MXPA00011690A - Sistema para reproducir y modular la estabilidad y recambio de moleculas de arn. - Google Patents

Abstract

Se provee un sistema in vitro que racapitula la estabilidad de ARNm regulado y el recambio de substratos de ARN exogeno; el sistema comprende un extracto celular opcionalmente con actividad agotada de proteinas que se unen a poliadenilato, y una secuencia de ARN objetivo, este sistema se utiliza para identificar agentes que puedan modular el recambio de ARN, asi como agentes que puedan modular el recambio de ARN en presencia de agentes modificadores de la estabilidad de ARN.

Description

SISTEMA PARA REPRODUCIR Y MODULAR LA ESTABILIDAD Y RECAMBIO DE MOLÉCULAS DE ARN APOYO GUBERNAMENTAL La investigación que condujo a la presente invención fue apoyada, por lo menos en parte, por el número de cesión GM56434 de los National Institutes for Health. Por lo tanto, el gobierno puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En su aspecto más amplio, la presente invención involucra un sistema y método para monitorear la estabilidad de ARN e identificar agentes capaces de modular la estabilidad de ARN.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La estabilidad relativa de un ARNm es un regulador importante de expresión de genes. La vida media de un ARNm desempeña un papel para determinar tanto el nivel de estado estable de expresión así como el régimen de capacidad de inducción de un producto génico. En general, muchas proteínas de vida corta son codificadas por ARNms de vida corta. Varios ARNms que codifican proteínas estables, tales como a-globina, también han demostrado que tienen medias vidas extraordinariamente largas. Los mecanismos de observación también son utilizados por la célula para identificar y acortar las vidas medias de ARNms que contienen mutaciones de codón no sentido. De manera clara, los cambios en la vida media de un ARNm puede tener dramáticas consecuencia en las respuestas y funciones celulares. Poco se sabe sobre los mecanismos de recambio de ARNm y estabilidad en células de mamífero, sin embargo los datos in vivo comienzan a dar algunas generalizaciones sobre las trayectorias principales de recambio de ARNm. La cola poli(A) de ARNm puede acortarse progresivamente a través de la vida de un ARNm en el citoplasma. El control del régimen de este procedimiento de desadenilación parece ser un objetivo para muchos factores que regulan la estabilidad de ARNm. Una vez que la cola poli(A) es acortada a aproximadamente 50-100 bases, el cuerpo del ARNm es degradado de manera rápida sin intermediarios discemibles. El procedimiento de traducción también influencia la estabilidad del ARNm. Poco se sabe, sin embargo, respecto a enzimas y componentes reguladores involucrados en el recambio de ARNm de mamífero. Varios elementos de acción cis han demostrado que desempeñan un papel en la estabilidad de ARNm. Las estructuras tapa terminal (5') y 3'-poli(A) y proteínas asociadas tienden a proteger el transcrito de las exonucleasas. Varios elementos de desestabilización así como elementos de estabilización localizados en el cuerpo del ARNm también han sido identificados. El elemento de inestabilidad mejor caracterizado es una secuencia rica en A-U (ARE) encontrada en la región 3' no traducida de muchos ARNms de vida corta. Estos AREs consisten principalmente de repeticiones AUUUA (SEQ ID NO: 12) o una secuencia nonamérica relacionada. Los AREs han demostrado que incrementan el régimen de desadenilación y recambio de ARNm en un modo independiente de traducción. Por ejemplo, las proteínas con elementos ricos en AU incluyen muchos ARNms de factor de crecimiento y citocina, tales como c-fos, c-jun, c-myc FNTa, GMCSF, IL1-15 y IFN-ß. Otros elementos de estabilidad incluyen elementos estabilizadores ricos en C, tales como los que se encuentran en ARNms de globina, colágeno, lipoxigenasa y tirosina hidroxilasa. Otros ARNms tienen elementos de secuencia todavía no caracterizados o escasamente caracterizados, por ejemplo, que se han identificado por análisis de deleción, por ejemplo ARNm de VEGF. Se han descrito numerosas proteínas que interactúan con cierta especificidad con un ARE, pero su papel exacto en el procedimiento de recambio de ARNm todavía no es definido. Por ejemplo, las proteínas que se unen a ARE descritas con anterioridad incluyen HuR y otras proteínas de la familia ELAv, tales como HuR (también llamada HuA), He1-N1 (también llamada HuB), HuC y HuD: AUF1 (cuatro ¡soformas); tristetrapolina; AUH; TÍA; TIAR; gliceraldehído-3-fosfato; hnRNP C; hnRNP A1 ; AU-A; y AU-B. Muchas otras no se han caracterizado extensamente.

A través de la aplicación de genética, los mecanismos y factores involucrados en el recambio de ARNm en Saccharomyces cerevisiae están comenzando a ser identificados. Una trayectoria principal de descomposición de ARNm involucra remoción de tapa seguido de la acción de una 5'- a -3' exonucleasa. También se ha obtenido evidencia de un papel para 3'- a -5' exonucleasas en una trayectoria alternativa. También se han descpto las interacciones funcionalmente importantes entre la estructura de tapa y la cola 3' poli(A) de ARNms de levadura. Diversos factores involucrados en la trayectoria dependiente de traducción de descomposición mediada por codón no sentido también han sido identificados. No obstante, todavía deberá establecerse si estas observaciones son aplicables generalmente a células de mamífero. Las cuestiones mecánicas en células de mamífero son normalmente mejor ejecutadas utilizando sistemas bioquímicos debido a las dificultades inherentes con células de mamífero como un sistema genético. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos por desarrollar sistemas in vitro para estudiar la estabilidad y recambio de ARNm. Sin embargo, los sistemas in vitro actualmente disponibles presentan numerosas limitaciones. Por ejemplo, muchas presentan una calidad de datos pobre y una carencia general de capacidad de reproducción que limita significativamente su aplicación. Otro problema esencial es que la mayoría de estos sistemas no reproduce fielmente todos los aspectos de la estabilidad de ARNm. Una dificultad importante en el desarrollo de estos sistemas es diferenciar entre degradación de ARN no específica, aleatoria y recambio de ARNm regulado verdadero. La importancia de todos los sistemas previos in vitro al procedimiento in vivo de la estabilidad de ARNm, por lo tanto, permanece incierta. A la fecha, ningún sistema de estabilidad de ARNm in vitro ha sido generalmente aceptado en la técnica como válido y útil. Otros problemas que no han sido cubiertos en los sistemas actualmente disponibles es que normalmente involucran un protocolo de extracto complicado que no es generalmente reproducible por otros laboratorios en la técnica. Además, los sistemas actualmente disponibles sólo pueden utilizarse para evaluar la estabilidad de ARNm endógenos, limitando seriamente su utilidad. Finalmente, la calidad de datos obtenidos utilizando dicho sistema es sumamente variable, impidiendo su uso en pruebas de selección sensible. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de estabilidad de ARN in vitro que sea eficiente y sumamente reproducible, y además, uno que produzca cantidades mínimas a no detectables de degradación de ARN. Existe también la necesidad de un sistema de estabilidad de ARN in vitro en donde la desadenilación de un transcrito de ARN en el sistema deberá ocurrir antes de que se observe la degradación general de un cuerpo de ARNm. También se necesita un sistema de estabilidad de ARN in vitro en donde la degradación de un cuerpo de ARNm ocurre aparentemente de una manera sumamente progresiva sin intermediarios detectables, y además, la regulación del régimen de desadenilación y degradación general deberá observarse de una manera específica de secuencia. Dicho sistema deberá poder aplicarse en ARNs exógenos y permitirá facilidad de manipulación experimental. La cita de cualquier referencia en la presente no deberá construirse como una admisión de que dicha referencia esté disponible como "técnica anterior" en la presente solicitud.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se provee un sistema in vitro para modular la estabilidad y el recambio de una molécula de ARN, el cual modela procesamiento de ARN in vivo. Por lo tanto, la presente invención permite selección de alto rendimiento de compuestos/macromoléculas que modulen la estabilidad de ARNs eucarióticos para poder identificar y designar fármacos para afectar la expresión de transcritos seleccionados, así como auxiliar en la caracterización de proteínas endógenas y otras macromoléculas involucradas en la estabilidad de ARNm. El sistema in vitro de la presente invención es útil como un auxiliar de diagnóstico para determinar el defecto molecular en alelos de enfermedades selectivas; desarrollo de sistemas de estabilidad de ARNm in vitro para otros organismos eucarióticos incluyendo parásitos y hongos que deberán conducir a un descubrimiento de fármacos novedosos; y mejorar los sistemas de suministro de genes utilizando el sistema para identificar factores y secuencias de ARN que afectan la estabilidad de ARN.

En su aspecto más amplio, la presente invención se extiende a un sistema in vitro capaz de recapitular recambio de ARN regulado de una secuencia de ARN objetivo preseleccionada añadida exógenamente, el sistema comprende un extracto celular y una secuencia de ARN objetivo. En un ejemplo no limitativo del sistema descrito en la presente, el recambio de ARN regulado es un recambio de ARN regulado de elemento rico en AU o recambio de ARN regulado de elemento rico en C. El extracto celular del sistema de la presente invención se aisla de células eucarióticas lisadas o tejidos; el extracto celular puede obtenerse por ejemplo de una línea de células, tal como línea de células HeLa o de células T, pero la invención no se limita a éstas. El extracto celular puede prepararse de células que comprenden ácido nucleico extraño, tales como aquellas que están infectadas, establemente transfectadas o transitoriamente transfectadas. El extracto celular puede ser parcialmente purificado. En una modalidad de la invención, el extracto celular puede tener una actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato. El agotamiento de actividad de proteínas que unen a poliadenilato del extracto celular puede lograrse mediante cualquier número de métodos, por ejemplo, la adición al sistema de ARN competidor por poliadenilato: el secuestro de proteínas que unen poliadenilatos; la adición de una proteinasa que inactiva una proteína que se une a un poliadenilato; o la adición de un agente que evita la interacción entre poliadeniiato y una macromolécula endógena que se une a poliadenilato, por mencionar algunos. Otros ejemplos de los métodos para secuestrar proteínas que se unen a poliadenilatos, pueden lograrse por dichos procedimientos no limitativos como el tratamiento del extracto con un material que agota macromoléculas que se unen a poliadenilatos, tales como anticuerpos para proteínas que se unen a poliadenilato, poliadenilato, y la combinación. El material puede unirse a una matriz. Pueden utilizarse otros métodos para lograr el agotamiento de la actividad de proteínas que se unen a poliadenilatos. La secuencia de ARN objetivo utilizada en el sistema puede ser, a manera de ejemplos no limitativos, ARN sintético, ARN que ocurre naturalmente, ARN mensajero, ARN químicamente modificado o derivados de ARN-ADN. La secuencia de ARN objetivo puede tener una tapa 5' y una secuencia de 3'poliadenilato. La secuencia de ARN objetivo puede ser una secuencia de ARN objetivo no marcada, una secuencia de ARN objetivo marcada, o una combinación de las mismas. La secuencia de ARN marcada puede marcarse con una porción tal como, pero no limitada a una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, y una combinación de porciones fluorescentes y de extinción. Otras porciones y medios para marcar ARN se comprenden en la presente. El sistema de la presente invención puede incluir adicionalmente nucleótido trifosfato exógenamente añadido; se prefiere ATP. También puede incluir un mejorador de reacción para incrementar la interacción entre los diversos componentes presentes en el sistema, por ejemplo, polímeros tales como, pero no limitados a alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y dextrano; se prefiere el alcohol polivinílico. La presente invención también se refiere a un método para identificar agentes capaces de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo. El método se lleva a cabo preparando el sistema descrito con anterioridad que incluye el extracto celular con actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato y la secuencia de ARN objetivo; introducir en dicho sistema un agente que será evaluado; determinar el grado de recambio de la secuencia de ARN objetivo mediante, por ejemplo, determinación del grado de degradación del ARN objetivo marcado; y después identificar un agentes que puede modular el grado de recambio de ARN así como capaz de modular la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo. El método descrito con anterioridad también puede incluir adicionalmente nucleótido trifosfato, ATP siendo preferido. El agente que será evaluado puede ser, pero no se limita a, una molécula modificadora de estabilidad de ARN. La selección no limitativa de los tipos de secuencia de ARN objetivo y los tipos no limitativos de marcas útiles para el ARN son como se describen en la presente anteriormente. El método de la presente invención es útil para identificar agentes que pueden incrementar o disminuir la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo. Dichos agentes pueden ser capaces de modular la actividad de una molécula de unión a ARN tal como, pero no limitada a, proteínas de unión a elementos ricos en C y proteínas de unión a elementos ricos en AU, ejemplos de los últimos ¡ncluyendo HuR y otras proteínas de familia ELAv, tales como HuR, Hel-NI, HuC y HuD; AUF1 ; tristetrapolina; AUH; TÍA; TIAR; gliceraldehído-3-fosfato: hnRNP C: hnRNP A1 : AU-A: y AU-B. Esta lista se provee como ilustrativa de los tipos de moléculas que pueden evaluarse en la presente invención, pero de ninguna manera es limitativa. En otra modalidad de la presente invención, se provee un método para identificar un agente que es capaz de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo en presencia de un modificador de estabilidad de ARN exógenamente añadido o macromolécula de unión a ARN. Ejemplos no limitativos de dichas moléculas se describen con anterioridad. El método se lleva a cabo preparando el sistema descrito con anterioridad que incluye el extracto celular que puede tener actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato y la secuencia de ARN objetivo; introducir en el sistema antes mencionado el modificador de estabilidad de ARN exógenamente añadido o macromolécula de unión y el agente que será evaluado; determinar el grado de recambio de la secuencia de ARN objetivo mediante, por ejemplo, determinar el grado de degradación del ARN objetivo marcado; y después identificar un agente que puede modular el grado de recambio de ARN así como capaz de modular la estabilidad de las secuencias de ARN objetivo en presencia del modificador de estabilidad de ARN exógenamente añadido. La selección no limitativa de los componentes de este método son como se describen con anterioridad. El método antes mencionado es útil, por ejemplo, cuando el modificador de estabilidad de ARN disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo, y el agente que será identificado incrementa la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo que es disminuida por el modificador de estabilidad de ARN. Además, el método es útil cuando el modificador de estabilidad de ARN incrementa la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo, y el agente que será identificado disminuye la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo que es incrementada por el modificador de estabilidad de ARN. Ejemplo no limitativos de modificadores de estabilidad de ARN incluyen proteínas de unión a elementos ricos en C, y proteínas de unión a elementos ricos en AU, ejemplos de proteínas de unión a elementos ricos en AU, incluyendo HuR y otras proteínas de familia ELAv, tales como HuR, Hel-NI, HuC y HuD; AUF1 ; tristetrapolina; AUH; TÍA; TIAR; gliceraldehído-3-fosfato; hnRNP C; hnRNP A1 ; AU-A; y AU-B. Esta lista se provee como ilustrativa de los tipos de moléculas que pueden evaluarse en la presente invención, pero de ninguna manera es limitativa. La presente invención se refiere adicionalmente a un método para identificar un agente capaz de modular la desadenilación de una secuencia de ARN objetivo que comprende preparar el sistema descrito con anterioridad en ausencia de nucleótido trifosfato, tal como ATP; introducir un agente en el sistema; y monitorear la desadenilación de la secuencia de ARN objetivo. Asimismo, la invención también se refiere a un método para identificar un agente capaz de modular la desadenilación y degradación de una secuencia de ARN objetivo que consiste en preparar el sistema descrito con anterioridad en la presente en presencia de ATP; introducir el agente en le sistema; y monitorear la desadenilación y degradación de la secuencia de ARN objetivo. Estas modalidades pueden llevarse a cabo en presencia de un modificador de estabilidad de ARN o macromolécula de unión a ARN para determinar la capacidad del agente para modular el efecto del modulador o molécula de unión en la estabilidad de ARN. Otro aspecto de la presente invención es proveer un método para identificar un agente capaz de modular el crecimiento celular o la diferenciación celular en un mamífero que comprende determinar la capacidad de dicho agente para modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo involucrada en la modulación de crecimiento celular o diferenciación de acuerdo con los métodos descritos con anterioridad. Los agentes capaces de modular el crecimiento celular o la diferenciación celular pueden intervenir en dichos procedimientos fisiológicos como transformación celular y desregulación inmune, pero la invención no se limita a eso. Otro aspecto de la presente invención es proveer un método para identificar, caracterizar y aislar una molécula endógena que se presume participa en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo que comprende preparar el sistema descrito en la presente anteriormente; introducir una proteína que se presume participa en la regulación de recambio de ARN en dicho sistema; y monitorear la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo. La molécula endógena que se presume participa en la desadenilación y/o degradación de ARN o regulación puede ser una proteína o ARN.

