BRPI0712392A2 - molécula de ácido nucléico isolada, amplicon, par de iniciadores de polinucleotìdeos, método e kit para detecção, planta de milho transgênico, semente de milho, amostra biológica, extrato, método para produção de uma planta de milho resistente e de sementes de milho hìbridas, semente hìbrida, proteìna inseticida isolada, vetor, célula hospedeira transgênica, sìtio alvo, método para fazer uma planta transgênica de milho - Google Patents

Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, AMPLICON, PAR DE INICIADORES DE POLINUCLEOTìDEOS, MéTODO E KIT PARA DETECçãO, PLANTA DE MILHO TRANSGêNICO, SEMENTE DE MILHO, AMOSTRA BIOLóGICA, EXTRATO, MéTODO PARA PRODUçãO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE E DE SEMENTES DE MILHO HìBRIDAS, SEMENTE HìBRIDA, PROTEìNA INSETICIDA ISOLADA, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA TRANSGêNICA, SìTIO ALVO, MéTODO PARA FAZER UMA PLANTA TRANSGêNICA DE MILHO. Um novo milho transgênico designado evento MIR162 é exposto. A invenção relata os ácidos nucléicos que são únicos ao evento MIR162 e os métodos para detectar a presença de evento MIR162 baseados em sequências de DNA dos recombinantes planejados inseridos dentro do genoma do milho que resultaram no enento MIR162, e das sequências genómicas pareando o sítio de inserção. A invenção também se refere a plantas de milho abrangendo o genótipo transgênico do MIR162 e aos métodos para produção de uma planta de milho pelo cruzamento com uma planta de milho contendo o genótipo MIR162 com ela mesma ou com outra variedade de milho. Sementes de plantas de milho contendo o genótipo MIR162 também são objetos da presente invenção. A invenção também relata os métodos de controle de insetos usando as plantas de milho MIR162.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, AMPLICON, PAR DE INICIADORES DE POLINUCLEOTÍDEOS, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO, PLANTA DE MILHO TRANSGÊNICO, SEMENTE DE MILHO, AMOSTRA BIOLÓGICA, EXTRATO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE E DE SEMENTES DE MILHO HÍBRIDAS, SEMENTE HÍBRI- DA, PROTEÍNA INSETICIDA ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, SÍTIO ALVO, MÉTODO PARA FAZER UMA PLANTA TRANSGÊNICA DE MILHO".

ANTECEDENTES

A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, transformação de plantas, e reprodução de plantas. Mais especi- ficamente, a invenção relaciona-se a plantas de milho transgênicas resisten- tes a insetos compreendendo um novo genótipo transgênico e a métodos de detecção da presença de ácidos nucléicos que são únicos às plantas de mi- lho transgênicas em uma amostra e composições desta.

As pragas de plantas é um fator principal na perda de importantes colheitas agrícolas do mundo. Aproximadamente USD $8 bilhões são perdidos a cada ano somente nos EUA devido a infestações de pragas não-mamíferas incluindo insetos. Em adição às perdas na colheita do campo, as pragas de insetos são também um fardo para os cultivadores de frutas e vegetais, para os produtores de flores ornamentais e para os jardineiros caseiros.

Pragas de insetos são principalmente controladas pelas aplica- ções intensas de pesticidas químicos, que são ativos através da inibição do crescimento dos insetos, a prevenção da alimentação ou reprodução dos insetos, ou causam a morte. Desta forma um bom controle dos insetos pode ser alcançado, mas estes químicos algumas vezes podem também afetar outros insetos benéficos. Outro problema resultante do grande uso de pesti- cidas químicos é o aparecimento das variedades às quais resistem a inse- tos. Isto tem sido parcialmente suavizado pelas várias práticas de gerencia- mento de resistência, mas há uma necessidade crescente por agentes alter- nativos de controle de pragas. Agentes de controle de pragas biológicas, tais como amostras de Bacillus thuringiensis (Bt) expressando toxinas pesticidas como δ-endotoxinas, também têm sido aplicados às culturas agrícolas de plantação com resultados satisfatórios, oferecendo uma alternativa ou com- plemento aos pesticidas químicos. A codificação de genes para algumas destas δ-endotoxinas foi isolada e suas expressões em hospedeiros heteró- Iogos têm demonstrado que fornecem outra ferramenta para o controle de pragas de insetos economicamente importantes. Em particular, a expressão da Bt δ-endotoxinas tem fornecido proteção eficiente contra pragas de inse- tos selecionadas, e plantas transgênicas expressando tais toxinas têm sido comercializadas, permitindo que fazendeiros reduzam as aplicações de a- gentes químicos de controle de insetos.

Outra família de proteínas inseticidas produzidas por espécies de Bacillus durante o estágio vegetativo de crescimento (proteínas insetici- das vegetativas (Vip)) também foi identificada. As Patentes dos EUA - US 5,877,012, 6,107,279, e US 6,137,033, incorporadas neste pedido por refe- rência, descrevem uma nova classe de proteínas inseticidas chamadas de Vip3. Outras descrições, incluindo o WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546, e WO 99/57282, também homólogos já identificaram a classe Vip3 de proteínas. As seqüências de codificação da Vip3 codificam aproxi- madamente 88 proteínas kDa que possuem atividade inseticida contra um grande espectro de pragas de lepidópteros, incluindo, mas não limitado a, lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-da-maçã-do-algodoeiro (TBW, Heliothis virescens), broca da cana-de-açúcar, (SCB, Diatraea saccharalis), lagarta elasmo (LCB, Elas- mopalpus lignosellus) e lagarta da espiga (CEW, Helicoverpa zea), e quando expressadas em plantas transgênicas, por exemplo milho (Zea mays), elas conferem proteção à planta contra os danos causados pela alimentação dos insetos.

Os atuais métodos de transformação das plantas geralmente levam à integração aleatória de transgênicos como vip3 dentro de um geno- ma de planta hospedeira. Esta inserção aleatória do DNA introduzido dentro do genoma da planta pode ser letal se o DNA estrangeiro for introduzido dentro de um gene nativo criticamente importante e desta forma causar a mutação do mesmo. Além disso, ainda se um evento de inserção aleatória não danificar o funcionamento de um gene da célula hospedeira, a expres- são de um gene estrangeiro inserido pode ser influenciada por "efeitos de posição" causados pelo DNA genômico ao redor. Em alguns casos, o gene é introduzido dentro dos sítios onde os efeitos de posição são fortes o suficien- te para evitar a síntese de uma quantidade eficaz do produto do gene intro- duzido. Por exemplo, foi observado nas plantas que podem haver grandes variações nos níveis de expressão de um gene heterólogo introduzido dentro de um cromossomo da planta entre os eventos selecionados individualmen- te. Também pode haver diferenças nos padrões temporais ou espaciais da expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene nos vários tecidos das plantas, que podem não corresponder aos padrões esperados dos elementos regulatórios transcricionais presentes na construc- to do gene introduzido. Em outros exemplos, a produção exagerada do pro- duto do gene possui efeitos danosos na célula. Devido a estes problemas potenciais, é comum a produção de centenas de eventos diferentes e fazer a filtragem daqueles eventos para um único evento que possui os padrões e níveis de expressão transgênica desejados para fins comerciais. Contudo, uma vez identificado um sítio viável comercialmente dentro do genoma da planta, seria vantajoso direcionar genes de interesse para aqueles sítios não prejudiciais.

Foram descritos diversos métodos para a inserção direcionada de uma seqüência de nucleotídeos de interesse, num sítio de cromossomo específico, dentro de uma célula de planta. Sistemas de recombinação es- pecíficos do sítio foram identificados nos diversos organismos procarióticos e eucarióticos inferiores. Tais sistemas compreendem tipicamente uma ou mais proteínas que reconhecem duas cópias de uma seqüência de nucleotí- deos específicos, separam e ligam aquelas seqüências de nucleotídeos, e desta forma fornecem uma troca de informações genéticas específicas do sítio numa forma precisa. Diversas recombinases específicas do sítio são conhecidas na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas a, por exem- pio, o sistema de bacteriófagos P1 Cre/lox (Austin e outros (1981) Cell 25: 729-736), o sistema de recombinase R/RS do plasmídeo pSR1 do Ievedo Zygosaccharomyces rouxii (Araki e outros (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), o sistema Gin/gix do fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet.

230: 170-176), o sistema de recombinase FLP/FRT do plasmídeo 2 .mu.m do Ievedo Saccharomyees eerevisiae (Broach e outros (1982) Cell 29: 227- 234), e a recombinase Int do bacteriófago Lambda (Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 912-949; Landy (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 699-707; Lorbach e outros (2000) J. Mol. Biol. 296: 1175-1181; e WO 01/16345). Uma aproximação direcionada específica do sítio particularmente útil é revelada na publicação do pedido de Patente Norte-Americana sob número: US 2006/0130179, incorporada neste por referência, usa recombinação mediada pela integrase lambda. O método compreende a introdução, dentro de uma célula de planta de uma seqüência de nucleotídeos direcionada compreen- dendo um primeiro sítio de reconhecimento Integrase; introdução de dentro da célula da planta de uma seqüência de nucleotídeos doadores compreendendo um segundo sítio de Reconhecimento Integrase; e a introdução dentro da célu- la da planta, uma Integrase ou de um complexo de Integrases. Outra apro- ximação direcionada específica do sítio útil está revelada na Publicação do pedido de Patente Americana sob o número sob US 2006/0253918, incorpo- rada neste por referência, e usa recombinação homóloga para integrar um ou mais genes (piramidação de genes) em sítios específicos no genoma.

Um evento que possui níveis ou padrões desejados de expres- são transgênica é útil para introduzir o transgene dentro de outros antece- dentes genéticos pelo cruzamento sexual usando métodos de reprodução convencionais. A progenitura de tais cruzamentos mantém as características de expressão transgênica do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar uma expressão do gene confiável num número de varieda- des que são bem adaptadas para as condições de crescimento locais. Seria também uma vantagem de ser capaz de detectar a presença de um evento particular a fim de determinar se a progenitura de um cruzamento sexual contém um transgênico de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular seria útil para cumprir com os regulamentos que exigem a aprovação do pré-mercado e rotulação dos alimentos derivados das plan- tas de plantações recombinantes, por exemplo. É possível detectar a pre- sença de um transgene por qualquer método de detecção do ácido nucléico bem conhecido incluindo, mas não limitado, a amplificação térmica (Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)) usando iniciadores de polinucleotídeos ao a hibridização do DNA usando sondas de ácido nucléico. Tipicamente, para o bem da simplicidade e uniformidade dos reagentes e metodologias para uso na detecção de uma constructo de DNA específica que foi usada para transformar várias variedades de plantas, estes métodos de detecção geral- mente focam nos elementos genéticos freqüentemente usados, por exemplo, promotores, terminadores, e genes marcadores, porque para muitas cons- truções de DNA, a região da seqüência de codificação é intercambiável. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para descriminar entre os constructos que diferem somente com referência para as seqüências de co- dificação. Além disso, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA a menos que a seqüência cromossomal DNA adjacente ao DNA heterólogo inserido ("pareamento de DNA") seja conheci- da.

Pelas razões mencionadas acima, há uma necessidade de even- tos de milho transgênico resistente a insetos compreendendo seqüências novas de ácido nucléico que são únicas ao evento de milho transgênico, ú- teis para identificar o evento de milho transgênico e para detectar ácidos nu- cléicos do evento de milho transgênico numa amostra biológica, bem como de kits compreendendo os reagentes necessários para o uso na detecção destes ácidos nucléicos numa amostra biológica. Ainda há uma outra neces- sidade em fornecer sítios alvos específicos dentro do genoma de milho para permitir o direcionamento e controle da inserção de seqüências de nucleotí- deos a serem integradas dentro do genoma do milho.

SUMÁRIO

A presente invenção refere-se a um evento de milho transforma- do (Zea mays), designado MIR162 compreendendo um novo genótipo trans- gênico que compreende uma seqüência de codificação vip3Aa20, que é úni- ca para o evento MIR162. A seqüência de codificação vip3Aa20 codifica uma proteína inseticida Vip3Aa20 que confere resistência aos insetos para as plantas de milho MIR162. O evento MIR162 também compreende uma seqüência de codificação pm/'codificando uma proteína PMI que confere nas células do milho a habilidade para utilizar manose como uma fonte de car- bono. Em adição à seqüência de codificação vip3A20, a presente invenção também fornece outros ácidos nucléicos que são únicos ao MIR162. A in- venção também fornece plantas de milho transgênico compreendendo os ácidos nucléicos únicos ao MIR162, semente das plantas de milho transgê- nico, e métodos para produzir uma planta de milho transgênico compreen- dendo os ácidos nucléicos únicos da invenção pelo cruzamento de um milho reproduzido com si próprio compreendendo os ácidos nucléicos únicos para o MIR162 ou outra linhagem de milho de um genótipo diferente. Uma amos- tra da semente, e consequentemente plantas de milho cultivado da semente, compreendendo ácidos nucléicos únicos para o MIR162, foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) com número de acesso PTA-8166. As plantas do milho transgênico da invenção podem ter essencialmen- te todas as características morfológicas e fisiológicas correspondentes das plantas de milho não-transgênicos isogênicos em adição àquelas conferidas nas plantas de milho pelo novo genótipo da invenção. Amostras biológicas e extratos das plantas de milho MIR162, tecidos e sementes também são for- necidos pela presente invenção. A presente invenção também fornece com- posições e métodos para detectar a presença de ácidos nucléicos únicos para o MIR162 em amostras biológicas baseadas na seqüência de DNA dos cassettes de expressão recombinante dentro do genoma do milho que resul- tou no evento MIR162, e das seqüências genômicas pareando o sítio de in- serção. A presente invenção também fornece um sítio alvo de inserção não- prejudicial num cromossomo do milho útil para introduzir genes de interesse para um local específico no cromossomo, e métodos de alterar um genoma de milho pela introdução de ácidos nucléicos heterólogos no sítio de inser- ção revelado ou na vizinhança do sítio de inserção revelado. O evento MIR162 pode ainda ser caracterizado pela análise dos níveis de expressão das proteínas Vip3Aa20 e PMI, bem como pelo teste do MIR162 para eficá- cia contra pragas de insetos lepidópteros. A presente invenção também for- nece métodos de produzir plantas de milho transgênico resistentes a um es- pectro mais amplo de pragas de insetos pela piramidação da característica de resistência ao inseto Vip3Aa20 com características de resistência ao in- seto diferente do Vip3Aa20.

Estes e outros aspectos da invenção ficarão mais aparentes a partir da descrição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 é a seqüência de codificação Vip3Aa20 no MIR162.

SEQ ID NO: 2 é a seqüência de aminoácido Vip3Aa20.

SEQ ID NO: 3 é a seqüência de plasmídeo pNOV1300.

SEQ ID Nos: 4-12 são iniciadores e sondas úteis num ensaio TAQMAN.

SEQ ID NO: 13 é a seqüência de uma sonda vip3Aa20.

SEQ ID NO: 14 é a seqüência de uma sonda pmi.

SEQ ID Nos: 15-37 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID No: 38 é a seqüência de um amplicon vip3Aa20.

SEQ ID Nos: 39-40 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID No: 41 é a seqüência de um amplicon CJ134/179 5'.

SEQ ID Nos: 42-43 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID NO: 44 é um amplicon vip3Aa20 3'.

SEQ ID NO: 45 é a junção de inserção do genoma 5'.

SEQ ID NO: 46 é a seqüência flanqueadora do genoma do milho 5' para inserção.

SEQ ID NO: 47 é a junção de inserção do genoma 3'.

SEQ ID NO: 48 é a seqüência flanqueadora do genoma do milho 3' para inserção.

SEQ ID NO: 49 é a inserção do MIR162 e seqüências flanquea- doras.

SEQ ID Nos. 50-54 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID NO: 55 é uma amplicon 5' PCR.

SEQ ID Nos. 56-58 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID NO: 59 é uma amplicon 3' PCR.

SEQ ID Nos. 60-105 são iniciadores úteis na presente invenção.

SEQ ID NO: 106 é a seqüência da região do cromossomo do milho 5 compreendendo o local alvo do cromossomo revelado.

SEQ ID NO: 107 é a seqüência genômica do milho que foi des- locada pela inserção do DNA heterólogo no MIR162.

DESCRIÇÃO DETALHADA

As seguintes definições e métodos a seguir são fornecidos para definir melhor a presente invenção e para guiar aqueles com habilidades comuns na técnica na prática da presente invenção. A menos que seja ob- servado de outra forma, os termos usados neste documento devem ser en- tendidos conforme o uso convencional para aqueles com habilidades co- muns na técnica em questão. As definições dos termos comuns da biologia molecular também podem ser encontradas no Rieger et a!., Glossário de Genética: Clássica e Molecular, 5â edição, Springer-Verlag: New York, 1994.

A nomenclatura das bases do DNA e dos aminoácidos conforme disposto no 37 C.F.R. § 1.822 é usada neste documento.

Como usado neste documento, o termo "amplificado" significa a construção de cópias múltiplas de uma molécula de ácido nucléico ou cópias múltiplas complementares à molécula de ácido nucléico usando pelo menos uma das moléculas de ácido nucléico como um padrão. Sistemas de amplifi- cação incluem, mas não estão limitados ao sistema de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sistema da reação em cadeia da Iigase (LCR), amplifi- cação baseada em seqüência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Missis- sauga, Ontário), sistemas de Q-Beta Replicase, sistema de amplificação ba- seada na transcrição (TAS), e amplificação pelo deslocamento da fita (SDA). Ver, por exemplo:Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applica- tions, D. H. Persing, e outros, Ed., American Societyfor Microbiology, Wash- ington, D.C. (1993). O produto da amplificação é descrito como um amplicon.

Uma "seqüência de codificação" é uma seqüência de ácido nu- cléico que é transcrita dentro do RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, "sentido" RNA ou "antissentido" RNA. Preferencialmente o RNA é então tra- duzido num organismo para produzir uma proteína.

Conforme usado neste, o termo milho significa Zea mays ou mi- lho e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com milho, incluindo espécies selvagens de milho.

"Kit de Detecção" conforme usado neste refere-se a um kit de partes úteis na detecção da presença ou ausência do DNA único para plan- tas MIR162 numa amostra, onde o kit compreende sondas de ácido nucléico e/ou iniciadores da presente invenção, que formam híbridos especificamente sob condições de alta estringência para uma seqüência alvo de DNA, e ou- tros materiais necessários para possibilitar métodos de amplificação ou hi- bridização do ácido nucléico.

Conforme usado neste o termo "evento" transgênico refere-se a uma planta recombinante produzida pela transformação e regeneração de um tecido ou célula da planta com DNA heterólogo, por exemplo, um casse- te de expressão que inclui um gene de interesse. O termo "evento" refere-se ao transformante original e/ou progenitura do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também refere-se à progenitura produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra linhagem de milho. Ain- da depois do retrocruzamento repetido para um parente recorrente, o DNA introduzido e o flanqueador DNA dos parentes transformados estão presen- tes na progenitura do cruzamento no mesmo local do cromossomo. O termo "evento" também refere-se ao DNA do transformante original compreenden- do o DNA inserido e a seqüência genômica flanqueadora imediatamente ad- jacente ao DNA inserido que esperaria-se ser transferido para uma progeni- tura que recebe o DNA inserido incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem progenitora que inclui o DNA inserido (por exemplo: o transformante original e a progenitura resul- tante da auto-fecundação) e uma linhagem progenitora que não contém o DNA inserido. Normalmente, a transformação do tecido da planta produz múltiplos eventos, cada um representa a inserção de uma construção de DNA dentro de uma localização diferente no genoma de uma célula de plan- ta. Baseado na expressão do transgene ou outras características desejáveis, um evento particular é selecionado. Desta forma, "evento MIR162" ou "even- to MIR162" podem ser usados intercambiavelmente.

Uma planta do milho MIR162 resistente aos insetos pode ser reproduzida primeiramente pelo cruzamento sexual de uma primeira planta de milho progenitora consistindo em uma planta de milho cultivada a partir de uma planta de milho MIR162 transgênico, tal como uma planta de milho MIR162 cultivada a partir da semente depositada no ATCC sob número de acesso: PTA-6188, e progenitura desta derivada da transformação com o cassete de expressão dos meios de execução da presente invenção que conferem resistência aos insetos, com uma segunda planta de milho proge- nitora que falta resistência aos insetos, desta forma produzindo uma plurali- dade de primeiras plantas da progenitura; e depois pela seleção de uma primeira planta da progenitura que é resistente aos insetos; e autofecunda- ção da primeira planta da progenitura, desta forma produzindo uma plurali- dade de segunda planta da progenitura; e finalmente pela seleção das se- gundas plantas da progenitura uma planta resistente a insetos. Estas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da primeira planta da progenitura re- sistente a insetos ou a segunda planta da progenitura resistente a insetos com a segunda planta de milho progenitora ou uma terceira planta de milho progenitora, desta forma produzindo uma planta de milho que seja resistente aos insetos.

"Cassete de Expressão " conforme usado neste documento sig- nifica uma molécula de ácido nucléico capaz de direcionar a expressão de uma seqüência de nucleotídeos específicos numa célula hospedeira apropri- ada, compreendendo um promotor ligado operavelmente à seqüência de nucleotídeos de interesse que é ligada operavelmente aos sinais de termina- ção. Isto também compreende tipicamente seqüências necessárias para tra- dução apropriada da seqüência de nucleotídeos. O cassete de expressão também pode compreender seqüências não necessárias na expressão direta de uma seqüência de nucleotídeos de interesse, mas que estão presentes devido aos sítios de restrição convenientes para remoção do cassete de um vetor de expressão. O cassete de expressão compreendendo a seqüência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo me- nos um dos seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um dos seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que esteja naturalmente ocorrendo mas que foi obtido numa forma re- combinante útil para a expressão heteróloga. Tipicamente, contudo, a ex- pressão cassete é heterólogo com relação ao hospedeiro, isto é, a seqüên- cia de ácido nucléico particular do cassete de expressão não ocorre natu- ralmente na célula do hospedeiro e deve ser introduzida dentro da célula do hospedeiro ou um antepassado da célula hospedeira por um processo de transformação conhecido na técnica. A expressão da seqüência de nucleotí- deo no cassete de expressão pode ser sob o controle de um promotor cons- titutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição somente quando a célula hospedeira é exposta a alguns estímulos externos particulares. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor tam- bém pode ser específico para um tecido em particular, ou orgão, ou estágio de desenvolvimento. Um cassete de expressão, ou fragmento deste, tam- bém pode ser referido como "seqüência inserida" ou "seqüência de inserção" quando transformada numa planta.

Um "gene" é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e que, apesar da seqüência de codificação mencionada acima, pode compreender outras, primariamente regulatória, seqüências de ácido nucléico responsáveis para o controle da expressão, que quer dizer a trans- crição e tradução, da porção de codificação. Um gene também pode conter outras seqüências não traduzidas 5' e 3' e seqüências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons.

"Gene de interesse" refere-se a qualquer gene que, quando transferido para uma planta, confere na planta uma característica desejada como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, re- sistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicidas, valor nutricional melhorado, melhora do desempenho num processo industri- al ou capacidade reprodutiva alterada.

"Genótipo" conforme usado neste documento é o material genético herdado das plantas do milho de origem, nem todas que são necessariamente expressadas nas plantas de milho descendentes. O genótipo MIR162 refere-se ao material genético heterólogo transformado dentro do genoma de uma planta bem como o material genético flanqueando a seqüência inserida.

Uma seqüência de ácido nucléico "heteróloga" é uma seqüência de ácido nucléico não naturalmente associada com uma célula hospedeira na qual esta é introduzida, incluindo a ocorrência não natural de cópias múl- tiplas de uma seqüência de ácido nucléico

Uma seqüência de ácido nucléico "homóloga" é uma seqüência de ácido nucléico naturalmente associada com uma célula hospedeira na qual esta é introduzida.

"Operavelmente-ligada" refere-se à associação das seqüências de ácido nucléico num fragmento de ácido nucléico único para que a função de uma afete a função da outra. Por exemplo, um promotor é operavelmente - ligado com uma seqüência de codificação ou RNA funcional quando este é capaz de afetar a expressão da seqüência de codificação ou RNA funcional (isto é, quando a seqüência de codificação ou RNA funcional está sob o con- trole transcricional do promotor). As seqüências de codificação em orienta- ção de senso ou antisenso podem ser operavelmente-ligadas às seqüências regulatórias.

"Iniciadores" conforme usados neste documento são ácidos nu- cléicos isolados que são fortalecidos para uma fita de DNA alvo complemen- tar pela hibridização do ácido nucléico para formar um híbrido entre o inicia- dor e a fita de DNA alvo, e então estendido ao longo da fita de DNA alvo por uma polimerase, tal como polimerase de DNA. Pares ou conjuntos de inicia- 30 dores podem ser usados para amplificação de uma molécula de ácido nu- cléico, por exemplo, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação do ácido nucléico. Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual é ligado um rótulo detectável convencional ou molécula repórter, tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima. Tal sonda é com- plementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente inven- ção, para uma fita de DNA genômico do milho evento MIR162. O DNA do MIR162 pode ser de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do MIR162. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não so- mente ácidos ribonucléicos ou desoxirribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se unem especificamente a uma seqüência de DNA alvo e podem ser usados para detectar a presença daquela seqüên- cia de DNA alvo.

Iniciadores e sondas são geralmente entre 10 e 15 nucleotídeos ou mais em comprimento. Iniciadores e sondas também podem ser pelo me- nos 20 nucleotídeos ou mais em comprimento, ou pelo menos 25 nucleotí- deos ou mais, ou pelo menos 30 nucleotídeos ou mais em comprimento. Tais iniciadores e sondas hibridizam especificamente para uma seqüência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Iniciadores e sondas de acordo com a presente invenção podem ter seqüência completa comple- mentar com a seqüência alvo, embora as sondas diferem da seqüência alvo e que retêm a habilidade para hibridizar as seqüências alvo podem ser proje- tadas por métodos convencionais.

Conforme usado neste documento "piramidação" (empilhamen- to) do gene ou de característica combina características desejadas dentro de uma linhagem transgênica. Reprodutores de plantas empilham característi- cas transgênicas ao fazer cruzamentos entre parentes que cada um têm uma característica desejada e então identifica a descendência que ambas têm destas características desejadas. Outra forma de empilhar genes é pela transferência de dois ou mais genes dentro do núcleo da célula de uma plan- ta ao mesmo tempo durante a transformação. Outra forma de empilhar ge- nes é pela retransformação de uma planta transgênica com outro gene de interesse. Por exemplo, empilhamento de gene pode ser usado para combi- nar duas características de resistência a insetos diferentes, uma característi- ca resiste a insetos e uma característica resiste a doenças, ou uma caracte- rística de resistência a herbicida. O uso de um marcador selecionável além de um gene de interesse também seria considerado empilhamento de gene.

"Condições estringentes" ou "condições de hibridização estrin- gentes" incluem referências a condições sob as quais uma sonda irá hibridi- zar para sua seqüência alvo, para um grau maior detectável do que para outras seqüências. Condições de estringência são dependentes da seqüên- cia alvo e irão diferir dependendo da estrutura do polinucleotídeo. Pelo con- trole da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, as seqüên- cias alvo que serão 100% complementares à sonda (sonda homóloga) po- dem ser identificadas. Alternativamente, condições estringentes podem ser ajustadas para permitir alguma inadequação nas seqüências de forma que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização dos ácidos nucléicos é encon- trado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid sonda assays", El- sevier: New York; e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel e outros, Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience: New York (1995), e também Sambrook e outros (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manu- al (5a Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridi- zação, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Geralmente, hibridização de alta resistência e condições de lavagem são selecionadas a estarem aproximadamente a 5QC abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica numa força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual .50% da seqüência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente compatível. Tipicamente, sob condições de alta estringência uma sonda irá hibridizar para sua seqüência alvo, mas não para outras seqüências.

Um exemplo de condições de hibridização de alta estringência para a hibridização dos ácidos nucléicos complementares que possuem mais de 100 resíduos complementares num filtro em "Southern Blot" ou "Northern Blot" é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42SC, a hibridiza- ção sendo executada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem de estringência muito alta é 0,15M NaCI a 72SC por aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem de estringência alta é uma lavagem 0,2x SSC a 659C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição do buffer SSC).

Um bom exemplo de condições de hibridização para a presente invenção incluem hibridização em 7% SDS1 0,25 M NaPO4 pH 7,2 a 67°C durante a noite, seguida por duas lavagens em 5% SDS, 0,20 M NaPO4 pH .7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem, e duas lavagens em 1% SDS,0,20 M NaPO4 pH 7,2 a 65°C por 30 minutos em cada lavagem. Um bom exemplo de lavagem de estringência média para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45SC por 15 minutos. Um bom exem- plo de lavagem de estringência baixa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40-C por 15 minutos.

Para sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleotídeos, condi- ções de alta estringência tipicamente envolvem concentrações de sal de menos de aproximadamente 1,0 M Na íon, tipicamente concentrações de aproximadamente 0,01 a 1,0 M Na íons (ou outros sais) num pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente de pelo menos de aproximadamente 30SC. Condições de alta estringência também podem ser alcançadas com a adição de agentes destabilizantes como a formamida. Geralmente, um sinal para taxa de ruído de 2x (ou superior) do que o observado para uma sonda não relacionada no ensaio específico de hibridização indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucléicos que não hibridizam entre si sob condições de alta estringência são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificarem forem substancialmente idênticas. Isto ocor- re, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a máxima degeneração do códon permitida pelo código genético.

A seguir alguns bons exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para hibridizar as seqüências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas às seqüências de nu- cleotídeos de referência da presente invenção: uma seqüência de nucleotí- deos de referência preferencialmente hibridiza para a seqüência de nucleotí- deos de referência em 7% de Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4,1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 2X SSC1 0,1% SDS a 50°C, mais pre- ferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais prefe- rencialmente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4,1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50°C, prefe- rencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais prefe- rencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M NaPO4, 1 mM EDTA a 50°C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C. As seqüências da presente invenção podem ser detectadas usando todas as condições a- cima. Para fins de definir a invenção, são usadas as condições de alta es- tringência.

"Transformação" é um processo para a introdução do ácido nu- cléico heterólogo dentro de uma célula hospedeira ou organismo. Particu- larmente, "transformação" significa a integração estável de uma molécula de DNA dentro do genoma de um organismo de interesse.

