ES2473602T3 - Evento de maíz MIR162 - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es única para el evento de maíz MIR162, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo constituido por SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complemetos.

Description

Evento de Maíz MIR162

Antecedentes

La presente invención se refiere generalmente al campo de la biología molecular de plantas, a la transformación de las plantas, y a la propagación de las plantas. De manera más específica, la invención se refiere a plantas de maíz transg�nicas resistentes a los insectos que comprenden un genotipo transg�nico novedoso y a métodos para detectar la presencia de ácidos nucleicos que son únicos para las plantas de maíz transg�nicas en una muestra y composiciones de estas.

Las plagas de las plantas constituyen un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas importantes del mundo. Aproximadamente 8 mil millones de dólares estadounidenses se pierden por año solo en los Estados Unidos debido a infestaciones de plagas no mamíferas, que incluyen insectos. Además de estas pérdidas en los cultivos de los campos, las plagas de insectos también significan una carga para los cultivadores de vegetales y frutas, los productores de flores decorativas y para los jardineros hogareños.

Las plagas de insectos se controlan principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que actúan a través de la inhibición del crecimiento de los insectos, la prevención de la alimentación o reproducción de los insectos, o causan su muerte. El buen control de los insectos se puede lograr de ese modo pero estos productos químicos pueden afectar a veces a otros insectos beneficiosos. Otro problema que resulta del amplio uso de plaguicidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Este hecho se alivi� parcialmente mediante diversas prácticas de control de la resistencia, pero existe una creciente necesidad de agentes de control de plagas alternativos. Los agentes de control de plagas biológicos, como por ejemplo las cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) que expresan toxinas plaguicidas como !-endotoxinas, también se han aplicado a las plantas de maíz con resultados satisfactorios, ofreciendo una alternativa o un complemento para los plaguicidas químicos. Los genes que codifican algunas de estas !-endotoxinas se aislaron y se demostr� que su expresión en huéspedes heter�logos proveía otra herramienta para el control de plagas de insectos importantes desde e�l punto de vista económico. En particular, la expresión de las !-endotoxinas de Bt ha provisto una protección eficiente contra plagas de insectos seleccionadas, y las plantas transg�nicas que expresan dichas toxinas se han comercializado, permitiendo a los granjeros reducir las aplicaciones de agentes químicos para el control de insectos.

Tambi�n, se identificó otra familia de proteínas insecticidas producidas por la especie Bacillus durante la etapa de crecimiento vegetativo (proteínas insecticidas vegetativas (Vip, por sus siglas en inglés)). Las Patentes de Invención estadounidenses números 5.877.012, 6.107.279, y 6.137.033, describen una nueva clase de proteínas insecticidas denominadas Vip3. Otras descripciones, incluidas las de los documentos WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546, y WO 99/57282, ahora han identificado también homólogos de la clase Vip3 de proteínas. Las secuencias que codifican la Vip3 codifican proteínas de aproximadamente 88 kDa que poseen actividad insecticida contra un amplio espectro de plagas de lepid�pteros, con inclusión, pero sin limitación, del gusano cortador negro (BCW, Agrotis ipsilon), gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano de las yemas del tabaco (TBW, Heliothis virescens), gusano perforador de la ca�a de azúcar (SCB, Diatraea saccharalis), gusano saltar�n perforador del tallo de maíz (LCB, Elasmopalpus lignosellus), e isoca del maíz (CEW, Helicoverpa zea), y cuando se expresan en plantas transg�nicas, por ejemplo maíz (Zea mays), confieren protección a la planta contra el daño producido por la alimentación de los insectos.

Los métodos presentes de transformación de plantas generalmente conducen a la integración aleatoria de trasgenes como vip3 en un genoma de planta huésped. Esta inserción aletoria de ADN introducido en el genoma de la planta puede ser letal si resulta que el ADN extraño se inserta en un gen nativo esencialmente importante y, de esa manera, hace mutar a dicho gen. Además, incluso si un evento de inserción aleatoria no perjudica el funcionamiento de un gen de célula huésped, la expresión de un gen extraño insertado puede ser influenciada por los “efectos de posición” causados por el ADN gen�mico circundante. En algunos casos, el gen se inserta en sitios en los que los efectos de la posición son lo suficientemente fuertes para evitar la síntesis de una cantidad efectiva de producto del gen introducido. Por ejemplo, se ha observado en las plantas que pueden existir amplias variaciones en los niveles de expresión de un gen heter�logo introducido en el cromosoma de una planta entre eventos individualmente seleccionados. Pueden existir también diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo diferencias en la expresión relativa de un transgen en diversos tejidos vegetales, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores transcripcionales presentes en el constructo del gen introducido. En otros casos, la sobreproducción del producto g�nico posee efectos perjudiciales sobre la célula. Debido a estos problemas potenciales, es común producir cientos de diferentes eventos y cribar aquellos eventos para escoger un único evento que posee patrones de expresión de transgenes y niveles deseados para fines comerciales. Sin embargo, una vez identificado el sitio comercialmente viable dentro del genoma de una planta, sería ventajoso dirigir los genes de interés a ese sitio no perjudicial.

Se han descripto varios métodos para la inserción dirigida de una secuencia de nucleótidos de interés en un sitio cromos�mico específico dentro de una célula vegetal. Los sistemas de recombinación de sitio específico se han identificado en varios organismos procariotas y eucariotas inferiores. Dichos sistemas comprenden generalmente una o

m�s proteínas que reconocen dos copias de una secuencia de nucleótidos específica, escinden y ligan aquellas secencias de nucleótidos y proveen as� un intercambio de información genética de sitio específico preciso. Varias recombinasas de sitio específico son conocidas en la técnica. Ellas incluyen, pero sin limitación, por ejemplo el sistema del bacteri�fago P1 Cre/lox (Austin et al. (1981) Cell 25: 729-736), el sistema de recominasa R/RS del pl�smido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176), el sistema de recombinasa FLP/FRT del pl�smido 2 .mu.m de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Broach et al. (1982) Cell 29: 227-234), y la recombinasa Int del bacteriofago Lambda (Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 912-949; Landy (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 699-707; Lorbach et al. (2000) J. Mol. Biol. 296: 1175-1181; y WO 01/16345). Una estrategia dirigida de sitio específico particularmente útil, descripta en la Publicación de la Solicitud de Patente de Invención estadounidense No. 2006/0130179, utiliza la recombinación mediada por la integrasa lambda. El método comprende introducir en una célula vegetal una secuencia de nucleótidos objetivo que comprende un primer Sitio de Reconocimiento de Integrasa; introducir en la célula vegetal una secuencia de nucleótidos donante que comprende un segundo Sitio de Reconocimiento de Integrasa; e introducir en la célula vegetal una integrasa o un complejo de integrasa. Otra estrategia dirigida de sitio específico útil se encuentra descripta en la Publicación de la Solicitud de Patente de Invención No. 2006/0253918, que utiliza la recombinación homóloga para integrar uno o más genes (apilamiento de genes) en ubicaciones específicas en el genoma.

Un evento que posee niveles deseados o patrones de expresión de transgenes es útil para introgresionar el transgen en otros antecedentes genéticos mediante un cruce exog�mico (“outcrossing”) sexual con el uso de métodos de cultivo selectivo convencionales. La progenie de dichos cruces mantiene las características de la expresión del transgen del transformante original. Esta estrategia se utiliza para asegurar la expresión confiable del gen en una cantidad de variedades que est� bien adaptada a las condiciones de cultivo locales. Asimismo, sería conveniente poder detectar la presencia de un evento particular a fin de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene un transgen de interés. Además, un método para detectar un evento particular sería útil para cumplir con las normas que requieren la aprobación percomercial y el etiquetado de, por ejemplo, los alimentos derivados de los vegetales de cultivos recombinantes. Es posible detectar la presencia de un transgen mediante cualquier método de detección de ácido nucleico bien conocido, que incluye, pero sin limitación, la amplificación térmica (reacción de cadena de polimerasa (PCR)) conel uso de cebadores de polinucle�tidos o hibridación de ADN con sondas de ácido nucleico. Generalmente, por razones de simpleza y uniformidad de los reactivos y las metodolog�as para utilizar en la detección de un constructo de ADN particular que se utilizó para transformar diversas variedades de plantas, estos métodos de detección generalmente se centran en elementos genéticos utilizados con frecuencia, por ejemplo, promotores, terminadores, y genes marcadores, puesto que para muchos constructos de ADN, la región de la secuencia codificadora es intercambiable. Como resultado, dichos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre constructos que difieren solamente con referencia a la secuencia codificadora. Además, dichos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aquellos producidos con el uso del mismo constructo de ADN a menos que se conozca la secuencia del ADN cromos�mico adyacente al ADN heter�logo insertado ("ADN flanqueante").

Por las razones expuestas precedentemente, existe la necesidad de eventos de maíz transg�nico resistente a los insectos que comprendan secuencias de ácido nucleico novedosas que sean únicas para el evento de maíz transg�nico, útiles para identificar el evento de maíz transg�nico y para detectar los ácidos nucleicos del evento de maíz transg�nico en una muestra biológica, as� como también conjuntos que comprendan a los reactivos necesarios para usar en la detección de estos ácidos nucleicos en una muestra biológica. Existe otra necesidad de proveer sitios objetivos específicos dentro del genoma del maíz a fin de permitir establecer el objetivo y controlar la inserción de secuencias de nucleótidos para que se integren en el genoma de maíz.

S�NTESIS

La presente invención se refiere a un evento de maíz transformado (Zea mays), denominado MIR162 que comprende un genotipo transg�nico nuevo que comprende una secuencia codificadora de vip3Aa20, que es única para el evento MIR162. La secuencia codificadora de vip3Aa20 codifica una proteína insecticida de Vip3Aa20 que confiere resistencia contra los insectos a las plantas de maíz de MIR162. El evento de MIR162 también comprende una secuencia codificadora de pmi que codifica una proteína de PMI que confiere a las células de maíz la capacidad para utilizar manosa como fuente de carbono. Además de la secuencia codificadora de vip3A20, la presente invención también provee otros ácidos nucleicos que son únicos para MIR162. La invención también provee plantas de maíz transg�nicas que comprenden ácidos nucleicos únicos para MIR162, semillas de las plantas de maíz transg�nicas, y describe métodos para producir una planta de maíz transg�nica que comprende los ácidos nucleicos únicos de la invención mediante el cruce de un endog�mico de maíz que comprende los ácidos nucleicos únicos para MIR162 u otra línea de maíz de un genotipo diferente. Un ejemplo de semilla, y por ende de plantas de maíz cultivadas a partir de dichas semillas, que comprende ácidos nucleicos únicos para MIR162 se deposit� en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos del Tipo Estadounidense) con número de acceso PTA-8166. Las plantas de maíz transg�nicas de la invención pueden tener esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas de maíz no transg�nicas isog�nicas además de aquellas conferidas a las plantas de maíz por el nuevo genotipo de la invención. Las muestras biológicas y los extractos, tejidos y semillas de las plantas de maíz MIR162 también se proveen mediante la presente invención. Esta invención también proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de ácidos nucleicos únicos para MIR162 en muestras biológicas basadas en la secuencia de ADN de los casetes de

expresi�n recombinantes insertados en el genoma del maíz que result� en el evento MIR162 y de las secuencias gen�micas que flanquean el sitio de inserción. El evento MIR162 se puede caracterizar también mediante el análisis de los niveles de expresión de las proteínas Vip3Aa20 y PMI como también mediante el sometimiento a prueba del MIR162 para determinar la eficacia contra las plagas de insectos lepid�pteros. La presente invención también provee métodos para producir plantas de maíz trang�nicas a un espectro más amplio de plagas de insectos mediante el apilamiento de un rasgo característico resistente a los insectos de Vip3Aa20 con los rasgos de resistencia a los insectos diferentes a Vip3Aa20.

Los aspectos mencionados anteriormente y otros aspectos de la invención ser�n más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCI�N DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 es la secuencia codificadora de Vip3Aa20 en MIR162. SEC ID NO: 2 es la secuencia de amino�cidos de Vip3Aa20. SEC ID NO: 3 es la secuencia del pl�smido pNOV1300. SEC ID Nos.: 4-12 son cebadores y sondas útiles en un ensayo TAQMAN. SEC ID NO: 13 es la secuencia de una sonda de vip3Aa20. SEC ID NO: 14 es la secuencia de una sonda de pmi. SEC ID Nos: 15-37 son cebadores útiles en la presente invención.

SEC ID No: 38 es la secuencia de un amplic�n de vip3Aa20. SEC ID Nos: 39-40 son cebadores útiles en la presente invención. SEC ID No: 41 es la secuencia del amplic�n de CJ134/179 5'. SEC ID Nos: 42-43 son cebadores útiles en la presente invención. SEC ID NO: 44 es un amplic�n de vip3Aa20 3'. SEC ID NO: 45 es la unión del inserto-genoma 5'. SEC ID NO: 46 es una secuencia de genoma del maíz que flanquea al inserto en 5’.

SEC ID NO: 47 es la unión del inserto –genoma 3’. SEC ID NO: 48 es el genoma de maíz que flanquea al inserto en 3’. SEC ID NO: 49 es el inserto MIR162 y las secuencias flanqueadoras. SEC ID Nos. 50-54 son cebadores útiles en la presente invención. SEC ID NO: 55 es un amplic�n de 5' PCR SEC ID Nos. 56-58 son los cebadores útiles en la presente invención. SEC ID NO: 59 es un amplic�n de PCR 3'. SEC ID Nos. 60-105 son cebadores útiles en la presente invención. SEC ID NO: 106 es la secuencia de la región del cromosoma de maíz 5 que comprende el sitio objetivo cromos�mico descripto. SEQ ID NO: 107 es la secuencia gen�mica de maíz que se reemplazó por la inserción del ADN heter�logo en MIR162.

DESCRIPCI�N DETALLADA

Las siguientes definiciones y métodos se proveen a los efectos de definir de manera más acabada la presente invención y guiar a aquellos con conocimiento común en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otro modo, los términos utilizados aquí deben entenderse de acuerdo con el uso convencional de las personas versadas en la materia relevante. Las definiciones de los términos comunes en biología molecular también se pueden hallar en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1994. En la presente, se utiliza la nomenclatura para las bases de ADN y amino�cidos de acuerdo con lo establecido en el art. 1.822, Título 37 del Código de Normas Federales.

De acuerdo con su uso en la presente, el término "amplificado" significa la construcción de múltiples copias de una molécula de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la molécula de ácido nucleico con el uso de por lo menos una de las moléculas de ácido nucleico como plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen, pero sin limitación, el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en las secuencias de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), sistemas de Q-Beta Replicasa, sistemas de amplificación basados en transcripciones (TAS), y amplificación por reemplazo de hebra (SDA). Véase, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). El producto de la amplificación se denomina un amplic�n.

Una "secuencia codificadora " es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en el ARN, como por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNnp, ARN sentido o ARN antisentido. Preferentemente, el ARN se traduce luego en un organismo para producir una proteína.

Como se utiliza en la presente, el término “maíz” significa maíz Zea e incluye a todas las variedades de plantas que se pueden reproducir con maíz, con inclusión de las especies de maíz silvestres.

“Conjunto de detección” como se usa en la presente se refiere a un conjunto de partes útiles para detectar la presencia

o ausencia de ADN único para las plantas de MIR162 en una muestra, en donde el conjunto comprende sondas y/o cebadores de ácido nucleico de la presente invención, que se hibridan específicamente bajo condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ADN objetivo, y otros materiales necesarios par permitir métodos de amplificación o hibridación de ácido nucleico.

Como se usa en la presente, el término “evento” transg�nico se refiere a una planta recombinante producida por la transformación y regeneración de una célula o tejido vegetal con ADN heter�logo, por ejemplo, un casete de expresión que incluye un gen de interés. El término “evento” se refiere al transformante original y/o progenie del transformante que incluye al ADN heter�logo. El término “evento” se refiere también a la progenie producida por un cruce exog�mico sexual entre el transformante y otra línea de maíz. Incluso luego de una retrocruza repetida a un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del progenitor transformado se encuentra presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromos�mica. El término “evento” se refiere también al ADN del transformante original que comprende al ADN insertado y la secuencia gen�mica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado del que se esperaría que se transfiriera a una progenie que recibe el ADN insertado que incluye al transgen de interés como el resultado de una cruza sexual de una línea pogenitora que incluye al ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultantes de la autopolinización (“selfing”)) y una línea progenitora que no contiene al ADN insertado. Normalmente, la transformación del tejido vegetal produce múltiples eventos, cada uno de los cuales representa la inserción de un constructo de ADN en una ubicación diferente en el genoma de una célula vegetal. En base a la expresión del transgen u otras características deseables, se selecciona un evento en particular. De esta manera, “evento MIR162”, “MIR162” o “evento MIR162” se pueden usar intercambiablemente.

Una planta de maíz MIR162 resistente a los insectos puede reproducirse mediante la cruza sexual de una primera planta de maíz progenitora que comprende una planta de maíz que creció a partir de una planta de maíz transg�nica MIR162, como por ejemplo una planta de maíz MIR162 cultivada a partir de la semilla depositada en la ATCC con el número de acceso PTA-6188, y su progenie derivada de la transformación con casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención que confieren resistencia a los insectos y una segunda planta de maíz progenitora que carece de resistencia a los insectos, para producir as� una pluralidad de plantas de primera progenie; y luego seleccionar una planta de la primera progenie resistente a los insectos; y autopolinizar la planta de la primera progenie, con lo cual se produce una pluralidad de plantas de segunda progenie; y luego seleccionar de las plantas de segunda progenie, una planta resistente a los insectos. Estos pasos pueden incluir además la retrocruza de la planta de la primera progenie resistente a los insectos o la planta de la segunda progenie resistente a los insectos con la segunda planta de maíz progenitora o una tercera planta de maíz progenitora, para producir as� una planta de maíz resistente a los insectos.