En otra modalidad de la invención, se provee un método para identificar un agente capaz de modular la degradación de una secuencia de ARN objetivo en ausencia de desadenilación que comprende proveer un extracto celular en presencia de un nucleótído trifosfato; introducir dicho agente en dicho extracto celular; y monitorear la degradación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho extracto. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un equipo para monitorear la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo preseleccionada bajo condiciones capaces de recapitular el recambio de ARN regulado. El equipo comprende un extracto celular que opcionalmente puede tener actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato; otros reactivos; e instrucciones para utilizarse. El equipo también puede comprender nucleótido trifosfatos, un incrementador de reacción, o ambos. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proveer un sistema para modular la estabilidad y el recambio de una molécula de ARN in vitro, que permite que un experto en la técnica estudie generalmente el recambio, o específicamente la desadenilación y degradación, de un transcrito de ARN, y seleccionar fármacos que puedan modular la estabilidad y el recambio de un transcrito de ARN. El recambio puede ser en ausencia o presencia de moduladores de estabilidad de ARN exógenamente añadidos, o puede permitir el estudio del papel de moléculas endógenas en el recambio de ARN.

Otra modalidad de la invención es proveer un equipo que un experto en la técnica pueda utilizar fácilmente para modular la estabilidad y el recambio de una molécula de ARN in vitro, e investigar los agentes antes mencionados. Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán mejor con referencia a los siguientes dibujos y descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1 A-D: La adición de poli(A) a extractos citoplásmicos S100 acciona actividades de desadenilación y degradación específicas. Panel A. ARN competidor por poli(A) acciona actividades nucleolíticas en el extracto. Un ARN de 54 bases radiomarcado, bloqueado que contiene una cola poli(A) de 60 bases (Gem-A60) se incubó a 30°C con extracto S100 en ausencia (canales marcados S100) o presencia (canales marcados S100 + Polí(A)) de 500 ng de ARN poli(A) frío como se describe en materiales y métodos del ejemplo I durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. La posición de un transcrito de 54 bases, desadenilado (Gem-AO) se indica a la derecha. Panel B. El acortamiento de transcritos de entrada se debe a una 3'-a-5' exonucleasa. ARN Gem-A60, marcado exclusivamente en la tapa 5', se incubó en el sistema de estabilidad de ARNm in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de reacción se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. La posición de un transcrito de 54 bases, desadenilado (Gem-AO) se indica a la derecha. Panel C. un enfoque alternativo también demuestra que el acortamiento de transcritos de entrada se debe a una 3' a 5' exonucleasa. ARN de ARE-A60, radiomarcado en los residuos A, se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de reacción se hibridaron en un oligo de ADN y se cortaron en fragmentos 5' y 3' utilizando ARNasa H. Los fragmentos se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Panel D. La actividad de 3' a 5' exonucleasa es una desadenilasa específica. ARN Gem-A60 o una variante que contiene 18 nucleótidos extras después del extracto poli(A) (Gem-A60-15) se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. La posición de un transcrito de 54 bases, desadenilado (Gem-AO) se indica a la izquierda. 31 ±1 1.0% del ARN Gem-A60 de entrada se desadeniló/degradó en 30 minutos. Fig. 2 A-E: El régimen de degradación del transcrito en ei sistema in vitro es regulado por elementos de inestabilidad ricos en AU en un modo específico de secuencia. Panel A. Los elementos ricos en AU dramáticamente incrementaron el régimen de recambio en el sistema in vitro. ARN Gem-A60 o un transcrito poliadenilado que contiene el elemento rico en AU de 34 bases del ARNm de FNT-a, se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indican las posiciones de transcritos desadenilados (Gem-AO y ARE-AO). El ARN de ARE-A60 se desadeniló/degradó 6.6±0.4 veces más rápido que ARN de Gem-A60. Panel B. El elemento rico en AU de ARNm de c-fos también funciona como un elemento de inestabilidad in vitro. El ARN Gem-A60 o un transcrito que contiene el elemento rico en AU de 72 bases del ARNm de c-fos (Fos-A60) se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indicaron las posiciones de los transcritos desadenilados (Gem-AO y Fos-AO). El ARN de Fos-A60 se desadeniló/degradó 3.5+0.3 veces más rápido que el ARN de Gem-A60. Panel C. La capacidad de elementos ricos en AU para mediar la inestabilidad de transcrito en el sistema in vitro es específica de secuencia. El ARN ARE-A60 o una variante que contiene una mutación en cada cuarta posición (mt ARE-A60; véase materiales y métodos) se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indican las posiciones de los transcritos desadenilados (ARE-AO y mt ARE-AO). Las mutaciones en el ARE redujeron el régimen de desadenilación/degradación por 3.7±1 .4 veces en comparación con el transcrito ARE-A60 de tipo silvestre. Panel D. El elemento rico en AU de FNT-a media la inestabilidad en un contexto heterólogo. Un ARN de 250 bases poliadenilado derivado de la unidad de transcripción tardía SV (SV-A60), o una variante'que contiene el elemento rico AU de 34 bases del ARNm de FNT-a (SVARE-A60), se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indican las posiciones de los transcritos desadenilados (SV-AO y SVARE-AO). ARN de SVARE-A60 se desadeniló/degradó 3.5±0.7 veces más rápido que el ARN de SV-A60. Panel E. El elemento rico en AU derivado del ARNm GM-CSF funciona in vitro sobre un substrato de ARN de longitud casi total. Una versión de longitud casi total del ARNm GM-CSF que contenía un elemento rico en AU (GM-CSF(+ARE), o una versión en donde el elemento rico en AU se eliminó (GM-CSF(-ARE), se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. GM-CSF(+ARE) se desadeniló/degradó 2.8±0.2 veces más rápido que el transcrito GM-CSF(-ARE). Fig. 3 A-B: La desadenilación ocurre en ausencia de ATP y es regulado por elementos ricos en AU in vitro. Panel A. La degradación, pero no la desadenilación requiere ATP. El ARN de SV-ARE-A60 se incubó en el sistema in vitro en presencia de (canales (+) ATP) o ausencia de (canales (-) ATP) durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Las posiciones del transcrito desadenilado (SVARE-A) se indican. Panel B. Los elementos ricos en AU regulan el régimen de desadenilación en substratos de ARN que portan una cola poli(A) de longitud fisiológica. ARN SV o ARN SV-ARE (una variante que contiene un elemento rico en AU) se poliadenilaron con poli(A) polimerasa de levadura y las especies que contenían colas de aproximadamente 150-200 bases se purificaron en gel. Estos ARNs (SV(A150-200) y SVARE(A 150-200) se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indican las posiciones de transcritos desadenilados (SV-A0 y SVARE-A0). El ARN de SVARE(A 150-200) se desadeniló 2.2±0.3% veces más rápido que el transcrito SV(A 150-200). Fig. 4 A-B: La proteína HuR de la familia ELAV se une específicamente al elemento rico en AU de FNT-a en el sistema in vitro. Panel A. Dos proteínas específicamente ¡nteractúan con el elemento rico en AU de FNT-a. Los ARNs de Gem-A60 y ARE-A60 se radiomarcaron en ios residuos U y se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro durante 5 minutos en presencia de EDTA (para bloquear degradación y permitir comparaciones exactas). Las mezclas de reacción se irradiaron con luz UV, se cortaron con ARNasa, y los complejos de proteína-ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 10% que contenía SDS. Los tamaños aproximados de las proteínas entrelazadas indicados a la derecha se dedujeron de los marcadores de peso molecular. Panel B. La proteína de 30 kDa es HuR. El ARN radiomarcado ARE-A60 se incubó en el sistema de estabilidad de ARN in vitro y se entrelazó con proteínas asociadas como se describe con anterioridad. Las proteínas entrelazadas se inmunoprecipitaron utilizando el antisuero indicado antes del análisis sobre un gel de acrilamida al 10% que contenía SDS. La entrada marcada de canal denota las proteínas entrelazadas totales antes del análisis de inmunoprecipitación.

Fig. 5 A-C: Aunque los factores de unión a elementos ricos en AU son importantes para promover la desadenilación y degradación de ARN, la unión de la proteína HuR con elementos ricos en AU no se asocia con la inestabilidad del transcrito mediado por elemento rico AU. Panel A. El análisis de competición sugiere que los factores de unión a elemento rico en AU se requieren para la desadenilación y degradación de transcritos. El ARN SVARE-A60 se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante 30 minutos en presencia de las cantidades indicadas de un competidor de ARN sintético que contenía el elemento rico en AU de FNT-a (ARE comp.) o una secuencia no específica. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. La posición del ARN SVARE-AO desadenilado se indica. Panel B. Las mezclas de reacción se prepararon como se describe en el panel A con la adición de EDTA para inhibir el recambio de ARN. Las interacciones de proteína -ARN se analizaron por análisis de entrelazamiento de UV y se analizaron sobre un gel de acrilamida al 10% que contenía SDS. Las posiciones de las especies entrelazadas específicas de elementos ricos en AU se indican a la izquierda. Panel C. Las reacciones se prepararon exactamente como se describe para el panel B, excepto que las muestras se inmunoprecipitaron utilizando un antisuero específico de a-HuR antes de la electroforesis en gel. Fig. 6 A-D: Proteínas ELAV estabilizaron específicamente intermediarios desadenilados en el sistema in vitro. Panel A. ARN SVARE-A60 se incubó en el sistema in vitro en presencia de (canales (+) Hel-NI)) o en ausencia de (canales (-) Hel-NI)) de 1 µg proteína Hel-NI recombinante. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Se indica la posición del transcrito SVARE-AO desadenilado. Panel B. ARN de SVARE-A60 se incubó en el sistema in vitro en presencia de 1 µg de Hel-N1 recombinante (canales (+) Hel-N1 ), sólo GST (canales (+) GST), o una proteína hnRNP H' (canales (+) hnRNP H*) de unión ARN no relacionado. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. La posición del transcrito SVARE-AO desadenilado es indicada. Panel C. ARN ARE-A60, o un transcrito no relacionado que carece de un elemento rico en AU (CX-A60), se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante 30 minutos, en presencia (canales +) o ausencia (canales -) de ~ 1 ug de proteína Hel-N2. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7M urea. Las posiciones de los transcritos desadenilados se indicaron. Panel D. Una variante de ARN SV-A60 que contenía ARE de FNT-a en la porción 5' del transcrito (SV5?GE-A60) se incubó en el sistema in vitro durante 50 minutos en ausencia (canal -) o presencia (canal +) de 1 µg de proteína Hel-N2. Los productos de ARN se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contenía 7 M urea. Se indicaron las posiciones de entrada y los transcritos desadenilados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Numerosos términos y frases se utilizan a lo largo de la presente descripción. Los significados de dichos términos y frases son como se establecen a continuación. En particular, como se utiliza en la presente "vida media" de una molécula de ARN se refiere a la medición de la disminución en la cantidad de una molécula de ARN para que sirva como una plantilla para la síntesis de su producto de proteína. Como se utiliza en la presente "recambio" se refiere a la degradación de una molécula de ARN. El recambio comprende desadenilación y degradación. Como se utiliza en la presente "tapa" o "tapa 5' " o "tapa terminal", se utilizan intercambiablemente, y se refiere a una tapa de 7-metil guanosina (7mG) químicamente conjugada al nucleótido más hacia el extremo 5' de la molécula de ARN. Como se utiliza en la presente, la frase "cola (poli(A)) de ácido poliadenílico" se refiere a una cadena de ácidos adenílicos contiguos (poliadenilato) añadida post-transcripcionalmente al extremo 3' de una molécula de ARN, tal como ARNm. Como se utiliza en la presente, el término "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una molécula de ARN para que pueda funcionar, y por lo tanto retardar el procedimiento de degradación de una molécula de ARN.

Como se utiliza en la presente, la frase "un oligómero de ácido nucleico competidor por ácido poliadeníiico" se refiere a un oligómero que comprende ácidos adenílicos contiguos que pueden agregarse a un sistema de la invención y proteínas secuestrantes que se unen a poii(A). Por lo tanto, la degradación de una molécula de ARN particular que tiene una cola poli(A) puede ser modulada. Además, como se utiliza en la presente, la frase "endonucleasa de restricción" se refiere a una enzima que reconoce secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ácido nucleico, y produce un rompimiento de doble cadena dentro o cerca del sitio. Algunas enzimas de restricción, tales como EcoRI o Hind\\\ producen "colas complementarias" sobre cada uno de los fragmentos producidos. Se dice que estas colas son "pegajosas" debido a que bajo condiciones de hibridación pueden alinearse entre sí. Por lo tanto, si dos moléculas de ácido nucleico separadas comparten el mismo sitio de restricción, entonces ambas comprenderán colas de cadena individual complementarias cuando se tratan con la misma endonucleasa de restricción, y pueden empalmarse juntas formando una molécula de ácido nucleico recombinante. Naturalmente, como se utiliza en la presente invención, la frase "sitio de endonucleasa de restricción" se refiere a una secuencia de nucleótidos específica que es reconocida por una endonucleasa de restricción específica.

