CN115461458A - 核酸扩增的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于扩增和检测核酸样品中特定核酸的方法。该方法可包括在荧光探针和探针补体存在下扩增靶核酸并检测该靶核酸。本文还描述了用于检测背景荧光降低的特定核酸序列的探针补体。

Description

核酸扩增的组合物和方法

交叉引用

本申请要求于2019年12月10日提交的美国临时申请号62/946,371的优先权，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

荧光探针通常用于检测特定的核酸序列。荧光核酸探针，如荧光水解型探针，已广泛用于实时PCR和数字PCR测定中。荧光探针，包括水解型探针，会发出背景荧光，这可能妨碍可靠的数据收集，特别是在三维样品中，包括较厚样品或具有较大深度的样品。需要背景荧光降低的荧光探针来对样品进行三维成像。

发明内容

在各个方面，本公开内容提供了一种扩增样品中核酸分子的方法，包括：使生物样品中的核酸分子与聚合酶、包含与靶基因序列退火的第一探针核酸的第一荧光探针和包含与第一探针核酸退火的第一互补核酸的第一探针补体接触；以及扩增核酸分子以形成扩增分子群体。

在一些方面，方法还包括对扩增分子群体进行成像。在一些方面，方法还包括对该成像进行分析。在一些方面，该成像是光片(light sheet)成像。在一些方面，该分析包括评估扩增分子群体中的荧光。在一些方面，第一互补核酸的序列缺少成串鸟嘌呤。在一些方面，该成串鸟嘌呤是该序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

在各个方面，本公开内容提供了一种用于确定靶基因序列在核酸分子群体中的比例的方法，包括：稀释来自样品的核酸分子群体以形成包含多个测定样品的集合；扩增测定样品内的核酸分子以在该集合的测定样品中形成扩增分子群体；分析该集合的测定样品中的扩增分子以确定包含靶基因序列的测定样品的第一数量和包含参考基因序列的测定样品的第二数量；将第一数量与第二数量进行比较，以确定反映样品组成的比例。

在一些方面，约10％的多个测定样品包含零个或一个核酸分子。在一些方面，分析扩增分子包括对扩增分子进行荧光成像。在一些方面，该方法包括添加包含与靶基因序列退火的第一探针核酸的第一荧光探针、包含与参考基因序列退火的第二探针核酸的第二荧光探针、包含与第一探针核酸退火的第一互补核酸的第一探针补体、以及包含与第二探针核酸退火的第二互补核酸的第二探针补体。在一些方面，对扩增分子进行成像包括光片成像。在一些方面，第一探针互补核酸的序列、第二探针互补核酸的序列或两者都缺少成串鸟嘌呤。在一些方面，该成串鸟嘌呤是至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

在各个方面，本公开内容提供了一种用于在核酸扩增测定中降低背景荧光的方法，该方法包括使样品与以下物质接触：荧光探针，该荧光探针包含与探针核酸缀合的荧光部分，其中将该探针核酸配置为与靶核酸退火；探针补体，该探针补体包含与互补核酸缀合的猝灭部分，其中该互补核酸与该探针核酸的区域基本上互补，并且其中该猝灭部分具有与该荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱；以及核酸聚合酶，当探针核酸与靶核酸退火时，该核酸聚合酶能够水解该探针核酸。

在一些方面，探针核酸的区域是该探针核酸的全长。在一些方面，探针核酸的区域小于该探针核酸的全长。在一些方面，互补核酸与探针核酸的区域完全互补。在一些方面，互补核酸包含至少一个相对于探针核酸的区域的碱基对错配。在一些方面，互补核酸的猝灭部分靠近探针核酸的荧光部分。在一些方面，靠近是互补核酸的猝灭部分距离探针核酸的荧光部分5个或更少的核苷酸碱基。在一些方面，靠近是互补核酸的猝灭部分与探针核酸的荧光部分相对。在一些方面，靠近是互补核酸的猝灭部分距离探针核酸的荧光部分1个核苷酸碱基。

在一些方面，互补核酸和探针核酸的区域的解链温度为30℃至60℃。在一些方面，互补核酸在约20℃至约25℃的温度下与探针核酸退火。在一些方面，互补核酸和探针核酸的区域的解链温度低于探针核酸和靶核酸的解链温度。在一些方面，当互补核酸与探针核酸退火时，猝灭部分猝灭荧光部分。在一些方面，互补核酸缺少成串鸟嘌呤。在一些方面，该成串鸟嘌呤是序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