"Casete de expresión" como se usa en la presente significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula huésped adecuada, que comprende un promotor unido operablemente a la secuencia de nucleótidos de interés, que est� operablemente unida a las señales de terminación. También, comprende generalmente secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. El casete de expresión puede comprender también secuencias no necesarias en la expresión directa de una secuencia de nucleótidos de interés pero que est�n presentes debido a los sitios de restricción convenientes para la eliminación del casete de un vector de expresión. El casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, es decir que por lo menos uno de sus componentes es heter�logo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede ser uno que se produzca naturalmente pero que se ha obtenido en forma recombinante útil para la expresión heter�loga. Generalmente, sin embargo, el casete de expresión es heter�logo con respecto al huésped, es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no se produce naturalmente en la célula huésped y debe haberse introducido en la célula huésped o un ancestro de la célula huésped mediante un proceso de transformación conocido en la técnica. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solamente cuando la célula huésped se expone a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, como por ejemplo una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido particular, u órgano o etapa de desarrollo. Un casete de expresión, o su fragmento, también se puede mencionar como “secuencia insertada” o “secuencia de inserción” cuando se transforma en una planta.

Un "gen" es una región definida que se ubica dentro de un genoma que, además de la secuencia codificadora mencionada anteriormente, puede comprender otras secuencias de ácido nucleico, principalmente reguladoras, responsables del control de la expresión, es decir la transcripción y traducción de la porción codificadora. Un gen puede también comprender otras secuencias no traducidas 5’ y 3’ y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden hallarse, por ejemplo, son los intrones.

"Gen de interés" se refiere a cualquier gen, cuando se transfiere a una planta, confiere a la planta una característica deseada como por ejemplo una resistencia antibiótica, resistencia a virus, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades o resistencia a otras plagas, tolerancia herbicida, valor nutricional mejorado, desempeño mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada.

“Genotipo” como se usa en la presente es el material genético heredado de las plantas de maíz progenitoras que no se encuentra expresado necesariamente en su totalidad en las plantas de maíz descendientes. El genotipo MIR162 se refiere al material genético heter�logo transformado en el genoma de una planta como también al material genético que flanquea la secuencia insertada.

Una secuencia de ácido nucleico "heterol�ga" es una secuencia de ácido nucleico no asociada naturalmente con una célula h�esped en la que se introduce, incluso copias múltiples no producidas naturalemente de una secuencia de ácido nucleico producida naturalmente.

Una secuencia de ácido nucleico “homóloga” es una secuencia de ácido nucleico asociada naturalmente con una célula huésped en la que se introduce.

“Operablemente unida” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico sobre un único fragmento de ácido nucleico de manera que la función de uno afecte la función del otro. Por ejemplo, un promotor est� operablemente unido con una secuencia codificadora o ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificadora o ARN funcional (es decir, la secuencia codificadora o ARN funcional est� bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras en orientación sentido o antisentido se pueden unir operablemente a las secuencias reguladoras.

“Cebadores”, como se utiliza en la presente, son ácidos nucleicos aislados que son templados a una hebra de ADN objetivo complementaria mediante hibridación del ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN objetivo, y luego extendidos a lo largo de la hebra de ADN objetivo mediante una polimerasa, como por ejemplo ADN polimerasa. Se pueden usar pares o conjuntos de cebadores para la amplificación de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico convencionales.

Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al que se unió una etiqueta detectable convencional o molécula informante, como por ejemplo un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o una enzima. Dicha sonda es complementaria a una hebra de un ácido nucleico objetivo, en el caso de la presente invención, a una hebra de ADN gen�mico del evento de maíz MIR162. El ADN de MIR162 puede provenir de una planta de maíz o de una muestra que incluye ADN de MIR162. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solamente ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y se pueden usar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN objetivo.

Los cebadores y sondas tienen generalmente entre 10 y 15 nucleótidos o más de longitud. Los cebadores y sondas pueden tener al menos 20 nucleótidos o más de longitud, o por lo menos 25 nucleótidos o más, o por lo menos 30 nucleótidos o más de longitud. Dichos cebadores y sondas se hibridan específicamente a una secuencia objetivo bajo condiciones de hidbridaci�n de alta rigurosidad. Los cebadores y las sondas de acuerdo con la presente invención pueden tener una complementariedad de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque las sondas que difieren de la secuencia objetivo y que retienen la capacidad de hibridarse con las secuencias objetivo se pueden diseñar mediante métodos convencionales.

De acuerdo con su uso en la presente, gen o “apilamiento” de rasgos es la combinación de rasgos deseados en una línea transg�nica. Los cultivadores de plantas apilan rasgos transg�nicos mediante cruzas entre progenitores que poseen un rasgo deseado y luego mediante la identificación de la descendencia que posea ambos rasgos deseados. Otra forma de apilar genes es mediante la transferencia de dos o más genes en el núcleo de la célula de una planta al mismo tiempo durante la transformación. Otra forma de apilar genes es mediante la retransformaci�n de una planta transg�nica con otro gen de interés. Por ejemplo, el apilamiento de genes se puede usar para combinar dos rasgos diferentes de resistencia a los insectos, un rasgo de resistencia a los insectos o un rasgo de resistencia a las enfermedades, o un rasgo de resistencia a herbicidas. El uso de un marcador seleccionable además de un gen de interés también se consideraría un apilamiento de genes.

"Condiciones rigurosas " o "condiciones de hibridación rigurosas " incluyen referencias a condiciones bajo las cuales una sonda hibridar� a su secuencia objetivo, con un grado detectablemente mayor que a otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia objetivo y diferirán según la estructura del polinucle�tido. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las secuencias objetivo se pueden identificar para que sean 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para permitir cierto desacoplamiento en las secuencias de manera que se detecten grados menores de similitud (sondeo heter�logo). Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. Una guía extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se halla en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier: Nueva York; y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience: Nueva York (1995), y también Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5a Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

La especificidad es generalmente la función de los lavados poshibridaci�n, en donde los factores críticos son la resistencia iónica y la temperatura de la solución del lavado final. Generalmente, las condiciones de lavado e hibridación de alta rigurosidad se seleccionan a aproximadamente 5�C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica y pH definidos. Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se hibrida a una sonda perfectamente acoplada. Generalmente, bajo condiciones de alta rigurosidad, una sonda se hibridar� a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias.

Un ejemplo de condiciones de hibridación de alta rigurosidad para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que poseen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en un Southern o northern blot es 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42�C, donde la hibridación se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de alta rigurosidad es de NaCl 0,15M a 72�C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado de alta rigurosidad es un lavado de 0,2x de SSC a 65�C durante 15 minutos (Véase, Sambrook, infra, para una descripción del tampón de SSC).

Las condiciones de hibridación ejemplares para la presente invención incluyen la hibridación en 7% de SDS, NaPO4 0,25 M pH 7,2 a 67oC durante la noche, seguido por dos lavados en 5% de SDS, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65oC durante 30 minutos cada lavado, y dos lavados en 1% de SDS, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65oC durante 30 minutos cada lavado. Un lavado de rigurosidad media ejemplar para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45�C durante 15 minutos. Un lavado de rigurosidad baja ejemplar para un dúplex de, por ejemplo más de 100 nucleótidos, es 4-6x de SSC a 40�C durante 15 minutos.

Para las sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos, las condiciones de alta rigurosidad generalmente comprenden concentraciones de sal inferiores a aproximadamente 1.0 M de iones de Na, generalmente una concentración de alrededor de 0,01 a 1,0 M de iones de Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es generalmente de por lo menos aproximadamente 30�C. Las condiciones altamente rigurosas se pueden lograr también con la adición de agentes desestabilizantes, como por ejemplo formamida. En general, una relación de señal y ruido de 2x (o más) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre s� bajo condiciones altamente rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Ello se produce, por ejemplo, cuando una copia de ácido nucleico se crea con el uso de una degeneración de cod�n máxima permitida por el código genético.

Los siguientes son conjuntos ejemplares de condiciones de hibridación/lavado que se pueden utilizar para hibridar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de referencia preferentementes se hibrida a la secuencia de nucleótidos de referencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50�C con un lavado en 2X SSC, 0,1% de SDS a 50�C, más deseablemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50�C con un lavado en 1X de SSC, 0,1% de SDS a 50�C, más deseablemente aún en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50�C con un lavado en 0,5X de SSC, 0,1% de SDS a 50�C, preferentemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50�C con un lavado en 0,1X de SSC, 0,1% de SDS a 50�C, de mayor preferencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50�C con un lavado en 0,1X de SSC, 0,1% de SDS a 65�C. Las secuencias de la presente invención se pueden detectar con el uso de todas las condiciones mencionadas precedentemente. A los efectos de definir la invención, se utilizan condiciones altamente rigurosas.

"Transformación" es un proceso para introducir ácido nucleico heter�logo en una célula huésped u organismo. En particular, "transformación" significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

"Transformado/transg�nico/recombinante" se refieren a un organismo huésped, como por ejemplo una bacteria o una planta, en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heter�loga. La molécula de ácido nucleico puede estar integrada establemente en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromos�mica. Dicha molécula extracromos�mica puede autorreplicarse. Se entiende que las células, tejidos o plantas transformadas comprenden no solamente el producto final de un proceso de transformación, sino también su progenie transg�nica. Un huésped "no transformado", "no transg�nico", o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo una bacteria o una planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heter�loga. Como se usa en la presente, "transg�nico" se refiere a una planta, célula vegetal, o multitud de células vegetales estructuradas o no estructuradas que han integrado, mediante técnicas de manipulación genética e inserción de genes bien conocidas, una secuencia de ácido nucleico que representa un gen de interés en el genoma de la planta, y generalmente en un cromosoma de un núcleo celular, mitocondria, u otro organelo que contiene cromosomas, en un sitio diferente, o en una cantidad de copias superior, a los presentes normalmente en la planta o célula vegetal nativos. Las plantas transg�nicas resultan de la manipulación e inserción de dichas secuencias de ácido nucleico, en contraposición a las mutaciones que se producen naturalmente, a fin de producir una planta que no se produce naturalmente o una planta con un genotipo que no se produce en forma natural. Las técnicas de transformación de plantas y células vegetales son muy conocidas en la técnica y pueden comprender, por ejemplo, la electroporaci�n, microinyecci�n, transformación mediada por Agrobacterium, y transformación balística.

Como se usa en la presente, el término “único” para MIR162 significa característico distintivamente de MIR162. Por lo tanto, los ácidos nucleicos únicos para el evento MIR162 no se hallan en otras plantas de maíz que no son de MIR162.

La clase "Vip3” de proteínas comprende, por ejemplo, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba, y Vip3Bb, y sus homólogos. "Homólogo" significa que la proteína o polip�ptido indicado porta una relación definida con otros miembros de la clase Vip3 de proteínas. “Vip3Aa20” es un homólogo de Vip3 único para el evento MIR162. Se gener� mediante mutaciones espontáneas introducidas en el gen vip3Aa19 optimizado del maíz, comprendido en pNOV1300 (SEC ID NO: 3) durante el proceso de transformación de la planta.

La presente invención se refiere a una línea genéticamente mejorada de maíz que produce una proteína de control de insectos, Vip3Aa20, y una enzima fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite a la planta utilizar manosa como fuente de carbono. La invención se dirige particularmente a un evento de maíz transg�nico denominado MIR162 que comprende un genotipo nuevo, as� como también a composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos únicos para MIR162 en una muestra biológica. La invención se refiere también a plantas de maíz que comprenden al genotipo de MIR162 y a la semilla transg�nica de las plantas de maíz. Las plantas de maíz que comprenden al genotipo de MIR162 de la invención son útiles para controlar las plagas de insectos leptid�pteros, que incluyen, pero sin limitación, al gusano cortador negro (BCW, Agrotis ipsilon), gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano de las yemas del tabaco (TBW, Heliothis virescens), gusano perforador de la ca�a de azúcar (SCB, Diatraea saccharalis), gusano saltar�n perforador de los tallos de maíz (LCB, Elasmopalpus lignosellus), isoca del maíz (CEW, Helicoverpa zea), oruga de frijol occidental (WBCW, Striacosta albicosta).

En una realización, la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es única para el evento MIR162.

En otra realización, la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que es única para el evento MIR162 y se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complementos.

Se describe también una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos una secuencia de unión del evento MIR162, en donde una secuencia de unión atraviesa la unión entre un casete de expresión heter�logo insertado en el genoma del maíz y el ADN del genoma del maíz que flanquea el sitio de inserción y que es diagnóstico para el evento. Preferentemente, la secuencia de unión se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, y sus complementos.

Se describe también una molécula de ácido nucleico aislada que une una molécula de ADN heter�loga al genoma de la planta de maíz en el evento MIR162 que comprende una secuencia de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que comprende las SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, y sus complementos.

En un aspecto de esta realización, la molécula de ácido nucleico aislada se encuentra comprendida en una semilla de maíz depositada en la American Type Culture Collection con el número de acceso PTA-8166, o en plantas cultivadas a partir de la semilla.

Tambi�n se describe un amplic�n que comprende una secuencia de nucleótidos única para el evento MIR162. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complementos.

Tambi�n se describen secuencias flanqueantes para detectar el evento MIR162. Dichos cebadores de secuencias flanqueantes comprenden una secuencia de nucleótidos de por lo menos 10-15 nucleótidos contiguos de la secuencia flanqueante 5' o 3'. En un aspecto de esta realización, los nucleótidos contiguos se seleccionan de los nucleótidos 11088 (inclusive) de la SEC ID NO: 49 (denominada arbitrariamente en la presente como secuencia flanqueante 5’), o sus complementos. Preferentemente, los cebadores de la secuencia flanqueante 5' se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 53, SEC ID números: 68-80, y sus complementos. Los nucleótidos contiguos también se pueden seleccionar de los nucleótidos 9391-10579 (inclusive) de la SEQ ID NO: 49 (denominada arbitrariamente como secuencia flanqueante 3'), o sus complementos. En incluso otro aspecto, los cebadores de la secuencia flanqueante 3' se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID NO: 58, SEC ID Números: 97-105, y sus complementos.

Tambi�n se describe un par de cebadores de polinucle�tidos que comprenden un primer cebador de polinucle�tido y un segundo cebador de polinucle�tido que funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN de evento MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento MIR162. Preferentemente, el primer cebador y/o el segundo cebador se eligen de la SEC ID NO: 1 o su complemento o el primer cebador y/o el segundo cebador se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NOs: 15-35, SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 42, y sus complementos. El

amplic�n que es producido por el par de cebadores comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 44, o sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende un par de cebadores de polinucle�tidos que comprende un primer cebador de polinucle�tido y un segundo cebador de polinucle�tido que funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN de evento MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento MIR162, en donde el primer cebador comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende los nucleótidos 1-1088 de la SEC ID NO: 49, nucleótidos 9391-10579 de la SEC ID NO: 49, y sus complementos y donde el segundo cebador de polinucle�tido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de la posición 1089-9390 de la SEC ID NO: 49, o sus complementos. En otro aspecto de esta realización, el primer cebador se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 58, SEC ID NOs: 68-72, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID números 97-105, y sus complementos. En incluso otro aspecto de esta realización, el segundo cebador de polinucle�tido se selecciona del grupo que comprende las SEC ID números: 1535, SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 40, SEC ID: 50-52, SEC ID: 54, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 96, y sus complementos.

El primer cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 36, y el segundo cebador de polinucle�tido que est� establecido en la SEC ID NO: 37, funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento MIR162 como se describe en el Ejemplo 4. El amplic�n comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 38.

Tambi�n, el primer cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 39, y el segundo cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 40, funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento de maíz MIR162 como se describe en el Ejemplo 4. El amplic�n comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 41.

Adem�s, el primer cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 53, y el segundo cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 54, funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento de maíz MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagns�tico para el evento de maíz MIR162 como se describe en el Ejemplo 5. En la presente, el amplic�n comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 55.

Finalmente, el primer cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 58, y el segundo cebador de polinucle�tido, que est� establecido en la SEC ID NO: 56, funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento de maíz MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento de maíz MIR162 como se encuentra descripto en el Ejemplo 5. El amplic�n comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO:

59.

Por supuesto, se encuentra dentro de la habilidad en la técnica la obtención de secuencias adicionales más afuera en la secuencia de genoma que flanquea cualquiera de los extremos de las secuencias de ADN heter�logas insertadas para utilizar como secuencia de cebadores que se puede utilizar en dichos pares de cebadores para amplificar las secuencias que son diagnósticos del evento MIR162. Para los fines de la presente descripción, la frase "más afuera en la secuencia del genoma que flanquea cualquiera de los extremos de las secuencias de ADN heter�logas insertadas" se refiere específicamente al movimiento secuencial alejándose de los extremos de las secuencias de ADN heter�logas insertadas, en cuyos puntos las secuencias de ADN insertadas est�n adyacentes a la secuencia de ADN gen�mica nativa, y hacia afuera hacia el interior del ADN gen�mico del cromosoma particular en el que se insertaron las secuencias de ADN heter�logas. Preferentemente, una secuencia de cebadores correspondiente o complementaria a una parte de la secuencia de inserción debería cebar la extensión transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de secuencias flanqueantes más cercana. En consecuencia, una secuencia de cebadores correspondiente o complementaria a una parte de la secuencia flanqueante gen�mica debería cebar la extensión transcripcional de una hebra naciente de ADN o ARN hacia la unión de las secuencias flanqueantes más cercana. Una secuencia de cebadores puede ser, o ser complementaria de, una secuencia de ADN heter�loga insertada en el cromosoma de la planta, o una secuencia flanqueante gen�mica. Un experto en la técnica reconocería fácilmente el beneficio de si una secuencia de cebadores necesitaría ser, o ser complementaria de, la secuencia como se establece dentro de la secuencia de ADN heter�loga insertada o como se establece en la SEC ID NO: 38 según la naturaleza del producto deseado que se obtendr� con el uso del conjunto anidado de cebadores que se han de utilizar para la amplificación de una secuencia flanqueante particular que contiene la unión entre la secuencia de ADN gen�mico y la secuencia de ADN heter�loga.

