proteína de HPPD mutada de la invención.

Los mismos cribados también se pueden usar cuando se examina si una proteína de HPPD mutada es capaz de modular,tal como reducir o aumentar, la tolerancia de una planta a al menos un inhibidor de herbicida de HPPD que se mencionará luego más adelante, con la diferencia de que al menos uno de tales inhibidores de HPPD se añade. 30 Los ejemplos de inhibidores de HPPD para usar en aquellos cribados incluyen tembotriona, mesotriona, pirasulfotol, biciclopirona, topramezona y sulcotriona. Un procedimiento de cribado que es simple de implementar consiste en determinar la dosis de inhibidor de HPPD que inhibe completamente la HPPD no mutada original y que es letal para las células que expresan esta HPPD no mutada y someter las células mutadas a esta dosis predeterminada y después de ello, aislar las células mutadas que han resistido esta dosis letal y luego aislar y clonar el gen que

35 codifica la HPPD mutada.

De modo alternativo, a nivel cuantitativo como pI50 (el valor pI50 implica el valor log de la concentración de inhibidor necesario para inhibir el 50 % de la actividad enzimática en concentración molar) se pueden obtener datos empleando el polipéptido de HPPD aislado y purificado, es decir, el polipéptido de HPPD mutado frente al no mutado y en presencia o ausencia de cualquier herbicida inhibidor de HPPD respectivo.

40 Los términos “tolerancia”, “tolerante” o “menos sensible” denota la falta de susceptibilidad de una planta que expresa la proteína de HPPD mutada de la presente invención a sustancias, en particular herbicidas, que inhiben las proteínas de HPPD, opcionalmente en comparación con la proteína de HPPD propia de la planta o con cualquier proteína conocida de HPPD. Más específicamente, dichos términos significan los niveles relativos de tolerancia inherente de la HPPD cribada de acuerdo con un fenotipo indicador visible de la cepa o la planta transformada con

45 un ácido nucleico que comprende el gen que codifica la respectiva proteína de HPPD en presencia de diferentes concentraciones de los diversos inhibidores de HPPD. Las respuestas a las dosis y los desplazamientos relativos en las respuestas a las dosis asociadas con estos fenotipos indicadores (formación de color marrón, inhibición del crecimiento, blanqueo, efecto herbicida, etc.) se expresan de modo conveniente en términos, por ejemplo, de valores de GR50 (concentración del 50 % de reducción del crecimiento) o de MIC (concentración inhibidora mínima) donde

50 los aumentos en valores corresponden a aumentos en la tolerancia inherente de la HPPD expresada, de la manera normal basada en el daño de plantas, síntomas de blanqueo meristemático, etc. en un rango de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos se pueden expresar en términos de, por ejemplo, valores de GR50 derivados de curvas de dosis/respuesta que tienen la “dosis” representada en el eje x y “muerte en porcentaje”, “efecto herbicida”, “números de plantas verdes que germinan”, etc., representados en el eje y donde valores de

55 GR50 aumentados corresponden a niveles aumentados de tolerancia inherente de la HPPD expresada. Los herbicidas se pueden aplicar apropiadamente pre-germinación o post-germinación.

Del mismo modo, el nivel de tolerancia del ácido nucleico o gen que codifica una proteína de HPPD de acuerdo con la invención, o la proteína de HPPD mutada de la invención se somete a criba por medio de ensayos de transgénesis, regeneración, cruza y pulverización de una planta de ensayo tal como tabaco, o de una planta de cultivo tal como soja o algodón. En línea con los resultados obtenidos por tal criba, tales plantas son al menos 2-4 veces más tolerantes a los inhibidores de HPPD como tembotriona, mesotriona, dicetonitrilo y/o biciclopirona, pirasulfotol, que las plantas que no contienen ningún gen exógeno que codifique una proteína de HPPD, o que

imagen5

5 plantas que contienen un gen que comprende un ADN que codifica HPPD de Arabidopsis thaliana, sometido al control del mismo promotor que el ácido nucleico que codifica la proteína de HPPD mutada de la invención. Conforme a ello, la expresión “capaz de aumentar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD” denota una tolerancia incrementada en una planta en al menos el factor de 2, alternativamente al menos el factor de 3 o 4 o incluso 5 o 6 en comparación con una planta que solo expresa su HPPD endógena o una planta que expresa una HPPD de Arabidopsis thaliana. En este sentido, la expresión “herbicida que actúa sobre HPPD” no está limitada a sustancias que se conocen y/o que se usan como herbicidas sino a cualquier sustancia que inhibe la actividad catalítica de las proteínas de HPPD.

En una forma de realización alternativa del ácido nucleico que codifica un polipéptido de HPPD mutado que comprende al menos una de las mutaciones definidas con anterioridad, la proteína de HPPD comprende

15 a) una His en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 226 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

b) una Ser en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 267 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

c) una Asn en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 282 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

d) una His en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 308 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

e) una Tyr en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 342 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

25 f) un Glu en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 394 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

g) una Gly en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 420 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2; y

h) una Asn en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 423 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

En la proteína de HPPD mutada codificada por el ácido nucleico de la invención se ha modificado o reemplazado al menos un aminoácido según se define con anterioridad.

La sustitución o la deleción se pueden realizar en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la HPPD no mutada original, es decir que se da en la naturaleza, según se define con anterioridad por cualquier medio que sea

35 apropiado para sustituir, en dicha secuencia, el codón que codifica el aminoácido para sustituir con el codón que corresponde al aminoácido que se ha de sustituir o por deleción de un codón, con dichos codones describiéndose ampliamente en la bibliografía y conociéndose bien por el experto en la técnica.

Se pueden usar varios procedimientos biológicos moleculares para lograr esta sustitución o deleción. Un procedimiento preferido para preparar una secuencia de ácidos nucleicos mutados de acuerdo con la invención y la correspondiente proteína comprende llevar a cabo mutagénesis dirigida a sitio sobre codones que codifican uno o más aminoácidos que se seleccionan de antemano. Los procedimientos para obtener estas mutaciones dirigidas a sitio se conocen bien por el experto en la técnica y se describen ampliamente en la bibliografía (en particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, editado por M. J. McPHERSON, IRL PRESS), o son procedimientos para los que es posible emplear kits comerciales (por ejemplo, el kit de mutagénesis U. S. E. de

45 PHARMACIA). Después de la mutagénesis dirigida a sitio, es de utilidad seleccionar las células que contienen una HPPD mutada que es menos sensible a un inhibidor de HPPD usando una ayuda de cribado apropiada. Los procedimientos de cribado apropiados para lograr esto se han descrito con anterioridad.

De acuerdo con la presente invención, la expresión “dicha posición corresponde a la posición X”, siendo X cualquier número hallado en el respectivo contexto en la presente solicitud, no solo incluye la respectiva posición en la SEC ID N.º mencionada luego sino que también incluye cualquier secuencia que codifica una proteína de HPPD, donde, después de la alineación con la SEC ID N.º de referencia, la respectiva posición puede tener un número diferente pero corresponde al indicado para la SEC ID N.º de referencia. Si bien las secuencias de HPPD pueden ser muy diversas y solo pueden mostrar una baja identidad de secuencia de aproximadamente el 30 %, las proteínas de HPPD se caracterizan por una estructura de consenso tridimensional común que se logra a pesar de una baja 55 identidad de secuencia. Debido a las posiciones específicas que se conservan dentro de las proteínas de HPPD, la

imagen6

Los procedimientos de alineación de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos y conforme a ello, la determinación de la identidad de secuencia de dos o más secuencias, se conocen bien en la técnica. Incluyen

5 realizar algoritmos matemáticos tales como el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17 o el algoritmo de alineación local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 872264 y el de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)).

Estos algoritmos se pueden implementar en programas de ordenador incluyendo pero sin limitación CLUSTALX, 10 ALIGN, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTDB y FASTA.

Por ejemplo, cuando se usa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se fijan, por supuesto, de modo tal que el porcentaje de identidad se calcule

15 en toda la longitud de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permitan brechas en homología de hasta el 5 % de la cantidad total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

La identidad entre una primera secuencia y una segunda secuencia, también mencionada como una alineación de secuencias global, se determina usando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). En una alineación de secuencias la consulta y las secuencias objetivo son 20 ambas secuencias de ADN. El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz = Unitaria, k-tuple = 4, Penalización por Apare3amiento Incorrecto = 1, Penalización por Unión = 30, Longitud Grupo de Distribución Aleatoria = 0, Puntuación Límite = 1, Penalización de las Brechas = 5, Penalización del Tamaño de las Brechas 0,05, Tamaño de Ventana = 500 o la longitud de la secuencia de

25 nucleótidos objetivo, que es más corta.

La presente invención se basa en los resultados de una combinación de una comparación de las secuencias de aminoácidos de proteínas de HPPD de diversos organismos y el análisis de la unión de sustrato y del sitio de unión del inhibidor de proteínas de HPPD seleccionadas, usando cristalografía por rayos X. Usado este enfoque combinado, era posible determinar las posiciones clave en las proteínas de HPPD, donde un aminoácido se puede

30 sustituir con uno de un grupo definido de otros aminoácidos a fin de modular la actividad catalítica de HPPD y la afinidad por al menos un inhibidor herbicida de HPPD con una planta que expresa la proteína de HPPD mutada.

La superposición de la estructura 3D de HPPD de Arabidopsis thaliana (1TFZ) (Yang et al., 2004, Biochemistry 43, 10414-10423) con las estructuras 3D de HPPD de otras especies tales como Pseudomonas fluorescens (1CJX) (Serre et al., 1999, Structure Fold Des. 7, 977-988), Streptomyces avermitilis (1T47) (Brownlee et al., 2004, 35 Biochemistry 43, 6370-6377), Homo sapiens (3ISQ) (PDB ID: 3isq Pilka et al., Structural Genomics Consortium (SGC). Crystal structure of human 4-Hydroxyfenilpiruvato dioxygenase), Rattus norvegicus (1SQI) (Yang et al., 2004, Biochemistry 43, 10414-10423) muestra que tienen el mismo plegado y los aminoácidos correspondientes están en una posición equivalente en la estructura 3D de la proteína. Como las especies con estructuras 3D conocidas son muy diversas en su secuencia de aminoácidos, se puede asumir que todas las secuencias de HPPD tienen el mismo 40 plegado básico a pesar de que la identidad de secuencia general es baja. La secuencia y la estructura 3D de Arabidopsis thaliana se ha usado como estructura de referencia en la presente invención. La Figura 1 muestra la superposición de la estructura de HPPD de A. thaliana con la estructura de (a) Pseudomonas fluorescens, (b) Streptomyces avermitilis, (c) Homo sapiens y (d) Rattus norvegicus. A fin de definir el sitio de unión del sustrato y/o inhibidores, se seleccionaron los aminoácidos que desempeñan un papel en la catálisis o unión del inhibidor. Esto 45 incluye aminoácidos en el sitio activo y aminoácidos de la hélice C-terminal. La disposición 3D se muestra en la Figura 2 que muestra los aminoácidos definidos como sitio de unión en el caso de (a) Arabidopsis thaliana, (b) Pseudomonas fluorescens, (c) Streptomyces avermitilis, (d) Homo sapiens y (e) Rattus norvegicus. La numeración de los aminoácidos de la estructura de Pseudomonas fluorescens (1cjx) se cambió a la numeración de acuerdo con la SEC ID N.º: 10. Los 36 aminoácidos que definen el sitio de unión incluyendo su posición se enumeran en la Tabla

50 1 para (a) Arabidopsis thaliana, (b) Pseudomonas fluorescens, (c) Streptomyces avermitilis, (d) Homo sapiens y (e) Rattus norvegicus.