在各个方面，本公开内容提供了一种探针补体，其包含与互补核酸缀合的猝灭部分，其中该猝灭部分具有与荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱，并且其中该互补核酸与缀合到荧光部分的探针核酸基本上互补。

在一些方面，探针核酸的区域是该探针核酸的全长。在一些方面，探针核酸的区域小于该探针核酸的全长。在一些方面，互补核酸与探针核酸的区域完全互补。在一些方面，互补核酸包含至少一个相对于探针核酸的区域的碱基对错配。在一些方面，互补核酸和探针核酸的区域的解链温度为30℃至60℃。在一些方面，互补核酸在约20℃至约25℃的温度下与探针核酸退火。在一些方面，当互补核酸与探针核酸退火时，猝灭部分猝灭荧光部分。在一些方面，探针补体的序列缺少成串鸟嘌呤。在一些方面，该成串鸟嘌呤是序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就如同明确且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入一样。

附图说明

专利或申请文件中包含至少一幅彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将会在应请求和缴纳必要费用后由专利局提供。在所附权利要求书中具体阐述了本公开内容的新颖性特征。通过参考以下阐述说明性实施方案(其中利用了本公开内容的原理)的详细描述和附图，将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，在附图中：

图1示出了用荧光探针标记的荧光液滴的三维样品的横截面荧光图像，该荧光探针包含用于数字聚合酶链反应的具有5'荧光团和3'猝灭剂的核酸。在每个试管中的液滴中进行数字聚合酶链反应(dPCR)，并使用光片成像进行成像。图1A示出了使用第一示例性荧光探针进行成像的试管的两个代表性横截面。图1B示出了使用第二示例性荧光探针进行成像的试管的两个代表性横截面。两种示例性荧光探针均显示出背景荧光，但是图1A中的第一示例性荧光探针的背景荧光低于图1B中的第二示例性荧光探针。

图2示出了示例性探针补体(“cProbe”)配置的示意图。该cProbe包含3'猝灭剂并与包含核酸和荧光团的荧光探针退火。任选地，荧光探针在与荧光团相对的核酸另一末端处包含猝灭剂。图2A示出了一种包含3'猝灭剂和核酸序列的cProbe配置，该核酸序列除错配外与荧光探针核酸互补。cProbe与荧光探针的退火使cProbe 3'猝灭剂紧密靠近荧光探针的5'荧光团，导致荧光探针5'荧光团的荧光发射猝灭。图2B示出了一种包含3'猝灭剂和核酸序列的cProbe配置，该核酸序列与荧光探针核酸的5'区片段互补。cProbe与荧光探针的退火使cProbe的3'猝灭剂紧密靠近荧光探针的5'荧光团，导致荧光探针5'荧光团的荧光发射猝灭。

图3示出了用荧光探针标记的荧光液滴的三维样品的横截面荧光图像，该荧光探针包含具有5'荧光团和3'猝灭剂的核酸。在每个试管中的液滴中进行数字PCR(dPCR)，并使用光片成像进行成像。图3A示出了使用不带cProbe的荧光探针进行成像的试管的两个代表性横截面。图3B示出了使用荧光探针和cProbe进行成像的试管的两个代表性横截面。与没有cProbe的样品dPCR相比，添加cProbe大大降低了三维样品的背景荧光。

具体实施方式

荧光成像可用于检测和量化样品中特定核酸分子的存在。包含与靶核酸退火的核酸序列的荧光探针可用于检测特定的核酸分子。荧光探针，例如TaqMan探针，其在与靶核酸结合时水解，从而增加探针荧光，经常用于检测特定核酸分子。荧光探针，例如LightCycler探针，其包含两种结合到靶核酸的荧光核酸，从而通过

共振能量转移(FRET)来增加探针荧光，也可用于检测特定核酸分子。使用荧光检测特定核酸分子可以使用测定法如数字聚合酶链反应(dPCR)、数字等温扩增(例如，数字LAMP或数字解旋酶依赖性扩增或数字重组酶聚合酶扩增)或杂交测定(例如，利用滚环扩增的纳米球)来进行。核酸样品的荧光检测(例如，数字PCR、数字等温扩增或杂交测定)可以在多种介质中进行或以多种样品形式进行。在一些实施方案中，样品核酸分子的荧光检测可在液滴、微孔、纳米孔、凝胶基质或固相基质中进行。在一些实施方案中，荧光检测通过成像来进行，成像可以是一维(1D)、二维(2D)、或三维(3D)成像。在一些实施方案中，通过光片显微术进行3D成像。样品可以是三维(3D)样品，例如试管或小瓶中的样品。样品可以是二维(2D)样品，例如平面阵列或平板中的样品。样品可以是一维(1D)样品，例如具有单个液滴或分子通过流道的样品。

