JP2000515748A - 植物細胞における導入遺伝子の発現可変性を減少させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 その中の外来遺伝子の発現の可変性を減少させた組み換え植物細胞の作製方法が本明細書に既述されている。方法は、（ａ）再生可能な植物細胞を提供し、（ｂ）構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーター（または境界成分）から成る、発現カセットから成るＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換することから成る。本法の実施に有用なＤＮＡ構築物と本法により作製される植物細胞と植物も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 植物細胞における導入遺伝子の発現可変性を減少させる方法 技術分野 本発明は、植物細胞における外来遺伝子の発現の可変性を減少させる方法と共 に、この様な方法を実行するためのインシュレーター(insulator)または境界成 分(boundary elements)、およびその様に産生された植物細胞および植物に関す る。 背景技術 農業生物工学、および特に植物生物工学は、生物工学技術の応用に関する主要 領域の１つと認識されるようになっている。植物細胞を形質転換し、形質転換細 胞から完全な植物を再生する方法が存在しており、構造遺伝子と遺伝子制御領域 は同定されつつあり、害虫抵抗性および乾燥抵抗性の様な遺伝子工学によって獲 得される特性を有する植物は今なお強く要求されている。 植物における外来遺伝子の発現に関する問題は、独立した形質転換細胞におけ る同一遺伝子の発現におけるクローンの変動であり、「位置効果」変動と呼ばれ る問題である。この問題を回避する完全に満足できる方法は未だに開発されてお らず、従ってこの問題の解決方法は今なお必要とされている。 発明の概要 前記の観点から、本発明の第一の点は、その中の外来遺伝子の発現の可変性を 減少させた組み換え植物細胞の作製方法である。方法は、（ａ）再生可能な植物 細胞を提供し、（ｂ）構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開 始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写 開始領域の５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写 開始領域の５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーター （または境界成分）から成る、発現カセットから成るＤＮＡ構築物を用いて植物 細胞を形質転換することから成る。１つ以上のスカホールド付着領域（すなわち 「ＳＡＲｓ」）を、インシュレーターに追加して構築物の中に任意で含めること ができる。好ましくは、形質転換段階に続き、形質転換細胞から苗条、根、また は苗条と根の両者（すなわち無傷の植物）が再生する。好ましくは、ＤＮＡ構築 物は、５’から３’の方向に、第一のインシュレーター、転写開始領域、転写開 始領域から下流に位置し、機能的にそれと結合した構造遺伝子、終末領域、およ び第二のインシュレーターから成る。 本発明の第二の点は、構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写 開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転 写開始領域の５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転 写開始領域の５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレータ ー（または境界成分）から成る、発現カセットから成るＤＮＡ構築物である。 本発明の第三の点は、植物形質転換ベクターにより実施される上記のＤＮＡ構 築物である。 本発明の第四の点は、上記のＤＮＡ構築物を含む植物細胞である。 本発明の第五の点は、形質転換植物細胞から成る組み換え植物で、形質転換植 物細胞は、構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開始領域から 下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の ５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の ５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーター（または境 界成分）から成る、発現カセットから成る異種ＤＮＡ構築物を含む。 スカホールド付着領域、すなわちＳＡＲｓは、植物における発現可変性を減少 させ、遺伝子発現を増加させるのに有用と過去に指摘されているものの（例えば 、 G．Allen et al.，The Plant Cell 5，603-613(1993);G．Allen et al.