"Transformado / transgênico / recombinante" refere-se a um or- ganismo hospedeiro como uma bactéria ou uma planta no qual uma molécu- la de ácido nucléico heteróloga foi introduzida. A molécula de ácido nucléico pode ser estavelmente integrada dentro do genoma do hospedeiro ou a mo- lécula de ácido nucléico também pode estar presente como uma molécula extracromossômica. Tal molécula extracromossômica pode ser auto- replicadora. Células transformadas, tecidos ou plantas são entendidas para conter não somente o produto final de um processo de transformação, mas também a progenitura transgênica deste. Um hospedeiro "não-transforma- do", "não-transgênico", ou "não-recombinante" refere-se a um organismo do tipo selvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contém a mo- lécula de ácido nucléico heteróloga. Como usado neste documento, "trans- gênico" refere-se a uma planta, célula de planta, ou grande quantidade de células de planta estruturadas ou não-estruturadas tendo integrado, através de técnicas bem conhecidas de manipulação genética e inserção de genes, uma seqüência de ácidos nucléicos representando um gene de interesse dentro do genoma da planta, e tipicamente dentro de um cromossomo de um núcleo da célula, mitocôndria ou outra organela contendo cromossomos, resultam da manipulação e inserção de tais seqüências de ácido nucléico, ao contrário das mutações que ocorrem naturalmente, para produzir uma planta que ocorre de forma não natural ou uma planta com um genótipo que ocorre de forma não natural.

Técnicas para a transformação das plantas e células das plantas são bem conhecidas no estado da técnica e podem compreender, por exemplo, ele- troporação, microinjeção, transformação mediada por Agrobactéria, e trans- formação balística.

Conforme usado neste documento, o termo "único" para MIR162 significa características distintivas de MIR162. Desta forma, ácidos nucléicos únicos para o evento MIR162 não são encontrados em outras plantas de milho que não sejam MIR162.

A classe "Vip3" de proteínas compreende, por exemplo, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba, e Vip3Bb, e seus homólogos. "Homólogo" significa que a proteína indicada ou polipeptídeo sustentam uma relação definida para outros membros da classe Vip3 de pro- teínas. "Vip3Aa20" é um homólogo Vip3 único para o evento MIR162. Foi gerado por mutações espontâneas introduzidas dentro do gene vip3Aa19 otimizado por milho contido no pNOV1300 (SEQ ID NO: 3) durante o pro- cesso de transformação da planta.

Esta invenção refere-se a uma linhagem geneticamente melho- rada de milho que produz uma proteína de controle de insetos, Vip3Aa20, e a uma enzima fosfomanose-isomerase (PMI) que permite que a planta utilize a manose como uma fonte de carbono. A invenção é particularmente proje- tada para um evento de milho transgênico designado MIR162 compreen- dendo um novo genótipo, bem como para composições e métodos para de- tectar ácidos nucléicos únicos ao MIR162 numa amostra biológica. A inven- ção é ainda projetada para plantas de milho compreendendo o genótipo MIR162, para sementes transgênicas das plantas de milho, e para métodos para produzir uma planta de milho compreendendo o genótipo MIR162 pelo cruzamento de um milho cruzado com si mesmo compreendendo o genótipo MIR162 ou outra linhagem de milho. Plantas de milho compreendendo o ge- nótipo MIR162 da invenção são úteis no controle de pragas de insetos Iepi- dópteros incluindo, mas não limitado a, lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho (FAW, Spodoptera frugiperdá), lagarta-da-maçã-do- algodoeiro (TBW, Heliothis virescens), broca da cana-de-açúcar, (SCB, Dia- traea saccharaiis), lagarta elasmo (LCB, Elasmopalpus lignosellus), e lagarta da espiga (CEW, Helicoverpa zea), e larva do feijão ocidental (WBCW, Stria- costa albicosta). A invenção é ainda projetada para um método de proteger o milho transgênico do dano causado pela alimentação dos insetos, pelo qual o empilhamento do traço de resistência do inseto do MIR162 com uma ca- racterística diferente de resistência ao inseto na mesma planta transgênica uma planta de milho que é protegida do dano causado pela alimentação dos insetos para um grau maior que as características de resistência do inseto por si só.

Numa modalidade, a presente invenção abrange uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é única ao evento MIR162.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma molé- cula de ácido nucléico isolada que liga uma molécula de DNA heteróloga introduzida dentro do genoma do MIR162 para o genoma do DNA no MIR162 compreendendo pelo menos 10 ou mais (por exemplo 15, 20, 25, 50 ou mais) nucleotídeos contíguos da molécula do DNA heteróloga e pelo me- nos 10 ou mais (por exemplo 15,20, 25, 50, ou mais) nucleotídeos contíguos do DNA do genoma flanqueando o ponto de inserção da molécula do DNA heteróloga. Estão também incluídas as seqüências de nucleotídeos que compreendem 10 ou mais nucleotídeos da seqüência de inserção contígua do evento MIR162 e pelo menos um nucleotídeo do DNA flanqueador do evento MIR162 adjacente à seqüência de inserção. Tais seqüências de nu- cleotídeos são únicas, e diagnosticar o evento MIR162. A hibridização ou amplificação do ácido nucléico do DNA genômico do MIR162 produz um amplicon compreendendo tais seqüências únicas permite diagnosticar para o evento MIR162. Em um aspecto desta modalidade, a seqüência de nucleotí- deos é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.

Em outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de áci- do nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma seqüência de junção do evento MIR162, na qual uma seqüência de junção transpõe a junção entre um cassete de ex- pressão heteróloga inserido dentro do genoma do milho e o DNA do genoma do milho pareando o local de inserção e é diagnosticado para o evento. Num aspecto desta modalidade, a seqüência de junção é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e os complemento desta.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma molé- cula de ácido nucléico isolada unindo uma molécula de DNA heteróloga o genoma da planta do milho no evento MIR162 compreendendo uma se- qüência de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 nucleotídeos contí- guos selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, e os complementos desta.

Em outra modalidade, a invenção engloba uma molécula de áci- do nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeos sele- cionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas. Num aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico isolada é contida numa semente de milho de- positada na "American Type Culture Collection" sob o número de acesso PTA-8166, ou em plantas cultivadas da semente.

Numa modalidade da presente invenção, uma amplicon compre- endendo uma seqüência de nucleotídeos única para o evento MIR162 é for- necida. Num aspecto desta modalidade, a seqüência de nucleotídeos é se- lecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba os iniciado- res da seqüência flanqueadora para detectar o evento MIR162. Tais iniciado- res da seqüência flanqueadora compreendem uma seqüência de nucleotí- deos de pelo menos 10-15 nucleotídeos contíguos de 5' ou a seqüência flanqueadora de 3'. Num aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contí- guos são selecionados dos nucleotídeos 1-1088 (inclusive) da SEQ ID NO: 49 (arbitrariamente designado neste como a seqüência flanqueadora 5'), ou os complementos desta. Em outro aspecto desta modalidade, os iniciadores da seqüência flanqueadora 5' são selecionados do grupo consistindo na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NOs: 68-80, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, os nucleotídeos contíguos são selecionados dos nucleotídeos 9391-10579 (inclusive) da SEQ ID NO: 49 (arbitrariamente designada neste como a seqüência flan- queadora 3'), ou os complementos desta. Ainda num outro aspecto desta modalidade, iniciadores da seqüência flanqueadora 3' são selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NOs: 97-105, e os comple- mentos destas.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam juntos na presença de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162. Num as- pecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é es- colhido da SEQ ID NO: 1 ou o complemento desta. Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador e/ou o segundo iniciador é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, e os complementos destas. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a am- plicon que é produzida pelo par de iniciadores compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, ou os complementos destas.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um par de iniciadores de polinucleotídeos compreendendo um primeiro iniciador de po- linucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo que funcionam jun- tos na presença de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162. Onde o primeiro iniciador é ou está complementar para uma seqüência de genoma da planta do milho pareando o ponto de inserção de uma seqüência de DNA heterólo- ga inserida dentro do genoma do evento MIR162, e o segunda seqüência de iniciador de polinucleotídeos é ou está complementar à seqüência de DNA heteróloga inserida dentro do genoma do evento MIR162.

Num aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador de polinu- cleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma se- qüência de nucleotídeos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1-1088 de SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9391-10579 da SEQ ID NO: 49, e os complementos destas. Num outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NOs: 68-72, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NOs: 97-105, e os complementos destas. Em outro aspecto desta modalidade, o segundo iniciador do polinucleotídeo compre- ende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da posição 1089-9390 da SEQ ID NO: 49, ou complementos desta. Ainda num outro aspecto desta modali- dade, o segundo iniciador do polinucleotídeo é selecionado do grupo consis- tindo nas SEQ ID NOs: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NOs: 50-52, SEQ ID NOs: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, e os complementos destas.

Em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do poli- nucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 36, e o segundo iniciador do po- linucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 37 funcionam juntos na presen- ça de um modelo de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento MIR162 conforme descrito no Exem- plo 4. Numa modalidade deste aspecto, o amplicon compreende a seqüência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 38.

Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 39, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 40 funcionam juntos na presença de um padrão de evento MIR162 DNA numa amostra para produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 conforme des- crito no Exemplo 4. Numa modalidade deste aspecto, o amplicon compreen- de a seqüência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 41.

Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 53, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 54 funcionam juntos na presença de um padrão de evento de milho MIR162 DNA numa amostra pa- ra produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 con- forme descrito no Exemplo 5. Numa modalidade, o amplicon compreende a seqüência de nucleotídeos dispostas na SEQ ID NO: 55.

Ainda em outro aspecto desta modalidade, o primeiro iniciador do polinucleotídeo, que é disposto na SEQ ID NO: 58, e o segundo iniciador do polinucleotídeo que é disposto na SEQ ID NO: 56, funcionam juntos na presença de um padrão de evento de milho MIR162 DNA numa amostra pa- ra produzir um diagnóstico do amplicon para o evento de milho MIR162 con- forme descrito no Exemplo 5. Numa modalidade, o amplicon compreende a seqüência de nucleotídeos dispostos na SEQ ID NO: 59.

Naturalmente, está bem dentro do conhecimento da técnica a obtenção da seqüência adicional ainda dentro da seqüência do genoma pa- reando qualquer lado das seqüências de DNA heteróloga inseridas para uso como uma seqüência de iniciadores que pode ser usada em tais pares de iniciadores para amplificar as seqüências que são diagnosticadas para o e- vento MIR162. Com o propósito desta descrição, a frase "ainda dentro da seqüência do genoma pareando qualquer lado das seqüências de DNA hete- rólogas inseridas" refere-se especificamente a um movimento seqüencial longe das extremidades das seqüências de DNA heterólogas inseridas, os pontos pelos quais as seqüências de DNA inseridas são adjacentes à se- quência de DNA genômica nativa, e fora para dentro do DNA genômico do cromossomo particular dentro do qual as seqüências de DNA heterólogas foram introduzidas. Preferencialmente, uma seqüência de iniciadores cor- respondente a ou complementar a uma parte da seqüência de inserção de- veria fazer o prime da extensão transcricional de uma tira nascente do DNA ou RNA em direção da junção de seqüência flanqueadora mais próxima. Consequentemente, uma seqüência de iniciadores correspondendo a ou complementar a uma parte da seqüência flanqueadora genômica deveria fazer o prime da extensão transcricional de uma tira nascente de DNA ou RNA na direção da junção de seqüência flanqueadora mais próxima. Uma seqüência de iniciadores pode ser, ou pode ser complementar a, uma se- qüência de DNA heteróloga inserida dentro do cromossomo de uma planta, ou uma seqüência flanqueadora genômica. Um técnico com conhecimentos na técnica reconheceria prontamente o benefício se uma seqüência de inici- adores necessitaria, ou necessitaria ser complementar a, a seqüência dis- posta dentro da seqüência de DNA heteróloga inserida ou conforme disposta na SEQ ID NO: 38 dependendo da natureza do produto desejado para ser obtido através do uso do conjunto alojado de iniciadores destinados para uso na amplificação de uma seqüência de pareamento particular contendo a jun- ção entre a seqüência de DNA genômica e a seqüência de DNA heteróloga inserida.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma proteí- na inseticida isolada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma molécula de áci- do nucléico codificando a SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto desta modalida- de, a molécula de ácido nucléico é SEQ ID NO: 1. A presente invenção tam- bém engloba um gene quimérico compreendendo um promoter heterólogo operavelmente ligado à molécula de ácido nucléico, e aos vetores recombi- nantes e células hospedeiras compreendendo o gene quimérico. Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 em numa amostra compreendendo ácidos nucléi- cos de milho, onde o método compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de iniciadores de polinucleotídeos que, quando usado numa reação de amplificação de ácidos nucléicos com DNA genômico do evento MIR162 produz um amplicon que é diagnosticado para o evento MIR162; (b) realização de uma reação de amplificação do ácido nucléico, por meio desta forma produzindo o amplicon; e (c) detectando o amplicon. Num aspecto desta modalidade, o amplicon compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.

Numa outra modalidade, a presente invenção engloba um méto- do de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 numa amostra compreendendo ácido nucléico do milho, onde o método compreende: (a) contatando a amostra com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento MIR162 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; (b) sujeitando a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detectando a hibridização da sonda para o DNA. A detecção pode ser feita por qualquer meio bem conhecido na técnica incluindo fluorescência, quimiluminescência, radiológica, imunológi- ca, e outros. No caso em que a hibridização destinar-se a ser usada como um meio para a amplificação de uma seqüência particular para produzir um amplicon que é diagnosticada para o evento MIR162, a produção e detecção por qualquer meio bem conhecido na técnica da amplicon destinam-se a ser um indicativo da hibridização destinada à seqüência alvo onde uma sonda ou iniciador é utilizado, ou seqüências onde duas ou mais sondas ou inicia- dores são utilizados. O termo "amostra biológica" destina-se a compreender uma amostra que contém ou é suspeita de conter um ácido nucléico com- preendendo entre cinco e dez nucleotídeos em qualquer lado do ponto no qual um ou outro dos dois pontos terminais da seqüência de DNA heteróloga inserida contacta a seqüência de DNA genômico dentro do cromossomo no qual a seqüência de DNA heteróloga foi inserida, neste documento também conhecido como seqüências de junção. Além disso, a seqüência de junção compreende tão pouco quanto dois nucleotídeos: aqueles sendo o primeiro nucleotídeo dentro do flanqueador DNA ou genômico adjacente ao covalen- temente unido ao primeiro nucleotídeo dentro da seqüência de DNA heteró- loga inserida. Em um aspecto desta modalidade, a sonda compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, e os complementos destas.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba um kit para a detecção dos ácidos nucléicos que são únicos ao evento MIR162 na amostra biológica. Kit inclui pelo menos uma molécula de ácido nucléico de comprimento suficiente de polinucleotídeos contíguos para funcionar como um iniciador ou sonda num método de detecção do ácido nucléico, que de- pois da amplificação ou hibridização para uma seqüência de ácido nucléico alvo numa amostra seguida pela detecção do amplicon ou hibridização para a seqüência alvo, são diagnosticados para a presença de seqüências de ácido nucléico únicas ao evento MIR162 na amostra. Kit ainda inclui outros materiais necessários para permitir a hibridização do ácido nucléico ou os métodos de amplificação. Num aspecto desta modalidade, uma molécula de ácido nucléico contida no kit compreende uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 49. Em outro aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucléico é um iniciador selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 15-37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NOs: 50-54, SEQ ID NOs: 56-58, SEQ ID NOs: 60- 105, e os complementos destas. Ainda em outro aspecto desta modalidade, o amplicon compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou os complementos destas. Uma variedade de métodos de detec- ção podem ser usados incluindo, mas não limitados a TAQMAN (Perkin El- mer), amplificação térmica, reação em cadeia por ligase, hibridização de Southern, métodos ELISA, e métodos de detecção colorimétrica e fluores- cente. Em particular a presente invenção fornece kits para detectar a pre- sença da seqüência alvo, isto é, pelo menos a seqüência vip3Aa20 ou uma seqüência de junção, numa amostra contendo ácido nucléico genômico do MIR162. Kit é compreendido por pelo menos um polinucleotídeo capaz de ligar ao sítio alvo ou substancialmente adjacente ao sítio alvo e pelo menos um meio para detectar a ligação do polinucleotídeo para o sítio alvo. Os meios de detecção podem ser fluorescente, quimioluminescência, colorimé- trica, ou isotópico e podem ser acoplados pelo menos com métodos imuno- lógicos para detectar a ligação. Kit também é visionado que pode detectar a presença do sítio alvo numa amostra, isto é, pelo menos a seqüência vip3Aa20 ou uma seqüência de junção do MIR162, levando vantagem de duas ou mais seqüências de polinucleotídeos que juntas são capazes de ligar às seqüências de nucleotídeo adjacentes a ou dentro de aproximada- mente 100 pares de base, ou dentro de aproximadamente 200 pares de ba- se ou dentro de aproximadamente 500 pares de base ou dentro de aproxi- madamente 1000 pares de base da seqüência alvo e que podem ser esten- didas entre si para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um método de detectar a proteína Vip3Aa20 numa amostra biológica, o método compre- ende: (a) extrair proteína do tecido do evento MIR162; (b) ensaiar a proteína extraída usando um método imunológico compreendendo anticorpos especí- ficos para a proteína Vip3Aa20 produzida pelo evento MIR162; e (c) detectar a ligação do anticorpo mencionado para a proteína Vip3Aa20.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção engloba uma amostra biológica derivada de uma planta de milho do evento MIR162, teci- do, ou semente, onde a amostra compreende uma seqüência de nucleotí- deos que é ou está complementar para a seqüência que é única ao evento MIR162, e onde a seqüência é detectável na amostra usando uma amplifica- ção de ácido nucléico ou um método de hibridização de ácido nucléico. Em um aspecto desta modalidade, a seqüência de nucleotídeos é ou está com- plementar à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59. Num outro aspecto desta modalidade, a amostra é selecionada do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, mai- sena e cereias fabricados no todo ou em parte que contenham produtos a base de milho.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba um extrato de uma amostra biológica derivada de uma planta de milho MIR162, tecido ou semente compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é ou está complementar a uma seqüência que é única ao MIR162. Em um aspecto desta modalidade, a seqüência é detectável no extrato usando uma amplifi- cação do ácido nucléico ou método de hibridização do ácido nucléico. Em outro aspecto desta modalidade, a seqüência é ou está complementar para SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59. Ainda em outro aspecto desta modalidade, a amostra é selecionada do grupo consistindo em farinha de milho, fubá, xarope do milho, óleo de milho, maisena, e cerei- as fabricados no todo ou em parte que contenham produtos a base de milho.

Outra modalidade da presente invenção engloba uma planta de milho, ou partes desta, e semente de uma planta de milho compreendendo o genótipo do evento transgênico MIR162, onde o genótipo compreende uma seqüência de nucleotídeos disposta nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou os complementos destas. Um exemplo de se- mente de milho compreende as moléculas de ácido nucléico da invenção que foram depositadas no dia 23 de janeiro de 2007 e atribuídas o número de acesso ATCC: PTA-8166. Em um aspecto desta modalidade, a planta de milho é das linhagens de milho reproduzidas CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, ΝΡ2222, ΝΡ2275, ΝΡ2276, ΝΡ2316, BCTT609, AF031, ΝΡΗ8431, 894, BUTT201, R327H, 2044ΒΤ, e 2070ΒΤ. Contudo um técnico com conheci- mentos na técnica reconhecerá que o genótipo MIR162 pode ser introduzido dentro de qualquer variedade de planta que possa ser reproduzida com mi- lho, incluindo espécies selvagens de milho, e desta forma, a lista de linha- gens reproduzidas desta modalidade não deve ser limitada.

Em outra modalidade, a presente invenção engloba uma planta de milho compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda seqüên- cia de DNA ligadas juntas para formar uma seqüência de nucleotídeos con- tíguos, onde a primeira seqüência de DNA está dentro de uma seqüência de junção e compreende pelo menos aproximadamente 11 nucleotídeos contí- guos selecionados do grupo consistindo em nucleotídeos 1079-1098 da SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9381-9400, e os complementos desta, onde a se- gunda seqüência de DNA está dentro da seqüência de DNA inserida heteró- loga disposta na SEQ ID NO: 49, e os complementos desta; e onde a primei- ra e segunda seqüência de DNA forem úteis como sondas ou iniciadores do nucleotídeo para detectar a presença das seqüências de ácido nucléico do evento de milho MIR162 numa amostra biológica. Num aspecto desta moda- lidade, os iniciadores do nucleotídeo são usados num método de amplifica- ção do DNA para amplificar uma seqüência de DNA alvo do DNA padrão extraído da planta de milho e a planta de milho é identificável de outras plan- tas de milho pela produção de uma amplicon correspondendo a uma se- qüência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47.

Plantas de milho da invenção podem ainda ser caracterizadas em que digerir simultaneamente o DNA genômico da planta com as endonu- cleases de restrição Kpnl, EcoRV ou Ncol resulta em aproximadamente uma banda de hibridização de 8 kb, de 13 kb ou 4.6 kb vip3Aa20 respectivamen- te, usando uma sonda vip3Aa20 sob condições de alta estringência. Exem- plificada neste documento está uma sonda vip3Aa20 compreendendo a se- quência de nucleotídeos disposta na SEQ ID NO: 13.

Plantas de milho da invenção podem ainda ser caracterizadas em que digerir o DNA genômico da planta com as endonucleases de restri- ção Acc65l ou BamHI resulta em uma única banda de hibridização pmi u- sando uma sonda pmi sob condições de alta estringência. Exemplificada neste documento está uma sonda pmi compreendendo a seqüência de nu- cleotídeos disposta na SEQ ID NO: 14.

Em uma modalidade, a presente invenção engloba uma planta de milho, onde o genótipo MIR162 confere a resistência ao inseto à planta de milho ou habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono, ou ambos, a resistência ao inseto e a habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono. Em um aspecto desta modalidade, o genótipo transgênico conferindo resistência ao inseto à planta de milho da invenção compreende um gene vip3Aa20 e o genótipo transgênico conferindo a habilidade para utilizar manose como uma fonte de carbono à planta de milho da invenção compreende um gene pmi.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta de milho resistente às pragas dos lepidóp- teros compreendendo: (a) sexualmente cruzando uma primeira planta de milho parente com uma segunda planta de milho parente, onde a primeira ou segunda planta de milho parente mencionadas compreendem o evento MIR162 DNA, desta forma produzindo uma pluralidade da primeira geração de plantas de progenitura; (b) selecionando uma primeira geração de planta da progenitura que é resistente a uma ou mais pragas dos lepidópteros; (c) purificando a primeira geração de planta da progenitura, desta forma produ- zindo uma pluralidade de plantas da progenitura de segunda geração; e (d) selecionado da segunda geração de plantas de progenitura, uma planta que seja resistente a uma ou mais pragas dos lepidópteros; onde as plantas da progenitura de segunda geração compreendem uma seqüência de nucleotí- deos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, e SEQ ID NO: 59.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de sementes de milho híbridas compreendendo: (a) plantando sementes de uma primeira linhagem de milho reproduzida compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, e SEQ ID NO: 59, e sementes de uma segunda linhagem reproduzida tendo um genótipo diferente; (b) cultivando plantas de milho resultantes da planta- ção mencionada até a hora da florescência; (c) castrando tais flores das plantas de uma das linhagens reproduzidas do milho; (d) cruzando sexual- mente as duas linhagens diferentes de reprodução entre si; e (e) colhendo a semente híbrida produzida deste. Num aspecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os parentes femininos. Em outro as- pecto desta modalidade, a primeira linhagem de milho reproduzida fornece os parentes masculinos. A presente invenção também engloba a semente híbrida produzida pelo método incorporado e as plantas híbridas cultivadas da semente.

Um técnico com conhecimentos na técnica reconhecerá que o genótipo transgênico do MIR162 pode ser introduzido pela reprodução den- tro de outras linhagens do milho compreendendo diferentes genótipos trans- gênicos. Por exemplo, um milho MIR162 reproduzido com milho pode ser cruzado com um milho reproduzido compreendendo o genótipo transgênico do evento Bt11 resistente ao lepidóptero (Patente dos EUA Nq 6.114.608 e 6.342.660, incorporada neste por referência). A semente e as plantas da progenitura resultantes possuem as características empilhadas de resistên- cia ao inseto e o espectro combinado de atividade do CryIAb e Vip3Aa20. Outra característica de empilhamento englobada pela presente invenção inclui a combinação da característica de resistência a insetos MIR162 e a característica de resistência a insetos MIR604 (Publicação do Pedido de Pa- tente dos EUA N2 2005/0216970, publicada em 29 de setembro de 2005, incorporadas neste por referência). As características empilhadas na semen- te resultante e progenitura conferem nas plantas um aumento do espectro de atividade; isto é, as plantas são ativas contra ambas as pragas de insetos lepidópteras e coleópteros.

Desta forma, a presente invenção engloba um método de prote- ger uma planta de milho transgênica dos danos causados pela alimentação de uma ou mais pragas de insetos onde o método compreende o empilha- mento na mesma planta de milho transgênica de uma característica resisten- te a insetos Vip3Aa20 com outra característica resistente a insetos que é diferente do Vip3Aa20, onde as características empilhadas protegem a plan- ta de milho contra danos causados pela alimentação de uma ou mais pragas de insetos para um grau superior do que seria esperado devido às caracte- rísticas de resistência a insetos por si só. Em um aspecto desta modalidade, a característica resistente a insetos Vip3Aa20 compreende um evento MIR162 que é empilhado com a característica resistente a insetos Cry3A055 compreendida no evento MIR604 na mesma planta de milho transgênica pelo cruzamento sexual do evento MIR162 com o evento MIR604 ou pela transformação das características juntamente dentro da mesma planta.

Exemplos de outros eventos transgênicos que podem ser cruza- dos com um MIR162 reproduzido incluem o evento GA21 tolerante a glifosa- to, o evento MON8O2 resistente a insetos lepidópteros/tolerante a glifosato, o evento DBT418 resistente a lepidópteros, o evento MS3 de esterilidade masculina, o evento B16 tolerante a fosfinotricina, o evento MON 80100 re- sistente a insetos lepidópteros, os eventos T14 e T25 tolerantes à fosfinotri- cina, o evento 176 resistente a insetos lepidópteros, e o evento MON863 resistente a coleópteros, todos estes são bem conhecidos na técnica. Será ainda reconhecido que outras combinações ou empilhamentos podem ser feitos com o genótipo transgênico da invenção e desta forma estes exemplos não devem ser vistos como limitadores.

Um técnico na técnica também reconhecerá que a semente do milho transgênica compreendendo o genótipo MIR162 pode ser tratada com vários tratamentos químicos da semente, incluindo inseticidas, para aumen- tar ou sinergizar a atividade inseticida da proteína Vip3Aa20.

A invenção descrita neste documento revela um sítio específico no cromossomo 5 no genoma do milho que é excelente para a introdução dos ácidos nucléicos heterólogos. Também é revelado um marcador molecu- lar 5' (opie2; nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106) e um marcador molecular 3' (gag; nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106) úteis na identificação.da localização de um local alvo no cromossomo 5. Desta forma, a invenção descrita fornece métodos para introduzir ácidos nucléicos heteró- Iogos de interesse dentro deste sítio alvo preestabelecido ou na vizinhança deste local alvo. A invenção descrita também engloba uma semente de mi- lho e/ou uma planta de milho compreendendo qualquer seqüência de nu- cleotídeos heteróloga inserida no local alvo revelado ou na vizinhança geral de tal local. Uma opção para executar tal integração alvo é substituir uma inserção diferente no lugar do cassete de expressão vip3Aa20 exemplificado neste documento. Com relação a isto, recombinação homóloga alvo, por e- xemplo sem limitações, pode ser usada de acordo com a invenção descrita. "Recombinação homóloga" refere-se a uma reação entre qualquer par de seqüência de nucleotídeos tendo sítios correspondentes contendo uma se- qüência de nucleotídeos similar (isto é, seqüências homólogas) através da qual as duas moléculas podem interagir (recombinar) para formar uma nova seqüência de DNA recombinante. Os sítios da seqüência de nucleotídeos similares são referidos neste como uma "seqüência de homologia". Geral- mente, a freqüência da recombinação homóloga aumenta conforme o com- primento da seqüência de homologia aumenta. Desta forma, enquanto a re- combinação homóloga pode ocorrer entre duas seqüências de nucleotídeos que são menos do que idênticas, a freqüência de recombinação (ou eficiên- cia) declina conforme a divergência entre as duas seqüências aumenta. A recombinação pode ser conquistada usando uma seqüência de homologia em cada uma das moléculas alvo e doadora, desta forma gerando um produ- to de recombinação "cruzamento único". Alternativamente, duas seqüências de homologia podem ser posicionadas em cada uma das seqüências de nu- cleotídeos doadores e alvo. A recombinação entre duas seqüências de ho- mologia no doador com duas seqüências de homologia no alvo gera um pro- duto de recombinação "cruzamento duplo". Se as seqüências de homologia na molécula do doador parear uma seqüência que deve ser manipulada (por exemplo, uma seqüência de interesse), a recombinação de cruzamento du- pio com a molécula alvo resultará num produto de recombinação onde a se- qüência de interesse substitui uma seqüência de DNA que estava original- mente entre as seqüências de homologia na molécula alvo. A troca da se- quência de DNA entre o alvo e o doador através de um evento de recombi- nação com cruzamento duplo é chamada de "substituição de seqüência." Este tipo de tecnologia é o assunto, por exemplo, da Publicação do Pedido de Patente dos EUA Ns 2006/0253918, incorporado neste por referência. Com o sítio alvo revelado agora sendo identificado e com as seqüências em volta do local alvo identificadas, o técnico com conhecimentos na técnica reconhecerá que outros métodos para a integração alvo dos ácidos nucléicos heterólogos podem ser usados. Tais métodos, por exemplo, sem limitações, são revela- dos na Publicação do Pedido de Patente dos EUA Nq 2007/0039074 e na Publicação do Pedido de Patente dos EUA Nq 2006/0130179.

Em uma modalidade, a presente invenção engloba um local alvo do cromossomo de milho localizado no cromossomo 5 entre um marcador molecular opie2 disposto como nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marcador molecular gag disposto como nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106, onde o sítio alvo compreende um ácido nucléico heterólo- go. Em outra modalidade, o sítio alvo do cromossomo de milho está locali- zado no cromossomo 5 entre os nucleotídeos 25,454 e 25,513 da SEQ ID NO: 106. Ainda em outra modalidade, o local alvo do cromossomo está pa- reado 5' pelos nucleotídeos 5,454 to 25,454 da SEQ ID NO: 106 e pareado 3' pelos nucleotídeos 25,513 a 45,513 da SEQ ID NO: 106.

Em uma modalidade, a presente invenção engloba um método de fazer uma planta de milho transgênico compreendendo a inserção de um ácido nucléico heterólogo numa posição no cromossomo 5 localizado entre um marcador molecular opie2 disposto como nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marcador molecular gag disposto como nucleotídeos 43,275-45,086 da SEQ ID NO: 106. Em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo é inserido no cromossomo 5 entre os nucleotídeos 25,454 e 25,513 da SEQ ID NO: 106. Ainda em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo é pareado 5' pelos nucleotídeos 5,454 a 25,454 da SEQ ID NO: 106 e pareados 3' pelos nucleotídeos 25,513 a 45,513 da SEQ ID NO: 106.