Tabla 1: aminoácidos que forman el sitio de unión en A. thaliana, P. fluorescens, S. avermitilis, H. sapiens, R. norvegicus

Arabidopsis thaliana: Pseudomonas fluorescens Streptomyces avermitilis Homo sapiens Rattus norvegicus

Posición Aminoácido
Posición Aminoácido
Posición Aminoácido
Posición Aminoácido
Posición Aminoácido

imagen7

226 H 228 V 248 H: 162 H 164 T 186 R 187 H 189 V 211 T 183 H 185 V 207 H 183 H 185 V 207 H

250 F 251 A 252 E 253 F 265 L 267 S 268 A 269 V 270 L 271 A 280 P 282 N 293 Q 294 I 307 Q 308 H 335 M 342 Y 368 L: 188 A 189 R 190 Y 191 F 200 L 202 S 203 K 204 A 205 M 206 S 215 P 217 N 226 Q 227 I 240 Q 241 H 264 M 271 Y 295 L 213 M 214 K 215 E 216 F 228 L 230 S 231 K 232 V 233 V 234 A 243 P 245 N 255 Q 256 I 269 Q 270 H 293 L 299 Y 323 L 209 F 210 W 211 S 212 V 224 L 226 S 227 I 228 V 229 V 230 A 239 P 241 N 251 Q 252 I 265 Q 266 H 289 L 295 Y 323 L 209 F 210 W 211 S 212 V 224 L 226 S 227 I 228 V 229 V 230 A 239 P 241 N 251 Q 252 I 265 Q 266 H 289 L 295 Y 323 L

379 Q 381 F 392 F 394 E 419 F 420 G 421 K 422 G 423 N 424 F 425 S 426 E 427 L: 310 Q 312 F 321 F 323 E 333 F 334 G 335 E 336 G 337 N 338 F 339 K 340 A 341 L 334 Q 336 F 347 F 349 E 359 F 360 G 361 K 362 G 363 N 364 F 365 K 366 A 367 L 334 Q 336 F 347 F 349 E 359 F 360 G 361 A 362 G 363 N 364 F 365 N 366 S 367 L 334 Q 336 F 347 F 349 E 359 F 360 G 361 A 362 G 363 N 364 F 365 N 366 S 367 L

431 I: 345 I 371 I 371 F 371 F

Una alineación de ejemplo de las proteínas de HPPD se da en la Tabla 2a para las proteínas de HPPD con estructuras 3D conocidas. La Tabla 2a da la numeración de los aminoácidos de la secuencia de Arabidopsis y también los aminoácidos que son comunes dentro de estas secuencias de HPPD, designando estos aminoácidos con un asterisco. Sobre la base de tal alineación y a partir de la definición del aminoácido de Arabidopsis por su posición y su naturaleza, es fácil identificar la posición del correspondiente aminoácido en otra secuencia de HPPD. La Figura 2 muestra que esto se puede llevar a cabo con la alineación de las secuencias de diferente origen vegetal, mamífero y bacteriano, lo que demuestra que este procedimiento de alineación, que es bien conocido por el experto en la técnica, puede ser generalizado a cualquier otra secuencia. Una alineación de diferentes secuencias de HPPD

imagen8

Tabla 2a: alineación de secuencias de HPPD con estructuras cristalinas conocidas, es decir, A. thaliana, P. fluorescens, S. avermitilis, H. sapiens, R. norvegicus

