JP2001506857A

JP2001506857A - 単為結実または雌性不稔トランスジェニック植物の生産方法

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Publication number: JP2001506857A
Application number: JP52838498A
Authority: JP
Inventors: スペーナ，アンジェロ; セトラー，ハインツ; ゾマー，ハンス; ロティーノ，グイゼッペ，レオナルド
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフトツアーフェルデルンクデルヴィッセンシャフテンエー．ファー．; イスティトゥートスペリメンターレペルロルティコルトゥーラ; スペーナ，アンジェロ
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2001-05-29
Also published as: EP0951558A1; IL130457A0; CA2275974A1; AU728015B2; AU5762398A; BR9714425A; CA2275974C; WO1998028430A1; EP0951558B1; AU728015C; ATE291093T1; US6483012B1; DE69732792D1; TR199901418T2; NZ336555A; TR200000858T2

Abstract

(57)【要約】植物の単為結実もしくは雌性不稔を樹立するために、または雌性前核生殖を高めるために、または結実および果物の生育を増進するために、キンギョソウのDefH9遺伝子のプロモーター領域または同じ発現パターンと特性を示す相同な遺伝子のプロモーターの使用が記載される。また、植物で発現の際に前記効果をもたらすＤＮＡ配列と組み合わせて、DefH9プロモーターを含有する組換えＤＮＡ分子が記載される。さらに、かかる組換えＤＮＡ分子で形質転換した植物細胞および植物が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】単為結実または雌性不稔トランスジェニック植物の生産方法本発明は、キンギョソウ（Anthirrhinum majus）のDefH9遺伝子のプロモーター領域および他種の相同遺伝子のプロモーター領域を、例えば単為結実、雌性不稔を達成するために植物の胎座および／または胚珠または胎座または胚珠から派生する組織における遺伝子の高度に特異的な発現に利用することならびに結実と果実の生育の増進に使用することに関する。また、本発明は、発現時に上述の効果をもたらすDNA配列の発現が該プロモーターによって制御されているDNA構築物に関する。さらに、本発明は、そのような構築物で遺伝的に改変されたトランスジェニック植物であって、受精しなくても（すなわち単為結実的生育により）果実を生育させうるもの、または雌性不稔であるもの、ならびにそれら植物の果実とそれら植物の繁殖物質に関する。果実が商業的価値を持つために栽培される作物の分野では、受精しなくても果実を生育させうる植物には大きな需要がある。これは種子がないから（例えば食用のブドウやメロン）というだけなく、最も顕著な理由は受精にとって不都合な環境条件で果実が得られるためである（例えばナス、トマト；LipariおよびPara tore，Acta Hort．229（1988）307-312:Savin，PHM Revue Horticole 374（1996 ）50-52）。単為結実的生育を達成する方法は本質的に、化学的活性成分を使用するか、その種に単為結実的生育性を付与する選抜された突然変異体を使用するか、染色体数の変化（すなわち倍数性）を利用することによっている。したがって、上述の望ましい特性を持つ植物の育種に適した植物は、今までのところ狭い範囲に限られてきた。実際、いくつかの園芸植物については、単為結実的生育を引き起こすために花芽を合成成長因子類で処理（すなわち噴霧）することが一般的である（上記参考文献；La TorreおよびImbroglini，Informatore Agrario 16 （1992）71-78;RobertsおよびHooley著「Plant Growth Regulators」Chapman an d Hall(ニューヨーク(1988))。植物ホルモンの外的適用の成功は、その植物器官に対するそれらホルモンの一様な作用に依っており、これは労働集約的でその生産工程に余分なコストを加えるものである。第二に、それら化学物質は、その適用部位から輸送されうるので、それらはその植物の他の部分またはその植物全体に影響を及ぼしうる。突然変異体の使用または植物ホルモンの植物への外的適用に関連する上述の欠点を回避するために、最近になって植物遺伝子操作が適用されている。例えばBa rg（「試験管内培養と園芸育種(In vitro culture and horticultural breeding )」に関する第３回国際園芸学会シンポジウム（エルサレム；1996年６月16〜21 日）の議事録，13）は、TPRP-F1プロモーター（トマト由来）の制御下にrolB遺伝子を含むトランスジェニックトマトの作出を開示した。このプロモーターの使用により、rolB遺伝子が子房と未熟な果実内で優先的に発現されるようになる。その結果この植物は単為結実的生育を示す。しかし、使用されたプロモーターは子房での発現（＝100％）と比較して栄養組織でも十分に検出できるレベル（すなわち根、茎、葉でそれぞれ1.8％、3.5％、0.1％）を示した（Saltsら，Plant Mol．Biol．17（1991）149-150）。この基礎発現レベルのため、この植物は栄養組織におけるその生理学的過程も改変されうる。第二の例では、細菌のiaaH遺伝子（これは、いくつかのインドールアセトアミド類縁体を加水分解する能力を持っていて不活性なインドールアセトアミド（IAM）とナフタレンアセトアミド（N AM）をそれぞれ活性な植物ホルモンであるインドール酢酸（IAA）とナフタレン酢酸（NAA）に変換できるインドールアセトアミド加水分解酵素をコードする）を発現させるために、Szechtmanら（「試験管内培養と園芸育種」に関する第３回国際園芸学会シンポジウム（エルサレム；1996年６月16〜21日）の議事録，32 ）によって、同じTPRP-F1プロモーターが使用された。その結果得られたトランスジェニック植物は、NAMを噴霧すると単為結実的生育を示した。この開示は単為結実的生育の効率が改善されたことを意味するが、それでもなおNAMなどの化学物質の外的適用に依存している。25ppmのNAMを噴霧した若い植物はわずかな上偏生長応答を示したと報告されているものの、この導入遺伝子そのものは有害な多面発現的影響を引き起こさなかった（Szechtmanら，上記引用文献中）。同じ報告でSzechtmanら（1996）は、果実での内因性オーキシン生合成を可能にするにはこのTPRP-F1-iaaH系をTPRP-F1-iaaMと組み合せる必要があるだろうと述べている。しかし、開示されたキメラ遺伝子に使用されたTPRP-F1プロモーターは、栄養組織でも一定の基礎発現レベルを持つため、形質転換後および形質転換細胞の再生過程でも活性であるという欠点を持つ。（rolBと同様に）オーキシン類への感受性を高めるiaaM遺伝子または遺伝子群の発現は再生過程を妨害するので、TPRP -F1プロモーターはiaaMまたはrolB遺伝子が導入された最適な植物を得るには適していない。その理由は、栄養組織における構成的な基礎発現レベルである。このプロモーターのこの特徴は、最適な発現レベルを持ちその栄養生長性が変化していない植物の効率よい再生を妨げる。その結果、iaaM遺伝子を発現しないトランスジェニック植物が再生され、および／または、iaaMまたはrolB遺伝子の構成的発現レベルが再生と両立できる程度に低い植物が再生されることになる。iaaM 遺伝子の構成的発現は、トランスジェニック植物に有害な作用を持つことが知られている(Gaudinら，Plant Physiol．Biochem．32（1994）11-29)。したがって、これらの植物は最適な産物には相当しない。というのは、ｉ）これらの植物はその栄養生長性が変化しているかもしれない（オーキシンは環境要因および微生物要因との相互作用を含む数多くの生理学的過程に影響する）し、またii）子房におけるその発現レベルが低下していて単為結実的生育を効率よく促進しうるほどには強くないかもしれないからである。組織培養での操作を伴わない形質転換法を使って得られた植物の場合は、栄養組織での構成的発現レベルが種子の発芽と実生の生長をさらに妨げるだろう。トランスジェニック植物の作出に関する上述の実験は、生育しつつある胚珠がオーキシンの良好な供給源であること(ArchboldおよびDennis，J．Amer．Soc．Hort ．Sci．110（1985）816-820)、および外因性オーキシンは生育しつつある胚珠（例えばイチゴの痩果）に代わって花床の生長を支持することができるので（Nits ch，Amer．J．Bot．37（1950）211-215;ArchboldおよびDennis，1985，上記引用文献中）、単為結実的生育をもたらすことという周知の事実に基いている。したがって、植物遺伝子工学によって受粉のホルモン効果を模倣するには、オーキシンの含有量と活性を変化させうるキメラ遺伝子の発現が、雌性生殖器官の細胞、好ましくは胚珠で、そして最も好ましくはそこから派生する組織でも、特異的に起るべきである。これには、そのような細胞での発現に高度に特異的なプロモーターが必要である。雌性不稔については、雌性生殖器官の細胞の死滅または無能化をもたらす遺伝情報で植物を遺伝子操作することによって雌性不稔植物を得る方法が、当技術分野でいくつか報告されている。これらの方法は主として、RNアーゼ、プロテアーゼまたは細菌毒素などといった毒性の高い因子をその細胞内で産生させるという概念に基いている。あるいは必須遺伝子の転写物に対するアンチセンスRNAまたはリボザイムが産生される。これらの方法はいずれも、導入された構築物が雌性生殖器官の細胞で高度に特異的に発現し、他の組織では発現しないことを必要とする。他の組織での発現は、その植物の生育に有害になるからである。したがって、本発明の根底にある技術的課題は、雌性生殖器官の細胞とりわけ胎座および／または胚珠における導入遺伝子の高度に特異的な発現ゆえに雌性不稔であるか、単為結実的生育または増進された単為結実的生育性を示すトランスジェニック植物を作出するための方法と手段の提供である。この技術的課題は請求の範囲で特徴づける態様の提供によって解決される。すなわち、本発明は、トランスジェニック植物の胎座および／または胚珠における高度に特異的な発現と栄養組織の細胞における極めて低い発現レベルを必要とする目的のために、植物細胞におけるDNA配列の発現にDefH9プロモーターを使用することに関する。そのような目的の例は、トランスジェニック植物の雌性生殖器官の細胞で特定のDNA配列を発現させることによる単為結実性または雄性不稔の樹立である。