JP2002516095A - Ｒｎａ分子の安定性およびターンオーバーの再現および調節のためのシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 調節下のｍＲＮＡの安定性および外因性ＲＮＡのターンオーバーを再現するinvitroシステムが提供される。本システムは、ポリアデニレート結合蛋白質の活性が場合によって枯渇されている細胞抽出物および標的ＲＮＡ配列を含む。本システムは、ＲＮＡターンオーバーを調整することができる物質、およびＲＮＡ安定性改変物質の存在下でＲＮＡターンオーバーを調整することができる物質を特定するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明の基礎となった研究は、少なくとも部分的には米国予防衛生研究所のグ
ラントＧＭ５６４３４号によって支援された。したがって前記の政府は本発明に
おいて一定の権利を有する。 一般に、本発明は、ＲＮＡの安定性をモニターし、さらにＲＮＡの安定性を調
節することができる因子を特定するシステムおよび方法に関する。

【０００２】従来技術 ｍＲＮＡの相対的安定性は遺伝子発現の重要な調節因子である。ｍＲＮＡの半
減期は、定常状態での発現レベルおよび遺伝子生成物の誘導速度の決定に役割を
果たす。一般に、短命な蛋白質の多くは短命なｍＲＮＡによってコードされる。
安定な蛋白質（例えばα−グロブリン）をコードするいくつかのｍＲＮＡはまた
極めて長い半減期をもつことが示された。ナンセンスコドン変異を含むｍＲＮＡ
を特定してその半減期を短くするために細胞は監査機構を用いる。明らかに、ｍ
ＲＮＡの半減期の変化は細胞の反応および機能に対して劇的な結果をもたらす。

【０００３】 哺乳類細胞のｍＲＮＡのターンオーバーおよび安定性のメカニズムについては
ほとんど判明していないが、in vivoのデータによって、ｍＲＮＡのターンオー
バーの主要な経路についていくつかの普遍化が可能になり始めた。ｍＲＮＡのポ
リ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの寿命の間に細胞質で徐々に短くなる。この脱アデ
ニル化プロセスの速度を制御することが、ｍＲＮＡの安定性を調節する多くの因
子の目標のようである。いったんポリ（Ａ）テールが約５０−１００塩基まで短
くなると、ｍＲＮＡ本体は識別可能な中間体をもたない急激な態様で分解する。
翻訳プロセスもまたｍＲＮＡの安定性に影響する。しかしながら、哺乳類のｍＲ
ＮＡのターンオーバーに必要な酵素および調節成分についてはほとんど知られて
いない。

【０００４】 いくつかのｃｉｓ作動性エレメントがｍＲＮＡの安定性に役割を演じることが
示された。ターミナル（５'）キャップおよび３'−ポリ（Ａ）構造および付随蛋
白質はおそらくエキソヌクレアーゼから転写物を保護するであろう。さらにまた
ｍＲＮＡ本体に存在するいくつかの脱安定化エレメントが安定化エレメントと同
様に特定された。もっとも性状が調べられた不安定性エレメントは、多くの短命
ｍＲＮＡの３'非翻訳領域に見出されるＡ−Ｕ富裕配列（ＡＲＥ）である。これ
らのＡＲＥは主にＡＵＵＵＡ（配列番号：１２）リピートまたは関連する九量体
配列から成る。ＡＲＥは、脱アデニル化およびｍＲＮＡターンオーバーの速度を
翻訳非依存性態様で高めることが示された。例えば、ＡＵ富裕断片をもつ蛋白質
には多くの増殖因子およびサイトカインｍＲＮＡが含まれる：例えばｃ−ｆｏｓ
、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃＴＮＦα、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ１−１５およびＩＦＮ−
βである。他の安定性エレメントにはＣ富裕安定性エレメント、例えばグロビン
、コラーゲン、リポキシゲナーゼおよびチロシンヒドロキシラーゼのｍＲＮＡで
見出されるものが含まれる。さらに他のｍＲＮＡは、まだ性状が判明していない
かまたはほとんど性状が調べられていない配列エレメントとして、例えば欠失分
析で特定されたものとして例えばＶＥＧＦｍＲＮＡを有する。

【０００５】 ＡＲＥと何らかの特異性をもって相互反応する多くの蛋白質が報告されたが、
ｍＲＮＡのターンオーバーのプロセスにおけるそれらの正確な役割は明らかでは
ない。例えば、上記のＡＲＥと結合する蛋白質には、ＨｕＲおよび他のＥＬＡｖ
類の蛋白質、例えばＨｕＲ（ＨｕＡとも称される）、Ｈｅｌ−Ｎ１（ＨｕＢとも
称される）、ＨｕＣおよびＨｕＤ；ＡＵＦ１（４つのアイソフォーム）；トリス
テトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩＡ；ＴＩＡＲ；グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲＮＰＡ１；ＡＵ−Ａ；およびＡＵ−Ｂが含まれる。

【０００６】 遺伝学を応用して、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）でｍＲＮＡの
ターンオーバーに関与する機構および因子が特定され始めている。ｍＲＮＡ崩壊
の主要な経路の１つは、脱キャップ反応とそれに続く５'から３'方向へのエキソ
ヌクレアーゼ作用を含む。また別の経路で３'から５'方向へのエキソヌクレアー
ゼの役割に関する証拠が得られた。酵母のｍＲＮＡのキャップ構造と３'ポリ（
Ａ）テールとの間の機能的に重要な相互作用もまた報告された。ナンセンスコド
ンによって仲介される崩壊の翻訳依存性経路に関与するいくつかの因子が特定さ
れた。しかしながら、これらの知見が哺乳類の細胞に一般的に適用できるか否か
はまだ確定されていない。

【０００７】 哺乳類細胞の機械学的疑問は、遺伝系のような哺乳類細胞に固有の困難さのた
めに通常は生化学系を用いてもっともよく研究される。したがって、ｍＲＮＡの
安定性およびターンオーバーを研究するためには、in vitroシステムを開発する
努力が為されてきた。しかしながら、現在利用可能なin vitroシステムは多くの
制限を受けている。例えば、データの質の貧弱さおよび再現性の一般的欠如（こ
れらはそれらデータの利用を著しく制限する）に多くの者が悩まされている。別
の重要な問題は、これらのシステムのほとんどがｍＲＮＡの安定性に関する全て
の局面を忠実に再現していないということである。これらのシステムを開発する
上での重要な問題は、ランダムで非特異的なＲＮＡの分解と本物の調節されてい
るｍＲＮＡのターンオーバーとの間に区別をつけることである。ｍＲＮＡ安定性
における本物のin vivoプロセスに対するこれまでのいずれのin vitroシステム
の意義もしたがって明らかではない。今日まで、一般的にいずれのｍＲＮＡ安定
性in vitroシステムも有効で有用なものとして受け入れられていない。

【０００８】 現在利用可能なシステムにおける他の明瞭な問題は、それらシステムが、一般
に当該分野の他の研究者が再現することができない複雑な抽出プロトコルを通常
必要とするということである。さらにまた、現在利用可能なシステムは内在性ｍ
ＲＮＡの安定性を評価するためにしか用いることができず、これはそれらシステ
ムの利用性を極めて限定する。最後に、そのようなシステムを用いて得られるデ
ータの質は極めて変動し、感度の高いスクリーニングアッセイではそれらを使用
することができない。

【０００９】 したがって、効率的で再現性が高く、さらにＲＮＡ分解の検出不能量が最小限
であるin vitroＲＮＡ安定性システムが必要とされている。 さらにまた、ｍＲＮＡ本体の全体的な分解が観察される前にＲＮＡ転写物の脱
アデニル化が発生するin vitroＲＮＡ安定性システムが必要とされている。さら
にまた、ｍＲＮＡ本体の分解が検出可能な中間体を生じることなく極めて急速に
変化しながら発生し、さらに全体的な脱アデニル化速度および分解速度が配列特
異的態様で観察されるin vitroＲＮＡ安定性システムが要求されている。そのよ
うなシステムは外因性ＲＮＡにも適用可能で、容易な実験操作を可能にするはず
である。 本明細書のいずれの参考文献の引用も、本出願に対する"先行技術"としてそれ
ら文献を利用することを容認しようとするものではない。

【００１０】発明が解決しようとする課題 本発明にしたがえば、in vivoでのＲＮＡプロセッシングにならってＲＮＡ分
子の安定性およびターンオーバーを調節するin vitroシステムが提供される。し
たがって、本発明は、選択転写物の発現に影響を与える物質を特定しさらにデザ
インするために、さらにｍＲＮＡ安定性に関与する内因性蛋白質および他の巨大
分子の性状決定を促進するために、真核細胞ＲＮＡの安定性を調節する化合物／
巨大分子の高処理量スクリーニングを可能にする。本発明のin vitroシステムは
さらに以下の場合に有用である：選択疾患の対立遺伝子座における分子的欠損を
決定する診断補助；新規な薬剤の発見につながる、他の真核生物（寄生虫および
真菌を含む）のためのin vitroのｍＲＮＡ安定性システムの開発；および、本シ
ステムを用いてＲＮＡ安定性に影響を与える因子およびＲＮＡ配列を特定するこ
とによる遺伝子デリバリーシステムの改良。

【００１１】 一般的にいえば、本発明は、外因的に付加された予め選択した標的ＲＮＡ配列
の調節されたＲＮＡターンオーバーを再現することができるin vitroシステムを
包含し、本システムは細胞抽出物および標的ＲＮＡ配列を含む。本明細書に開示
する本システムの非限定的な例では、調節ＲＮＡターンオーバーは、ＡＵ富裕エ
レメントによって調節されるＲＮＡターンオーバーまたはＣ富裕エレメントによ
って調節されるＲＮＡターンオーバーである。

【００１２】 本発明のシステムの細胞抽出物は溶解させた真核細胞または組織から単離され
るが、この細胞抽出物は例えばＨｅＬａ細胞またはＴ細胞株のような細胞株から
得ることができる（ただし本発明はこれに限定されない）。細胞抽出物は、外来
核酸を含む細胞、例えば感染細胞、安定的にトランスフェクトされた細胞または
一過性にトランスフェクトされた細胞から調製できる。細胞抽出物は部分的に精
製してもよい。

【００１３】 本発明のある実施態様では、細胞抽出物のポリアデニレートに結合する蛋白質
の活性を枯渇させることができる。細胞抽出物からポリアデニレート結合蛋白質
活性を枯渇させるには、多数の方法、いくつかを挙げれば例えばポリアデニレー
ト競合ＲＮＡの本システムへの添加；ポリアデニレート結合蛋白質の除去；ポリ
アデニレート結合蛋白質を不活化させるプロテイナーゼの添加；またはポリアデ
ニレート結合内因性巨大分子とポリアデニレートとの相互作用を妨げる物質の添
加によって達成できる。ポリアデニレート結合蛋白質を除去する方法のさらに別
の例としては、ポリアデニレートと結合する巨大分子を枯渇させる物質（例えば
ポリアデニレート結合蛋白質に対する抗体）、ポリアデニレートおよびその組合
せを用いて抽出物を処理するというような非限定的方法によって達成することが
できる。この物質はマトリックスに結合させることができる。ポリアデニレート
結合蛋白質活性の枯渇を達成する他の方法も用いることができる。

【００１４】 本システムで用いられる標的ＲＮＡ配列は、非限定的な例として、合成ＲＮＡ
、天然に存在するＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、化学的に改変したＲＮＡ、ま
たはＲＮＡ−ＤＮＡ派生体である。標的ＲＮＡ配列は５'キャップおよび３'ポリ
アデニレート配列を有することができる。標的ＲＮＡ配列は非標識標的ＲＮＡ配
列でも、標識標的ＲＮＡ配列でも、または両者の結合物でもよい。標識ＲＮＡ配
列は、蛍光性成分または可視性成分、放射能活性成分、リガンドおよび蛍光性成
分と消光性成分の結合物で標識することができるが、ただしこれらに限定されな
い。ＲＮＡを標識する他の成分および手段も包含される。

【００１５】 本発明のシステムは、さらに外因的に付加されたヌクレオチド三燐酸を含むこ
とができるが、ＡＴＰが好ましい。本システムはさらに、システムに存在する種
々の成分間での反応を強化するために反応強化物質（例えばポリマー）を含むこ
とができる。前記ポリマーは、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンおよびデキストランで、ただしこれらに限定されないが、ポリビニルアルコ
ールが好ましい。

【００１６】 本発明の目的はまた、標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することができる物質を
特定する方法である。本方法は、ポリアデニレート結合蛋白質活性を枯渇させた
細胞抽出物および標的ＲＮＡ配列を含む上記で説明したシステムを調製し、前述
のシステムに被験物質を導入し、標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度を、例
えば標識標的ＲＮＡの分解度を測定することによって求め、続いて前記標的ＲＮ
Ａ配列の安定性を調節する能力にしたがってＲＮＡターンオーバーの程度を調節
することができる物質を特定することによって実施される。 上記の方法はさらにヌクレオチド三燐酸を含むことができる。この場合ＡＴＰ
が好ましい。被験物質はおそらくＲＮＡ安定性を改変する分子であるが、ただし
これに限定されない。非限定的に選択される標的ＲＮＡ配列の種類および前記Ｒ
ＮＡのために有用な非限定的な標識の種類は上記で述べたとおりである。

【００１７】 本発明の方法は、前記標的ＲＮＡの安定性を高めるかまたは低下させることが
できる物質を特定するために有用である。そのような物質は、ＲＮＡ結合分子、
例えばＣ富裕エレメント結合蛋白質およびＡＵ富裕エレメント結合蛋白質（ただ
しこれらに限定されない）の活性を調節することができる。ＡＵ富裕エレメント
結合蛋白質の例にはＨｕＲおよび他のＥＬＡｖ類の蛋白質、例えばＨｕＲ、Ｈｅ
ｌ−Ｎ１、ＨｕＣおよびＨｕＤ；ＡＵＦ１；トリステトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩ
Ａ；ＴＩＡＲ；グルセルアルデヒド−３−ホスフェート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲ
ＮＰＡ１；ＡＵ−Ａ；およびＡＵ−Ｂが含まれる。この表示は、本発明で評価可
能な分子の種類の説明であり、それらに限定しようとするものではない。

【００１８】 本発明のさらに別の実施態様では、外因的に添加されたＲＮＡ安定性改変物質
またはＲＮＡ結合巨大分子の存在下で標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することが
できる物質を特定する方法が提供される。そのような分子の非限定的な例は上記
で述べた。本方法は、ポリアデニレート結合蛋白質活性を枯渇させた細胞抽出物
および標的ＲＮＡ配列を含む上記で説明したシステムを調製し、前述のシステム
に外因的に添加したＲＮＡ安定性改変物質または結合巨大分子および被験物質を
導入し、標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの度合いを、例えば標識標的ＲＮＡの
分解度を測定することによって求め、続いて外因的に添加したＲＮＡ安定性改変
物質の存在下で前記標的ＲＮＡ配列の安定性を調節する能力に応じてＲＮＡター
ンオーバーの度合いを調節することができる物質を特定することによって実施さ
れる。

【００１９】 非限定的に選択される本方法の成分は上記で述べたとおりである。前述の方法
は、例えばＲＮＡ安定性改変物質が前記標的ＲＮＡ配列の安定性を低下させ、さ
らに被験物質が、前記ＲＮＡ安定性改変物質によって低下した標的ＲＮＡ配列の
安定性を高める場合に有用である。さらに本方法は、ＲＮＡ安定性改変物質が標
的ＲＮＡ配列の安定性を高め、さらに被験物質が、前記ＲＮＡ安定性改変物質に
よって高められた標的ＲＮＡ配列の安定性を低下させる場合に有用である。ＲＮ
Ａ安定性改変物質の非限定的な例には、Ｃ富裕エレメント結合蛋白質およびＡＵ
富裕エレメント結合蛋白質が含まれる。ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質の例には
ＨｕＲおよび他のＥＬＡｖ類の蛋白質、例えばＨｕＲ、Ｈｅｌ−Ｎ１、ＨｕＣお
よびＨｕＤ；ＡＵＦ１；トリステトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩＡ；ＴＩＡＲ；グル
セルアルデヒド−３−ホスフェート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲＮＰＡ１；ＡＵ−Ａ
；およびＡＵ−Ｂが含まれる。この表示は、本発明で評価可能な分子の種類の説
明として提供され、それらに限定しようとするものではない。

【００２０】 本発明のさらに別の目的は、標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化を調節することが
できる物質を特定する方法である。本方法はヌクレオチド三燐酸（例えばＡＴＰ
）の非存在下で上記のシステムを調製し、このシステムにある物質を導入し、さ
らに標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化をモニターすることを含む。さらにまた、本
発明の目的は、標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および分解を調節することができ
る物質を特定する方法である。本方法は、ＡＴＰの存在下で上記のシステムを調
製し、このシステムに前記物質を導入し、さらに標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化
および分解をモニターすることを含む。これらの実施態様はまた、ＲＮＡ安定性
改変物質またはＲＮＡ結合巨大分子の存在下で実施し、ＲＮＡ安定性に対する前
記改変物質または結合分子の作用を調節する能力を測定することもできる。

