CN102719534B

CN102719534B - 转基因玉米标准样品、其建立方法及应用

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Publication number: CN102719534B
Application number: CN 201210172122
Authority: CN
Inventors: 曹际娟; 徐君怡; 赵昕; 于兵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: CN102719534A

Abstract

本发明公开一种转基因玉米MIR162的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因玉米MIR162中的应用，分别以转基因玉米MIR162或非转基因玉米为原料，将原料研磨、过筛、加水，搅拌、静置、将沉淀物制备成冻干粉；再将二者以科学的比例混合，并重复“加水，搅拌、静置、将沉淀物制备成冻干粉”的过程，分装，0℃~4℃贮存；通过上述方法获得转基因玉米MIR162的标准样品，也可以应用于转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒。这对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

Description

转基因玉米标准样品、其建立方法及应用

技术领域

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因玉米MIR162的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因玉米MIR162中的应用。

背景技术

玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。

开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性，保障食品安全，解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。

在所有的商品化的转基因作物中，转基因玉米的品系最多，共有28个品系。我国尚未批准进境的转基因玉米品系有7种：MIR162品系，MON 89034品系，DBT418品系，LY038品系，ES3272品系，Bt10品系，DP98140品系。2010年我国深圳等口岸已陆续截获违禁品系,MIR162品系就是其中的一种。转基因玉米MIR162是先正达种苗公司的产品，在美国被批准食用的时间为1997年，在加拿大被批准食用的时间为1997年，在澳大利亚被批准食用的时间为2002年。转基因玉米MIR162所含的外源基因有：1）抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20，2）选择性标记基因pmi。

国内很多检测机构开始大量地开展玉米中转基因成分的检测，但国内外市场却始终没有转基因MIR162品系的标准样品。

发明内容

鉴于国内转基因MIR162品系标准样品紧缺的状况，我们研制了转基因玉米MIR162品系标准样品，本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

转基因玉米MIR162品系简介：

转基因玉米MIR162所含的外源基因有：1）抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20，2）选择性标记基因pmi。质粒图谱如图1：

本发明通过以下技术路线实现：

本发明的一方面在于：转基因玉米MIR162标准样品的制备方法，其具体步骤如下：

（1）将原料研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置1h，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉；

（2）以转基因玉米MIR162为原料，按照步骤（1）所述方法制备的冻干粉为添加原料；

（3）以非转基因玉米为原料，按照步骤（1）所述方法制备的冻干粉为基质原料；

（4）将步骤（2）制备的添加原料与步骤（3）制备的基质原料按1：100的重量比例混合，向混合粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置1h，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉并分装,0℃～4℃贮存；

上述步骤（1）～（4）中任一项所述的冻干，其具体步骤如下：

冷冻干燥程序：

①样品预冻：先把样品在-80℃冷冻2h；

②冷冻过程：关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35℃时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；

③样品干燥：干燥室的温度设置为15℃,当真空度降至0.1Torr时，样品已干燥好；

④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。

混合粉状样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即转基因玉米粉状标准样品；分装后的样品加贴唯一性标识，放置于-20℃中避光贮存。

本发明的另一方面在于：公开一种转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因玉米MIR162检测基因和阳性标准对照品，其中，

阳性标准对照品：是利用上述方法制备的转基因玉米MIR162标准样品；

转基因玉米MIR162检测基因，包括：

其中：FAM为6-carboxyfluorescein,TAMRA为6-carboxytetramethylrhodamine。本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。

试剂盒的使用方法：是以待测样品的基因组为模板，利用转基因玉米MIR162检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。或者通过PCR特异性的引物和探针序列，扩增待测样品与阳性标准对照品，并将扩增的结果进行比对，确认样品中是否含有转基因玉米MIR162品种，具体制作和检测方法参照实施例。上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。

本发明的创新特征是：

本项标准样品的制备完成及其制备方法的建立，对解决转基因MIR162品系检测分子标准样品的制备技术和稳定性保证技术，开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义及应用价值。

图1：转基因玉米MIR162的质粒图谱；所含的外源基因有：1）抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20，2）选择性标记基因pmi。

