JPH08508649A - 遺伝安定化エレメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子が、植物細胞にとって外来性であり、遺伝子の３'または５'−フランキング領域に、少なくとも一つの安定化ＤＮＡセグメントを有するものである、宿主植物細胞を形質転換するための安定化遺伝子。遺伝子は、安定化ＤＮＡセグメントを遺伝子の３'−フランキング領域に、第２安定化ＤＮＡセグメントを遺伝子の５'−フランキング領域に含み得る。本発明は更に安定化遺伝子を含むベクターおよびトランスジェニック植物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝安定化エレメント 本発明は、植物分子生物学の分野、特に外来性遺伝子を植物細胞中に移入し、 トランスジェニック植物上の上記遺伝子の安定表現型を与えることに関する。 “トランスジーン（transgene）”または“外来性遺伝子”は、宿主細胞また は宿主植物以外の源から、宿主細胞または宿主植物に移入された遺伝子を意味す るために、当分野で使用されている語である。しかしながら、トランスジーンは 、本明細書において、安定化ＤＮＡセグメントを含む１個またはそれ以上のフラ ンキング領域を加える宿主植物または宿主細胞に通常位置できる遺伝子を意味し 得る。従って、宿主植物細胞または宿主植物にとって内在性の遺伝子は、安定化 ＤＮＡセグメントを含むフランキング領域で修飾し得、それにより本出願の意味 において内在性遺伝子は外来性遺伝子またはトランスジーンになる。本明細書で 使用の“トランスジーン”および“外来性遺伝子”の語は、同じ意味である。外 来性遺伝子の宿主植物細胞への移入は、当分野で既知の種々の手段により達成で きる。植物のほとんどのクラスは、形質転換および再生され、トランスジーンの 表現型を示す成熟植物を産生する。 トランスジェニック植物を産生する方法は、典型的には、外来性遺伝子を宿主 細胞中に導入するために、個々の細胞、原形質または切除組織の形であり得る植 物細胞を、外来性遺伝子を含むＤＮＡにさらすことを含む。ＤＮＡにさらされた 細胞フラクションのみが実際に形質転換される。受容細胞を、次いで、形質転換 体をし、トランスジーンを発現するものを同定し、選択するためにインビトロで 培養する。しばしば、形質転換体を、非形質転換細胞の成育が阻害される条件下 で成育できる能力により簡単に選択できるように、または形質転換体の成育を助 ける選択可能マーカーを外来性ＤＮＡと共に導入する。しかしながら、ある場合 には、それらを含む形質転換細胞またはカルスを直接同定することもまた可能で ある。更なる工程は、それから最後に全植物が得られる分化芽、根または胚芽を 産生するための再生技術を含む。このような技術は当業者に既知である。 第一形質転換体は、形質転換工程後に外来性遺伝子を有するものとして、直接 または間接的に最初に観察できる細胞または増殖組織（例えばカルスコロニー） である。最も普通には、外来性遺伝子の保有は、共形質転換選択可能マーカーの 発現として間接的に観察する。ある場合、外来性遺伝子の発現に関する表現型は 、第一形質転換体に観察可能である。抗生物質耐性のような選択可能マーカーが 存在する場合、選択試薬である抗生物質が存在する培地は、耐性表現型を発現す る細胞のみの成育を確実にする。しかしながら、選択がない場合、第一形質転換 体の子孫は、トランジーンに関する表現型を失うことがしばしば観察される。例 えば、第一形質転換体カルスの外植片は、しばしば、連続選択圧力なしでは、外 来性遺伝子の表現型を示さない。更に、全植物が形質転換組織またはカルスから 再生された場合、幾つかの再生植物は、外来性遺伝子の表現型を有せず、同じ現 象が、近親交配形質転換植物の子孫において観察される。このような場合、表現 型の損失が、外来性遺伝子自身の損失によるものものであるか、または外来性遺 伝子を発現する能力の損失によるものであるか否か、確立されていない。表現型 の損失は、機構が何であれ、全ての形質転換効率の段階的な減退をもたらし、即 ち形質転換体の全数が、最初の形質転換体に比べて、経時的に減少する。本発明 は、高い総体的な形質転換効率が得られるように、外来性遺伝子の表現型の損失 に対して形質転換体を安定化する手段を提供する。 真核細胞核および核内の染色質の組織の研究は、ＤＮＡ組成および、核の組織 化に関係する細胞性ＤＮＡの核構成的組成を同定する新規技術を導いている。こ のような研究は、ＤＮＡse Ｉ消化および２Ｍ ＮａＣｌによる抽出後の構造的組 成を含む複合核マトリックスの存在を証明している（ガッサー、エス・エム（１ ９８８）Architecture of Eukaryotic Genes：Symposium on Chromatin Structu reof Plant Genes，フランクフルト・アム・マイン、西ドイツ、１９８６年９月 、XIV＋５１８、ＰＶＣＨパブリッシャーズ；ニューヨーク、４６１−４７１頁 参照）。Ｌｉ−３,５−ジヨードサリチレート（ＬＩＳ）抽出が、染色体ＤＮＡ からヒストンを除くという発見は、ＬＩＳ抽出とエンドヌクレアーゼ消化の組み 合わせにより、核スカホールドを単離することを可能にした。このような方法は 、残存ＤＮＡセグメントを核スカホールドに結合したままにする。このようなＤ ＮＡセ グメントは、スカホールド結合領域（ＳＡＲ）およびマトリックス関連領域（Ｍ ＡＲ）と呼ぶ。このようなＤＮＡセグメントは、どのようにして得たかに関係な く、天然のものと機能的に同じであると見なされている。本明細書で使用のＭＡ Ｒの語は、エンドヌクレアーゼ処理後の核スカホールドまたは核マトリックス調 製物から単離されたＤＮＡセグメントを意味する。 ＭＡＲは、典型的に核マトリックスまたはスカホールド調製物に可逆的に結合 している。結合は飽和でき、限定された数の特異的部位への結合を示唆する。Ｍ ＡＲは、任意のサイズであることができるが、一般に約１kbまたはそれ以下のサ イズであり、一般にＡＴに富む。一定の配列モチーフが、あるＭＡＲで観察され ているが、広範囲配列相同性を共有する必要はない。多くのＭＡＲは、トポイソ メラーゼII開裂部位コンセンサス配列を有する。 ＭＡＲは、染色体ＤＮＡを核の構造要素に結合させる構造結合点としてインビ ボで機能すると信じられている。染色体構造のモデルは提案されており、その中 でＭＡＲの２つの結合の間の染色体領域は、ＭＡＲの錨点の間にＤＮＡループを 形成する。ＭＡＲ結合は、近くの遺伝子の転写を、これらの遺伝子を、ポリメラ ーゼ、転写因子、基質等を濃縮し得る核膜孔またはチャンネルの近くに位置させ ることにより促進することが提案されている。同時に、核マトリックスへの投錨 は、別の染色質ループ上の遺伝子の群の分離または単離に働き、境界要素として 活動し、通常位置効果と呼ばれている、一つの錨上の近くの転写単位に影響が限 定される。 ＭＡＲは、例えば、動物ＭＡＲを植物に使用した場合、マトリックス結合特性 は減少され得るが、種境界にまたがって機能するように思える。ＭＡＲおよびＤ ＮＡ複製の間の機能的関係は、メイズＤＮＡのあるマトリックス結合配列が、酵 母のＡＲＳ（自動増殖配列）として機能し得ることを示した研究においてまた関 連している。 フィーヴァン、エルら（１９９０）Mol.Cell.Biol．10:2302-2307は、外来性 レポーター遺伝子に並んだＭＡＲの存在下または非存在下のレポーター遺伝子発 現の効果を比較している。ＭＡＲ配列は、ニワトリライソゾーム遺伝子５'フラ ン キング領域から単離し、宿主細胞は線維芽細胞であった。レポーター遺伝子活性 の促進および位置効果（個々のトランスフェクタントの間の個々の発現レベルの 変化）の減少の両方とも、レポーター遺伝子構築物が遺伝子と並んだＭＡＲを含 む場合、観察された。ＭＡＲに帰すことができる境界機能のレビューは、アイゼ ンベルグ、ジェー・シーおよびエルジン、エス・シー・アール（１９９１）、Tr ends in Genetics 7:335-340により出版されている。著者らは、ＭＡＲが、遺伝 子をそのエンハンサーとひとまとめにした場合、それらを染色体位置効果から切 り離すことによりエンハンサーの活性を維持するために、隔離物として、および 遺伝子およびエンハンサーの間においた場合、バリアーとして機能することを示 唆する。 高等植物において、ＭＡＲの存在は、ホール、ジーら、（１９９１）Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 88:9320-9324に報告されている。タバコＭＡＲ（ＳＡＲＳと呼 ぶ）は、３個の根特異的遺伝子のフランキング遺伝子から単離された。核スカホ ールド調製物に結合する能力を基本とするＭＡＲの“内在性”検定が記載されて いた。ＭＡＲを含むＤＮＡフラグメントへの単離スカホールドの結合能力を基本 にした“外来性”検定が記載されていた。エンドウ豆プラストシアニン遺伝子の 下流に位置するスカホールド関連ＤＮＡ領域は、スラッター、アール・イーら（ １９９１）、Plant Cell 3:1239-1250により単離され、特徴付された。ＳＡＲは 、下流反復配列に結合し、ＡおよびＴ配列が豊富である配列、幾つかのトポイソ メラーゼII結合部位および幾つかのＡＲＳ配列を有した。 ブレイン、ピーら、（１９９２）Plant Cell 4:463-471は、タバコ由来ＳＡＲ を使用し、フィー−ヴァンら（１９９０）に記載の実験と同様に、トランスジェ ニック植物においてレポーター遺伝子が並んだ効果を分析した。個々のタバコ形 質転換体間のトランスジーン発現の分散におけるトランスジーンが並んだタバコ ＳＡＲの効果を示す、定性的に同様な結果が得られた。