【００２１】 さらに本発明の別の特徴では、哺乳類で細胞増殖または細胞の分化を調節する
ことができる物質を特定する方法が提供される。本方法は、細胞増殖または分化
の調節に必要な標的ＲＮＡ配列の安定性を調節する前記物質の能力を上記の本発
明の方法にしたがって決定することを含む。細胞増殖または細胞分化を調節する
ことができる物質は、細胞の形質転換および免疫調節失調のような生理学的プロ
セスに介入できる可能性があるが、ただし本発明はそのような制限を受けない。

【００２２】 本発明のさらに別の特徴は、ＲＮＡの脱アデニル化もしくは分解またはその調
節に参画すると思われる内因性分子の特定、性状決定および単離の方法を提供す
る。本方法は、上記のシステムを調製し、前記システムにＲＮＡターンオーバー
の調節に参画すると思われる蛋白質を導入し、さらに標的ＲＮＡ配列の安定性を
モニターすることを含む。ＲＮＡの脱アデニル化および／または分解または調節
に参画すると思われる内因性分子は蛋白質またはＲＮＡであろう。

【００２３】 本発明のさらに別の実施態様では、脱アデニル化反応の非存在下で標的ＲＮＡ
配列の分解を調節することができる物質を特定する方法が提供される。本方法は
、ヌクレオチド三燐酸の存在下で細胞抽出物を提供し、前記物質を前記細胞抽出
物に導入し、さらに前記抽出物での前記標的ＲＮＡの分解をモニターすることを
含む。

【００２４】 本発明のさらに別の目的は、調節されているＲＮＡターンオーバーを再現する
ことができる条件下で予め選択した標的ＲＮＡの安定性をモニターするキットで
ある。本キットは、場合によってポリアデニレート結合蛋白質活性が枯渇されて
いる細胞抽出物、他の試薬および使用指示を含む。本キットはさらにヌクレオチ
ド三燐酸、反応強化物質またはその両方を含むことができる。

【００２５】 したがって、本発明の目的はＲＮＡ分子の安定性およびターンオーバーをin v
itroで調節するシステムを提供することである。本システムは、当業者がＲＮＡ
転写物のターンオーバーを一般的に、または脱アデニル化および分解を特異的に
調べることを可能にし、さらにＲＮＡ転写物の安定性およびターンオーバーを調
節することができる薬剤をスクリーニングすることを可能にする。このターンオ
ーバーは、外因的に添加されたＲＮＡ安定性改変物質が非存在下または存在下で
惹起されるであろう。本システムはまたＲＮＡターンオーバーにおける内因性分
子の役割の研究を可能にするであろう。

【００２６】 本発明のさらに別の実施態様では、ＲＮＡ分子の安定性およびターンオーバー
をin vitroで調節し、さらに前述の物質を調査するために当業者が容易に使用で
きるキットが提供される。 本発明のこれらの特徴および他の特徴は、下記の図面および詳細な説明を参考
にしてより一層理解できるであろう。

【００２７】課題を解決するための手段 本明細書中では多数の用語および語句が用いられている。これらの用語および
語句の意味は下記で説明する。 特に本明細書で用いられるように、ＲＮＡの"半減期"は、その蛋白生成物の合
成用鋳型として機能するＲＮＡ分子の量の減少の測定をいう。 本明細書で用いられるように、"ターンオーバー"はＲＮＡ分子の分解を指し、
ターンオーバーは脱アデニル化および分解を含む。 本明細書で用いられるように、"キャップ"または"５'キャップ"または"末端キ
ャップ"は互換的に用いられ、そのＲＮＡ分子のもっとも５'側のヌクレオチドに
化学的に結合した７−メチルグアノシン（７ｍＧ）キャップを指す。

【００２８】 本明細書で用いられるように、"ポリアデニル酸（ポリ（Ａ))テール" は、Ｒ
ＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）の３'末端に転写後に付加される連続したアデニル
酸の鎖（ポリアデニレート）を指す。 本明細書で用いられるように、"安定性"という用語は、その機能によってＲＮ
Ａ分子の分解プロセスを遅らせることができるＲＮＡ分子の保全を意味する。 本明細書で用いられるように、"ポリアデニル酸競合核酸オリゴマー"という語
句は、本発明のシステムに添加され、ポリ（Ａ）結合蛋白質を除去できる連続し
たアデニル酸を含むオリゴマーを指す。したがって、ポリ（Ａ）テールをもつ個
々のＲＮＡ分子の分解を調節することができる。

【００２９】 さらに本明細書で用いられるように、"制限エンドヌクレアーゼ"は、核酸分子
内の特定のヌクレオチド配列を認識し、前記部位内またはその近くに二本鎖をも
つ裂け目をつくる酵素を指す。いくつかの制限酵素、例えばＥｃｏＲＩまたはＨ
ｉｎｄＩＩＩは"相補性テール"を生成された各フラグメントに生じる。これらの
テールは、ハイブリダイゼーション条件下で互いに再度アニールすることができ
るので"粘着性"と称される。したがって、２つの分離核酸分子が同じ制限部位を
共有する場合は、同じ制限エンドヌクレアーゼで処理されたとき、両者は相補的
な一本鎖テールを含み、一緒にスプライスされて組換え核酸分子を生成すること
ができる。 当然のこととして、本明細書で用いられる"制限エンドヌクレアーゼ部位"とい
う語句は、特定の制限エンドヌクレアーゼによって認識される特定のヌクレオチ
ド配列を指す。

【００３０】 さらにまた、本発明を実施するために、当技術分野における多くの一般的な分
子生物学、微生物学および遺伝子組換えＤＮＡ技術を容易に利用することができ
る。そのような技術は以下の文献で完全に説明されている（Sambrook, Fritsch
& Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Second Edition(1989
), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（本
明細書では"Sambrook et al., 1985"と記す）；Oligonucleotide Synthesis(M.J
. Gait ed. 1984)); Nucleic Acid Hybridization, (B.D. Hames & S.J. Higgin
s eds.(1985); Transcription and Translation, (B.D. Hames & S.J. Higgins
eds.(1984)); Animal Cell Culture, (R.I. Freshny, ed.(1986)); Immobilized
Cells and Enzymes, (IRL Press.(1986)); B. Perbal, A Practical Guide to
Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994)）。 したがって、本明細書で使用される場合、以下の用語は下記に示す定義を有す
るであろう。

【００３１】 "ベクター"とは、レプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドで
あって、それらに対して別のＤＮＡ断片が結合され、その結果結合させたセグメ
ントが複製される。"レプリコン"は、in vivoでＤＮＡ複製の自律的単位（すな
わちそれ自身の制御の下で複製できる）として機能する任意の遺伝的断片（例え
ばプラスミド、染色体、ウイルス）である。

【００３２】 "カセット"とは、特定の制限部位でベクターに挿入される核酸分子の断片（例
えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。核酸分子の断片は、問題のポリペプチドをコ
ードするものでもよい。さらにカセットおよび制限部位は、転写および翻訳のた
めに適切な読み枠で前記カセットを挿入することができるようにデザインされる
。 外因性または異種ＤＮＡを細胞内に導入する場合は、そのようなＤＮＡで細胞
を"トランスフェクト"する。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化をも
たらす場合は、細胞は外因性または異種ＤＮＡによって"形質転換"されている。
好ましくは、形質転換ＤＮＡは、前記細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに共
有結合によって組み込まれているはずである。

【００３３】 "核酸分子"とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまた
はシチジン："ＲＮＡ分子"）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノ
シン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン："ＤＮ
Ａ分子"）のリン酸エステルポリマー、または任意のそのホスホエステル類似体
、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルであって、一本鎖または二本鎖
ヘリックス形のいずれかであるものを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子という用語、特に
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は前記分子の一次構造および二次構造のみを指し、いず
れの特定の三次形態に制限するものではない。したがって、この用語は、とりわ
け直線状または環状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、プラスミドおよび
染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。個々の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察
する場合は、配列は、通常の慣例にしたがってＤＮＡ非転写鎖（すなわちｍＲＮ
Ａと相同な配列をもつ鎖）の５'から３'方向の配列のみを提示するように記載さ
れる。"組換えＤＮＡ分子"とは分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。

【００３４】 ＤＮＡ"コード配列"とは、転写される二本鎖ＤＮＡ配列で、さらにこれは、適
切な調節配列の制御下に置かれた場合、in vitroまたはin vivoで細胞内でポリ
ペプチドに翻訳される。コード配列の境界は、５'（アミノ）末端の開始コドン
および３'（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード
配列には原核細胞配列、真核細胞ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核細胞（例え
ば哺乳類細胞）ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列さらには合成ＤＮＡ配列が含
まれるが、ただしこれらに限定されない。コード配列が真核細胞での発現を意図
されている場合は、ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、コード配列
に対して３'に通常配置できる。

【００３５】 "プロモーター配列"は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して下流の（３'
方向の）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本
発明を規定するために、プロモーター配列は、その３'末端の境界に転写開始部
位をもち、上流（５'方向）に伸長してバックグラウンドを越える検出可能レベ
ルでの転写を開始させるために必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プ
ロモーター配列内には、転写開始部位（通常は例えばヌクレアーゼＳ１によるマ
ッピングで特定される）および、ＲＮＡポリメラーゼ結合に必要な蛋白質結合ド
メイン（コンセンサス配列）が見出される。

【００３６】 本発明は、in vitroでのＲＮＡ分子の調節下のターンオーバーを活性化させる
、本出願人らによるこれまで知られていなかったシステムの発見を基にする。本
システムは、驚くべきことにかつ予想に反して、当業者によるin vitroでのＲＮ
Ａ分子の安定性の研究および調節、したがってin vitroでのＲＮＡ分子のターン
オーバーの調節を可能にする。したがって、本発明の新規で有用なシステムは、
普遍的および調節下の両局面におけるＲＮＡ分子（特に真核細胞ｍＲＮＡ転写物
）の脱アデニル化および分解の正確で忠実な再生（本明細書ではまた調節下のＲ
ＮＡターンオーバーの再現と称する）を可能にする。特に本発明の新規で有用な
システムは、最低限の（好ましくは検出不能の）ｍＲＮＡターンオーバーを許し
、さらにこの系ではＲＮＡ分子の脱アデニル化はＲＮＡ分子の分解前に発生し、
このシステムはin vivoで見出されるＲＮＡのターンオーバープロセスに類似す
る。

【００３７】 本システムの開発および本システムを利用する方法にとって手掛かりは、ポリ
アデニレート競合ＲＮＡは、ポリアデニレート結合蛋白質と結合してその結果デ
アデニラーゼ酵素を活性させ、ＲＮＡターンオーバーを誘発する蛋白質を隔離す
ることができるという発見に基づいている。以前は、ポリアデニレートと結合す
る蛋白質はＲＮＡの脱アデニル化に寄与するかもしれないと考えられていたので
、そのような蛋白質はそれとは反対にＲＮＡの安定化物質であるという発見は、
脱安定化仲介物質と相互作用して前記仲介物質を不活化させるということを認識
させた。したがって、本発明の目的は、外因的に付加された予め選択した標的Ｒ
ＮＡ配列の調節されたＲＮＡターンオーバーを再現することができるin vitroシ
ステムである。前記システムは、ポリアデニレート結合蛋白質活性を枯渇させた
細胞抽出物および予め選択した標的ＲＮＡを含む。

【００３８】 具体的な実施態様では、調節下のＲＮＡターンオーバーはＡＵ富裕エレメント
（ＡＲＥ）調節ＲＮＡターンオーバーによって調節されるものである。ＡＵ富裕
エレメントを含むｍＲＮＡの例には非限定例である以下のものが含まれる：ｃ−
ｆｏｓ；ｃ−ｊｕｎ；ｃ−ｍｙｃＴＮＦ−α、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ１−１５および
ＩＦＮ−β。上記で特記したように、ＡＵ富裕エレメントは、以下を含む多数の
蛋白質の結合のための部位である：ＡＲＥ結合蛋白質のＥＬＡＶ類、例えばＨｕ
Ｒ、ＨｅｌＮ−１、ＨｕＣおよびＨｕＤ。他のものには以下が含まれる：ＡＵＦ
１；トリステトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩＡ；ＴＩＡＲ；グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲＮＰＡ１；ＡＵ−ＡおよびＡＵ−Ｂ。別
の実施態様では、調節されるＲＮＡターンオーバーは、Ｃ富裕エレメント（ＣＲ
Ｅ）調節ＲＮＡターンオーバーによって調節されるものである。そのようなエレ
メントは、グロビンｍＲＮＡ、コラーゲン、リポキシゲナーゼ、およびチロシン
ヒドロキシラーゼのｍＲＮＡで見出されるようなエレメントである。未だ性状が
明らかにされていない配列エレメントを含む別のｍＲＮＡはＶＥＧＦのそれであ
る。しかしながら、本発明は、これらの特定のエレメントまたはＲＮＡターンオ
ーバーの調節に必要なこれらエレメントとの結合蛋白質に限定されない。

【００３９】 本発明の細胞抽出物は溶解させた真核細胞または組織から調製される。当業者
の知る多様な方法を用いて細胞抽出物を調製することができる。種々の細胞供給
源（新鮮な細胞および組織、並びに株細胞を含む）を用いることができる。その
ような細胞は外来核酸を例えば感染細胞内に含んでいてもよいし、または哺乳類
の発現ベクターを一過性にまたは安定的にトランスフェクトされていてもよい（
後者については下記でより詳しく述べる）。ある種の目的のためには（例えばＲ
ＮＡターンオーバーにおける感染、特に細胞内感染の役割を解明するために）、
感染細胞を本明細書の細胞抽出物の供給源として用いてもよい。ウイルスまたは
他の細胞内微生物（例えばリステリア＝モノサイトジーン、ＨＴＬＶ、単純疱疹
ウイルスおよびＨＩＶ）をこれらの特定の環境のために用いてもよい。さらに細
胞抽出物の調製前に、細胞をある種の化学物質または他の細胞外刺激、例えばホ
ルモン、増殖因子並びにキナーゼおよびホスファターゼ抑制物質（これらはＲＮ
Ａターンオーバーを変化させるかもしれない）に曝してもよい。これは、本明細
書で開示するようにそれらをその後の研究に用いて、ＲＮＡターンオーバーの調
節に必要なある種の蛋白質の誘発を特定するため、またはそのような刺激によっ
て誘発される不利なＲＮＡターンオーバーの調節と対抗できる薬剤を特定するた
めである。

【００４０】 下記で詳細に記載するように、本発明の方法は、種々の原因によって誘発され
る不利なＲＮＡターンオーバーに干渉することによって細胞を保護することがで
きる物質を特定するために用いることができる。好ましくは、細胞抽出物は核お
よび核内含有物を含まずに細胞質を含むが、しかしながらこれは、核由来の特定
の成分（例えば酵素または他の因子）が本システムの実施に干渉しないかぎり必
須ではない。典型的な調製物（これは本発明の範囲から外れることなく改変でき
る）では、細胞を増殖させ、これを採集して溶解し、１０００００Ｘｇで１時間
遠心して透析する。凍結して保存する場合は抽出物を保護するためにグルセロー
ルを添加してもよい。

【００４１】 上記で説明したように、細胞抽出物を調製するために用いられる細胞は外来Ｄ
ＮＡを含むことができる。本発明のシステムに加えるべき単離核酸分子は、先ず
最初にクローニングベクターに挿入し、この核酸分子の多数のコピーを生成する
ことができる。当分野で知られている多数のベクター−ホスト系を使用できる。
可能なベクターには、プラスミドまたは改変ウイルス（ただしこれらに限定され
ない）が含まれるが、ベクター系は使用するホスト細胞と適合していなければな
らない。ベクターの例には、大腸菌、バクテリオファージ（例えばラムダ由来フ
ァージ）またはプラスミド（例えばｐＢＲ３２２由来プラスミド、またはｐＵＣ
由来プラスミド、例えばｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなど）が
含まれるが、ただしこれらに限定されない。

【００４２】 クローニングベクターへの挿入は、例えば核酸分子を相補的な粘着末端を有す
るクローニングベクターに連結することによって達成できる。しかしながら、核
酸分子を分断するために使用される相補的な制限部位がクローニングベクターに
存在しない場合は、前記核酸分子の末端を酵素的に改変することができる。また
別には、前記核酸分子の末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することに
よって、所望されるどのような部位も作出することができる。連結されるこれら
のリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合
成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。形質転換、トランスフェクシ
ョン、感染、電気穿孔などによってリコンビナント分子をホスト細胞に導入し、
それによって多くの核酸分子コピーを生成することができる。