Además, numerosas técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, y de ARN recombinante dentro del campo pueden utilizarse fácilmente para practicar la presente invención. Dichas técnicas se explican por completo en la literatura. Véase, por ejemplo Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (aquí "Sambrook et al, 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984) Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)] Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)] Animal Cell Culture [R.l. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press,

[1986]); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). De esta manera, si aparecen en la presente, los siguientes términos tendrán las siguientes definiciones. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual otro segmento de ADN puede unirse para producir la replicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir capaz de replicarse bajo su propio control.

Un "cassette" se refiere a un segmento de una molécula de ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que puede insertarse en un vector en sitios de restricción específicos. El segmento de la molécula de ácido nucleico puede codificar para un polipéptido de interés, y el cassette y los sitios de restricción son diseñados para asegurar la inserción del cassette en el marco de lectura adecuado para transcripción y traducción. Una célula ha sido "transfectada" por ADN exógeno o heterólogo, cuando dicho ADN ha sido introducido en la célula. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN transfectado realiza un cambio fenotípico. De preferencia, el ADN de transformación se debe integrar (enlazado de manera covalente) en ADN cromosómico que conforma ei genoma de la célula. Una "molécula" de ácido nucleico se refiere a la forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribunucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina: "moléculas de ADN"), o cualquier análogo de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, ya sea en forma de cadena sencilla o una hélice de doble cadena. Son posibles las hélices de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN de doble cadena. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, solamente se refiere a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no la limita a cualquier forma terciaria particular. De este modo, este término incluye ADN de doble cadena encontrado inter alia, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos, y cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas particulares de ADN de doble cadena, se pueden describir las secuencias en la presente, de acuerdo a la convención normal de dar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que se ha sometido a manipulación biológica molecular. Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena la cual es transcrita y traducida en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en la terminal 5' (amino) y un codón de término de traducción en la terminal 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a secuencias procarióticas, ADN de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo mamíferos) e incluso secuencias de ADN sintético. Si la secuencia de codificación tiene la intención de expresión en una célula eucariótica, una secuencia de señal de poliadenilación y terminación de transcripción normalmente se localizará en el extremo 3' hacia la secuencia de codificación. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a polimerasa de ARN en una célula e iniciar transcripción de una secuencia de codificación hacia el extremo 3'. Para efectos de definir la presente invención, la secuencia de promotor se une a su terminal 3' mediante el sitio de iniciación de transcripción y se extiende hacia el extremo 5' para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar transcripción a niveles que se pueden detectar por encima del ruido de fondo. Dentro de la secuencia de promotor se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (definido de manera conveniente por ejemplo, mediante mapeo con nucleasa S1 ), así como dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de polimerasa de ARN. La presente invención se basa en el descubrimiento del solicitante de un sistema hasta ahora desconocido para activar el recambio regulado de moléculas de ARN que le permiten de manera sorprendente e inesperada a un experto estudiar o modular la estabilidad y de este modo, el recambio de una molécula de ARN in vitro. De este modo, el nuevo y útil sistema de la invención permite reproducción precisa y confiable de aspectos tanto generales como regulados de desadenilación y degradación de una molécula de ARN, también referida en la presente como recapitulación de recambio de ARN regulado, particularmente un transcrito de ARNm eucariótico. En particular el nuevo y útil sistema de la invención permite cantidades mínimas, de preferencia, no detectables, de recambio de ARNm, y además la desadenilación de una molécula de ARN ocurre en el sistema antes de degradación de la molécula de ARN, lo cual simula el procedimiento de recambio de ARN encontrado in vivo.

La clave para el desarrollo del sistema y métodos que utilizan el sistema, se basa en el descubrimiento de que ARN competidor por poliadenilato es capaz de secuestrar proteínas que se unen a poliadenilato y posteriormente activar la enzima de adenilasa, induciendo el recambio de ARN. Habiéndose considerado que tales proteínas que se unen a poliadenilato pueden contribuir a desadenilación de ARN, el presente descubrimiento de que tales proteínas son, en contraste, estabilizadores de ARN, condujo a la comprensión de que tales proteínas interactúan con e inactivan mediadores desestabilizadores in vivo. Así, la presente invención se refiere a un sistema in vitro capaz de recapitular el recambio de ARN regulado de una secuencia de ARN objetivo preseleccionada añadida exógenamente que comprende un extracto celular de actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato, y una secuencia de ARN objetivo preseleccionada. En una modalidad particular, el recambio de ARN regulado es aquel modulado por recambio de ARN regulado de elemento rico en AU (ARE). Los ejemplos de ARNm con elementos ricos en AU incluyen aquellos a manera de ejemplo no limitativo, c-fos: c-jun: c-myc FNT-a, GMCSF, ILI-15 y IFN-ß. Como se mencionó anteriormente, los elementos ricos en AU son sitios de unión de numerosas proteínas, que incluyen la familia ELAV de proteínas que se unen a ARE, tales como HuR, Hel-NI, HuC y HuD; otras incluyen AUFI; tristetrapolin; AUH; TÍA; TIAR, gliceraldehído-3-fosfato; hnRNP C; hnRNP Al; AU-A; y AU-B. En otra modalidad, el recambio de ARN regulado es aquel modulado por recambio de ARN regulado de elemento rico en C (CRE), tales elementos según son encontrados en el ARNm de ARNm de globina, colágeno, lipoxigenasa y tirosin hidroxilasa. Otro ARNm con un elemento de secuencia^ todavía sin caracterizar es aquel de VEGF. Sin embargo, la invención no se limita a los elementos particulares o proteínas de unión a estos elementos involucrados en la regulación de recambio de ARN. El extracto celular de la presente invención se prepara a partir de células o tejidos eucarióticos usados. Se pueden utilizar diferentes métodos conocidos por el experto en la técnica para preparar el extracto celular. Se pueden utilizar diferentes fuentes de células, que incluyen células y tejidos frescos y líneas celulosas. Tales células pueden comprender ácido nucleico extraño, tal como en células que están infectadas; o que están temporal o establemente transfectadas con un vector de expresión de mamífero, el último según se describe con mayor detalle a continuación. Para ciertos propósitos, por ejemplo para investigar el papel de infección, y en particular infección intracelular, en recambio de ARN, las células infectadas se pueden utilizar como la fuente del extracto celular de la presente. Las células infectadas con virus u otros microorganismos intracelulares tales como Listeria monocytogenes, HTLV, virus simple de herpes y VIH, se pueden emplear para estas circunstancias particulares. Además, antes de la preparación del extracto celular, las células se pueden exponer a ciertos estímulos químicos u otros estímulos extracelulares, por ejemplo, hormonas, factores de crecimiento e inhibidores de cinasa y fosfatasa, los cuales pueden alterar el recambio de ARN, para los cuales se pueden utilizar estudios posteriores según se describe en la presente para identificar la inducción de ciertas proteínas involucradas en la modulación del recambio de ARN, o para la identificación de agentes los cuales pueden contrarrestar la modulación adversa del recambio de ARN inducida por tales estímulos. Como se apreciará a continuación con más detalle, los métodos de la presente se pueden utilizar para identificar agentes los cuales pueden proteger células al interferir con el recambio de ARN adverso inducido pro varias fuentes. De preferencia, el extracto celular está libre de núcleos y contenidos nucleares y comprende citoplasma, pero esto no es esencial, a menos que componentes particulares tales como enzimas u otros factores, de núcleos, interfieran con la operación del sistema. En una preparación normal, la cual se puede modificar sin apartarse del alcance de la invención, las células crecen, se cultivan, se lisan, centrifugan para 100,000 x g durante 1 hora y se dializan. Se puede añadir glicerol para proteger el extracto si se almacena congelado. Como se describió anteriormente, una célula utilizada para preparar el extracto celular puede comprender ADN extraño. Una molécula de ácido nucleico aislada a colocarse en un sistema de la invención se puede insertar inicialmente en un vector de clonación para producir numerosas copias de la molécula. Se puede utilizar un gran número de sistemas hospederos de vector conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedera utilizada. Los ejemplos de vectores incluyen pero no se limitan a, E. coli, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados de plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación por ejemplo, se puede realizar al ligar la molécula de ácido nucleico en un vector de clonación el cual tiene terminales cohesivas complementarias. Sin embargo, si los sitios de restricción complementaria utilizados para fragmentar la molécula de ácido nucleico no están presentes en el vector de clonación, los extremos de la molécula se pueden modificar de manera enzimática. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado al enlazar secuencias de nucleótidos (enlazadores) en las terminales de las moléculas de ácido nucleico; estos enlazadores enlazados pueden comprender oligonucleótidos específicos químicamente sintetizados que codifican para secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. Se pueden introducir moléculas recombinantes en células hospederas a través de transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan varias copias de la molécula de ácido nucleico. De preferencia, la molécula de ácido nucleico clonada está contenida en un plásmido de vector transportador, el cual provee expansión en una célula de clonación, por ejemplo, E. coli, y purificación fácil para inserción posterior en una línea de células de expresión adecuadas, si así se desea. Por ejemplo, un vector transportador, el cual es un vector que se puede replicar en más de un tipo de organismo, se puede preparar para réplica tanto en E. coli como Saccharomyces cerevisiae al enlazar secuencias de un plásmido de E. coli con secuencias de plásmido 2µ de levadura. Naturalmente, se pueden utilizar cualquiera de los métodos previamente descritos para inserción de una molécula de ácido nucleico aislada en un vector de clonación para construir vectores de expresión que contienen una molécula de ácido nucleico que consta de señales de control de transcripción/traducción y las secuencias de codificación de proteínas adecuadas. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vitro y recombinación in vivo (recombinación genética). Los vectores de expresión de mamíferos contemplados para uso en la invención, incluyen vectores con promotores capaces de ser inducidos, tales como el promotor de dihidrofolato reductasa (DHFR), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un vector de expresión DHFR, o un vector de coamplificación de DHFR/metotrexato, tal como pED (sitio de clonación de Pst\, Sal\. Smal, y EcoRI, con el vector expresando tanto el gen clonado como DHFR: véase Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991 ). De manera alternativa, un vector de coamplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitio de clonación de HindlW, Xbal, Smal, Sbal, EcoRI, y Bell, en el cual el vector expresa glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). En otra modalidad, se puede utilizar un vector que dirige expresión episomal bajo control del Virus Epstein Barr (EBVF) tal como pREP4 (sitio de clonación de Bam l, Sfi\, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvu l, y Kpnl, promotor de RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitio de clonación de BamHl, Sfi , Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvu , y Kpnl, gen precoz inmediato de hCMV constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitio de clonación de pnl, Pvu l, Nhel, Hindlll, Notl, Nhel, Xhol, Sfil, y SamHI, promotor de gen metalotioneina lla que se puede inducir, marcador seleccionable de higromicina Invitrogen), pREPd (sitio de clonación de BamHl, Xhol, Notl, Hindlll, Nhel, y Kpnl, promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitio de clonación de Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Nhel, Sfil, y BamHl, promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de G418; Invitrogen) y pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de higromicina, péptido N-terminal que se puede purificar a través de resina de ProBond y cortado mediante enterocinasa; Invitrogen). Los vectores de expresión de mamíferos seieccionables para uso en la invención incluyen pRc/CMV (sitio de clonación de Hindlll, BstXI, Notl, Sbgal, Apal, selección de G418; Invitrogen), pRc/RSV (sitio de clonación de Hindlll, Spel, SsXI, Notl, Xbal, selección de G418; Invitrogen), y otros. Los vectores de expresión de mamíferos de virus Vaccinia (véase, Kaufman, 1991 , supra) para uso de acuerdo a la invención, incluyen pero no se limitan a pSC1 1 (sitio de clonación de Smal, selección de TK- y ß-gal), pMJ601 (sitio de clonación de Salí, Smal, Afll, Narí, BspMW, BamHl. Apal, Nhel, Sacll, Kpnl y Hindlll; selección de TK- y ß-gal), y pTKpgtFI S (sitio de clonación de EcoRI, Pstl, Salí, Accl, Hindll, Sbal, BamHl, y Hpa, selección de TK o XPRT).

Una vez que una molécula de ácido nucleico particular, tai como ARN, es ¡nsertada en un vector, se pueden utilizar diferentes métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se establece un sistema hospedero y condiciones de crecimiento adecuados, los vectores de expresión recombinantes se pueden propagar y preparar en cantidad. Como se explicó anteriormente, los vectores de expresión que se pueden utilizar incluyen, pero no limitan a los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales, tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN de cósmido y plásmido, solo por nombrar algunos. Además, se puede seleccionar una cadena de células hospederas, la cual modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto de gen en la forma específica deseada. Los vectores son introducidos en las células hospederas deseadas a través de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación de fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosoma), uso de un inyector de genes, o un transportador de vector de ADN (véase por ejemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu and Wu, 1998. J. Biol. Chem. 263: 14621 -14624: Hartmunt et al., solicitud de patente canadiense No. 2,013,31 1 , presentada el 15 de marzo de 1990). Las células útiles para la preparación descrita en la presente, incluyen células inmortalizadas o parcialmente inmortalizadas las cuales pueden crecer en grandes cantidades bajo condiciones definidas, tales como células HeLa y varias líneas celulosas T. Otras fuentes incluyen tejidos, células sanguíneas o células mieloides. Otras fuentes están bien dentro del ámbito de la presente invención. El extracto celular del sistema aquí descrito, tiene actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato. Esto se puede realizar a través de uno o una combinación de métodos tales como los siguientes. Sin limitarse a la teoría, cada uno de estos métodos, ya sea que remuevan las proteínas que se unen al poliadenilato o inactiven la actividad de unión. Estos procedimientos se pueden aplicar al extracto celular conforme se utiliza en los métodos aquí descritos, o el extracto celular se puede tratar anticipadamente. Por ejemplo, un ARN competidor por poliadenilato se puede añadir al extracto celular para proveer una secuencia de ARN irrelevante a la cual se pueden unir ias proteínas de unión, limpiando así la secuencia de ARN objetivo de tales proteínas de unión. En otra modalidad, se puede realizar el secuestro de proteínas que se unen al poliadenilato. El secuestro se puede realizar al añadir al extracto celular o exponer el extracto celular a un material que se une a las proteínas antes mencionadas, tales como anticuerpos para proteínas que se unen al poliadenilato, o secuencias de poliadenilato o macromoléculas que comprenden secuencias de poliadenilato que sirven como objetivos de unión para tales proteínas. Alternativamente o además, estos materiales de unión a proteínas se pueden unir a una matriz, tales como perlas de agarosa, y el extracto celular puede pasarse a través de una columna de tales perlas para remover las proteínas las cuales se unen al poliadenilato. La preparación de tales perlas modificadas de manera covalente para comprender anticuerpos o secuencias de ARN, ya sea poliadenilato o secuencias que comprenden poliadenilato, se conoce por el experto en la técnica. Otros medios para reducir o eliminar tal actividad del extracto celular es mediante exposición a una o más proteinasas conocidas por inactivar una proteína que se une a poliadenilato. Estas proteinasas se pueden añadir al extracto, o unir a una matriz y exponer al extracto, después de cuya inactivación, se pueden remover las perlas. Un medio adicional abarca la adición al extracto de un agente que previene la interacción entre poliadenilato y una macromolécula endógena que se une al poliadenilato. Estos y otros métodos contemplados por la presente invención cumplen ei objetivo deseado de agotar macromoléculas que se unen al poliadenilato a partir del extracto celular, permitiendo así que el extracto celular en combinación con la secuencia de ARN objetivo, se someta a recambio de ARN de tipo in vivo. Se puede emplear uno o una combinación de los métodos antes mencionados para reducir el nivel de dicha proteína a un límite aceptable, dependiendo de la fuente de las células o tejidos a partir de los cuales se hace el extracto, la secuencia de ARN objetivo particular y otros factores. Como se apreciará más adelante, ciertas macromoléculas que se unen al poliadenilato se pueden incluir en pruebas de análisis particulares u otros métodos que emplean el sistema y métodos aquí descritos, cuando la proteína particular u otra macromolécula se somete a investigación como se describió en la presente.