O genótipo transgênico da presente invenção pode ser introdu- zido em qualquer milho reproduzido ou híbrido usando técnicas de reprodu- ção reconhecidas na técnica. O objetivo da reprodução da planta é combinar numa variedade única ou híbrida várias características desejáveis. Para co- lheitas do campo, estas características podem incluir resistência a insetos e doenças, tolerância a herbicidas, tolerâncias a aquecimento e seca, reduzin- do o tempo para maturidade da colheita, maior produção, e melhor qualidade agronômica. Com a colheita mecânica de muitas culturas, a uniformidade das características da planta tal como germinação, o estabelecimento das culturas, taxa de crescimento, maturidade, e altura da planta e da parte su- perior, é importante.

Colheitas do campo são reproduzidas através de técnicas que levam vantagem do método de polinização da planta. Planta é auto-polini- zada se o pólen de uma flor for transferido para a mesma ou outra flor da mesma planta. Planta tem polinização cruzada se o pólen vier de uma flor de planta diferente.

Plantas que foram autopolinizadas e selecionadas por tipo por muitas gerações tornam-se homozigotas em quase todos genes de Ioci e produzem uma população uniforme de progenitura de cruzamento verdadei- ra. Um cruzamento entre duas linhagens homozigotas diferentes produz uma população uniforme de plantas híbridas que podem ser heterozigotas para muitos genes de loci. Um cruzamento de duas plantas cada uma heterozigo- ta num número de gene de Ioci produzirá uma população de plantas híbridas que diferem geneticamente e não serão uniformes.

Milho (Zea mays L.), pode ser reproduzido por ambas as técni- cas de autopolinização e polinização cruzada. Milho possui flores femininas e masculinas separadas na mesma planta, localizadas no pendão e na espi- ga, respectivamente. A polinização natural ocorre no milho quando o vento sopra o pólen da franja para o cabelo do milho que sai do topo das espigas.

Um método confiável de controle da fertilidade masculina nas plantas oferece a oportunidade para a reprodução melhorada da planta. Isto é especialmente verdadeiro para o desenvolvimento dos híbridos do milho, que dependem de algum tipo de sistema de esterilidade masculina. Existem diversas opções para o controle da fertilidade masculina disponíveis para os reprodutores, tais como: castração manual ou mecânica (ou despendoamen- to), esterilidade masculina citoplasmática, esterilidade masculina genética, gametócitos e similares.

A semente do milho híbrido é produzida tipicamente por um sis- tema de esterilidade masculina incorporando o despendoamento manual ou mecânico. Tiras alternadas de duas linhagens de milho são plantadas no campo, e as franjas produzindo pólen são removidas de uma das linhagens (feminina). Contanto que haja isolação suficiente das fontes do pólen de mi- lho estrangeiras, as espigas das linhagens despendoadas serão fertilizadas somente da outra linhagem (masculino), e a semente resultante é desta for- ma híbrida e formará plantas híbridas.

O processo de despendoamento geralmente laboroso, e ocasio- nalmente não confiável, pode ser evitado pelo uso de um dos muitos méto- dos de conferir esterilidade masculina genética conhecido na técnica, cada um com seus próprios benefícios e desvantagens. Estes métodos usam uma variedade de aproximações tais como depositar dentro da planta um gene codificando uma substância citotóxica associada com um promotor específi- co de tecido masculino ou um sistema antissentido no qual um gene crítico para fertilidade é identificado e um antissentido para aquele gene é inserido na planta (ver: Fabinjanski, e outros EPO 89/3010153.8, publicação número 329,308 e pedido PCT PCT/CA90/00037 publicado como WO 90/08828).

O uso das linhagens estéreis masculinas é assim um fator na produção dos híbridos de milho. Técnicas de reprodução de plantas conhe- cidas na técnica e usadas num programa de reprodução de planta de milho incluem, mas não estão limitadas a, seleção recorrente, retrocruzamento, reprodução pedigree, seleção melhorada do polimorfismo do comprimento de restrição, transformação e seleção melhorada do marcador genético. O desenvolvimento dos híbridos de milho num programa de reprodução de planta de milho exige, geralmente, o desenvolvimento das linhagens de re- produção homozigotas, o cruzamento destas linhagens, e a avaliação dos cruzamentos. Métodos de reprodução por seleção recorrente e reprodução pedigree são usados para desenvolver linhagens de reprodução das popula- ções para reprodução. Programas de reprodução de planta de milho combi- nam os antecedentes genéticos de duas ou mais linhagens de reprodução ou várias outras fontes de germoplasma dentro de pools de reprodução a partir dos quais novas linhagens de reprodução são desenvolvidas e é feita a seleção dos fenótipos desejados. As novas linhagens são cruzadas com ou- tras linhagens reproduzidas e os híbridos destes cruzamentos são avaliados para determinar quais destes têm potencial comercial. Reprodução de plan- tas e o desenvolvimento de híbridos, conforme praticado num programa de reprodução de planta de milho, são processos caros e consomem tempo. Reprodução pedigree inicia com o cruzamento de dois genóti- pos, cada qual pode ter uma ou mais características desejáveis que está faltando no outro ou que complementa o outro. Se os dois parentes originais não proverem todas as características desejáveis, outras fontes podem ser incluídas na população de reprodução. No método pedigree, plantas superio- res são autofecundadas e selecionadas nas gerações sucessivas. Nas gera- ções sucessivas a condição heterozigótica dá lugar às linhagens homogê- neas como um resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente no mé- todo pedigree de reprodução de cinco ou mais gerações de autofecundação e seleção é praticada: Fi F2; F2 F3; F3 ->F4; F4 ->F.5; etc.

Reprodução de seleção recorrente, retrocruzamento, por exem- plo, pode ser usado para melhorar uma linhagem de reprodução e um híbri- do que é feito usando aquelas linhagens. Retrocruzamento pode ser usado para transferir uma característica específica desejável de uma linhagem ou fonte para uma linhagem em que falta aquela característica. Isto pode ser conquistado, por exemplo, pelo primeiro cruzamento de uma linhagem supe- rior (parente recorrente) com uma linhagem doadora (parente não- recorrente), que carrega o(s) gene(s) apropriado(s) em questão. A progenitu- ra deste cruzamento é então acasalada novamente ao parente recorrente superior seguido pela seleção na progenitura resultante para a característica desejada para ser transferida do parente não- recorrente. Depois de cinco ou mais gerações de retrocruzamento com seleção para a característica dese- jada, a progenitura será homozigota para Ioci controlando a característica sendo transferida, mas será como o parente superior para essencialmente todos os outros genes. A última geração retrocruzada é então autofecunda- da para dar reprodução de progenitura pura para o(s) gene(s) sendo transfe- rida. Um híbrido desenvolvido das linhagens contendo o(s) gene(s) transferi- do(s) é essencialmente o mesmo como um híbrido desenvolvido das mes- mas linhagens sem o(s) gene(s) transferidos.

Linhagens de reprodução de elite, que é, puras, linhagens de reprodução homozigota, também podem ser usadas como materiais de início para reprodução ou populações fonte a partir das quais podem desenvolver outras linhagens de reprodução. Estas linhagens de reprodução derivadas das linhagens de reprodução da elite podem ser desenvolvidas usando os métodos de reprodução de seleção recorrente e reprodução pedigree men- cionados anteriormente. Como um exemplo, quando a reprodução de retro- cruzamento é usada para criar estas linhagens derivadas num programa de reprodução de planta de milho, a reprodução de elite pode ser usada como uma linhagem progenitora ou material de início ou população fonte e pode servir como parente recorrente ou doador.

Um híbrido do milho simples resulta do cruzamento de duas li- nhagens de reprodução, cada uma das quais possui um genótipo que com- plementa o genótipo da outra. A progenitura híbrida da primeira geração é designada Fi. No desenvolvimento dos híbridos comerciais num programa de reprodução de planta de milho, somente as plantas do híbrido Fi são pro- curadas. Híbridos Fi preferidos são mais vigorosos que seus parentes repro- duzidos. Este vigor híbrido, ou heterose, pode ser manifestado em muitas características poligênicas, incluindo aumento do crescimento vegetativo e da produção.

O desenvolvimento de um híbrido de milho num programa de reprodução de planta de milho envolve três etapas: (1) a seleção das plantas dos vários pools de germoplasma para cruzamentos para reprodução inicial; (2) a autofecundação das plantas selecionadas dos cruzamentos para re- produção para diversas gerações para produzir uma série de linhagens de reprodução, que embora diferentes uma da outra, reproduzem verdadeira- mente e são altamente uniformes; e (3) cruzamento das linhagens de repro- dução selecionadas com linhagens reproduzidas diferentes para produzir a progenitura híbrida (F1). Durante o processo de reprodução no milho, o vigor das linhagens diminui. O vigor é restaurado quando duas linhagens diferen- tes de reprodução são cruzadas para produzir a progenitura híbrida (Fi). Uma importante conseqüência da homozigosidade e homogeneidade das linhagens de reprodução é que o híbrido entre um par definido de reprodu- ções sempre será o mesmo. Uma vez que as reproduções que dão um hí- brido superior tenham sido identificadas, a semente do híbrido pode ser re- produzida indefinitamente enquanto a homogeneidade dos parentes repro- duzidos seja mantida.

Um híbrido simples é produzido quando duas linhagens de re- produção são cruzadas para produzir a progenitura F1. Um híbrido duplo é produzido de quatro linhagens reproduzidas cruzadas em pares (A X B e C X D) e então os dois híbridos F-i são cruzados novamente (A X Β) X (C X D). Um híbrido triplo é produzido de três linhagens reproduzidas onde duas li- nhagens reproduzidas são cruzadas (A X B) e então o híbrido Fi resultante é cruzado com o terceiro reproduzido (A X Β) X C. Muito do vigor híbrido exibi- do pelos híbridos F1 é perdido na próxima geração (F2). Consequentemente, a semente dos híbridos não é usada para estoque de plantas.

A produção de semente híbrida requer a eliminação ou inativa- ção do pólen produzido pelo parente feminino. A remoção incompleta ou ina- tivação do pólen fornece o potencial para autopolinização. Esta semente au- topolinizada inadvertidamente pode ser colhida acidentalmente e embalada com a semente híbrida.

Uma vez que as sementes são plantadas, é possível identificar e selecionar aquelas "autopolinizadas". Essas plantas "autopolinizadas" serão geneticamente equivalentes à linhagem de fêmeas congênitas utilizadas pa- ra produzir o híbrido.

Tipicamente essas plantas "autopolinizadas" podem ser identifi-

cadas e selecionadas de acordo com seu declínio no vigor. Fêmeas puras são identificadas pela sua aparência menos vigorosa para características vegetativas e/ou reprodutivas, incluindo plantas de baixa estatura, pequeno tamanho de espiga, formatos da espiga e do grão, cor do sabugo ou outras características.

A identificação dessas linhagens "autopolinizadas" também pode ser efetuada através de análises com marcadores moleculares. Ver, "The Identification of Femaie Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electro- phoresis and Morphoiogy", Smith, J. S. C. and Wych, R. D., Seed Science and Technology 14, pp. 1-8 (1995), cujas divulgações estão expressamente incorporadas neste por referência. Através dessas tecnologias, a homozigo- sidade da linhagem de "auto-polinizadas" pode ser verificada analisando a composição alélica em vários Ioci ao longo do genoma. Estes métodos per- mitem a rápida identificação da invenção descrita por referência. Ver tam- bém, "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Apli- cata Vol. 20 (1) pp. 29-42.

Como é prontamente aparente para alguém conhecedor da ci- ência, os antecedentes são apenas alguma das várias maneiras inerentes pelas quais a presente invenção pode ser concebida por aqueles interessa- dos no desenvolvimento de genótipos transgênicos da invenção dentro de outras linhagens de milho. Outras maneiras estão disponíveis, e os exem- plos acima são meramente ilustrativos.

Os exemplos subsequentes têm unicamente o propósito de ilus- trar uma ou mais incorporações preferenciais da invenção e não são para serem construídos como limitador do escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Transformação e Seleção do Evento MIR162

O evento MIR604 foi produzido por uma transformação mediada pelo Agrobacterium de uma linhagem de milho (Zea mays) patenteada. Em- briões imaturos foram transformados essencialmente como descrito por Ne- grotto et al. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000), referência incorporada por referência, usando um fragmento de DNA do plasmídeo pNOV1300 (SEQ ID NO: 3). pNQV1300 contém uma seqüência de nucleotídeos incluin- do cassetes de expressão arranjados. O primeiro cassete de expressão in- clui uma região promotora ZmUbiInt de um gene poliumbiquitina de Zea mays o qual contém o primeiro íntron (GenBank® Número de Acesso S94464) Έ operavelmente ligado a uma seqüência codificadora posterior vip3Aa19 E operavelmente ligada ao íntron PEPC #9 do gene fosfoenolpiru- vato carboxilase (GenBank® Número de acesso X15239) de Zea mays (Mat- suoka and Minami, 1989. European J. Of Biochem. 181:593-598) e um finali- zador de seqüência 35S do RNA 35S do mosaico de vírus genoma da cou- ve-flor (Similar ao GenBank® Número de Acesso AF140604). Sua função é promover a seqüência de poliadenilação (Franck et ai, 1980. Cell 21:285- 294). O gene vip3Aa19 em pNOV1300 inclui uma seqüência codificadora sintética/otimizada por milho, vip3Aa (Estruch, etal., 1999.) a qual foi sinteti- zada para acomodar o códon preferencial, habitual para o milho (Murray et ai, 1989). A seqüência codificadora sintética vip3Aa19 usada em transfor- mações de plantas, codifica uma seqüência de aminoácidos idêntica à se- qüência codificadora do vip3Aa1 nativo, encontrado nas bactérias do solo Bacillus thuringiensis cepa AB88 (patente US 5,877,012), com exceção de um único aminoácido diferente na posição 284; a seqüência codificadora do vip3Aa1 nativo codifica a lisina, enquanto que a seqüência codificadora do vip3Aa19 sintético codifica a glutamina nesta posição. A seqüência codifica- dora vip3Aa 19 codifica uma proteína de controle de insetos, a Vip3Aa19 que promove resistência aos insetos lepidópteros. O segundo cassete de ex- pressão é compreendido pelo promotor ZmUbiInt operavelmente ligado a uma seqüência codificadora pmi (também conhecido como E.coli manA), codificando a fosfomanose isomerase (GenBank® Número de Acesso M15380), a qual catalisa a isomerização da manose-6-fosfato para frutose-6- fosfato (Negrotto etal., 2000). A seqüência codificadora pmié posteriormen- te ligada a uma terminação da transcrição final da nopalina sintase 3' e à seqüência de poliadenilação.

Embriões imaturos foram extirpados entre 8-12 dias de idade e enxaguados em meio de cultura recém preparado para a transformação. Os embriões foram agitados com a suspensão de células de Agrobacterium a- brigando o vetor de transformação pNOV1300, agitando em vortex durante 30 segundos, seguido por mais 5 minutos de incubação. A solução em ex- cesso contendo Agrobacterium foi aspirada e os embriões foram movidos para placas contendo um meio de cultura não seletivo. Embriões foram co- cultivados com o Agrobacterium remanescente a 22 □ C por 2-3 dias ao abri- go da luz. Embriões foram transferidos para um meio de cultura suplementa- do com ticarcilina (100 mg/ml) e nitrato de prata (1,6 mg/l) sendo incubados ao abrigo da luz por 10 dias. Embriões produzindo o calo embriogênico fo- ram transferidos para o meio de cultura celular contendo manose. As plântulas regeneradas foram testadas pela análise TAQMAN® PCR (ver Exemplo 2) para a presença de ambos os genes pmi e vip3Aa19, tão bem como pela ausência do gene de resistência ao antibiótico especti- nomicina {spec). Foi descoberto posteriormente (ver abaixo Exemplo 4) que durante o processo de transformação duas mutações foram introduzidas dentro da seqüência codificadora vip3Aa19, uma das quais resultou em uma mudança no aminoácido da proteína Vip3Aa19. Consequentemente essa nova seqüência codificadora vip3Aa o qual é única para o evento MIR162, foi designada vip3Aa20. A seqüência codificadora vip3Aa20 codifica a iso- Ieucina na posição 129 no local de um resíduo de metionina codificado pelo gene vip3Aa19.

Plantas positivas para ambos transgenes, e negativas para o gene spec, foram transferidas para uma estufa para propagação posterior. Os eventos positivos foram identificados e triados usando bioensaios com insetos contra a lagarta de cereais. Os eventos inseticidas foram caracteri- zados como número de transcrição pela análise TAQMAN. MIR162 foi esco- lhido para análise posterior por ter uma seqüência única de transcrição dos transgenes, boa expressão da proteína identificada por ELISA, e boa ativi- dade inseticida contra a lagarta de cereais.

O pedigree da produção do evento MIR162 foi como segue: T0 MIR162 planta (χ NPH8431)-» -» NPH8431 (MIR162) Fi (χ NP2161) NP2161(MIR162) F1 (χ NP2161) -> NP2161 (MIR162) BC1 Fi (x B9620)^Fi (χ B9620) BCIF1 (χ B9620) BC2F! (x B9620)JBC3Fi (x B9620) BC4Fi (χ B9620). O material vegetal da geração BC4 foi usado para a análi- se Southern, determinação da transcrição e seqüência do DNA inserido. Controles negativos para os experimentos consistem de 10 plantas segrega- das da geração BC4.

Exemplo 2. Detecção de MIR162 por TAQMAN PCR

A análise TAQMAN foi essencialmente conduzida como descrita em Ingham et aí. (Biotechniques, 31:132-140, 2001), referência incorporada por referência. DNA genômico foi isolado de folhas de plantas de milho poços. Para o controle do gene endógeno do milho, "iniciadores" e as son- das foram projetados especificamente para a seqüência codificadora de ál- cool/desidrogenase (adhl) de Zea mays (Genbank N0 de Acesso AF044295). Será reconhecido por uma pessoa habilidosa que outros genes do milho po- dem ser usados como controles endógenos. Reações foram multiplicadas 20 para amplificação simultânea de vip3Aa e adhl ou pmi e adhl. Para cada amostra, uma mistura principal foi gerada pela combinação de 20 μΙ_ do ex- trato de DNA genômico com 35 μΙ_ 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suplementado com "iniciadores" para uma concentra- ção final de 900 nM cada, sondas para uma concentração final de 100 nM cada, e água para completar um volume final de 70μΙ_. Esta mistura foi dis- tribuída dentro de três replicatas de 20 μΐ_ cada uma em placas de amplifica- ção de 96-poços seladas com filme termosselante e transparente (Marsh Bio Products). PCR foi executado em um instrumento ABI Prism 7700 usando os seguintes parâmetros de amplificação: 2 min a 50°C e 10 min a 95°C, segui- dos de 35 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 60°C.

Resultados da análise TAQMAN demonstraram que o evento MIR162 possuía uma cópia do gene vip3Aa20 e uma cópia do gene pmi. Os iniciadores e as sondas que foram utilizados nas reações TAQMAN PCR, são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. "Iniciadores" usados no ensaio TAQMAN.

<table>table see original document page 44</column></row><table> Exemplo 3. Detecção de MIR162 por blot Southern

O DNA genômico utilizado para a análise Southern foi separado do tecido de folha empoçado de 10 plantas representando a geração BC4 de MIR162 usando essencialmente o método de Thomas et al. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993), referência incorporada por referência. Todas as plantas usadas para isolamento do DNA foram individualmente analisadas usando TAQMAN PCR (como descrito no Exemplo 2) para confirmar a pre- sença de uma única cópia do gene vip3Aa20 e do gene pmi. Para os contro- les negativos segregados, o DNA foi separado do tecido de folha empoçado dos segregados negativos da geração BC4. Essas plantas negativas segre- gadas foram individualmente analisadas usando TAQMAN PCR para confir- mar a ausência dos genes vip3Aa20 e pmi, mas foram, como esperado, po- sitivas para o gene de milho endógeno adhl.

A análise Southern foi conduzida usando técnicas convencionais de biologia molecular (Ver Chomczynski, P. 1992. Analytical Biochemistry 201:34-139). O DNA genômico (7.5 pg) foi digerido com enzimas restritoras que digerem dentro do suplemento do evento MIR162, mas não dentro da seqüência codificadora que corresponde a uma sonda específica usada no experimento. Esse avanço permitiu a determinação de um número de cópias de cada gene, correspondendo a uma sonda específica usada para cada análise Southern, o qual foi incorporado dentro do evento MIR162.

Outras séries de digestões restritoras foram conduzidas nas quais o suplemento foi digerido com enzimas de restrição que poderiam libe- rar um fragmento de um tamanho conhecido do suplemento. Esse avanço fornece evidência adicional para a presença de uma única cópia de cada seqüência codificadora presente no MIR162 e permitiu uma detecção de có- pias parciais do suplemento, que podem estar intimamente ligadas ao su- plemento MIR162. Dando seqüência a uma eletroforese em gel de agarose e uma transferência alcalina para uma Zeta-Sonda® de membrana GT (Bio- Rad, Cat. N2 162-0195), as hibridizações foram conduzidas usando as son- das PCR de elementos geradas em comprimento total. As sondas foram marcadas com 32P via impregnação aleatória usando o sistema MegaPrime® (Amersham Biosciences, Cat. N- RPN1607). A hibridização foi conduzida a 65°C, seguida de enxágues múltiplos em 2X SSC,0,1% SDS e depois 0,1 X SSC e 0.1% SDS. As membranas foram submetidas à auto-radiografia. Inclusas em cada análise Southern estão três amostras controle:

(1) DNA de um segregado negativo (não-transformado) usado para identifi- car quaisquer seqüências endógenas Zea mays que possam hibridizar- cruzado com a sonda específica-elemento; (2) DNA de um segregado nega- tivo interno o qual é introduzido em uma quantidade de pNOV1300 digerido que é equivalente a um número de cópias no tamanho do plasmídeo intro- duzido, para demonstrar a sensibilidade do experimento em detectar uma única cópia contendo o genoma de Zea mays e (3) Plasmídeo pNOV130O digerido análogo a um número de cópia baseado no tamanho do plasmídeo, para agir como controle positivo para hibridização tão bem como para de- monstrar a sensibilidade do experimento.

Os resultados da análise Southern demonstraram que o suple- mento MIR162 contém uma única cópia dos genes vip3Aa20 e pmi e não contém as seqüências determinadoras de pNOV1300. Uma sonda vip3Aa19 (SEQ ID NO: 13) foi utilizada para a análise Southern de vip3Aa20. As se- qüências dos nucleotídeos vip3Aa19 e vip3Aa20 diferem por dois nucleotí- deos e são 99,9 % idênticas. Por esta razão a sonda vip3Aa19 hibridizada para a seqüência presente em MIR162 sob condições precisas. Usando a sonda vip3Aa19, uma digestão de Kpn\ e EcoRV resultou em bandas sim- ples de hibridização com aproximadamente 8 kb e 13 kb de tamanho, res- pectivamente. Além do mais, uma dupla digestão Nco\ resultou em uma úni- ca banda de hibridização coerente com o tamanho esperado de 4.6 kb. U- sando uma sonda pmi (SEQ ID NO: 14), uma digestão Acc65\ e uma SamHI resultaram em únicas bandas de hibridizações com tamanho aproximado de 4 kb e 6 kb, respectivamente. Além disso, uma dupla digestão Xma\ + HindlW resultou em uma única banda de hibridização coerente com o tamanho es- perado de 8.1 kb. A banda 8.1 kb Xma\ + HZndllI pNOV1300 (controle positi- vo) também hibridizou com as sondas vip3Aa19e pmi conforme o esperado. Alguma hibridização cruzada no caminho do "plasmídeo-único" com a esca- da de sonda do DNA foi detectada. Tipicamente escadas de DNA disponí- veis comercialmente, podem conter algumas seqüências de vetor que po- dem cruzar hibridizadamente com as seqüências do plasmídeo controle con- forme observado nesses experimentos, porém não impactam as descobertas deste estudo. Finalmente, a sonda determinante não hibridizou demonstran- do a ausência de qualquer incorporação de seqüências do vetor pNOV1300 dentro do MIR162 durante os processos de transformação.

Exemplo 4. Seguenciamento do suplemento do DNA Heteróloqo

A seqüência de nucleotídeos do vip3Aa e pmi das seqüências codificadoras na molécula de DNA heteróloga inserida em MIR162 foi de- terminada por demonstrar integridade total do suplemento, contiguidade dos elementos funcionais e por detectar quaisquer mudanças individuais no par de bases. As seqüências codificadoras foram amplificadas do DNA derivado da geração BC4. A amplificação PCR foi conduzida usando um dos sistemas Expand High Fidelity PCR (Roche, Cat. N2 1732650) ou PhAJItra® Hotstart High-Fidelity DNA polimerase (Stratagene, Cat. N2 600390). Cada um dos produtos da PCR foi clonado individualmente dentro seja pelo vetor pCR®- XL-TOPO (Invitrogen, Cat. N2 K4700-20), ou pelo vetor pCR®-Bluntll-TOPO (Invitrogen, Cat. N2 K2800-20) e, três clones separados para cada produto da PCR foram identificados e sequenciados. Sequenciamento foi conduzido usando um analisador ABI3730XL baseado em ABI BigDye® 1.1 ou química Big Dye 3.1 dGTP (para padrões enriquecidos para CG). A análise seqüen- cial foi feita usando o Phred1 Phrap, e pacote Consed da Universidade de Washington e conduzida em uma taxa de erro inferior a 1 em 10.000 bases (Ewing & Green, 1998. Genome Research 8:186-194). O consenso final da seqüência de cada gene foi determinado pela combinação dos dados se- qüenciais de cada um dos três clones individuais para gerar um consenso para seqüência de cada gene. O alinhamento seqüencial foi conduzido u- sando o programa CIustaIW utilizando os seguintes parâmetros: scoring ma- trix blosum55, gap opening penalty 15, gap extension penalty 6.66 (Thomp- son etal, 1994. Nucleic Acids Research 22:4673-4680).

PCR usando os "iniciadores" MOV3Aa-01-5': 5'ATGAACAAGAACAACACCAA3' (SEQ ID NO: 15) e MOV3Aa-01-3': 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3' (SEQ ID NO: 16) e enzima PfuUItra Hotstart gerando um produto 2370bp. O "amplicon" PCR foi sequenciado usando os "iniciadores" mostrados na Ta- bela 2.

A seqüência codificadora completa do vip3Aa20 foi amplificada por

Tabela 2.

<table>table see original document page 47</column></row><table> <table>table see original document page 48</column></row><table>

Duas outras reações PCR se sobrepuseram à seqüência codificadora completa do vip3Aa20. O final 5' de vip3Aa20io\ coberto com uma amplificação PCR usando os "iniciadores" 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO: 36) e VIP_R4 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEQ ID NO: 37) e enzima "Expansora de Alta Fidelidade". A segunda reação cobriu o final 3' de vi'p3Aa20, o produto foi amplificado com os "iniciadores" VIP-F3: 5'GGTGCTGTTCGAGAAGAGGT3' (SEQ ID NO: 42) e PMI_REV1: 5'CGATTTATCACTCTCAATCACAT3' (SEQ ID NO: 43) e enzima "Expanso- ra de Alta Fidelidade". Os "amplicons" gerados por estas reações compreen- dem uma seqüência de nucleotídeos 2946 bp (SEQ ID NO: 38) e uma se- qüência de nucleotídeos 2577 bp (SEQ ID NO: 44), respectivamente.

O consenso dos dados seqüenciais revelaram duas mudanças nos nucleotídeos na seqüência codificadora de vip3Aa em MIR162 (desig- nada vip3Aa20) comparada à seqüência codificadora do vip3Aa em pNOV1300 (designada vip3Aa19), a qual foi usada para transformar MIR162. A primeira mudança de nucleotídeos, uma mutação de G para T, ocorreu na posição 387 da seqüência codificadora do vip3Aa19 (SEQ ID NO: 3). Essa mutação resultou na metionina na posição 129 de Vip3Aa19 sendo trocada por uma isoleucina em Vip3Aa20 (M129I). A segunda mudança de nucleotí- deos ocorreu na posição 1683 da seqüência codificadora ocasionando uma mutação de G para C, porém não resultou em uma mudança de aminoáci- dos. Consequentemente, a seqüência codificadora de vip3Aa20 e da proteí- na Vip3Aa20 são únicas para o evento MIR162 e podem ser usadas para identificar qualquer planta compreendendo o genótipo transgênico MIR162. A seqüência codificadora pmi, MIR162 foi idêntica àquela na transformação do plasmídeo pNOV13(X). Um alinhamento das proteínas inseticidas Vip3Aa20 e Vip3Aa19 é mostrado na Tabela 3.

Tabela 3. Comparação das seqüências de aminoácidos de Vip3Aa20 e Vip3Aa19.

<table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table> A caixa sombreada indica a mudança no aminoácido. Exemplo 5. Análise da Seqüência de Pareamento do DNA

Um número de métodos é conhecido por aqueles com habilidade na técnica de amplificar seqüências de DNA desconhecido adjacentes a uma região nuclear de seqüência conhecida. Esses métodos incluem, mas não são limitados por PCR inverso (iPCR) [Ochman et. al., Genetics 120:621-623 (1988); Triglia et. al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)], PCR "cabo de ca- çarola" [Jones e Winistorfer, Nucleic Acids Res. 20:595-600 (1992); Jones e Winistorfer, Biotechniques 23:132-138 (1997)], PCR ligação-ancorada casse- te [Mueller e Wold, Science 246:780-786 (1989)], PCR-vetorette [Riley et. al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990)], novo-Alu-PCR [Puskas et. al., Nu- cleic Acids Res. 22:3251-3252 (1994)] e PCR Interlaceamento Termo- Assimétrico (TAIL-PCR) [Liu e Whittier, Genomics 25:673-681 (1995)].

Um método utilizado pra amplificar o genoma do DNA do milho, seqüência de pareamento do DNA heterólogo dentro do evento MIR162, foi PCR vetorette essencialmente como descrito por Riley et al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990), referência incorporada por referência.

A seqüência de pareamento 5' e a seqüência de junção foram confirmadas usando procedimentos PCR padrão. Os pares do "iniciador" sequentes, ou complementos dele, foram usados para confirmar a seqüên- cia: 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO: 36)/ VIP_R4: 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEQ ID NO: 37) e CJB179: 5'ATGCAAATAGGCTGGGAATAGTC3' (SEQ ID NO: 39)/ CJB134 .5'GTACCAGCTTGCTGAGTGGCT3' (SEQ ID NO: 40). O "amplicon" resul- tante teve a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 41 e compreende a se- qüência de junção 5' do SEQ ID NO: 45. Será reconhecido que outras se- quências de "iniciador" podem seu utilizadas para confirmar as seqüências de pareamento e de junção. Usando este método, o suplemento MIR162 foi encontrado como sendo pareado a 5' pelos nucleotídeos 1040-1088 da se- qüência genômica do milho mostrada em SEQ ID NO: 46.