【００４３】 好ましくは、クローニングされる核酸分子をシャトルベクタープラスミドに含
有させる。このベクタープラスミドはクローニング用細胞（例えば大腸菌）内で
の増量および、その後の適切な発現細胞株への挿入のために容易な精製（そのよ
うな精製が必要な場合は）を提供する。例えば、シャトルベクター（２種類以上
の生物で複製することができるベクター）は、大腸菌プラスミド由来の配列を酵
母２μプラスミド由来の配列に連結することによって、大腸菌とビール酵母菌と
の両方での複製のために作製できる。

【００４４】 当然のことながら、以前に単離核酸分子をクローニングベクターに挿入するた
めに報告されたいずれの方法も使用可能で、適切な転写／翻訳制御シグナルおよ
び蛋白質コード配列から成る核酸分子を含む発現ベクターを構築することができ
る。これらの方法にはin vitroリコンビナントＤＮＡ技術、合成技術およびin v
ivo組換え（遺伝子組換え）が含まれる。

【００４５】 本発明で使用できる哺乳類の発現ベクターには以下が含まれる：ジヒドロフォ
レートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターのような誘発性プロモーターを含
むベクター、例えばＤＨＦＲ発現ベクターを含む任意の発現ベクター、またはＤ
ＨＦＲ／メトトレキセート同時増幅ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローニング遺伝
子およびＤＨＦＥの両方を発現するベクターを含む：Kaufman, Current Protoco
ls in Molecular Biology, 16.12(1991)）。また別には以下がある：グルタミン
シンターゼ／ミチオニンスルフォキシミン同時増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４
（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ
クローニング部位を含む、ベクターはグルタミンシンターゼおよびクローニング
遺伝子を発現する(Celltech)）。別の実施態様は以下のとおりである：エプスタ
イン＝バーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームでの発現を誘導するベクタ
ー、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ
、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、
構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒグロマイシン選別マーカー（Invitrogen
))、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的
ｈＣＭＶ極初期遺伝子、ヒグロマイシン選別マーカー（Invitrogen))、ｐＭＥＰ
４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、
ＢａｍＨＩクローニング部位、誘発性メタロチオネインＩｌａ遺伝子プロモータ
ー、ヒグロマイシン選別マーカー（Invitrogen))、ｐＲＥＰ（ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位
、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選別マーカー（Invitrogen))、
ｐＲＥＰ（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、Ｓｆｉ
ＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８
選別マーカー（Invitrogen))、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモー
ター、ヒグロマイシン選別マーカー、Ｎ−末端ペプチド精製可(ProBond樹脂およ
びエンテロキナーゼでの切断による）(Invitrogen)）。本発明で使用できる選別
可能哺乳類発現ベクターには以下が含まれる：ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ
、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩおよびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８
選別（Invitrogen))、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ
、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選別（Invitrogen))および他
のベクター。本発明で使用できるワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（Kauf
man(1991）上掲書）には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ｐＳ
Ｃ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫおよびβ−ｇａｌ選別）、ｐＭＪ６０
１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ａ
ｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫお
よびβ−ｇａｌ選別）およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａ
ｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニ
ング部位；ＴＫまたはＸＰＲＴ選別）。

【００４６】 いったん特定の核酸分子（例えばＲＮＡ）をベクターに挿入したら、当分野で
知られているいくつかの方法を用いて前記分子を増殖させることができる。適切
なホスト系および増殖条件が確立したら、リコンビナント発現ベクターを増殖さ
せて大量に調製することができる。以前に説明したように、使用できる発現ベク
ターにはいくらかを挙げれば以下のベクターまたはそれらの誘導体が含まれる（
ただしこれらに限定されない）：ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウ
イルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベ
クター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、並びにプラスミドおよ
びコスミドＤＮＡベクター。さらに、挿入配列の発現を調節または改変し、さら
に特定の所望の態様で遺伝子生成物を加工するホスト細胞株を選択することがで
きる。

【００４７】 ベクターは所望のホスト細胞に例えば以下のような当分野で知られている方法
によって導入できる：トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクシ
ョン、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシウム
沈澱、リポフェクション（リポソーム融合）。遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベ
クター輸送系（例えば以下を参照：Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967(19
92); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624(1988)；カナダ特許出願２０１
２３１１号(Hartmunt et al., 1990年3月15日出願))。 本明細書に開示する調製において有用な細胞には、規定の条件下で大量に増殖
させることができる不朽化または部分的不朽化細胞、例えばＨｅＬａ細胞および
種々のＴ細胞株が含まれる。他の供給源には、組織、血液細胞または類骨髄細胞
が含まれる。他の供給源も本発明の分野で周知である。

【００４８】 本明細書で開示するシステムの細胞抽出物はポリアデニレート結合蛋白質活性
が枯渇されている。これは、例えば以下の方法のいずれかまたはそれらの組合せ
によって達成できる。理論に拘束されないが、これらの方法の各々はポリアデニ
レート結合蛋白質を除去するか、または結合活性を不活化させる。これらの手順
は、本明細書に記載する方法で細胞抽出物を使用するときに前記抽出物に適用す
るか、または細胞抽出物を予め処理してもよい。例えば、結合蛋白質が結合でき
る無関係のＲＮＡ配列を提供し、それによってそのような結合蛋白質の標的ＲＮ
Ａ配列を隔離するために、ポリアデニレート競合ＲＮＡを細胞抽出物に加えても
よい。別の実施態様では、ポリアデニレート結合蛋白質の除去を実施することが
できる。除去は、細胞抽出物に前述の蛋白質に結合する物質を添加するか、また
は細胞抽出物を前記物質に暴露することによって達成される。前記物質は、例え
ばポリアデニレート結合蛋白質に対する抗体、またはポリアデニレート配列それ
自身またはポリアデニレート配列を含む巨大分子で、これらはそのような蛋白質
に対する結合標的として機能する。また別の選択肢として、またはそれに加えて
、これらの蛋白質結合物質はマトリックス（例えばアガロースビーズ）に結合さ
せ、細胞抽出物をそのようなビーズカラムに通して、ポリアデニレート結合蛋白
質を除去してもよい。共有結合によって抗体またはＲＮＡ配列を含有するように
改変したそのようなビーズの調製は、ポリアデニレートであれポリアデニレート
含有配列であれ、当業者の知るところである。

【００４９】 細胞抽出物からそのようなそのような活性を減少させるか、排除する別の手段
は、ポリアデニレート結合蛋白質を不活化することが分かっている１つまたは２
つ以上のプロテイナーゼに暴露するものである。これらのプロテイナーゼは抽出
物に添加するか、またはマトリックスに結合させ抽出物に暴露してからビーズを
除去してもよい。さらに別の手段は、ポリアデニレートとポリアデニレート結合
内因性巨大分子との間の相互反応を防ぐ物質を抽出物に添加することを含む。本
発明に含まれるこれらの方法および他の方法は、ポリアデニレート結合巨大分子
を細胞抽出物から枯渇させるという所望の目的を達成し、したがって標的ＲＮＡ
配列と混合した細胞抽出物がin vivo様ＲＮＡターンオーバーを受けることを可
能にする。

【００５０】 前述の方法の１つまたはそれらの組合せを利用して、抽出物が作製された細胞
または組織の供給源、個々の標的ＲＮＡ配列および他の因子に応じて、そのよう
な蛋白質レベルを許容限界まで低下させることができる。下記で特記するように
、ポリアデニレートに結合するある種の巨大分子は、前記特定の蛋白質または他
の巨大分子を本明細書に記載するような研究に付す場合は、本明細書に開示する
システムおよび方法を用いる特定のアッセイまたは他の方法に包含させることが
できる。

【００５１】 本発明のさらに別の実施態様では、細胞抽出物は部分的に精製されるか、そう
でなければ巧みに操作される。例えば、場合によってはポリアデニレート結合蛋
白質の枯渇前または枯渇後に、本発明のシステムに加える前にある種の成分を除
去するために細胞抽出物を部分的に精製することができる。例えば、本発明の方
法と干渉するある種の非特異的因子および／または無関係な活性は細胞抽出物か
ら除去できる。当業者には、下記で詳細に調査される特定の標的ＲＮＡについて
は、抽出物の部分精製の必要性およびポリアデニレート結合因子の枯渇の必要性
が理解されよう。さらにまた、本発明のシステムが調節下のＲＮＡターンオーバ
ーを再現することを担保するために他の成分を添加することができる。

【００５２】 本発明のシステムにおける標的ＲＮＡ配列は、多数のＲＮＡの１つでもまたは
改変ＲＮＡ分子でもよい。例えば、合成ＲＮＡは固相合成によって調製してもよ
いし、または当業者の知るようにファージポリメラーゼを用いてin vitro転写に
よって再生してもよい。天然に存在するＲＮＡは細胞、組織および他の生物学的
供給源から単離できる。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（本発明で
の好ましいＲＮＡ種）またはＲＮＡ−ＤＮＡ誘導体であろう。メッセンジャーＲ
ＮＡは、典型的には５'キャップおよび３'ポリアデニレート配列を含む。化学的
に改変したＲＮＡ（例えばホスホチオエート成分によって改変されたＲＮＡ）は
本発明に包含される。

【００５３】 本発明のシステムおよび方法で用いられる個々のＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）は
、調査される個々のｍＲＮＡ種にしたがって選別できる。ｍＲＮＡターンオーバ
ー、そのターンオーバーの内因性調節物質および外因的に添加される分子（特に
ｍＲＮＡターンオーバーに影響を与える特に小さな分子）の詳細な調査は、多様
な症状の予防および治療に重要な治療上の意義を有する。ある種のｍＲＮＡ（例
えばサイトカインのｍＲＮＡ）は短命で、他のもの（例えばグロビンメッセンジ
ャー）は長命である。特定の蛋白質および特定の細胞タイプのｍＲＮＡの寿命の
調節は、ターンオーバーを変化させしたがって細胞の生理学を変化させる外部の
刺激に対する影響から多様な反対の作用を受けるであろう。多様な症状における
細胞蛋白質および細胞表現型の発現の変化は、ｍＲＮＡターンオーバーの変化の
結果かもしれない。ターンオーバーの変化を回復させるためにそのようなｍＲＮ
Ａターンオーバーの変化を薬理学的に調整すること、または生物の利益のために
ターンオーバーの変化を誘発することは、本明細書に開示するシステムおよび方
法によって達成することができる。

【００５４】 例えば、特定のｍＲＮＡ（例えば前炎症性サイトカインＴＮＦαのｍＲＮＡ）
は、ターンオーバーを遅らせてｍＲＮＡの寿命および前記蛋白質の炎症細胞によ
る発現を延長させる小分子調節物質を特定するための標的として選択される。そ
のような調節物質は、ＴＮＦαの分泌増加が有益なある種の免疫学的疾患の治療
で実質的に利点を提供するかもしれない。反対に、敗血症でのＴＮＦαの大量の
過剰産生、または類リューマチ性関節炎および炎症性大腸疾患におけるその副作
用は、そのターンオーバーを速め、したがって炎症細胞によるＴＮＦαの発現を
低下させる物質の使用によって軽減できるかもしれない。 本発明の他のｍＲＮＡ種への適用は、本明細書の教示によって理解されよう。
特に本発明の方法は、疾患の治療または予防に利用できるＲＮＡターンオーバー
の調節物質を特定する高処理量スクリーニングを推進する。

【００５５】 本発明のシステムおよび方法の特徴の１つでは、標的ＲＮＡ配列のターンオー
バーがモニターされる。これは、当業者の知る多様な方法の１つまたはそれらを
組み合わせて達成できる（それらの１つは標識ＲＮＡを供給するものである）。
本発明の標的ＲＮＡ配列は、標識されてなくても標識されていてもよく、または
それらの組合せでもよい。例えば、非標識標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および
／または分解が発生する条件を設定した後、そのレベルが多数の方法のいずれか
によって評価される。上記の方法では標識プローブ、またはＵＶ吸収、ゲル電気
泳動とそれに続く特異的もしくは非特異的染色、または増幅系（例えばファージ
ポリメラーゼ）とそれに続く適切な増幅由来技術（例えば分子探知法）が用いら
れる。また別に（おそらくはより簡単に）、標的ｍＲＮＡ配列は標識されて完全
配列または分解ＲＮＡフラグメントの量が容易に定量される。標識は例えば蛍光
性成分、可視性成分、放射性成分、リガンドおよび蛍光成分と消光成分の組合せ
であるが、これらの非限定例は単に説明のために提供される。

【００５６】 さらにまた、場合によってはＲＮＡ分子またはその部分（例えばポリ（Ａ）テ
ール）は、当業者に周知の日常的プロトコルによって検出できるように標識され
る。適切な標識には、酵素、蛍光発光団（例えばいくつかの蛍光発光団を挙げれ
ばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）
、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド系塩
（特にＥｕ³⁺))、発色団、放射性同位元素、キレート剤、染料、コロイド金、ラ
テックス粒子、リガンド（例えばビオチン）および化学発光物質が含まれる。コ
ントロールマーカーを用いる場合は、同じまたは異なる標識をレセプターとコン
トロールマーカーに用いることができる。

【００５７】 放射性標識（例えば以下のような同位元素：³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ
、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉおよび¹⁸⁶Ｒｅ）を用
いる場合は、現在利用可能な既知の計測手段を利用することができる。特定のリ
ボヌクレオチドは適切な同位元素を用いて調製し、標識ＲＮＡは固相合成によっ
て製造できる。また別には、同位元素を含む部分はＲＮＡに共有結合によって連
結させてもよい。標識が酵素の場合は、検出は、当分野で知られている現在利用
可能な比色分析、分光分析、蛍光分光分析、電流測定、ガス圧測定の何れかによ
って達成できる。さらに別の例では、ビオチン成分がいずれかの手段によってＲ
ＮＡに取り込まれる。続いてこのビオチン化ＲＮＡまたは分解フラグメントはア
ビジン試薬によって定量される。

【００５８】 直接標識は本発明にしたがって用いることができる標識の一例である。直接標
識とは、その自然な状態で裸眼または光学フィルターおよび／または刺激の利用
（例えば蛍光励起のためのＵＶ光）によって容易に目で見ることができるものと
定義される。本発明にしたがって用いることができる着色標識の例では、とりわ
け金属ゾル粒子（例えばLeuvering(米国特許４３１３７３４号）が記載した金ゾ
ル粒子）；染料ゾル粒子（例えばGribnau et al(米国特許４３７３９３２号）お
よびMay et al(ＷＯ８８／０８５３４号）が記載したもの）；染色ラテックス（
例えばMay(上掲書）およびSynder（ＥＰ−Ａ２８０５５９号および２８１３２７
号）が記載したもの）；またはリポソームに被包化された染料（米国特許４７０
３０１７号（Campbell et al))が含まれる。他の直接標識には、放射性ヌクレオ
チド、蛍光成分また化学発光成分が含まれる。これらの直接標識方法の他に、酵
素を含む間接標識もまた本発明にしたがって用いることができる。免疫アッセイ
と連係させた種々のタイプの酵素も当分野で周知で、例えばアルカリホスファタ
ーゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼおよび
他のものが以下の文献で詳細に考察されている（Eva Engvall, "Emzyme Immunoa
ssay ELISA and EMIT"(Methods in Enzymology, 70:419-439(1980));米国特許４
８５７４５３号）。 適切な酵素にはアルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビペルオキシダー
ゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明で使用される他の標識に
は磁性ビーズまたは磁気共鳴画像化標識が含まれる。

【００５９】 本明細書に特記したように、ＲＮＡターンオーバーは２段階で生じる、すなわ
ち脱アデニル化（これはヌクレオチド三燐酸の存在に左右されない）および分解
（これは前記の存在に左右される）である。細胞抽出物のヌクレオシド三燐酸（
リボヌクレオチドおよび／またはデオキシヌクレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ
、ＣＴＰおよび／またはＧＴＰ）を含む）のレベルは、ＲＮＡターンオーバーの
分解段階の発生を許容するほど十分な場合と十分でない場合がある。本発明のあ
る実施態様では、本システムはさらに外因的に付加したヌクレオチド三燐酸、好
ましくはＡＴＰを含む。

【００６０】 本発明の研究中に反応強化物質の添加はＲＮＡ分解の効率をわずかに促進する
ことが観察された。これはおそらく、in vitroでの巨大分子複合体の生成を促進
するその能力によるものと思われる。したがって。本発明では、場合によって反
応強化物質（例えばポリマー）が本システムの成分間の相互反応を刺激するため
に使用される。その非限定的な例には、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、およびデキストランが含まれるが、ポリビニルアルコールが好ましい。

【００６１】 予め選択したＲＮＡ配列のin vitroＲＮＡターンオーバーを再現する上記のシ
ステムはいくつかの用途（特に内因性および外因性調節物質のＲＮＡターンオー
バーにおける役割の特定）を有する。本発明の目的は、一般的に標的ＲＮＡ配列
の安定性を調節することができる物質を特定することで、本方法は以下の工程を
含む： （Ａ）上記のように本システムを調製し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し； （Ｃ）前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度を測定し；さらに （Ｄ）前記ターンオーバーの程度を調節する能力をもつ物質を前記標的ＲＮＡ配
列の安定性を調節することができる物質と特定する。 上記の方法は、上記の目的のためにさらに添加ヌクレオチド三燐酸（好ましく
はＡＴＰ）を含むことができる。