En una modalidad adicional de la invención, el extracto celular puede ser parcialmente purificado o de otra forma manipulado. Por ejemplo, el extracto celular puede estar parcialmente purificado para remover ciertos componentes antes de ser colocados en el sistema de la invención, antes o después de ser opcionalmente agotados de macromoléculas que se unen al poliadenilato. Por ejemplo, se pueden remover del extracto celular ciertos factores no específicos y/o actividades no relacionadas para interferir con los métodos de la presente invención. El experto en la técnica reconocerá para el ARN objetivo particular bajo investigación, la necesidad de purificación parcial del extracto y la necesidad de agotar los factores que se unen a poliadenilato. Además, se pueden añadir otros componentes para asegurar que el sistema de la invención recapitule el recambio de ARN regulado. La secuencia de ARN objetivo en el sistema de la presente invención puede ser una de un número de moléculas de ARN o ARN modificado. Por ejemplo, se puede preparar ARN sintético mediante síntesis en fase sólida, o reproducir mediante transcripción in vitro utilizando polimerasa de fagos como es sabido para el experto en la técnica. El ARN natural se puede aislar de células, tejidos y otras fuentes biológicas. El ARN puede ser un ARN mensajero (ARNm), una especie preferida en la presente, o derivados de ARN-ADN. Normalmente, el ARN mensajero comprende una tapa 5' y una secuencia 3' poliadenilato. Se contempla en la presente ARN químicamente modificado, tal como ARN modificado por porciones de fosfotioato.

El ARN particular, que incluye ARNm utilizado en el sistema y métodos de la presente invención, se puede seleccionar dependiendo de la especie particular de ARNm a estudiar. Las investigaciones de recambio de ARNm, moduladores endógenos de su recambio y moléculas añadidas exógenamente, particularmente moléculas pequeñas las cuales afectan el recambio de ARNm, tienen importantes implicaciones terapéuticas en la profilaxis y tratamiento de una variedad de condiciones y enfermedades. Ciertos ARNm tienen vida corta, tales como aquellos de citocinas; otros tienen larga vida, tales como mensajeros de globina. La regulación de tiempos de vida de ARNm para proteínas particulares y tipos de células particulares puede estar sometida a diferentes efectos adversos, desde infección hasta estímulos externos, los cuales alteran el recambio y por lo tanto, la fisiología celular. En varias condiciones, la expresión alterada de proteínas celulares y fenotipos celulares pueden ser consecuencias de recambio de ARNm alterado. La intervención farmacológica de tal recambio de ARNm alterado, para restablecer un recambio alterado, o la inducción de un recambio alterado para lograr un beneficio para el organismo, se consigue con base en los sistemas y métodos aquí descritos. Por ejemplo, un ARNm particular, tal como el de citocina FNTa proinflamatoria, se selecciona como un objetivo para identificación de moduladores de moléculas pequeñas que pueden disminuir el recambio, y esto prolonga el tiempo de vida y expresión de esta proteína por células inflamatorias. Tales moduladores pueden proveer beneficios sustanciales en el tratamiento de ciertas enfermedades inmunológicas en donde es benéfica una secreción incrementada de FNTa. De manera contraria, la sobreproducción masiva de FNTa en sepsis, o sus efectos adversos en artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria en intestino se puede mejorar mediante el uso de un agente el cual incrementa además el recambio y de este modo, disminuye la expresión de FNTa por células inflamatorias. La aplicación de la invención a otras especies de ARNm se contempla mediante las enseñanzas en la presente. En particular, los métodos de la presente invención facilitan el análisis de alto rendimiento para la identificación de moduladores de recambio de ARN, para ser aplicados al tratamiento o profilaxis de enfermedad. Un aspecto del sistema y método de la presente invención, es monitorear el recambio de la secuencia de ARN objetivo. Esto se puede realizar mediante uno o una combinación de varios métodos conocidos para el experto, uno de los cuales es la provisión de ARN marcado. La secuencia de ARN objetivo de la presente puede estar no marcado, marcado o ser una combinación. Por ejemplo, después de fijar las condiciones bajo las cuales ocurre la desadenilación y/o degradación de la secuencia de ARN objetivo no marcada, se puede evaluar su nivel mediante cualquier número de métodos que utilizan una sonda marcada, tal como mediante hibridación, o por medio de absorbancia de UV, electroforesis en gel seguida por tinción específica o no específica, o utilizando un sistema de amplificación, tal como polimerasa de fagos, y luego cuantificación a través de una técnica a base .de. amplificación adecuada, tai como el método de guía molecular. De manera alternativa, y quizás más simple, la secuencia de ARNm objetivo se puede marcar, y el grado de secuencia intacta o fragmentos de ARN degradados se pueden cuantificar fácilmente. Las marcas tales como una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, y una combinación de porciones fluorescentes y de extinción. Estos ejemplos no limitativos se proveen solamente para efectos de ilustración. Además, de manera opcional, una molécula de ARN o una porción de la misma, tal como su cola poli(A), se puede marcar de manera detectable utilizando protocolos de rutina fácilmente conocidos para un experto. Las marcas adecuadas incluyen enzimas, fluoróforos (por ejemplo ¡sotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), rojo de Texas (TR), rodamina, sales libres o quelatadas de la serie de lantánidos, especialmente Eu3+, (por nombrar algunos fluoróforos), cromóforos, radioisótopos, agentes quelatadores, colorantes, oro coloidal, partículas de látex, ligandos (por ejemplo, biotina) y agentes quimioluminiscentes. Cuando se emplea un marcador de control, se pueden utilizar las mismas o diferentes marcas para el marcador receptor y de control. En el caso en que se utilice una marca radiactiva, tales como los isótopos 3H, 14C, 32P, 8S, 36CI, 51Cr, 57Co, 8Co, 8Fe, 8Y, 125l, 131l, y 186Re, se pueden utilizar procedimientos de conteo actualmente disponibles. Los ribonucleótidos particulares se pueden preparar utilizando los isótopos adecuados, y el ARN marcado se puede preparar mediante síntesis en fase sólida. Alternativamente, las porciones que comprenden los isótopos se pueden unir de manera covalente al ARN. En el caso en que la marca sea una enzima, la detección se puede realizar mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas conocidas en la técnica. En un ejemplo adicional, se pueden incorporar las porciones de biotina en el ARN a través de cualquier número de medios. Posteriormente, el ARN biotinilado o fragmentos de degradación se pueden cuantificar por un reactivo de avidina. Las marcas directas son un ejemplo de marcas, las cuales se pueden utilizar de acuerdo a la presente invención. Una marca directa se ha definido como una entidad, la cual en su estado natural, es fácilmente visible, ya sea a simple vista o con la ayuda de un filtro óptico y/o estimulación aplicada, por ejemplo, luz U.V para promover fluorescencia. Entre los ejemplos de marcas de color, las cuales se pueden utilizar de acuerdo a la presente invención, se incluyen partículas de sol metálicas, por ejemplo, partículas de sol de oro tales como aquellas descritas por Leuvering (patente de E.U.A. 4,313,734); partículas de colorantes tales como las descritas por Gribnau et al. (patente de E.U.A. 4,373,932) y May et al. (WO 88/08534); látex teñido tal como el descrito por May, supra, Snyder (EP-A 0 280 559 y 0 281 327); o colorantes encapsulados en liposomas según se describe en Campbell et al. (patente de E.U.A. 4,703,017). Otras marcas directas incluyen un radionucleótido, una porción fluorescente o una porción luminiscente. Además de estos dispositivos de marcado directo, las marcas indirectas que comprenden enzimas también se pueden utilizar de acuerdo a la presente invención. Se conocen en la técnica diferentes tipos de inmunoensayos enlazados con enzima, por ejemplo, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante, lisozima, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, ureasa, los cuales, además de otros se han descrito a detalle por Eva Engvall en Enzyme Immunoassay ELISA y EMIT en Methods in Enzymology, 70. 419-439, 1980 y en patente de E.U.A. 4,857,453. Las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante. Otras marcas para uso en la invención incluyen perlas magnéticas o marcas de formación de imagen de resonancia magnética. Como se menciona en la presente, el recambio de ARN ocurre en dos pasos: desadenilación, la cual no depende de la presencia de nucleótido trifosfatos, y degradación, la cual es dependiente. El nivel de nucleósido trifosfatos, ¡ncluyendo ribonucleótido y/o desoxiribonucleótido trifosfatos, ATP, UTP, CTP, TTP, y/o GTP, en el extracto celular pueden o no ser suficientes para permitir que ocurra el aspecto de degradación de recambio de ARN. En una modalidad de la presente invención, el sistema aquí descrito comprende además nucleótido trifosfato añadido exógenamente, de preferencia ATP. Se observó durante el desarrollo de la presente invención, que la inclusión de un mejorador de reacción dio como resultado una ligera estimulación en la eficiencia de degradación de ARN. Esto posiblemente se debe a su capacidad de promover formación de complejos macromoleculares in vitro. Por lo tanto, la invención incluye de manera opcional el uso de un mejorador de reacción tal como un polímero, para estimular la interacción entre los componentes del sistema. Los ejemplos no limitativos incluyen alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y dextrano; se prefiere alcohol polivinílico. El sistema antes descrito, el cual recapitula in vitro el recambio de ARN de secuencias de ARN preseleccionadas tiene diferentes utilidades, en particular, la identificación del papel de factores endógenos y moduladores exógenos en el recambio de ARN. La presente invención se refiere ampliamente a un método para identificar un agente capaz de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) preparar el sistema según se describió anteriormente; (B) introducir dicho agente en dicho sistema; (C) determinar el grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo; y (D) identificar un agente capaz de modular el grado de dicho recambio y capaz de modular la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo. El método antes mencionado puede comprender adicionalmente nucleótido trifosfatos añadidos, de preferencia ATP, para los efectos antes descritos.

Los agentes cuya actividad para modular el recambio de ARN se puede detectar en el método antes mencionado, incluyen pero no se limitan a una molécula modificadora de estabilidad de ARN. Como se describió anteriormente, la secuencia de ARN objetivo se puede seleccionar según se describió antes, dependiendo del ARN particular a estudiar. El ARN objetivo puede ser una secuencia de ARN objetivo no marcada, secuencia de ARN objetivo marcada, o la combinación de las mismas. Las marcas incluyen pero no se limitan, a una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, o una combinación de porciones fluorescentes y de extinción. El monitoreo dei grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo comprende determinar el punto de degradación de dicho ARN objetivo marcado, a través de los métodos antes descritos. En particular, el presente método puede estar dirigido para identificar agentes capaces de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo la cual incrementa la estabilidad de la secuencia de ARN objetivo, o de manera alternativa, disminuir ia estabilidad de ia secuencia de ARN. En una modalidad particular, el agente es capaz de modular la actividad de un elemento rico en AU que se une a proteína o un elemento rico en C, pero no es tan limitado. Los ejemplos de elementos ricos en AU que se unen a proteínas y elemento rico en C que se une a proteínas son como se describen en la presente.

En una modalidad adicional de la presente invención, se provee un método para identificar un agente capaz de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo en presencia de un modificador de estabilidad de ARN añadido exógenamente que comprende (a) preparar el sistema como se describió anteriormente; (b) introducir dicho modificador de estabilidad de ARN en dicho sistema; (c) introducir dicho agente en dicho sistema; (d) determinar el grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo y; (e) identificar un agente capaz de modular el grado de dicho recambio y capaz de modular la estabilidad del dicha secuencia de ARN objetivo en presencia de dicho modificador de estabilidad de ARN añadido exógenamente. Este aspecto de la invención se refiere a identificar agentes, en particular moléculas pequeñas, capaces de afectar la actividad de un modulador de recambio de ARN. Como se describió anteriormente, tales moléculas pequeñas se pueden seleccionar para determinar su efecto en la capacidad de estabilizar o desestabilizar el ARN de un mediador endógeno, el cual se añade al sistema de prueba. Alternativamente, se puede utilizar para identificar compuestos los cuales agonizan o antagonizan agentes exógenos. Los componentes del sistema, incluyendo nucleótido trifosfato, el ARN objetivo, marcas, son como se describen anteriormente. En un aspecto de esta modalidad, el modificador de estabilidad de ARN incrementa la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo, y en una modalidad adicional, el agente disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo incrementada por dicho modificador de estabilidad de ARN. En otra modalidad, el modificador de estabilidad de ARN disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo, y en una modalidad adicional, el agente incrementa la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo disminuida por dicho modificador de estabilidad de ARN. Las series candidatas de modificadores de estabilidad de ARN incluyen proteínas que se unen al elemento rico en AU, pero la invención no se limita a tales factores. Se describen anteriormente ejemplos de proteínas conocidas que tienen tales elementos en el ARNm, y proteínas de unión a los elementos, sin embargo, la invención no se limita a estos ejemplos. Además, en otra modalidad, las macromoléculas que se unen a ARN que son removidas del extracto celular de conformidad con los procedimientos antes mencionados, se pueden añadir de vuelta al sistema para investigar su papel en el recambio de ARN, así como el efecto de agentes, en particular moléculas pequeñas, en el recambio de ARN modulado por estas macromoléculas que se unen al ARN. Esta modalidad se puede aplicar a cualquiera de los métodos aquí descritos. En otra modalidad, el ARN objetivo se puede cargar con una macromolécula que se une a ARN antes de la adición al sistema, para los mismos propósitos antes expuestos.