En otra realización, la presente invención comprende una proteína insecticida aislada que comprende la SEC ID NO: 2 y una molécula de ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 2. En un aspecto de esta realización, la molécula de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1. La presente invención también comprende un gen quimérico que comprende un promotor heter�logo operablemente unido a la molécula de ácido nucleico, y a vectores recombinantes y células huésped que comprenden al gen quimérico.

En incluso otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que es única para el evento MIR162 en una muestra que comprende ácidos nucleicos de maíz, en donde el método comprende: (a) contactar la muestra con un par de cebadores de polinucle�tidos que, al utilizarse con una reacción de amplificación de ácido nucleico con un ADN gen�mico del evento MIR162, produce un amplic�n que es diagnóstico del evento MIR162; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, para producir as� al amplic�n; y (c) detectar el amplic�n. En un aspecto de esta invención, el amplic�n comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complementos.

En otra realización, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que es única para el evento MIR162 en una muestra que comprende ácidos nucleicos de maíz, en donde el método comprende: (a) contactar la muestra con una sonda que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con ADN gen�mico del evento MIR162 y no se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con ADN de una planta de maíz de control; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación altamente rigurosas; y (c) detectar la hibridación de la sonda al ADN. La detección se puede realizar mediante cualquier medio bien conocido en la técnica, que incluye la técnica fluorescente, quemiluminiscente, radiol�gica, inmunol�gica, y similares. En el caso en el que la hibridación se pretende utilizar como medio para la amplificación de una secuencia en particular para producir un amplic�n que es diagnóstico para el evento MIR162, la producción y detección por cualquier medio bien conocido en la técnica del amplic�n tiene como objectivo la hibridación pretendida a la secuencia objetivo en donde se utiliza una sonda o un cebador, o secuencias en las que se utilizan dos o más sondas o cebadores. El término "muestra biológica " comprende una muestra que contiene o de la que se sospecha que contiene un ácido nucleico que comprende entre cinco y diez nucleótidos en cualquiera de los lados del punto en el que uno o el otro de los dos extremos terminales de la secuencia de ADN heter�loga insertada se contacta con la secuencia de ADN gen�mica dentro del cromosoma en el que se insert� la secuencia de ADN heter�loga, conocidas aquí también como las secuencias de unión. Además, la secuencia de unión comprende tan solo dos nucleótidos: aquellos que constituyen el primer nucleótido dentro del ADN gen�mico flanqueante adyacente y unido convalentemente al primer nucleótido dentro de la secuencia de ADN heter�loga insertada. En un aspecto de esta realización, la sonda comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complementos.

En incluso otra realización, la presente invención comprende un kit para la detección de ácidos nucleicos que son únicos para el evento MIR162 en una muestra biológica. El conjunto incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico de longitud suficiente de polinucle�tidos contiguos para funcionar como un cebador o una sonda en un método de detección de ácido nucleico, y que ante la amplificación de o hibridación a una secuencia objetivo de ácido nucleico en una muestra seguida de la detección del amplic�n o la hibridación a la secuencia objetivo, sirve de diagnóstico para la presencia de secuencias de ácidos nucleicos únicas para el evento MIR162 en la muestra. El conjunto además incluye otros materiales necesarios para posibilitar los métodos de amplificación o hibridación de ácidos nucleicos. En un aspecto de esta realización, una molécula de ácido nucleico contenida en el conjunto comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 49. En otro aspecto de esta realización, la molécula de ácido nucleico es un cebador seleccionado del grupo que comprende las SEC ID NOs: 15-37, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NOs: 50-54, SEC ID NOs: 56-58, SEC ID NOs: 60-105, y sus complementos. En incluso otro aspecto de esta realización, el amplic�n comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, o sus complementos. Se puede utilizar una diversidad de métodos de detección que incluyen, pero sin limitación, TAQMAN (Perkin Elmer), amplificación térmica, reacción en cadena de la ligasa, hibridación southern, métodos ELISA, y métodos de detección colorim�trico y fluorescente. En particular, la presente invención provee conjuntos para detectar la presencia de la secuencia objetivo, es decir, por lo menos la secuencia de vip3Aa20 o una secuencia de unión, en una muestra que contiene ácido nucleico gen�mico de MIR162. El conjunto comprende por lo menos un polinucle�tido capaz de unirse al sitio objetivo o sustancialmente adyacente al sitio objetivo y por lo menos un medio para detectar la unión del polinucle�tido al sitio objetivo. El medio de detección puede ser fluorescente, quemiluminiscente, colorim�trico, o isot�pico y se puede acoplar por lo menos con métodos inmunol�gicos para detectar la unión. Un conjunto también se prev� que puede detectar la presencia del sitio objetivo en una muestra, es decir, por lo menos la secuencia de vip3Aa20 o una secuencia de unión de MIR162, aprovechando dos o más secuencias de polinucle�tidos que juntas son capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos adyacentes o dentro de aproximadamente 100 pares de base, o dentro de aproximadamente 200 pares de base, o dentro de aproximadamente 500 pares de base o dentro de aproximadamente 1000 pares de base de la secuencia objetivo y que se pueden extender una hacia la otra para formar un amplic�n que contiene por lo menos el sitio objetivo.

Tambien se describe un método para detectar la proteína Vip3Aa20 en una muestra biológica, en donde el método comprende: (a) extraer la proteína del tejido del evento MIR162; (b) evaluar la proteína extraída con el uso de un método inmunol�gico que comprende el anticuerpo específico para la proteína Vip3Aa20 producida por el evento MIR162; y (c) detectar la unión de dicho anticuerpo a la proteína Vip3Aa20.

En incluso otra realización, la presente invención comprende una muestra biológica derivada de una planta de maíz, tejido o semilla del evento MIR162, en donde la muestra comprende una secuencia de nucleótidos que es, o es complementaria de, una secuencia que es única para el evento MIR162, y en donde la secuencia es detectable en la

muestra con el uso de un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. En un aspecto de esta realización, la secuencia de nucleótidos es, o es complementaria de las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, o SEC ID NO: 59. En otro aspecto de esta realización, la muestra se selecciona del grupo que comprende harina de maíz, polenta de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados total o parcialmente para que contengan subproductos del maíz.

Tambi�n se describe un extracto de una muestra biológica derivada de una planta de maíz, tejido o semilla de MIR162 que comprende una secuencia de nucleótidos que es o es complementaria de una secuencia que es única para MIR162. La secuencia es detectable en el extracto con el uso de un método de amplificación de ácido nucleico o hibridación de ácido nucleico. Preferentemente, la secuencia es o es complementaria de las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, o SEC ID NO: 59. La muestra se puede seleccionar del grupo que comprende harina de maíz, polenta de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, y cereales producidos total o parcialmente para que contengan subproductos del maíz.

Otra realización de la presente invención comprende una planta de maíz, o partes de ella y la semilla de una planta de maíz que comprende el genotipo del evento transg�nico MIR162, en donde el genotipo comprende una secuencia de nucleótidos establecida en las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, o sus complementos. Un ejemplo de semilla de maíz que comprende las moléculas de ácido nucleico de la invención se deposit� el 23 de enero de 2007 y recibió el número de Acceso PTA8166 de la ATCC. En un aspecto de esta realización, la planta de maíz es de las líneas de maíz endog�micas CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, NPH8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT, y 2070BT. Un experto en la técnica reconocer�, sin embargo, que el genotipo MIR162 se puede introgresar en cualquier variedad de planta que se pueda reproducir con maíz, incluso con especies de maíz salvajes y, por ende, la lista de líneas endog�micas de esta realización no es limitativa.

Tambi�n se describe una planta de maíz que comprende por lo menos una primera y una segunda secuencia de ADN unidas juntas para formar una secuencia de nucleótidos contigua, en donde la primera secuencia de ADN se encuentra dentro de una secuencia de unión y comprende por lo menos aproximadamente 11 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que comprende a los nucleótidos 1079-1098 de la SEC ID NO: 49, nucleótidos 9381-9400, y sus complementos, en donde la segunda secuencia de ADN se encuentra dentro de la secuencia de ADN heter�loga de inserción establecida en la SEC ID NO: 49, y sus complementos; y en donde las secuencias de ADN primera y segunda son útiles como cebadores o sondas de nucleótidos para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico del evento MIR162 del maíz en una muestra biológica. En un aspecto de la realización, los cebadores de nucleótidos se utilizan en un método de amplificación de ADN para amplificar una secuencia de ADN objetivo a partir del ADN de plantilla extraido de la planta de maíz y la planta de maíz se puede identificar a partir de otras plantas de maíz mediante la producción de un amplic�n correspondiente a una secuencia de ADN que comprende las SEC ID NO: 45 o SEC ID NO: 47.

Las plantas de maíz de la invención se pueden caracterizar además porque la digestión simultánea del ADN gen�mico de la planta con las endonucleasas de restricción KpnI, EcoRV o NcoI resulta en una banda de hibridación de vip3A20 de aproximadamente 8 kb, 13 kb o 4,6, respectivamente, con el uso de una sonda de vip3Aa20 bajo condiciones de alta rigurosidad. En la presente, se ejemplifica una sonda de vip3Aa20 que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 13.

Las plantas de maíz de la invención se pueden caracterizar además porque la digestión del ADN gen�mico de la planta con la endonucleasa de restricción Acc65I o BamHI resulta en una única banda de hibridación pmi con el uso de una sonda pmi bajo condiciones de alta rigurosidad. En la presente, se ejemplifica una sonda pmi que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 14.

En una realización, la presente invención provee una planta de maíz, en donde el genotipo de MIR162 confiere a la planta de maíz resistencia a los insectos o la capacidad de utilizar manosa como fuente de carbono, o tanto la resistencia a los insectos como la capacidad de utilizar manosa como fuente de carbono. En un aspecto de esta realización, el genotipo transg�nico que confiere resistencia a los insectos a la planta de maíz de la invención comprende un gen vip3Aa20 y el genotipo transg�nico que confiere la capacidad de utilizar manosa como fuente de carbono a la planta de maíz comprende un gen pmi.

Tambi�n se describe un método para producir una planta de maíz resistente a las plagas de lepid�pteros que comprende: (a) cruzar sexualmente una primera planta de maíz progenitora con una segunda planta de maíz progenitora, en donde dicha primera o segunda planta de maíz progenitora comprende ADN del evento MIR162, con lo cual produce una pluralidad de la primera generación de plantas de progenie; (b) seleccionar una primera generación de planta de progenie que sea resistente a una o más plagas de leptid�pteros; (c) autopolinizar la primera generación de planta de progenie; y (d) seleccionar de las plantas de progenie de segunda generación una planta que sea resistente a una o más plagas de lepid�pteros; en donde las plantas de progenie de la segunda generación comprenden una

secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, y SEC ID NO: 59.

Tambi�n se describe un método para producir semillas de maíz híbrido que comprende: (a) sembrar semillas de una primera línea de maíz endog�mico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, y SEC ID NO: 59, y semillas de una segunda línea endog�mica que posee un genotipo diferente; (b) cultivar las plantas de maíz que resultan de dicha siembra hasta el florecimiento; (c) emascular las flores de las plantas de una de las líneas endog�micas de maíz; (d) cruzar sexualmente las dos líneas endog�micas diferentes entre s�; y (e) cosechar la semilla híbrida producida de ese modo. La primera línea de maíz endog�mica puede proveer progenitores hembras. La primera línea de maíz endog�mica provee progenitores machos.

Un experto en la técnica reconocer� que el genotipo transg�nico de MIR162 se puede introgresar mediante la reproducción en otras líneas de maíz que comprenden diferentes genotipos transg�nicos. Por ejemplo, una endogamia en maíz de MIR162 se puede cruzar con una endogamia en maíz que comprende el genotipo transg�nico del evento Bt11 resitente a los lepid�pteros (Patentes de Invención estadounidenses Nos. 6.114.608 y 6.342.660). La semilla y las planta de progenie resultantes poseen las características de resistencia a los insectos apiladas y el espectro combinado de actividad de Cry1Ab y Vip3Aa20. Otro apilamiento de rasgo comprendido por la presente invención incluye la combinación del rasgo de MIR162 de resistencia a los insectos y el rasgo de resistencia a los insectos MIR604 (Publicación de solicitud de patente de invención estadounidense No. 2005/0216970, publicada el 29 de septiembre de 2005). Los rasgos de apilamiento en la semilla resultante y en la progenie confieren a las plantas un espectro de actividad aumentado; es decir, las plantas son activas contra las plagas de insectos lepid�pteros y cole�pteros.

Tambi�n se describe un método para proteger una planta de maíz transg�nica del daño producido por la alimentación de una o más plagas de insectos en donde el método comprende apilar en la misma planta de maíz transg�nica un rasgo de Vip3Aa20 de resistencia a los insectos con otro rasgos de resistencia a los insectos que sea diferente a Vip3Aa20, por lo cual los rasgos apilados protegen a la planta de maíz contra el daño producido por la alimentación de una o más plagas de insectos en un grado mayor al que se esperaría debido a los rasgos de resistencia a los insectos solos. En un aspecto de esta realización, el rasgo de Vip3Aa20 de resistencia a los insectos en el evento MIR162 se apila con el rasgo de resistencia a los insectos Cry3A055 comprendido en el evento MIR604 en la misma planta de maíz transg�nica mediante el cruce sexual del evento MIR162 con el evento MIR604 o mediante la transformación de los rasgos juntos en la misma planta.

Los ejemplos de otros eventos transg�nicos que se pueden cruzar con una endogamia de MIR162 incluyen al evento GA21 tolerante al glifosato, el evento MON802 resistente a los insectos lepid�pteros/tolerante al glifosato, el evento DBT418 resistente a los lepid�pteros, el evento estéril macho MS3, el evento B16 tolerante a fosfinotricina, el evento MON 80100 resistente a los insectos lepid�pteros, los eventos T14 y T25 tolerantes a la fosfinotricina, el evento 176 resistente a los insectos lepid�pteros, y el evento MON863 resistente a los cole�pteros, todos ellos son conocidos en la técnica. Se reconocer� además que otras combinaciones o apilamientos se pueden realizar con el genotipo transg�nico de la invención y, por ende, estos ejemplos no deberían verse como limitativos.

Un experto en la técnica reconocer� también que la semilla de maíz transg�nica que comprende al genotipo MIR162 se puede tratar con diversos productos químicos de tratamiento de semillas, que incluyen insecticidas, para aumentar o sinergizar la actividad insecticida de la proteína Vip3Aa20.

La presente divulgación describe en la presente un sitio específico en el cromosoma 5 en el genoma de maíz que es excelente para la inserción de ácidos nucleicos heter�logos. También, se describe un marcador molecular de 5' (opie2; nucleótidos 1680-3338 de la SEC ID NO: 106) y un marcador molecular de 3' (gag; nucleótidos 43,275-45,086 de la SEC ID NO: 106) útiles para identificar la ubicación de un sitio de dirección de objetivo en el cromosoma 5. Una opción para lograr dicha integración establecida como objetivo consiste en sustituir un inserto diferente en lugar del casete de expresión de vip3Aa20 ejemplificado en la presente. En este respecto general, la recombinación homóloga establecido como objetivo, por ejemplo sin limitación, se puede utilizar. "Recombinación homóloga" se refiere a una reacción entre cualquier par de secuencias de nucleótidos que poseen sitios correspondientes que contienen una secuencia de nucleótidos similar (es decir, secuencias homólogas) a través de la cual las dos moléculas pueden interactuar (recombinar) para formar una nueva secuencia de ADN recombinante. Los sitios de secuencia de nucleótidos similar se mencionan cada uno en la presente como “secuencia de homología". Generalmente, la frecuencia de la recombinación homóloga aumenta a medida que aumenta la longitud de la secuencia de homología. De esta manera, mientras la recombinación homóloga se puede producir entre dos secuencias de nucleótidos que son menos que idénticas, la frecuencia de recombinación (o eficiencia) disminuye a medida que aumenta la divergencia entre las dos secuencias. La recombinación se puede lograr con el uso de una secuencia de homología sobre cada una de las moléculas donante y objetivo, con lo cual se genera un producto de recombinación de "cruce único". Como alternativa, dos secuencias de homología se pueden colocar sobre cada una de las secuencias de nucleótidos objetivo y donante. La recombinación entre dos secuencias de homología sobre el donante con dos secuencias de homología sobre el objetivo genera un producto de recombinación de "cruce doble". Si las secuencias de homología sobre la molécula donante flanquean una secuencia que se ha de manipular (por ejemplo, una secuencia de interés), la recombinación de doble cruce con la molécula objetivo resultar� en un producto de recombinación en donde la secuencia de interés reemplaza una

secuencia de ADN que estaba originalmente entre las secuencias de homología sobre la molécula objetivo. El intercambio de la secuencia de ADN entre la objetivo y la donante a través de un evento de recombinación de doble cruza se denomina "reemplazo de secuencias". Este tipo de tecnología es el tema de, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de Invención estadounidense No. 2006/0253918. Con el sitio objetivo descripto que se identifica ahora y con las secuencias que rodean al sitio objetivo identificado, el experto en la técnica reconocer� que se pueden utilizar otros métodos para la integración establecida como objetivo de ácidos nucleicos heter�logos. Estos métodos, por ejemplo, sin limitación, se describen en la Publicación de Patente de Invención estadounidense No. 2007/0039074 y en la Publicación de la Solicitud de Patente de Invención estadounidense No. 2006/0130179.