他の目的には雌性発生率の増加、半数体−倍加半数体株の作出または遠縁の植物種間の交雑がある。したがって、第一の側面として本発明は、キンギョソウのDefH9遺伝子のプロモーター領域またはキンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子のプロモーター領域であって植物中でそれに連結されたDNA配列の胎座および／または胚珠特異的発現を指示できるものを、単為結実性の樹立に使用することに関する。本発明は、キンギョソウのDefH9遺伝子を発現させるプロモーター領域が胎座および／または胚珠以外の組織では極めて低い基礎活性レベルを持つという発見に基いている。したがってこのプロモーターは、一方では、植物の雌性生殖器官の上述の組織で、あるDNA配列を高度に特異的に発現させるのに適している。これは、当技術分野で知られている各方法の欠点である他の生理学的過程および生育過程の望ましくない改変を回避するのに役立つ。単為結実的生育を達成するには、例えばオーキシン代謝に影響を及ぼす導入キメラ遺伝子の構成的発現の基礎レベルができるだけ低い（すなわち好ましくは検出限界未満である）必要がある。この側面は、とりわけ植物細胞に導入される遺伝情報が成長因子（例えばオーキシンタイプの成長因子）のレベルおよび活性を制御するものである場合（オーキシンの含有量または活性を増加させることによって単為結実性を樹立しようと試みるような場合）に関係する。他方、このプロモーターは栄養組織におけるその極めて低い基礎活性レベルゆえに、例えばTPRP-F1プロモーターを使用した場合に生じる上述の問題点を回避するためにも役立つ。具体的に述べると、DefH9プロモーターは形質転換植物細胞のトランスジェニック植物への再生中は活性でないので、極めて低いレベルのプロモーター活性しか持たない細胞の選択が起らない。したがってこのプロモーターは、雌性生殖器官の細胞すなわち胎座および／または胚珠と、最も好ましくは胎座または胚珠から派生する組織（種子の珠皮など）での外来DNA配列の特異的発現により単為結実的生育を示すトランスジェニック植物の作出における使用にとりわけ好適かつ有用である。本発明において「DefH9プロモーター」という用語は、トランスジェニック植物の胎座および／または胚珠またはそれらから派生する組織での発現を特異的に指示することができ、栄養組織では検出しうる基礎発現レベルを示さない、調節配列を含むキンギョソウのDefH9遺伝子のプロモーター領域を意味する。このプロモーターは、好ましくは、開花の開始前にそれら組織での発現を指示しはじめる。この文脈で「検出しうる発現レベルを示さない」とは、DefH9プロモーターに連結された遺伝子の発現が栄養組織のプローブ中にノーザンブロット分析で検出できないことを意味する。そのようなノーザンブロット分析は当技術分野で知られている方法に従って行うことができ、好ましくは本明細書の実施例（下記参照）に記述するように行われる。イン・サイチュハイブリダイゼーションによって示されるように、DefH9遺伝子の発現は花の生育の初期相中に胎座と胚珠で極めて特異的に起る。本発明では、栄養組織におけるDefH9プロモーターの発現レベルがノーザンブロット分析の検出限界未満であることを示す（図３参照）。キンギョソウのDefH9（Deficie nsホモログ９）遺伝子は、Rolf Hansenの博士論文（ケルン大学数理学部、1993 年）に記述されている。この論文にはDefH9遺伝子のcDNA配列とゲノム配列が、そのプロモーター領域とその調節配列を含めて開示されている。DefH9遺伝子は、初期段階では雌性生殖器官の生育しつつある胎座および胚珠で特異的にその発現が起り、後期段階ではその発現が胚珠と胎座維管束とに限定されるようになる MADSボックス遺伝子である。DefH9のプロモーターと調節領域のヌクレオチド配列を図２と配列番号１に示す。この配列では転写開始部位が2265番目に位置する。第一イントロンは転写非翻訳リーダー内に位置し、配列番号１に示す配列のヌクレオチド2418〜3462に対応する。「プロモーター」という用語は、転写開始（すなわちRNAポリメラーゼの結合）に必要なヌクレオチド配列を指し、例えばTATAボックスなども含まれる。「調節領域」という用語は、例えばそれらが組織特異性を付与するというような意味で発現レベルにさらなる影響を及ぼす配列を指す。そのような領域は転写開始部位の上流に位置しうるが、その下流、例えば転写非翻訳リーダー配列中、特にイントロン中などにも位置しうる。本発明において「DefH9プロモーター」という用語は、上述の特異性（すなわち植物の胎座および／または胚珠での特異的発現と栄養組織の細胞での検出不能な発現）を得るために必要なプロモーターと調節領域を含むものとして使用される。本発明の好ましい態様として、プロモーターは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド１〜2264、またはその断片であってまだトランスジェニック植物の胎座および／または胚珠での特異的発現を付与するものを含む。そのような断片は、最も好ましくは、プロモーターの他にキンギョソウのDefH9遺伝子の転写非翻訳リーダー配列に対応するヌクレオチド2265〜3480、最も好ましくは第一イントロン（ヌクレオチド2418〜3462）をさらに含む。「DefH9プロモーター」という用語は、キンギョソウのDefH9遺伝子と相同であってそのプロモーター領域がDefH9プロモーターと同じ組織特異性を持つ、同じ植物種または別の植物種に由来する遺伝子のプロモーター領域と調節領域をも包含する。そのようなプロモーターは、雌性生殖器官の細胞（すなわち胎座および／または胚珠の細胞または胎座または胚珠から派生した組織の細胞）以外の器官および組織での極めて低い活性レベルを特徴とする。キンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子は、キンギョソウのDefH9遺伝子産物に構造的または機能的に相同なタンパク質をコードする遺伝子である。構造的相同性とは、好ましくは、その遺伝子のコード領域がキンギョソウのDefH9遺伝子のコード領域と少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を示すことを意味する。より好ましくは、キンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子は、MADSボックスタンパク質ファミリーに属するタンパク質、さらに好ましくはMADSボックスタンパク質のAGAMOUSサブファミリーに属するタンパク質をコードする。したがって本発明では、キンギョソウ由来のDefH9プロモーターに構造的または機能的に相同な他種由来のプロモーター、または胎座および／または胚珠で発現されるというばかりでなく最も重要なことに栄養組織では検出しうる発現レベルを示さないという意味で同じ発現パターンを示すプロモーターを使用できる。当業者は、キンギョソウ由来の既知のDefH9遺伝子を利用して、他の植物品種または植物種から対応する遺伝子を単離することができる。これは、当技術分野で知られている従来の技術で、例えばDefH9遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして使用したり、適当なPCRプライマーを設計することによって行いうる。次に、対応するプロモーター領域を従来の技術で単離し、その発現パターンについてそれを調べることができる。この目的には、例えばルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をそのプロモーターに融合し、トランスジェニック植物におけるそのレポーター遺伝子の発現を評価することができる。また、本発明は、栄養組織の細胞では検出しうる発現を示すことなく植物の胎座および／または胚珠での特異的発現を付与できる、キンギョソウのDefH9プロモーター、または相同遺伝子のプロモーターまたはその一部と実質上同一なプロモーター領域の使用に関する。そのようなプロモーターは、上述のプロモーターとは１ヶ所またはそれ以上が異なるが、依然として同じ特異性を持つ。すなわち、それらプロモーターは上述の組織特異性を担う配列モチーフと同じまたは類似する配列モチーフを含む。好ましくは、それらプロモーターは上述したプロモーターの一つに、最も好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。上述したプロモーターの一つと少なくとも85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の配列同一性を持ち同じ特異性を持つプロモーターがとりわけ好ましい。上述のように、DefH9プロモーターまたは栄養組織における基礎発現レベルが極めて低い同一のまたは類似する発現パターンを示す相同遺伝子のプロモーターは、単為結実的生育を示す植物の遺伝子工学による作出にとりわけ有用である。植物で単為結実的生育を達成する一方法は、植物の雌性生殖器官の細胞、好ましくは胎座および／または胚珠におけるオーキシンの含有量および／または活性の増加である。一般に、これは種々の方法で達成できる。本発明の一態様では、雌性生殖器官の細胞における少なくとも１種類のオーキシンの含有量および／または活性の増加が、発現時に少なくとも１種類のオーキシンの細胞内含有量または活性の増加をもたらすDNA配列を、植物内でDefH9プロモーターの制御下に発現させることによって達成される。「オーキシンの含有量および／または活性の増カ旧という用語の一つの意味は、あるオーキシンの合成速度が増加することである。これは例えば、ある代謝産物のオーキシンへの直接的な変換を増加させるか、あるいは各オーキシンに変換されるオーキシン前駆体の合成量を増加させ、その結果としてその前駆体の濃度を増加させることによって達成されうる。この用語のもうひとつの意味は、複合型オーキシンの放出が増進されること、またはオーキシンの複合体化が防止されるまたは減少することである。このような関係においては、「オーキシン」という用語は、好ましくは極めて低濃度で、最も好ましくはわずか10^-6M未満の濃度で苗条の伸長を促進し根の伸長を抑制するという意味で、植物ホルモンとして作用する天然物質と合成有機物質を包含する。好ましくは、オーキシンは植物の生育に対して次に挙げる作用の少なくとも一つを示す：細胞分裂の刺激、細胞伸長および／または細胞拡大の刺激、頂芽優性の刺激、木部分化の刺激、形成層の細胞の細胞伸長および細胞分裂活性の刺激、側根および不定根形成の刺激、根粒着生の刺激、発芽の刺激、葉の上偏生長の刺激、子房細胞成長の刺激、単為結実の刺激、雌花の形成の刺激、および葉の拡大の刺激。より具体的には「オーキシン」という用語は、植物細胞ではおそらくはトリプトファンからインドール-3-ピルベートとインドール-3-アセトアルデヒドを経由して合成されると考えられ、酵素的に触媒される酸化反応によって分解される、インドール酢酸（IAA）を指す。