核酸扩增方法

本文描述了用于扩增和检测核酸样品中特定核酸的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于确定靶核酸和参考核酸的总体比率。一种用于扩增核酸样品中特定核酸的方法可包括稀释包含核酸模板分子的生物样品，以形成包含多个测定样品的集合。例如，生物样品可包含来自人类对象的染色体DNA。在一些实施方案中，稀释模板分子(例如，包含靶核酸的核酸分子)可包括分配模板分子。例如，可以将模板分子分配至液滴、微孔或纳米孔中。备选地，还可以将模板分子及其扩增产物在空间中定位(例如，通过凝胶基质内的受限扩散，或锚定至表面上)，这样使得模板分子及其扩增产物的分配不需要任何物理屏障。

每个分配区可包含一个拷贝的模板分子或零个拷贝的模板分子。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得至少95％、至少97.5％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的分配区包含不超过一个拷贝的模板分子。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或其间的任何百分比的分配区包含不超过一个拷贝的模板分子。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的分配区包含不超过一个拷贝的模板分子。每个分配区可包含一个拷贝或零个拷贝的参考核酸分子。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得至少95％、至少97.5％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的分配区包含不超过一个拷贝的参考核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或其间的任何百分比的分配区包含不超过一个拷贝的参考核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的分配区包含不超过一个拷贝的参考核酸。每个分配区可包含一个拷贝或零个拷贝的靶核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得至少95％、至少97.5％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的分配区包含不超过一个拷贝的靶核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或其间的任何百分比的分配区包含不超过一个拷贝的靶核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的分配区包含不超过一个拷贝的靶核酸。在一些实施方案中，选择稀释因子，使得不大于5％、不大于2.5％、不大于2％、不大于1％、不大于0.5％或不大于0.1％的分配区同时包含参考核酸和靶核酸。

可以将模板分子在测定样品内扩增，以在该集合的测定样品中形成扩增分子群体。在一些实施方案中，通过聚合酶链反应(PCR)、数字PCR(dPCR)、等温扩增(例如，环介导等温扩增(LAMP)或解旋酶依赖性扩增)或数字等温扩增来进行扩增。在一些实施方案中，扩增反应可包括聚合酶，任选具有核酸酶活性的聚合酶，例如DNA聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应可包括荧光探针，例如荧光核酸探针。在一些实施方案中，荧光核酸探针可以是水解型探针。

荧光探针可以包括与靶核酸退火的探针核酸和与该探针核酸缀合并位于其末端的荧光部分。荧光探针可以包括与参考核酸退火的探针核酸和与该探针核酸缀合并位于其末端的荧光部分。荧光部分可以是有机荧光团(例如，Alexa-fluor、Cy染料、HEX荧光团、FAM荧光团、VIC、TEX615、SUN、Yakima黄、ATTO染料、TYE染料、TET、JOE、ROX、TAMRA、BODIPY染料、IRDye或罗丹明)。在一些实施方案中，荧光探针还可包含与探针核酸的另一末端缀合的猝灭部分。该猝灭部分可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制荧光部分的荧光。猝灭部分可以具有与荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱。在一些实施方案中，猝灭部分可包括暗猝灭剂(示例-黑洞猝灭剂、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、Dabysl、Qxl猝灭剂、IRDye QC-1)。在一些实施方案中，互补核酸的猝灭部分靠近探针核酸的荧光部分。在一些实施方案中，靠近是互补核酸的猝灭部分距离探针核酸的荧光部分5个或更少的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靠近是互补核酸的猝灭部分与探针核酸的荧光部分相对。在一些实施方案中，靠近是互补核酸的猝灭部分距离探针核酸的荧光部分1个核苷酸碱基。