Uma região mais ampla da seqüência de pareamento 5' do e- vento MIR162 foi gerada usando o kit Seegene DNA Walking SpeedUp® Premix seguindo as instruções do fabricante.

Uma primeira reação PCR foi conduzida independentemente em quarto tubos individuais usando "iniciador" FE1002:

.5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (SEQ ID NO: 50) com uma dos "inici- adores" DW-ACP 1, 2, 3, ou 4 fornecidos pelo fabricante. Os seguintes rea- gentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 100 pg DNA genômico MIR162, 4 μΙ 2,5 μΜ DW-ACP (um de cada com o DW-ACP 1, 2, 3, ou 4), 4 μΙ 2,5 μΜ FE1002, 19 μΙ água destilada, e 25 μΙ 2X SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos foram submetidos à preaquecimento num ciclador térmico (94°C). PCR foi completado usando o seguinte protocolo: um ciclo a .94°C por cinco minutos, 42°C por um minuto e, 72°C por dois minutos, 30 ciclos de 94°C por 40 segundos, 55°C por 40 segundos, e 72°C por 90 se- gundos, e um ciclo a 72°C por sete minutos. Os produtos do PCR foram puri- ficados usando exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão.

Uma segunda reação PCR foi conduzida em quatro tubos indivi- duais usando "iniciador" FE1003: 5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (SEQ ID NO: 51) com o "iniciador" DW-ACPN fornecido pelo fabricante do kit. Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 3 μΙ do produto PCR purificado, 1 μΙ 10 μΜ DW-ACPN, 1 μΙ 10 μΜ FE1003, 5 μΙ água destilada, e 10 μΙ 2X SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos fo- ram submetidos à pré-aquecimento (94°C) em ciclador térmico. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: um ciclo a 94°C por cinco minu- tos, 35 ciclos a 94°C por 40 segundos, 60°C por 40 segundos, e 72°C por 90 segundos, e um ciclo a 72°C por sete minutos.

Uma terceira reação PCR foi conduzida independentemente em quatro tubos individuais usando o "iniciador" FE1004:5'GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT3' (SEQ ID NO: 52) com o "iniciador Universal" fornecido pelo fabricante. Os seguintes reagentes foram mistura- dos em tubo PCR em gelo: 2 μΙ de produto PCR purificado, 1 μΙ 10 μΜ "inici- ador Universal", 1 μΙ 10 μΜ FE1004, 6 μΙ água destilada, e 10 μΙ 2X See- AmpTM ACPTM Master Mix II. Os tubos foram submetidos à pré- aquecimento (94°C) em ciclador térmico. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: um ciclo a 94°C por cinco minutos, 35 ciclos a 94°C por .40 segundos, 60°C por 40 segundos, e 72°C por 90 segundos, e um ciclo a .72°C por sete minutos.

Dez μΙ dos produtos do PCR foram corridos em gel de agarose contendo 1% brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qiagen Qiaquick Gel de a- cordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi clonado em um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fa- bricante. Este clone foi transformado dentro de E. coli, e o DNA do plasmí- deo foi extraído das células após uma noite crescendo com um kit Qiagen Miniprep de acordo com as instruções do fabricante. Este plasmídeo foi utili- zado para eluir o sequenciamento.

Um novo "iniciador" foi projetado contendo uma nova seqüência previamente conhecida, para ser usada com um "iniciador" no suplemento do DNA heterólogo para amplificar a completa seqüência de pareamento 1 kb fora da seqüência de pareamento do "iniciador" do DNA genômico. A se- qüência de pareamento do "iniciador" 162DWConf3: .5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCTGTC3' (SEQ ID NO: 53) e suplemento do DNA "iniciador" FE0900: 5'GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (SEQ ID NO: 54) foram usados para amplificar a molécula de ácido nucléico contendo a seqüência de pareamento 5' para confirmação. A seqüência do "amplicon" resultante é publicada em SEQ ID NO: 55. Este "amplicon" 5' compreende a seqüência de junção 5' publicada em SEQ ID NO: 45. Dez μΙ do produto PCR ("amplicon") foram corridos em gel de agarose contendo 1% de brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qiagen Qiaquick Gel de acordo com as informações do fabricante. O DNA extraído foi clonado dentro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Este clone foi transformado dentro de uma E. coli. O DNA do plasmídeo foi extraído das células após crescimento noturno em meio de cultura com um kit Qiagen Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Três plasmídeos foram comple- tamente sequenciados usando os "iniciadores" mostrados na Tabela 4. As seqüências dos plasmídeos foram alinhadas para gerar a confirmação com- pleta da seqüência de pareamento 5'. Usando este método aproximadamen- te, 1 kb da seqüência de pareamento 5' (SEQ ID NO: 46) foi determinada.

Tabela 4. Seqüências do "Iniciador".

<table>table see original document page 53</column></row><table> A seqüência de pareamento 3' do evento MIR162 foi gerada u- sando um "kit Universal" Clonetech GenomeWalker™ (Clonetech Laboratori- es, Inc.) seguindo as instruções do fabricante.

Primeiro, poços de adaptador-ligado aos fragmentos de DNA genômico não clonado, conhecidos como "bibliotecas" GenomeWalker foram construídas. Cada biblioteca foi construída pela digestão do DNA genômico MIR162 com uma enzima restritora (Dra\, EcoRV1 PviAl, Stu\, and Xmn\) como se segue: por exemplo, 25 μΙ de DNA genômico MIR162 (0.1 Mg/μΙ), 8 μ da enzima restritora (10 unids/μΙ), 10 μΙ do tampão para enzima restritora (10X), e 57 μΙ H2O destilada foram misturados em um tubo e incubados a 37°C por uma noite.

DNA foi então purificado realizando várias series de extração de fenol/ clorofórmio. Finalmente, o DNA foi precipitado e lavado com etanol, seco e dissolvido em 20 μΙ de tampão TE.

Para ligar o adaptador GenomeWalker no final do DNA genômi- co do MIR162, 4μΙ do DNA genômico purificado e digerido, foi misturado com 1,9 μΙ do adaptador GenomeWalker (25 μΜ), 1,6 μΙ 10X Tampão de Li- gação, e 0,5 μΙ T4 DNA Ligase (6 unids/μΙ). Essas reações foram incubadas por uma noite a 16°C. As reações foram paralisadas com incubação a 70°C por cinco minutos. Após a parada da reação, 72 μΙ de TE foram adicionados em cada tubo, e os conteúdos foram agitados completamente.

Uma primeira reação PCR foi conduzida usando "iniciador" AP1, fornecido pelo fabricante, com "iniciadores" diferentes projetados contendo seqüência conhecida do suplemento de DNA heterólogo (Ciclo 1 "iniciadores específicos do gene" ou "GSP1"). Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 1 μΙ do DNA MIR162 apropriado da biblioteca, 1 μΙ 10 μΜ AP1, 1 μ110 μΜ GSP1, 1 μΙ 10 mM dNTPs, 5 μΙ 10Χ Tampão Advantage 2 PCR, 1 μΙ of BD Advantage 2 polimerase, e 40 μΙ água destilada. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: sete ciclos a 94°C por 25 segundos e 72°C por quatro minutos, 32 ciclos a 94°C por 25 segundos e 67°C por quatro minutos e, um ciclo a 67°C por quatro minutos. Cada reação PCR primária foi diluída 50 vezes pela adição de 1 μΙ do produto PCR primário, com .49 μΙ de água destilada. As reações que funcionaram foram (1) as bibliotecas Dral e Xmnl com o iniciador GSP1 162GW3F1:

5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID NO: 56) e "inicia- dor" AP1.

Uma segunda reação PCR foi conduzida independentemente usando "iniciador" AP2, fornecido pelo fabricante, com diferentes "iniciado- res" projetados contendo a seqüência conhecida do suplemento DNA hete- rólogo (Ciclo 2 "iniciadores específicos do gene" ou "GSP2"). Os seguintes reagentes foram misturados em um tubo PCR em gelo: 1 μΙ do produto PCR primário apropriado, 1 μΙ 10 μΜ AP2, 1 μΙ 10 μΜ GSP2, 1 μΙ 10 mM dNTPs, 5 μΙ 10Χ Tampão Advantage 2 PCR, 1 μΙ of BD Advantage 2 polimerase, e 40 μΙ água destilada. PCR foi completado adotando o seguinte protocolo: cinco ciclos a 94°C por 25 segundos e 72°C por quatro minutos, 20 ciclos a 94°C por 25 segundos e 67°C por quatro minutos, e um ciclo a 67°C por quatro minutos. As reações que funcionaram foram (1) as bibliotecas Dral e Xmnl com o "iniciador" GSP2, 162GW3F2:

.5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG3' (SEQ ID NO: 57) e "iniciador" AP2.

Dez μΙ dos produtos do PCR foram corridos em um gel de aga- rose contendo 1 % de brometo de etídio. A banda apropriada foi extraída do gel de agarose e purificada usando um kit de extração Qiagen Qiaquick Gel de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi clonado den- tro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instru- ções do fabricante. Esse clone foi transformado dentro de uma E. coli, e o DNA do plasmídeo foi extraído das células após uma noite de crescimento, usando um kit Qiagen Miniprep seguindo as instruções do fabricante. Esse plasmídeo foi sequenciado usando sequenciamento final de eluição.

Um novo "iniciador" foi projetado contendo uma nova seqüência previamente conhecida, para ser usada com um iniciador no DNA suplemen- tar para amplificar aproximadamente 1 kb da seqüência de pareamento de 3' fora do DNA genômico. O "iniciador" de DNA suplementar 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID NO: 56) e um "inici- ador" de seqüência de pareamento 3' 1623'GWR1: 5CTGGTGAACCGA Illll ACGGAGG3' (SEQ ID NO: 58) foram usados pa- ra amplificar uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de pareamento 3' para confirmação. A seqüência do "amplicon" resultante é publicada em SEQ ID NO: 59. Esse "amplicon" 3' compreende a seqüência de junção 3' publicado em SEQ ID NO: 47. Dez μΙ do "amplicon" PCR foi elu- ído em gel de agarose contendo 1 % de brometo de etídio. A banda apropri- ada foi extraída do gel de agarose e purificada, usando um kit de extração Qiagen Qiaquick Gel de acordo com as instruções do fabricante. O DNA ex- traído foi clonado dentro de um vetor de clonagem Invitrogen TOPO-XL de acordo com as instruções do fabricante. Esse clone foi transformado dentro de E. coli. DNA do plasmídeo foi extraído das células após crescimento em meio de cultura durante a noite, com um kit Qiagen Miniprep, de acordo com as instruções do fabricante. Três plasmídeos foram completamente sequen- ciados usando os "iniciadores" mostrados na Tabela 5. As seqüências dos plasmídeos foram alinhadas para gerar a confirmação completa da seqüên- cia de pareamento 3' (SEQ ID NO: 48).

Tabela 5. Seqüência do "Iniciador".

Nome do "Iniciador" Seqüência (5'—>3') N0 da seqüência b00106a GATTGAATCCTGTTGCC SEQ ID NO: 81 b00106b TCTCAT AAAT AACGTCATGC SEQ ID NO: 82 b00108a TCTGTGGATAACCGTATTAC SEQ ID NO: 83 b00201h TTCACGGGAGACTTT ATCTG SEQ ID NO: 60 b00605a CCGATTCATT AATGCAG SEQ ID NO: 61 b00704h AATAATATCACTCTGTACATCC SEQ ID NO: 64 b00712e AGTAACATAGATGACACCGC SEQ ID NO: 84 b01106a CCAGTGTGCTGGAATTCG SEQ ID NO: 85 b01106f GTTGTAAAACGACGG SEQ ID NO: 65 b01107h CCAGTGTGATGGAT ATCTGC SEQ ID NO: 86 b01108e CCAGTGTGCTGGAATTCG SEQ ID NO: 87 b01111f CCAGTGTGATGGAT ATCTGC SEQ ID NO: 88 b01709f TAG G C ACCCC AG G CTTTA SEQ ID NO: 66 b02701a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEQ ID NO: 89 b02701e TATCTGCAGAATTCGCCCTT SEQ ID NO: 90 b02702a GTGTGCTGGAATTCGCCCTT SEQ ID NO: 91 <table>table see original document page 57</column></row><table>

Exemplo 6. Detecção da proteína Vip3Aa20 em MIR162 por ELISA

Os extratos foram preparados das folhas, raízes, cerne, caroço, seda, pólen e das plantas completas MIR162. Elas foram quantitativamente analisadas para Vip3Aa20 por ELISA usando imunoafinidade, anti-Vip3A purificada de cabra, proteína Α-purificada de coelho e anticorpos policlonais anti-Vip3A usando método conhecido como procedimento ELISA. Vip3Aa20 foi detectado em todos os tecidos analisados para todos os estágios de cres- cimento. O significado do nível de proteína Vip3Aa20 detectado em planta inteira durante a florescência e maturidade da semente foi 10 μg/g peso fresco e 16 μg/g peso fresco, respectivamente. O significado dos níveis de proteína Vip3Aa20 nas folhas durante a florescência foi 22 μg/g peso fresco. Exemplo 7. Eficácia do MIR162 em campo.

O evento MIR162 foi testado em campo para a eficácia contra lagarta de cereais (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta do milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta rosca (BCW, Agrotis ipsilon), e broca do milho Eu- ropeu (ECB, Ostrinia nubilalis). Performance do evento MIR162 foi compara- da àquela do Warrior® (Syngenta, Inc.), um inseticida convencional padrão aplicado em uma taxa de 11,2 g a.i./acre, evento milho transgênico Bt11, compreendendo um gene crylAb, e um híbrido Bt11 X MIR162, produzido pelo cruzamento de uma linhagem inata Bt11 com uma linhagem inata MIR162.

Vinte e oito provas foram plantadas em 13 estados que repre- sentam as maiores regiões de cultivo de milho dos Estados Unidos continen- tal. Provas foram plantadas randomicamente em blocos completos projeta- dos com quatro canteiros replicados em cada bloco. Os canteiros possuíam .5,334 metros (17,5 pés) por fileira por tratamento por replicação. A densida- de de plantio objetivada era de aproximadamente 30.000 plantas/acre. Fai- xas do Immunodiagnóstico foram utilizadas para confirmar a presença ou a ausência das proteínas Vip3Aa20 e CryIAb em diferentes grupos de trata- mento.

Pestes de infestações naturais que foram utilizadas nas provas onde as populações eram suficientemente altas; onde não o eram, infesta- ções artificiais foram induzidas. Infestação artificial com dois, 2o - ao 3o "ins- tar" Iarval a V1-V2, foi utilizado nas provas BCW. Os canteiros foram avalia- dos a 3, 7, e 14 dias pós-infestação. Os danos em BCW foram relatados como plantas parcialmente danificadas e plantas completamente cortadas. Os canteiros FAW foram avaliados 7 e 14 dias pós-infestação ou após o 3o estágio Iarval foram observados nas plantas controle. A seguinte escala foi usada para avaliar os danos nas folhas em FAW e CEW:

- Nenhum dano visível à folha

- Dano buraco-de-alfinete em poucas folhas

- Pequena quantidade de buraco-de-tiro em poucas folhas

- Dano buraco-de-tiro em várias folhas

- Dano buraco-de-tiro e lesões em poucas folhas

- Lesões em várias folhas

- Lesões amplas em várias folhas

- Lesões amplas e porções devoradas em poucas folhas

- Lesões amplas e porções devoradas em várias folhas

- Lesões amplas e porções devoradas na maioria das folhas

Danos nas plantas foram estimados para ambos, primeira e se- gunda geração ECB. A seguinte escala foi usada para classificar danos da primeira geração, tipicamente quando as larvas do 3o ao 4o "instar": .1 - Nenhum dano visível às folhas

.2 - Pequena quantidade de feridas buraco-de-tiro em poucas

folhas

.3 - Feridas buraco-de-bala comuns em várias folhas

.4 - Várias folhas com buracos-de-tiro e lesões alongadas

.5 - Várias folhas com lesões alongadas

.6 - Várias folhas com lesões alongadas cerca de 2,5 cm

.7 - Lesões longas comuns em cerca de metade das folhas

.8 - Lesões longas comuns em cerca de dois terços das folhas

- Maioria das folhas com lesões longas

Danos à segunda geração ECB foram estimados de três a qua- tro semanas após infestação artificial ou ao final do período de postura de ovos. As seguintes medições foram tomadas: número de larvas vivas/talo, número de larvas vivas/pé, Número de larvas vivas/espiga, Número de tú- neis/talo, comprimento cumulativo do túnel (cm)/talo, comprimento cumulati- vo do túnel(cm)/pé, Número de túneis/espiga, comprimento cumulativo túnel dano no caroço (cm)/espiga, e % de plantas infestadas.

As provas CEW foram geralmente plantadas tardiamente para aumentar os níveis de infestação natural. O dano por alimentação das espi- gas foi avaliado quando larvas CEW nas plantas controle estavam em está- gio de crescimento L5-L6. Espigas avaliadas incluíram o registro do número de larvas observado por espiga e o comprimento visível do túnel por alimen- tação do caroço, medindo da ponta da espiga até a média do caroço mais baixo destruído.

Os resultados do teste de BCW em campo são mostrados na Tabela 6. Menos que 3% das plantas MIR162 e plantas Bt11 X MIR162 fo- ram cortadas pelas larvas BCW. Números significantes de Bt11 e das plan- tas controle foram cortadas. Plantas contendo o genótipo MIR162 tiveram menos danos de alimentação por BCW que as plantas tratadas com insetici- das convencionais. Tabela 6. Danos aos talos das cinco provas com BCW 21 dias após infesta- ção. Os danos foram avaliados com o percentual total de plantas cortadas.

Tratamento % Plantas cortadas

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Os resultados da prova FAW em campo são mostrados na Tabe- la 7. Dano por alimentação de FAW foi avaliado em uma escala de 0,01 a 9. O significado do dano por alimentação nos híbridos de MIR162 foi muito bai- xo (< 1) e significantemente mais baixo que os danos médios observados em Bt11 e com tratamentos por inseticidas convencionais. A opressão de insetos nessas provas foi muito forte com aproximadamente 50 a 100 larvas recém-nascidas/planta. Bt11 promoveu alguma proteção contra danos, con- siderando que o tratamento convencional com inseticida não promoveu pro- teção, apresentando a mesma quantidade de danos que o controle. Tabela 7. Taxa de danos por alimentação das folhas de cinco provas para FAW. O significado da taxa de danos 14 dias após a infestação é apresenta- do para cada tratamento.

Tratamento Classificação significado (0.01-9)

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Os resultados das provas estimados para a primeira geração ECB são apresentados na Tabela 8. Dano por alimentação por ECB foi clas- sificado em uma escala de1-9. Nessas provas, MIR162 conferiu mínima pro- teção contra danos for alimentação contra ECB. Bt11 protegeu completa- mente as plantas dos danos contra alimentação de ECB. As plantas Bt11 X MIR162 possuíram o mesmo nível de proteção que as plantas Bt11. O tra- tamento com inseticida convencional promoveu melhor proteção que o traço de MIR162, porém significantemente menos proteção que àquela promovida por Bt11.

Tabela 8. Danos por alimentação das folhas teste em campo. O significado das taxas de danos 14 dias após a infestação.

Tratamento Taxa de Danos às folhas (1-9)

<table>table see original document page 61</column></row><table>

Os resultados dos danos provocados por ECB à segunda gera- ção são apresentados na Tabela 9. Os danos por alimentação foram medi- dos como comprimento cumulativo do túnel em cada talo de milho (se mais de um túnel fossem encontrados, os comprimentos seriam somados). Os tratamentos Bt11 e Bt11 χ MIR162 promoveram forte proteção contra a per- furação dos talos, considerando não existir proteção contra o tunelamento que foi promovido somente pelo MIR162 ou com o tratamento pelo inseticida. Tabela 9. Taxas de danos de sete provas da segunda geração larvas ECB medidos em comprimento de túnel (cm) por talo. As medidas foram tomadas de três a quatro dias após a infestação artificial.

Tratamento Significado comprimento de túnel (cm)

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Resultados das provas para os danos estimados CEW são apre- sentados na Tabela 10. Danos por alimentação foram classificados pelo comprimento do túnel por espiga, medidos da ponta da espiga até a média do caroço mais baixo destruído. Danos significantes das espigas foram ob- servados em Bt11, inseticida, e canteiros de controle. Bt11 promoveu algum nível de proteção comparado ao controle não tratado e foi comparado à pro- teção promovida pelo tratamento convencional com inseticida. MIR162 e Bt11 X MIR162 promoveram proteção quase completa para as espigas do dano por alimentação das larvas CEW.

Tabela 10. Taxas de danos às espigas de seis provas para CEW medidos como médias do comprimento dos danos de alimentação. As medidas foram tomadas quando larvas CEW estavam L5-L6 em plantas controle.

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Exemplo 8. Eficácia de MIR162 contra a lagarta do feijão ocidental (WBCW).

Os eventos transgênicos comerciais produtores da proteína CryIAb não promoveram níveis aceitáveis de proteção contra a lagarta do feijão ocidental (WBCW, Striacosta albicosta). Por esta razão, o MIR162 so- 10 zinho e combinado com outros genótipos transgênicos foi testado para eficá- cia contra WBCW.

Os ovos de WBCW foram coletados de uma mariposa fêmea selvagem, capturada. As larvas foram alimentadas com uma dieta "meridic" para larvas cortadoras até serem utilizadas nos experimentos. Plantas de milho foram desenvolvidas em campo. Os seguintes tratamentos foram tes- tados: MIR162, Bt11, MIR604, MIR162 X Bt11, MIR162 X MIR604, MIR604 X Bt11, Force® (Syngenta, Inc.), um inseticida convencional aplicado ao plantio para uma isolinhagem negativa, e dois controles isolinhagens negati- vos. MIR604 é um novo evento milho transgênico que compreende um gene cry3A055 codificador da proteína que é ativa contra a larva da praga do mi- lho (Diabrotica spp.) e é revelado em um pedido de patente nos EUA número de publicação N°. 2005/0216970, publicada em 29 de Setembro de 2005, referência incorporada por referência.

Para os experimentos, um pedaço de duas polegadas das sedas verdes e da casca foi cortado das espigas de um campo de crescimento de plantas de milho em cada tratamento e réplica. As terminações finais mar- rons das sedas foram removidas e as cascas, descartadas. Aproximadamen- te 3,81 cm (1,5 polegadas) das sedas foram colocadas em copos plásticos individuais de 14 ml. Uma larva foi colocada em cada copo e os copos foram selados. Vários estágios diferentes de larvas foram testados variando do 3o ao 6o "instars". Copos contendo sedas e as larvas foram mantidos a um pe- ríodo de dia natural a temperatura ambiente durante a permanência dos ex- perimentos. A sobrevivência das larvas foi registrada após oito dias. Os tra- tamentos foram realizados em quatro replicatas por experimento.

Os resultados dos experimentos com WBCW são apresentados na Tabela 11. Sobrevivência de WBCW nas sedas das isolinhagens negati- vas e do tratamento convencional com inseticida foi próximo de 100%. So- brevivência das larvas WBCW nas sedas Btll e MIR604, testadas quer sejam sozinhas, ou em combinação na mesma planta, não foi diferente dos sobre- viventes das isolinhagens negativas. Sobrevivência das larvas WBCW foi reduzida quando as larvas foram alimentadas com as sedas de MIR162. A combinação de MIR162 X Bt11 na mesma planta não promoveu a redução da sobrevivência que o MIR162 sozinho. Entretanto, surpreendentemente, quando o genótipo transgênico de MIR162 foi combinado com o genótipo transgênico de MIR604 na mesma planta, a mortalidade Iarval aumentou significativamente quando comparado ao MIR162 ou ao MIR604 sozinhos.

Tabela 11. Percentual (±SE) sobrevivência de larvas WBCW nas sedas de milho.

Número do Experimento

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Exemplo 9. Uso do sítio de inserção do evento MIR162 para integração obie- tivada no milho.

As seqüências de pareamento do MIR162 reveladas em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48 Foram usadas para busca de "milhos" em bases de dados genômicos. Pares idênticos para ambas as seqüências de parea- mento foram encontradas em um clone BAC, CH201-307P5, do cromosso- mo (NCBI N0 acesso. AC185313) em Contig 13 (SEQ ID NO: 106). Mais es- pecificamente, o suplemento MIR162 está no cromossomo 5 entre um mar- cador molecular 5', designado por referência como marcador Opie2 (nucleo- tídeos 1680-3338 do SEQ ID NO: 106), e um marcador molecular 3', desig- nado por referência como marcador gag (nucleotídeos 43.275-45.086 do SEQ ID NO: 106). Usando esta informação, foi determinado que o DNA he- terólogo inserido dentro de MIR162 desordenou 58 nucleotídeos do milho DNA genômico, nucleotídeos 25.455 para 25.512 do SEQ ID NO: 106 (tam- bém mostrado como SEQ ID NO: 107), o qual está entre a seqüência de pa- reamento 5' (nucleotídeos 1-25.454 do SEQ ID NO: 106) e a seqüência de pareamento 3' (nucleotídeos 25.513-51.328 do SEQ ID NO: 106).

Considerando a performance agronômica do transgene do even- to MIR162 sobre várias gerações sob condições de campo, sugere que es- sas regiões identificadas ao redor do sítio de inserção em MIR162 fornece- ram boas posições genômicas para a integração desejada dos outros genes transgênicos de interesse. Tal integração desejada supera os problemas com o que chamamos de "efeitos de posição", e o risco de criar uma muta- ção no genoma sobre integração do transgene dentro do hospedeiro. Outras vantagens de tal integração desejada incluem, mas não se limitam a, redu- ção do amplo número de eventos de transformação que precisam ser rastre- ados e testados antes da obtenção de uma planta transgênica que exiba o nível desejado da expressão do transgene sem que também exiba anormali- dades resultantes da inserção indevida do transgene dentro de um lócus importante no genoma do hospedeiro. Além disso, tal integração desejada permite abundância da execução e criação de transgenes de linhagens de plantas de elite com ambos os genes mais eficientes.

Usando o preceito acima descrito, a pessoa habilidosa é apta a usar métodos conhecidos na ciência para atingir ácidos nucléicos heterólo- gos de interesse para o mesmo sítio de inserção no cromossomo 5 como aquele no MIR162 ou para um sítio em justa proximidade ao sítio de inser- ção em MIR162. Um desses métodos é descrito em Publicação de Pedido Patente Aplicação EUA N°. 20060253918, incorporada na íntegra por refe- rência para referência. Brevemente, acima de 20 Kb de seqüência genômica de pareamento 5' para o sítio de inserção (nucleotídeos 5.454 a 25.454 de SEQ ID NO: 106) e acima de 20 Kb de seqüência genômica de pareamento .3' para o sítio de inserção (nucleotídeos 25.513 a 45.513 de SEQ ID NO:106) são usados para parear o gene ou os genes de interesse que são pre- tendidos a serem inseridos dentro de uma locação gênica no Cromossomo 5 via recombinação homóloga. Essas seqüências podem ser promovidas pa- reando a margem do T-DNA repetidamente tal como a borda esquerda (LB) e a borda direita (RB) seqüências repetidas e outras seqüência incentivado- ras para aumentar a eficiência de livramento de T-DNA. O gene ou os genes de interesse podem ser colocados exatamente como no sítio de inserção do MIR162 ou podem ser colocadas em qualquer lugar contendo as regiões 20 Kb ao redor dos sítios de inserção MIR162 para conferir níveis consistentes de expressão do transgene sem efeitos prejudiciais à planta. Os vetores de DNA contendo o gene ou os genes de interesse e as seqüências de parea- mento podem ser liberados dentro das células das plantas via um dos vários métodos conhecidos por aqueles especialistas na área, incluindo, porém não limitando a transformação mediada pelo Agrobacterium. A inserção do vetor DNA dentro do sítio alvo do MIR162 pode ser acentuada por um dos vários métodos, incluindo, mas não limitando à co-expressão ou a super-regulação da recombinação dos genes intensificados ou a sub-regulação da recombi- nação endógena dos genes de supressão. Além disso, é conhecida na ciên- cia que a clivagem de seqüências específicas do genoma, pode ser usada para aumentar a freqüência de recombinação homóloga, por esta razão a inserção dentro do sítio de inserção em MIR162 e suas regiões de parea- mento podem ser acrescidas pela expressão da sequência-específica de endonucleases natural ou projetada para clivar essas seqüências. Contudo usando o preceito fornecido por referência, qualquer ácido nucléico heteró- Iogo pode ser inserido no cromossomo milho 5 em um sítio alvo localizado entre os nucleotídeos 25.454 e 45.513 de SEQ ID NO: 106 ou em um sítio alvo na vizinhança deste sítio.

Exemplo 10. Uso do sítio de inserção do evento MIR162 e seqüências de pareamento para estabilização da expressão do gene.

As seguências genômicas de pareamento do sítio de inserção do MIR162 também podem ser usadas para estabilizar a expressão de ou- tro(s) gene(s) de interesse guando inseridos como um transgene em outras posições genômicas no milho e em outros cultivos. Especificamente, acima de 20 Kb da seguência genômica de pareamento 5' para o sítio de inserção (nucleotídeos 5.454 a 25.454 de SEQ ID NO: 106) e acima de 20 Kb da se- qüência genômica de pareamento 3' para o sítio de inserção (nucleotídeos 25.513 a 45.513 de SEQ ID NO: 106) são usados para parear o gene ou os genes de interesse gue são pretendidos a serem inseridos dentro do geno- ma das plantas. Essas seguências podem ser promovidas pareando a mar- gem do T-DNA repetidamente tal como a borda esguerda (LB) e a borda di- reita (RB) seqüências repetidas e outras seqüência incentivadoras para au- mentar a eficiência de livramento de T-DNA. O gene ou os genes de interes- se podem ser colocados exatamente como no sítio de inserção em MIR162 ou podem ser colocadas em qualquer lugar interiormente as regiões 20 Kb ao redor dos sítios de inserção em MIR162 para conferir níveis consistentes de expressão do transgene. Os vetores de DNA contendo o gene ou os ge- nes de interesse e a seqüência de pareamento do sítio de inserção de MIR162 podem ser liberados dentro das células da planta via um dos vários métodos conhecidos àqueles habilidosos na ciência, incluindo, mas não limi- tando a transformação "protoplat", bombardeamento biolítico e a transforma- ção mediada via Agrobacterium. O DNA liberado pode se integrar randomi- camente dentro de um genoma da planta ou também se fazer presente co- mo parte das unidades genéticas independentemente segregadas tais como um cromossomo ou um minicromossomo. Os vetores de DNA contendo o(s) gene(s) de interesse e as seqüências de pareamento do sítio de inserção de MIR162 podem ser liberados dentro das células da planta. Deste modo, cir- cundando um gene ou genes de interesse com a seqüência genômica de pareamento o sítio de inserção de MIR162, a expressão de tais genes é es- tabilizada em plantas transgênicas hospedeiras tais como planta dicotiledô- nea ou uma planta monocotiledônea como a planta de milho.