图2：转基因玉米MIR162标准样品制备、检测工艺流程。

附图说明

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施方式

制备转基因玉米MIR162品系标准样品的原料购于AOCS；

研钵，100目标准筛，DNA提取试剂和PCR反应试剂均购于宝生物工程（大连）有限公司；

DNA提取试剂盒：购于宝生物工程（大连）有限公司（货号D9093）；

TaqMan Universal Master Mix：购于ABI公司；

引物和探针：宝生物工程（大连）有限公司合成；

实时荧光定量PCR仪：ABI 7500型；

核酸蛋白分析仪：日本日立公司。

实施例1

转基因玉米粉状标准样品的制备步骤

（a）取原料放在研钵中，用研棒搅拌、研磨成粉末。将粉末过100目标准筛。将过筛后

（b）将粉末加约一倍的水，使用搅拌机搅拌30min使其均匀后，静置1h，弃上清，将浆糊放置于中试冻干机内，按如下冻干程序，去除水分，制备成冻干粉。

（c）转基因玉米MIR162冻干粉作为添加原料；非转基因玉米冻干粉作为基质原料。两种原料制备程序和冻干程序完全相同，但分别独立、隔离制备完成。

（d）在恒温恒湿、无菌操作间中，称取5.0g转基因玉米MIR162粉添加原料和495.0g非转基因玉米粉基质原料，按1%的添加比例混合，将混合粉末加约一倍的水，使用搅拌机搅拌30min，混匀上述混合样品，均匀后，静置1h，弃上清；

（e）将混合浆糊样品放置于中试冻干机中，按照冻干程序，进行低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉；

（f）将混合冻干粉样品分装于经160℃干热处理2h的洁净的7mL棕色玻璃瓶中封盖密封，每瓶内装混合冻干粉样品1g。

（g）获500瓶1.0％添加含量的转基因玉米粉MIR162标准样品。瓶装后的样品加贴唯一性标识，放置于阴凉干燥处0℃~4℃贮存。

其中，步骤（a）~（h）中所述的冻干程序，其具体步骤如下：

（1）样品预冻：先把混合粉状样品溶液在-80℃低温冷冻2h。

（2）冷冻过程：关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35℃时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的标准品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空，真空表显示值开始下降；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程。

（3）样品干燥：对干燥室加热，提高样品干燥速度；干燥室的温度设置为15℃。当真空度降至0.1Torr或更低时，表示样品已干燥好。

（4）关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。

混合粉状样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即转基因玉米MIR162粉状标准样品；分装后的样品加贴唯一性标识，放置于-20℃中避光贮存。

实施例2定值方法

采用实时荧光定量PCR法：《转基因成分检测玉米检测方法》SN/T 1196-2011和GB/T19495.5-2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》进行测定转基因玉米MIR162品系和定值。

检测转基因玉米MIR162品系特异性及玉米内源zSSIIb基因的引物序列和探针序列见下表1。

表1检测转基因玉米MIR162品系特异性基因的引物序列和探针序列

其中，FAM为6-carboxyfluorescein,TAMRA为6-carboxytetramethylrhodamine。

实时荧光PCR反应体系见表2。

表2实时荧光PCR反应体系

实时荧光PCR反应参数见表3。

表3实时荧光PCR反应参数

d.结果计算

反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，制作标准曲线等。根据公式计算待测样品中转基因成分的含量。

(a)计算公式：

备注：不同的机器有不同的内标比，具体计算方法为：取100%转基因的样品测OD值，然后按OD值稀释四个不同的梯度，例:500ng/ul、100ng/ul、50ng/ul、10ng/ul。分别计算四个不同的梯度样品的外源基因的拷贝数与内源基因的拷贝数的比值，最后求得四个数的平均数，这个平均数就是内标比。按以下公式计算。

内标比计算公式为：

(b)计算方法：

①将标准样品的拷贝数取以10为底的对数作为X坐标轴，以CT值为Y坐标轴，分别得到一条内源标准曲线和一条外源标准曲线。同时也会得到两条一元一次方程，一条是内源方程，一条是外源方程；