しかしながら、平均発現 レベルの増加は観察されなかった。分散の減少の効果は、タバコＳＡＲの代わり に哺乳類β−グロブリンＳＡＲを含む構築物で観察されなかった。現在までの観 察された総ての効果は、単一世代内で起こる現象に関する。 本発明の基本は、外来性遺伝子を共に植物宿主細胞に挿入した場合、細胞の世 代から世代において、またはトランスジェニック植物の世代から世代において、 外来性遺伝子を安定化させる、ある安定化ＤＮＡセグメントにの存在を提供する 。外来性遺伝子の表現型（“トランスジーン表現型”）が、一つの世代から次世 代へ、安定化ＤＮＡが存在しないもので観察されるよりも高い頻度で維持される 場場合、安定化は起こっている。トランスジーン表現型の損失が、第一形質転換 体の数と比較した場合、最も明白であるため、安定化は、第一形質転換体と比較 した場合、１またはそれ以上の世代にわたるトランスジーン表現型の損失の頻度 としてまた定義される。 安定化ＤＮＡセグメントは、当分野で既知の核マトリックスまたはスカホール ドとの結合測定により同定されるＭＡＲおよびＳＡＲセグメントを含むが、これ に限定されない。安定化ＤＮＡセグメントは、ある反復配列、遺伝子座活性化領 域（ＬＡＲ）としてまた既知である、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）およびＤＮＡ se過敏領域（ＨＲ）のようなある他の配列を含む。 結合検定なしで、好適な安定化ＤＮＡセグメント候補は、１またはそれ以上の トポイソメラーゼII結合部位、ＤＮＡseへの過敏、高いＡ＆Ｔ含量およびＡＲＳ コンセンサス配列を有するような種々の構造特性により同定できる。安定化ＤＮ Ａセグメントは、１個またはそれ以上のこれらの構造特性を有するが、１個また はそれ以上のそのような特性の欠如は、セグメントを安定化機能を有するものか ら除くものではない。 機能試験は、ベクター上の隣接した遺伝子を個々の発現単位に分けるために、 安定化ＤＮＡセグメントの特性を利用するものを本明細書に記載する。安定化Ｄ ＮＡセグメントは、ベクター上に縦に並んだ２つの遺伝子または転写単位の間を 妨害し、本明細書に記載のように、遺伝子の間の安定化ＤＮＡセグメントの欠如 により発生する下流遺伝子の発現抑制を有効に妨げる。 本明細書には、また、多くの世代にわたるトランスジーン表現型の損失は、ト ランスジーンではなく、むしろトランスジーンの発現の能力の損失によるもので あることを示すデータを記載する。本明細書に記載の実験は、外来性遺伝子をフ ランキング安定化ＤＮＡセグメントと共に提供することにより、多くの細胞世代 にわたる発現の安定化を示す。 従って、本発明は、トランシジーンの３'−および５'−フランキング領域の一 方または両方に安定化ＤＮＡセグメントを提供することにより、多くの細胞世代 にわたる安定なトランスジーン発現の達成のためのベクターを提供する。本発明 は、外来性遺伝子間に安定化ＤＮＡセグメントを提供することにより、同じベク ター上の少なくとも２個の外来性遺伝子の個々の発現を達成するためのベクター をまた含む。 本発明の一部として、植物細胞内に外来性遺伝子のフランキング領域に存在す る少なくとも一つの安定化ＤＮＡセグメントを有するベクターを挿入することに より、外来性遺伝子の表現型の安定性を促進するために、外来性遺伝子で植物を 形質転換する方法をまた含む。好ましい態様において、ベクターは、安定化ＤＮ Ａエレメントの間に外来性遺伝子が位置するように、１個以上の安定化ＤＮＡセ グメントを有する。 本発明は、関連する実施例、図面および配列同定と結び付けて、以下の記載に より更に明白になるであろう。 図１は、実施例２に記載のプラスミドｐＺＯ１０７１およびｐＺＯ１０５１の 図である。 図２は、実施例９に記載のように、核マトリックス結合検定の電気泳動後のＤ ＮＡのオートラジオグラフである。 図３は、ＭＡＲ ＤＮＡの量を増加させるに連れて、核マトリックスへのＭＡ Ｒの結合の飽和を示すグラフである。実施例９参照。 図４は、競合物質ＭＡＲ ＤＮＡを添加するに連れて、トマト核マトリックス へのトマトＭＡＲの結合の競合を示すグラフである。各々の試験は、検定当たり 、１００ng標識トマトＭＡＲに対応する。 ｐＢＲ３２２ベクターフラグメント ショウジョウバエヒストンＭＡＲ ラットＧＤＨ５'ＭＡＲ 相同性トマトＭＡＲ 図５は、大腸菌（E.coli）ＤＮＡの存在下および非存在下での核マトリックス および核殻調製物へのＭＡＲの結合を示す電気泳動ゲルのオートラジオグラフで ある。実施例９参照。 図６は、ＣａＭＮ３５Ｓプロモーターにより制御されたＴＳＷＶ核タンパク質 遺伝子を有するＴ−ＤＮＡベクター、ｐＺＵ０４３Ａの図である。実施例１５参 照。 図７は、実施例１５に記載のような、種々の形質転換系におけるＴＳＷＶ Ｄ ＮＡの存在を示すサザンブロットのオートラジオグラフである。 図８は、実施例１７に記載のような、種々のＭＡＲセグメントを有するＴ−Ｄ ＮＡベクターの図である。 配列番号１は、表１Ａに記載のＭＲＳ５のヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、表１Ｂに記載のＭＲＳ４のヌクレオチド配列を示す。 配列番号３は、表１Ｃに記載のＭＲＳ３の部分的ヌクレオチド配列を示す。 配列番号４は、表５Ａに記載のＭＡＲ１のヌクレオチド配列を示す。 配列番号５は、表５Ｂに記載のＭＡＲ２のヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、表５Ｃに記載の大豆スモールヒートショック遺伝子（ＭＡＲ３ ）由来のＳＡＲＬａ領域のヌクレオチド配列を示す。 配列番号７は、プライマー１９２９ＥＣＯＲのヌクレオチド配列を示す。 配列番号８は、プライマー１９２９ＥＣＯＵのヌクレオチド配列を示す。 本明細書で使用の“安定化”は、本発明の“安定化外来性遺伝子”を有する形 質転換体と、制御外来性遺伝子を有するものと比較した場合、外来性遺伝子の表 現型の保持を、植物細胞および／または植物の１またはそれ以上の世代にわたっ て、増加させることを意味する。比較は、全細胞増殖について補正した後の、一 定時間における外来性遺伝子の表現型（“トランスジーン表現型”）を有する形 質転換体の数とその後のトランスジーン表現型を有する形質転換体の数の間で行 う。従って、（付随して影響を与え得るが）測定すべき定量的発現レベルではな く、個々の細胞系および／または第一形質転換体の植物子孫のトランスジーン表 現型そ れ自身の保持率である。 安定化外来性遺伝子は、１個または好ましくはそれ以上の安定化ＤＮＡエレメ ントをその３'−および５'−フランキング領域に有する外来性遺伝子である。１ 個以上の外来性遺伝子を宿主植物に挿入すべき場合、安定化ＤＮＡエレメントは 、全遺伝子が一対の安定化ＤＮＡセグメントにより並ばされ、安定化されている か、個々に並び得るか、１個の遺伝子は並ぶことができるが、他は並ばないまま であるように提供することができる。後者の場合、並んでいない遺伝子は並んで いる遺伝子より安定性が少ない場合があり、例えば、並んでいない遺伝子が最初 の形質転換体選択のマーカーとしてのみ有用であるが、全植物には影響がない場 合、望ましいことがある。 安定化ＤＮＡセグメントは、ＭＡＲ、ＳＡＲ、ＬＣＲまたはＬＡＲ、前述のよ うなＨＲ等、前述のような反復エレメントならびに構造および機能的特性を共有 する他のＤＮＡセグメントを含む。ある安定化ＤＮＡセグメントは、単一ベクタ ー内で縦に並んでいる２個の遺伝子の間に位置する場合、安定化ＤＮＡセグメン トが存在しない場合に観察されるよりも、下流遺伝子は上流遺伝子の発現の影響 を受けないように、遮蔽効果をまた及ぼす。ＭＲＳエレメントの遮蔽効果の証明 は、本明細書に示され、安定化ＤＮＡセグメントを認識する手段を提供する。安 定化ＤＮＡを認識する他の手段は、当分野で既知の種々のマトリックス結合およ びスカホールド結合検定を含む。安定化ＤＮＡエレメントは、任意の真核または 原核細胞型から得ることができる。好ましい源は、動物または植物源の真核細胞 型であり、最も好ましくは安定化ＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが宿主 細胞に内在性であり得るように、宿主細胞と適合性である。安定化ＤＮＡセグメ ントは、効力および特異性の範囲を表示する。任意の検出可能レベルの安定化が 有効であり、それにより十分な実行物を発見するための多くの形質転換体のスク リーニングおよび評価の必要性を減少する。 宿主植物中に発見される、または通常発見されない任意の遺伝子または宿主植 物に全く発見されない任意の遺伝子を、外来性遺伝子として働かせ得る。別の表 現型を提供するために十分に修飾した宿主細胞の遺伝子を、外来性遺伝子として 提供する。例えば、植物のトランスジーン表現型が野生型と異なるように、タイ ミング、組織特異性、発現レベル、誘発または他の遺伝子制御の態様を変えるよ うに、異なったプロモーターと共に提供された宿主植物の遺伝子は、本定義下で は外来性である。宿主植物の寄生虫または病原体の遺伝子または宿主細胞にとっ て病原でない他の源由来の遺伝子もまた外来性遺伝子である。 本明細書でトランスジーン表現型とまた呼ぶ外来性遺伝子に関する表現型は、 外来性遺伝子によりトランスジェニック植物または宿主植物細胞に寄与された任 意の特性または特徴である。表現型は物理的または農業的試験で、外来性遺伝子 によりコード化されるタンパク質またはＲＮＡの測定できる量に及ぶことができ る。殆どの場合、１個以上の表現型が与えられた外来性遺伝子として検出できる 。