，The Pl ant Cell 8，899-913(1996)、ＳＡＲｓとインシュレーターは構造的にも機能的 にも異なるものであり、出願者が知る限り、植物細胞内のインシュレーターに関 してこの様な活性の示唆あるいは報告はされていない。 本発明の前記およびその他の目的および側面は、本明細書の図および下記の明 細書に詳細に説明されている。 図面の簡単な説明 図１は、微粒子銃により遺伝子導入されたＮＴ１細胞におけるルシフェラーゼ 発現に対するインシュレーターの効果を示す。ルシフェラーゼリポーター遺伝子 と非結合カナマイシン耐性遺伝子は、ルシフェラーゼリポータープラスミドと、 ｎｏｓ：：ｎｐｔＩＩ選択可能マーカー遺伝子を有する別のプラスミドを含む混 合物を用いる同時形質転換により、ＮＴ１細胞の中に導入された。ＤＮＡ混合物 （モル比４：１）は、微粒子銃によりタバコＮＴ１細胞の中に導入された。等モ ル量の異なるルシフェラーゼ構築物がそれぞれ使用された。安定した形質転換細 胞系を確立後、黒い９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートの中の充填細胞にルシフェ リンを添加し、一晩インキュベーションし、Hamamatsu光子計数装置において３ ０秒間画像化する事により、発現を分析した。 図１Ａは、対照３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ発現カセット構築物を用いて 形質転換された細胞を示す。 図１Ｂは、対照ＲＢ７ＭＡＲ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ：：ＲＢ７ ＭＡＲ発現カセット構築物を用いて形質転換された細胞を示す。 図１Ｃは、インシュレーターを含むｓｃｓ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓ Ｔ：：ｓｃｓ’構築物を用いて形質転換された細胞を示す。 発明の詳細な説明 ヌクレオチド配列は、左から右に５’から３’の方向に、一本鎖のみによって 本明細書では表示されている。 本発明は、多種多様の植物の細胞を用いて実施できる。本明細書に使用されて いる様に、「植物」は、単子葉植物と双子葉植物の両者および被子植物と裸子植 物の両者を含む維管束植物を意味する。 本明細書に使用されている様に、「機能的に結合した」という言葉は、１つの ＤＮＡ分子上の１つのＤＮＡ配列が別のＤＮＡ配列により影響されるように結合 されたＤＮＡ配列を意味する。従って、転写開始領域は、構造遺伝子の発現に影 響を及ぼすことができる場合には、構造遺伝子と機能的に結合している（即ち、 構造遺伝子は、その転写開始領域により転写が制御されている。）。転写開始領 域は、構造遺伝子の「上流」にあると表現され、それは逆に、構造遺伝子は転写 開始領域の「下流」にあると表現される。 「インシュレーター」（または「クロマチンインシュレーター」、「境界成分 」）という言葉は、本技術において従来の意味を持っており、インシュレーター または境界成分の片側に位置するエンハンサーが、隣接する領域に位置するプロ モーターに作用するのを防止するDNA断片を意味する。V．Corces，Nature 376， 462(10 August 1995)。本発明の実施に有用なインシュレーターは、植物および 動物種の両者を含むいずれに由来してもよいが、一般に真核生物由来である。植 物のインシュレーターは、下記に明示された植物を含む適切な植物の全てから得 られる。動物のインシュレーターは、昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ属 ）、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ）、鳥（例えば、ニワトリ 、シチメンチョウ）等を含む適切な動物全てから得られる。インシュレーターは 、真菌（例えば、Saccharomyces cereviceae）の様なその他の真核生物から得ら れる。２つのインシュレーターが使用される場合、それらは同じでも異なってい てもよい。インシュレーターは、インシュレーターとしての機能を保持している 限り、自然界に存在するインシュレーターの断片でもよい。インシュレーター の長さは重要ではないが、一般に１００、２００または３００から２０００また は３０００塩基長である。ｓｃｓインシュレーター（この言葉は下流のｓｃｓ’ を含む）が現在の所好ましい。 インシュレーターとしての活性を有する候補となるインシュレーターをテスト するには、５’から３’の方向に構成エンハンサー、候補となるインシュレータ ー、誘導できるプロモーター（例えば、ＨＳＰ７０プロモーター）、リポーター 遺伝子（例えば、ｇｕｓ、ルシフェラーゼ）を含む構築物の中に、候補となるイ ンシュレーターをクローニングするだけでよい。次に植物細胞を、本明細書に報 告されている適切な全ての手段により構築物を用いて形質転換し、（任意で）そ の細胞から植物を作製する。リポーター遺伝子の発現は本質的に抑制されるはず であるが、誘導可能なプロモーターに適切なシグナル（例えば、温度）により活 性化される。例えば、R.Kellum et al.，Molec．Cell．Biology，2424-2431（Ma y 1992）参照。 