②方程中的Y用样品的CT值代入（内源代入内源方程，外源代入外源方程），计算出X值；

③再求出X值的反对数即为样品的拷贝数；

④然后用外源的拷贝数除以内源的拷贝数，再除以内参比，得到的数值再乘以100％即为该样品中转基因的百分含量。

实施例3均匀性检验

从最终包装1g/瓶的转基因玉米MIR162样品中，随机抽取15瓶样品，每瓶样品分成2份子样用实时荧光PCR定量检测方法测试，取样量100mg，分析转基因玉米MIR162品系的含量。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。检测结果使用方差分析方法进行均匀性评价。

转基因玉米MIR162标准样品的均匀性测定结果见表4，其均匀性评价结果见表5。

从表5可知，两个样品组之间不存在显著差异，可以认为样品是均匀的。

从表5可见，经F检验，计算F比为1.19，小于查表所得到的F（14,15）=2.42，说明样品是均匀的。样品（不）均匀性标准不确定度为0.005%。

表4转基因玉米MIR162标准样品均匀性测定结果

样品号	子样1测试结果(%)	子样2测试结果(%)
			1	0.99	1.03
2	0.98	0.99
			3	1.02	1.01

4	0.97	1.01
			5	1.02	1.01
6	0.98	0.99
			7	0.98	1.02
8	1.01	0.98
			9	1.01	1.01
10	0.99	1.01
			11	0.97	0.99
12	0.97	1.00
			13	0.99	0.98
14	1.02	1.01
			15	0.99	1.00

表5转基因玉米MIR162标准样品均匀性评价结果

实施例4稳定性预实验

从2007年7月-2011年7月进行标准样品稳定性预实验研究，所选取的用于稳定性预实验的包装好的样品在0~4℃低温条件下历经了四年时间保存。随机选取样品进行稳定性试验，第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试，采用实时荧光PCR方法定值。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表6。

表6转基因玉米MIR162标准样品的稳定性预实验结果

由于没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的降解机理，故采用直线作为经验模型。事实上，对于这种基体中的特性值而言，理想值为：截距（在不确定度内）等于测定得到的值，而斜率趋近于零。

斜率可用下式计算：

b_{1} = \frac{Σ_{i = 1}^{n} (X_{i} - \overset{&OverBar;}{X}) (Y_{i} - \overset{&OverBar;}{Y})}{Σ_{i = 1}^{n} {(X_{i} - \overset{&OverBar;}{X})}^{2}} = 0.00000

式中：

\overset{&OverBar;}{Y} = 0.998

\overset{&OverBar;}{X} = 22.1

截距由下式计算：

b_{0} = \overset{&OverBar;}{Y} - b_{1} \overset{&OverBar;}{X} = 0.99844

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

s^{2} = \frac{Σ_{i = 1}^{n} {(Y_{i} - b_{0} - b_{1} X_{i})}^{2}}{n - 2} = 0.00023

取其平方根s＝0.01527％，与斜率相关的不确定度用下式计算：

s (b_{1}) = \frac{s}{\sqrt{Σ_{i = 1}^{n} {(X_{i} - \overset{&OverBar;}{X})}^{2}}} = 0.00023

自由度为n-2和p=0.95（95％置信水平）的学生分布t－因子等于2.11。

由于|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)

故斜率是不显著的。因而稳定性预实验中未观测到不稳定性。

实施例5运输条件下的稳定性检验

2011年4－7月间，采用同步设计方法在-80℃~55℃范围内（选择-80℃、-20℃、4℃、25℃、55℃）进行了运输条件下标准样品的稳定性研究，由稳定性预实验所得到的数据初步分析，在0－4℃范围内的标准样品未观测到不稳定性，因此，使用在此温度范围内储存的标准样品作为“基点”，其他温度条件下放置的标准样品为研究对象，每个温度条件下测试3瓶标准样品，每瓶重复测试两次，历经的条件和测试结果如表7。

表7同步设计运输条件下稳定性研究条件及其测试结果

不考虑瓶间不均匀性与温度效应的交互作用，采用双因素方差分析（见表8），得到运输条件下不稳定性标准差为0.0022。

表8稳定性方差分析表

因素	平方和	自由度	均方	F比	F临界值	置信概率	不稳定标准差
								温度	0.001233	4	0.000308	1.89	3.06	0.95	0.0022
瓶间	0.002800	10	0.000280	1.71	2.54	0.95
								随机	0.002450	15	0.000163
总和	0.006483