Tambi�n se describe en la presente un sitio objetivo cromos�mico de maíz ubicado en el cromosoma 5 entre un marcador molecular opie2 establecido como nucleótidos 1680-3338 de la SEC ID NO: 106 y un marcador molecular gag establecido como nucleótidos 43,275-45,086 de la SEC ID NO: 106, en donde el sitio objetivo comprende un ácido nucleico heter�logo. El sitio objetivo cromos�mico del maíz se encuentra sobre el cromosoma 5 entre los nucleótidos

25.454 y 25.513 de la SEC ID NO: 106. En incluso otra realización, el sitio objetivo cromos�mico es 5’ flanqueado por los nucleótidos 5.454 a 25.454 de la SEC ID NO: 106 y 3’ flanqueado por los nucleótidos 25.513 a 45.513 de la SEC ID NO: 106.

El genotipo transg�nico de la presente invención se puede introgresar en cualquier endogamia o híbrido de maíz con el uso de técnicas de propagación reconocidas. El objetivo de la propagación de plantas consiste en combinar en una sola variedad o híbrido diversos rasgos deseables. Para los cultivos de campo, estos rasgos pueden incluir resistencia a los insectos y enfermedades, tolerancia a los herbicidas, tolerancia al calor y a la sequía, reducción del tiempo para alcanzar la madurez, mayor rendimiento, y una mejor calidad agrónoma. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, la uniformidad de las características de las plantas, tales como la germinación y el establecimiento de pl�ntulas, velocidad de crecimiento, madurez y altura de la planta y de la espiga, son importantes.

Los cultivos de campo se propagan a través de técnicas que toman ventaja del método de polinizaci�n de la planta. Una planta se autopoliniza si el polen de una flor se transfiere a la misma flor o a otra flor de la misma planta. Una planta se poliniza por cruza si el polen proviene de otra flor de una planta diferente.

Las plantas que se han autopolinizado y seleccionado por tipo para muchas generaciones se vuelven homocig�ticas en casi toda la posición del gen y producen una población uniforme de progenie de endogamia verdadera. Una cruza entre dos líneas homocig�ticas diferentes produce una población uniforme de plantas híbridas que pueden ser heterocig�ticas para muchas posiciones del gen. Una cruza de dos plantas, cada una de ellas heterocig�ticas, en una cantidad de posiciones del gen producir� una población de plantas híbridas que difieren genéticamente y no ser�n uniformes.

El maíz (Zea mays L.) se puede propagar mediante técnicas de autopolinización o polinizaci�n cruzada. El maíz tiene flores macho y flores hembra en la misma planta, ubicadas en la espiga y espiguilla, respectivamente. La polinizaci�n natural se produce en el maíz cuando el viento sopla el polen de las espigas a las sedas que sobresalen de las puntas de las espigas.

Un método confiable para controlar la fertilidad masculina de las plantas ofrece la oportunidad de una propagación mejorada de las plantas. Ello es especialmente cierto para el desarrollo de híbridos de maíz, que reside en alguna clase de sistema de esterilidad masculina. Existen varias opciones para controlar la fertilidad masculina disponibles para los cultivadores, tales como la emasculaci�n manual o mecánica (o desespigamiento), esterilidad masculina citopl�smica, esterilidad masculina genética, gametocidas y similares.

La semilla de maíz híbrida se produce generalmente mediante un sistema de esterilidad masculina que incorpora el desespigamiento manual o mecánico. Las hileras alternadas de dos endogamias de maíz se plantan en un campo, y las espigas que portan el polen se retiran de uno de los endog�micos (hembra). Con la condición de que exista un aislamiento suficiente de otras fuentes de polen de maíz ex�genas, las espigas del endog�mico desespigado se fertilizarán solamente del otro endog�mico (macho), y la semila resultante es, por lo tanto, híbrida y formar� plantas híbridas.

El proceso de desespigamiento trabajoso, y ocasionalmente desconfiable, se puede evitar mediante el uso de muchos de los métodos de otorgamiento de esterilidad genética masculina de la técnica, cada uno de los cuales presenta sus propios beneficios y desventajas. Estos métodos utilizan una diversidad de estrategias, como por ejemplo la administración a la planta de un gen que codifica una sustancia citot�xica asociada con un promotor de tejido específico

o un sistema de antisentido en el que se identifica un gen esencial para la fertilidad y se inserta un antisentido a ese gen en la planta (Véase: Fabinjanski, et al. EPO 89/3010153.8 publicación no. 329.308 y solicitud PCT PCT/CA90/00037 publicada como WO 90/08828).

El uso de endog�micos estériles machos es solo un factor en la producción de híbridos de maíz. Las técnicas de propagación de plantas conocidas en la técnica y utilizadas en un programa de propagación de plantas de maíz incluyen, pero sin limitación, la selección recurrente, retrocruza, propagación de pedigr�, selección aumentada del polimorfismo de longitud de restricción, selección y transformación aumentada por un marcador genético. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de propagación de plantas de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas de

endog�micos homocig�ticos, la cruza de estas líneas, y la evaluación de las cruzas. Los métodos de propagación de pedigr� y propagación por selección recurrente se utilizan para desarrollar líneas de endog�micos de poblaciones de propagación. Los programas de propagación de plantas de maíz combinan los antecedentes genéticos de dos o más líneas endog�micas u otras diversas fuentes de germplasma en conjuntos de propagación a partir de los cuales se desarrollan nuevas líneas endog�micas por autopolinización y selección de los fenotipos deseados. Los nuevos endog�micos se cruzan con otras líneas endog�micas y los híbridos de estas cruzas se evalúan para determinar cuáles son las que tienen potencial comercial. La propagación de plantas y el desarrollo de híbridos, como se practican en un pragrama de propagación y mejoramiento de plantas de maíz, son procesos costosos y que llevan mucho tiempo.

La propagación de pedigr�s comienza con la cruza de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables que le falta al otro o que complementa al otro. Si los dos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de propagación. En el método de pedigr�, las plantas superiores son autopolinizadas y seleccionadas en generaciones sucesivas. En las siguientes generaciones, la condición heterocig�tica da lugar a las líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y selección. Generalmente, en el método de propagación de pedigr�, se practican cinco o más generaciones de autopolinización y selección: F1 • F2; F2 • F3; F3 �F4; F4 �F.5; etc.

La propagación por selección recurrente, por ejemplo retrocruce, se puede utilizar para mejorar una línea endog�mica y un híbrido que se realiza con el uso de aquellos endog�micos. El retrocruce se puede usar para transferir un rasgo deseable específico a partir de un endog�mico o fuente a un endog�mico que carece de ese rasgo. Ello se puede lograr, por ejemplo, mediante el cruce en primer lugar de un endog�mico superior (progenitor recurrente) a un endog�mico donante (progenitor no recurrente), que porta el o los genes adecuados para el rasgo en cuestión. La progenie de este cruce se aparea luego otra vez con el progenitor recurrente superior seguido por la selección en la progenie resultante para transferir el rasgo deseado desde el progenitor no recurrente. Luego de cinco o más generaciones de retrocruce con la selección de ese rasgo deseado, la progenie ser� homocig�tica para la posición que controla la característica que se transfiere, pero ser� como el progenitor superior para esencialmente todos los demás genes. La última generación de retrocruce se autopoliniza luego para proporcionar una progenie de propagación pura para el o los genes que se transfieren. Un híbrido desarrollado a partir de endog�micos que contienen el o los genes transferidos es esencialmente el mismo que un híbrido desarrollado a partir de los mismos endog�micos sin los genes transferidos.

Las líneas de endog�micos de elite, es decir las líneas de propagación puras, las líneas endog�micas homocig�ticas, también se pueden usar como materiales de partida para poblaciones de propagación o fuente de las que se pueden desarrollar otras líneas endog�micas. Estas líneas endog�micas derivadas de las líneas endog�micas de elite se pueden desarrollar con los métodos de propagación de pedigr� y de selección recurrente descriptos anteriormente. Como ejemplo, cuando se utiliza un retrocruce para crear estas líneas derivadas en un programa de propagación de plantas de maíz, se pueden usar endog�micos de elite como una línea progenitora o como material de partida o población fuente y pueden servir como donante o como progenitor recurrente.

Un único híbrido de maíz de cruza resulta de la cruza de dos líneas endog�micas, cada una de las cuales posee un genotipo que complementa al genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se denomina F1. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de propagación de plantas de maíz, se buscan solamente las plantas híbridas F1. Los h�bridosF1 preferidos son más vigorosos que sus progenitores endog�micos. Este vigor híbrido o heterosis, se puede manifestar en muchos rasgos polig�nicos, que incluyen un aumento del crecimiento vegetativo y un mayor rendimiento.

El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de propagación de plantas de maíz comprende tres pasos: (1) la selección de plantas de diversos conjuntos de germplasma para las cruzas de propagación iniciales; (2) la autopolinización de las plantas seleccionadas a partir de las cruzas de propagación para varias generaciones a fin de producir una serie de líneas endog�micas, que aunque son diferentes una de la otra, se propagan realmente y son altamente uniformes; y (3) el cruce de las líneas endog�micas seleccionadas con diferentes líneas endog�micas para producir la progenie híbrida (F1). Durante el proceso de propagación en el maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor se restaura cuando dos líneas endog�micas diferentes se cruzan para producir la progenie híbrida (F1). Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneidad de las líneas endog�micas es que el híbrido entre un par definido de endog�micos siempre ser� igual. Una vez indentificados los endog�micos que proporcionan un híbrido superior, la semilla del híbrido se puede reproducir indefinidamente con la condición de que se mantenga la homogeneidad de los progenitores endog�micos.

Un híbrido de cruce único se produce cuando se cruzan dos líneas endog�micas para producir la progenie F1. Un híbrido de cruce doble se produce a partir de cuatro líneas endog�micas cruzadas en pares (A X B y C X D) y luego los dos híbridos F1 se cruzan nuevamente (A X B) X (C X D). Un cruce de híbridos de tres formas se produce a partir de tres líneas endog�micas en donde dos de las líneas endog�micas se cruzan (A X B) y luego el híbrido F1 resultante se cruza con el tercer endog�mico (A X B) X C. Una gran cantidad del vigor del híbrido presentado por los híbridos F1 se pierde en la siguiente generación (F2). En consecuencia, la semilla de los híbridos no se utiliza para el stock de plantación.

La producción de semillas híbridas requiere la elminaci�n o inactivaci�n del polen producido por la progenitora. La eliminación o inactivaci�n incompleta del polen provee el potencial para la autopolinización. Esta semilla inadvertidamente autopolinizada puede ser cosechada involuntariamente y envasada con las semillas híbridas.

Una vez plantada la semilla, es posible identificar y seleccionar estas plantas autopolinizadas. Las plantas autopolinizadas ser�n genéticamente equivalentes a la línea endog�mica hembra usada para producir el híbrido.

Generalmente, estas plantas autopolinizadas se pueden identificar y seleccionar debido a su vigor disminuido. Las autopolinizadoras hembras se identifican por su apariencia de menor vigor para las características vegetativas y/o reproductivas, con inclusión de la altura más corta de la planta, el tamaño menor de la espiga, la forma de la espiga y del grano, el color de la mazorca, u otras características.

La identificación de estas líneas autopolinizadas también se puede lograr a través de análisis de marcadores moleculares. Véase, "The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electrophoresis and Morphology", Smith, J. S. C. y Wych, R. D., Seed Science and Technology 14, p�gs. 1-8 (1995). A través de estas tecnologías, la homocigosidad de la línea autopolinizada se puede verificar mediante el análisis de la composición al�lica en diversos lugares a lo largo del genoma. Estos métodos permiten la identificación rápida de la invención descripta en la presente. Véase también, "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol. 20 (1) p. 29-42.

Como ser� fácilmente evidente para un experto en la técnica, lo expuesto precedentemente constituye solamente algunas de las diversas maneras por las que se puede obtener el endog�mico de la presente invención por aquellos que desean introgresar el genotipo transg�nico de la invención en otras líneas de maíz. Otros medios disponibles y los ejemplos indicados anteriormente son solo ilustrativos.

Los siguientes ejemplos tienen por fin simplemente ilustrar una o más realizaciones preferidas de la invención y no han de interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Transformación y Selección del Evento MIR162

El evento MIR604 se produjo por la transformación mediada por Agrobacterium de una línea de maíz patentada (Zea mays). Los embriones inmaduros se transformaron esencialmente de acuerdo con lo descripto en Negrotto et al. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000), con el uso de un fragmento de ADN del pl�smido pNOV1300 (SEQ ID NO: 3). El pNOV1300 contiene una secuencia de nucleótidos que comprende casetes de expresión en t�ndem. El primer casete de expresión comprende una región de promotor ZmUbiInt de un gen de poliubiquitina de Zea mays, que contiene el primer intr�n (GenBank� Número de acceso S94464) unido operablemente a una secuencia codificadora de vip3Aa19 unida además operablemente a un intr�n PEPC #9 del gen fosfoenolpiruvato carboxilasa (GenBank� Número de acceso X15239) de Zea mays (Matsuoka y Minami, 1989. European J. Of Biochem. 181:593-598) y una secuencia terminadora 35S del ARN 35S del genoma del virus mosaico del coliflor (Similar a GenBank�, Número de acceso AF140604). Su función consiste en proveer una secuencia de poliadenilaci�n (Franck et al., 1980. Cell 21:285-294). El gen de vip3Aa19 en pNOV1300 comprende una secuencia codificadora de vip3Aa sintética optimizada de maíz (Estruch, et al., 1999.) que se sintetizó para alojar al uso del cod�n preferido para el maíz (Murray et al., 1989). La secuencia codificadora de vip3Aa19 sintética utilizada en las transformaciones de la planta codifica a la secuencia de amino�cido idéntica como la secuencia codificadora de vip3Aa1 nativa hallada en la cepa de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis AB88 (Patente de Invención estadounidense 5.877.012), con la excepción de la diferencia de un solo amino�cido en la posición 284; la secuencia codificadora de vip3Aa1 nativa codifica lisina, mientras que la secuencia codificadora de vip3Aa19 sintética codifica glutamina en esta posición. La secuencia codificadora de vip3Aa19 codifica una proteína de control de insectos, Vip3Aa19 que provee resistencia a los insectos lepid�pteros. El segundo casete de expresión comprende un promotor de ZmUbiInt unido operablemente a una secuencia codificadora de pmi (también conocida como E.coli manA) que codifica fosfomanosa isomerasa (GenBank� Número de acceso M15380), que cataliza la isomerizaci�n de manosa-6-fosfato a fructosa-6-fosfato (Negrotto et al., 2000). La secuencia codificadora de pmi est� también unida operablemente a una secuencia de poliadenilaci�n y terminación de transcripción de extremo 3’ de nopalina sintasa.

Los embriones inmaduros se extirparon de espigas de 8-12 días de edad y se enjuagaron con un medio fresco para prepararlos para la transformación. Los embriones se mezclaron con la suspensión de células de Agrobacterium que albergaban al vector de transformación pNOV1300, se sometieron a v�rtex durante 30 segundos, y se dejaron incubar durante otros 5 minutos más. Se aspir� el exceso de solución que contenía Agrobacterium y los embriones se transfirieron luego a placas que contenían un medio de cultivo no selectivo. Los embriones se cocultivaron con el resto de Agrobacterium a 22∀C durante 2-3 días en la oscuridad. Los embriones se transfirieron a un medio de cultivo complementado con ticarcilina (100 mg/ml) y nitrato de plata (1,6 mg/l) y se incubaron en la oscuridad durante 10 días. Los embriones que produjeron un callo embriog�nico se transfirieron al medio de cultivo celular que contenía manosa.

Las pl�ntulas regeneradas se sometieron a prueba mediante un análisis de PCR TAQMAN� (véase el Ejemplo 2) para determinar la presencia de ambos genes pmi y vip3Aa19, as� como también la ausencia del gen de espectinomicina (spec) resistente a los antibióticos. Se descubrió luego (Véase el Ejemplo 4 más adelante) que durante el proceso de transformación, se introdujeron dos mutaciones en la secuencia codificadora de vip3Aa19, una de las cuales result� en un cambio de amino�cidos en la proteína Vip3Aa19. Por lo tanto, esta nueva secuencia codificadora de vip3Aa, que es única para el evento MIR162, se denomin� vip3Aa20. La secuencia codificadora vip3Aa20 codifica la isoleucina en la posición 129 en lugar del residuo de metionina condificado por el gen vip3Aa19.

Las plantas positivas para ambos transgenes, y las negativas para el gen spec, se transfirieron al invernadero para su propagación. Los eventos positivos se identificaron y se cribaron con el uso de bioensayos para insectos contra el gusano cogollero. Los eventos insecticidas se caracterizaron para el número de copia mediante el análisis TAQMAN. El MIR162 se eligió para otro análisis por tener una sola copia de transgenes, una buena expresión de proteínas de acuerdo con lo identificado por ELISA, y una buena actividad insecticida contra el gusano cogollero.

El pedigr� de propagación del evento MIR162 fue de la siguiente manera: T0 planta de MIR162 (x NPH8431)�• NPH8431 (MIR162) F1 (x NP2161)�NP2161(MIR162) F1 (x NP2161)�NP2161 (MIR162) BC1F1 (x B9620)�F1 (x B9620)�BC1F1 (x B9620)�BC2F1 (x B9620)�BC3F1 (x B9620)�BC4F1 (x B9620). El material vegetal de la generación BC4 se utilizó para el análisis Southern, la determinación del número de copias y el secuenciamiento del ADN de inserción. Los controles negativos para los experimentos consistieron en 10 vegetales segregantes negativos de la generación BC4.