本発明のＤＮＡ構築物または「発現カセット」は好ましくは、転写方向の５’ から３’に、転写開始領域、転写開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合 した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の ３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の５’方向と構造遺伝子の３’方向 の両者に位置するインシュレーター、および任意でＲＮＡポリメラーゼの停止シ グナルおよびポリアデニラーゼのポリアデニル化シグナルを含む終結配列を含む （例えば、ｎｏｓターミネーター）。プロモーターは、細胞内で形質転換される ように機能することが可能でなくてはならない。終結領域は、プロモーター領域 と同じ遺伝子由来でも、異なる遺伝子由来でもよい。 上記の様に、本発明の発現カセットは、全てのインシュレーターの内側に含ま れるか、あるいは外側に位置する、スカホールド付着領域（または「ＳＡＲ」） を含んでよい。従って、ＳＡＲまたはＳＡＲｓは、（ｉ）転写開始領域の５’方 向（例えば、転写開始領域の５’に位置する全てのインシュレーターの５’また は３’の位置）、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向（例えば、構造遺伝子の３’に 位置する全てのインシュレーターの５’または３’の位置）、あるいは（ｉｉｉ ）転写開始領域の５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者（例えば、転写開始領 域の５’に位置する全てのインシュレーターの５’または３’の位置にある５’ ＳＡＲと構造遺伝子の３’に位置する全てのインシュレーターの５’または３’ の位置にある３’ＳＡＲを有する）に位置する。好ましくは、インシュレーター はＳＡＲまたはＳＡＲｓの外側に位置する（すなわち、ＳＡＲはインシュレータ ーと構造遺伝子の間に位置する）。 本発明の実施に有用なＳＡＲｓ（基質付着領域、または「ＭＡＲｓ」とも呼ば れる）は適切な供給源の全てから得られる。一般に、全ての真核生物（植物、動 物、酵母を含む。）のＳＡＲが使用できる。なぜならばＳＡＲｓは真核生物間で 高度に保存されているからである。例えば、G．Allen et al.，The Plant Cell 5，603-613(1993);M．Eva Luderus et al.，Cell 70，949-959(1992);G．Hall e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，9320-9324(1991)。例えば、P．Breyne ，The Plant Cell 4，463-471(1992)において動物のＳＡＲｓは、植物において 機能することが明らかにされている。植物のＳＡＲｓは上記および下記に明示さ れている植物から得られる。動物のＳＡＲｓは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ） 、鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）等を含む適切な動物全てから得られ る。ＳＡＲｓは、真菌（例えば、Saccharomyces cereviceae）の様なその他の真 核生物から得られる。２つのＳＡＲｓが使用される場合、それらは同じでも異な っていてもよい。ＳＡＲは、ＳＡＲとしての機能を保持している限り、ＳＡＲの 長さは重要ではないが、一般に４００から１０００塩基対長が典型的である。 転写開始領域は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（プロモーター）を含むが、宿 主植物において機能する領域である限り、形質転換される宿主植物由来でも、別 の供給源由来でもよい。その他の供給源には、ノパリン、オクトピン、マノピン を生合成するための転写開始領域またはその他のオパイン転写開始領域の様なAg robacterium Ｔ−ＤＮＡ遺伝子、ユビキチンプロモーターの様な植物由来の転写 開始領域、根に特異的なプロモーター（例えば、Conkling et al.の米国特許第5 ,459,252号;Advanced TechnologiesのWO 91/13992を参照）、ウイルス（宿主に 特異的なウイルスを含む）由来の転写開始領域または部分的または全体的な合成 転写開始領域が含まれる。転写開始領域と終結領域は公知であり（例えば、dGre ve，J．Mol．Appl．Genet．1，499-511(1983);Salomon et al.，EMBO J．3，141 -146(1984);Garfinkel et al.，Cell 27，143-153(1983);Barker et al.，Plant Mol．Biol．2，235-350(1983)を参照）、植物（例えば、米国特許第4,962,028 号を参照）およびウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルスプロモータ ー、ＣａＭＶ ３５Ｓ）から分離された種々のプロモーターが含まれる。 