DEPÓSITO

Peticionários fizeram um depósito das sementes de milho do evento MIR162 revelado acima anteriormente a 23 de Janeiro de 2007 de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Colection (ATCC), 1801 Universidade de Boulevard1 Manassas1 VA 20110 sob N0 de acesso ATCC N°. PTA-8166. O depósito será mantido no depositário por um período de 30 anos, ou 5 anos após o ultimo pedido, ou o tempo de vida efe- tivo da patente, o qual for mais tardio, e será substituído se necessário du- rante aquele período. Peticionários não impõem restrições sobre a disponibi- lidade do material depositado do ATCC; contudo, peticionários não têm auto- ridade para protelar qualquer uma das restrições impostas pela lei posto à transferência de material biológico ou sua transportação em comércio. Peti- cionários não protelam qualquer violação de seus direitos garantidos sob esta patente ou sob a Proteção de Variedade de Plantas (Plant Variety Pro- tection) decreto 7 USC 2321 et seq.

Todas as publicações e documentos da patente publicados, ci- tados neste relatório são incorporados para referência na mesma extensão que cada publicação individual ou documento de patente foi especificamente e individualmente indicado a serem incorporados segundo referência. LISTAGEM DE SEQYÊNCIA <110> Syngenta Participations AG Long, NyKoll Pulliam, Derrick Hart, Hope Bottoms, Jeff Meghj i, Moez Que, Qiudeng

<120> Corn Event MIR162

<130> 71133WOPCT

<160> 107

<170> Patente em versão 3.3

<210> 1

<211> 2370

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Seqüência que codifica vip3Aa20

<400> 1

atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180

atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240

ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300

aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360

atcaccagca tgctgagcga cgtgattaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 42 0

tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480

ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600

agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780 gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840

ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960

aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020

agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080

gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 12 00

tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 12 60

gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 132 0

aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 13 80

gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg 1440

atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500

cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg 1560

agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 162 0

aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680

gtcgaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc 1740

atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800

gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860

gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920

gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980

aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040

accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100

cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160

gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 222 0

ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 22 80

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340

gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag 2370

<210> 2 <211> 789 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Toxina Vip3Aa

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (789)

<223> Proteína Vip3Aa20 produzido por MIR162

<400> 2

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn 65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Ile Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val 145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

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Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

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Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 740 745 750 Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu 755 760 765 Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr 770 775 780 Asp Val Ser Ile Lys 785

<210> 3

<211> 14405

<212> DNA

<220>

<223> Plasmídeo pNOV1300

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aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

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gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600

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ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900 atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960

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agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080

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atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800

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gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980

aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040

accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100

cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160

gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220

ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 22 80

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340

gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag gagctctaga tctgttctgc acaaagtgga 2400

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gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta 3120

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ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa 3540

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agccgatggc cgagctgtgg atgggcgcac atccgaaaag cagttcacga gtgcagaatg 4740 ccgccggaga tatcgtttca ctgcgtgatg tgattgagag tgataaatcg actctgctcg 4800

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aattaattcg gacgtacgtt ctgaacacag ctggatactt acttgggcga ttgtcataca 6660 tgacatcaac aatgtacccg tttgtgtaac cgtctcttgg aggttcgtat gacactagtg 6720

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caaaaacaga gaaaggaaac gacagaggcc aaaaagctcg ctttcagcac ctgtcgtttc 10620

ctttcttttc agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgacgaaga agaacggaaa 10680

cgccttaaac cggaaaattt tcataaatag cgaaaacccg cgaggtcgcc gccccgtaac 10740

ctgtcggatc accggaaagg acccgtaaag tgataatgat tatcatctac atatcacaac 10800

gtgcgtggag gccatcaaac cacgtcaaat aatcaattat gacgcaggta tcgtattaat 10860

tgatctgcat caacttaacg taaaaacaac ttcagacaat acaaatcagc gacactgaat 10920

acggggcaac ctcatgtccc cccccccccc ccccctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 10980

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 11040

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 11100

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 11160

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 1122 0

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 11280

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 11340

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11400

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 11460

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 11520

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 11580

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 11640

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 11700

cttcaagaat tggtcgacga tcttgctgcg ttcggatatt ttcgtggagt tcccgccaca 11760

gacccggatt gaaggcgaga tccagcaact cgcgccagat catcctgtga cggaactttg 1182 0

gcgcgtgatg actggccagg acgtcggccg aaagagcgac aagcagatca cgcttttcga 11880

cagcgtcgga tttgcgatcg aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga 11940

gggatcaagc cacagcagcc cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct 12000

ttttggaatg ctgctccgtc gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat 12060

tatcgcacgg aatgccaagc actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa 1212 0

tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct 12180

cttttctctt aggtttaccc gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag 12240

gcgggaaacg acaatctgat catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc 12 3 00

cgatgacgcg ggacaagccg ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac gttgaaggag 12360

ccactcagca agctggtaca agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 12420 ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 12480

tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 12540

acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 12600

aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 12660

atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 12720

ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 12780

tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 12840

attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 12900

attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 12960

tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 13020

agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 13080

acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 13140

gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 13200

accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 13260

gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 13320

cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc 13380

cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 13440

tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 13500

cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 13560

cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 13620

cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 13680

caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 13740

gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 13800

acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 13860

aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 13 92 0

tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 13980

ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 14040

tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 14100

atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 14160

atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 14220

aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 14280

agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 14340 tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat 14400 ccacc 14405

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador TAQMAN vip3Aa sintetizado quimicamente

<400> 4

caccttcagc aacccgaact a 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador rev TAQMAN vip3Aa sintetizado

<400> 5

gcttagcctc cacgatcatc tt 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sonda TAQMAN vip3Aa sintetizado quimicamente

<400> 6

gtcctcgtcg ctgcccttca cct 23

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador para TAQMAN pmi sintetizado quimicamente <400> 7

ccgggtgaat cagcgttt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador rev TAQMAN pmi sintetizado quimicamente

<400> 8

gccgtggcct ttgacagt 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sonda TAQMAN pmi sintetizado quimicamente

<400> 9

tgccgccaac gaatcaccgg 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador para TAQMAN ZmADH-267 - Sintetizado quimicamente

<400> 10

gaacgtgtgt tgggtttgca t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador rev TAQMAN ZmADH-267 - Sintetizado quimicamente <400> 11

tccagcaatc cttgcacctt 20

<210> 12 <211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sonda TAQMAN ZmADH-267 - Sintetizado quimicamente

<400> 12

tgcagcctaa ccatgcgcag ggta 24

<210> 13

<211> 2370

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sonda vip3Aa20 - Sintetizado quimicamente

<400> 13

atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60 aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120 gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180 atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240 ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300 aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360 atcaccagca tgctgagcga cgtgatgaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420 tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480 ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540 gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600 agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660 aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720 aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780 gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840 ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900 atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac gtggaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag <210> 14

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2370

<211>

1176

<212>

DNA

<213>

Seqüência artificial

<220>

<223>

Sonda pmi - Sintetizado quimicamente

<400>

14 atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60

gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120 catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180 gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240 ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300 aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 3 60 gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420 cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480 gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540 agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600 attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660 tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720 ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780 gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840 tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900 ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960 tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 102 0 gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080 cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140 cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176

<210> 15

<211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador MOV3Aa-01-5' - Sintetizado quimicamente

<400> 15

atgaacaaga acaacaccaa 2 0

<210> 16 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador MOV3Aa-01-3' - Sintetizado quimicamente

<400> 16

ctacttgatg ctcacgtcgt ag 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 17

acgagcagaa ccaggtgc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 18

ggtgaagaag gacggcag 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 19

acctgtcgca agctgctggg 2 0

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 20

tggacaagct gctgtgtc

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 21

tgcaggccga cgagaacag

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 22

tgatccagta caccgtgaa

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 23

accctgaccc tgtaccag

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 24 gtgttgccgc tgatgttg

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 25 cgtactcggt cttcggct

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 26

ctgcaggcca aagccgtt

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 27 tcgccgtaga tcacctcg

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 28

gcttgcgaca ggtggtca

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 29

ttgctgctgg tctcggtgg

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 30

cgttggcgat cttaaggat

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 31

gcaagccatc gattcac

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 32 gcaacaccct gaccctg

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 33

tctacgacgt gagcatcaag

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 34

gtagaagtgc acgatcggg

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 35

cggtgctggt ccagttg

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 162INSERT-F2 - sintetizado quimicamente

<400> 36

acaccaatga tgcaaatagg c 21

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador VIP_R4 - sintetizado quimicamente

<400> 37

gaaggtgttc aggtagaact cgaag 2 5

<210> 38

<211> 2946

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Amplicon vip3Aa20 5' - sintetizado quimicamente

<400> 38

acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg aatcatgtca 60

ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag aattaaggga 12 0

gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag 180

aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gctggtacaa gcttgcatgc ctgcagtgca 240

gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa 300

aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca 360

tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt 420

ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac 480

aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat 540

agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt 600

aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa 660

ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa 720

taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa 780 acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac 840

ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca 900

tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg 960

ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc 1020

ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc 1080

tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc 1140

tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca 1200

cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat 1260

cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga 1320

tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca 1380

gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta 1440

gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt 1500

ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat 1560

gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag 1620

tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc 1680

atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta 1740

tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg 1800

tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt 1860

tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat 1920

agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg 1980

gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg 2040

agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt 2100

ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat 2160

ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg 2220

caggtcgact ctagaggatc caccatgaac aagaacaaca ccaagctgag cacccgcgcc 22 80

ctgccgagct tcatcgacta cttcaacggc atctacggct tcgccaccgg catcaaggac 2340

atcatgaaca tgatcttcaa gaccgacacc ggcggcgacc tgaccctgga cgagatcctg 2400

aagaaccagc agctgctgaa cgacatcagc ggcaagctgg acggcgtgaa cggcagcctg 2460

aacgacctga tcgcccaggg caacctgaac accgagctga gcaaggagat ccttaagatc 2520

gccaacgagc agaaccaggt gctgaacgac gtgaacaaca agctggacgc catcaacacc 2580

atgctgcgcg tgtacctgcc gaagatcacc agcatgctga gcgacgtgat taagcagaac 2640

tacgccctga gcctgcagat cgagtacctg agcaagcagc tgcaggagat cagcgacaag 2700 ctggacatca tcaacgtgaa cgtcctgatc aacagcaccc tgaccgagat caccccggcc 2760 taccagcgca tcaagtacgt gaacgagaag ttcgaagagc tgaccttcgc caccgagacc 2820 agcagcaagg tgaagaagga cggcagcccg gccgacatcc tggacgagct gaccgagctg 2880 accgagctgg cgaagagcgt gaccaagaac gacgtggacg gcttcgagtt ctacctgaac 2940 accttc 2946

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador CJB179 - Sintetizado quimicamente

<400> 39

atgcaaatag gctgggaata gtc 23

<210> 40 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador reverso CTRB3116 - Sintetizado quimicamente

<400> 40

gtaccagctt gctgagtggc t 21

<210> 41

<211> 209

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Amplicon CJB134/179 5' - Sintetizado quimicamente

<400> 41

atgcaaatag gctgggaata gtctgtctaa tagtttgagt gaatcatgtc actgatagtt 60 taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta 120 tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac 180 gttgaaggag ccactcagca agctggtac 209 <210> 42

<211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador VIP-F3 - Sintetizado quimicamente

<400> 42

ggtgctgttc gagaagaggt 2 0

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador PMI_REV1 - Sintetizado quimicamente

<400> 43

cgatttatca ctctcaatca cat 23

<210> 44

<211> 2577

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Amplicon vip3Aa20 3' - Sintetizado quimicamente

<400> 44

ggtgctgttc gagaagaggt acatgagcgg cgccaaggac gtgagcgaga tgttcaccac 60

caagttcgag aaggacaact tctacatcga gctgagccag ggcaacaacc tgtacggcgg 12 0 cccgatcgtg cacttctacg acgtgagcat caagtaggag ctctagatct gttctgcaca 180 aagtggagta gtcagtcatc gatcaggaac cagacaccag acttttattc atacagtgaa 240 gtgaagtgaa gtgcagtgca gtgagttgct ggtttttgta caacttagta tgtatttgta 300 tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc caggggtacc 360 agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca 420 ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg 480 cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag 540 tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa 600

aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg 660

ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac 720

atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt 780

tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa 840

taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa 900

gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta 960

aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 102 0

agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc 1080

tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 1140

tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt 1200

cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct 1260

ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc 1320

ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc 1380

ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact 1440

tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac 1500

acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg 1560

gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg 1620

tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg 1680

tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg 1740

ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt 1800

ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga 1860

aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga 1920

tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct 1980

agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat 2040

gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga 2100

taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc 2160

tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat 2220

tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt 2280

agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc 2340

tgttgtttgg tgttacttct gcagggatcc ccgatcatgc aaaaactcat taactcagtg 2400

caaaactatg cctggggcag caaaacggcg ttgactgaac tttatggtat ggaaaatccg 2460 tccagccagc cgatggccga gctgtggatg ggcgcacatc cgaaaagcag ttcacgagtg 2520 cagaatgccg ccggagatat cgtttcactg cgtgatgtga ttgagagtga taaatcg 2577

<210> 45

<211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de junção 5' entre genoma de milho e inserto de DNA

<400> 45

tgaatcatgt cactgatagt 20

<210> 46 <211> 1088 <212> DNA <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de flanqueamento 5'

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (236)

<223> Seqüência de flanqueamento 5'

<400> 46

tcctgtgttg ttggaacaga cttctgtctc ttctggtgat cataaatatt agttgtgttg gaaaatgttg ttttcttttg tctctagact ggaaagcgga acacggttct ttcaactagg gatgaaagtg gtaatccgaa ttgttagtac ttttaaaata gatatgtata aaattttatg ttgatctttt ttatgttatc gtataaatta gtataaatat gaataaaata ttacataaaa tgttttatgt ccctacaaca taaatagttg aaaaaattac taaatttgtt ttcgaatcta tatatctatt atttaagaaa aatataggat gaaaaggttt atcttttatg agctggatct tataaacaag aaaataaatt tatattgtag attttatatc gcaatcaaag aaaagcgact aaaaaactga ttaccgagta aatactgttt tcgtccctac tatcaacgcc ttctcccaac cgcagtcgat ctgtccgtct cagcggcacc cctgctgttc gactatctag accatagaat attttaggta

taaatgaacc 60

gttctcgtca 120

aaatttaata 180

aagcacatta 240

attatttggt 300

tatcgaagtt 360

aatctttaca 420

ctatttattc 480

ccaaccgttt 540

gtatcaggcg 600

tacaataatt 660 ttagttccac gctagaacat tttagttaga ataataacaa gatttgctat tgatgtagga 720 ctcgcccgtc actgtctaaa aaagcattct gtcggtctta ttctttaggc atcagcgggt 780 gtactatctc atttttccta tcatattcct cagtactctg ttaagtataa atggtctatt 840 ttacatgatg aactaataaa actaattaag gatcctaact ttttgtgaag gtaatttgga 900 tcattatgca ttaccatcct acgtatacct gctgcagcag catctgcgta agcacagcct 960 agatatatgc ttctgtgtgg actgaaagga gactttgttt atcaattagt atactcccaa 102 0 aaaactgatg acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg 1080 aatcatgt 1088

<210> 47

<211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> 31 junction sequence between insert DNA and corn genome

<400> 47

aaacgtccgc catggtctga 20

<210> 48

<211> 1189

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de flanqueamento 3'

<400> 48

catggtctga aggcaacaga taaggcatac tgggccttgt ggtagttgtt ttactgggcc 60

tttttgtatg atctataaaa ttcactggga tcaacccgga gaggaatggc agcagatgca 120 gtccccaggg tcctccgtcg ccgcctgagc acccggcacc cgcgctgaac cggagaggga 180 cgcgcggacg ccgtgcagct ggtgcggagg gggctgtggc agatgaggat gagacgcgta 240 cgtggctggg aaggccagca ggccaccggg tcttcgtcca gcccggcgcg agtggacagg 300 actagagatg gcaacggtta caaacccgct gggttttacc gtcccaaacc cgtacccgtg 360 aaaaatatct atgcccatta aaaaacccgt acccatgacg ggtttgagat tttgcccaaa 42 0 cccgtaccca tcgggttaac gggtacccat gggttacccg cgggtttcat ctccaatata 480 cctgttcttc tcataatcaa taagtatcgt aatgattaat gatatcatga tccaaaatct 540 atgtaatgaa caacgagttc atgatttggt ataaaaatta ttagtagaga gaatgaaata 600

caaataataa gttgtataat taagtgacct tgcactaagt tatccatcca tcacatatat 660

aacgctagta aaaactataa tatcaagcaa gcaacactct caccgactac tgatacattc 720

accaattgat aaaaaatatg aagtaaataa ggaataacaa gtttgttgtt cgtttataaa 780

ataaaatgac aatatgcact aggtttggtc gggtttaaaa aacccacggg ttcacgggtt 840

tgggtactat aggaacaaac ccgtacccat aaacccattg ggtacagatt tatgcccgtt 900

aacaaaccca tgggtatgaa aattgaccca aacctatacc ctaatggggt aaaaacccat 960

cgggtttcgg atttcgggta cccattgcca tctctagaca ggacaacctc ggccggtcct 102 0

gtatgtaggc caccagcatc ggccagttgg tacatccagc cggggtcagg tcacttttac 1080

tcgtctcaat cagacaatca ccgtccacca acgaacgcca acgttgtcac ttgtcaggtc 1140

ggttgagact tgtatttttt tttgtcctcc gtaaaaatcg gttcaccag 1189

<210> 49

<211> 10579

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Vip3Aa20 seqüências de flanqueamento e inserto do evento MIR162

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1088)

<223> Seqüência de flanqueamento 5' do evento MIR162

<400> 49

tcctgtgttg ttggaacaga cttctgtctc ttctggtgat cataaatatt taaatgaacc 60

agttgtgttg gaaaatgttg ttttcttttg tctctagact ggaaagcgga gttctcgtca 120

acacggttct ttcaactagg gatgaaagtg gtaatccgaa ttgttagtac aaatttaata 180

ttttaaaata gatatgtata aaattttatg ttgatctttt ttatgttatc aagcacatta 240

gtataaatta gtataaatat gaataaaata ttacataaaa tgttttatgt attatttggt 300

ccctacaaca taaatagttg aaaaaattac taaatttgtt ttcgaatcta tatcgaagtt 360

tatatctatt atttaagaaa aatataggat gaaaaggttt atcttttatg aatctttaca 42 0

agctggatct tataaacaag aaaataaatt tatattgtag attttatatc ctatttattc 480

gcaatcaaag aaaagcgact aaaaaactga ttaccgagta aatactgttt ccaaccgttt 540

tcgtccctac tatcaacgcc ttctcccaac cgcagtcgat ctgtccgtct gtatcaggcg 600 cagcggcacc cctgctgttc gactatctag accatagaat attttaggta tacaataatt 660

ttagttccac gctagaacat tttagttaga ataataacaa gatttgctat tgatgtagga 720

ctcgcccgtc actgtctaaa aaagcattct gtcggtctta ttctttaggc atcagcgggt 780

gtactatctc atttttccta tcatattcct cagtactctg ttaagtataa atggtctatt 840

ttacatgatg aactaataaa actaattaag gatcctaact ttttgtgaag gtaatttgga 900

tcattatgca ttaccatcct acgtatacct gctgcagcag catctgcgta agcacagcct 960

agatatatgc ttctgtgtgg actgaaagga gactttgttt atcaattagt atactcccaa 102 0

aaaactgatg acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg 1080

aatcatgtca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag 1140

aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg 1200

gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gctggtacaa gcttgcatgc 1260

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 1320

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 1380

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 1440

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 1500

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 1560

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 1620

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 1680

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 1740

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 1800

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 1860

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 1920

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 1980

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 2040

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 2100

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 2160

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 2220

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 2280

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 2340

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 2400

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 2460

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 2520 agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 2580

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 2640

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 2700

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 27 60

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 2820

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 2 880

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 2940

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 3 000

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 3060

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 3120

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 3180

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 3240

gttacttctg caggtcgact ctagaggatc caccatgaac aagaacaaca ccaagctgag 3300

cacccgcgcc ctgccgagct tcatcgacta cttcaacggc atctacggct tcgccaccgg 3360

catcaaggac atcatgaaca tgatcttcaa gaccgacacc ggcggcgacc tgaccctgga 342 0

cgagatcctg aagaaccagc agctgctgaa cgacatcagc ggcaagctgg acggcgtgaa 3480

cggcagcctg aacgacctga tcgcccaggg caacctgaac accgagctga gcaaggagat 3540

ccttaagatc gccaacgagc agaaccaggt gctgaacgac gtgaacaaca agctggacgc 3 600

catcaacacc atgctgcgcg tgtacctgcc gaagatcacc agcatgctga gcgacgtgat 3660

gaagcagaac tacgccctga gcctgcagat cgagtacctg agcaagcagc tgcaggagat 3720

cagcgacaag ctggacatca tcaacgtgaa cgtcctgatc aacagcaccc tgaccgagat 3780

caccccggcc taccagcgca tcaagtacgt gaacgagaag ttcgaagagc tgaccttcgc 3 840

caccgagacc agcagcaagg tgaagaagga cggcagcccg gccgacatcc tggacgagct 3900

gaccgagctg accgagctgg cgaagagcgt gaccaagaac gacgtggacg gcttcgagtt 3960

ctacctgaac accttccacg acgtgatggt gggcaacaac ctgttcggcc gcagcgccct 4020

gaagaccgcc agcgagctga tcaccaagga gaacgtgaag accagcggca gcgaggtggg 4080

caacgtgtac aacttcctga tcgtgctgac cgccctgcag gcccaggcct tcctgaccct 4140

gaccacctgt cgcaagctgc tgggcctggc cgacatcgac tacaccagca tcatgaacga 4200

gcacttgaac aaggagaagg aggagttccg cgtgaacatc ctgccgaccc tgagcaacac 4260

cttcagcaac ccgaactacg ccaaggtgaa gggcagcgac gaggacgcca agatgatcgt 432 0

ggaggctaag ccgggccacg cgttgatcgg cttcgagatc agcaacgaca gcatcaccgt 4380

gctgaaggtg tacgaggcca agctgaagca gaactaccag gtggacaagg acagcttgag 4440 cgaggtgatc tacggcgaca tggacaagct ctacaccaac aacatcgtgt tcccgaacga gaagatgaag accctgcgct acgaggtgac gatcgacctg aacaagaaga aggtggagag gaacgacgac ggcgtctaca tgccactggg caacggcttt ggcctgcagg ccgacgagaa ctacctgcgc gagctgctgc tagccaccga gccaccgagc ggcttcatca gcaacatcgt ggagccgtgg aaggccaaca acaagaacgc caccaaggcc ctgtacgtgc acaaggacgg gaagccgaag accgagtacg tgatccagta gaaggacgag aacaccggct acatccacta ccagaccatc aacaagcgct tcaccaccgg gaagagccag aacggcgacg aggcctgggg gagcgagaag ctgctgagcc cggagctgat caccaacatc agcggcaaca ccctgaccct gaacctgcag ctggacagct tcagcaccta caacgtgcgc atccgcaact cccgcgaggt caaggacgtg agcgagatgt tcaccaccaa gagccagggc aacaacctgt acggcggccc gtaggagctc tagatctgtt ctgcacaaag acaccagact tttattcata cagtgaagtg ttttgtacaa cttagtatgt atttgtattt ttcctaaaac caaaatccag gggtaccagc cgtgcccctc tctagagata atgagcattg ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag ttactctacg aataatataa tctatagtac ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc ataatacttc atccatttta ttagtacatc agactaattt ttttagtaca tctattttat aaactctatt ttagtttttt tatttaataa

gctgtgtccg gaccagagcg agcaaatcta 4500 gtacgtgatc accaagatcg acttcaccaa 4560 cgccaacttc tacgacagca gcaccggcga 4620 cagcgaggcc gagtaccgca ccctgagcgc 4680 cgtgatcagc gagaccttcc tgaccccgat 4740 cagccgcctg atcaccctga cctgtaagag 4800 cctgagcaac aaggagacca agctgatcgt 4860 ggagaacggc agcatcgagg aggacaacct 4920 ctacgtggac cacaccggcg gcgtgaacgg 4980 cggcatcagc cagttcatcg gcgacaagct 5040 caccgtgaag ggcaagccat cgattcacct 5100 cgaggacacc aacaacaacc tggaggacta 5160 caccgacctg aagggcgtgt acctgatcct 5220 cgacaacttc atcatcctgg agatcagccc 52 80 caacaccaac aactggacca gcaccggcag 5340 gtaccagggc ggccgcggca tcctgaagca 5400 ccgcgtgtac ttcagcgtga gcggcgacgc 5460 gctgttcgag aagaggtaca tgagcggcgc 5520 gttcgagaag gacaacttct acatcgagct 5580 gatcgtgcac ttctacgacg tgagcatcaa 5640 tggagtagtc agtcatcgat caggaaccag 5700 aagtgaagtg cagtgcagtg agttgctggt 5760 gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa 5820 ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt 5880 catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata 5940 tttatctatc tttatacata tatttaaact 6000 tacaataata tcagtgtttt agagaatcat 6060 acaattgagt attttgacaa caggactcta 6120 tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat 6180 catttagggt ttagggttaa tggtttttat 6240 tctattttag cctctaaatt aagaaaacta 6300 tttagatata aaatagaata aaataaagtg 6360 actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg 6420 tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca 6480 gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg 6540

cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc 6600

agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc 6660

tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc 6720 gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg 6780

gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 6840

ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 6900

ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 6960

ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 7020

ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 7080

acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 7140

tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 7200

cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt 7260

tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 7320

agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 7380

cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 7440

gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 7500

gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 7560

aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 7620

catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 7680

ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 7740

atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 7800

tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca gggatccccg 7860

atcatgcaaa aactcattaa ctcagtgcaa aactatgcct ggggcagcaa aacggcgttg 7920

actgaacttt atggtatgga aaatccgtcc agccagccga tggccgagct gtggatgggc 7980

gcacatccga aaagcagttc acgagtgcag aatgccgccg gagatatcgt ttcactgcgt 8040

gatgtgattg agagtgataa atcgactctg ctcggagagg ccgttgccaa acgctttggc 8100

gaactgcctt tcctgttcaa agtattatgc gcagcacagc cactctccat tcaggttcat 8160

ccaaacaaac acaattctga aatcggtttt gccaaagaaa atgccgcagg tatcccgatg 8220

gatgccgccg agcgtaacta taaagatcct aaccacaagc cggagctggt ttttgcgctg 8280 acgcctttcc ttgcgatgaa cgcgtttcgt gaattttccg agattgtctc cctactccag 8340 ccggtcgcag gtgcacatcc ggcgattgct cactttttac aacagcctga tgccgaacgt 8400 ttaagcgaac tgttcgccag cctgttgaat atgcagggtg aagaaaaatc ccgcgcgctg 8460 gcgattttaa aatcggccct cgatagccag cagggtgaac cgtggcaaac gattcgttta 8520 atttctgaat tttacccgga agacagcggt ctgttctccc cgctattgct gaatgtggtg 8580 aaattgaacc ctggcgaagc gatgttcctg ttcgctgaaa caccgcacgc ttacctgcaa 8640 ggcgtggcgc tggaagtgat ggcaaactcc gataacgtgc tgcgtgcggg tctgacgcct 8700 aaatacattg atattccgga actggttgcc aatgtgaaat tcgaagccaa accggctaac 8760 cagttgttga cccagccggt gaaacaaggt gcagaactgg acttcccgat tccagtggat 8820 gattttgcct tctcgctgca tgaccttagt gataaagaaa ccaccattag ccagcagagt 8880 gccgccattt tgttctgcgt cgaaggcgat gcaacgttgt ggaaaggttc tcagcagtta 8940 cagcttaaac cgggtgaatc agcgtttatt gccgccaacg aatcaccggt gactgtcaaa 9000 ggccacggcc gtttagcgcg tgtttacaac aagctgtaag agcttactga aaaaattaac 9060 atctcttgct aagctgggag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa 9120 taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 9180 ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 9240 gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 9300 cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tccccgggtc 9360 tagacaattc agtacattaa aaacgtccgc catggtctga aggcaacaga taaggcatac 9420 tgggccttgt ggtagttgtt ttactgggcc tttttgtatg atctataaaa ttcactggga 9480 tcaacccgga gaggaatggc agcagatgca gtccccaggg tcctccgtcg ccgcctgagc 9540 acccggcacc cgcgctgaac cggagaggga cgcgcggacg ccgtgcagct ggtgcggagg 9600 gggctgtggc agatgaggat gagacgcgta cgtggctggg aaggccagca ggccaccggg 9660 tcttcgtcca gcccggcgcg agtggacagg actagagatg gcaacggtta caaacccgct 9720 gggttttacc gtcccaaacc cgtacccgtg aaaaatatct atgcccatta aaaaacccgt 9780 acccatgacg ggtttgagat tttgcccaaa cccgtaccca tcgggttaac gggtacccat 9840 gggttacccg cgggtttcat ctccaatata cctgttcttc tcataatcaa taagtatcgt 9900 aatgattaat gatatcatga tccaaaatct atgtaatgaa caacgagttc atgatttggt 9960 ataaaaatta ttagtagaga gaatgaaata caaataataa gttgtataat taagtgacct 10020 tgcactaagt tatccatcca tcacatatat aacgctagta aaaactataa tatcaagcaa 10080 gcaacactct caccgactac tgatacattc accaattgat aaaaaatatg aagtaaataa 10140 ggaataacaa gtttgttgtt cgtttataaa ataaaatgac aatatgcact aggtttggtc 10200 gggtttaaaa aacccacggg ttcacgggtt tgggtactat aggaacaaac ccgtacccat 10260 aaacccattg ggtacagatt tatgcccgtt aacaaaccca tgggtatgaa aattgaccca 10320 aacctatacc ctaatggggt aaaaacccat cgggtttcgg atttcgggta cccattgcca 10380 tctctagaca ggacaacctc ggccggtcct gtatgtaggc caccagcatc ggccagttgg 10440 tacatccagc cggggtcagg tcacttttac tcgtctcaat cagacaatca ccgtccacca 10500 acgaacgcca acgttgtcac ttgtcaggtc ggttgagact tgtatttttt tttgtcctcc 10560 gtaaaaatcg gttcaccag 10579

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador FE1002 - Sintetizado quimicamente