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

A. thaliana: P. fluorescens S. avermitilis H. sapiens R. norvegicus aminoácido

1: M - - -

2: G - - -

3: H - - -

4: Q - - -

5: N - - -

6: A - - -

7: A - - -

8: V - - -

9: S - - -

10: E - - -

11: N - - -

12: Q - - -

13: N - - -

14: H - 1 M -

15: D - 2 T -

16: D - 3 Q -

17: G - 4 T -

18: A - 5 T -

19: A - 6 H 8 G 8 G

20: S - 7 H 9 A 9 P

21: S - 8 T 10 K 10 K

22: P - 9 P 11 P 11 P

23: G - - -

24: F - - -

25: K - - -

26: L - - -

27: V - - -

28: G - - -

29: F - - -

30: S - - -

31: K - - -

32: F - - -

33: V - - -

34: R - 10 D 12 E 12 E

35: K 2 A 11 T 13 R 13 R

36: N 3 D 12 A 14 G 14 G

37: P 4 L 13 R 15 R 15 R

38: K 5 Y 14 Q 16 F 16 F

39: S 6 E 15 A 17 L 17 L

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

40: D 7 N 16 D 18 H 18 H

41: K 8 P 17 P -

42: F 9 M 18 F -

43: K 10 G 19 P -

44: V 11 L 20 V -

45: K 12 M 21 K -

46: R 13 G 22 G -

47: F 14 F 23 M 19 F 19 F

48: H 15 E 24 D 20 H 20 H

49: H 16 F 25 A 21 S 21 S

50: I 17 I 26 V 22 V 22 V

51: E 18 E 27 V 23 T 23 T

52: F 19 F 28 F 24 F 24 F x

53: W 20 A 29 A 25 W 25 W

54: C 21 S 30 V 26 V 26 V

55: G 22 P 31 G 27 G 27 G

56: D 23 T 32 N 28 N 28 N

57: A 24 P 33 A 29 A 29 A

58: T 25 G 34 K 30 K 30 K

59: N 26 T 35 Q 31 Q 31 Q

60: V 27 L 36 A 32 A 32 A

61: A 28 E 37 A 33 A 33 A

62: R 29 P 38 H 34 S 34 S

63: R 30 I 39 Y 35 F 35 F

64: F 31 F 40 Y 36 Y 36 Y

65: S 32 E 41 S 37 C 37 C

66: W 33 I 42 T 38 S 38 N

67: G 34 M 43 A 39 K 39 K

68: L 35 G 44 F 40 M 40 M

69: G 36 F 45 G 41 G 41 G

70: M 37 T 46 M 42 F 42 F

71: R 38 K 47 Q 43 E 43 E

72: F 39 V 48 L 44 P 44 P

73: S 40 A 49 V 45 L 45 L

74: A 41 T 50 A 46 A 46 A

75: K 42 H 51 Y 47 Y 47 Y

76: S 43 R 52 S 48 R 48 K

77: D 44 S 53 G 49 G 49 G

78: L 45 K 54 P 50 L 50 L

79: S 46 N 55 E 51 E 51 E

80: T - 56 N 52 T 52 T

81: G - 57 G 53 G 53 G

imagen9

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

82: N - 58 S 54 S 54 S

83: M - 59 R 55 R 55 R

84: V - 60 E 56 E 56 E

85: H - 61 T 57 V 57 V

86: A - 62 A 58 V 58 V

87: S 47 V 63 S 59 S 59 S

88: Y 48 H 64 Y 60 H 60 H

89: L 49 L 65 V 61 V 61 V

90: L 50 Y 66 L 62 I 62 I

91: T 51 R 67 T 63 K 63 K

92: S 52 Q 68 N 64 Q 64 Q

93: G 53 G 69 G 65 G 65 G X

94: D 54 E 70 S 66 K 66 K

95: L 55 I 71 A 67 I 67 I

96: R 56 N 72 R 68 V 68 V

97: F 57 L 73 F 69 F 69 F

98: L 58 I 74 V 70 V 70 V

99: F 59 L 75 L 71 L 71 L

100: T 60 N 76 T 72 S 72 C

101: A 61 N 77 S 73 S 73 S

102: P 62 E 78 V 74 A 74 A

103: Y 63 P 79 I 75 L 75 L

104: S 64 N 80 K 76 N 76 N

105: P 65 S 81 P -

106: S 66 I 82 A -

107: L 67 A 83 T -

108: S 68 S 84 P 77 P 77 P

109: A - 85 W 78 W 78 W

110: G - 86 G 79 N 79 N

111: E - 87 H 80 K 80 K

112: I - 88 F 81 E 81 E

113: K - 89 L 82 M 82 M

114: P - 90 A 83 G 83 G

115: T - - -

116: T - - -

117: T - - -

118: A - - -

119: S - - -

120: I - - -

121: P - - -

122: S - - -

123: F - - -

imagen10

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

124: D - - -

125: H - - -

126: G - - -

127: S - - -

128: C - - -

129: R - - -

130: S 69 Y 91 D 84 D 84 D

131: F 70 F 92 H 85 H 85 H

132: F 71 A 93 V 86 L 86 L

133: S 72 A 94 A 87 V 87 V

134: S 73 E 95 E 88 K 88 K

135: H 74 H 96 H 89 H 89 H X

136: G 75 G 97 G 90 G 90 G X

137: L 76 P 98 D 91 D 91 D

138: G 77 S 99 G 92 G 92 G

139: V 78 V 100 V 93 V 93 V X

140: R 79 C 101 V 94 K 94 K

141: A 80 G 102 D 95 D 95 D

142: V 81 M 103 L 96 I 96 I

143: A 82 A 104 A 97 A 97 A X

144: I 83 F 105 I 98 F 98 F

145: E 84 R 106 E 99 E 99 E

146: V 85 V 107 V 100 V 100 V X

147: E 86 K 108 P 101 E 101 E

148: D 87 D 109 D 102 D 102 D X

149: A 88 S 110 A 103 C 103 C

150: E 89 Q 111 R 104 D 104 E

151: S 90 K 112 A 105 Y 105 H

152: A 91 A 113 A 106 I 106 I

153: F 92 Y 114 H 107 V 107 V

154: S 93 N 115 A 108 Q 108 Q

155: I 94 R 116 Y 109 K 109 K

156: S 95 A 117 A 110 A 110 A

157: V 96 L 118 I 111 R 111 R

158: A 97 E 119 E 112 E 112 E

159: N 98 L 120 H 113 R 113 R

160: G 99 G 121 G 114 G 114 G X

161: A 100 A 122 A 115 A 115 A

162: I 101 Q 123 R 116 K 116 K

163: P - 124 S 117 I 117 I

164: S - 125 V 118 M 118 V

165: S - 126 A 119 R 119 R

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

166: P - 127 E 120 E 120 E

167: P 102 P 128 P 121 P 121 P X

168: I 103 I 129 Y 122 W 122 W

169: V 104 H 130 E 123 V 123 V

170: L 105 I 131 L 124 E 124 E

171: N 106 D 132 K 125 Q 125 E

172: E 107 T 133 D 126 D 126 D

173: A 108 G 134 E 127 K 127 K

174: V 109 P 135 H 128 F 128 F

175: T 110 M 136 G 129 G 129 G

176: I 111 E 137 T 130 K 130 K

177: A 112 L 138 V 131 V 131 V

178: E 113 N 139 V 132 K 132 K

179: V 114 L 140 L 133 F 133 F

180: K 115 P 141 A 134 A 134 A

181: L 116 A 142 A 135 V 135 V

182: Y 117 I 143 I 136 L 136 L

183: G 118 K 144 A 137 Q 137 Q

184: D 119 G 145 T 138 T 138 T

185: V 120 I 146 Y 139 Y 139 Y

186: V 121 G 147 G 140 G 140 G

187: L 122 G 148 K 141 D 141 D

188: R 123 A 149 T 142 T 142 T

189: Y 124 P 150 R 143 T 143 T

190: V 125 L 151 H 144 H 144 H

191: S 126 Y 152 T 145 T 145 T

192: Y 127 L 153 L 146 L 146 L

193: K 128 I 154 V 147 V 147 V

194: A 129 D 155 D 148 E 148 E

195: E 130 R 156 R 149 K 149 K

196: D 131 F 157 T 150 M 150 I

197: T 132 G 158 G 151 N 151 N

198: E 133 E 159 Y 152 Y 152 Y

-: 134 G
-
-

199: K 135 S 160 D 153 I 153 T

200: S 136 S 161 G 154 G 154 G

201: E 137 I 162 P 155 Q 155 R

202: F 138 Y 163 Y 156 F 156 F

203: L 139 D 164 L 157 L 157 L

204: P 140 I 165 P 158 P 158 P

205: G 141 D 166 G 159 G 159 G

206: F 142 F 167 Y 160 Y 160 F

imagen11

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

207: E 143 V 168 V 161 E 161 E

208: R 144 Y 169 A 162 A 162 A

209: V 145 L 170 A 163 P 163 P

210: E 146 E 171 A 164 A 164 T

211: D 147 G - 165 F 165 Y

-
-
-: 166 M 166 K

-
-
-: 167 D 167 D

-
-: 172 P 168 P 168 T

212: A 148 V 173 I 169 L 169 L

213: S 149 E 174 V 170 L 170 L

214: S 150 R 175 E 171 P 171 P

215: F 151 N 176 P 172 K 172 K

216: P 152 P 177 P 173 L 173 L

217: L 153 V 178 A 174 P 174 P

218: D 154 G 179 H 175 K 175 S

219: Y 155 A 180 R 176 C 176 C

220: G 156 G 181 T 177 S 177 N

221: I 157 L 182 F 178 L 178 L

222: R 158 K 183 Q 179 E 179 E

223: R 159 V 184 A 180 M 180 I

224: L 160 I 185 I 181 I 181 I

225: D 161 D 186 D 182 D 182 D x

226: H 162 H 187 H 183 H 183 H x

227: A 163 L 188 C 184 I 184 I

228: V 164 T 189 V 185 V 185 V

229: G 165 H 190 G 186 G 186 G

230: N 166 N 191 N 187 N 187 N x

231: V 167 V 192 V 188 Q 188 Q

232: P 168 Y 193 E 189 P 189 P

-: 169 R 194 L 190 D 190 D

-: 170 G 195 G 191 Q 191 Q

233: E 171 R 196 R 192 E 192 E

234: L 172 M 197 M 193 M 193 M

235: G 173 V 198 N 194 V 194 E

236: P 174 Y 199 E 195 S 195 S

237: A 175 W 200 W 196 A 196 A

238: L 176 A 201 V 197 S 197 S

239: T 177 N 202 G 198 E 198 E

240: Y 178 F 203 F 199 W 199 W

241: V 179 Y 204 Y 200 Y 200 Y

242: A 180 E 205 N 201 L 201 L

243: G 181 K 206 K 202 K 202 K

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

244: F 182 L 207 V 203 N 203 N

245: T 183 F 208 M 204 L 204 L

246: G 184 N 209 G 205 Q 205 Q

247: F 185 F 210 F 206 F 206 F x

248: H 186 R 211 T 207 H 207 H

249: Q 187 E 212 N 208 R 208 R

250: F 188 A 213 M 209 F 209 F

251: A 189 R 214 K 210 W 210 W

252: E 190 Y 215 E 211 S 211 S

253: F 191 F 216 F 212 V 212 V

254: T 192 D 217 V 213 D 213 D

255: A 193 I 218 G 214 D 214 D

256: D 194 K 219 D 215 T 215 T

257: D 195 G 220 D 216 Q 216 Q

258: V 196 E 221 I 217 V 217 V

259: G - 222 A 218 H 218 H

260: T - 223 T 219 T 219 T

261: A - 224 E 220 E 220 E

262: E 197 Y 225 Y 221 Y 221 Y

263: S 198 T 226 S 222 S 222 S

264: G 199 G 227 A 223 S 223 S

265: L 200 L 228 L 224 L 224 L x

266: N 201 T 229 M 225 R 225 R

267: S 202 S 230 S 226 S 226 S x

268: A 203 K 231 K 227 I 227 I

269: V 204 A 232 V 228 V 228 V

270: L 205 M 233 V 229 V 229 V

271: A 206 S 234 A 230 A 230 A x

272: S 207 A 235 D 231 N 231 N

273: N 208 P 236 G 232 Y 232 Y

274: D 209 D 237 T 233 E 233 E

275: E 210 G 238 L 234 E 234 E

276: M 211 M 239 K 235 S 235 S

277: V 212 I 240 V 236 I 236 I

278: L 213 R 241 K 237 K 237 K

279: L 214 I 242 F 238 M 238 M

280: P 215 P 243 P 239 P 239 P x

281: I 216 L 244 I 240 I 240 I

282: N 217 N 245 N 241 N 241 N x

283: E 218 E 246 E 242 E 242 E x

284: P 219 E 247 P 243 P 243 P

285: V 220 S 248 A 244 A 244 A

imagen12

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

286: H - 249 L 245 P 245 P

287: G - 250 A 246 G 246 G

288: T 221 S 251 K 247 K 247 R

289: K 222 K 252 K 248 K 248 K x

290: R 223 G - -

291: K 224 A 253 K 249 K 249 K

292: S 225 G 254 S 250 S 250 S

293: Q 226 Q 255 Q 251 Q 251 Q x

294: I 227 I 256 I 252 I 252 I x

295: Q 228 E 257 D 253 Q 253 Q

296: T 229 E 258 E 254 E 254 E

297: Y 230 F 259 Y 255 Y 255 Y

298: L 231 L 260 L 256 V 256 V

299: E 232 M 261 E 257 D 257 D

300: H 233 Q 262 F 258 Y 258 Y

301: N 234 F 263 Y 259 N 259 N

302: E 235 N 264 G 260 G 260 G

303: G 236 G 265 G 261 G 261 G x

304: A 237 E 266 A 262 A 262 A

305: G 238 G 267 G 263 G 263 G x

306: L 239 I 268 V 264 V 264 V

307: Q 240 Q 269 Q 265 Q 265 Q x

308: H 241 H 270 H 266 H 266 H x

309: L 242 V 271 I 267 I 267 I

310: A 243 A 272 A 268 A 268 A x

311: L 244 F 273 L 269 L 269 L

312: M 245 L 274 N 270 K 270 R

313: S 246 T 275 T 271 T 271 T

314: E 247 D 276 G 272 E 272 E

315: D 248 D 277 D 273 D 273 D x

316: I 249 L 278 I 274 I 274 I

317: F 250 V 279 V 275 I 275 I

318: R 251 K 280 E 276 T 276 T

319: T 252 T 281 T 277 A 277 T

320: L 253 W 282 V 278 I 278 I

321: R 254 D 283 R 279 R 279 R

322: E 255 A 284 T 280 H 280 H

323: M 256 L 285 M 281 L 281 L

324: R 257 K 286 R 282 R 282 R

325: K 258 K 287 A 283 E 283 E

326: R 259 I 288 A 284 R 284 R

327: S - - -

imagen13

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

328: S - - -

329: I - - -

330: G - - -

331: G 260 G 289 G 285 G 285 G x

332: F 261 M 290 V 286 L 286 M

333: D 262 R 291 Q 287 E 287 E

334: F 263 F 292 F 288 F 288 F x

335: M 264 M 293 L 289 L 289 L

336: P 265 T 294 D 290 S 290 A

337: S 266 A 295 T 291 V 291 V

338: P 267 P 296 P 292 P 292 P x

339: P 268 P - -

340: P 269 D 297 D 293 S 293 S

341: T 270 T 298 S 294 T 294 S

342: Y 271 Y 299 Y 295 Y 295 Y x

343: Y 272 Y 300 Y 296 Y 296 Y x

344: Q 273 E 301 D 297 K 297 R

345: N 274 M 302 T 298 Q 298 L

346: L 275 L 303 L 299 L 299 L x

347: K 276 E 304 G 300 R 300 R

348: K 277 G 305 E 301 E 301 E

349: R 278 R 306 W 302 K 302 N

350: V 279 L 307 V 303 L 303 L

351: G 280 P 308 G 304 K 304 K

352: D 281 D 309 D 305 T 305 T

353: V 282 H 310 T 306 A 306 S

354: L 283 G 311 R 307 K 307 K

355: S 284 E 312 V 308 I 308 I

356: D 285 P 313 P 309 K 309 Q

357: D 286 V 314 V 310 V 310 V

358: Q 287 D - 311 K 311 K

-: 288 Q - 312 E 312 E