転写開始領域は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の他に、転写を制御する領域を 含み、この場合制御は、例えば、化学的または物理的抑制または誘導（例えば、 代謝産物、光またはその他の物理化学的因子に基づく制御、例えば、ネマトード 反応性プロモーターを開示しているWO 93/06710を参照）または細胞分化に基づ く制御（例えば、植物の葉、根、種子等に関連する、例えば、根に特異的なプロ モーターを開示している米国特許第5,459,252号を参照）に関与している。従っ て、転写開始領域またはこの様な領域の制御部分は、この様に制御される適切な 遺伝子から得られる。例えば、１，５−リブロース二燐酸カルボキシラーゼ遺伝 子は光により誘導され、転写開始に使用できる。ストレス、温度、傷、病原体な どの作用により誘導されるその他の遺伝子が公知である。 本明細書において使用される「構造遺伝子」という言葉は、蛋白質、ポリペプ チド、またはそれらの部分をコードするＤＮＡ断片から成り、あるいはリボソー ム結合部位および／または翻訳開始コドンを含むが、転写開始領域は欠失してい る。この言葉は、細胞内の天然の構造遺伝子のコピーであって、人工的に導入さ れたものを意味する場合もある。構造遺伝子は、構造遺伝子が導入された、ある いは機能的に結合した転写開始領域と結合された植物細胞内に通常は認められな い蛋白質をエンコードできるが、この場合異種構造遺伝子と呼ばれる。植物種に おいて発現するために転写開始領域と機能的に結合した遺伝子は、染色体遺伝子 、ｃＤＮＡ、合成遺伝子、またはその組み合わせから得られる。どの様な構造遺 伝子でも使用できる。構造遺伝子は、グリホスフェート耐性の様な所望の特性を 植物に導入するための酵素をエンコードできる。構造遺伝子は、害虫耐性を植物 に与えるためにBacillus thuringiensis蛋白質の様な蛋白質（またはその断片） をエンコードできる。構造遺伝子はウイルス耐性を植物に与えるために植物ウイ ルス蛋白質またはその断片をエンコードできる。本明細書に使用される「構造遺 伝子」という言葉は、植物細胞の特定のｍＲＮＡに結合し、その翻訳をダウンレ ギュレートするアンチセンス物質をエンコードするＤＮＡを含むことも意図して いる。例えば、Shewmarker et al．の米国特許第5,107,065号を参照。 本発明の方法において有用な発現カセットは、少なくとも１つの複製系も有す るＤＮＡ構築物の中に供給できる。好都合には、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐ ＡＣＹＣ１８４等の大腸菌において機能する複製系を有するのが一般的である。 この方法において、各操作後の各段階毎に、得られた構築物をクローニングし、 配列決定し、操作の正確性を決定できる。更に、大腸菌の複製系の代わりに、広 範囲の宿主の複製系を使用でき、例えば、ｐＲＫ２９０の様なＰ−１不和合性プ ラスミドの複製系がある。複製系の他に、少なくとも１つのマーカーがしばしば 存在し、１種類以上の宿主に有用な場合もあれば、個々の宿主毎にマーカーが異 なる場合もある。すなわち、原核宿主における選択にあるマーカーが使用され、 真核宿主、特に植物宿主における選択に別のマーカーが使用される。マーカーは 、抗生物質、毒素、重金属等の殺生物剤に対する保護物質が可能であり、例えば 、 栄養要求宿主に原栄養性を与えることにより、補足し、あるいは新しい化合物の 生成により視認可能な表現型を提供する。使用可能な遺伝子の例として、ネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）、ヒグロマイシンホスホトラン スフェラーゼ（ＨＰＴ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ ＣＡＴ）、ニトリラーゼ、ゲンタマイシン耐性遺伝子がある。植物宿主の選択に は、適切なマーカーの限定されない例として、インジゴ産生を引き起こすβ−グ ルクロニダーゼ、可視光線発生を引き起こすルシフェラーゼ、カナマイシン耐性 またはＧ４１８耐性を提供するＮＰＴＩＩ、ヒグロマイシン耐性を提供するＨＰ Ｔ、グリホセート耐性を提供する突然変異ａｒｏＡ遺伝子がある。 種々の構築物、発現カセット、マーカーなどから成る種々の断片を、適切な複 製系の制限酵素切断、および特定の構築物または断片の利用可能な部位への挿入 により連続的に導入することができる。連結反応とクローニングの後、ＤＮＡ構 築物を更なる操作のために分離できる。これらの技術の全ては文献に広く例示さ れており、特定の具体例が、Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laborator y Manual，（第二版、1988）(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Ha rbor，NY)に示されている。 本明細書に使用されている形質転換植物は、少なくとも幾つかの細胞が、異種 ＤＮＡ構築物により安定な状態で形質転換されている植物を意味する。ここに使 用されているように、異種ＤＮＡ構築物とは、細胞または細胞の先祖に人工的に 導入されるＤＮＡを意味する。この様なＤＮＡは、形質転換される細胞内に通常 は認められない遺伝子またはＤＮＡを含むか、あるいは形質転換される細胞内に 含まれる遺伝子またはＤＮＡを含むことができる。後者の場合、細胞は、目的の ＤＮＡ配列または遺伝子の更なるまたは複数のコピーを含むように形質転換され る。 