<400> 50

cgtgactccc ttaattctcc gct 23

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador FE1003 - Sintetizado quimicamente

<400> 51

gatcagattg tcgtttcccg cctt 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Iniciador FE1004 - Sintetizado quimicamente

<400> 52

gattgtcgtt tcccgccttc agtt 24

<210> 53 <211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador 162_DW_Conf3 - Sintetizado quimicamente

<400> 53

cctgtgttgt tggaacagac ttctgtc 27

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador FE0900- Sintetizado quimicamente

<400> 54

ggctccttca acgttgcggt tctgtc 26

<210> 55

<211> 1230

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Amplicon 5' PCR - Sintetizado quimicamente

<400> 55

cctgtgttgt tggaacagac ttctgtctct tctggtgatc ataaatattt aaatgaacca 60

gttgtgttgg aaaatgttgt tttcttttgt ctctagactg gaaagcggag ttctcgtcaa 120

cacggttctt tcaactaggg atgaaagtgg taatccgaat tgttagtaca aatttaatat 180

tttaaaatag atatgtataa aattttatgt tgatcttttt tatgttatca agcacattag 240

tataaattag tataaatatg aataaaatat tacataaaat gttttatgta ttatttggtc 300

cctacaacat aaatagttga aaaaattact aaatttgttt tcgaatctat atcgaagttt 360

atatctatta tttaagaaaa atataggatg aaaaggttta tcttttatga atctttacaa 420

gctggatctt ataaacaaga aaataaattt atattgtaga ttttatatcc tatttattcg 480

caatcaaaga aaagcgacta aaaaactgat taccgagtaa atactgtttc caaccgtttt 540

cgtccctact atcaacgcct tctcccaacc gcagtcgatc tgtccgtctg tatcaggcgc 600 agcggcaccc ctgctgttcg actatctaga ccatagaata ttttaggtat acaataattt 660 tagttccacg ctagaacatt ttagttagaa taataacaag atttgctatt gatgtaggac 720 tcgcccgtca ctgtctaaaa aagcattctg tcggtcttat tctttaggca tcagcgggtg 780 tactatctca tttttcctat catattcctc agtactctgt taagtataaa tggtctattt 840 tacatgatga actaataaaa ctaattaagg atcctaactt tttgtgaagg taatttggat 900 cattatgcat taccatccta cgtatacctg ctgcagcagc atctgcgtaa gcacagccta 960 gatatatgct tctgtgtgga ctgaaaggag actttgttta tcaattagta tactcccaaa 1020 aaactgatga caccaatgat gcaaataggc tgggaatagt ctgtctaata gtttgagtga 1080 atcatgtcac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 1140 attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 1200 aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc 1230

<210> 56

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador 162_GW_3_F1 - Sintetizado quimicamente

<400> 56 tctcttgcta agctgggagc tcgatccg 28

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Iniciador 162_GW_3_F2 - Sintetizado quimicamente

<400> 57 aagattgaat cctgttgccg gtcttgcg 2 8

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0> <223> Iniciador 162_3'GW_R1 - Sintetizado quimicamente

<400> 58

ctggtgaacc gatttttacg gagg 24 <210> 59 <211> 1518 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Amplicon 3' PCR - Sintetizado quimicamente

<400> 59

tctcttgcta agctgggagc tcgatccgtc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat 60

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 120

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 180

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 240

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat ccccgggtct 300

agacaattca gtacattaaa aacgtccgcc atggtctgaa ggcaacagat aaggcatact 360

gggccttgtg gtagttgttt tactgggcct ttttgtatga tctataaaat tcactgggat 420

caacccggag aggaatggca gcagatgcag tccccagggt cctccgtcgc cgcctgagca 480

cccggcaccc gcgctgaacc ggagagggac gcgcggacgc cgtgcagctg gtgcggaggg 540

ggctgtggca gatgaggatg agacgcgtac gtggctggga aggccagcag gccaccgggt 600

cttcgtccag cccggcgcga gtggacagga ctagagatgg caacggttac aaacccgctg 660

ggttttaccg tcccaaaccc gtacccgtga aaaatatcta tgcccattaa aaaacccgta 720

cccatgacgg gtttgagatt ttgcccaaac ccgtacccat cgggttaacg ggtacccatg 780

ggttacccgc gggtttcatc tccaatatac ctgttcttct cataatcaat aagtatcgta 840

atgattaatg atatcatgat ccaaaatcta tgtaatgaac aacgagttca tgatttggta 900

taaaaattat tagtagagag aatgaaatac aaataataag ttgtataatt aagtgacctt 960

gcactaagtt atccatccat cacatatata acgctagtaa aaactataat atcaagcaag 1020

caacactctc accgactact gatacattca ccaattgata aaaaatatga agtaaataag 1080

gaataacaag tttgttgttc gtttataaaa taaaatgaca atatgcacta ggtttggtcg 1140

ggtttaaaaa acccacgggt tcacgggttt gggtactata ggaacaaacc cgtacccata 1200

aacccattgg gtacagattt atgcccgtta acaaacccat gggtatgaaa attgacccaa 1260

acctataccc taatggggta aaaacccatc gggtttcgga tttcgggtac ccattgccat 1320 ctctagacag gacaacctcg gccggtcctg tatgtaggcc accagcatcg gccagttggt 13 80 acatccagccggggtcaggt cacttttact cgtctcaatc agacaatcac cgtccaccaa 1440 cgaacgccaa cgttgtcact tgtcaggtcg gttgagactt gtattttttt ttgtcctccg 1500 taaaaatcgg ttcaccag 1518

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 60

ttcacgggag actttatctg 20

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 61

ccgattcatt aatgcag 17

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 62

acgtaaaacg gcttgtc 17

<210> 63

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 63

gtttaaactg aaggcgg

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 64

aataatatca ctctgtacat cc

<210> 65

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 65

gttgtaaaac gacgg

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 66

taggcacccc aggcttta

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 67

aattgaattt agcggccg

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 68 ggtccctaca acataaatag

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 69

ttcgtcccta ctatcaacgc

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 70 ctttaggcat cagcgggt

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 71 agcatctgcg taagcaca

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 72 ctgatgacac caatgatgc

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 73

gatcagattg tcgtttccc

<210> 74

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 74 gcatcattgg tgtcatcag

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 75

tgtgcttacg cagatgct

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 76

acccgctgat gcctaaag

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 77 gcgttgatag tagggacgaa

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 78

ctatttatgt tgtagggacc

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 79

ctagactgga aagcggag

<210> 80

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 80 ccactttcat ccctagttg

<210> 81

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 81 gattgaatcc tgttgcc

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 82 tctcataaat aacgtcatgc

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 83

tctgtggata accgtattac

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 84

agtaacatag atgacaccgc

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 85 ccagtgtgct ggaattcg

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 86 ccagtgtgat ggatatctgc

<210> 87

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 87 ccagtgtgct ggaattcg

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 88 ccagtgtgat ggatatctgc

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 89 gtgtgctgga attcgccctt

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 90

tatctgcaga attcgccctt

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado guimicamente

<400> 91

gtgtgctgga attcgccctt

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado guimicamente

<400> 92 tatctgcaga attcgccctt

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 93 gtgtgctgga attcgccctt

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 94 tatctgcaga attcgccctt

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 95

gtgtgctgga attcgccctt

<210> 96

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 96 ggtcttgcga tgattatc

<210> 97

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 97 gagaggaatg gcagcaga

<210> 98

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 98 catgacgggt ttgagatt

<210> 99

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 99

aatctcaaac ccgtcatg 18

<210> 100

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 100 tctgctgcca ttcctctc 18

<210> 101

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sintetizado quimicamente

<400> 101 gatcaacccg gagaggaat 19

<210> 102

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de sequênciamento b05104h-Sintetizado quimicamente

<400> 102

ccatgacggg tttgagat 18

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de sequênciamento b05105c - Sintetizado guimicamente

<400> 103

caaccgacct gacaagtgac 20

<210> 104

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de sequênciamento b05105e - Sintetizado quimicamente

<400> 104

atctcaaacc cgtcatgg 18

<210> 105

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de sequênciamento b05105f - Sintetizado quimicamente

<400> 105

attcctctcc gggttgatc 19

<210> 106

<211> 51328

<212> DNA

<213> Zea mays <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1680)..(3338)

<223> Marcador opie2 <22 0>

<221> misc_feature

<222> (25455) . . (25512)

<223> Seqüência genômica de milho substituído por DNA Heterólogo. <220>

<221>

misc_feature

<222>

(43275) . . (45086)

<223>

Marcador gag

<400>

106

agatctagag attcgtcatt tgtagaaagg atagaaaggt gattgctagg aagttagggg caaaatgcaa gggtgataaa acttgcattt ggatccctaa ggaaattgtg actaaccttg taggacccaa caagagttgg gtacctaagt cccaagccta aatttgcctt gcaggtttat gcatccgggg gttcaagctg gattattgat agcggatgca caaaccatat gacgggggag aagaagatgt tcacctccta tgtcaagaat aaggattccc aagattcaat tatattcggt gatgggaatc aaggcaaggt aaaagggtta ggtaaaattg caatttctaa tgagcactcc atatctaatg tgtttttagt agagtctctc agatataatt tgctatctgt tagtcaatta tgcaacatgg ggtataactg tctatttacc aatgtagatg tgtctgtctt tagaagaagt gatggttcac tagcttttaa gggtgtatta gacggcaaac tttatttagt tgattttgca aaagaagagg ccggtctaga tgcatgctta atagctaaga ctagcatggg ctggctgtgg catcgccgct tagcacatgt ggggatgaag aaccttcaca agcttctaaa gggagaacac gtgataggtt tgactaatgt gcaattcgaa aaagatagac cttgtgcagc ttgtcaagca gggaaacagg tgggaagcgc tcatcacacc aaaaatgtga tgacaacatc aagacccctg gagctgctac atatggacct cttcggaccc gtcgcctatc tgagcatagg aggaagtaag tatggtctag ttatcgttga tgacttttcc cgcttcactt gggtgttctt tttgcaggat aaatctgaaa cccaagggac cctcaagcgc ttcctcagga gatctcaaaa tgagtttgag ctcaaggtga agaagataag gagcgacaac gggtccgagt tcaagaacct tcaagtggag gagttccttg aggaggaagg gatcaagcac gagttctccg ctccctacac accacagcaa aatggtgtgg tagagaggaa gaacatgacg ctaatcgata tggcgagaac gatgcttgga gaattcaaga cccccgagtg tttctggtcg gaagccgtga acacggcttg ccacgccatc aacagggtct accttcaccg cctcctcaag aagacgtcgt atgagcttct aaccggtaac aaacccaatg tatcttactt tcgtgtattt gggagcaaat gctacattct agtgaagaag ggtagaaatt ctaagtttgc tcccaaagct gtagaagggt ttttgttagg ttatgactca aatacaaagg cgtatagagt cttcaacaaa tcatcgggtt tggttgaaat ctctagcgac gttgtatttg atgagactaa tggctctcca agagagcaag ttgttgattg tgatgatgta gatgaagaag atgttccaac ggctgctata cgaaccatgg cgattggaga agtgcggcca caggaacaag atgaacgaga tcaaccttct tcctcaacaa cggtgcatcc cccaactcaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 gacgatgaac aggttcatca acaggaggca tgtgatcaag gggagcacaa gatgatcatg 1680

tgatggagga agaagcgcaa ccggcacctc caacccaagt tcgagcgatg attcaaagga 1740

atcatcccgt cgatcaaatt ctgggtgata ttagcaaggg agtaactact cgatctcgat 1800

tagttaattt ttgtgagcat tactcctttg tctcttctat tgagcctttc agggtagaag 1860

aggccttgct agatccggac tgggtgttag ccatgcagga ggaactcaac aacttcaagc 1920

gcaatgaagt ttggacactg gtgcctcgtc ccaagcaaaa tgttgtggga accaagtggg 1980

tgttccgcaa caaacaggac gagcacgggg tggtgacgag gaacaaggct cgacttgtgg 2040

caaaaggtta tgcccaagtc gcaggtttgg actttgagga gacgtttgct cctgtggcta 2100

ggctagagtc aattcgcatc ttgctagcat atgccgctca ccactctttc aggttgtacc 2160

aaatggatgt gaagagcgct ttcctcaacg ggccgatcaa ggaagaggtg tacgtggagc 2220

aaccccctgg cttcgaggat gaacggtacc ccgaccacgt gtgtaagctc tctaaggcgc 2280

tctatggact taagcaagcc ccaagagcat ggtatgaatg ccttagagac tttttacttg 2340

ctaatgcttt caaggttggg aaagccgatc caactctgtt cactaagaca tgtgatggtg 2400

atttgtttgt gtgccaaatt tatgtcgacg acataatatt tggttctact aaccaaaagt 2460

cttgtgaaga gtttagcagg gtaatggcgc agaaattcga gatgtcaatg atgggcgagt 2520

tgaactactt ccttgggttc caagtgaagc aactcaagga tggcaccttc atctcccaaa 2580

cgaagtacac gcaagatcta ctaaagcggt ttgggatgaa ggacgccaag cccgcaaaga 2640

ctccgatggg gaccgacgga cacaccgacc tcaacaaagg aggtaagtcc gttgatcaaa 2700

aagcataccg gtcaatgata ggttctttac tttacttatg tgctagtaga ccggatatta 2760

tgcttagcgt atgcatgtgt gctagatttc aatccgatcc taaggagtgt cacttagtgg 2820

cggtgaagcg aattattaga tatttggttg ctacgccttg cttcgggctc tggtatccaa 2880

aggggtctac ctttgacctg gttggatact cagattccga ctatgttgga tgtaaggtcg 2940

ataggaagag tacatcgggg acgtgccaat tcttaggaag gtccctggtg tcgtggaact 3000

ctaagaaaca aacctccgtt gccctatcca ccgctgaggc cgagtatgtt gccgcaggac 3060

agtgttgcgc gcaactactt tggatgaggc aaaccctccg ggactttggc tacaatctga 3120

gcaaagtccc actcctatgt gacaatgaga gtgctatccg catggcggaa aatcctgttg 3180

aacacagccg cacaaagcac atagacatcc ggcatcactt tttgagagac caccagcaaa 3240

agggagatat cgaagtgttt catgttagca ccgagaacca gctagctgat atcgaagtgt 3300

ttcatgttag caccgagaac cttttgcagg ctgcgtagta agctaaatgt cttagattcg 3360

cggaacttgg attgaattgt agcatacatg tgtttatgcc tttgatcatg ttcattctgc 3420

attttgttgc ttattgtggt gctcaagttg tacaaacact ccctggatct cacaagtccg 3480

ttgcaaagtg atgctgagag cacctagagg gggggtgaat aggtgatcct gtaaaaactt 3540 aacttatagc cacaaaaact tgttaaaggt tagcacaata attgccaagt ggctaaagag 3600

gagatcttgc acaatacgat tatcacagag aattcaacac agaggagaca tagtgattta 3660

tcccgtggtt cggccaagta caaaacttgc ctacttccac gttgtggcgt cccaacggac 372 0

gagggttgca atcaaccctt ctcaagcggt ccaaagaccc acttgaatac cacggtgttt 3780

ttgccttgct tatctttatc ccacttacga ggaatctcca cagattggag tctctcgccc 3840

ttacacttaa gattcacaaa gaagcacgga gtaagggagg gaagcaacac acacaaatcc 3900

acagcgaaat gcgcacacac acggccaaga atcgagctca aagactatct cacagtttct 3960

cacaagaaca gagctcgaat cacttagaat cacaaacgga tgcgcaaaga ctgagtgtgg 4020

atgatcaaga atgctcaaag gttgcttggt gtctccctcc atgcgtctag gggtcccttt 4080

tatagcccca aggcagctag gagccgttga gaacaaatct ggaaggccat ctttgccttc 4140

tgtcgtcggg cgcaccggac agtccggtgc ccgattcctt tccttaattg gcgaagccga 4200

ccgttgcaga tgcgggagcc gttggcgcac cggacatgtc cggtgcacac cggacagtcc 42 60

ggtgccccct tccgaccgtt ggctcggcca cgtgtcccgc gcagatcgcg cggtcgaccg 4320

ttggctcagc cgaccgttgg ctcaccggac agtccggtgc acaccggaca gtccggtgca 4380

caccggacag tccggtgaat tttagccgta cgccgtcagc aaattcccga gagcggcctc 4440

ttcggccaag gcagcctggc gcaccggaca ctgtccggtg caccaccgga cagtccggtg 4500

ccccagaccg aaacagcctc ttggctgtac acagccaagt cttctcttct cttcttcttt 4560

ctgtttctaa cacttagaca aatatattag tacacaaaac caatgtacta aggcttagaa 4620

acataccttt gctctagatt ttcactttgt tcatccatgg gcattgattc acatttaagc 4680

acttgtgttg acactcaatc accaaaatac ttagaaatgg cccaagggca catttccctt 4740

tcagatgcac agtttgaggg ggagatgtgt tacaacttga ccctttgaga ctaaccgtat 4800

gcttgagttt gcttgtttta gtctcaaagg agaattaaaa gggaaaaggt ggacttggac 4860

catgaaagac ttccactgca ctccgatgag agggtagctt attccaagtt catctcatgt 4920

actcttattg cctttgtatt cttattgaag attttggtga ggcaatgggg ttcttgggcc 4980

aagattgatc ctgttttggt gcttgatgcc aaagggggag aaaataaggg ccaaagcaat 5040

aaatggatca gctaccactt gagaaatttt gaaaacagta gaatagagct tttggtttgt 5100

caaatctctt ttgttgtctc ttttgtcaaa agttggcctc ttgtggggag aagtgttgat 5160

tatgggaaaa agggggagtt tttgaaatct ttcctttgga atgactctcc ttatgcttca 5220

acatgtgtgt ttgacttaga gatagagatt tgagtttgat ttgcaaaaac aaaccaagtg 5280

gtggcaaagg atgatccata tatgccaaat tgaatcaaaa taaatttgag tttttatttg 5340

aagtaatatt gcacttgttc tagttgcttt atgtagtgtt ggcataaatc accaaaaagg 5400

gggagattga aagggaaatg tgcccttggg ccatttctaa gtattttggt gattgagtgc 5460 caacacaagt gcttaaatgt gaattcatgt ttatggatga ataaagtgaa aatcaagagc 552 0

aaaggtatgt ttctaagtct tagtacattg gttttgtgta ctaatatact tgtctaagta 5580

ttggaaacag gaagaaaaag aaaagaaaag agttggctgt gtacagccaa gaggctgttt 5640

cggtctgggg caccggactg tccggtggtg caccggacag tgtccggtgg tgcaccggac 5700

agtgtccggt gcgccaggct gcctcggccg aagtagccgc tctcgggaat tcgctgacgg 5760

cgtacgacta taattcaccg gactgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt gtgcaccgga 5820

ctgtccggtg agccaacggt cggccgggcc aacggtcggc cgcgcgatct gcgcgtgaca 5880

cgtggccgag ccaacggcta gaagggggca ccggactgtc cggtgtgcac cggacatgtc 5940

cggtgcgcca acggctctct ggcgggcaac gggcggctgc gccattttag gaaggaaatc 6000

gggcaccgga cagtgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt gcgcccgacg acagaaggca 6060

aggatggcct tccagatttg ttctcaacgg ctcctagctg tcttggggct ataaaaggga 6120

cccctaggcg catggaggag tacaccaagc attcctacaa cattcctaag caccaagaca 6180

tcgatctcac gcattcgttt cattgtgata gcatctagag ctcttgttga gttgcgaact 6240

ctttgagttg tgttgcgagc tcttgttgcg acttgtgtgc gtgttgttgc tctgatcttt 6300

tgaagtcttg tgtgcgttgc tcattccccc tttgctctgt gttctttgtg aacttcaatt 6360

gtaagggcga gaggctccaa gttgtggaga ttcctcgcaa acgggattga gaaaaaaagc 6420

aagcaaaaca ccgtggtatt caagtgggtc tttggaccgc ttgagagggg ttgattgcaa 6480

ccctcgtccg ttgggacgcc acaacatgga gtaggcaagc gttggtcttg gccgaaccac 6540

gggataaacc actgtgtcgt ctctgtgatt gatctcttgt ggtattgtgt tttgttgaga 6600

ctcctttcta gccacttggc atttattgtg ctaacactta acaagttttt gtggctataa 6660

gtttaagttt tacaggatca cctattcacc ccccccccct ctaggtgttc tcacctatgc 6720

acccgtagct aggcttgagt caattcgcat attattggcc tatgctactt accatggctt 6780

taagctttat caaatggacg tgaaaagtgc cttcctcaac ggaccaatca aggaagaggt 6840

ctatgttgag caacctcccg gctttgaaga cagtgagtat cctaaccatg tttataggct 6900

ctctaaggcg ctttatgggc tcaagcaagc cccaagagca tggtatgaat gccttagaga 6960

tttccttatc gctaatggct tcaaagtcgg caaggccgat cctactctat ccactaaaac 7020

tcttgacaat gatttgtttg tatgccaaat ttatgttgat gatatcatat ttgggtctac 7080

taacgaatct acttgtgagg aatttagtag gatcatgaca cagaaattcg agatgtctat 7140

gatgggggag ttgaaatatt tcttaggatt tcaagtgaag caactccaag agggcacctt 7200

cattagccaa acgaagtaca ctcaagacat tctaaacaag tttggaatga aggatgccaa 7260

gcccatcaaa acacccatgg gaacaaatgg gcatctcggc ctcgacacgg gaggtaagtc 7320

cgtggatcaa aaggtatacc ggtcgatgat tggttcattg ctttatttat gtgcatctcg 73 80 accggacatt atgctttccg tatgcatgtg tgcaagattc caatccgacc ctaaggaatc 7440

ccaccttacg gccgtaaaac gaatcttgag atatttggct tatactccta agtttgggct 7500

ttggtaccct cggggatcca cttttgattt aattggttat tccgatgctg attgggcggg 7560

gtgtaagatt aataggaaga gcacatcggg gacttgccag ttcttgggaa gatccttggt 7620

gtcttgggct tcaaagaagc aaaattcggt tgctctttcc accgccgaag ccgagtacat 7680

tgccgcaggt cattgttgcg cgcaattgct ttggatgagg caaaccctgc gggactatgg 7740

ttacaaatta accaaagtcc ctttgctatg tgataatgag agtgcaatca aaatggccga 7800

caatcccgtc gagcatagcc gcactaagca catagccatt cggtatcatt ttcttaggga 7860

tcaccaacaa aagggagata tcgagatttc ttatattaac actaaagatc aattagccga 7920

tatctttacc aagcctcttg atgaacaaac ttttaccaaa cttaggcatg agctcaatat 7980

tcttgattcg cgcaattttt tttgctagat tgcacacgta gctcatttat atacctttga 8040

tcatatctct ttcatatgct atgactaatg tgtttttcaa gtccatttca caccaagtca 8100

taggtatatt gaaagggaat tggagttttc ggcgaagaca aaggcttcca ctccgtaact 8160

catcctttgc catcgctcca agaaaaggac cttgtctttg ggggagagag taaaagccca 8220

aagcaaaagg actggacttc gtctttggta taatcttaac tcatttactt atgaccaaag 8280

gggaagatag tacttctatg ggctctaatg attccgtttt tggcgattca tgccaaaggg 8340

ggagaaagta tgagcccaaa gcaaaaggac cgcaccacca ccaatttcaa aaacttagtg 8400

ctttctaaga gtatttatca attggtatcc tattgtgttc aaaaggagga gaaaattagt 8460

tttttcaaaa atgtatatca aaaccctctt gaacactaag aggtggatct cctttagggg 8520

gaattttttg ttaagtcaaa ggaaaagcat ttgaaacagg gggagaaaat ttcaaatctt 8580

gaaaatgctt tgcaaactct tattcattta cctttgacta tttgcaaaag atcttttgaa 8640

atggatttac aaaaagaatt tgcaaaaaca aaacatgtgg tgcaaacgtg gtccaaaatg 8700

ttaaataaga aagaaacaat ccatgcatat cttgtaagta gttatattgg ctcaattcca 8760

agcaaccttt acacttacat tatgcaaact agttcaatta tgcacttcta tatttgcttt 8820

ggtttgtgtt ggcatcaatc accaaaaagg gggagattga aagggaatta ggcttacacc 8880

tagttcctaa ataattttgg tggttgaatt gaccaacaca aataattgga ctaactagtt 8940

tgcccaagtg tatagattat acaggtgtaa aaggttcaca ctcagccaat aaaaagacca 9000

agttttggat tcaacaaagg agcaaagggg caaccgaagg cacccctggt ctggcgcacc 9060

ggactgtccg gtgtgccacc ggacatgtcc ggtgcaccag ggggactcag actcaaactc 9120

gccaccttcg ggaatttcca gaggcgactc ggctataatt caccggactg tccggtgtac 9180

accggacatg tccggtgctc caaggaaggt cggcctcagg aactcgccag cctcgggttt 9240

tctccctcgc cgctccgcta taattcaccg gactgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt 9300 gcaacctcgg agcaacggct acttcgcgcc aacggctacc tgcaacggca tttaatgcgc 9360

gcgcagcacg cgcaggagtc agaatcgccc atgctggcac accggacagc aaacagtaca 9420

tgtccggtgt gcaccggaca cccaggtggg cccacaagtc agaagctcca acggtcagaa 9480

tccaacggca gtgatgacgt ggcagggggc accggactgt ccggtgtgca ccggactgtc 9540

cggtgcgcca tcgaacagac agcctcccaa cggccacttt tggtggttgg ggctataaat 9600

accccaacca ccccaccatt cattgcatcc aagttttcca cttctcaacc acttacaaga 9660

gctaggcatt caattctaga cacacccaaa gtgatcaaat cctctccaat tcaacacaaa 9720

gccctagtga ctagtgagag tgatttgccg tgttcatttg agctcttgcg cttggattgc 9780

tttctctctt tcattctttc ttgtgttcaa tactcacttg taaccaaggc aagagacacc 9840

aattgtgtgg tggtccttgc ggggaggttt ttctcccggt tgatttgaga agagaaagct 9900

cactcggtcg gagggaccgt ttgagagagg gaaagggttg aaaaagaccc ggcctttgtg 9960

gcctcctcaa cggggagtag gtttgagaga accgaacctc ggtaaaacaa atcctcgtgt 10020

ctcacttcat tatttgcttg cgatttgttt tcacgccctc tctcggactc gattatattt 10080

ctaacgctaa cccggcttgt agttgtgttt atatttgtaa atttcagttt cgccctattc 10140

accccccccc ctctaggcga ctatcaccag gcggtagtcc gcgagccaca gttccggtct 10200

cgtttccccc gaatacttcg tgatagtagt cgggggtcgg aaccgggtcg ggaacgacgc 10260

ccgtcggatg gcccgactga aggcttgcgg accgggtggt tcgggcgagg gactccgatc 10320

cctccccact gtcgtagcgc ccccccacgc ctggggtggt agcctcggcg caccctttcg 10380

tcgaggtggg cccgacggtc gcgtcgatgg tgctcgttgc cgaggtggcc cggggccgca 10440

ggcgcggtgt tgcgcgtgcg tccggtatag accgaggctt cccgcataaa ttgggaagtc 10500

gcggcgtgag gttccgaggg gtatccccgc ctccgggagg cagtgctctc ggcccgtcgg 10560

gccgcagcgc cttccaggag attcttgagc tctccctgga ttcgccgacc ctcggtggtt 10620

gatggctccg gcatcgtgcg gaggagcatc gctgcggctg ccaggttctg accaaccccg 10680

ctggatgcgg gcggcggcct gagcctgaca tcgttggcga cgcggtgctg gagaccttgg 10740

ggcaggtgac gtatttctcc ggccgagggt tggcccgccc atacctgccc gacgtcccgg 10800

cggatcgtct caagcgcccc tgttccctcg tcgagcctgg cctgcgcccc gcggacttgc 10860

tcgagctgtg ggtcgtgacc ccccgccgga acggggacca cagctagctc ccgcgggatg 10920

tcggcgcgag ggcaccggcc taggaaaatc accgtcctcc ggcatgccaa gatggttgcc 10980

ttcggaggga tcccctagct cgacgtggaa acattcgcgg cttgggccgc agtcctcgtc 11040

gtcaaggctg cggcttccgt cggaacagtc ggagaggcag tagtcacatg cggtcatgaa 11100

gtcccgcatg gcactggggt tgccaagtcc agagaaaccc caacagatgc tgggatcgtc 11160

atcttcctcg gacccagagg gcccgtaggt cgagacgtcc gtcaatcggt cccaaggcga 11220 ccgcatacga aaccccagtg gggttgcact cgcctcaatg agagcgcccg ccaaagcgag 11280

gtcgcttggc gggtcgaggc cgagtcgaaa tgacgtaaga tgggagttag ttagtacctt 11340

ttggtcgacg cggagcgacg tagtcacatc ggggactggt tgcaccgtca tctcaggtac 11400

gagggcgacg tcctgcaggc tttccgcgag cgtgctggcg tcttcttctt gctcgggatc 11460

agcgtgtcgc ggggggacgg cgcttgcctt cgtctcgaac gcgaggtcga cgcccggcgt 1152 0

gccctccgtg ggggcgctgg ggacgtcgat tcgctcgaca gccgacgaag cgcggcctcc 11580

cacttggcct tggttgcccc gcctcctcct ccgttggcgg gggagaggac ggggcgagct 11640

cgaatgttgt ttttccaccg cgcggggaag atgtcgtcgg ttccgccgcc gacgggcggg 11700

atgtcggccg ccattgtcgt tgtcgcgcgg cggtggaagg agtatcatgt cgtagctgcc 11760

gtcgaaggac atgaactcaa gactcccgaa acggagcacc gtcccgggcc ggagaggttg 1182 0

ctggagactg cccatctgga gcttgacggg aagctgttcg tcagcacgca gcaggcccct 11880

acctggcgca ccaactgtcg gcgtttcgag accggggggt ccccgagccg acgagtgagt 11940

gtgccgcgtg ccccagccca gatgggtcga gcgcgtgggc gagcgcgaag gggggagagg 12000

cgaggtgtcc ggagacgggc gtgagagagg tggagatccc gcggccttcg tgttcgtccc 12 060

gcgcccaggt cgggtgcgct tgcagtaggg gggttacaag cgtccacgcg ggtgagggaa 12120

gcgagcggcc ccaagagagc gcctgtctcg tcctcgtccc cgcgcggcca accttctcta 12180

agaaggccct ggtccttcct tttataggcg taaggagagg atccaggtgt acaatggggg 12240

tgtagcagag tgctacgtgt ctagcggagg gagagctagc gccctaagta catgccaatg 12300

tggcagccgg agagatcttg gcaccctact ggcgtgatgt cgtggctgtc ggaggagcaa 12360

cggagcctgg cggagggaca gctgtcggag cggtcgagtc cttgctgacg tccccttgct 1242 0

tccgtaagag agctgagagc cgccgtcgtc acagagcttg tggggcgcca tcattgccca 12480

tctggtggag ctagccagag gggacaccgg tcttgttctt cgtgacccga gtcggctcgg 12540

ggtaggatga tgatggcgct tcccgttgac gtggcgggcc tgtgccctag gtcgggcgac 12600

gtgggggctc ctccgaagcc gaggtcgaat ctgtcttccg tggccgaggc cgagcccgag 12660

cccctgggtc gggcgaggcg gaggtcgttc ggtagaggcc agggcggagt ccgagccctg 1272 0

gggtcgggcg aagcggagtt tgtcgtcttc cgggtctcag cccgagtccg agctttgggg 12780

tcgggtggag cggagttcgt cgtcttccgg gtcttagccc gagtccgagc cctggggtcg 12840

ggcggagcgg agttcgccgt cttccgggtc ttagcccgag tccgagccct ggggtcgggc 12900

ggagcggagt tcgtcgtctt ccgaggctga gcccgagtcc gagccctggg tcgggcggag 12960

cggagcttcc tatggcgcct ttggcaaggc ctgactgcct gtcagactca ctttgtcgag 13020

tggcactgca gtcggagtgg cgcaggcggc gctgtccttc tgtcagaccg gtcagtggtg 13080

cggcggagtg acggcggtca cttcggctct gccggggggc gcgcgtcagg ataaatgtgt 13140 caggccacct ttgcgttaaa tgctcctgca gggttgcttc ttagcgaagc caaggcctcg ggggggcctc gggcgagaca gaagtccctc tcgggcgaag cgtgatcgag tcactcgtat aggcctctgc agctttatgc tgatgggggt acccctaatt atggtccccg acaactataa agcttttttg tctattagag agagagtata gcaattgaga tatgttttta aagtagataa tttgttgtgc atttggattt tgaatctcaa aaaataaaaa ctgaaataaa aagataagga cccctagtcc tagccatgcc ccctcttcca caccgcacca gcatgatagc atctcgcacc ggacccacgt tcagcctctc cgcgctcgtg aatggggtcc gcgcgaccgc gcttcagttt caccacggaa cacagaagac agcaagggaa agaatagggt acgcaacgtg gcggatgttc tagcacatag tctatatatg tcactcctga ccactgcggc ccaaccacat ttaagtttgg catctcctga tgtgttgccg ctgtctccag cttgtcttcc gacgacgctt tgctgacatt gatcaacgct tttggaaacc gagcacgcag ctcagtcatg cctgaccaga ccaccttgac gaagcggcat tgtagaatac atgtaggcac aggtgaggcc cgttgatcac gcccgatgac gtgaatagag ctggaggccg gtaaagctag atctggaaag gaccaaagaa tttgaaggac gattggatat aaggttgtaa cttcaagtaa ctgcgctgct tgtcagcttg ccgtttcata atgactttgg tcataagctc tcgttccttc acaatatcaa ccaaaattcc aaaatatcgc gtacgcccca aggttgaatg tactgtggta gctgaccaac gtgaaggaca agtgtgcaca

actcggtcag tcggtgcggc gatttagtca ggcgagccgg agatgcgtcc gccgttaaaa gaggtcggct gcccttggcc gaggctaggc ggactgatcc ctgacttaat cgcacccatc taccagctga gaattaggcg tcttgagggt accccaaagg gttgttttag aagtctaggt ttagaaattt attttagtgt gtgatttctc taataataaa ataaacatct atgatggagt cttcaaaact gtattagaat ttgaaacttg aaaaacaaaa ccactgtcgg gccactatct tcagtcgagt gggtcagttg gccggcccaa cgcctggttg gtttcacagg cgaccatgcg cctatggacg gtagtcggca gacaccaatc ctcgtcgtcg tacgcatggg tcactgttag agaggaaggg caacttggag cagaagaaga tttgttattt cgttcatatc ctcagcagcc actggactgc cacaatacgg cttacacggt cttcctggtc ctcagcacgc gaggctgcat gtcttgattc ccacttgctg ccagcttctt cccctgtcct cgagcgccag cttggtccca tgcctcaacg tcctcccagg tagccagatc ctgcgcgatt aactcaccac cacggtcaat ctggataggg ccaacatctt ggggcagctg ccgtttgagc tgtgacacat gaaaaattgg acggtaagcc acggaaccca gacgatcgta aacttgtgat tggagcgtgt agcaaccgaa acccaatcac ccaccaaaaa cacgcgttca cggtcttgag ctcgatgcag atgcaattta aaccaagttt cgagctctgg ctgtggcacc ggagtgtggc catataacac ttcaaagggt ttgtaccagt attcagcaac tgacagccaa tagcaacgaa gaaaagtttc caagcattga