-: 289 L - 313 N 313 N

359: I 290 Q - 314 I 314 M

360: K 291 A 315 D 315 D 315 D

361: E 292 R 316 T 316 A 316 V

362: C 293 G 317 L 317 L 317 L

363: E 294 I 318 R 318 E 318 E

364: E 295 L 319 E 319 E 319 E

365: L 296 L 320 L 320 L 320 L x

366: G 297 D 321 K 321 K 321 K

367: I 298 G 322 I 322 I 322 I

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

368: L 299 S 323 L 323 L 323 L

369: V 300 S 324 A 324 V 324 V

370: D 301 V 325 D 325 D 325 D

371: R 302 E 326 R 326 Y 326 Y

372: D 303 G 327 D 327 D 327 D

373: D 304 D 328 E 328 E 328 E

374: Q 305 K 329 D 329 K 329 K

375: G 306 R 330 G 330 G 330 G

376: T 307 L 331 Y 331 Y 331 Y

377: L 308 L 332 L 332 L 332 L x

378: L 309 L 333 L 333 L 333 L x

379: Q 310 Q 334 Q 334 Q 334 Q x

380: I 311 I 335 I 335 I 335 I x

381: F 312 F 336 F 336 F 336 F x

382: T 313 S 337 T 337 T 337 T

383: K 314 E 338 K 338 K 338 K

384: P 315 T 339 P 339 P 339 P

385: L 316 L 340 V 340 V 340 M

386: G 317 M 341 Q 341 Q 341 Q

387: D 318 G 342 D 342 D 342 D

388: R - 343 R 343 R 343 R

389: P - 344 P 344 P 344 P

390: T 319 P 345 T 345 T 345 T

391: I 320 V 346 V 346 L 346 L

392: F 321 F 347 F 347 F 347 F x

393: I 322 F 348 F 348 L 348 L

394: E 323 E 349 E 349 E 349 E x

395: I 324 F 350 I 350 V 350 V

396: I 325 I 351 I 351 I 351 I x

397: Q 326 Q 352 E 352 Q 352 Q

398: R 327 R 353 R 353 R 353 R x

399: V 328 K 354 H 354 H 354 H

400: G - - -

401: C - - -

402: M - - -

403: M - - -

404: K - - -

405: D - - -

406: E - - -

407: E - - -

408: G - - -

409: K - - -

imagen14

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

410: A - - -

411: Y - - -

412: Q - - -

413: S - - -

414: G - - -

415: G 329 G 355 G 355 N 355 N

416: C 330 D 356 S 356 H 356 H

417: G 331 D 357 M 357 Q 357 Q

418: G 332 G 358 G 358 G 358 G x

419: F 333 F 359 F 359 F 359 F x

420: G 334 G 360 G 360 G 360 G x

421: K 335 E 361 K 361 A 361 A

422: G 336 G 362 G 362 G 362 G x

423: N 337 N 363 N 363 N 363 N x

424: F 338 F 364 F 364 F 364 F x

425: S 339 K 365 K 365 N 365 N

426: E 340 A 366 A 366 S 366 S

427: L 341 L 367 L 367 L 367 L x

428: F 342 F 368 F 368 F 368 F x

429: K 343 E 369 E 369 K 369 K

430: S 344 S 370 A 370 A 370 A

431: I 345 I 371 I 371 F 371 F

432: E 346 E 372 E 372 E 372 E x

433: E 347 R 373 R 373 E 373 E

434: Y 348 D 374 E 374 E 374 E

435: E 349 Q 375 Q 375 Q 375 Q

436: K 350 V 376 E 376 N 376 A

437: T 351 R 377 K 377 L 377 L

438: L 352 R 378 R 378 R 378 R

439: E 353 G 379 G 379 G 379 G

440: A 354 V 380 N 380 N 380 N

441: K 355 L 381 L 381 L 381 L

442: Q 356 A 382 T 382 T

443: L 357 T 383 N 383 D

444: V 358 D 384 M 384 L

445: G 385 E 385 E

386: T 386 T

387: N 387 N

388: G 388 G

389: V 389 V

390: V 390 R

391: P 391 S

imagen15

Pos.: 1TFZ Pos. 1CJX Pos. 1T47 Pos. 3ISQ Pos. 1SQI Común

392: G 392 G

393: M 393 M

394: A
394

395: E
395

396: N
396

397: L
397

398: Y
398

399: F
399

400: Q
400

Un análisis de secuencia de más de 700 secuencias de HPPD de bases de datos públicas incluyendo secuencias de proteínas de HPPD y proteínas de HPPD pronosticadas tales como de plantas, mamíferos, hongos y bacterias se realizó usando ClustalX. La alineación se corrigió usando la información de las estructuras 3D disponibles. Idénticas secuencias de aminoácidos con diferentes identificadores se incluyeron solo una vez y algunas secuencias con errores de secuencia obvios fueron excluidas. La alineación también incluye secuencias incompletas. La Tabla 2b muestra la alineación de las secuencias para un grupo representativo de proteínas de HPPD e incluye secuencias de plantas, bacterias, mamíferos.

Tabla 2b: alineación de un grupo representativo de secuencias de HPPD

CLUSTAL X (1.81) alineación de secuencias múltiples

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

La identidad de secuencia general entre secuencias individuales de HPPD de longitud total es, en general, bastante baja y se muestra para las proteínas de HHPD representativas en la Tabla 3. La Tabla 4a muestra la alineación de 5 secuencias de la bolsa de unión. Por el contrario, la identidad de secuencia de los 36 aminoácidos que forman el sitio de unión es significativamente mayor que la que se muestra para las proteínas de HPPD representativas en la Tabla 4b. En particular, los aminoácidos en 8 posiciones se conservan de forma estricta en todas las especies e ilustran que estos aminoácidos tienen un papel clave (por ejemplo, His226, His308, Glu394 que se unen con el hierro requerido para la catálisis). Estas posiciones, con referencia a la HPPD de Arabidopsis (SEC ID N.º: 2) son 10 His226, Ser267, Asn282, His308, Tyr342, Glu394, Gly420, Asn423 (Tabla 5a). Una mutación de cualquiera de los aminoácidos en cualquiera de estas posiciones llevará más probablemente a una proteína inactiva. La variabilidad en otras posiciones dentro del sitio de unión es más alta. La Tabla 5b muestra las 28 posiciones variables en el sitio de unión y los aminoácidos que se identificaron en estas posiciones usando la alineación de secuencias. Algunas posiciones tienen solo una variabilidad limitada que refleja su papel en el ambiente 3D. Un ejemplo de ello está 15 representado por la posición 269. Todas las proteínas de HPPD tienen en esta posición ya sea Val, Ala o Thr. Observando las estructuras 3D, parece que en esta posición se requiere un aminoácido apolar pequeño y una mutación en un aminoácido polar como Arg, His o Lys perturbará la estructura proteica de forma local. Otro ejemplo está representado por la posición 379. La mayoría de las secuencias tienen una glutamina en la posición 379. Sin embargo, también hay algunas secuencias bacterianas que tienen una histidina en esta posición. Observando la 20 estructura 3D, parece que solo algunos aminoácidos se toleran en esta posición. Gln379 en A. thaliana estabiliza a través de su donante de enlace de H la conformación de la cadena lateral de Glu394 estrictamente conservado que a su vez interactúa con el hierro catalítico. Además, con sus aceptores de enlace de H, Gln379 estabiliza la conformación de la cadena lateral de Asn423 estrictamente conservada que a su vez interactúa con la Tyr342 estrictamente conservada. Solo glutamina, asparagina e histidina tienen un donante de enlace H y un aceptor 25 requerido para la estabilización de esta disposición 3D particular que muy probablemente desempeña un papel clave en la interacción de la hélice C-terminal con el núcleo de la proteína de HPPD. También se observó una variabilidad limitada en la posición 381 bien con una fenilalanina o bien con una tirosina en todas las secuencias de HPPD. El anillo aromático estabiliza la unión de los inhibidores de HPPD y muy probablemente también la unión del sustrato con la unión de HPPD. Sin embargo, la presencia del grupo hidroxilo adicional en la tirosina en comparación con 30 fenilalanina no perturba la actividad catalítica. La tercera categoría de posiciones incluye aquellas posiciones que muestran una variabilidad natural muy alta. Estas posiciones pueden no ser cruciales para la unión con el sustrato y la catálisis pero influyen sobre la unión con el inhibidor. Estas posiciones incluyen posiciones adyacentes en la cadena 248 a 255 y posiciones en la hélice C-terminal 419-427. Se puede asumir que la interacción de esta cadena particular y la hélice C-terminal con el núcleo de la proteína desempeña un papel crucial en la unión con el inhibidor.

35 La Tabla 5b incluye para cada posición variable aquellos aminoácidos que se han identificado en las alineaciones de secuencias usando todas las secuencias de HPPD conocidas.

Tabla 3: identidad de secuencia a pares de las secuencias de HPPD a partir del grupo representativo de proteínas de HPPD

imagen33

Tabla 4a: alineación de secuencias de aminoácidos que forman la bolsa de unión en el grupo representativo de secuencias de HPPD

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

226 H: 162 H 187 H 183 H 183 H

267 S 282 N 308 H 342 Y 394 E 420 G 423 N: 202 S 217 N 241 H 271 Y 323 E 334 G 337 N 230 S 245 N 270 H 299 Y 349 E 360 G 363 N 226 S 241 N 266 H 295 Y 349 E 360 G 363 N 226 S 241 N 266 H 295 Y 349 E 360 G 363 N

imagen39

imagen40

imagen41

No todos los aminoácidos que se producen en las posiciones variables tienen la misma probabilidad de estar presentes en una proteína activa. En algunos casos la mayoría de las secuencias tienen los mismos aminoácidos en una posición particular mientras que otros aminoácidos están presentes en la posición en solo algunas pocas secuencias de HPPD. Un ejemplo es la posición 392. La mayoría de las secuencias tiene en una correspondiente

5 posición una fenilalanina mientras que algunas, es decir, las secuencia de Burkholderia tienen una serina. Si bien, en algunos casos raros, los aminoácidos raros pueden ser el resultado de un error de secuenciación, en la mayoría de los otros casos, la proteína resultante es activa. La Tabla 5c muestra una lista con los aminoácidos más comunes en las posiciones variables.

La influencia de los aminoácidos en las posiciones variables es diferente. Algunas de estas posiciones son cruciales

10 para la catálisis y/o la interacción de HPPD con un inhibidor mientras que otras pueden tener un menor impacto. Por ejemplo los cambios en las posiciones 269 y 280 que están en contacto directo con el inhibidor y el sustrato tendrán muy probablemente un gran impacto sobre la catálisis y la unión con el inhibidor. Además las modificaciones en las posiciones implicadas en el movimiento de la hélice inducido por el inhibidor o la unión con el sustrato tales como las posiciones 252, 421 y 422 probablemente tengan un alto impacto sobre la unión con el inhibidor. Por el contrario las

15 modificaciones en las posiciones como 293 influyen menos probablemente en la unión con el inhibidor porque esta posición está bien alejada del sitio activo. La Tabla 6a muestra la posición con muy alto impacto y la Tabla 6b con alto impacto sobre la actividad y la unión con el inhibidor.

A partir de estas observaciones, los autores de la presente invención sacaron la conclusión de que los aminoácidos se prefieren en los sitios de unión que se producen de forma natural en las posiciones correspondientes. Esto

20 significa, que esas modificaciones que intercambian un aminoácido que se da en la naturaleza en otro proporcionan probablemente una proteína de HPPD catalíticamente activa que puede ejercer una tolerancia modificada o incluso incrementada a los inhibidores de herbicidas de HPPD. Son aún más promisorias aquellas proteínas mutantes que tienen el aminoácido hallado con mayor frecuencia en la naturaleza en la posición variable seleccionada de la Tabla 5c.