扩增反应可包括探针补体。该探针补体可以抑制未结合到靶核酸或参考核酸的荧光探针的荧光。该探针补体可抑制未由具有核酸酶活性的聚合酶水解的荧光探针的荧光。该探针补体可以包括与探针核酸或探针核酸的区域基本上互补的互补核酸，以及缀合到该互补核酸一个末端的猝灭部分。该探针补体序列(例如，互补核酸序列)可能缺少成串的鸟嘌呤。成串的鸟嘌呤可阻止对背景荧光的抑制。在第一示例性配置中，互补核酸包括相对于探针核酸的错配。在第二示例性配置中，互补核酸与探针核酸的片段完全互补。互补核酸可包含相对于探针核酸的1、2、3、4、5个或更多个错配。互补核酸可以与探针核酸的片段退火，该片段长度为1至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40个核酸。互补核酸的长度可以是1至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40个核酸。探针核酸的长度可以是1至10、5至15、10至20、15至25、20至30、25至35、30至40个核酸。在一些实施方案中，探针补体的序列缺少4个或更多个连续鸟嘌呤。在进一步的实施方案中，探针补体的序列缺少4、5、6、7、8、9、10、20、30或40个或者其间任何数量的连续鸟嘌呤。在一些实施方案中，探针补体的序列缺少4个连续鸟嘌呤。

猝灭部分可以具有与荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱。在一些实施方案中，选择猝灭部分以增加猝灭部分的吸收光谱和荧光部分的发射光谱之间的光谱重叠。在一些实施方案中，选择荧光部分以增加猝灭部分的吸收光谱和荧光部分的发射光谱之间的光谱重叠。猝灭部分和荧光部分可缀合到其各自核酸的相对末端。例如，猝灭部分可与互补核酸的3'末端缀合，且荧光部分可与探针核酸的5'末端缀合。猝灭部分可与互补核酸的5'末端缀合，且荧光部分可与探针核酸的3'末端缀合。

可以将互补核酸序列设计为在测定温度(例如可进行成像的温度)下与探针核酸退火。在一些实施方案中，互补核酸可在室温下与探针核酸退火。互补核酸可在约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃的温度下与探针核酸退火。互补核酸相对于荧光探针核酸序列的解链温度可以是约30℃至约60℃。互补核酸相对于荧光探针核酸序列的解链温度可以是30℃至50℃、30℃至40℃、40℃至50℃、45℃至55℃、50℃至60℃、55℃至65℃或60℃至70℃。在一些实施方案中，互补核酸和探针核酸的区域的解链温度低于探针核酸和靶核酸的解链温度。在一些实施方案中，互补核酸在PCR反应的退火温度下不与探针核酸退火。

用于扩增核酸样品中特定核酸的方法可包括分析该集合的测定样品中的扩增分子，以确定包含所选序列(例如，靶核酸)的测定样品的第一数量和包含参考基因序列(例如，参考核酸)的测定样品的第二数量。分析扩增分子可包括对扩增分子进行成像。在一些实施方案中，可以通过荧光成像对扩增分子进行成像。例如，可以通过检测本文所述的荧光探针(例如，荧光核酸探针)的荧光来对扩增分子进行成像。可以使用如本文所述的一维、二维或三维成像方法来进行成像。例如，可以使用光片成像对三维样品(例如，包含液滴(例如，在不混溶流体中形成的水性液滴，例如烃油、硅油、氟化油等)的试管)中的扩增分子进行成像。在一些实施方案中，可在探针补体的存在下进行成像。在一些实施方案中，可以在两种波长下进行荧光成像。例如，可以在第一波长处进行荧光成像以测量与靶核酸退火的荧光探针的荧光，并且可以在第二波长处进行荧光成像以测量与参考核酸退火的荧光探针的荧光。

用于扩增核酸样品中的特定核酸的方法可包括将第一数量(例如，对应于靶核酸)与第二数量(例如，对应于参考核酸)进行比较，以确定反映生物样品组成的比例。例如，可以将具有与靶核酸退火的荧光探针的荧光的分配区数量与具有与参考核酸退火的荧光探针的荧光的分配区数量进行比较。

本文所述的探针补体可与荧光探针组合使用。在一些实施方案中，探针补体可与荧光核酸探针组合使用。在一些实施方案中，荧光核酸探针可以是水解型探针或

共振能量(FRET)探针。

本文所述的探针补体可用于一维、二维或三维成像技术。例如，探针补体可用于落射荧光显微术、全内反射荧光(TIRF)显微术、使用摄像机或光电二极管的荧光照射和检测、光片成像、共焦显微术或对通过流动池通道的液滴进行成像。