Como se mencionó anteriormente, el extracto celular utilizado en cualquiera de los métodos descritos puede estar parcialmente purificado. También se provee un método para identificar un agente capaz de modular la desadenilación de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) preparar el sistema de la presente invención en ausencia de un nucleótido trifosfato; (B) introducir dicho agente en dicho sistema, y (C) monitorear la desadenilación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema. Se provee un método adicional para identificar un agente capaz de modular la desadenilación y degradación de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) preparar el sistema de la presente invención en presencia de ATP; (B) introducir dicho agente en dicho sistema, y (C) monitorear la desadenilación y degradación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema. Además, se proveen en la presente métodos para identificar un agente capaz de modular crecimiento celular o diferenciación celular en un mamífero, que comprende determinar la capacidad de dicho agente para modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo involucrada en la modulación de crecimiento o diferenciación celular, utilizando los métodos antes mencionados. El agente capaz de modular el crecimiento celular o diferenciación celular puede intervenir en transformación celular, o en desregulación inmune. Una modalidad adicional de la presente invención, se refiere a un método para identificar, caracterizar o aislar una molécula endógena que se presume participa en la desadenilación o degradación de ARN o regulación de la misma, que comprende (A) proveer el sistema de la presente invención como se describió anteriormente; (B) introducir dicha proteína que se presume participa en la regulación de recambio de ARN en dicho sistema; (C) monitorear la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema; y (D) identificar, caracterizar o aislar dicha molécula endógena capaz de modular dicha desadenilación o degradación y capaz de participar en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo. La molécula que se presume participa en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo puede ser una proteína o ARN. En otra modalidad de la presente invención se provee un método para identificar un agente capaz de modular la degradación de una secuencia de ARN objetivo en la ausencia de desadenilación que comprende A) proveer un extracto celular que presencia de un nucleótido trifosfato; B) introducir dicho agente en dicho extracto celular; y C) monitorear la degradación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho extracto. La presente invención también está dirigida a equipos para el monitoreo de la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo seleccionada previamente bajo condiciones que pueden recapitular el recambio de ARN regulado. Tales equipos comprenden: a) un extracto celular con actividad de proteínas opcionalmente agotada que se une a poliadenilato; b) otros reactivos; e c) indicaciones para el uso de dicho equipo. Un equipo puede comprender adicionalmente nucleótido trifosfatos, un incrementador de reacción, una secuencia de ARN objetivo, proteínas de unión a ARN, modificadores de estabilidad de ARN, o una combinación de los mismos. El experto en la técnica observará que los equipos de la invención proveen los componentes para desarrollar los diversos métodos descritos en la presente, como agentes de identificación y factores endógenos que modulan el recambio de ARN, agentes de identificación que modulan la actividad de recambio de ARN de diversos factores involucrados en el recambio de ARN, y otros, en el uso particular en la selección de pequeñas moléculas para identificar los agentes terapéuticos potencialmente útiles para la profilaxis y/o tratamiento de diversas condiciones o de enfermedades que se benefician mediante la modulación del recambio de ARN. Los equipos pueden estar preparados para investigar ya sea la desadenilación de ARN, la degradación de ARN, o ambas, dependiendo de los componentes como se describió en párrafos anteriores. Además, el extracto celular puede purificarse parcialmente. El equipo puede incluir reactivos para agotar la actividad de las proteínas presentes en el extracto que se unen a poliadenilato; dichos reactivos, como poliadenilato, poliadenilato unido a una matriz, un anticuerpo de proteínas que se une a poliadenilato, y un anticuerpo tal unido a una matriz. La presente invención puede comprenderse mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que se proveen como ejemplos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de manera más completa las modalidades que se prefieren de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse como limitativos del amplio alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Las proteínas ELAV estabilizan los intermediarios desadenilados en un sistema in vitro novedoso de desadenilación/degradación de ARN mensajero En la presente se establece un sistema in vitro de estabilidad de ARNm novedoso que usa extractos citoplásmicos S100 de células Hela y substratos de ARN poliadenilatado exógenos que reproduce aspectos regulados de la descomposición (recambio) de ARNm. La adición de un ARN competidor por poli(A) frío activado por una actividad de desadenilasa específica de secuencia en los extractos, así como por una potente actividad ribonucleolítica dependiente de ATP. Los regímenes de desadenilación y degradación se sobre regularon por la presencia de una variedad de elementos ricos en AU en el cuerpo de ARN substrato. Los análisis de competencia demostraron que se requirieron factores de acción trans- para la desestabilización de ARN mediante elementos ricos en AU. La proteína ELAV de -30 kDa, HuR, se unió específicamente a los ARN que contenían un elemento rico en AU derivados de ARNm de FNT-a en el sistema in vitro. Sin embargo, la interacción de HuR con elementos ricos en AU no se asoció con la desestabilización de ARN. De manera interesante, las proteínas ELAV recombinantes estabilizaron específicamente los intermediarios desadenilados generados del recambio de los ARN substrato que contienen un elemento rico en AU. De esta manera, las proteínas ELAV de mamíferos juegan un papel importante en la regulación de la estabilidad de ARNm, influenciando el acceso de enzimas degradadoras a los substratos de ARN. La estabilidad relativa de ARNm es un regulador importante de la expresión genética. La vida media de un ARNm específico puede ser importante en la determinación de un nivel estable de expresión, así como en la velocidad a la cual se induce su producto genético (revisado en Ross, 1995; Caponigro y Parker, 1996). Adicionalmente, las mutaciones que afectan la estabilidad de los ARNm que codifican factores de regulación pueden promover la transformación oncogénica y la desregulación inmupológica (Aghub et al., 1990; Schiavi et al., 1992). En general, muchas proteínas de vida corta, incluyendo las derivadas de citocina y proto-oncogenes están codificadas por ARNm de vida corta. También se ha demostrado que diversos ARNm que codifican proteínas estables, como a-globina, tienen vidas medias extraordinariamente largas (Holcik y Liebhaber, 1997). Además, se han descrito los mecanismos de supervivencia que identifican y reducen la vida media de los ARNm aberrantes que contienen mutaciones en codones sin sentido (Maquat, 1995; Jacobson y Peltz, 1996). Por lo tanto, la regulación de la vida media de los ARNm puede tener consecuencias importantes en las respuestas celulares y resultados funcionales durante el crecimiento y desarrollo. A través de la aplicación de la genética, los mecanismos y factores involucrados en el recambio de ARNm en Saccharomyces cerevisiae comienzan a identificarse. Diversas rutas de recambio de ARNm están presentes en la levadura, permitiendo diversos niveles de regulación y ajustes finos en la expresión genética. Una trayectoria general de la descomposición de los ARNm involucra el acortamiento de cola poli(A) seguido por la remoción de las tapas y la descomposición exonucleolítica de 5' a 3' (Muhlrad et al., 1994). Una segunda trayectoria general involucra la desadenilación seguida por el recambio de 3' a 5' del cuerpo de ARNm (Anderson y Parker, 1998). El corte endonucleolítico de algunos ARNm también se ha demostrado (Presutti et al., 1995). Finalmente, otra trayectoria alternativa de descomposición que desvía la desadenilación está involucrada en la degradación dependiente de la traducción de los ARNm que contienen codones sin sentido (Weng et al., 1997). Se han identificado diversas enzimas de degradación y proteínas de regulación que figuran en la estabilidad de ARNm en la levadura (Caponigro y Parker, 1996; Weng et al., 1997). También se ha descrito interacciones funcionalmente importantes entre la estructura de tapa y la cola poli(A) del extremo 3' de los ARNm de la levadura (Tarun y Sachs, 1997). Sin embargo, está por establecerse si estas observaciones son aplicables en general a las células de mamíferos. Las observaciones in vivo comienzan a permitir algunas generalizaciones con respecto a las trayectorias principales en el recambio de ARNm en células de mamíferos. Una cola poli(A) de aproximadamente 200 bases se añade a la mayoría de los ARNm durante el procesamiento en el núcleo (Colgan y Manley, 1997). La cola poli(A) sirve por lo menos a dos funciones conocidas en la estabilidad de ARNm. En primer lugar, junto con ias proteínas de unión de poli(A) (Bernstein et al., 1989; Ford et al., 1997), protege el ARNm de exonucleasas de 3' a 5'. En segundo lugar, la cola poli(A) sirve como un sitio de iniciación para el recambio de ARNm. La cola poli(A) puede acortarse progresivamente durante el tiempo de vida de un ARNm en el citoplasma. Controlar el régimen de desadenilación aparentemente es un importante punto de regulación en la estabilidad de ARNm (Wilson y Treisman, 1988: Xu et al., 1997). Una vez que la cola poli(A) se ha acortado de aproximadamente 30 a 65 bases, el cuerpo de ARNm parece degradarse manera rápida in vivo sin la acumulación de intermediarios discernibles (Chen et al., 1995; Xu et al., 1997). Sin embargo, poco se sabe con respecto a las enzimas y los componentes de regulación involucrados en el recambio de ARNm de mamíferos. Además de la cola poli(A), diversos elementos de acción cis- han demostrado que son importantes en la estabilidad de ARNm. La estructura de tapa terminal del extremo 5' protege el transcrito de exonucleasas (Furuichi et al., 1977). También se han identificado diversos elementos desestabilizadores (Caput et al., 1986; Shyu et al., 1989; Bonnieu et al., 1990; Peng et al., 1996), así como elementos estabilizadores (Stefonovic et al., 1997), ubicados en el cuerpo de ARNm. Un elemento bien caracterizado que regula la estabilidad de ARNm es una secuencia rica en AU (ARE) que se encuentra en la región sin traducción del extremo 3' de muchos ARNm de vida corta (Shaw y Kamen., 1986). Estas ARE consisten principalmente en repeticiones de AUUUA o una secuencia nonamérica relacionada (Lagnado et al., 1994; Zubiaga et al., 1995; Xu et al., 1997) y se han dividido en tres clases con base en las características de secuencia y cinética de degradación (Xu et al., 1997). En general, se ha demostrado que las ARE incrementan el régimen de desadenilación y recambio de ARN de manera independiente a la traducción (Chen et al., 1995; Fan et al., 1997). Sin embargo, aún no se ha determinado el mecanismo subyacente tras la función de ARE. Se han descrito diversas proteínas que pueden unirse in vitro a elementos ricos en AU (por ejemplo Malter, 1989; Vakalopoulou et al., 1991 ; Bohjanen et al., 1991 ; Brewer et al., 1991 ; Levine et al., 1993; Hamilton et al., 1993; Katz et al., 1994; Nakaga a et al., 1995; Ma et al., 1996), no obstante aún no se definido la función exacta de cada factor en el procedimiento del recambio de ARNm. La familia ELAV de las proteínas de unión a ARE se conserva de manera evolutiva y se expresa diferencialmente en tejidos a lo largo de todo el desarrollo de los vertebrados (revisado en Antic y Keepe, 1997). Aunque se han descubierto proteínas ELAV tanto en el citoplasma como en el núcleo (Gao y Keene, 1996), la forma expresada más ubicuamente, HuR, puede moverse entre el núcleo y el citoplasma (Fan y Steitz, 1998; Peng et al., 1998; Atasoy et al., 1998). Las proteínas ELAV juegan un papel importante en el crecimiento y desarrollo, así como el homólogo de Drosophila es genéticamente esencial para el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso (Campos et al., 1985; Robinov y White, 1988). Además, las proteínas ELAV de mamíferos se inducen durante la diferenciación y se distribuyen en granulos RNP a lo largo de dendritas (Gao y Keene, 1996). Diversas líneas de evidencia sugieren que las proteínas ELAV controlan aspectos de la expresión genética posterior a la transcripción (Gao y Keene, 1996; Koushika et al., 1996; Myer et al., 1997: Ma et al., 1997; Antic y Keene, 1998). Se ha demostrado que la sobreexpresión de los miembros de la familia ELAV, por ejemplo, afecta la acumulación de ARNm seleccionados (Jain et al., 1997; Levy et al., 1998; Fan y Steitz, 1998; Peng et al., 1998). Sin embargo, aún no se ha establecido el papel preciso de las proteínas ELAV y otros factores de unión a ARE.