【００６２】 ＲＮＡターンオーバーを調節するその活性が前述の方法で検出することができ
る物質にはＲＮＡ安定性改変物質が含まれるが、ただしこれに限定されない。 上記で述べたように、標的ＲＮＡ配列は、個々の被験ＲＮＡに応じて上記のよ
うに選択できる。標的ＲＮＡは、非標識標的ＲＮＡ配列でも、標識標的ＲＮＡ配
列でも、またはその組合せでもよい。標識には蛍光性成分、可視性成分、放射能
活性成分、リガンド、または蛍光成分と消光成分を組合せたものが含まれるが、
ただしこれらに限定されない。

【００６３】 前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度をモニターすることには、上記の
方法によって前記標識標的ＲＮＡの分解の程度を測定することが含まれる。 特に本方法は、標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することができる物質の特定に
用いることができる。この物質は、標的ＲＮＡ配列の安定性を高めるか、また別
にはＲＮＡ配列の安定性を低下させる。 ある実施態様では、この物質は、ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質またはＣ富裕
エレメント結合蛋白質の活性を調節することができるが、ただしそのように限定
されるものではない。ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質およびＣ富裕エレメント結
合蛋白質の例は本明細書に記載したとおりである。

【００６４】 本発明のさらに別の実施態様では、外因的に添加したＲＮＡ安定性改変物質の
存在下で標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することができる物質を特定する方法が
提供される。本方法は以下の工程を含む： （ａ）上記に記載したように本システムを調製し； （ｂ）前記システムに前記ＲＮＡ安定性改変物質を導入し； （ｃ）前記システムに前記物質を導入し； （ｄ）前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度を測定し；さらに （ｅ）前記ターンオーバーの程度を調節する能力をもつ物質を、前記外因的に付
加されたＲＮＡ安定性改変物質の存在下で前記標的ＲＮＡ配列の安定性を調節す
ることができる物質と特定する。

【００６５】 本発明のこの特徴では、ＲＮＡターンオーバー調節物質の活性に影響を与える
ことができる物質、特に小分子が特定される。上記で述べたように、そのような
小分子は、ＲＮＡ安定化または内因性仲介物質（これは検査システムに添加され
る）の活性を脱安定化に対するそれらの影響を決定するためにスクリーニングで
きる。また別には、本発明は、外因性物質とともに作用するかまたは拮抗する化
合物を特定するために用いることができる。本システムの成分（ヌクレオチド三
燐酸、標的ＲＮＡ、標識を含む）は上記のとおりである。この実施態様の一例で
は、ＲＮＡ安定性改変物質は前記標的ＲＮＡ配列の安定性を高め、別の態様では
、前記物質は、前記ＲＮＡ安定性改変物質によって高められた前記標的ＲＮＡ配
列の安定性を低下させる。別の実施態様では、ＲＮＡ安定性改変物質は標的ＲＮ
Ａ配列の安定性を低下させ、さらに別の態様では前記物質は、前記ＲＮＡ安定性
改変物質によって低下した前記標的ＲＮＡ配列の安定性を高める。

【００６６】 ＲＮＡ安定性改変物質の一連の候補物質にはＡＵ富裕エレメント結合蛋白質が
含まれるが、ただし本発明はそのような因子に限定されない。ｍＲＮＡのそのよ
うなエレメントをもつ既知の蛋白質および当該エレメントに対する結合蛋白質の
例は上記で述べたが、ただし本発明はこれらの例に限定されない。

【００６７】 さらにまた、別の実施態様では、前述の手順にしたがって細胞抽出物から除去
されたＲＮＡ結合巨大分子が本システムに戻され、ＲＮＡターンオーバーにおけ
るそれらの役割を解明されるとともに、ＲＮＡに結合するこれら巨大分子によっ
て仲介されるＲＮＡターンオーバーに対する物質、特に小分子の影響が詳細に調
べられる。さらに別の実施態様では、上記に述べたものと同じ目的のために、標
的ＲＮＡは本発明のシステムに添加する前にＲＮＡ結合巨大分子とともにロード
される。 上記に特記したように、本明細書で述べる方法のいずれかで使用される細胞抽
出物は部分的に精製してもよい。

【００６８】 さらにまた、以下の工程を含む、標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化を調節するこ
とができる物質を特定する方法が提供される： （Ａ）ヌクレオチド三燐酸の非存在下で本発明のシステムを調製し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し；さらに、 （Ｃ）前記システムで前記標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化をモニターする。 以下の工程を含む、標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および分解を調節すること
ができる物質を特定するさらに別の方法が提供される： （Ａ）ＡＴＰの存在下で本発明のシステムを調製し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し；さらに、 （Ｃ）前記システムで前記標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および分解をモニター
する。

【００６９】 さらにまた、哺乳類で細胞増殖または細胞分化を調節することができる物質を
特定する方法が本明細書で提供される。本方法では、前述の方法を利用しながら
細胞増殖または細胞分化の調節に必要な標的ＲＮＡ配列の安定性を調節すること
ができる前記物質の能力を測定する工程が含まれる。細胞増殖または細胞分化を
調節することができる物質は、細胞の形質転換または免疫失調に介入することが
できる。

【００７０】 本発明のさらに別の実施態様では、以下の工程を含む、ＲＮＡの脱アデニル化
もしくは分解またはその調節に参画すると思われる内因性分子を特定し、性状を
決定し、また単離する方法が提供される： （Ａ）上記の本発明のシステムを提供し； （Ｂ）ＲＮＡターンオーバーの調節に参画すると思われる前記蛋白質を前記シス
テムに導入し； （Ｃ）前記システムにおける前記標的ＲＮＡ配列の安定性をモニターし；さらに
（Ｄ）ＲＮＡの脱アデニル化もしくは分解またはその調節に参画することができ
る物質として、前記脱アデニル化または分解を調節する能力を有する前記内因性
分子を特定し、性状を決定し、または単離する。 ＲＮＡの脱アデニル化もしくは分解またはその調節に参画すると思われる分子
は、蛋白質またはＲＮＡであろう。

【００７１】 本発明の別の実施態様では、以下の工程を含む、脱アデニル化が惹起されない
状態で標的ＲＮＡの分解を調節することができる分子を特定する方法が提供され
る： （Ａ）ヌクレオチド三燐酸の存在下で細胞抽出物を提供し； （Ｂ）前記細胞抽出物に前記物質を導入し；さらに、 （Ｃ）前記抽出物おける前記標的ＲＮＡ配列の分解をモニターする。 本発明の目的はまた、調節下のＲＮＡターンオーバーを再現することができる
条件下で予め選ばれた標的ＲＮＡの安定性をモニターするキットである。そのよ
うなキットは以下を含む： （ａ）ポリアデニレート結合蛋白質活性が場合によって枯渇されている細胞抽出
物； （ｂ）他の試薬；および （ｃ）前記キットの使用指示。

【００７２】 キットは、さらにヌクレオチド三燐酸、反応強化物質、標的ＲＮＡ配列、ＲＮ
Ａ結合蛋白質、ＲＮＡ安定性改変物質、またはその組合せを含むことができる。
本発明のキットは、本明細書で開示した多様な方法を実施するための成分を提供
することは当業者には理解されよう。そのような多様な方法とは、例えばＲＮＡ
ターンオーバーを調節する物質および内因性因子の特定；ＲＮＡターンオーバー
に必要な多様な因子のＲＮＡターンオーバー活性を調節する物質の特定、および
以下の特定の用途における他の方法（ＲＮＡターンオーバーを調節することによ
って効果が得られる多様な症状または疾患の予防および／または治療のために潜
在的に有用な治療物質を特定するために小分子をスクリーニングする）である。
本キットは、上記の成分に応じてＲＮＡの脱アデニル化、ＲＮＡの分解またはそ
の両方を調べるために調製される。さらにまた、細胞抽出物は部分的に精製でき
る。本キットは、ポリアデニレートに結合する、抽出物に存在する蛋白質の活性
を枯渇させるための試薬を含むことができる。そのような試薬は、例えばポリア
デニレート、マトリックスに結合させたポリアデニレート、ポリアデニレート結
合蛋白質に対する抗体およびマトリックスに結合させた前記抗体である。

【００７３】 本発明は、本発明の典型的な例として提供される以下の非限定的な実施例を参
考にしてよりいっそう理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい
実施態様をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それら実施例
は本発明の広い範囲を限定するものと解してはならない。

【００７４】実施例 実施例１：ＥＬＡＶ蛋白質は新規なｍＲＮＡ脱アデニル化／分解in vitroシス
テムで脱アデニル化中間体を安定化させる 本実施例では、ＨｅＬａ細胞細胞質Ｓ１００抽出物および外因性ポリアデニル
化ＲＮＡ基質を用いる、調節下のｍＲＮＡ崩壊（ターンオーバー）を再現する新
規なin vitroでのｍＲＮＡ安定性システムを説明する。コールドのポリ（Ａ）競
合ＲＮＡの添加によって、強力なＡＴＰ依存性リボ核酸分解活性と同様に、配列
特異的デアデニラーゼ活性がともに抽出物で活性化された。脱アデニル化および
分解の両方の速度が、基質ＲＮＡ本体の種々のＡＵ富裕エレメントの存在によっ
てアップレギュレートされた。

【００７５】 競合アッセイによって、トランス作動性因子がＡＵ富裕エレメントによるＲＮ
Ａの脱安定化に要求されることが示された。このin vitroシステムで、約３０ｋ
ＤａのＥＬＡＶ蛋白質（ＨｕＲ）が、ＴＮＦ−αｍＲＮＡに由来するＡＵ富裕エ
レメント含有ＲＮＡに特異的に結合した。しかしながら、ＨｕＲとＡＵ富裕エレ
メントとの相互作用はＲＮＡ脱安定化を伴わなかった。興味深いことに、リコン
ビナントＥＬＡＶ蛋白質は、ＡＵ富裕エレメント含有基質ＲＮＡのターンオーバ
ーから生じた脱アデニル化中間体を特異的に安定化した。したがって、哺乳類の
ＥＬＡＶ蛋白質は、分解酵素のＲＮＡ基質への接近に影響を与えることによって
ｍＲＮＡ安定性の調節で役割を果たしている。

【００７６】 ｍＲＮＡの相対的安定性は遺伝子発現の重要な調節因子である。個々のｍＲＮ
Ａの半減期は、その発現の定常レベルおよびその遺伝子生成物が誘発される速度
の両方の決定で役割を果たす（以下の文献で概括されている：Ross, 1995; Capo
nigro & Parker, 1996）。さらにまた、調節因子をコードするｍＲＮＡの安定性
に影響を与える変異は、腫瘍原性形質転換および免疫失調を促進する（Aghib et
al., 1990; Schiavi et al., 1992）。一般に、多くの短命な蛋白質（サイトカ
インおよびプロト−オンコジーンに由来するものを含む）は短命なｍＲＮＡによ
ってコードされる。 また、安定な蛋白質（例えばグロビン）をコードするいくつかのｍＲＮＡは、
極めて長い半減期をもつことが示された（Holcik & Liebhalber, 1997)。さらに
、ナンセンスコドン変異を含む異常なｍＲＮＡを特定し、その半減期を短くする
監査機構が報告された（Maquat, 1995; Jacobson & Peltz, 1996）。したがって
、ｍＲＮＡの半減期の調節は、増殖および発生中の細胞反応と機能の出現に劇的
な結果をもたらす。

【００７７】 遺伝学を応用しつつ、ビール酵母菌におけるｍＲＮＡのターンオーバーに必要
な機構および因子が特定され始めた。ｍＲＮＡターンオーバーに関する多くの経
路が酵母に存在し、遺伝子発現について多様な調節レベルおよび精密なチューニ
ングを可能にする。ｍＲＮＡ崩壊の一般的経路の１つは、ポリ（Ａ）テールの短
縮化とそれに続く脱キャップおよび５'から３'方向に核酸の末端から進行する崩
壊を含む（Muhlrad et al., 1994）。第二の一般的経路は、脱アデニル化とそれ
に続くｍＲＮＡ本体の３'から５'方向のターンオーバーを含む（Anderson & Par
ker, 1998)。いくつかのｍＲＮＡでは、核酸の内部から進行する核酸分解による
切断もまた明らかにされた（Presutti et al., 1995)。最後に、ナンセンスコド
ン含有ｍＲＮＡの翻訳依存分解では、脱アデニル化を迂回するまた別の崩壊経路
が含まれる（Weng et al., 1997)。酵母のｍＲＮＡ安定性で役割を演じるいくつ
かの分解酵素および調節蛋白質が特定された（Caponigro & Parker, 1996; Weng
et al., 1997)。酵母ｍＲＮＡのキャップ構造と３'ポリ（Ａ）テールとの間の
機能的に重要な相互作用もまた報告された（Tarun & Sachs, 1997)。しかしなが
ら、これらの知見が一般的に哺乳類細胞に適用できるか否かは確定していない。

【００７８】 in vivoの知見によって、哺乳類細胞におけるｍＲＮＡターンオーバーの主要
経路に関していくつかの普遍化が可能になり始めた。核内でのプロセッシングで
ほとんどのｍＲＮＡに約２００塩基のポリ（Ａ）が付加される（Colgan & Manle
y, 1997)。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ安定性において少なくとも２つの既知
の機能を示す。第一に、ポリ（Ａ）結合蛋白質と結合して（Bernstein et al.,
1989; Ford et al., 1997)、３'−５'エキソヌクレアーゼからｍＲＮＡを保護す
る。第二に、ポリ（Ａ）テールはｍＲＮＡのターンオーバーの開始部位として機
能する。ポリ（Ａ）テールは、細胞質でのｍＲＮＡの寿命中に徐々に短縮される
。脱アデニル化速度の制御はｍＲＮＡ安定性における重要な調節事項のようであ
る（Wilson & Treisman, 1988; Xu et al., 1997）。ポリ（Ａ）テールが約３０
−６５塩基まで短くなったら、ｍＲＮＡ本体は、識別可能な中間体を蓄積するこ
となくin vivoで急激に分解するようである（Chen et al., 1995; Xu et al., 1
997）。しかしながら、哺乳類のｍＲＮＡターンオーバーに必要な酵素および調
節成分についてはほとんど分かっていない。

【００７９】 ポリ（Ａ）テールの他に、ｍＲＮＡの安定性ではいくつかのシス−作動性エレ
メントが役割を演じることが示された。５'末端キャップ構造はエキソヌクレア
ーゼから転写物を保護する（Furuichi et al., 1977)。ｍＲＮＡの本体に存在す
るいくつかの脱安定化エレメント（Caput et al., 1986; Shyu et al., 1989; B
onnieu et al., 1990; Peng et al., 1996）が、安定化エレメント（Stefonovic
et al., 1997)と同様に特定された。十分に性状が調べられたｍＲＮＡ安定性を
調節するエレメントの１つは、多くの短命なｍＲＮＡの３'非翻訳領域で見出さ
れるＡＵ富裕配列（ＡＲＥ）である（Shaw & Kamen, 1986）。これらのＡＲＥは
主にＡＵＵＵＡリピートまたは関連する九量体配列から成り（Lagnado et al.,
1994; Zubiaga et al., 1995; Xu et al., 1997)、配列の特徴および分解キネテ
ィクスを基準に３種類に分類された（Xu et al., 1997)。一般に、ＡＲＥは、翻
訳非依存的態様で脱アデニル化およびＲＮＡターンオーバーの速度を速めること
が示された（Chen et al., 1995; Fan et al., 1997)。しかしながら、ＡＲＥ機
能の背後にある基礎的メカニズムはまだ決定されていない。

【００８０】 ＡＵ富裕エレメントとin vitroで結合することができる多くの蛋白質が報告さ
れたが（例えば、Malter, 1989; Vakalopoulou et al., 1991; Bohjanen et al.
, 1991; Brewer, 1991; Levine et al., 1993; Hamilton et al., 1993; Katz e
t al., 1994; Nakagawa et al., 1995; Ma et al., 1996)、ｍＲＮＡターンオー
バー過程での各因子の正確な役割は未だ明らかにされていない。ＡＲＥ結合蛋白
質のＥＬＡＶ類は発生の間保存され、脊椎動物で発生の全体を通して組織で弁別
的に発現される（以下の文献で概括される：Antic & Keene, 1997)。ＥＬＡＶ蛋
白質は細胞質および核の両方で見出されたが（Gao & Keene, 1996)、最も普遍的
に発現される形態、ＨｕＲは核と細胞質間を往復できる（Fan & Steiz, 1998; P
eng et al., 1998; Atasoy et al., 1998)。ＥＬＡＶ蛋白質のショウジョウバエ
相同体は神経系の発生および維持に遺伝的に必須であるように、それは増殖と発
生に重要な役割を果たす（Campos et al., 1985; Robinow & White, 1988）。