例えば、外来性遺伝子がバシラス・スリンゲンシス（Bacillus thuringiensis ）毒素のような殺虫タンパク質をコードする場合、表現型は植物組織中へのタン パク質の存在およびある昆虫に対する耐性を含む。外来性遺伝子が植物ウィルス に対するアンチセンスＲＮＡをコードする場合、表現型は植物組織中へのＲＮＡ の存在およびあるウィルスに対する耐性を含む。ある場合、１個またはそれ以上 の外来性遺伝子を、測定が困難な表現型と組み合わさった容易に測定できる表現 型を提供するために、単一安定化遺伝子カセット中に挿入し得る。例は、真菌耐 性遺伝子と組み合わさったカナマイシン耐性である。従って、外来性遺伝子に関 する表現型は、組み合わさった外来性遺伝子の表現型を含む。 外来性遺伝子およびそれに関連する表現型の例は： ａ）ウィルス耐性を付与するため、または宿主植物の内在性遺伝子の発現を調節 するためのアンチセンスＲＮＡ； ｂ）ウィルス耐性を付与するためのウィルスコートタンパク質および／またはＲ ＮＡもしくは他のウィルスまたは植物遺伝子； ｃ）あるいは、傷誘発遺伝子により付与される真菌耐性； ｄ）殺虫毒素または他のタンパク質により付与される昆虫耐性； ｅ）色素産生に影響を与える遺伝子により付与される花の色または花の配色； ｆ）収穫改善； ｇ）日照り耐性； ｈ）自家不和合成； ｉ）雄性不稔性； ｊ）遅延または加速された成熟； ｋ）例えば治療的に有用なタンパク質をコードする哺乳類遺伝子により付与され るタンパク質合成； ｌ）アミノ酸バランスに影響を及ぼすように修飾した種子貯蔵タンパク質遺伝子 により付与される改善された栄養バランス； ｍ）種々の除草剤耐性機構により付与される、除草剤耐性； ｎ）硝酸塩耐性； ｏ）植物形態、例えば植物の成育に向かう植物源を最小にする小型変種遺伝子； ｐ）糖、澱粉、複合炭水化物、油、アルカロイド、ガム等のような有用な植物生 産物の製造を増加または変化させる代謝置換： を含むが、これに限定されない。 植物内に挿入するのに有用な外来性遺伝子の他の種類は、本発明の分野の当業 者に既知であろう。 安定化外来性遺伝子を含む形質転換体の構築は、ＤＮＡ操作の標準的技術によ り容易に達成できる。安定化ＤＮＡセグメントは、プロモーター配列の上流の５ '−フランキング領域、またはもし存在するのであればポリアデニル化信号配列 の下流に位置し得またはし得ない３'−フランキング領域に挿入できる。外来性 遺伝子のいずれかの末端から安定化ＤＮＡセグメントへの正確な距離は重要では ない。しかしながら、もし構築物がアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ −ＤＮＡ境界を含めば、安定化ＤＮＡセグメントはＴ−ＤＮＡ境界の間になるよ うに挿入すべきであり、安定化ＤＮＡセグメントの統合を確実にする。１個また はそれ以上の安定化ＤＮＡエレメントの効果は、隣かまたは近接して位置する遺 伝子を安定化する。従って、好ましい構築物は、安定化ＤＮＡエレメントを、そ の発現を安定化すべき遺伝子のみに並ぶように位置する。安定化ＤＮＡセグメン トはその末端またはその近くに制限部位を有する必要はないが、ベクター上の所 望の部位への安定化ＤＮＡセグメントの挿入を容易にするために、例えばオリゴ ヌクレオチドリンカー、またはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーのライゲーシ ョンに使用する末端は、制限部位配列を含むように修飾することは当業者には重 要なことである。安定化すべき遺伝子の位置に関連した安定化ＤＮＡセグメント の位置は、安定化機能にとっては重要な因子ではない。与えられた遺伝子に並ん でいる安定化ＤＮＡエレメントは、同一であることも、同じ源生物から得られた ものであることも必要でははない。安定化ＤＮＡエレメントは外来性である必要 はないが、宿主生物から得られたものと変えることができる。動物ＭＡＲおよび ＳＡＲ配列およびその植物の対応物に表面上の類似性があるが、植物は安定化Ｄ ＮＡエレメントの好ましい源であり、最も好ましくは、宿主植物種か非常に近い 種の植物である。 安定化ＤＮＡセグメントは、種々の方法で単離できる。第一に、任意の安定化 遺伝子の３'または５'フランキング領域を分析するのは可能であるが、好ましく はコード化領域のいずれかの端の約５００kbp内に位置するフランキング領域に 限定されない。候補物は、ＤＮＡse過敏、トポイソメラーゼII結合部位、マトリ ックスまたはスカホールド調製物への結合能等のような基準により同定可能であ る。別法は、安定化遺伝子のフラグメントを単にクローン化し、次いでＤＮＡse 過敏、位置制御領域、マトリックス結合、スカホールド結合等の特性を示すフラ グメントを選択する。更に別の方法は、植物核の単離、ＬＩＳと共に核を抽出、 次いで例えば制限エンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼで処理し、結合 またはスカホールドの結合を残すＤＮＡを、フェノール抽出により抽出し、得ら れたＭＡＲをクローン化する。他の方法は、植物核マトリックスまたはスカホー ルドを単離し、次いで好ましくは約０.１−１.０kbのサイズのＤＮＡフラグメン トを、マトリックスまたはスカホールドに結合する能力についてスクリーニング する。非常に強く結合できるものを次いでクローン化する。上記の方法の変法と して、例えばトリから単離した位置制御領域（ＬＣＲ）を、ＬＣＲ結合タンパク 質を単離するのに使用する。ＬＣＲタンパク質をコード化する遺伝子を、次いで クローン化し、好適な系で発現させ、タンパク質に結合能力を示す植物ＤＮＡセ グメント を同定するのに使用可能な十分な量産生させる。候補安定化ＤＮＡセグメントが クローン化させる総ての例において、多くの細胞世代にわたりトランスジーンを 安定化する能力は、好適なトランスジェニック宿主におけるマーカートランスジ ーンの使用により試験可能である。試験宿主植物は、好ましくは安定化ＤＮＡセ グメントの非存在下では安定化発現の低い頻度を示す。例えば、レタスは、安定 化ＤＮＡセグメントで形質転換しない場合、第一形質転換体の約１５％の安定発 現頻度を示す。 形質転換は、当分野で既知の任意の方法で行うことができる。これらは、所望 によりＤＮＡの細胞透過性を増加させるために、化学的または物理的試薬の助け を受けて、例えばポリエチレングリコール、デキストランスルフェート、エレク トロポレーションによる処理およびＤＮＡ被覆粒子の弾道移植をして、ＤＮＡを 全細胞、組織または原形質に直接移入する。形質転換は、またアグロバクテリウ ム（Agrobacterium）株、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumef aciens）およびアグロバクテリウム・リゾジェネス（A.rhizogenes）、およびま た、アグロバクテリア（Agrobacteria）の癌誘発プラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を 含む種々の遺伝子工学により形質転換したプラスミドにより媒介される。Ｔ−Ｄ ＮＡ境界は、他の形質転換構築物に包含することができ、Ｔ−ＤＮＡ境界エレメ ントの間の安定化外来性遺伝子の組み込みを促進する。ＤＮＡの細胞への挿入を 行う他の手段は、ウィルスベクターおよびアグロインフェクションを含む。 形質転換に好適なＤＮＡ構築物は、少なくとも１個の安定化ＤＮＡセグメント に並んだ移入されるべき最小の外来性遺伝子（プロモーターおよびコード化配列 ）を含むが、他のエレメントも包含できる。安定化外来性遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ 境界に並んだベクター内にマーカー遺伝子と組み合わせて導入でき、総て当業者 に既知の方法に従う。構築物の選択は、取り入れられる形質転換体の方法により 影響を受けるであろう。例えば、弾道形質転換が所望である場合、ベクターの使 用は不必要であるが、一方（安定化ＤＮＡセグメントに加えて）フランキングＴ −ＤＮＡ境界が、トランスジーンのゲノム同化の促進の手段として所望であり得 る。 植物形質転換に好適なベクターの例は、ｐＣＧＮ１５４７、ｐＡＲＴ２７、ｐ ＯＣＡ１８、ｐＣＶ００１、ｐＣＶ００２、ＭＯＮ２００、ｐＧＶ３８５０、ｐ ＧＶ２６０、ｐＧＰＴＶベクター、およびMini−Tiプラスミドを含むがこれに限 定されない。上記および本発明に使用するのに好適な他ベクターを記載している 参考文献は、（Mini−Ti）フラモンド・デ・エー・ジェー（１９８３年５月）Bi o/Technology）２６２−２６９頁；（ｐＣＶ００１／ｐＣＶ００２）コンツ・シ ーおよびシェル・ジェー（１９８６）Mol.Gen.genet.、２０４：３８３−３９６ ；クリー・エイチ・ジェーら（１９８５）Bio/Technology）３：６３７−６４２ ；（ｐＣＧＮ１５４７）マックブライド・ケー・イーおよびサマーフェルト・ケ ー・アール（１９９０）Plant Mol.Biol.、１４：２６９−２７６；ヘーケマ・ エーら（１９８５）Plant Mol.Biol.、５：８５−８９；（ｐＧＶ３８５０）ツ ァムブリスキー・ピーら（１９８３）EMBO J.、２：２１４３−２１５０；（ｐ ＯＣＡ１８）オルスツェウスキー・エヌ・イーら（１９８８）Nucl.Acids Res. 、１６（２２）：１０７６５−１０７８２；（ｐＡＲＴ２７）グラーベ・エー・ ピー（１９９２）Plant Mol.Biol.、２０：１２０３−１２０７；（ｐＧＶ２６ ０）デブラーレ・アールら（１９８５）Nucl.Acids Res.、１３：４７７７；（ ｐＧＰＴＶベクター）ベッカー・ディーら（１９９２）Plant Mol.Biol.