しかし、この用語は、インドールまたは他の化合物から誘導されオーキシンとして作用する他の天然化合物、例えば非インドールオーキシンである天然のフェニル酢酸や4-(インドール-3-イル）酪酸なども包含する。さらにこの用語は、上に列挙した植物の生育に対する作用の少なくとも一つを持つ植物以外の生物から得られる化合物または化学合成された化合物も包含する。そのような化合物の一例は2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)である。好ましい態様として、DefH9プロモーターに連結されるDNA配列は、植物細胞で少なくとも一種類のオーキシンの生合成に本来関与するポリペプチドをコードする。植物細胞でのそのDNA配列の発現はこのポリペプチドの生物活性（例えば酵素活性）の増加をもたらし、その結果、その細胞における少なくとも一種類のオーキシンの含有量および／または活性の増加をもたらす。したがって原則として、この態様によって、植物細胞でのオーキシンの含有量および／または活性は、少なくとも一種類のオーキシンの生合成を植物細胞中に本来存在する生合成経路の刺激／加速によって増加させることにより、増大させうると考えられる。もうひとつの好ましい態様として、DefH9プロモーターに連結されるDNA配列は、植物細胞では本来発現されないタンパク質であって、植物細胞での発現時に少なくとも一種類のオーキシンまたはオーキシンの前駆体を植物細胞中に存在する代謝産物から合成させるタンパク質をコードする。これに関連して使用しうる遺伝情報は、例えばいくつかの細菌のゲノムに存在する。例えば細菌によって誘発される植物の病因では多くの場合、ホルモンの生合成、含有量および活性の変化が植物と細菌の相互作用に重要な役割を果たしている。したがって本発明のより好ましい態様として、DefH9プロモーターに連結されるDNA配列は細菌タンパク質、すなわち植物細胞内で少なくとも一種類のオーキシンの含有量または活性の増加をもたらすタンパク質をコードする。好ましくは、該DNA配列は、シュードモナス（Pseudomonas）属またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌のタンパク質をコードする。より好ましくは、該D NA配列はシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）もしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のタンパク質をコードする。本発明の目的に好ましく使用される遺伝子の一例は、オリーブまたはセイヨウキョウチクトウの植物腫瘍の病原体シュードモナス・シリンゲ・パソバール・サバスタノイ（Pseudomonas syringae pv．savastanoi）のiaaM遺伝子である（Sp enaら，Curr．Opinion in Biotechnology 3（1992）159−163;Gaudinら，1994，上記引用文献中）。腫瘍形成は、細菌によって合成され周囲の組織に分泌されて植物細胞の無制限生長を引き起こす植物ホルモンによって引き起こされる。このタイプの腫瘍の病因に関与する遺伝子のうち、iaaM遺伝子はインドールアセトアミドモノオキシゲナーゼをコードし、酸化反応によるアミノ酸トリプトファンのインドールアセトアミドへの変換を担っている。インドールアセトアミドは格別なオーキシン活性を持たないが、これは化学的または酵素的に（植物ハイドロラーゼ類により）ゆっくりと、植物におけるオーキシンの主要形態であるIAAに変換される。トランスジェニック植物におけるiaaM遺伝子の発現はそれだけでホルモンの代謝と活性に変化を引き起こし、その結果、生化学的過程および生育過程を変調させうる（Sitbonら，Plant Physiol．95（1991）480-485）。したがって、組織培養からのトランスジェニック植物の再生を妨げるかもしれない構成的発現を避け、トランスジェニック植物がその栄養生長性に変化を生じる可能性を避け、および／または、再生過程と両立しうる低い発現レベルだけを発現させるために、iaaMコード配列は本発明に従ってDefH9プロモーターの制御下に置かれる。本発明は、シュードモナス・シリンゲのiaaM遺伝子がDefH9プロモーターによって操作される場合、植物に単為結実的生育をもたらしうることを立証する。さらにiaaM遺伝子発現の時間的空間的に正確かつ特異的な制御が単為結実的生育の発生に決定的な役割を果たすことも明らかにする。高度に特異的で厳しく制御されたDefH9プロモーターと制御配列下での発現は、栄養生長には変化がなく結実と果実の生育に改変が加えられたトランスジェニック植物の再生を可能にする。これに反し、栄養組織におけるiaaMの基礎発現レベルは、栄養生長に変化がなくしかも望ましい組織または器官内でiaaM遺伝子を最適な強度で発現させるトランスジェニック植物の再生とは両立しない。シュードモナス・シリンゲ亜種サバスタノイ（Pseudomonas syringae subsp． savastanoi）由来のiaaM遺伝子は既知遺伝子であり、その配列は公表されている（Yamadaら，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 82（1985）6522-6526）。本発明によれば、本発明の目的にはP．シリンゲのiaaM遺伝子と機能面で相同な遺伝子を使用しうる。当業者は、好ましくはヌクレオチド配列についても相同であるそのような遺伝子を、既知の方法、例えばP.シリンゲのiaaM遺伝子に基いて設計されたプローブでcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングした後、その遺伝子産物をその生物活性について試験することで単離できる。P．シリンゲのiaaM遺伝子と類似する活性を持つそのような遺伝子は、例えばアグロバクテリア（すなわちA．ツメファシエンス，A．リゾゲネス）のいくつかの株からクローニングされている（例えばKleeら，Gene Dev．1（1987）86-96;Whiteら，J ．Bacteriol．164（1985）33-44;Cardarelliら，Mol．Gen．Genet．208（1987） 457-463を参照されたい）。さらに、本願が提供する実験データは、DefH9プロモーターの制御下でのiaaM 遺伝子の発現が、ナスの受精と果実の生育にとって極めて不利な気候条件に相当する条件下でさえそれらの植物が結実と果実の生育を示すという予想外の効果を持つことを示す。したがって本発明は、オーキシンの濃度および／または活性を増大させるDNA配列が植物の雌性生殖器官の細胞で特異的に発現することにより、不利な気候条件下でさえ結実が起りうるという証拠を提供する。これはこの方法で結実と果実の生育を増進できることを意味する。これは、非形質転換植物と比べて本発明のトランスジェニック植物が（受粉によりまたは受粉なしで）実を結ぶことができ、非トランスジェニック植物では受精および／または果実の生育が不可能な気候条件下でそれらを生育させうることを意味する。本発明のもうひとつの好ましい態様では、DefH9プロモーターによって発現させられるDNA配列が、毛根病の病原体アグロバクテリウムリゾゲネスのA4 Riプラスミド由来のrolB遺伝子（Spenaら，1992，上記引用文献中；Gaudinら，1994 ，上記引用文献中）またはrolB遺伝子と機能的に同等な他の供給源由来の遺伝子である。 rolB遺伝子は、それだけで植物の生長を変化させることができる。これはβ- グルコシダーゼ活性を持つタンパク質をコードし、そのタンパク質は不活性なインドールエタノール-β-グルコシド（IEG）を加水分解してその不活性グルコシドから活性なオーキシンであるインドールエタノールを放出させるのかもしれない。この未公表の仮説によれば、この遺伝子は輸送可能な成長因子類の合成に直接関与するのではなく、不活性なグルコシドからインドールエタノールを放出させると予想される。インドールエタノールはそれ自体が作用するのかもしれないし、また植物におけるオーキシンの主要形態であるIAAに変換されるのかもしれない。 A．リゾゲネスのRiプラスミドA4由来のrolB遺伝子の配列は、Slightomら(J．B iol．Chem．261（1986）108-121)によって公表されており、詳細な説明はSpena ら（EMBO J．6（1987）3891-3899）によって為されている。類似の活性を持つ遺伝子は、アグロバクテリウムリゾゲネスの他のいくつかの株からクローニングされており、関連配列はいくつかの植物種（例えばNicotiana glauca（キダチタバコ））のゲノムからクローニングできた。本発明は、rolB遺伝子が少なくともタバコではいずれの場合もそれだけでは単為結実的生育を誘発できないという証拠を提供する。したがってDefH9プロモーターの制御下にあるrolB遺伝子は、特定の状況下（例えば特定の環境条件下）に独力で単為結実的生育を示す植物に使用することが好ましい。これらの場合は、 DefH9プロモーターの制御下でrolB遺伝子を発現させることにより、単為結実的生育の発生を増加させることができる。本発明の好ましい態様として、単為結実的生育を達成するために、rolB遺伝子とiaaM遺伝子を組み合せて使用する。これは、例えばこれら２つの遺伝子を同時に導入するか、これらの遺伝子で植物を逐次形質転換することによって行ってもよい。あるいは、一方がiaaM遺伝子をDefH9プロモーターの制御下に含み、他方がrolB遺伝子をDefH9プロモーターの制御下に含む二つの植物を交雑させてもよい。これらの場合、たとえDefH9-rolB遺伝子の発現自体は目的のすべての植物には単為結実的生育をもたらすことができないとしても、それは好ましくはDefH9 ｃ-iaaMキメラ遺伝子と連携して単為結実的生育を増加させることができる。この態様は、とりわけ次の理由から好ましい。実験結果は、rolB遺伝子産物が不活性なインドール-β-グルコシドを加水分解することによって、天然オーキシンであるインドールエタノールを放出する可能性のあるβ-グルコシダーゼであることを示した。IAAが増加するとIAAのインドールエタノールへの変換が増加し、そのインドールエタノールはさらにインドールエタノール-β-グルコシドに変換される。したがって、例えばDefH9-iaaM遺伝子を導入した植物ではIAAが増加しているばかりでなく、子房内でrolB遺伝子産物の基質となる不活性なインドールエタノール-β-グルコシドの含有量も増加している。したがって、同じ組織内でのrolB遺伝子の発現はインドールエタノール-β-グルコシドを活性なオーキシンであるインドールエタノール（これは次いでIAAに逆変換されうる）に加水分解するだろう（CohenおよびBialek，「The Biosynthesis and Metabolism in Hi gher Plants（訳：高等植物における生合成と代謝）」（CrozierおよびHillman 編），Society for Experimental Biology Seminar 23(1984)の16５〜181頁）。