Las preguntas mecanicistas en células de mamíferos usualmente se abordan de mejor manera usando sistemas bioquímicos debido a las dificultades inherentes a las células de mamíferos como sistema genético. Sin embargo, ha sido difícil establecer un sistema in vitro versátil para estudiar la estabilidad y el recambio de ARNm. Con base en observaciones in vivo y consideraciones prácticas, un sistema in vitro óptimo para estudiar el procedimiento de la estabilidad de ARNm debe tener las siguientes propiedades: Primero, el sistema debe ser eficiente y de alta capacidad de reproductibilidad. En segundo lugar, cantidades mínimas (preferiblemente no detectables) de la degradación de ARN en el sistema deben ser ocasionadas por la degradación aleatoria por ribonucleasas contaminantes no específicas. En tercer lugar, la desadenilación debería ocurrir antes de que se observe la degradación general del cuerpo de ARNm. En cuarto lugar, la degradación del cuerpo de ARNm debería ocurrir de manera altamente progresiva en apariencia sin intermediarios detectables. En quinto lugar, la regulación del régimen de desadenilación y degradación general debería observarse de manera específica por secuencia. Finalmente, el sistema debería trabajar en ARN exógenos para permitir una mayor facilidad de la manipulación experimental. En la presente invención se informa el descubrimiento de un sistema in vitro de estabilidad de ARNm nuevo y útil que usa extractos citoplásmicos S100 que cumplen con todos los criterios mencionados en párrafos anteriores y que posee todas las propiedades conocidas que se involucran en el recambio de ARNm mediado por ARE. Este sistema se ha usado satisfactoriamente para demostrar la importancia de las proteínas de unión al elemento rico en AU de la familia ELAV en la estabilidad de ARNm. Estos descubrimientos indican que las proteínas ELAV pueden afectar una trayectoria implícita de la degradación mediada por ARE ya sea protegiendo el ARNm del ataque de nucleasa o por el desplazamiento de factores que de otra manera marcan estos transcritos de vida corta para la degradación. Este sistema in vitro permite la identificación de factores celulares involucrados en el recambio de ARNm y ayuda a dilucidar mecanismos involucrados en la regulación posterior a transcripción de la expresión genética. Además, el sistema in vitro de la invención tiene aplicaciones listas en pruebas de alto rendimiento total para examinar cuidadosamente genotecas de compuestos para dilucidar qué compuestos pueden tener aplicaciones como agentes farmacéuticos que puedan modular la estabilidad y recambio de los transcritos de ARN in vivo, y de esta manera usarse para tratar una amplia variedad de enfermedades o trastornos. i. Desarrollo de un sistema in vitro que desadenila y degrada substratos de ARN. El desarrollo de un sistema in vitro para estudiar el recambio de ARNm requiere la generación de una fuente conveniente de substrato de ARN de poli(A)+ y un extracto celular activo. Para obtener ARN substrato que se sometieron a poliadenilación y se identificaron fácilmente usando tecnología de gel de acrilamida estándar, se usó un enfoque novedoso y versátil de ligamiento-PCR que puede unirse a una plantilla que codifica una cola poli(A) de 60 bases en ei extremo 3' de fragmentos de ADN que contienen un sitio Hind lll, y se describen más adelante. En estudios iniciales para desarrollar un sistema in vitro de estabilidad de ARN, una cola poli(A) de 60 bases se unió a una secuencia derivada de un polienlazador de 54 bases (Gem-A60). El tamaño pequeño de este transcrito poliadenilado facilitó analizar intermediarios en la trayectoria del recambio de ARN en geles de acrilamida. Se prepararon extractos celulares siguiendo un protocolo citoplásmico S100 estándar (Dignam et al., 1983) usando células Hela de cultivo en agitación lisadas hipotónicamente con variaciones menores según se describe en la sección de Materiales y métodos. Se incubó ARN Gem-A60 en extractos S100 en presencia de ATP. Como se observa en la figura 1A (panel izquierdo), se observó un recambio muy pequeño del ARN Gem-A60 después de 60 minutos de incubación. Esta régimen bajo reproducible condujo a elaborar la hipótesis de que un inhibidor de los procesos de desadenilación/degradación puede estar presente en extractos S100. Esta hipótesis se basó en diversas observaciones. Primero, el trabajo previo con extractos nucleares determinó que las proteínas de unión a poli(A) fueron inhibidores fuertes de la actividad de exonucleasa de 3' a 5' (Ford et al., 1997). En segundo lugar, la actividad de una preparación de desadelinasa de mamífero purificada parcialmente se inhibió mediante cantidades mayores de PABP (Korner y Wahle, 1997). En tercer lugar, la sobreexpresión de PABP en oocitos de Xenopus inhibe la desadenilación específica por maduración (Wormington et al., 1996). Para evaluar si las cantidades en exceso de las proteínas de unión a poli(A) eran las responsables de la inhibición de desadenilación de ARN Gem-A60 en extractos S100, se añadieron cantidades cada vez mayores de ARN competidor por poli(A) frío a las mezclas de reacción para secuestrar proteínas de unión a poli(A). Como se muestra en la figura 1A (lado derecho), la adición del competidor por poli(A) inició una actividad de degradación en los extractos S100. El ARN Gem-A60 se acortó a especies ligeramente mayores que el tamaño de un marcador desadenilado (Gem-AO) y se degradó aproximadamente 30% del ARN de entrada. Los experimentos de titulación realizados en coordinación con los estudios de entrelazamiento de UV demostraron que la cantidad de ARN competidor por poli(A) requerido para activar el extracto S100 correspondió precisamente con la capacidad del competidor para inhibir la unión de proteínas a la cola poli(A) del ARN substrato (no se muestran los datos). Adicionalmente, las actividades nucleolíticas activadas por la adición de ARN poli(A) frío como competidor a los extractos S100 aún pudieron observarse en concentraciones d ^poü^A) >500 ng. Estos datos sugirieron que la(s) nucleasa(s) activada(s) son altamente refractarias a la competencia por poli(A). El acortamiento progresivo del substrato de ARN Gem-A60 observado a la incubación en el extracto S100 complementado con ARN competidor por poli(A) se determinó que se debe a una exonucieasa específica de cola poli(A) de 3' a 5' con base en las siguientes observaciones: primero, los substratos de ARN marcados 32P exclusivamente en sus estructuras de tapa 5' se acortaron progresivamente en el sistema de manera similar como los transcritos marcados de manera uniforme (comparar figura 1A y 1 B). Estos datos sugieren que el acortamiento del ARN de entrada ocurrió en una dirección de 3' a 5'. Esta conclusión se confirmó analizando por separado de las porciones de 5' y 3' de los productos de ARN desde el sistema in vitro mediante la digestión de RNAse H antes de la electroforesis en gel. Como se muestra en la figura 1 C, la porción 3' del substrato de ARN (que consiste principalmente en la cola poli(A)) de 60 bases se degradó claramente antes de detectar cualquier recambio de la porción 5' del transcrito. Después de 9 minutos de incubación, 72% del fragmento 3' que contenía la cola poli(A) se degradó, aunque únicamente el 19% del fragmento 5' sufrió un recambio. Finalmente, para indagar si esta actividad exonucleasa de 3' a 5' fue una desadenilasa específica de poli(A), se añadieron 15 bases de una secuencia no adenilada en el extremo 3' de ARN Gem-A60 (Gem-A60-15). Como se observa en la figura 1 D, mientras el transcrito de Gem-A60 (que contiene una cola poli(A) de 3') es un substrato excelente para la actividad de exonucleasa de 3', el ARN Gem-A60-15, que tiene el tracto poli(A) incorporado con 15 bases no lo es. A partir de estos datos se ha concluido que la adición de ARN competidor por poli(A) a un extracto S100 activa una desadenilasa que es activa en ARN de substrato poli(A)+. El sistema in vitro reproduce diversos aspectos de la estabilidad de ARNm observada in vivo. La observación sorprendente de que la desadenilasa por si misma no se inhibe aparentemente mediante poli(A) frío sugiere que la enzima nativa pudiere no tener una alta afinidad por su substrato. La actividad de desadenilasa puede contener actividades de unión a ARN adicionales que la sujetan a los ARNm, tal vez como parte de un complejo de componentes múltiples. ii. El Recambio de ARN en el sistema in vitro es regulado por elementos de estabilidad ricos en AU Se determinó si las actividades de recambio de ARN exhibidas por el sistema de extracto S100 podria estar influido o modulado por secuencias en el cuerpo del transcrito de manera específica. Se determinó en el sistema de estabilidad in vitro la estabilidad relativa de ARN poliadenilados pequeños que contienen ya sea una secuencia de polienlazador de 54 bases (Gem-A60), un elemento rico en AU de 34 bases (ARE) de ARNm de FNT-a (ARE-A60) o un ARE de 72 bases de ARNm de c-fos (Fos-A60). Como se muestra en las figuras 2A y 2B, el recambio de ambos ARN que contienen ARE incrementó en gran medida en comparación con el transcrito de control Gem-A60. Para evaluar directamente si la regulación mediante ARE se presentó de manera específica por secuencia, FNT-a-ARE se sometió a mutación de manera extensa como se describe en la sección de Materiales y métodos. Se demostró previamente que mutaciones similares en elementos de estabilidad ricas en AU incrementan en gran medida la vida media de los ARNm in vivo (Myer et al, 1997). Como se observa en las figuras 2C, las mutaciones en ARE redujeron el régimen y extensión de desadenilación/degradación más de 3 veces en el sistema in vitro. De esta manera, el recambio de ARN en el sistema in vitro puede regularse o modularse mediante elementos de estabilidad ricos AU de manera específica de secuencia. Todos los substratos de ARN que se han examinado anteriormente contienen un cuerpo de aproximadamente 50 a 70 bases unidas a una cola poli(A). Entonces se determinó que el recambio regulado usando substratos de ARN poliadenilado mayores podrían detectarse en el sistema de la invención. Como se muestra en la figura 2D, un ARN de 250 bases poliadenilado derivado de UTR del extremo 3' del ARNm último SV40 (SV-A60) se desadeniló pero se degradó de manera insuficiente en el sistema in vitro. Al añadir FNT-a ARNm a la porción 3' de ARN (SVARE-A60) se obtuvo como resultado un incremento de aproximadamente 3.5 veces en el régimen de recambio. Finalmente, una versión de longitud casi completa (-950 bases) de ARNm GM-CSF humano se preparó, así como una en donde se eliminó ARE (GM-CSF(-ARE)). Los extremos 3' de estos transcritos se poliadenilaron usando polimerasa poli(A) de levadura (Martin y Keller, 1998). Los ARN purificados en gel se incubaron en el sistema de estabilidad in vitro y se eliminaron alícuotas en los tiempos indicadas. Como se observa en la figura 2E, la versión ARNm GM-CSF que contiene un ARE fue de aproximadamente 2.5 veces menos estable que GM-CSF(-ARE) en el sistema in vitro. Como se observó anteriormente con otros transcritos, los transcritos GM-CSF también se desadenilaron en el sistema. La desadenilación no pudo observarse en la figura 2E debido a la falta de resolución del sistema de gel empleado, pero puede observarse usando geles de formaldehído-agarosa (no se muestran los datos). iii. La degradación requiere ATP, no así la desadenilación. Se observó que los transcritos con 60 adenilados en el extremo 3' pasan por la desadenilación, así como por el recambio en el sistema in vitro. Esto es consistente con las observaciones in vivo que sugieren que la cola poli(A) se acorta aproximadamente 30-65 bases antes de que se observe el recambio de ARNm (Xu et al, 1997). Debido a que la degradación aparentemente comenzó antes de que el transcrito de entrada se desadenilara por completo (por ejemplo figura 2), fue difícil evaluar cuantitativamente los efectos de los elementos ricos en AU en los regímenes de desadenilación relativos. Para intentar desacoplar estos procesos y evaluar adecuadamente el efecto de ARE en los regímenes de desadenilación en el sistema in vitro, se estudió los requerimientos de cofactor que pudieran ser únicos para la desadenilación o para el recambio. Ambos procesos se inhibieron mediante la adición de EDTA (no se muestran los datos), sugiriendo que participan los cationes divalentes. Curiosamente, la desadenilación se pudo haber presentado sin la adición de ATP/fosfocreatina al sistema (figura 3A). Por otro lado, degradación requirió ATP/fosfocreatina como se indica por la acumulación de intermediarios desadenilados en esta ausencia (figura 3A, en columnas -ATP). Por lo tanto, al omitir ATP de la reacción se pudo evaluar los regímenes de desadenilación relativos en presencia o ausencia de un elemento de estabilidad rico en AU. Los ARN con longitud fisiológica de colas poli(A) (150 a 200 bases) que carecían de (SV-A 150-200) o contenían (SVARE-A 150-200) ARE se incubaron en el sistema in vitro y se analizaron alícuotas en los tiempos indicados. Como se observa en la figura 3B, los substratos de ARN que contienen ARE se desadenilaron a una velocidad aproximadamente dos veces más rápida que los ARN que no contienen el elemento de inestabilidad. En resumen, se descubrió un sistema in vitro de estabilidad de ARNm que actúa sobre substratos exógenos y reproduce fielmente todos los aspectos conocidos in vivo del recambio. Los ARN primero se desadenilaron antes de la degradación del cuerpo del transcrito. La degradación del cuerpo de ARNm entonces se presentó altamente progresiva de manera aparente sin intermediarios discernibles. Los regímenes de desadenilación y descomposición incrementaron varias veces por la inclusión de un elemento de estabilidad rico en AU. La regulación por ARE de la estabilidad de ARN es específica por secuencia y muy reproducible, ya que se ha probado que los tres ARE funcionan de manera similar en el sistema in vitro. Este sistema debe proveer un medio para dilucidar aspectos mecanísticos de las trayectorias de recambio de ARNm regulado y general. iv. El papel de las proteínas de unión ARE en el sistema in vitro El sistema in vitro descrito en la presente permite la evaluación del papel de las proteínas de unión a ARE en el procedimiento de desadenilación/degradación de ARN. Se descubrió que diversas proteínas están asociadas con ARN que contienen ARE en los extractos de la presente. Como se observa en la figura 4A, una proteína de -30 kDa y un grupo de proteínas de -40 kDa se entrelazaron específicamente con UV al transcrito ARE-A60 corto. Una especie de aproximadamente 70 kDa también se detectó cuando este ARE se insertó en un transcrito mayor (SVARE-A60; véase la figura 5B). Es posible que esta proteína de 70 kDa no se detectó en el ARN de ARE-A60 debido al tamaño relativamente pequeño del transcrito. Esfuerzos para determinar la identidad de estas especies entrelazadas usando anticuerpos disponibles a proteínas de unión ARE conocidas revelaron la presencia de una proteína ELAV. Como se muestra en la figura 4B, las pruebas de inmunoprecipitación identificaron la proteína de 30 kDa como HuR (conocida como HuA), un miembro de la familia de proteínas ELAV que se expresa ubicuamente en todos los tejidos (Good, 1995; Ma et al, 1996; Myer et al, 1997). Antisuero contra otra proteína de unión a ARN de aproximadamente 30 kDa, hnRNP A1 , no detectó ninguna proteína entrelazada en el sistema de la presente invención(figura 4B). Dos antisueros adicionales se probaron para identificar la banda de 40 kDa. Los anticuerpos de proteína hnRNP C no detectaron ninguna proteína entrelazada, aunque el antisuero de AUF-1 (conocida como hnRNP D) (Brewer, 1991) precipitó una pequeña cantidad de proteína de 40 kDa entrelazada (no se muestran los datos). Sin embargo, este producto entrelazado no compitió por cantidades de incremento de un ARN competidor por ARE sintético de 34 bases (no se muestran los datos). La importancia de este nivel bajo de entrelazamiento de AUF-1 no específico en el sistema no es claro. Se concluyó que la especie de 30 kDa que específicamente entrelaza al elemento de ARE es HuR, una proteína que ha sugerido anteriormente que juega un papel en la descomposición de ARNm mediada por ARE (Vakalolopou et al., 1991 ; Antic and Keene, 1997; Myer et al., 1997). Después, se determinó si la interacción de las proteínas de unión a ARE entrelazadas con los elementos se requirió para mediar la inestabilidad. Se usaron ribonucleótidos sintéticos que contienen FNT-a-ARE de 34 bases o elegidos al azar, de secuencias no ARE. Los ARN competidor sintéticos se añadieron en cantidades cada vez mayores al sistema de estabilidad in vitro y se evalúo su efecto en el recambio de ARN. Como se observa en la figura 5A, el ARN competidor por ARE inhibió por completo la desadenilación y degradación en 40 pm, aunque el ARN no específico no presentó efecto en concentraciones similares. El ARN competidor por ARE presentó un efecto similar en la desadenilación/degradación de ARN ya sea que contuviera o no un ARE. De esta manera, los factores que pueden interactuar con ARE son importantes para la desadenilación, y pueden ser una parte de un complejo de desadenilasa/degradación de proteínas múltiples.