【００８１】 さらに、哺乳類のＥＬＡＶ蛋白質は分化中に誘発され、樹状突起に沿ってＲＮ
Ｐ顆粒中に分布する（Gao & Keene, 1996)。いくつかの情報は、ＥＬＡＶ蛋白質
は翻訳後遺伝子発現状態を制御することを示唆している（Gao & Keene, 1996; K
oushika et al., 1996; Myer et al., 1997; Ma et al., 1997; Antic & Keene,
1998)。例えば、ＥＬＡＶ類蛋白質の過剰発現は、選択したｍＲＮＡの蓄積に影
響を与えることが明らかにされた（Jain et al., 1997; Levy et al., 1998; Fa
n & Steitz, 1998; Peng et al., 1998)。しかしながら、ＥＬＡＶ蛋白質および
他のＡＲＥ結合因子の正確な役割はまだ確定されていない。

【００８２】 哺乳類細胞における機械学的疑問は、遺伝的システムのような哺乳類がもつ固
有の難しさのために通常は生化学的システムを用いてもっとも効率的に研究され
る。しかしながら、ｍＲＮＡの安定性およびターンオーバーを調べるための不安
定なin vitroシステムを確立することは困難であった。in vivoの知見および実
際上の考察を基にして、ｍＲＮＡ安定性の過程を研究するための最適なin vitro
システムは以下の特性を有するべきである：第一に、本システムは効率的で再現
性が高くなければならない。第二に、本システムでは最低限（好ましくは検出不
能）のＲＮＡ分解は、非特異的な夾雑リボヌクレアーゼによるランダムな分解に
よるものであるべきである。第三に、脱アデニル化は、ｍＲＮＡ本体の全体的な
分解が認められる前に発生しなければならない。第四に、ｍＲＮＡ本体の分解は
、検出可能な中間体がない極めて急激に進行する態様で生じなければならない。
第五に、全体的な脱アデニル化および分解の速度の調節は、配列特異的態様で観
察されなければならない。最後に、本システムは外因性ＲＮＡについて機能し、
容易な実験操作を可能にしなければならない。

【００８３】 本明細書で報告するものは、上記に挙げた基準の全てを満たし、さらにＡＲＥ
仲介ｍＲＮＡターンオーバーに必要とされることが分かっている特徴の全てを有
する、細胞質Ｓ１００抽出物を用いる新規で有用なｍＲＮＡ安定性in vitroシス
テムの発見である。このシステムを用いて、ｍＲＮＡ安定性におけるＥＬＡＶ類
のＡＵ富裕エレメント結合蛋白質の役割を明らかにすることができた。これらの
発見は、ＥＬＡＶ蛋白質は、ｍＲＮＡをヌクレアーゼの攻撃から保護するか、ま
たはこれら短命な転写物に目印を付ける因子を置換することによってＡＲＥ仲介
分解のデフォルト経路に影響を与えることができることを示している。このin v
itroシステムは、ｍＲＮＡターンオーバーに必要な細胞因子の特定を可能にし、
さらに遺伝子発現の転写後調節に必要なメカニズムの解明を助ける。

【００８４】 さらにまた、本発明のin vitroシステムは、化合物ライブラリーのスクリーニ
ングのために高処理量アッセイに容易に適用し、ＲＮＡ転写物の安定性およびタ
ーンオーバーをin vivoで調節することができる医薬品としてどの化合物を適用
し、したがって多様な疾病または疾患の治療に用いることができるかを解明する
ことができる。

【００８５】 ｉ．ＲＮＡ基質を脱アデニル化および分解するin vitroシステムの開発 ＲＮＡターンオーバーを調べるin vitroシステムの開発には、ポリ（Ａ）+Ｒ
ＮＡ基質の簡便な供給源の作製と活性を有する細胞抽出物が必要である。ポリア
デニル化されており、しかも標準的なアクリルアミドゲル技術を用いて容易に特
定できる基質ＲＮＡを得るために、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むＤＮＡフラグメン
トの３'末端に６０塩基のポリ（Ａ）テールをコードする鋳型を付加することが
できる新規で融通性をもつ連結−ＰＣＲ法を用いた（この方法は下記で説明する
）。in vitroＲＮＡ安定性システムの開発研究では、初めは６０塩基のポリ（Ａ
）テールを５４塩基のポリリンカー由来配列に結合させた（Ｇｅｍ−Ａ６０）。
このポリアデニル化転写物の小さなサイズのおかげで、ＲＮＡターンオーバー経
路における中間体のアクリルアミドゲルでの分析が容易になった。細胞抽出物は
、材料と方法の項で述べるようにわずかの改変を加えつつ低浸透圧下で溶解した
ＨｅＬａスピンナー細胞を用い、標準的な細胞質Ｓ１００プロトコル（Dignam e
t al., 1983)にしたがって調製した。

【００８６】 Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡをＡＴＰの存在下でＳ１００抽出物中で保温した。図１
Ａ（左図）に示すように、Ｇｅｍ−６０ＲＮＡのきわめてわずかのターンオーバ
ーが保温後６０分で認められた。この再現性を有する緩徐なターンオーバー速度
によって、我々は、脱アデニル化／分解プロセスの抑制物質がＳ１００抽出物に
存在しているのかもしれないという仮説をたてるにいたった。この仮説は、いく
つかの観察を基にしていた。第一に、核抽出物を用いた以前の実験によって、ポ
リ（Ａ）結合蛋白質は３'から５'方向のエキソヌクレアーゼ活性の強力な抑制物
質であることが示された（Ford et al., 1997)。第二に、部分精製した哺乳類の
デアデニラーゼ調製物の活性は大量のＰＡＢＰによって抑制された（Korner & W
ahle, 1997）。第三に、ツメガエル（Xenopus)卵母細胞のＰＡＢＰの過剰発現は
成熟特異的脱アデニル化を抑制する（Wormington et al., 1996)。

【００８７】 過剰量のポリ（Ａ）結合蛋白質がＳ１００抽出物中でのＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡ
の脱アデニル化の抑制の原因であるか否かを調べるために、量を増加させながら
コールドのポリ（Ａ）競合ＲＮＡを反応混合物に添加し、ポリ（Ａ）結合蛋白質
を隔離した。図１Ａ（右側）に示すように、ポリ（Ａ）競合物の添加はＳ１００
抽出物の分解活性を賦活させた。Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡは脱アデニル化マーカー
（Ｇｅｍ−Ａ０）のサイズよりもわずかに大きな種に短縮され、投入ＲＮＡの約
３０％が分解された。ＵＶ架橋実験と組み合わせて実施した力価測定実験によっ
て、Ｓ１００抽出物を活性化させるために必要なポリ（Ａ）競合ＲＮＡの量は、
基質ＲＮＡのポリ（Ａ）テールと蛋白質の結合を抑制する前記競合物の能力と一
致することが明らかになった（データは提示されていない）。さらにまた、Ｓ１
００抽出物に対する競合物質としてコールドのポリ（Ａ）ＲＮＡを添加すること
によって活性化される核酸分解活性は、＞５００ｎｇのポリ（Ａ）濃度でも観察
された。これらのデータは、活性化ヌクレアーゼはポリ（Ａ）による競合に対し
て極めて抵抗性を有することを示唆している。

【００８８】 ポリ（Ａ）競合ＲＮＡを補充したＳ１００抽出物中で保温したときに観察され
たＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡの短縮化の進行は、以下の観察を基に３'から５'方向の
ポリ（Ａ）テール特異的エキソヌクレアーゼによるものと判明した：第一に、も
っぱらその５'キャップを³²Ｐで標識されたＲＮＡ基質が、均一に標識された転
写物と同じ態様で本システム中で次第に短縮された（図１Ａと１Ｂを比較された
い）。これらのデータは、投入ＲＮＡの短縮は３'から５'方向で発生することを
示唆している。この結論は、ゲル電気泳動前のリボヌクレアーゼＨ消化によって
in vitroシステムから得られたＲＮＡ生成物の５'および３'部分を別々に分析す
ることによって確認された。図１Ｃに示したように、基質ＲＮＡの３'部分（主
に６０塩基ポリ（Ａ）テールから成る）が、転写物の５'部分のターンオーバー
が検出される前に明らかに分解が進行していた。保温後９分して、ポリ（Ａ）テ
ール含有３'フラグメントの７２％が分解し、一方、５'フラグメントの１９％の
みがターンオーバーされた。最後に、この３'から５'方向のエキソヌクレアーゼ
活性が本当にポリ（Ａ）特異的デアデニラーゼであるのか否かを確認するために
、１５塩基の非アデニレート配列をＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡの３'末端に付加した
（Ｇｅｍ−Ａ６０−１５）。図１Ｄに示すように、Ｇｅｍ−Ａ６０転写物（３'
ポリ（Ａ）テールを含有する）は３'エキソヌクレアーゼ活性のための優れた基
質であるが、一方、Ｇｅｍ−Ａ６０−１５ＲＮＡ（これはポリ（Ａ）鎖を内在化
させた１５塩基を有する）は３'エキソヌクレアーゼ活性のための優れた基質で
はなかった。

【００８９】 これらのデータから、ポリ（Ａ）競合ＲＮＡのＳ１００抽出物への添加は、デ
アデニラーゼ（外因性のポリ（Ａ）⁺基質ＲＮＡに対して活性を有する）を活性
化すると結論された。本in vitroシステムは、in vivoで観察されるｍＲＮＡ安
定性のいくつかの局面を再現する。デアデニラーゼそれ自体はコールドのポリ（
Ａ）によって顕著には抑制されないという驚くべき知見は、天然の酵素はその基
質に対して高い親和性をもたない可能性を示唆している。デアデニラーゼ活性は
、それをｍＲＮＡに結合させるまた別のＲＮＡ結合活性を、多成分複合体の部分
として含むのかもしれない。

【００９０】 ｉｉ．in vitroシステムにおけるＲＮＡターンオーバーはＡＵ富裕不安定性エ
レメントによって調節される Ｓ１００抽出物システムによって示されるＲＮＡターンオーバー活性が、転写
物本体の配列によって特異的な態様で影響を受けるかまたは調節されるか否かを
決定した。５４塩基のポリリンカー配列（Ｇｅｍ−Ａ６０）、ＴＮＦ−αｍＲＮ
Ａ由来の３４塩基ＡＵ富裕エレメント（ＡＲＥ）（ＡＲＥ−Ａ６０）またはｃ−
ｆｏｓｍＲＮＡ由来の７２塩基ＡＲＥ（Ｆｏｓ−Ａ６０）のいずれかを含む小さ
なポリアデニル化ＲＮＡの相対的安定性を、本in vitro安定性システムで決定し
た。図２Ａおよび２Ｂに示すように、両方のＡＲＥ含有ＲＮＡのターンオーバー
は、Ｇｅｍ−Ａ６０コントロール転写物と比較して劇的に増加した。ＡＲＥによ
る調節が配列特異的態様で発生するか否かを直接的に評価するために、ＴＮＦ−
α−ＡＲＥを材料と方法の項で述べるように広範囲に変異させた。ＡＵ富裕不安
定性エレメントにおける同様な変異は、in vivoでｍＲＮＡの半減期を大きく増
加させることが以前に示された（Myer et al., 1997)。図２Ｃで示すように、Ａ
ＲＥの変異は、in vitroシステムで脱アデニル化／分解の速度および程度を３倍
以上減少させた。したがって、本in vitroシステムにおけるターンオーバーは、
配列特異的態様でＡＵ富裕不安定性エレメントによって調節または調整される。

【００９１】 上記で我々が調べたＲＮＡ基質の全てが、ポリ（Ａ）テールに結合させた約５
０−７０塩基の本体を含んでいた。続いて、より大きなポリアデニル化ＲＮＡ基
質を用いる調節下のターンオーバーが本発明のシステムで検出できるか否かを調
べた。図２Ｄに示すように、本in vitroシステムではＳＶ４０後期ｍＲＮＡの３
'ＵＴＲに由来するポリアデニル化された２５０塩基のＲＮＡ（ＳＶ−Ａ６０）
は脱アデニル化されたが、分解は非効率的であった。このＲＮＡの３'部分への
ＴＮＦ−α−ＡＲＥの付加は、約３．５倍のターンオーバー速度の増加をもたら
した。最後に、ヒトＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡのほぼ完全長（〜９５０塩基）型をＡ
ＲＥが欠失したもの（ＧＭ−ＣＳＦ（−ＡＲＥ))とともに調製した。これらの転
写物の３'末端を酵母のポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリアデニル化した（M
artin & Keller, 1998)。ゲル精製ＲＮＡを本in vitroシステム中で保温し、部
分標本を表示の時間に取り出した。図２Ｅに示すように、ＡＲＥを含むＧＭ−Ｃ
ＳＦｍＲＮＡは、in vitroシステムではＧＭ−ＣＳＦ（−ＡＲＥ）よりも約２．
５倍不安定であった。他の転写物について上記で認められたように、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ転写物もまた本システムで脱アデニル化された。脱アデニル化は、用いたゲル
システムの解像の欠陥のために図２Ｅでは観察できなかったが、ホルムアルデヒ
ド−アガロースゲルを用いて観察された（データは提示されていない）。

【００９２】 ｉｉｉ．分解はＡＴＰを必要とし、脱アデニル化は必要としない ３'末端に６０のアデニレートをもつ転写物が、本システムで脱アデニル化お
よびターンオーバーを受けることが観察された。これは、ｍＲＮＡターンオーバ
ーが観察される前にポリ（Ａ）テールは約３０−６５塩基まで短縮されるという
ことを示唆する観察と一致する（Xu et al., 1997)。分解は、投入転写物が完全
に脱アデニル化される前に開始するようであるので（例えば図２）、相対的脱ア
デニル化速度に対するＡＵ富裕エレメントの影響を定量的に評価することは困難
であった。これらのプロセスの連結を解き、in vitroシステムでの脱アデニル化
速度に対するＡＲＥの影響を正確に評価するために、我々は、脱アデニル化また
はターンオーバーのどちらかのプロセスに固有の可能性がある補助因子の要件を
調べた。両プロセスはＥＤＴＡの添加によって抑制され（データは提示されてい
ない）、二価陽イオンの役割が示唆された。興味深いことには、脱アデニル化は
本システムにＡＴＰ／ホスホクレアチンの添加なしに生じる（図３Ａ）。他方、
分解はＡＴＰ／ホスホクレアチンを要求し、これは、それが存在しないときには
脱アデニル化中間体が蓄積することによって示される（図３Ａ、レーン−ＡＴＰ
）。したがって、反応からＡＴＰを省略することによって、我々は、ＡＵ富裕不
安定性エレメントの有無における相対的脱アデニル化速度を評価することができ
た。ＡＲＥを欠くか（ＳＶ−Ａ１５０−２００）またはＡＲＥを含む（ＳＶＡＲ
Ｅ−Ａ１５０−２００）、生理学的な長さのポリ（Ａ）テール（１５０−２００
塩基）をもつＲＮＡを、本in vitroシステムで保温し、部分標本を表示した時間
に分析した。図３Ｂに示すように、ＡＲＥを含むＲＮＡ基質は、この不安定性エ
レメントを含まないＲＮＡよりも約２倍の速さで脱アデニル化した。

【００９３】 要約すれば、in vitroｍＲＮＡ安定性システムは外因性基質に作用し、さらに
ターンオーバーのin vivoの局面で知られている全てを忠実に再現することが見
出された。ＲＮＡは、先ず転写物本体の分解前に脱アデニル化される。続いてｍ
ＲＮＡ本体の分解が、識別可能な中間体のない極めて進行速度の速い態様で発生
する。脱アデニル化および崩壊速度は、ＡＵ富裕不安定性エレメントの付加によ
って数倍増加する。我々がin vitroシステムで調べた３つのＡＲＥの全てが同様
な態様で機能するので、ＲＮＡ安定性のＡＲＥ調節は配列特異的で極めて再現性
が高い。本システムは調節下ｍＲＮＡターンオーバー経路および一般的ｍＲＮＡ
ターンオーバー経路の機械学的局面を解明するために貴重な手段を提供するはず
である。

【００９４】 ｉｖ．ＡＲＥ結合蛋白質のin vitroシステムにおける役割 本実施例で述べるin vitroシステムは、ＲＮＡ脱アデニル化／分解プロセスに
おけるＡＲＥ結合蛋白質の役割の評価を可能にする。幾つかの蛋白質は、我々の
抽出物でＡＲＥ含有ＲＮＡと結合した。図４Ａで認められるように、〜３０ｋＤ
ａの蛋白質および一群の〜４０ｋＤａ蛋白質は短いＡＲＥ−Ａ６０転写物と特異
的にＵＶで架橋された。約７０ｋＤａのものもまた、このＡＲＥがより大きな転
写物（ＳＶＡＲＥ−Ａ６０；図５Ｂ参照）に挿入されたとき検出された。この７
０ｋＤａ蛋白質は、ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡ転写物の比較的小さなサイズのために
ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡでは検出されなかったのかもしれない。既知のＡＲＥ−結
合蛋白質に対する利用可能な抗体を用いてこれら架橋種を特定しようとする努力
によって、ＥＬＡＶ蛋白質が明らかになった。