13200 13260 13320 13380 13440 13500 13560 13620 13680 13740 13800 13860 13920 13980 14040 14100 14160 14220 14280 14340 14400 14460 14520 14580 14640 14700 14760 14820 14880 14940 15000 15060 ttcaagcgct ctgtttgtcc atcggattgg ggatggtaag aagaggacat ggacagattg 15120

gtacccgtga tctgaaatag ttgttgccag aatgagctag taaaaattct gtcgcgatct 15180

gaaatgatgt tgacaggtaa cccgtgtagc ttgtacacat tgtcaagaaa aacacgagcc 15240

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tccacaacca ccaagatgca gttatagtga gctgaacggg gcaaaccttc aataaaatcc 153 60

aatgaaactg tatgccacgc ttgtggtgga acttccaaag gctgcaatag gccaggatat 1542 0

ttagcacgat cgggcttgga ttgctggcat accgtacaag attgaacgta ctgtagcaca 15480

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aaattgccgc ccacccagat tctatttttg tgtcgaatga ttccttgatg caaggaaaaa 15660

ggagctttgt ctgcagaatt caaaattaat tgagccagca actgtttact agtaggatcc 15720

ttgtcatagc cttccactcc ctcctgcagc caagtaggca cactgtgaga aatagcacaa 15780

cagtgactat cttcctggac ttttcgagac agtgcatctg cagctccatt atccacccct 15840

tttctgtaga caatcttata ttgcaagcca gccaatttcg tatacatttt ctgttgccag 15900

atagtatgta aacgctgctc attcagttgt gctaaactcc tgtgatctgt atagataatg 15960

aactcagcca actgaagata ggacctccat tgagcaatgg ctaaaataat ggccatgtat 16020

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cggctagacc caggaaacat cgcagttcct tagcattggt tggtactgcc caagaggata 163 80

tggcttgaat tttactagga tctgtggata ccccttgctc actgatgata tggcccaagt 16440

aagcaatatt tgtttgagca aattcacact tagataattt gactttccaa ttatcagaca 16500

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ccaagatgtc atcaaaaaaa ccagagcaca ttttctcaat actggtttca gggtttcatt 16620

cgttgcactt aagaatgtgt taggagcacc tgtcaagtca aaagccatca ctctaaactc 16680

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ttggtgatat ccagctctga gatccagttt actaaaccat ttagagtggg cgagctcatc 16800

aatcaattgg tcaaacacag gaactgggta tttgctcttg agagtgaggg cattcaaata 16860

cctatagtcc acacaaaatc gccatgtcat gtcttttttc ttgaccaaca ccatagggga 16920

agcaaaagaa ctattgcttt tctgaataac accttgatga aacatctctt gaacttgttt 16980 ttcaatttca tccttcaggg ctggaggata cctgtaaggt ctgacagaca ctggctgagc 17040

accttccacc aaaggaatag catggtcaca atccctgctt gggggcaaac cctgaggttc 17100

gtcaaagact gagctgaact gttgtagcaa tgcttgaatt gcaggatggc tgtcaggaga 17160

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ttgagcccaa tccactctca tgggactaaa ggatttaagc caatccatgc ctaccaccat 17340

gtcgtagtag ggaaggggca ggaatgaaac gtccgaagta aaactgcagt tctgaatctg 17400

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ttgcagagta gatgccatag atgtcacccc ttgcaagtgt ggtctaagtt gatcattcaa 17520

aaaggtgtgt gagctgccac tatctatcag aataagtaag ggatgattct gaatgctccc 17580

atttaatttc agagtttgtc gaccagtcga ccccgtccat gcagatttgg aaatagtcac 17640

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caccaataat gaccaaacct cctccatagc atgaagttga gcagtggcaa cacatttgtg 17760

accgggattc cacttttctg cacacttgtc acaaagaccc tttgctcgac gaaaacgtcg 17820

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agaacggcgc caacgtctcg ccgttgtggc ctcctcctgc accaacgcga gagaacaggc 18000

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atcaacaagt attgaaaatt gttctacata ctcagctacg ataccggact gatgtatgtg 18180

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acaaaattca gaccacgaca acatacgcac cctctgacca acagactgta accatgatgc 18300

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catatcaaag taattttcac aaagcgtctt ccacaactga ggattgtccc cgtcaaagtg 18420

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acgctccatg aacttggtgg cacgcttgct ctcgaggaag aggttctcca gacgcctctc 187 80

cacttctggg cgccaagtat ccacctcgga atgccccatc ttgagtgaga tgaagcgtgc 18840

ctccgcttgt tgcgccatcg cgtcgatccg ttgctcaatc gcgccgcagc gattctccag 18900 cgtcgcagcc atgcgctctt ccatctgcga caaggcctct agaaccttct gcatcgcgga 18960

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ctttgttatt tcgttcatat cctcagcagc ctagcacata gtctatatat gtcactcctg 19200

aactggactg ccacaatacg gcttacacgg cccactgcgg cccaaccaca tttaagtttg 19260

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ggtcttgatt cccacttgct gccagcttct tcttgtcttc cgacgacgct ctgctgacag 19380

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acccgccttg gactcgtcca ctgcccctat ataaacggtc gccccccgcc ctcgatcaat 19560

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cgcacgccat cgtaattcag ccacacctac gcttttgcct tgctttcggt aggaggtttg 19680

agggtttcgc cgtcgtacgt gggagctgct ggatgtttcg ttaggtgagg gaatctactg 19740

gaggcaggca ctgcgtgccg aggatcaccg ttgcatccca agccaccgtt cgacgtcgcc 19800

gactctcgcc ctcaatttag ttaccgacga ggaccccttg actgtttcgt ttgcttctca 19860

ctcgtaccta ggcacgagta gcgctttaga tcggttttgg ggcactcgga ttgctcgccg 19920

gtgttcagag attaccacag agtcacgctg tgctgagcgc gaggctcgac gctgcatgat 19980

cattgatcag accttgtccg tgttgtcttc attgaccaca gcttcgcata ccaccatttg 20040

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gttaactgct attttcatca tttttgctgg tggaagatgt ggttgagctt gctttacagt 22740 attttggttt tgttagcttg tgttgcatct ctctctctac atttattatg tgttgatttt 22800

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tcagttctgt tcctaatgct tacacatggg tttgtgctac aagtatagta ttagtattac 23340

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tattagtatt agtattacag ctcattgtgt ttatatagga gttttaatct gttctatttc 23460

tgttcctaag tgtcttctga cttttctttt tggcagcgcg ctaggctcgt cctccagctc 23520

ctgttcgtga tggtggtggt ggctccattc ttggaggaat tgggtccacc attgcttaag 23580

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tcagaagctg ctgctgctgc ccctcctgct ccagtgatga acgctaatgc ttgcagcatc 23820

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tcggccggtc ctgtatgtag gccaccagca tcggccagtt ggtacatcca gccggggtca 26580 ggtcactttt acttgtcagg gacagatacc atgagccgaa aaggcactac tttccctcct atatataaaa ctcctgctat cctgcacacc cacttccacc cctccgtaaa agtcgtttag taaaaagaaa ggaaccaaac atagcagttt gacggattaa gctgctgcga ccttgtccgg aacaacaaac gacagacaga agtatgtggt tccgggtggc ttgtcggacc aactcgatca gccgtcgggt ccgcccagcg ggaagtgtag ctgcctggca tcgggaacac tacgatattg gtacgagtac gctctcggac

actcgtctca tcggttgaga ccgacggtaa gatgcaagca gagaatgaac tttttttatt aacaaacaat agcgccacac ttgctccaca tggcagtcct aatcagctcc tttgagtcca agaagtggat caacgaacaa ctgtacaact cctaggcatc cgactggagc ctgccgcacg aaaacaagga gagacaaacg tgtggcggag cctggacgcc gcgccagcgc ccggcatgtg ggatgcagct cccggcacag tagccacagg tcggcgcccc gccaagtaat ggaacctcct gacgacggaa cacagggaca

atcagacaat cttgtatttt gcggacagcg gcatatgcaa tggtgccacg aatgcttcgg atgacggatt cttgctgctg gctccttgtc gccaacaaca aacgacagat caaatgagcc gcaaaggcac ttttttccct cttgagttct caatgccccc cttcccttga tcgaagctcg cagatatttt aacactcggc gaggcggtcg catggcgcgg ctcggcgccg cacgggcagc caccccgatg gatctgcgtg agtttagagg accaccgaca tgattcatgt aggattccac gacttcgcgg gcgacagtgt

caccgtccac tttttgtcct ctgtcgtagt cgtgtgttac gaaagatgga acgacgatag aacctaggca cgacgactgg cggctgccgc aacaaaacaa accccgacgg gaagatgaaa tacgagaatg cctttttttt gaagcacata caatttcctc ggaagcccct tcttggccac ttttccatgt acgctgtcgt gcgatgctca ccgccgaggc gggggcagct ttcagcggcg tcccagccct ccgcaatcaa tacgtgtgcg gggccgatgg gcacacagac tgctaaacaa ccacaagagc aagagctctt

caacgaacgc ccgtaaaaat cgttttgttt aaagaaaaga accaaaccaa cagtttctgt tccaatgccc agccttccct acgtcgaagc ggacagatat taagcggaca gcagcatatg aactggtgcc tattaatgct taataaaaaa ctgctatagc gcacaccttg ttccacctgg cacagacaga tactattatg tgaggacgtc ggaacatctc cccacacctc cgaacagccg tggccgaccg acagcttcag taacgtggac acgcaactaa tgtccccctt ttggtgtctc aatccaaatc tgaagttgcg

caacgttgtc cagttccaac gagtccacaa agtggatgca cgaactattt acaactcttg ccccaatttc tgaggaagcc tcgtcttggc ttttttttgt gcgctgtcgt caaggtgtgt acggaaagat tcggacgaag caaacaatat gccacacctt ctccacagct cagtcctgcc cagacagaca attaattacc cttgctgtac gacgcgggtc gtcctggtgg cgccgccgcc ccccgtgcgc gagttaagac gcgtgcaagt aacgttttct ctgtttgtag ctgttcctgc caaggctctg agtgttatta

26640 26700 26760 26820 26880 26940 27000 27060 27120 27180 27240 27300 27360 27420 27480 27540 27600 27660 27720 27780 27840 27900 27960 28020 28080 28140 28200 28260 28320 28380 28440 28500 acatagaacc aagtaataat taggagaaga ggtcagtacg tcctcacgcg tcgaggcacg 28560

tctctgacaa aagcgtggtt cgcgcgggcg attgcgtgcg cttgggcttg ggcgctaccc 28620

gcacgccctt gggcgtgatc tgatcccctg agctgctggg ttggtacgct agtagcatcg 2 8680

tcatcccaaa agcaatctcg ctcggcaggc gagatgcgtc acgccatttg cgttcttcgt 28740

cctcctcctc cttcccgggg gatttgattt taaaatttgc aggcgcggtt tacgcgccac 28800

tttgaggcaa acaaaccggc gaaccggaat aggggaaccg ctcgctcctc taagccaggg 28860

caggggcgca gggctctgtg actgtgagcc aaacgtccgg ccacagacgc agcgggccgt 28920

aggagatcct gcagaacaga tacccactcc acttgtctgt gtgccaacaa caacagcaac 28980

ccagctgcca cggccacgtc acaccacgtg aatcagcgat gtcagcctcg agccttaacc 29040

ctttgtttga gagatgctgc cgtgtcttaa acctagatta gcgtggagtt tgtagtcact 29100

aatccatcca atcagtcccg tgtccgtctg tttgcttcga cccgaatcaa accaggggcc 29160

tctgcttcta tgaactgaac tggcatggac tgaaacaaaa cagcgtcatg gcagaagcaa 29220

gagctctata ttgtgcgctc taaatggaga ttggtaaaac tcgtagaatt gggggttcgt 29280

ttcttccgtc aaactctaac tgtgggcttg atgctagcac tgagtcacct ttgtcattct 29340

ctggggaaaa aaaataaggc atctttccgt ccccattgct actgctcacc aattaagcag 29400

ccagtaccgt ttgtactagt caaaatgcat caagaacgac cacgggtcgc cgtaaaaaaa 29460

aagaaagaaa ataatagaaa agaaaaggtg cgccgggtgg acgggaaggc gctaggctag 2 952 0

aagagcggca gccccaccag gtggtgcccg cagcgtcccg cggtcccgtg attcaccagc 29580

gacgacggag aaacccagct acgcgcggaa gggactagac gagaaccaac cgcaccgcac 29640

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gagcgcgagg atccagggct cgtcgccgtg cgcgtcggcg cagctcccgg agatgacgaa 29820

cccgtcgaac ccggctgcct cggcgtcggc ggggagctcc ccgcggacgg cgctgtacac 29880

ccgccacctc tcgccgtcct cctccagcag cgcgcggaag acggcgaagt agccgccgta 29940

cttctgccgc acgtactccg agtcctcgcc gcactgcagc accgcgtacg agcccgcccg 30000

cgagggggcg gcggcggcgg cggcggcggc ctccagcgcg gccgacgcgg cgttgtcgag 30060

cggccccatt cccatggctg gcggcgtcgc ggccaggcag gcgcgtctcc ggcccgggaa 30120

tggaggcggg ggttgggcgt cgcttggctt ggctgactcg cttgcggggg gtgagaggtg 30180

gcggggagga tggggggaga acggcgaggc gaggcgaggg cgatatttaa agtaagcacg 3 0240

agcggttttc cctcggattt tttttatttt ttcgtcgctg gttttccatt ttgctattat 30300

agtactgttt ctgttttttt ttactggtac tggggctggc cgctaccggc ctaccgctaa 30360

catttggtat ggacgtatgg catggcaacg gccagcaggc gcgggacggg ggctaccggc 30420 gagcggcggt tttgctcggg tccccttcac tgctcgggtc tttggccggg tcctagtaat 30480

gggtacccaa aatcgggtat ccgatagata aaaatcctat tagagcatgg atgtagcgaa 30540

ttttaatatc tatggatatt ttattaggtc atttattaaa tttcactcgc tcatgcatac 30600

aatatactta acaagcaaag aagacaaacg tggacccctt aatctcacct ttaaaacata 30660

tattgataaa agagtttttt tttctagacc gatcttgtca aatactgtat ctacctgcct 30720

gataaaagat tcaaacagga agagcaaaag cgtatatcaa attaattgac acgggagtcc 30780

atttctgtgc tcagagtaag cgagccctac aattgcaaaa aaaagggggg gggggggggt 30840

atgcatatgt aatatctgat gtcatttata tatagtgcaa cgattctctt tcgtaccaag 30900

ttgcaagtcc tcatatcgaa tcgtaagtta ttctgttttc ctgtgtacat atgaacatat 30960

ctatctttta atacaaacag cattttttat agttttttct aagtacatat gaacatatat 31020

ctatcttcta atacaaacaa catatttttt gtatagtttt tgttatgatc atatgttttc 31080

ccatgctacc gtttgtatta aaacacggaa actaaactac actaatttat tttattcata 31140

tttctttctt taaaaaaatg ttttttatcg ttccatcctc tctatttcaa accgtaagct 31200

gttctggctt tttttttcta aatgcgtatt ttagttatat ttctagatat aattagagtg 31260

tacataaaca cataaaaacc cacttactaa aatcacaaca acttacagca atttaaaacc 31320

gtgagattgc cgagcagggc gagaaccgac tgttagacat gctcacatgc atgtctgggg 313 80

cattgtttga ttttatttgc ccgagaaatt gctctgtttt cattcgtaga atttgtacta 31440

gtattttctt accgaggctg gctgggcata cgtgcacgcg cgcgatcgtg cagcgacatg 31500

cacatgcaat gcaatcaccg cgtgacggag taccgaggcg aggtcgtcga ccacgtgccg 31560

tatgggccgc tggcacgtga caccaccgat tcggatcctt atttattcat tcatttgtca 31620

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tttactgtcc gaaacgcctt gtgcaactag ctaggctagg aggctaactc attagtaaaa 31740

tgttgtgttt tccacccttc ctttgtacta attttataga ctattagccc ggacgagctg 31800

gctaggccag acagggaaat tatattttac tttgacgcct catctggatc attggaattg 31860

aattccattc taacaatatt aatttaggta tatatcaatt aagctaatcc ggttttatgc 31920

aaaatatatt tatatactat tattagcaag atgtcggaga tatttatgtg ctacattttt 31980

actataaagg agtgaaacga agagtgtcat gtaaattaca gactagaaac gaattctact 32040

aatgcataaa atcatttcac acactccacc ccatgaattt gagatagcct tatatctgaa 32100

ctttggaaag tggtggaatg tcaaattcca aactaaataa gttattttat tgagtgaatt 32160

ccaattcctc taaaatgaag ggatccaaat gccccgtgac tggaatttgg agacgaagcg 3222 0

cgcgcagaat attcgggtca aatagaatca gctacatact atgtgcatta gggctcacat 32280

aaataatcca tatcttgagg agtatcaaga gagtaagtgt aaaaaaaata caagagacat 32340 atcttgatga agagatgtat ctagctcagt tctctaagtc tagatacagt ttcgtccata 32400

caacccacat aaatgagtta tatcatgaga gattctagtg aataagatat atgattatat 32460

acaaaaatag tttcttatat gtttttttgt attttgaaaa ccgaactgga gtcttaaggt 32520

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ttctacattg tacatgccct tagggatgtt accaattttg gtagtgaaac gcaataatga 32 640

attaagcaat aattcaagcg gatcagaatt aaatgagacg tgtggtgtag actgtagaga 32700

gtactctacg atatgtagtg ggatacttgg agcagtaatt attactaaac atgaggtgta 32760

gtaaacattg acgggataac gctgcacatt aaatactagt atcagtaaac gatgcaatat 32820

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tattaaaact gaacgttacc gttttttgtt agtagtgata aagatcgatt aaggtaactc 32940

cagcaacgtt ggatgtgtat aacactgttt tgtattgtag atgtactctt tttatataag 33000

gagaagttta aaatagaaat tacgataacg taaagtgggt ttttaccggc taaatttgaa 33060

cgttttccct ttccttccct ggtcctgtac ttgcagtatt gcactgtcgc ctgtcggttc 33120

atcgatcgga acgacgacgt cgtcgcgcgc ggcactatgg gcactagtac tttggtggca 33180

gtggcacacg ttcgtagtgt gtgtcacttt ggtgtctgga gcctgctgga gcaagacagc 33240

aagtcaggct gaggccggct actcagctgg gcgagtgggt gttgctgcga gctttggcgg 33300

atatcagggt atgcatatat ggcaacggct ccaaaaacgc gctgctgcga ctgcgatgcc 33360

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ggaccctaac acgggctggg tgaagctgaa gaggacctaa tttttggtag ttttgtttga 33540

ctgaattatt ggtagttaag ctagattagt cctacttttg ggccggggct ggctttctgg 33600

cctagctcaa cacataattg tttttttttc tccatacgga cggcgtacat gcgttcaaat 33660

tttaaacctt gaccttttac ttttattcac gtacggtgta ctgaacccgc cgtagtccgg 33720

tagaaaaaag tttaaaaatg agagacacga cctcatgtta accgtcaccc gtgcatcatc 33780

gatggacgta cgttgacagc atcacaacga ctacaaaaat atcaaataat gcatgttaat 33840

ctgattctta gtatagcctt tcggtgtcgg caaattgcaa tgccgtgtgc cactatgttc 33900

attctcaaaa aaactgacca attgacgccg gactaatgct ggatcaacaa cgaccgcaca 33960

agtcgtgata gtaacggtct agctagtttt cacttttcag agattaattt agagacagct 34020

agctagctca ttagttagtt agcaaattag ctagttattt gttagttagc taatttcact 34080

aatatttttt agccaactaa ctatatatat cttcagtgca ttcaaacagt ccctatataa 34140

tctagattaa tttagttgta gctatttggc atcctagatt aatggaactc agattttcat 34200

cattagacaa cactgtccac ggtcgtattt cttcattatt tatgatactg tagcagtttg 34260 taggtacata aaaacgttga acatgttcaa acacattaaa aataaatatt tcatacacat 34320

tttgtgccca tatcatacta catttgaaat taaattacat tcttctcgca aataatacat 34380

tgacaatttt atctagaaaa gtattcgcgg ttccctcttc atctcccaat ccggtatcgt 34440

gatgacttga tggtatttaa tcgttgtcgt cttcatcaca tcaatcaaat agttcttccc 34500

gtatatgtta ctacctcaaa tgaaaaaatt attccttcaa cattggataa cttggtaagt 34560

ccaataaaat tatgaatttc atcttcgaga cagcgaaaga ttgctcaata tgataagtgc 34620

aattggttga atacatctca tcatcacatg tcagtcaatt aattagtcga tcaacgatga 34680

aaattaagcc ctgaggttca ccgtgctaca aaacgacatg attgtgtgta cagttttcgt 34740

actatttaag ttttacctcc ttcctatatg aaacataatt cctcaacgat tgtttgcttc 34800

ggattaaagc ggactattta gattggtgta ggtgtaatct ataaaaacaa aagtactata 34860

gaaccagtag aaaccggtat agattaaagt caagggaacg actgaaagtc cacaaagcta 34920

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gtctgaaaat tcccttccca gcaaataaag agaaactagc aaattgttca tatatgctac 35040

ggttctattt atacttatgt atagaatata aaatataaag atatgagtgt attgttagtt 35100

atgtggatat gaatgtgagt ttagagctaa taatcatagt tcgaatctct atttgtatat 35160

aattttagca tttttataat ttaaatgtga ggtatacgat gaaaatcata aaactaggaa 35220

aattagtgtt ttaatatagt acagatatta ttctctgaac caaagacaca caccagaata 35280

caactcacat atgcattgca cgtgtgaagc tccgacacac agggcgcaac aactcagctg 35340

ctttctttac gtgatcagat tgctagagta cttcacaaag ggacgccgag agagtatcgt 35400

tcaccaacct ggcagtggca gttgccgcat tgtactagtg tacaaaagcc cagctgaacg 35460

gtgatcagtg gcctcccaat gccattctgt gtaggcgatc acagatctat caacaccacc 35520

aaacccaagc cagcacactg caaaacacca aaaggattga agcaagctgc caaatggcac 35580

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tggccgtggc acgttggccg ctcgaggcaa caacttctat attggcatag ccagaatgat 35760

aatattgttg tacaactcag ttagagatcg agtcgcacga tcatgctcgc actctctgat 35820

tagggacgta acaatctgtt ggttaataag ttctcctttc ataccacata ataaatagtc 35880

aaagaaccga tacgcgaacc aacattcata ccgagattcg atctaatatc taccggccat 3 5940

cttttcgact ccccgaacca tagccggagt ggccatgggc atttctccgc ccttgatcag 36000

catggcatct ccttccaatt ctggaggtac aaatctatgt tctatgattt ctaatggcta 36060

ggattacgag tcgaggtctt aaaatctaat agtggtatca aagccatggt tttaggctcg 36120

ggctctaact ataaatgaca gttttcctta agttttatga caaaatccga gaaaaacacc 36180 tcttaactct ctctaaccca cacccaagca tcgaagacct tttgttaaat aatctagttt catttggtat gcttgacaaa cacttgtaca caaaataggc ttagaaaatt taataacatc accactcaat atagaatgga ctaaaattag agcaaattag actattgagt gctaattaca tctgaggtga gcaactctac tcatagttag aaaaaagata tttttttatt aacatgtggt gaaccctcat tcatgtttta atcctcaaat gtcccagtta tggctatccc tgttgttgaa acaaaaggcc aatgtttcgc

ttgtattcgt acatttccac cacaaagaaa agcctacaca atttttaaat catttacgat gaatcatgat cgaggatggt cgagcacaaa tattgggagt agtatatttg ctacattatt tggataccta actaggtaac ctgaagacat ctaatactcc gtcaaataaa ctaacaatgt tgacctgcat atgcagccat ttgtccgtgt tttatttaaa tttaaattat atactggtta aggctgcgtt agggtgtgtt aaggttgttt tccctcgaaa tatgtgtacc agggttgcaa aaacctgtga atgtctgtaa

gttcctactc ctttcccaaa gggaaagcag cacatctgtg tacgttaact aaagttcaat cggttgtttt gaattcattt ctcgatggca gacaaacaac gatatctcat tttagggcct attagttgtt taagggggtg ccaaacactt ctccgatttt taaaaatgga ttagccaact gtggtatgac cgtcctagag gtgctagggt cacgatctaa ttgtatatat gagactcttt ggacgcacgg tggttgtaat agtttagggt ttagagagac gcaaccaaac ccttaactac agatttactg accgaagaaa

acgtagaaca ctctaatcct acgttaggaa aaactgtatt cgtcttttct aatcattatc tctctaaatg tttacgcatc tgtaagtgat tcctcaagtc ttaaaaaccc gttttgggaa gactaatctt ttggattaca tagctaatag tttatttgac ggtagtagtt aactattagt ttaagtcact ttaattggtc ttctttatac actcatagat atttacaata gttttgtctc ccgcgagagt gatgggaatg caagggttgg gagaggggac gcaccataaa agcactaacc ttgtattaca aatagttggt

agcaaaaggg aaggcagtcc agcagccatg aaattgttaa agttattact cttctcttga tttgggtgag tcatattatt tttagggtgt taaggactaa attgaagctt ctagagatgt gattagttgg ctagagataa ttaaactatt gtttgttagt aggtagacat tctagtgcat tggcctcatt actagttagt catatagata tctcatatcg tcaattctta tcactgagtg tagacgatcc agacagaatg aacaagactg gcgaggaaac ttaatgatga gccttatcca taattacaag tccaaacatc

gagaaagaaa ataatctgag tgctatatat atatttttag tatagcttca ttactatttt taatctttag taaagtgcat gattgacaca ataagaatat gatttttggt tctaagggct atgacagaaa tagttagctg agctattttt gaaaatctga ttgttaggta taaaacatcc agcctaattt tgctaactgg ggctttatcg cacaattata ggcacaaatg agcaggattt acgataaaac aaatgtgatg tcccagtatt gtctctgacc tgatgcttat aggatcaaac attaccctgg ccaggtacta

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tatttctaag cctctaacca tttttgcatt ctatgcagtg tcacctcatc agagagttaa 38220