、２０ ：１１９５−１１９７；（ｐＧＡベクター）アン・ジーら（１９８５）EMBO J. 、４（２）：２７７−２８４；（チャプターＡ２およびＡ３の一般のバイナリー ベクターおよび一般の共同統合ベクター）Plant Mol.Biol.Manual、グレビンお よびシルペロート編集、クルーワー・アカデミック・パブリッシャーズ（Kluwer Academic Publishers）（１９８８）をまた含む。 実質的に農業的または園芸的に価値のある総ての植物は、形質転換可能であり 、再生可能であることが知られている。技術は、当業者に理解されているように 、個々の種の詳細により変化する。与えられた植物種に使用するために適用可能 な形質転換法の性質は、任意の与えられた例で使用できる再生プロトコールの型 に影響し得る。例えば、再生が原形質から得ることができない場合、形質転換法 は全細胞または組織に適用できなければならない。植物種がアグロバクテリウム を使用した形質転換が難しい場合、別の弾道形質転換が好ましい。総てのこのよ うな考察は、当業者に既知のものある。 本発明の使用に適した植物は、ソラナセアエ（Solanaceae）、アポシナセアエ （Apocynaceae）、ケノディアセアエ（Chenodiaceae）、ポリゴナセアエ（Polyg onaceae）、ボラジナセアエ（Boraginaceae）、コンポシタエ（Compositae）、 ルビアセアエ（Rubiaceae）、スクロフラリアセアエ（Scrophulariaceae）、カ プリフォリアセアエ（Caprifoliaceae）、レグミノサエ（Leguminosae）、アラ ッカエ（Araccae）、モラセアエ（Moraceae）、ユーフォルビアセアエ（Euphorb iaceae）、ブラッシカセアエ（Brassicaceae）、プリムラセアエ（Plimulaceae ）、ビオラセアエ（Violaceae）、プロツラセアエ（Plotulaceae）およびロサセ アエ（Rosaceae）の仲間を含むがこれに限定されない。加えて、以下の群の植物 が本発明の使用に好適である：ポリポディアセアエ（polypodiaceae）、アンベ リフェラエ（umbelliferae）、リリアッカエ（liliaccae）、クルシフェレアエ （crucifereae）、グラミネアエ（gramineae）、ゲラナセアエ（geranaceae）、 ラヌンクルセアエ（ranunculceae）、ベゴニアセアエ（begoniaceae）、ラビア タエ（labiatae）、カリオフィラセアエ（caryophyllaceae）、バルサミナセア エ（balsaminaceae）、パピリオナセアエ（papilionaceae）、ゲスネリアセアエ （gesneriaceae）、ビオラセアエ（violaceae）、アラリアセアエ（araliaceae ）および一般的にシダ、ニンジン、リーキ、アスプレニウム（asplenium）、ラ ディッシュ、セロリ、玉ねぎ、ウイキョウ、小麦、ライムギ、大麦、トウモロコ シ（メイズ）、大豆、オートムギ、米、ゼラニウム、スミレ、アネモネ、鑑賞用 アスパラガス、ベゴニア、イラクサ、ヒエンソウ、カーネーション、ナデシコ、 ビジー・リジー（Busy Lizzy）、ハウチワマメ、キンポウゲ（crowflower）、セ ージ、ホタルブクロ、ソープ・ハーブおよびパナックス・チョウセンニンジン： として既知の植物。具体的な記載は、以下の植物：トマト、メロン、スイカ、ト ウガラシ、レタス、マメ、種なし植物を含むブラシカ、キャベツ、ブロッコリー 、カリフラワー、ヒマワリ、サトウダイコン、スミレ、ベゴニア、ペラゴニウム ・ペルタトゥム、ペラゴニウム・ホルトルム、トウモロコシ（メイズ）、スウィ ート・コーン、シクラメンおよびホウセンカについてまた行う。 実施例１：メイズ反復配列（ＭＲＳ）の単離 ゼア・メイズ・エル（Ａ３７８０）ゲノムＤＮＡのライブラリーを、ゲノムＤ Ｎ ＡをＥcoＲＩ＋ＨindIIIで制限し、得られたフラグメントを０.６％低融点アガ ロースで分離し、１から３kbのサイズのフラグメントを含む領域を切除し、希釈 し、ＥcoＲＩ＋ＨindIII切断ｐＴＺ１９Ｒに融合およびライゲーションすること によりｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア）中に構築し、大腸菌（E.coli）Ｃ６００細 胞に形質転換する。特記しない限り、プラスミドＤＮＡのクローニングおよび調 製法は、本質的に記載されたもの（マニアティスら（１９８２）Molecular Clon ing、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）である。一般に、総て のクローニングは低融点アガロースから除いたもので行う。本ラボラトリー由来 の個々のコロニーをマイクロタイター皿の個々のウェルで成育させる。本ライブ ラリーの反復配列をスクリーニングするために、各々のウェル由来の細胞を、ド ット−ブロット装置を使用してニトロセルロースフィルターに移し、希釈ＮａＯ Ｈを使用してその上に融解し、洗浄し、次いでフィルターを乾燥し、焼く。フィ ルターをニックトランスレーションにより、メイズゲノムＤＮＡ標識とハブリダ イズする。クローン化反復ＤＮＡに対応するコロニーのみがこれらの条件下で強 い信号を発する。約２０個のコロニーを更にＤＮＡ調製、制限部位地図作成およ びサザンブロットにより分析する。６個を更なる試験のために選択し、その挿入 物をＭＲＳ１、ＭＲＳ２、ＭＲＳ３、ＭＲＳ４、ＭＲＳ５およびＭＲＳ６と名付 ける。メイズ挿入物は、そのＨindIII部位で切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ 処理により末端を平滑にし、次いでＥcoＲＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼを 使用してライゲートする。過剰のリンカーをＥcoＲＩとの処理により除去し、そ れはまた各々のフラグメントをプラスミドベクターから遊離させる。各々のフラ グメントを低融点アガロースから除去し、ｐＺＯ１０７１にライゲートし（実施 例２）、それをＥcoＲＩで切断し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）で 処理し、低融点アガロースから除去する（図１参照）。一般に、ｐＺＯ１０７１ 中の各々の挿入物の一つの配向のみが回収される。ＥcoＲＩ切断＋ＣＡＰ処理ｐ ＺＯ１０５１のクローニングのために、各々のフラグメントを対応するｐＺＯ１ ０７１の挿入物からＥcoＲＩによる制限により除去する。この場合、ＭＲ３、４ および５の各々の２つの可能性のある配向（“ａ”および“ｂ”と命名）を回収 することに努力する。 ＭＲＳ５の配列は表１Ａ（配列番号１）に記載する。表１ＢはＭＲＳ４（配列番 号２）の配列および表１ＣはＭＲＳ３（配列番号３）の部分的配列を記載する。 実施例２：ｐＺＯ１０５１およびｐＺＯ１０７１の構築 ｐＵＣ１９（ヤーニッシューペロン・シーら（１９８５）Gene、３３：１０３ −１１９）のＥcoＯ１０９１部位を、ＢglIIリンカーで満たし、ライゲーション することによりＢglII部位に代え、ｐＺＯ９１９を得る。NPT II遺伝子カセット をｐＺＯ９１９をＢglIIおよびＣＡＰで処理することにより集め、それを３５Ｓ プロモーター（ＡluＩからＤdeＩ、フランク・エーら（１９８０）Cell、２１： ２８５−２９４）、メイズＡdhＩＳイントロン２（フリーリング・エムおよびベ ネット・ディー・シー（１９８５）Ann.Rev.Genet.、１９：２９７−３２３）、 ＴＮ−５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ベック・イーら（１９ ８２）Gene、１９：３２７−３３６）およびＮＯＳターミネーター（ベバン・エ ムら（１９８３）Nucl.Acids Res.、１１：３６９−３８５）から成るＢglIIフ ラグメントに平滑な０．２５kb平滑を含有する１.７kb BglIIからＳmaＩフラグ メントにライゲートする。プラスミドｐＺＯ９２１は、ＮＯＳターミネーターが 多重クローニング部位のＥcoＲＩ部位に最も近接したｐＺＯ９２１中の本カセッ トの特異的配向から成る。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）カセットは３５Ｓプ ロモーター（DdeＩからＤdeＩ）フランクら、同書）、メイズAdh１Ｓイントロン ６（フリーリングおよびベネット、同書）、ＧＵＳ遺伝子（ジェファーソン・ア ール・エーら（１９８６）Proc.Natl.Acad.Sci.、８３：８４４７−８４５１） およびＮＯＳターミネーターから成る。ＧＵＳカセットを、次いで３.１kbＥco ＲＩからＨinｄIIIフラグメントとして、ＥcoＲＩ＋ＨindIII切断ｐＺＯ９２１ に挿入し、ｐＺＯ１０５１を構築する（図１参照）。 ｐＺＯ９１９の多重クローニング部位の配向をそのＰvuIIフラグメントを、ｐ ＵＣ１８の対応するＰvuIIフラグメント（約３００bp）で置き換えることにより 逆転させ、ｐＺＯ９３０を構築する。ＧＵＳカセットを、次いで、ＥｃｏＲＩか らＨindIIIフラグメントとして挿入し、ｐＺＯ１０６８を構築する。最後に、ｐ Ｚ０９２１由来のNPT IIカセットを１.９kbＢamＨＩからＢglＨＩ破片として、 ｐＺＯ１０６８のＢglII部位にクローン化する。３５ＳプロモーターがＨindIII 部位に最も近いNPT IIカセットの配向をｐＺＯ１０７１と名付ける（図１参照） 。 