25 Tabla 6a: posiciones de aminoácidos con alta prioridad mostrada para las estructuras de rayos X

Pos. Aminoácido
Pos. Aminoácido
Pos. Aminoácido
Pos. Aminoácido
Pos. Aminoácido

228 V 250 F 251 A 252 E 253 F 265 L 268 A 269 V 270 L 271 A 280 P 307 Q 335 M 368 L 379 Q 392 F 421 K: 164 T 188 A 189 R 190 Y 191 F 200 L 203 K 204 A 205 M 206 S 215 P 240 Q 264 M 295 L 310 Q 321 F 335 E 189 V 213 M 214 K 215 E 216 F 228 L 231 K 232 V 233 V 234 A 243 P 269 Q 293 L 323 L 334 Q 347 F 361 K 185 V 209 F 210 W 211 S 212 V 224 L 227 I 228 V 229 V 230 A 239 P 265 Q 289 L 323 L 334 Q 347 F 361 A 185 V 209 F 210 W 211 S 212 V 224 L 227 I 228 V 229 V 230 A 239 P 265 Q 289 L 323 L 334 Q 347 F 361 A

422 G: 336 G 362 G 362 G 362 G

426 E 427 L: 340 A 341 L 366 A 367 L 366 S 367 L 366 S 367 L

5

10

15

20

25

30

35

40

252 E 269 V 280 P 335 M 368 L 421 K 422 G: 190 Y 204 A 215 P 264 M 295 L 335 E 336 G 215 E 232 V 243 P 293 L 323 L 361 K 362 G 211 S 228 V 239 P 289 L 323 L 361 A 362 G 211 S 228 V 239 P 289 L 323 L 361 A 362 G

En otro aspecto, en el ácido nucleico aislado de la invención según se define con anterioridad, dicho aminoácido está seleccionado de Ala, Pro, Thr o Val en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

Diversas secuencias de proteínas HPPD o de proteínas HPPD pronosticadas se conocen en la técnica. Ellas incluyen las secuencias de HPPD de Streptomyces avermitilis (Genebank SAV11864), Daucus carota (Genebank DCU 87257), Arabidopsis thaliana (Genebank AF047834), Mycosphaerella graminicola (Genebank AF038152), Oryza sativa / arroz [BAD26248], Zea mays / maíz [ACN36372], Avena sativa [ABZ23427], Pseudomonas fluorescens [ABF50055], Synechococcus sp. [YP_473959], Blepharisma japonicum [BAF91881], Rhodococcus RHA1 sp. ro0240 [YP_702005], Rhodococcus RHA1 sp. ro0341 [YP_703002], Picrophilus torridus [YP_024147], Kordia algicida [ZP_02161490], Sorghum bicolor [XP_002453359], Triticum aestivum / trigo [AAZ67144], o Hordeum vulgare / cebada [048604].

La secuencia de la proteína de HPPD tomada como punto de partida puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que codifica una proteína de HPPD catalíticamente activa. En una forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 4 [Oryza sativa], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 266 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 4 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 [Zea mays], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende al menos el aminoácido Ala en la posición 243 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 6 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 [Avena sativa], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 260 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 10 [Pseudomonas fluorescens], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 204 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 10 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 14 [Synechococcus sp.], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 185 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 14 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 16 [Blepharisma japonicum], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 228 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 16 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 18 [Rhodococcus RHA1 sp. ro0240], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 250 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 18 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 30 [Rhodococcus RHA1 sp. 0341], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 251 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 18 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20 [Picrophilus torridus], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 220 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 22 [Kordia algicida], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 238 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 22 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 24 [Sorghum bicolor], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 260 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 24 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 26 [Triticum aestivum / trigo], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 256 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 26 (correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).

En otra forma de realización, del ácido nucleico aislado de la invención, dicha proteína de HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2 [Arabidopsis thaliana], en la que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

En una forma de realización adicional del ácido nucleico de la invención, en dicha proteína de HPPD mutada se han reemplazado al menos dos aminoácidos.

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPPD mutada,

en la que dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD,

en la que en dicha proteína de HPPD mutada al menos un aminoácido en la posición 228, 248, 270, 271, 379 y/o 427 se reemplazó por otro aminoácido.

En una forma de realización alternativa del ácido nucleico de la invención que tiene al menos un aminoácido en la posición 228, 248, 270, 271, 379 y/o 427 suprimido o reemplazado por otro aminoácido según se define con anterioridad, dicha proteína de HPPD mutada comprende

a) una His en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 226 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

b) una Ser en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 267 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2 o en una posición correspondiente en una enzima de HPPD diferente;

f) un Glu en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 394 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

En otra forma de realización del ácido nucleico aislado según se define con anterioridad, en dicha proteína de HPPD a. Ala, Cys, Gly, Thr o Val en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 228 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

imagen42

5 b. Ala, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr o Tyr en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 248 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

c. Ala, Ile, Leu, Met o Val en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 270 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

d. Ala, Glu, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Ser, Thr o Val en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha 10 posición corresponde a la posición 271 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

e.: His o Gln en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 379 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2; y

f.: Leu o Arg en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 427 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

15 En otra forma de realización del ácido nucleico aislado según se define con anterioridad, en dicha proteína de HPPD mutada, al menos un aminoácido se reemplazó de modo tal que la secuencia de aminoácidos resultante tenía al menos uno seleccionado de

a. Val o Thr en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 228 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

20 b. Leu, Met o Val en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 270 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

c. Ala o Ser en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 271 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2,

d. Gln en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 379 de la 25 secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2; y

e. Leu en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 427 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.

En otra forma de realización del ácido nucleico según se define con anterioridad, dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD (también 30 denominado herbicida inhibidor de HPPD).

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una proteína codificada por el ácido nucleico aislado de la invención.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un gen quimérico que comprende una secuencia codificadora que comprende el ácido nucleico de la invención operativamente ligado a un promotor que se puede 35 expresar en plantas y opcionalmente una región de terminación de la transcripción y poliadenilación.

Como una secuencia de regulación que funciona como un promotor en células vegetales y plantas, se puede hacer uso de cualquier secuencia promotora de un gen que se expresa naturalmente en plantas, en particular un promotor que se expresa en especial en las hojas de plantas como, por ejemplo, promotores “constitutivos” de origen bacteriano, viral o vegetal, o promotores “dependientes de la luz”, tales como aquel de un gen de subunidad 40 pequeña de ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) de planta, o cualquier promotor expresable conocido apropiado que se puede usar. Entre los promotores de origen vegetal, se pueden mencionar los promotores de histonas como se describen en el documento EP 0 507 698 A1, el promotor de actina de arroz (documento US 5.641.876), o un promotor de ubiquitina vegetal (documento US 5.510.474). Entre los promotores de un gen viral de planta, se mencionará aquel del virus mosaico de la coliflor (CaMV 19S o 35S, Sanders et al. (1987), Nucleic Acids

45 Res. 15(4):1543-58), el circovirus (AU 689 311) o el virus mosaico de la vena Cassava (CsVMV, documento US 7.053.205).

En una forma de realización de esta invención, una secuencia promotora específica de regiones o tejidos vegetales particulares se puede usar para expresar las proteínas de HPPD de la invención, como promotores específicos de semillas (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), en especial el promotor de nabo (documento

50 EP 255 378 A1), el promotor de faseolina, el promotor de glutenina, el promotor de heliantinina (documento WO 92/17580), el promotor de albúmina (documento WO 98/45460), el promotor de oleosina (documento WO 98/45461), el promotor SAT1 o el promotor de SAT3 (documento PCT/US98/06978).

imagen43

También se puede usar un promotor inducible elegido ventajosamente de los promotores de fenilalanina amoníaco liasa (PAL), HMG-CoA reductasa (HMG), quitinasa, glucanasa, inhibidor de proteinasa (PI), gen de la familia PR1, nopalina sintasa (nos) y vspB (documento US 5 670 349, Tabla 3), el promotor HMG2 (documento US 5 670 349), el promotor de beta-galactosidasa (ABG1) de manzana y el promotor de aminociclopropancarboxilato (ACC sintasa) de

5 manzana (documento WO 98/45445).

De acuerdo con la invención, se pueden usar también, en combinación con el promotor, otras secuencias de regulación que se ubican entre el promotor y la secuencia codificadora, como activadores de la transcripción (“potenciadores”), por ejemplo, el activador de la traducción del virus del mosaico del tabaco (TMV) descritos en la solicitud WO 87/07644, o del virus del grabado de tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64:

10 1590-1597, por ejemplo, o intrones tales como el intrón adh1 de maíz o el intrón 1 de la actina del arroz.

Como un terminador de regulación o secuencia de poliadenilación, se puede usar cualquier secuencia correspondiente de origen bacteriano tal como por ejemplo el terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, de origen viral tal como por ejemplo, el terminador CaMV 35S, o de origen vegetal tal como por ejemplo un terminador de histonas como se describió en la solicitud de patente publicada EP 0 633 317 A1.

15 Un procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada capaz de modular la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, en el que dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD, que comprende

i. proporcionar una proteína de HPPD, comprendiendo opcionalmente dicha HPPD una secuencia de aminoácidos, en la que

20 a) una His está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 226 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

b) una Ser está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 267 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

c) una Asn está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la 25 posición 282 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

d) una His está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 308 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

e) una Tyr está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 342 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

30 f) un Glu está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 394 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

g) una Gly está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la posición 420 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2; y

h) un Asn está presente en una posición en una proteína de HPPD, donde dicha posición corresponde a la 35 posición 423 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2

ii) sustituir un aminoácido en dicha enzima de HPPD de modo tal que la secuencia de aminoácidos resultante tenga el aminoácido Ala en la posición que corresponde a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

a) y una deleción o sustitución aminoacídica de al menos una posición en una proteína de HPPD, en donde dicha

40 posición corresponde a al menos una de las posiciones 228, 248, 270, 271, 379 y 427 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

iii) determinar la inhibición de la proteína de HPPD resultante por al menos un herbicida que actúa sobre HPPD;

en la que una inhibición de la proteína resultante de menos o más que la observada con una proteína de HPPD de

45 referencia es indicativa de que la proteína resultante es capaz de modular la tolerancia de una planta a dicho herbicida.

Se ha de entender que también los aminoácidos (más específicos) y posiciones enumerados con anterioridad para otras formas de realización, tales como el ácido nucleico de la invención, se pueden aplicar al procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada tal como se describió con anterioridad.

50 En una forma de realización alternativa del procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada tal como se describió con anterioridad, dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a

imagen44

Dentro del procedimiento de obtención anterior de una proteína de HPPD mutada, se pueden seleccionar diferentes herbicidas que actúan sobre la HPPD. Conforme a ello, en otra forma de realización del procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada tal como se describió con anterioridad, en donde dicha proteína de HPPD mutada 5 es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, el herbicida que actúa sobre HPPD está seleccionado de tricetonas, o pirazolinatos, con preferencia, tembotriona, mesotriona, topramezona o sulcotriona, biciclopirona, pirasulfotol, pirazolato, benzofenap y tefuriltriona, en particular tembotriona y tales plantas que contienen la HPPD de la invención tienen una tolerancia agronómicamente aceptable a un herbicida inhibidor de HPPD en particular a tricetonas, o pirazolinatos, con preferencia, tembotriona, mesotriona, 10 topramezona o sulcotriona, biciclopirona, pirasulfotol, pirazolato, benzofenap y tefuriltriona, en particular tembotriona.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende introducir en dicho genoma vegetal el ácido nucleico de la presente invención operativamente ligado a un promotor expresable en plantas, el gen quimérico de la invención o un ácido nucleico que codifica la enzima de HPPD identificada por el procedimiento de la reivindicación 18 o 19.

15 En una forma de realización alternativa del procedimiento de producción de una planta transgénica tal como se describe con anterioridad, el ácido nucleico de la invención, en el que dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, o un ácido nucleico identificado por el procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada, en el que dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, ambos

20 operativamente ligados a un promotor expresable en plantas, o el gen quimérico de la invención que comprende un ácido nucleico, en el que dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD, se introduce en dicha planta.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una célula vegetal que comprende el ácido nucleico aislado de la invención o el gen quimérico de la invención en su información genética.

25 La presente invención también se refiere a una planta, una parte de una planta o tejido vegetal que consiste esencialmente en las células vegetales de la invención.