【００９５】 図４Ｂに示すように、免疫沈澱アッセイによって３０ｋＤａ蛋白質はＨｕＲ（
別名ＨｕＡ）と認定された。ＨｕＲはＥＬＡＶ蛋白類の蛋白質で全ての組織で普
遍的に発現される（Good, 1995; Ma et al., 1996; Myer et al., 1997）。約３
０ｋＤａの別のＲＮＡ結合蛋白質（ｈｎＲＮＰＡ１）に対する抗血清は、我々の
システムでいずれの架橋蛋白質も検出できなかった（図４Ｂ）。２つのまた別の
抗血清を４０ｋＤａのバンドを特定するためにテストした。ｈｎＲＮＰＣ蛋白質
に対する抗体は、いずれの架橋蛋白質も検出できなかったが、一方、ＡＵＦ−１
（別名ｈｎＲＮＰＤ）(Brewer, 1991)に対する抗血清は少量の架橋４０ｋＤａ蛋
白質を沈澱させた（データは提示されていない）。しかしながら、この架橋生成
物は、３４塩基の合成ＡＲＥ競合ＲＮＡの量を増加させたとき競合しなかった（
データは提示されていない）。本システムにおけるこの低レベルの非特異的ＡＵ
Ｆ−１架橋の意義は不明である。ＡＲＥエレメントと特異的に架橋する３０ｋＤ
ａはＨｕＲであると結論した。ＨｕＲは、ＡＲＥ仲介ｍＲＮＡ崩壊で役割を演じ
ると以前に提唱された蛋白質である（Vakaloloupou et al., 1991; Antic & Kee
ne, 1997; Myer et al., 1997)。

【００９６】 次に、架橋したＡＲＥ結合蛋白質の当該エレメントとの相互反応が不安定性を
仲介するために必要であるか否かを決定した。３４塩基のＴＮＦ−αＡＲＥまた
は任意に選択した非ＡＲＥ配列を含む合成リボヌクレオチドを使用した。合成競
合ＲＮＡを量を増加させながらin vitroシステムに添加し、ＲＮＡターンオーバ
ーに対するそれらの影響を評価した。図５Ａで分かるように、ＡＲＥ競合ＲＮＡ
は、４０ｐｍで完全に脱アデニル化および分解を抑制し、一方、非特異的ＲＮＡ
は同様な濃度では全く影響をもたなかった。ＡＲＥ競合ＲＮＡは、ＲＮＡの脱ア
デニル化／分解に対して後者がＡＲＥを含むか否かにかかわらず影響を与えた。
したがってＡＲＥと相互作用することができる因子は脱アデニル化に重要で、多
蛋白質脱アデニル化／分解複合体の一部分であるかもしれない。

【００９７】 合成ＡＲＥ競合ＲＮＡの脱アデニル化を遮断する能力を、このＲＮＡがＡＲＥ
結合蛋白質と基質転写物との相互作用に競合する能力とを比較した。ＥＤＴＡを
架橋アッセイに添加してＲＮＡターンオーバーを抑制し、種々のレベルの競合物
の架橋／標識移転効率に対する影響を評価した。図５Ｂに示したように、全ての
ＡＲＥ結合蛋白質（パネルＣに示すようにゲル電気泳動の前に特異的抗血清を用
いて免疫沈澱させることができるＨｕＲを含む）が、５ｐｍの合成ＲＮＡ競合物
の添加に際してＳＶ−ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡ基質で特異的に競合した。図５Ａに
示すように、５ｐｍの合成ＡＲＥ競合ＲＮＡは、本システムでＲＮＡの脱アデニ
ル化／分解速度に対して評価可能な影響を与えることができなかった。したがっ
て、架橋によって検出できるＡＲＥ結合蛋白質のいずれも、本in vitroシステム
で脱アデニル化／分解に要求されないようである。

【００９８】 ｖ．ＥＬＡＶ蛋白質は本in vitroシステムで脱アデニル化転写物の分解を防止
する 架橋によって我々が検出したＡＲＥ結合蛋白質は脱アデニル化／分解に必要で
あるようにはみえないので、それらは転写物の安定性に役割を果たすのかもしれ
ない。このモデルに一致して、最近のin vitroのデータは、Ｈｅｌ−Ｎ１および
ＨｕＲ蛋白質の過剰発現はＡＲＥ含有転写物を安定化させることができることを
示唆している（Jain et al., 1997; Fan & Stetz, 1998; Peng et al., 1998)。
マウスのリコンビナントＨｕＲ蛋白質を、他のＥＬＡＶ類の蛋白質（Ｈｅｌ−Ｎ
１およびＨｅｌ−Ｎ２（別名ＨｕＢ))と同様にＧＳＴ融合蛋白質として生成し、
これらをin vitro安定性システムに基質ＲＮＡに対して１０：１のモル比で添加
した。同様なデータが３つのリコンビナントＥＬＡＶ類蛋白質の何れかを用いて
得られたが、ｒＨｅｌ−Ｎ１に関するデータのみを示す。図６Ａで分かるように
、ｒＨｅｌ−Ｎ１蛋白質は、本in vitroシステムでＳＶＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡ基
質の脱アデニル化に影響を与えることができなかったが、脱アデニル化中間体を
安定化させた。ＧＳＴ単独またはＲＮＡ（ｈｎＲＮＰＨ'）と結合する別のＧＳ
Ｔ融合蛋白質は、in vitroシステムで転写物の安定性に対して影響をもたなかっ
た（図６Ｂ）。結果として、ＥＬＡＶ類のＲＮＡ結合蛋白質は、分解酵素から脱
アデニル化転写物を保護するために機能すると結論された。

【００９９】 次に、ｒＥＬＡＶ蛋白質がin vitroシステムで脱アデニル化中間体を安定化す
るために、ＲＮＡ基質はＡＲＥを含んでいなければならないのか否かを調べた。
ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡまたは無関係であるが同様なサイズをもちポリアデニル化
されている転写物（ＣＸ−Ａ６０）を、ｒＥＬＡＶ蛋白質の存在下または非存在
下で本in vitroシステムで保温した。図６Ｃで分かるように、ｒＨｅｌ−Ｎ１（
または他のｒＥＬＡＶ蛋白質（データは提示されていない))は、ＡＲＥ結合部位
を含むＲＮＡに由来する脱アデニル化中間体のみを安定化した。したがって、脱
アデニル化中間体のＥＬＡＶ蛋白質による安定化にはＡＲＥが要求される。さら
にまた、ＥＬＡＶ蛋白質は、ＡＲＥの位置が２５０塩基のＳＶＡＲＥ−Ａ６０Ｒ
ＮＡの３'または５'であろうとまたは中央であろうと、脱アデニル化中間体を安
定化させることができる。これらのデータは、ＡＲＥ−ＥＬＡＶ蛋白質複合体は
、単純に転写物の末端を立体的に遮断することによってターンオーバーを防止し
てエキソヌクレアーゼの接近を妨げるのではないことを示唆している。

【０１００】 ここで詳述するのは、新規で有用なin vitroＲＮＡ安定性システムで、これは
哺乳類細胞でのin vivoｍＲＮＡターンオーバーの多くの既知の局面を忠実に再
現する。ＲＮＡ本体の分解が検出可能な中間体を生じることなく極めて速く進行
する処理態様で発生する前に、外因性ＲＮＡ基質は脱アデニル化される。さらに
また、ＲＮＡの脱アデニル化および分解速度は、本システムで配列特異的態様で
ＡＵ富裕エレメントによって調節される。本発明のシステムを用いて、分解工程
を特異的に遮断することによる脱アデニル化転写物の安定性におけるＥＬＡＶ類
のＡＲＥ結合蛋白質の役割を決定することに成功した。これらのデータは、ｍＲ
ＮＡターンオーバーの調節メカニズムのための本システムの価値を明瞭にする。

【０１０１】 本明細書で開示するin vitroシステムは、その有用性を顕著に高める幾つかの
重要な技術的利点を有する。第一に、本システムは再現性が高く、Ｈｅｌａスピ
ンナー細胞の標準的Ｓ１００細胞質抽出物を用いる。実際には、９つのそれぞれ
別個のＳ１００調製物（これらは全てアッセイで同様な態様で機能した）をテス
トした。抽出物間でのただ１つの相違はターンオーバーのキネティクスにあるよ
うである（例えば、図１ＡのＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡのターンオーバーパターンを
図１Ｄで観察されたパターンと比較されたい）。第二に、本抽出物では、非特異
的ヌクレアーゼによるＲＮＡのバックグラウンド分解が最小限である。本システ
ムにおけるこのノイズの無さはその再現性に極めて貢献する。本システムの別の
重要な要素は、基質として外因性のポリアデニル化ＲＮＡを使用するということ
である。この特性は、ＲＮＡ基質調製物の多様性を可能にし、配列操作を可能に
する。第四に、本システムは、翻訳の非存在下でＡＵ富裕エレメントによる配列
特異的調節を示す。総合的に、これらの技術的利点は、本システムをｍＲＮＡタ
ーンオーバーに必要な成分の特定およびｍＲＮＡ安定性調節メカニズムの研究に
おける貴重な試薬とするであろう。

【０１０２】 ポリ（Ａ）競合ＲＮＡの添加は、調節的態様でＲＮＡを効率的に脱アデニル化
し分解するためにＳ１００抽出物を活性化するために要求された。充分な競合物
質が添加され、放射能標識基質ＲＮＡのポリ（Ａ）テールへの７０ｋＤａポリ（
Ａ）結合蛋白質の架橋を実質的に減少させたとき、抽出物は脱アデニル化／分解
について活性化されることがコールドのポリ（Ａ）の力価測定によって明瞭に示
された（データは提示されていない）。

【０１０３】 驚くべきことに、抽出物の脱アデニル化は、＞５００ｎｇのポリ（Ａ）の存在
下でさえも活性を保持していた。ポリヌクレオチドホスホリラーゼで調製された
市販のポリ（Ａ）調製物は、したがって相互作用してデアデニラーゼ酵素を排除
することができないように思われる。これらのデータは、デアデニラーゼ活性は
抽出物中に膨大な量で存在するか、またはその基質と強い親和性をもたない可能
性を示唆している。このことと合わせて、ＡＲＥ含有ＲＮＡの脱アデニル化速度
の増加（図２および３）が、ＡＲＥ競合ＲＮＡのＡＲＥ非含有基質の脱アデニル
化抑制能力と同様に観察された。これらのデータはＡＲＥ結合蛋白質はデアデニ
ラーゼ活性に付随している可能性を示唆している。

【０１０４】 さらにまた、ＨｕＲ蛋白質（普遍的に発現されているＥＬＡＶ類のＲＮＡ結合
蛋白質（Good, 1995; Ma et al., 1996; Myer et al., 1997; Antic & Keene, 1
997)）が、本発明のシステムで主要なＡＲＥ結合因子の１つとして特定された。
また、本発明のシステムを用いて、ＡＵＦ−１（ｈｎＲＮＰＤ）（以前にはin v
itroでのｍＲＮＡ崩壊の調節に必要であると考えられた蛋白質（DeMaria & Brew
er, 1996）との微弱な結合の検出に成功した。したがって、ＡＵＦ−１は、我々
のシステムで転写物の安定性に顕著な役割を果たすとは思えない。ＥＬＡＶ蛋白
質は脱アデニル化／分解に要求されないが、ＡＲＥを含む脱アデニル化ＲＮＡの
安定性にむしろ役割を果たしている（図６）。これらのデータは、脱アデニル化
速度に対するその影響（Chen et al., 1996; Xu et al., 1997）の他に、ＡＲＥ
はｍＲＮＡ本体のターンオーバーの効率に影響を与えることを示唆している。in
vivoの観察（Chen et al., 1995; Peng et al., 1998）はまた、ＡＲＥはｍＲ
ＮＡ分解速度に影響を与えるという結論を支持している。

【０１０５】 したがって、ＥＬＡＶ蛋白質はin vitroでｍＲＮＡの安定性を調節するように
思われ、これはin vivoのトランスフェクション実験と一致する。ＥＬＡＶ類は
４つの構成メンバーを含む。そのうちの３つは組織で発現されるか、または特異
的な発生態様で発現される（以下の文献で概括されている：Antic & Keene, 199
7)。また、組織特異的ＥＬＡＶ蛋白質は細胞質に主に分布し、一方、普遍的なＨ
ｕＲ蛋白質はもっぱら核に存在し、さらに細胞質に再分配される（Atasoy et al
., 1998; Peng et al., 1998; Fan & Steitz, 1998）。弁別的に発現されるＥＬ
ＡＶ蛋白質は核および細胞質の両ＲＮＡの安定性の調節で役割を果たし、それに
よって特定の発生状態での精密な遺伝子発現をチューニングする（Gao & Keene,
1996; Antic & Keene, 1998）。

【０１０６】 図５に示す競合データは、ＡＲＥに結合する因子が、基質ＲＮＡの脱アデニル
化／分解に要求されることを明瞭に示している。競合のキネティクスを基に、こ
れらの因子は、Ｈｕｒのような架橋できるＡＲＥ結合蛋白質よりもはるかに豊富
であるか、またははるかに低い親和性でＡＲＥと相互作用しなければならない。
我々は後者のモデルを好み、これらの因子は、デアデニラーゼおよび分解酵素を
含む多成分複合体の一部であろうと考える。多数の協同的相互作用を介して、こ
れらの弱いＡＲＥ結合成分は、ＡＲＥ含有転写物のデアデニラーゼ／分解複合体
の効率的集合を可能にし、一方、効率は低いがＡＲＥ非含有ＲＮＡでの集合も可
能にするのであろう。本提唱複合体のＲＮＡ結合成分はまた、他の非ＡＲＥ不安
定性エレメントに対する親和性をもつかもしれない（例えば、Peng et al., 199
6)。

【０１０７】 本明細書で述べたＳ１００抽出物の内因性ＨｕＲ蛋白質はＡＲＥ含有ＲＮＡ基
質と架橋することができるという観察（図５）では、ＡＲＥはin vitroアッセイ
で脱安定化エレメントとして機能するということは驚くべきことである。ＨｕＲ
蛋白質はもっぱら核に存在するが、おそらくこの低レベルの蛋白質が我々のシス
テムの細胞質にも存在するのであろう。この低レベルのＨｕＲ蛋白質はおそらく
ＡＲＥとの結合について脱安定化因子と効率的に競合できないのであろう。実際
のところ、低レベルの合成ＡＲＥ競合ＲＮＡの添加によるＨｕＲ蛋白質の排除は
、本in vitroシステムでＡＲＥ含有ＲＮＡのターンオーバー速度の増加をもたら
さない。図５Ａに示すように、競合ＲＮＡの非存在下での本システムでの３０分
後の残存ＳＶＡＲＥ−Ａ６０の量（レーン０）は、アッセイを５ｐｍのＡＲＥ競
合ＲＮＡの存在下で実施（レーン５ｐｍ）したときよりも約２０％多い。したが
っていくつかの事例では調節された脱アデニル化および分解を観るために、Ｓ１
００抽出物でのＨｕＲの排除が必要かもしれない。

【０１０８】 材料と方法 転写の鋳型およびＲＮＡ： ＲＮＡは、表示のように7mＧｐｐｐＧキャップアナローグおよび放射能標識Ｕ
ＴＰまたはＡＴＰの存在下でＳＰ６ポリメラーゼ（Melton et al., 1984)を用い
てin vitro転写によって製造した。全ての転写物は使用前にゲル精製した。もっ
ぱら５'キャップで標識したＲＮＡのためには、転写反応をキャップアナローグ
および放射能標識ヌクレオチドの非存在下で実施した。続いてキャッピングはグ
アニルトランスフェラーゼ（BRL)および放射能標識ＧＴＰを製造元の推奨にした
がって用いて実施した。in vitroシステムで基質として用いた短いＲＮＡの配列
は表１に示されている。