実施例３：一時的検定 メイズ・ブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）浮遊細胞およびタバコ浮 遊細胞の原形質の調製およびエレクトロポレーションを本質的に記載のように行 う（フロムら（１９８５）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２：５８２４−５８２８ ）。エレクトロポレーションした原形質を、暗闇で１から２日培養し、次いで本 質的に記載のように（ジェファーソン・アール・エー（１９８７）Plant Mol.Bi ol.Rep.、５：３８７−４０５）β−グルクロニダーゼ検定を行う。 表２は、エレクトロポレーションしたＢＭＳ原形質の一時的検定の結果を示す 。ｐＺＯ１０７１のＧＵＳ活性を１.００とする。結果は、ｐＺＯ１０５１また はｐＺＯ１０７１のいずれかのＥcoＲＩ部位にクローン化した各々のＭＲＳにつ いて得る。ＢＭＳ原形質にエレクトロポレーションした場合、ｐＺＯ１０５１は ｐＺＯ１０７１のＧＵＣ活性の約２０％しか有しない。（逆に、NPT II活性を測 定した場合、ｐＺＯ１０７１はｐＺＯ１０５１より幾分少ない活性を有する、デ ータは示していない）。従って、転写の方向の下流にある遺伝子は、減少された 発現を示す。上流遺伝子は、他のカセットが同じプラスミドに存在しない場合に 見られたのと変わらない活性を示す。各々のＭＲＳはその能力を測定し、本発明 を際立たせる。ＭＲＳ総てがそれ自身ＧＵＳ発現に強い効果を有しないが、ｐＺ Ｏ１０７１にクローン化した場合の結果に見られるように、ＭＲＳ３、４および ５は各々ｐＺＯ１０５１のＧＵＳカセットの活性を、その最大レベルに保存する ある能力がある。 実施例４： 更なる実験において、タバコ原形質へのプラスミドのエレクトロポレーション の結果が得られる。ＧＵＳカセットに関連するＭＲＳの配向の効果をまた試験す る。表３は、ｐＺＯ１０５１由来のＧＵＳ活性がタバコ原形質中のｐＺＯ１０７ １と比較して多く減少しており、ＭＲＳ３、ＭＲＳ４およびＭＲＳ５が本発明を 救済でき、ＭＲＳ４およびＭＲＳ３の適度の好ましい配向があり得ることを示す 。ＭＲＳ３において、天然ＥcoＲＩ部位がプロモーターに近い場合、（ａ）配向 が起こる。ＭＲＳ４において、天然ＨindIII部位がプロモーターに近い場合、（ ａ）配向が起こる。ＭＲＳ５において、ＨindIII部位がプロモーターに近い場合 、（ａ）配向が起こる。 実施例５：ＭＲＳ５のサブクローンの活性 ｐＺＯ１０５１中のＧＵＳ遺伝子を隔離するための能力を残しているＭＲＳ内 の領域があるか否かを発見するために、下記表４に制限地図を記載するようなＭ ＲＳ５の３個のフラグメントの末端をＥcoＲＩ部位に代え、これらのｐＺＯ１０ ５１のＥcoＲＩ部位へのクローニングを可能にした。各々の配向は各々のフラグ メントに対して回復している。配向はｐＺＯ１４６４およびｐＺＯ１４６５に対 応する。ＢＭＳおよび表４のタバコ原形質の一時的検定の結果は、少なくともＭ ＲＳ５の場合、各々のフラグメントが隔離能力の一部のみを残していることを明 白に示唆する。Ａ配向は、ＭＲＳ５（ａ）について実施例４で記載したのと同じ である。 実施例６：安定カルス培養の結果 プラスミドｐＺＯ１０７１、ｐＺＯ１０５１、ｐＺＯ１４４２、ｐＺＯ１４４ ３およびｐＺＯ１４６４を、フィルターに置いたＢＭＳ原形質内にエレクトロポ レーションし、次いで好適なフィーダー細胞の層およびカナマイシン７５mg／Ｌ を含む寒天上で培養する。抽出物は、各々の構築物について約２０個のカナマイ シン耐性カルスから調製する。各々のカルスが真性形質転換体であることを決定 するために、NPT II活性をＥＬＩＳＡ（５プライム、３プライム・インコーポレ イテッド）により確認する。ＧＵＳ活性を、分光光学的に測定し、全タンパク質 について正常化する。 ＧＵＳ発現カルスの頻度は、ＭＲＳ３、４または５を含むこれらの構築物につ いて最も高くなければならず、ＧＵＳ活性のレベルは、より均一であることが発 見される。 ＧＵＳ発現カルスを、数カ月カナマシン含有培地上で維持し、経時的にＧＵＳ 活性を測定する。ｐＺＯ１０５１またはｐＺＯ１０７１で形質転換した個々のカ ルスは、ＧＵＳ発現を失ったことが発見され、このようなカルスのフラクション は、数カ月にわたって増加することが分かる。しかしながら、［一個またはそれ 以上の］ｐＺＯ１４４２、ｐＺＯ１４４３およびｐＺＯ１４６４の形質転換体は 、非常に高い頻度でＧＵＳ活性を維持することが分かる。 従って、一時的検定において本質的に“境界”特性を有することが本来同定さ れていたこれらのＭＲＳは、安定化形質転換体で安定化ＤＮＡセグメントとして また行動することが分かった。 実施例７：子孫の安定化 メイズ細胞系を細胞系に依存してエレクトロポレーションまたは弾道法で形質 転換する以外、実施例６と同様の実験を行う。選択培地で成育させた後回収した 安定カルスを新芽発芽に好適な再生培地に移し、新芽を発根培地に移し、最後に 成熟植物に成長した植物を得、ＧＵＳおよびNPT II発現により特徴付けられ、他 と交配または近親交配する。得られる最初の子孫は、またトランスジーン発現に より特徴付する。トランスジーンの発現および遺伝力は、連続した世代に続く。 あるＭＲＳ含有プラスミド由来のこれらの形質転換体の群は、ｐＺＯ１０５１ またはｐＺＯ１０７１と比較した場合、ＧＵＳ遺伝子の発現の、特に世代にわた る改善された安定性を示すことが分かる。 実施例８：マトリックス関連領域（ＭＡＲＳ）の配列決定、クローニングおよ び一時的検定 ２個のフラグメント、ＭＡＲ１（メイズ０.８kbＡＴに富む領域）およびＭＡ Ｒ２（メイズＡＲＳ３を伴う１.２５kb領域）は、本来アール・ベーラニら（１ ９８８ Plant Mol.Biol.、１１：１６１−１７２）によりクローン化された５k bメイズＥcoＲＩフラグメント内に発見され、核マトリックス結合活性を有する 。ＭＡＲ １フラグメントの配列は表５Ａ（配列番号４）に示し、先に配列決定されていな いＭＡＲ２の部分は、公開されているＡＲＳ２と呼ぶＭＡＲ２の部分（ベーラニ ら １９８８ Plant Molecular Biology、１１：１７３−１８２）と一緒に表 ５Ｂ（配列番号５）に示す。加えて、大豆スモールヒートショック遺伝子（ＭＡ Ｒ３）由来の領域ＳＡＲ_L由来の配列（大豆ＨＳＰ１７.６ ０.４kbＳＡＲＬ） を表５Ｃ（配列番号６）に示す。（シェーフルら、Transgenic Res.、２、９３ −１００（１９９３））。フラグメントは、標準ジデオキシ法により配列決定す る。 標準クローニング法を、遺伝子活性に対するプラスミドを構築するために使用 する。ＭＡＲ１は、ｐＺＭＡ３２１から、ＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメンとして ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア）にサブクローン化され、ｐＺＯ１９２７を 形成する。ＭＡＲ２は、ｐＺＭＡ３２１から、ＨindIIIフラグメントとしてｐＴ ７Ｔ３−１８Ｕにサブクローン化され、ＰＺＯ１９２９を形成する。本来ＨpaII −ＥcoＲＩフラグメントであるＭＡＲ３のＨpaII末端は、ｐＳＶＢ２０−ＳＡＲ_L 中のＥcoＲＩに既に代えられている（シェーフル、前掲）。ＥcoＲＩ部位への クローニングのために、ｐＺＯ１９２７は、ＨindIIIで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポ リメラーゼＩで処理し、次いでＥcoＲＩリンカー（ＮＥＢ）をライゲーションに より加え、続いてＥcoＲＩで制限する。ＭＡＲ２のＨindIII末端をｐＺＯ１０２ ９を鋳型として、Ｍ１３Ｒ側にプライマー“１９２９ＥＣＯＲ”ＴＧＡＧＧＡＡ ＴＴＣＧＣＧＧＴＣＴＡＴＣＣＣＣＣＧＣＡＣＧ、配列番号７を使用して、Ｍ１ ３Ｕ側に“１９２９ＥＣＯＵ”ＧＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣ ＴＧＡＧＡＣＡＡＧ、配列番号８を使用したＰＣＲ、続いてＥcoＲＩでの制限に より代える。ＭＡＲ３はＥcoＲＩでの制限に続いて直接ＥcoＲＩ部位にクローン 化する。ＨindIII部位へのクローニングのために、ｐＺＯ１９２７およびｐＳＶ Ｂ２０−ＳＡＲＬをＥcoＲＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、 ＨindIIIリンカーをライゲーションし、続いてＨindIIIで制限する。ＭＡＲ２を 、ＨindIIIでの制限に続き、直接ＨindIII部位にクローン化する。 プラスミドｐＺＯ１０７１およびｐＺＯ１０５１は、実施例２に従って構築し 、各々のＭＡＲフラグメントをＥcoＲＩ部位にクローン化する。これらのプラス ミ ドを実施例２に従って構築する。ＭＡＲのＥcoＲＩでの一つの配向に対して、２ 個目のコピーをＨindIII部位にまたクローン化し、ＧＵＳカセットがＭＡＲの対 により結合しているプラスミドを得る。 メイズ・ブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）浮遊細胞の調製およびエ レクトロポレーションは実施例３に記載の通りである。表６は、エレクトロポレ ーションしたＢＭＳ原形質の一時的検定の数の平均結果を示す。ｐＺＯ１０７１ のＧＵＳ活性を１.００とする。結果は、ｐＺＯ１０７１またはｐＺＯ１０５１ のいずれかのＥcoＲＩ部位にクローン化した各々のＭＲＳについて得た。ＭＡＲ ＩについてＡ配向はＣlaＩ部位がプロモーターに近接している場合に起こる。Ｍ ＡＲ２について、Ａ配向はＳacII部位の対がプロモーターに近接している場合に 起こる。