本文所述的探针补体可用于测定，如数字聚合酶链反应(dPCR)、数字等温扩增(例如，数字LAMP或数字解旋酶依赖性扩增或数字重组酶聚合酶扩增)或杂交测定(例如，利用滚环扩增的纳米球)。可以将本文所述的探针补体添加到液滴、微孔、纳米孔、凝胶基质或固相基质中的样品中。

核酸样品的荧光成像

为了量化或检测核酸样品，可以对样品进行成像。在一些实施方案中，可以在数字PCR、数字等温扩增或杂交测定后对样品进行成像。可以基于样品形式选择成像技术。例如，可以使用一维成像技术对一维(1D)样品(例如，流动池)进行成像。一维成像技术可包括落射荧光显微术、全内反射荧光(TIRF)显微术或者使用摄像机或光电二极管的荧光照射和检测(例如，凝胶荧光成像仪)。在一些实施方案中，通过使液滴或荧光核酸分子通过流动池通道，例如使样品的液滴或荧光核酸分子逐一通过，并检测荧光，对一维(1D)样品进行成像。可使用二维成像技术对二维(2D)样品(例如，平面阵列、微孔板或纳米孔板)进行成像。二维成像技术可包括落射荧光显微术、全内反射荧光(TIRF)显微术或使用摄像机的荧光照射和检测(例如，凝胶荧光成像仪)。可使用三维成像技术对三维样品(例如，试管或细胞)进行成像。三维成像技术可包括光片成像或共焦显微镜。三维成像技术可包括对三维样品的连续横截面进行照射和成像，以产生三维图像数据集。

在每种荧光成像技术中，都需要提高信噪比，以提高信号检测的准确度和精确度。提高信噪比的一种方式是降低背景荧光。这在三维成像技术中特别重要，因为三维成像可以通过较厚样品或本体溶液进行成像，从而使高荧光背景的影响变得复杂化。例如，在包含聚集在一起的PCR隔室(例如，液滴)的数字样品中，相邻阴性隔室中的任何残余荧光都可能使阳性隔室的检测变得复杂化并对其产生干扰。因此，在3D可视化中，优选尽可能抑制背景荧光。

用于降低背景荧光的系统和方法

与在探针补体不存在的情况下进行的方法相比，在探针补体存在的情况下进行的用于扩增和检测核酸样品中特定核酸的方法可以降低背景荧光。与在探针补体不存在的情况下进行的方法相比，在探针补体存在的情况下进行的方法可以提高信噪比。包含与靶核酸退火的核酸、与该核酸一个末端缀合的荧光团和与该核酸另一末端缀合的猝灭剂的核酸探针可用于降低荧光背景。这种探针可以通过在与靶核酸退火时水解而发挥作用，从而将荧光团与猝灭剂分离。在溶液中，当探针未与靶核酸结合时，猝灭剂可抑制荧光团的荧光，从而降低背景荧光。然而，这种背景荧光降低对于三维成像可能是不够的。在一些实施方案中，通过在探针的核酸序列中设计出发夹序列，使猝灭剂在溶液中时更接近荧光团，可以进一步降低背景荧光。然而，为所需的靶核酸序列设计出发夹结构可能很困难。

核酸探针可用于降低荧光背景，该核酸探针包含第一核酸和第二核酸，第一核酸与缀合至缀合的第一荧光团的靶核酸退火，第二核酸在缀合至第二荧光团的第一核酸附近与该靶核酸退火，该第二荧光团与该第一荧光团形成FRET对。在第一核酸和第二核酸结合到靶核酸时，这种探针可以通过从第一荧光团到第二荧光团的FRET转移来发挥作用。在溶液中，当探针未与靶核酸结合时，FRET可能较低，从而降低背景荧光。然而，这种背景荧光降低对于三维成像可能是不够的。

本文描述了在荧光核酸检测成像中降低背景荧光的方法、系统和试剂盒。降低背景荧光的系统可包括荧光探针和探针补体。荧光探针可包括如本文所述的荧光探针。探针补体可包括如本文所述的探针补体。探针补体可降低未结合到靶核酸的荧光探针的荧光。探针补体可降低未由具有核酸酶活性的DNA聚合酶水解的荧光探针的荧光。探针补体可通过与荧光探针退火并猝灭荧光团的荧光来降低荧光探针的荧光。