このように、DefH9-rolB構築物の使用は、主としてインドールエタノール含有量を増加させることによりDefH9-iaaM遺伝子のオーキシン効果を強化することになる。このことの実用上の意義は、インドールエタノールを使った花芽の化学処理によって単為結実果を生育させる能力について、交雑で使用すべきDefH9-rolBトランスジェニック植物をスクリーニングできる可能性である。外的に供給されたインドールエタノールは、正常植物と非発現トランスジェニック植物では不活性なインドールエタノール-β-グルコシドへのその変換ゆえに一過性の作用を持つだろうが、十分に高いレベルのrolBタンパク質の発現はその不活性グルコシドを活性なアグリコンに加水分解するだろう。その結果、これら２つの遺伝子は２種類の方法でオーキシンの含有量と活性を増加させるように作用するだろう。すなわち（１）DefH9-iaaMキメラ遺伝子は、インドールアセトアミド経由で主としてIA Aの含有量を増加させ、（２）DefH9-rolBは、主としてインドールエタノールをそのグルコシドから放出することによってオーキシン効果を持つだろう。したがって、その作用はインドールエタノール-β-グルコシドの含有量が高い植物だけに限定されるだろう。インドールエタノール-β-グルコシドの含有量は、IAAまたはインドールエタノールを化学的に加えるか、トランスジェニック植物内でia aM遺伝子を発現させることによって高めることができる。本発明のさらなる好ましい態様では、DefH9プロモーターによって発現させられるDNA配列がインドールピルベートデカルボキシラーゼをコードする配列である。インドールピルベートデカルボキシラーゼは、IAAがトリプトファンから合成されるIAA合成のインドールピルビン酸経路の鍵酵素である。この経路ではインドールピルビン酸の変換が律速段階である。好適なインドールピルベートデカルボキシラーゼをコードするDNA配列は、例えばエンテロバクタークロアカエ（Enterobacter cloacae）からクローニングされている（例えばKogaら，Mol．G en．Genet．226（1991）10-16を参照されたい）。植物中に存在する最も一般的なオーキシンIAAは、主としてそのカルボキシル基を介して種々のアミノ酸、ペプチドおよび炭水化物と複合体化している。この複合体は、細胞中に存在するIAAの約95％を占める。これらの複合体は、遊離IA A濃度の急速な変化を可能にすると思われる。したがって、植物の雌性生殖器官の細胞中のオーキシンの含有量および／または活性を増加させるもうひとつの方法は、発現時にオーキシン（例えばIAA）のその複合型（１または複数）からの放出を増加させるか、遊離オーキシンの複合型への変換を減少させるDNA配列を、DefH9プロモーターの制御下に発現させることだろう。そのようなDNA配列の一例は、IAAとアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物との複合体を加水分解するDNA配列である。好ましい態様では、DefH9プロモーターによって発現させられるそのDNA配列が、植物の化R1遺伝子である。ILR1遺伝子によってコードされるタンパク質は、アミノヒドロラーゼ活性を持ち、IAAをアミノ酸との複合体から放出させる。ILR1 遺伝子は、種々の植物に由来するもの、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsistha liana）由来のもの（BartelおよびFink，Science 263（1995）1745-1748;GenBan kアクセッション番号U23794）などが知られている。類似する酵素活性を持つタンパク質をコードするDNA配列を細菌から得ることもできる。さらなる例は、それぞれILL1タンパク質とILL2タンパク質をコードするILL1遺伝子とILL2遺伝子である。これらDNA配列は、例えばシロイヌナズナから単離されており、それぞれGenBankアクセッション番号U23795およびU23796として入手できる。上述のように、植物細胞でオーキシンの含有量および／または活性を増加させるもうひとつの方法として、遊離IAAのその複合体への変換速度を低下させることが考えられる。これは、この変換を触媒するタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することによって達成できる。考えうる方法は、例えばアンチセンス RNA、リボザイムまたは特異的阻害因子の発現である。そのような反応を触媒するタンパク質は、例えばトウモロコシのiaglu遺伝子によってコードされるタンパク質である。対応するDNA配列はクローニングされている（例えばSzersenら，Science 265（1994）1699を参照されたい）。また、オーキシン分解速度の低下はそのオーキシン（例えばIAA）の分解に関与する酵素の発現を阻害することによっても行える。オーキシンの含有量および／または活性を増加させる方法としては、さらにその輸送の阻害も考えられる。「オーキシンの含有量および／または活性の増加」という用語のもうひとつの意味は、オーキシンレセプターの活性または感受性が増加するということである。したがって、例えば植物細胞中で上記プロモーターの制御下にオーキシンレセプターであるタンパク質を発現させることにより、オーキシンの生物活性を増加させることができる。また、オーキシンに対してより高い感受性を持つオーキシンレセプターを発現させることもできる。これもまたオーキシンの生物活性の増加をもたらすだろう。植物で単為結実を樹立するもうひとつの方法は、雌性生殖器官の細胞における少なくとも一種類のジベレリンの含有量および／または活性の増加である。これは、例えば植物中でジベレリン類の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現によって達成されるうる。そのような遺伝子は例えばSunら(Plan t Cell 4（1992）119-128)やBensenら(Plant Cell 7（1995）75-84)に記述されている。 DefH9プロモーターの活性は植物の胎座および／または胚珠で上述した高い特異性をもつことから、これは、例えば雑種種子の作出に関係する雌性不稔植物の作出にとって有用な手段にもなる。したがって本発明は、もうひとつの側面として、キンギョソウのDefH9遺伝子のプロモーター領域またはキンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子のプロモーター領域であって植物内でそれに連結されたDNA配列の胎座および／または胚珠特異的発現を指示できるものを雌性不稔の樹立に使用することに関する。欧州特許出願EP-A1 0 412006号明細書に記述されているように、雌性不稔は、いわゆる「雌性不稔DNA」（すなわち発現時に雌性生殖器官の細胞の適切な代謝、機能発現および／または生育を著しく不都合に撹乱するDNA）を植物の雌性生殖器官の細胞で特異的に発現させることによって達成できる。該DNAは細胞での発現時に細胞死をもたらすことが好ましい。植物で雌性不稔を樹立するためにDe fH9プロモーター領域と組み合せて使用しうるそのようなDNA配列の例は、DNアーゼ（例えば制限エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼ）、RNアーゼ（例えばバルナーゼやRNアーゼT1）、プロテアーゼ（例えばトリプシンやパパイン）、グルカナーゼ、リパーゼ、脂質ペルオキシダーゼ、植物細胞壁合成阻害因子、植物細胞にとって毒性を持つ細菌毒素（例えばボツリン、ジフテリア毒素など）である。他の例は、植物細胞中で通常発現される遺伝子の転写物のアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列である。この方法は、例えば欧州特許出願EP-A0 223 399 号明細書に記述されている。転写されたアンチセンスRNAは、植物細胞中に天然に存在する対応する転写物の翻訳を阻害する。この点で使用しうるDNA配列には、好ましくは、植物細胞の機能発現に必須なRNAまたはタンパク質をコードするもの（例えばrRNA遺伝子）が含まれる。「雌性不稔DNA」として使用しうるDNA配列のもうひとつの例は、与えられた標的配列を高度に選択的に切断できるリボザイムをコードするDNA配列である。そのような標的配列は、やはり植物細胞の機能発現に必須な産物の遺伝子の転写物であることが好ましい。上述の説明から明らかなように、発現の特異性と栄養組織での検出不可能な構成的発現レベルは、栄養生長には変化がないが単為結実的生育または雌性不稔を示すトランスジェニック植物の作出に決定的な役割を果たす。DefH9遺伝子は今までに試験された花特異遺伝子のなかで唯一、栄養組織で検出不可能な発現レベルを示すものである。この要件は、その発現が植物内のオーキシンの含有量および／または活性に影響を及ぼすか、細胞の死または無能化をもたらす遺伝子を使用する場合に不可欠である。例えば、子房特異的発現によって達成された子房内でのオーキシンの含有量と活性の増加は、園芸実務で使用されるオーキシンの外的適用を模倣することになるだろう。しかし、栄養組織内での発現は極めて低い基礎発現であっても植物の再生および／または植物の生長を妨げることになるだろう。しかし、栄養生長の変化は園芸および果実作物には望ましくない特徴である。さらなる側面として、本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結された少なくとも一つのDNA配列であって植物中で発現した時にその細胞内の少なくとも一種類のオーキシンの含有量および／または活性の増加をもたらすものとを含んでなる組換えDNA分子に関する。そのような組換えDNA分子は、一般的にはさらに該DNA配列の3'末端に転写終結領域をも含む。好ましい態様として、そのような組換え分子中に使用されるプロモーターは配列番号１に記載のヌクレオチド配列またはその断片であって、それでもなおトランスジェニック植物の胎座および胚珠における特異的発現を付与するものを含む。そのような構築物中で該プロモーターに連結されるDNA配列は、単為結実的生育を示す植物を作出するためのDefH9プロモーターの使用に関連して上述したDN Ａ配列の一つであることが好ましい。さらなる側面として、本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結された少なくとも一つのDNA配列であって植物中で発現した時にその植物の雌性生殖器官の細胞の死および／または無能化を引き起こすことにより雌性不稔をもたらすものとを含んでなる組換えDNA分子に関する。そのような組換えDNA分子は一般的にはさらに該DNA配列の3'末端に転写終結領域を含む。好ましい態様として、そのような組換え分子に使用されるプロモーターは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはその断片であってそれでもなおトランスジェニック植物の胎座および胚珠における特異的発現を付与するものを含む。