La capacidad del ARN competidor por ARE de bloquear la desadenilación se comparó con la capacidad de ARN de competir por la interacción de proteínas de unión a ARE con el transcrito del substrato. Se añadió EDTA a las pruebas de entrelazamiento para inhibir el recambio de ARN y evaluar el efecto de diversos niveles de competidores en la eficiencia de entrelazamiento/transferencia de marca. Como se muestra en la figura 5B, todas las proteínas de unión a ARE (incluyendo la proteína HuR que podría inmunoprecipitarse usando antisuero específico antes de la electroforesis en gel como se muestra en el panel C) compitieron específicamente desde los substratos de ARN SV-ARE-A60 a la adición de 5 pm del ARN competidor sintético. Sin embargo, como se muestra en la figura 5A, 5 pm del ARN competidor por ARE sintético no presentó efecto perceptible en el régimen de desadenilacíón/degradación de ARN en el sistema. Por lo tanto, ninguna de las proteínas de unión a ARE que pudieran detectarse mediante entrelazamiento parece ser requerida para la desadenilación/degradación en el sistema in vitro. v. Las proteínas ELAV evitan la degradación en los transcritos desadenilados en el sistema in vitro Debido a que las proteínas de unión a ARE que se detectaron mediante entrelazamiento aparentemente no se requieren para la desadenilación/degradación, pueden desarrollar un papel en la estabilidad del transcrito. Consistente con este modelo, los datos in vivo sugieren que la sobreexpresión de las proteínas Hel-N1 y HuR pueden estabilizar transcritos que contienen ARE ((Jain et al., 1997; Fan y Steitz. 1998; Peng et al., 1998). Una proteína HuR recombinante de ratón, así como otros miembros de la familia ELAV (Hel-N1 y Hel-N2[a.k.a. HuB]) se produjeron como proteínas de fusión a GST y se añadieron al sistema de estabilidad in vitro en una relación molar 10:1 al substrato de ARN. Datos similares se obtuvieron usando cualquiera de las tres proteínas recombinantes de la familia ELAV, pero sólo se muestran datos con rHel-N1 . Como se observa en la figura 6A la proteína rHel-N1 no afectó la desadenilación del substrato de ARN de SVARE-A60 en el sistema in vitro, pero estabilizó un intermediario desadenilado. GST solo, u otra proteína de fusión a GST que une ARN (hnRNP H') no presentó efectos en la estabilidad del transcrito en el sistema in vitro (figura 6B). Como resultado, se concluyó que la familia ELAV de las proteínas de unión a ARN funcionan para proteger los transcritos desadenilados de las enzimas de degradación. Después, se evalúo si el substrato de ARN debe contener un ARE para que las proteínas rELAV estabilicen un intermediario desadenilado en el sistema in vitro. ARN ARE-A60 o un transcrito no relacionado pero de un tamaño similar y poliadenilado, CX-A60, se incubó en el sistema in vitro en presencia o ausencia de proteínas rELAV. Como se observa en la figura 6C, rHeINI (u otras proteínas rELAV [no se muestran los datos]) estabilizó el intermediario desadenilado únicamente a partir de ARN que contenían un sitio de unión a ARE. De esta manera, la estabilización de los intermediarios desadenilados mediante proteínas ELAV requiere un ARE. Adicionalmente, las proteínas ELAV pueden estabilizar un intermediario desadenilado, ya sea que ARE esté ubicado en las posiciones 3', 5' o central del ARN SVARE-A de 250 bases. Estos datos indican que el complejo de proteínas ARE-ELAV probablemente no evita simplemente el recambio a través del bloqueo estérico de un extremo del transcrito, de esta manera evitando el acceso de exonucleasa. En la presente se establece un sistema in vitro de estabilidad de ARN novedoso y útil que reproduce fielmente diversos aspectos conocidos del recambio de ARNm in vivo en células de mamíferos. Los substratos de ARN exógenos se desadenilan antes de que la degradación del cuerpo de ARN se presente altamente progresiva de manera aparente sin intermediarios discernibles. Adicionalmente, los regímenes de desadenilación y degradación de ARN están regulados mediante elementos ricos en AU en el sistema en una manera específica de secuencia. El sistema de la invención se ha usado satisfactoriamente para determinar el papel de la familia ELAV de las proteínas de unión a ARE en la estabilidad de transcritos desadenilados mediante bloqueo específico del paso de degradación. Estos datos ilustran el valor del sistema para dirigirse al mecanismo del recambio de ARNm regulado. El sistema in vitro descrito en este informe tiene diversas ventajas técnicas claves que incrementan de manera importante su utilidad. Primero, el sistema puede reproducirse ampliamente y utiliza extractos citoplásmicos S100 estándares de células de Hela giratorias. De hecho, se sometieron a pruebas nueve preparaciones independientes del extracto S100, y todas funcionaron de manera similar. La única diferencia entre los extractos aparentemente es la cinética del recambio (por ejemplo, hacer comparación de las ligeras diferencias en el patrón de recambio de ARN Gem-A60 en la figura 1A con el patrón que se observa en la figura 1 D). En segundo lugar, los extractos exhiben degradación del ruido de fondo mínimo de ARN debido a nucleasas no específicas. Esta falta de ruido en el sistema contribuye de manera importante a su capacidad de ser reproducido. Otro elemento clave del sistema es que usan ARN poliadenilados exógenos como substratos. Esta propiedad presenta una variedad en la preparación del substrato de ARN y una manipulación de secuencia. En cuarto lugar, el sistema exhibe una regulación específica por secuencia mediante elementos ricos en AU en ausencia de traducción. En total, estas ventajas técnicas hacen del sistema un reactivo importante para identificar componentes involucrados en el recambio de ARNm y se dirige al mecanismo de la estabilidad de ARNm regulada. La adición de ARN competidor por poli(A) se requirió para activar los extractos S100 para desadenilar y degradar de manera eficiente los ARN de manera regulada. La titulación de poli(A) frío demostró que los extractos se activaron para la desadenilación/degradación cuando se añadió cantidad suficiente de competidor para reducir sustancialmente el entrelazamiento de la proteína de unión a poli(A) de 70 kDa a la cola poli(A) del substrato de ARN radiomarcado (no se muestran los datos).

De manera sorprendente, la desadenilación en los extractos permanece activa incluso en presencia de >500 ng de poli(A). Por lo tanto, aparentemente las preparaciones de poii(A) comerciales preparadas con fosforilasa de polinucleótido no son capaces de interactuar con y secuestrar la enzima desadenilasa. Estos datos sugieren que la actividad de desadenilasa se encuentra en concentraciones extraordinarias en los extractos o puede no presentar una afinidad fuerte por este substrato. Además de esto, se ha observado que un incremento en el régimen de desadenilación de ARN que contienen ARE (figuras 2 y 3), así como la capacidad de ARN competidor por ARE para inhibir la desadenilación de substratos que no contienen ARE. Estos datos sugieren que las proteínas de unión a ARE pueden estar asociadas con la actividad de desadenilasa. Además, la proteína HuR, un miembro expresado ubicuamente de la familia de ELAV de proteínas que se unen a ARN (Good, 1995: Ma et al., 1996; Myer et al., 1997; Antic y Keene, 1997), se ha identificado como uno de los factores de unión a ARE principales en el sistema de la invención. También, el sistema de la invención se ha usado con éxito para detectar unión débil a AUF-1 (hnRNP D), una proteína que anteriormente se especulaba que estaba implicada en la descomposición de ARNm regulado in vitro (DeMaria y Brewer, 1996). Por lo tanto, AUF-1 no parece jugar un papel significativo en la inestabilidad de transcritos en este sistema. Las proteínas ELAV no se requieren para desadenilación/degradación, sino más bien juegan un papel en la estabilidad de los ARN desadenilados que contienen un ARE (Fig. 6). Estos datos sugieren que además de su efecto sobre las velocidades de desadenilación (Chen et al., 1995: Xu et al., 1997), el ARE tiene influencia sobre la eficiencia de recambio del cuerpo del ARNm. Observaciones in vivo (Chen et al., 1995; Xu et ai., 1997: Peng et al., 1998) también soportan la conclusión de que ARE tiene influencia sobre las velocidades de degradación de ARNm. Por consiguiente, las proteínas ELAV, parecen regular la estabilidad de ARNm in vitro, una observación consistente con estudios de transfección in vivo. La familia de ELAV comprende cuatro miembros, tres de los cuales se expresan en una manera específica de tejido o específica de desarrollo (revisado en Antic y Keene, 1997). Las proteínas ELAV específicas de tejido también se localizan principalmente en el citoplasma, mientras que la proteína HuR ubicua es predominantemente nuclear y se puede redistribuir al citoplasma (Atasoy et al., 1998; Peng et al., 1998; Fan y Steitz, 1998). Se ha sugerido que las proteínas ELAV expresadas de manera diferencial juegan un papel en la regulación de la estabilidad de ARN tanto nuclear como citoplásmico, ajustando así la expresión de genes en estados de desarrollo específicos (Gao y Keene, 1996: Antic y Keene, 1998). Los datos de competencia mostrados en la figura 5 demuestran claramente que factores asociados con el ARE se requieren para desadenilación/degradación de los ARN de substrato. Con base en la cinética de la competencia, estos factores deben ser mucho más abundantes que las proteínas que se unen a ARE entrelazables como HuR, o interactuar con el ARE con una afinidad mucho más baja. Se favorece el segundo modelo, y se sugiere que estos factores sean parte de un complejo de componentes múltiples que incluya las enzimas desadenilasa y de degradación. Mediante interacciones de cooperación múltiples, estos componentes que se unen a ARE débiles pueden permitir un ensamble eficiente del complejo de desadenilasa/degradación en transcritos que contienen ARE mientras se deja aún que el complejo se ensamble, aunque de manera menos efectiva, en los ARN que no contienen ARE. Los componentes que se unen a ARN de este complejo propuesto pueden tener también afinidad con otros elementos de inestabilidad que no son de ARE (por ejemplo, Peng et al, 1996). La observación de que la proteína HuR endógena en extractos de S100 aquí expuesta se puede entrelazar con substratos de ARN que contienen ARE (Fig. 5) hace sorprendente que un ARE pueda funcionar como un elemento desestabilizante en la prueba in vitro. Sin embargo, debido a que la proteína HuR es predominantemente nuclear, es probable que solamente niveles bajos de la proteína estén presentes en estos extractos citoplásmicos. Este nivel bajo de proteína HuR probablemente es incapaz de competir de manera eficiente con factores desestabilizantes para unirse al ARE. De hecho, el secuestro de la proteína HuR mediante la adición de niveles bajos de ARN competidor de ARE sintético lleva a una velocidad incrementada de recambio de los ARN que contienen ARE en el sistema in vitro. Como se muestra en la figura 5A, la cantidad de ARN de SVARE-A60 que queda después de 30 minutos en el sistema en ausencia de ARN competidor (canal 0) es aproximadamente 20% mayor que cuando la prueba se realiza en presencia 5 pm de ARN competidor de ARE (canal 5 pm). La remoción o secuestro de proteína HuR en extractos de S100, por lo tanto, puede ser necesaria a fin de observar desadenilación y degradación reguladas en algunos casos.

Materiales y métodos Plantillas de transcripción y los ARN Se produjeron los ARN mediante transcripción in vitro utilizando SP6 polimerasa (Melton et al., 1984) en presencia de análogo de tapa de 7mGpppG y UTP o ATP radiomarcado. Todos los transcritos se purificaron con gel antes de usarse. Para los ARN marcados exclusivamente en la tapa 5', las reacciones de transcripción se realizaron en ausencia del análogo de tapa y nucleótidos radioactivos. Después se realizó el bloqueo utilizando guaniltransferasa (BRL) y GTP radiomarcado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La secuencia de ARN cortos usados como substratos en el sistema in vitro se muestra en el cuadro 1 . Las plantillas de transcripción se derivaron de la manera siguiente (favor de observar que todos los oligonucleótidos sintéticos usados como plantillas de transcripción mostrados más adelante contienen un fragmento de promotor de SP6 de 24 bases en sus extremos 5'): se produjo ARN de Gem-AO a partir de pGem4 cortado por Hind lll (Promega). Se produjo ARN de Gem-A60-15 producido a partir de producto de PCR usado para producir ARN de Gem-A60 (ver más adelante) sin eliminar el sitio de unión de iniciador con Ssp 1 . Las plantillas para ARN de ARE-AO se generaron hibridando el oligonucleótido sintético 5'- ATTTAGGTGACACTATAGAATACACATTATTTA TTATTTATTTATTATTTATTTATTTA-3' (SEQ ID NO:1 ) y su complemento apropiado. Las plantillas para ARN de MT-ARE-AO se generaron hibridando el oligonucleótido sintético 5*-ATTTAGGTGACACTATAGAATACACGTTAGTATT CATTTGTTTACTATTGATTTCTTTA-3' (SEQ ID NO:2) y su complemento apropiado. Las plantillas para ARN de Fos-AO se generaron hibridando el oligonucleótido sintético 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACACAAATTTTAT TGTG I I I l I AATTTATTTATTAAGATGGATTCTC-3" (SEQ ID NO:3) y su complemento apropiado. La plantilla para ARN de SV-AO fue pSVL-Gem cortado por Hind lll (Wilusz et al., 1998). Las plantillas para ARN de SVARE-AO se generaron insertando el FNT-a ARE que contiene el oligonucleótido 5'-ATTATTTATTATTTATTTATTATTTATTATTTA (SEQ ID NO:4) y su complemento apropiado entre los sitios Pstl y Hind lll de pSVL-Gem (localizados cerca del extremo 3' del ARN). El ARN de SVARE-AO se transcribió a partir de ADN en línea con Hind lll. La plantilla para ARN de GMCSF (+ARE) fue pGM-CSF cortado por EcoRI (Shaw y Kamen. 1986). La plantilla para ARN de GM-CSF (-ARE) fue pGM-CSF cortado de Ncol. Las plantillas para ARN de CX-AO se generaron hibridando el oligonucleótido sintético 5*-ATTTAGGTGACACTATAGAATACACCCCAACGGGCCCTCCCTC CCCTCCTTGCACCATCATCGCATCACG (SEQ ID NO: 5) y su complemento apropiado.

Los ARN sintéticos usados en estudios de competencia se elaboraron mediante los Medios de Núcleo Molecular NJMS y contenían las siguientes secuencias: ARE: 5'AUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUUAUUUA UUUA (SEQ ID NO: 6); competidor no específico: 5'-GUCACGUGUCACC (SEQ ID NO: 7).

Adición de colas poli(A) a los transcritos Una plantilla para una cola poli (A) de 60 bases se añadió a plantillas de ADN usando un protocolo de ligamiento/PCR descrito anteriormente (Ford et al., 1997). Brevemente, todas las plantillas antes descritas contienen un sitio Hind lll que se usa para generar el extremo 3' del ARN. El oligonucleótido sintético d'-AGCTAßoTATTGAGGTGCTCGAGGT (SEQ ID NO: 8) y su complemento apropiado se generaron, hibridaron y ligaron a plantillas de ADN cortado por Hind lll. Los productos de ligamiento se amplificaron usando un iniciador de promotor SP6 (5'-CATACGATTTAGGTGACACTATAG (SEQ ID NO: 9)) y un iniciador específico para el extremo 3' del oiigonucleótido ligado (5'-ACCTCGAGCACCTC (SEQ ID NO:10)). Los productos amplificados se purificaron en columnas de Centricon 100, se cortaron con Sspl, y se usaron como plantillas para los ARN generados por SP6 polimerasa que llevan la designación A60' Se usó Poli(A) polimerasa (Amersham) para añadir colas de poli(A) de 150-200 bases en los transcritos. Los ARN se incubaron con enzima, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, en hielo durante 5-8 min. Después de la reacción, los ARN fueron extraídos con fenol-cloroformo, se precipitaron con etanol, y se purificaron en geles de acrilamida al 5% que contienen urea 7M para obtener los ARN con la cantidad apropiada de poli(A) en el extremo 3'.