本発明のＤＮＡ構築物を用いて植物を形質転換するために使用されるベクター には、Agrobacteriumベクター、Agrobacterium以外のベクター（特に射撃ベクタ ー）およびＤＮＡを介する形質転換に適したその他の公知のベクターが含まれる 。 本発明のＤＮＡ構築物を有する微粒子は、細胞の微粒子銃による形質転換に適 した微粒子で、本発明に従って細胞を形質転換するのに有用である。微粒子は細 胞の中に発射され、形質転換細胞を産生する。形質転換細胞が植物細胞の場合、 本技術において公知の技術により、植物は形質転換細胞から再生できる。本発明 の実施に、適切な微粒子銃による細胞形質転換方法全てを用いることができる。 装置と手順の具体例がstomp et al.，米国特許第5,122,366号およびSanford and Wolf，米国特許第4,945,050号に開示されている（本明細書に引用されている米 国特許の引用は全て引用する事により本明細書の一部を成す事とする。）。微粒 子銃による形質転換手順を用いる場合、形質転換される細胞において複製可能な プラスミドの中に発現カセットが組み込まれる。この様な系において使用するの に適した微粒子の具体例として、１から５μｍの金球が挙げられる。ＤＮＡ構築 物を、沈殿の様な適切な技術のいずれかにより微粒子上に蓄積させる。この様な 微粒子銃による形質転換技術は、外来遺伝子を種々の植物種に導入するのに有用 であり、特に単子葉植物の系に有用である。 本発明の実施に使用されるベクターには、Agrobacteriumベクターが含まれる 。多くのAgrobacteriumベクターが公知である。例えば、Andersonの米国特許第4 ,536,475号;Schliperoort et al.の米国特許第4,693,977号;Sederoff et al.の 米国特許第4,886,937号;Offringa et al.の米国特許第5,501,967号;T．Hall et al.のEPO Application No．0122791;R．Fraley et al.のProc．Natl．Acad．Sci ．USA 84:4803(1983);L．Herrera-Estrella et al.のEMBO J．2:9867(1983);G． Helmer et al.のBio/Technology 2:520(1984);N．Murai et al.のScience 222:4 76(1983)を参照。一般に、この様なベクターはagrobacteria、典型的には、Agro bacterlum tumefaciensから成り、少なくとも１つの腫瘍誘導（またはＴ ｉ）プラスミドを有する。agrobacteriaがAgrobacterium rhizogenesである場合 、このプラスミドも根誘導（または「Ｒｉ」）プラスミドとして公知である。Ｔ ｉ（またはＲｉ）プラスミドは、植物がagrobacteriaにより感染された時に、そ の宿主植物の細胞に転移される「Ｔ−ＤＮＡ」と呼ばれるＤＮＡを含んでいる。 Agrobacteriumベクターにおいて、Ｔ−ＤＮＡは、遺伝子工学技術により修飾さ れ、形質転換植物細胞において発現される目的の「発現カセット」または遺伝子 と、関連する制御配列を含む。agrobacteriaは、「バイナリー」ベクター系の場 合の様に、複数のプラスミドを含むことができる。この様なAgrobacteriumベク ターは、外来遺伝子を種々の植物種に導入するのに有用であり、双子葉植物の形 質転換に特に有用である。 Agrobacteriumベクターと微粒子銃による形質転換の併用も本技術において公 知である（例えば、D．Bidneyの欧州特許第486233号および第486234号を参照） 。 遺伝子導入植物は、植物細胞プロトプラストをDNAを介して形質転換し、引き 続き形質転換されたプロトプラストから植物を再生することにより、本技術にお いて公知の手順に従って、本発明のＤＮＡ構築物を使用して産生できる。 器官形成であれ、胚形成であれ、その後のクローン増殖が可能な植物組織であ れば全て、本発明のべクターを用いて形質転換できる。本明細書に使用される「 器官形成」という言葉は、分裂組織中心部から苗条と根が連続して発生する過程 を意味する。本明細書に使用される「胚形成」という言葉は、体細胞または配偶 子から生殖苗条と根が（連続的でなく）協奏的に同時に発生する過程を意味する 。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって有効な、また最も 適切なクローン増殖系によって異なる。組織標的の具体例として、葉の円盤状組 織、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、 頂端分裂組織、腋芽、および根分裂組織）および誘導された分裂組織（例えば、 子葉分裂組織および胚軸分裂組織）が挙げられる。 本発明の植物は種々の形態を取り得る。植物は形質転換細胞と非形質転換細胞 のキメラが可能である。植物はクローン形質転換細胞が可能である（例えば、発 現カセットを含む様に全ての細胞が形質転換されている）。植物は形質転換組織 と非形質転換組織の接ぎ穂を含むことが可能である（例えば、柑橘属において形 質転換された台木と形質転換されていない接ぎ穂が接ぎ木される）。