そのような構築物中で該プロモーターに連結されるDNA配列は、雌性不稔を示す植物を作出するためのDefH9プロモーターの使用に関連して上述したDNA配列の一つであることが好ましい。さらに本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結されたDNA配列であって植物中で発現した時にその細胞内で少なくとも一種類のオーキシンの含有量および／または活性の増加を引き起こすものとを含む上述のような組換えDNA分子で形質転換された宿主細胞に関する。それら宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）であってもよいし、真核細胞（例えば真菌細胞や動物細胞）であってもよい。好ましい態様では、宿主細胞は植物細胞である。したがって本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結されたDNA配列であって植物中で発現した時にその細胞内で少なくとも一種類のオーキシンの含有量および／または活性の増加を引き起こすものとを含む組換えDNA分子で形質転換され遺伝子操作されたトランスジェニック植物細胞にも関する。そのような細胞は、そのゲノム中に安定に組込まれた上述のような組換えDNA分子を含有するという特色によって特徴づけられる。本発明の好ましい態様として、共にDefH9プロモーターの制御下にあるiaaM遺伝子とro1B遺伝子で、植物細胞が形質転換される。また本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。そのような植物は、その栄養生長には変化がなく、オーキシンの含有量および／または活性の増加ゆえに単為結実的生育を示しうる。栄養生長に変化がないという特徴はとりわけ重要であり、これは栄養組織ではDefH9プロモーターに連結されたDNA配列の検出しうる発現がないことによる。本発明の植物は、次に挙げる特徴の少なくとも一つを示すことが好ましい：ａ）単為結実的生育（すなわち受精を伴わない果実の生育）、ｂ）無核単為結実果、ｃ）受粉された場合は種子を持つ果実、ｄ）子房内、胎座および胚珠内における、好ましくは加えて胚珠または胎座から派生した組織における高特異的発現、ｅ）約２×10⁹cpm/μg DNAの比活性で標識されたプローブによるノーザンブロット分析の検出限界から推定して他の組織での発現がないこと、ｆ）対応する非形質転換植物と比較した場合の結実および／または果実の生育の増進。また本発明は、本発明の植物の器官であって上述の細胞を含む部分に関する。具体的には、本発明はそれら植物の果実と、任意の種類の繁殖物質（例えば種子、実生また挿木）に関する。さらにまた本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結されたDNA配列であってその宿主細胞を含む植物中で発現したときにその植物を雌性不稔にするように植物の雌性生殖器官の細胞の死または無能化を引き起こすものとを含む組換え DNA分子で形質転換された宿主細胞に関する。それら宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）であってもよいし、真核細胞（例えば真菌細胞や動物細胞）であってもよい。好ましい態様では、宿主細胞は植物細胞である。したがって本発明は、DefH9プロモーターと、それに連結されたDNA配列であってその宿主細胞を含む植物中で発現した時にその植物を雌性不稔にするように植物の雌性生殖器官の細胞の死または無能化を引き起こすものとを含む組換えDNA分子で形質転換され遺伝子操作されたトランスジェニック植物細胞に関する。そのような細胞は、そのゲノム中に安定に組込まれた上述のような組換えDNA分子を含有するという特色によって特徴づけられる。また本発明は、上述したような植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。そのような植物は、雌性生殖器官の細胞におけるDefH9プロモーターに連結されたDNA配列の発現ゆえに雌性不稔を示す。さらに本発明は、上述した植物の器官であって本発明の植物細胞を含むもの、具体的には例えば花粉、挿木など繁殖物質に関する。本発明の植物は、所望の植物種のいずれに属してもよく、好ましくはナス科（ Solanaceae）、サボテン科（Cactaceae）、マメ科（Papilionaceae）、マタタビ科（Actinidaceae）、ウリ科（Cucurbitaceae）、アカネ科（Rubiaceae）、クワ科（Moraceae）、ミカン科（Rutaceae）、ブドウ科（Vitaceae）、カキノキ科（ Ebenaceae）、ベンケイソウ科（Crassularaceae）、バラ科（Rosaceae）、バラ科（Drupaceae）、トケイソウ科（Passifloraceae）、パパイヤ科（Caricaceae ）、ツツジ科（Ericaceae）、イネ科（Gramineae）、十字花科（Cruciferae）、ナデシコ科（Cariofillaceae）、ヒガンバナ科（Amaryllidiaceae）、アヤメ科（Iridaceae）、マメ科（Leguminosae）、ユリ科（Liliaceae）、ボタン科（Paeoniaceae）、ケシ科（Papaveraceae）、サクラソウ科（Primulaceae）、ゴマノハグサ科（Scrophulariaceae）、スミレ科（Violaceae）、アオイ科（M alvaceae）およびイネ科（Gramiaceae）からなる群またはキウイフルーツ（Acti nidia sinensis）種から選択される科の植物を使用する。ナス、トマト、メロンまたはスイカ、キュウリ、カンキツ類、コショウ、イチゴ、ブドウ、リンゴ、西洋ナシ、サクランボまたはオリーブに由来する植物がとりわけ好ましい。原則的に、双子葉植物と単子葉植物は、どちらも本発明の植物を作成するための好適な出発物質である。本発明の上記トランスジェニック植物は、半数体または倍加半数体雌性発生植物を作出するための外植片（すなわち子房および／または胚珠）の供給源として使用できる。オーキシンは、試験管内雌性発生カルスまたは胚を得て、次いで植物を得るために使用される培地に含まれる成長因子類である。トランスジェニック植物の胚珠および胎座における適当なキメラ遺伝子（例えばDefH9-iaaMキメラ遺伝子のみ、DefH9-rolBキメラ遺伝子のみ、またはDefH9配列の制御下にあるiaa Mコード領域とrolBコード領域の組み合せ）の特異的発現により、この技術が現在使用されている植物種中に生じる雌性発生植物の頻度を向上させるか、または雌性発生を利用しうる種の数を広げることを可能にする、オーキシンの増加が保証される。胚珠特異的発現によって達成される子房内のオーキシンの含有量と活性の増加は、本来なら花粉管成長と受精によってのみ引き起こされる胚嚢での半数体細胞分裂の刺激を強化することにより、不全花粉による受粉後の雌性発生植物の回収率をも向上させる（例えばKellerとKorzumの総説（Jain，Soporyおよび Veilleux編「in vitro haploid production of higher plants」第１巻（オランダ・Kluwer Academic Publishers，1996）の217-235頁）を参照されたい）。 iaaMおよび／またはrolBコード領域の胚珠特異的遺伝子発現の上述の機構は、遠縁の植物種間の交雑を目的とする配偶子融合／受精または試験管内柱頭／胎座／胚珠／受粉による有性交雑後に形成される生存可能な胚の頻度に対して全般的にプラスの効果を発揮するだろう。BhojwaniとRasteが「in vitro haploid prod uction of higher plants」第１巻（Jain，SoporyおよびVeilleux編，オランダ・Kluwer Academic Publishers，1996）の237-262頁に報告しているように、使用される培養培地の大半は接合子分裂を刺激するための成長因子としてオーキシン類を含有する。本発明のトランスジェニック植物は、さらに単為結実的生育性を持つ植物を育種するために、または不完全な単為結実的生育を示す品種における単為結実形質の表現度を育種によって増加させるために使用できる。また、本トランスジェニック植物は、雌性発生用物質の供給源としておよび／または試験管内受精にも使用できる。本トランスジェニック植物細胞とトランスジェニック植物は、当技術分野で知られている従来の方法に従って作成できる。具体的には、本植物は次の方法のいずれでも作出できる：１．本発明の組換えDNA分子または少なくとも二つの本発明の組換えDNA分子の組み合せを保持するプラスミドを含有するアグロバクテリウムツメファシエンス細菌またはアグロバクテリウムリゾゲネス細菌による植物プロトプラストまたは植物外植片の形質転換。２．上述の構築物を保持するアグロバクテリウム株を使って植物を感染させるイン・プランタ（in planta）形質転換。３．植物のプロトプラスト、組織または器官のエレクトロポレーション。４．上述の組換え構築物で被覆した粒子を用いた植物組織または植物器官の射撃（ボンバードメント）。５．化学法（例えばPEG）による上記組換え構築物の植物プロトプラスト取り込み。６．植物のプロトプラスト、分裂組織、小胞子、花粉、胚珠、組織または器官への上記組換えプラスミドのマイクロインジェクション。７．花粉と上述したもののいずれかを保持するプラスミドの混合物による植物の受精。８．上記構築物のいずれかを保持するアグロバクテリアへの小植物体全体または種子のばく露。９．上記組換え構築物を含有する染色体の全部または一部の遺伝子移入。 10．上記構築物を用いたファイバーカーバイド植物形質転換。 11．直接形質転換法または媒介形質転換法により上記構築物のいずれかで形質転換された花粉による植物の受精。本発明の上記構築物の組み合せを植物細胞または植物に導入しようとする場合は、その組み合せは（ｉ）独立した構築物の同時形質転換、（ii）両キメラ遺伝子（すなわちDefH9-iaaM遺伝子とDefH9-rolB遺伝子）を同じ構築物上に乗せること、（iii）両者がDefH9プロモーターと制御配列の制御下に発現されることを保証するために２つのオープンリーディングフレーム間に内部リボソーム侵入部位を持つビスシストロン性mRNAを構築すること、または（iv）それぞれ例えばDefH 9-iaaM遺伝子またはDefH9-rolB遺伝子を含有する２つの独立したトランスジェニック植物の有性および無性交雑、によって達成できる。図面の説明図１：使用したキメラ遺伝子の略図。キンギョソウ由来のDNA配列は、（ｉ）シュードモナスサバスタノイのiaaM遺伝子、（ii）アグロバクテリウムリゾゲネスのrolB遺伝子、（iii）シロイヌナズナのill1、ill2またはilr1遺伝子に由来するコード領域を転写するためのプロモーターおよび調節配列を提供する。 A．ツメファシエンスのnos遺伝子由来の転写終結シグナルが含まれる場合は、そのように表示してある。図２：実施例に記述するようなプラスミドの構築に使用されるキンギョソウの DefH9遺伝子のプロモーターおよび調節配列のDNA配列。