【０１０９】 転写の鋳型は以下のようにして得られた（下記に示す転写鋳型として用いた全
ての合成オリゴヌクレオチドは２４塩基のＳＰ６プロモーターフラグメントをそ
の５'末端に含むことに留意されたい）：Ｇｅｍ−Ａ０ＲＮＡは、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ切断ｐＧｅｍ４（Promega)から作製した。Ｇｅｍ−Ａ６０−１５ＲＮＡは、Ｇ
ｅｍ−Ａ６０ＲＮＡ（下記参照）を作製するために用いたＰＣＲ生成物からＳｓ
ｐＩとのプライマー結合部位を除去することなく作製した。ＡＲＥ−Ａ０のため
の鋳型は、以下の合成オリゴヌクレオチドとその適切な相補物をハイブリダイズ
させて作製した：５'ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＡ
ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡ−３'
（配列番号：１）。ＭＴ−ＡＲＥ−Ａ０ＲＮＡの鋳型は以下の合成オリゴヌクレ
オチドとその適切な相補物をハイブリダイズさせて作製した：５'−ＡＴＴＴＡ
ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＧＴＴＡＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴ
ＴＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＡ−３'（配列番号：２）。Ｆｏｓ−Ａ０
ＲＮＡの鋳型は以下の合成オリゴヌクレオチドとその適切な相補物をハイブリダ
イズさせて作製した：５'−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ
ＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＧＡ
ＴＧＧＡＴＴＣＴＣ−３'（配列番号：３）。ＳＶ−Ａ０ＲＮＡは、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断ｐＳＶＬ−Ｇｅｍ（Wilusz et al., 1988)であった。ＳＶＡＲＥ−Ａ０
ＲＮＡの鋳型は、以下のオリゴヌクレオチドおよびその適切な相補物を含むＴＮ
Ｆ−αＡＲＥをｐＳＶＬ−ＧｅｍのＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間（そ
のＲＮＡの３'末端近くに位置する）に挿入することによって作製した：５'−Ａ
ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡ（配列番
号：４）。ＳＶＡＲＥ−Ａ０ＲＮＡはＨｉｎｄＩＩＩによって直鎖状にしたＤＮ
Ａから転写した。ＧＭ−ＣＳＦ（＋ＡＲＥ）ＲＮＡの鋳型はＥｃｏＲＩ切断ｐＧ
Ｍ−ＣＳＦ（Shaw & Kamen, 1986）であった。ＧＭ−ＣＳＦ（−ＡＲＥ）ＲＮＡ
の鋳型はＮｃｏＩ切断ｐＧＭ−ＣＳＦであった。ＣＸ−Ａ０ＲＮＡの鋳型は以下
の合成オリゴヌクレオチドとその適切な相補物をハイブリダイズさせて作製した
：５'−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＧ
ＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡ
ＣＧ（配列番号：５）。

【０１１０】 競合実験に用いた合成ＲＮＡはＮＪＭＳ分子コア設備（Molecular Core Facil
ity)で製造し、以下の配列を含んでいた：ＡＲＥ： ５７−ＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵ
Ａ（配列番号：６）： 非特異的競合物：５'−ＧＵＣＡＣＧＵＧＵＣＡＣＣ（配列番号：７）。

【０１１１】 転写物へのポリ（Ａ）テールの付加： ６０塩基のポリ（Ａ）テールの鋳型は、最近報告された連結／ＰＣＲプロトコ
ルを用いてＤＮＡ鋳型に付加した（Ford et al., 1997)。簡単に記せば、上記の
全ての鋳型は、ＲＮＡの３'末端を作製するために用いられるＨｉｎｄＩＩＩを
含んでいる。合成オリゴヌクレオチド、５'−ＡＧＣＴＡ₆₀ＴＡＴＴＧＡＧＧＴ
ＧＣＴＣＧＡＧＧＴ（配列番号：８）およびその適切な相補物を作製し、ハイブ
リダイズさせ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＤＮＡ鋳型に連結した。連結生成物をＳＰ６
プロモータープライマー（５'−ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡ
ＴＡＧ（配列番号：９))および連結オリゴヌクレオチドの３'末端に特異的なプ
ライマー（５'−ＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＴＣ（配列番号：１０))を用いて増
幅させた。増幅生成物をセントリコン１００カラムで精製し、ＳｓｐＩで切断し
、ＳＰ６ポリメラーゼにより生成される"Ａ６０"の称号をもつＲＮＡの鋳型とし
て使用した。

【０１１２】 ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Amersham）を用いて転写物に１５０−２００塩基ポ
リ（Ａ）テールを添加した。ＲＮＡを製造元の推奨にしたがって氷上で５−８分
酵素とインキュベートした。反応の後、ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈澱させ、７Ｍ尿素を含む５％アクリルアミドゲルで精製し
てその３'末端に適切な量のポリ（Ａ）をもつＲＮＡを得た。

【０１１３】 Ｓ１００抽出物の製造： 細胞質抽出物は、Dignamら(1983)が記載したとおり１０％ウマ血清補充ＪＭＥ
Ｍで増殖させたＨｅｌａスピンナー細胞から、下記の２つの改変を加えて調製し
た。第一に、１０００００Ｘｇで１時間遠心した後、上清を透析の前に１０％グ
リセロールに調整した。第二に、透析時間を３０分に短縮した。抽出物は−８０
℃に保存した。

【０１１４】 in vitroＲＮＡ脱アデニル化／分解システム： 典型的には、反応当たり約２０００００ｃｐｍ（〜５０ｆｍ）のゲル精製ＲＮ
Ａを用いる。比較実験では、等しいモル量の転写物を用いた。典型的な１４．２
５μｌ反応混合物は以下を含んでいた：３．２５μｌの１０％ポリビニルアルコ
ール、１μｌの１２．５ｍＭのＡＴＰ／２５０ｍＭのホスホクレアチン混合物、
１μｌの５００ｎｇ／μｌポリ（Ａ）（Pharmacia)、１μｌのＲＮＡおよび８μ
ｌの透析抽出物。表示した時間反応物を３０℃で保温し、４００μｌの停止緩衝
液（４００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、０．１％
ＳＤＳ）の添加によって反応を停止させた。反応混合物をフェノールで抽出し、
エタノールで沈澱させ、７モル尿素を含む５％アクリルアミドゲルで分析した。
全ての定量は、モリキュラー＝ダイナミクス＝ホスファーイメージャー（Molecu
lar Dynamics Phosphorimager)を用いて実施した。

【０１１５】 リコンビナントＥＬＡＶ蛋白質（ＨｕＲ、Ｈｅｌ−Ｎ１およびＨｅｌ−Ｎ２）
をＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で作製し、グルタチオン−セファロースアフィ
ニティークロマトグラフィーで製造元の推奨にしたがって精製した（Levine et
al., 1993)。

【０１１６】 リボヌクレアーゼＨによる消化： ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡ（Ａ残基を放射能標識）を表示した時間in vitro安定性
システムで保温した。ＲＮＡ生成物をフェノール抽出し、エタノール沈澱で濃縮
した。サンプルを以下を含む３０μｌの最終容積に再懸濁した：２０ｍＭトリス
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤ
ＴＴ、１００ピコモルのアンチセンスオリゴヌクレオチド（５'−ＡＧＴＴＡＡ
ＡＴＡＡＡＴ（配列番号：１１))、および１単位のリボヌクレアーゼＨ。反応物
を３７℃で３０分保温し、生成物を７モル尿素含有５％アクリルアミドゲルで分
析した。

【０１１７】 ＵＶ架橋および免疫沈澱： ＵＶ架橋／標識移転実験は、シルバニアＧ１５Ｔ８殺菌灯を用いて以前に報告
されたように実施した（Wilusz & Shenk, 1988）。架橋実験は、ＲＮＡターンオ
ーバーを抑制し、サンプル間の正確な比較を可能にするために２５ｍＭのＥＤＴ
Ａの存在下で実施した。リボヌクレアーゼＡ、Ｔ１およびＴ２で消化した後、架
橋蛋白質をＳＤＳ含有１０％アクリルアミドゲルで分析した。

【０１１８】 ＵＶ架橋およびリボヌクレアーゼ処理の後の免疫沈澱分析のために、３００μ
ｌのＲＩＰＡ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ。１％ＮＰ−４０、０．５％デオキ
シコレート、０．１％ＳＤＳおよび５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６))をサン
プルに添加した。微量遠心装置で簡単に遠心した後、予備清澄化したサンプルを
抗体とともに氷上で１時間インキュベートした。抗原−抗体複合体は、ホルマリ
ン固定し、洗浄したプロテインＡ陽性黄色ブドウ球菌（S. aureus)細胞を用いて
採集し、ＲＩＰＡ緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳ含有１０％アクリルアミドゲルで
分析した。ＧＲＳＦ（Qian & Wilusz, 1994)およびｈｎＲＮＰＡ１（Wilusz & S
henk, 1990）に特異的な抗体については以前に報告された。ＨｕＲに特異的なウ
サギのポリクローナル抗体の製造および性状は他で報告されるであろう（Atasoy
et al., 1998)。

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【０１２５】 Peng, S.-Y., Chen, C.-Y.A., Xu, N., and Shyu, A.-B. 1998. RNA stabilizat
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【０１２７】 Wilusz, J., and Shenk, T. 1990. A uridylate tract mediates efficient het
erogeneous nuclear ribonucleoprotein C protein-RNA cross-linking and fun
ctionally substitutes for the downstream element of the polyadenylation
signal. Mol. Cell. Biol. 10 6397-6407. Wormington, M., Searfoss, A.M., and Hurney, C.A. 1996. Overexpression of
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ol. Cell. Biol. 15: 2219-2230.

【０１２８】 本発明は、ここで述べた特定の実施態様の範囲に限定されない。実際のところ
、ここで詳述した実施態様の他に本発明の多様な変形が、前述の記載および貼付
の図面を参考に当業者には明らかであろう。そのような改変は添付の請求の範囲
に包含されるものである。 さらにまた、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズま
たはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は概数で説明のため
に提供される。 本明細書で引用される種々の文献は参照により本明細書に含まれる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−Ｄ：細胞質Ｓ１００抽出物へのポリ（Ａ）の添加は特異的なデアデニ
ラーゼおよび分解活性を賦活する。パネルＡ：ポリ（Ａ）競合ＲＮＡは抽出物中
の核酸分解活性を賦活する。６０塩基のポリ（Ａ）テールを含むキャップ構造を
もつ放射能標識５４塩基ＲＮＡ（Ｇｅｍ−Ａ６０）を、５００ｎｇのコールドの
ポリ（Ａ）ＲＮＡの非存在下（Ｓ１００のマークをもつレーン）または存在下（
Ｓ１００＋ポリ（Ａ）のマークをもつレーン）で表示した時間、実施例１の材料
と方法で述べたように３０℃でＳ１００とともに保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ
尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化された５４塩基の転
写物（Ｇｅｍ−Ａ０）の位置は右側に表示されている。パネルＢ：投入転写物の
短縮は、３'から５'方向のエキソヌクレアーゼによるものである。もっぱら５'
キャップを標識したＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡを表示した時間in vitroｍＲＮＡ安定
性システムで保温した。反応生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分
析した。脱アデニル化５４塩基転写物（Ｇｅｍ−Ａ０）の位置は右側に表示され
ている。パネルＣ：また別のアプローチによって、投入転写物の短縮は、３'か
ら５'方向のエキソヌクレアーゼによるものであることが明らかにされた。Ａ残
基で放射能標識されたＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡを表示した時間in vitro安定性シス
テムで保温した。反応生成物をＤＮＡオリゴとハイブリダイズし、リボヌクレア
ーゼＨを用いて５'および３'フラグメントに切断した。フラグメントを７Ｍ尿素
含有５％アクリルアミドゲルで分析した。パネルＤ：３'から５'方向のエキソヌ
クレアーゼ活性は特異的なデアデニラーゼである。Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡ、およ
びポリ（Ａ）の鎖の後に余分な１８ヌクレオチドを含む変種（Ｇｅｍ−Ａ６０−
１５）を表示した時間in vitro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ
尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化５４塩基転写物（Ｇ
ｅｍ−Ａ０）の位置は左側に表示されている。投入Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡの３１
±１１．０％が３０分で脱アデニル化／分解された。

【図２】 図２Ａ−Ｅ：in vitroシステムでの転写物分解速度は、ＡＵ富裕不安定性エレ
メントによって配列特異的態様で調節される。パネルＡ：ＡＵ富裕エレメントは
、in vitroシステムで劇的にターンオーバー速度を速める。Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮ
Ａまたは、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの３４塩基ＡＵ富裕エレメントを含むポリアデニ
ル化転写物を表示した時間in vitro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を
７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化転写物（Ｇｅｍ
−Ａ０およびＡＲＥ−Ａ０）の位置が表示されている。ＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡは
Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡよりも６．６±０．４倍速く脱アデニル化／分解された。
パネルＢ：ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡのＡＵ富裕エレメントはまた、in vitroで不安定
性エレメントとして機能する。Ｇｅｍ−Ａ６０ＲＮＡまたは、ｃ−ｆｏｓｍＲＮ
Ａの７２塩基ＡＵ富裕エレメントを含む転写物を表示した時間in vitro安定性シ
ステムで保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析
した。脱アデニル化転写物（Ｇｅｍ−Ａ０およびＦｏｓ−Ａ０）の位置が表示さ
れている。Ｆｏｓ−Ａ６０ＲＮＡはＧｅｍ−Ａ６０ＲＮＡよりも３．５±０．３
倍速く脱アデニル化／分解された。パネルＣ：in vitroシステムで転写物の不安
定性を仲介するＡＵ富裕エレメントの能力は配列特異的である。ＡＲＥ−Ａ６０
ＲＮＡまたは、４番目の位置毎に変異を含む変種（ｍｔＡＲＥ−Ａ６０：材料と
方法参照）を表示した時間in vitro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を
７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化転写物（ＡＲＥ
−Ａ０およびｍｔＡＲＥ−Ａ０）の位置が表示されている。ＡＲＥでの変異は、
野性型ＡＲＥ−Ａ６０の転写物と比較して脱アデニル化／分解速度を３．７±１
．４倍低下させた。パネルＤ：ＴＮＦ−αＡＵ富裕エレメントは異種系で不安定
性を仲介する。ＳＶ後期転写単位に由来するポリアデニル化２５０塩基ＲＮＡ（
ＳＶ−Ａ６０）、またはＴＮＦ−αｍＲＮＡの３４塩基ＡＵ富裕エレメントを含
む変種（ＳＶＡＲＥ−Ａ６０）を表示した時間in vitro安定性システムで保温し
た。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニ
ル化転写物（ＳＶ−Ａ０およびＳＶＡＲＥ−Ａ０）の位置が表示されている。Ｓ
ＶＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡは、ＳＶ−Ａ６０ＲＮＡよりも３．５±０．７倍速く脱
アデニル化／分解された。パネルＥ：ＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡ由来ＡＵ富裕エレメ
ントは、ほぼ完全長のＲＮＡ基質にin vitroで機能する。ＡＵ富裕エレメントを
含むＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡのほぼ完全長型（ＧＭ−ＣＳＦ（＋ＡＲＥ))、または
ＡＵ富裕エレメントを欠く型（ＧＭ−ＣＳＦ（−ＡＲＥ))を表示した時間in vit
ro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミド
ゲルで分析した。ＧＭ−ＣＳＦ（＋ＡＲＥ）は、ＧＭ−ＣＳＦ（−ＡＲＥ）より
も２．８±０．２倍速く脱アデニル化／分解された。

【図３】 図３Ａ−Ｂ：脱アデニル化はin vitroでＡＴＰの非存在下で生じ、ＡＵ富裕エ
レメントによって調節される。パネルＡ：分解はＡＴＰを要求するが、脱アデニ
ル化は要求しない。ＳＶ−ＡＲＥ−Ａ６０をＡＴＰの存在下((＋）ＡＴＰレーン
）または非存在下((−）ＡＴＰレーン）で表示した時間in vitro安定性システム
で保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。
脱アデニル化転写物（ＳＶＡＲＥ−Ａ０）の位置が表示されている。パネルＢ：
ＡＵ富裕エレメントは、生理学的な長さのポリ（Ａ）テールをもつＲＮＡ基質で
脱アデニル化速度を調節する。ＳＶＲＮＡまたはＳＶ−ＡＲＥＲＮＡ（ＡＵ富裕
エレメントを含む）を酵母のポリ（Ａ）ポリメラーゼでポリアデニル化し、約１
５０−２００塩基のテールを含むものをゲル精製した。これらのＲＮＡ（ＳＶ（
Ａ１５０−２００）およびＳＶＡＲＥ（Ａ１５０−２００))を表示した時間in v
itro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミ
ドゲルで分析した。脱アデニル化転写物（ＳＶ−Ａ０およびＳＶＡＲＥ−Ａ０）
の位置が表示されている。ＳＶＡＲＥ（Ａ１５０−２００）ＲＮＡは、ＳＶ（Ａ
１５０−２００）転写物より２．２＋０．３％倍速く脱アデニル化された。

【図４】 図４Ａ−Ｂ：ＥＬＡＶ類のＨｕＲ蛋白質は、in vitroシステムでＴＮＦ−αの
ＡＵ富裕エレメントに特異的に結合する。パネルＡ：２つの蛋白質がＴＮＦ−α
のＡＵ富裕エレメントと特異的に相互作用する。Ｇｅｍ−Ａ６０およびＡＲＥ−
Ａ６０ＲＮＡのＵ残基を放射能標識し、ＥＤＴＡの存在下で（分解を阻止し、正
確な比較を可能にするため）in vitroシステムで５分間保温した。反応混合物に
ＵＶ光を照射し、リボヌクレアーゼＡで切断し、蛋白質−ＲＮＡ複合体をＳＤＳ
含有１０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。右側に表示した架橋蛋白質のお
およそのサイズは分子量マーカーから推定された。パネルＢ：３０ｋＤａ蛋白質
はＨｕＲである。放射能標識ＡＲＥ−６０ＲＮＡをin vitroＲＮＡ安定性システ
ムで保温し、上記のように結合蛋白質と架橋させた。ＳＤＳ含有１０％アクリル
アミドゲルでの分析の前に、表示した抗血清を用いて架橋蛋白質を免疫沈澱させ
た。インプットと記したレーンは、免疫沈澱分析前の総架橋蛋白質を示す。