ＭＡＲ３について、Ａ配向は、ＥcoＲＶ部位がプロモーターに遠い場合 に起こる。ｐＺＯ１７０１での結果は、ＭＡＲＳが、５'（ＥcoＲＩ）または３' （ＨindIII）位置のいずれかでＧＵＳカセットの発現に明白に影響しないことを 示す。ｐＺＯ１０５１のＧＵＳ活性は、ｐＺＯ１０７１と比較してまた減少して いる。各々の試験したＭＡＲはまた本発明を部分的に際立たせる。 実施例９：ＭＡＲの安定形質転換体の結果 実施例６と同様の一連の実験を、上記のプラスミドに取り込まれたＭＡＲにつ いて行う。一つの実験において、ｐＺＯ１０５１のＥcoＲＩ部位へのＭＡＲＩの 挿入を試験する。結果を表７に示し、（ｎ）は形質転換体の数である。ｐＺＯ１ ０５１に比べて、形質転換体ｐＺＯ１９３４およびｐＺＯ１９３７の平均ＧＵＳ レベルの増加がある。０.５ＯＤ／時間／タンパク質mgにわたるｐＺＯ１９３４ およびｐＺＯ１９３７形質転換体のＧＵＳ活性の比は、ｐＺＯ１０５１形質転換 体に比べて少なくとも２倍である。同様な結果がＭＡＲ２個結合ＧＵＳカセット の構築物についても見られる（データは示していない）。 実施例１０：核マトリックスＭＡＲ結合系の単離 原形質を葉２０グラムから単離し、Ｗ５培地、メンクツェルら（１９８１）Th eor.Appl.Genet.、５９：１９１−１９５に再懸濁し、遠沈（７'８０ｇ）し、Ｉ Ｂ（２０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.０５mM スペルミン、０.１２５mM スペルミジン、２０mM ＫＣｌ、１％チオジエタノール、１Ｍ ヘキシレングリ コール、０.５mM ＥＤＴＡ、０.５％トリトン−Ｘ−１００（商標）、０.２mM ＰＭＳＦ、５mg／mlアプロチニン、１０mM Ｅ６４［トランス−エポキシサク シニル−Ｌ−ロイシクルアミド［４グアニジノ］ブタン］）１５mlに再懸濁する 。原形質を２０''ボルテックスすることにより均質化し、得られる均質物を７' （８０ｇ）遠心する。上清を遠心（１０'３００ｇ）し、得られるペレット（粗 核）をＩＢ（１５'６００ｇ）の１５％パーコール勾配で精製する。中間層およ び／または管壁の“塗抹”が出現する；両方のフラクションは、多くの混入物お よび僅かな核を含む。ペレットフラクション中の精製核をトリトン（商標）なし のＩＢ緩衝液に再懸濁し、洗浄し、続いて遠心（１０'４００ｇ）する。得られ るペレットを洗浄し、再び同じ緩衝液中で遠心する（１０'３００ｇ）；最終ペ レットをトリトン（商標）なしのＩＢ２mlに再懸濁する。核単離効率は、ＤＡＰ Ｉ染色で測定して慣習的に４０％である（１２×１０⁶核）。 １２×１０⁶核の部分をＷＢ（３.７５mM トリスｐＨ７.４、２０mM ＫＣｌ 、０.５mM ＥＤＴＡ、１％チオジエタノール、０.０５mM スペルミン、０.１ ２５mM スペルミジン、０.１％ジギトニン、トラシロール１mg／ml）１０mlで 洗浄 し、１０'（４００ｇ）遠沈する。洗浄ペレットをＷＢ １００μlに再懸濁し、 核マトリックスを２０'、４２℃の振盪水浴中でインキュベーションすることに より安定化する。ヒストンタンパク質を、安定化核をＬＩＳ−ＨＬＥ緩衝液（２ ０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１Ｍ ＬｉＡｃ、１mM ＥＤＴＡ、４mg／ml ＬＩＳ）［３',５'−ジヨードサリチレート］、０.１％ジギトニン、２５μg／m lトラシロール、１.５mM ＰＭＳＦ）１０mlで、５'、室温でインキュベーショ ンすることにより抽出する。核スカホールドに結合していない（±９０％）染色 体ＤＮＡをループアウトする；遠心（３'、１３,０００ｇ）の後、抽出核は、ふ わふわしたペレットとして現れ、ループアウト染色体ＤＮＡに関連する安定化核 スカホールド（核マトリックスまたは核ハロス（halos））から成る。これらの マトリックスを３回ＤＢ（２０mM トリス、ｐＨ７.４、２０mM ＫＣｌ、７０m M ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ₂、０.０５mM スペルミン、０.１２５mM スペ ルミジン、０.２mM ＰＭＳＦ）１２mlで洗浄する；最後のマトリックスペレッ トを１２００単位の制限酵素を含むＤＢ９.６mlに再懸濁する。ループアウトＤ ＮＡを６０'、３７℃で消化することにより除去する。この段階において、マト リックスは選択ＭＡＲ配列のＤＮＡ結合検定に好適である。 実施例１１：試験陽性ＭＡＲＤＮＡ配列の核マトリックス結合検定の特徴付 １０⁶核から調製した核マトリックスＭＡＲ結合系をＤＢ緩衝液中で３７℃で 一晩、陽性ＭＡＲ配列保持５ng γ^-32Ｐ−末端標識消化プラスミドと共にイン キュベーションする。ＭＡＲ ＤＮＡフラグメントへの結合は、“空”マトリッ クス結合部位または“満たされた”マトリックス結合部位（内在性ＭＡＲの“置 換”結合）のいずれかで起こる。結合後、混合物を遠沈する；ペレット（結合標 識ＤＮＡ ＭＡＲフラグメントに関連した核マトリックスＭＡＲ結合系を含有） を一度ＤＢで洗浄し、再び遠沈する。２回の上清フラクション（非結合ＤＮＡフ ラグメントを含む）を蓄積し、最終ペレットをＤＢ ２００μlに再懸濁する。 ＤＮＡをＳＤＳ／プロテイナーゼＫ処理により上清およびペレットフラクション の両方から単離し、続いてフェノール／クロロホルム抽出し、２回エーテル抽出 およびエタノール沈澱する。上清およびペレット−フラクションから単離した両 方の ＤＮＡを水平アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフ ィー暴露を、１−３日に、−７０℃で、強調スクリーニングと共に行う。ＤＮＡ フラグメント末端標識、ＤＮＡ抽出、電気泳動およびＸ線暴露は、総てマニアテ ィスら（マニアティスら、１９８９）に従う。 結合の親和性を測定するために、一連の結合実験を行い、その中で非特異的超 音波処理大腸菌競合物質ＤＮＡの濃度を変化させる。核マトリックスＭＡＲ結合 系の質および結合すべきＤＮＡフラグメントの親和性に依存して、異なった濃度 の競合物質ＤＮＡが、ＭＡＲフラグメントのみに特異的な結合をもたらすために 必要である。図２は、このような結合の例である；大腸菌競合物質ＤＮＡなしで 、ＭＡＲ−含有フラグメントは核マトリックス系および総ての他のベクターフラ グメントに結合する（非特異的条件）。しかしながら、ベクターフラグメントは 、大腸菌ＤＮＡ濃度を増加させることにより、容易に上清に置き換えることがで きるが、ストリンジェントな条件下で、ＭＡＲフラグメントの結合のみが持続す る（大腸菌ＤＮＡ２０μgは、１kbpＭＡＲフラグメントに２０,０００モル過剰 である）。特異的ＭＡＲ結合を阻止する大腸菌競合物質ＤＮＡの量は、ＭＡＲフ ラグメントの結合親和性の参考となる。 このような系での結合は、正しい非特異的大腸菌競合物質ＤＮＡ量が適用され た場合、ＭＡＲ−含有フラグメントがペレットフラクションに結合するように特 異的である（図２参照）。このような系の結合は、トマトＭＡＲ［１−２５０ng ］を含む末端標識フラグメントの添加を増加させた実験の結合トマトＭＡＲフラ グメントの液体シンチレーション計数が、５０および１００ngフラグメントの間 で最大結合レベルが得られることを示すように、また飽和可能である（図３参照 ）。 核マトリックス内のＭＡＲ結合部位は、他のＭＡＲフラグメントが結合有効性 を競合できるように、特異的ＭＡＲについて非選択的であり、従って、ＭＡＲ結 合はまた可逆的である。図４において、トマトＭＡＲの結合を示す；これは、６ 倍過剰のラットＭＡＲにより約２０％競合できる。これは、ＭＡＲマトリックス 相互作用が、この評価の間保護されていることを示唆する。 核マトリックス単離の間の熱安定化を省いた場合、核マトリックススカホール ド（残渣核小体および薄フィラメントのネットワークで高度に枝別れして包埋さ れている高電子密度群の顆粒群を含む内部マトリックス）は安定化されておらず 、外来性層のみから成る“空”核殻をもたらす。特異的および飽和可能ＭＡＲ ＤＮＡフラクメト結合は、核マトリックス系と同様に、また核殻で可能である（ 図５参照）。核殻結合部位が、非特異的大腸菌ＤＮＡによってより速く競合され ることのみが違い、核殻のＭＡＲ結合部位の数が、核マトリックスと比べて少な いことを証明する。 実施例１２：核マトリックスからの植物ＭＡＲ ＤＮＡ配列の単離 核エンベロープは、トマト原形質からコウフマンおよびシャーパー（１９８４ ）Exp.Cell Res.、１５５：４７７−４９７に従って単離する；Ｌam Ｂ１−様 分子を、エービら（１９８６）Nature、３２３：５６０−５６４に記載のように エンベロープから単離する。Ｌamin Ｂ１を、陽性ＭＡＲ配列の選択道具として 使用するシアノジェンブロミドを使用して、不活性カラム、例えばセファロース ＣＬ ４Ｂと結合させる。 トマト核染色体ＤＮＡをベルナツキー・アールおよびタンクスレー・エス（１ ９８６）Plant Mol.Bio1.Reporter、４：３７−４１に従って単離する。ＭboＩ 消化トマトＤＮＡを、Ｌamin Ｂ１親和性カラムを通し、特異的結合ＤＮＡフラ グメントを溶出させ、クローン化し、更に実施例９で記載したような核マトリッ クスＭＡＲ結合系で核マトリックス結合を特徴付する。 実施例１３：安定化トランスジーンを包む陽性染色質ループからの植物ＭＡＲ ＤＮＡ配列の単離 トマトスポット立ち枯れ病ウィルス（ＴＳＷＶ）（ペータース・ディーら、Pr oceedings USDA Workshop、ベルツビル、ＭＤ、フスおよびローソン編、Nat.Tec h.Inf.Serv.