図３：キンギョソウにおけるDefH9m RNAの発現を示すノーザンブロット分析。種々の器官から得た２μgのmRNAを数字で示した各レーンに充填した。左から右へ：実生(1)、葉(2)、包葉(3)、萼(4)、花弁(5)、雄ずい(6)および心皮(7)。ハイブリダイゼーションシグナルは心皮から抽出したmRNAにのみ検出される。図４：野生型SRIタバコ（左）とトランスジェニックDefH9-iaaM単為結実性植物（右）の比較。トランスジェニック植物は、その栄養生長が変化していない。すなわちトランスジェニック植物は生長性と開花に何の変化も示さない。図５：野生型SR1タバコ（左）とトランスジェニックDefH9-iaaM植物（右）の開花期における比較。DefH9-iaaM遺伝子を導入した植物は、生長性に何の変化も示さない。図６：野生型タバコとDefH9-iaaMタバコにおける自家受粉によって得られたさく果の比較。このトランスジェニック植物は、受粉すると正常なさく果を生育させうる。図７：DefH9-iaaM植物で受粉によってまたは受粉なしで（単為結実的に）生育させたさく果の比較。このトランスジェニック植物は、除雄しても（すなわち単為結実的に）さく果を生育させうる。そのさく果は無核である。図８：受粉したDefH9-iaaMトランスジェニック植物から得られるさく果。正常な種子生育が観察される。図９：除雄した花から生育させた同じ植物のさく果。種子の生育は起らない。図10：図10は、自家受粉（×）および受粉なし（EM）によって生育させた果実を持つ、DefH9-iaaM遺伝子で形質転換されたトランスジェニックナスを示す。図11：図11は、DefH9-iaaM遺伝子で形質転換されたナスの自家受粉によってまたは受粉なしで得られた果実の比較を示す。図12：図12は、DefH9-iaaM遺伝子で形質転換されたナスについて、自家受粉によって得られた果実（これは生育中の種子を含む）と受粉なしで得られた果実（これは種子を含まない）（単為結実果）の比較を示す。本発明を下記の実施例で説明する。下記の実施例では次の材料と方法を使用した。１．細菌株と培養組換えプラスミドの増殖には大腸菌細胞DH5αを使用した。すべての組換えプラスミドはエレクトロポレーションまたは接合により標準的な技術を使ってアグロバクテリウムツメファシエンスGV310l株に導入した(KonczおよびSchell，Mo l．Gen．Genet．204（1986）383-396)。２．組換えプラスミドと構築物の構築使用した組換えプラスミドと構築物は確立された方法に従って構築した(Mania tisら，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labora tory，1982)。３．植物組織の培養と形質転換 3.1 タバコの形質転換タバコ栽培品種Petit Havana SR1のアグロバクテリウムツメファシエンスによる形質転換はリーフディスク法で行なった。リーフディスクを試験管内で生育した植物から調製し、0.5mg/Lチジアズロンと0.1mg/L IAAを添加したMS（Murash igeおよびSkooog，Physiologica Plantarum 15（1962）473-497）基本培地で２日間前培養し、200μMのアセトシリンゴンを含むMS液体基本培地に0.1のOD₆₀₀で再懸濁したアグロバクテリア終夜培養物に５分間浸漬し、同じペトリ皿に戻した。２日後、そのリーフディスクを、100mg/Lカナマイシンと500mg/Lセフォタキシムを含む同じ培地で培養し、３週間毎に継代した。生育した苗条を50mg /Lカナマイシンを含むMS無ホルモン培地で発根させた。馴化後、それらの植物を温室条件下に栽培した。 3.2 ナスの形質転換形質転換には、イスティトゥートスペリメンターレペルロルティコルトゥーラ(Istituto Sperimentale per I'Orticoltura)が公表したF1ナス雑種「Rim ina」の雌親を使用した。ナス形質転換は基本的にRontioおよびGleddie(PlantCe ll Rep．3（1990）26-29)とRotinoら（第８回トウガラシ属とナスの遺伝学と育種に関する会議の議事録(Proc．VIIIth Meeting on genetics and breeding of Capsicum and eggplant，イタリア・ローマ，1992年９月７〜10日)，Capsicum N ewsletter特別号の295〜300頁）と同様の方法で、これに改良を加えて行なった。葉、子葉および胚軸外植片を、MS多量栄養素および微量栄養素（MurashigeおよびSkoog(1962)上記引用文献中）、Gamborgビタミン類(Gamborgら，Exp．Cell Res．50（1968）151-158）、0.5g/L MES，20μMアセトシリンゴン（次の成長調整物質（mg/L）を添加：ZEA0.5、BAP0.3、KIN0.2、NAA0.1）で２日間前培養し、培地は2g/L phytagel（Sigma社）で凝固させた（pH5.8）。外植片感染用に、アグロバクテリウムツメファシエンス終夜液体培養物を遠心分離し、そのペレットをMS基本培地、２％グルコース、200μMアセトシリンゴン(pH5.5)に0.1 OD₆ ₀₀ の密度で再懸濁した。子葉の切断端を再び切断し、すべての外植片を細菌懸濁液に５分間浸漬することによって感染させ、滅菌ろ紙で水気を取って、同じプレートに戻した。48時間後、それらの外植片をアセトシリンゴンを含まず30mg/Lカナマイシンと500mg/Lセフォタキシムを添加した選択培地（上述）に移した。密な緑色粒を持つカルスをNAAを含まない同じ選択培地に移すことにより、苗条− 芽分化と苗条伸長を達成した。抗生物質を含まないV3培地（Chambonnet“Cultur e d'antheres in vitro chez trois Solanacees maraic heres:le piment(Capsicum annum)，L'aubergine(Solanum maelongena)，latoma te(Lycopersicon esculentum)”（1985）These de Docteur d'Universite，Acad emie de Montpellier）で苗条を発根、増殖させた。トランスジェニック小植物体を温室で生育した。４．単為結実果生育の検出 4.1 タバコ選択した形質転換再生植物10本と非形質転換再生植物１本のそれぞれの二つの花序によって作られる花を毎日（１ヶ月間）２〜３cmの長さで除雄し、紙袋で覆った。自家受粉種子を得るためにもうひとつの花房には除雄と覆いを施さなかった。 4.2 ナス形質転換ナスと非形質転換ナスの花芽を紙袋で覆った。各植物について、花を約の裂開前に除雄するか（閉じた花）、手で自家受粉させ（開いた花）、紙袋で覆った。この実験は1996年11月から1997年１月にかけてMontanaso Lombardoにて二重プラスチック温室内部で行われた。これは、この実験が短日条件下に人工的な照明を行わずに弱い自然光線と約14℃〜約22℃の範囲の室内温度で行われたことを意味する。これらの条件は、ナスの受精と果実の生育には極めて不利な気候条件に相当する。温室内部の平均温度は16.9℃で、これはナスの結実にとって極めて制限的な条件に相当する。さらに重要なことに、日照時間は一日わずか７時間で、その強度はわずか46.4W/m²だった。５．PCRによるDNA分析ゲノムDNAは、DoyleおよびDoyle(1987)に従って葉組織から得た。nptIIコード領域の739bpの断片を増幅する5’ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGG 3'（配列番号２）プライマーと5’GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATA 3'（配列番号３）プライマーならびにDefH9-iaaM遺伝子の450bpの断片を増幅する5’TCTTGGCTTGTAATGGGG ATCC 3’（配列番号４）プライマーと5’GGGTGAATTAAAATGGTCATACAT 3'（配列番号５）プライマーを使って、100gのDNAをPCRで分析した。PCR反応は、１×緩衝液（Perkin Elmer社）、100μM dNPT類、50pMの各プライマー、1UのTaqポリメラーゼを含む25μlの最終体積で行なった。55℃のアニーリング温度で45サイクルを使用した。６．RNA分析花芽（0.4〜0.6cm長）を収集し、液体窒素で凍結し、十分に確立された方法に従ってmRNAを抽出、精製した。iaaM特異的プライマー(5’GGGTGAATTAAAATGGTCAT ACAT 3'（配列番号５）および5’TTCTTTGGAACTCGTGTTGAGCTC 3'（配列番号８）と逆転写酵素を用い、45℃で１時間、相補cDNAを合成した。そのcDNAを鋳型とし、同じiaaM特異的プライマーと、DefH9遺伝子の非転写非翻訳リーダー配列中、そのイントロンの5'末端に位置するプライマーとを用いて、53℃で35サイクルの第−PCR反応を行なった。この反応液の一部を第二PCRアッセイの鋳型として使用した。このアッセイは、アッセイの開始に「ホットスタート法」を用いて55℃の Tmで行なった。反応は、35サイクル繰返した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動、制限分析およびDNAブロッティングとそれに続くハイブリダイゼーションで分析した。また反応産物を配列決定した。７．ノーザンブロット分析全RNAを、Logemannら（Anal．Biochem．163（1987）16-20）が記述しているように植物の器官および組織から抽出した。ポリA+RNAは、オリゴd（T）Dynabeads （Dynal社）を使って全RNAからその製造者のプロトコルに従って単離した。RNA の量は、分光光度法で決定した。各レーンに２μgのmRNAを負荷し、７％ホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルで分離した。そのRNAを標準的技術（Maniatisら，上記引用文献中）でH ybond Nフィルター（Amersham社）に転写した。放射能標識したプローブによるハイブリダイゼーションは、５×SSPEおよび50％ホルムアミド中42℃で終夜行なった。他のMADSボックスRNAとの交差ハイブリダイゼーションを避けるために、保存されたMADSボックスを5'末端に持たないDefH9 cDNAの600bp断片をプローブとして使用した。シグナルは、Kodak社X-OMAT AR5 X線フィルムを使って検出した。実施例１プラスミドpPCV002-DefH9-iaaMの構築キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーター配列（2250bp）と調節配列（1 212bp）をまたぐ3480bp（14＋2250＋1212＋4bp）のEcoRI-KpnI断片を、シュードモナス・シリンゲ・パソバール・サバスタノイ由来のiaaM遺伝子のコード領域をまたぐ1775bp（２＋53＋1671＋49）のKpnI-SphI断片に連結することにより、組換えプラスミドpPCV002-DefH9-iaaMを得た。