CN103352084A - 转基因玉米mir162转化体复合pcr检测引物和探针及其应用 - Google Patents
转基因玉米mir162转化体复合pcr检测引物和探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种转基因玉米MIR162转化体复合PCR检测引物和探针及其应用，所述的引物正反向序列是：MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'；其探针序列是：MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse。利用本发明提供的引物和探针，建立了SYBR Green I复合PCR实时荧光定量检测转基因玉米MIR162的方法和TaqMan探针实时荧光定量检测转基因玉米MIR162成分的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中转基因植物的分子生物学的检测方法，特别是涉及转基因玉米MIR162转化体复合PCR检测引物和探针及其应用。
背景技术
根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)最新的研究报告，2012年全球转基因作物种植面积达1.703亿公顷。比2011年增加6.04%。种植面积前六位的国家依然是美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度、中国。分别占全球种植面积的40.8%、21.5%、14%、6.8%、6.3%和2.3%。种植面积最大的4种作物是：大豆、玉米、棉花、油菜。分别占全球转基因作物面积的48%、32%、14%和5%。从转基因作物的性状看，抗除草剂、抗虫、多抗(抗除草剂兼抗虫)特性的全球转基因作物面积各为100.9、25.4、44.4百万公顷，分别占59.3、14.9、25.8%。
复合PCR检测，是将两对或者两对以上的引物在同一个反应管中进行扩增，达到同时检测两个或两个以上目的DNA片段的目的。复合PCR检测的优点是PCR检测的效率高，实际检测时间短、费用低，且具有很高的检测灵敏度。复合PCR检测方法建立的难点在于PCR引物的设计和PCR反应条件的优化和每对引物反应效率不一致。因此在建立复合PCR检测体系时必须考虑上述因素。
目前，还没有有关转基因抗虫玉米MIR162复合PCR检测及进行荧光定量的方法，不有利于加强转基因产品的标识管理。本发明可以填补国内外相关领域的空白。
发明内容
本发明的目的是提供转基因玉米MIR162转化体特异性复合PCR检测引物和探针及其在转基因玉米MIR162实时荧光定量PCR检测中的应用。
本发明所采用的方法是：
一种转基因玉米MIR162转化体特异性复合PCR引物，正向、反向引物序列分别为：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'。
一种转基因玉米MIR162转化体特异性复合PCR探针，序列为：
MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse。
本发明涉及一种转基因玉米MIR162转化体特异性引物在SYBR Green I复合PCR实时荧光定量检测转基因玉米MIR162的应用，所述方法如下：
(1)建立MIR162转化体特异性基因和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中同时加入MIR162转化体特异性基因的引物和zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；
②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162转化体特异性基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中同时加入MIR162转化体特异性基因的引物和zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162转化体特异性基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则MIR162转化体特异性基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
步骤(1)和(2)中，zSSIIb引物采用国家标准序列如下：
zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'
转基因玉米MIR162转化体特异性引物扩增序列如下：
CTGATGACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATGTCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTAT
所述步骤(1)和(2)中，扩增的参数均如下：2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，上游引物(10μmol L-1)0.4μL，下游引物(10μmol L-1)0.4μL，DNA模板1μL，加水补至20μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
本发明还涉及一种转基因玉米MIR162转化体特异性引物和探针在TaqMan探针实时荧光定量检测转基因玉米MIR162成分的应用，方法如下：
(1)建立转基因玉米MIR162转化体特异性序列和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：
①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中同时加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；
②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的转基因玉米MIR162的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。
所述步骤(1)①和(2)中，zSSIIb基因采用国家标准引物和荧光标记探针如下：
zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'
zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-Eclipse；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'。
MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse。
转基因玉米MIR162转化体特异性引物扩增序列如下：
CTGATGACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATGTCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTAT
所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数均如下：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5μL，浓度为10μmol L-1的Forward primer1μL，浓度为10μmol L-1的Reverseprimer1μL，浓度为10μmol L-1的TaqMan probe0.5μL，ddH2O4μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性，95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
本发明具有的优点和效果如下：
利用本发明设计的复合PCR引物与探针序列，建立了转基因玉米MIR162转化体特异性SYBR Green I实时荧光定量复合PCR检测方法和TaqMan探针实时荧光定量复合PCR检测方法，这两种方法比普通PCR检测通量高、成本低、操作简便、准确性好，且简单、可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
附图说明
图1为实施例1中内标准基因zSSIIb的复合SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。
图2为实施例1中转基因玉米MIR162复合SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。
图3为实施例2中内标准基因zSSIIb的复合TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。
图4为实施例2中转基因玉米MIR162复合TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1转基因玉米MIR162转化体特异性复合SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法：
提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至62500、12500、2500、500和100copiesμL-1。每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。
引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成，稀释成10μmol L-1备用。
合成的转基因玉米MIR162转化体特异性引物序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'。
玉米内标引物(zSSIIb)采用国家标准引物，其序列如下：
zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'
扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH2O，空白)和非转基因样品对照。
结果：通过对拷贝数为分别为62500、12500、2500、500、100的转基因玉米MIR162标准品DNA进行复合SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct值，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的植酸酶玉米标准品(5.0%、3.0%和1.0%)、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。