Ejemplo 2. Detección de MIR162 por PCR TAQMAN

El análisis TAQMAN se realizó esencialmente del modo descripto en Ingham et al. (Biotechniques, 31:132-140, 2001) En resumen, el ADN gen�mico se aisl� de las hojas de plantas de maíz transg�nicas y no transg�nicas con el uso de un conjunto de extracción de ADN gen�mico Puregene� (Gentra Systems, Minneapolis, MN) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que todos los pasos se realizaron en placas de 96 pocillos de 1,2 ml. El pellet de ADN secado se resuspendi� en tampón de TE (Tris-HCl 10 Mm, pH 8,0, EDTA 1mM).

Las reacciones de PCR TAQMAN se realizaron en placas de 96 pocillos. Para el control de genes de maíz end�genos, se diseñaron cebadores y sondas específicos para la secuencia codificadora de alcohol deshidrogenasa de Zea mays (adhI) (Genbank Número de acceso AF044295). El experto en la técnica reconocer� que se pueden usar otros genes de maíz como controles end�genos. Las reacciones se multiplexaron para amplificar simultáneamente la vip3Aa y adhI o pmi y adhI. Para cada muestra, una mezcla maestra combinando 20 #L de ADN gen�mico extraído se gener� con 35 #L 2x de mezcla maestra de PCR TAQMAN Universal (Applied Biosystems) complementado con cebadores hasta una concentración final de 900 nM cada uno, sondas hasta una concentración final de 100 nM cada una, y agua hasta un volumen final de 70 #L. Esta mezcla se distribuyó en tres réplicas de 20 #L cada una en placas de amplificación de 96 pocillos y se sellaron con una película de sellado térmico �pticamente transparente (Marsh Bio Products). La PCR se Ilev� a cabo en el instrumento ABI Prism 7700 con los siguientes parámetros de amplificación: 2 min a 50oC y 10 min a 95oC, seguido por 35 ciclos de 15 s a 95oC y 1 min a 60oC.

Los resultados del análisis TAQMAN demostraron que el evento MIR162 present� una copia del gen vip3Aa20 y una copia del gen pmi.

Los cebadores y las sondas que se usaron en las reacciones de PCR TAQMAN se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Cebadores usados en el ensayo TAQMAN. Nombre del cebador Secuencia del cebador Secuencia No:

Vip3Aa-hacia adelante Vip3Aa –inversa Vip3Aa –sonda

5'CACCTTCAGCAACCCGAACTA3' 5'GCTTAGCCTCCACGATCATCTT3' 5'GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT3' (etiqueta 5' = FAM, etiqueta 3' = TAMRA) SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6

PMI-hacia adelante PMI-inversa PMI-sonda

5'CCGGGTGAATCAGCGTTT3' 5'GCCGTGGCCTTTGACAGT3' 5'TGCCGCCAACGAATCACCGG3' (etiqueta 5' = FAM, etiqueta 3' = TAMRA) SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9

ZmADH-267 hacia adelante ZmADH-337 inversa ZmADH-316 sonda

5'GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT3' 5'TCCAGCAATCCTTGCACCTT3' 5'TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA3' (etiqueta 5' = TET, etiqueta 3' = TAMRA) SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12

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Ejemplo 3. Detección de MIR162 por Southern Blot

El ADN gen�mico que se utiliza para el análisis southern se aisl� del tejido de hoja extraído de 10 plantas que representaba la generación BC4 del MIR162 con el uso esencialmente del método de Thomas et al. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993). Todas las plantas usadas para el aislamiento de ADN se analizaron individualmente con PCR TAQMAN (como se describe en el Ejemplo 2) para confirmar la presencia de una sola copia del gen vip3Aa20 y del gen pmi. Para los controles segregantes negativos, se aisl� ADN de un tejido de hoja extraído de segregantes negativos de la generación BC4. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente con el uso de PCR TAQMAN para confirmar la ausencia de los genes vip3Aa20 y pmi, pero fueron, tal como se esperaba, positivas para el gen adhl de maíz end�geno.

El análisis Southern se realizó con el uso de técnicas de biología molecular convencionales. (Véase Chomczynski, P. 1992. Analytical Biochemistry 201:34-139). El ADN gen�mico DNA (7,5 μg) se digirió con las enzimas de restricción que digieren dentro del inserto del evento MIR162, pero no dentro de la secuencia codificadora que corresponde a la sonda específica utilizada en el experimento. Esta estrategia permitió la determinación de la cantidad de copias de cada gen, que corresponde a la sonda específica utilizada para cada análisis Southern, que se incorpor� en el evento MIR162.

Se realizó otra serie de digestiones de restricción en las que el inserto se digirió con enzimas de restricción que liberarían un fragmento de tamaño conocido del inserto. Esta estrategia proveyó una prueba adicional para la presencia de una sola copia de cada secuencia codificadora presente en MIR162 y permitió la detección de copias parciales del inserto que pueden estar unidas estrechamente al inserto de MIR162. Luego de una electroforesis de gel de agarosa y la transferencia alcalina a una membrana de GT Zeta-Probe� (Bio-Rad, Cat. No. 162-0195), se realizaron hibridaciones con sondas de elementos generados por PCR de longitud completa. Las sondas se etiquetaron con cebaci�n aleatoria via 32P con el sistema MegaPrimeTM (Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1607). La hibridación se realizó a 65�C, seguida de múltiples lavados en 2X SSC, 0,1% de SDS y luego 0,1X de SSC y 0,1% de SDS. Las membranas se sometieron luego a autorradiograf�a.

Se incluyeron en cada análisis Southern tres muestras de control: (1) ADN del segregante negativo (no transformado) usado para identificar cualesquiera secuencias de Zea mays end�genas que pudieran hibridarse por cruzamiento con la sonda de elemento específico; (2) se introdujo ADN de un segregante negativo en el que se introduce una cantidad de pNOV1300 digerido que es igual a un número de copias basado en el tamaño del pl�smido para demostrar la sensibilidad del experimento para detectar una sola copia del gen dentro del genoma de Zea mays; y (3) el pl�smido pNOV1300 digerido igual a un número de copias basado en el tamaño del pl�smido, para actuar como un control positivo para la hibridación, as� como también para demostrar la sensibilidad del experimento.

Los resultados de los análisis Southern demostraron que el inserto de MIR162 contiene una sola copia del gen vip3Aa20 y del gen pmi y no contiene ninguna secuencia de estructura principal de pNOV1300. Una sonda de vip3Aa19 (SEC ID NO: 13) se utilizó para el análisis Southern de vip3Aa20. Las secuencias de nucleótidos de vip3Aa19 y vip3Aa20 difieren por dos nucleótidos y son un 99,9% idénticas. Por lo tanto, la sonda de vip3Aa19 se hibrid� a la secuencia de vip3Aa20 presente en MIR162 bajo condiciones rigurosas. Con el uso de la sonda de vip3Aa19, un digerido KpnI y un digerido EcoRV resultaron en bandas de una sola hibridación de aproximadamente 8 kb y 13 kb de tamaño, respectivamente. Además, un doble digerido de NcoI result� en una sola banda de hibridación coherente con el tamaño esperado de 4,6 kb. Con el uso de la sonda de pmi (SEC ID NO: 14), un digerido Acc65I y un digerido BamHI resultaron en bandas de hibridación única de aproximadamente 4 kb y 6 kb de tamaño, respectivamente. Además, un doble digerido XmaI + HindIII result� en una banda de hibridación única coherente con el tamaño esperado de 8,1 kb. La banda de 8,1 kb, XmaI + HindIII, de pNOV1300 (control positivo) también hibrid� con las sondas de vip3Aa19 y pmi de acuerdo con lo esperado. Alguna hibridación cruzada se detect� en las franjas del pl�smido solamente con la sonda de la escalera del ADN. Las escaleras de ADN generalmente comercialmente disponibles pueden contener algunas secuencias de vectores que pueden tener una hibridación cruzada con las sencuencias de control del pl�smido de acuerdo con lo observado en estos experimentos, pero ello no impacta en los hallazgos de este estudio. Finalmente, una sonda de estructura principal de pNOV1300 no se hibrid�, lo cual demuestra la ausencia de incorporación de cualquier secuencia de estructura principal del vector de pNOV1300 en MIR162 durante el proceso de transformación.

Ejemplo 4. Secuenciamiento del inserto de ADN heter�logo

Se determin� que la secuencia de nucleótidos de las secuencias codificadoras de vip3Aa y pmi en la molécula de ADN heter�loga insertada en MIR162 demuestra una integridad total del inserto, contigüidad de los elementos funcionales y la detección de cualquier cambio en el par de bases individual. Las secuencias codificadoras se amplificaron a partir del ADN derivado de la generación BC4. La amplificación por PCR se realizó con el sistema de PCR de Expansión de Alta Fidelidad (Expand High Fidelity PCR system, Roche, Cat. No. 1732650) o polimerasa de ADN de alta fidelidad de comienzo caliente PfuUltra™ (Hotstart High-Fidelity DNA polymerase) (Stratagene, Cat. No. 600390). Cada producto de la PCR se clon� individualmente en cualquiera de los vectores pCR�-XL-TOPO (Invitrogen, Cat. No. K4700-20) o pCR�-BluntII-TOPO (Invitrogen, Cat. No. K2800-20) y se identificaron tres clones separados para cada producto de PCR y se

secuenciaron. El secuenciamiento se realizó con el analizador ABI3730XL con ABI BigDye� 1,1 o con la química de Big Dye 3.1 dGTP (para las plantillas ricas en GC). El análisis de las secuencias se realizó con el paquete Phred, Phrap, y Consed de la Universidad de Washington y se realizó hasta una velocidad de error inferior a 1 en 10.000 bases (Ewing & Green, 1998. Genome Research 8:186-194). La secuencia de consenso final para cada gen se determin� combinando los datos de la secuencia de los tres clones individuales para generar una secuencia de consenso para cada gen. La alineación de secuencias se realizó con el programa ClustalW con los siguientes parámetros: matriz de clasificación blosum55, falla de apertura de espacio 15, falla de extensión de espacio 6,66 (Thompson et al, 1994. Nucleic Acids Research 22:4673-4680).

La secuencia codificadora completa de vip3Aa20 se amplificó mediante PCR con los cebadores MOV3Aa-01-5': 5'ATGAACAAGAACAACACCAA3' (SEC ID NO: 15) y MOV3Aa-01-3': 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3' (SEC ID NO: 16) y la enzima PfuUltra Hotstart generando un producto 2370bp. El amplic�n de la PCR se secuenci� con los cebadores mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2.

Nombre del cebador

Secuencia (5'�3') Secuencia No.

b03503b

ACGAGCAGAACCAGGTGC SEC ID NO: 17

b03503c

GGTGAAGAAGGACGGCAG SEC ID NO: 18

b03503d

ACCTGTCGCAAGCTGCTGGG SEC ID NO: 19

b03503e

TGGACAAGCTGCTGTGTC SEC ID NO: 20

b03503f

TGCAGGCCGACGAGAACAG SEC ID NO: 21

b03503g

TGATCCAGTACACCGTGAA SEC ID NO: 22

b03503h

ACCCTGACCCTGTACCAG SEC ID NO: 23

b03504b

GTGTTGCCGCTGATGTTG SEC ID NO: 24

b03504c

CGTACTCGGTCTTCGGCT SEC ID NO: 25

b03504d

CTGCAGGCCAAAGCCGTT SEC ID NO: 26

b03504e

TCGCCGTAGATCACCTCG SEC ID NO: 27

b03504f

GCTTGCGACAGGTGGTCA SEC ID NO: 28

b03504g

TTGCTGCTGGTCTCGGTGG SEC ID NO: 29

b03504h

CGTTGGCGATCTTAAGGAT SEC ID NO: 30

b00203c

GCAAGCCATCGATTCAC SEC ID NO: 31

b00203d

GCAACACCCTGACCCTG SEC ID NO: 32

b00203e

TCTACGACGTGAGCATCAAG SEC ID NO: 33

b00203f

GTAGAAGTGCACGATCGGG SEC ID NO: 34

b00203g

CGGTGCTGGTCCAGTTG SEC ID NO: 35

Otras dos reacciones de PCR se superpusieron con la secuencia codificadora completa de vip3Aa20. El extremo 5' de vip3Aa20 se cubrió con una amplificación de PCR con los cebadores 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEC ID NO: 36) y VIP_R4 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEC ID NO: 37) y con la enzima de expansión de alta fidelidad. La segunda reacción cubrió el extremo 3’ de vip3Aa20; el producto se amplificó con los cebadores VIP-F3: 5'GGTGCTGTTCGAGAAGAGGT3' (SEC ID NO: 42) y PMI_REV1: 5'CGATTTATCACTCTCAATCACAT3' (SEC ID NO: 43) y la enzima de expansión de alta fidelidad. Los amplicones generados por estas reacciones comprendieron una secuencia de nucleótidos de 2946 bp (SEC ID NO: 38) y una secuencia de nucleótidos de 2577 bp (SEC ID NO: 44), respectivamente.

Los datos de la secuencia de consenso revelaron dos cambios de nucleótidos en la secuencia codificadora de vip3Aa en MIR162 (denominada vip3Aa20) en comparación con la secuencia condificadora de vip3Aa en pNOV1300 (denominada vip3Aa19), que se utilizó para transformar el MIR162. El primer cambio de nucleótidos, una mutación de G a T, se produjo en la posición 387 de la secuencia codificadora vip3Aa19 (SEC ID NO: 3). Esta mutación result� en que la metionina en la posición 129 de la Vip3Aa19 cambi� a isoleucina en la Vip3Aa20 (M129I). El segundo cambio de nucleótidos se produjo en la posición 1683 de la secuencia codificadora, una mutación de G a C, pero no result� en un cambio de amino�cidos. Por lo tanto, la secuencia codificadora vip3Aa20 y la proteína Vip3Aa20 son únicas para el evento MIR162 y se pueden usar para identificar cualquier planta que comprenda al genotipo transg�nico MIR162. El MIR162 de la secuencia codificadora de pmi fue idéntico a aquel del pl�smido de transformación pNOV1300. Una alineación de las proteínas insecticidas de Vip3Aa20 y Vip3Aa19 se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Comparación de las secuencias de amino�cidos Vip3Aa20 y Vip3Aa19 Nombre Alineación de Secuencias

Vip3Aa20

(1) MNKNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGGDLTLDE

Vip3Aa19

(1) MNKNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGGDLTLDE

18

Vip3Aa20

(51) ILKNQQLLNDISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVL

Vip3Aa19

(51) ILKNQQLLNDISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVL

Vip3Aa20

(101) NDVNNKLDAINTMLRVYLPKITSMLSDVIKQNYALSLQIEYLSKQLQEIS

Vip3Aa19

(101) NDVNNKLDAINTMLRVYLPKITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEIS

Vip3Aa20

(151) DKLDIINVNVLINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETSSKVKKDG

Vip3Aa19

(151) DKLDIINVNVLINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETSSKVKKDG

Vip3Aa20

(201) SPADILDELTELTELAKSVTKNDVDGFEFYLNTFHDVMVGNNLFGRSALK

Vip3Aa19

(201) SPADILDELTELTELAKSVTKNDVDGFEFYLNTFHDVMVGNNLFGRSALK

Vip3Aa20

(251) TASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLIVLTALQAQAFLTLTTCRKLLGLAD

Vip3Aa19

(251) TASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLIVLTALQAQAFLTLTTCRKLLGLAD

Vip3Aa20

(301) IDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPNYAKVKGSDEDAKMIVE

Vip3Aa19

(301) IDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPNYAKVKGSDEDAKMIVE

Vip3Aa20

(351) AKPGHALIGFEISNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVIYGDMDKLL

Vip3Aa19

(351) AKPGHALIGFEISNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVIYGDMDKLL

Vip3Aa20

(401) CPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITKIDFTKKMKTLRYEVTANFYDSSTGEI

Vip3Aa19

(401) CPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITKIDFTKKMKTLRYEVTANFYDSSTGEI

Vip3Aa20

(451) DLNKKKVESSEAEYRTLSANDDGVYMPLGVISETFLTPINGFGLQADENS

Vip3Aa19

(451) DLNKKKVESSEAEYRTLSANDDGVYMPLGVISETFLTPINGFGLQADENS

Vip3Aa20

(501) RLITLTCKSYLRELLLATDLSNKETKLIVPPSGFISNIVENGSIEEDNLE

Vip3Aa19

(501) RLITLTCKSYLRELLLATDLSNKETKLIVPPSGFISNIVENGSIEEDNLE

Vip3Aa20

(551) PWKANNKNAYVDHTGGVNGTKALYVHKDGGISQFIGDKLKPKTEYVIQYT

Vip3Aa19

(551) PWKANNKNAYVDHTGGVNGTKALYVHKDGGISQFIGDKLKPKTEYVIQYT

Vip3Aa20

(601) VKGKPSIHLKDENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINKRFTTGTDLKGVYLILK

Vip3Aa19

(601) VKGKPSIHLKDENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINKRFTTGTDLKGVYLILK

Vip3Aa20

(651) SQNGDEAWGDNFIILEISPSEKLLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLY

Vip3Aa19

(651) SQNGDEAWGDNFIILEISPSEKLLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLY

Vip3Aa20

(701) QGGRGILKQNLQLDSFSTYRVYFSVSGDANVRIRNSREVLFEKRYMSGAK

Vip3Aa19

(701) QGGRGILKQNLQLDSFSTYRVYFSVSGDANVRIRNSREVLFEKRYMSGAK

Vip3Aa20

(751) DVSEMFTTKFEKDNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK

Vip3Aa19

(751) DVSEMFTTKFEKDNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK

El casillero sombreado indica el cambio de amino�cidos.