形質転換植 物は、クローン増殖または古典的な育種技術の様な種々の方法により増殖される 。例えば、第一世代（またはＴ１）形質転換植物は自家受粉し、同型接合第二世 代（またはＴ２）形質転換植物を生じ、Ｔ２植物は従来の育種技術により更に増 殖される。優性の選択可能なマーカー（例えば、ｎｐｔ ＩＩ）を、育種を補助 するために発現カセットと連結させることができる。従来の技術に従って、本発 明の成熟植物から種子を収集し、本明細書に記載されているように、発芽し植物 を生じる種子を提供することができる。 本発明の実施に使用できる植物として、タバコ（Nicotiana Tabacum）、ジャ ガイモ（Solanum tuberosum）、ダイズ（glycine max）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatus）、 タピオカノキ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（C ocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、ミカンノキ（Citrus spp. ）、ココア（Theobroma cacal）、チャノキ（Camellia sinensis）、バナナ（Mu sa spp.）、アボガド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、バン ジロウ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale ）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus） 、テンサイ（Beta vulgaris）、トウモロコシ（Zea mays、メイズとしても知ら れている）、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、野菜、観賞植物 および針葉樹が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。野菜として、ト マト（Lycope rsicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuea sativa）、緑莢インゲン（Pha seolus vulgaris）、ライマメ（Phaseolus limensis）、エンドウ（Pisum spp. ）およびキュウリ（C．sativus）、カンタロープ（C．cantalupensis）およびマ スクメロン（C．melo）等のCucumis属が挙げられる。観葉植物として、アザレア （Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（ Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.） 、ラッパスイセン（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カー ネーション（dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherima ）、キクが挙げられる。本発明を実施するために使用される裸子植物には、テー ダマツ（Pinus taeda）、カリブマツ（Pinus elliotii）、ポンデローサマツ（P inus ponderosa）、ロジェポールマツ（Pinus contorta）、モンテレーマツ（Pi nus radiata）等のマツ、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）、アメリカツガ（ Tsuga canadensisi）、ベイトウヒ（Picea glauca）、セコイア（Sequoia sempe rvirens）、ヨーロッパモミ（Abies amabilis）およびバルサムノキ（Abies bal samea）等の純種のモミ、およびベイスギ（Thuja plicata）およびアラスカヒノ キ（Chamaecyparis nootkatensis）等のヒマラヤスギ等の針葉樹物が挙げられる 。 下記の具体例は、本発明を説明するためのもので、本発明を制限することを意 図するものではない。 具体例１ プラスミドの作製 P．Schedl（モフェット研究所生物学部門、プリンストン、ニュージャージー 州）の好意により提供されたｐＲＢＫＳおよびｐｃＢＢＸ７は、ｓｃｓ’および １．８ｋｂ ｓｃｓ成分をそれぞれ含む。 G．Hallの好意により提供されたｐＢＨＮＣ０７は、タバコＲＢ７遺伝子の３ ’末端由来の直列反復する１．１ｋｂの基質付着領域（ＭＡＲ）成分を含む。 リポータープラスミドは、ｐＢＩ２２１(Jefferson et al.，EMBO J．6，3901 -3907(1987))から得られ、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプ ロモーターおよびノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のポリアデニル化部位由 来の転写終結区を含む(Depicker et al.，J．Mol．Appl．Genet．