试剂盒

用于核酸样品扩增和检测的试剂盒可包括如本文所述的探针补体和如本文所述的荧光探针。一种用于核酸样品扩增和检测的试剂盒可包括DNA聚合酶。与不包含探针补体的用于核酸样品扩增和检测的试剂盒相比，包含探针补体的用于核酸样品扩增和检测的试剂盒可提供更低的背景荧光。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何提及均旨在包含“和/或”。

每当术语“至少”、“大于”或者“大于或等于”出现在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或者“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3相当于大于或等于1、大于或等于2或者大于或等于3。

每当术语“不超过”、“小于”、“小于或等于”或者“至多”出现在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不超过”、“小于”或者“小于或等于”或者“至多”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1相当于小于或等于3、小于或等于2或者小于或等于1。

在将值描述为范围的情况下，应当理解，此类公开内容包括公开此类范围内所有可能的子范围，以及落入此类范围内的特定数值，而无论是否明确规定了特定数值或特定子范围。

实施例

以下实施例是说明性的，且并非对本文所述的装置、系统、流体装置、试剂盒和方法的范围加以限制。

实施例1

使用水解型探针对数字PCR样品进行光片成像

本实施例描述了使用水解型探针对数字PCR(dPCR)样品的光片成像。在PCR试管中的液滴中进行数字PCR。简言之，基于泊松统计，将核酸样品分割成液滴，使得每个液滴最可能包含零个或一个核酸拷贝。在具有核酸酶活性的DNA聚合酶和与被扩增的核酸样品片段互补的荧光水解型探针(TaqMan水解型探针)的存在下对液滴进行聚合酶链反应(PCR)。当水解型探针与扩增的核酸结合时，DNA聚合酶水解水解型探针的核酸序列，从而将猝灭剂与荧光团分离。由于猝灭剂靠近荧光团，未与核酸退火的水解型探针抑制了荧光。使用光片成像在PCR试管中对样品进行成像。使用具有高荧光背景的水解型探针或具有低荧光背景的水解型探针进行数字PCR。

图1示出了用荧光水解型探针(例如，TaqMan水解型探针)标记的荧光液滴的三维样品的横截面荧光图像。在每个试管中的液滴中进行数字聚合酶链反应(dPCR)，并使用光片成像进行成像。图1A示出了使用具有低荧光背景的水解型探针进行成像的试管的两个代表性横截面。图1B示出了使用具有高荧光背景的水解型探针进行成像的试管的两个代表性横截面。

对水解型探针的核酸序列进行分析以确定降低荧光背景的机制。如果核酸序列形成Gibbs自由能(ΔG)负变化的发夹结构，则包含在5'末端具有荧光团和在3'末端具有猝灭剂的短核酸序列的水解型探针通常显示出低荧光背景(如在图1A中使用的探针中)。发夹结构可以使猝灭剂更靠近荧光团，从而抑制探针背景。

实施例2

用于降低背景荧光的探针补体设计

本实施例描述了用于降低背景荧光的探针补体设计。设计探针补体用于数字PCR扩增反应。探针补体旨在降低核酸探针(如水解型探针)的背景荧光。探针补体包括位于核酸序列末端的猝灭剂。将核酸序列设计为与荧光核酸探针的全部或部分核酸序列基本上或完全互补。

图2示出了示例性探针补体配置的示意图。该探针补体与包含核酸和荧光团的荧光探针退火。任选地，荧光探针在与荧光团相对的该核酸另一末端处包含猝灭剂。

在第一探针补体配置中，将猝灭剂置于核酸序列的3'末端，该核酸序列与在核酸序列的5'末端上具有荧光团的荧光探针的核酸序列接近互补。图2A示出了一种探针补体配置，其中探针补体包含与荧光探针核酸接近互补的核酸序列。探针补体与荧光探针的退火使猝灭剂紧密靠近荧光团，导致荧光发射猝灭。

在第二探针补体配置中，将猝灭剂置于核酸序列的3'末端，该核酸序列与在核酸序列的5'末端上具有荧光团的荧光探针的核酸序列片段完全互补。图2B示出了一种探针补体配置，其中探针补体包含与荧光探针核酸片段完全互补的核酸序列。探针补体与荧光探针的退火使猝灭剂紧密靠近荧光团，导致荧光发射猝灭。