Producción de extractos de S 100 Se prepararon extractos citoplásmicos a partir de células de giro Hela de cultivo en agitación cultivadas en JMEM complementado con suero de caballo al 10% como se describe en Dignam et al (1983) con las siguientes dos modificaciones. En primer lugar, después de la centrifugación a 100,000 x g durante 1 hora, el sobrenadante fue ajustado a glicerol al 10 % antes de la diálisis. En segundo lugar, los tiempos de diálisis se redujeron a 30 min. Los extractos se almacenaron a -80°C.

Sistema de desadenilación/deqradación de ARN in vitro Típicamente, se usó aproximadamente 200,000 cpm (-50 fm) de ARN purificado con gel por cada reacción. En estudios comparativos, se utilizaron cantidades molares iguales de transcritos. Una mezcla de reacción de 14.25 µl típica contiene 3.25 µl de alcohol polivinílico al 10%, 1 µl de una mezcla de ATP 12.5 mM/fosfocreatina 250 mM, 1 µl de 500 ng/ul de poli(A) (Pharmacia), 1 µl de ARN y 8 µl de extracto dializado. Las reacciones se incubaron a 30°C durante los tiempos indicados y se terminaron mediante la adición de 400 µl de regulador de pH de terminación (NaCI 400 mM, Tris-Cl 25 mM, pH 7.6, SDS al 0.1 %). Las mezclas de reacción se extrajeron con fenol, se precipitaron con etanol, y se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contiene urea 7M. Toda la cuantificación se realizó utilizando un Formador de Imágenes con Pantalla de Fósforo para Dinámica Molecular. Las proteínas ELAV recombinantes (HuR, Hel-N1 y Hel-N2) se elaboraron como proteínas de fusión GST en E. coli y se purificaron utilizando cromatografía de afinidad de glutatión-sefarosa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Levine et al. 1993).

Digestión de ARNasa H ARN de ARE-A60, radiomarcado en los residuos A, se incubó en el sistema de estabilidad in vitro durante los tiempos indicados. Los productos de ARN se extrajeron con fenol y se concentraron mediante precipitación con etanol. La mezcla se volvió a suspender en un volumen final de 30 µl que contenía Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, NaCI 100 mM., MgCI2 10 mM, DTT 1 mM. 100 picomoles del oligonucleótído antisentido 5'-AGTTAAATAAAT (SEQ ID NO: 1 1 ), y 1 unidad de ARNasa H. Las reacciones se incubaron a 37°C durante 30 minutos, y los productos se analizaron en un gel de acrilamida al 5% que contiene urea 7 M.

Entrelazamiento UV e inmunoprecipitaciones Se realizaron experimentos de entrelazamiento UV/transferencia de marca como se describe anteriormente utilizando luz germicida Sylvania G15T8 (Wilusz y Shenk, 1988). Los experimentos de entrelazamiento se realizaron en presencia de EDTA 25 mM para inhibir el recambio de ARN para considerar comparaciones exactas entre las muestras. Después de la digestión con ARNasa A. T1 y T2, las proteínas entrelazadas se analizaron en geles de acrilamida al 10% que contienen SDS. Para análisis de inmunoprecipitación después de entrelazamiento UV y tratamiento con ARNasa, 300 µl de regulador de pH RIPA (NaCI 0.15 M, NP-40 al 1 %, desoxicolato al 0.5%, SDS al 0.1 % y Tris-Cl 50 mM, PH 7.6) fue añadido a las muestras. Después de una breve centrifugación en una microcentrífuga, las muestras limpiadas previamente se incubaron en hielo con anticuerpos durante 1 hora. Los complejos antígeno- anticuerpo se recogieron utilizando células de S. aureus positivas a proteína A lavadas, fijadas con formalina, se lavaron cinco veces utilizando solución reguladora de pH RIPA, y se analizaron en un gel de acrilamida al 10% que contiene SDS. Los anti-cuerpos específicos para GRSF (Quian ? Wilusz, 1994) y hnRNP A1 (Wilusz y Shenk, 1990) se han descrito anteriormente. La - preparación y caracterización de anticuerpos policlonales de conejo específicos para HuR se describirán en otra parte (Atasoy et al., 1998). Aghib, D.F., Bishop, J.M., Ottolenghi, S., Guerrasio, A., Serra, A., y Saglio, G. 1990. A 3' truncation of myc caused by chromosomal transiocation in a human T-cell leukemia increases mRNA stability. Oncogene 5: 707-711. Anderson. J.S.J., y Parker, R. 1998. The 3' to 5' degradation of yeast mRNAs is a general mechanism for mRNA turnover that requires the SK12 DEVH box protein and 3' a 5' exonuclease of the exosome complex. EMBO J. 17: 1497-1506. Antic, D., y Keene, J.D. 1997. Embryonic lethal abnormal visual RNA-binding proteins involved in growth, differentiation, and posttranscriptional gene expression. Am. J. Hum. Genet. 61 : 273-278. Antic, D., y Keene. J.D. 1998. Messenger ribonucleoprotein complexes containing human ELAV proteins: interactions with cytoskeleton and translational apparatus. J. Cell. Sci. 1 1 1 : 183-197. Atasoy, U., Watson. J., Patel, D., y Keene, J.D. 1998. Ubiquitously-expressed ELAV RNA binding protein. HuA, is upregulated during serum stimulation and T cell activation and undergoes nuclear/cytoplasmic shuttling. J. Cell Sci., In Press. Bernstein, P., Peltz, S.W., y Ross, J. 1989. The poly(A)-poly(A) binding protein complex is a major determinant of mRNA stability in vitro. Mol. Cell. Biol. 9:659-670. Bonnieu. A., Roux, P., Marty, L., Jeanteur, P., y Piechaczyk 1990. AUUUA motifs are dispensable for rapid degradation of the mouse c-myc mRNA. Oncogene 5: 1585-1588. Bohjanen, P.R., Bronislawa, P., June, C.H., Thompson. C.B., y ündsten, T. 1991. An inducible cytoplasmic factor (AU-B) binds selectively to AUUUA multimers in the 3' untranslated región of lymphokine mRNA. Mol. Cell. Biol. 1 1 : 3288-3295. Brewer, G. 1991 . An A+U rich element RNA-binding factor regulates c-myc mRNA stability in vitro. Mol. Cell. Biol. 1 1 : 2460-2466.

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Claims (55)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un sistema in vitro capaz de recapitular el recambio de ARN regulado de una secuencia de ARN objetivo preseleccionada añadida exógenamente que comprende un extracto celular y dicha secuencia de ARN objetivo.

2.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho recambio de ARN regulado se selecciona del grupo que consiste de un recambio de ARN regulado por un elemento rico en AU y recambio regulado por un elemento rico en O

3.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho extracto celular es aislado de células o tejidos ecuarióticos usados.

4.- El sistema de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho extracto celular se obtiene de una línea celular seleccionada del grupo que consiste de células HeLa y una línea de células T.

5.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho extracto celular se prepara a partir de células que comprenden ácido nucleico extraño.

6.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho extracto celular se prepara a partir de células que son infectadas, transfectadas de manera estable, o transfectadas de manera transitoria.

7.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho extracto celular es purificado parcialmente.

8.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho extracto celular tiene actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato.

9.- El sistema de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho extracto celular con actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato se prepara mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: (a) adición a dicho sistema de ARN competidor por poliadenilato; (b) secuestro de proteínas que se unen a poliadenilato; (c) adición de una proteinasa que inactiva una proteína que se une a poliadenilato; y (d) adición de un agente que previene la interacción entre poliadenilato y una macromolécula endógena que se une a poliadenilato.

10.- El sistema de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho secuestro de proteínas que se unen a poliadenilato se logra mediante tratamiento de dicho extracto con un material que agota las macromoléculas que unen poliadenilato seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos para proteínas que se unen a poliadenilato, poliadenilato, y una combinación de los mismos.

11.- El sistema de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho material está unido a una matriz.

12.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ARN objetivo se selecciona del grupo de ARN sintético, ARN que ocurre naturalmente, ARN mensajero, ARN modificado químicamente, y derivados de ARN-ADN.

13.- El sistema de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha secuencia de ARN objetivo comprende una tapa 5' y una secuencia de poliadenilato 3'.

14.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ARN objetivo se selecciona del grupo que consiste de una secuencia de ARN objetivo no marcada, secuencia de ARN objetivo marcada, y la combinación de las mismas.

15.- El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la secuencia de ARN objetivo marcada es marcada con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, y una combinación de porciones fluorescentes y de extinción.

16.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende además nucleótido trifosfato añadido exógenamente.

17.- El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho nucleótido trifosfato es ATP.

18.- El sistema de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende además un mejorador de reacción.

19.- El sistema de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho mejorador de reacción se selecciona del grupo que consiste de alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y dextrano.

20.- El sistema de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho mejorador de reacción es alcohol polivinílico.

21 .- Un método para identificar un agente capaz de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) proveer el sistema de la reivindicación 1 ; (B) introducir dicho agente en dicho sistema; (C) determinar el grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo; y (D) identificar un agente capaz de modular el grado de dicho recambio como capaz de modular la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho sistema comprende además nucleótido trifosfato.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho nucleótido trifosfato es ATP.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho agente es una molécula modificadora de la estabilidad de ARN.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha secuencia de ARN objetivo se selecciona del grupo que consiste de secuencia de ARN objetivo no marcada, secuencia de ARN objetivo marcada, y la combinación de las mismas.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha secuencia de ARN marcada es marcada con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, y una combinación de porciones fluorescentes y de extinción.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho monitoreo del grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo comprende determinar el grado de degradación de dicho ARN objetivo marcado.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha modulación de la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo incrementa la estabilidad de dicha secuencia ARN objetivo.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha modulación de la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho agente es capaz de modular la actividad de una proteína de unión a un elemento rico en AU o una proteína de unión a un elemento rico en C.

31 .- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha proteína de unión a un elemento rico en AU se selecciona del grupo que consiste de un miembro de la familia de proteínas de ELAV; AUF1 ; tristetrapolina; AUH; TIAR; gliceraldehído-3-fosfato; hnRNP C; hnRNP A1 ; AU-A; y AU-B.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dicho miembro de la familia de proteínas de ELAV se selecciona del grupo que consiste de HuR, Hel-N1 , HuC y HuD.

33.- Un método para identificar un agente capaz de modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo en presencia de un modificador de estabilidad de ARN añadido exógenamente que comprende (a) proveer el sistema de la reivindicación 1 ; (b) introducir dicho modificador de estabilidad de ARN en dicho sistema; (c) introducir dicho agente en dicho sistema; (d) determinar el grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo; y (e) identificar un agente capaz de modular el grado de dicho recambio como capaz de modular la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo en presencia de dicho modificador de estabilidad de ARN añadido exógenamente.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho sistema comprende además nucleótido trifosfato.

35.- El método de conformidad con ia reivindicación 34, caracterizado además porque dicho nucleótido trifosfato es ATP.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha secuencia de ARN objetivo se selecciona del grupo que consiste de una secuencia de ARN objetivo no marcada, secuencia de ARN marcada, y la combinación de las mismas.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque dicha secuencia de ARN marcada es marcada con una porción que se selecciona del grupo que consiste de una porción fluorescente, una porción visible, una porción radiactiva, un ligando, y una combinación de porciones fluorescentes y de extinción.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha determinación del grado de recambio de dicha secuencia de ARN objetivo comprende determinar el grado de degradación de dicho ARN objetivo marcado.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho modificador de estabilidad de ARN incrementa la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque dicho agente disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo incrementada por dicho modificador de estabilidad de ARN.

41 .- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho modificador de estabilidad de ARN disminuye la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicho agente incrementa la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo disminuida por dicho modificador de estabilidad de ARN.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho agente es capaz de modular la actividad de una proteína de unión a un elemento rico en AU o una proteína de unión a un elemento rico en C.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha proteína de unión a un elemento rico en AU se selecciona del grupo que consiste de un miembro de la familia de proteínas de ELAV; AUF1 , tristetrapolina; AUH; TÍA: TIAR; gliceraldehído-3-fosfato; hnRNP C; hnRNP A1 ; AU-A; y AU-B.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dicho miembro de la familia de proteínas de ELAV se selecciona del grupo que consiste de HuR, Hel-N1 , HuC y HuD.

46.- Un método para identificar un agente capaz de modular la desadenilación de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) proveer el sistema de la reivindicación 1 en ausencia de un nucleótido trifosfato; (B) introducir dicho agente en dicho sistema; (C) monitorear la desadenilación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema; y (D) identificar un agente capaz de modular el grado de dicha desadenilación como capaz de modular la desadenilación de dicha secuencia de ARN objetivo.

47.- Un método para identificar un agente capaz de modular la desadenilación y degradación de una secuencia de ARN objetivo que comprende (A) proveer el sistema de la reivindicación 1 en presencia de un nucleótido trifosfato; (B) introducir dicho agente en dicho sistema;, (C) monitorear la desadenilación y degradación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema; y (D) identificar un agente capaz de modular el grado de dicha desadenilación y degradación como capaz de modular la desadenilación y degradación de dicha secuencia de ARN objetivo.

48.- Un método para identificar un agente capaz de modular el crecimiento celular o la diferenciación celular en un mamífero que comprende determinar la capacidad de dicho agente para modular la estabilidad de una secuencia de ARN objetivo implicada en la modulación de crecimiento o diferenciación celular como se reclama en la reivindicación 19.

49.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque dicho agente capaz de modular el crecimiento celular o diferenciación celular interviene en la transformación celular.

50.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque dicho agente capaz de modular el crecimiento celular o diferenciación celular interviene en la desregulación inmune.

51 .- Un método para identificar, caracterizar o aislar una molécula endógena que se presume participa en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo que comprende (A) proveer el sistema de la reivindicación 1 ; (B) introducir dicha proteína que se presume participa en la regulación de recambio de ARN en dicho sistema; (C) monitorear la estabilidad de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho sistema; y (D) identificar, caracterizar o aislar dicha molécula endógena capaz de modular dicha desadenilación o degradación como capaz de participar en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha molécula que se presume participa en la desadenilación o degradación de ARN o regulación del mismo es proteína o ARN.

53.- Un equipo para monitorear ia estabilidad de una secuencia de ARN objetivo preseleccionada bajo condiciones capaces de recapitular el recambio de ARN regulado, dicho equipo comprendiendo: (a) extracto celular con actividad agotada de proteínas que se unen a poliadenilato; (b) otros reactivos; y (c) instrucciones para el uso de dicho equipo.

54.- El equipo de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque comprende adicionalmente nucleótido trifosfatos, un mejorador de reacción, una secuencia de ARN objetivo, o cualquier combinación de los mismos.

55.- Un método para identificar un agente capaz de modular la degradación de una secuencia de ARN objetivo en ausencia de desadenilación que comprende (A) proveer un extracto celular en presencia de un nucleótido trifosfato; (B) introducir dicho agente en dicho extracto celular; y (C) monitorear la degradación de dicha secuencia de ARN objetivo en dicho extracto.