1，499-512(19 82))。ＰＢＩ２２１のグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を修飾Photinus pyral isルシフェラーゼ（ｌｕｃ’）遺伝子と置き換えるために(Bonin et al.，Gene 141，75-77(1994))、オリゴＤＮＡリンカーを使用してｐＢＩ２２１ＢｇｌＩＩ とｐＢｌｕｃＢｇｌＩＩを作製し、Ｂｇｌ部位を作製し、ＳａｃＩおよびＰｓｔ Ｉ部位をそれぞれ除去した。ｐＢｌｕｃＢｇｌＩＩの１．７ｋｂ ＢｇｌＩＩ ＳｐｅＩ断片を、ｐＢＩ２２１ＢｇｌＩＩの３．７ｋｂ ＢｇｌＩＩ Ｘｂａｌ 断片の中にクローニングし、ｐＳｌｕｃ１０を作製した。 ｐＳｌｕｃ２０（３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ発現カセット構築物を含む ）を、ｐＳｌｕｃ１０由来の３．０ｋｂ ｌｕｃ’含有ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩ ＩＩ断片をｐＫＳ（−）の中にクローニングすることにより作製した。ｐＳｌｕ ｃ１５（ＲＢ７ＭＡＲ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ：：ＲＢ７ＭＡＲ発 現カセット構築物を含む）を、同じ３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断 片をｐＧＨＮＣＯ７ ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩの中にクローニングすること により作製した。最後に、ｐＳｌｕｃ２３（ｓｃｓ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：： ｎｏｓＴ：：ｓｃｓ’構築物を含む）を、ｐＳｌｕｃ１０、ｐＲＢＫＳおよびｐ ｃＢＢＸ７から２段階工程で作製した。ｐＳｌｕｃ２１は、ｐＳｌｕｃ１０の３ ．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＲＢＫＳの中にクローニングす ることにより作製される中間産物であり、次にｐｃＢＢＸ７の１．８ｋｂ Ａｃ ｃ６５１ ＳａＩＩ断片をｐＳｌｕｃ２１ Ａｃｃ６５１の中にクローニングし 、ｐＳｌｕｃ２３を生成した。 具体例２ タバコ細胞の形質転換とルシフェラーゼ分析 ＮＴ１、Nicotiana tabacum細胞系を、Allenn et al.，Plant Cell 5，603-61 3(1993)により報告されている方法に従い、選択プラスミドとしてｐＧＨＮＣ１ ０を用いて(Allen et al.，Plant Cell 8，899-913(1996))、微粒子銃により形 質転換した。微粒子銃による形質転換後5週間後に分離された全ての形質転換細 胞を、細胞懸濁培地において１週間成長させた。次いで、細胞をへらでかき集め 、９６ウェルプレートの１つのウェルの中に入れ、下記の様に定性的ルシフェラ ーゼ分析に供した。 具体例３ 定性的ルシフェラーゼ分析 定性的ルシフェラーゼ分析は、Hamamatsu Agrus-50 CCD低輝度画像化装置にお いて画像化する３０分前に、１週間成長させた細胞に１００μＬの０．５ｍＭル シフェリン溶液をピペッティングすることにより実施し、偽色で観察した。視覚 による観察可能な線を比較した。 図１Ａは、３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ発現カセット構築物により形質転 換された細胞を示す。これらの対照細胞１９中６が検出可能な発現を示した。３ ５ｓＰはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを意味 する。ｌｕｃは修飾Phtinus puralisルシフェラーゼ遺伝子を意味する。ｎｏｓ Ｔはノパリンシンターゼ遺伝子ポリアデニル化部位由来の転写ターミネータを意 味する。 図１Ｂは、ＲＢ７ＭＡＲ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ：：ＲＢ７ＭＡ Ｒ発現カセット構築物により形質転換された細胞を示す。これらは、同じルシフ ェラーゼリポーター遺伝子がＭＡＲ配列により直列反復方向で挟まれている対照 形質転換細胞である。これらの形質転換の１２中６（５０％）が検出可能な発現 を示した。ＲＢ７ＭＡＲは、タバコＲＢ７遺伝子基質付着領域（ＭＡＲ）を意味 する。 図１Ｃは、ｓｃｓ：：３５ＳＰ：：ｌｕｃ：：ｎｏｓＴ：：ｓｃｓ’構築物に より形質転換された細胞を示す。これらの形質転換細胞は１４中１２（８６％） が検出可能な発現を示し、発現レベルの変動の顕著な低下を示した。ｓｃｓとｓ ｃｓ’は、５’および対応する３’ｓｃｓインシュレーターを意味する。 前記の具体例は本発明を説明するためのもので、本発明の制限を意図していな い。