【図５】 図５Ａ−Ｃ：ＡＵ富裕エレメント結合因子がＲＮＡの脱アデニル化および分解
に重要であるが、一方、ＨｕＲ蛋白質のＡＵ富裕エレメントとの結合は、ＡＵ富
裕エレメント仲介転写物不安定性と連携していない。パネルＡ：競合分析は、Ａ
Ｕ富裕エレメント結合因子は転写物の脱アデニル化および分解に必要であること
を示唆する。ＴＮＦ−αのＡＵ富裕エレメント（ＡＲＥ競合物質（comp))または
非特異的配列を含む表示量の合成ＲＮＡ競合物質の存在下で、ＳＶＡＲＥ−Ａ６
０ＲＮＡを３０分in vitro安定性システムで保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素
含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化ＳＶＡＲＥ−Ａ０ＲＮＡ
の位置が表示されている。パネルＢ：反応混合物はパネルＡで述べたように調製
し、ＲＮＡのターンオーバーを抑制するためにＥＤＴＡを添加した。蛋白質−Ｒ
ＮＡの相互作用はＵＶ架橋分析で分析し、ＳＤＳ含有１０％ポリアクリルアミド
ゲルで分析した。ＡＵ富裕エレメント特異的架橋種の位置は左側に表示されてい
る。パネルＣ：反応物はパネルＢについて述べたとおりに調製したが、ただしサ
ンプルはＨｕＲ特異的抗血清でゲル電気泳動前に免疫沈澱させた。

【図６】 図６Ａ−Ｄ：ＥＬＡＶ蛋白質は、in vitroシステムで特異的に脱アデニル化中
間体を安定化させる。パネルＡ：１μｇのリコンビナントＨｅｌ−Ｎ１蛋白質の
存在下（レーン：（＋）Ｈｅｌ−Ｎ１))または非存在下（レーン：（−）Ｈｅｌ
−Ｎ１))で、ＳＶＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡをin vitroシステムで保温した。ＲＮＡ
生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱アデニル化ＳＶＡ
ＲＥ−Ａ０転写物の位置が表示されている。パネルＢ：１μｇのリコンビナント
Ｈｅｌ−Ｎ１蛋白質（レーン：（＋）Ｈｅｌ−Ｎ１))、ＧＳＴのみ（レーン：（
＋）ＧＳＴ）または無関係のＲＮＡ結合蛋白質ｈｎＲＮＰＨ'（レーン：（＋）
ｈｎＲＮＰＨ'）の存在下で、ＳＶＡＲＥ−Ａ６０ＲＮＡをin vitroシステムで
保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。脱
アデニル化転写物の位置が表示されている。パネルＣ：〜１ｕｇのＨｅｌ−Ｎ２
蛋白質の存在下（＋レーン）または非存在下（−レーン）で、ＡＲＥ−Ａ６０Ｒ
ＮＡ、またはＡＵ富裕エレメントを欠く無関係の転写物（ＣＸ−Ａ６０）をin v
itroシステムで３０分保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ尿素含有５％アクリルアミ
ドゲルで分析した。脱アデニル化転写物の位置が表示されている。パネルＤ：転
写物の５'部分にＴＮＦ−αＡＲＥを含むＳＶ−Ａ６０ＲＮＡの変種（ＳＶ５'Ａ
ＧＥ−Ａ６０）を、１ｕｇのＨｅｌ−Ｎ２蛋白質の非存在下（−レーン）または
存在下（＋レーン）でin vitroシステムで５０分保温した。ＲＮＡ生成物を７Ｍ
尿素含有５％アクリルアミドゲルで分析した。インプットおよび脱アデニル化転
写物の位置が表示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 フォード ランス ピー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07016 クランフォード サウス ユニオ ン アベニュー 30 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA21 CA11 DA02 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ52 QR32 QR42 QR77 QR80 QS08 QS20 4B064 AF27 AG01 CA10 CA19 CC24 DA13

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞抽出物および予め選択された標的ＲＮＡ配列を含む、外
   因的に添加された前記標的ＲＮＡ配列の調節されたＲＮＡターンオーバーを再現
   することができるin vitroシステム。
2. 【請求項２】 前記調節下にあるＲＮＡターンオーバーが、ＡＵ富裕エレメ
   ント調節ＲＮＡターンオーバーおよびＣ富裕エレメント調節ターンオーバーから
   成る群から選ばれる請求項１のシステム。
3. 【請求項３】 前記細胞抽出物が溶解させた真核細胞または組織から単離さ
   れる請求項１のシステム。
4. 【請求項４】 前記細胞抽出物が、ＨｅＬａ細胞およびＴ細胞株から成る群
   から選ばれる細胞株から単離される請求項３のシステム。
5. 【請求項５】 前記細胞抽出物が外来核酸を含む細胞から調製される請求項
   １のシステム。
6. 【請求項６】 前記細胞抽出物が、感染細胞、安定にトランスフェクトされ
   た細胞または一過性にトランスフェクトされた細胞から調製される請求項１のシ
   ステム。
7. 【請求項７】 前記細胞抽出物が部分的に精製される請求項１のシステム。
8. 【請求項８】 前記細胞抽出物でポリアデニレートと結合する蛋白質の活性
   が枯渇されている請求項１のシステム。
9. 【請求項９】 ポリアデニレート結合蛋白質の活性が枯渇された前記細胞抽
   出物が、以下から成る群から選ばれる方法で調製される請求項８のシステム： （ａ）ポリアデニレート競合ＲＮＡの前記システムへの添加； （ｂ）ポリアデニレート結合蛋白質の除去； （ｃ）ポリアデニレート結合蛋白質を不活化するプロテイナーゼの添加；および
   （ｄ）ポリアデニレートとポリアデニレートに結合する内因性巨大分子との間の
   相互作用を妨げる物質の添加。
10. 【請求項１０】 前記のポリアデニレートと結合する蛋白質の除去が、ポリ
    アデニレート結合蛋白質に対する抗体、ポリアデニレートおよびその組合せから
    成る群から選ばれる物質で前記細胞抽出物を処理することによって達成される請
    求項９のシステム。
11. 【請求項１１】 前記物質がマトリックスに結合されている請求項１０のシ
    ステム。
12. 【請求項１２】 前記標的ＲＮＡ配列が、合成ＲＮＡ、天然に存在するＲＮ
    Ａ、メッセンジャーＲＮＡ、化学的に改変されたＲＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡ誘
    導体の群から選ばれる請求項１のシステム。
13. 【請求項１３】 前記標的ＲＮＡ配列が５'キャップおよび３'ポリアデニレ
    ート配列を含む請求項１２のシステム。
14. 【請求項１４】 前記標的ＲＮＡ配列が、非標識標的ＲＮＡ配列、標識標的
    ＲＮＡ配列、およびその組合せから成る群から選ばれる請求項１のシステム。
15. 【請求項１５】 前記標識標的ＲＮＡ配列が、蛍光性成分、可視性成分、放
    射性成分、リガンドおよび蛍光成分と消光成分の組合せから成る群から選ばれる
    成分で標識される請求項１４のシステム。
16. 【請求項１６】 さらに外因的に添加されたヌクレオチド三燐酸を含む請求
    項１のシステム。
17. 【請求項１７】 前記ヌクレオチド三燐酸がＡＴＰである請求項１６のシス
    テム。
18. 【請求項１８】 さらに反応強化物質を含む請求項１のシステム。
19. 【請求項１９】 前記反応強化物質が、ポリビニルアルコール、ポリビニル
    ピロリドンおよびデキストランから成る群から選ばれる請求項１８のシステム。
20. 【請求項２０】 前記反応強化物質がポリビニルアルコールである請求項１
    ９のシステム。
21. 【請求項２１】 以下の（Ａ）−（Ｄ）を含む、標的ＲＮＡ配列の安定性を
    調節することができる物質を特定する方法： （Ａ）請求項１のシステムを提供し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し； （Ｃ）前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度を決定し；さらに （Ｄ）前記ターンオーバーの程度を調節することができる物質を前記標的ＲＮＡ
    配列の安定性を調節することができる物質と特定する。
22. 【請求項２２】 前記システムが、さらにヌクレオチド三燐酸を含む請求項
    ２１の方法。
23. 【請求項２３】 前記ヌクレオチド三燐酸が、ＡＴＰである請求項２２の方
    法。
24. 【請求項２４】 前記物質が、ＲＮＡ安定性改変分子である請求項２１の方
    法。
25. 【請求項２５】 前記標的ＲＮＡ配列が、非標識標的ＲＮＡ配列、標識標的
    ＲＮＡ配列、およびその組合せから成る群から選ばれる請求項２１の方法。
26. 【請求項２６】 前記標識ＲＮＡ配列が、蛍光性成分、可視性成分、放射性
    成分、リガンドおよび蛍光成分と消光成分の組合せから成る群から選ばれる成分
    で標識される請求項２５の方法。
27. 【請求項２７】 前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度についての前
    記モニターが、前記標的ＲＮＡの分解の程度を測定することを含む請求項２１の
    方法。
28. 【請求項２８】 前記標的ＲＮＡ配列の安定性の調節が前記標的ＲＮＡ配列
    の安定性を増加させることである請求項２１の方法。
29. 【請求項２９】 前記標的ＲＮＡ配列の安定性の調節が前記標的ＲＮＡ配列
    の安定性を低下させることである請求項２１の方法。
30. 【請求項３０】 前記物質が、ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質またはＣ富裕
    エレメント結合蛋白質の活性を調節することができる請求項２１の方法。
31. 【請求項３１】 前記ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質が、ＥＬＡＶ蛋白質類
    に属するもの；ＡＵＦ１；トリステトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩＡ；ＴＩＡＲ；グ
    リセルアルデヒド−３−ホスフェート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲＮＰＡ１；ＡＵ−
    Ａ；およびＡＵ−Ｂから成る群から選ばれる請求項３０の方法。
32. 【請求項３２】 前記ＥＬＡＶ蛋白質類に属するものがＨｕＲ、Ｈｅｌ−Ｎ
    １、ＨｕＣおよびＨｕＤから成る群から選ばれる請求項３１の方法。
33. 【請求項３３】 以下の（ａ）−（ｅ）を含む、外因的に添加されたＲＮＡ
    安定性改変物質の存在下で標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することができる物質
    を特定する方法： （ａ）請求項１のシステムを提供し； （ｂ）前記システムに前記ＲＮＡ安定性改変物質を導入し； （ｃ）前記システムに前記物質を導入し； （ｄ）前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度を決定し；さらに （ｅ）前記ターンオーバーの程度を調節することができる物質を、前記外因的に
    添加されたＲＮＡ安定性改変物質の存在下で前記標的ＲＮＡ配列の安定性を調節
    することができる物質と特定する。
34. 【請求項３４】 前記システムがさらにヌクレオチド三燐酸を含む請求項３
    ３の方法。
35. 【請求項３５】 前記ヌクレオチド三燐酸が、ＡＴＰである請求項３４の方
    法。
36. 【請求項３６】 前記標的ＲＮＡ配列が、非標識標的ＲＮＡ配列、標識標的
    ＲＮＡ配列、およびその組合せから成る群から選ばれる請求項３３の方法。
37. 【請求項３７】 前記標識ＲＮＡ配列が、蛍光性成分、可視性成分、放射性
    成分、リガンドおよび蛍光成分と消光成分の組合せから成る群から選ばれる成分
    で標識される請求項３６の方法。
38. 【請求項３８】 前記標的ＲＮＡ配列のターンオーバーの程度の測定が前記
    標識標的ＲＮＡの分解の程度の測定を含む請求項３３の方法。
39. 【請求項３９】 前記ＲＮＡ安定性改変物質が前記標的ＲＮＡ配列の安定性
    を高める請求項３３の方法。
40. 【請求項４０】 前記物質が、前記ＲＮＡ安定性改変物質によって高められ
    た前記標的ＲＮＡ配列の安定性を低下させる請求項３９の方法。
41. 【請求項４１】 前記ＲＮＡ安定性改変物質が前記標的ＲＮＡ配列の安定性
    を低下させる請求項３３の方法。
42. 【請求項４２】 前記物質が、前記ＲＮＡ安定性改変物質によって低下した
    前記標的ＲＮＡ配列の安定性を高める請求項４１の方法。
43. 【請求項４３】 前記物質が、ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質またはＣ富裕
    エレメント結合蛋白質の活性を調節することができる請求項３３の方法。
44. 【請求項４４】 前記ＡＵ富裕エレメント結合蛋白質が、ＥＬＡＶ蛋白質類
    に属するもの；ＡＵＦ１；トリステトラポリン；ＡＵＨ；ＴＩＡ；ＴＩＡＲ；グ
    リセルアルデヒド−３−ホスフェート；ｈｎＲＮＰＣ；ｈｎＲＮＰＡ１；ＡＵ−
    Ａ；およびＡＵ−Ｂから成る群から選ばれる請求項４３の方法。
45. 【請求項４５】 前記ＥＬＡＶ蛋白質類に属するものがＨｕＲ、Ｈｅｌ−Ｎ
    １、ＨｕＣおよびＨｕＤから成る群から選ばれる請求項４４の方法。
46. 【請求項４６】 以下の（Ａ）−（Ｄ）を含む、標的ＲＮＡ配列の脱アデニ
    ル化を調節することができる物質を特定する方法： （Ａ）ヌクレオチド三燐酸の非存在下で請求項１のシステムを提供し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し； （Ｃ）前記システムで前記標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化をモニターし；さらに
    （Ｄ）前記脱アデニル化の程度を調節することができる物質を前記標的ＲＮＡ配
    列の脱アデニル化を調節することができる物質と特定する。
47. 【請求項４７】 以下の（Ａ）−（Ｄ）を含む、標的ＲＮＡ配列の脱アデニ
    ル化および分解を調節することができる物質を特定する方法： （Ａ）ヌクレオチド三燐酸の存在下で請求項１のシステムを提供し； （Ｂ）前記システムに前記物質を導入し； （Ｃ）前記システムで前記標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および分解をモニター
    し、さらに （Ｄ）前記脱アデニル化および分解の程度を調節することができる物質を、前記
    標的ＲＮＡ配列の脱アデニル化および分解を調節することができる物質と特定す
    る。
48. 【請求項４８】 哺乳類で細胞増殖および細胞分化を調節することができる
    物質を特定する方法であって、前記方法が、請求項１９にしたがって細胞増殖ま
    たは分化の調節に必要な標的ＲＮＡ配列の安定性を調節することができる前記物
    質の能力を測定することを含む前記物質の特定方法。
49. 【請求項４９】 細胞増殖または細胞分化を調節することができる前記物質
    が細胞の形質転換を調整する請求項４８の方法。
50. 【請求項５０】 細胞増殖または細胞分化を調節することができる前記物質
    が免疫失調を調整する請求項４８の方法。
51. 【請求項５１】 以下の（Ａ）−（Ｄ）を含む、ＲＮＡの脱アデニル化もし
    くは分解またはその調節に参画すると思われる内因性分子を特定し、性状を決定
    し、または単離する方法： （Ａ）請求項１のシステムを提供し； （Ｂ）前記システムにＲＮＡターンオーバーの調節に参画すると思われる前記蛋
    白質を導入し； （Ｃ）前記システムで前記標的ＲＮＡ配列の安定性をモニターし、さらに （Ｄ）ＲＮＡの脱アデニル化もしくは分解またはその調節に参画することができ
    る前記内因性分子を特定し、性状を決定し、または単離する。
52. 【請求項５２】 ＲＮＡの脱アデニル化もしくは分解またはその調節に参画
    すると思われる前記分子が蛋白質またはＲＮＡである請求項５１の方法。
53. 【請求項５３】 以下の（ａ）−（ｃ）を含む、調節下にあるＲＮＡターン
    オーバーを再現することができる条件下で予め選択したＲＮＡ配列の安定性をモ
    ニターするキット： （ａ）ポリアデニレート結合蛋白質活性が枯渇されている細胞抽出物； （ｂ）他の試薬；および （ｃ）前記キットの使用指示。
54. 【請求項５４】 さらにヌクレオチド三燐酸、反応強化物質、標的ＲＮＡ配
    列またはその組合せを含む請求項５３のキット。
55. 【請求項５５】 以下の（Ａ）−（Ｃ）を含む、脱アデニル化のない状態で
    標的ＲＮＡ配列の分解を調節することができる物質を特定する方法： （Ａ）ヌクレオチド三燐酸の存在下で細胞抽出物を提供し； （Ｂ）前記細胞抽出物に前記物質を導入し； （Ｃ）前記抽出物で前記標的ＲＮＡ配列の分解をモニターする。