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tcccctattt catacttatc tctacaaaca gtgttatata tagttccacg tcatatattt 40680

tccactctac tagaaacatg tttgattcgc ccctgactgt gccacaattt acaatttatc 40740

taaggttagt aaaaaaaagt tagataaagt atgataagat ggcgaactaa atatacccta 40800

gcgacacaac agcttggaac aacttcaacc agccctagtt agccactcgt agcttcatgg 40860

taaagatttt ggataatttt ttacaagttt acacacttca tcacgacaaa gattgtgaat 40920

gctggatgtt tttggatttt gacaccttta cacacttcat aacgtgtgcc atctattaga 40980

ggagaaacga gaactgcacg cagcaacgca ccaggctaat aagtgacaac cgaacaagga 41040

aaggcgggaa gggggcaacc tggaaaatag agagcagagc agaactttat tcctcctctc 41100

aggaagtgtc cttgtcactc taaacgctaa cagccgaagg aaagaaggct gagagtgaga 41160

tttggagcca caaaaagata accggcatac tcagaactac atgggtccaa atttgagatg 41220

gtattcaaat tttagatggc aaggtctctt aggcacagct cattcgtctc ccattgcaag 41280

ttctagcgcg taatcatctc tttcctgaaa aacaaggagt ccattttatc tcagtgaagt 41340

gtctaataac ctataatcac actttgcaga tcagaaagta ttgttactca ccactggccc 41400

tcgtgcaaag tatctcccga attggagcca atatacctgc aaattgacaa acaacatgct 41460

ttgaagagcg aatttcctac tacatataga gctagatatt aattaatttc aaaaggtgtt 41520

ttagactacg tgcttgcctc atcttcatct tgagtctcga cttcaacatc gccagatggg 41580

aaaccaacac acaacaaagc atagccctga aaaggaaacc atacaataga actctaaaat 41640

ccttaagtac catacttgat aggcaacatc ggacaatgct cctttccact ttagctatga 41700

atttggattt atccgaattt atagctaagt gtctactatt ttaggacgaa gatagtactt 41760

tataattggt agctaatttg tattgatgaa catttctatg ttgcttggcc aagaataact 41820

gatcaataaa aaaatctatt gtcatatctg taacacaaaa aatacaaaat aaattgtggg 41880

tcacattgca atcataatcc ttccttaaaa gtcgacataa tagttatgca tcaaactcta 41940 gcaattgccc aggaacattc aggaaattgt acaaactagg taactgacta aactggagga 42000

caggttaaga gtgaaataca acctctcatt tccagaccat gtacacaggg aacaataata 42060

tgtcatgggc acaatactcc aatcgtgctt caactagtgg aagaaaaaat ggatgtacct 42120

tatcttttag ttctgcagat atcccaagtg cttcaggctg ccttatctgt cctgatttta 42180

ttcggactgc acagcttgtg cagcaacctg attaccaaaa tgagttttca attgttatat 42240

agaccacacg gaacaatcaa ataagagatg ctatccaatc aaaaggtatt catagttaaa 42300

taatatatca aaagccaatg gcatgggtag tttttttttt aatttatagt tgctataagt 42360

atttgacaaa tagaaagagt cccaaatgag tccaacatgg ttctgactac atattccaaa 42420

atcaaaacca acatcacact cccacacgat actatctata tcaacataaa ggaggatgag 42480

aaatagccaa cattcagttt gcacatattg gagcagctag tggtggagct tggccataaa 42 540

aagaggacgg accattatga tatgaagtgt aaagagaagg gagacagatt agtatttcat 42600

cagttccgcc actcaagaca gggcttcatc aggctctatt tgtaacaaat gaagacggtt 42660

caagctgaag ggtgacattc atgcttagca cttagtgtag ctgctactaa ctaggcatgc 42720

ataatgagtc gcccaatagc ttactgtcat gtacggccgc acttacaggc gccgtcgtga 42780

cgccaggagg gctgcagatc gcgcagccaa ggcaggcgcc acaatcagtg gctaagttta 42840

gaaagataag gattagtttc cctcttgcat gccttaatca taggagggat tggttacgat 42 900

tagtttcctt ttcatatgcc ttaataatag gagagattgg ttaagattag tttccttttc 42960

atatgcctta atcataggaa aggttggttg aaccagaggc tatatatatg ccgtgtaata 43020

ggctgggaaa taatcaagca agatcaatta tccaaaactg ctcttctcct ttgcctctct 43080

caagccaccg gtgaggaatc cctcacggtg aaggtctaga gcgcgactac gaactgcgta 43140

gccgcggtcc agcgacgttg ggcgtcgagg cgcttgacaa cctggtatca gcgtcacgtc 43200

gatcctcacc cacccgctct tgccctccac catccccttc cacgcccacc acctccaccg 43260

accactccat caccatggct gagcccacca tcaaggacct catggagctg atgcagtctt 43320

tccaaaccga gttggctgcc gtgaaagcca ccatgaagga caagtcgtcc tcgtcgtcca 43380

ccgacggcgg cggcgagcgc gaggatcccc ctcgtgtgga tcggcccccc aggttccaga 43440

agctcgactt tccccggttc gatggcacca ccgacccgat gctcttcatc aacaaatgtg 43500

aatcctattt tcgccaacag cgcaccatgg cggaggaacg cgtgtggatg gcctcttata 43560

atctggagga cgtcgcgcag ctgtggttca tccagctgca ggacgacgag ggcacaccat 43620

cctgggggcg gttcaaggac ctcctcaatc ttcgcttcgg gccaccactc tgctcagcgc 43680

ccctgttcga gttggcggag tgtcgccgca ccgggaccgt ggaggaatac tccaaccggt 43740

tccaggccct gctgccgcgc gcgggtcgcc tcacggaggg ccagcgtgtc caactctaca 43800

caggcggtct ccttccccca ttgagccacg ttgttcgcat ccacaacccg gagacacttg 43860 atggggccat gagtctcgcc cgtcaagccg agcagctgga gttggcacgg ggaccgccac 43920 cggccgccag gggagcccct cgctctcttc ccccagcgcc ggcgcccaag cagccgctgc 43980 tcgccctccc tgcaccaccc gcgggcgcgc cccagccgcg accagagggt ccgcccttga 44040 agcggctatc accggaggaa caggcggaac ggcgccgcct cggcctctgc ttcaactgca 44100 atgagccgta caaccgcggc cacaaccgtg tctgccgccg catcttctac ctccatggcg 44160 tcgagctcac ggccgctgcc gaggaactcg taggggacga cccgcaggac ggcgcccctg 44220 tcttctccct cagggcagtc actggcatgc ccatctgcaa ttccatgcag gtgcgggcca 44280 ccctaggcgc caccaccctc ctcgcgctcc tggacaccgg ctccacgcat aacttcattg 44340 gggaggatgc cgcccgccgc accggcctgc cgatccagcc gcacctcacg gccactgtgg 44400 ccaacggtga acgtgtcacc tgcccaggag tcattcgccg cgcccaggtc atcatcgagg 44460 gcgagccatt cttcatcgac ctcttcgtca tgccgctcgc agggtacgac ctcgtcctag 44520 ggactcaatg gatggtcacc cttggtcgca tggtgtggga cttcgtcgac cgctccgtct 44580 ccttcctgca ccaaggtcgc caggtctcct ggtcggacgt cgccgaccgt cagcatcccc 44640 tgctcgccgc taccacgaca ccgagcgccc tccttgagga gctcttgcac tccttcgacg 44700 gggtgtttgc tgagccggcg ggtctgcccc cacagcgagc tcgggaccac gccatcgtcc 44760 tcaagccagg ctctacacct gtggcggtcc ggccgtaccg ctacccggtg gcgcacaagg 44820 atgagttgga gcggcaatgt gccgccatgt tgacccaagg catcgtacac cgcagtgact 44880 cggcgttctc ctcaccggtt ctgctggtca agaagcacga cggggcttgg cggttttgcg 44940 tggactaccg cgcccttaat gccctcaccg tcaaagacgc cttccccatc cccatcgtcg 45000 acgagctcct tgacgagctg catggtgcgc agttcttcac gaagctggac cttcgctccg 45060 gtgatagtcg cctagagggg gggtgaatag ggcgaaactg aaatttacaa atataaacac 45120 aactacaaga cggggttagc gttaggaata agaaacgagt ccgcaagaga gggcgcaaaa 45180 caaatcccaa gcgaataagc aagtgagaca cggagatttg ttttaccgag gttcggttct 45240 ctcaaaccta ctccccgttg aggaggccac aaaggcctgg tctctttcaa cccttccctc 45300 tctcaaacga tccacggatc gagtgagctt tctcttctca atcacttgga acacaaagtt 45360 cccacaagga ccaccacaag attggtgttt cttgccttaa ttacaagtga gtttgattgc 45420 aaagaaggat caagaaagaa gaaagcaatc caagcgcaag agctcgaaag aacacgagta 45480 aatcactctc tctagtcact atggcgttgt gtggaatttg gagaggattt gatctctttg 45540 gcgtgtctag aattgaatgc tagagctctt gtagtagttg ggaagtggaa aacttggatg 45600 caatgaatgg tggggtggtt ggggtattta tagcctcaac caccaaaagt ggccgttgga 45660 aggctgtctg ttcgatggcg caccggacag tccggtgcac accggacagt ccggtgcccc 45720 ctgccacgtc atcactgtcg ttggattctg accgttggag cttctgactt gtgggcccgc 45780 ctgggtgtcc ggtgcacacc tttctgactc ctgcgcgcgc gagaagaccg ttgctccgga ttggggtttc ccgaagctgg gtccggtgta caccggacag aggtggcgag tttgagtctg ggggtgcctt cggttgcccc gctgagtgtg aaccttttac attatttgtg ttgggcaatt tccctttcaa tctccccctt agtgcataat tgaactagtt tgtaaatact tacaagatat cttgcaccac atgttttgtt gcaaatggtc aaaggtaaat ctccccctgt ttcaaatgct cctcttagtg ttcaagaggg ttgaacacaa taggatacca ggttgtggtg cggtcctttt ccaaaaacgg aatcattaga tgagttaaga ttataccaaa cccaaagaca aggtccttta ttgtctttca ccgaagactc acttgaaaac acattagtca atctagcaaa agaagttgcg gtttgttcat caagaggctt gaaatctcga tatccccctt tgcttagtgc ggctatgctc catagcaaag ggactttggt agcaattgcg cgcaacaatg accgaatttt gcttctttga cctgatgtgc tcttcctatt aaatcaaatg tggatccccg

ggacaggtac tgtttgctgt agagcgcgca ttaaatgcgc gacgcaccgg acagtccggt cgagttcctg aggccgacct tccggtgaat tatagcgcga agtccccctg gtgcaccgga tttgctcttt tgttgaatcc acctgtgtaa tctatacact caaccaccaa aattaattag tttggtgatt gatgccaaca tgcataatgt aagagtaaag gcagggattg tttctttctt tttgcaaatt ctttttgtaa gaataagagt ttgcaaagca tttcctttga ctaaacaaaa ttttgatata tcatttttga attgataaat actcttggaa tgctttgggc tcatactttc gcctatcgaa gtactatcgt gacgaaatcc ggtcttttag ttggagcgat ggcgaaggat caattccctt tcaatatacc tagcatatat gattaaaagt tgaatcaaga atattgagct ggtaaagata tcggctaatt ttgttggtga tccctaagaa gacgggattg tcggtcattt taatttgtaa ccgtagtccc acctgcggca atgtactcag agcccaagac accaaagatc aattttgcac cccgcccaat agggtaccaa agtccaaact

ccggtgtgcc agcatgggcg ggcagagagc cgttggcgcg gaattatagt ggactagccg cctttggcgc accggacact gtgcctctgg aaattcccga cagtccggtg cgccagacca aaaactgggt ctttttattg tgggcaaact agttagtcca ggactaggtg taagcctaat caaaccaaag caaatataga gttgcttgga attgagccaa atatattatt ttggaccacg atccatttca aagatctttt ttttcaagat ttgaaatttt ctccccctaa aagagatcct aatactactt tctccccctt aacactaagt ttttgaaatt tccccctttg gcatgaatcg cccctttggt cataagtaaa ctttgggttc ttactctctc gagttaccga gtggaagcct tatgacttgg tttgaaatag ataaatgagc tatgtgtgca catgcctaag tttggtaaaa gatctttagt gttaatgtaa aatgataccg aatggctatg tgattgcact ctcattatca gcagggtttg cctcatccaa cttcggcggt ggaaagagcg ttcccaagaa ctggcaagtc cggcatccga ataaccaatc taggagtata agccaaatat

45840 45900 45960 46020 46080 46140 46200 46260 46320 46380 46440 46500 46560 46620 46680 46740 46800 46860 46920 46980 47040 47100 47160 47220 47280 47340 47400 47460 47520 47580 47640 47700 ctcaagattc gttttacggc cgtaaggtgg gattccttag ggtcggattg gaatcttgca 47760

cacatgcata cggaaagcat aatgtccggt cgagaagcac ataaatagag taaagaacct 47820

atcatcgacc ggtatacctt ttgatccacg gacttacctc ccgtgtcgag gtcgagatgc 47880

ccattggttc ccatgggtgt cttgatgggc ttggcatcct tcattccaaa cttgcttaga 47940

atatcttgag tatactttgt ttggctaagg aaggtgccct cttggagttg tttgacttgg 48000

aatcctagaa aatacttcaa ctcccccatc atagacatct cgaatttctg tgtcatgatc 48060

ctactaaact cttcacatgt agactcgtta gtagacccaa atataatatc atcaacataa 48120

atttggcata caaacaagtc attttcaaga gttttagtaa agagtgtagg atcggccttg 48180

ccgactttga agtcattagc aataaggaaa tctctaaggc attcatacca tgctcttggg 48240

ggcttgcttg agcccataaa gcgcctttga gagcctatag acatggttag ggtactcact 48300

atcttcaaag ccgggaggtt gctcaacata gacctcttcc ttgattggtc cgttgaggaa 48360

ggcacttttc acgtccattt gataaagctt aaagccatgg taagtagcat aggctaataa 48420

tattcgtatt gactcaagcc tagctacggg tgcataggtt tcaccgaaat ccaaaccttc 48480

gacttgggag tatcccttgg ccacaagtcg tgctttgttc cttgtcacca caccatgctc 48540

atcttgcttg ttgcggaaga cccatttggt ccctacaaca ttttgggtta ggacgtggaa 48600

ccaaatgcca tacctcattc ctcgtgaaat tgttgagctc ctcttgcatc gcccaccacc 48660

caatccgaat ctgaagtgct tcctctatcc tatgtggctc aatagaggaa acaaaagagt 48720

aatgctcaca aaaatgggca acacgagatc gagtagttac ccccttatga atgtcgccga 48780

ggatggtgtc gacggggtga tctcgttgta ttgcttggtg gactcttggg tgtggcggtc 48840

ttggttcttc ctcatgctcc ttctcttgat catttgcatc tcccccttga tcattgtcat 48900

tatcttgagg tggctcatct tcttgatttt gcccttcatc aacttgagcc tcatcctcat 48960

tttgagttgg tggagatgct tgcgtggtgg aggatgattg atcttgtgca cttggaggct 49020

cttcggattc cttaggacac acatccccaa tggacatgtt ccttagcgct atgcatggag 49080

cctcttcatt acctatctca tcaagatcaa cttgctgtac ttgagagccg ttagtctcat 49140

caaacacaac gtcacatgag acttcaacta gtccagtgga cttgttaaag accctatatg 49200

cccttgtgtt tgagtcataa ccaagtaaaa agccttctac agttttagga gcaaatttag 49260

attttctacc tcttttaaca agaataaagc atttgctacc aaaaactcta aagtatgaaa 49320

tgttgggctt tttaccggtt aggagttcat atgatgtctt cttgaggatt cggtgaagat 49380

ataaccggtt gatggcgtag caggcggtgt tgaccgctgc ggcccaaaac cggtccggtg 49440

tcttgtactc atcaagcatg gttcttgcca tgtccaatag agttcgattc ttcctctcca 49500

ctacaccatt ttgttgaggg gtgtagggag aagagaactc atgcttgatg ccctcctcct 49560

caagaaagcc ttcaatttgt gagttcttga actccgtccc gttgtcgctt cttattttct 49620 tgatccttaa gccgaactca ttttgagccc tttgagattt ttcctgtaaa aagaataccc ctagacagta cttactcccg ccgatgctta gtaggagctc cagtggcctg tcggtcgtca cttgcttccc cgcctgacat gcgctacaaa atcctaaaat gtgttctccc tttagaagct gtcggcggtg ccagagccaa cccatgttag ctctatcaaa atctactaag tatagctgac cattacttct tctaaagaca gtgacaccta gacataattg agaaacagaa agcaagttgt aatagaatgg tcaggagata tagcaatttt atccccgaat gtgatagctc gttggggatc tttctcccca gtcatatggt ttgtgcaccc tgcataaacc tacaaaacaa atttagttct ctttggcatt agaaacaaga actttgggta tgcccccaac aaacttggca actactttgc caaaagtttt aaatgaaata gcatgatcat acttagcacg ggttggttgc ctagaactag tagggccaga gtgagacttc ctagaatgag cagggtacaa aatgtaaccc tcgttatcct tggacaagtt cttaggaggg gcattaagtt catccttaat gccggggcgt ctcccattat cattctctaa gttgtgctcg gcaattttag gtttaattaa agccatatga tcatgaatag aaatagtgac atgctcaatg gtggatgtag tagcacgaag tatatcattc ttatctctaa aatctttagc cttagcaatt aaattttcat tcaattcatc aatcttaaca agcaaatcaa catcaccaaa tatgtgaatc aaccttaa <210> 107

<211> 58

<212> DNA

gtctcaagaa tcccttcaag gtctcttggg aagtgaagcg agaataatca tccacaataa tgtaagcaat cgggccgaat agatccatgt tgatgttctt gtgtggatga tgagctccaa tcctgtcttt ctcaaaatga acatttgtta tatgaagatt cttcatccca acatgggcta tcttagcaat taagcatgtg tcgagttcag cctctaacac acccttaaat gctattgaat catcagtaaa aagacagttg tagcctattt aatctaaaga atcaacaaga aaacattgga accaagtcct ttgaccaaac cttgatttcc ttggtttttc tcatatgagg agaacattct gctgtcgagt atccaacttg agcccccgga tgactttagg tacccaaact gttttgggtc cccaaacaca agtcttggaa cccttgtgtt cggatttgtt agtcaaaaca taggatgcat ttgaagcatt aggagttttc tttctaggca atgtctcacc cttatacata aaagcatggt ttctcctaat tttgctctca ggataaccgg gaggcatggg agccttgccc ttaacaaagt tgacattgtc tcccctttgg aagccaatgt aaagcatgct acgagcaaat ttaaatttct catctagttt tgttatatga tcattttgtt catcaatatc aacattttta catctagtgc atggtttgca agaattaagt tcaacaatct gatcagaaat tgtaattttg caaacatcaa tttctaatct aaggctagca agagatacat cattatcatc tctaagattg ggaattgaaa

49680 49740 49800 49860 49920 49980 50040 50100 50160 50220 50280 50340 50400 50460 50520 50580 50640 50700 50760 50820 50880 50940 51000 51060 51120 51180 51240 51300 51328 <213> Zea mays

<400> 107

cactgtgcgt cctctgcagg cagttgttga catgagcgca tcgtcactgc tgaatcgc

Claims (61)

1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos que é única ao evento MIR162.

2. Molécula isolada de ácido nucléico de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico une uma molécula do DNA heterólogo inserida dentro do genoma do evento MIR162 ao DNA genômico no evento MIR162 abrangendo pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da molécula de DNA heterólogo e pelo menos 10 nucleotídeos contíguos do DNA genômico que flanqueiam o ponto de inser- ção da molécula de DNA heterólogo.

3. Molécula isolada de ácido nucléico de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico une uma molécula do DNA heterólogo inserida dentro do genoma do evento MIR162 ao DNA genômico no evento MIR162 abrangendo pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da molécula de DNA heterólogo e pelo menos 20 nucleotídeos contíguos do DNA genômico que flanqueiam o ponto de inser- ção da molécula de DNA heterólogo.

4. Molécula isolada de ácido nucléico de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico une uma molécula do DNA heterólogo inserida dentro do genoma do evento MIR162 ao DNA genômico no evento MIR162 abrangendo pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da molécula de DNA heterólogo e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos do DNA genômico que flanqueiam o ponto de inser- ção da molécula de DNA heterólogo.

5. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, e de seus complementos.

6. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindi- cação 5, caracterizada pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

7. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico é compreendida numa semente de milho depositada na Ame- rican Type Culture Collection sob número de acesso N°. PTA-8166.

8. Amplicon, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Par de iniciadores de polinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que compreende o primeiro iniciador de polinucleotídeo e um segundo iniciador de polinucleotídeo os quais funcionam juntos na presença de um DNA modelo do evento MIR162 em uma amostra para produzir um diagnós- tico do amplicon para o evento MIR162.

10. Par de iniciadores de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizado pelo fato de que a primeira seqüência do iniciador e/ou a segunda seqüência do iniciador é escolhida a partir da SEQ ID NO: 1.

11. Par de iniciadores de acordo com a reivindicação 10, carac- terizado pelo fato de que o amplicon compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, ou seus complementos.

12. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência do inicia- dor é ou está complementar à seqüência genômica da planta de milho que flanqueia o ponto de inserção de uma seqüência do DNA heterólogo inserida dentro do genoma da planta de milho do evento MIR162, e a segunda se- qüência do iniciador de polinucleotídeo é ou está complementar à seqüência de DNA heterólogo inserida dentro do genoma do evento MIR162.

13. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinu- cleotídeo compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de uma se- qüência de nucleotídeos selecionada de um grupo consistindo nos nucleotí- deos 1-1088 da SEQ ID NO: 49, nucleotídeos 9391-10579 da SEQ ID NO: .49, e seus complementos.

14. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinu- cleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NOs: 68-72, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NOs: 97-105, e seus complementos.

15. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo iniciador de polinu- cleotídeos compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos dos nucleotí- deos 1089-9390 da SEQ ID NO: 49, ou seus complementos.

16. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 15, caracterizado pelo fato de que o segundo iniciador de polinu- cleotídeos compreende a seqüência de nucleotídeos selecionada a aprtir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15-35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NOs: 50-52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, e seus com- plementos.

17. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinu- cleotídeo consiste da SEQ ID NO: 36 e o segundo iniciador de polinucleotí- deos consiste na SEQ ID NO: 37.

18. Par dos iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 17, caracterizado pelo fato de que o amplicon consiste na SEQ ID NO: 38.

19. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinu- cleotídeo consiste na SEQ ID NO: 39 e o segundo iniciador de polinucleotí- deo consiste na SEQ ID NO: 40.

20. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 19, caracterizado pelo fato de que o amplicon consiste na SEQ ID NO: 41.

21. Par de iniciadores polinucleotídeos de acordo com a reivindi- cação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador de polinucleotí- deo consiste na SEQ ID NO: 53 e o segundo iniciador de polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 54.

22. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 21, caracterizado pelo fato de que o amplicon consiste na SEQ ID NO: 55.

23. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador do polinu- cleotídeo consiste na SEQ ID NO: 58 e o segundo iniciador de polinucleotí- deo consiste na SEQ ID NO: 56.

24. Par de iniciadores de polinucleotídeos de acordo com a rei- vindicação 23, caracterizado pelo fato de que o amplicon consiste na SEQ ID NO: 59.

25. Método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com um par de "iniciadores" que, quando usado em uma reação de amplificação de ácidos nucléicos com DNA genômico do evento MIR162 produz um amplicon que é diagnosticado para o evento MIR162; (b) executar uma reação de amplificação de ácido nucléico, por meio desta produzindo o amplicon; e (c) detectar o amplicon.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pe- lo fato de que o amplicon compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, ou seus complementos.

27. Método de detecção da presença de uma molécula de ácido nucléico que é única ao evento MIR162 em uma amostra compreendendo ácidos nucléicos do milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de alta estringência com DNA genômico do evento MIR162 e não hibridiza sob condições de alta estringência com DNA de uma planta de milho controle; (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização de alta estringência; e (c) detectar hibridização da sonda para a molécula de ácido nu- cléico.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe- lo fato de que a sonda compreende uma seqüência de nucleotídeos selecio- nada a aprtir do grupo consistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: .55, SEQ ID NO: 59, e de seus complementos.

29. Kit para detecção de ácidos nucléicos que são únicos ao e- vento MIR162, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico de comprimento suficiente dos polinucleotídeos contíguos para funcionarem como um iniciador ou sonda num método de detecção de ácidos nucléicos, e nos quais, de amplificação ou hibridização de uma seqüência de ácidos nucléicos alvo numa amostra seguida pela de- tecção do "amplicon" ou hibridização para a seqüência alvo, são diagnosti- cados para a presença das seqüências de ácidos nucléicos únicas ao evento MIR162 na amostra.

30. Kit de acordo de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüên- cia de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 49.

31. Kit de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucléico é um "iniciador" selecionado a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 15-37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NOs: 50-54, SEQ ID NOS: 56-58, SEQ ID NOs: 60-105, e os complementos deste.

32. Planta de milho transgênico, ou suas células ou seus teci- dos, caracterizada pelo fato de que cada um compreende uma molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

33. Planta de milho de acordo com a reivindicação 32, caracteri- zada pelo fato de que o digesto do DNA genômico da planta com a endonu- clease de restrição Kpn\, EcoRV ou Ncol resultar em uma única banda de hibridização vip3Aa20 usando uma sonda vip3Aa20 sob condições de alta estringência.

34. Planta de milho de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zada pelo fato de que a sonda compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 13, ou o seus complementos.

35. Planta de milho de acordo com a reivindicação 32, caracteri- zada pelo fato de que a planta planta de milho é resistente aos insetos.

36. Planta de milho de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zada pelo fato de que a planta resistência a insetos é devido à expressão do gene vip3Aa20.

37. Semente de milho, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma molécula de ácido nucléico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

38. Semente de milho, caracterizada pelo fato de que está depo- sitada na American Type Culture Collection sob o número de acesso PTA- .8166.

39. Planta de milho transgênica, caracterizada ppelo fato de que é produzida a partir das sementes, como definidas na reivindicação 37 ou 38.

40. Amostra biológica derivada de uma planta de milho evento MIR162, tecido, ou semente, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos a qual é ou é complementar à SEQ ID NO: .1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59 e na qual a seqüência é detec- tável na amostra usando uma amplificação do ácido nucléico ou método de hibridização do ácido nucléico.

41. Amostra biológica de acordo com a reivindicação 40, caracte- rizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo consistindo em farinha de milho, polvilho de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte com produtos derivados de milho.

42. Extrato derivado de uma amostra biológica de uma planta de milho do evento MIR162, tecidos, ou sementes, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos a qual é ou está comple- mentar à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59.

43. Extrato de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a seqüência é detectável no extrato usando uma amplificação de ácido nucléico ou método de hibridização de ácidos nucléicos.

44. Extrato de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracteriza- do pelo fato de que a planta amostra é selecionada a partir do grupo consis- tindo em farinha de milho, polvilho de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, e cereais fabricados no todo ou em parte contendo produtos derivados de milho.

45. Método para produção de uma planta de milho resistente às pestes lepidópteras caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar sexualmente uma primeira planta de milho progenitora com uma segunda planta de milho progenitora, caracterizado pelo fato de que a primeira ou segunda planta de milho progenitora mencionada compre- ende o DNA evento MIR162, por meio disso produzindo uma pluralidade de primeira geração de plantas descendentes; (b) selecionar uma primeira geração de plantas descendentes que sejam resistentes à infestação pelos insetos lepidópteros; (c) autopolinizar a primeira geração de plantas descendentes, por meio da produção de uma pluralidade de segunda geração de plantas descendentes; (d) selecionar a partir da segunda geração de plantas descen- dentes, uma planta que seja resistente às pestes lepidópteras; no qual a segunda geração de plantas descendentes compreen- dem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 59.

46. Método de produção de sementes de milho híbridas, caracte- rizado pelo fato de que compreende: (a) plantar sementes de uma primeira linhagem de milho congê- nita compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: -59 e sementes de uma segunda linhagem congênita tendo um genótipo dife- rente; (b) cultivar plantas de milho resultantes das ditas plantadas até a época de floração; (c) emascular as flores mencionadas das plantas de uma das linhagens congênitas de milho; (d) cruzar sexualmente as duas diferentes linhagens congênitas uma com a outra; e (e) ceifar a semente híbrida produzida desta maneira.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que a plantas da primeira linhagem de milho congênita são os pro- genitores femininos.

48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pe- lo fato de que a plantas da primeira linhagem de milho congênita são os pro- genitores masculinos.

49. Semente híbrida, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como definido na reivindicação 46.

50. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo crescimento da semente de milho híbrido como definida na reivindica- ção 44.

51. Proteína inseticida isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 2.

52. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que é codificadora da proteína como definida na reivindicação 51.

53. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência heteróloga promotora operativamente unida à molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 52.

54. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compre- ende o gene quimérico como definido na reivindicação 53.

55. Célula hospedeira transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende um gene quimérico como definido na reivindicação 53.

56. Sítio alvo do milho cromossomal, caracterizado pelo fato de que está localizado no cromossomo 5 entre um marcador molecular opie2 publicados como nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marca- dor molecular gag publicado como nucleotídeos 43.275-45.086 da SEQ ID NO: 106, no qual o sítio alvo compreende um ácido nucléico heterólogo.

57. Sítio alvo do milho comossomal de acordo com a reivindica- ção 56, caracterizado pelo fato de que o sítio alvo mencionado está localiza- do entre os nucleotídeos 25.454 e 25.513 da SEQ ID NO: 106.

58. Sítio alvo do milho cromossomal de acordo com a reivindica- ção 56, caracterizado pelo fato de que o sítio alvo mencionado é pareado 5' pelos nucleotídeos 5.454 a 25.454 da SEQ ID NO: 106 e pareado 3' pelos nucleotídeos 25.513 a 45.513 da SEQ ID NO: 106.

59. Método de fazer uma planta transgênica de milho, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma inserção de ácido nucléico heterólo- go em uma posição no cromossomo 5 localizada entre um marcador molecu- lar opie2 publicado como nucleotídeos 1680-3338 da SEQ ID NO: 106 e um marcador molecular gag publicado como nucleotídeos 43.275-45.086 da SEQ ID NO: 106.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pe- lo fato de que o ácido nucléico heterólogo é inserido no cromossomo 5 entre os nucleotídeos 25.454 e 25.513 da SEQ ID NO: 106.

61. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pe- lo fato de que o mencionado ácido nucléico heterólogo inserido é pareado 5' pelos nucleotídeos 5.454 a 25.454 da SEQ ID NO: 106 e pareamento 3' pe- los nucleotídeos 25.513 a 45.513 da SEQ ID NO: 106.