Por otra parte, la presente invención se refiere a una planta que se puede obtener a partir del procedimiento de obtención de una proteína de HPPD mutada capaz de modular o aumentar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD en todos los aspectos alternativos descritos con anterioridad.

30 La planta de la presente invención puede ser cualquier planta. Los ejemplos no limitativos de plantas de la invención incluyen trigo, algodón, canola, arroz, maíz, soja, sorgo, canola, girasol, tabaco, remolacha, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, fresa, plátano, melón, patata, zanahoria, lechuga, repollo, cebolla, Soya spp., caña de azúcar, guisante, judía, álamo, uva, cítricos, alfalfa, centeno, avena, césped y gramíneas forrajeras, lino y colza oleaginosa y plantas productoras de nueces. La presente invención también se

35 refiere a una semilla de la planta de la invención.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de modulación de la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD que comprende introducir el ácido nucleico aislado de la invención operativamente ligado a un promotor expresable en plantas o el gen quimérico de la invención en el genoma de una planta.

40 En una forma de realización alternativa, la presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD u obtener una planta tolerante a un herbicida inhibidor de HPPD que comprende introducir el ácido nucleico aislado de la invención, en la que dicho ácido nucleico codifica una proteína de HPPD mutada que es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, operativamente ligado a un promotor expresable en plantas o el gen

45 quimérico de la invención que comprende un ácido nucleico de la invención, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína de HPPD mutada que es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, en el genoma de una planta.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de control de malas hierbas que comprende pulverizar al menos un herbicida que actúa sobre HPPD en o alrededor de una planta de cultivo, en la que dicha planta de 50 cultivo comprende el ácido nucleico de la presente invención, en la que dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, operativamente ligado a un promotor expresable en plantas o el gen quimérico de la invención que comprende el ácido nucleico de la invención, en la que dicha proteína de HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD. En una forma de realización alternativa del procedimiento de control de malas

55 hierbas, se aumenta la tolerancia de dicha planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD.

Además, la presente invención se refiere al uso de un gen quimérico de la invención o el ácido nucleico de la invención operativamente ligado a un promotor expresable en plantas para modular la tolerancia de una planta a al En una forma de realización alternativa, la presente invención se refiere al uso de un gen quimérico de la invención o el ácido nucleico de la invención operativamente ligado a un promotor expresable en plantas para incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD. En esta forma de realización de la

imagen45

5 invención, el gen quimérico usado comprende el ácido nucleico de la invención, en la que la proteína de HPPD mutada codificada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD. De modo alternativo, si se usa un ácido nucleico operativamente ligado a un promotor expresable en plantas, se selecciona dicho ácido nucleico de modo tal que la proteína de HPPD mutada codificada sea capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD.

10 La presente invención también se refiere a la célula vegetal de la invención y la planta de la invención que puede comprender otro rasgo útil tal como se describe más adelante.

Si bien una cantidad de plantas de cultivos tolerantes a herbicidas son asequibles en comercios en la actualidad, un tema que surgió para muchos herbicidas comerciales y combinaciones de herbicida/cultivo es que los herbicidas individuales tienen un espectro incompleto de actividad contra especies de malas hierbas comunes. Para la mayoría 15 de los herbicidas individuales que se usaron durante algún tiempo, poblaciones de especies de malas hierbas resistentes a herbicidas y biotipos se han vuelto más prevalentes (ver, por ejemplo, Tranel y Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen y Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311). Se han descrito plantas transgénicas que son resistentes a más de un herbicida (ver, por ejemplo, documento WO 2005/012515). Sin embargo, hay una demanda continua de mejoras en todo aspecto de la producción de cultivos, opciones de control de malas hierbas,

20 extensión del control de malas hierbas residual y mejora en el rendimiento de cultivos.

La proteína o gen de HPPD de la invención se combina ventajosamente en plantas con otros genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles a estas plantas. Entre los genes que codifican proteínas o ARN que confieren propiedades agronómicas útiles en plantas transformadas, se pueden mencionar secuencias de ADN que codifican proteínas que confieren tolerancia a uno o varios herbicidas que, de acuerdo con

25 su estructura química, difieren de los herbicidas inhibidores de HPPD y otros que confieren tolerancia a ciertos insectos, aquellos que confieren tolerancia a ciertas enfermedades, ADN que codifican ARN que proporcionan un control de nematodos o insectos, etc.

Estos genes se describen en particular en las solicitudes de patentes PCT publicadas WO 91/02071 y WO 95/06128.

Entre las secuencias de ADN que codifican proteínas que confieren tolerancia a ciertos herbicidas en células

30 vegetales transformadas y plantas, se pueden mencionar un gen bar o PAT o el gen de Streptomyces coelicolor descrito en el documento WO 2009/152359 que confiere tolerancia a herbicidas de glufosinato, un gen que codifica un EPSPS apropiado que confiere tolerancia a herbicidas que tienen EPSPS como un blanco, como glifosato y sus sales (documentos US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.310.667, US 5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435), o un gen que codifica glifosato

35 oxidorreductasa (documento US 5.463.175).

Entre las secuencias de ADN que codifican un EPSPS apropiado que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen EPSPS como un blanco, se mencionará en particular el gen que codifica un EPSPS de planta, en particular EPSPS de maíz, en particular un EPSPS de maíz que comprende dos mutaciones, en particular una mutación en la posición de aminoácido 102 y una mutación en la posición de aminoácido 106 (documento WO 2004/074443) y que se

40 describe en la solicitud de patente US 6566587, en adelante mencionado EPSPS de maíz doble mutante o 2mEPSPS, o el gen que codifica un EPSPS aislado de Agrobacterium y que se describe por la secuencia ID N.º: 2 y la secuencia ID N.º: 3 de la patente US 5.633.435, también denominado CP4.

Entre las secuencias de ADN que codifican un EPSPS apropiado que confieren tolerancia a los herbicidas que tienen EPSPS como un blanco, se mencionará más en particular el gen que codifica un EPSPS GRG23 de

45 Arthrobacter globiformis, pero también los mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2, o GRG23 ACE3, en particular los mutantes o variantes de GRG23 tal como se describen en el documento WO 2008/100353, como GRG23(ace3)R173K de la SEC ID N.º: 29 en el documento WO 2008/100353.

En el caso de las secuencias de ADN que codifican EPSPS y más en particular que codifican los genes anteriores, la secuencia que codifica estas enzimas está precedida ventajosamente por una secuencia que codifica un péptido

50 de tránsito, en particular el “péptido de tránsito optimizado” descrito en la patente US 5.510.471 o 5.633.448.

En el documento WO 2007/024782, se divulgan plantas tolerantes a glifosato y al menos un inhibidor de ALS (acetolactato sintasa). Más específicamente se divulgan plantas que contienen genes que codifican un polipéptido de GAT (glifosato-N-acetiltransferasa) y un polipéptido que confiere resistencia a inhibidores de ALS.

En el documento US 6855533, se divulgaron plantas de tabaco transgénicas con genes ALS/AHAS de Arabidopsis 55 mutados.

En el documento US 6.153.401, se divulgan plantas que contienen genes que codifican 2,4-D-monooxigenasas que En el documento US 2008/0119361 y el documento US 2008/0120739, se divulgan plantas que contienen genes que codifican dicamba monooxigenasas que confieren tolerancia a dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) por metabolización.

imagen46

5 Todos los rasgos de tolerancia a herbicidas antes mencionados se pueden combinar con aquellos que tienen tolerancia a HPPD que son materia objeto de esta invención.

Entre las secuencias de ADN que codifican proteínas que se refieren a las propiedades de tolerancia a insectos, se mencionarán más en particular las proteínas Bt ampliamente descritas en la bibliografía y bien conocidas por los expertos en la técnica. También se hará mención de las proteínas extraídas de bacterias tales como Photorhabdus

10 (documento WO 97/17432 y documento WO 98/08932).

Entre tales secuencias de ADN que codifican proteínas de interés que se refieren a propiedades de tolerancia a insectos, se hará mención más en particular a las proteínas Bt Cry o VIP descritas ampliamente en la bibliografía y bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Éstas incluyen la proteína Cry1F o híbridos derivados de una proteína Cry1F (por ejemplo, las proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas en los documentos US 6.326.169; US 15 6.281.016; US 6.218.188, o sus fragmentos tóxicos), las proteínas de tipo Cry1A o sus fragmentos tóxicos, con preferencia la proteína Cry1Ac o híbridos derivados de la proteína Cry1Ac (por ejemplo, la proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita en el documento US 5.880.275) o la proteína Cry1Ab o Bt2 o sus fragmentos insecticidas tal como se describen en el documento EP451878, las proteínas Cry2Ae, Cry2Af o Cry2Ag tal como se describen en el documento WO 02/057664 o sus fragmentos tóxicos, la proteína Cry1A.105 descrita en el documento WO 20 2007/140256 (SEC ID N.º: 7) o uno de sus fragmentos tóxicos, la proteína VIP3Aa19 de N.º de acceso de NCBI ABG20428, la proteína VIP3Aa20 de N.º de acceso de NCBI ABG20429 (SEC ID N.º: 2 en el documento WO 2007/142840), las proteínas VIP3A producidas en los eventos de algodón COT202 o COT203 (documentos WO 2005/054479 y WO 2005/054480, respectivamente), las proteínas Cry tal como se describen en el documento WO 01/47952, la proteína VIP3Aa o uno de sus fragmentos tóxicos tal como se describe en Estruch et al. (1996), Proc 25 Natl Acad Sci U S A. 28; 93(11):5389-94 y US 6.291.156, las proteínas insecticidas de Xenorhabdus (tal como se describe en el documento WO 98/50427), Serratia (en particular de S. entomophila) o cepas de especies de Photorhabdus, como proteínas Tc de Photorhabdus tal como se describen en el documento WO 98/08932 (por ejemplo, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11): 5017-24; French-Constant y Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5): 828-33). También se incluyen en el presente documento cualquier variante o mutante de cualquiera

30 de estas proteínas que difieren en algunos (1-10, con preferencia, 1-5) aminoácidos de cualquiera de las secuencias anteriores, en particular la secuencia de su fragmento tóxico, o que se fusionan con un péptido de tránsito, como un péptido de tránsito de plástido u otra proteína o péptido.

Las FIGURAS muestran:

FIGURA 1: Superposición de la estructura de rayos X de HPPD de Arabidopsis thaliana (gris oscuro) y (a)

35 Pseudomonas fluorescens (gris claro), (b) Streptomyces avermitilis, (c) Homo sapiens, (d) Rattus norvegicus. Las estructuras se muestran como gráfico de cintas.

FIGURA 2: Aminoácidos que forman el sitio de unión de (a) Arabidopsis thaliana, (b) Pseudomonas fluorescens (c) Streptomyces avermitilis (d) Homo sapiens y (e) Rattus norvegicus (representado por líneas en negrita). El núcleo de la proteína de HPPD se muestra como traza de Calfa y el hierro está marcado.