スプリングフィールド、ＶＡ（１９９１）；ジーレン・ジェー・ジ ェー・エルら、（１９９１）Bio/Technology、９：１３６３−１３６７）ヌクレ オカプシド遺伝子を、NPT II選択遺伝子を含む植物形質転換ベクターｐＢＩＮ１ ９（ベバン・エム（１９８４）Nucl.Acids Res.、１２（２２）：８７１１−８ ７２１）にクローン化する。カナマイシン耐性について選択した形質転換体につ いて、ＴＳＷＶ トラスジーンのコピー数をサザンブロットハイブリダイゼーションにより、およ びＴＳＷＶヌクレオカプシド遺伝子の発現をＥＬＩＳＡ検定により、両方分析す る。ＴＳＷＶヌクレオカプシド遺伝子の１つの単一コピーを含む形質転換体を近 親交配し、連続する世代の遺伝子発現安定性について、ＥＬＩＳＡ分析で試験す る。ゲノムコスミドＤＮＡライブラリーを、安定トランスジェニックＳ３系から 、制限エンドヌクレアーゼＭboＩを使用して単離した精製トマト染色体ＤＮＡを 構築する。 ＴＳＷＶヌクレオカプシド遺伝子をプローブとするコロニーハイブリダーゼシ ョンスクリーニングは、トランスジーンを含むクローンの同定をもたらす；染色 体移動技術（マニアティス、１９８９）を使用して、トランスジーンの１００kb p領域上流および１００kbp領域下流を同定し、更に特徴付する。この２００kbp 領域は、真性染色質（“開放”）ループの一部を含む；最も確実には、本領域は 完全真性染色質ループを、平均染色質ループ８０−９０kbpとして含む（ジャク ソンら、１９９０）。この２００kbp領域のサブクローンは、実施例９に記載の ような核マトリックスＭＡＲ結合系における、特異的核マトリックス結合を試験 する。幾つかのトマト染色体ＤＮＡフラグメントが、特異的ＭＡＲ ＤＮＡ配列 として同定される。 実施例１４：５'および３'の核遺伝子に並んでいる植物ＭＡＲ ＤＮＡ配列の 単離 ゲノムコスミドＤＮＡラブラリーは、（制限エンドヌクレアーゼＭboＩを使用 して）精製トマト染色体ＤＮＡから構築する。コロニーハイブリダーゼーション スクリーニングは、両側から約２０kbpフランキング領域を伴うトマトプラスト シアニン遺伝子を含むクローンをもたらす。５'領域をサブクローンし、実施例 ９に記載のような核マトリックスＭＡＲ結合系における、特異的核マトリックス 結合を試験する。約１kbp５'上流トマト染色体ＤＮＡが、特異的ＭＡＲ ＤＮＡ 配列として同定される。 実施例１５：過敏染色体ＤＮＡ領域の同定 染色質を、特異的ＭＡＲ配列を外部（殻）および内部核マトリックスに投錨す る ことにより、局所的拘束ＤＮＡループを組成する。陽性活性遺伝子（分散真性染 色質と呼ぶ）を有するループは、転写因子にアクセス可能な領域、ＲＮＡポリメ ラーゼおよび転写に必要な他の成分を含むと考えられているが、不活性ループ（ 領域）（濃縮異質染色質と呼ぶ）は、アクセス不可能である。安定トランスジェ ニック（植物）系中のトランスジーンは、少なくとも部分的に分散した転写活性 である開放真性染色質に統合されていることを示唆する。このような活性（トラ ンス）ジーンを有する染色質ループ領域のアクセス能は、不活性染色質ループ領 域と比べて増加したヌクレアーゼ消化に反映される（ワイントラウブおよびグロ ーディン、１９７６）。開放／分散または閉鎖／濃縮ループ（領域）の基礎を成 す分子機構はまだ理解されていない。しかしながら、あるシス−活性エンハンサ ー−様ＤＮＡフラグメント（ＬＣＲ−位置制御領域（フェルセンフェルド・ジー （１９９２）Nature、３５５：２１９−２２３と呼ぶ）は、ループ領域で染色質 構造の開放＜＞閉鎖スイッチ／レギュレーターとして働くと思われる。差異は、 不活性または閉鎖真性染色質領域による異質染色質領域への組織特異的特異遺伝 子発現の保持である。過敏染色体ＤＮＡ領域は、ヌクレアーゼ消化に対して感受 性の増加を示すＤＮＡ領域として定義する。このような過敏ＤＮＡ領域は、ＬＣ Ｒのようなシス活性レギュレーター配列を含む。従って、ＤＮＡseＩ過敏ＤＮＡ 領域のスクリーニングは、予備選択染色体構造−制御シス活性エレメントである 。 原形質は、実施例８に記載のように、細胞壁分解酵素が（低）範囲の濃縮で適 用される修飾により単離され、インビボ細胞と原形質の中間の形の透過可能細胞 をもたらす。細胞／原形質は、Ｗ５培地で２回洗浄し、続いてヌクレアーゼ緩衝 液（０.０５Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５mM ＭｇＣｌ₂、０.０１Ｍ ２ −メルカプトエタノール、１０ｐg／ml ＢＳＡ）に再懸濁する。細胞をＤＮＡs eＩの変化させた濃度（１０^-3−１０^-5Ｕ／ml）で、１０'、室温で処理する。Ｄ ＮＡを標準フェノール／クロロホルム法を使用して単離し、好適な制限酵素で消 化し、ハイボンド（Hybond）Ｎ⁺にブロットする。ハイブリダイゼーションは、 安定トマトトランスジェニック系から単離した（実施例１２に記載）安定ＴＳＷ Ｖヌクレオカプシド遺伝子に囲まれた２００kbpゲノム領域由来のプローブと共 に行う。過 敏領域（染色質構造制御シス活性エレメント）を、ＤＮＡseＩ濃度の一連の増加 を、透過可能トマト細胞に適用した場合、予期されるＤＮＡ制限フラグメントと ハイブリダイズ可能なプローブの量の減少を示す領域として同定する。別法とし て、ＨＲの同定は、本質的にはフォレスター・ダブリュー・シーら（１９９０） 、Genes and Development、４：１６３７−１６４９に記載のようなＤＮＡサブ フラグメントに関する更なる過敏の分析によりまた行うことができる。 実施例１６：レタスにおけるトランスジーン不安定性 典型的アグロバクテリウム−媒介形質転換実験において、１６個の独立したＳ １子孫系を得、それらは挿入トランスジーンを発現する：ＴＳＷＶ核タンパク質 遺伝子カセット（Ｔ−ＤＮＡの図式的示唆は図６に示す）。ＴＳＷＶ核タンパク 質を蓄積する個々のＳ１子孫植物を自家授粉により維持する。得られるＳ２子孫 系は、１６形質転換系を示し、再びＴＳＷＶ核タンパク質の蓄積をＥＬＩＳＡ分 析により分析し、トランスジーンの分離比を明らかにする。この時点で、異常、 非メンデル分離比および遺伝子発現の“沈黙”は、形質転換体の約５０％で見ら れ、トランスジーン発現の不安定性を示唆する。トランスジーンがホモ接合状態 で“固定”されている安定、“ホモ接合体”Ｓ２集団は、僅か６個の形質転換系 で同定された。 異常分離比を発現レベルで示す“不安定”形質転換系のサザンブロット分析は 、トランスジーン分離は、Ｓ２集団内のＤＮＡレベルでは正常であることを証明 する。２個の不安定Ｓ２系（６Ａ−７および２６−１１）由来の９個の独立した Ｓ２植物を、それぞれサザンブロット分析およびＥＬＩＳＡ分析の手段によりト ランスジーンの存在および発現を分析する。図７に示すように、トランスジーン の存在と発現の間の相関関係は観察されない（ＥＬＩＳＡ検定で測定したように 、ＴＳＷＶ核タンパク質を蓄積する植物の数は囲まれている；ＸbalＩによる消 化は１.６kbの完全ＴＳＷＶ核タンパク質遺伝子を遊離し、一方ＨindIIIによる 消化は、ゲノム内に統合されたＴ−ＤＮＡコピーの数に関係する境界フラグメン トを産生する）。トランスジーンそれ自身、ＤＮＡレベルでは“正常”に分離す る；９個中２個のみの固体がトランスジーンを有しないが、トランスジーンを有 する いくつかの植物が、トランスジーンを発現せず、トランスジーン発現の不安定性 を説明する。 ＸbaＩで消化した多くの非発現系のサザンブロット分析は、トランスジーンの 存在を証明するが、これらのＳ２系はＴＳＷＶ核タンパク質を蓄積しない。再び 、トランスジーンの存在と発現の間の相関関係は証明できない。これらのＳ２系 の幾つかはまだＳ１集団の核タンパク質生産物を蓄積できる（形質転換系１１お よび２１）ことは、トランスジーン発現の世代にわたる陽性“沈黙”を説明する 。 トランスジーン発現の不安定性は、多くの商業的除草剤の活性物質であるホス ホイノシリシンに対する耐性を付与するストレプトマイセス・ヒグロスコピクス 由来のバー遺伝子を有する２個の形質転換系においてまた観察される。Ｓ１およ びＳ２子孫集団の除草剤処理は、非メンデル分離比およびモ接合体系における除 草剤耐性の固定が達成されていないことを明らかにする。 実施例１７：トマトにおけるトランスジーン不安定性 トマトにおいて、ＴＳＷＶ核タンパク質遺伝子カセット導入の上でトランスジ ーン不安定性の同様な例が観察される。レタスの場合のように、トランスジーン 発現の最初の“沈黙”の兆候は異常な非メンデル分離比を示す子孫集団のＥＬＩ ＳＡ分析により遭遇する。９個のＳ２子孫植物（形質転換系２７−５）のＥＬＩ ＳＡおよびサザンブロットを合わせた分析は、不活性トランスジーンを有するあ る植物固体の同定をもたらす一つの第一形質転換体から伝来する。ＸbaＩによる 消化は、１.６kbの完全ＴＳＷＶ核タンパク質遺伝子カセットを遊離するが、Ｈi ndIIIによる消化はより広いフラグメントを産生し、その数はゲノム内で統合さ れるＴ−ＤＮＡコピーの数と関連する。明らかに、トランスジーンそれ自身ＤＮ Ａレベルでは正常に分離する；分析した固体の１／３のみが分離の間にトランス ジーンを“欠失”しているが、他の−不活性であるトランスジーンを保持し得、 タンパク質レベルでの異常な分離をもたらす。 不安定形質転換系由来の個々のトマト植物の詳細な研究は、不安定性の現象の 更なる洞察を提供する。一つの同じ植物の異なった年令の葉材料のサンプリング において、ＥＬＩＳＡ−陽性およびＥＬＩＳＡ−陰性サンプルが同定され、植物 におけるトランスジーン発現の“モザイク”パターンをもたらす。トランスジー ン不活性化および葉の年令の間の相関関係は観察されなかった。