iaaM遺伝子は、Yamadaら（1985）によって特徴づけられており、使用した配列はATG開始コドンの53bp前に位置するD raI部位からTAA停止コドンの46bp後にあるSphI部位までの1773bp（53＋167l＋49 ）を含む。アグロバクテリウムツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子由来の転写終結配列をそのコード領域の3'側に使用する。使用したDNA配列は、SphI部位からHindIII部位（どちらもリンカー配列によって提供された部位）までの222bp長である。したがって、得られたプラスミドpPCV002-DefH9-iaaMは、次に挙げる構造上の特徴を持つ：・キンギョソウ由来のDefH9プロモーターの2250bp（5'末端に14bpのEcoRIアダプターを持つ）；・キンギョソウ由来のDefH9遺伝子の転写非翻訳リーダー配列中に存在する調節配列の1212bp（1045塩基のイントロンを含む）；・KpnIリンカー付加によって加えられた6bp；・融合部位にCTGAGGTACCGAAAGAATCG（配列番号６）というヌクレオチド配列を持つシュードモナス・シリンゲ・パソバール・サバスタノイ由来のiaaM遺伝子の非翻訳配列の53bp（KpnIリンカーを付加することによって得られた融合）；・シュードモナス・シリンゲ・パソバール・サバスタノイ由来のiaaM遺伝子のコード領域の1671bp；・シュードモナス・シリンゲ・パソバール・サバスタノイ由来のiaaM遺伝子の3' 非翻訳トレーラー配列の49bp（46＋停止コドンの3bp）；および・アグロバクテリウムのnos遺伝子由来の転写終結配列を含む222bp。実施例２プラスミドpPV002-DefH9-rolBの構築キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーター配列と調節配列をまたぐ3480b pのEcoRI-KpnI断片を、rolB遺伝子のコード領域をまたぐ1509bp（39＋774＋694 ＋KpnIリンカーによって付加された余分の２塩基）のKpnI-HindIII断片に連結することにより、組換えプラスミドpPCV002-DefH9-rolBを得た。したがって、得られたプラスミドpPCV002-DefH9-rolBは次に挙げる構造上の特徴を持つ：・キンギョソウ由来のDefH9プロモーターの2250bp（5'側に14bpのEcoRIアダプターを持つ）；・キンギョソウ由来のDefH9遺伝子の転写非翻訳リーダー配列中に存在する調節配列の1212bp（1045塩基のイントロンを含む）；・リンカー付加によって加えられた6bp；・融合部位にCTGAGGTACCGGGCACTT（配列番号７）というヌクレオチド配列を持つアグロバクテリウムリゾゲネスRiプラスミドA4由来のrolB遺伝子の非翻訳配列の39bp（KpnIリンカーを付加することによって得られた融合）；・アグロバクテリウムリゾゲネスRiプラスミドA4由来のrolB遺伝子のコード領域の774bp；および・rolBコード領域の3'末端に存在する3'隣接配列の694bp（すなわち691＋停止コドンの3bp）。実施例３トランスジェニックタバコにおけるDefH9-iaaM遺伝子の生物学的効果 DefH9-iaaM構築物で形質転換したタバコをiaaM遺伝子の発現について分析した。この目的で、そのトランスジェニック植物の花芽からRNAを得て、それをRT-PC Rで分析した。 168bpの予想される産物は分析した10本のトランスジェニック植物中10本に検出されたが、陰性対照（すなわち非形質転換タバコ）には検出されなかった。予想通り、それらの断片はKpnI部位を含有することがアガロースゲル電気泳動とDN Aブロット分析によって示された。一つのトランスジェニック植物から得たRT-PC R産物のDNAを配列決定した。そのDNA配列から、この168bp断片がDefH9-iaaM遺伝子のスプライシングされたmRNAに相当することが確認された。したがってこれらのトランスジェニック植物は未熟な花芽中でこの遺伝子を発現させ、そのプレmR NAは正確にスプライスされる。 DefH9-iaaM遺伝子を導入されたタバコは、非形質転換タバコと比較して、栄養生長の変化を何ら示さない（図４と５を参照されたい）。さらにこれらは、受粉すると正常なさく果生育を示す（図６参照）。しかし、除雄すると、花芽でDefH 9-iaaM遺伝子を発現させるトランスジェニック植物は、単為結実的生育を示し、結果として無核さく果を与える（図９参照）。非形質転換タバコ（およびDefH9- iaaM遺伝子を効率よく発現させない植物）は単為結実的生育を示さない。この形質はメンデル的に子孫に遺伝される。実施例４ DefH9-rolB遺伝子の生物学的効果 DefH9-rolB構築物で形質転換されている試験した20のトランスジェニックタバコのうち、独力で単為結実的生育を示すものは一つもなかった。しかし、これらの植物は、交雑またはDefH9-rolB遺伝子とDefH9-iaaM遺伝子の同時導入によって DefH9-iaaM遺伝子を導入した植物での単為結実的生育を増加させるために使用できる。実施例５トランスジェニックナスにおけるDefH9-iaaM遺伝子の生物学的効果 DefH9-iaaM遺伝子を導入したナスは、その栄養生長と花の形態に関して表現型的に正常であるように見える。これらは非形質転換ナスと見分けがつかない。結実と果実の生育は、DefH9-iaaM遺伝子を導入したナスだけで達成された（図 10）。実際、非形質転換ナスでは除雄した花も手で受粉した花も落花した。DefH 9-iaaM遺伝子を発現させるトランスジェニックナスでは、除雄した花から得られた果実のサイズが自家受粉した花から得られた果実と比較してわずかに小さかった（図11）。また、それらは除雄すると単為結実的生育を示し、その結果、無核果を与えた（図12）。実験に使用した温度は結実には最低限の値であり（至適平均温度は28〜30℃）、光の強度と持続時間は受粉、受精および結実を許すには最低レベル未満だった（至適平均光強度は500〜800W/m²）ので、これらの実験データはDefH9-iaaM遺伝子の導入により、不利な気候条件での栽培時に植物への外的ホルモン適用を避けうることを示している。不利な条件は、低温および／または低光強度または高温のいずれでもよい。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月８日（１９９９．３．８）【補正内容】明細書単為結実または雌性不稔トランスジェニック植物の生産方法本発明は、キンギョソウ（Antirrhinum majus）のDefH9遺伝子のプロモーター領域および他種の相同遺伝子のプロモーター領域を、例えば単為結実、雌性不稔を達成するために植物の胎座および／または胚珠または胎座または胚珠から派生する組織における遺伝子の高度に特異的な発現に利用することならびに結実と果実の生育の増進に使用することに関する。また、本発明は、発現時に上述の効果をもたらすDNA配列の発現が該プロモーターによって制御されているDNA構築物に関する。さらに、本発明は、そのような構築物で遺伝的に改変されたトランスジェニック植物であって、受精しなくても（すなわち単為結実的生育により）果実を生育させうるもの、または雌性不稔であるもの、ならびにそれら植物の果実とそれら植物の繁殖物質に関する。果実が商業的価値を持つために栽培される作物の分野では、受精しなくても果実を生育させうる植物には大きな需要がある。これは種子がないから（例えば食用のブドウやメロン）というだけなく、最も顕著な理由は受精にとって不都合な環境条件で果実が得られるためである（例えばナス、トマト；LipariおよびPara tore，Acta Hort．229（1988）307-312:Savin，PHM Revue Horticole 374（1996 ）50-52）。単為結実的生育を達成する方法は本質的に、化学的活性成分を使用するか、その種に単為結実的生育性を付与する選抜された突然変異体を使用するか、染色体数の変化（すなわち倍数性）を利用することによっている。したがって、上述の望ましい特性を持つ植物の育種に適した植物は、今までのところ狭い範囲に限られてきた。実際、いくつかの園芸植物については、単為結実的生育を引き起こすために花芽を合成成長因子類で処理（すなわち噴霧）することが一般的である（上記参考文献；La TorreおよびImbroglini，Informatore Agrario 16 （1992）71-78;RobertsおよびHooley著「Plant Growth Regulators」Chapman an d Hall(ニューヨーク(1988))。請求の範囲１．キンギョソウ(Antirrhinum majus)由来のDeficiensホモログ9(DefH9)遺伝子のプロモーターまたはキンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターの使用であって、該プロモーターは、植物の単為結実もしくは雌性不稔を樹立するために、または雌性前核生殖の割合を高めるために、または結実および果物の生育を増進するために該プロモーターに連結したＤＮＡ配列の胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能である使用。２．キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーターが配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、または植物の胎座および／または胚珠での特異的発現を付与可能なその一部を含有する請求項１記載の使用。３．単為結実が、植物細胞で発現の際に少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらすＤＮＡ配列に該プロモーターを連結することにより達成される請求項１または２記載の使用。４．該ＤＮＡ配列が、植物細胞でオーキシンの生合成に関与するタンパク質をコードする請求項３記載の使用。５．該ＤＮＡ配列が、植物細胞で発現の際にオーキシンまたはオーキシンの前駆体の合成をもたらす、植物細胞で通常発現されないタンパク質をコードする請求項３記載の使用。６．該ＤＮＡ配列が細菌のタンパク質をコードする請求項５記載の使用。７．該ＤＮＡ配列が、シュードモナス・シリンゲのiaaM遺伝子または他の生物由来の機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子である請求項５または６記載の使用。８．該ＤＮＡ配列が、アグロバクテリウム・リゾゲネスのrolB遺伝子または他の生物由来の機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子である請求項５または６記載の使用。