对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162转化体特异性引物同时对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行复合SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图1示，该曲线的斜率为-3.375，相关系数R2为0.999。转基因玉米MIR162转化体特异性引物的标准曲线如图2示，该曲线的斜率为-3.399,相关系数R2为0.998。根据待检测玉米样品扩增反应的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：
样品中转基因玉米MIR162含量=(转基因玉米MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％
得到MIR162含量为5.0%、3.0%和1.0%的混合玉米样品中转基因玉米MIR162的百分含量分别为4.7%，2.7%和0.96%，定量准确度较高。
实施例2转基因玉米MIR162转化体特异性TapMan探针实时荧光定量PCR检测方法：
提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA，按5倍倍比分别稀释至62500、12500、2500、500和100copiesμL-1。每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。
引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成，稀释成10μmol L-1备用。
合成的转玉米MIR162转化体特异性引物与探针序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'。
MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse。
玉米内标引物与探针(zSSIIb)采用国家标准引物与探针，其序列如下：
zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'
zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-Eclipse
扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5μL，浓度为10μmol L-1的Forwardprimer1μL，浓度为10μmol L-1的Reverse primer1μL，浓度为10μmol L-1的TaqMan probe0.5μL，ddH2O4μL，DNA模板1μL，.扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水(ddH2O，空白)和非转基因样品对照。
结果：通过对拷贝数为分别为62500、12500、2500、500、100的转基因玉米MIR162标准品DNA进行复合Taqman探针实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct值，横坐标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的植酸酶玉米标准品(5.0%、3.0%和1.0%)、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。
对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162转化体特异性引物同时对同一组标准品DNA和不同百分含量的转基因玉米DNA进行复合Taqman探针实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图3示，该曲线的斜率为-3.401，相关系数R2为0.999。转基因玉米MIR162转化体特异性引物的标准曲线如图4示，该曲线的斜率为-3.327,相关系数R2为0.999。根据待检测玉米样品扩增反应的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：
样品中转基因玉米MIR162含量=(转基因玉米MIR162拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数)×100％
得到MIR162含量为5.0%、3.0%和1.0%的混合玉米样品中转基因玉米MIR162的百分含量分别为5.2%，2.8%和1.07%，定量准确度较高。
以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量复合PCR和Taqman探针实时荧光定量复合PCR检测提供了通量高，操作简便，结果可靠的测定方法，为该转基因产品的监管与控制提供了更加先进的技术手段。
Claims (6)
1.一种转基因玉米MIR162转化体特异性复合PCR引物和探针，所述的引物正向、反向序列分别为：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'；所述的探针序列为：
MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse。
2.权利要求1所述的特异性引物在SYBR Green I复合PCR实时荧光定量检测转基因玉米MIR162的应用。
3.权利要求2所述的应用方法，其特征是，具体步骤是：
(1)建立MIR162转化体特异性基因和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中同时加入MIR162转化体特异性基因的引物和zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；
②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162转化体特异性基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中同时加入MIR162转化体特异性基因的引物和zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162转化体特异性基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则MIR162转化体特异性基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量；
步骤(1)和(2)中，zSSIIb引物采用国家标准序列如下：
zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物扩增序列如下：
CTGATGACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATGTCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTAT；
所述步骤(1)和(2)中，扩增的参数均如下：2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，上游引物(10μmol L-1)0.4μL，下游引物(10μmol L-1)0.4μL，DNA模板1μL，加水补至20μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
4.权利要求1所述的特异性引物和探针在TaqMan探针实时荧光定量检测转基因玉米MIR162成分的应用。
5.权利要求4所述的应用方法，其特征是，具体步骤是：
(1)建立转基因玉米MIR162转化体特异性序列和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；
①提取转基因玉米MIR162标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中同时加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；
②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的转基因玉米MIR162的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量；
所述步骤(1)①和(2)中，zSSIIb基因采用国家标准引物和荧光标记探针如下：
zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'
zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'
zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-Eclipse；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针序列如下：
MIR162-136-F:5'-CTGATGACACCAATGATGCAAATAG-3'
MIR162-136-R:5'-ATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCG-3'。
MIR162-136-P:FAM-5'-ATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'-Eclipse；
转基因玉米MIR162转化体特异性引物扩增序列如下：
CTGATGACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATGTCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTAT；
所述步骤(1)①和(2)中，扩增的参数均如下：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5μL，浓度为10μmol L-1的Forward primer1μL，浓度为10μmol L-1的Reverseprimer1μL，浓度为10μmol L-1的TaqMan probe0.5μL，ddH2O4μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性，95℃变性15s，60℃退火延伸30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
6.权利要求3或5所述应用方法，其特征是，所述的DNA的梯度稀释是按照5倍倍比进行稀释。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131016 |