“沈黙”形質転 換体由来の外植体からのトマト新芽のインビトロ再生は、トランスジーン発現の 部分的再活性をもたらし、ＥＬＩＳＡ−陽性およびＥＬＩＳＡ−陰性新芽は同定 された。結果は、組織培養の間のトランスジーンの“沈黙”反応性の可能性を証 明する。 実施例１８：ＭＡＲ配列を使用した世代にわたる遺伝子発現の安定化 世代にわたる遺伝子発現の境界エレメントとしてのＭＡＲ配列の効果を評価す るために、多くの“Ｔ−ＤＮＡ”構築物をトマトおよびレタスに形質導入し、そ の中で、NPT II選択マーカーおよびＴＳＷＶ核タンパク質遺伝子カセットは、ラ ット、大豆およびトマトＭＡＲ（それぞれｐＭＡＲｒ、ｐＭＡＲｓおよびｐＭＡ Ｒｔ）から単離された配列に並んでいる。これらのＴ−ＤＮＡの図式的提示は、 図８に示す。ｐＭＡＲｃ構築物は、ＭＡＲエレメントとほぼ同じ長さのランダム ＤＮＡ配列（例えば、ベクターＤＮＡ）からなる境界エレメントを有するが、植 物核物質への任意の親和性は有しない。 トマトおよびレタスのアグロバクテリウム媒介形質転換において、ＴＳＷＶ核 殻タンパク質を蓄積する第一形質転換体は、サザンブロット分析により、そのＴ −ＤＮＡコピー数を分析する。Ｔ−ＤＮＡの１個のコピーを有する形質転換体の みを維持し、自家授粉する。得られるＳ１子孫集団から、核タンパク質トランス ジーンを発現する個々の１０個の植物を、もう一回自家授粉してＳ２系を産生す る。ホモ接合状態でトランスジーンが“固定”された非分離Ｓ２系をＴＳＷＶ核 タンパク質の蓄積についてＥＬＩＳＡ分析により同定する。これらの“ホモ接合 体”Ｓ２系を、反復近親交配を維持し、トランスジーン発現を連続する世代にわ たり追跡する。ｐＭＡＲｃ構築物と比較して、８世代後の安定ｐＭＡＲｓおよび ｐＭＡＲｔ形質転換系の割合は著しく高く、これらのＭＡＲ配列がトマトのトラ ンスジーン発現に作用する安定効果を説明する。ｐＭＡＲｔ構築物の場合、連続 する世代において、ｐＭＡＲｃで観察された進行性トランスジーン不活性化はほ とんど完全に予防される。少ない程度で、安定化トランスジーン発現について植 物由来ＭＡＲ配列ほど優れていないヘテロ接合体ラットＭＡＲエレメントについ て観察され、安定化形質転換体の中間の割合をもたらす。レタスにおいて、両方 の植物由来のＭＡＲ配列は同じように良好に働く。トマトおよび大豆ＭＡＲは、 レタスのトランスジーン発現の不安定性を、ｐＭＡＲｃ形質転換系で例示したよ うに減少させる。明らかに、植物由来ＭＡＲ配列は、世代にわたるヘテロ接合体 形質転換系のトランスジーンの安定に使用できる。 配列表 （1）一般的情報： （i）出願人： （A）名称：サンド・リミテッド （B）通り：リヒトシュトラーセ３５番 （C）市：バーゼル （D）州：BS （E）国：スイス （F）郵便番号：ツェーハー−４００２ （G）電話番号：０６１−３２４−１１１１ （H）ファックス番号：０６１−３２２−７５３２ （I）テレックス番号：９６ ５０ ５０ ５５ （A）名称：サンド・パテント・ゲー・エム・べー・ハー （B）通り：フンボルトシュトラーセ３番 （C）市：レラッハ （E）国：ドイツ （F）郵便番号：デー−７９５４０ （A）名称：サンド・エルフィンドュンゲン・フェアヴァルツングス・ゲー・ エム・べー・ハー （B）通り：ブルンナーストラーセ５９番 （C）市：ヴィエナ （E）国：オーストリア （F）郵便番号：アー−１２３５ （ii）発明の名称：遺伝安定化エレメント （iii）配列の数：８ （iv）コンピュターリーダブル フォーム： （A）ミディアムタイプ：フロッピーディスク （B）コンピュータ：IBM PCコンパチブル （C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウェア：パテントインリリースNo.1.0，バージョンNo.1.25 （EPO） （2）配列番号１の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１３５４塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：１： （2）配列番号２の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１６７３塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：Genomic DNA （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイス （xi）配列：配列番号：２： （2）配列番号３の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１３５３塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：３： （2）配列番号４の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：８６２塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：４： （2）配列番号５の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：１２６８塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：５： （2）配列番号６の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：３９９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：二本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：６： （2）配列番号７の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：２９塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：７： （2）配列番号８の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：３１塩基対 （B）型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：DNA Genomic （iii）ハイポセティカル：NO （iii）アンチセンス：NO （vi）起源： （A）生物名：ゼア・メイズ （xi）配列：配列番号：８：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヘレン、ヨハネス・ヤコブス・ルドヘラス オランダ、エヌエル―1602ヘーセー・エン クハイゼン、ヤン・ホースカーイ73番 (72)発明者 デ・ハース、ヨハネス・マリア オランダ、エヌエル―1611セーエム・ボヘ ンカルスペル、ペパーストラート27番 (72)発明者 ファン・ドリール、ルーランド オランダ、エヌエル―1902デーイックス・ カストリサム、ダッハ・ハマルスクヨール ドラーン12番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物細胞にとって外来性である遺伝子と、遺伝子の３'または５'−フラン キング領域に少なくとも一つの安定化ＤＮＡセグメントを含むものである、宿主 植物細胞を形質転換するための安定化遺伝子。 ２．遺伝子の３'−フランキング領域に第１安定化ＤＮＡセグメントを、遺伝 子の５'−フランキング領域に第２安定化ＤＮＡセグメントを含む、請求項１記 載の安定化遺伝子。 ３．ベクターが植物細胞にとって外来性である遺伝子と、遺伝子の３'または ５'−フランキング領域に少なくとも一つの安定化ＤＮＡセグメントを含むもの である、植物形質転換ベクター。 ４．遺伝子の３'−フランキング領域に第１安定化ＤＮＡセグメントを、遺伝 子の５'−フランキング領域に第２安定化ＤＮＡセグメントを含む、請求項３記 載のベクター。 ５．外来性遺伝子が、１個以上のコード化領域を含み、各々のコード化領域が それ自身のプロモーターを含むものである、請求項３または４記載のベクター。 ６．少なくとも２個の安定化ＤＮＡセグメントを含み、第１安定化ＤＮＡセグ メントが両方のコード化領域の５'に位置し、第２安定化ＤＮＡセグメントが上 記コード化領域の間に位置するものである、請求項５記載のベクター。 ７．少なくとも２個の安定化ＤＮＡセグメントを含み、第１安定化ＤＮＡセグ メントが両方のコード化領域の５'に位置し、第２安定化ＤＮＡセグメントが両 方のコード化領域の３'に位置するものである、請求項５記載のベクター。 ８．植物細胞にコード化領域、上記コード化領域の５'末端に制御領域および 遺伝子の３'−または５'−フランキング領域に位置する少なくとも１個の安定化 ＤＮＡセグメントを含む安定化外来性遺伝子を挿入することを含む、植物細胞を 形質転換する方法。 ９．安定化外来性遺伝子が、遺伝子の３'−フランキング領域に位置する第１ 安定化ＤＮＡセグメントおよび遺伝子の５'−フランキング領域に位置する第２ 安定化セグメントを含むものである、請求項８記載の方法。 １０．外来性遺伝子が１個以上のコード化領域を含むものである、請求項８記 載の方法。 １１．安定化ＤＮＡセグメントが、植物マトリックス関連領域、植物スカホー ルド結合領域またはメイズ反復配列からなる群から選択されたものである、請求 項８記載の方法。 １２．遺伝子の間に安定化ＤＮＡセグメントを挿入することを含む、植物に外 来性の２個の形質転換遺伝子の個々の発現を安定する方法。 １３．安定化ＤＮＡエレメントがレタス、トマト、大豆またはメイズ反復配列 である、請求項１２記載の方法。