在两种配置中，将探针补体核酸序列设计成使其在进行成像的温度下与荧光探针核酸序列退火。如在实施例1中进行的，在室温(约21℃至25℃)下进行成像。将探针补体核酸序列设计为相对于荧光探针核酸序列的解链温度为30℃至60℃，使得探针补体不会在PCR退火温度下与荧光探针退火。探针补体核酸序列相对于荧光探针核酸序列的解链温度对于完全互补的序列(如图2B所示出的)比对于含有错配的序列(如图2A所示出的)更容易预测，因为错配序列的预测解链温度基于所用的解链温度算法而有所不同。

实施例3

使用带有探针补体的数字PCR鉴定21三体综合征

本实施例描述了使用带有探针补体猝灭剂的数字PCR鉴定21三体综合征。如实施例1所述，使用带有锁核酸的水解型探针(TaqMan锁核酸(LNA)探针)对人类核酸样品进行数字PCR，该锁核酸具有靶向21号染色体(“chr21”)或18号染色体(“chr18”)的10个碱基。靶向21号染色体的水解型探针在LNA序列的5'末端具有HEX荧光团，并且在LNA序列的3'末端具有黑洞猝灭剂。靶向18号染色体的水解型探针在LNA序列的5'末端具有FAM荧光团，并且在LNA序列的3'末端具有黑洞猝灭剂。

在第一测定中，比较两个样品之间的背景荧光。在第一样品中，在没有探针补体的情况下进行数字PCR。在第二样品中，数字PCR反应中包括两种探针补体，一种与21号染色体荧光探针退火，一种与18号染色体荧光探针退火。图3A示出了使用不带探针补体的水解型探针进行成像的试管的两个代表性横截面。图3B示出了使用带有探针补体的水解型探针进行成像的试管的两个代表性横截面。探针补体的加入降低了三维样品的背景荧光。

在第二测定中，如前所述，在靶向21号染色体荧光探针和18号染色体荧光探针的两种探针补体存在的情况下对样品进行数字PCR。每个样品都含有来自患有21三体综合征的人类或具有正常数量染色体的对照样品的染色体DNA。使用光片成像对样品进行成像，并对每个样品中对应于18号染色体和21号染色体的荧光颗粒进行计数。所得计数如表1中所示。基于21号染色体荧光颗粒计数与18号染色体荧光颗粒计数之比，测定灵敏度足以鉴定21三体综合征样品。正如所料，21三体综合征样品的21号染色体与18号染色体的比率(“chr21:chr18”)约为1.5，而对照样品的21号染色体与18号染色体的比率约为1。

表1-21三体综合征和对照样品中18号染色体和21号染色体的荧光计数

在第三测定中，以2倍连续稀释方式对21三体综合征核酸样品进行稀释。如前所述，在存在21号染色体和18号染色体的水解型探针以及靶向21号染色体和18号染色体荧光探针的猝灭剂探针的情况下，对每个稀释物进行数字PCR。还对没有核酸模板的对照样品(“NTC”)进行了数字PCR。在较高的样品浓度(低滴定系列号)下，该测定准确检测出21号染色体与18号染色体的比率(“chr21:chr18”)。由于低拷贝数下的泊松统计，在较低样品浓度(高滴定系列号)下的准确度降低。滴定系列的每个样品的荧光计数和21号染色体与18号染色体的比率如表2所示。

表2–来自21三体综合征个体的基因组DNA滴定系列

尽管本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变更、改变和替换。应该理解的是，在实施本公开内容的过程中，可以采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (39)

1.一种扩增样品中核酸分子的方法，包括：

使生物样品中的核酸分子与聚合酶、第一荧光探针和第一探针补体接触，所述第一荧光探针包含与靶基因序列退火的第一探针核酸，所述第一探针补体包含与所述第一探针核酸退火的第一互补核酸；以及

扩增所述核酸分子以形成扩增分子群体。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括对所述扩增分子群体进行成像。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括对所述成像进行分析。

4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述成像是光片成像。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述分析包括评估所述扩增分子群体中的荧光。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第一互补核酸的序列缺少成串鸟嘌呤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述成串鸟嘌呤是所述序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