Ejemplo 5. Análisis de la sencuencia de ADN flanqueante

Una cantidad de métodos son conocidos por los expertos en la técnica para amplificar las secuencias de ADN desconocidas adyacentes a una región núcleo de la secuencia conocida. Esos métodos incluyen, pero sin limitación, PCR inversa (iPCR) [Ochman et. al., Genetics 120:621-623 (1988); Triglia et. al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)], PCR angosta (“panhandle PCR”) [Jones and Winistorfer, Nucleic Acids Res. 20:595-600 (1992); Jones y Winistorfer, Biotechniques 23:132-138 (1997)], PCR anclada por ligamiento de casetes [Mueller and Wold, Science 246:780-786 (1989)], PCR de Vectorette [Riley et. al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990)], PCR de Alu nueva [Puskas et. al., Nucleic Acids Res. 22:3251-3252 (1994)] y PCR interlazada asimétrica térmica (TAIL-PCR) [Liu and Whittier, Genomics 25:673-681 (1995)].

Un método utilizado para amplificar la secuencia de ADN del genoma de maíz que flanquea al ADN heter�logo insertado en el evento MIR162 fue la PCR de vectorette esencialmente como se describe por Riley et al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990).

La secuencia flanqueante de 5' y la secuencia de unión se confirmaron con el uso de procedimientos de PCR convencionales. Los siguientes pares de cebadores, o sus complementos, se utilizaron para confirmar la secuencia:

162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEC ID NO: 36)/ VIP_R4: 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEC ID NO: 37) y CJB179: 5'ATGCAAATAGGCTGGGAATAGTC3' (SEC ID NO: 39)/ CJB134 5'GTACCAGCTTGCTGAGTGGCT3' (SEC ID NO: 40). El amplic�n resultante tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 41 y comprende la secuencia de unión 5' de SEC ID NO: 45. Se reconocer� que las otras secuencias de cebador se pueden usar para confirmar las secuencias de unión y flanqueantes. Con este método, se descubrió que el inserto de MIR162 era 5’ flanqueado por los nucleótidos 1040-1088 de la secuencia gen�mica de maíz que se muestra en la SEC ID NO: 46.

Una región más grande de la secuencia flanqueadora 5' del evento MIR162 se gener� con el conjunto de premezcla Seegene DNA Walking SpeedUpTM Premix siguiendo las instrucciones del fabricante.

Una primera reacción de PCR se realizó independientemente en cuatro tubos individuales con el cebador FE1002: 5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (SEC ID NO: 50) con uno de los cebadores 1, 2, 3 o 4 DW-ACP provistos por el fabricante. Los siguientes reactivos se mezclaron en un tubo de PCR sobre hielo.: 100 μg de ADN gen�mico de MIR162, 4 μl 2,5 μM de DW-ACP (cada uno con DW-ACP 1, 2, 3, o 4), 4 μl 2,5 μM de FE1002, 19 μl de agua destilada, y 25 μl 2X de mezcla maestra SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Los tubos se colocaron en un ciclador térmico precalentado (94�C). La PCR se complet� con el siguiente programa: un ciclo a 94�C durante cinco minutos, 42�C durante un minuto, y 72�C durante dos minutos, 30 ciclos de 94�C durante 40 segundos, 55�C durante 40 segundos, y 72�C durante 90 segundos, y un ciclo a 72�C durante siete minutos. Los productos de la PCR se purificaron con el uso de Exonucleasa I y fosfatasa alcalina de langostino.

Una segunda reacción de PCR se realizó independientemente en cuatro tubos individuales con el cebador FE1003: 5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (SEC ID NO: 51) con el cebador DW-ACPN provisto por el fabricante del conjunto. Los reactivos siguientes se mezclaron en un tubo de PCR sobre hielo: 3 μl de producto de PCR purificado, 1 μl 10 μM de DW-ACPN, 1 μl 10 μM de FE1003, 5 μl de agua destilada, y 10 μl 2X de mezcla maestra SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Los tubos se colocaron en un ciclador térmico precalentado (94�C). La PCR se complet� con el siguiente programa: un ciclo a 94�C durante cinco minutos, 35 ciclos de 94�C durante 40 segundos, 60�C durante 40 segundos, y 72�C durante 90 segundos, y un ciclo a 72�C durante siete minutos.

Una tercera reacción de PCR se realizó independientemente en cuatro tubos individuales con el cebador FE1004: 5'GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT3' (SEC ID NO: 52) con el cebador Universal provisto por el fabricante. Se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de PCR sobre hielo: 2 μl de producto de PCR purificado, 1 μl de cebador Universal 10 μM, 1 μl de FE1004 10 μM, 6 μl de agua destilada, y 10 μl de 2X mezcla maestra SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Los tubos se colocaron en un ciclador térmico precalentado (94�C). La PCR se complet� con el siguiente programa: un ciclo a 94�C durante cinco minutos, 35 ciclos de 94�C durante 40 segundos, 60�C durante 40 segundos, y 72�C durante 90 segundos, y un ciclo a 72�C durante siete minutos.

Diez μl de los productos de la PCR se analizaron sobre un 1% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio. La banda adecuada se extrajo del gel de agarosa y se purificó con un conjunto de extracción de gel Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se clon� en un vector de clonaci�n TOPO-XL de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este clon se transform� en E. coli, y el ADN del pl�smido se extrajo de las células al otro día cultivado con un conjunto Qiagen Miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este pl�smido se utilizó para el secuenciamiento del análisis final.

Se dise�� un nuevo cebador dentro de la secuencia nueva conocida previamente para utilizarse con un cebador en el inserto de ADN heter�logo para amplificar el 1 kb completo de la secuencia flanqueante fuera del ADN gen�mico. El cebador de la secuencia flanqueante 162DWConf3: 5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCTGTC3' (SEC ID NO: 53) y el cebador del ADN del inserto FE0900: 5'GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (SEC ID NO: 54) se utilizaron para amplificar una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia flanqueante 5' para la confirmación. La secuencia del amplic�n resultante se encuentra establecida en la SEC ID NO: 55. Este amplic�n 5' comprende la secuencia de unión de 5' establecida en la SEC ID NO: 45. Diez μl del producto de la PCR (amplic�n) se analizaron sobre un 1% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio. La banda adecuada se extrajo del gel de agarosa y se purificó con un conjunto de extracción de gel Qiagen Qiaquick Gel Extraction de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se clon� en un vector de clonaci�n TOPO-XL de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este clon se transform� en ADN del pl�smido de E. coli. El ADN del pl�smido se extrajo de las células al otro día en un medio con un conjunto Qiagen Miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron completamente tres pl�smidos con los cebadores que se muestran en la Tabla 4. Las secuencias de los pl�smidos se alinearon para generar la escuencia flanqueante 5’ confirmada. Con el uso de este método, se determin� aproximadamente 1 kb de la secuencia flanqueante 5' (SEC ID NO: 46).

Tabla 4. Secuencias de Cebadores

Nombre del cebador b00201h b00605a b00701b

Secuencia (5'�3') TTCACGGGAGACTTTATCTG CCGATTCATTAATGCAG ACGTAAAACGGCTTGTC Secuencia No. SEC ID NO: 60 SEC ID NO: 61 SEC ID NO: 62

20

b00702b GTTTAAACTGAAGGCGG SEC ID NO: 63

b00704h AATAATATCACTCTGTACATCC SEC ID NO: 64 SEC ID NO: 65

b01106f GTTGTAAAACGACGG SEC ID NO: 66

b01709f TAGGCACCCCAGGCTTTA SEC ID NO: 67

b03504a AATTGAATTTAGCGGCCG SEC ID NO: 68

b05102f GGTCCCTACAACATAAATAG

b05102g TTCGTCCCTACTATCAACGC SEC ID NO: 69 SEC ID NO: 70

b05102h CTTTAGGCATCAGCGGGT SEC ID NO: 71

b05103a AGCATCTGCGTAAGCACA SEC ID NO: 72

b05103b CTGATGACACCAATGATGC SEC ID NO: 73

b05103c GATCAGATTGTCGTTTCCC SEC ID NO: 74

b05103d GCATCATTGGTGTCATCAG SEC ID NO: 75

b05103e TGTGCTTACGCAGATGCT SEC ID NO: 76

b05103f ACCCGCTGATGCCTAAAG

b05103g GCGTTGATAGTAGGGACGAA SEC ID NO: 77 SEC ID NO: 78

b05103h CTATTTATGTTGTAGGGACC SEC ID NO: 79

b05210a CTAGACTGGAAAGCGGAG SEC ID NO: 80

b05210b CCACTTTCATCCCTAGTTG

La secuencia flanqueante 3' del evento MIR162 se gener� con el uso del conjunto Clonetech GenomeWalkerTM Universal (Clonetech Laboratories, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En primer lugar, se construyeron conjuntos de fragmentos de ADN gen�mico ligados a adaptadores, no clonados, conocidos como “colecciones” de GenomeWalker. Cada colección se construyó mediante la digestión del ADN gen�mico de MIR162 con una enzima de restricción (DraI, EcoRV, PvuII, StuI, y XmnI) de la siguiente manera: Por ejemplo, 25 μl de ADN gen�mico de MIR162 (0,1 μg/μl), 8 μl de la enzima de restricción (10 unidades/μl), 10 μl del tampón de la enzima de restricción (10X), y 57 μl de H2O destilada se mezclaron en un tubo y se incubaron a 37�C durante la noche.

El ADN se purificó luego con varias rondas de extracción de fenol/cloroformo. Finalmente, el ADN se precipit� y se lav� con etanol, se secó y se disolvió en 20 μl de tampón de TE.

Para ligar los extremos del Adaptador de GenomeWalker al ADN gen�mico de MIR162, se mezclaron 4 μl del ADN gen�mico purificado digerido, con 1,9 μl del Adaptador de GenomeWalker (25 μM), 1,6 μl 10X de Tampón de Unión, y 0,5 μl T4 de Ligasa de ADN (6 unidades/ μl). Estas reacciones se incubaron durante la noche a 16�C. Las reacciones se detuvieron con la incubaci�n a 70�C durante cinco minutos. Luego de detenida la reacción, se agregaron 72 μl de TE a cada tubo, y los contenidos se mezclaron completamente.

Una primera reacción de PCR se realizó con el cebador AP1, provisto por el fabricante, con diferentes cebadores diseñados dentro de la secuencia heter�loga de ADN del inserto conocida (Ronda 1 “cebadores específicos del gen” o “GSP1”). Los siguientes reactivos se mezclaron en un tubo de PCR sobre hielo: 1 μl de la colección de ADN de MIR 162 adecuada, 1 μl de AP1 10 μM, 1 μl de GSP1 10 μM, 1 μl de dNTPs 10 mM, 5 μl de 10X Tampón de PCR Advantage 2, 1 μl de Polimerasa de BD Advantage 2, y 40 μl de agua destilada. La PCR se complet� con el siguiente programa: siete ciclos a 94�C durante 25 segundos y 72�C durante cuatro minutos, 32 ciclos a 94�C durante 25 segundos y 67�C durante cuatro minutos, y un ciclo a 67�C durante cuatro minutos. Cada reacción de PCR primaria se diluyó 50 veces mediante el agregado de 1 μl del producto de PCR primario con 49 μl de agua destilada. Las reacciones que funcionaron fueron (1) las colecciones de DraI y XmnI con el cebador de GSP1 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEC ID NO: 56) y el cebador AP1.

Una segunda reacción de PCR se realizó independientemente con el cebador AP2, provisto por el fabricante con diferentes cebadores diseñados dentro de la secuencia de ADN del inserto heter�loga (Ronda 2 “cebadores específicos del gen” o “GSP2”). Los siguientes reactivos se mezclaron en un tubo de PCR sobre hielo: 1 μl del producto de PCR primario diluido adecuado, 1 μl de AP2 10 μM, 1 μl de GSP2 10 μM, 1 μl de dNTPs 10 mM, 5 μl de 10X Tampón de PCR Advantage 2, 1 μl de Polimerasa de BD Advantage 2, y 40 μl de agua destilada. La PCR se complet� con el siguiente programa: cinco ciclos a 94�C durante 25 segundos y 72�C durante cuatro minutos, 20 ciclos a 94�C durante 25 segundos y 67�C durante cuatro minutos, y un ciclo a 67�C durante cuatro minutos. Las reacciones que funcionaron fueron: (1) las colecciones de DraI y XmnI con el cebador de GSP2 162GW3F2: 5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG3' (SEC ID NO: 57) y el cebador AP2.

Diez μl de los productos de la PCR se analizaron sobre 1% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio. La banda adecuada se extrajo del gel de agarosa y se purificó con un conjunto de extracción de gel Qiagen Qiaquick de

acuerdo con las instrucciones del cliente. El ADN extraído se clon� en un vector de clonaci�n TOPO-XL de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este clon se transform� en E. coli, y el ADN del pl�smido se extrajo de las células luego de un cultivo durante la noche con un conjunto Qiagen Miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este pl�smido se secuenci� con el uso del secuenciamiento del análisis final.

Un nuevo cebador se diseño dentro de la nueva secuencia, previamente desconocida, para utilizarse con un cebador en el ADN del inserto a fin de amplificar aproximadamente 1 kb de la secuencia flanqueante 3' hacia afuera del ADN gen�mico. El cebador del ADN del inserto 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEC ID NO: 56) y un cebador de la secuencia flanqueante 3' 1623'GWR1: 5CTGGTGAACCGATTTTTACGGAGG3' (SEC ID NO: 58) se utilizaron para amplificar una molécula de ácido nucleico que comprendía la secuencia flanqueante 3' para la confirmación. La secuencia del amplic�n resultante se encuentra establecida en la SEC ID NO: 59. Este amplic�n de 3' comprende la secuencia de unión 3' establecida en la SEC ID NO: 47. Diez μl del amplic�n de la PCR se analizaron sobre 1% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio. La banda adecuada se extrajo del gel de agarosa y se purificó con un conjunto de extracción de gel Qiagen Qiaquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se clon� en un vector de clonaci�n TOPO-XL de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este clon se transform� en E. coli. El ADN del pl�smido se extrajo de las células luego de un cultivo durante la noche en un medio con un conjunto Qiagen Miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron completamente tres pl�smidos con los cebadores que se muestran en la Tabla 5. Las secuencias del pl�smido se alinearon para generar la secuencia flanqueante 3' completa confirmada (SEC ID NO: 48).

Tabla 5. Secuencias del Cebador

Nombre del cebador Secuencia (5'�3') Secuencia No. SEC ID NO: 81

b00106a GATTGAATCCTGTTGCC SEC ID NO: 82

b00106b TCTCATAAATAACGTCATGC SEC ID NO: 83

b00108a TCTGTGGATAACCGTATTAC SEC ID NO: 60

b00201h TTCACGGGAGACTTTATCTG SEC ID NO: 61

b00605a CCGATTCATTAATGCAG SEC ID NO: 64

b00704h AATAATATCACTCTGTACATCC SEC ID NO: 84

b00712e AGTAACATAGATGACACCGC SEC ID NO: 85

b01106a CCAGTGTGCTGGAATTCG SEC ID NO: 65

b01106f GTTGTAAAACGACGG SEC ID NO: 86

b01107h CCAGTGTGATGGATATCTGC SEC ID NO: 87

b01108e CCAGTGTGCTGGAATTCG SEC ID NO: 88

b01111f CCAGTGTGATGGATATCTGC SEC ID NO: 66

b01709f TAGGCACCCCAGGCTTTA SEC ID NO: 89

b02701a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 90

b02701e TATCTGCAGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 91

b02702a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 92

b02702e TATCTGCAGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 93

b02703a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 94

b02703e TATCTGCAGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 95

b02704a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEC ID NO: 96

b02811a GGTCTTGCGATGATTATC SEC ID NO: 97

b05104c GAGAGGAATGGCAGCAGA SEC ID NO: 98

b05104d CATGACGGGTTTGAGATT SEC ID NO: 99

b05104e AATCTCAAACCCGTCATG SEC ID NO: 100

b05104f TCTGCTGCCATTCCTCTC

b05104g GATCAACCCGGAGAGGAAT SEC ID NO: 101 SEC ID NO: 102

b05104h CCATGACGGGTTTGAGAT SEC ID NO: 103

b05105c CAACCGACCTGACAAGTGAC SEC ID NO: 104

b05105e ATCTCAAACCCGTCATGG SEC ID NO: 105

b05105f ATTCCTCTCCGGGTTGATC

Ejemplo 6. Detección de la Proteína Vip3Aa20 en MIR162 por ELISA

Los extractos se prepararon a partir de hojas, raíces, piel, granos, seda, polen, y plantas enteras de MIR 162. Los extractos se analizaron cuantitativamente para determinar la Vip3Aa20 mediante ELISA con el uso de los anticuerpos 22 5

policlonales anti-Vip3A de cabra purificado por inmunoafinidad y anti-Vip3A de conejo purificado con la Proteína A con los procedimientos ELISA reconocidos en la técnica. La Vip3Aa20 se detect� en todos los tejidos analizados en todas las etapas de crecimiento. El nivel medio de proteína Vip3Aa20 detectado en toda la planta en la antesis y madurez de la semilla fue de 10 #g/g en peso fresco y 16 #g/g en peso fresco, respectivamente. El nivel medio de proteína Vip3Aa20 en las hojas en la antesis fue de 22 #g/g en peso fresco.

Ejemplo 7. Eficacia del MIR162 en el Campo

El evento MIR162 se sometió a prueba en el campo para determinar la eficacia contra el gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda), gusano del fruto del maíz (CEW, Helicoverpa zea), gusano cortador negro (BCW, Agrotis ipsilon), y la oruga perforadora del maíz europea (ECB, Ostrinia nubilalis). El desempeño del evento MIR162 se compar� con aquel de Warrior� (Syngenta, Inc.), un insecticida convencional estándar aplicado a una velocidad de 11,2 g a.i./acre, el evento Bt11 del maíz transg�nico, que comprende un gen cry1Ab, y un híbrido de Bt11 X MIR162, producido mediante el cruce de una línea endog�mica de Bt11 con una línea endog�mica de MIR162.