40 FIGURA 3: Color de ensayo marrón en Escherichia coli

Listado de secuencias

SEC ID N.º: 1: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Arabidopsis thaliana

SEC ID N.º: 2: proteína codificada por SEC ID N.º: 1

SEC ID N.º: 3: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Oryza sativa

45 SEC ID N.º: 4: proteína codificada por SEC ID N.º: 3

SEC ID N.º: 5: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Zea mays

SEC ID N.º: 6: proteína codificada por SEC ID N.º: 5

SEC ID N.º: 7: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Avena sativa

SEC ID N.º: 8: proteína codificada por SEC ID N.º: 7

50 SEC ID N.º: 9: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Pseudomonas fluorescens

5

10

15

20

25

30

35

40

SEC ID N.º: 10: proteína codificada por SEC ID N.º: 9 SEC ID N.º: 13: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Synechococcus sp. SEC ID N.º: 14: proteína codificada por SEC ID N.º: 13 SEC ID N.º: 15: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Blepharsima japonicum SEC ID N.º: 16: proteína codificada por SEC ID N.º: 15 SEC ID N.º: 17: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD ro0341 aislada de Rhodococcus RHA1 SEC ID N.º: 18: proteína codificada por SEC ID N.º: 17 SEC ID N.º: 19: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Picrophilus torridus SEC ID N.º: 20: proteína codificada por SEC ID N.º: 19 SEC ID N.º: 21: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Kordia algicida SEC ID N.º: 22: proteína codificada por SEC ID N.º: 21 SEC ID N.º: 23: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Sorghum bicolor SEC ID N.º: 24: proteína codificada por SEC ID N.º: 23 SEC ID N.º: 25: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Triticum aestivum SEC ID N.º: 26: proteína codificada por SEC ID N.º: 25 SEC ID N.º: 27: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Hordeum vulgare SEC ID N.º: 28: proteína codificada por SEC ID N.º: 27 SEC ID N.º: 29: secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD ro0240 aislado de Rhodococcus RHA1 SEC ID N.º: 30: proteína codificada por SEC ID N.º: 29 SEC ID N.º: 31: secuencia de ácidos nucleicos que codifica polipéptido de HPPD de tipo silvestre de Arabidopsis

thaliana, que también contiene en el extremo 5’ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de

histidina

SEC ID N.º: 32: proteína codificada por SEC ID N.º: 31 SEC ID N.º: 33: secuencia de ácidos nucleicos que codifica polipéptido de HPPD mutante, que también contiene en el extremo 5’ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina

SEC ID N.º: 34: proteína codificada por SEC ID N.º: 33,

SEC ID N.º: 35: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina SEC ID N.º: 36: proteína codificada por SEC ID N.º: 35, SEC ID N.º: 37: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene

en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina SEC ID N.º: 38: proteína codificada por SEC ID N.º: 37, SEC ID N.º: 39: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene

en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina SEC ID N.º: 40: proteína codificada por SEC ID N.º: 39, SEC ID N.º: 41: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene

en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina SEC ID N.º: 42: proteína codificada por SEC ID N.º: 41, SEC ID N.º: 43: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene

en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

SEC ID N.º: 44: proteína codificada por SEC ID N.º: 43,

SEC ID N.º: 45: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina

SEC ID N.º: 46: proteína codificada por SEC ID N.º: 45

SEC ID N.º: 47: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina

SEC ID N.º: 48: proteína codificada por SEC ID N.º: 47

SEC ID N.º: 49: secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de HPPD mutante, que también contiene en el extremo 5´ un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos de histidina

SEC ID N.º: 50: proteína codificada por SEC ID N.º: 49.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1:

Una mutación de aminoácidos estrictamente conservados lleva a una proteína inactiva. Los mutantes puntuales S267A (SEC ID N.º: 34) en A. thaliana y N282A (SEC ID N.º: 36) en A. thaliana son inactivos. Las posiciones de aminoácido dadas se refieren a la posición de la SEC ID N.º: 2.

Los polipéptidos de HPPD mutantes de la presente invención tienen cambios de aminoácidos en una o más posiciones respecto de la secuencia inicial de tipo silvestre de la que se derivan.

La secuencia de ADN SEC ID N.º: 2 que codifica la proteína de HPPD de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana (1335 pares de bases; Genebank AF047834; documento WO 96/38567) se clonó en el vector pSE420(RI)NX (modificado del vector de clonación y expresión pSE420(RI)NX (5261 pares de bases) se basa en el plásmido pSE420 por Invitrogen (Karlsruhe, Alemania)). En el extremo 5’, se insertó directamente corriente abajo de ATG una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un aminoácido de alanina y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un HIS6-Tag N-terminal (6x HIS, codificado por: cat cat cat cac cat cat). La secuencia resultante se presenta como SEC ID N.º: 31. Corriente arriba de ATG, se añadieron dos pares de bases de cisteína adicionales a fin de obtener una secuencia correspondiente al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NcoI y corriente abajo del codón de detención se añadieron las secuencias correspondientes al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XbaI. El plásmido resultante se usó luego para transformar células de E. coli BL21 (DE3) con 50 µg/ml de kanamicina o 100 µg/ml de selección de carbenicilina tal como se describe en las solicitudes de patentes europeas EP09015984.9; EP09015985.6; EP 09015986.4, EP 09015987.2; y EP09015988.0, todas presentadas el 23 de diciembre de 2009.

Ensayo rápido de la actividad de la proteína de HPPD: producción de color marrón

Ensayo de control colorimétrico para enzimas activas de HPPD

Un medio de cultivo de tipo caldo de YT con el 1 % de agarosa, 5 mM de L-tirosina y 42 mM de succinato, que contiene el agente de selección para el vector pSE420 se vierte en placas de pocillos profundos. El cultivo de E. coli en la fase de crecimiento exponencial que contiene el vector pSE420-HPPDx (cualquier gen que codifica una enzima / proteína de HPPD teórica) se aplica a cada pocillo. Después de 16 horas a 37 °C, los pocillos que no contienen el medio de cultivo, aquellos que habían sido sembrados con un cultivo de E. coli con el vector vacío pSE420, son transparentes, o aquellos que habían sido sembrados con un cultivo de E. coli con un vector pSE420 que contiene un gen que codifica una HPPD inactiva, son transparentes, mientras que los pocillos sembrados con un cultivo de E. coli con el vector pSE420-HPPD que codifica la HPPD activa son marrones. Previamente se había demostrado que este ensayo refleja la actividad de HPPD, no importa cuál sea el origen de esta actividad y permite la identificación de actividades de la HPPD (documento US 6.768.044).

Como puede verse en la Figura 3, el cultivo de bacterias que contiene el gen que codifica la HPPD mutante no desarrolló un color marrón mientras que uno que contiene el gen que codifica la HPPD de tipo silvestre desarrolló un color marrón fuerte que reflejaba la actividad de las enzimas de HPPD. Se puede concluir que los dos mutantes de HPPD no son capaces de convertir HPP en homogentisato. Los dos mutantes de HPPD son inactivos. Se puede concluir que las posiciones de aminoácido 267 y 282 (referidas a la posición en la SEC ID N.º: 2) son esenciales para la actividad de HPPD.

La expresión de la proteína de HPPD se realizó de la siguiente manera.

Se usaron cultivos durante la noche cultivados a 37 °C para inocular el medio LB en una relación 1:100. Se dejaron crecer las células hasta que la DO alcanzara 0,5, luego se inició la expresión a partir del promotor trp-lac (trc) por inducción con 1 mM de IPTG que se une con el represor lac y causa su disociación del operón lac. La expresión se llevó a cabo durante 15 h a 28 °C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Para preparar el cultivo de prearranque, se inocularon 2 ml de medio TB (100 µg*ml-1 de carbenicilina) con 50 µl de una solución madre de K-12 BL21 glicerol de E. coli. El cultivo de prearranque se incubó a 37 °C con agitación a 140 rpm durante 15 h. Se usaron 200 µl del cultivo de prearranque para iniciar el cultivo de inicio (5 ml de suplemento de TB con 100 µg*l-1), que se incubó durante 3 h a 37 °C.

Para preparar el cultivo principal, se inocularon 400 ml de medio TB (100 µg*ml-1 de carbenicilina) con 4 ml del cultivo de inicio. Este cultivo de inicio se incubó a 37 ºC con agitación a 140 rpm hasta que se alcanzó la DO600 de 0,5. Luego se indujo la expresión de la proteína recombinante con 400 µl de 1 M de solución IPTG. Las células se dejaron en cultivo durante una hora adicional en estas condiciones, luego la temperatura se redujo a 28 °C y el cultivo se agitó a 140 rpm durante 15 h. Las células se cultivaron por centrifugación a 6000 x g durante 15 min a 4 °C. Luego se almacenaron los sedimentos celulares a -80 °C.

Aislamiento y purificación de His6-AtHPPD en forma nativa

Lisis de células

Se lisaron células usando lisozima, una enzima que escinde las ligaciones 1,4- entre el ácido N-acetilmurámico y residuos de N-acetil-D-glucosamina en peptidoglicano que forma la pared celular bacteriana. Las membranas celulares se desbarataron luego por la presión interna de la célula bacteriana. Además, el tampón de lisis contenía Benzonase® Nucleasa, una endonucleasa que hidroliza todas las formas de ADN y ARN sin dañar las proteínas y así reduce ampliamente la viscosidad del lisado celular. La lisis en condiciones nativas se llevó a cabo en hielo.

Para la purificación de proteínas rotuladas con His6, se usó el kit QIAexpress® Ni-NTA Fast Start Kit según la instrucción del manual del usuario.

Purificación de proteínas rotuladas con His6 por cromatografía por afinidad de ion metálico inmovilizado (IMAC)

El lisado celular clarificado (10 ml) obtenido después de la centrifugación de la reacción de lisis se cargó en una columna Ni-NTA Fast Start Column con el kit QIAexpress® Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y la purificación se llevó a cabo de acuerdo con el manual de instrucciones. La proteína rotulada con His6 se eluyó con 2,5 ml de tampón de elución.

Desalinización de soluciones de HPPD por filtración en gel

Se aplicaron soluciones de HPPD eluidas de una columna Ni-NTA Fast Start con 2,5 ml de tampón de elución a una columna Sephadex G-25 PD-10 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del manual del usuario. Después de que toda la muestra entrara en el lecho de gel, se realizó la elución con 3,5 ml de tampón de almacenamiento.

Las soluciones de HPPD eluidas de la columna de desalinización se congelaron a -80 °C en alícuotas de 1 ml.

Determinación de la concentración de proteína de HPPD usando el ensayo de proteína de Bradford

La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de Bradford estándar (Bradford, (1976), Anal Biochem

72: 248-254).

Determinación de la pureza de soluciones de HPPD usando SDS-PAGE

La integridad de la proteína eluida se controló por medio de electroforesis en gel de proteína SDS-PAGE usando NuPAGE® Novex 4-12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se cargaron aproximadamente 10 µg de proteína. Se añadieron 10 µl de tampón de muestra de Laemmli a 1-10 µl de solución de proteína y la mezcla se incubó a 90 °C durante 10 min. Después de una corta etapa de centrifugación, toda la mezcla se cargó en una ranura de un gel SDS previamente fijado en una cámara de gel XCell SureLockTM Novex Mini-Cell rellena con tampón de corrida NuPAGE® MOPS SDS (diluido de la solución 20 x con ddH2O). Luego se aplicó un voltaje de 150 a la cámara de gel durante 1 h. Para la tinción de las bandas de proteína, el gel se sumergió en solución de tinción azul brillante de Coomassie R-250. Para desteñir el gel de poliacrilamida, se sumergió en solución para desteñir azul brillante de Coomassie R-250 hasta que las bandas de proteína aparecieron azules en un gel blanco.