8.一种用于确定靶基因序列在核酸分子群体中的比例的方法，包括：

稀释来自样品的所述核酸分子群体以形成包含多个测定样品的集合；

扩增所述测定样品内的所述核酸分子以在所述集合的所述测定样品中形成扩增分子群体；

分析所述集合的所述测定样品中的扩增分子以确定包含所述靶基因序列的测定样品的第一数量和包含参考基因序列的测定样品的第二数量；

将所述第一数量与所述第二数量进行比较，以确定反映所述样品组成的比例。

9.根据权利要求8所述的方法，其中约10％的所述多个测定样品包含零个或一个核酸分子。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中分析所述扩增分子包括对所述扩增分子进行荧光成像。

11.根据权利要求10所述的方法，包括添加包含与所述靶基因序列退火的第一探针核酸的第一荧光探针、包含与所述参考基因序列退火的第二探针核酸的第二荧光探针、包含与所述第一探针核酸退火的第一互补核酸的第一探针补体、以及包含与所述第二探针核酸退火的第二互补核酸的第二探针补体。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中对所述扩增分子进行成像包括光片成像。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一探针互补核酸的序列、所述第二互补核酸的序列或两者都缺少成串鸟嘌呤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述成串鸟嘌呤是所述序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

15.一种用于在核酸扩增测定中降低背景荧光的方法，所述方法包括使样品与以下物质接触：

荧光探针，所述荧光探针包含与探针核酸缀合的荧光部分，其中将所述探针核酸配置为与靶核酸退火；

探针补体，所述探针补体包含与互补核酸缀合的猝灭部分，其中所述互补核酸与所述探针核酸的区域基本上互补，并且其中所述猝灭部分具有与所述荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱；以及

核酸聚合酶，当所述探针核酸与所述靶核酸退火时，所述核酸聚合酶能够水解所述探针核酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针核酸的所述区域是所述探针核酸的全长。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针核酸的所述区域小于所述探针核酸的全长。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述互补核酸与所述探针核酸的所述区域完全互补。

19.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述互补核酸包含至少一个相对于所述探针核酸的所述区域的碱基对错配。

20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述互补核酸的所述猝灭部分靠近所述探针核酸的所述荧光部分。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述靠近是所述互补核酸的猝灭部分距离所述探针核酸的荧光部分5个或更少的核苷酸碱基。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述靠近是所述互补核酸的猝灭部分与所述探针核酸的荧光部分相对。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述靠近是所述互补核酸的猝灭部分距离所述探针核酸的荧光部分1个核苷酸碱基。

24.根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中所述互补核酸和所述探针核酸的所述区域的解链温度为30℃至60℃。

25.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述互补核酸在约20℃至约25℃的温度下与所述探针核酸退火。

26.根据权利要求15-25中任一项所述的方法，其中所述互补核酸和所述探针核酸的所述区域的解链温度低于所述探针核酸和所述靶核酸的解链温度。

27.根据权利要求15-26中任一项所述的方法，其中当所述互补核酸与所述探针核酸退火时，所述猝灭部分猝灭所述荧光部分。

28.根据权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述互补核酸缺少成串鸟嘌呤。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述成串鸟嘌呤是所述序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

30.一种探针补体，其包含与互补核酸缀合的猝灭部分，其中所述猝灭部分具有与荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱，并且其中所述互补核酸与缀合到所述荧光部分的探针核酸基本上互补。

31.根据权利要求30所述的探针补体，其中所述探针核酸的区域是所述探针核酸的全长。

32.根据权利要求30所述的探针补体，其中所述探针核酸的区域小于所述探针核酸的全长。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的探针补体，其中所述互补核酸与所述探针核酸的所述区域完全互补。

34.根据权利要求30-32中任一项所述的探针补体，其中所述互补核酸包含至少一个相对于所述探针核酸的所述区域的碱基对错配。

35.根据权利要求30-34中任一项所述的探针补体，其中所述互补核酸和所述探针核酸的所述区域的解链温度为30℃至60℃。

36.根据权利要求30-35中任一项所述的探针补体，其中所述互补核酸在约20℃至约25℃的温度下与所述探针核酸退火。

37.根据权利要求30-36中任一项所述的探针补体，其中当所述互补核酸与所述探针核酸退火时，所述猝灭部分猝灭所述荧光部分。

38.根据权利要求30-37中任一项所述的探针补体，其中所述探针补体的序列缺少成串鸟嘌呤。

39.根据权利要求38所述的探针补体，其中所述成串鸟嘌呤是所述序列中的至少4个或更多个连续鸟嘌呤。

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