本発明は以下の請求項と、本明細書に含まれる請求項と同等物により定義さ れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アレン，ジョージ・シー アメリカ合衆国、27608 ノース・キャロ ライナ、ローリー、カルティエ・ドライヴ 2719 (72)発明者 マンキン，スコッツ・エル アメリカ合衆国、27606 ノース・キャロ ライナ、ローリー、アヴェント・ヒル・ロ ード 1033―エイ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 再生可能な植物細胞を提供し、 構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開始領域から下流に位置 し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の５’方向、 （ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の５’方向と 構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーターから成る、発現カセッ トから成るＤＮＡ構築物を用いて植物細胞を形質転換することから成る、その中 の外来遺伝子の発現の可変性を減少させた組み換え植物細胞の作製方法。 ２． 構築物は、５’から３’の方向に、第一のインシュレーター、転写開始 領域、前記転写開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、 および第二のインシュレーターから成る、請求項１記載の方法。 ３． 前記形質転換段階が、前記発現カセットを有する微粒子銃による形質転 換により実施される、請求項１記載の方法。 ４． 前記形質転換段階がAgrobacteriumを介する形質転換段階により実施さ れる、請求項１記載の方法。 ５． 前記植物細胞が、再生可能な植物組織に存在する、請求項１記載の方法 。 ６． 前記形質転換植物細胞からの苗条の再生段階を更に含む、請求項１記載 の方法。 ７． 前記形質転換植物細胞からの根の再生段階を更に含む、請求項１記載の 方法。 ８． 前記形質転換植物細胞からの植物の再生段階を更に含む、請求項１記載 の方法。 ９． 前記植物細胞が単子葉細胞である、請求項１記載の方法。 １０． 前記植物細胞が双子葉細胞である、請求項１記載の方法。 １１． 前記インシュレーターが植物のインシュレーターである、請求項１記 載の方法。 １２． 前記インシュレーターが動物のインシュレーターである、請求項１記 載の方法。 １３． 構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開始領域から 下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の ５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の ５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーターから成る、 発現カセットから成るＤＮＡ構築物。 １４． 構築物は、５’から３’の方向に、第一のインシュレーター、転写開 始領域、前記転写開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子 、および第二のインシュレーターから成る、請求項１３記載のＤＮＡ構築物。 １５． 植物形質転換ベクターにより実施される、請求項１３記載のＤＮＡ構 築物。 １６． 前記第一および第二のインシュレーターが植物のインシュレーターで ある、請求項１４記載のＤＮＡ構築物。 １７． 前記第一および第二のインシュレーターが動物のインシュレーターで ある、請求項１４記載のＤＮＡ構築物。 １８． 請求項１３記載のＤＮＡ構築物を含む植物細胞。 １９． 請求項１３記載のＤＮＡ構築物を含む双子葉植物細胞。 ２０． 請求項１３記載のＤＮＡ構築物を含む単子葉植物細胞。 ２１． 構築物は、５’から３’の方向に、転写開始領域、転写開始領域から 下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子、および（ｉ）転写開始領域の ５’方向、（ｉｉ）構造遺伝子の３’方向、あるいは（ｉｉｉ）転写開始領域の ５’方向と構造遺伝子の３’方向の両者に位置するインシュレーターから成る、 発現カセットから成る異種ＤＮＡ構築物を含む、形質転換植物細胞から成る組み 換え植物。 ２２． 構築物は、５’から３’の方向に、第一のインシュレーター、転写開 始領域、前記転写開始領域から下流に位置し機能的にそれと結合した構造遺伝子 、および第二のインシュレーターから成る、請求項２１記載の組み換え植物。 ２３． 前記第一および第二のインシュレーターが植物のインシュレーターで ある、請求項２１記載の組み換え植物。 ２４． 前記第一および第二のインシュレーターが動物のインシュレーターで ある、請求項２１記載の組み換え植物。 ２５． 前記構造遺伝子の下流に位置し、それと機能的に結合し、第二のイン シュレーターの５’に位置する終結配列を更に含む、請求項２３記載の組み換え 植物。 ２６． 植物が単子葉である、請求項２１記載の組み換え植物。 ２７． 植物が双子葉である、請求項２１記載の組み換え植物。 ２８． 植物が、タバコ、ジャガイモ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、穀物から 成るグループから選択される、請求項２１記載の組み換え植物。 ２９． 発芽して請求項２１記載の植物を生じる種子。