实施例6稳定性检验

所选取的用于稳定性测试的包装好的样品在0~4℃低温条件下历经了长时间保存。随机选取样品进行稳定性试验。第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试，采用实时荧光PCR方法定值。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表9，稳定性方差分析表见表10，不稳定标准差为0.0076。

表9转基因玉米MIR162标准样品的稳定性检验结果

表10稳定性方差分析表

实施例7标准值及其不确定度检测

采用实时荧光定量PCR法进行定值。分别对转基因玉米MIR162标准样品进行了6次的重复测试，测试数据汇总表见表11。

经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。

按照GB/T 15000-94的要求对数据进行统计，计算转基因玉米MIR162标准样品的标准值及不确定度，结果见表12。

表11转基因玉米MIR162标准样品定值结果汇总表

表12转基因玉米MIR162标准样品定值结果统计分析表

正态性检验中，偏态系数A小于95%临界值，峰态系数B落于95%置信区间内。正态性检验结果表明，定值数据符合正态分布。

异常值检验结果表明，定值数据中不存在异常值。

考虑到本研制的标准样品仅作为定性检测使用，因此将均匀性检验、稳定性检验的不确定度引入定值合成不确定度中，选用k=2，可满足使用。

将均匀性和稳定性所导致的不确定度与测定不确定度合成，得到结果的合成标准不确定度，取包含因子为2，得到结果的扩展不确定度，转基因玉米MIR162标准样品的定值结果为：1.00%±0.02%。得到的结果证明均匀性和稳定性很好。

实施例8

转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒内，包括转基因玉米MIR162检测基因和阳性标准对照品，

其中的转基因玉米MIR162检测基因，包括：

品系鉴定基因的检测引物和探针序列:

正向引物5’-CACCTTCAGCAACCCGAACTA-3” SEQ ID NO：1

反向引物5’-GCTTAGCCTCCACGATCATCTT-3’ SEQ ID NO：2

探针5’-FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCTTAMRA-3’ SEQ ID NO：3

zSSIIb基因的检测引物和探针序列:

正向引物5’-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C-3’ SEQ ID NO：4

反向引物5’-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3’ SEQ ID NO：5

探针5’-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA-3’SEQ ID NO：6

其中：FAM为6-carboxyfluorescein,TAMRA为6-carboxytetramethylrhodamine。

还包括阳性标准对照品是转基因玉米MIR162标准样品，其具体制备方法如上述实施例1。

本发明中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均为常规技术。PCR、Real-Time PCR反应所用缓冲液等反应试剂、反应体系和反应参数设置，均如上述实施例。

试剂盒的使用方法：是以待测样品的基因组为模板，利用转基因玉米MIR162检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。具体制作和检测方法参照实施例。

转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒的制备完成，对待测样品经过Real-TimePCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量，本项发明包括标准样品的制备及检测试剂盒的制备，对全面深入的研究解决转基因成分、检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

Claims

1.一种转基因玉米MIR162标准样品，其特征在于，制备方法包括：

（1）以转基因玉米MIR162为原料，研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置1h，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉；

（2）以非转基因玉米为原料，研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置1h，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉；

（3）将步骤（1）制备的冻干粉与步骤（2）制备的冻干粉按1：100的重量比例混合，向混合粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置1h，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉并分装, 0℃~4℃贮存；

上述步骤（1）~（3）中所述的冻干粉的冷冻干燥程序如下：

①样品预冻：先把样品在-80℃冷冻2 h；

②冷冻过程：关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35℃时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至0.5 Torr时，结束冷冻过程；

2.一种转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：

① 阳性标准对照品：是权利要求1所述的转基因玉米MIR162标准样品；

② 品系鉴定基因的检测引物和探针序列：

正向引物 SEQ ID NO：1 反向引物 SEQ ID NO：2 探针 SEQ ID NO：3

③ zSSIIb基因的检测引物和探针序列：

正向引物 SEQ ID NO：4 反向引物 SEQ ID NO：5 探针 SEQ ID NO：6 。