La actividad de HPPD se controló por medio de un ensayo espectrofotométrico estándar (procedimiento descrito extensivamente en el documento WO 2009/144079).

En este contexto, el valor de pI50 implica el valor de log de la concentración de inhibidor necesaria para inhibir el 50 % de la actividad enzimática en concentración molar.

Los valores de pI50 para inhibidores de HPPD se determinaron a partir de los gráficos de dosis-respuesta de la actividad de HPPD frente a la concentración de inhibidor usando el ensayo extensivamente descrito en el documento WO 2009/144079 a 2 mM de concentración de HPP fijo y 3 minutos de tiempo de incubación fijo usando el ID Business Solutions Ltd. XLfit software suite.

imagen47

Tabla 7: Determinación de los pI50 de las enzimas de HPPD (HPPD de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana “SEC ID N.º: 32”, los mutantes S267A (SEC ID N.º: 34) y N282A (SEC ID N.º: 36)” y la tolerancia a los diversos inhibidores de HPPD enumerados más abajo tembotriona, dicetonitrilo, mesotriona, biciclopirona, pirasulfotol, sulcotriona, pirazolato, tefuriltriona y benzofenap. El símbolo “>“ significa que el valor era mucho mayor que el indicado, pero no se podía calcular de forma precisa dentro del rango de concentración del inhibidor ensayado (2,5 x 10-6, 5,0 x 10-6 , 1,0 x 10-5, 2,5 x 10-5, 6,3 x 10-5 y 2,5 x 10-4 M).

Biciclopirona: Benzofenap Dicetonitrilo Mesotriona

WT (SEC ID N.º: 32): 5,2 > 5,6 > 5,6 > 5,6

S267A (SEC ID N.º: 34): nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P)

N282A (SEC ID N.º: 36): nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P)

Pirasulfotol: Pirazolato Sulcotriona Tefuriltriona Tembotriona

WT (SEC ID N.º: 32): 5,4 5,4 > 5,6 > 5,6 > 5,6

S267A (SEC ID N.º: 34): nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P)

N282A (SEC ID N.º: 36): nd – la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P) nd -la (P)

Tal como se demostró previamente, los 2 mutantes de proteínas no son capaces de convertir HPP en homogentisato, 10 lo que confirma que las 2 proteínas mutantes son inactivas. Esto confirma la hipótesis de que la posición 267 y 282 (haciendo referencia a la posición SEC ID N.º: 2) son absolutamente esenciales para obtener una HPPD activa.

Ejemplo 2: mutantes de punto simple revelaban mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de HPPD:

Caracterización cinética y evaluación de tolerancia a inhibidores de HPPD de la enzima de HPPD “SEC ID N.º: 32”.

15 La actividad de HPPD se controló por medio del ensayo espectrofotométrico estándar (procedimiento extensivamente descrito en el documento WO 2009/144079).

Determinación de las propiedades cinéticas in vitro de HPPD

Los valores de Km, Vmáx y kcat para diferentes preparaciones enzimáticas de HPPD y Ki, K1 = Kon y K-1 = Koff para diferentes inhibidores de HPPD se determinaron usando un ensayo de HPLC para las mediciones de la actividad de 20 HPPD. Las mezclas de ensayo contenían en un volumen de 1 ml 150 mM de tampón de Tris-HCl a pH 7,8, 10 mM de ascorbato de sodio, 650 unidades de catalasa bovina (Sigma C30 (Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania), 34 mg de proteína/ml, 23.000 unidades/mg) y cantidades apropiadas de HPP, enzima de HPPD purificada e inhibidores de HPPD. Para la determinación del valor de Km, Vmáx y kcat, las concentraciones de HPP en la mezcla de ensayo se variaron entre 10 y 400 µM. Para la determinación del valor Ki, K1 = Kon y K-1 = Koff, se usaron 2 mM de HPP. Todos 25 los ensayos se iniciaron por adición de la enzima de HPPD a la mezcla de ensayo y se detuvieron en una serie de tiempos de entre 0 y 240 s por adición de 200 µl de la mezcla de reacción a los tubos de ensayo de reacción que contienen 20 µl de ácido perclórico al 10 %. La proteína precipitada se sedimentó por una centrifugación de 5 minutos a 10.000 g. 100 µl del sobrenadante se cargaron en una columna 250 x 4 mm Knauer (Berlín, Alemania) Eurospher 100-5 C18 equilibrada con 10 % de metanol, 0,1 % de ácido trifluoroacético (tampón A). La columna se 30 eluyó, también a 1,5 ml/min, usando un lavado de 4 minutos con tampón A, seguido de un lavado de 3 min con 95 % de metanol y con un lavado adicional de 2 minutos con tampón A. La elución de HGA (ácido homogentísico) y HPP (hidroxifenilpiruvato) se controló a 292 nm. HGA se eluye a aproximadamente 5 minutos y HPP se eluye más tarde. Un grupo estándar de concentraciones de HGA se usaron para proporcionar una curva estándar a fin de calibrar la absorbancia de 292 nm del pico de HGA frente a la concentración de HGA. Para las determinaciones del valor Km y 35 Vmáx las tasas iniciales de la reacción de HPPD a diferentes concentraciones de sustrato se determinaron a partir de gráficos de HGA formados frente al tiempo y se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para enzimas no reaccionadas usando el paquete de software XLfit de ID Business Solutions Ltd. (www.idbs.com). Para la determinación de los valores Ki, K1 = Kon y K-1 = Koff se ajustaron los cursos en el tiempo de la reacción de HPPD a diferentes concentraciones de inhibidor a las ecuaciones para el Mecanismo A, inhibición competitiva, para

40 inhibidores de ligación estrecha (Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors – I. Kinetic behaviour. Biochemical Pharmacology 24, 2177-2185) usando el paquete de software XLfit de ID Business Solutions Ltd.

Tabla 8

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1.

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPPD mutada, en donde dicha proteína de HPPD mutada tiene actividad de HPPD y en donde en dicha proteína de HPPD mutada el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2 ha sido reemplazado de tal modo que la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición correspondiente a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2:
2.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD se deriva de Streptomyces avermitilis (Genebank SAV11864), Daucus carota (Genebank DCU 87257), Arabidopsis thaliana (Genebank AF047834), Mycosphaerella graminicola (Genebank AF038152), Oryza sativa / arroz [BAD26248], Zea mays / maíz [ACN36372], Avena sativa [ABZ23427], Synechococcus [YP_473959], Blepharisma japonicum [BAF91881], Rhodococcus RHA1 sp. ro0240 [YP_702005], Rhodococcus RHA1 sp. ro0341 [YP_703002], Picrophilus torridus [YP_024147], Kordia algicida [ZP_02161490], Sorghum bicolor [XP_002453359], Triticum aestivum / trigo [AAZ67144] u Hordeum vulgare / cebada [O48604].
3.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 4 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 266 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 4 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
4.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 243 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 6 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
5.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 260 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 8 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
6.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 14 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 185 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 14 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
7.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 16 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 228 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 16 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
8.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 18 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 250 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 18 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
9.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 30 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 251 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 30 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
10.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 220 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 20 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
11.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 22 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 238 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 22 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
12.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 24 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 260 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 24 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
13.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 26 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala

110

imagen2

en la posición 256 de la SEC ID N.º: 26 (que corresponde a la posición 269 de la SEC ID N.º: 2).
14.

El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde dicha proteína HPPD comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2 y en donde la secuencia de aminoácidos resultante comprende el aminoácido Ala en la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.
15.

El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha proteína HPPD es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD.
16.

Una proteína codificada por el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
17.

Un gen quimérico que comprende una secuencia codificada que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 unido operativamente a un promotor expresable en plantas y opcionalmente una terminación de transcripción y una región de poliadenilación.
18.

Un procedimiento de obtención de una proteína HPPD mutada capaz de modular la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre HPPD, en donde dicha proteína HPPD mutada tiene actividad HPPD, comprendiendo el procedimiento

i) proporcionar una proteína HPPD;

ii) reemplazar un aminoácido en dicha proteína HPPD de tal forma que la secuencia de aminoácidos resultante comprende Ala en una posición en una proteína HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 269 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 2;

iii) determinar la inhibición de la proteína HPPD resultante por al menos un herbicida que actúa sobre la HPPD,

en donde una inhibición de la proteína resultante de menos o más que la observada con una proteína de HPPD de referencia es indicativa de que la proteína resultante es capaz de modular la tolerancia de una planta a dicho herbicida.
19.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicha proteína HPPD mutada es capaz de incrementar la tolerancia de una planta a al menos un herbicida inhibidor de HPPD.
20.

El ácido nucleico de la reivindicación 16 o el procedimiento de la reivindicación 18, en donde el herbicida que actúa sobre la HPPD es tembrotriona.
21.

Un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende introducir dentro de dicha planta el ácideo nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o un ácido nucleico que codifica la enzima HPPD identificada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, ambos unidos operativamente a un promotor expresable en plantas o el gen quimérico de la reivindicación 18.
22.

El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el ácido nucleico de la reivindicación 15 o un ácido nucleico identificado por el procedimiento de las reivindicaciones 18 o 19, ambos unidos operativamente a un promotor expresable en plantas, o el gen quimérico de la reivindicación 17 que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, se introducen en dicha planta.
23.

El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, en donde dicha proteína HPPD comprende:

a) una His en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 226 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

b) una Ser en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 267 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

c) una Asn en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 282 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

d) una His en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 308 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

e) una Tyr en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 342 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

f) una Glu en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 394 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

g) una Gly en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 420 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2;

111

imagen3

h) un Asn en una posición en una proteína de HPPD, correspondiendo dicha posición a la posición 423 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2.
24. Una célula vegetal que comprende el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 del gen quimérico de la reivindicación 17 en su información genética.

5 25. Una planta, una parte de la misma o un tejido vegetal que consisten esencialmente en las células vegetales de la reivindicación 24.
26.

La planta de las reivindicaciones 25 o 27 que se selecciona de trigo, algodón, colza, arroz, maíz, soja y sorgo.
27.

Un procedimiento de modulación de la tolerancia de una planta a al menos un herbicida que actúa sobre

10 HPPD o de obtención de una planta tolerante a un herbicida inhibidor de la HPPD que comprende introducir el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 unido operativamente a un promotor expresable de plantas o el gen quimérico de la reivindicación 17 dentro del genoma de una planta.
28. Uso de un gen quimérico de la reivindicación 17 o del ácido nucleico de una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 14 unido operativamente a un promotor expresable en plantas para modular la tolerancia de una 15 planta a al menos un herbicida inhibidor de la HPPD aplicado para controlar malas hierbas.
29. El procedimiento de las reivindicaciones 18, 21 o 27 o el uso de la reivindicación 28, en los que se incrementa la tolerancia de una planta a al menos un herbicida inhibidor de la HPPD.

112