Se plantaron veintiocho pruebas en 13 estados que representaban las regiones principales de cultivo de maíz de los Estados Unidos continental. Las pruebas se plantaron en un diseño de bloque completo aleatorio con cuatro lotes replicados por bloque. Los lotes consistían en filas de 17,5 pies por tratamiento por réplica. La densidad de la plantación se fij� en aproximadamente 30.000 plantas/hectárea. Las franjas para inmunodiagn�stico se utilizaron para confirmar la presencia o ausencia de las proteínas Vip3Aa20 y Cry1Ab en los diferentes grupos de tratamiento.

Las infestaciones de plagas naturales se utilizaron en pruebas en las que las poblaciones fueron lo suficientemente elevadas; en donde no se realizaron infestaciones artificiales. La infestación artificial con dos larvas de 2a-a 3a-instar en V1-V2 se utilizó en las pruebas de BCW. Los lotes se clasificaron a los 3, 7, y 14 días luego de la infestación. El daño producido por BCW se registr� como plantas dañadas parcialmente y plantas cortadas completamente. Los lotes de FAW se clasificaron a los 7 y 14 días luego de la infestación o luego de observarse la tercera larva instar en las plantas de control. La siguiente escala se utilizó para evaluar el daño producido en las hojas por FAW y CEW:

0.01 – Daño no visible a la hoja 1 – Daño en forma de orificios pequeños tipo alfiler en unas pocas hojas 2 – Pequeña cantidad de daño en forma de orificios más grandes del tipo bala en unas pocas hojas 3 – Daño en forma de orificios tipo bala sobre varias hojas 4 – Daño en forma de orificios tipo bala y lesiones en unas pocas hojas 5 – Lesiones en varias hojas 6 – Grandes lesiones sobre varias hojas 7 – Grandes lesiones y porciones comidas en unas pocas hojas 8 – Grandes lesiones y porciones comidas en varias hojas 9 – Grandes lesiones y porciones comidas en la mayoría de las hojas El daño a las plantas se evalu� para ambas ECB de generaciones primera y segunda. La siguiente escala se utilizó para clasificar el daño de la primera generación, generalmente cuando las larvas se encontraban en la tercera y cuarta instar: 1 – Ningún daño visible a la hoja 2 – Pequeña cantidad de lesiones en forma de orificios tipo bala sobre unas pocas hojas 3 -Lesiones en forma de orificios tipo bala comunes en varias hojas 4 – Varias hojas con orificios tipo bala y lesiones alargadas 5 -Varias hojas con lesiones alargadas 6 – Varias hojas con lesiones alargadas de aproximadamente 2,5 cm 7 – Lesiones largas comunes en aproximadamente la mitad de las hojas.

8 – Lesiones largas comunes en aproximadamente dos tercios de las hojas 9 – La mayoría de las hojas con lesiones largas

El daño producido por ECB de la segunda generación se evalu� a las tres a cuatro semanas luego de la infestación artificial o al final del período pico de puesta de huevos. Se tomaron las siguientes mediciones: cantidad de larvas vivas/tallo, cantidad de larvas vivas /varillas, cantidad de larvas vivas /espiga, cantidad de túneles /tallo, longitud acumulativa de túneles (cm)/tallo, longitud acumulativa de túneles (cm)/varillas, cantidad de túneles /espiga, daño a los granos, longitud de túneles acumulativos (cm)/espiga, y % de plantas infestadas.

Las pruebas de CEW se plantaron generalmente tarde a fin de aumentar los niveles de infestación natural. El daño producido por la alimentación a las espigas se evalu� cuando las larvas de CEW en las plantas de control habían alcanzado la etapa de crecimiento L5-L6. Las clasificaciones de las espigas incluyeron el registro de la cantidad de larvas observadas por espiga y la longitud de alimentación visible en el grano medida a partir de la punta de la espiga hasta el grano promedio más bajo destruido.

Los resultados de la prueba de campo con BCW se muestran en la Tabla 6. Menos del 3% de las plantas de MIR162 y las plantas de Bt11 X MIR162 fue cortado por las larvas de BCW. Fueron cortadas cantidades significativas de Bt11 y plantas de control. Las plantas que comprendían el genotipo del MIR162 presentaron un daño menor producido por la alimentación de BCW que las plantas tratadas con el insecticida convencional.

Tabla 6. Clasificaciones del daño en los tallos a partir de cinco pruebas con BCW a 21 días luego de la infestación. El daño se midió como porcentaje del corte de las plantas totales.

Tratamiento % de plantas cortadas MIR162 2 Bt11 42 Bt11 X MIR162 3 Insecticida Warrior 12 Control Negativo 40

Los resultados de la prueba de campo de FAW se muestran en la Tabla 7. El daño producido por la alimentación de FAW se midió sobre una escala de 0,01 a 9. El daño por alimentación medio en los híbridos de MIR162 fue muy bajo (< 1) y significativamente menor que el daño promedio observado en el Bt11 y en los tratamientos con insecticidas convencionales. La presión de los insectos en estas pruebas fue pesada con aproximadamente 50 a 100 neonatos de larvas /planta. El Bt11 proveyó alguna protección contra el daño, mientras que el tratamiento con el insecticida convencional no proporcion� ninguna protección presentando la misma cantidad de daño que las plantas de control.

Tabla 7. Clasificaciones del daño producido por la alimentación en las hojas a partir de cinco pruebas para FAW. Las clasificaciones de los daños medios a los 14 días luego de la infestación se presentan para cada tratamiento.

Tratamiento Clasificación del Daño Medio en las Hojas (0,01-9) MIR162 0,0 Bt11 2,52 Bt11 X MIR162 0,84 Insecticida Warrior 3,60 Control Negativo 3,78

Los resultados de estas pruebas para evaluar el daño de ECB de la primera generación se presentan en la Tabla 8. El daño producido por la alimentación de ECB se clasificó sobre una escala de 1-9. En estas pruebas, el MIR162 proporcion� una protección mínima contra el daño por la alimentación de ECB. El Bt11 protegió completamente las plantas contra el daño producido por la alimentación de ECB. Las plantas de Bt11 X MIR162 tuvieron el mismo nivel de protección que las plantas de Bt11. El tratamiento con el insecticida convencional proveyó una mejor protección que el rasgo del MIR162 pero con una protección significativamente menor que la provista por Bt11.

Tabla 8. Prueba de campo del daño producido por la alimentación en las hojas. Clasificaciones del daño medio a los 14 días luego de la infestación. Tratamiento Clasificación del Daño medio en las hojas (1-9) MIR162 2,95 Bt11 1,00 Bt11 X MIR162 1,00 Insecticida Warrior 2,05 Control Negativo 3,88

Los resultados del daño por ECB de segunda generación se presentan en la Tabla 9. El daño por la alimentación se midió como la longitud de túneles acumulativa en cada tallo de maíz (si se hall� más de un túnel, se sumaron las longitudes de los túneles). Los tratamientos con Bt11 y Bt11 x MIR162 proporcionaron una fuerte protección contra la perforación de los tallos, mientras que el tratamiento con MIR162 solo o con el insecticida no proveyó ninguna protección contra la producción de túneles.

Tabla 9. Clasificaciones del daño producido en los tallos a partir de siete pruebas para las larvas de ECB de segunda generación medido en longitud de túnel (cm) por tallo. Las mediciones se tomaron tres a cuatro semanas luego de la infestación artificial.

Tratamiento MIR162 Bt11 Bt11 X MIR162

Longitud media del túnel (cm) 5,46 0,37 0,48

24

Insecticida Warrior 5,06 Control Negativo 5,04

Los resultados de las pruebas para evaluar el daño producido por CEW se presentan en la Tabla 10. El daño causado por la alimentación se clasificó como longitud del daño producido en el grano por espiga, medido desde la punta de la espiga hasta el grano destruido promedio más bajo. Se observo un daño considerable en los lotes de Bt11, insecticida y de chequeo. El Bt11 proporcion� algún nivel de protección en comparación con el de chequeo no tratado y fue equivalente a la protección provista por el tratamiento con el insecticida convencional. El MIR162 y Bt11 X MIR162 proporcionaron una protección casi completa de las espigas contra el daño producido por la alimentación de las larvas de CEW.

Tabla 10. Clasificaciones del daño producido en las espigas a partir de seis pruebas para CEW medido como la longitud promedio del daño producido por la alimentación. Las mediciones se tomaron cuando las larvas de CEW eran L5-L6 en las plantas de chequeo.

Tratamiento Daño medio en las espigas (cm) MIR162 0,17 Bt11 2,24 Bt11 X MIR162 0,02 Insecticida Warrior 2,20 Control Negativo 3,42

Ejemplo 8. Eficacia de MIR162 contra el gusano cortador de habichuelas occidental.

Los eventos transg�nicos comerciales actuales que producen la proteína Cry1Ab no proporcionaron niveles aceptables de protección contra el gusano cortador de habichuelas occidental (WBCW, Striacosta albicosta). Por lo tanto, el MIR162 solo y apilado con otros genotipos transg�nicos se sometió a prueba para determinar la eficacia contra WBCW.

Los huevos de WBCW se recogieron de polillas hembras silvestres. Las larvas se alimentaron con una dieta de gusanos cortadores mer�dicos hasta utilizarse en los experimentos. Las plantas de maíz se cultivaron en el campo. Se evaluaron los siguientes tratamientos: MIR162, Bt11, MIR604, MIR162 X Bt11, MIR162 X MIR604, MIR604 X Bt11, Force� (Syngenta, Inc.), un insecticida convencional aplicado en la plantación a una isolina negativa, y dos isolinas de control negativo. El MIR604 es un evento de maíz transg�nico novedoso que comprende un gen cry3A055 que codifica una proteína que es activa contra las larvas del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica spp.) y se encuentra descripto en la publicación de la solicitud de patente de invención estadounidense No. 2005/0216970, publicada el 29 de septiembre de 2005.

Para los experimentos, se cortaron sedas verdes de dos pulgadas y vainas de las espigas de plantas de maíz cultivadas en el campo en cada tratamiento y replicaci�n. Los extremos marrones terminales de las sedas se retiraron y se desecharon las vainas. Aproximadamente 1,5 pulgadas de seda se colocaron en recipientes de plástico de 14 ml individuales. Se colocó luego una larva en cada recipiente y se sellaron los recipientes. Se sometieron a prueba varias etapas diferentes de larvas, que oscilaban entre los estadios de desarrollo tercero a sexto. Los recipientes que contenían sedas y larvas se mantuvieron a luz natural de día y a temperatura ambiente durante los experimentos. Se registr� la supervivencia de las larvas luego de 8 días. Los tratamientos se replicaron cuatro veces por experimento.

Los resultados de los experimentos de WBCW se presentan en la Tabla 11. La supervivencia de WBCW en las sedas de las isolinas negativas y el tratamiento con insecticida convencional fue de aproximadamente el 100%. La supervivencia de las larvas de WBCW en las sedas con Btll y MIR604, evaluadas solas o en combinación en la misma planta, no fue diferente a la supervivencia sobre las isolinas negativas. La supervivencia de las larvas de WBCW se redujo cuando las larvas se alimentaron con las sedas del MIR162. La combinación del MIR162 X Bt11 en la misma planta no disminuyó la supervivencia más que el MIR162 solo. Sin embargo, de manera sorprendente, cuando el genotipo transg�nico del MIR162 se apil� con el genotipo transg�nico del MIR604 en la misma planta, la mortalidad de las larvas aumento significativamente en comparación con el MIR162 o MIR604 solos.

Tabla 11. Porcentaje (ÉSE) de la supervivencia de las larvas de WBCW sobre sedas de maíz.

Tratamiento Bt11 MIR162 MIR604 MIR162xBt11 MIR162xMIR604

Número de experimento 1 2 3 75(25) 75(25) 100(0) 25(25) 0(0) 0(0) 25(25) 25(25) 0(0) 4 100(0) 50(29) 0(0) 5 100(0) 50(29) 100(0) 25(25) 0(0) 6 100(0) 50(29) 100(0) 25(25) 25(25) 7 100(0) 0(0) 100(0) 25(25) 50(29)

25

MIR604xBt11

75(25)

Fuerza

100(0) 100(0) 100(0)

Control Neg. #1

100(0) 75(25) 100(0) 100(0) 75(25) 100(0) 100(0)

Control Neg. #2

100(0) 100(0) 100(0) 100(0) 100(0) 100(0) 100(0)

Ejemplo ilustrativo 9. Uso del sitio de inserción del evento MIR162 para la integración fijada como objetivo en el maíz.

Las secuencias flanqueantes de MIR162 descriptas en la SEC ID NO: 46 y SEC ID NO: 48 se utilizaron para la búsqueda de las bases de datos gen�micas del maíz. Se hallaron combinaciones idénticas para ambas secuencias flanqueantes en un clon de BAC, CH201-307P5, del cromosoma 5 (NCBI Número de acceso AC185313) en el Contig 13 (SEC ID NO: 106). Más específicamente, el inserto de MIR162 est� en el cromosoma 5 entre el marcador molecular 5’, denominado en la presente como el marcador Opie2 (nucleótidos 1680-3338 de la SEC ID NO: 106), y un marcador molecular 3', denominado en la presente como marcador gag (nucleótidos 43.275-45.086 de la SEC ID NO: 106). Con esta información, se determin� que el ADN heter�logo inserto en el MIR162 desplazó a 58 nucleótidos de ADN gen�mico de maíz, nucleótidos 25.455 a 25.512 de la SEC ID NO: 106 (también mostrada como SEC ID NO: 107), que est� entre la secuencia flanqueante 5' (nucleótidos 1-25.454 de la SEC ID NO: 106) y la secuencia flanqueante 3' (nucleótidos 25.513-51.328 de la SEC ID NO: 106).

El desempeño agron�mico uniforme del transgen del evento MIR162 respecto de varias generaciones bajo condiciones de campo sugiere que estas regiones identificadas alrededor del sitio de inserción de MIR162 proveen buenas ubicaciones gen�micas para la integración dirigida de otros genes transg�nicos de interés. Dicha integración dirigida supera los problemas con los llamados “efectos de posición” y el riesgo de crear una mutación en el genoma ante la integración del transgen en el huésped. Otras ventajas de dicha integración dirigida incluyen, pero sin limitación, la reducción de la gran cantidad de eventos de transformación que se deben cribar y probar antes de obtener una planta transg�nica que exhiba el nivel deseado de expresión transg�nica sin exhibir también anormalidades resultantes de la inserción inadvertida del transgen en un lugar importante en el genoma del huésped. Además, dicha integración dirigida permite el apilamiento de transgenes con lo cual la propagación de las líneas de vegetales de elite con ambos genes se torna más eficiente.

Con el uso de la enseñanza provista precedentemente, el experto puede utilizar los métodos conocidos en la técnica para dirigir los ácidos nucleicos heter�logos de interés al mismo sitio de inserción en el cromosoma 5 que aquel en el MIR162 o en un sitio en estrecha proximidad al sitio de inserción de MIR162. Un método de esta naturaleza se describe en la Publicación de Patente de Invención estadounidense 20060253918. En síntesis, hasta 20 Kb de la secuencia gen�mica flanqueante 5' al sitio de inserción (nucleótidos 5.454 a 25.454 de SEC ID NO: 106) y hasta 20 Kb de la secuencia gen�mica flanquante de 3' al sitio de inserción (nucleótidos 25.513 a 45.513 de SEC ID NO: 106) se utilizan para flanquear el gen o los genes de interés que se han de insertar en una ubicación gen�mica sobre el Cromosoma 5 mediante recombinación homóloga. Estas secuencias se pueden flanquear además por repeticiones de borde de T-ADN, como por ejemplo las secuencias de repetición de borde izquierdo (LB) y borde derecho (RB) y otras secuencias estimulantes para aumentar la eficiencia de la administración del T-ADN. El gen o los genes de interés se pueden colocar exactamente en el sitio de inserción de MIR162 o se pueden colocar en cualquier lugar dentro de las regiones de 20 Kb alrededor de los sitios de inserción de MIR162 para conferir un nivel coherente de expresión transg�nica sin efectos perjudiciales sobre la planta. Los vectores de ADN que contienen al gen o los genes de interés y las secuencias flanqueantes se pueden administrar en células vegetales mediante uno de los varios métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, la transformación mediada por Agrobacterium. La inserción del vector de ADN en el sitio objetivo del MIR162 se puede aumentar aún más mediante uno de los varios métodos, que incluyen, pero sin limitación, la coexpresi�n o regulaci�n ascendente de genes que aumentan la recombinación o la regulaci�n descendente de genes de supersi�n de la recombinación end�gena. Además, se sabe en la técnica que el clivaje de las secuencias específicas en el genoma se puede usar para aumentar la frecuencia de recombinación homóloga, por lo cual la inserción en el sitio de inserción del MIR162 y sus regiones flanqueantes puede ser aumentada por la expresión de endonucleasas de secuencias específicas diseñadas o naturales para escindir estas secuencias. De esta manera, con el uso de la enseñanza provista en la presente, se puede inertar cualquier ácido nucleico heter�logo sobre el cromosoma 5 del maíz en un sitio objetivo ubicado entre los nucleótidos 25.454 y 45.513 de la SEC ID NO: 106

o un sitio objetivo en la vecindad de este sitio.