９．該ＤＮＡ配列が発現の際に、少なくとも１種のオーキシンのその複合型からの放出増加をもたらすポリペプチドをコードする請求項３記載の使用。１０．該ＤＮＡ配列がＩＡＡとアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物との複合体を加水分解するタンパク質をコードする請求項９記載の使用。１１．該ＤＮＡ配列がアミノヒドロラーゼ活性を有するILR1タンパク質をコードする請求項１０記載の使用。１２．該ＤＮＡ配列が植物細胞で発現の際に、少なくとも１種のオーキシンの分解または複合化の減少をもたらすことにより、少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらす、請求項３記載の使用。１３．該ＤＮＡ配列が、植物細胞で少なくとも１種のオーキシンの分解または複合化に関与するタンパク質の転写物に対するアンチセンスＲＮＡをコードする請求項１２記載の使用。１４．雌性不稔が、発現の際に、発現される細胞の細胞死または不能をもたらすＤＮＡ配列に前記プロモーターを連結することにより達成される請求項１または２記載の使用。１５．該ＤＮＡ配列が細胞死をもたらすタンパク質をコードする請求項１４記載の使用。１６．該タンパク質がRNアーゼ、DNアーゼ、プロテアーゼおよび毒素からなる群より選ばれたものである請求項１５記載の使用。１７．該ＤＮＡ配列が、細胞の正常な機能に必要な遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする請求項１４記載の使用。１８．（ａ）キンギョソウ由来のＤｅｆＨ９遺伝子のプロモーターまたは該遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターであって、胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能なプロモーター、ならびに（ｂ）植物細胞での発現の際に少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらす、前記プロモーターに操作可能に連結したＤＮＡ配列、を含有してなる組換えＤＮＡ分子。１９．該プロモーターが請求項２に規定されたプロモーターである請求項１８記載の組換えＤＮＡ分子。２０．該ＤＮＡ配列が請求項３〜１３いずれかに規定されたＤＮＡ配列である、請求項１８または１９記載の組換えＤＮＡ分子。２１．請求項１８〜２０いずれか記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。２２．請求項１８〜２０いずれか記載の組換えＤＮＡ分子を含有してなる植物細胞。２３．請求項２２記載の植物細胞を含有してなる植物。２４．請求項２２記載の植物細胞を含有してなる請求項２３記載の植物の器官。２５．果実、種子またはあらゆる種類の繁殖物質である請求項２４記載の植物の器官。２６．（ａ）キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーターまたは該遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターであって、胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能なプロモーター、ならびに（ｂ）植物細胞での発現の際に該細胞の不能または細胞死をもたらす、前記プロモーターに操作可能に連結したＤＮＡ配列、を含有してなる組換えＤＮＡ分子。２７．該プロモーターが請求項２に規定されたプロモーターである請求項２５記載の組換えＤＮＡ分子。２８．該ＤＮＡ配列が請求項１５〜１７いずれかに規定されたＤＮＡ配列である、請求項２６または２７記載の組換えＤＮＡ分子。２９．請求項２６〜２８いずれか記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。３０．請求項２６〜２８いずれか記載の組換えＤＮＡ分子を含有してなる植物細胞。３１．請求項３０記載の植物細胞を含有してなる植物。３２．請求項３０記載の植物細胞を含有してなる請求項３１記載の植物の器官。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９７１０５８４３．３ (32)優先日平成９年４月９日(1997．4．9) (33)優先権主張国ヨーロッパ特許庁（ＥＰ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スペーナ，アンジェロイタリア国ヴェローナイ―37131 ヴィアザンボーニ 38／ア (72)発明者セトラー，ハインツドイツ連邦共和国ケルンデー―50829 カール―フォン―リンネ―ウェーク14 (72)発明者ゾマー，ハンスドイツ連邦共和国プルハイムデー― 50259 マティルデンシュトラーセ 23 (72)発明者ロティーノ，グイゼッペ，レオナルドイタリア国ローディイ―26900 ヴィアフェラビーニヴィコーロ２ア

Claims

【特許請求の範囲】１．キンギョソウ（Anthirrhinum majus）由来のDefH9遺伝子のプロモーターまたはキンギョソウのDefH9遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターであって、該プロモーターに連結したＤＮＡ配列の胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能であるプロモーターの、植物の単為結実もしくは雌性不稔を樹立するため、または雌性発生の割合を高めるため、または結実および果実の生育を増進するための使用。２．キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーターが配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、または植物の胎座および／または胚珠での特異的発現を付与可能なその一部を含有する請求項１記載の使用。３．単為結実が、植物細胞での発現の際に少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらすＤＮＡ配列に該プロモーターを連結することにより達成される請求項１または２記載の使用。４．該ＤＮＡ配列が、植物細胞でのオーキシンの生合成に関与するタンパク質をコードする請求項３記載の使用。５．該ＤＮＡ配列が、植物細胞での発現の際にオーキシンまたはオーキシンの前駆体の合成をもたらす、植物細胞で通常発現されないタンパク質をコードする請求項３記載の使用。６．該ＤＮＡ配列が細菌のタンパク質をコードする請求項５記載の使用。７．該ＤＮＡ配列が、シュードモナス・シリンゲのiaaM遺伝子または他の生物由来の機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子である請求項５または６記載の使用。８．該ＤＮＡ配列が、アグロバクテリウム・リゾゲネスのrolB遺伝子または他の生物由来の機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子である請求項５または６記載の使用。９．該ＤＮＡ配列が、発現の際に、少なくとも１種のオーキシンのその複合型からの放出増加をもたらすポリペプチドをコードする請求項３記載の使用。１０．該ＤＮＡ配列が、ＩＡＡとアミノ酸、ペプチドまたは炭水化物との複合体を加水分解するタンパク質をコードする請求項９記載の使用。１１．該ＤＮＡ配列が、アミノヒドロラーゼ活性を有するILR1タンパク質をコードする請求項１０記載の使用。１２．該ＤＮＡ配列が、植物細胞での発現の際に、少なくとも１種のオーキシンの分解または複合化の減少をもたらすことにより、少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらす、請求項３記載の使用。１３．該ＤＮＡ配列が、植物細胞で少なくとも１種のオーキシンの分解または複合化に関与するタンパク質の転写物に対するアンチセンスＲＮＡをコードする請求項９記載の使用。１４．雌性不稔が、発現の際に、発現される細胞の細胞死または不能をもたらすＤＮＡ配列に前記プロモーターを連結することにより達成される請求項１または２記載の使用。１５．該ＤＮＡ配列が細胞死をもたらすタンパク質をコードする請求項１４記載の使用。１６．該タンパク質がRNアーゼ、DNアーゼ、プロテアーゼおよび毒素からなる群より選ばれたものである請求項１５記載の使用。１７．該ＤＮＡ配列が、細胞の正常な機能に必要な遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする請求項１４記載の使用。１８．（ａ）キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のプロモーターまたは該遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターであって、胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能なプロモーター、ならびに（ｂ）植物細胞での発現の際に少なくとも１種のオーキシンの細胞内含有量および／または活性の増加をもたらす、前記プロモーターに操作可能に連結したＤＮＡ配列、を含有してなる組換えＤＮＡ分子。１９．該プロモーターが請求項２に規定されたプロモーターである請求項１８記載の組換えＤＮＡ分子。２０．該ＤＮＡ配列が請求項３〜１３いずれかに規定されたＤＮＡ配列である、請求項１８または１９記載の組換えＤＮＡ分子。２１．請求項１８〜２０いずれか記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。２２．請求項１８〜２０いずれか記載の組換えＤＮＡ分子を含有してなる植物細胞。２３．請求項２２記載の植物細胞を含有してなる植物。２４．請求項２２記載の植物細胞を含有してなる請求項２３記載の植物の器官。２５．果実、種子またはあらゆる種類の繁殖物質である請求項２４記載の植物の器官。２６．（ａ）キンギョソウ由来のDefH9遺伝子のブロモーターまたは該遺伝子に相同な遺伝子のプロモーターであって、胎座および／または胚珠特異的発現を付与可能なプロモーター、ならびに（ｂ）植物細胞での発現の際に該細胞の不能または細胞死をもたらす、前記プロモーターに操作可能に連結したＤＮＡ配列、を含有してなる組換えＤＮＡ分子。２７．該プロモーターが請求項２に規定されたプロモーターである請求項２５記載の組換えＤＮＡ分子。２８．該ＤＮＡ配列が請求項１５〜１７いずれかに規定されたＤＮＡ配列である、請求項２６または２７記載の組換えＤＮＡ分子。２９．請求項２６〜２８いずれか記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。３０．請求項２６〜２８いずれか記載の組換えＤＮＡ分子を含有してなる植物細胞。３１．請求項３０記載の植物細胞を含有してなる植物。３２．請求項３０記載の植物細胞を含有してなる請求項３１記載の植物の器官。