Ejemplo ilustrativo 10. Uso del sitio de inserción del evento MIR162 y secuencias flanqueantes para la estabilizaci�n de la expresión del gen

Las secuencias gen�micas que flanquean al sitio de inserción del MIR162 se pueden usar también para estabilizar la expresión de otros genes de interés cuando se insertan como un transgen en otras ubicaciones gen�micas en el maíz y otros cultivos. Específicamente, hasta 20 Kb de la secuencia gen�mica que flanquea a 5’ hasta el sitio de inserción (nucleótidos 5.454 a 25.454 de SEC ID NO: 106) y hasta 20 Kb de la secuencia gen�mica que flanquea a 3’ hasta el sitio de inserción (nucleótidos 25.513 a 45.513 de SEC ID NO: 106) se utilizan para flanquear el gen o los genes de interés que se han de insertar en el genoma de las plantas. Estas secuencias se pueden flanquear también por repeticiones de bordes de T-ADN, como por ejemplo secuencias de repetición del borde izquierdo (LB) y del borde

derecho (RB) y otras secuencias estimulantes para aumentar la eficiencia en la administración de T-ADN. El gen o los genes de interés se pueden colocar exactamente en el sitio de inserción del MIR162 o bien se pueden colocar en cualquier lugar dentro de las regiones 20 Kb alrededor de los sitios de inserción de MIR162 para conferir un nivel uniforme de expresión transg�nica. Los vectores de ADN que contienen al gen o a los genes de interés y la secuencia 5 flanqueante del sitio de inserción del MIR162 se pueden administrar en las células vegetales mediante uno de los varios métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, la transformación de protoplastos, bombardeo balístico, y la transformación mediada por Agrobacterium. El ADN administrado se puede integrar aleatoriamente en un genoma de una planta o puede hallarse como parte de las unidades genéticas segregantes independientemente, como por ejemplo, un cromosoma artificial o minicromosoma. Los vectores de ADN que contienen

10 al gen o a los genes de interés y las secuencias flanqueantes del sitio de inserción de MIR162 se pueden administrar en células vegetales. De esta manera, al rodear un gen o genes de interés con la secuencia gen�mica que flanquea al sitio de inserción de MIR162, la expresión de esos genes se estabiliza en una planta huésped transg�nica, como por ejemplo una planta dicotiled�nea o una planta monocotiled�nea, como el maíz.

15 DEPÓSITO

Los solicitantes han hecho el depósito de la semilla de maíz del evento MIR162 descripto precedentemente el día 23 de enero de 2007, de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 con el número de acceso de la ATCC PTA-8166. El depósito permanecer� en el centro 20 de depósitos por un período de 30 años o 5 años luego de la última solicitud, o durante la duración de la patente de invención, cualquiera sea el mayor, y se reemplazar� según lo necesario durante ese período. Los solicitantes no imponen restricciones a la disponibilidad del material depositado por parte de la ATCC. Sin embargo, los solicitantes no tienen facultad para renunciar a cualquier restricción impuesta por ley sobre la transferencia de material biológico o su transporte en el comercio. Los solicitantes no renuncian a ninguna violación de sus derechos otorgados de conformidad

25 con esta Patente de Invención o por la Ley de Protección de Varidades de Plantas (Art. 2321 y siguientes, Título 7, Código de los Estados Unidos).

LISTADO DE SECUENCIAS

5 <110> Syngenta Participations AG Long, NyKoll Pulliam, Derrick Hart, Hope Bottoms, Jeff

10 Meghji, Moez Que, Qiudeng

<120> Evento de maíz MIR162

<130> 71133WOPCT

<160> 107

15 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2370

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> Secuencia codificadora de vip3Aa20

<400> 1

<210> 2

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Toxina Vip3Aa

<220> 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(789)

<223> Proteína Vip3Aa20 producida por MIR162

<400> 2

<210> 3

<211> 14405

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Pl�smido pNOV1300

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador TAQMAN de vip3Aa químicamente sintetizado

<400> 4 caccttcagc aacccgaact a 21

<210> 5

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5 <220>

<223> Cebador rev TAQMAN de vip3Aa químicamente sintetizado

<400> 5 gcttagcctc cacgatcatc tt 22

<210> 6 10 <211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TAQMAN de vip3Aa químicamente sintetizada

15 <400> 6 gtcctcgtcg ctgcccttca cct 23

<210> 7

<211> 18

<212> ADN 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador TAQMAN de pmi químicamente sintetizado para

<400> 7 ccgggtgaat cagcgttt 18

25 <210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> cebador rev TAQMAN pmi químicamente sintetizado

<400> 8 gccgtggcct ttgacagt 18

<210> 9

<211> 20 35 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TAQMAN de pmi químicamente sintetizada

<400> 9 40 tgccgccaac gaatcaccgg 20

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador TAQMAN ZmADH-267 químicamente sintetizado para

<400> 10 gaacgtgtgt tgggtttgca t 21

5 <210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Cebador rev TAQMAN ZmADH-267 químicamente sintetizado

<400> 11 tccagcaatc cttgcacctt 20

<210> 12

<211> 24 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TAQMAN ZmADH-267 químicamente sintetizada

<400> 12 20 tgcagcctaa ccatgcgcag ggta 24

<210> 13

<211> 2370

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Sonda de vip3Aa20 químicamente sintetizada

<400> 13

<210> 14

<211> 1176

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda pmi químicamente sintetizada

<400> 14

<210> 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador MOV3Aa-01-5' químicamente sintetizado

<400> 15 10 atgaacaaga acaacaccaa 20

<210> 16

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Cebador MOV3Aa-01-3' químicamente sintetizado

<400> 16 ctacttgatg ctcacgtcgt ag 22

<210> 17 20 <211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado <400> 17 acgagcagaa ccaggtgc 18

<210> 18

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 18 10 ggtgaagaag gacggcag 18

<210> 19

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 19 acctgtcgca agctgctggg 20

<210> 20 20 <211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

25 <400> 20 tggacaagct gctgtgtc 18

<210> 21

<211> 19

<212> ADN 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 21 tgcaggccga cgagaacag 19

35 <210> 22

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Químicamente sintetizado

<400> 22 tgatccagta caccgtgaa 19

<210> 23

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

5 <400> 23 accctgaccc tgtaccag 18

<210> 24

<211> 18

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 24 gtgttgccgc tgatgttg 18

15 <210> 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Químicamente sintetizado

<400> 25 cgtactcggt cttcggct 18

<210> 26

<211> 18 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 26 30 ctgcaggcca aagccgtt 18

<210> 27

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 27 tcgccgtaga tcacctcg 18

<210> 28 40 <211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado <400> 28 gcttgcgaca ggtggtca 18

<210> 29

<211> 19 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 29 10 ttgctgctgg tctcggtgg 19

<210> 30

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 30 cgttggcgat cttaaggat 19

<210> 31 20 <211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

25 <400> 31 gcaagccatc gattcac 17

<210> 32

<211> 17

<212> ADN 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 32 gcaacaccct gaccctg 17

35 <210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Químicamente sintetizado

<400> 33 tctacgacgt gagcatcaag 20

<210> 34

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

5 <400> 34 gtagaagtgc acgatcggg 19

<210> 35

<211> 17

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 35 cggtgctggt ccagttg 17

15 <210> 36

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Cebador 162INSERT-F2 químicamente sintetizado

<400> 36 acaccaatga tgcaaatagg c 21

<210> 37

<211> 25 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador VIP_R4 químicamente sintetizado

<400> 37 30 gaaggtgttc aggtagaact cgaag 25

<210> 38

<211> 2946

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

35 <220>

<223> Amplic�n vip3Aa20 5' químicamente sintetizado

<400> 38

<210> 39

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador CJB179 químicamente sintetizado

<400> 39 10 atgcaaatag gctgggaata gtc 23

<210> 40

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Cebador inverso CTRB3116 químicamente sintetizado

<400> 40 gtaccagctt gctgagtggc t 21

<210> 41 20 <211> 209

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Amplic�n CJB134/179 5' químicamente sintetizado

25 <400> 41

<210> 42

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador VIP-F3 químicamente sintetizado

<400> 42 ggtgctgttc gagaagaggt 20

5 <210> 43

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Cebador PMI_REV1 químicamente sintetizado

<400> 43 cgatttatca ctctcaatca cat 23

<210> 44

<211> 2577 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Amplic�n vip3Aa20 3' químicamente sintetizado <210> 45

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de unión 5' entre el genoma de maíz y el ADN de inserción

<400> 45 10 tgaatcatgt cactgatagt 20

<210> 46

<211> 1088

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Secuencia flanqueante 5'

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(236) 20 <223> Secuencia flanqueante 5'

<400> 46

<210> 47

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia de unión 3' entre el ADN de inserción y el genoma de maíz

<400> 47 10 aaacgtccgc catggtctga 20

<210> 48

<211> 1189

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Secuencia flanqueante 3' <400> 48 catggtctga aggcaacaga taaggcatac tgggccttgt ggtagttgtt ttactgggcc 60

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencias flanqueantes y de inserción del Evento MIR162 de Vip3Aa20

10 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1088)

<223> Secuencia flanqueante 5' del evento MIR162

<400> 49

<210> 50

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador FE1002 químicamente sintetizado

<400> 50 cgtgactccc ttaattctcc gct 23

<210> 51

<211> 24 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador FE1003 químicamente sintetizado

<400> 51 10 gatcagattg tcgtttcccg cctt 24

<210> 52

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Cebador FE1004 químicamente sintetizado

<400> 52 gattgtcgtt tcccgccttc agtt 24

<210> 53 20 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador 162_DW_Conf3 Químicamente sintetizado

25 <400> 53 cctgtgttgt tggaacagac ttctgtc 27

<210> 54

<211> 26

<212> ADN 30 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador FE0900 químicamente sintetizado

<400> 54 ggctccttca acgttgcggt tctgtc 26

35 <210> 55

<211> 1230

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Amplic�n de PCR 5' químicamente sintetizado

<400> 55

<210> 56

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador 162_GW_3_F1 químicamente sintetizado

<400> 56 10 tctcttgcta agctgggagc tcgatccg 28

<210> 57

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Cebador 162_GW_3_F2 químicamente sintetizado

<400> 57 aagattgaat cctgttgccg gtcttgcg 28

<210> 58 20 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador 162_3'GW_R1 químicamente sintetizado

<400> 58 ctggtgaacc gatttttacg gagg 24

5 <210> 59

<211> 1518

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Amplic�n de PCR 3' químicamente sintetizado

<400> 59

15 <210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 60 ttcacgggag actttatctg 20

<210> 61

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 61 ccgattcatt aatgcag 17

<210> 62

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 62 acgtaaaacg gcttgtc 17

<210> 63

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 63 gtttaaactg aaggcgg 17

<210> 64

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 64 aataatatca ctctgtacat cc 22

<210> 65

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 65 gttgtaaaac gacgg 15

<210> 66

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 66 taggcacccc aggcttta 18

<210> 67

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 67 aattgaattt agcggccg 18

<210> 68

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 68 ggtccctaca acataaatag 20

<210> 69

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 69 ttcgtcccta ctatcaacgc 20

<210> 70

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 70 ctttaggcat cagcgggt 18

<210> 71

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 71 agcatctgcg taagcaca 18

<210> 72

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 72 ctgatgacac caatgatgc 19

<210> 73

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 73 gatcagattg tcgtttccc 19

<210> 74

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 74 gcatcattgg tgtcatcag 19

<210> 75

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 75 tgtgcttacg cagatgct 18

<210> 76

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 76 acccgctgat gcctaaag 18

<210> 77

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 77 gcgttgatag tagggacgaa 20

<210> 78

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 78 ctatttatgt tgtagggacc 20

<210> 79

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 79 ctagactgga aagcggag 18

<210> 80

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 80 ccactttcat ccctagttg 19

<210> 81

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 81 gattgaatcc tgttgcc 17

<210> 82

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 82 tctcataaat aacgtcatgc 20

<210> 83

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 83 tctgtggata accgtattac 20

<210> 84

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 84 agtaacatag atgacaccgc 20

<210> 85

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 85 ccagtgtgct ggaattcg 18

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 86 ccagtgtgat ggatatctgc 20

<210> 87

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 87 ccagtgtgct ggaattcg 18

<210> 88

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 88 ccagtgtgat ggatatctgc 20

<210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 89 gtgtgctgga attcgccctt 20

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 90 tatctgcaga attcgccctt 20

<210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 91 gtgtgctgga attcgccctt 20

<210> 92

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 92 tatctgcaga attcgccctt 20

<210> 93

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 93 gtgtgctgga attcgccctt 20

<210> 94

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 94 tatctgcaga attcgccctt 20

<210> 95

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 95 gtgtgctgga attcgccctt 20

<210> 96

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 96 ggtcttgcga tgattatc 18

<210> 97

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 97 gagaggaatg gcagcaga 18

<210> 98

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 98 catgacgggt ttgagatt 18

<210> 99

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 99 aatctcaaac ccgtcatg 18

<210> 100

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 100 tctgctgcca ttcctctc 18

<210> 101

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Químicamente sintetizado

<400> 101 gatcaacccg gagaggaat 19

<210> 102

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de secuenciamiento b05104h químicamente sintetizado

<400> 102 ccatgacggg tttgagat 18

<210> 103

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de secuenciamiento b05105c químicamente sintetizado

<400> 103 caaccgacct gacaagtgac 20

<210> 104

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador de secuenciamiento b05105e químicamente sintetizado

<400> 104 atctcaaacc cgtcatgg 18

5 <210> 105

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Cebador de secuenciamiento b05105f químicamente sintetizado

<400> 105 attcctctcc gggttgatc 19

<210> 106

<211> 51328 15 <212> ADN

<213> zea mays

<220>

<221> misc_feature

<222> (1680)..(3338) 20 <223> Marcador opie2

<220>

<221> misc_feature

<222> (25455)..(25512)

<223> Secuencia gen�mica de maíz desplazada por ADN heter�logo de MIR162

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (43275)..(45086)

<223> marcador gag

<400> 106

5

<210> 107 <211> 58 <212> ADN <213> Zea mays

<400> 107 cactgtgcgt cctctgcagg cagttgttga catgagcgca tcgtcactgc tgaatcgc

58

10

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es única para el evento de maíz MIR162, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo constituido por SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59, y sus complemetos.

2. 2.

   La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia de nucl�tidos codifica una porte�na que comprende la SEC ID NO: 2.

3. 3.

   La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, donde la molécula de ácido nucleico se encuentra en una semilla de maíz depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PAT-8166.

4. 4.

   Un par de cebadores de polinucle�tidos que comprende un primer cebador de polinucle�tido y un segundo cebador de polinucle�tido que funcionan juntos en presencia de una plantilla de ADN del evento MIR162 en una muestra para producir un amplic�n diagnóstico para el evento de maíz MIR162, donde el primer cebador de polinucle�tido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende los nucleótidos 1-1088 de la SEC ID NO: 49, los nucleótidos 9391-10579 de la SEC ID NO: 49 y sus complementos, y donde el segundo cebador de polinucle�tido comprende por lo menos 10 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 1089-9390 de la SEC ID NO: 49 o sus complementos, y donde dicho evento de maíz MIR162 est� caracterizado por la presencia de la secuencia SEC ID NO: 49 en el genoma del maíz.

5. 5.

   El par de cebadores de polinucle�tidos de acuerdo con la reivindicación 4, donde el primer cebador de polinucle�tidos se selecciona del grupo que comprende las SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 58, SEC ID NOs: 68-72, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NOs: 97-105 y sus complementos, y donde el segundo cebador de polinucle�tidos se selecciona del grupo que comprende SEC ID NOs: 15-35, SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 40, SEC ID NOs: 50-52, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 96 y sus complementos.

6. 6.

   Un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que es única para el evento de maíz MIR162 en una muestra que comprende ácidos nucleicos de maíz, donde el método comprende:

   (a)

   poner en contacto la muestra con un par de cebadores que, al utilizarse en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN gen�mico del evento de maíz MIR162 produce un amplic�n que es diagnóstico para el evento de maíz MIR162;

   (b)

   realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico para producir as� al amplic�n; y

   (c)

   detectar al amplic�n,

   donde dicho evento de maíz MIR162 est� caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maíz.
7. 7. Un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico que es única para el evento de maíz MIR162 en una muestra que comprende ácidos nucleicos de maíz, donde el método comprende:

   (a)

   poner en contacto la muestra con una sonda que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad con ADN gen�mico del evento de maíz MIR162 y no se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el ADN de la planta de maíz de control;

   (b)

   someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación de alta rigurosidad; y

   (c)

   detectar la hibridación de la sonda a la molécula de ácido nucleico,

   donde dicho evento de maíz MIR162 est� caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maíz.

8. 8.

   El método de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, donde el amplic�n o la sonda comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 59 y sus complementos.

9. 9.

   Un conjunto para detectar ácidos nucleicos que son únicos para el evento de maíz MIR162 que comprende por lo menos una molécula de ácido nucleico de suficiente longitud de polinucle�tidos contiguos para funcionar como un cebador o una sonda en un método de detección de ácido nucleico, y que ante la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo o una hibridación a una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra seguido de la detección del amplic�n o la hibridación a la secuencia objetivo, sirven de diagnóstico para la presencia de secuencias de ácido nucleico únicas para el evento de maíz MIR162 en la muestra, donde dicho evento de maíz MIR162 est� caracterizado por la presencia de la secuencia de la SEC ID NO: 49 en el genoma del maíz.

10. 10.

    El conjunto de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 49.

11. 11. Una planta de maíz transg�nica, o sus células o tejidos, cada uno de los cuales comprende una molécula de ácido 5 nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. 12. Una semilla de maíz que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

    10 13. Una semilla de maíz de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha semilla de maíz es la semilla de maíz depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso PTA-8166.
13. 14. Una muestra biológica derivada de una planta de maíz, tejido o semilla del evento de maíz MIR162, donde la muestra comprende una secuencia de nucleótidos que es la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID

    15 NO: 45, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 55, o SEC ID NO: 59 o complementaria de éstas y donde la secuencia es detectable en la muestra con el uso de un método de amplificación de ácido nucleico o de hibridación de ácido nucleico.
14. 15. La muestra biológica de la reivindicación 14, donde la muestra se selecciona del grupo que comprende harina de

    20 maíz, polenta de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales fabricados total o parcialmente para que contengan subproductos del maíz.
15. 16. Una proteína insecticida aislada que comprende la SEC ID NO: 2.